WO2018143166A1 - 細胞の凍結保存組成物および凍結保存方法 - Google Patents

細胞の凍結保存組成物および凍結保存方法 Download PDF

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明日香 野上
宗樹 龍見
七瀬 石井
瑞之 竜
善彦 平田
芳樹 澤
繁 宮川
充弘 齋藤
弘達 大河原
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サラヤ株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62—DMSO

Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation composition used for cryopreserving cells and a cryopreservation method using the composition.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Non-Patent Document 2 dimethyl sulfoxide
  • Non-Patent Document 2 DMSO is the most effective and frequently used (Non-Patent Document 2), but it does not satisfy the preservation rate of cells, and it cannot always be said that the effect of suppressing ice crystals is sufficient. .
  • Patent Document 3 one that enhances the effect of DMSO by adding polyether
  • Patent Document 4 one that enhances the cytoprotective effect by using fructan
  • Patent Document 5 stem cells by blending carboxylated polylysine
  • concentration of fructan added is as high as 30%, it is difficult to remove economically after storage, or cell storage of carboxylated polylysine focuses only on stem cells, and is not versatile. Since it is a polypeptide, there is a concern about the influence on the functionality of cells, and the preservation of cells is not always satisfactory. Therefore, a low toxicity that can preserve all cells is desired.
  • Patent No. 5940975 JP 2001-247401 A Japanese National Patent Publication No. 10-511402 JP 2012-235728 A Japanese Patent No. 5630979 JP 2016-160244 A
  • sophorose lipid has an effect of suppressing the formation of ice crystals and can easily suppress cell damage due to frost damage.
  • SL sophorose lipid
  • a composition containing 0.01% to 20% by weight of sophorose lipid to enhance cell viability after cryopreservation [2] A composition containing 5% to 10% by weight of dimethyl sulfoxide (DMSO) Composition [3] containing 1 to 50% by weight of polyhydric alcohol [1] or [2] The composition [4] polyhydric alcohol as at least one of glycerin, ethylene glycol, and propylene glycol The composition described in [3] containing 5 [5] and the composition described in [1] was added to the cell culture medium so as to be 1% by volume in the cell culture medium immediately before and 6 hours before cryopreserving the cells.
  • Method of cryopreserving cells [6] When cells are cryopreserved, the cells are cryopreserved by adding 10% to 99% by volume of the composition described in [2] to [4] to the cell culture medium. how to
  • SL can reduce frost damage caused by cells.
  • a cell survival rate of a certain level or more can be obtained without depending on the effects of DMSO and serum.
  • FIG. 4 is a micrograph of cell morphology, of which (A) is 0.2% SL + 30% Gly, (B) is 0.2% SL + 20% Gly, and (C) is 0.2% SL + 15% Gly.
  • (D) is 0.1% SL + 30% Gly
  • (E) is 0.1% SL + 20% Gly
  • (F) is 0.1% SL + 15% Gly
  • (G) is 0 .05% SL + 30% Gly
  • (H) is 0.05% SL + 20% Gly
  • (I) is 0.05% SL + 15% Gly
  • (J) is 30% Gly
  • (K) Is 20% DMSO.
  • SL is a low-toxic glycolipid type biosurfactant, which is a fermentation product obtained from yeast fermentation. When SL is added before freezing (pre-addition), it is taken into the cell and suppresses ice crystals inside the cell. When SL is added during freezing, it suppresses extracellular ice crystals. It is thought to be effective.
  • SL used in the following experimental examples and examples was prepared according to the description in JP-A No. 2016-160244. The SL was adjusted to pH 6-8. Examples of the pH adjuster include an alkali agent and an acid.
  • the polyhydric alcohol is glycerin, ethylene glycol, propylene glycol or the like, preferably propylene glycol.
  • the cells in the cell preservation solution are animal and plant cells. Somatic cells, cancer cells, cell lines, stem cells, etc.
  • the freezing / thawing method using the present invention is not particularly limited, and normal slow freezing / rapid thawing is possible without performing fine temperature control during freezing.
  • Example Ice Crystal Inhibition Composition and Ice Crystal Inhibition Effect The composition shown in Table 1 was mixed in a volume ratio of 7: 3 with Dulbecco's modified medium (DMEM), which is the most commonly used medium for cell storage. Each sample was dispensed into a 15 mL centrifuge tube (Thermo Scientific BioLite), cooled in the order of 5 minutes at 4 ° C, 20 minutes at -20 ° C, and -80 ° C, and after 10 minutes at -80 ° C. The appearance of the sample was visually observed.
  • DMEM Dulbecco's modified medium
  • FIG. 1 is a photomicrograph of ice crystal formation inhibition, of which (A) is ultrapure water, (B) is 10 wt% SL, (C) is 0.1 wt% SL, (D) is 10 wt% DMSO, (E) is 10 wt% Gly, (F) is 10 wt% PG, (G) is 10 wt% EG, (H) is 10 wt% % APG. As shown in FIGS. 1B and 1C, when the composition is SL, the ice crystal formation suppressing effect was obtained at 10 wt% or 0.1 wt%. As shown in FIGS.
  • the remaining cells were suspended in 1 mL of 10% DMSO / fetal calf serum-containing DMEM in a cryogenic vial (Sansho), 5 minutes at 4 ° C, 20 minutes at -20 ° C, and -80 ° C. Cooled in order. After overnight storage at ⁇ 80 ° C., thawed rapidly at 37 ° C., and the number of viable cells was counted by trypan blue staining (viable cell number after thawing). The remaining cell suspension was seeded in a 6-well plate and cultured for 72 hours. The number of viable cells after culture was counted by trypan blue staining (number of viable cells after culture).
  • the survival rate and proliferation rate upon thawing were calculated by the following formulas.
  • human normal fibroblasts (Kurabo) were seeded in a 10 mm dish so as to be 4.0 ⁇ 10 4 cells / ml and cultured for 72 hours. After culturing, a 5 wt% SL aqueous solution was added to a concentration of 0.05% by volume. After culturing for a predetermined time, the cells were seeded on a 96-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / ml and cultured for 6 or 72 hours, and the absorbance was measured by Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) ( Unfreezed absorbance).
  • a cell suspension was prepared so that the remaining cells had a cell density of 4.0 ⁇ 10 5 cells / ml, and a cryogenic vial (Sansho) was used at a volume ratio of 1: 1 with 20% DMSO. Mixed. It put into the freezing processing container BICELL (Japan freezer), and cooled on -80 degreeC conditions. After overnight storage, thaw quickly at 37 ° C., inoculate 100 ⁇ L on a 96-well plate, incubate for 6 or 72 hours, and measure absorbance by Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) Absorbance).
  • Human normal fibroblasts (Kurabo) were seeded in a 6-well plate at 3.2 ⁇ 10 4 cells / ml and cultured for 48 hours. After culturing, the culture medium was removed, and a 5% by weight SL aqueous solution was diluted with DMEM medium to 0.05% by volume and added. After culturing for 6 hours, the number of viable cells was counted by trypan blue staining (number of viable cells before freezing).
  • the remaining cells were suspended in 1 mL of 10% DMSO / DMEM in a cryogenic vial (Sansho), and cooled in order of 5 minutes at 4 ° C, 20 minutes at -20 ° C, and -80 ° C. . After overnight storage at ⁇ 80 ° C., thawed rapidly at 37 ° C., and the number of viable cells was counted by trypan blue staining (viable cell number after thawing).
  • the survival rate before and after freezing was calculated by the following formula.
  • the remaining cells were suspended in 1 mL of 10% DMSO / MSCGM-CD medium in a cryogenic vial (Sansho), 5 minutes at 4 ° C, 20 minutes at -20 ° C, and -80 ° C. Cooled in order. After overnight storage at ⁇ 80 ° C., thawed rapidly at 37 ° C., and the number of viable cells was counted by trypan blue staining (viable cell number after thawing).
  • the survival rate before and after freezing was calculated by the following formula.
  • the survival rate and proliferation rate before and after freezing were calculated according to the following formulas.
  • Examples 12 and 13 showed a high cell survival rate, and Example 13 had a higher survival rate than Comparative Examples 4 to 6.
  • Example 14 had a higher growth rate than Comparative Example 7.
  • human normal fibroblasts were seeded on a 96-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / ml and cultured for 6 hours or 72 hours, and then the absorbance was measured with Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). (Absorbed absorbance). The remaining cells were suspended in DMEM containing fetal bovine serum so as to be 4.0 ⁇ 10 5 cells / ml. In a cryogenic vial (Sansho), each composition shown in Table 9 and the cell suspension were mixed at a volume ratio of 1: 1, put into a freezing container BICELL (Japan Freezer), and under the condition of -80 ° C. Cooled down.
  • VEGF cytokine
  • the survival rate before and after freezing and the survival rate after growth were calculated by the following formulas.
  • Example 22 and 23 had higher survival rates before and after freezing than Comparative Example 10. In addition, Example 23 had a higher survival rate after growth than Comparative Examples 10 and 11.
  • the residual rate before and after freezing was calculated by the following formulas.
  • Residual rate before and after freezing total number of cells after thawing / total number of cells before freezing ⁇ 100
  • mesenchymal stem cells (Lonza) were seeded on a 96-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / ml and cultured for 6 hours or 72 hours, and the absorbance was measured by Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). Was measured (unfrozen absorbance). The remaining cells were suspended in DMEM containing fetal bovine serum so as to be 4.0 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • each composition shown in Table 15 and the cell suspension were mixed at a volume ratio of 1: 1, put into a freezing container BICELL (Japan Freezer), and under the condition of -80 ° C. Cooled down. After storing overnight, thawed rapidly at 37 ° C., 100 ⁇ L was seeded on a 96-well plate, cultured for 6 hours or 72 hours, and the absorbance was measured by Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). Absorbance after storage). In addition, cellular gene (mRNA) expression before and after freezing was evaluated.
  • mRNA cellular gene
  • the examples of the present invention had a high survival rate before and after freezing.
  • the growth rate before and after freezing was also high, but the survival rate before and after freezing slightly decreased when 0.2 wt% SL was added.
  • c-myc which is an oncogene serving as an accelerator that promotes cell division, was observed to vary in Comparative Example 26 (20 wt% DMSO) as compared to when it was not frozen. In the examples according to the present invention, there is almost no variation, and it is considered that there is little influence on the mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells had lower toxicity in the case of SL + glycerine than DMSO.
  • Mesenchymal stem cells (Lonza) are seeded on a 96-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / ml and cultured for 6 or 72 hours, and then the absorbance is measured with Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). (Absorbed absorbance). The remaining cells were suspended in DMEM containing fetal bovine serum so as to be 4.0 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • each composition shown in Table 17 and the cell suspension were mixed at a volume ratio of 1: 1, placed in a freezing container BICELL (Japan Freezer), and at ⁇ 80 ° C. Cooled down. After overnight storage, thawed rapidly at 37 ° C., and without removing each composition, 100 ⁇ L was seeded on a 96-well plate and cultured for 6 hours. Absorbance was measured using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). Was measured (absorbance after cryopreservation).
  • FIG. 3 is a photomicrograph of cell morphology, of which (A) is 0.2 wt% SL + 30 wt% Gly, (B) is 0.2 wt% SL + 20 wt% Gly, and (C) is 0.2 wt% SL + 15 wt% Gly, (D) is 0.1 wt% SL + 30 wt% Gly, (E) is 0.1 wt% SL + 20 wt% Gly, and (F) is 0.
  • Drip outflow rate (%) Drip amount / Weight before freezing x 100

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Abstract

細胞を凍結保存時に簡便に添加して、細胞の生存率を向上させる。ソホロースリピッドを０．０１重量％から２０重量％含む組成物を凍結保存の直前から６時間前までの間に１容量％添加して細胞を保存する。この組成物は細胞の凍害を減少させることにより、凍結保存時の細胞生存率を向上させることが可能であり、ＤＭＳＯおよび血清を使用せずに細胞を保存できる。また、細胞凍結保存時の凍結速度の細かな制御も不要であり、簡便で低廉な保存方法である。

Description

細胞の凍結保存組成物および凍結保存方法
　本発明は、細胞を凍結保存するために用いる凍結保存組成物およびそれを用いた凍結保存方法に関する。
　細胞の凍結保存は、継代による細胞変質の防止、継代に伴う雑菌による汚染の防止、細胞の輸送、などを行う上で必須の技術として広く利用されている。しかし、細胞を凍結する過程において、細胞内外の水分が氷結晶となり細胞にダメージを与えることが知られている（非特許文献１）。そのため、凍結、融解時のダメージから細胞を保護し、さらに細胞の性質を維持して凍結保存することが望まれる。
　通常の凍結保存は、氷結晶によるダメージから細胞を保護するために凍結防御剤を添加したウシ血清などを含有した培養液に細胞を懸濁し、クライオチューブ等に詰めて冷却し、最終的に－８０℃もしくは－１９６℃の極低温で凍結保存するのが一般的である。凍結防御剤としては、５～２０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン（Ｇｌｙ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）などが用いられている（特許文献１、２）。そのなかで最も効果が高く、よく用いられているのがＤＭＳＯである（非特許文献２）が、細胞の保存率が満足した結果にならず、かならずしも氷結晶の抑制効果が十分とはいえない。
　また、ポリエーテルを添加することでＤＭＳＯの効果を増強したもの（特許文献３）、フルクタンを使用することで細胞保護効果を高めたもの（特許文献４）、カルボキシル化ポリリジンを配合することで幹細胞の保存効果を高めたもの（特許文献５）があるが、いずれも氷結晶生成抑制効果が十分とは言えない。さらに、ポリエーテルの残留による細胞毒性が懸念され、より低毒性の保存液が望まれている。また、フルクタンの添加濃度が３０％と高濃度なため経済的な問題や、保存後の除去が困難だったり、カルボキシル化ポリリジンの細胞保存は幹細胞のみに着目したもので、汎用性が低く、またポリペプチドであることから細胞の機能性への影響が懸念されるなどで、細胞の保存に関してかならずしも満足とは限らない。従って、すべての細胞を保存できる低毒性なものが望まれている。
特許第５９４０９７５号 特開２００１－２４７４０１号公報 特表平１０－５１１４０２号公報 特開２０１２－２３５７２８号公報 特許５６３０９７９号 特開２０１６－１６０２４４号公報
Ｍａｚｕｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４７：Ｃ１２５－１４２，１９８４ Ｋｏｖｅｌｏｃｋ　ＪＥ　ａｎｄ　Ｂｉｏｓｈｏｐ　ＭＷＨ，Ｎａｔｕｒｅ　１８３：１３９４－１３９５，１９５９
　現状の凍結保存法では、氷結晶の生成抑制効果が不十分であり、凍害から細胞を保護する効果が十分ではないため、毒性の低い新規凍結保存剤の開発が望まれている。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ソホロースリピッド（ＳＬ）が氷結晶生成を抑制する効果を有し、簡便に凍害による細胞ダメージを抑制できることを見出した。これを利用し、０．０１重量％から２０重量％のＳＬを凍結保存する前の細胞培養液中に添加することで、細胞の保存効率が高まることを見出した。また、細胞凍結時に、ＳＬを０．０１重量％から２０重量％添加するとＤＭＳＯの毒性を緩和することも見出した。さらに、０．０１重量％から２０重量％のＳＬに１重量％から５０重量％の多価アルコールを配合することで、ＤＭＳＯを添加せずに保存後の細胞生存率が高まることを見出した。すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］ソホロースリピッドを０．０１重量％から２０重量％含む凍結保存後の細胞生存率を高める組成物
［２］ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５重量％から１０重量％含む［１］に記載する組成物
［３］多価アルコールを１重量％から５０重量％含む［１］または［２］に記載する組成物
［４］多価アルコールとして、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールのいずれか少なくとも一つを含む［３］に記載する組成物
［５］細胞を凍結保存する直前から６時間前の間で細胞培養培地中に［１］で記載する組成物を１容量％となるように添加して細胞を凍結保存する方法
［６］細胞を凍結保存する際に、細胞培養培地中に［２］乃至［４］に記載する組成物を１０容量％から９９容量％添加して細胞を凍結保存する方法
　ＳＬの添加により、細胞の受ける凍害を低減できる。この結果、ＤＭＳＯや血清の効果に頼らずとも一定水準以上の細胞生存率が得られる。
氷晶形成抑制についての顕微鏡写真図であり、そのうち（Ａ）は超純水であり、（Ｂ）は１０％ＳＬであり、（Ｃ）は０．１％ＳＬであり、（Ｄ）は１０％ＤＭＳＯであり、（Ｅ）は１０％Ｇｌｙであり、（Ｆ）は１０％ＰＧであり、（Ｇ）は１０％ＥＧであり、（Ｈ）は１０％ＡＰＧである。 細胞マーカーの発現を示す図である。 細胞形態についての顕微鏡写真図であり、そのうち（Ａ）は０．２％ＳＬ＋３０％Ｇｌｙであり、（Ｂ）は０．２％ＳＬ＋２０％Ｇｌｙであり、（Ｃ）は０．２％ＳＬ＋１５％Ｇｌｙであり、（Ｄ）は０．１％ＳＬ＋３０％Ｇｌｙであり、（Ｅ）は０．１％ＳＬ＋２０％Ｇｌｙであり、（Ｆ）は０．１％ＳＬ＋１５％Ｇｌｙであり、（Ｇ）は０．０５％ＳＬ＋３０％Ｇｌｙであり、（Ｈ）は０．０５％ＳＬ＋２０％Ｇｌｙであり、（Ｉ）は０．０５％ＳＬ＋１５％Ｇｌｙであり、（Ｊ）は３０％Ｇｌｙであり、（Ｋ）は２０％ＤＭＳＯである。
　ＳＬとは、低毒性の糖脂質型バイオサーファクタントであり、酵母の発酵から得られる発酵産物である。ＳＬは細胞を凍結する前に添加することで（前添加）、細胞内に取り込まれ、細胞内の氷の結晶を抑制し、凍結時に添加することで細胞外の氷の結晶を抑制することで効果を発揮すると考えられる。以下の実験例、実施例で使用するＳＬは特開２０１６－１６０２４４号公報の記載に従って調製した。なお、ＳＬはｐＨ６～８に調製したものを用いた。ｐＨ調整剤として、アルカリ剤、酸などがあげられる。
　多価アルコールとは、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどであり、好ましくは、プロピレングリコールである。
　細胞保存液の細胞とは、動植物細胞のことである。体細胞、がん細胞、株化細胞、幹細胞などである。
　また、細胞にて構成される組織、臓器、動植物などの個体にも同様に応用できる。植物や動物由来の食品の鮮度を保つ効果が期待できる。
　また、本発明を用いた凍結・融解方法は特に限定せず、凍結する際の細かい温度コントロールを行わなくても、通常の緩慢凍結・急速融解でも可能である。
　［実験例　氷結晶抑制組成物と氷結晶生成抑制効果］
　最も汎用されている細胞保存時に使用する培地であるダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）に表１の組成物を７：３の容量比で混和した。各試料を１５ｍＬ遠沈管（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＢｉｏＬｉｔｅ）に分注し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却し、－８０℃１０分後に試料の外観を目視にて観察した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、実験例１～４は実験例５、６よりも氷結晶生成抑制効果が認められた。
　表２の組成となるように超純水で調製した。各試料を走査型プローブ顕微鏡（ＡＦＭ５０００／ＡＦＭ５３００、日立ハイテクサイエンス）の冷却ステージにて凍結させ、光学顕微鏡で観察した。本試験は、大阪大学ナノテクノロジー設備併用拠点の支援で実施した。また、観察した画像を画像解析ソフト（OLYMPUS cellSens Standard）を用いて氷の結晶1つあたりの面積を計測した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１は氷晶形成抑制についての顕微鏡写真図であり、そのうち（Ａ）は超純水であり、（Ｂ）は１０重量％ＳＬであり、（Ｃ）は０．１重量％ＳＬであり、（Ｄ）は１０重量％ＤＭＳＯであり、（Ｅ）は１０重量％Ｇｌｙであり、（Ｆ）は１０重量％ＰＧであり、（Ｇ）は１０重量％ＥＧであり、（Ｈ）は１０重量％ＡＰＧである。図１（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるように、組成がＳＬの場合は１０重量％でも０．１重量％でも氷晶形成抑制効果があった。図１（Ａ）（Ｄ）（Ｅ）（Ｆ）及び（Ｇ）に示されるようにＳＬ以外の場合は氷晶形成抑制効果は十分ではなかったが、図１（Ｈ）に示されるようにＳＬと同じ糖脂質型界面活性剤であるＡＰＧの場合は氷晶形成抑制効果が見られた。
　［１　凍結保存前培養時におけるＳＬ添加の効果（ヒト正常線維芽細胞、血清添加培地）］
　ヒト正常線維芽細胞（クラボウ）を３．２×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように６ウェルプレートに播種し、４８時間培養した。培養後、培養培地を除去し、５重量％ＳＬ水溶液を０．０５容量％となるようにウシ胎児血清含有のＤＭＥＭにて希釈して添加した。所定時間培養後、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（凍結前の生細胞数）。残りの細胞をクライオジェニックバイアル（三商）の中で１０％ＤＭＳＯ／ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ１ｍＬに懸濁し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（解凍後の生細胞数）。残りの細胞懸濁液を６ウェルプレートに播種して７２時間培養した。培養後の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（培養後の生細胞数）。
　解凍時の生存率と増殖率を以下の式によりそれぞれ算出した。
　解凍時の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／解凍後の総細胞数×１００
　増殖率（％）＝培養後の生細胞数／解凍後の生細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果から、ＳＬを細胞凍結保存の１から６時間前に添加して培養すると、未添加よりも細胞の解凍時の生存率および細胞増殖率が高くなることがわかった。
　また解凍時の生存率のみならず、凍結前後の生存率についても検討した。即ち、ヒト正常線維芽細胞（クラボウ）を４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０ ｍｍディッシュに播種し、７２時間培養した。培養後、５重量％ＳＬ水溶液を０．０５容量％となるように添加した。所定時間培養後、２．０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養して、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（未凍結の吸光度）。残りの細胞を細胞密度が４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製して、クライオジェニックバイアル（三商）の中で２０％ＤＭＳＯと１：１の容量比で混合した。凍結処理容器ＢＩＣＥＬＬ（日本フリーザー）に入れて、―８０℃条件下で冷却した。一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、１００μＬを９６ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養して、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（凍結保存後の吸光度）。
　凍結前後の生存率と増殖率を以下の式により算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝凍結保存後の吸光度（６時間培養）／未凍結の吸光度（６時間培養）
　増殖率（％）＝凍結保存後の吸光度（７２時間培養）／未凍結の吸光度（７２時間培養）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果から、ＳＬを細胞凍結保存の１から６時間前に添加して培養すると、未添加よりも細胞の凍結前後の生存率および細胞増殖率が高くなることがわかった。
　［２　凍結保存前培養時におけるＳＬ添加の効果（ヒト正常線維芽細胞、血清無添加培地）］
　ヒト正常線維芽細胞（クラボウ）を３．２×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように６ウェルプレートに播種し、４８時間培養した。培養後、培養培地を除去し、５重量％ＳＬ水溶液を０．０５容量％となるようにＤＭＥＭ培地にて希釈して添加した。６時間培養後、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（凍結前の生細胞数）。残りの細胞をクライオジェニックバイアル（三商）の中で１０％ＤＭＳＯ／ＤＭＥＭ１ｍＬに懸濁し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（解凍後の生細胞数）。
　凍結前後の生存率を以下の式により算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／凍結前の生細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５の結果から、ＳＬを細胞凍結保存の６時間前に添加して培養すると、未添加よりも凍結前後の細胞の生存率が高くなることがわかった。
　［３　凍結保存前培養時におけるＳＬ添加の効果（間葉系幹細胞、血清無添加培地）］
　間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ）を３．２×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように６ウェルプレートに播種し、４８時間培養した。培養後、培養培地を除去し、５重量％ＳＬ水溶液を０．０５容量％となるようにＭＳＣＧＭ－ＣＤ培地にて希釈して添加した。６時間培養後、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（凍結前の生細胞数）。残りの細胞をクライオジェニックバイアル（三商）の中で１０％ＤＭＳＯ／ＭＳＣＧＭ－ＣＤ培地１ｍＬに懸濁し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（解凍後の生細胞数）。
　凍結前後の生存率を以下の式により算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／凍結前の生細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６の結果から、ＳＬを細胞凍結保存の６時間前に添加して培養すると、未添加よりも細胞の凍結前後の生存率が高くなることがわかった。
　［４　凍結保存前培養無しでのＳＬ添加の効果（ヒト正常線維芽細胞、血清添加培地）］
　ヒト正常線維芽細胞（クラボウ）の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（凍結前の生細胞数）。細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表７、８の各試料と細胞懸濁液を３：７の容量比で混合し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（解凍後の生細胞数）。残りの細胞懸濁液を６ウェルプレートに播種して７２時間培養した。培養後の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（培養後の生細胞数）。
　凍結前後の生存率と増殖率を以下の式によりそれぞれ算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／凍結前の生細胞数×１００
　増殖率（％）＝培養後の生細胞数／解凍後の生細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７の結果から、実施例１２、１３は高い細胞生存率が見られ、実施例１３は比較例４～６よりも生存率が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例１４は、比較例７よりも増殖率が高かった。
　また、ヒト正常線維芽細胞を２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（未凍結の吸光度）。残りの細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表９の各組成物と細胞懸濁液を１：１の容量比で混合し、凍結処理容器ＢＩＣＥＬＬ（日本フリーザー）に入れて、―８０℃条件下で冷却した。一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、１００ μＬを９６ ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養して、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（凍結保存後の吸光度）。
　生存率と増殖率を以下の式により算出した。
　生存率（％）＝凍結保存後の吸光度（６時間培養）／未凍結の吸光度（６時間培養）
　増殖率（％）＝凍結保存後の吸光度（７２時間培養）／未凍結の吸光度（７２時間培養）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９の結果から、本発明の実施例は高い細胞生存率および高い細胞増殖率を有することが確認できた。
　［５　凍結保存前培養無しでのＳＬ添加にＤＭＳＯ添加が与える影響（ラット骨格筋筋芽細胞、血清添加培地）］
　ラット骨格筋筋芽細胞（ＪＣＲＢ９０８１　Ｌ６）の生細胞数を計測した（凍結前の生細胞数）。残りの細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表７の各組成物と細胞懸濁液を３：７の容量比で混合し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数を計測した（解凍後の生細胞数）。
　生存率を以下の式により算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／凍結前の生細胞数×１００
　また、筋芽細胞の性質として、５日間培養後の培養上清中のサイトカイン（ＶＥＧＦ）をＥＬＩＳＡで定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０の結果から、実施例１５～１７は比較例８（１０重量％ＤＭＳＯのみ）よりも細胞の生存率が高いことがわかった。また、実施例１５～１７は比較例８（１０重量％ＤＭＳＯのみ）よりもＶＥＧＦ量が高いことがわかった。これは凍結による細胞の性質への影響が本実施例では比較例よりも少ないことを意味する。
　［６　凍結保存前培養無しでのＳＬ添加にＤＭＳＯ添加が与える影響（ヒト骨格筋筋芽細胞、血清添加培地）］
　ヒト骨格筋筋芽細胞（患者より）の生細胞数を計測した（凍結前の生細胞数）。残りの細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表１１の各組成物と細胞懸濁液を３：７の容量比で混合し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数を計測した（解凍後の生細胞数）。
　生存率を以下の式により算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／凍結前の生細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１の結果から、実施例１８～２１は比較例９（１０重量％ＤＭＳＯのみ）よりも細胞の生存率が高いことがわかった。
　また、解凍時の生存率につき、ＳＬ添加にＤＭＳＯ添加が与える影響をＣａｃｏ－２細胞、血清添加培地にて調べた。即ち、Ｃａｃｏ－２細胞（ヒト結腸腺癌）の生細胞数を計測した（凍結前の生細胞数）。残りの細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表１０の各組成物と細胞懸濁液を１：１の容量比で混合し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数を計測した（解凍後の生細胞数）。
　生存率を以下の式により算出した。
　解凍時の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／解凍後の総細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２の結果から、本発明の実施例は比較例（２０重量％ＤＭＳＯのみ）よりも解凍時の生存率が高いことがわかった。
　［７　凍結保存前培養無しでのＳＬ添加にＰＧ添加が与える影響（ヒト正常線維芽細胞、血清無添加培地）］
　ヒト正常線維芽細胞（クラボウ）の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（凍結前の生細胞数）。細胞を非血清のＤＭＥＭで懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表１３の各試料と細胞懸濁液を３：７の容量比で混合し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（解凍後の生細胞数）。
　凍結前後の生存率と増殖後の生存率を以下の式によりそれぞれ算出した。
　凍結前後の生存率（％）＝解凍後の生細胞数／凍結前の生細胞数×１００
　増殖後の生存率（％）＝培養後の生細胞数／培養後の総細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３の結果から、実施例２２、２３は、凍結前後の生存率が比較例１０よりも高かった。また、実施例２３は比較例１０、１１よりも増殖後の生存率が高かった。
　［８　凍結保存前培養無しでのＳＬ添加にＰＧ添加が与える影響（間葉系幹細胞、血清無添加培地）］
　間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ）の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（凍結前の生細胞数）。細胞をＭＳＣＧＭ－ＣＤ培地で懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表１４の各試料と細胞懸濁液を３：７の容量比で混合し、４℃条件下で５分、－２０℃条件下で２０分、－８０℃条件下の順で冷却した。－８０℃で一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した（解凍後の生細胞数）。
　凍結前後の残存率を以下の式によりそれぞれ算出した。
　凍結前後の残存率（％）＝解凍後の総細胞数／凍結前の総細胞数×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１４の結果から、実施例２４～２６は、凍結前後の残存率が比較例１２より高かった。また、実施例２５、２６は、凍結前後の残存率が比較例１３よりも高かった。
　また、凍結保存前培養無しでのＳＬ添加にＰＧ以外の多価アルコール添加が与える影響（間葉系幹細胞、血清添加培地）を調べた。即ち、間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ）を２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（未凍結の吸光度）。残りの細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表１５の各組成物と細胞懸濁液を１：１の容量比で混合し、凍結処理容器ＢＩＣＥＬＬ（日本フリーザー）に入れて、―８０℃条件下で冷却した。一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、１００ μＬを９６ ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養して、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（凍結保存後の吸光度）。また、凍結前後の細胞遺伝子(mRNA)発現を評価した。
　生存率と増殖率は以下の式により算出した。
　生存率（％）＝凍結保存後の吸光度（６時間培養）／未凍結の吸光度（６時間培養）
　増殖率（％）＝凍結保存後の吸光度（７２時間培養）／未凍結の吸光度（７２時間培養）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１５の結果から、本発明の実施例は凍結前後の生存率が高かった。また凍結前後の増殖率も高かったが、０．２重量％ＳＬ添加の場合はやや凍結前後の生存率が低下した。
　また、本発明の実施例０．０２重量％ＳＬ＋３０重量％Ｇｌｙ、０．０２重量％ＳＬ＋３０重量％ＥＧおよび０．１重量％ＳＬ＋３０重量％Ｇｌｙの場合と、比較例２０重量％ＤＭＳＯの場合について細胞の遺伝子発現を調べた。結果を図２に示す。ＣＤ３４及びＣＤ７３は間葉系幹細胞のマーカーであるが、未凍結時と比較して本発明にかかる実施例では変動がほとんどなく、間葉系幹細胞としての性質が維持されていると考えられる。また、細胞分裂を促進するアクセル役となるがん遺伝子であるc-mycは、未凍結時と比較して比較例２６（２０重量％ＤＭＳＯ）では変動が認められたのに対して、本発明にかかる実施例では変動がほとんどなく、間葉系幹細胞への影響が少ないと考えられる。
　［９　組成物の細胞毒性（間葉系幹細胞）］
　間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ）を２．０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、７２時間培養した。培養後、培養培地を除去して、表１６の各組成物の濃度となるようにウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭにて希釈して添加した。４８時間培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した。
　生存率は以下の式により算出した。
　生存率（％）＝組成物暴露後の吸光度／未処理の吸光度
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６の結果から、間葉系幹細胞について、ＳＬ＋グリセリンの場合はＤＭＳＯと比較して毒性が低いことが示された。
　［１０　解凍後、凍結保存組成を除去せずにそのまま培養した結果（間葉系幹細胞）］
　間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ）を２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して６時間あるいは７２時間培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（未凍結の吸光度）。残りの細胞をウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。クライオジェニックバイアル（三商）の中で表１７の各組成物と細胞懸濁液を１：１の容量比で混合し、凍結処理容器ＢＩＣＥＬＬ（日本フリーザー）に入れて、―８０℃条件下で冷却した。一晩保存後、３７℃で速やかに解凍し、各組成物を除去せずに１００ μＬを９６ ｗｅｌｌプレートに播種して６時間培養して、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋit－８（同仁化学研究所）により吸光度を測定した（凍結保存後の吸光度）。
　生存率と増殖率は以下の式により算出した。
　生存率（％）＝凍結保存後の吸光度（６時間培養）／未凍結の吸光度（６時間培養）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　各実施例の場合および比較例の場合について細胞の形態を顕微鏡観察した。図３は細胞形態についての顕微鏡写真図であり、そのうち（Ａ）は０．２重量％ＳＬ＋３０重量％Ｇｌｙであり、（Ｂ）は０．２重量％ＳＬ＋２０重量％Ｇｌｙであり、（Ｃ）は０．２重量％ＳＬ＋１５重量％Ｇｌｙであり、（Ｄ）は０．１重量％ＳＬ＋３０重量％Ｇｌｙであり、（Ｅ）は０．１重量％ＳＬ＋２０重量％Ｇｌｙであり、（Ｆ）は０．１重量％ＳＬ＋１５重量％Ｇｌｙであり、（Ｇ）は０．０５重量％ＳＬ＋３０重量％Ｇｌｙであり、（Ｈ）は０．０５重量％ＳＬ＋２０重量％Ｇｌｙであり、（Ｉ）は０．０５重量％ＳＬ＋１５重量％Ｇｌｙであり、（Ｊ）は３０重量％Ｇｌｙであり、（Ｋ）は２０重量％ＤＭＳＯである。表１７の結果から、間葉系幹細胞について、ＳＬ＋グリセリンの場合はＤＭＳＯと比較して毒性が低いことが示された。また図３の結果からＳＬ＋グリセリンの場合はＤＭＳＯと比較して細胞の形態も良好であることが示された。
　［１１　野菜又は果物の冷凍保存におけるＳＬの添加効果］
　各食品（きゅうり、ほうれん草、りんご）を、それぞれ、表１８、表１９、表２０の組成となるように水で調製した溶液１００ｇに３０分間浸漬した。浸漬後、ペーパータオルで余分な水分を拭き取り、－２０℃で冷凍した。一晩保存後、３７℃で解凍して、外観および食感を以下の判定基準に従って評点下した。
＜判定基準＞
３：冷凍前と比べて、差は認められない
２：冷凍前と比べて、差が認められる
１：冷凍前と比べて、かなり差が認められる
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表１８、表１９及び表２０の結果から、野菜又は果物を冷凍保存する前にＳＬ添加溶液に浸漬することにより、冷凍保存後解凍した場合、食味及び食感が良好であることが確認できた。
　［１２　魚介類又は食肉の冷凍保存におけるＳＬの添加効果］
　各食品（まぐろ、レバー）を、それぞれ、表２１、２２の組成となるように水で調製した溶液１００ｇに３０分間浸漬した。浸漬後、ペーパータオルで余分な水分を拭き取り重量測定（冷凍前の重量）後、－２０℃で冷凍した。一晩保存後、３７℃で解凍し、外観観察とドリップ量測定を行った。外観を以下の判定基準に従って評点下した。
＜判定基準＞
３：冷凍前と比べて、差は認められない
２：冷凍前と比べて、差が認められる
１：冷凍前と比べて、かなり差が認められる
　ドリップ量（食材を取り除いた後の重量）を測定して、以下の式によりドリップ流出率を算出した。ドリップ量とは、食品を解凍した際に、細胞内の氷が溶けて水になり、傷ついた細胞から流れ出てくる水分のことをいう。
　ドリップ流出率（％）＝ドリップ量／凍結前の重量×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表２１及び表２２の結果から、魚介類又は食肉を冷凍保存する前にＳＬ添加溶液に浸漬することにより、ドリップ流出量が抑制されることが確認できた。

Claims (9)

  1. 　ソホロースリピッドを０．０１重量％から２０重量％含む凍結保存後の細胞生存率を高める組成物。
  2. 　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５重量％から１０重量％含む請求項１に記載する組成物。
  3. 　多価アルコールを１重量％から５０重量％含む請求項１または２に記載する組成物。
  4. 　多価アルコールとして、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールのいずれか少なくとも一つを含む請求項３に記載する組成物。
  5. 　ソホロースリピッド及び多価アルコールを含み、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない、凍結保存後の細胞生存率を高める組成物。
  6. 　前記多価アルコールはグリセリンであり、細胞は幹細胞である請求項５記載の組成物。
  7. 　前記幹細胞は間葉系幹細胞である請求項６記載の組成物。
  8. 　細胞を凍結保存する直前から６時間前の間で細胞培養培地中に請求項１で記載する組成物を１容量％となるように添加して細胞を凍結保存する方法。
  9. 　細胞を凍結保存する際に、細胞培養培地中に請求項２乃至７の何れか１項に記載する組成物を１０容量％から９９容量％添加して細胞を凍結保存する方法。
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