CN109679994B - 通过四环素诱导表达外源基因的游离载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过四环素诱导表达外源基因的游离载体。所述通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，包括AmpR基因片段、ori基因片段、SV40 poly(A)基因片段、tight TRE promoter基因片段、mCherry基因片段、bGH poly(A)基因片段、OriP基因片段、EF‑1αcore promoter基因片段、EBNA1基因片段、T2A基因片段、rtTA‑Advanced基因片段、EGFP基因片段、NeoR基因片段以及rabbitβ‑globin poly(A)基因片段。本发明提供的游离载体，在人类多能干细胞内高效的表达外源基因，转染效率高且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通过四环素诱导表达外源基因的游离载体及其构建方法。
背景技术
对人类多能干细胞进行基因组层面的操控有着深远的科研和医学意义。而这依赖于我们能够在人类多能干细胞内进行高效的外源基因表达。由于人类多能干细胞的特性，对其进行转染往往效率低下或复杂昂贵。所以，目前最常用的手段是通过慢病毒在细胞基因组内随机地插入外源基因。但这种方法可能导致被改造的细胞产生不可控的基因组变异以至于形成肿瘤细胞而失去其医学价值。
因此，有必要提供一种新的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体及其构建方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，用于解决相关技术中，在人类多能干细胞内高效的表达外源基因，转染效率低且成本高的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，所述载体包括AmpR基因片段、ori基因片段、SV40 poly(A)基因片段、tight TREpromoter基因片段、mCherry基因片段、bGH poly(A)基因片段、OriP基因片段、EF-1αcorepromoter基因片段、EBNA1基因片段、T2A基因片段、rtTA-Advanced基因片段、EGFP基因片段、NeoR基因片段以及rabbitβ-globin poly(A)基因片段，其构建方法包括如下步骤：
步骤S1，根据基因合成技术得到以下各DNA片段：
T2A
rtTA-Advanced
EGFP
NeoR
rabbit b-globin poly(A)
SV40 poly(A)
tight TRE promoter
mCherry
bGH poly(A)；
步骤S2，由PCR得到以下各DNA片段：
OriP，来自人类herpesvirus 4(EBV)基因组；
使用引物：
oriP-F gcaggaaaaggacaagcagcga；
oriP-R cgcggggcagtgcatg；
EBNA1，来自人类herpesvirus 4(EBV)基因组；
使用引物：
EBNA1-F atgtctgacgaggggccagg；
EBNA1-R tcactcctgcccttcctcaccc；
EF-1αcore promoter，来自人类基因组；
使用引物：
EF1a_F TCACTGAGGTGGAGAAGAGCAT；
EF1a_R acctgtgttctggcggcaaa；
AmpR-ori，来自质粒pUC19；
使用引物：
AmpR-ori_F GCGCGGAACCCCTATTTGTT；
AmpR-ori_R TTTTCCATAGGCTCCGCCC；
步骤S3，使用以下引物对AmpR-ori进行二次PCR以增加末端序列：
pE_Am_sF gtgaggaagggcaggagtgaAAGCTTGCGCGGAACCCCTATTTG；
pE_Am_sR cctggcccctcgtcagacatGAATTCTTTTCCATAGGCTCCGCCC；
得到线性产物AmpR-ori-E1，将其与EBNA1通过Gibson Assembly反应生成环形DNA质粒pEBNA1；
步骤S4，对之前已合成的DNA片段使用以下对应引物进行二次PCR以增加末端序列：
T2A:
rr_T1_sF ggtgaggaagggcaggagGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T1_sR agtctagacatTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
rtTA-Advanced：
rr_rt_sF TCCTGGCCCAatgtctagactggacaagagcaaag；
rr_rt_sR CCGATCCcccggggagcatgtcaag；
T2A:
rr_T2_sF ccccgggGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T2_sR GCTCACCATTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
EGFP：
rr_GFP_sF CTGGCCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；
rr_GFP_sRCTCCCGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC；
T2A:
rr_T3_sF GCTGTACAAGGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T3_sR cgatcccatTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
NeoR：
rr_Neo_sF CCTGGCCCAatgggatcggccattgaaca；
rr_Neo_sR acctgaggagtgtcagaagaactcgtcaagaaggcgata；
rabbitβ-globin poly(A)：
rr_rpA_sF agttcttctgacactcctcaggtgcaggc；
rr_rpA_sRACAAATAGGGGTTCCGCGCcaaaacaaaatataaaaaaaatctaacctcaagtcaagg；
步骤S5，对以上得到的线性片段用overlap PCR方法进行组装，得到rtTA-EGFP-NeoR-rbpA：
步骤S6，使用HindIII消化pEBNA1，用Gibson Assembly将线性片段rtTA-EGFP-NeoR-rbpA接入，得到pEBNA1-REN:
步骤S7，对之前已合成的DNA片段使用以下对应引物进行二次PCR以增加末端序列：
SV40 poly(A):
sb_spA_sF
GGGGCGGAGCCTATGGAAAAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAG；
sb_spA_sR
TAGGGAGTAAACTCGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGT；
tight TRE promoter
sb_TRE_sF
TTTTTTTCACTGCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTA；
sb_TRE_sR ccttgctcacTCTCCAGGCGATCTGACGG；
mCherry:
sb_mCh_sF GCCTGGAGAgtgagcaagggcgaggag；
sb_mCh_sR TAGAAGGCACAGtcacttgtacagctcgtccatgc；
bGH poly(A)
sb_bpA_sF ctgtacaagtgaCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG；
sb_bpA_sR ctggcccctcgtcagacatACCCATAGAGCCCACCG；
OriP
sb_OriP_sF GCTCTATGGGTgcaggaaaaggacaagcagc；
sb_OriP_sR CTCAGTGAcgcggggcagtgc
EF-1αcore promoter
sb_EF_sF gccccgcgTCACTGAGGTGGAGAAGAGCATg；
sb_EF_sR ctggcccctcgtcagacatacctgtgttctggcggc；
步骤S8，对以上得到的线性片段用overlap PCR方法进行组装，得到SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF；
步骤S9，使用EcoRI消化pEBNA1-REN，用Gibson Assembly将线性片段SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF接入，得到最终质粒pLN-1。
本发明提供的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，能够通过载体自身属性极大地增强在人类多能干细胞中的转染效率，并不插入基因组、游离于细胞基因组之外进行自我维持复制的，且可通过四环素诱导外源基因表达的载体。该载体极大地拓展了我们对人类多能干细胞进行基因操控的能力，有着广泛的医学和研究价值。
附图说明
图1为本发明提供的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体的物理图谱；
图2为环形DNA质粒pEBNA1的物理谱图；
图3为rtTA-EGFP-NeoR-rbpA的物理谱图；
图4为pEBNA1-REN的物理谱图；
图5为SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF的物理谱图；
图6为本发明提供的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体一实验效果图；
图7为本发明提供的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体另一实验效果图；
图8为本发明提供的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体又一实验效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
本发明提出一种通过四环素诱导表达外源基因的游离载体。
在本发明的一实施例中，通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，所述载体包括AmpR基因片段、ori基因片段、SV40 poly(A)基因片段、tight TRE promoter基因片段、mCherry基因片段、bGH poly(A)基因片段、OriP基因片段、EF-1αcore promoter基因片段、EBNA1基因片段、T2A基因片段、rtTA-Advanced基因片段、EGFP基因片段、NeoR基因片段以及rabbitβ-globin poly(A)基因片段，其构建方法包括如下步骤：
步骤S1，根据基因合成技术得到以下各DNA片段：
T2A
rtTA-Advanced
EGFP
NeoR
rabbitβ-globin poly(A)SV40 poly(A)
tight TRE promoter
mCherry
bGH poly(A)；
步骤S2，由PCR得到以下各DNA片段：
OriP，来自人类herpesvirus 4(EBV)基因组；
使用引物：
oriP-F gcaggaaaaggacaagcagcga；
oriP-R cgcggggcagtgcatg；
EBNA1，来自人类herpesvirus 4(EBV)基因组；
使用引物：
EBNA1-F atgtctgacgaggggccagg；
EBNA1-R tcactcctgcccttcctcaccc；
EF-1αcore promoter，来自人类基因组；
使用引物：
EF1a_F TCACTGAGGTGGAGAAGAGCAT；
EF1a_R acctgtgttctggcggcaaa；
AmpR-ori，来自质粒pUC19；
使用引物：
AmpR-ori_F GCGCGGAACCCCTATTTGTT；
AmpR-ori_R TTTTCCATAGGCTCCGCCC；
步骤S3，使用以下引物对AmpR-ori进行二次PCR以增加末端序列：
pE_Am_sF gtgaggaagggcaggagtgaAAGCTTGCGCGGAACCCCTATTTG；
pE_Am_sR cctggcccctcgtcagacatGAATTCTTTTCCATAGGCTCCGCCC；
得到线性产物AmpR-ori-E1，将其与EBNA1通过Gibson Assembly反应生成环形DNA质粒pEBNA1；请参阅图2。
步骤S4，对之前已合成的DNA片段使用以下对应引物进行二次PCR以增加末端序列：
T2A:
rr_T1_sF ggtgaggaagggcaggagGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T1_sR agtctagacatTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
rtTA-Advanced：
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T2A:
rr_T2_sF ccccgggGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T2_sR GCTCACCATTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
EGFP：
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T2A:
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rr_T3_sR cgatcccatTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
NeoR：
rr_Neo_sF CCTGGCCCAatgggatcggccattgaaca；
rr_Neo_sR acctgaggagtgtcagaagaactcgtcaagaaggcgata；
rabbitβ-globin poly(A)：
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rr_rpA_sR ACAAATAGGGGTTCCGCGCcaaaacaaaatataaaaaaaatctaacctcaagtcaagg；
步骤S5，对以上得到的线性片段用overlap PCR方法进行组装，得到rtTA-EGFP-NeoR-rbpA：请参阅图3。
步骤S6，使用HindIII消化pEBNA1，用Gibson Assembly将线性片段rtTA-EGFP-NeoR-rbpA接入，得到pEBNA1-REN；请参阅图4。
步骤S7，对之前已合成的DNA片段使用以下对应引物进行二次PCR以增加末端序列：
SV40 poly(A):
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GGGGCGGAGCCTATGGAAAAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAG；
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TAGGGAGTAAACTCGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGT；
tight TRE promoter
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mCherry:
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sb_mCh_sR TAGAAGGCACAGtcacttgtacagctcgtccatgc；
bGH poly(A)
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OriP
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EF-1αcore promoter
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步骤S8，对以上得到的线性片段用overlap PCR方法进行组装，得到SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF；请参阅图5。
步骤S9，使用EcoRI消化pEBNA1-REN，用Gibson Assembly将线性片段SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF接入，得到最终质粒pLN-1。请参阅图1。
本发明提供的通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，能够通过载体自身属性极大地增强在人类多能干细胞中的转染效率，并不插入基因组、游离于细胞基因组之外进行自我维持复制的，且可通过四环素诱导外源基因表达的载体。该载体极大地拓展了我们对人类多能干细胞进行基因操控的能力，有着广泛的医学和研究价值。
各基因片段功能作用介绍：
AmpR：为包含该质粒的菌株提供氨苄抗性以在大肠杆菌内筛选和扩增质粒；
ori：为质粒提供在大肠杆菌内复制的能力；
SV40 poly(A)：转录终止信号域，用以阻止TRE启动子被非特异性激活；
tight TRE promoter：该启动子会在四环素或多西环素存在的情况下被rtTA-Advanced蛋白结合并激活转录下游产物；
mCherry：红色荧光蛋白，在这里用以代替目标基因，并报告四环素诱导的表达程度；
bGH poly(A)：转录终止信号域，用以终止TRE启动子对其下游的继续转录进程；
OriP:该段DNA可以被EBNA1蛋白识别并结合，EBNA1介导其锚定至染色体以实现质粒随着染色体复制而复制，并不易随细胞分裂而被稀释出细胞核；
EF-1αcore promoter:来自于人类elongation factor 1的启动子。该启动子能恒定地表达下游基因，受细胞应激状态扰动极小；
EBNA1：该蛋白来自于EBV病毒，可以结合OriP DNA元件，介导其锚定至染色体以实现质粒随着染色体复制而复制，并不易随细胞分裂而被稀释出细胞核；
T2A:可产生二级结构阻止核糖体在特定区域产生肽链，从而使一个读码框在翻译过程中产生两条肽链；
rtTA-Advanced：该蛋白在结合四环素后可以改变构象结合TRE启动子，从而介导四环素诱导的应激表达；
EGFP:绿色荧光蛋白，用以报告质粒在细胞内的存在，评估转染效率等；
NeoR:赋予细胞G418抗性，用以筛选富集成功转染了质粒的细胞；
rabbitβ-globin poly(A)：转录终止信号。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (1)
1.一种通过四环素诱导表达外源基因的游离载体，其特征在于，所述载体包括AmpR基因片段、ori基因片段、SV40 poly(A)基因片段、tight TRE promoter基因片段、mCherry基因片段、bGH poly(A)基因片段、OriP基因片段、EF-1αcore promoter基因片段、EBNA1基因片段、T2A基因片段、rtTA-Advanced基因片段、EGFP基因片段、NeoR基因片段以及rabbitβ-globin poly(A)基因片段，其构建方法包括如下步骤：
步骤S1，根据基因合成技术得到以下各DNA片段：
T2A
rtTA-Advanced
EGFP
NeoR
rabbitβ-globin poly(A)
SV40 poly(A)
tight TRE promoter
mCherry
bGH poly(A)；
步骤S2，由PCR得到以下各DNA片段：
OriP，来自人类herpesvirus 4(EBV)基因组；
使用引物：
oriP-F gcaggaaaaggacaagcagcga；
oriP-R cgcggggcagtgcatg；
EBNA1，来自人类herpesvirus 4(EBV)基因组；
使用引物：
EBNA1-F atgtctgacgaggggccagg；
EBNA1-R tcactcctgcccttcctcaccc；
EF-1αcore promoter，来自人类基因组；
使用引物：
EF1a_F TCACTGAGGTGGAGAAGAGCAT；
EF1a_R acctgtgttctggcggcaaa；
AmpR-ori，来自质粒pUC19；
使用引物：
AmpR-ori_F GCGCGGAACCCCTATTTGTT；
AmpR-ori_R TTTTCCATAGGCTCCGCCC；
步骤S3，使用以下引物对AmpR-ori进行二次PCR以增加末端序列：
pE_Am_sF gtgaggaagggcaggagtgaAAGCTTGCGCGGAACCCCTATTTG；
pE_Am_sR cctggcccctcgtcagacatGAATTCTTTTCCATAGGCTCCGCCC；
得到线性产物AmpR-ori-E1，将其与EBNA1通过Gibson Assembly反应生成环形DNA质粒pEBNA1；
步骤S4，对之前已合成的DNA片段使用以下对应引物进行二次PCR以增加末端序列：
T2A:
rr_T1_sF ggtgaggaagggcaggagGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T1_sR agtctagacatTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
rtTA-Advanced：
rr_rt_sF TCCTGGCCCAatgtctagactggacaagagcaaag；
rr_rt_sR CCGATCCcccggggagcatgtcaag；
T2A:
rr_T2_sF ccccgggGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T2_sR GCTCACCATTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
EGFP：
rr_GFP_sF CTGGCCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；
rr_GFP_sR CTCCCGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC；
T2A:
rr_T3_sF GCTGTACAAGGGATCGGGAGAGGGCAG；
rr_T3_sR cgatcccatTGGGCCAGGATTCTCCTCG；
NeoR：
rr_Neo_sF CCTGGCCCAatgggatcggccattgaaca；
rr_Neo_sR acctgaggagtgtcagaagaactcgtcaagaaggcgata；
rabbitβ-globin poly(A)：
rr_rpA_sF agttcttctgacactcctcaggtgcaggc；
rr_rpA_sR ACAAATAGGGGTTCCGCGCcaaaacaaaatataaaaaaaatctaacctcaagtcaagg；
步骤S5，对以上得到的线性片段用overlap PCR方法进行组装，得到rtTA-EGFP-NeoR-rbpA：
步骤S6，使用HindIII消化pEBNA1，用Gibson Assembly将线性片段rtTA-EGFP-NeoR-rbpA接入，得到pEBNA1-REN:
步骤S7，对之前已合成的DNA片段使用以下对应引物进行二次PCR以增加末端序列：
SV40 poly(A):
sb_spA_sF
GGGGCGGAGCCTATGGAAAAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAG；
sb_spA_sR
TAGGGAGTAAACTCGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGT；
tight TRE promoter
sb_TRE_sF
TTTTTTTCACTGCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTA；
sb_TRE_sR ccttgctcacTCTCCAGGCGATCTGACGG；
mCherry:
sb_mCh_sF GCCTGGAGAgtgagcaagggcgaggag；
sb_mCh_sR TAGAAGGCACAGtcacttgtacagctcgtccatgc；
bGH poly(A)
sb_bpA_sF ctgtacaagtgaCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG；
sb_bpA_sR ctggcccctcgtcagacatACCCATAGAGCCCACCG；
OriP
sb_OriP_sF GCTCTATGGGTgcaggaaaaggacaagcagc；
sb_OriP_sR CTCAGTGAcgcggggcagtgc
EF-1αcore promoter
sb_EF_sF gccccgcgTCACTGAGGTGGAGAAGAGCATg；
sb_EF_sR ctggcccctcgtcagacatacctgtgttctggcggc；
步骤S8，对以上得到的线性片段用overlap PCR方法进行组装，得到SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF；
步骤S9，使用EcoRI消化pEBNA1-REN，用Gibson Assembly将线性片段SpA-TRE-mCh-bpA-oriP-EF接入，得到最终质粒pLN-1。
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| 基于EBNA1和oriP的载体在基因治疗中的应用研究进展;何婕等;《生物工程学报》;20050531;第21卷(第3期);第507-510页 * |
| 基于β-内酰胺酶的正向选择蛋白表达载体的构建;朱宇鹏等;《南京师大学报( 自然科学版)》;20110930;第34卷(第3期);第103-106页 * |
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