KR20220073545A - 미토템포(MitoTEMPO)를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

미토템포(MitoTEMPO)를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토템포를 이용한 정액 동결 보존용 조성물을 제공하여, 동결 정자의 향상된 운동성과 생존율을 이용하여 우수한 유전자원의 장기보존이 가능하도록 하고, 동결 정자의 수정능력을 증진할 수 있도록 한다.

Description

미토템포(MitoTEMPO)를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물 및 이의 제조방법{COMPOSITION FOR CRYOPRESERVATION OF SEMEN CONTAINING MITOTEMPO AND MANUFACTURING METHOD USING THE SAME}
본 발명은 미토템포를 포함하여 동결 정자의 수정능력을 증진할 수 있는 정액 동결 보존용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유전능력이 우수한 개체의 품종의 보존과 번식을 위하여 정자의 장기보존 기술에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있다.
현재까지 돼지의 번식을 위한 인공수정에는 대부분 액상정액이 사용되고 있으나 액상정액은 동결보존된 정액에 비해 보존기간이 2~3일 내로 짧은 단점이 있다. 이러한 단점으로 인하여 우수한 유전능력을 보유한 개체의 정액 활용이 원활하지 못하고 보존기간에 따른 정자 운동성 저하 및 세균감염으로 인한 수태율 저하로 인한 엄청난 경제적인 손실을 가져오고 있는 실정이다.
이러한 제약을 극복하기 위하여 -196℃의 액체질소 내에서 반영구적으로 정자를 보존하고 유통이 가능한 정액 동결에 대한 관심이 높아지고, 이에 따라 실험 및 인공수정을 위한 정자 세포의 유용성이 확장되고 있다. 그러나, 동결과 융해를 겪은 정자는 동결융해 과정에서 저온충격, 산화 스트레스, 삼투성 스트레스, 동결보호제 독성 등으로 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하고 수정능력의 저하가 나타난다.
동결-융해된 정자는 운동성이 신선 정자의 약 40% 수준에 불과하며, 동결-융해 정액을 인공수정시 수태율 및 산자수는 일반 액상 정액에 비해 30~40% 저하되는 것으로 밝혀졌다.
특히, 인간 및 토끼 정자의 경우에는 냉각시 세포 사멸의 주요 원인 중 하나인 막 손상을 겪지 않는 것으로 밝혀졌으나, 돼지 정자는 삼투성 스트레스가 크고 여러 가지 면에서 민감하여 동결-융해된 샘플로 수정된 결과의 차이가 다른 가축들에 비해서 크게 나타나는 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하고, 유전능력이 우수한 정액, 특히 돼지 정액을 동결하여 장기보존 함으로써 활용성을 증대하고자 하였다. 그리고 수정능력이 우수하면서도 장기보관이 가능한 정자, 특히 돼지 정자를 이용하여 체계적이고 안정적인 동물, 특히 돼지의 개량과 유지에 이용하고자 한다.
또한, 다른 가축에 비해 온도변화에 대한 정자의 민감성이 큰 돼지 정자를 안정적으로 동결 보존하여 동결정액의 수태능력을 증진할 수 있는 정액 동결 보존액을 제공하고자 한다. 이로써 돼지의 품종보존, 번식, 유지 등을 통한 축산업의 발전에 이바지하고자 한다.
본 발명은 미토템포(MitoTEMPO)를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미토템포(MitoTEMPO)의 농도는 1.0 μM 내지 200 μM일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정액 동결 보존용 조성물은 동해방지제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 동해방지제는 세포내성 동해방지제 및 세포외성 동해방지제 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포내성 동해방지제는 DMSO, 글리세롤, 및 글리콜 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포외성 동해방지제는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈, 라피노오스, 덱스트론, 혈청, 및 알부민 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 동해방지제의 농도는 돼지 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 7 부피% 내지 20 부피%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정액 동결 보존용 조성물은 OEP(Orvus Es Paste) 및 글리세롤 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 OEP(Orvus Es Paste)는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 0.3 부피% 내지 0.7 부피%를 포함하고, 상기 글리세롤은 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 4.0 부피% 내지 6.0 부피%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 항생제는 겐타마이신, 네오마이신, 아프라마이신, 및 카나마이신 중 적어도 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정액은 두록(Duroc) 돼지의 정액일 수 있다.
본 발명은 8 부피% 내지 14 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 60mL 내지 100mL와 난황(egg yolk) 10mL 내지 30mL를 혼합하여 1시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계, 상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계, 상기 혼합액에 미토템포(MitoTEMPO)를 0 μM 내지 150 μM을 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 30분 내지 3시간 동안 교반하여 1차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계, 및 제조된 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.0 부피% 내지 2.0 부피%의 OEP 및 6 부피% 내지 12 부피%의 글리세롤 중 적어도 하나를 혼합하는 단계를 포함하여 제조되는 정액 동결 보존용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명은 정액을 여과하는 단계, 여과된 상기 정액을 등온조건(약 38℃으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합하여 1차 희석정액을 제조하는 단계, 상기 1차 희석정액을 등온조건(약 38℃으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합하여 2차 희석정액을 제조하는 단계, 상기 2차 희석정액을 12시간 이상 10℃내지 20℃에서 보관하는 단계, 상기 2차 희석정액을 10℃내지 20℃에서 500g 내지 1,000g으로 5분 내지 15분 원심분리하여 정자를 수득하는 단계, 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계, 상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계, 및 상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 액체질소에서 보관하는 단계를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계는, 8 부피% 내지 14 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 60mL 내지 100mL와 난황(egg yolk) 10mL 내지 30mL를 혼합하여 1시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계, 상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계, 상기 혼합액에 미토템포(MitoTEMPO)를 0 μM 내지 150 μM을 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 30분 내지 3시간 동안 교반하여 1차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계, 제조된 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.0 부피% 내지 2.0 부피%의 OEP 및 6 부피% 내지 12 부피%의 글리세롤 중 적어도 하나를 혼합하는 단계, 및 상기 혼합액을 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계를 포함하여 2차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계는, 상기 정자 및 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 정자의 농도를 1.5×1010cells/mL 내지 1.5×108cells/mL 으로 설정하는 단계, 상기 정자 및 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합한 혼합액을 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계, 및 상기 혼합액에 상기 2차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 정자의 농도를 1.0×1010cells/mL 내지 1.0×108cells/mL로 설정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 정자의 동결시 발생할 수 있는 정자의 운동성 저하, 생존성 저하 등과 같은 수정능력의 감소를 줄여줄 수 있는 효과적인 동결 보존용 조성물을 제공한다.
동결 정자의 향상된 운동성과 생존율을 이용하여 우수한 유전자원의 장기보존 및 활용도 증대를 가져올 수 있다.
따라서 융해 후 정액의 운동성을 개선하여, 우수한 유전능력을 가진 개체를 체계적이고 안정적으로 개량 및 유지함으로써 가축, 특히 양돈산업 경쟁력을 도모할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 정액 동결 보존용 조성물 제조방법을 순서도의 형태로 나타낸 것이다.
도 2는 정액 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결 정액을 보관하는 방법을 순서도의 형태로 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 명세서에 개시된 실시예들을 도면을 참조하여 상세하게 설명하고 자 한다. 상세한 설명, 도면들 및 청구항들에서 상술하는 예시적인 실시예들은 한정을 위한 것이 아니며, 기재된 실시예들과 다른 실시예들이 이용될 수 있으며, 여기서 개시되는 기술의 사상이나 범주를 벗어나지 않는 한 다른 변경들도 가능하다.
개시된 기술에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시예에 불과하므로, 개시된 기술의 권리범위는 본문에 설명된 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 개시된 기술의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용된 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 개시된 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석 될 수 없다.
본 발명은 미토템포(MitoTEMPO)를 포함하는 두록(Duroc) 돼지 정액 동결 보존용 조성물을 제공한다.
미토템포(MitoTEMPO)는 미토콘드리아를 표적으로 과산화물을 제거하는 항산화 물질이다. 동결 보존제 없이 정자의 미토콘드리아를 동결보존 시, 과도한 과산화물들에 의해 심각하게 손상을 받으며, ATP의 생산에 부정적인 영향을 미쳐 정자의 운동성이 감소한다. 또한, 정액 동결과정은 활성산소의 과잉 생산을 유발할수 있고, 이는 융해 후 정자의 운동성 및 정자의 형태를 손상시킬 우려가 있다. 이는, 두록(Duroc) 돼지 정액을 동결 시 동결보존제로 미토템포(MitoTEMPO)를 첨가함으로써, 미토템포(MitoTEMPO)가 미토콘드리아를 표적으로 과산화물을 제거하기 때문이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 두록(Duroc) 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 미토템포(MitoTEMPO)를 1.0 μM 내지 200 μM 포함할 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 정액을 동결하여 보존할 때, 정자의 운동성이 파괴되지 않는 범위 내라면 1.0 μM 이하 또는 200 μM 이상의 농도를 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 두록(Duroc) 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 OEP(Orvus Es Paste) 및 글리세롤 중 적어도 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 OEP는 총 조성물 부피 대비 0.5 부피% 내지 2.5 부피%일 수 있고, 상기 글리세롤은 총 조성물 부피 대비 7 부피% 내지 11 부피%일 수도 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 정액을 동결하여 보존할 때, 정자의 운동성이 파괴되지 않는 범위 내라면 이외의 범위로 구성될 수도 있다.
본 발명에 따른 상기 두록(Duroc) 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 동해방지제를 더 포함할 수 있다. 상기 동해방지제는 세포내성 동해방지제 및 세포외성 동해방지제 중 적어도 하나 이상일 수 있다. 상기 동해방지제는 총 조성물 부피 대비 7 부피% 내지 20 부피%로 구성될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 정액을 동결하여 보존할 때, 정자의 운동성이 파괴되지 않는 범위 내라면 7 부피% 이하 또는 20 부피% 이상으로 구성될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포내성 동해방지제는 DMSO, 글리세롤, 및 글리콜 중 적어도 하나 이상을 포함하여 구성될 수 있다. 상기 세포외성 동해방지제는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈, 라피노오스, 덱스트론, 혈청, 및 알부민 중 적어도 하나 이상을 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 두록(Duroc) 돼지 정액 동결 보존용 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 항생제는 겐타마이신, 네오마이신, 아프라마이신, 및 카나마이신 중 적어도 하나 이상일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 돼지 정자의 운동성에 영향을 미치지 않거나, 그 영향이 미미한 항생제의 경우, 상기 두록(Duroc) 돼지 정액 동결 보존용 조성물에 포함될 수도 있다.
본 발명은 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 도 1은 본 발명에 따른 정액 동결 보존용 조성물 제조방법을 순서도의 형태로 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 방법은 8 부피% 내지 14 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 60mL 내지 100mL와 난황(egg yolk) 10mL 내지 30mL를 혼합하여 1시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계(S110), 상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계(S120), 상기 혼합액에 미토템포(MitoTEMPO)를 0 μM 내지 150 μM을 혼합하는 단계(S130), 상기 혼합액을 30분 내지 3시간 동안 교반하여 1차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계(S140), 및 제조된 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.0 부피% 내지 2.0 부피%의 OEP 및 6 부피% 내지 12 부피%의 글리세롤 중 적어도 하나를 혼합하는 단계(S150)를 포함하여 제조될 수 있다.
그러나 상기 단계에 한정되는 것은 아니며, 상기 정액 동결 보존용 조성물 제조방법은 동해방지제를 포함하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 동해방지제는 세포내성 동해방지제 및 세포외성 동해방지제 중 적어도 하나 이상일 수 있다. 상기 동해방지제는 총 조성물 부피 대비 7 부피% 내지 20 부피%로 구성될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 정액을 동결하여 보존할 때, 정자의 운동성이 파괴되지 않는 범위 내라면 7 부피% 이하 또는 20 부피% 이상으로 구성될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포내성 동해방지제는 DMSO, 글리세롤, 및 글리콜 중 적어도 하나 이상을 포함하여 구성될 수 있다. 상기 세포외성 동해방지제는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈, 라피노오스, 덱스트론, 혈청, 및 알부민 중 적어도 하나 이상을 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정액 동결 보존용 조성물 제조방법은 항생제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 항생제는 겐타마이신, 네오마이신, 아프라마이신, 및 카나마이신 중 적어도 하나 이상일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 돼지 정자의 운동성에 영향을 미치지 않거나, 그 영향이 미미한 항생제의 경우, 상기 정액 동결 보존용 조성물 제조방법에 포함될 수도 있다.
본 발명은 정액 동결 보존용 조성물을 이용한 동결 정액 보관방법을 제공한다. 도 2는 정액 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결 정액을 보관하는 방법을 순서도의 형태로 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 동결 정액 보관방법은 정액을 여과하는 단계(S210), 여과된 상기 정액을 등온조건(약 38℃으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합하여 1차 희석정액을 제조하는 단계(S220), 상기 1차 희석정액을 등온조건(약 38℃으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합하여 2차 희석정액을 제조하는 단계(S230), 상기 2차 희석정액을 12시간 이상 10℃내지 20℃에서 보관하는 단계(S240), 상기 2차 희석정액을 10℃내지 20℃에서 500g 내지 1,000g으로 5분 내지 15분 원심분리하여 정자를 수득하는 단계(S250), 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계(S260), 상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계(S270), 및 상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 액체질소에서 보관하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계는 8 부피% 내지 14 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 60mL 내지 100mL와 난황(egg yolk) 10mL 내지 30mL를 혼합하여 1시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계, 상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계, 상기 혼합액에 미토템포(MitoTEMPO)를 0 μM 내지 150 μM을 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 30분 내지 3시간 동안 교반하여 1차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계, 제조된 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.0 부피% 내지 2.0 부피%의 OEP 및 6 부피% 내지 12 부피%의 글리세롤을 혼합하는 단계, 및 상기 혼합액을 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계를 포함하여 2차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계는 상기 정자 및 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 정자의 농도를 1.5×1010cells/mL 내지 1.5×108cells/mL 으로 설정하는 단계, 상기 정자 및 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합한 혼합액을 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계, 및 상기 혼합액에 상기 2차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 정자의 농도를 1.0×1010cells/mL 내지 1.0×108cells/mL로 설정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 동결 보존액이 정자의 수정능력에 미치는 영향을 평가하기 위하여 아래의 방법으로 정자의 운동학적 특성들을 측정하였다.
<실험예 1-1 : 실험 재료>
본 발명에 사용된 정액은 농촌진흥청 국립축산과학원 양돈과에서 사육된 성숙한 두록종(Duroc) 수퇘지 3두를 대상으로 음경 수압법을 이용하여 채취하였다. 채취된 두록돼지의 정액은 여과지를 통해 교양물질 및 불순물을 제거한 후, 채취정액과 등온조건(약 38℃)으로 가온한 정액희석액(BTS; Beltsville thawing solution)을 1:1 비율로 1차 혼합하여 1차 희석정액을 제조하고, 1시간 이내에 실험실로 운반하여 이용하였다. 상기 정액희석액(BTS)는 파우더 형태의 완제품으로 판매되는 돼지 정액 보존용 희석제이며, 일반적으로 증류수에 정액희석액(BTS) 파우더를 녹여 BTS 용액을 만들어 사용한다.
<실험예 1-2 : 두록 돼지의 정액 준비>
실험실로 운반된 1차 희석정액은 등온조건(약 38℃)으로 가온한 정액희석액(BTS)으로 2차 희석을 실시하여 최종 정자농도를 30×106cell/mL로 조정하였다. 희석을 마친 정액샘플들은 자동 정자분석기(CASA; Computer-assisted sperm analysis, ISASv1, PROISER, SPAIN)을 이용하여 정자의 운동성이 80% 이상이고 정상적인 형태를 가진 정자의 비율이 80% 이상인 정액샘플만을 선별하여 본 실험에 이용하였다.
<실험예 1-3 : 정액 동결 보존용 조성물 제조>
1차 정액 동결 보존용 조성물(LEY; Lactose-Egg Yolk extender) 준비를 위하여 11 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 80mL와 난황(egg yolk) 20mL를 혼합하여 2시간 동안 교반을 실시하였다. 이후, 상기 혼합액을 원심분리(3,000 rpm, 5℃, 20분)하여 상층액만을 회수하고 상기 혼합액에 각각 다양한 농도(0, 0.5, 5, 50, 및 500 μM)의 미토템포(MitoTEMPO)를 첨가하여 1시간 동안 교반을 실시하였다.
2차 정액 동결 보존용 조성물은 미토템포(MitoTEMPO)가 첨가되지 않은 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.5 부피% OEP(Orvus Es Paste; Nova Chem, U.S.A)와 9 부피% 글리세롤(Glycerol)을 첨가하여 4℃ 냉장고 보관하여 실험에 사용하였다. 동결 시 OEP와 글리세롤(Glycerol)의 최종 농도는 각각 0.5 부피%와 3 부피%로 하였다.
<실험예 1-4 : 두록 돼지 정액의 동결 및 융해방법>
동결보존에 앞서 희석정액 샘플은 24시간 동안 17℃ 냉장고에서 보관되었다. 그 후 희석정액 샘플을 17℃ 에서 800g으로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 최종 정자농도가 1.5×109cells/mL가 되도록 1차 정액 동결 보존용 조성물을 첨가하였다. 1차 정액 동결 보존용 조성물로 희석정액 샘플을 세포동결기로 옮겨 2시간 동안 17℃에서 5℃까지 냉각시킨 후 2차 정액 동결 보존용 조성물을 1차 정액 동결 보존용 조성물 용량의 1/2 만큼 첨가하여 최종 정자농도를 1×109cells/mL로 맞추었다. 정액샘플은 0.5mL 스트로우(IMV, L'Aigle, France)에 봉입하여 5℃에 1시간 동안 보관하여 글리세롤 평형을 유지하였다. 정액샘플의 동결은 자동 정액동결기(SY-LAB Gerate GmbH, Austria)를 사용하여 실시하였고 동결인 완료된 샘플들은 -196℃ 액체질소에 담가서 분석에 사용될 때까지 보관하였다. 동결된 스트로우는 38℃ 항온수조에 20초 동안 담그는 방법으로 융해하여, 등온조건(약 38℃)으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합 후 원심분리(400g, 38℃, 10분)하여 상층액을 제거하고, 등온조건(약 38℃)으로 가온한 정액희석액(BTS)으로 재부유하여 정자의 운동학적 특성 분석을 하였다.
개체 간의 변이를 최소화하기 위해서 동결-융해 후 정자의 운동성이 30% 이상인 개체(두록종 수퇘지)만을 선발한 후 정액샘플을 풀링(pooling)하여 본 발명에 이용하였다.
<실험예 1-5 : 정자 운동학적 특성 분석>
동결-융해된 정자의 운동학적 특성들은 CASA를 사용하여 객관적으로 평가되었다. 정자샘플은 등온조건(약 38℃)으로 가온한 정액희석액(BTS)의 희석을 통해 30×106cells/mL의 농도로 조정하여 분석했다. 38℃로 가온된 정자샘플 5μl를 markler counting chamber (Sefi-Medical Instruments, Israel)와 CASA를 사용하여 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하기 위해서 10회 이상 분석을 반복하여 데이터를 수집하였다. 각 정자샘플의 운동학적 특성 지표인 운동성(MOT, percent of motile sperm, %; 운동성이 있는 정자의 비율), 곡선운동 속도(VCL, curvilinear velocity, ㎛/s; 정자의 운동경로를 따라 형성되는 호를 단위시간 당 이동한 거리), 직선운동 속도(VSL, straight-line velocity, ㎛/s; 정자의 처음 위치와 마지막 위치 사이의 직선거리를 전체 경과시간으로 나눈 값), 평균운동 속도(VAP, average path velocity, ㎛/s; 전체 이동한 거리를 경과한 시간으로 나눈 값), 직진성(LIN, linearity, %; VSL과 VCL의 비[VSL/VCL]), 측두 이동거리(ALH, Amplitude of lateral head displacement, ㎛; 이동에 따른 정자두부 좌우 진폭의 평균거리)가 측정되었다.
<실험예 1-6 : 통계적 분석>
본 발명에서의 통계분석은 R 3.6.1 버전을 이용하여 아노바(ANOVA; Analysis of variance)와 GLM(Generalized linear model)를 적용하여 던컨(Duncan)의 다중 범위 테스트(multiple range test)방법에 의하여 통계적 유의성을 분석하였으며 처리 평균 간의 유의성 검정은 t-검정(t-test)을 이용하였다. 유의수준은 5%로 설정하여 검정을 실시하였다.
<실험예 2-1 : 결과(미토템포 첨가한 동결정액을 융해한 직후의 운동학적 특성)>
표 1은 돼지 정액의 동결과정 중 정액 동결 보존용 조성물에 미토템포(MitoTEMPO)를 첨가한 경우의 융해 직후 정자의 운동학적 특성을 나타낸 표이다.
미토템포 농도(μM) 운동성(%) VCL
(μm/s)		 VSL
(μm/s)		 VAP
(μm/s)		 LIN
(%)		 ALH
(μm)
0 41.68±1.31ab 55.36±2.61 34.79±1.56 38.82±2.09 65.23±0.92 1.89±0.09
0.5 40.28±0.75ab 52.37±1.72 34.72±0.22 39.04±0.27 66.41±1.79 1.83±0.07
5 50.46±2.71a 53.52±1.38 36.97±0.89 41.18±0.84 69.08±0.11 1.80±0.06
50 46.96±2.66a 52.68±2.78 35.69±1.54 39.56±2.00 67.82±0.75 1.81±0.06
500 35.40±2.95b 50.50±1.03 31.84±1.16 36.34±0.77 63.09±2.43 1.85±0.07
표 1에서, VCL(curvilinear velocity)은 곡선 속도를 나타내고, VSL(straight-line velocity)는 직선 속도를 나타내고, VAP(average path velocity)은 평균 경로 속도를 나타내고, LIN(linearity)은 선형성을 나타내고, ALH(amplitude of lateral head displacement)는 측면 헤드 변위의 진폭을 나타낸다. 상기 표에서 표의 데이터 중 a및 b는 던컨 다중 범위 검정(Duncan's multiple range test)을 이용하여 각 시료 간의 유의성을 나타낸 것이다(p<0.05).미토템포(MitoTEMPO) 5 μM 처리구에서의 운동성 및 50 μM 처리구에서의 운동성은 각각 50.46±2.71% 및 46.96±2.66%로 무처리구(0 μM, 41.68±1.31%) 및 0.5 μM 처리구(40.28±0.75%) 보다 다소 높은 운동성을 보였으나 유의적인 차이를 보이지 않았고 500 μM 처리구(35.40±2.95 %) 보다는 유의적으로 높은 운동성을 나타냈다 (p<0.05).
상기 결과는 5 및 50 μM 미토템포(MitoTEMPO) 처리가, 생존은 하고 있으나 낮은 대사 상태로 움직이지 않는 정자의 운동성을 개선하기 때문이다. 정자의 운동성(MOT) 이외에 평균운동 속도(VAP)와 직진성(LIN)이 대조구에 비해 0.5, 5 및 50 μM MitoTEMPO 처리구에서 다소 높은 경향을 보였으나, 곡선운동 속도(VCL)와 직선운동 속도(VSL)와 마찬가지로 유의적인 차이를 보이지 않았다.
<실험예 2-2 : 결과(미토템포 첨가한 동결정액을 융해한 후 30분 경과 시점의 운동학적 특성)>
표 2는 돼지 정액의 동결과정 중 정액 동결 보존용 조성물에 미토템포(MitoTEMPO)를 첨가한 경우의 융해 후 30분 경과 시점의 정자의 운동학적 특성을 나타낸 표이다.
미토템포 농도(μM) 운동성(%) VCL
(μm/s)		 VSL
(μm/s)		 VAP
(μm/s)		 LIN
(%)		 ALH
(μm)
0 36.32±2.04ab 55.55±1.98 38.53±2.22 40.73±2.13 76.12±1.37 1.67±0.03
0.5 35.09±2.30ab 47.88±0.88 35.96±0.90 38.38±0.86 75.10±0.77 1.58±0.01
5 41.42±2.14a 48.69±2.02 36.14±1.69 38.98±1.67 74.18±0.38 1.62±0.07
50 35.91±0.77ab 48.74±1.03 36.15±1.04 38.64±0.87 74.16±0.59 1.65±0.01
500 29.88±1.06b 46.50±3.03 32.58±3.43 35.73±3.48 69.71±2.84 1.66±0.01
표 2에 나타난 바와 같이, 정자의 운동성은 미토템포의 농도가 5 μM일 때 41.42±2.14로 가장 높게 나타났다. 미토템포의 농도가 0 μM, 0.5 μM, 및 50 μM인 경우, 정자의 운동성이 각각 36.32±2.04, 35.09±2.30, 및 35.91±0.77로 나타났다. 표 2를 통해 융해 직후의 정자의 운동학적 특성과 유사한 경향을 보였다. 이를 통해, 시간이 경과함에 따라 두록 돼지의 정자에 미치는 미토템포의 영향이 비슷하다는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서는 돼지 동결용 보존액에 대한 5 μM의 미토템포 처리 및 50 μM의 미토템포 처리가 융해 후 돼지 정자의 운동성에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이와 달리, 두록 돼지의 정자에 500 μM의 미토템포를 처리했을 때 무처리구 보다 운동성이 낮았고, 고농도의 미토템포를 처리시 세포독성을 나타냈다. 상기 표에서 표의 데이터 중 a및 b는 던컨 다중 범위 검정(Duncan's multiple range test)을 이용하여 각 시료 간의 유의성을 나타낸 것이다(p<0.05).
<실험예 3. 결론>
본 발명의 실험예에 나타난 바와 같이, 정액 동결 보존용 조성물에 대한 5 μM 미토템포 및 50 μM 미토템포의 첨가는 동결-융해 후 돼지 정자의 운동성, VCL, VSL VAP, LIN에 긍정적인 영향을 미친다. 본 발명은, 우량 씨돼지 유전자원 보존과 번식효율 증진측면에서 돼지 육종개량과 더불어 양돈산업에 잠재적 가치가 높으며, 돼지 정자의 동결보존과 돼지 정자를 융해한 후 품질개선을 위한 다양한 첨가물 활용에 이용이 가능하다.
상기의 본 발명은 바람직한 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 미토템포(MitoTEMPO)를 포함하는 정액 동결 보존용 조성물.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 미토템포(MitoTEMPO)의 농도는 1.0 μM 내지 200 μM인 정액 동결 보존용 조성물.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 정액 동결 보존용 조성물은 동해방지제를 더 포함하는 정액 동결 보존용 조성물.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 동해방지제는 세포내성 동해방지제 및 세포외성 동해방지제 중 적어도 하나 이상인 정액 동결 보존용 조성물.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 세포내성 동해방지제는 DMSO, 글리세롤, 및 글리콜 중 적어도 하나 이상인 정액 동결 보존용 조성물.
  6. 제4 항에 있어서,
    상기 세포외성 동해방지제는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈, 라피노오스, 덱스트론, 혈청, 및 알부민 중 적어도 하나 이상인 정액 동결 보존용 조성물.
  7. 제4 항에 있어서,
    상기 동해방지제의 농도는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 7 부피% 내지 20 부피%인 정액 동결 보존용 조성물.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 정액 동결 보존용 조성물은 OEP(Orvus Es Paste) 및 글리세롤 중 적어도 하나 이상을 포함하는 정액 동결 보존용 조성물.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 OEP(Orvus Es Paste)는 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 0.3 부피% 내지 0.7 부피%를 포함하고, 상기 글리세롤은 정액 동결 보존용 조성물 총 부피 대비 4.0 부피% 내지 6.0 부피%인 정액 동결 보존용 조성물.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 정액 동결 보존용 조성물은 항생제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정액 동결 보존용 조성물.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 항생제는 겐타마이신, 네오마이신, 아프라마이신, 및 카나마이신 중 적어도 하나 이상인 정액 동결 보존용 조성물.
  12. 제1 항에 있어서,
    상기 정액은 두록(Duroc) 돼지의 정액인 정액 동결 보존용 조성물.
  13. 8 부피% 내지 14 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 60mL 내지 100mL와 난황(egg yolk) 10mL 내지 30mL를 혼합하여 1시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계;
    상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계;
    상기 혼합액에 미토템포(MitoTEMPO)를 1.0 μM 내지 200 μM을 혼합하는 단계;
    상기 혼합액을 30분 내지 3시간 동안 교반하여 1차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계; 및
    제조된 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.0 부피% 내지 2.0 부피%의 OEP 및 6 부피% 내지 12 부피%의 글리세롤 중 적어도 하나를 혼합하는 단계를 포함하여 제조되는 정액 동결 보존용 조성물 제조방법.
  14. 정액을 여과하는 단계;
    여과된 상기 정액을 등온조건(약 38℃으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합하여 1차 희석정액을 제조하는 단계;
    상기 1차 희석정액을 등온조건(약 38℃으로 가온한 정액희석액(BTS)과 혼합하여 2차 희석정액을 제조하는 단계;
    상기 2차 희석정액을 12시간 이상 10℃내지 20℃에서 보관하는 단계;
    상기 2차 희석정액을 10℃내지 20℃에서 500g 내지 1,000g으로 5분 내지 15분 원심분리하여 정자를 수득하는 단계;
    정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계;
    상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계; 및
    상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 액체질소에서 보관하는 단계를 포함하는 동결 정액 보관방법.
  15. 제14 항에 있어서,
    상기 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계는
    8 부피% 내지 14 부피%의 α-락토오스(Lactose) 용액 60mL 내지 100mL와 난황(egg yolk) 10mL 내지 30mL를 혼합하여 1시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계;
    상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계;
    상기 혼합액에 미토템포(MitoTEMPO)를 0 μM 내지 150 μM을 혼합하는 단계;
    상기 혼합액을 30분 내지 3시간 동안 교반하여 1차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계;
    제조된 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물에 1.0 부피% 내지 2.0 부피%의 OEP 및 6 부피% 내지 12 부피%의 글리세롤 중 적어도 하나를 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합액을 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계를 포함하여 2차 정액 동결 보존용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 동결 정액 보관방법.
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 정자 및 상기 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계는
    상기 정자 및 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 정자의 농도를 1.5×1010cells/mL 내지 1.5×108cells/mL 으로 설정하는 단계;
    상기 정자 및 상기 1차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합한 혼합액을 2℃내지 7℃에서 30분 내지 3시간 보관하는 단계; 및
    상기 혼합액에 상기 2차 정액 동결 보존용 조성물을 혼합하여 정자의 농도를 1.0×1010cells/mL 내지 1.0×108cells/mL로 설정하는 단계를 포함하는 동결 정액 보관방법.
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