CN106719602A - 一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法 - Google Patents

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葛啸虎
王飞
王一飞
黄幸
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Abstract

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法。本发明提供的冻存液中包括基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2‑丙二醇，其对脂肪组织具有良好的保护作用，以本发明提供的冻存液对脂肪组织进行冻存后，再经复融的脂肪组织中，细胞活性保持良好。经原代分离培养，获得脂肪干细胞的成功率为100％。

Description

一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法。
背景技术
脂肪组织(adipose tissue)：主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。脂肪组织中的网状纤维很发达。黄(白)色脂肪组织呈黄色(在某些哺乳动物呈白色)，即通常所说的脂肪组织。它由大量单泡脂肪细胞集聚而成，脂肪细胞呈圆形或多边形，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡。胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，连同部分胞质呈新月形。黄色脂肪组织主要分布在皮下组织、网膜和肠系膜等处，在成年男子一般约占体重的10％～20％，女人往往更多一些。脂肪组织是人体内最大的“能源库”。具有贮存脂肪、保持体温和参与脂肪代谢的功能。参与能量代谢，并具有产生热量、维持体温、缓冲保护和支持填充等作用。
自体脂肪是一种理想的填充材料，几乎可用于全身各个部位的软组织缺损填充。尽管为了提高成活率和减少吸收率，国内外的研究人员进行了大量的研究，但目前移植后脂肪组织体积最终只能保持在移植时的50％左右。因此，临床上仍需要通过少量、反复、多次移植提高脂肪移植成活率，以达到患者满意的填充效果。但多次脂肪注射除增加了医生的工作量外，对患者造成多次抽脂的痛苦、较高的风险及费用。如果能实现一次抽取足够的脂肪体外长期冷冻储存，需要时复温培养后注射移植，则具有重要的临床应用价值。
目前尚未有专们用于脂肪组织冻存的方法，经典的冻存液配方是FBS+DMSO，主要用在细胞冻存上，但该冻存液对脂肪组织的保存效果并不稳定。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法，以本发明提供的冻存液冻存脂肪组织，能够保护脂肪组织的活性，经复融后脂肪组织中的细胞仍保持良好的分化能力。
本发明提供的冻存液包括：基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。
非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，NEAA)，包含7种细胞培养所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。非必需氨基酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。NEAA可为自行配置也可为市场购得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的NEAA为购自sigma的100×NEAA。本发明中，NEAA的体积分数为1％。
DMSO：二甲基亚砜，是一种含硫有机化合物，分子式为(CH3)2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡，本发明实施例中，DMSO的体积分数为10％～20％；一个具体实施例中，DMSO的体积分数为20％。
丙三醇为无色味甜澄明黏稠液体。无臭，有暖甜味，俗称甘油。具有保护细胞活性的作用。本发明实施例中，丙三醇的体积分数为5％～30％。一个具体实施例中，丙三醇的体积分数为15％。
1,2-丙二醇的化学式为C3H8O2；其可与水、乙醇及多种有机溶剂混溶，具有保护细胞活性的作用。本发明实施例中，1,2-丙二醇的体积分数为5％～30％。一个具体实施例中，1,2-丙二醇的体积分数为15％。
本发明实施例中，基础培养液DMEM/F12。
本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明实施例中，基础培养基为DMEM/F12。
一些具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：
一个具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：
一个具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：
一个具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：
本发明提供的冻存液在脂肪组织冻存中的应用。
本发明实施例中，以本发明提供的冻存液冻存脂肪组织，3个月后复苏并进行原代分离培养，结果表明，复苏后的脂肪组织原代分离获得脂肪干细胞的成功率为100％。培养至第三代后，诱导脂肪干细胞向脂肪细胞分化。
本发明还提供了一种冻存脂肪组织的方法，以本发明提供的冻存液与脂肪组织混合后，浸入液氮中。
本发明实施例中，冻存液与脂肪组织的体积比为1：1。
本发明提供了一种冻存液，其中包括基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇，其对脂肪组织具有良好的保护作用，以本发明提供的冻存液对脂肪组织进行冻存后，再经复融的脂肪组织中，细胞活性保持良好。经原代分离培养，获得脂肪干细胞的成功率为100％。
附图说明
图1示未经冻存的脂肪组织进行原代分离获得P2代脂肪干细胞的显微图；其中，图1-a示40放大；图1-b示100倍放大；
图2示经实施例1冻存液保护下经冻存的脂肪组织复苏后，进行原代分离获得P2代脂肪干细胞的显微图；其中，图2-a示40放大；图2-b示100倍放大。
具体实施方式
本发明提供了一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1～3
按照表1配方配制冻存液，然后灭菌：
表1实施例1～3
NEAA体积分数 DMSO 丙三醇 1,2-丙二醇 DMEM/F12
实施例1 10mL 200mL 150mL 150mL 490mL
实施例2 10mL 100mL 300mL 300mL 290mL
实施例3 10mL 200mL 50mL 50mL 690mL
采集人脂肪组织30份，随机分为3组，以等体积生理盐水清洗2遍后500g离心5min，弃上层油脂层和下层生理盐水层，用剪刀剪碎后过2mm筛网，然后各组脂肪组织分别以1:1的体积比与实施例1～3的冻存液混合，进入液氮中。保存3个月。
对比例1～3
按照表2配方配制冻存液，然后灭菌：
表2对比例1～3
NEAA体积分数 DMSO 丙三醇 1,2-丙二醇 DMEM/F12
对比例1 10mL 200mL -- -- 490mL
对比例2 10mL -- 150mL 150mL 490mL
对比例3 -- 200mL 150mL 150mL 490mL
采集人脂肪组织30份，随机分为3组，以等体积生理盐水清洗2遍后500g离心5min，弃上层油脂层和下层生理盐水层，用剪刀剪碎后过2mm筛网，然后各组脂肪组织分别以1:1的体积比与对比例1～3的冻存液混合，进入液氮中。保存3个月。
实施例4
取未经冻存的脂肪组织为对照组，进行原代分离，获得P0代脂肪干细胞，在倒置显微镜下观察。
以实施例1～3和对比例1～3配置冻存液冻存后的脂肪组织，经复苏后，进行原代分离，获得P2代脂肪干细胞，在倒置显微镜下观察(图1)。
原代分离的方法为：终浓度0.2％的I型胶原酶消化35min后1800RPM-5MIN离心，仅保留底部沉淀，生理盐水清洗沉淀后接种培养得到P0细胞。
统计分离成功率结果如表3：
表3分离成功率
分离成功率
对照组 100％
实施例1 100％
实施例2 46.67％
实施例3 36.67％
对比例1 6.67％
对比例2 0
对比例3 30.00％
结果表明，各实施例皆有着良好的分离成功率，其中以实施例1的配方分离成功率最佳，与其他实施例或对比例皆存在显著性差异，p<0.05。
取配方各组第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。结果如表4：
表4细胞免疫表型
CD73 CD90 CD105 CD11b CD19 CD34 CD45 HLA-DR
对照组 99.10％ 100.00％ 100.00％ 0.21％ 1.11％ 0.00％ 0.00％ 0.00％
实施例1 100.00％ 99.98％ 99.65％ 0.00％ 0.01％ 0.00％ 0.00％ 0.00％
实施例2 99.98％ 98.63％ 99.63％ 0.10％ 0.21％ 0.00％ 0.00％ 0.12％
实施例3 99.12％ 100.00％ 100.00％ 0.25％ 0.36％ 0.00％ 0.00％ 0.23％
对比例1 99.00％ 99.56％ 98.28％ 1.10％ 1.23％ 0.00％ 0.12％ 0.00％
对比例2 - - - - - - - -
对比例3 100.00％ 99.50％ 99.65％ 0.00％ 0.00％ 0.12％ 0.40％ 1.00％
结果表明，采用本专利方案冻存后的脂肪组织复苏后原代分离得到的细胞与原始组织得到的细胞在表面标记物上无差别。
取配方各组第3代细胞，按2.5×104的细胞浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。检测脂肪干细胞向脂肪细胞分化的能力。
表5分化结果
是否分化
对照组 是
实施例1 是
实施例2 是
实施例3 是
对比例1 是
对比例2 -
对比例3 是
结果表明：采用本专利方案冻存后的脂肪组织复苏后原代分离得到的细胞与原始组织得到的细胞在分化能力上无差别。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种冻存液，其特征在于，包括：基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述NEAA的体积分数为1％。
3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO的体积分数为10％～20％。
4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述丙三醇的体积分数为5％～30％。
5.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述1,2-丙二醇的体积分数为5％～30％。
6.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述基础培养液DMEM/F12。
7.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，包括：
8.权利要求1～7任一项所述的冻存液在脂肪组织冻存中的应用。
9.一种冻存脂肪组织的方法，其特征在于，以权利要求1～7任一项所述的冻存液与脂肪组织混合后，浸入液氮中。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，权利要求1～7任一项所述的冻存液与脂肪组织的体积比为1：1。
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