JP5804437B2 - 幹細胞保存媒体、幹細胞保存方法および幹細胞保存システム - Google Patents
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Description
2M,アセトアミド 1M,プロピレングリコール 3Mという高い溶質濃度をもつため、浸透圧による毒性が非常に高く、ヒトを含む霊長類iPS/ES細胞を凍結する際には、懸濁を始めてから液体窒素に浸漬するまでに要する時間を10秒程度という短時間処理や解凍時に液体窒素から取り出した後、ただちに、37℃にあらかじめ温めておいた培地を迅速に添加し急速解凍が必要であり、インキュベータによるチューブごと解凍ができないなど手技的にかなりの熟練を要する。
また、凍結時よりもむしろ溶解時に再結晶化が起こることにより細胞がダメージを受けることがより大きな問題となっている。
WuCFらは、ヒトES細胞(hES1株)のトレハロースを含む凍結保存液により緩慢凍結後、急速解凍し、生存率48%であったことを報告している(非特許文献2を参照)。
+保存用培地 (80% DMEM/F12 + 20% KSR + 400μL HEPES)を用いてプログラムフリーザーを用いて緩慢凍結した後、融解時に0.1Mスクロースを含む特殊な回復培地を添加して5分間インキュベート処理すると生存率80%を報告している(非特許文献4を参照)。
なお、彼らは、凍結保存液5% HES+5%もしくは10% EG
+凍結用培地 (80% DMEM/F12 + 20% KSR + 400μL HEPES)を用い緩慢凍結した場合、生存率が0%であることも報告しており、DMSOは有効であるが、エチレングリコール単独では凍結保護効果がないことも報告している。
また、最近ではTrypLE(登録商標)Expressやtrypsin/EDTAを用いて細胞をシングルセルに細胞剥離した後、凍結保存し、ROCK阻害剤Y27632を10μM添加培養により生存率を向上させる方法も複数のグループから報告もある(非特許文献5〜非特許文献9を参照)。
従って、もっとハンドリングが容易で効率が高く、毒性が低く、再現性が高く堅牢な新しい凍結保存方法の開発が望まれている。
上記状況に鑑みて、本発明は、ガラス化法に代わる緩慢凍結法に用いられ、高い細胞生存率を有し、かつ、簡便で効率良い、幹細胞の保存媒体、保存方法および保存システムを提供することを目的とする。
また、緩慢凍結保存の保存方法における細胞剥離操作において、プロナーゼ溶液を用いて細胞クランプのサイズを小さくして緩慢凍結することにより、高い細胞生存率が得られることの知見を得た。
本発明の幹細胞保存媒体は、好ましくは、ヒドロキシエチルスターチ(HES)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)を含有し、かつ、血清、血清の代替成分、蛋白成分(例えばアルブミン)、動物由来成分のいずれの成分も含まない。血清、血清の代替成分、アルブミンなどの蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含まない、いわゆるアニマルコンポーネントフリーの幹細胞保存液の場合、ヒトiPS/ES細胞を用いた再生医療の臨床応用に有益である。
また、本発明の幹細胞保存媒体は、常温で保存可能な媒体であり、利便性に優れている。
また、本発明の幹細胞保存媒体を用いて緩慢凍結保存した凍結チューブを、温培地を添加して超急速解凍、もしくはウォーターバス(37℃湯浴)にて急速融解した場合でも、他の幹細胞保存媒体を用いた場合より、高い細胞生存率が得られた。ここで温培地の温度は、例えば20℃以上、好ましくは25℃以上、より好ましくは30℃以上であり、例えば40℃以下、好ましくは39℃以下、より好ましくは38℃以下であり、最も好ましくは約37℃である。また、独自の解凍液CELLOTIOM(登録商標)や0.1Mスクロースを含む特殊な回復培地を用いず、通常の培地添加による高い生存率が得られた。プログラムフリージング不要、特殊な回復培地が不要、通常の細胞株と同様に凍結融解が可能である点は、操作が簡便であり、堅牢性が向上し、ヒトiPS/ES細胞を用いた再生医療の臨床応用に有益である。
すなわち、ヒドロキシエチルスターチ(HES)とジメチルスルホキシド(DMSO)とエチレングリコール(EG)の3成分が適当な濃度で共存すると、優れた細胞保護効果を示すのである。
HESは多糖類であり、細胞膜を透過せず、細胞表面において氷塊形成による細胞障害から細胞膜を保護する効果があり、融解後の細胞生存率の向上に寄与すると考えられている。
また、エチレングリコール(EG)添加により、DMSOの細胞分化の誘導作用を軽減できる。DMSOおよびエチレングリコール(EG)は、凍害防止剤として作用して、凍結の際の氷の結晶の形成を抑制する。DMSOは、細胞分化作用があることが指摘されているが、エチレングリコール(EG)がその作用と拮抗し低減するものと考えられる。
さらに、解凍時に温培地添加による急速解凍と希釈と遠心除去によりにDMSOとの接触時間を極力短時間にすることにより分化誘導遺伝子の遺伝子発現を極力おさえることが可能である。実際、幹細胞のマーカーやin vitro三胚葉分化の確認により多能性が維持されていることを確認している。
ここで、幹細胞保存媒体は、上述の本発明の幹細胞保存媒体であり、ヒドロキシエチルスターチ(HES)とジメチルスルホキシド(DMSO)とエチレングリコール(EG)を含有する媒体である。
或いは、幹細胞保存媒体は、既存のCP−1と同様、ヒドロキシエチルスターチ(HES)とジメチルスルホキシド(DMSO)と、培地(culture medium)もしくはアルブミン溶液とを含む媒体である。
本発明の幹細胞保存方法においては、簡易凍結法により簡便で効率良く作業を行うことができる。
また、ヒドロキシエチルスターチ(HES)は、4〜8%(w/v)の範囲内の濃度で存在することが好ましく、5〜6%(w/v)が更に好ましい。一方、ジメチルスルホキシド(DMSO)は、4〜6%(v/v)の範囲内の濃度で存在することが好ましく、略5%(v/v)が更に好ましい。
また、本発明の幹細胞保存方法において、アルブミン溶液は、略4%(w/v)の濃度で存在することが好ましい。
また、上記解凍工程の後、ROCK阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含むことが好ましい。ROCK阻害剤を添加した培養を行うことにより、ROCK阻害剤を添加しない培養に比べて高い細胞生存率を得ることができる。効率よりも安全性やコストや重視する臨床応用の場合、ROCK阻害剤を添加しないで培養させるのが好ましい。ROCK阻害剤の添加による培養は、研究試薬レベルにおいては、高い細胞生存率を得る重要なファクターのひとつである。ROCK阻害剤としては、Rho-associated coiled-coilキナーゼ(ROCK)を阻害する任意の物質を使用することができ、例えば、Y−27632、FasudilおよびH−1152が例示される。
1)幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液
2)上述の本発明の幹細胞保存媒体
3)剥離した幹細胞を細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段
また、本発明によれば、高い細胞生存率であり、従来のガラス化法による凍結保存に伴う細胞生存率の不安定化を避けることができる。
そして、緩衝液や培地に懸濁した幹細胞を、プロナーゼ溶液を用いた処理によりフィーダー細胞を除去した細胞コロニーを一定サイズに細分化した後、幹細胞の遠心後の細胞ペレットと上記の幹細胞保存媒体を混合する。幹細胞保存媒体と幹細胞を混合した後、毎分1〜2℃の速度で−80℃まで冷却し凍結保存する。冷却は、保護ケースに入れた細胞浮遊液を−80℃の冷凍庫内の発砲スチロール箱に入れて行う。なお、さらに液体窒素の温度まで冷却して、液体窒素中で保存してもよい。
上述の如く、本発明の幹細胞保存方法は、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程を備える。
また、使用する凍結保存液としての幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(HES)とジメチルスルホキシド(DMSO)とエチレングリコール(EG)を含有する媒体、或いは、ヒドロキシエチルスターチ(HES)とジメチルスルホキシド(DMSO)と、培地(culture medium)もしくはアルブミン溶液とを含む媒体である。
また、下記の5種の凍結保存液を調製した。以下の濃度表記は最終濃度を表している。
(凍結保存液A)6%
HES + 5% DMSO + 5% EG+ 0.9% NaCl
(凍結保存液B)6%
HES + 5% DMSO + 4% BSA+50% DMEM/F12+ 0.9% NaCl
(凍結保存液C)6%
HES + 5% DMSO + 4% BSA+ 0.9% NaCl
(凍結保存液D)6%
HES + 5% DMSO+50% DMEM/F12+ 0.9% NaCl
(凍結保存液E)6%
HES + 5% DMSO+ 0.9% NaCl
具体的には、凍結保存液Aは、CP−1原液6.8mLに、生理食塩水3.2mLを添加し10mLとし、よく混合した後、10%のEG(和光純薬社製)を含む生理食塩水を等量10mLにおだやかに低温で混合し調製した。
また、凍結保存液Bは、CP−1原液6.8mLに、25%BSA3.2mLを添加し10mLとし、よく混合した後、DMEM/F12培地を等量10mLにおだやかに低温で混合し調製した。
また、凍結保存液Dは、CP−1原液6.8mLに、生理食塩水3.2mLを添加し10mLとし、よく混合した後、DMEM/F12培地を等量10mLにおだやかに低温で混合し調製した。
また、凍結保存液Eは、CP−1原液6.8mLに、生理食塩水3.2mLを添加し10mLとし、おだやかに低温で混合し調製した。
DMEM/F12(Glutamax含HEPES不含) 、1% 非必須アミノ酸、20%代替血清KSR(以上、Invitrogen社製)、100IU/mL ペニシリン/100μg/mL ストレプトマイシン(明治製菓社製)と使用直前に0.1mM 2−メルカプトエタノール(和光純薬社製)、5ng/mL
bFGF(和光純薬社製)を添加し使用した。
CaCl2/PBS)(CaCl2はナカライテスク社製、その他はInvitrogen社製)を用いて剥離し、6分の1希釈にて継代培養を行った。
a)融解法1:プレインキュベーションした温培地を直接バイアルに添加する希釈による急速融解(温培地添加による希釈融解)
具体的には、−150℃のディープフリーザーからチューブを取り出し、あらかじめ37℃にてプレインキュベーションしておいた培地5mLにて急速解凍し、15mLの遠心チューブ(培地3mLをあらかじめ添加)に移し、遠心し(300g,3分間,4℃)、上清を吸引除去する。
b)融解法2:温浴(ウォーターバス)による融解
具体的には、−150℃のディープフリーザーからチューブを取り出し、37℃湯浴にて急速融解し、培地を5mL添加した後、15mLの遠心チューブ(培地3mLをあらかじめ添加)に移し、遠心し(300g,3分間,4℃)、上清を吸引除去する。
本実施例における幹細胞保存方法のフローを図10に示す。図10のフローは、融解法1(温培地添加による希釈融解)を用いた場合の幹細胞保存方法を示している。具体的には、図10に示すように、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離し(剥離工程:ステップS01)、次に、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結して(凍結工程:ステップS03)、凍結保存する(ステップS05)。凍結工程で用いる幹細胞保存媒体は、上述の凍結保存液A〜Eのいずれかを用いる。
凍結保存された幹細胞を解凍する時は、凍結チューブに温培地を添加するか(超急速融解)、若しくは37℃のウオーターバスにて急速融解した後、遠心により凍結媒体を迅速に除去し(解凍工程:ステップS07)、ROCK阻害剤を添加した培地で培養(最大48時間)し、その後は通常培地にて培養する(培養工程:ステップS09)。そして、拡大培養(ステップS11)するか、或いは、剥離工程(ステップS01)に戻り、再び凍結保存する。
なお、融解の際、急速融解と超急速融解のどちらも使用可能である。特に37℃のウオーターバスにて融解する急速融解法は、通常の細胞株の融解法と同じであり、操作ミスが少なく堅牢性が高まるというメリットがある。
1mL、37℃で約1分間処理により、フィーダー細胞のみを先に剥離浮遊させ、吸引除去した。ただちにPBS(−)にて洗浄し吸引除去し、培地5mLを添加し、P1000ピペットにより穏やかにピペッティングし、クランプを崩さないように500 μL(約2.5×105個/チューブ)を1.5mLチューブに分注した。遠心(300g,3分間,4℃)後、上清をできるだけ取り除き、細胞ペレットにDAP213凍結液(2M
DMSO(カルビオケム社製)、1M アセトアミド(シグマ社製)、3M プロピレングリコール(ナカライテスク社製))0.2mLを加え、10秒以内に迅速に液体窒素にて急速凍結し、液体窒素または−150℃のディープフリーザーに移し、7日間凍結保存した。
生存率(%)=
凍結融解後5日間培養後のコロニー数/継代後5日間培養後のコロニー数×100で算出した。
その結果を図1に示す。図1は、凍結保存液A〜Eを用いて緩慢凍結法を行ったヒトiPS細胞の生存率を示すグラフである。
融解法1(温培地添加による希釈融解)で解凍した場合、凍結保存液Aを用いたものの生存率は88.4%であり、凍結保存液Bを用いたものの生存率は96.4%であり、凍結保存液Cを用いたものの生存率は94.3%であり、凍結保存液Dを用いたものの生存率は76.3%であり、凍結保存液Eを用いたものの生存率は88.1%である(いずれの生存率も中間点の値)。
一方、融解法2(温浴による融解)で解凍した場合、凍結保存液Aを用いたものの生存率は78.7%であり、凍結保存液Bを用いたものの生存率は44.5%であり、凍結保存液Cを用いたものの生存率は47.3%であり、凍結保存液Dを用いたものの生存率は33.5%であり、凍結保存液Eを用いたものの生存率は38.5%である(いずれの生存率も中間点の値)。
また、図1に示すように、上述の凍結保存液A〜Eを用いて緩慢凍結法を行い、融解法2(温浴による融解)で解凍したものは、凍結保存液Aのみが生存率が75%以上であった。凍結保存液Aを用いて緩慢凍結法を行ったものは、融解法に左右されず、高い生存率を示したことがわかる。
また、図11は、凍結保存液Aの用いて緩慢凍結法をバッチ間で比較実験をおこなったものである。異なるバッチにおいても融解法に左右されず、高い生存率を示したことがわかる。
特に、凍結保存液A(本発明の幹細胞保存媒体)を用いて緩慢凍結法を行ったものは、融解法に左右されず、生存率が80%以上であることがわかった。凍結保存液A(本発明の幹細胞保存媒体)は、BSAおよび培地を含まないアニマルコンポーネントフリーの凍結保存液であり、ヒトiPS細胞を用いた再生医療の臨床応用に有益である。
その結果を図3に示す。図3に示すように、様々な濃度のエチレングリコール(EG)の凍結保存液の検討結果、エチレングリコール(EG)濃度が5%のものが、融解法に左右されず、90%以上の生存率であることが確認できた。
実施例2の融解法2では、エチレングリコール(EG)が無添加、エチレングリコール(EG)濃度が2〜5%で、80%以上の生存率であった。エチレングリコール(EG)濃度が5%で102%の生存率であり改善が最大になった。エチレングリコール(EG)濃度が4〜10%では、融解法に左右されず安定して回復した。
具体的には、以下の5種類のプロテアーゼの細胞剥離液にて剥離を行い、実施例2の凍結保存液A(本発明の幹細胞保存媒体)により凍結保存し、温浴培地添加による急速解凍により融解し培養し、最適な組合せを検討した。
(細胞剥離液B)0.05% Trypsin/EDTA(インビトロジェン社製)、37℃、1分間
(細胞剥離液C)2mg/mL Disease II(ロシュ社製、10xストックをDMEM/F12で希釈)、37℃、15分間
(細胞剥離液D)1.5mg/mL Collagenase IV(粉末をDMEM/F12で溶解)、37℃、40分間
(細胞剥離液E)CTK、37℃、1分間
なお、図4および図5において、Pronaseは細胞剥離液A、Trypsinは細胞剥離液B、Diseaseは細胞剥離液C、Collagenaseは細胞剥離液D、CTKは細胞剥離液Eを示している。
また、様々なプロテアーゼを用いた場合の細胞剥離時の細胞塊の大きさ(クランプサイズ)を、201B7株を用いて、その後のクランプサイズの定量化した。
細胞剥離後、細胞をコンベンショナル培地で回収し、6wellプレートに懸濁液を入れてイメージングシステム(キーエンス社製)によりデジタル画像(4x)を撮影し、付属ソフトウェアのエリア計測モードを用いてクランプサイズを定量した。
μm2であった。このサイズは、ディスパーゼ処理の場合の25454±41002μm2、コラゲナーゼ処理の場合の8551±18884μm2、CTK処理で8600±13267μm2と比較して、有意(P<0.01)に小さく、またばらつきも小さかった。一方、トリプシン処理の場合は、1936±1663μm2とプロナーゼ処理の場合とほぼ同等であり、有意差がなかった。
また、それぞれの剥離液での剥離後の凍結保存において、クランプサイズの細かったプロナーゼおよびトリプシンに関しては、保存することが可能であった。
しかしながら、プロナーゼ処理とトリプシン処理の2つの生存率を比較すると、プロナーゼが88%、トリプシンが30%であり、プロナーゼが有意に高かった。
a)細胞表面のiPS細胞の生存に必要な未知の蛋白を分解や、細胞死を誘導する蛋白質が影響した。
b)トリプシンのプロテアーゼ効力は、プロナーゼと比べ強く、作用後の不活化も難しく、コロニーサイズを測定した後も残存活性により、ピペット操作やチューブ間移動により、一部のiPS細胞がシングルセルまでにばらばらになった。特に、エピステム状態にあるヒトiPS細胞はある程度の細胞塊の状態であれば生存率はよいが、シングルセルになった場合、マウスES細胞のような内部細胞塊由来のグランドステート状態にある細胞と違って生存できなくなった。
クランプサイズの微小化が凍結保存の成功には不可欠であり、本発明の幹細胞保存方法のプロナーゼ溶液を用いた細胞剥離によれば、短時間にフィーダー細胞との分離、コロニーの細分化が行え、また生存率が高く、さらに動物由来成分を含まないといった利点がある。
幹細胞保存方法における培養および凍結は、実施例2と同様の方法により行った。融解は、温培地を用いた急速融解をおこなった後、ROCK阻害剤10μM Y−27632の添加の有無による生存率の違いについて測定した。添加する場合は、Y−27632存在下で2日培養し、その後は、Y−27632を含まない培地でさらに3日間培養した。一方、添加しない場合は、通常培地で5日間培養した。双方とも、実施例2の方法に従い生存率を測定した。
図6に示すように、測定の結果、ROCK阻害剤(+)培養の場合は約120%の生存率であり、ROCK阻害剤(−)培養の場合の約30%の生存率よりも高い生存率を示した。以上から、ROCK阻害剤(+)培養が、幹細胞保存方法において高い生存率を支持する重要な試薬であることがわかる。
その結果を図7に示す。ヒトiPS細胞201B7株、253G1株および株化ヒトES細胞KhES1株、H1株において、80〜100%の高い生存率が確認できた。すなわち、HES,DMSO,EGを含有する幹細胞保存媒体を用いた本発明の幹細胞保存方法が、複数の幹細胞株の凍結保存において有効であることを示された。
Reaction)により半定量的に遺伝子発現解析を行った結果を示す。表1に、RT−PCR遺伝子発現解析用プライマーリストを示す。プライマーは、論文(Takenaka et al. Experimental Hematology. 2010. 38(2):154-62.)に基づき、Invitrogen社に依頼して合成した。
RNA濃度は、Nanodrop(ThermoFisher社製)を用いて260nmの吸光度を測定し定量した。逆転写反応は、Rever Tra Ace qPCR RT kit(東洋紡社製)の添付プロトコールに従い、65℃、5分間の加温処理後に急冷し、変性させたTotal RNA 100ngに対し、5x RT Buffer 2μL、RT Enzyme Mix 0.5μL、Primer Mix 0.5μLを添加した10μLの系で、37℃、15分間逆転写反応、続いて98℃5分間の加熱処理にて酵素の失活処理を行い、cDNAを調製した。
1μL、2.5mM dNTP 0.8μL、ExTaq HS 0.05μL(すべてTakara社製)、10μM
primer mix 1μLにて98℃で10秒間、55℃で20秒間、72℃で30秒間を30サイクルおこない、さらに72℃で5分間のPCRを行った。反応液全量に10x Loading Bufferを1μLずつ添加し、全量を2%アガロースゲルにて定電圧120V、10分間電気泳動した。エチジウムブロマイド染色後UVにより検出した。
その結果を図8に示す。図8(1)に示すように、ヒトiPS/ES細胞(ヒトiPS細胞201B7,ヒトES細胞KhES−1)の主要な幹細胞マーカー(OCT4,KLF4,SOX2,C−MYC,NANOG)をRT−PCRによる解析によりバンドが確認でき遺伝子発現が凍結前後において顕著な差がないことが確認できた。また、図8(2)に示すように、主要な幹細胞マーカー(OCT4,SSEA3,SSEA4,TRA−1−60,TRA−1−81)が、免疫細胞化学的解析により全ての場合で染色されることから、凍結前後において顕著な差がないことが確認できた。
ヒドロキシエチルスターチ(HES)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)を含有する本発明の幹細胞保存媒体による凍結融解後、7日間オンフィーダー培養した201B7株をCTK剥離液により、SNL細胞を除去後、ヒトiPS細胞培地(−bFGF)にて回収し、そのまま低接着表面プレート(コーニング社製)にて10日間培養し胚葉体(EB)を形成させた。培地交換は1日置きに行った。
胚葉体(EB)の半分量をチューブに回収し、RT−PCRにより三胚葉特異的マーカーの遺伝子発現解析を行った。具体的には、RLT
Buffer(キアゲン社製RNeasy mini kit付属)によりRNA抽出し、常法どおり、逆転写反応とPCRを行った。表2にRT−PCR遺伝子発現解析用プライマーリストを示す。
vitroで分化させ、主要な分化マーカー(外胚葉
PAX6、中胚葉BRACHYURY、内胚葉SOX17、GATA4)をRT−PCRによる解析によりバンドが確認でき分化遺伝子の遺伝子発現を確認した。また、図9(2)に示すように、主要な分化細胞マーカー(外胚葉β-tubulin、中胚葉αSMA、内胚葉αFetoprotein(AFP))が、免疫細胞化学的解析により全ての場合で染色されることから、三胚葉分化能が維持されていることが確認できた。
凍結前では、株化ヒトiPS細胞201B7株を初期播種濃度約 25,000/well/6ウエルプレートから4日おきにCTKにて剥離し、1/6希釈により継代培養した。融解後は、25,000/vialを、10cmディッシュにて1週間培養し、4日おきにCTKにて剥離し、1/6希釈により継代培養した。細胞数は、経時的にサンプリングし、0.05%Trypsin/EDTA処理(37℃、10分間)にてシングルセルまでに分散した後、トリパンブルー染色し、血球算定盤にて顕微鏡下にて測定した。
その結果を図12に示す。株化ヒトiPS細胞201B7株について凍結融解前後でほぼ一定であることを確認できた。
その結果を図13に示す。融解後3〜5継代した株化ヒトiPS細胞201B7株についてG-バンド分析を行い、正常核型であることを確認できた。
なお、2012年6月15日に出願された日本国特許出願第2012−136422号をそのまま参照により本明細書に取り込むものとする。また、本明細書中で引用する全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参照により本明細書に取り込むものとする。
Claims (12)
- 幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(HES)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、及びエチレングリコール(EG)を含有し、
エチレングリコール(EG)が、4〜12.5%(v/v)の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(HES)が、4〜8%(w/v)の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(DMSO)が、4〜6%(v/v)の範囲内の濃度で存在する、幹細胞保存媒体。 - 血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項1に記載の幹細胞保存媒体。
- 幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(HES)とジメチルスルホキシド(DMSO)とエチレングリコール(EG)を含有する媒体であって、
エチレングリコール(EG)が、4〜12.5%(v/v)の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(HES)が、4〜8%(w/v)の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(DMSO)が、4〜6%(v/v)の範囲内の濃度で存在する、媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴(ウォーターバス)にて融解するものである、幹細胞保存方法。 - 上記の剥離工程において、クランプサイズが200〜10000μm2である、請求項3に記載の幹細胞保存方法。
- 上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体1ミリリットル当り1×103〜1×106個の範囲で存在する、請求項3に記載の幹細胞保存方法。
- 上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ1本当り略0.2〜1ミリリットルとする、請求項5に記載の幹細胞保存方法。
- 前記培地は、ダルベッコ改変Eagle(DMEM培地)およびF12培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項3に記載の幹細胞保存方法。
- 上記解凍工程の後、ROCK阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項3に記載の幹細胞保存方法。
- 前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹(ES)細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項3に記載の幹細胞保存方法。
- 幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項1の幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、
を備える幹細胞保存システム。 - プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離した幹細胞を保存するために用いられる請求項1に記載の幹細胞保存媒体。
- 前記エチレングリコール(EG)が、4〜10%(v/v)の範囲内の濃度で存在し、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴(ウォーターバス)にて融解のいずれの融解法にも左右されず生存率が60%以上で安定して回復し得る請求項1又は11に記載の幹細胞保存媒体。
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