JP6323895B2 - 細胞の凍結保存方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の凍結保存方法、さらに詳しくは幹細胞の凍結保存方法および凍結保護剤を用いない細胞の凍結保存方法に関する。
近年、再生医療技術の進歩に伴い、生体由来の細胞および組織を凍結保存し、必要時に解凍して利用する技術の需要が非常に高まっている。しかしながら、解凍後の細胞生存率の低さが克服すべき課題となっている。特に、未分化な幹細胞に対しては、満足できる生存率が得られていない。さらに、凍結保護剤を用いない条件下では、ほとんど生存細胞を得ることは不可能である。
凍結・解凍後の細胞生存率が低い最大の理由は、凍結時に生じる氷晶の成長によって細胞膜やオルガネラ膜が破壊されるからである。そのため、凍結保存液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、ポリエチレングリコール等の凍結保護剤を添加し、急速に凍結することで氷晶の成長を抑える凍結方法が広く行われている（例として、特許文献１および非特許文献１）。
これまでのところ、ＤＭＳＯと比較してグリセリンやポリエチレングリコールの凍害防御能は低く、十分な細胞生存率を得るにはＤＭＳＯが使用されている。一方、ＤＭＳＯをはじめとした凍結保護剤は細胞内に浸透して細胞毒性を発揮するうえに、多能性幹細胞に対しては中内胚葉系へ分化誘導し得ることが報告されている（非特許文献２）。ＤＭＳＯ以外の凍結保護剤であるエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシル化ポリリジン等を凍結保護剤に用いた凍結方法が提案されているが（特許文献２、３等）、いずれも細胞や生体に対しては何らかの為害作用やアレルギーを惹起する可能性があるため、解凍後の細胞をそのまま再生医療に用いることはできなかった。
より高い生存率を得るための方法としては、Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎという方法が試みられている。これは高濃度の凍結保護剤を用いて短時間に凍結することで、氷晶の形成を抑制する方法である。受精卵の保存等に有効性が示されているが、凍結保護剤に細胞の為害作用があるために、再生医療分野での応用や有効性は限られている（非特許文献３等）。
このように、再生医療の分野では、幹細胞の凍結融解後の生存率を高めるための方法と、凍結保護剤を用いずに細胞の生存能力を維持できる凍結保存方法が求められていた。
このように、再生医療の分野では、幹細胞の凍結融解後の生存率を高めるための方法と、凍結保護剤を用いずに細胞の生存能力を維持できる凍結保存方法が求められていた。
Ｉｎｔ． Ｊ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， 第４８号、１１４９−１１５４頁（２００４年）
Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， 第６５巻、５４−８０頁（２００８年）
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， 第２８巻、１５８５−１５９６頁（２００７年）
前記従来技術の問題に対し、本発明者は、冷凍食品の分野で用いられている磁気共鳴凍結方法に注目した。磁気共鳴凍結方法とは、被凍結物に電磁波を照射して該被凍結物中の水分子の水素原子核に磁気共鳴を生じさせ、水分の氷結温度を降下させることで過冷却状態を作り出し、通常以下の氷結温度で急速凍結させる方法である（特許文献４）。この方法を用いると、凍結開始から凍結完了までの時間が短縮されて氷晶の成長が抑制されるため、生鮮食品の鮮度や風味を損なわない冷凍方法として注目を集めている。
通常、磁気共鳴凍結方法においては、１００Ｈｚ以下の交流電源に接続されたコイルに交流を流し、コイル中央部において交流周波数に対応した周波数の変動磁場を形成させ、その磁場内で対象物の冷却を行う。
しかしながら、交流により形成される変動磁場と過冷却状態との関係は十分には解明されてなく、特に磁場の周波数と過冷却状態との関係は不明である。また、冷凍食品の分野では食材組織の構造の変化のみを防止すればよいが、再生医療の分野で求められているのは細胞の生存能力の維持である。特許文献５では、磁場の周波数２００Ｈｚ以上で磁気共鳴凍結方法を用いた場合に、凍結保護剤に浸漬して凍結したラットの臓器の組織形態がよく保持されることを報告しているが、当該組織を構成する細胞の生存能力については不明である。
細胞の凍結が成功するためには、細胞の形が保たれているのみならず、細胞小器官や遺伝子が変異なく保たれ、細胞が生存し続けるとともに増殖する能力を失っていないことが必要である。さらに、幹細胞の凍結保存においては、通常の細胞と比較して高い増殖活性を持つ細胞であるため、その高い増殖活性が維持されていることが重要である。
このような事情があるにも関わらず、凍結保護剤非存在下で磁気共鳴凍結を行った場合の細胞の生存能力、特に幹細胞の生存能力については全くの未知数であった。
しかしながら、交流により形成される変動磁場と過冷却状態との関係は十分には解明されてなく、特に磁場の周波数と過冷却状態との関係は不明である。また、冷凍食品の分野では食材組織の構造の変化のみを防止すればよいが、再生医療の分野で求められているのは細胞の生存能力の維持である。特許文献５では、磁場の周波数２００Ｈｚ以上で磁気共鳴凍結方法を用いた場合に、凍結保護剤に浸漬して凍結したラットの臓器の組織形態がよく保持されることを報告しているが、当該組織を構成する細胞の生存能力については不明である。
細胞の凍結が成功するためには、細胞の形が保たれているのみならず、細胞小器官や遺伝子が変異なく保たれ、細胞が生存し続けるとともに増殖する能力を失っていないことが必要である。さらに、幹細胞の凍結保存においては、通常の細胞と比較して高い増殖活性を持つ細胞であるため、その高い増殖活性が維持されていることが重要である。
このような事情があるにも関わらず、凍結保護剤非存在下で磁気共鳴凍結を行った場合の細胞の生存能力、特に幹細胞の生存能力については全くの未知数であった。
前記課題に対し本発明者らが鋭意検討を行った結果、特定の変動磁場中で細胞を凍結することにより、凍結保護剤の非存在下でも細胞の生存能力を維持できること見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明により、凍結保護剤非存在下で、変動磁場中で細胞を凍結することを特徴とする細胞の凍結保存方法が提供される。
また、前記細胞の凍結保存方法において、当該変動磁場は、周波数が５〜２０Ｈｚ、磁束密度が１．５〜２．２Ｇの変動磁場であることが好適である。
また、前記細胞の凍結保存方法において、当該変動磁場は、周波数が５〜２０Ｈｚ、磁束密度が１．５〜２．２Ｇの変動磁場であることが好適である。
本発明により、凍結保護剤を用いることなく、生存能力を維持した細胞を凍結保存する方法が提供される。本発明の方法によって凍結保存された細胞は、有害または生分解性の低い人工物を含んでいないため、移植等に直接用いることが可能である。
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
・凍結保存液
本発明に用いる凍結保存液は、低温、好ましくは−８０℃以下、より好ましくは−１９６℃以下にて細胞を保存させるための溶液であり、具体的には、動物細胞培養用培地、臓器保存液、培養用血清、および／または該血清代替物を好適に用いることができる。最も好ましくは、血清または血清代替物を５〜２０容量％含有する動物細胞培養用培地である。
動物細胞培養用培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｆ−１２）等を好適に用いることができる。
培養用血清としては、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ；ＦＣＳ）等が挙げられる。また、血清代替物としては、ヒト自己血清、ヒト他家血清、ヒト血小板由来物、アルブミン／アルブミン代替物、インスリン／インスリン代替物、およびトランスフェリンの単独または併用、あるいは、ノックアウト血清代替物（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＫＳＲ、インビトロジェン・ライフテクノロジー社製）等を好適に用いることができる。なお、無血清培地を用いた場合には、これらの血清あるいは血清用添加物を用いずに培養することが可能である。
・凍結保存液
本発明に用いる凍結保存液は、低温、好ましくは−８０℃以下、より好ましくは−１９６℃以下にて細胞を保存させるための溶液であり、具体的には、動物細胞培養用培地、臓器保存液、培養用血清、および／または該血清代替物を好適に用いることができる。最も好ましくは、血清または血清代替物を５〜２０容量％含有する動物細胞培養用培地である。
動物細胞培養用培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｆ−１２）等を好適に用いることができる。
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・凍結保護剤
本発明の凍結保存液は、凍結保護剤を実質的に（具体的には１容量％以上）含まないことを特徴とする（例えば、ＤＭＳＯは通常５容量％未満の濃度では細胞に対して凍結保護効果を発揮することができない）。ここで凍結保護剤とは、水分子との親和性が高く、凍結保存液中に溶かした際に氷晶の成長を抑制する効果の高い物質を指し、例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、トレハロース、ショ糖、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシル化ポリリジン等が挙げられる。
本発明の凍結保存液は、凍結保護剤を実質的に（具体的には１容量％以上）含まないことを特徴とする（例えば、ＤＭＳＯは通常５容量％未満の濃度では細胞に対して凍結保護効果を発揮することができない）。ここで凍結保護剤とは、水分子との親和性が高く、凍結保存液中に溶かした際に氷晶の成長を抑制する効果の高い物質を指し、例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、トレハロース、ショ糖、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシル化ポリリジン等が挙げられる。
・磁場条件
本発明においては、周波数が５〜２０Ｈｚ、磁束密度が１．５〜２．２Ｇの変動磁場中で細胞を凍結することが好ましい。さらに好ましくは、周波数が８〜１２Ｈｚ、磁束密度が１．７〜２．１Ｇの変動磁場である。
本発明においては、周波数が５〜２０Ｈｚ、磁束密度が１．５〜２．２Ｇの変動磁場中で細胞を凍結することが好ましい。さらに好ましくは、周波数が８〜１２Ｈｚ、磁束密度が１．７〜２．１Ｇの変動磁場である。
・凍結温度
本発明においては、細胞および組織を４℃で１５〜２０分間冷却した後、毎分０．７〜１．２℃ずつ、−７５℃まで降下させる凍結方法が好適である。
本発明においては、細胞および組織を４℃で１５〜２０分間冷却した後、毎分０．７〜１．２℃ずつ、−７５℃まで降下させる凍結方法が好適である。
本発明の凍結保存方法は、一般的な動物細胞の細胞株は勿論、ヒトを含む哺乳類動物から採取した臓器、組織、体液（血液、リンパ液、および精液を含む）、および細胞（体細胞、生殖細胞、および幹細胞を含む）に対して適用することが可能である。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［試験例１：変動磁場条件が細胞生存率に及ぼす効果の検討］
マウス繊維芽細胞を、凍結保護剤非存在下で種々の変動磁場を与えながら凍結し、解凍後の細胞生存率を解析した。
マウス繊維芽細胞を、凍結保護剤非存在下で種々の変動磁場を与えながら凍結し、解凍後の細胞生存率を解析した。
＜方法＞
対数増殖期のマウス線維芽細胞（マウスより採取後１継代または２継代、５×１０５細胞）を凍結チューブ内で１ｍｌの１００％ＦＢＳ中に懸濁し、変動磁場発生器を備えた冷凍装置（ＡＢＩ ＣＡＳ−ＬＡＢ１、アビー株式会社製）を用いて凍結を行った（Ｎ＝３）。凍結プログラムは、４℃１５分、その後１分ごとに１℃ずつ下げ、−７５℃に到達後は当該温度を維持するプログラムを使用した。
翌日、凍結した細胞を３７℃の温水中で速やかに解凍し、生細胞数を計測（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色法）したのち、１０ｃｍ ｄｉｓｈに播種して３７℃のインキュベーター内で培養した（５％ＣＯ２、湿度１００％）。培養１日後、細胞を回収して再び生細胞数を計測し、生細胞数と生細胞率を算出した。
対数増殖期のマウス線維芽細胞（マウスより採取後１継代または２継代、５×１０５細胞）を凍結チューブ内で１ｍｌの１００％ＦＢＳ中に懸濁し、変動磁場発生器を備えた冷凍装置（ＡＢＩ ＣＡＳ−ＬＡＢ１、アビー株式会社製）を用いて凍結を行った（Ｎ＝３）。凍結プログラムは、４℃１５分、その後１分ごとに１℃ずつ下げ、−７５℃に到達後は当該温度を維持するプログラムを使用した。
翌日、凍結した細胞を３７℃の温水中で速やかに解凍し、生細胞数を計測（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色法）したのち、１０ｃｍ ｄｉｓｈに播種して３７℃のインキュベーター内で培養した（５％ＣＯ２、湿度１００％）。培養１日後、細胞を回収して再び生細胞数を計測し、生細胞数と生細胞率を算出した。
＜変動磁場の印加条件＞
下表１に示した９通りの磁場条件で細胞を凍結した（試験例１〜９）。ＡＢＩ ＣＡＳ−ＬＡＢ１（アビー株式会社製）において周波数と電圧を設定し、ハンディガウスメーター（ＧＭ−３０１、電子磁気工業株式会社製）を用いて磁束密度を測定した。
下表１に示した９通りの磁場条件で細胞を凍結した（試験例１〜９）。ＡＢＩ ＣＡＳ−ＬＡＢ１（アビー株式会社製）において周波数と電圧を設定し、ハンディガウスメーター（ＧＭ−３０１、電子磁気工業株式会社製）を用いて磁束密度を測定した。
＜結果＞
解凍直後、および培養１日後の生存細胞数（表２）および細胞生存率（表３）を次に示す。
解凍直後、および培養１日後の生存細胞数（表２）および細胞生存率（表３）を次に示す。
周波数１０〜６０Ｈｚ、電圧０．５〜１．４Ｖ、磁束密度１．３〜１５．４Ｇの範囲の変動磁場中で細胞凍結を行った結果、周波数１０Ｈｚ、電圧１．０Ｖ、磁束密度２．０Ｇの磁場条件を用いた場合（試験例２）に、特異的に高い細胞生存率（解凍直後で４９．１７％、培養１日後で６７．５０％）が得られることが明らかとなった。さらに、試験例２では、解凍直後の生細胞数（２４．５８×１０４細胞）からの増加は生存細胞数のばらつきによる原因が考えられるが、生存細胞は解凍後も増殖能を維持していたことから、当該条件の磁場中で凍結した細胞は解凍後速やかに正常な細胞周期に入り、細胞分裂が行われた可能性が考えられる。
なお、試験例１、４、９、１０においても解凍直後には高い生細胞数が計測されたが、培養１日後には生細胞数が激減して、変動磁場なしで凍結した場合（試験例１０）とほぼ生存率となってしまった。よって、試験例１、４、９、１０の磁場条件では細胞の生存能力を維持できないことがわかる。また、特許文献５の磁場条件（周波数が２００Ｈｚ以上）では、解凍直後および培養１日後の生存率はいずれも非常に低かった（データは割愛）。
ちなみに、組織形態の維持を目的とした生鮮食品の冷凍方法としては、試練例５の磁場条件が最適である。しかしながら、表２および３の結果より、当該磁場条件では、細胞の生存能力を維持できないことは明らかである。
なお、試験例１、４、９、１０においても解凍直後には高い生細胞数が計測されたが、培養１日後には生細胞数が激減して、変動磁場なしで凍結した場合（試験例１０）とほぼ生存率となってしまった。よって、試験例１、４、９、１０の磁場条件では細胞の生存能力を維持できないことがわかる。また、特許文献５の磁場条件（周波数が２００Ｈｚ以上）では、解凍直後および培養１日後の生存率はいずれも非常に低かった（データは割愛）。
ちなみに、組織形態の維持を目的とした生鮮食品の冷凍方法としては、試練例５の磁場条件が最適である。しかしながら、表２および３の結果より、当該磁場条件では、細胞の生存能力を維持できないことは明らかである。
以上より、凍結保護剤非存在下で細胞の生存能力を維持したまま凍結を行うには、周波数が５〜２０Ｈｚ、磁束密度が１．５〜２．２Ｇ（本実験に用いた装置では電圧が０．７〜１．２Ｖに相当する）の変動磁場中、さらに好ましくは、周波数が８〜１２Ｈｚ、磁束密度が１．７〜２．１Ｇ（本実験に用いた装置では電圧が０．８〜１．１Ｖに相当する）の変動磁場中で凍結すればよいと考えられる。
本発明によれば、生体由来の細胞および組織を、生存能力を維持したまま凍結保護剤不含の状態で凍結保存することが可能である。よって、本発明にかかる凍結保存方法は、凍結保護剤の残留が問題となる幹細胞等の保存に特に有益である。
Claims (2)
- 凍結保護剤の非存在下で、周波数が８〜２０Ｈｚ、磁束密度が１．５〜２．２Ｇの変動磁場中で、単離された動物細胞の細胞株、体細胞、生殖細胞、又は幹細胞を凍結することを特徴とする細胞の凍結保存方法。
- 請求項１に記載の細胞の凍結保存方法において、前記変動磁場が、周波数が８〜１２Ｈｚ、磁束密度が１．７〜２．１Ｇの変動磁場であることを特徴とする細胞の凍結保存方法。
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