CN108048484A - 诱导性多能干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，并通过细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程，得到诱导性多能干细胞。实验结果表明，将Erbin基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞中，可以提高人iPS细胞的重编程效率，并且获得的iPS细胞可以在体外培养传代中长期维持多能性，解决了传统iPS重编程方法存在的重编程效率低、传代过程中易分化的缺陷。

Description

诱导性多能干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS细胞)，是指体细胞经导入多能遗传基因或在其他诱导因子的作用下进行基因的重新编排，从而得到的具有多向分化潜能的干细胞。2006年8月，日本京都大学Yamanaka研究小组将Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(OSKM)这4个基因转入小鼠成纤维细胞，首次将体细胞直接重编程为胚胎干细胞样的多潜能干细胞，标志着体细胞重编程为iPS细胞技术的诞生。2007年底，Yamanaka小组和Thomson小组先后成功将人成纤维细胞重编程为iPS细胞。这项研究对于人类干细胞领域的研究和应用起到了巨大的推动作用，它规避了胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)异体移植免疫排斥的风险以及ESCs所带来的伦理学问题等，使得iPS细胞在再生医学领域展现出广阔的应用前景。
尽管iPS细胞有着诱人的应用前景，然而在整个iPS研究过程中，iPS转化效率低以及易分化现象始终是研究中较大的障碍。在此前的常规转化方法中，利用逆转录病毒将人类皮肤细胞转换为iPS细胞的效率约为0.01％，而且这一过程可能需要数周时间。主要原因可能是转染是一种相对随机且不易控制的过程，目的基因的整合位点、插入的拷贝数等都无法人为掌控。很可能导入的每种因子的表达水平都必须合适才能让细胞发生重编程，而这种合适的水平可能范围又很窄，因此，这种随机的基因导入方式导致只有很少的细胞才具备发生重编程的条件。并且iPS细胞克隆传代时，细胞易发生分化和凋亡，很难扩增培养。
综上，传统的方法制备iPS细胞时重编程效率低，制得的iPS细胞稳定性差。
发明内容
基于此，有必要提供一种重编程效率高、制得的iPS细胞稳定性好的制备方法。
此外，还有必要提供一种iPS细胞及其应用。
一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；以及
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞。
在一个实施方式中，所述向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因的步骤包括：
将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为30％～80％；以及
用携带转录因子的慢病毒以及携带Erbin基因的慢病毒感染所述皮肤成纤维细胞，细胞培养使得所述转录因子以及所述Erbin基因导入所述皮肤成纤维细胞中。
在一个实施方式中，所述携带Erbin基因的慢病毒通过如下方法制备得到：
利用限制性内切酶酶切表达质粒pSin4-EF2-Oct4，得到空载体pSin-EF2；
将Ebin基因插入所述空载体pSin-EF2内，得到pSin-EF2-Erbin质粒；以及
将所述pSin-EF2-Erbin质粒转染293T细胞，培养转染后的所述293T细胞并收集培养上清，得到所述携带Erbin基因的慢病毒。
在一个实施方式中，所述细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤包括：
将人类重组层粘连蛋白和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将所述混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除所述混合液，得到混合液包被后的培养皿；
将导入了转录因子以及Erbin基因后的所述皮肤成纤维细胞加入到包被后的所述培养皿中，继续培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到所述诱导性多能干细胞。
在一个实施方式中，所述皮肤成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。
一种诱导性多能干细胞，通过如上述任一项所述的诱导性多能干细胞的制备方法制备得到。
如上述任一项所述的诱导性多能干细胞的制备方法或如上述所述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
一种体外制备软骨细胞的方法，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述软骨细胞。
一种体外制备脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成脂肪诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述脂肪细胞。
一种体外制备心肌细胞的方法，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成心肌诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述心肌细胞。
上述iPS细胞的制备方法，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因。其中转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。实验结果表明，Erbin基因与OSKM转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)一起导入皮肤成纤维细胞中，可以大大提高人iPS细胞的重编程效率，其重编程效率是传统OSKM四转录因子导入法的17.1倍，并且获得的iPS细胞可以在体外培养传代中长期维持多能性，解决了传统iPS重编程方法存在的重编程效率低、传代过程中易分化的缺陷。综上，上述iPS细胞的制备方法能够实现从皮肤成纤维细胞制备iPS细胞，制备 iPS细胞时重编程效率高，制得的iPS细胞稳定性好。
附图说明
图1为实施例1中pSin4-EF2-Oct4质粒酶切电泳图；
图2为实施例1中pSin-EF2-Erbin质粒酶切电泳图；
图3为实施例3中OSKIM感染组和OSKIM+Erbin感染组制备iPS重编程效率对比图；
图4为实施例3中OSKIM感染组和OSKIM+Erbin感染组制备的iPS克隆传代10次后对比图；
图5为实施例3中OSKIM感染组和OSKIM+Erbin感染组制备的iPS克隆的碱性磷酸酶染色结果对比图；
图6为实施例3中OSKIM感染组和OSKIM+Erbin感染组制备的iPS细胞 RT-PCR产物的电泳检测条带对比图；
图7为实施例4中OSKIM感染组的iPS和OSKIM+Erbin感染组的iPS诱导形成的软骨细胞的免疫荧光染色对比图；
图8为实施例5中OSKIM感染组的iPS和OSKIM+Erbin感染组的iPS诱导形成的脂肪细胞的油红O染色对比图；
图9为实施例6中OSKIM感染组的iPS和OSKIM+Erbin感染组的iPS诱导形成的心肌细胞的免疫荧光染色对比图；
图10为对iPS性能测定时，PCR的反应条件流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的诱导性多能干细胞(iPS)的制备方法，包括以下步骤 S110～S120。
S110、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。
在一个实施方式中，皮肤成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。通过本实施方式的iPS的制备方法能够实现从人皮肤成纤维细胞重编程形成人iPS细胞，且重编程效率高。
其中，Erbin基因是一个新型的基因，位于人类5号染色体长臂，其表达的蛋白简称Erbin蛋白(Erb B2-interacting protein)。
本实施方式中，Erbin基因的序列参见NCBI数据库NM_001253697.1。
Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子的组合，简称OSKM，将OSKM 导入体细胞中，能够将体细胞直接重编程为胚胎干细胞样的多潜能干细胞(iPS)。
在一个实施方式中，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因步骤包括以下操作S111～S112。
S111、将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为30％～80％。
具体地，汇合度是指细胞在瓶中增殖时，出现在细胞间的粘连和排列状态汇合程度，汇合度为30％～80％有利于目的基因的转染。
S112、用携带转录因子的慢病毒以及携带Erbin基因的慢病毒感染皮肤成纤维细胞，细胞培养使得转录因子以及Erbin基因导入皮肤成纤维细胞中。
使用慢病毒载体将转录因子以及Erbin基因导入皮肤成纤维细胞中，导入的效率高。当然，在其他实施方式中，还可以使用其他方式，如将腺病毒作为载体将转录因子以及Erbin基因导入成纤维细胞中。
在一个实施方式中，携带Erbin基因的慢病毒通过如下方法制备得到：利用限制性内切酶酶切慢病毒表达质粒pSin4-EF2-Oct4，得到空载体pSin-EF2。将Ebin基因插入空载体pSin-EF2内，得到pSin-EF2-Erbin质粒。然后将 pSin-EF2-Erbin质粒转染293T细胞，培养转染后的293T细胞并收集培养上清，得到携带Erbin基因的慢病毒。
在一个实施方式中，携带转录因子的慢病毒表达质粒为pSin-EF2-OKSIM(Addgene，124603)。
S120、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程，得到诱导性多能干细胞。
在一个实施方式中，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤包括：将人类重组层粘连蛋白(Laminin-521)和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除混合液，得到混合液包被后的培养皿。将导入了转录因子以及Erbin基因后的皮肤成纤维细胞加入到包被后的培养皿中，继续培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到诱导性多能干细胞。
一实施方式的诱导性多能干细胞(iPS)，通过上述的诱导性多能干细胞(iPS) 的制备方法制备得到。
具体地，该诱导性多能干细胞(iPS)来源于人皮肤成纤维细胞。
上述iPS细胞的制备方法，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因。其中转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。实验结果表明，Erbin基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞中，可以大大提高人iPS细胞的重编程效率，其重编程效率是传统OSKM四基因导入法的17.1倍，并且获得的iPS 细胞可以在体外培养传代中长期维持多能性，解决了传统iPS重编程方法存在的重编程效率低、传代过程中易分化的缺陷。
虽然为什么Erbin基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞中能够提高iPS细胞的重编程效率以稳定性的原理尚未完全确认。猜测可能是Erbin基因可以抑制上皮间质转化(EMT)，即抑制细胞基质间自由移动呈现纤维样表型的转化过程。而皮肤成纤维细胞是诱导性多能干细胞(iPS)重编程中常用的体细胞，属于典型的间充质细胞。皮肤成纤维细胞重编程形成iPS，某种意义上说就是让间充质细胞向上皮细胞转化的过程。因此在iPS重编程过程中通过Erbin抑制EMT相关的分子信号通路，理论上应该能间接促进皮肤成纤维细胞向iPS细胞的重编程，提高iPS细胞的重编程效率以稳定性。
综上，上述iPS细胞的制备方法，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及 Erbin基因能够实现从皮肤成纤维细胞制备iPS细胞，制备iPS细胞时重编程效率高，制得的iPS细胞在传代培养时不容易发生分化，稳定性好。
一实施方式的上述诱导性多能干细胞的制备方法或上述诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
具体地，医用功能材料可以为软骨、脂肪或心肌等。
一实施方式的体外制备软骨细胞的方法，包括以下步骤S210～S230.
S210、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。
具体地，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因的步骤可参见上文步骤S110。
S220、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程，得到诱导性多能干细胞。
具体地，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤可参见上文步骤 S120。
S230、将诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得诱导性多能干细胞分化得到软骨细胞。
在一个实施方式中，成软骨诱导分化培养基包括基础培养基以及成软骨生长因子。将成软骨生长因子加入到基础培养基中配制成软骨诱导分化培养基。
具体地，基础培养基为DMEM培养基，成软骨生长因子包括FBS(胎牛血清)、丙酮酸钠、维生素C-2磷酸钠、地塞米松、ITS细胞培养添加物(成分包括胰岛素(Iusulin)、人转铁蛋白(human transferrin)、亚硒酸(selenous acid))和 TGF-β1(转化生长因子-β1)。FBS在成软骨诱导分化培养基中的体积分数为 5％v/v～15％v/v，丙酮酸钠在成软骨诱导分化培养基中的浓度为 80mg/L～150mg/L，维生素C-2磷酸钠在成软骨诱导分化培养基中的浓度为 0.05mmol/L～0.5mmol/L，地塞米松在成软骨诱导分化培养基中的浓度为 50mmol/L～200mmol/L，ITS在成软骨诱导分化培养基中的体积分数为 0.5％v/v～2％v/v，TGF-β1在成软骨诱导分化培养基中的浓度为5ng/mL～20ng/mL。
具体地，将诱导性多能干细胞(iPS细胞)置于培养瓶中，加入成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养3天。分化第4、7、10、13、 16、19天换液，即弃去培养瓶中的旧培养液，添加新的成软骨诱导分化完全培养基。继续置于5％CO2、37℃培养箱中培养3天。分化培养第22天，软骨细胞已分化完全。
上述体外制备软骨细胞的方法，由Erbin基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞制备得到的iPS细胞分化得到。实验结果表明，该iPS细胞诱导的软骨细胞标志物Collagen II的表达量明显提高。
一实施方式的体外制备脂肪细胞的方法，包括以下步骤S310～S330。
S310、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。
具体地，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因的步骤可参见上文步骤S110。
S320、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程，得到诱导性多能干细胞。
具体地，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤可参见上文步骤 S120。
S330、将诱导性多能干细胞置于成脂肪诱导分化培养基中培养使得诱导性多能干细胞分化得到脂肪细胞。
在一个实施方式中，成脂肪诱导分化培养基包括基础培养基以及成脂肪生长因子。将成脂肪生长因子加入到基础培养基中配制成脂肪诱导分化培养基。
具体地，基础培养基为DMEM培养基，成脂肪生长因子包括FBS(胎牛血清)、IBMX(3-Isobutyl-1-Methylxanthine)、地塞米松以及胰岛素。FBS在成脂肪诱导分化培养基中的体积分数为5％v/v～15％v/v，IBMX在成脂肪诱导分化培养基中的浓度为0.05mmol/L～0.1mmol/L，地塞米松在成脂肪诱导分化培养基中的浓度为50mmol/L～200mmol/L，胰岛素在成脂肪诱导分化培养基中的浓度为 5μmol/L～20μmol/L。
具体地，将诱导性多能干细胞(iPS细胞)置于培养瓶中，加入成脂肪诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。第1天、第3天、第5天换液，即弃去培养瓶中的旧培养液，添加新的成脂肪诱导分化完全培养基。分化培养第7天，脂肪细胞已分化完全。
上述体外制备脂肪细胞的方法，由Erbin基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞制备得到的iPS细胞分化得到。实验结果表明，该iPS细胞诱导的成熟脂肪细胞的数量明显提高。
一实施方式的体外制备心肌细胞的方法，包括以下步骤S410～S430。
S410、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。
具体地，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因的步骤可参见上文步骤S110。
S420、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程，得到诱导性多能干细胞。
具体地，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤可参见上文步骤 S120。
S430、将诱导性多能干细胞置于成心肌诱导分化培养基中培养使得诱导性多能干细胞分化得到心肌细胞。
在一个实施方式中，成心肌诱导分化培养基包括基础培养基以及成心肌生长因子。将成心肌生长因子加入到基础培养基中配制成心肌诱导分化培养基。
具体地，基础培养基为RPMI 1640培养基，成心肌生长因子包括B27细胞培养添加剂(B27minus insulin supplement)。
具体地，成心肌分化培养基1#的组分如下：RPMI 1640(with L-glutamine)+1％v/v～5％v/vB27minus insulin supplement。
成心肌分化培养基2#的组分如下：RPMI 1640(with L-glutamine) +1％v/v～5％v/v B27plus insulin supplement+1％v/v～5％v/vFBS。
将诱导性多能干细胞(iPS细胞)置于培养瓶中，加入成心肌诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。分化第1与第2天换液，即弃去iPS 培养板中的旧培养基，补加成心肌分化培养基1#，同时补加6uM CHIR-99021。分化第3、4天：全量更换新鲜的心肌分化培养基1#。分化第5、6天：全量更换新鲜的心肌分化培养基1#，同时补加5uM IWR-1。分化第7、8天：全量更换新鲜的心肌分化培养基1#。分化第9天：全量更换新鲜的心肌分化培养基2#。此后每两天全量更换新鲜的心肌分化培养基2#，直到观察到带收缩功能的心肌细胞出现。
上述体外制备心肌细胞的方法，由Erbin基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞制备得到的iPS细胞分化得到。实验结果表明，该iPS细胞诱导的心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T的表达量明显提高。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
慢病毒表达载体pSin-EF2-Erbin的构建
利用EcoR I和SpeI双酶切慢病毒表达质粒pSin4-EF2-Oct4(Addgene， 16579)，利用琼脂糖凝胶电泳将条带分开。酶切产物电泳图如图1所示，分别在大约7.5kb和1.1kb处有两条清晰条带。切胶回收7569bp片段(AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒)，该片段即为慢病毒表达空载体pSin-EF2，用于构建慢病毒表达质粒。
人工合成编码Erbin的基因(NM_001253697.1)，在5’端和3’端分别添加限制性酶切位点EcoR I和SpeI，将该基因片段克隆进慢病毒表达空载体pSin-EF2 中，构建得到慢病毒表达载体pSin-EF2-Erbin。构建的pSin-EF2-Erbin慢病毒表达质粒经过EcoR I和SpeI双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如图2 所示，分别在大约7.5kb和7kb处有两条清晰条带，与预期片段数和片段大小一致。证明Erbin基因成功插入到pSin4-EF2载体中。
实施例2
制备携带Erbin基因的慢病毒以及携带转录因子的慢病毒
按Invitrogen公司Lipofectamine 3000转染试剂盒使用说明，将 pSin-EF2-Erbin质粒与慢病毒包装质粒PMD2.G(Addgene，12259)转染293T 细胞，培养并收集培养上清，获得携带目的基因Erbin的慢病毒(Erbin慢病毒)
按Invitrogen公司Lipofectamine 3000转染试剂盒使用说明，将 pSin-EF2-OKSIM(Addgene，124603)与慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene， 12260)转染293T细胞，并收集培养上清，获得携带OKSIM的慢病毒(OKSIM 慢病毒)。其中pSin-EF2-OKSIM质粒含有Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc这四个基因，中间的I代表IRES，即内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES)，其作用是启动后续基因的翻译。
慢病毒制备的详细实验步骤如下：
(1)Day1：接种293T细胞至两个10cm培养皿中，5×106个/皿，于37℃， 5％CO2培养箱中过夜培养。
(2)Day3：按照lipo3000试剂盒说明书对293T细胞分别进行2种慢病毒表达质粒的转染，两个皿中加入的质粒如下：
1#皿：25μg PMD2.G、25μg psPAX2、40μg pSin-EF2-Erbin质粒；
2#皿：25μg PMD2.G、25μg psPAX2、40μg pSin-EF2-OKSIM质粒。
转染6h后，培养皿更换新鲜的无抗生素的293T完全培养基。
(3)Day5：收集培养皿中含慢病毒的细胞培养基，0.45um滤膜过滤后， 0.5mL/支分装，保存于-80℃冰箱中，原培养皿加入10mL新鲜的无抗生素的293T 完全培养基。
(4)Day6：用上述同样的方法再收集1次。
实施例3
皮肤成纤维细胞重编程制备诱导性多能干细胞(iPS)
1、接种细胞
Day-1：消化人原代皮肤成纤维(HDF)细胞，计数后取6×105个细胞接种至六孔板的六个孔中，2×105个细胞/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
实验共分三组，每组两个平行对照，各组设置如下表1所示。
表1：分组情况
第一组 第二组 第三组
阴性对照(1) OSKIM感染(1) OSKIM+Erbin感染(1)
阴性对照(2) OSKIM感染(2) OSKIM+Erbin感染(2)
2、慢病毒感染
(1)Day0：当孔中HDF细胞长满至50％汇合度时，将空白对照组其中一个孔的细胞消化下来计数，各孔换成无抗生素的HDF完全培养基，另外将第一次收集的慢病毒从-80℃冰箱中取出置于冰上解冻，按照上述各孔设置加入慢病毒溶液，②组每孔分别加入1mLOSKIM慢病毒溶液以及1mL无抗生素的HDF 完全培养基，③组每孔加入1mL OSKIM慢病毒溶液以及1mL Erbin慢病毒溶液，另外每孔分别加入8ug/mL polybrene，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
(2)Day1：弃去含慢病毒培养液，用第二次收集的慢病毒溶液按上述同样的方法再感染一次。
(3)Day2：弃去含慢病毒培养液，用新鲜的HDF完全培养基全量换液。
(4)Day4：用新鲜的HDF完全培养基全量换液。
(5)Day6：用新鲜的HDF完全培养基全量换液。另外，取出Laminin-521， 4℃解冻后，吸取3mL Laminin-521，用17mL含钙镁DPBS稀释，混合均匀后，加到4个10cm培养皿中，5mL/皿，封口膜封好后，平放至2-8℃冰箱中，过夜包被。
(6)Day7：将六孔板各孔中的细胞消化下来，离心后吸弃上清液，用10mL 人皮肤成纤维细胞培养基重悬后，接种至弃去包被液的10cm培养皿中，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
(7)Day8：弃去培养皿中的旧培养基，添加10mL新鲜的人iPS细胞完全培养基(NutriStem XF)继续培养。此后需要每天更换新鲜的人iPS细胞完全培养基。每隔一天在显微镜下观察胚胎干细胞(ESC)样克隆出现情况，同时记录各组出现的ESC样克隆数量。并统计iPS细胞重编程效率。
各组iPS细胞重编程效率的计算公式如下：
iPS重编程效率＝ESC样克隆数量÷病毒感染前细胞数量×100％。
各组iPS细胞重编程效率统计如图3所示。OSKIM感染组的iPS重编程效率为0.011％，而OSKIM+Erbin感染组的iPS重编程效率为0.188％，远远高于 OSKIM感染组，重编程效率是OSKIM感染组的17.1倍。
对iPS性能测定
1、iPS克隆传代
待培养孔中出现大的ESC样细胞克隆后，提前一天用Laminin-521包被12 孔板，封口膜封好后4℃包被过夜。使用前弃去包被液，每孔加入0.5mL人iPS 细胞完全培养基后，放入培养箱备用。挑选边缘清晰、无分化的克隆团，在显微镜下用5号胰岛素注射针头将一个克隆团划分成5-8块，再用200μl枪头吸取克隆团碎片，均匀滴入上述准备好的包被板中，一个iPS克隆单独转入一个培养孔，按克隆编号做好标记，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。48 小时后，用新鲜的人iPS细胞完全培养基全量换液。此后每天全量更换新鲜的人 iPS细胞完全培养基。
将OSKIM病毒感染组和OSKIM+Erbin病毒感染组获得的克隆分别经过10 次传代后，由显微拍摄，结果如图4，可以看出，OSKIM病毒感染组的克隆边缘发生分化形象(第一排)，而OSKIM+Erbin病毒感染组的iPS克隆仍然保持典型的ESC样克隆形态，克隆边缘清晰，未发生分化现象(第二排)，说明该组iPS 细胞的基因组更稳定，可长期增殖，并保持未分化状态。
2、碱性磷酸酶染色
(1)碱性磷酸酶染液配制
取100mM Tris-HCl 5mL+2滴试剂盒Reagent 1液+2滴试剂盒Reagent 2液 +2滴试剂盒Reagent 3液(VECTOR Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit，SK-5300，VectorLaboratories)，混合均匀后，即为碱性磷酸酶染液，避光保存备用。
(2)iPS克隆染色
弃去iPS检测孔中的培养基，用D-PBS洗两遍；加入4％多聚甲醛固定液，室温孵育15分钟；吸弃甲醛固定液，用D-PBS洗两遍；吸取足够剂量的染色剂加入细胞中，室温避光孵育30分钟；吸弃染色剂，用D-PBS洗两遍，再加入 D-PBS保持湿润，放在倒置显微镜下观察拍照。
由于iPS细胞具有碱性磷酸酶活性，利用Blue Substrate(VectorLaboratories，Cat.No.SK-5300)对传代10次后的iPS克隆进行染色，结果如图 5所示。若为未分化的iPS细胞，则会在细胞原位生成蓝色反应产物。由图5可以看出，OSKIM病毒感染组的克隆边缘发生分化的细胞没有染成蓝色，而 OSKIM+Erbin病毒感染组的iPS克隆均成功染上蓝色，初步判定为未分化的iPS 细胞。进一步说明OSKIM+Erbin病毒感染组的iPS克隆传代培养中不易分化，稳定性好。
3、iPS细胞基因表达水平检测
选取传代10次以后的iPS克隆，分别提取两组iPS细胞的总RNA，逆转录成cDNA后，利用相关引物扩增目的基因，最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。具体步骤如下：
3.1反转录获取cDNA
cDNA合成试剂盒：FastLine Cell cDNA kit，KR105，天根生化科技(北京) 有限公司。
3.1.1准备iPS细胞裂解物
(1)准备iPS细胞接种至24孔板中，培养至50％～80％覆盖率；
(2)吸掉细胞培养板中的培养基，每孔中加入500μl Buffer FCW，室温孵育5min；
(3)吸弃Buffer FCW，加入200μl Buffer FCP，室温孵育10min；
(4)用无RNA/DNA酶移液器吸头吹打细胞，吸取裂解物放入无RNA/DNA 酶PCR管中，置于-80度冰箱备用或者马上使用。
3.1.2去除gDNA
(1)按下表使用无RNA/DNA酶移液器吸头在无RNA/DNA酶PCR管中配制反应体系，反应体系参见表2所示，注意应在冰上操作：
表2：去除gDNA反应的反应体系
组分 体积
Wipeout Buffer(7x) 2μL
FastLine lysate 1μL～4μL
RNase-Free ddH2O 补足至14μL
总体积 14μL
(2)将上步中配制好的反应体系，置于PCR仪中，42℃孵育5min，孵育完后马上放于冰上。
3.1.3反转录
(1)按下表3的反应体系，使用无RNA/DNA酶移液器吸头配制反转录体系(应在冰上操作)
表3：反转录反应的反应体系
组分 体积
F-Quant Reverse Transcriptase 1μL
Quantiscript RT Bufer(5x) 4μL
RT Primer Mix 1μL
裂解物(上步所得) 14μL
总体积 20μL
(2)将上步中配制好的反应体系，置于PCR仪中42℃孵育30min，95℃孵育3min。
(3)反应结束后，PCR管中产物即为iPS细胞的cDNA，取样用微量紫外分光光度计检测DNA浓度。
3.2目的基因片段的扩增
(1)PCR反应体系，参见下表4所示。
表4：扩增目的基因片段的反应体系
组分 体积
CDNA样品 1μL
primer mix 2μL
2×Taq Master Mix 25μL
dd H2O 22μL
总体积 50μL
注意：SOX2、OCT3/4、LIN28三个基因的检测体系需分开配制。
(2)PCR反应条件(参见图10所示)
3.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物水平
配制1％浓度的琼脂糖凝胶，上样检测2.2中获得的PCR产物，凝胶成像仪进行拍照观察电泳结果，电泳条带图如图6所示。从图6可以得出看出，胚胎干细胞的3个标记基因(SOX2、OCT3/4、LIN28)在OSKIM感染组仅有Lin28 基因有表达，而在OSKIM+Erbin感染组则全部表达，证明OSKIM感染组的iPS 细胞为不完全重编程的细胞，而OSKIM+Erbin感染组的iPS细胞为正确重编程的iPS细胞。
实施例4
iPS细胞向软骨细胞的诱导分化
分别选取传代10次以后的两组iPS克隆，进行软骨方向的诱导分化。诱导后第21天，用免疫荧光染色法检测软骨细胞标志物Collagen II的表达情况。具体步骤如下：
(1)成软骨诱导分化完全培养基的配制
DMEM+10％FBS+110mg/L丙酮酸钠+0.15mM维生素C-2磷酸钠+100nM 地塞米松+1％ITS+10ng/mL TGF-β1。
(2)成软骨诱导分化
分化第1天：弃去iPS细胞培养容器中旧培养液，加入成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养3天。
分化第4、7、10、13、16、19天：弃去培养瓶中的旧培养液，添加新的成软骨诱导分化完全培养基。继续置于5％CO2、37℃培养箱中培养3天。
分化第22天：软骨细胞已分化完全。
(3)软骨细胞的鉴定
分化第22天，利用免疫荧光染色法(Anti-Collagen II抗体)检测iPS诱导分化获得的软骨细胞标志物Collagen II的表达情况。利用Leica倒置荧光显微镜进行拍摄，如图7所示。可以看出，OSKIM+Erbin感染组的iPS细胞所诱导的软骨细胞Collagen II(绿色荧光通道)的表达量明显高于OSKIM感染组。
实施例5
iPS细胞向脂肪细胞的诱导分化
分别选取传代10次以后的两组iPS克隆，进行脂肪方向的诱导分化。具体步骤如下：
(1)成脂肪诱导分化完全培养基的配制
DMEM+10％FBS+0.5mM IBMX+100nM地塞米松+10μM胰岛素。
(2)成脂肪诱导分化
分化第1天：弃去IPS细胞培养液，补加相应体积的成脂肪诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
分化第3、5天：弃去培养液，补加相应体积的成脂肪诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
分化第7天：脂肪细胞已分化完全。
(3)脂肪细胞的鉴定
1)清洗：弃掉培养液，DPBS洗2次；
2)固定：4％甲醛固定30min；
3)漂洗：弃甲醛，DPBS轻柔清洗一次；
4)染色：油红O工作液室温避光染色10分钟到1小时；
5)弃掉油红，DPBS轻柔洗3次，3min/次；
6)加入DPBS浸润(可长期保存)，显微镜拍照观察，显微拍摄如图8所示。可以看出，OSKIM+Erbin感染组的iPS细胞所诱导的成熟脂肪细胞的数量明显高于OSKIM感染组。
实施例6
iPS细胞向心肌细胞的诱导分化
分别选取传代10次以后的两组iPS克隆，进行心肌方向的诱导分化。具体步骤如下：
(1)心肌诱导分化培养基的配制
心肌分化培养基1#：RPMI 1640(with L-glutamine)+2％B27minus insulinsupplement；
心肌分化培养基2#：RPMI 1640(with L-glutamine)+2％B27plus insulinsupplement+2％FBS。
(2)心肌方向诱导分化
分化第1、2天：弃去iPS培养板中的旧培养基，补加心肌分化培养基1#，同时补加6uM CHIR-99021。
分化第3、4天：全量更换新鲜的心肌分化培养基1#。
分化第5、6天：全量更换新鲜的心肌分化培养基1#，同时补加5uM IWR-1。
分化第7、8天：全量更换新鲜的心肌分化培养基1#。
分化第9天：全量更换新鲜的心肌分化培养基2#。此后每两天全量更换新鲜的心肌分化培养基2#，直到观察到带收缩功能的心肌细胞出现。
(3)心肌细胞的鉴定
诱导后第12天，分化成熟的心肌细胞利用免疫荧光染色法(Anti-CardiacTroponin T antibody)检测心肌细胞标志物Cardiac Troponin T(心肌肌钙蛋白T) 的表达情况。利用Leica倒置荧光显微镜进行拍摄，如图9所示。可以看出， OSKIM+Erbin感染组的iPS细胞所诱导的心肌细胞肌钙蛋白T(绿色荧光通道) 的表达量明显高于OSKIM感染组。
以上实验结果表明，将Erbin基因与OSKM四基因共同导入人皮肤成纤维细胞制备人iPS细胞，其重编程效率是传统OSKM四基因导入法的17.1倍，大大提高了人皮肤成纤维细胞的重编程效率，且获得的iPS细胞在体外长期培养传代中没有发生分化现象，并长期维持多能性，可在体外诱导条件下向软骨、脂肪和心肌方向进行高效分化。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；以及
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因的步骤包括：
将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为30％～80％；以及
用携带转录因子的慢病毒以及携带Erbin基因的慢病毒感染所述皮肤成纤维细胞，细胞培养使得所述转录因子以及所述Erbin基因导入所述皮肤成纤维细胞中。
3.根据权利要求2所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述携带Erbin基因的慢病毒通过如下方法制备得到：
利用限制性内切酶酶切表达质粒pSin4-EF2-Oct4，得到空载体pSin-EF2；
将Ebin基因插入所述空载体pSin-EF2内，得到pSin-EF2-Erbin质粒；以及
将所述pSin-EF2-Erbin质粒转染293T细胞，培养转染后的所述293T细胞并收集培养上清，得到所述携带Erbin基因的慢病毒。
4.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤包括：
将人类重组层粘连蛋白和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将所述混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除所述混合液，得到混合液包被后的培养皿；
将导入了转录因子以及Erbin基因后的所述皮肤成纤维细胞加入到包被后的所述培养皿中，继续培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到所述诱导性多能干细胞。
5.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述皮肤成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。
6.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，通过如权利要求1～5任一项所述的诱导性多能干细胞的制备方法制备得到。
7.如权利要求1～5任一项所述的诱导性多能干细胞的制备方法或如权利要求6所述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
8.一种体外制备软骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述软骨细胞。
9.一种体外制备脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成脂肪诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述脂肪细胞。
10.一种体外制备心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及Erbin基因，其中，所述转录因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc；
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程，得到所述诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成心肌诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述心肌细胞。
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