KR20120126634A - 조직 보관 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직을 동결보관하기 위한 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 동결 보관된 조직으로부터 세포를 일차 배양할 수 있는 조직의 동결 보관 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조직 보관 방법을 이용하면 조직을 동결 보관한 후에도 동결 보관 전 상태의 신선한 형태의 조직 이용이 가능하며, 조직 특이성 세포의 특성을 유지하여 조직 재건 및 세포 세포의 일차 배양이 가능하여 일차 배양세포를 대량으로 확보하여 세포배양 관련 연구에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 이식 후 세포의 배양으로 인한 세포 재생 및 회복 효과가 우수한 이식용 조직을 제공할 수 있다.

Description

조직 보관 방법 {Preservation Method for Tissues}

본 발명은 조직을 동결 보관하기 위한 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 동결 보관된 조직으로부터 세포를 일차 배양할 수 있는 조직의 동결 보관 방법에 관한 것이다.

최근 동물 세포배양 방법이 발전하면서, 각종 생체조직으로부터 세포를 분리하여 일차 배양(primary culture)하는 다양한 방법들이 사용되고 있다. 여러 조직 유래의 세포를 일차 배양 하는 가장 일반적인 방법은 채취한 조직을 신선한 상태에서 단백질분해효소 혼합용액으로 처리하여 세포를 수확하거나, 조직을 잘게 자른 후 잘게 잘린 조직절편을 직접 세포배양접시에서 배양하여 조직절편으로부터 세포가 자라나오도록 하는 방법이다.

상기 방법을 사용하기 위해서는 기본적으로 조직의 상태가 신선해야 하며, 일단 조직이 동결된 이후에는 세포의 일차 배양이 불가능하다고 알려져 있어, 통상 일차 배양된 세포의 장기 보관은 우선 일차 배양 세포주를 확보한 후 이를 동결, 보관 및 해동과정을 통하여서만 이루어져 왔으며, 조직을 동결 보관 한 후 이로부터 세포를 분리하여 일차 배양할 수 있는 방법은 거의 보고된 바가 없다.

이상과 같이 현재까지는 조직이 일단 동결되면 일차 배양을 할 수 없는 것으로 널리 알려져 있고, 세포의 일차 배양을 목적으로 조직을 동결하여 보관하는 방법이나, 동결된 조직으로부터 일차 배양을 시도하였거나 성공한 보고는 거의 없는 실정이다.

조직의 보관 및 보관된 조직으로부터의 세포의 일차 배양은 조직 이식을 목적으로 하는 다양한 의료 및 미용 분야에서도 중요하다. 조직 내에는 다양한 세포들이 존재하며 이러한 세포들 중 줄기세포는 신경세포를 비롯한 간세포 뼈세포 등 다양한 세포로 분화 할 수 있는 다능성을 갖고 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 조직은 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 등 다양한 호르몬 및 사이토카인 등을 함유하고 있다. 조직의 이러한 특징은 피부노화를 억제 하는데 이용 되거나 또는 주름살 제거, 뼈 세포의 노화로 생긴 골다공증, 망가지거나 상처 난 조직의 대체, 암 등을 제거한 후 조직재건 등 다양한 의료 및 미용 분야에 이용되고 있다. 특히 한국 내 많은 성형외과에서 이러한 조직 내 세포의 다양한 기능에 초점을 맞추어 지방 및 피부조직을 채취하여 특별한 처리 없이 동결 보관한 후 성형외과적 이식 재료로 사용하고 있다. 하지만 실제 이렇게 동결 보관된 후 사용된 조직 내에 세포가 포함되어 있는지 또는 세포가 살아있는지에 대한 보고는 없었다.

본 발명은 동결 보관 후에도 세포의 일차 배양을 가능하게 하는 새로운 조직 보관 방법 및 동결 보관 후에도 세포의 일차 배양이 가능한 이식용 조직을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 동결방지제와 혈청 또는 혈장을 포함하고 세포배양액은 포함하지 않는 동결보존액에 동물 조직을 침지하여 동결 보관하는 단계를 포함하는 조직 보관 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조직 보관 방법으로 동결 보관된 조직을 해동시키고, 상기 해동된 조직에 단백질분해효소를 처리하여, 세포를 배양하는 단계를 포함하는 동결 보관된 조직으로부터 세포를 일차 배양하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조직 보관 방법으로 동결 보관된 이식용 조직을 제공한다.

본 발명에서 제시한 조직 보관 방법을 이용하면 조직을 동결 보관 한 후에도 동결 보관 전 상태의 신선한 형태의 조직 이용이 가능하며, 보관된 조직으로부터 세포의 일차 배양이 가능하여 일차 배양세포를 대량으로 확보할 수 있으며, 조직 재건 및 세포배양 관련 연구에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 이식 후 세포의 배양으로 인한 세포 재생 및 회복 효과가 우수한 이식용 조직을 제공할 수 있다.

도 1은 지방 조직을 수술용 칼로 절단하거나(좌) 콜라게나아제 처리하여(우) 표준배지에서 1주일 배양한 후, 이를 위상차 현미경으로 관찰한 사진(A) 및 상대적인 세포 생존율을 나타낸 것이다(B).
도 2는 지방 조직을 수술용 칼로 절단하거나(Chopping) 콜라게나아제 처리하여(Collagenase) 표준배지에서 1주일 배양한 후, 동결보존액을 사용하지 않고 -20℃에 조직을 보관하였을 때 세포의 생존율을 분석한 결과를 나타낸다. A는 3개월간 보관되어 있던 지방 조직, B는 6개월간 보관되어 있던 지방 조직, C는 12개월 동안 보관되어 있던 지방조직의 분석 결과이다.
도 3은 보관 조건을 다르게 한 지방 조직을 각각 표준배지에서 배양한 후 위상차 현미경으로 관찰한 사진(A) 및 상대적인 세포 생존율(B)을 나타낸다.
도 4는 조직 보관 온도에 따른 세포의 배양 여부를 위상차 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다(A는 10% DMSO + 90% FBS 동결보관액 사용; B는 10% DMSO + 90% 사람혈장 동결보관액 사용).

본 발명은 동결방지제와 혈청 또는 혈장을 포함하고 세포배양액은 포함하지 않는 동결보존액에 동물 조직을 침지하여 동결 보관하는 단계를 포함하는 조직 보관 방법을 제공한다.

하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 동물 조직을 DMSO + FBS, DMSO + 사람혈장, DMSO + FBS + DMEM으로 이루어진 각각의 동결보존액에 침지하여 동결 보관한 후 해동하여 표준배지에서 배양한 결과, DMEM을 포함하는 동결보존액에 비해 DMEM을 포함하지 않고 DMSO와 FBS 또는 사람혈장으로만 이루어진 동결보존액을 사용한 경우에 세포의 일차배양 및 생존율이 현저하게 높아진 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 동결보존액은 동결보존액의 성분으로 일반적으로 사용되는 세포배양액을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 세포배양액은 조직의 보관 및 배양에 사용되는 일반적인 세포배양액을 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium), KGM(keratinocyte growth medium) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 동결방지제는 DMSO(Dimethyl sulfoxide), 글리세롤, 글리콜류, 슈크로오스, 라피노오스, 락토오스, 트레할로오스, PVP, 덱스트론 및 알부민 중 적어도 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 혈청 또는 혈장은 우태아혈청(FBS), 갓태어난 소혈청(NBS), 말혈청, 사람혈청 및 사람혈장(human plasma) 중 적어도 하나일 수 있으며, 상기 혈청 또는 혈장은 자가혈청 또는 자가혈장일 수 있다.

하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 동물 혈청(FBS)을 이용하여 조직을 보관하는 방법과 사람 혈장(human plasma)을 이용하여 조직을 보관하는 방법 간에는 세포의 배양 및 생존율에 있어 큰 차이가 없음을 확인하였다. 다만 세포 배양에 이용되는 동물 혈청들은 많은 멸균 과정을 거쳐서 세포 배양 재료로 이용되지만 실제 그 혈청 내에는 멸균 과정을 통하여 파괴되지 않은 바이러스나 프리온 단백질 등 동물에서 유래되어 사람에 적용되었을 때 치명적인 질병을 초래하는 미생물 또는 단백질 등이 포함되어 있을 수 있기 때문에, 사람의 생체에 이식하기 위한 조직의 경우에는 많은 나라에서 그 사용을 엄격히 제한하고 있으며, 이와 같은 목적을 위해서는 동물 혈청 보다는 사람혈청 또는 사람혈장을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 상기 동결보존액은 동결방지제 10 부피부에 대하여 혈청 또는 혈장을 10 내지 90 부피부, 20 내지 90 부피부, 30 내지 90 부피부, 40 내지 90 부피부, 50 내지 90 부피부, 60 내지 90 부피부, 70 내지 90 부피부 또는 80 내지 90 부피부로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "부피부"란 동결보존액에 포함된 동결방지제와 혈청 또는 혈장 사이의 상대적인 부피의 비율을 의미한다.

본 발명의 조직 보관에 사용되는 동물 조직은 사람을 포함하는 동물의 조직일 수 있다. 상기 동물 조직은 외과적 수술에 의하여 수득되는 조직 또는 조직의 절편을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 치수, 치근, 근육, 폐, 간, 신장, 비장, 이자, 유방, 자궁경부, 구강상피, 골, 인대, 연골, 관절 등 다양한 장기에서 유래된 조직일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 상기 조직 보관에 사용되는 동물 조직은 특히 지방 조직 또는 피부 조직일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 상기 동결 보관은 -150 내지 -200℃, -160 내지 -200℃, -170 내지 -200℃, -180 내지 -200℃, -160 내지 -190℃, -170 내지 -190℃, -180 내지 -190℃ 또는 -160 내지 -180℃에서 이루어질 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조직 보관 방법으로 동결 보관된 조직을 해동시키고, 상기 해동된 조직에 단백질분해효소를 처리하여, 세포를 배양하는 단계를 포함하는 동결 보관된 조직으로부터 세포를 일차 배양하는 방법을 제공한다.

하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 전술한 조직 보관 방법으로 동결 보관된 조직으로부터 세포를 일차 배양하는데 있어서, 해동된 조직을 물리적으로 잘게 잘라 배양하는 것에 비해 단백질분해효소(콜라게나아제)를 처리하여 배양하는 경우 세포의 배양 및 생존율이 훨씬 우수함을 알 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조직 보관 방법으로 동결 보관된 이식용 조직을 제공한다.

본 발명에 따른 이식용 조직은 동결보관 후에도 조직 특이성 세포의 특성을 유지하여 조직 재건 및 세포 치료용, 성형용 이식재로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 물리적 절단 또는 효소 처리시 세포 생존율 비교

지방 조직으로부터 세포를 분리 배양하는데 있어서 효율적인 분리 배양 방법을 조사하기 위하여, 수술용 칼로 조직을 잘게 자른 후 세포를 배양한 경우와 콜라게나아제(collagenase) 처리 후 배양한 경우의 세포 생존율을 분석하였다.

구체적으로, 레알 성형외과에서 성형 시술 후 당일 절취된 지방조직을 배양접시에 놓고 수술용 칼로 잘게 자른 후 DMEM + FBS 10% + 항체 1% (이하, 표준배지)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 또한 상기 당일 절취된 지방조직을 튜브로 옮기고 여기에 콜라게나아제(collagenase) 효소를 첨가하여 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시킨 후 표준배지를 첨가하여 상기 효소를 불활성화 시키고 40㎛m 세포필터를 통과시킨 후 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고 가라앉은 침전물만을 취하여 표준배지를 첨가하였으며, 37℃ 배양기에서 1주일간 배양하였다. 상기 각각의 세포 배양물을 위상차 현미경을 사용하여 관찰하였다. 또한 콜라게나아제(collagenase) 효소를 첨가하여 분리된 세포를 기준으로 수술용 칼로 잘게 자른 후 분리된 세포수를 세어서 콜라게나아제(collagenase) 효소를 첨가하여 분리된 세포에 대한 수술용 칼로 잘게 자른 후 분리된 세포의 상대적인 세포 생존율을 분석하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 수술용 칼로 조직을 잘게 자른 후 세포를 배양하는 것보다 콜라게나아제 처리한 후 세포를 배양하는 경우에 훨씬 많은 수의 지방유래세포가 배양되었으며, 세포 생존율이 훨씬 높은 것을 확인하였다.

실시예 2: 동결보존액의 사용 유무에 따른 세포 생존율 비교

DMSO와 같은 기존의 동결보존액을 사용하지 않고 -20℃에 조직을 보관하였을 때 세포가 배양되는지를 관찰하기 위하여, 지방 조직을 수술용 칼로 잘게 자르거나 콜라게나아제를 처리한 후 표준배지에서 1주일간 배양한 후 관찰하였다.

구체적으로, 레알 성형외과에서 성형 시술 후 동결보존액을 사용하지 않고 -20℃에 동결 보존된 조직 중 3개월, 6개월, 12개월 된 조직을 꺼내7어 해동시킨 후 원심분리를 통하여 내용물을 침전시켰다. 원심분리 후 상층 지방조직을 실시예 1과 동일한 방법으로 수술용 칼로 잘게 자르거나 콜라게나아제를 처리한 후 표준배지에서 1주일간 배양한 후 위상차 현미경으로 관찰하였다.

또한 -20℃에서 보관된 조직 내의 세포 생존율을 조사하기 위하여 아넥신 V (anexin V) 염색법을 사용하여 세포 죽음을 분석하였다. 수술용 칼 또는 콜라게나아제 처리 후 수집된 세포들을 한곳으로 모아 아넥신 V 염색법(BD phamingen)을 제조사의 방식대로 처리 한 후 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다.

도 2에 나타난 바와 같이 동결보존액을 사용하지 않고 -20℃에서 보관된 지방 조직들은 기간에 상관없이 세포가 배양되지 않았으며 조직 내의 세포들이 거의 다 죽어 있음을 알 수 있다(A는 3개월, B는 6개월, C는 12개월 동안 보관되어 있던 지방조직의 분석 결과이다).

실시예 3: 세포배양액의 사용 유무에 따른 세포 생존율 비교

당일 채취된 지방 조직을 각각 10% DMSO + 90% FBS(Fetal bovine serum), 10% DMSO + 90% 사람혈장(human plasma), 10% DMSO + 10% FBS + 80% DMEM 으로 이루어진 보관액에 넣고 1주일 동안 LN2 탱크(-180℃)에 보관한 후 해동시켰다. 해동된 세포들을 수술용 칼로 잘게 자르거나 콜라게나아제 처리한 후 표준배지에 넣어 37℃ 배양기에서 1주일간 배양한 후 위상차 현미경으로 관찰하였다.

도 3은 위상차 현미경으로 관찰한 사진(A) 및 상대적인 세포 생존율(B)을 보여준다. 도 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 지방 조직을 세포배양액 DMEM을 포함한 배지에 보관한 경우에 비해, 세포배양액 DMEM을 포함하지 않은 배지에 보관한 경우의 세포 생존율이 약 3~10배 이상으로 현저히 높았다. 또한 동물 혈청(FBS)을 이용하여 조직을 보관하는 방법과 사람 혈장(human plasma)을 이용하여 조직을 보관하는 방법 간에는 세포 생존율에 있어 큰 차이가 없음을 알 수 있다.

실시예 4: 조직 보관 온도에 따른 세포 생존율 비교

조직 보관 온도에 따른 세포의 배양 여부를 관찰하기 위하여 당일 절취된 지방조직을 10% DMSO + 90% FBS (A) 및 10% DMSO + 90% 사람 혈장(B)으로 이루어진 보관액에 넣어 -20℃, -70℃, -180℃(액체질소)에서 1주일간 보관하였다. 보관된 지방조직을 해동시킨 후 콜라게나아제를 처리하고, 수집된 세포들을 표준배지에 첨가하여 37℃ 배양기에서 1주일간 배양한 후 위상차 현미경으로 관찰하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, - 20℃ 및 -70℃ 에서 보관된 조직의 경우 보관액의 종류에 상관 없이 배양된 세포들을 관찰할 수 없었으며, -180℃ 액체질소에 보관한 경우에만 세포가 배양되는 것을 관찰할 수 있었다.

Claims (8)

1. 동결방지제와 혈청 또는 혈장을 포함하고 세포배양액은 포함하지 않는 동결보존액에 동물 조직을 침지하여 동결 보관하는 단계를 포함하는 조직 보관 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 동결방지제는 DMSO, 글리세롤, 글리콜류, 슈크로오스, 라피노오스, 락토오스, 트레할로오스, PVP, 덱스트론 및 알부민 중 적어도 하나인 조직 보관 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 혈청 또는 혈장은 우태아혈청(FBS), 갓태어난 소혈청(NBS), 말혈청, 사람혈청 및 사람혈장(human plasma) 중 적어도 하나인 조직 보관 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 혈청 또는 혈장은 자가혈청 또는 자가혈장인 조직 보관 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 동결보존액은 동결방지제 10 부피부에 대하여 혈청 또는 혈장을 10 내지 90 부피부로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 보관 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 동결보관은 -150 내지 -200℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 조직 보관 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 동결 보관된 조직을 해동시키고, 상기 해동된 조직에 단백질분해효소를 처리하여, 세포를 배양하는 단계를 포함하는 동결 보관된 조직으로부터 세포를 일차 배양하는 방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 동결 보관된 이식용 조직.

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