KR101611555B1 - 동물 배아의 보존 방법 - Google Patents

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Abstract

동물 배아의 보존 방법이 개시된다. 동물 배아의 보존 방법은 체외 수정 또는 체세포 핵이식된 난자를 준비하는 단계; 상기 난자를 플라보노이드계 화합물을 포함하는 배양액에서 배양하여 배아를 형성하는 단계; 및 상기 배아를 동결하는 단계를 포함한다.

Description

동물 배아의 보존 방법 {METHOD OF PRESERVING ANIMAL EMBRYO}
본 발명은 생명과학 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 동물 배아의 보존 방법에 관한 것이다.
동물의 체외 수정란 생산은 기술의 보편화로 많이 이루어지고 있으나, 생산된 배아를 효율적으로 활용하기 위해서는 성공적인 동결 방법이 요구된다. 이는 수정란을 이식할 대리모를 찾기 전에 상기 배아를 보존해야 하기 때문이다. 만약, 동결이 원활하게 이루어진다면 일시에 다수의 수정란을 준비해 두었다가 필요한 때에 사용할 수 있다. 따라서, 배아의 동결 및 상기 동결된 배아를 융해한 후 상기 대리모에 이식하기까지 상기 배아의 생존률을 높일 필요가 있다.
한편, 생명체는 호흡을 통해 유입된 산소를 산화시켜 얻어지는 에너지를 이용하여 생명을 유지한다. 상기 산소가 필요한 생명체의 대사과정에서 불가피하게 생명체의 세포를 파괴시키는 독성물질들이 부산물로 만들어지는데, 이를 활성산소라고 한다. 상기 활성산소는 생체 조직을 공격하여 세포를 산화, 손상시키는 주범으로서, 생체 내 여러 단백질의 아미노산을 산화시켜 단백질의 기능 저하를 초래한다.
상기 활성산소로 인해 세포가 노화되고 손상되는 것을 막아주는 물질인 항산화제(antioxidants)로는 여러 가지 종류가 있다. 상기 항산화제는 활성산소의 독작용을 제거하여 생체를 보호할 수 있으나, 상기 항산화제가 활성산소를 적절히 제거하지 못할 경우 축적되는 활성산소에 의해 세포의 파괴와 노화가 초래될 수 있다.
따라서, 상기 항산화제에 대한 연구는 지속적으로 이루어질 필요가 있으며, 아울러 동물 배아를 보존하기 위해 상기 항산화제의 이용 가능성에 대한 검토가 필요한 시점이다.
본 발명의 일 측면은 동물 배아의 생존율을 개선할 수 있는 동물 배아의 보존 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 동물 배아의 보존 방법은 체외 수정 또는 체세포 핵이식된 난자를 준비하는 단계; 상기 난자를 플라보노이드계 화합물을 포함하는 배양액에서 배양하여 배아를 형성하는 단계; 및 상기 배아를 동결하는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 플라보노이드계 화합물은 3´4´-디하이드록시플라본을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 배양액은, 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함하는 기본 배양액; 및 상기 플라보노이드계 화합물 및 상기 플라보노이드계 화합물을 용해하기 위한 용매를 포함하고, 상기 기본 배양액에 첨가되는 첨가 배양액을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 배아 형성 단계는, 상기 난자를 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함하는 기본 배양액에서 배양하여 1차 배아를 준비하는 단계; 및 상기 1차 배아를 상기 배양액에서 2차 배아로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 2차 배아는 배반포기배일 수 있다.
여기서, 상기 동결은 초자화동결 방식으로 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명의 일 측면에 따른 동물 배아의 보존 방법은 체외 수정 또는 체세포 핵이식된 난자를 준비하는 단계; 상기 난자를 제1 배양액에서 배양하여 배아를 형성하는 단계; 상기 배아를 동결하는 단계; 상기 동결된 배아를 융해하는 단계; 및 상기 융해된 배아를 제2 배양액으로 배양하는 단계를 포함하고, 상기 제1 및 제2 배양액 중에서 적어도 하나는 플라보노이드계 화합물을 포함한다.
여기서, 상기 제2 배양액은 상기 플라보노이드계 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 동물 배아의 배양에 필요한 배양액에 항산화제의 일종인 플라보노이드계 화합물이 첨가되어 있으므로, 동물 배아의 체외 배양 환경을 개선할 수 있다. 이를 통해, 동물 배아의 생존율을 향상시킬 수 있다. 나아가, 상기 플라보노이드계 화합물을 포함하는 배양액에서 동물 배아가 배양되므로, 상기 배아가 대리모에 이식되었을 때 임신율을 제고할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명의 일 측면에 따른 동물 배아의 보존 방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따른 동물 배아의 보존 방법은 단위발생란, 또는 체외 수정 난자, 또는 체세포 핵이식된 난자로부터 유래된 배아를 동결하기까지의 과정, 또는 상기 배아를 동결 및 융해한 후, 대리모 이식전까지의 과정 중에 상기 배아를 강력한 체외 배양 환경에서 보존하기 위한 방법이다. 이러한 과정에서 필요한 배양액 중에서 적어도 하나는 기본 배양액(기본 배지) 및 항산화제를 포함한다.
상기 기본 배양액은 배아 및/또는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 성분들을 포함하는 배지를 말한다. 상기 기본 배양액을 구성하는 성분은 상기 배아 또는 세포의 종류 및 그 성장 조건에 따라 달라질 수 있으므로, 상기 기본 배양액의 구체적인 성분 및 각 성분들의 함량에 의해 본 발명이 한정되지 않으나, 예를 들어, 상기 기본 배양액은 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함할 수 있다. 이외에도, 상기 기본 배양액은 당, 물 등을 더 포함할 수 있다. 상기 기본 배양액으로는 인위적으로 합성된 것을 사용하거나, 또는 상업적으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
상기 항산화제는 기본적으로 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라 배아 및/또는 세포의 체외 배양시 그 체외 배양 환경을 개선할 수 있다. 예를 들어, 상기 항산화제는 세포사멸을 감소시킬 수 있으며, 아울러 대사율을 증가시킬 수 있다. 이를 통해, 배 발달에 유익한 유전자 발현에 긍정적인 영향을 미침으로써 열악한 체외 환경으로부터 배아를 보호하고 세포의 질적, 양적 증가에 기여할 수 있다. 따라서, 배아의 생존율이 향상될 수 있으며, 나아가 동물 복제시 임신율이 향상될 수 있다.
상기 항산화제로는 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 비타민 E, C, 베타카로틴, 셀레니움, 플라보노이드계 화합물, 폴리페놀계 화합물, 프로폴리스계 화합물 등을 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
그 중에서, 본 발명의 일 측면에서는, 예를 들어, 플라보노이드계 화합물을 사용할 수 있다. 상기 플라보노이드계 화합물은 페닐기 2개가 C3사슬을 매개하여 결합한 C6-C3-C6형 탄소골격구조로 되어 있는 화합물이다. 상기 플라보노이드계 화합물은 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성을 지니며, 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 보고되고 있다. 또한, 상기 플라보노이드계 화합물은 모든 질병의 원인이 되는 생체 내 산화작용을 억제할 수 있다.
상기 플라보노이드계 화합물은 식물의 잎, 꽃, 뿌리, 열매, 줄기 등에 많이 들어 있으며, 특히 건조된 녹차잎의 경우 플라보노이드계 화합물이 녹차잎 무게의 30% 정도 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 플라보노이드계 화합물로는 식물 등으로부터 추출된 것을 사용할 수 있으나, 이에 국한되지 않으며, 인위적으로 합성되거나, 또는 시판되는 것을 사용할 수 있다.
상기 플라보노이드계 화합물의 구체적인 예로서는, 3´4´-디하이드록시플라본(3´4´-dihydroxyflavone), 2´,5,7-트라이하이드록시-4´,5´-(2,2-다이메틸크로메노)-6-프레닐플라바논(2´,5,7-trihydroxy-4´,5´-(2,2-dimethylchromeno)-6-prenylflavanone), 2´,4´,5-트라이하이드록시-6,7-(2,2-다이메틸크로메노)-3-프레닐플라본(2´,4´,5-Trihydroxy-6,7-(2,2-dimethylchromeno)-3-prenylflavone) 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 또는 2종 이상 조합되어 사용될 수 있으나, 본 발명은 상기 플라보노이드계 화합물의 구체적인 종류에 의해 한정되지 않는다.
상기 플라보노이드계 화합물은 용매에 용해되어 용액 상으로 상기 기본 배양액에 첨가될 수 있다. 즉, 상기 플라보노이드계 화합물을 포함하는 배양액은 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함하는 기본 배양액, 및 상기 플라보노이드계 화합물 및 상기 플라보노이드계 화합물을 용해하기 위한 용매를 포함하고, 상기 기본 배양액에 첨가되는 첨가 배양액을 포함할 수 있다. 상기 용매로는, 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO)를 사용할 수 있으나, 배아 및/또는 세포의 체외 배양에 악영향을 주지 않는 것이면 어느 것을 사용하여도 무방하다. 한편, 상기 플라보노이드계 화합물은 용액 상으로 첨가되는 대신에 상기 기본 배양액에 단독으로 직접 첨가되어도 무방하다.
본 발명의 일 측면에 따른 동물 배아의 보존 방법은, 구체적으로, 체외 수정 또는 체세포 핵이식된 난자를 준비하는 단계, 상기 난자를 제1 배양액에서 배양하여 배아를 형성하는 단계, 상기 배아를 동결하는 단계를 포함한다. 아울러, 상기 동물 배아의 보존 방법은 상기 동결된 배아를 융해하는 단계, 및 상기 융해된 배아를 제2 배양액으로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제1 및 제2 배양액 중에서 적어도 하나는 플라보노이드계 화합물을 포함한다. 이하에서는, 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
먼저, 예를 들어, 수핵 난자로부터 핵을 제거하여 미수정란을 준비한다.
상기 수핵 난자는 복제하고자 하는 대상 동물, 예를 들어, 소 또는 개 등으로부터 회수될 수 있다. 이때, 상기 수핵 난자는 체외에서 성숙된 난자를 회수하여 이용하거나, 또는 동물의 체내에서 성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다. 상기 수핵 난자를 탈핵하여 핵이 제거된 미수정란을 준비하기 위해, 예를 들어, 성숙된 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고, 이를 통하여 제1 극체, 난자의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거하는 방법을 사용할 수 있다. 이와 다르게, 수핵 난자의 난구 세포를 제거한 다음, 난자를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipet)을 이용하여 제1 극체 및 난자의 핵을 제거하는 방법을 사용할 수 있다. 이 외에도, 공지된 모든 방법을 사용할 수 있을 것이다.
상기 핵이 제거된 미수정란이 준비되면, 상기 미수정란에 상기 미수정란의 핵이식을 위한 공여 체세포를 주입하여 핵이식 난자를 준비한다. 여기서, 상기 핵이식 난자의 준비 과정은, 예를 들어, 상기 공여 체세포의 주입 과정 뿐만 아니라 그에 이어지는 세포 융합, 난활성 과정을 모두 포괄하는 개념일 수 있다.
상기 공여 체세포로는, 예를 들어, 복제 대상 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포 등을 이용할 수 있으나, 이 외에도 다른 세포들을 이용할 수 있을 것이다. 상기 공여 체세포는 상기 공여 체세포에, 예를 들어, 특정 유전자를 삽입 또는 조작하여 염색체를 유전자 이식방법이나 유전자 적중법을 이용하여 형질전환시킨 것일 수 있으나, 본 발명은 이에 국한되지 않는다.
상기 핵이식 난자가 준비되면, 상기 핵이식 난자를 제1 배양액에서 배양하여 배아를 형성한다. 여기서, 상기 제1 배양액은 항산화제, 예를 들어, 플라보노이드계 화합물을 포함할 수 있으나, 포함하지 않아도 무방하다. 상기 제1 배양액이 상기 항산화제를 포함하지 않는 경우는 상기 제2 배양액이 상기 항산화제를 포함할 필요가 있다. 여기서, 상기 항산화제를 포함하는 배양액은 전술한 바와 동일하므로, 이하에서는 그 상세한 설명은 생략한다.
상기 배아 형성 단계는 체외 배양 단계로서, 상기 제1 배양액에서 배양 초기부터 연속적으로 수행될 수 있으나, 그 과정 중 배양액을 달리하여 보다 세분화되어 진행될 수 있다. 일 예로, 상기 배아 형성은 상기 난자를 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함하는 기본 배양액에서 배양하여 1차 배아를 준비한 후, 상기 1차 배아를 상기 제1 배양액에서 2차 배아로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 배양액은 상기 항산화제를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 2차 배아는 배반포기배일 수 있다.
다음으로, 상기 배아의 장기 보존을 위해 상기 배아를 동결한다. 상기 동결 방법으로는 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 초자화동결(vitrification) 방법을 사용할 수 있다. 여기서, 상기 초자화동결은 동결기가 없는 상황에서 동해제 농도를 상당히 높인 상태에서(예를 들어, 35-45%) 수분을 빙정화시키지 않고 유리화 상태로 유지하는 방법을 말한다.
다음으로, 상기 동결된 배아를 대리모에 이식할 필요가 있을시 상기 동결된 배아를 융해한 후, 필요에 따라 상기 융해된 배아를 제2 배양액을 배양한다. 이때, 상기 제2 배양액은 플라보노이드계 화합물을 포함할 수 있으나, 포함하지 않아도 무방하다. 상기 제2 배양액이 상기 항산화제를 포함하지 않는 경우는 상기 제1 배양액이 상기 항산화제를 포함할 필요가 있다.
이하, 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 기술적 사상이 그에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
하기 실시예에서는 소 배아의 체외 배양 및 동결전 및/또는 동결후 배양 과정에 강력한 항산화제인 플라보노이드계 화합물을 처리함으로써 동결 배아의 생존율 개선 여부를 조사하였다. 이를 위해, 소 단위발생 배아의 동결전 및/또는 동결후에 적정량의 플라보노이드계 화합물을 처리하고, 융해후 생존율을 조사하였으며 그 영향성을 세포사멸 차원에서 분석하였다. 단위발생 배아는 미수정 난자가 난활성 유도를 통해 만들어진 배아를 말하므로, 단위발생 배아와 핵이식 배아는 난활성에 의해 만들어지는 배아라는 공통성을 갖고 있다. 따라서, 체외 수정 또는 체세포 핵이식 배아 등의 배양 환경을 개선함에 있어서 단위발생 배아를 이용하는 것이 매우 효율적이기 때문에, 하기 실시예에서 단위발생 배아를 사용하였다.
1. 플라보노이드계 화합물 준비
합성 플라보노이드계 화합물로서 하기 화학식 1로 표시된 3´4´-디하이드록시플라본(INDOFINE Chemical사 제조, 미국)을 사용하였고, 이를 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO)에 용해하여 이용하였다.
Figure 112009024374115-pat00001
2. 소 난자의 채취 및 성숙 배양
소 난소 표면에 육안으로 보이는 3-6 mm 크기 다수의 난포로부터 난구세포-난자 복합체(cumulus-oocyte complexes)를 18 게이지(gauge) 주사기를 이용하여 채취하였다.
상기 채취된 난구세포-난자 복합체를 1 mg/ml 소혈청 알부민이 들어있는 TL-HEPES 버퍼로 3회 이상 충분히 세척하고, 10% 우태아혈청(FBS)과 0.2mM 피루브산 나트륨, 1㎍/ml 난포자극 호르몬, 1㎍/ml 에스트라디올, 25㎍/ml 젠타마이신이 들어간 TCM-199 체외 성숙용 배양액에 넣은 후, 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기 내에서 22~24 시간 동안 성숙 배양하였다.
3. 소 난자의 단위발생과 체외 배양 및 플라보노이드계 화합물 처리
소 난자의 단위발생을 위해 체외 성숙된 난구세포-난자 복합체를 1 mg/ml의 하이알루로니다제를 이용해서 먼저 난구세포를 제거하고, TL-HEPES 버퍼로 충분히 세척한 다음, 10 μM 칼슘 아이오노마이신이 들어있는 CR1aa 배양액에서 5분 동안 활성화를 유도하고, 2 μM 6-디메틸아미노퓨린(6-dimethylaminopurine)이 들어있는 CR1aa 배양액에서 3시간 동안 배양하였다. 이때 사용된 배양액은 지방산이 제거된 소혈청 알부민(fatty acid free-BSA)이 3 mg/ml 함유되어 있는 CR1aa 배양액(기본 배양액 I)이었다.
이어, 상기 활성화를 난자를 기본 배양액 I에서 2일간 배양시켜 난할을 유도 하였다.
이어, 체외 배양 2일째에 4-8 세포로 분열된 난자를 배아의 질적 상태를 판정하여 기본 배양액 I인 CR1aa 배양액(대조군)과 상기 기본 배양액 I에 플라보노이드계 화합물이 들어있는 배양액(실험군)에 균등하게 나누어 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기 내에서 2일간 추가 배양하였다.
이어, 체외 배양 4일째에 각 대조군과 실험군의 배아를 10% FBS가 들어 있는 CRIaa 배양액(기본 배양액 II)에 플라보노이드계 화합물이 첨가되지 않은 군(대조군)과 CRIaa 배양액(기본 배양액 II)에 플라보노이드계 화합물이 첨가된 군(실험군)으로 각각 옮겨 4일간 추가 배양하여 체외 배양 7-8일째 배반포기배까지의 배 발달을 유도하였다. 여기서, 플라보노이드계 화합물은 10 μM 농도로 체외 배양 단계에서 처리군의 경우 배양 2일(≥2·4세포기)부터 8일(배반포기배)까지 2일 간격으로 배양액에 첨가하여 처리하였다.
4. 초자화동결 수행
체외 생산으로부터 획득된 팽창 배반포기배를 2단계 과정을 거쳐 초자화동결을 실시하였다. 구체적으로, 1단계로서 10% 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)과 10% FBS(우혈청)가 들어있는 D-PBS 용액(동결전처리 용액)에서 5분 동안 침지하여 평형을 유도한 후, 처리된 수정란을 다시 2단계 용액인 30% 에틸렌 글리콜, 0.5M 수크로오스(sucrose)와 10% 우혈청이 들어 있는 D-PBS 초자화동결액에 넣었다가 바로 빼내어 30초 안에 최소한의 동결액이 코팅된 상태로 동결 스트로에 옮긴후, 곧바로 -196℃ 액체 질소에 넣어 보관하였다.
5. 동결 수정란의 융해 및 배양
액체질소에 보관된 수정란을 급속으로 융해하였다. 구체적으로, 36℃ 물이 담겨있는 수조에 동결 스트로를 옮겨 30 초간 융해하고 스트로를 꺼내어 1.0 M 수크로오스가 들어있는 용기에 잘라 쏟아낸 다음, 수정란을 찾아 바로 0.5M 수크로오스로 옮기고, 1분 후에 0.25M 수크로오스로, 다시 1분 뒤에 0.125 M 수크로오스에 옮기며, 마지막으로 D-PBS 용액으로 1분뒤에 옮겼다. 최종적으로, 융해 과정이 끝난후 회수된 수정란은 대조군과 플라보노이드계 화합물 처리군을 각각 다시 나누어 플라보노이드계 화합물 처리 유무에 따른 생존을 조사하였다. 여기서, 플라보노이드계 화합물은 동결, 융해후 처리군에서 10uM 농도로 2일간 배양액에 첨가하여 처리하였다.
6. TUNEL(terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP nick end labeling) 분석을 이용한 세포사멸 검사
플라보노이드계 화합물을 이용한 처리가 배아의 세포사멸에 미치는 영향을 조사하기 위하여 TUNEL 분석을 실시하였다. 분석을 위해 회수된 대조군과 실험군의 배반포기배를 1mg/ml 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone)이 들어있는 PBS(처리용액)에 3번 세척하고, 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 1시간 동안 실온에서 고정을 실시하였다. 이어, 고정된 배아를 처리용액으로 다시 세척하고 0.3% Triton X-100 용액으로 실온에서 1시간 동안 침투를 유기하였다. 이어, 배아를 다시 처리용액으로 2회 세척한 다음, 광을 차단시킨 채로 37℃ 배양기에서 형광물질이 부착된 dUTP와 말단 데옥시뉴클레오티드(terminal deoxynucleotidyl) 전환 효소(Roche사, 독일)에 1시간 동안 반응을 유도하고, 40 mg/ml 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, Sigma사 제조)와 50 mg/ml RNase A 용액에 넣어 1시간 동안 핵 염색을 실시하였다. 이어, 반응이 끝난 배아를 처리용액으로 충분히 세척하고, 슬라이드 글래스에 옮겨 커버 슬립으로 누른 후 형광 현미경(Olympus사 제조, 일본)하에서 관찰하였다.
세포사멸 판정은 다음과 같이 수행하였다. 즉, 배아 내 전체 세포 핵은 붉게 염색되었으나, 그 중 사멸 핵은 푸르게 녹색으로 염색되고 파편화되어 있는 양상을 볼 수 있었는데, 이때 세포사멸 지수(apoptotic index)는 상기 염색결과를 이머징하여, 하기 수학식 1과 같이, 총 세포 핵수(No. of total nucleus) 대한 세포사멸 핵수(No. of apoptotic body)의 백분율로 조사하여 나타내었다.
Figure 112009024374115-pat00002
7. 플라보노이드계 화합물 처리가 동결 배아의 생존율에 미치는 영향 분석
플라보노이드계 화합물을 배반포기배 동결전/후에 처리한 후 생존율에 미치는 영향을 조사하였다. 단위발생으로 생산된 4-8세포기 배아의 체외 배양액 내에 및/또는 동결후 배양액 내에 플라보노이드계 화합물 10 μM을 처리하여 융해후 48시간째까지 생존율에 미치는 영향을 조사하였다. 본 실험은 5회에 걸쳐 실행되었다. 하기 표 1에 플라보노이드계 화합물 처리가 동결 배반포기배의 생존율에 미치는 영향을 나타내었다.
플라보노이드계 화합물 처리 동결란 생존배아수
동결전 융해후 융해후 48시간
(≥ 재-팽창율)
대조군 - - 79 53 (67.1)a
- + 73 57 (78.1)a,b
처리군
(10 uM)		 + - 73 54 (74.0)a,b
+ + 75 63 (84.0)b
표 1을 참조하면, 플라보노이드계 화합물 무처리군(-/-)의 융해후 생존율은 67.1%(53/79)인 반면, 동결전과 융해후 처리군(+/+)의 경우 생존능이 84.0%(63/75)로 나타나 플라보노이드계 화합물 처리 효과가 유의하게 있음(p<0.05)을 확인하였다. 또한, 동결전(+/-)이나 융해후(-/+) 플라보노이드계 화합물 처리군의 경우 융해후 처리군이 더 높은 생존율을 나타내어 융해후 플라보노이드계 화합물 처리가 동결 배아의 생존에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
8. 플라보노이드계 화합물 처리된 동결 배아의 세포 사멸율 조사
융해후 각군에서 생존한 배아의 세포 사멸율을 조사하기 위해 TUNEL 염색을 실시하였다.
도 1은 플라보노이드계 화합물을 이용한 처리 여부에 따른 동결 배아의 세포사멸을 나타낸 도면이다. 도 1에서, A 및 A-1은 동결전-융해후 무처리군(-/-)에 대한 세포 사진이고, B 및 B-1은 융해후 처리군(-/+)에 대한 세포 사진이고, C 및 C-1은 동결전 처리군(+/-)에 대한 세포 사진이고, D 및 D-1은 동결전-융해후 처리군(+/+)에 대한 세포 사진이고, E는 총 세포수(No. of total cell)를 나타낸 그래프이고, F는 세포사멸 지수를 나타낸 그래프이다. 여기서, Control은 대조군을 말하며, Flavonoid는 플라보노이드계 화합물로 처리된 군을 말한다.
도 1을 참조하면, 각 처리군의 총 세포수는 비슷한 반면, 융해후(-/+) 혹은 동결전/융해후(+/+) 플라보노이드계 화합물 처리군의 세포 사멸율이(≒ 10%) 무처리군(-/-) 또는 동결전처리군(+/-)의 세포 사멸율(>20%)에 비해 유의하게 감소되는 경향을 나타내었다. 이를 통해, 플라보노이드계 화합물 처리는 동결 배아의 세포사멸 지수를 감소시켜 생존율을 증진시킨다는 것을 알 수 있었으며, 특히 융해후 플라보노이드계 화합물 첨가가 생존에 효과가 있음을 알 수 있었다. 한편, 전술한 실시예에서는 단위발생 배아를 사용하였지만, 상기 실시예 결과는 체외 수정 또는 체세포 핵이식 배아 등의 배양 환경에도 동일하게 적용될 수 있다.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 이상에서 기술한 실시예들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이므로, 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 하며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
도 1은 플라보노이드계 화합물을 이용한 처리 여부에 따른 동결 배아의 세포사멸을 나타낸 도면이다.

Claims (8)

  1. 체외 수정 또는 체세포 핵이식된 난자를 준비하는 단계;
    상기 난자를 3'4'-디하이드록시플라본을 포함하는 배양액에서 배양하여 배아를 형성하는 단계; 및
    상기 배아를 동결하는 단계;를 포함하고,
    상기 난자는 인간을 제외한 동물의 난자인 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양액은, 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함하는 기본 배양액; 및 첨가 배양액;을 포함하고,
    상기 첨가 배양액은, 상기 3'4'-디하이드록시플라본 및 상기 3'4'-디하이드록시플라본을 용해하기 위한 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배아 형성 단계는,
    상기 난자를 지방산이 제거된 소혈청 알부민을 포함하는 기본 배양액에서 배양하여 1차 배아를 준비하는 단계; 및
    상기 1차 배아를 상기 배양액에서 2차 배아로 배양하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 2차 배아는 배반포기배인 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 동결은 초자화동결 방식으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
  7. 체외 수정 또는 체세포 핵이식된 난자를 준비하는 단계;
    상기 난자를 제1 배양액에서 배양하여 배아를 형성하는 단계;
    상기 배아를 동결하는 단계;
    상기 동결된 배아를 융해하는 단계; 및
    상기 융해된 배아를 제2 배양액으로 배양하는 단계;를 포함하고,
    상기 난자는 인간을 제외한 동물의 난자이고,
    상기 제1 및 제2 배양액 중에서 적어도 하나는 3'4'-디하이드록시플라본을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제2 배양액은 상기 3'4'-디하이드록시플라본을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 배아의 보존 방법.
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