KR102635317B1 - 네크로스타틴-1을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법 - Google Patents
네크로스타틴-1을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 네크로스타틴-1(Necrostatin-1)을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 관한 것으로, 본 발명의 정원줄기세포 동결보존용 조성물을 이용하는 경우, 동결보존 후에도 증식력 및 활성이 우수한 정원줄기세포를 제공하는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 정원줄기세포의 동결보존 효율을 높이기 위한 네크로스타틴-1(Necrostatin-1)을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 관한 것이다.
정원줄기세포(spermatognial stem cells)는 정자형성과정(spermatogenesis)을 통해 정자를 형성하는 남성 생식능력의 기반이 되는 성체 줄기세포로 자가재생(self-renewal) 능력을 통하여 적절한 수를 유지하고, 분화(differentiation) 능력을 통하여 정자를 생산하는 능력을 지니고 있다. 이 세포는 다른 줄기세포와 달리 남성의 유전정보를 다음 세대로 전달할 수 있는 유일한 생식선 줄기세포로 그 중요성이 강조되고 있다. 래트의 정소 내 정원줄기세포는 전체 정소세포군 중 극소수만이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 이론상으로 하나의 정원줄기세포는 4096개의 정자를 만들어 낼 수 있어 생산성이 매우 높은 세포라 할 수 있다. 이러한 정원줄기세포의 동결보존이 가능하다면, 암 치료, 화학적 치료 등과 같이 정자형성과정을 일시적 혹은 영구적으로 정지시키는 외부요인으로부터 발생될 수 있는 남성불임 치료에 매우 유용할 것으로 생각된다.
정원줄기세포의 동결보존에는 일반적으로 완만동결-급속융해법(slow freezing-rapid thawing)이 활용되고 있지만, 이러한 동결보존 방법은 미토콘드리아 기능 이상, DNA 절편화(DNA fragmentation), 과도한 활성산소 발생을 통한 산화적 스트레스(oxidative stress), 동결-융해 후 세포자연사(apoptosis) 유도 및 삼투압 스트레스(osmotic stress) 등과 같은 동결 상해(cryoinjury)를 유발한다는 문제점이 존재한다. 동결-융행 과정에서 발생하는 비정상적 활성산소는 세포에 산화적 스트레스를 유발함으로서 세포자연사를 유도하게 된다.
정원줄기세포의 생물학적 특성과 메커니즘(mechanism)은 체세포와 엄연히 다른 것임에도, 종래기술들은 정원줄기세포를 동결보존함에 있어서 체세포 동결보존 기법과 유사한 방법을 사용하였다는 한계점을 지니고 있으며, 이로 인해 동결-융해 후, 정원줄기세포의 동결보존으로 인한 효율성이 감소된 것으로 보인다. 하지만 이에 대해 생식세포 동결보존을 최적화하기 위해 동결보존의 효과를 직접적으로 평가하기 위한 시도는 많이 이루어지지 않은 실정이다. 따라서 종래기술의 문제점들을 해결하기 위해 동결-상해를 감소시킬 수 있는 효율적인 정원줄기세포 동결보존 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 정원줄기세포의 동결보존 효율을 높이기 위한 네크로스타틴-1(Necrostatin-1)을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 네크로스타틴-1을 포함하는 정원줄기세포(Spermatogonial stem cells)의 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 동결보존용 조성물은 50μM 내지 200μM 농도의 네크로스타틴-1을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 동결보존용 조성물은 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 함유하는 동결보존액을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 네크로스타틴-1을 포함하는 동결보존용 조성물을 이용하여 정원줄기세포를 동결시키는 단계를 포함하는 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 동결보존용 조성물은 50μM 내지 200μM 농도의 네크로스타틴-1을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 동결보존용 조성물은 우태아혈청, DMSO 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 동결보존액을 사용하는 경우, 동결보존 후에도 자가세포사멸을 낮춤으로써 증식력 및 활성이 우수한 정원줄기세포를 제공할 수 있으므로, 효울적인 동결보존을 통한 우수종축의 형질을 보존, 인간 불임치료, 세포치료제 등과 같은 분야의 획기적인 발전을 기대할 수 있다.
도 1은 네크로스타틴-1의 농도에 따른 동결보존 후 융해된 정원줄기세포의 융해 직후 생존율을 나타낸다.
도 2는 네크로스타틴-1의 농도에 따른 동결보존 후 융해된 정원줄기세포의 융해 및 원심분리 후 회수율을 나타낸다.
도 3은 네크로스타틴-1의 농도에 따른 동결-융해된 정원줄기세포의 일주일간 체외배양 후의 증식율을 나타낸다.
도 4는 동결-융해된 정원줄기세포의 증식능력을 확인하기 위하여 일주일간 배양된 세포의 정상적인 생식세포 콜로니(germ cell colony)와 GFP(green fluorescent protein)의 발현 태양을 나타낸다.
도 5는 네크로스타틴-1의 농도에 따른 정원줄기세포의 자가세포사멸비율의 관찰도를 나타낸다.
도 6은 면역세포화학법을 통한 정원줄기세포의 자가세포사멸정도의 관찰도를 나타낸다.
도 7은 면역세포화학법을 통한 정원줄기세포의 미분화상태의 관찰도를 나타낸다.
도 2는 네크로스타틴-1의 농도에 따른 동결보존 후 융해된 정원줄기세포의 융해 및 원심분리 후 회수율을 나타낸다.
도 3은 네크로스타틴-1의 농도에 따른 동결-융해된 정원줄기세포의 일주일간 체외배양 후의 증식율을 나타낸다.
도 4는 동결-융해된 정원줄기세포의 증식능력을 확인하기 위하여 일주일간 배양된 세포의 정상적인 생식세포 콜로니(germ cell colony)와 GFP(green fluorescent protein)의 발현 태양을 나타낸다.
도 5는 네크로스타틴-1의 농도에 따른 정원줄기세포의 자가세포사멸비율의 관찰도를 나타낸다.
도 6은 면역세포화학법을 통한 정원줄기세포의 자가세포사멸정도의 관찰도를 나타낸다.
도 7은 면역세포화학법을 통한 정원줄기세포의 미분화상태의 관찰도를 나타낸다.
본 발명자는 종래 동결보존 방법의 효율에 대한 문제점을 해결하기 위하여 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용하여 정원줄기세포의 동결보존 방법에 있어서, 상기 보존액은 네크로스타틴-1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 발명하였다. 또한, 상기 동결보존 방법이 정원줄기세포의 동결보존 후 증식력 및 활성이 향상되는 등 효율을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태는 네크로스타틴-1을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 "네크로스타틴-1"은 정원줄기세포가 동결보존되는 동안 발생할 수 있는 세포자가사멸정도를 감소시킴으로써 정원줄기세포의 동결보존 효율을 높이는데 기여한다. 상기 네크로스타틴-1은 총 동결보존용 조성물 중 50μM 내지 200μM, 바람직하게는 50μM 내지 100μM, 보다 바람직하게는 50μM의 농도로 포함될 수 있다.
상기 동결보존용 조성물은 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 우태아혈청은 총 동결보존용 조성물 중 5 내지 30%(v/v), 바람직하게는 10 내지 20%의 농도로 포함될 수 있으며, 상기 DMSO는 총 동결보존용 조성물 중 5 내지 30%(v/v), 바람직하게는 10 내지 20%의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 함유하는 동결보존액을 제공한다. 상기 동결보존액은 공지된 동물세포 배양배지를 포함할 수 있다. 상기 동결보존액은 염류, 항산화제, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액일 수 있으며, 구체적으로는 시트르산염, 바이카보네이트염 등의 염류; 타우린 등의 항산화제; 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란 등의 당류; 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 난황단백질, 아미노산 등의 단백질류를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "동결보존"은 액체질소 등을 이용해 -196℃ 이하의 온도에서 세포, 조직, 배아 등을 저장하는 방법으로서, 세포를 생리기능이 회복될 수 있는 상태로 동결, 보존하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "동결보존용 조성물"은 세포를 동결상태에서 보존할 경우 발생할 수 있는 동해를 경감할 목적으로 동결보존액에 첨가하는 물질을 지칭한다.
본 발명의 일 양태는 네크로스타틴-1을 포함하는 동결보존용 조성물을 이용하여 정원줄기세포를 동결시키는 단계를 포함하는 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.
상기 정원줄기세포의 동결보존 방법은 a) 동물의 정소를 효소처리 함으로써 정원줄기세포를 회수하는 단계; b) 상기 단계 a)의 정원줄기세포를 체외배양한 후 회수하는 단계; 및 c) 네크로스타틴-1이 첨가된 동결보존용 조성물을 이용하여 상기 단계 b)에서 회수된 정원줄기세포를 동결보존하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단계 b)에서의 체외배양은 성장인자가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층이 피복된 체외배양기에서 배양하는 동결보존 방법일 수 있고, 성장인자는 GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor, 신경영양인자), GFRα1(soluble GDNF receptor family α1), bFGF(basic fibroblast growth factor, 섬유아세포 성장인자)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 단계 b)에서 체외배양된 정원줄기세포의 회수는 트립신 처리를 통해서 단일세포로 회수하는 방법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 동결보존용 조성물 중 네크로스타틴-1은 50μM 내지 200μM, 바람직하게는 50μM 내지 100μM, 보다 바람직하게는 50μM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 동결보존용 조성물은 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 우태아혈청은 총 동결보존용 조성물 중 5 내지 30%(v/v), 바람직하게는 10 내지 20%의 농도로 포함될 수 있으며, 상기 DMSO는 총 동결보존용 조성물 중 5 내지 30%(v/v), 바람직하게는 10 내지 20%의 농도로 포함될 수 있다. 상기 동결보존용 조성물은 공지된 동물세포 배양배지에 첨가되어 사용될 수 있다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 네크로스타틴-1을 포함하는 동결보존액을 이용한 동결보존
본 실시예에서는 생식선줄기세포의 효율적인 동결보존법 개발을 위하여 관리와 정소세포군의 회수가 용이한 생쥐를 대상 동물로 선정하였고, 형광발현 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자를 지닌 C57BL/6-TgEGFP(C57GFP)종의 정원줄기세포를 실험의 대상으로 설정하였다.
1-1. 생쥐 정소로부터 정원줄기세포의 회수
생후 6 내지 8일령의 C57GFP 생쥐로부터 외과적인 방법으로 정소를 적출한 후, 적출된 정소의 백막을 제거하였고, 정소 조직을 트립신(trypsin)-EDTA와 DNaseⅠ 등의 효소들을 복합 처리하는 방법으로 정소로부터 정원줄기세포가 포함된 단일 세포들을 분리하였다. 분리된 단일세포들을 다음 단계의 처리 전까지 세포부유액에 10% 우태아혈청을 첨가한 후, 공극 크기(pore size)가 40㎛인 나일론 그물망(nylon mesh)에 통과시켜 잔여 정소조직과 세포 덩어리들을 제거하였고, 이후 30% 퍼콜(Percoll) 층을 이용한 원심분리(4℃, 600g, 10분)를 통하여 정소세포를 분리하였다. 분리된 세포들은 PBS-S(DPBS에 1mM 피루빈산나트륨, 5.6mM D-글루코오스, 10mM HEPES, 50units/㎖ 페니실린, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 1% FBS 첨가)로 2회 세척한 후, 항-Thy-1-항체 마이크로비드(microbead)가 피복된 자기 마이크로비드와 MACS(Magnetic activated cell sorting) 기법을 이용하여 고순도 정원줄기세포를 회수하였다.
1-2. 정원줄기세포의 체외배양 후 회수
상기 실시예 1-1에서 회수된 고순도 정원줄기세포의 대량증식을 위해 체외배양을 실시하였다. 회수된 정원줄기세포를 공배양세포(feeder cell)가 준비된 12웰 배양접시에 한 웰당 0.4×106개씩 담아 성장인자(10ng/㎖ GDNF, 75ng/㎖ GFRα1, 1ng/㎖ bFGF)가 첨가된 무혈청 배양액에서 체외배양하였고, 배양액은 2~3일마다 교체해주었다. 체외배양을 통해 대량 증식된 정원줄기세포는 트립신 처리를 통해 단일세포로 회수되었다. 회수된 단일 정원줄기세포는 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEM-α 배양액에 넣어 원심분리하였다.
1-3. 네크로스타틴-1을 이용한 동결보존
체외 증식된 정원줄기세포를 대상으로 동결보존시 네크로스타틴-1의 영향을 확인하기 위하여 네크로스타틴-1의 농도에 따른 동결보존 능력을 측정하였다. 우태아혈청 10%, DMSO 10%가 포함된 DPBS에 네크로스타틴-1을 각각 50μM, 100μM 및 200μM로 첨가하여 동결보존하고 해동하여 원심분리 후 생존율, 회수율 및 증식율을 측정하였다.
동결보존 방법은 체외 증식 후 회수된 정원줄기세포를 동결보존액과 0.25×106cells/㎖의 농도로 희석하여 1.8㎖ 동결용기에 보존하였고, 동결용기를 냉동용 컨테이너(Freezing container)에 넣고 약 -1℃/min의 속도로 -80℃까지 온도를 낮춰 하루 동안 보관한 후, 동결용기를 다시 액체질소로 옮겨 1달간 보관하였다.
실시예 2. 동결-융해 후 동결보존 효율 측정 실험 결과
본 실시예에서는 네크로스타틴-1의 첨가가 정원줄기세포의 동결보존에 미치는 효율을 알아보았다. 정원줄기세포의 동결보존에 네크로스타틴-1의 효과를 확인하기 위하여, FBS 10% 및 DMSO 10%로 구성된 기본 동결보존액에 각각의 제제를 서로 다른 농도로 동결보존액에 첨가하였다. DMSO를 용매로 하여 네크로스타틴-1을 고농도로 용해 후, DPBS에 첨가되는 농도의 두 배로 희석하여, 20%의 FBS와 20%의 DMSO를 포함하는 DPBS로 구성된 동결보존액에 1:1 비율로 섞어 6주간 체외배양한 정원줄기세포를 액체 질소에서 1달간 동결보존 하였다. 세포의 증식력을 측정하기 위해 동결-융해시킨 정원줄기세포를 생쥐의 무혈청 배양액에서 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 일주일간 체외배양하였다.
2-1. 회수율과 증식율 측정을 통한 동결보존 효율 비교
본 실시예에 필요한 정원줄기세포의 수적 확보를 위하여 동결보존 전 체외배양을 실시하였다. 정원줄기세포의 동결보존에 대한 네크로스타틴-1의 효과를 확인하기 위하여 FBS 10% 및 DMSO 10%로 구성된 기본 동결보존액에 각각의 제제를 농도별로 첨가하였으며, 네크로스타틴-1을 첨가하지 않은 기본 동결보존액을 대조군으로 하였다. 체외배양한 정원줄기세포를 액체 질소에 1달간 동결 보관한 후, 동결된 세포를 융해하여 융해 직후 트라이판블루를 이용하여 생존율(Survival rate) 및 원심분리 후 회수율(Recovery rate)에 대한 효과를 측정하였다. GFP를 발현하는 세포의 생존 및 회수율을 네크로스타틴-1을 첨가하지 않은 기본 배양액에 동결보존했던 대조군과 비교하였다. 그 결과, 농도에 관계없이 네크로스타틴-1의 모든 농도별 처리군에서 세포의 생존율을 유의적인 차이가 나타나지 않았지만(도 1 참조), 동결-융해 및 원심분리 후 세포의 회수율을 평가한 결과 네크로스타틴-1 50μM, 100μM 및 200μM 처리군에서 유의적으로 높은 회수율을 보였다(도 2 참조). 동결-융해 후 1주간 배양을 통해 세포의 증식율(proliferation rate)을 평가한 결과, 50μM 및 100μM 처리군에서 유의적으로 차이를 보였으며, 그 중 50μM의 농도로 처리한 그룹에서 가장 높은 증식율을 나타내었다(도 3 참조). 또한, 회수율과 증식율이 유의적으로 높은 네크로스타틴-1 50μM 처리군에서 정상적인 생식세포 콜로니(germ cell colony)가 관찰되었다(도 4 참조).
본 실시예를 통하여, 네크로스타틴-1 농도별 처리군 모두 정원줄기세포의 동결-융해 후 회수율 및 증식율에 긍정적인 영향을 미쳤지만, 네크로스타틴-1 50μM 및 100μM 처리군에서 정원줄기세포의 동결-융해 후 회수율 및 증식율의 현저한 향상을 확인할 수 있으므로, 네크로스타틴-1의 동결보존제로서의 효율성이 검증되었다.
2-2.
면역세포화학법을
이용한
세포자가사멸
확인을 통한 동결보존 효율 비교
상기 실시예 2-1을 토대로 네크로스타틴-1이 정원줄기세포의 동결보존 효율을 높이는 원인을 확인하기 위하여 면역세포화학법을 이용하여 세포자가사멸 정도를 확인하였다. 면역세포화학법을 이용하여 세포자가사멸 시 발생하는 시토크롬 C(cytochrome C)의 발현을 확인하였고, 네크로스타틴-1의 농도별 처리가 정원줄기세포의 세포자가사멸 감소에 미치는 영향을 영항을 확인하기 위하여 시토크롬 C의 발현 비율을 확인하였다. 또한 네크로스타틴-1을 첨가하지 않은 기본 배양액에 동결보존했던 대조군과 비교하였다.
그 결과, 네크로스타틴-1을 첨가하지 않은 대조군(33.33±5.50%)에 비하여, 세포자가사멸 정도가 네크로스타틴-1 50μM, 100μM 및 200μM 처리군에서 각각 3.89±0.80%, 5.28±0.71%, 9.32±1.47%로 감소하였음을 확인하였고(도 5 참조), 이로 인해 네크로스타틴-1 50μM, 100μM 및 200μM 처리군에서 높은 회수율 및 증식율을 나타내었다(도 2 및 3 참조). 또한 회수율 및 증식율이 높고 세포자가사멸 정도가 낮은 네크로스타틴-1 50μM 처리군에서 시토크롬 C의 발현정도를 면역세포화학법을 통하여 확인하였다(도 6 참조).
2-3. 면역세포화학법을 이용한 정원줄기세포의 미분화상태 검증
상기 실시예 2-1과 2-2의 결과를 종합해볼 때, 50μM과 100μM 및 200μM 농도의 네크로스타틴-1이 사용된 동결보존 방법은 정원줄기세포의 동결보존 후 증식율 및 세포자가사멸을 감소시킴으로써 정원줄기세포의 보존 효율을 효과적으로 증진시킬 수 있고, 50μM 농도의 네크로스타틴-1이 사용된 동결보존 방법이 정원줄기세포의 보존 효율을 가장 효과적으로 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 토대로 네크로스타틴-1 50μM이 포함된 동결보존액으로 한 달동안 동결보존된 정원줄기세포의 미분화상태를 검증하기 위해 면역세포화학법을 실시하였다. 사용된 마커로는 미분화 정원줄기세포의 대표 마커인 GFRα1, PLZF와 일반적인 생식세포 마커로 알려진 VASA, 분화된 생식세포에서 발현하는 C-Kit의 발현을 확인하였다(도 7 참조). 확인한 결과, GFRα1, PLZF, 및 VASA가 정상적으로 발현하고, C-Kit이 발현하지 않았음에 따라 네크로스타틴-1 50μM가 포함된 동결보존액으로 동결보존된 정원줄기세포의 미분화상태를 검증할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 네크로스타틴-1(Necrostatin-1)을 포함하는 정원줄기세포(Spermatogonial stem cells)의 동결보존용 조성물로서;
상기 동결보존용 조성물은 50μM의 농도의 네크로스타틴-1을 포함하는 것이고,
상기 동결보존용 조성물은 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 10 내지 20 중량%, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 10 내지 30중량% 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것인,
정원줄기세포의 동결보존용 조성물.
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- 제 1 항에 따른 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 함유하는 동결보존액.
- 네크로스타틴-1을 포함하는 동결보존용 조성물을 이용하여 정원줄기세포를 동결시키는 단계를 포함하는 정원줄기세포의 동결보존 방법으로서;
상기 동결보존용 조성물은 50μM의 농도의 네크로스타틴-1을 포함하는 것이고,
상기 동결보존용 조성물은 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 10 내지 20 중량%, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 10 내지 30중량% 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것인,
정원줄기세포의 동결보존 방법.
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