JP2002253207A

JP2002253207A - 組織凍結保存法

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Publication number: JP2002253207A
Application number: JP2001109281A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Fujita; 達男藤田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2001-03-01
Publication date: 2002-09-10

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞を、消化酵素などによる細胞分散処理や細
胞培養を行わずに、細切組織のまま、血清を含まないガ
ラス化液で凍結保存する方法を提供する。【解決手段】生体からバイオプシー針で採取した組織、
または死後間もない死体や屠畜場などで採取した組織を
鋏でペースト状になるまで細切し、燐酸緩衝液で良く洗
浄する。細切組織を血清を含まないガラス化液に入れ、
細切組織浮遊液とし、これを個体識別ラベルを貼った凍
結保存用容器に入れ、密封する。これを液体窒素上で冷
却後、液体窒素中に入れ、液体窒素中で保存する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞を消化酵素な
どによる細胞分散処理及び細胞培養を行わずに、細切組
織のまま、血清を含まないガラス化液で半永久的に凍結
保存する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般的に、細胞の凍結保存は、細胞の培
養から始まる。まず、採取した組織を細かく切断し、ト
リプシンなどの細胞分散剤で細胞を分散させ、牛胎児血
清などを含む培養液で初代培養し、２代、３代と継代培
養し，細胞を増殖させた後、凍結保存する。ここで、細
胞分散剤として使用するトリプシンは主に豚膵臓から抽
出したものが使用されており、豚を宿主とする未知のウ
イルスなどの病原体が混入している可能性がある。ま
た、培養液及び凍結保存液に使用されている牛胎児血清
についても同様のことが考えられ、未知の病原体等によ
る細胞への感染の可能性がある。

【０００３】また、多様な遺伝資源を豊富に確保するた
めに、多数の個体の細胞を保存する方法として、採取組
織から細胞を培養し、増殖した細胞を凍結保存する従来
の方法は、多くの労力、時間、経費を要し、また炭酸ガ
ス培養器等の機器を備えた施設でないと実施できない。

【０００４】いっぽう、細胞の凍結に関しては、分離さ
れた細胞株や胚について種々の凍結保存法が開発されて
いる。一般的には、細胞を低濃度のグリセロールなどの
凍結防御剤で平衡させ、保存用容器に充填し、徐々に温
度を下げていくことによって行う緩慢冷却法、又は、細
胞を高濃度の凍結防御剤とともに、急速に液体窒素温度
まで保存するガラス化法によって行われている。

【０００５】緩慢冷却法は、低濃度の凍結防御剤を用い
るため、細胞に対するストレスが比較的低く、一般的な
培養細胞や受精卵などに広く用いられている凍結保存法
であるが、冷却速度をコントロールするための機器が必
要である。

【０００６】ガラス化保存法は、細胞を高濃度の凍結防
御剤とともに容器に充填し、急激に液体窒素温度まで冷
却することによって、細胞内外とも氷晶を形成しないガ
ラス化状態にして保存する方法である。冷却速度をコン
トロールする特別な機器を必要としないなどの利点があ
り、近年注目を浴びている方法である。

【０００７】動物では、乳腺細胞や成牛の筋肉組織由来
細胞をドナー細胞とした体細胞クローン動物の生産が可
能となった。「牛の筋肉組織の培養細胞を用いて受胎可
能な体細胞核移植クローン胚の作出及びクローン胚を凍
結保存する方法」（特開平１１−２８９９１６）では、
ドナー細胞は、牛の筋肉組織をコラゲナーゼで細胞分散
処理後、培養し、３代継代増殖した細胞を、エチレング
リコール及び子牛血清を含む保存液で、プログラムフリ
ーザーによる緩慢冷却法で凍結保存したものを使用して
いる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】体細胞クローン技術に
よって、動物の個体の複製が可能となった。絶滅の危機
に瀕している貴重な野生動物や希少品種の家畜を保存、
維持するために、体細胞クローン技術が応用されようと
している。また、家畜では優れた経済形質を持つ個体を
選抜し、その個体を体細胞クローン技術によって複製
し、これを種畜として改良増殖を推進させる試みが行わ
れている。将来、食習慣の変化や健康志向などによる嗜
好性の変化、あるいは、地球環境の変化に伴う生産形態
の変化などに素早く対応して国民の食糧を守るために
は、体細胞クローン技術を応用した改良増殖が最も近道
で実現可能な手法と考えられる。このためには、多様な
遺伝的形質を持つ細胞を豊富に確保しておくことが重要
であり、これは国家戦略的にも重要な意義をもつといわ
れている。このような背景から、多数の個体の細胞を確
実に、簡単に、安い経費で、そしてプログラムフリーザ
ー等の機器を使用しない方法で凍結保存ずる方法を解決
する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、動物生体からバイ
オプシー針で採取した組織や死後間もない死体または屠
畜場などで採取した組織を細切、洗浄し、血清等を含ま
ないガラス化液に入れ、細切組織浮遊液とし、これを凍
結保存用容器に入れ密封後、液体窒素上で冷却し、液体
窒素中に保存することにより、組織のまま簡単に細胞を
保存する方法を発明した。すなわち、本発明は、細胞
を、未知の病原体に感染する可能性を遮断し、細切組織
のまま確実に、簡単に、低コストでかつ半永久的に保存
することを可能にした。

【００１０】

【発明の実施の形態】細胞を、消化酵素などによる細胞
分散処理及び細胞培養を行わずに、細切組織のまま、血
清を含まないガラス化液によって凍結保存する方法であ
る。以下に、本発明を詳細に説明する。

【００１１】組織の採取法には、生体からのバイオプシ
ーによる方法と解剖による方法がある。解剖による方法
とは、死後間もない死体からの採取や屠畜場での屠殺家
畜からの採取を含む。以下に、牛生体からのバイオプシ
ーによる筋肉組織の採取法と屠畜場における組織採取法
に分けて説明する。死後間もない死体からの組織採取
は、屠畜場での採取法に準じて行う。

【００１２】まず、牛生体からの筋肉組織採取法につい
て述べる。牛に筋弛緩剤を投与し、採取部位を剃毛、消
毒し、局所麻酔する。尖鋭メスで皮膚を穿孔した後、バ
イオプシー針を穿孔部から筋肉に挿入し、バイオプシー
針の外刀で筋肉組織を針内に切り取る。切り取った筋肉
組織は、Ｈａｎｋ′ｓ液の入った遠心管に入れる。この
切り取り操作を数回繰り返す。

【００１３】屠畜場では、屠殺、放血、剥皮後に行われ
る内臓及び頭部検査の過程で採取する。本法による組織
凍結保存法は、ほとんどすべての組織に応用可能であ
る。目的とする臓器を材料採取し易い状態に置き、滅菌
した鋏、ピンセットを用いて組織を約１ｇ採取し、Ｈａ
ｎｋ′ｓ液の入った遠心管に入れる。

【００１４】前述した、

【００１１】及び

【００１２】のＨａｎｋ′ｓ液には抗生物質を添加して
おき、組織採取後は、４〜２５℃に保管し、実験施設に
運ぶ。以下の操作は、生体からのバイオプシー採取材
料、死体又は屠畜からの採取材料いずれにも共通する。

【００１５】採取組織の入った遠心管を軽く振盪後、Ｈ
ａｎｋ′ｓ液を除去し、新たに同液を加え、遠心管を軽
く振盪して採取組織を洗浄する。同液を除去した後、組
織を直径９０ｍｍの滅菌済みプラスチックシャーレに出
し、眼科鋏でペースト状になるまで細切する。採取材料
が大きすぎた場合は、眼科鋏で適当な大きさに組織を切
り取り、これを眼科鋏でペースト状になるまで細切す
る。ペースト状になった細切組織を同眼科鋏で集め、燐
酸緩衝液５ｍｌを入れた新たな遠心管に移し、軽く振盪
する。遠心管を静置し、細切組織が沈下したら、上清を
アスピレーターで除去する。新たに、燐酸緩衝液５ｍｌ
を加え、同様に、振盪、静置、上清除去の操作を２回繰
り返し、２回目は、６０×Ｇ、２分間遠心後、上清をア
スピレーターで除去する。なお、遠心した時点で細切組
織の沈渣が遠心管の目盛りで約０．５ｍｌ程度になるよ
うに細切組織の量を調整しておく。０．５ｍｌに満たな
い場合はその量を計測しておく。

【００１６】この試験管にガラス化液を細切組織量の約
１０倍量入れ、細切組織と静かに混和し、細切組織浮遊
液とする。ガラス化液とは、低温域における液体の氷晶
形成を抑制する凍結防御剤や糖などを含み、液化窒素中
でも氷晶を形成しない溶液を意味し、２５％グリセロー
ルと２５％エチレングリコールの混合物、又は２５％エ
チレングリコールと２５％ＤＭＳＯの混合物などが使用
される。本発明では未知の病原体による感染の可能性を
遮断するため、血清を含まないガラス化液とした。

【００１７】予め、凍結保存用容器に、採取年月日、個
体名、臓器名などを記載したラベルを貼っておき、この
容器に、ガラス化液と混和して数分間経過した細切組織
浮遊液を入れ、密封する。液体窒素上に浮かべた厚さ約
１ｃｍの発泡スチロール板上に、細切組織浮遊液を入れ
た容器を置き、ここで約２分間冷却後、液体窒素中に入
れる。保存管理し易いように、キャニスター等に移し変
え、保存する。以上で組織凍結保存は完了である。

【００１８】以下に、凍結融解法及び培養法を説明す
る。液体窒素中から凍結保存容器を出し、室温の空中で
数秒間保持後、２０℃の水に入れる。水中で凍結保存溶
液が融解したら、容器を水中から出し、細切組織浮遊液
を遠心管に入れる。このとき遠心管には、予め、細胞培
養液５ｍｌ入れておく。遠心管をよく振盪し、６０×
Ｇ、２分間遠心後、上清を除去する。新たに、同培養液
５ｍｌを加え、同様に、振盪、遠心、上清除去を２回繰
り返す。同培養液６ｍｌで細切組織を浮遊させ、ピペッ
トに吸引し、２５ｃｍ^２細胞培養フラスコに移して、３
８．５℃、５％炭酸ガス培養器で培養する。

【００１９】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。

【実施例１】牛生体から筋肉組織をバイオプシー針で採
取し、凍結保存する方法について実施例を説明する。牛
に筋弛緩剤を投与し、採取部位を剃毛、消毒し、局所麻
酔した。尖鋭メスで皮膚を穿孔した後、Ｂａｘｔｅｒ社
（米国）製１４ゲージのバイオプシー針を用いて筋肉組
織を採取した。採取組織の入った遠心管を軽く振当とう
後、Ｈａｎｋ′ｓ液を除去し、新たに同液を加え、遠心
管を軽く振盪して採取組織を洗浄した。同液を除去した
後、組織を直径９０ｍｍの滅菌済みプラスチックシャー
レに出し、眼科鋏でペースト状になるまで細切した。ペ
ースト状になった細切組織を同眼科鋏で集め、燐酸緩衝
液（ゲンタマイシンを６０ｍｇ／ｌ加えたダルベッコの
修正ＰＢＳ）５ｍｌを入れた新たな遠心管に移し、軽く
振盪した。遠心管を静置し、細切組織が沈下した後、上
清を除去した。新たに、同燐酸緩衝液５ｍｌを加え、同
様に、振盪、静置、上清除去の操作を２回繰り返し、２
回目は、６０×Ｇ、２分間遠心後、上清を除去した。な
お、遠心した時点で細切組織の沈渣のおおよその量を遠
心管の目盛りで計測した。

【００２０】ガラス化液は２５％^Ｖ／_Ｖグリセロール＋
２５％^Ｖ／_Ｖエチレングリコール加燐酸緩衝液とし、細
切組織量の約１０倍量を使用した。ガラス化液と静かに
混和すると、細切組織は、はじめは浮上するが、２分ぐ
らいで一部は沈澱した。ガラス化液を入れて約６分経過
後、遠心管内に沈んだ筋肉細切組織を、数本のストロー
精液管（細型、綿栓付、消毒済み、容量０．５ｍｌ、富
士平工業株式会社製）に吸入、充填し、末端を加熱密封
した。液体窒素上に浮かべた厚さ約１ｃｍの発泡スチロ
ール板上に、細切組織浮遊液を入れたストローを置き、
ここで２分間冷却後、液体窒素中に入れ凍結保存した。

【００２１】

【実施例２】屠場で頬筋及び大動脈を採取し、凍結保存
する方法について実施例を説明する。屠畜場において、
滅菌した鋏、ピンセットを用いて頬筋及び大動脈を約１
ｇ採取し、Ｈａｎｋ′ｓ液の入った遠心管に入れた。採
取組織の入った遠心管を軽く振当とう後、Ｈａｎｋ′ｓ
液を除去し、新たに同液を加え、遠心管を軽く振盪して
採取組織を洗浄した。同液を除去した後、組織を直径９
０ｍｍの滅菌済みプラスチックシャーレに出し、眼科鋏
でペースト状になるまで細切した。採取材料が大きすぎ
た場合は、眼科鋏で適当な大きさに組織を切り取り、こ
れを眼科鋏でペースト状になるまで細切した。ペースト
状になった細切組織を同眼科鋏で集め、燐酸緩衝液（ゲ
ンタマイシンを６０ｍｇ／ｌ加えたダルベッコの修正Ｐ
ＢＳ）５ｍｌを入れた新たな遠心管に移し、軽く振盪し
た。遠心管を静置し、細切組織が沈下した後、上清を除
去した。新たに、燐酸緩衝液５ｍｌを加え、同様に、振
盪、静置、上清除去の操作を２回繰り返し、２回目は、
６０×Ｇ、２分間遠心後、上清を除去した。なお、遠心
した時点で細切組織の沈渣が遠心管の目盛りで約０．５
ｍｌ程度になるように細切組織の量を調整した。

【００２２】ガラス化液は２５％^Ｖ／_Ｖグリセロール＋
２５％^Ｖ／_Ｖエチレングリコール加燐酸緩衝液を使用し
た。ガラス化液５ｍｌを加えピペットで静かに混和する
と、細切組織は、はじめは浮上するが、２分ぐらいで沈
澱した。ガラス化液を入れて約６分経過後、遠心管内に
沈んだ細切組織を、数本のストロー精液管（細型、綿栓
付、消毒済み、容量０．５ｍｌ、富士平工業株式会社
製）に吸入、充填し、末端を加熱密封した。液体窒素上
に浮かべた厚さ約１ｃｍの発泡スチロール板上に、細切
組織浮遊液を入れたストローを置き、ここで２分間冷却
後、液体窒素中に入れ凍結保存した。

【００２３】実施例１，２で凍結保存した組織を凍結か
ら４週間後に融解し、培養した。具体的には、まず、液
体窒素からストローを取り出し、室温の空中で６秒間保
持後、２０℃の水に入れた。２０秒経過後、ストローを
水中から出し、アルコール綿花で清拭し、ストローカッ
ターでストローの両端を切断し、組織細切片浮遊液を遠
心管に入れた。このとき遠心管には、予め、培養液（１
０％牛胎児血清加ダルベッコ修正イーグルメディウムに
ゲンタマイシン６０ｍｇ／ｌ添加）を５ｍｌ入れておい
た。遠心管をよく振盪し、６０×Ｇ、２分間遠心後、上
清を除去した。新たに、同培養液５ｍｌを加え、同様
に、振盪、遠心、上清除去を２回繰り返した。同培養液
６ｍｌで細切組織を浮遊させ、ピペットに吸引し、２５
ｃｍ^２細胞培養フラスコに移して、３８．５℃、５％炭
酸ガス培養器で培養した。

【００２４】生体由来の筋肉組織、屠場由来の筋肉組織
いずれも培養開始５日目頃から細胞の増殖がみられた。
大動脈組織では培養開始７日目頃から細胞の増殖がみら
れはじめ、筋肉組織、大動脈組織いずれも約２週間で培
養フラスコ内底面の全体に細胞増殖が広がった。これら
の細胞は、いずれも線維芽細胞の増殖形態を示した。

【００２５】この頬筋組織由来細胞及び大動脈由来細胞
をさらに３〜５代継代培養した。この細胞をドナー細胞
として、体細胞クローン胚の作出を行った。体細胞クロ
ーン胚の作出方法は、「牛の筋肉組織の培養細胞を用い
て受胎可能な体細胞核移植クローン胚の作出及びクロー
ン胚を凍結保存する方法」（特開平１１−２８９９１
６）に準じて行った。概略は以下のとおりである。ま
ず、屠場由来卵子を成熟培養し、除核した後、上記のド
ナー細胞を除核卵子内に挿入した。チンマーマン細胞融
合液中で７００〜１０００Ｖ／ｃｍ直流電流５０μ秒間
２回印加による融合処理、カルシウムイオノフォアとシ
クロヘキシミドによる複合活性化処理を行った後、ＳＯ
Ｆ培養液で６〜８日間培養した。

【００２６】「牛の筋肉組織の培養細胞を用いて受胎可
能な体細胞核移植クローン胚の作出及びクローン胚を凍
結保存する方法」（特開平１１−２８９９１６）で使用
された牛生体採取筋肉組織由来細胞と、本発明で得られ
た屠場採取筋肉組織由来細胞及び大動脈由来細胞の核移
植成績を表に示した。分割率、胚盤胞率において、各細
胞に有意な差はみられなかった。また、屠場採取筋肉組
織由来細胞をドナー細胞とするクローン牛の生産に成功
した。

【００２７】

【発明の効果】本発明の組織凍結保存法は、体細胞クロ
ーン技術と融合することによって、最も効果を発揮す
る。絶滅の危機に瀕している貴重な野生動物や希少品種
家畜の保存、維持の手法として、また、家畜における多
様な経済的形質、あるいは種々の血統を遺伝資源として
確保する手法として、本発明の組織凍結保法は大いに活
用できる。

【００２８】本発明は、本来は野生動物や家畜を対象と
したものであるが、近年、進歩の著しいヒトの遺伝病治
療、臓器移植などの医療分野で必要とされる自己の細胞
あるいは組織の保存にも応用可能と考えられる。

【００２９】

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を、消化酵素などによる細胞分散処理
及び細胞培養を行わずに、細切組織のまま凍結保存する
方法。
【請求項２】細切組織を血清を含まないガラス化液に入
れ、細切組織浮遊液とし、これを凍結保存用容器に入
れ、素早く液体窒素上で冷却後、液体窒素中に凍結保存
する方法。
【請求項３】請求項１，２による、増殖可能な細胞とし
ての遺伝資源の保存。