CN108410823A - 一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法。包括如下步骤，S1、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；S2、将表达外源重编程因子的微环游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；S3、将S2中获取的含有表达外源重编程因子的微环游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得外源重编程因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC。

Description

一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微环游离型载体高效重编程血 液细胞生成iPSC的方法。
背景技术
2006年，Takahashi和Yamanaka利用逆转录病毒载体将四种转录因子 OSKM即八聚体集合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4， Oct4)、性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y box protein 2， Sox2)、Kuppel样因子4(kruppel-likefactor 4，Klf4)和C-髓细胞组 织增生原癌基因(cellular myelocytomatosis oncogene，c-Myc)转入小 鼠成纤维细胞，获得了诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell,iPSC)。签于iPSC在生物学特性上与胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESCs)极其相似，而且有效避免了伦理限制和取材困难等问题，在疾病模型、 药物筛选、发育生物学研究和细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。 Yamanaka也因这一开创性的成果而获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。
(Takahashi K1,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell.2006；126:663-676).
2007年11月，Yamanaka研究组使用了同样的方法获得了人类诱导多能 干细胞hiPSC,同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导成 纤维细胞转化为具有人类胚胎干细胞hESC基本特征的hiPSC，所不同的是他 们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择出了POU5F1、SOX2、 NANOG、LIN28A等4个基因进行转导。
(Takahashi,K.,et al.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131(5):861-72.
Yu,J.,et al.，Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science.2007；318:1917-1920)
2009年，中国科学家周琪研究组、高绍荣研究组以及美国Baldwin研究 组通过四倍体补偿技术获得了完全由iPSC发育而来的小鼠，证明了iPSC具 有与胚胎干细胞同样的发育潜能(Boland,et al.2009；Kang,et al.2009； Zhao,et al.2009)。
(Boland,M.J.,et al.Adult mice generated from induced pluripotent stemcells.Nature 2009；461(7260):91-4.
Kang,L.,et al.iPS cells can support full-term development oftetraploid blastocyst-complemented embryos.Cell Stem Cell 2009； 5(2):135-8.
Zhao,X.Y.,et al.iPS cells produce viable mice through tetraploidcomplementation.Nature 2009；461(7260):86-90.)
由于向供体细胞转导外源基因使用的病毒载体会在重编程过程中对其 产生一定影响，通过此类方法筛选获得的克隆中存在基因重排、核型异常、 表观遗传学异常等现象，甚至具有高危致癌几率。2008年，Okita等人通过 多次常规质粒转染的方法获得了小鼠iPSC，但操作麻烦、重编程效率低下。 同年，Stadtfeld等人首次使用由腺病毒载体衍生的复制缺陷型载体生成无 整合的iPSC。他们成功地在小鼠肝脏细胞中表达此种载体携带的外源OSKM 基因，并得到了无外源基因整合的iPSC。但是在重编程小鼠胎儿肝细胞及成 体成纤维细胞时，必须在稳定反式表达外源Oct4基因的前提下转染携带SKM 基因的载体，才能得到iPSC。2009年，Fusaki团队利用基于仙台病毒(Sendai virus，一个RNA病毒)的载体将不同类型的终末分化细胞重编程为hiPSC。 但这种方法诱导获得的iPSC内仍然含有此病毒载体，并且在多次传代后仍 然可能在细胞内存在，不易删除。在多次传代后筛选到的不含此载体的iPSC 克隆由于长时间异位表达Myc基因，可能会导致其核型异常。另外Zhou等人于2009年以蛋白质OSKM与一个精氨酸的细胞膜转导结构域融合，在大肠 杆菌中表达并提纯了融合蛋白、将这些融合蛋白转导入含Oct4-GFP报告基 因的MEF中，获得了绿色荧光蛋白阳性的克隆，这种方法避免将外源性基因 材料引入重编程细胞中，但最大缺陷在于效率低下，重编程所需时间长，并 且需耗费很大精力用以提纯高剂量的融合蛋白。
(Okita,K.,et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cellswithout viral vectors.Science 2008；322(5903):949-53；
Stadtfeld,M.,et al.Induced pluripotent stem cells generated withoutviral integration.Science 2008；322(5903):945-9；
Fusaki,N.,et al.Efficient induction of transgene-free humanpluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus,an RNA virus thatdoes not integrate into the host genome.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci2009；85(8):348-62.
Zhou,H.,et al.Generation of induced pluripotent stem cells usingrecombinant proteins.Cell Stem Cell 2009；4(5):381-4.)
2009年，Kaji等人利用脂质体包裹携带DNA的一种特殊载体系统重编 程了小鼠成纤维细胞，在这载体两侧插入了loxP位点，在完成诱导后通过 瞬时表达Cre重组酶而删除此重编程构件。这一系统的优点在于，在重编程 完成后可对外源基因进行删除，其结果可能会提高iPSC的再分化潜能(排 除外源基因干扰)，更重要的是可以避免重编程因子的激活，从而降低了肿 瘤生成的风险。缺点是使用此系统的重编程因子去除效率极低，并且在删除 重编程构件后，在Cre重组酶切除loxP位点后，细胞内仍残留含loxP位点 的载体。基于这些原因，Woltjen在内的研究者尝试使用了转座子系统：即 同时使用携带目的基因的piggyBac转座子及转座子酶对供体细胞进行了重 编程，并成功获得了iPSC。转座子系统不仅能精确切除目的基因，并且在切 除后无残留，但重编程因子去除效率低下，同时使用转座子酶具有一个表达 时间窗口，需要严格控制其表达时间，否则会因为多轮剪切整合导致非保守 删除。
(Kaji,K.,et al.Virus-free induction of pluripotency and subsequentexcision of reprogramming factors.Nature 2009； 458(7239):771-5；
Woltjen,K.,et al piggyBac transposition reprograms fibroblasts toinduced pluripotent stem cells.Nature.2009；458(7239):766-70.)
2009年，Yu等人利用OriP/EBNA1游离型载体首次获得了无外源基因污 染的人类诱导多能干细胞，即“无痕”hiPSC。此方法只需一次转染，操作 简单，而且游离型载体在hiPSC扩增时会自动的从细胞内去除。但初始的 OriP/EBNA1游离载体重编程方法效率低下，而且需滋养层细胞，不利于 hiPSC的规模化制备以及临床级hiPSC的制备。利用在重编程特定时间段添 加小分子化合物与相关细胞因子，OriP/EBNA1游离型载体重编程系统于2011年，实现了从不同种类成体细胞高效制备“无痕”hiPSC，且无需滋养 层细胞(Yu,etal.2011)。
(Yu,J.,et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector andtransgene sequences.Science 2009；324(5928):797-801；
Yu,J.,et al.Efficient feeder-free episomal reprogramming with smallmolecules.PLoS One 2011；6(3):e17557.)
2010年，Jia等人利用Minicircle载体从人类脂肪来源的间充质干细 胞获得了非整合iPSC,但需要多次转染，操作比较麻烦，效率提高有限。
(Jia,F.,et al.A nonviral minicircle vector for deriving human iPScells.Nat Methods 2010；7(3):197-9.)
目前，iPSC的生成大多依赖于使用逆转录病毒或慢病毒载体，这些载体 自完全重编程的iPSC中可以发生转录沉默。但是，部分重编程的iPSC则无 法沉默外源性病毒转基因的表达，从而增加了致瘤性的安全隐患，极大地限 制了其在临床上的应用。此外，外源基因删除的人iPSC与ESC的相似性高 于转基因未删除的人iPSC，残余转基因的表达将影响iPSC的分子特征。
如何提高体细胞重编程的效率，一直是该领域科研人员的研究主题之 一。提高iPSC细胞产生的效率，使产生的iPSC细胞更加安全有效，是iPSC 细胞得以应用亟需解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种微环游离型载体高效重编 程血液细胞生成iPSC的方法，包括如下步骤，
S1、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养， 获取红细胞祖细胞；
S2、将表达外源重编程因子的微环游离型载体导入S1中获取的红细胞 祖细胞；
S3、将S2中获取的含有表达外源重编程因子的微环游离型载体红细胞 祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间 态细胞；
S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干 细胞培养基维持培养，获得外源重编程因子表达消失且内源多能性基因 POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC。
优选的，所述微环游离型载体为包含单向位点特异性重组酶的产物杂合 序列且不含原核质粒元件的环状DNA。
优选的，所述单向位点特异性重组酶及其作用位点选自Cre重组酶 /LoxP、Flp重组酶/FRT、ФC31整合酶/attB/attP中任意一种。
优选的，其特征在于，所述的单向位点特异性重组酶是ФC31整合酶， 其整合酶作用的重组位点为attB和attP。
优选的，所述微环游离型载体包括依次连接的DNA复制启动子以及作用 于该DNA复制启动子的反式作用因子、转录调控元件、重编程因子编码序列 和polyA加尾信号。
优选的，所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi's肉瘤疱疹病毒、 松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP。
优选的，所述反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1或其衍生物。
优选的，所述外源重编程因子选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、 MYCL、MYCN、MYC、p53 knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、 GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、 TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。
优选的，所述外源重编程因子选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28A、MYCL 和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。
优选的，所述OCT4转录因子为非哺乳动物中蝾螈Oct4蛋白。
优选的，所述NANOG、SOX2、LIN28A、MYCL和SV40LT转录因子为人源 因子。
优选的，所述人类血液细胞来源于人外周血，脐带血和骨髓血中的任意 一种。
优选的，所述S1中的扩增培养基、S3中的多能干细胞诱导培养基和S4 中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。
本发明还提供了一种微环游离型载体的制备方法，包括如下步骤，
S1、用微环DNA亲本质粒转化宿主菌，该宿主菌内含有表达单向位点特 异性重组酶的基因，该微环DNA亲本质粒中包含用于诱导红细胞祖细胞成为 多能干细胞的外源重编程因子；
S2、诱导S1中宿主菌内单向位点特异性重组酶的表达；
S3、使S1中的微环DNA亲本质粒与S2中的单向位点特异性重组酶接触， 发生位点特异性重组产生微环游离型载体。
优选的，所述微环DNA亲本质粒还含有细菌序列。
优选的，所述微环DNA亲本质粒还含有被宿主菌内单向位点特异性重组 酶识别的attB和attP位点，以及被宿主菌内的限制性内切酶识别的限制性 酶切位点，其中，所述attB和attP位点分别位于微环DNA亲本质粒上下游。
优选的，所述S1的具体步骤为采用微环DNA亲本质粒在37℃条件下转 化ZYCY10P3S2T工程菌，并静置培养14～16h；
所述S2的具体步骤为将S1所得含微环DNA亲本质粒的工程菌挑取单克 隆悬浮培养过夜；过夜后加等体积的含有阿拉伯糖的新鲜LB培养基，所述 阿拉伯糖最终质量体积浓度为0.1％，在温度为32℃，摇晃频率为250次/分 钟的条件下孵育4小时，诱导ZYCY10P3S2T工程菌表达ФC31整合酶；
所述S3的具体步骤为使微环DNA亲本质粒与上述ФC31整合酶接触， 从而发生位点特异性重组产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含有attR 位点的微环DNA，其中，含有attR位点的微环DNA即为微环游离型载体。
本发明还提供了一中微环DNA亲本质粒的制备方法，
S1、合成含有attB、attP、30×I-SceI限制性内切酶的酶切位点序列 的微环DNA空质粒；
S2、对包含外源重编程因子的游离型载体进行双酶切，得到大小不同的 核苷酸片段；
S3、采用T4 DNA连接酶将S2中得到的大小不同的核苷酸片段插入S1 中的微环DNA空质粒中，在4℃下连接过夜或者室温下连接1小时，然后将 连接产物加入E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在 含有氨苄青霉素的LB平板上，在37℃条件下静置培养过夜，获得含外源重 编程因子的的微环DNA亲本质粒。
本发明提供了一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方 法，通过该方法获取的iPSC无外源基因成分，适用于细胞再生医疗的临床 前研究和临床应用。
本发明的有益效果是：本发明的微环游离型载体拥有更高的转染效率， 将重编程因子导入血液细胞中，高效诱导获得多能干细胞克隆，且该载体不 会整合进入体细胞基因组，会随着细胞的分裂增殖而被稀释，最后从细胞内 完全消失，该方法获取的hiPSC无外源基因成分，适用于细胞再生医疗的临 床前研究和临床应用。
附图说明
图1是产生微环游离性载体策略的示意图；
图2是构建的含有重编程因子的OriP/EBNA1游离型载体表达系统；
图3是含有OriP/EBNA1系统的微环DNA的制备过程：上图是构建的含 有OriP/EBNA1系统的微环DNA亲本质粒表达系统；下图是制备的含有 OriP/EBNA1系统的微环DNA表达系统；
图4是人类血细胞的hiPSC重编程方法流程图；
图5是利用流式细胞术对红细胞祖细胞的鉴定：扩增第10天红细胞祖 细胞CD71和CD235a的表达情况；
图6是非微环游离型载体(OriP/EBNA1)和微环游离型载体 (MC-OriP/EBNA1)诱导血液细胞重编程为hiPSC的效率差异统计图；
图7是微环游离型载体实验组的hiPSC的形态图示，D1、D2、D3、D4 分别为培养第1、2、3、4天时显微镜下hiPSC的形态图，其中Scale bar 为200μm；
图8A是利用流式细胞分析对微环游离型载体实验组的hiPSC(第10代) 细胞表面标志物SSEA-4的检测，其中浅灰色线条为同种抗体阴性对照，黑 线为hiPSC细胞表面标志物抗体；
图8B利用流式细胞分析对微环游离型载体实验组的hiPSC(第10代)细 胞表面标志物TRA-1-81的检测，其中浅灰色线条为同种抗体阴性对照，黑 线为hiPSC细胞表面标志物抗体；
图9是利用qRT-PCR检测微环游离型载体实验组的hiPSC(第10代)多 能性基因OCT4+/NONOG+的表达；
图10是对微环游离型载体实验组的hiPSC(第10代)进行染色体核型检 测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做具体说明。
实施例1微环DNA亲本质粒的构建思路
本发明微环DNA亲本质粒构建策略图如图1所示。图中微环DNA亲本质 粒中的attB为重组酶Ф31的细菌附着位点；attP为噬菌体附着位点； 32×Sce-I sites是含有32个连续的I-SceI限制性酶切位点；pUC ORI质 粒复制起点；Kan R卡那霉素抗性基因；SV40poly-A是猿猴空泡病毒PolyA 加尾信号；Transgene表示插入的外源基因核苷酸序列；P为外源基因表达 盒的启动子，一般为常规启动子，较佳地为真核启动子，更加地为pEF1α 启动子或CMV启动子。微环DNA亲本质粒在宿主菌内发生位点特异性重组的 过程为：微环DNA亲本质粒具有attB位点和attP位点，在阿拉伯糖的诱导 下，该attB位点和attP位点能在Ф31重组酶的作用下进行重组，使得微 环DNA亲本质粒非可逆地产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含attR位 点的微环DNA，含attR位点的微环DNA不含原核质粒序列，也不含质粒骨架 中所见的表达沉默序列，且能游离于人及哺乳动物细胞染色体DNA外高效表 达外源基因表达盒；含有attL位点的细菌质粒DNA环则被I-SceI酶切为线 性DNA，继而被宿主菌降解，便于微环DNA的分离提纯。
相对于染色体整合的长期异源基因表达，基于BK病毒、牛乳头瘤病毒 -1、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)或Epstein-Barr病毒 (Epstein-Barr virus，EBV)成分和支架/基质附着区(scaffold/matrix attachment region，S/MAR)元件而建立的游离型载体是非染色体整合的外 源基因长期表达的良好选择。其中，基于EBV成分的OriP/EBNA1游离型载 体已被广泛用于iPSC的生成，该附加型携带复制起点(origin of replication，OriP)和顺式作用EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1， EBNA1)元件。其中，OriP由重复序列家族(family of repeats，FR)和二 重对称(dyad symmetry，DS)元件构成，DS区域通过EBNA1蛋白的螺旋- 转角-螺旋结构域与之发生结合。
本发明结合微环DNA载体和OriP/EBNA1游离型载体的各自优势，提供 一种微环游离型载体重编程血细胞生成hiPSC的方法，提供的微环DNA亲本 质粒无编码ФC31重组酶和I-SceI内切酶的核苷酸序列，其制备的微环DNA 亲本质粒更加优质，少了重组内切酶和I-SceI内切酶的核苷酸的污染；但 是需配套使用ZYCY10P3S2T工程菌，因为无编码ФC31重组酶和I-SceI内 切酶核苷酸序列的微环DNA亲本质粒需要具有编码ФC31重组酶和I-SceI内切酶功能的ZYCY10P3S2T工程菌才能产生体内位点特异性重组(而大肠埃 希氏DH5α或TOP10无此功能)并最终生产微环DNA。将本发明的具有attB 位点和attP位点的微环DNA亲本质粒转化至ZYCY10P3S2T工程菌中，在阿 拉伯糖的诱导下，该attB位点和attP位点在Ф31重组酶的作用下进行重 组，使得微环DNA亲本质粒产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含attR 位点的微环DNA，所述含有attL位点的细菌质粒DNA环则被I-SceI酶切为 线性DNA，继而被宿主均降解，便于微环DNA的分离提纯。所述含attR位点 的微环DNA基本上不含有除重组酶杂交产物序列和外源基因序列(即被转录 序列)及表达所需的调控序列以外的载体序列。如附图2所示，本发明构建 的含OriP/EBNA1系统的微环DNA质粒分别为：pMEP4-E-AxOct4、 pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET,相对于亲本质粒的长度，全长含有所需元件 的微环DNA长度变小，如通过全身给予血细胞时，显著提高接触血细胞时进 入血细胞的能力，提高了重编程因子的转染效率，则相应提高血细胞重编程 为hiPSC的效率。
本发明所述的含OriP/EBNA1系统的微环DNA不会稳定地整合到血细胞 DNA中。含OriP/EBNA1微环DNA无需药物筛选，每个细胞分裂周期中就有 2％-8％的载体成分发生丢失，一段时间后，细胞中载体成分即被删除；因此， 本发明的含OriP/EBNA1系统的微环DNA载体能够实现有效传递重编程因子 且高效重编程为iPSC。获得的hiPSC无外源基因整合、无外源病毒感染风险、 制备简单、安全性更高，能适用于各种疾病的细胞疗法和临床科研研究。
实施例2 pMEP4-E-AxOct4、pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET微环DNA 亲本质粒的构建
通过以下方案构建微环DNA亲本质粒
S1、通过商业化公司合成含有attB、attP、30×I-SceI限制性内切酶 酶切位点序列的微环DNA空质粒。
S2、分别对附图2所示的pEP4-E-AxOct4、pEP4-ESCLM2L和pEP4-ENET 游离型载体进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，分别得到酶切 后的大小不同的核苷酸片段。
S3、采用T4 DNA连接酶将所得酶切后的核苷酸片段插入微环DNA空质 粒中，在4℃下进行连接过夜或者室温下连接1小时，然后将连接产物加入 E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在含有氨苄青霉素 的LB平板上37℃静置培养过夜，挑取单菌落进行重组质粒载体的酶切验证； 选取酶切结果验证的阳性克隆，进行测序验证，分别获得含OriP/EBNA1系 统微环DNA亲本质粒：pMEP4-E-AxOct4、pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET，其序列大小分别为13.5kb、14.1kb、14.5kb。
上述微环DNA亲本载体上包含至少一个内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry size，IRES)，其中第一个载体依次包含attP位点、抗性 基因、pUC质粒复制起点、30×I-SceI限制性内切酶酶切位点的重复序列、 attB位点、第一启动子、AxOc4、第二启动子、HcRed，其中第二个载体依次 包含attP位点、抗性基因、pUC质粒复制起点、30×I-SceI重复序列、attB 位点、第三启动子、SOX2、第四启动子、MYCL、IRES2、LIN28A、并且其中 第三个载体依次包含attP位点、抗性基因、pUC质粒复制起点、30×I-SceI 重复序列、attB位点、第五启动子、NANOG、第六启动子、SV40LT。第一、 第三、第五和第六启动子均是延伸因子1α(EF1α)基因启动子，第二启动 子、第四启动子是巨细胞病毒(Cytomegalovrus,CMV)启动子。抗性基因 表示氨苄青霉素标记基因；HcRed表示红荧光蛋白的编码序列；“ESCLM2L” 是指一种具有位于SOX2编码区下游、MYCL及LIN28A编码区上游且其间有 IRES2的CMV启动子的表达序列。“ENET”是指一种具有位于NANOG和 SV40LT编码区上游且其间EF1α启动子的表达序列。
实施例3 pMEP4-E-AxOct4、pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET微环DNA 的制备
通过以下方案构建微环DNA亲本质粒
S1、用实施例2构建的pMEP4-E-AxOct4、pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET 微环DNA亲本质粒在37℃条件下转化ZYCY10P3S2T工程菌，并静置培养14～ 16h；
S2、从S1所得含微环DNA亲本质粒的工程菌挑取单克隆悬浮培养过夜； 过夜后加等体积的含有阿拉伯糖的新鲜LB培养基，所述阿拉伯糖最终质量 体积浓度为0.1％，即在1L水溶液中含有1g阿拉伯糖，在温度为32℃，摇 晃频率为250次/分钟的条件下孵育4小时，诱导ZYCY10P3S2T工程菌表达 ФC31整合酶和限制性内切酶I-SceI；
S3、使微环DNA亲本质粒与上述ФC31整合酶接触，从而发生位点特异 性重组产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含有attR位点的微环DNA， 其中，含有attR位点的微环DNA即为微环游离型载体；限制性内切酶I-SceI 作用于上述含attL位点的细菌质粒DNA中的I-SceI核苷酸序列，进而引起 细菌DNA的降解；含有attR位点的微环DNA成为唯一的染色体外环状DNA， 由亲和柱提取，得到含OriP/EBNA1系统的微环DNA，即pMEP4-E-AxOct4、pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET，序列大小分别为10.8kb、11.3kb、11.8kb。
如附图3所示，获得的pMEP4-E-AxOct4依次包含attR位点、第一启动 子、AxOct4、第二启动子、HcRed，pMEP4-ESCLM2L依次包含attR位点、第 三启动子、SOX2、第四启动子、MYCL、IRES2、LIN28A、pMEP4-ENET依次包 含attR位点、第五启动子、NANOG、第六启动子、SV40LT；其中第一、第三、 第五和第六启动子均是延伸因子1α(EF1α)基因启动子，第二启动子、第 四启动子是巨细胞病毒(Cytomegalovrus,CMV)启动子。HcRed表示红荧光 蛋白的编码序列；“ESCLM2L”是指一种具有位于SOX2编码区下游、MYCL 及LIN28A编码区上游且其间有IRES2的CMV启动子的表达序列。“ENET” 是指一种具有位于NANOG和SV40LT编码区上游且其间EF1α启动子的表达 序列。
实施例4：一种含OriP/EBNA1系统的微环DNA重编程血细胞生成多能干细 胞的方法
1、红细胞祖细胞单核细胞的原代分离与培养、鉴定
a、红细胞祖细胞单核细胞的原代分离与培养
采集至少10μl的血样，转移到淋巴细胞分离管中，离心，取单核细胞 层，该单核细胞群包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细 胞、红细胞祖细胞等，用DPBS离心洗涤两遍，取样计数，根据计数结果取 3×106细胞分3孔接种于6孔板中，加红细胞祖细胞扩增培养基2ml/孔， 置于37℃、5％CO2培养箱中培养。分别于扩增第4天和第8天每孔补加2ml 新鲜的扩增培养基。
本实施例的扩增培养基，具体配方为：每升扩增培养基包含ITS添加剂 10ml、GlutaMAX 10ml、Lipid Concentrate 1ml、L-抗坏血酸2-磷酸化半 镁盐水合物250μmol、硫酸亚铁3μmol、硝酸铁0.2μmol、硫辛酸1μmol、 氢化可的松1μmol、干细胞因子100μg、促红细胞生成素20μg、白细胞介 素-3 5μg、剩余补充IMDM基础培养基。
b、红细胞祖细胞的鉴定
培养红细胞祖细胞第10天时，利用流式细胞术检测其表面分子CD71和 CD235a的表达情况，分别检测其阳性率和平均荧光强度指标，实验结果如 附图5所示，数据显示红细胞祖细胞特异性标志CD71+比例占98.1％，CD235a+ 比例占76.2％。
2、游离型载体诱导重编程
a、待上述红细胞祖细胞扩增6～16天后，取0.5～4×106细胞于转染 杯中，共为2组，其中1组为含OriP/EBNA1系统微环DNA试验组(简写为 MC-OriP/EBNA1)，将携带重编程因子的微环DNA质粒pMEP4-E-AxOct4、 pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET＝1:1:1电转染上述细胞中。另1组为 OriP/EBNA1游离型载体对照组(简写为OriP/EBNA1)，电转染携带重编程因子的质粒pEP4-E-AxOct4：pEP4-ESCLM2L：pEP4-ENET＝1:1:1，将携带重编程 因子的质粒分别电转染上述2组细胞中，之后将上述2组细胞接种于 Matrigel或玻连蛋白或其它细胞基质包被的96,48,24,12或6孔板中进 行培养，整个操作流程图如附图4所示。
b、48小时后更换新鲜的多能干细胞诱导培养基，继续培养至10天，隔 天进行换液，添加与起始培养基同样体积的新鲜的多能干细胞诱导培养基， 即在无饲养层体系上进行重编程。
本实施例的多能干细胞诱导培养基，其组分为：在每升实施例2红细胞 祖细胞扩增培养基的基础上添加一种或多种以下小分子：CHIR99021 3μmol、A-83-01 0.5μmol和PD0325901 0.5μmol。
3、重编程细胞的维持培养
10天后，将诱导多能干细胞更换为多能干细胞培养基，继续培养。重编 程15天后，挑取形态类似于人胚胎干细胞的克隆至新的培养皿中进行扩增。
干细胞培养基：本实施例的干细胞培养基选自TeSR1和E8培养基中的 任意一种。
实施例4：目的hiPSC的鉴定
1.方法
1.1 hiPSCs的重编程效率
培养至15天时分别对电转染pMEP4-E-AmOct4、pMEP4-ESCLM2L和 pMEP4-ENET微环DNA实验组和电转染pEP4-E-AmOct4：pEP4-E-SCLM2L： pEP4-ENET对照组的iPSC克隆进行计数，经计数实验组每120万个起始红细 胞祖细胞中可获得4514个诱导多能干细胞克隆；对照组每120万个起始红 细胞祖细胞中可获得275个诱导多能干细胞克隆。其实验结果见图6，图6 是iPSC效率差异的统计图，该图表明：微环游离型载体(MC-OriP/EBNA1)比 非微环游离性载体(OriP/EBNA1)可以明显地提高iPSC诱导效率。
1.2 hiPSC的细胞形态
通过显微镜观察电转染pMEP4-E-AmOct4、pMEP4-ESCLM2L和pMEP4-ENET 实验组获得的hiPSC细胞在第1、2、3、4天中形态的变化过程，并对其拍照 保存(实验结果如附图7所示)，显微镜的比例尺(Scale bar)为200μm。
1.3 hiPSC细胞表面标志物的检测
采用培养至第10代的hiPSC细胞(微环DNA实验组)，用Accutase收 集细胞密度达80-90％的hiPSC，离心弃上清，重悬后加入SSEA-4-PE、 TRA-1-81-PE以及相应Isotype，避光孵育，加FACS buffer，重悬离心弃上 清，再加入FACS buffer重悬，使用流式细胞仪进行分析(实验结果如附图 8所示)，其中灰色线条为同种抗体阴性对照，黑线为hiPSC细胞表面标志 物抗体。
1.4 hiPSC的多能性基因鉴定情况
采用培养至第10代的hiPSC细胞(微环DNA实验组)，分别提取各hiPSC 以及原代间充质干细胞(阴性对照组)的总RNA，将总RNA反转录为cDNA， 用多能性基因引物POU5F1(OCT4)、NANOG进行QPCR，导出数据并分析。(实 验结果如附图9)。
1.5 hiPSC的核型鉴定：采用培养至第10代的hiPSC(微环DNA实验组)， 待hiPSC融合度为80％～90％时，加入秋水仙碱处理细胞3小时，后用 Accutase消化细胞，离心收集细胞，用KCl溶液重悬细胞，加入新鲜配制的 固定液(冰乙酸：甲醇＝1:3)固定细胞，重复固定1次，离心，用固定液 重悬细胞后滴于玻片上，置烘箱烘烤。将玻片置于2.5g/L胰蛋白酶消化液 处理10s，Giemsa染液染色10min，室温晾干后在显微镜下观察分裂中期相 染色体，并用IMSTAR全自动智能染色体核型扫描分析系统对染色体进行分 析。(实验结果如附图10所示)
2.结果：
含OriP/EBNA1系统微环DNA实验组的hiPSC克隆挑出来后进行扩增和 传代，传代后得到的iPSC克隆细胞仍保持高核质比，轮廓清晰、中心紧凑 (图7D)。显微镜(Scale bar：200μm)观察获得的hiPSC在第1、2、3、 4天中形态的变化过程，hiPSC由梭形转变为圆形，聚集成团，核质比增大， 中心部分排列紧密(图7B)。4天时可见成簇的iPSC团形成。
含OriP/EBNA1系统微环DNA实验组的hiPSC(第10代)表达多能性细 胞表面标志物SSEA-4、与TRA-1-81(图8A、图8B)；含OriP/EBNA1系统 微环DNA实验组的hiPSC(第10代)PCR结果显示其表达细胞多能性相关基 因POU5F1、NANOG(图9)；该含OriP/EBNA1系统微环DNA实验组的hiPSC (第10代)可以维持正常的核型(图10)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参 照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术 特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同 替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；
S2、将表达外源重编程因子的微环游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；
S3、将S2中获取的含有表达外源重编程因子的微环游离型载体红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；
S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得外源重编程因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC。
2.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环游离型载体为包含单向位点特异性重组酶的产物杂合序列且不含原核质粒元件的环状DNA。
3.根据权利要求2所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶及其作用位点选自Cre重组酶/LoxP、Flp重组酶/FRT、ФC31整合酶/attB/attP中任意一种。
4.根据权利要求3所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述的单向位点特异性重组酶是ФC31整合酶，其整合酶作用的重组位点为attB和attP。
5.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环游离型载体包括依次连接的DNA复制启动子以及作用于该DNA复制启动子的反式作用因子、转录调控元件、重编程因子编码序列和polyA加尾信号。
6.根据权利要求5所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi's肉瘤疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP。
7.根据权利要求5所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1或其衍生物。
8.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述外源重编程因子选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。
9.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述外源重编程因子选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28A、MYCL和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。
10.根据权利要求8或9所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述OCT4转录因子为非哺乳动物中蝾螈Oct4蛋白。
11.根据权利要求8或9所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述NANOG、SOX2、LIN28A、MYCL和SV40LT转录因子为人源因子。
12.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述人类血液细胞来源于人外周血、脐带血和骨髓血中的任意一种。
13.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述S1中的扩增培养基、S3中的多能干细胞诱导培养基和S4中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。
14.一种如权利要求4所述的微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环游离型载体的制备方法包括如下步骤，
S1、用微环DNA亲本质粒转化宿主菌，该宿主菌内含有表达单向位点特异性重组酶的基因，该微环DNA亲本质粒中包含用于诱导红细胞祖细胞成为多能干细胞的外源重编程因子；
S2、诱导S1中宿主菌内单向位点特异性重组酶的表达；
S3、使S1中的微环DNA亲本质粒与S2中的单向位点特异性重组酶接触，发生位点特异性重组产生微环游离型载体。
15.根据权利要求14所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环DNA亲本质粒还含有细菌序列。
16.根据权利要求14所述的一种微环游离型载体的制备方法，其特征在于，所述微环DNA亲本质粒还含有被宿主菌内单向位点特异性重组酶识别的attB和attP位点，以及被宿主菌内的限制性内切酶识别的限制性酶切位点，其中，所述attB和attP位点分别位于微环DNA亲本质粒的上下游。
17.根据权利要求16所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，
所述S1的具体步骤为采用微环DNA亲本质粒在37℃条件下转化ZYCY10P3S2T工程菌，并静置培养14～16h；
所述S2的具体步骤为将S1所得含微环DNA亲本质粒的工程菌挑取单克隆悬浮培养过夜；过夜后加等体积的含有阿拉伯糖的新鲜LB培养基，所述阿拉伯糖最终质量体积浓度为0.1％，在温度为32℃，摇晃频率为250次/分钟的条件下孵育4小时，诱导ZYCY10P3S2T工程菌表达ФC31整合酶；
所述S3的具体步骤为使微环DNA亲本质粒与上述ФC31整合酶接触，从而发生位点特异性重组产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含有attR位点的微环DNA，其中，含有attR位点的微环DNA即为微环游离型载体。
18.根据权利要求14所述的微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环DNA亲本质粒采用如下方法制备，
S1、合成含有attB、attP、30×I-SceI限制性内切酶的酶切位点序列的微环DNA空质粒；
S2、对包含外源重编程因子的游离型载体进行双酶切，得到大小不同的核苷酸片段；
S3、采用T4DNA连接酶将S2中得到的大小不同的核苷酸片段插入S1中的微环DNA空质粒中，在4℃下连接过夜或者室温下连接1小时，然后将连接产物加入E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，在37℃条件下静置培养过夜，获得含外源重编程因子的的微环DNA亲本质粒。
19.一种如权利要求1-9、12和13中任一项微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，通过该方法获取的iPSC无外源基因成分，适用于细胞再生医疗的临床前研究和临床应用。
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