CN101897330A - 一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液以及使用该冻存液的方法 - Google Patents
一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液以及使用该冻存液的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种低毒性的人胚胎干细胞(hESCs)玻璃化冻存液。该冻存液由DMEM-F12液，HEPES缓存液，胎牛血清(FBS)，乙二醇，异丙醇和蔗糖按一定比例组成。与传统的细胞冻存方法相比，该冻存方法中去除了对细胞毒性较大的二甲基亚砜(DMSO)，采用乙二醇和异丙醇按一定比例混合作为渗透性防冻剂，结合蔗糖溶液作为非渗透性保护剂用于低温保存hESCs，且复苏率和存活率都达到了较高的水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞的冻存液，具体为一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液。
背景技术
自从1998年Thomson等首次成功分离得到hESCs系以来，hESCs在未来的再生医学、发育生物学以及药理学、毒理学等研究领域被寄予众望。hESCs未来的广泛应用意味着细胞资源需要在不同的实验室之间运输和传递，以促进科学合作；此外就建立hESCs库而言，需要提供具有不同组织相容抗原分型的种子细胞用于将来的移植替代治疗，以及在不同阶段保存细胞有利于保证细胞系的稳定和细胞材料能被永久使用，这些目标的实现都需要建立一种高效的冷冻方式来保存hESCs。目前所广泛使用的传统慢速冻存法保存hESCs效率较低，多数hESCs解冻后死亡和易于分化。Reubinoff等首次将玻璃化冷冻应用于hESCs的冷冻，发现其复苏效率明显高于慢速冷冻。因为玻璃化冷冻过程采用急速降温，理论上＞-1500℃/min。一方面最大限度地避免了冰晶形成，另一方面减少了细胞在正常物理温度下接触低温的时间，降低了冷冻保护液对细胞的毒性。目前国际上的报道，经过玻璃化冷冻，有大于75％的hESCs克隆能够存活。但是有一个问题就是在hESCs玻璃化冷冻过程中使用的冷冻保护剂DMSO对细胞的毒性较大。DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。但是研究表明，DMSO存在严重的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性，因此在hESCs运用于临床的过程中，应避免引入DMSO的潜在影响。
发明内容
本发明将探讨用一种毒性较低的冷冻保护剂对DMSO进行替代，对hESCs进行玻璃化冻存，并取得与之相等甚至更好的冷冻复苏效果。
本发明提供的hESCs玻璃化冻存液是由下列组分组成的：其由三种分开保存的混合液组成，各混合液按体积百分比计的组成如下：
平衡缓冲液：20％FBS+2％1M HEPES+78％DMEM-F12；
玻璃化冻存液I：10％乙二醇+10％异丙醇+80％平衡缓冲液；
玻璃化冻存液II：20％乙二醇+20％异丙醇+30％1M蔗糖溶液+30％平衡缓冲液。
使用时将hESCs用平衡缓冲液平衡5-10分钟；加入玻璃化冻存液I 1分钟；再加入玻璃化冻存液II 25秒，最后直接投入液氮内保存。
该玻璃化冻存方法用到的冻存液去除了对细胞毒性较大的DMSO，采用乙二醇和异丙醇按一定比例混合作为渗透性防冻剂，结合蔗糖溶液作为非渗透性保护剂用于低温保存hESCs，复苏后存活率达到86.67±15.28％，且91.53±7.50％的hESCs仍然保持了未分化特征。
DMEM-F12，商品化试剂Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)中的KNOCKOUT DMEM-F12(货号12660-012)
附图说明中的基因和抗原名称的中文意思对应翻译如下：
Hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
OCT-4：一种干细胞转录因子，核内抗原；
SSEA-3：阶段特异性胚胎抗原-3；TRA-1-60：肿瘤排斥抗原-1-60
SSEA-4：阶段特异性胚胎抗原-3；TRA-1-81：肿瘤排斥抗原-1-81
SOX-2、NANOG、REX-1：一种干细胞转录因子编码基因；
TDGF1：畸胎癌来源的生长因子1；TERF1：端粒相关因子1
FGF4：成纤维细胞生长因子4；LEFTYA：TGF-β家族的基因
THY-1：一种抑癌基因，又名CD90；
DPPA2：发育多能性相关因子2
上述物质都是可商业化得到的。
附图说明
图1复苏后hESCs的形态学和细胞免疫细胞化学染色结果。A复苏后细胞在形态上保持了未分化外观：克隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比。复苏后克隆为Oct-4(B)，SSEA-3(C)，SSEA-4(D)，TRA-1-60(E)，TRA-1-81(F)阳性克隆；
图2运用本发明冻存hESCs，复苏后表达了多能性基因Oct-4，SOX-2，Nanog，Rex1，TDGF1，TERF1，Thy-1，LEFTYA，FGF4和DPPA2；
具体实施方式
方法和步骤：
1、配液
1).平衡缓冲液
15.6ml DMEM-F12
4.0ml FBS
0.4ml 1M HEPES
2).1M蔗糖溶液
3.42g 蔗糖
8.0ml 平衡缓冲液
37℃溶解后，用0.22um规格的过滤器过滤，4℃保存备用，或-20℃长期保存。
3).玻璃化冻存液I
800ul 平衡缓冲液
100ul 乙二醇
100ul 异丙醇
4).玻璃化冻存液II
300ul 平衡缓冲液
300ul 1M蔗糖溶液
200ul 乙二醇
200ul 异丙醇
5).复苏液I(0.2M蔗糖溶液)
800ul 平衡缓冲液
200ul 1M蔗糖溶液
6).复苏液II(0.1M蔗糖溶液)
900ul 平衡缓冲液
100ul 1M蔗糖溶液
2、细胞准备
1)用Rock inhibitor处理hESCs 1小时。
2)将hESCs克隆用1ml注射器切成10个约1mmX1mm大小的团块，用TIP头轻轻铲起使之悬浮。
3、冷冻
将10个hESCs团块放入平衡缓冲液中平衡5-10分钟；玻璃化冻存液I 1分钟；玻璃化冻存液II 25秒，最后利用毛细作用吸入冻存麦管中，直接投入液氮内。
4、复苏
将冻存麦管从液氮中取出，并迅速将其中的hESCs团块传入复苏液I 1分钟；复苏液II 5分钟；平衡缓冲液5分钟；再传入另一平衡缓冲液中5分钟，最后将细胞团块种入hESCs的基础培养基中。
5、结果统计
免疫细胞化学染色结果显示为Oct-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81阳性(图1B，1C，1D，1E，1F)，表达了多能性基因Oct-4，Sox-2，Nanog，Rex1，TDGF1，TERF1，Thy-1，LEFTYA，FGF4和DPPA2(图2)，在形态上保持了未分化外观：克隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比(图1A)。
本实施例重复了3次，结果统计如下：
复苏百分率：96.67±5.77
存活百分率：86.67±15.28
未分化百分率：91.53±7.50 。
Claims (2)
1.一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液，其特征在于其由三种分开保存的混合液组成，各混合液按体积百分比计的组成如下：
平衡缓冲液：20％FBS+2％1M HEPES+78％DMEM-F12；
玻璃化冻存液I：10％乙二醇+10％异丙醇+80％平衡缓冲液；
玻璃化冻存液II：20％乙二醇+20％异丙醇+30％1M蔗糖溶液+30％平衡缓冲液。
2.使用上述低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液保存细胞的方法，将hESCs用平衡缓冲液平衡5-10分钟；加入玻璃化冻存液I 1分钟；再加入玻璃化冻存液II 25秒，最后直接投入液氮内保存。
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