KR102493297B1 - 세포의 동결 보존 조성물 및 동결 보존 방법 - Google Patents

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Abstract

세포를 동결 보존 시에 간편하게 첨가하여 세포의 생존율을 향상시킨다. 소포로오스 리피드를 0.01중량%에서 20중량% 포함하는 조성물을 동결 보존 직전으로부터 6시간 전까지의 사이에, 1용량% 첨가하여 세포를 보존한다. 이 조성물은 세포의 동해를 감소시킴으로써, 동결 보존 시의 세포 생존율을 향상시키는 것이 가능하고, DMSO 및 혈청을 사용하지 않고 세포를 보존할 수 있다. 또한, 세포 동결 보존 시의 동결 속도의 미세한 제어도 불필요하여, 간편하고 저렴한 보존 방법이다.

Description

세포의 동결 보존 조성물 및 동결 보존 방법
본 발명은, 세포를 동결 보존하기 위해 사용하는 동결 보존 조성물 및 이를 사용한 동결 보존 방법에 관한 것이다.
세포의 동결 보존은, 계대에 의한 세포 변질의 방지, 계대에 따른 잡균으로 인한 오염 방지, 세포의 수송 등에 있어서 필수적인 기술로서 널리 이용되고 있다. 그러나, 세포를 동결하는 과정에 있어서, 세포 내외의 수분이 빙결정이 되어 세포에 손상을 주는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 이 때문에, 동결, 융해 시의 손상으로부터 세포를 보호하고, 더 나아가 세포의 성질을 유지하며 동결 보존하는 것이 요망된다.
통상의 동결 보존은, 빙결정에 의한 손상으로부터 세포를 보호하기 위해 동결 방어제를 첨가한 소혈청 등을 함유한 배양액에 세포를 현탁하고, 크라이오튜브 등에 채워 냉각시켜, 최종적으로 -80℃또는 -196℃의 극저온에서 동결 보존하는 것이 일반적이다. 동결 방어제로는, 5∼20%의 디메틸술폭시드(DMSO), 글리세린(Gly), 에틸렌글리콜(EG), 프로필렌글리콜(PG) 등이 사용되고 있다(특허문헌 1, 2). 그 중에서 가장 효과가 높고, 자주 사용되고 있는 것이 DMSO이지만(비특허문헌 2), 세포의 보존율의 결과가 만족스럽지 않아, 빙결정의 억제 효과가 반드시 충분하다고는 할 수 없다.
또한, 폴리에테르를 첨가함으로써 DMSO의 효과를 증강시킨 것(특허문헌 3), 프룩탄을 사용함으로써 세포 보호 효과를 높인 것(특허문헌 4), 카복실화폴리리신을 배합함으로써 줄기 세포의 보존 효과를 높인 것(특허문헌 5)이 있지만, 모두 빙결정 생성 억제 효과가 충분하다고는 할 수 없다. 또한, 폴리에테르의 잔류에 의한 세포 독성이 우려되고, 보다 저독성의 보존액이 요망되고 있다. 또한, 프룩탄의 첨가 농도가 30%로 고농도이기 때문에 경제적인 문제나, 보존 후의 제거가 곤란하거나, 카복실화폴리리신의 세포 보존은 줄기 세포에만 착안한 것으로, 범용성이 낮고, 또 폴리펩티드이기 때문에 세포의 기능성에 대한 영향이 우려되는 등, 세포의 보존에 관해서 반드시 만족스럽다고는 할 수 없다. 따라서, 모든 세포를 보존할 수 있는 저독성인 것이 요망되고 있다.
특허문헌 1 : 일본 특허 제5940975호 특허문헌 2 : 일본 특허공개 2001-247401호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허공표 평10-511402호 공보 특허문헌 4 : 일본 특허공개 2012-235728호 공보 특허문헌 5 : 일본특허 5630979호 공보 특허문헌 6 : 일본 특허공개 2016-160244호 공보
비특허문헌 1 : Mazur, Am.J.Physiol., 247:C125-142, 1984 비특허문헌 2 : Kovelock JE and Bioshop MWH, Nature 183:1394-1395, 1959
현재 동결 보존법으로는, 빙결정의 생성 억제 효과가 불충분하고, 동해(凍害)로부터 세포를 보호하는 효과가 충분하지 않기 때문에, 독성이 낮은 신규 동결 보존제의 개발이 요망되고 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시하였다. 그 결과, 소포로오스 리피드(SL)가 빙결정 생성을 억제하는 효과를 가지며, 간편하게 동해로 인한 세포 손상을 억제할 수 있음을 알아내었다. 이를 이용하여, 0.01중량%에서 20중량%의 SL를 동결 보존하기 전의 세포 배양액 중에 첨가함으로써, 세포의 보존 효율이 높아지는 것을 알아내었다. 또한, 세포 동결 시에, SL를 0.01중량%에서 20중량% 첨가하면 DMSO의 독성을 완화시키는 것도 알아내었다. 추가로, 0.01중량%에서 20중량%의 SL에 1중량%에서 50중량%의 다가 알코올을 배합함으로써, DMSO를 첨가하지 않고 보존 후의 세포 생존율이 높아지는 것을 알아내었다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
[1] 소포로오스 리피드를 0.01중량%에서 20중량% 포함하는 동결 보존 후의 세포 생존율을 높이는 조성물
[2] 디메틸술폭시드(DMSO)를 5중량%에서 10중량% 포함하는 [1]에 기재하는 조성물
[3] 다가 알코올을 1중량%에서 50중량% 포함하는 [1] 또는 [2]에 기재하는 조성물
[4] 다가 알코올로서, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중 적어도 어느 하나를 포함하는 [3]에 기재하는 조성물
[5] 세포를 동결 보존하기 직전으로부터 6시간 전의 사이에, 세포 배양 배지 중에 [1]에서 기재하는 조성물을 1용량%가 되도록 첨가하여 세포를 동결 보존하는 방법
[6] 세포를 동결 보존할 때, 세포 배양 배지 중에 [2] 내지 [4]에 기재하는 조성물을 10용량%에서 99용량% 첨가하여 세포를 동결 보존하는 방법
SL 첨가에 따라 세포의 동해를 저감시킬 수 있다. 이 결과, DMSO나 혈청의 효과에 의존하지 않고도 일정 수준 이상의 세포 생존율이 얻어진다.
도 1은 빙정 형성 억제에 대한 현미경 사진도이며, 그 중 (A)는 초순수이고, (B)는 10중량% SL이고, (C)는 0.1중량% SL이며, (D)는 10중량% DMSO이고, (E)는 10중량% Gly이며, (F)는 10중량% PG이고, (G)는 10중량% EG이며, (H)는 10중량% APG이다.
도 2는 세포 마커의 발현을 나타내는 도면이다.
도 3은 세포 형태에 대한 현미경 사진도이며, 그 중 (A)는 0.2중량% SL＋30중량% Gly이고, (B)는 0.2중량% SL＋20중량% Gly이며, (C)는 0.2중량% SL＋15중량% Gly이고, (D)는 0.1중량% SL＋30중량% Gly이며, (E)는 0.1중량% SL＋20중량% Gly이고, (F)는 0.1중량% SL＋15중량% Gly이며, (G)는 0.05중량% SL＋30중량% Gly이고, (H)는 0.05중량% SL＋20중량% Gly이며, (I)는 0.05중량% SL＋15중량% Gly이고, (J)는 30중량% Gly이며, (K)는 20중량% DMSO이다.
SL란 저독성의 당지질형 생물계면활성제이며, 효모의 발효로부터 얻어지는 발효산물이다. SL는 세포를 동결시키기 전에 첨가함으로써(전첨가), 세포 내에 침투되어, 세포 내의 빙결정을 억제하고, 동결 시에 첨가함으로써 세포 외의 빙결정을 억제함에 따라 효과를 발휘한다고 생각된다. 이하의 실험예, 실시예에서 사용하는 SL는 일본 특허공개 제2016-160244호 공보의 기재에 따라 제조하였다. 또한, SL는 pH6∼8로 조정한 것을 사용하였다. pH 조정제로서, 알칼리제, 산 등을 들 수 있다.
다가 알코올이란, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등이며, 바람직하게는 프로필렌글리콜이다.
세포 보존액의 세포란, 동식물 세포를 말한다. 체세포, 암세포, 주화 세포, 줄기 세포 등이다.
또한, 세포로 구성되는 조직, 장기, 동식물 등의 개체에도 동일하게 응용할 수 있다. 식물이나 동물 유래의 식품의 선도를 유지하는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명을 이용한 동결·융해 방법은 특별히 한정되지 않고, 동결할 때의 미세한 온도 컨트롤을 실행하지 않아도, 통상의 완만 동결·급속 융해라도 가능하다.
[실험예 빙결정 억제 조성물과 빙결정 생성 억제 효과]
가장 범용되고 있는 세포 보존 시에 사용하는 배지인 둘베코수정배지(DMEM)에 표 1의 조성물을 7:3의 용량비로 혼화하였다. 각 시료를 15㎖ 원침관(Thermo Scientific BioLite)에 분주하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시키고, -80℃ 10분 후에 시료의 외관을 육안으로 관찰하였다.
Figure 112019087080513-pct00001
표 1의 결과로부터, 실험예 1∼4는 실험예 5, 6보다 빙결정 생성 억제 효과가 확인되었다.
표 2의 조성이 되도록 초순수로 제조하였다. 각 시료를 주사형 프로브 현미경(AFM5000／AFM5300, 히타치하이테크사이언스)의 냉각 스테이지에서 동결시키고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 본 시험은, 오사카대학 나노테크놀로지 설비 병용 거점의 지원 하에 실시하였다. 또한, 관찰한 화상을 화상 해석 프로그램(OLYMPUS cellSens Standard)을 이용하여 빙결정 하나당 면적을 계측하였다.
Figure 112019087080513-pct00002
도 1은 빙정 형성 억제에 대한 현미경 사진도이며, 그 중 (A)는 초순수이고, (B)는 10중량% SL이고, (C)는 0.1중량% SL이며, (D)는 10중량% DMSO이고, (E)는 10중량% Gly이며, (F)는 10중량% PG이고, (G)는 10중량% EG이며, (H)는 10중량% APG이다. 도 1의 (B) 및 (C)에 나타내는 바와 같이, 조성이 SL인 경우에는 10중량%여도 0.1중량%여도 빙정 형성 억제 효과가 있었다. 도 1의 (A), (D), (E), (F) 및 (G)에 나타내는 바와 같이, SL 이외의 경우에는 빙정 형성 억제 효과는 충분하지 않았지만, 도 1의 (H)에 나타내는 바와 같이 SL와 동일한 당지질형 계면활성제인 APG의 경우는 빙정 형성 억제 효과가 확인되었다.
실시예
[1 동결 보존 전 배양 시 SL 첨가 효과(정상 인간 섬유아세포, 혈청 첨가 배지)]
정상 인간 섬유아세포(쿠라보 주식회사)를 3.2Х104cells/㎖가 되도록 6웰 플레이트에 파종하고, 48시간 배양하였다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 5중량% SL 수용액을 0.05용량%가 되도록 소태아혈청 함유 DMEM에서 희석하여 첨가하였다. 소정시간 배양 후, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 나머지 세포를 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 10% DMSO/소태아혈청 함유 DMEM 1㎖에 현탁하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(해동 후의 생세포 수). 나머지 세포 현탁액을 6웰 플레이트에 파종하고, 72시간 배양하였다. 배양 후의 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(배양 후의 생세포 수).
해동 시의 생존율과 증식률을 이하의 식에 의해 각각 산출하였다.
해동 시의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 해동 후의 총 세포 수 Х 100
증식률(%) = 배양 후의 생세포 수 / 해동 후의 생세포 수 Х 100
Figure 112019087080513-pct00003
표 3의 결과로부터, SL를 세포 동결 보존 1시간에서 6시간 전에 첨가하여 배양하면, 미첨가보다 세포의 해동 시의 생존율 및 세포 증식률이 높아지는 것을 알 수 있었다.
또한 해동 시의 생존율뿐만 아니라, 동결 전후의 생존율에 대해서도 검토하였다. 즉, 정상 인간 섬유아세포(쿠라보 주식회사)를 4.0Х104cells/㎖가 되도록 10mm 접시에 파종하고, 72시간 배양하였다. 배양 후, 5중량% SL 수용액을 0.05용량%가 되도록 첨가하였다. 소정 시간 배양 후, 2.0Х104cells/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양하고, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(미동결의 흡광도). 나머지 세포를 세포 밀도가 4.0Х105cells/㎖가 되도록 세포 현탁액을 제조하고, 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 20% DMSO와 1:1의 용량비로 혼합하였다. 동결 처리 용기 BICELL(일본프리저 주식회사)에 넣고, -80℃ 조건 하에서 냉각시켰다. 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 100μL를 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양하여, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(동결 보존 후의 흡광도).
동결 전후의 생존율과 증식률을 이하의 식에 의해 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 동결 보존 후의 흡광도(6시간 배양) / 미동결의 흡광도(6시간 배양)
증식률(%) = 동결 보존 후의 흡광도(72시간 배양) / 미동결의 흡광도(72시간 배양)
Figure 112019087080513-pct00004
표 4의 결과로부터, SL를 세포 동결 보존 1시간에서 6시간 전에 첨가하여 배양하면, 미첨가보다 세포의 동결 전후의 생존율 및 세포 증식률이 높아지는 것을 알 수 있었다.
[2 동결 보존 전 배양 시 SL 첨가 효과(정상 인간 섬유아세포, 혈청 무첨가 배지)]
정상 인간 섬유아세포(쿠라보 주식회사)를 3.2Х104cells/㎖가 되도록 6웰 플레이트에 파종하고, 48시간 배양하였다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 5중량% SL 수용액을 0.05용량%가 되도록 DMEM 배지에서 희석하여 첨가하였다. 6시간 배양 후, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 나머지 세포를 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 10% DMSO/DMEM 1㎖에 현탁하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
동결 전후의 생존율을 이하의 식에 의해 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 동결 전의 생세포 수 Х 100
Figure 112019087080513-pct00005
표 5의 결과로부터, SL를 세포 동결 보존 6시간 전에 첨가하여 배양하면, 미첨가보다 동결 전후의 세포의 생존율이 높아지는 것을 알 수 있었다.
[3 동결 보존 전 배양 시 SL 첨가 효과(간엽계 줄기 세포, 혈청 무첨가 배지)]
간엽계 줄기 세포(Lonza)를 3.2Х104cells/㎖가 되도록 6웰 플레이트에 파종하고, 48시간 배양하였다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 5중량% SL 수용액을 0.05용량%가 되도록 MSCGM-CD 배지에서 희석하여 첨가하였다. 6시간 배양 후, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 나머지 세포를 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 10% DMSO/MSCGM-CD 배지 1㎖에 현탁하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
동결 전후의 생존율을 이하의 식에 의해 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 동결 전의 생세포 수 Х 100
Figure 112019087080513-pct00006
표 6의 결과로부터, SL를 세포 동결 보존 6시간 전에 첨가하여 배양하면, 미첨가보다 세포의 동결 전후의 생존율이 높아지는 것을 알 수 있었다.
[4 동결 보존 전 배양 없이 SL 첨가 효과(정상 인간 섬유아세포, 혈청 첨가 배지)]
정상 인간 섬유아세포(쿠라보 주식회사)의 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 7, 8의 각 시료와 세포현탁액을 3:7의 용량비로 혼합하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(해동 후의 생세포 수). 나머지 세포 현탁액을 6웰 플레이트에 파종하고, 72시간 배양하였다. 배양 후의 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(배양 후의 생세포 수).
동결 전후의 생존율과 증식률을 이하의 식에 의해 각각 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 동결 전의 생세포 수 Х 100
증식률(%) = 배양 후의 생세포 수 / 해동 후의 생세포 수 Х 100
Figure 112019087080513-pct00007
표 7의 결과로부터, 실시예 12, 13은 높은 세포 생존율이 확인되고, 실시예 13은 비교예 4∼6보다 생존율이 높았다.
Figure 112019087080513-pct00008
실시예 14는, 비교예 7보다 증식률이 높았다.
또한, 정상 인간 섬유아세포를 2.0Х104cells/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양 후, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(미동결의 흡광도). 나머지 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 4.0Х105cells/㎖가 되도록 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 9의 각 조성물과 세포현탁액을 1:1의 용량비로 혼합하고, 동결 처리 용기 BICELL(일본프리저 주식회사)에 넣고, -80℃ 조건 하에서 냉각시켰다. 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 100μL를 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양하고, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(동결 보존 후의 흡광도).
생존율과 증식률을 이하의 식에 의해 산출하였다.
생존율(%) = 동결 보존 후의 흡광도(6시간 배양) / 미동결의 흡광도(6시간 배양)
증식률(%) = 동결 보존 후의 흡광도(72시간 배양) / 미동결의 흡광도(72시간 배양)
Figure 112019087080513-pct00009
표 9의 결과로부터, 본 발명의 실시예는 높은 세포 생존율 및 높은 세포 증식률을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
[5 동결 보존 전 배양 없이 SL 첨가에 DMSO 첨가가 미치는 영향(쥐골격근 근아세포, 혈청 첨가 배지)]
쥐골격근 근아세포(JCRB9081 L6)의 생세포 수를 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 나머지 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 10의 각 조성물과 세포현탁액을 3:7의 용량비로 혼합하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
생존율을 이하의 식에 의해 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 동결 전의 생세포 수 Х 100
또한, 근아세포의 성질로서, 5일간 배양 후의 배양 상청 중의 사이토카인(VEGF)을 ELISA로 정량하였다.
Figure 112022067080043-pct00026
표 10의 결과로부터, 실시예 16∼17은 비교예 8(33중량% DMSO만)보다 세포의 생존율이 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 실시예 16∼17은 비교예 8(33중량% DMSO만)보다 VEGF 양이 높은 것을 알 수 있었다. 이는 동결에 의한 세포의 성질에 대한 영향이 본 실시예에서는 비교예보다 적은 것을 의미한다.
[6 동결 보존 전 배양 없이 SL 첨가에 DMSO 첨가가 미치는 영향(인간골격근 근아세포, 혈청 첨가 배지)]
인간골격근 근아세포(환자로부터)의 생세포 수를 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 나머지 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 11의 각 조성물과 세포현탁액을 3:7의 용량비로 혼합하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
생존율을 이하의 식에 의해 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 동결 전의 생세포 수 × 100
Figure 112019087080513-pct00011
표 11의 결과로부터, 실시예 18∼21은 비교예 9(33중량% DMSO만)보다 세포의 생존율이 높은 것을 알 수 있었다.
또한, SL 첨가에 DMSO 첨가가 미치는 영향을 혈청 첨가 배지를 이용하여 Caco-2 세포의 해동 시의 생존율을 조사하였다. 즉, Caco-2 세포(인간 결장 선암)의 생세포 수를 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 나머지 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 12의 각 조성물과 세포현탁액을 1:1의 용량비로 혼합하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
생존율을 이하의 식에 의해 산출하였다.
해동 시의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 해동 후의 총 세포 수 × 100
Figure 112019087080513-pct00012
표 12의 결과로부터, 본 발명의 실시예는 비교예(20중량% DMSO만)보다 해동 시의 생존율이 높은 것을 알 수 있었다.
[7 동결 보존 전 배양 없이 SL 첨가에 PG 첨가가 미치는 영향(정상 인간 섬유아세포, 혈청 무첨가 배지)]
정상 인간 섬유아세포(쿠라보 주식회사)의 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 세포를 비혈청 DMEM에서 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 13의 각 시료와 세포현탁액을 3:7의 용량비로 혼합하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
동결 전후의 생존율과 증식 후의 생존율을 이하의 식에 의해 각각 산출하였다.
동결 전후의 생존율(%) = 해동 후의 생세포 수 / 동결 전의 생세포 수 × 100
증식 후의 생존율(%) = 배양 후의 생세포 수 / 배양 후의 총 세포 수 × 100
Figure 112019087080513-pct00013
표 13의 결과로부터, 실시예 22, 23은, 동결 전후의 생존율이 비교예 10보다 높았다. 또한, 실시예 23은 비교예 10, 11보다 증식 후의 생존율이 높았다.
[8 동결 보존 전 배양 없이 SL 첨가에 PG 첨가가 미치는 영향(간엽계 줄기 세포, 혈청 무첨가 배지)]
간엽계 줄기 세포(Lonza)의 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(동결 전의 생세포 수). 세포를 MSCGM-CD 배지에서 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 14의 각 시료와 세포현탁액을 3:7의 용량비로 혼합하고, 4℃ 조건 하에서 5분, -20℃ 조건 하에서 20분, -80℃ 조건 하의 순으로 냉각시켰다. -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 생세포 수를 트리판블루 염색에 의해 계측하였다(해동 후의 생세포 수).
동결 전후의 잔존율을 이하의 식에 의해 각각 산출하였다.
동결 전후의 잔존율(%) = 해동 후의 총 세포 수 / 동결 전의 총 세포 수 × 100
Figure 112019087080513-pct00014
표 14의 결과로부터, 실시예 24∼26은, 동결 전후의 잔존율이 비교예 12보다 높았다. 또한, 실시예 25, 26은, 동결 전후의 잔존율이 비교예 13보다 높았다.
또한, 동결 보존 전 배양 없이 SL 첨가에 PG 이외의 다가 알코올 첨가가 미치는 영향(간엽계 줄기 세포, 혈청 첨가 배지)을 조사하였다. 즉, 간엽계 줄기 세포(Lonza)를 2.0Х104cells/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양 후, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(미동결의 흡광도). 나머지 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 4.0Х105cells/㎖가 되도록 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 15의 각 조성물과 세포현탁액을 1:1의 용량비로 혼합하고, 동결 처리 용기 BICELL(일본프리저 주식회사)에 넣고, -80℃ 조건 하에서 냉각시켰다. 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 100μL를 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양하고, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(동결 보존 후의 흡광도). 또한, 동결 전후의 세포 유전자(mRNA) 발현을 평가하였다.
생존율과 증식률은 이하의 식에 의해 산출하였다.
생존율(%) = 동결 보존 후의 흡광도(6시간 배양) / 미동결의 흡광도(6시간 배양)
증식률(%) = 동결 보존 후의 흡광도(72시간 배양) / 미동결의 흡광도(72시간 배양)
Figure 112019087080513-pct00015
표 15의 결과로부터, 본 발명의 실시예는 동결 전후의 생존율이 높았다. 또한 동결 전후의 증식률도 높았으나, 0.2중량% SL 첨가인 경우는 약간 동결 전후의 생존율이 저하되었다.
또한, 본 발명의 실시예 0.02중량% SL+30중량% Gly, 0.02중량% SL+30중량% EG 및 0.1중량% SL+30중량% Gly의 경우와, 비교예 20중량% DMSO의 경우에 대해 세포의 유전자 발현을 조사하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. CD34 및 CD73은 간엽계 줄기 세포의 마커이지만, 미동결 시와 비교하여 본 발명에 따른 실시예에서는 변동이 거의 없고, 간엽계 줄기 세포로서의 성질이 유지되었다고 생각된다. 또한, 세포 분열을 촉진시키는 가속 역할이 되는 암 유전자인 c-myc는, 미동결 시와 비교하여 비교예 26(20중량% DMSO)에서는 변동이 확인된 것에 비하여, 본 발명에 따른 실시예에서는 변동이 거의 없고, 간엽계 줄기 세포에 대한 영향이 적다고 생각된다.
[9 조성물의 세포 독성(간엽계 줄기 세포)]
간엽계 줄기 세포(Lonza)를 2.0Х104cells/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 72시간 배양하였다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 표 16의 각 조성물의 농도가 되도록 소태아혈청 비함유 DMEM에서 희석하여 첨가하였다. 48시간 배양 후, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다.
생존율은 이하의 식에 의해 산출하였다.
생존율(%) = 조성물 노출 후의 흡광도 / 미처리 흡광도
Figure 112019087080513-pct00016
표 16의 결과로부터, 간엽계 줄기 세포에 대해서, SL+글리세린의 경우는 DMSO와 비교하여 독성이 낮은 것이 나타났다.
[10 해동 후, 동결 보존 조성을 제거하지 않고 그대로 배양한 결과(간엽계 줄기 세포)]
간엽계 줄기 세포(Lonza)를 2.0Х104cells/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 또는 72시간 배양 후, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(미동결의 흡광도). 나머지 세포를 소태아혈청 함유 DMEM에서 4.0Х105cells/㎖가 되도록 현탁하였다. 크라이오제닉바이알(산쇼 주식회사) 중에서 표 17의 각 조성물과 세포현탁액을 1:1의 용량비로 혼합하고, 동결 처리 용기 BICELL(일본프리저 주식회사)에 넣고, -80℃ 조건 하에서 냉각시켰다. 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 각 조성물을 제거하지 않고 100μL를 96웰 플레이트에 파종하여 6시간 배양하여, Cell Counting Kit-8(도진 화학 연구소)에 의해 흡광도를 측정하였다(동결 보존 후의 흡광도).
생존율과 증식률은 이하의 식에 의해 산출하였다.
생존율(%) = 동결 보존 후의 흡광도(6시간 배양) / 미동결의 흡광도(6시간 배양)
Figure 112019087080513-pct00017
각 실시예의 경우 및 비교예의 경우에 대해 세포의 형태를 현미경 관찰하였다. 도 3은 세포 형태에 대한 현미경 사진도이며, 그 중 (A)는 0.2중량% SL＋30중량% Gly이고, (B)는 0.2중량% SL＋20중량% Gly이며, (C)는 0.2중량% SL＋15중량% Gly이고, (D)는 0.1중량% SL＋30중량% Gly이며, (E)는 0.1중량% SL＋20중량% Gly이고, (F)는 0.1중량% SL＋15중량% Gly이며, (G)는 0.05중량% SL＋30중량% Gly이고, (H)는 0.05중량% SL＋20중량% Gly이며, (I)는 0.05중량% SL＋15중량% Gly이고, (J)는 30중량% Gly이며, (K)는 20중량% DMSO이다. 표 17의 결과로부터, 간엽계 줄기 세포에 대해서, SL+글리세린의 경우는 DMSO와 비교하여 독성이 낮은 것이 나타났다. 또한, 도 3의 결과로부터 SL+글리세린의 경우에는 DMSO와 비교하여 세포의 형태도 양호한 것으로 나타났다.
[11 야채 또는 과일의 냉동 보존에서의 SL의 첨가 효과]
각 식품(오이, 시금치, 사과)을, 각각, 표 18, 표 19, 표 20의 조성이 되도록 물로 제조한 용액 100g에 30분간 침지하였다. 침지 후, 키친타올로 여분의 수분을 닦아 내고, -20℃에서 냉동시켰다. 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 해동시키고, 외관 및 식감을 이하의 판정 기준에 따라 평점하였다.
＜판정 기준＞
3 : 냉동 전과 비교하여 차이는 관찰되지 않음
2 : 냉동 전과 비교하여 차이가 관찰됨
1 : 냉동 전과 비교하여 상당한 차이가 관찰됨
Figure 112019087080513-pct00018
Figure 112019087080513-pct00019
Figure 112019087080513-pct00020
표 18, 표 19 및 표 20의 결과로부터, 야채 또는 과일을 냉동 보존하기 전에 SL 첨가 용액에 침지함으로써, 냉동 보존 후 해동한 경우, 맛 및 식감이 양호한 것을 확인할 수 있었다.
[12 어류 또는 육류의 냉동 보존에서의 SL의 첨가 효과]
각 식품(다랑어, 간)을, 각각, 표 21, 22의 조성이 되도록 물로 제조한 용액 100g에 30분간 침지하였다. 침지 후, 키친타올로 여분의 수분을 닦아 내고, 중량 측정(냉동 전의 중량) 후, -20℃에서 냉동시켰다. 하룻밤 보존한 후, 37℃에서 해동시키고, 외관 관찰과 드립양 측정을 행하였다. 외관을 이하의 판정 기준에 따라 평점하였다.
＜판정 기준＞
3 : 냉동 전과 비교하여 차이는 관찰되지 않음
2 : 냉동 전과 비교하여 차이가 관찰됨
1 : 냉동 전과 비교하여 상당한 차이가 관찰됨
드립양(식재료를 제거한 후의 중량)을 측정하여, 이하의 식에 의해 드립 유출율을 산출하였다. 드립양이란, 식품을 해동했을 때, 세포 내의 얼음이 녹아 물이 되어, 손상된 세포로부터 흘러 나오는 수분을 말한다.
드립 유출율(%) = 드립양 / 동결 전의 중량 × 100
Figure 112019087080513-pct00021
Figure 112019087080513-pct00022
표 21 및 표 22의 결과로부터, 어류 또는 고기를 냉동 보존하기 전에 SL 첨가 용액에 침지함으로써, 드립 유출량이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 소포로오스 리피드를 0.01중량%에서 20중량% 포함하고, 세포의 동결 보존시에 사용되고, 동결 보존 후의 세포 생존율을 높이는 용도로 사용되는, 동결 보존 후의 세포 생존율을 높이는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    디메틸술폭시드(DMSO)를 5중량%에서 10중량% 포함하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    다가 알코올을 1중량%에서 50중량% 포함하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    다가 알코올로서, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중 적어도 어느 하나를 포함하는 조성물.
  5. 소포로오스 리피드 및 다가 알코올을 포함하고, 디메틸술폭시드(DMSO)를 포함하지 않는, 세포의 동결 보존시에 사용되고, 동결 보존 후의 세포 생존율을 높이는 용도로 사용되는, 동결 보존 후의 세포 생존율을 높이는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 다가 알코올은 글리세린이고, 세포는 줄기 세포인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 간엽계 줄기 세포인 조성물.
  8. 세포를 동결 보존하기 직전으로부터 6시간 전의 사이에, 세포 배양 배지 중에 제 1 항에 기재된 조성물을 1용량%가 되도록 첨가하여 세포를 동결 보존하는 방법.
  9. 세포를 동결 보존할 때, 세포 배양 배지 중에 제 2 항에 기재된 조성물을 10용량%에서 99용량% 첨가하여 세포를 동결 보존하는 방법.
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