CN101363010A - 肝芽干细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及肝芽干细胞，及其制备方法和用途。近年来干细胞生物学得到了迅猛的发展。肝干/祖细胞的分离培养及其深入研究对于肝脏发育、肝脏肿瘤和肝脏再生的发生机理以及多种肝脏疾病的防治都具有十分重要的价值。目前成功培养的肝干/祖细胞系是十分有限的。本发明是从孕4.5～6周的人胚肝芽组织中分离到的一种多潜能的干细胞，对于肝脏发育与再生等相关医学问题的认识具有重要意义，并为肝干细胞生物学的研究提供一个理想的细胞模型，也有可能为各种因素所致肝脏疾病的细胞治疗、药物的筛选、组织工程等多个领域的研究提供一种理想的细胞来源。

Description

肝芽干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及肝芽干细胞，及其制备方法和用途。

背景技术

近年来干细胞生物学得到了迅猛的发展。所谓干细胞，是指那些处于分化过程之中，具有分裂增殖能力，可自我更新，有多向分化潜能，即能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞。干细胞依其分化潜能的大小可分为：①胚胎干细胞，即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞，如囊胚内细胞团细胞。②成体干细胞，即具有自我更新能力，但通常只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的“专业”细胞，它是存在于成熟个体各种组织器官中的干细胞，如造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、角膜干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、肝脏干细胞等。在成体干细胞向终末成熟细胞分化的进程中，其分化潜能进一步限定，从而产生相应的祖细胞。

肝干/祖细胞的分离培养及其深入研究对于肝脏发育、肝脏肿瘤和肝脏再生的发生机理以及多种肝脏疾病的防治都具有十分重要的价值。一般意义上的肝干/祖细胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏原始细胞。由于肝干细胞在肝脏中存在的数量极少，再加上其分离培养的技术条件又十分特别等因素的缘故，目前成功培养的肝干/祖细胞系是十分有限的。而在成功培养的这些肝干/祖细胞系中，它们则主要来自大鼠或小鼠。

对于人的肝干细胞的研究则相对少得多。目前仅见有来源于人成体肝脏(Herrera MB等，2006)，或晚期胚胎肝脏的干细胞(Dan YY等，2006；Malhi H等，2002)，而尚未见有来源于早期胚胎肝脏的干细胞。肝原基于人胚发育的第4周开始出现，第6周肝脏开始造血。大概90％的成体肝脏结构在胚胎发育的第8周可见。如果能从早期人胚肝芽组织中分离得到多潜能的干细胞，将为肝干细胞生物学的研究提供一个理想的细胞模型，也有可能为各种因素所致肝脏疾病的细胞治疗、药物的筛选、组织工程等多个领域的研究提供一种理想的细胞来源。

发明内容

本发明的目的是提供一种从人早期胚胎肝芽组织中分离培养多潜能干细胞的方法，本发明的另一目的是提供根据上述方法制得的肝芽干细胞及其应用。

本发明的一种从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法，由以下步骤组成的：

A、原代培养物的建立：

取胎龄4.5至6周的流产人胚胎，以PBS充分洗涤后在解剖显微镜下分离出完整的胚胎肝脏，置于96孔板内以0.05％ Trypsin/EDTA消化约5分钟，然后加入改良IF培养液终止消化，静置后取悬液，置于铺有0.2％明胶的培养皿内，37℃、5％ CO₂、95％湿度条件培养；待3-4小时细胞贴壁后换液，以后隔天换液，每次均以PBS洗涤2-3次；

改良IF培养液是以IMDM培养基：HAM F12培养基＝1：1为基础培养基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、20ng/ml表皮细胞生长因子、1％非必需氨基酸、1mM GlutamaxTM和1％青/链霉素配制而成；

B、细胞传代培养：

在原代培养物生长两周以后，一种小三角形细胞出现优势克隆样生长，以无菌细胞刮去除其他形态的细胞，PBS充分洗涤后，用0.05％ Trypsin/EDTA消化至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，计数后以1×10⁴/cm²的密度接种至另一铺有0.2％明胶的培养瓶/皿中继续培养；每4～5天传代一次；

C、培养细胞的冻存与复苏：

a)细胞的消化与冻存：细胞长至约90％汇合时，PBS充分洗涤，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，1000r.p.m离心6分钟，弃去上清液，以10⁷个细胞/ml的比例加入冻存液，充分混匀后置于冻存管中密封，先置于4℃ 30-60分钟，后置于-70℃ 10-14小时，最后置于液氮罐中保存；

冻存液是以冻存原液和步骤A中配制的改良IF培养液各一份混匀而成，冻存原液是以改良IF培养液：胎牛血清：二甲亚砜＝3:1:1配制而成；

b)冻存细胞的复苏：将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解冻；1000r.p.m离心6分钟，弃去冻存液，置于铺有0.2％明胶的培养皿中，加入改良IF培养液，37℃、5％ CO2、95％湿度条件培养。

由于本发明提供的改良IF培养液，才使从人胚肝芽组织中分离出的肝芽干细胞被成功建系。而且本发明提供的冻存液又较好地保持了肝芽干细胞的生物学特性。

本发明还提供了根据上述分离培养方法得到的人肝芽干细胞，它具有以下特点：

1、独特的形态学特征：体积较小，细胞核较大，呈小三角形，既不同于上皮细胞的铺路石样外观，也不同于成纤维细胞的长梭形外观。电镜下可见细胞核质比极大，胞质内细胞器极少。

2、强大的增殖能力：hLBSC传至第5代时绘制生长曲线。根据公式TD＝tlog2/log(N/NO)计算倍增时间为28.1小时。以1×104/cm2的密度接种细胞，大约每4～5天传代一次。目前已经在体外培养长达数年，传代超过25代(约90个倍增时间)而细胞的增殖保持稳定。

3、hLBSC是正常细胞：核型分析和致瘤性实验结果显示hLBSC核型正常，且不会在SCID小鼠体内形成肿瘤，表明hLBSC是正常细胞。

4、hLBSC表达多种不同类型的分子标志：RT-PCR检测和流式细胞分析结果显示hLBSC表达肝干细胞相关的分子标志(如ALB、CYP1B1、CK18、CK19、GGT、DPPIV、c-Met、Thy-1和c-kit等)，而且还表达间质细胞的部分分子标志(如CD44、CD29、SDF-l等)，但不表达造血细胞的标志(如CD34和CD45)。另外还检测到Oct4、Nanog等多能性干细胞标志。

本发明的所提供的人肝芽干细胞具有多向分化潜能：在体外特定的诱导条件下，可以分别分化为内胚层的成熟肝细胞、胆管细胞和胰β细胞；外胚层的神经细胞和中胚层的脂肪细胞及成骨细胞；能够参与SCID小鼠损伤肝脏的修复。

本发明所提供的人肝芽干细胞具有广泛的用途。其特征在于可能为相关脏器疾病的细胞治疗以及组织工程提供理想的细胞来源，为相关脏器疾病的基因治疗提供一种理想的细胞载体，并为体外研究肝脏的发育及其损伤修复提供一种理想的细胞模型。

附图说明

图1为解剖显微镜下的4.5周人胚图，显示肝芽所处的部位。

图2为倒置相差显微镜下人肝芽干细胞的形态图。

图3为人肝芽干细胞的生长曲线图。

图4为人肝芽干细胞表达的分子标志图。其中A为RT-PCR检测结果，显示hLBSC表达ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit等肝干细胞相关分子标志，而不表达TAT和HNF；B为流式细胞仪分析结果，显示hLBSC不表达造血系标志CD34、CD45，而表达CD44、CD29等间质细胞标志，以及Thy-1；C为RT-PCR结果，显示hFLSC表达SDF-1等间质细胞的分子标志；D为RT-PCR结果，显示hFLSC表达Oct4、Nanog等多能性干细胞标志。其中P4、P9、P12分别代表第4代、第9代、第12代的hFLSC。

图5为人肝芽干细胞分化为成熟肝细胞的图。其中A为光镜下细胞形态的改变，B、C为超微结构的变化，D显示hLBSC在丁酸钠作用下PAS反应呈阳性，E为RT-PCR检测结果，显示在丁酸钠诱导下肝细胞标志和胆管细胞标志的表达均上调。

图6为人肝芽干细胞分化为脂肪细胞的图。其中A为油红染色结果，B为脂肪特异性标志PPARγ2的RT-PCR检测结果，M：分子量标准；1.未加诱导条件的对照细胞；2.诱导10天后的细胞；3.诱导14天的细胞(PPARγ-2：351bp；β-actin：516bp)

图7为人肝芽干细胞向成骨细胞的诱导分化图。其中A为光镜下形态的变化，B为经成骨诱导后碱性磷酸酶染色结果，C为经成骨诱导后I型胶原的RT-PCR检测结果M：分子量标准；1.RT(—)；2.未加诱导条件的对照细胞；3.诱导14天的细胞。

图8为人肝芽干细胞向神经样细胞的诱导分化图。其中A为光镜下细胞形态的改变，B为经ATRA诱导后Nestin的RT-PCR检测结果M：分子量标准；1.RT(—)；2.未加诱导条件的对照细胞；3.诱导6天的细胞

图9为人肝芽干细胞在SCID小鼠损伤肝脏中植入后荧光显微镜下受体SCID小鼠肝脏绿色荧光分布情况图。A.移植后2天小鼠肝脏未见绿色荧光；B.C.移植后10天，肝脏冰冻切片见散在绿色荧光；D.E.移植后17天，EGFP阳性细胞较为均匀的散布于肝脏中，通常6～7个细胞一团，甚至更多。

图10为人肝芽干细胞在SCID小鼠损伤肝脏中植入后受体SCID小鼠肝脏中绿色荧光的分布及对应的组织结构图。A：荧光视野；B：对应HE切片的可见光视野，矩形框示发出绿色荧光的细胞位置。

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明作详细描述。

实施例1.从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞

1.1培养器皿的预处理：以0.2％明胶覆盖培养瓶/皿/板的底壁，室温下放置30分钟后，将0.2％明胶吸出，室温晾干后备用。

1.2配制培养用液：

改良IF培养液：

其中IMDM和HAM F12培养基、NEAA、GlutamaxTM、青/链霉素为GibcolBRL公司产品，FBS为Hyclone公司产品，胰岛素、EGF为Sigma公司产品。

冻存原液的制备：

混匀，4℃保存备用。

1.3人胎肝细胞的分离及接种培养：取胎龄4.5周的流产人胚胎置于解剖显微镜下(图1)，可见肝芽位于胚胎腹侧，心包的下后方，如图中L所示。以PBS充分洗涤后小心分离出完整的胚胎肝脏，置于96孔板内以0.05％Trypsin/EDTA消化约5分钟，然后加入改良IF培养液终止消化，并用吸头反复吹打几次，静置几分钟后取悬液，置于铺有0.2％明胶的35mm一次性培养皿内，37℃、5％CO₂、95％湿度条件培养。待3-4小时细胞贴壁后换液，以后隔天换液，每次均以PBS轻轻洗涤2-3次。分离的胎肝细胞很快贴壁，极少细胞悬浮。贴壁细胞形体较大，形态混杂。这些细胞在两周后生长停滞，而代之以一种小梭形或三角形细胞的优势生长。

1.4细胞传代培养：在原代培养物生长两周以后，一种小三角形细胞出现优势克隆样生长，以无菌细胞刮去除其他形态的细胞，用吸管吸去旧培养液，PBS充分洗涤后，用0.05％ Trypsin/EDTA消化至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，计数后以1×10⁴/cm²的密度接种至另一铺有0.2％明胶的培养瓶/皿中继续培养。传代培养物为形态均一且增殖稳定的小三角形细胞，如图2所示。每4～5天即传代一次。

1.5培养细胞的冻存与复苏：

1)冻存液的配制：先配制冻存原液(改良IF培养液：胎牛血清：二甲亚砜＝3：1：1)，临用前取冻存原液和改良IF培养液各一份混匀，即为冻存液。

2)细胞的消化与冻存：细胞长至约90％汇合时，用吸管吸去旧培养液，PBS充分洗涤，用0.05％ Trypsin/EDTA消化，至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，用吸管反复吹打成单细胞悬液，1000r.p.m离心5分钟，弃去上清液，以10⁷个细胞/ml的比例加入冻存液，充分混匀后置于冻存管中密封。先后置于4℃ 40分钟，-70℃过夜，最后置于液氮罐中保存。

3)冻存细胞的复苏：迅速将冻存管从液氮罐中取出，快速置于37℃水浴箱中完全解冻。1000r.p.m离心6分钟，弃去冻存液，置于铺有0.2％明胶的35mm培养皿中，加入改良IF培养液，37℃、5％ CO2、95％湿度条件培养。

实施例2：人肝芽干细胞系生物学特性的鉴定：

2.1增殖动力学分析

参照《细胞培养》(世界图书出版公司，司徒镇强、吴军正主编)绘制生长曲线如图3所示。根据公式TD＝tlog2/log(N/N0)计算倍增时间为28.1小时。以1×10⁴/cm²的密度接种细胞，大约每4～5天传代一次。目前已经在体外培养长达一年以上，传代超过25代(约90个倍增时间)而细胞的增殖保持稳定。

2.2细胞的致瘤性分析：

将2×10⁷个hLBSC细胞移植到SCID小鼠(n＝4)皮下，每周观察一次，共观察14周未见肿瘤发生。证明hLBSC没有发生转化、没有致瘤性。

2.3细胞的分子表型检测：

(1)RT-PCR分析显示hLBSC表达ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit等肝干细胞相关分子标志，而不表达TAT和HNF。另外还表达SDF-1等间质细胞的分子标志；以及Oct4、Nanog等多能性干细胞标志，如图4A、C、D所示。具体做法如下：

1)细胞总RNA的抽提：实验前将与RNA接触的玻璃器皿洗净后置于180℃烘烤8小时，不耐高温的耗材浸泡于0.1％的DEPC溶液中12小时，70℃烘烤干燥，然后于121℃高压灭菌15分钟，而后烘干。将贴壁培养的细胞消化成单细胞悬液，1500r.p.m.离心5min后，完全弃去上清液，用“EZ SpinColumn RNA Isolation Kit”试剂盒抽取细胞总RNA。加入水溶解RNA。保存于-70℃。

2)逆转录反应：按下列反应组成调制反应液：

3)RT-PCR反应：反应体系为50μl，如下表所示。反应条件：95℃ 5min变性后，进入循环：94℃ 30sec→X℃ 30sec→72℃ 1min循环30次，然后72℃延长10min，于4℃保存。以1.5％的琼脂糖凝胶，上样10μlPCR产物进行电泳鉴定。

RT-PCR反应体系

RT-PCR引物列表(由生工生物公司合成)

(2)流式细胞仪分析显示hLBSC不表达造血系标志CD34、CD45，而表达CD44、CD29等间质细胞标志，以及Thy-1，如图4B所示。具体做法如下：

取约10⁵～10⁶细胞，分别按抗体说明书加入相应检测量的荧光标记抗体和相应的同型对照抗体，混匀，室温避光放置20min。加入2ml PBS，1000g离心5min，弃上清，加入300μl PBS重悬细胞。流式细胞仪检测，以Cellquest软件获取细胞，分析阳性细胞百分比。所用的荧光抗体为晶美生物公司产品，包括CD45-PerCP，CD34-FITC，CD90-FITC，CD44-FITC，CD29-PE。

实施例3.肝芽干细胞向肝细胞的诱导分化

3.1诱导液的配制：

D-10-SB培养基

3.2向肝细胞的诱导：

将盖玻片置于60mm的培养皿中，接种细胞2×10⁴/CM²，当盖玻片上的细胞生长至60％汇合时，换诱导液D-10-SB培养基继续培养。

3.3分化过程的形态学观察：

每天在倒置相差显微镜下观察并通过显微摄影记录细胞形态和生长状况。光镜下可见短梭形或三角形的细胞在加入丁酸钠24小时后即变得扁平而肥大，核质比明显缩小。诱导后48小时镜下可见肥大的双核细胞。10天后大约有10～15％的细胞变为双核细胞，偶见三核细胞，如图5A所示。由于成熟肝细胞在体内多为双核或多核细胞，在丁酸钠的作用下双核细胞的出现提示hLBSC变为肝细胞样细胞。

3.4分化细胞超微结构的观察：

a)用细胞刮将丁酸钠诱导第4天的细胞从培养皿刮下，用PBS洗3次，尽可能保留大片的细胞不被打散。1000转离心5分钟得到细胞团块，凝块，将细胞团块用4％的多聚甲醛固定4小时，然后用0.1M PBS漂洗5次。

b)用1％的锇酸固定2小时，PBS洗一次。双蒸水洗一次，然后依次通过30％的乙醇5分钟，50％的乙醇5分钟，70％的乙醇10分钟，90％的乙醇10分钟，90％的丙酮10分钟，无水丙酮10分钟×3次。

c)1：1的丙酮：包埋剂浸透1小时；1：2的丙酮：包埋剂浸透过夜；纯包埋剂浸透2小时。包埋剂聚合：37℃作用12小时、60℃作用36小时。

d)修块、超薄切片；醋酸铀染色15分钟，双蒸水洗；硝酸铅染色5分钟，双蒸水洗。

e)透射电镜观察，可见诱导后的细胞胞质内具有丰富的细胞器，包括丰富的线粒体、核糖体、排列整齐的粗面内质网、高尔基体以及大量的糖原颗粒，与诱导前细胞形成鲜明的对比。并可见到细胞间胆管样结构，腔内有较多绒毛样突起，其旁有细胞间连接。如图5B、C所示。

3.5分化细胞分子表型的检测：

(1)RT-PCR：将诱导4天的细胞抽取总RNA，同前所述体系和条件检测肝细胞标志ALB、DPPIV及胆管细胞标志CK19、GGT，结果如图5E所示，可见其表达均有所增强。

(2)PAS实验检测细胞糖原含量：将长有细胞的盖玻片在第10天取出，10％的中性缓冲甲醛固定20分钟，蒸馏水洗后，浸入0.5％高碘酸15分钟，充分水洗后浸入Schiff氏液作用10～15分钟，水洗，晾干，中性树胶封片，镜下观察。结果如图5D所示，可见诱导后的细胞胞质中糖原颗粒呈紫红色颗粒状着色，有的甚至连接成片。在双核细胞多见。以上光镜下细胞形态的改变，超微结构的变化，结合分子表型的改变，以及PAS阳性结果，提示hLBSC可以分化为成熟的肝细胞。

实施例4.肝芽干细胞向脂肪细胞的诱导分化

4.1脂肪诱导培养基的配制

4.2向脂肪细胞的诱导：

将盖玻片置于60mm的培养皿中，接种细胞5×10⁴/CM²，当盖玻片上的细胞生长至100％汇合时，换诱导培养基继续培养，每3天换液，共14天。

4.3分化过程的形态学观察：

每天在倒置相差显微镜下观察并通过显微摄影记录细胞形态和生长状况。在马血清作用24小时后，光镜下可见细胞形态变大，呈长而宽扁的梭形。两天后有10％的细胞胞质内出现折光率很高、大小不等的黄色脂滴样物。

4.4分化标志的检测

(1)RT-PCR：分别对诱导10天和14天的细胞抽取总RNA，同前所述体系和条件检测脂肪细胞特异性分子标志PPAR γ-2的表达。结果显示诱导10天和14天的细胞均有PPAR γ—2的表达，且诱导14天的细胞PPARγ2的表达有所增强，如图6B所示。

(2)油红-0特异性染色：将生长于飞片上诱导13天的细胞以甲醇于—20℃固定2分钟，50％乙醇洗涤后，加入油红工作液染色15分钟，然后以50％的乙醇洗涤，苏木精衬染约2分钟，蒸馏水洗涤后，以甘油明胶封片，镜下观察，结果如图6A所示，可见约90％的细胞胞质内有大小不等的红色脂滴。由此可见人肝芽干细胞确实具有向脂肪细胞分化的潜能。

实施例5.人肝芽干细胞向成骨细胞的诱导分化：

5.1成骨诱导培养基的配制：

5.2向成骨细胞的诱导：

将盖玻片置于60mm的培养皿中，接种细胞3×10⁴/cm²，当盖玻片上的细胞生长至60％汇合时，换诱导液继续培养。

5.3分化过程的形态学观察：

每天在倒置相差显微镜下观察并通过显微摄影记录细胞形态和生长状况。可见诱导第3天后细胞形态发生改变，由三角形变为扁平的立方型或多角形，随着培养时间的延长，细胞基质中出现折光率很高的钙化斑，如图7A所示。

5.4分化标志的检测：

(1)RT-PCR：对诱导14天的细胞抽取总RNA，同前所述体系和条件检测I型胶原，结果显示I型胶原的表达增强，如图7C所示。

(2)碱性磷酸酶显色反应：将生长于飞片上的细胞以甲醇于—20℃固定2分钟，缓冲液洗10分钟，加入BCIP/NBT染液于37℃避光孵育10分钟(不时观察直至发色达到满意程度为止)，蒸馏水洗.甲基绿复染约10分钟，蒸馏水洗涤后，以甘油明胶封片，镜下观察可见，诱导14天后大约30％的细胞碱性磷酸酶染色呈阳性，如图7B所示。初步结果显示hLBSC可能向成骨细胞分化。

实施例6.人肝芽干细胞向神经样细胞的诱导分化

6.1神经诱导培养基的配制：

IF-BME培养基

IF-ATRA培养基

6.2培养细胞的诱导：

将盖玻片置于60mm的培养皿中，接种细胞3×10⁴/cm²，当盖玻片上的细胞生长至70％汇合时，换IF-BME培养基或IF-ATRA培养基继续培养。

6.3分化过程的形态学观察：

每天在倒置相差显微镜下观察并通过显微摄影记录细胞形态和生长状况。发现在BME作用后24小时有较多细长细胞可见，这种细胞胞体两端各有一支长长的突起，有的突起还有分支，如图8A所示。

6.4分化过程分子表型的检测：

用RT-PCR方法分别对诱导4天和8天的细胞抽取总RNA，同前所述体系和条件检测Nestin和GFAP的表达。如图8B所示，检测到Nestin的阳性表达，而GFAP表达呈阴性。

实施例7.人肝芽干细胞植入SCID小鼠损伤肝脏的实验

7.1hLBSC体外标记EGFP报告基因

1)将稳定转染有pLNCG C1载体DNA的PT67细胞系接种于100mm的培养皿中，待细胞生长至大约60％融合时换新鲜培养液，继续培养24小时，收获病毒上清，加入8μg/ml的polybrene，以0.45μm的滤膜过滤，通过感染NIH-3T3细胞的方法测定病毒的滴度；

2)hLBSC生长至大约40％汇合时，加入收获的含病毒培养液上清培养20小时，换为新鲜细胞培养液继续培养24～48小时；加入含800μg/ml G418的细胞培养液培养7天，得到稳定表达绿色荧光蛋白的hLBSC-EGFP。

7.2SCID小鼠肝损伤模型的建立

将CCL4和橄榄油以1：5的比例混合配制成CCL4溶液，于细胞移植前24小时腹腔注射入SCID小鼠体内(100μl/20g体重)。

7.3hLBSC-EGFP细胞移植

将hLBSCEGFP经脾注射入7只CCL4肝损伤SCID小鼠体内，每只注射细胞数为2.4×10⁶个，并设三只对照。

7.4标记细胞植入的检测

A.分别在移植后的第2天、10天、20天取受体鼠的肝组织做冰冻切片，于荧光显微镜下直接观察，结果发现，在移植后2天，肝脏冰冻切片未见绿色荧光；移植后10天，肝脏冰冻切片见散在绿色荧光；移植后20天，EGFP阳性细胞较为均匀的散布于肝脏中，通常6～7个细胞一团，甚至更多，如图9所示。

B.连续冰冻切片同时做HE染色，分析绿色荧光蛋白的分布情况，发现绿色荧光所处位置为肝板内的多个成熟肝细胞，如图10所示。从而有力的证明了hLBSC细胞可以在损伤肝脏中增殖并分化为肝细胞。具体做法如下：

1)将冰冻切片于37℃干燥后，浸入Mayer苏木精液中数分钟；

2)取出切片，用自来水轻轻冲洗，待细胞染蓝色后，用稀盐酸70％乙醇溶液进行分色，再用自来水冲洗约10分钟；

3)蒸馏水洗后，浸入1％伊红染液5-10分钟；

4)用蒸馏水洗去浮色后，经梯度乙醇(70％、80％、90％、95％和100％)脱水，直至胞质与胞核的红、蓝反差鲜明；

5)二甲苯透明，树胶封片，光镜下观察。

Claims (4)

1.一种从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法，其特征在于该方法是由以下步骤组成的：

A、原代培养物的建立：

取胎龄4.5至6周的流产人胚胎，以PBS充分洗涤后在解剖显微镜下分离出完整的胚胎肝脏，置于96孔板内以0.05％ Trypsin/EDTA消化约2-8分钟，然后加入改良IF培养液终止消化，静置后取悬液，置于铺有0.2％明胶的培养皿内，37℃、5％ CO₂、95％湿度条件培养；待3-4小时细胞贴壁后换液，以后隔天换液，每次均以PBS洗涤2-3次；

改良IF培养液是以IMDM培养基：HAM F12培养基＝1:1为基础培养基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、20ng/ml表皮细胞生长因子、1％非必需氨基酸、1mM GlutamaxTM和1％青/链霉素配制而成；

B、细胞传代培养：

在原代培养物生长两周以后，一种小三角形细胞出现优势克隆样生长，以无菌细胞刮去除其他形态的细胞，PBS充分洗涤后，用0.05％Trypsin/EDTA消化至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，计数后以1×10⁴/cm²的密度接种至另一铺有0.2％明胶的培养瓶/皿中继续培养；每4～5天传代一次；

C、培养细胞的冻存与复苏：

a)细胞的消化与冻存：细胞长至约90％汇合时，PBS充分洗涤，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，1000r.p.m离心6分钟，弃去上清液，以10⁷个细胞/ml的比例加入冻存液，充分混匀后置于冻存管中密封，先置于4℃30-60分钟，后置于-70℃ 10-14小时，最后置于液氮罐中保存；

冻存液是以冻存原液和步骤A中配制的改良IF培养液各一份混匀而成，冻存原液是以改良IF培养液:胎牛血清:二甲亚砜＝3:1:1配制而成；

b)冻存细胞的复苏：将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解冻；1000r.p.m离心6分钟，弃去冻存液，置于铺有0.2％明胶的培养皿中，加入改良IF培养液，37℃、5％ CO2、95％湿度条件培养。

2.一种根据权利要求1的从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法制得的肝芽干细胞。

3.一种根据权利要求1的从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法制得的肝芽干细胞，其特征在于该肝芽干细胞表达ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit肝干细胞相关分子标志，而不表达AFP、TAT和HNF；还表达SDF-1间质细胞的分子标志；以及Oct4、Nanog多能性干细胞标志；另外，该肝芽干细胞经体外诱导，分化为内胚层的成熟肝细胞、胆管细胞和胰β细胞；外胚层的神经细胞或中胚层的脂肪细胞及成骨细胞。

4.一种根据权利要求1的从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法制得的肝芽干细胞作为脏器疾病的细胞治疗及组织工程中细胞来源的应用。

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