KR101403597B1

KR101403597B1 - 정액 동결 보존용 조성물

Info

Publication number: KR101403597B1
Application number: KR1020120136009A
Authority: KR
Inventors: 사수진; 김인철; 최선호; 백선영; 김용곤; 김상운
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2014-06-03

Abstract

본 발명은 프로폴리스를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정액 동결 보존용 조성물은 정자, 특히 돼지의 정자의 동결시 발생할 수 있는 정자의 운동성 저하, 생존성 저하 등과 같은 수정능력의 감소를 획기적으로 줄여줄 수 있다.

Description

정액 동결 보존용 조성물 {Composition for cryopreservation of semen}

본 발명은 동결 정자의 수정능력을 증진할 수 있는 정액 동결 보존용 조성물에 관한 것이다.

유전능력이 우수한 개체의 품종의 보존과 번식을 위하여 정자의 장기보존 기술에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있다.

현재까지 돼지의 번식을 위한 인공수정에는 대부분 액상정액이 사용되어지고 있으나 액상정액은 동결보존된 정액에 비해 보존기간이 2~3일 내로 짧은 단점이 있다. 이러한 단점으로 인하여 우수한 유전능력을 보유한 개체의 정액 활용이 원활하지 못하고 보존기간에 따른 정자 운동성 저하 및 세균감염으로 인한 수태율 저하로 인한 엄청난 경제적인 손실을 가져오고 있는 실정이다.

이러한 제약을 극복하기 위하여 -196℃의 액체질소 내에서 반영구적으로 정자를 보존하고 유통이 가능한 정액 동결에 대한 관심이 높아지고, 이에 따라 실험 및 인공수정을 위한 정자 세포의 유용성이 확장되고 있다. 그러나, 동결과 융해를 겪은 정자는 동결융해 과정에서 저온충격, 산화 스트레스, 삼투성 스트레스, 동결보호제 독성 등으로 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하고 수정능력의 저하가 나타난다.

동결-융해된 정자는 운동성이 신선 정자의 약 40% 수준에 불과하며, 동결-융해 정액을 인공수정시 수태율 및 산자수는 일반 액상 정액에 비해 30~40% 저하되는 것으로 밝혀졌다.

특히, 인간 및 토끼 정자의 경우에는 냉각시 세포 사멸의 주요 원인 중 하나인 막 손상을 겪지 않는 것으로 밝혀졌으나, 돼지 정자는 삼투성 스트레스가 크고 여러 가지 면에서 민감하여 동결-융해된 샘플로 수정된 결과의 차이가 다른 가축들에 비해서 크게 나타나는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하고, 유전능력이 우수한 정액, 특히 돼지 정액을 동결하여 장기보존함으로써 활용성을 증대하고자 하였다. 그리고 수정능력이 우수하면서도 장기보관이 가능한 정자, 특히 돼지 정자를 이용하여 체계적이고 안정적인 동물, 특히 돼지의 개량과 유지에 이용하고자 한다.

또한, 다른 가축에 비해 온도변화에 대한 정자의 민감성이 큰 돼지 정자를 안정적으로 동결 보존하여 동결정액의 수태능력을 증진할 수 있는 정액 동결 보존액을 제공하고자 한다. 이로써 돼지의 품종보존, 번식, 유지 등을 통한 축산업의 발전에 이바지하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 프로폴리스를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물을 제공한다.

상기 프로폴리스(propolis)는 꿀벌들이 자신들의 생존과 번식을 위해 수목의 새싹이나 꽃에서 채취한 수지상태의 물질에 자신(꿀벌)의 타액과 효소 등을 혼합하여 만든 교질상태의 물질로써, 이를 벌집의 입구나 내벽에 발라 병균이나 바이러스를 막는 향균 작용이 강한 물질이다. 고순도의 프로폴리스 원액에는 수지, 밀랍, 화분, 유지성분 외에 특히 플라보노이드군, 비타민류, 미네랄 등 다양한 성분들이 다량으로 들어있다.

본 발명에서 사용되는 프로폴리스 원료는 통상 브라질, 중국, 유럽 및 미국으로부터 흑색, 녹흑색 또는 흑갈색의 괴상물 형태로 수입되거나 국내에서 생산되고 있는 것인데, 이들을 모두 본 발명에 사용할 수 있다.

상기 프로폴리스 원료는 프로폴리스 원괴로부터 에틸알콜 추출법, 글리세린 추출법, 미트셀(mitcell) 방법 등을 이용하여 분리하여 사용할 수 있다. 상기 프로폴리스 원괴는 프로폴리스를 꿀벌에서 채집한 상태를 의미한다.

상기 정액은 돼지의 정액인 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되지 않으며 소, 말 등을 포함하는 가축류의 정액 동결을 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 정액 동결 보존용 조성물은 정액을 동결하는 과정에서 발생하는 정자세포의 동해(凍害)를 방지할 목적 즉, 세포가 동결과정에서 손상을 입지 않도록 하는 동해방지제를 포함한다. 상기 동해방지제는 급속 동결온도, 바람직하게는 -130℃의 온도에서도 정자 세포의 동해를 방지할 수 있고, 최종적으로 -196℃의 액체질소에서 보관될 시에도 정자세포의 손상을 최소화할 수 있다.

상기 동해방지제는 세포내성 동해방지제 및 세포외성 동해방지제로 구분할 수 있다. 상기 세포내성 동해방지제는 세포 투과성으로, 세포에 침투하여 수분량을 감소시켜 동결시 세포내에 빙정이 형성되는 것을 억제해 세포를 보호하며, 글리세롤(glycerol), DMSO 및 글리콜(glycols)류를 포함한다. 상기 세포외성 동해방지제는 세포 비투과성으로, 동결전 세포내의 수분 유출을 조장하여 세포내외의 삼투평형을 유지시켜 세포막의 손상을 방지하며, 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 라피노오스(raffinose), 트레할로오스(trehalose), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 덱스트론(dextron), 혈청(serum) 및 알부민(albumin)을 포함한다.

상기 동해방지제의 농도는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 1 내지80 %(v/v) 포함되며, 바람직하게는 5 내지 60 %(v/v), 더욱 바람직하게는 7 내지 20 %(v/v) 포함될 수 있다.

본 발명의 정액 동결 보존용 조성물은 난황 및/또는 OEP(Orvus Es Paste, 합성 청정제)를 더 포함하며, 이들은 동결에 의한 정자의 손상을 방지할 수 있는 보호 교질의 역할을 한다.

상기 난황의 농도는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 5 내지 60 %(v/v) 포함되며, 바람직하게는 10 내지 40%(v/v), 더욱 바람직하게는 15 내지30 %(v/v) 포함될 수 있다.

상기 OEP의 농도는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 0.01 내지10 %(v/v) 포함되며, 바람직하게는 0.08 내지 5%(v/v), 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 %(v/v) 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 정액 동결 보존용 조성물은 보존기간의 연장에 따른 정액의 세균오염을 방지하여 정자의 생존성 저하를 방지하기 위하여 항생제를 포함하며, 이러한 항생제의 예로는 겐타마이신, 네오마이신, 아프라마이신, 카나마이신 등이 포함되나, 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 카나마이신이 이용된다.

상기 항생제의 농도는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 10 내지 1000 ug/ml 포함되며, 바람직하게는 30 내지 500 ug/ml, 더욱 바람직하게는 80 내지 200 ug/ml 포함될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 정액 동결 보존용 조성물에는 락토스 8-14% (v/v), 난황 17-23% (v/v), 황산 카나마이신 80-200ug/ml, 글리세롤 2-5% (v/v) 및 합성청정제 0.1-1% (v/v)이 포함되며, 매질로 정제수를 포함한다.

본 발명에 따른, 정액 동결 보존용 조성물 내의 프로폴리스 함량은 0.1-500 ug/ml이 바람직하며, 1-100 ug/ml이 더욱 바람직하고, 2-50 ug/ml가 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 정액 동결 보존용 조성물은 정액동결과정 중 사용시점에 따라 1차와 2차 동결 보존용 조성물으로 구분할 수 있다.

상기 1차 정액 동결 보존용 조성물은 동결에 앞서 정액의 온도를 냉장온도로, 바람직하게는 17℃에서 5℃까지 낮추는 과정에 사용하고, 상기 2차 정액 동결 보존용 조성물은 정액의 온도를 냉장온도에서 급속냉각 온도로, 바람직하게는 5℃에서 -130℃까지 낮추어 정액을 동결하는 과정에 사용한다.

본 발명의 정액은 정액 희석액과 혼합하여 원심분리를 실시한 후에, 분리된 정자펠렛을 모아 1차 동결보존액과 혼합된다. 상기 정액은 정액 희석액과 바람직하게는 1:1의 비율로 혼합된다. 상기 1차 동결보존액에 희석된 정자는 2차 동결보존액과 1~2:2~1의 비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 2:1의 비율로 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 정자의 동결시 발생할 수 있는 정자의 운동성 저하, 생존성 저하 등과 같은 수정능력의 감소를 줄여줄 수 있는 효과적인 동결 보존용 조성물을 제공한다.

동결 정자의 향상된 운동성과 생존율을 이용하여 우수한 유전자원의 장기보존 및 활용도 증대를 가져올 수 있다.

우수한 유전능력을 가진 개체를 체계적이고 안정적으로 개량 및 유지함으로써 가축, 특히 양돈산업 경쟁력을 도모할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

본 발명의 동결 보존액이 정자의 수정능력에 미치는 영향을 평가하기 위하여 아래의 방법으로 정자 생존율과 정자 운동성을 측정하였다.

<시험예 1. 정자 생존율 테스트>

동결된 정자의 융해 후 생존성을 평가하기 위해서 SYBR-14와 propidium iodide(PI)로 구성되어 있는 생사염색 키트(Live/Dead kit: Maxwell과 Johnson, 1997)를 이용해 정자를 형광염색하는 방법을 사용하였으며, 형광현미경(Olympus IX71, Japan)을 이용해 형광의 발현차를 분석하였다. SYBR-14는 살아있는 정자의 DNA에 부착하여 녹색 형광을 나타내며, PI는 죽은 정자의 DNA에 부착하여 붉은색 형광을 나타낸다. 정자의 생존율은 동결 후 융해된 정자 100마리당 살아있는 정자의 비율(%)로 나타내었다.

<시험예 2. 정자 운동성 테스트>

동결된 정액 스트로우(0.5㎖)를 38℃에서 정확히 20초간 융해하였다. 융해 후의 정액샘플을 34℃로 가온된 돼지 액상정액 보존액 BTS(Beltsville thawing solution; KRUUSE)에 희석하였다. BTS에 희석된 정액샘플을 38℃ water bath에서 30분간 가온한 다음, 정자자동분석기(CASA; computer-assisted semen analysis, Medical Supply, Korea)를 이용하여 정자의 운동성(%)을 측정하였다.

실시예 1. 프로폴리스가 첨가된 정액 동결 보존액을 이용한 동결 정자의 수정능력 평가

1. 프로폴리스가 첨가된 정액 동결 보존액 제조

LEY(Lactose Egg-yolk) 동결보존액은 첨가물 조성과 정액동결과정 중 사용시점에 따라 1차와 2차 동결보존액으로 구분할 수 있다. 락토스, 난황 및 항생제를 포함하고 있는 것을 1차 동결보존액이라고 하며, 동결에 앞서 정액의 온도를 17℃에서 5℃까지 낮추는 과정에 사용한다. 락토스, 난황, 항생제, 글리세롤 및 OEP를 포함하고 있는 것을 2차 동결보존액이라고 하며, 정액의 온도를 5℃에서 -130℃까지 낮추어 정액을 동결하는 과정에 사용한다. 본 발명에서는 프로폴리스가 1차와 2차 동결보존액 모두에 첨가되었으며, 정액을 동결하고 융해하여 프로폴리스가 포함된 LEY 동결보존액이 동결-융해된 정자의 수정능력에 미치는 영향을 평가하였다.

(1) 1차 동결보존액의 제조 및 프로폴리스 첨가

1차 동결보존액 조성(LEY 용액; Lactose Egg-yolk 용액)

1차 동결보존액	조성	농도	g/1,000㎖
	α-Lactose	11%	110
	Egg yolk	20%	200㎖
	Kanamycin sulfate	100㎍/㎖	0.1

락토스 11% (v/v), 난황 20% (v/v) 및 황산 카나마이신 100㎍/㎖을 포함하는 1차 정액 동결 보존액을 제조한 후, 상기 1차 정액 동결 보존액에 프로폴리스를 0, 5 및 10㎍/㎖ 첨가한 정액 동결 보존액을 각각 제조하였다.

계란은 난각을 깨어 흰자를 제거한 다음, 여과지에 난황을 굴리는 방식으로 여분의 난백을 제거하고 난황(egg yolk)만을 추출하여 보존액에 첨가하였다.

(2) 2차 동결보존액의 제조 및 프로폴리스 첨가

2차 동결보존액 조성(LEY 용액+glycerol+OEP)

2차 동결보존액	조성	농도	g/1,000㎖
	α-Lactose	11%	110
	Egg yolk	20%	200㎖
	Kanamycin sulfate	100㎍/㎖	0.1
	Glycerol	7%	70㎖
	OEP	1%	10㎖

락토스 11% (v/v), 난황 20% (v/v),황산 카나마이신 100㎍/㎖, 글리세롤 7% (v/v) 및 OEP (v/v) 1%를 포함하는 2차 정액 동결 보존액을 제조한 후, 상기 2차 정액 동결 보존액에 프로폴리스를 0, 5 및 10㎍/㎖ 첨가한 정액 동결 보존액을 각각 제조하였다.

2. 정자의 채취

듀록 수퇘지 5두의 정액을 수압법을 이용하여 채취하였다. 채취한 정액을 돼지정액 희석액 BTS(Beltsville thawing solution; KRUUSE)에 1:1의 비율로 희석하여 실험실로 운반하였다.

3. 정액의 동결

(1) 동결 전 정액의 평가

수퇘지로부터 채취된 정액은 혈구계산판(hematocytometer)를 이용하여 정자농도를 측정하였다. 정자의 운동성(%)은 정자자동분석기(CASA; computer-assisted semen analysis, Medical Supply, Korea)를 이용하여 측정하였으며, 80% 이상의 정자 운동성을 보이는 샘플만을 동결 시험에 이용하였다.

(2) 돼지 정액의 동결방법

수퇘지로부터 채취한 정액은 돼지정액 희석액 BTS(Beltsville thawing solution; KRUUSE)와 1:1의 비율로 희석하여 동결 전까지 17℃ 보관고에서 2시간 이상 예비냉각을 실시하였다. 이 때 1차 동결보존액도 17℃ 보관고에 보관하여 정액샘플과 온도가 동일하게 되도록 준비하였다.

50㎖ 원심튜브에 BTS에 희석된 정액샘플을 40㎖씩 분주한 다음, 17℃ 온도에서 800g로 10분간 원심분리를 실시하여 상층액(정장)을 제거하였다. 원심분리를 마친 정액샘플로부터 상층액(정장)을 제거하고 정자펠렛을 모아 1차 동결보존액으로 일차 희석을 실시하였다. 이 때 정자의 농도는 1.5× 10⁹/㎖이 되도록 한 다음, 1차 동결보존액에 희석된 정자샘플(17℃)을 90분 동안 냉장고 안에서 보관하여 정액샘플의 온도가 5℃까지 내려가도록 냉각을 실시하였다.

5℃의 1차 동결보존액에 희석된 정액샘플을 동일온도(5℃)로 냉각된 2차 동결보존액(LEY 용액+glycerol+OEP)과 2:1의 비율로 혼합하였으며, 이 때 정자의 농도는 1.0× 10⁹/㎖가 된다. 혼합을 마친 정액샘플은 자동 정액주입 및 봉입장치(filling & sealing machine, IMV technologies, FRANCE)를 이용하여 0.5㎖ 용량의 동결용 스트로우에 정액샘플을 봉입하였다. 그 후 세포내에 글리세롤이 침투되도록 5℃에서 90분 동안 정액이 봉입된 스트로우를 냉장고에 정치하면서 글리세롤 평형을 실시하였다. 이 때 글리세롤의 최종농도는 3.5%이며, OEP의 최종농도는 0.5%가 된다.

글리세롤 평형을 마친 샘플들은 정액 자동동결기(SY-LAB Gerate GmbH, Austria)를 이용하여 5℃에서 -130℃까지 온도를 순차적으로 낮추는 방식으로 동결시켰으며, 동결된 스트로우들은 -196℃의 액체질소 컨테이너에 보관하였다.

4. 정액의 융해

상기 동결정액을 38℃의 water bath에서 20초간 융해한 후에 정자의 운동성 및 생존성을 평가하였다.

5. 결과

구분	propolis 농도(㎍/㎖)
구분	0	5	10
운동성(%)	45.4± 4.2	50.6± 4.0	58.3± 3.3
생존성(%)	45.8± 3.8	47.2± 6.1	55.7± 4.9

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 동결 정액의 운동성과 생존성은 프로폴리스의 농도에 의존하여 향상되는 것을 알 수 있었으며, 따라서 프로폴리스가 동결 정자의 수정능력에 긍정적인 작용을 미치는 것으로 추측된다.

비교예 1. 포도잎 추출물이 첨가된 정액 동결 보존액을 이용한 동결 정자의 수정능력 평가

상기 실시예 1에서 프로폴리스 대신 플라보노이드 성분이 다량 함유된 것으로 알려진 포도잎 추출물을 첨가하여 정액 동결 보존액을 제조하여 돼지의 정액을 동결시킨 후에 시험예 2와 동일한 방법으로 정자의 운동성을 평가하였다.

구분	Type of flavonoid
구분	대조군	포도잎 추출물	프로폴리스
운동성(%)	34.6± 1.7	35.4± 2.7	40.6± 1.6

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 플라보노이드가 다량 함유된 것으로 알려진 포도잎 추출물의 경우, 대조군에 비해서는 미비하게나마 정자의 운동성이 증가된 것으로 나타났으나, 프로폴리스에 비해서는 정자의 운동성이 저조한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 정자 수정능력의 증가는 플라보노이드 성분 이외에도 프로폴리스에 포함된 다양한 성분들이 영향을 미쳤을 것으로 추정이 된다.

Claims

프로폴리스를 포함하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 프로폴리스는 돼지 정액 동결 보존용 조성물 1㎖당 2 내지 50㎍이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 동해방지제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 동해방지제는 세포내성 동해방지제 및 세포외성 동해방지제 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 세포내성 동해방지제는 글리세롤, DMSO 및 글리콜 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 세포외성 동해방지제는 락토오스, 수크로오스, 라피노오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트론, 혈청 및 알부민 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 동해방지제의 농도는 돼지 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 7 내지 20 %(v/v) 포함되는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 정자의 동해를 방지하는 보호 교질의 역할을 하기 위해 난황 및/또는 OEP(Orvus Es Paste)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 난황은 돼지 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 15 내지 30 %(v/v) 포함되며, 상기 OEP(Orvus Es Paste)는 돼지 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 0.1 내지 1 %(v/v) 포함되는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 항생제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 항생제는 겐타마이신, 네오마이신, 아프라마이신 및 카나마이신 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 항생제는 상기 돼지 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 2 내지 50 ug/ml 포함되는 것을 특징으로 하는 돼지 정액 동결 보존용 조성물.