CN111849872A - 一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理；(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，重悬后培养得到获能精液；(3)将抽出卵泡液的卵巢在显微镜下拣出卵丘‑卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘；(4)向每个受精小滴加获能精液，放入培养箱中培养后洗去卵母细胞上附着的精子，体外受精培养完成。本发明通过在冷冻基础液Ⅰ联合添加相应浓度的咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，两者产生的协同作用，能有效的提高解冻后猪精子的活力、质膜完整率、DNA完整率，进而提高解冻后猪精子体外受精效果。

Description

一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法
技术领域
本发明涉及猪精子冷冻保存技术领域，具体涉及一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法。
背景技术
精液的冷冻保存可以有效保留生物的遗传育种和种质资源[8]。随着猪冷冻精液生产工艺和人工授精技术的迅速发展，采用冷冻精液繁育的种猪在受孕率和仔猪分娩数方面均得到了有效的提高，已经接近鲜精的配种水平。但猪冷冻精液生产因难度大、冻精-解冻后活率及受胎率低等诸多原因，导致猪精液冷冻技术的研究仍未完全成熟。总体而言，完善猪冷冻精液制备技术，还有很多的问题亟待解决。
猪是一种在转基因生物反应器领域有着广阔应用前景的模型动物,需要建立一套有效的体外繁殖技术为转基因猪生产提供大量高质量的成熟卵母细胞和胚胎。体外成熟(IVM)猪卵母细胞IVF后囊胚发育率在20％左右，与牛、羊等动物体外胚胎生产(IVP)相比,猪IVP的效率较低。卵母细胞成熟质量差、多精子受精率高和胚胎质量差是猪IVP所面临的主要问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：
(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，其中冷冻基础液中还包括咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为30-50μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.4-0.6％；；
(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM液获能液重悬，调整精液浓度4-9×106个/mL，放入培养箱中获能35-45min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.4-0.9份，氯化钾0.01-0.05份，二水氯化钙0.08-0.12份，葡萄糖0.1-0.2份，丙酮酸钠0.02-0.08份，咖啡因0.005-0.010份，L-半胱氨酸0.002-0.008份，Tris 0.1-0.3份，牛血清白蛋白0.05-0.20份溶于90-110份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液；
(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存；
(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成。
具体地，所述受精操作液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠6-7份，氯化钾0.1-0.3份，碳酸氢钠0.1-0.3份，磷酸二氢钠0.01-0.06份，乳酸钠1-2份，六水氯化镁0.1-0.2份，羟乙基哌秦乙硫磺酸1-4份，酚红0.005-0.015份，二水氯化钙0.1-0.3g，PVA 0.05-0.15份，山梨醇1-3份，丙酮酸钠0.01-0.03份，青霉素钠0.04-0.08份，硫酸链霉素0.04-0.06份溶于900-1100份三蒸水中，滤器过滤后，制得受精操作液。
具体地，上述步骤(3)中，将卵丘-卵母细胞复合体培养出卵母细胞的具体操作为：将卵丘-卵母细胞复合体，在平衡好的成熟液Ⅰ中洗两遍，最后放入矿物油覆盖的成熟液Ⅰ小滴中，每个小滴30枚卵母细胞，然后放入38.5℃、体积浓度为5％CO2的完全湿度培养箱中培养22h，后换入提前2h制作和平衡好的成熟液Ⅱ小滴中于培养箱中培养22h。
具体地，所述成熟液Ⅰ的成分如下：mTCM 3.82mL，卵泡液500μL，胎牛血清500μL，L-半胱氨酸5μL，孕马血清促性腺激素50μL，人绒毛膜促性腺激素25μL，双抗100μL；
所述成熟液Ⅱ成分如下：mTCM 3.895mL，卵泡液500μL，FBS 500μL，L-半胱氨酸5μL，双抗100μL；
所述mTCM是将葡萄糖0.05495g和聚乙烯醇0.10098g溶于100mL M199培养基中制成。
具体地，上述步骤(3)中，mTBM受精小滴采用以下方法制成：将mTBM获能液在培养皿中做成小滴，每滴上面覆盖100μL矿物油，于38.5℃、CO2体积分数为5％的完全湿度培养箱中平衡2h后，制得mTBM受精小滴。
具体地，上述步骤(4)中，胚胎培养液采用以下方法制成：将氯化钠0.6318g，氯化钾0.075g，硫酸镁0.0049g，磷酸二氢钾0.005g，亚牛磺酸0.055g，碳酸氢钠0.211g，L-谷氨酰胺0.015g，丙酮酸钠0.0023g，乳酸钙五水合物0.06166g，BSA 0.3g，BME培养基2mL，MEM培养基1mL，青霉素钠0.065g，硫酸链霉素0.05g依次加入至三蒸水中，混合搅拌均匀后，继续添加三蒸水定容至100mL，制得胚胎培养液。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
咖啡酸苯乙酯是蜂胶提取物的主要活性载体，是一种酚类物质，具有广泛的药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血等，在医药及动物生产中具有广泛的意义。现有技术中，咖啡酸苯乙酯常应用于以下方面：咖啡酸苯乙酯可以降低心肌肥厚，心肌纤维化并且增加心脏泵血功能，降低组织形态学肥大变化；咖啡酸苯乙酯治疗能显著抑制糖尿病大鼠牙周炎的氧化应激和RANKL诱导的破骨细胞生成及牙槽骨丢失；咖啡酸苯乙酯可能是维持氧化还原稳态的种子化合物之一；咖啡酸苯乙酯在体外，通过激活SIRT1/eNOS通路和抑制NF-κB的表达，抑制HR诱导的H9c2细胞凋亡和ROS生成。但是，至今未有研究者把它运用到冷冻猪精液中。
聚乙烯吡咯烷酮是一种由N-乙烯吡咯烷酮(N-vinylpyrrolidone，NVP)聚合而成的聚合性非渗透性冷冻保护剂，具有高分子表面活性、成膜性、抗冷冻性、低毒性、强稳定性等优良特性，目前广泛应用于食品、化妆品、医疗卫生等领域。聚乙烯吡咯烷酮具有成功保存多种生物细胞的能力。与渗透性冻保护剂组合添加到冷冻基础液中，聚乙烯吡咯烷酮可以促进细胞外无冰玻璃化。公鸡精液冷冻常利用聚乙烯吡咯烷酮与渗透性冷冻保护剂结合添加到冷冻基础液中，用二甲基亚砜和聚乙烯吡咯烷酮对鸡、雉和老鹰的精液进行冷冻，达到了较好的效果。利用质量浓度为6％的聚乙烯吡咯烷酮替代甘油能更好地维持印度红原鸡精液解冻后的品质，但聚乙烯吡咯烷酮对猪冷冻精液效果的影响尚未有人提及。
本发明通过在冷冻基础液Ⅰ联合添加相应浓度的咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，两者产生的协同作用，能有效的提高解冻后猪精子的活力、质膜完整率、顶体完整率、DNA完整率，进而提升了冷冻后猪精子的质量。
本发明提供的mTBM获能液，可进一步的提升解冻后精液的活性，进而有效的提升了猪精子体外受精效果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：
(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖200份、乳糖300份、碳酸氢钠10份、青霉素钠5份、硫酸链霉素8份、卵黄1800份、三蒸水7000份，其中冷冻基础液中还包括咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为30μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.4％；；
(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM液获能液重悬，调整精液浓度4×106个/mL，放入培养箱中获能35min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.4份，氯化钾0.01份，二水氯化钙0.08份，葡萄糖0.1份，丙酮酸钠0.02份，咖啡因0.005份，L-半胱氨酸0.002份，Tris0.1份，牛血清白蛋白0.05份溶于90份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液，所述受精操作液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠6份，氯化钾0.1份，碳酸氢钠0.1份，磷酸二氢钠0.01份，乳酸钠1份，六水氯化镁0.1份，羟乙基哌秦乙硫磺酸1份，酚红0.005份，二水氯化钙0.1g，PVA 0.05份，山梨醇1份，丙酮酸钠0.01份，青霉素钠0.04份，硫酸链霉素0.04份溶于900份三蒸水中，滤器过滤后，制得受精操作液；
(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存，上述步骤(3)中，将卵丘-卵母细胞复合体培养出卵母细胞的具体操作为：将卵丘-卵母细胞复合体，在平衡好的成熟液Ⅰ中洗两遍，最后放入矿物油覆盖的成熟液Ⅰ小滴中，每个小滴30枚卵母细胞，然后放入38.5℃、体积浓度为5％CO2的完全湿度培养箱中培养22h，后换入提前2h制作和平衡好的成熟液Ⅱ小滴中于培养箱中培养22h，所述成熟液Ⅰ的成分如下：mTCM 3.82mL，卵泡液500μL，胎牛血清500μL，L-半胱氨酸5μL，孕马血清促性腺激素50μL，人绒毛膜促性腺激素25μL，双抗100μL；所述成熟液Ⅱ成分如下：mTCM3.895mL，卵泡液500μL，FBS 500μL，L-半胱氨酸5μL，双抗100μL；所述mTCM是将葡萄糖0.05495g和聚乙烯醇0.10098g溶于100mL M199培养基中制成；
mTBM受精小滴采用以下方法制成：将mTBM获能液在培养皿中做成小滴，每滴上面覆盖100μL矿物油，于38.5℃、CO2体积分数为5％的完全湿度培养箱中平衡2h后，制得mTBM受精小滴。
(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成；
胚胎培养液采用以下方法制成：将氯化钠0.6318g，氯化钾0.075g，硫酸镁0.0049g，磷酸二氢钾0.005g，亚牛磺酸0.055g，碳酸氢钠0.211g，L-谷氨酰胺0.015g，丙酮酸钠0.0023g，乳酸钙五水合物0.06166g，BSA 0.3g，BME培养基2mL，MEM培养基1mL，青霉素钠0.065g，硫酸链霉素0.05g依次加入至三蒸水中，混合搅拌均匀后，继续添加三蒸水定容至100mL，制得胚胎培养液。
实施例2
一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：
(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖250份、乳糖350份、碳酸氢钠13份、青霉素钠6份、硫酸链霉素10份、卵黄2000份、三蒸水8000份，其中冷冻基础液中还包括咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为40μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.5％；；
(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM液获能液重悬，调整精液浓度7×106个/mL，放入培养箱中获能40min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.6份，氯化钾0.03份，二水氯化钙0.10份，葡萄糖0.1份，丙酮酸钠0.06份，咖啡因0.007份，L-半胱氨酸0.004份，Tris0.2份，牛血清白蛋白0.15份溶于100份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液，所述受精操作液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠6份，氯化钾0.2份，碳酸氢钠0.2份，磷酸二氢钠0.03份，乳酸钠1.5份，六水氯化镁0.15份，羟乙基哌秦乙硫磺酸3份，酚红0.010份，二水氯化钙0.2g，PVA 0.10份，山梨醇2份，丙酮酸钠0.02份，青霉素钠0.06份，硫酸链霉素0.05份溶于1000份三蒸水中，滤器过滤后，制得受精操作液；
(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存，上述步骤(3)中，将卵丘-卵母细胞复合体培养出卵母细胞的具体操作为：将卵丘-卵母细胞复合体，在平衡好的成熟液Ⅰ中洗两遍，最后放入矿物油覆盖的成熟液Ⅰ小滴中，每个小滴30枚卵母细胞，然后放入38.5℃、体积浓度为5％CO2的完全湿度培养箱中培养22h，后换入提前2h制作和平衡好的成熟液Ⅱ小滴中于培养箱中培养22h，所述成熟液Ⅰ的成分如下：mTCM 3.82mL，卵泡液500μL，胎牛血清500μL，L-半胱氨酸5μL，孕马血清促性腺激素50μL，人绒毛膜促性腺激素25μL，双抗100μL；所述成熟液Ⅱ成分如下：mTCM3.895mL，卵泡液500μL，FBS 500μL，L-半胱氨酸5μL，双抗100μL；所述mTCM是将葡萄糖0.05495g和聚乙烯醇0.10098g溶于100mL M199培养基中制成；
mTBM受精小滴采用以下方法制成：将mTBM获能液在培养皿中做成小滴，每滴上面覆盖100μL矿物油，于38.5℃、CO2体积分数为5％的完全湿度培养箱中平衡2h后，制得mTBM受精小滴。
(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成；
胚胎培养液采用以下方法制成：将氯化钠0.6318g，氯化钾0.075g，硫酸镁0.0049g，磷酸二氢钾0.005g，亚牛磺酸0.055g，碳酸氢钠0.211g，L-谷氨酰胺0.015g，丙酮酸钠0.0023g，乳酸钙五水合物0.06166g，BSA 0.3g，BME培养基2mL，MEM培养基1mL，青霉素钠0.065g，硫酸链霉素0.05g依次加入至三蒸水中，混合搅拌均匀后，继续添加三蒸水定容至100mL，制得胚胎培养液。
实施例3
一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：
(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖300份、乳糖400份、碳酸氢钠15份、青霉素钠7份、硫酸链霉素12份、卵黄2200份、三蒸水9000份，其中冷冻基础液中还包括咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为50μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.6％；；
(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM液获能液重悬，调整精液浓度9×106个/mL，放入培养箱中获能45min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.9份，氯化钾0.05份，二水氯化钙0.12份，葡萄糖0.2份，丙酮酸钠0.08份，咖啡因0.010份，L-半胱氨酸0.008份，Tris0.3份，牛血清白蛋白0.20份溶于110份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液，所述受精操作液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠7份，氯化钾0.3份，碳酸氢钠0.3份，磷酸二氢钠0.06份，乳酸钠2份，六水氯化镁0.2份，羟乙基哌秦乙硫磺酸4份，酚红0.015份，二水氯化钙0.3g，PVA 0.15份，山梨醇3份，丙酮酸钠0.03份，青霉素钠0.08份，硫酸链霉素0.06份溶于1100份三蒸水中，滤器过滤后，制得受精操作液；
(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存，上述步骤(3)中，将卵丘-卵母细胞复合体培养出卵母细胞的具体操作为：将卵丘-卵母细胞复合体，在平衡好的成熟液Ⅰ中洗两遍，最后放入矿物油覆盖的成熟液Ⅰ小滴中，每个小滴30枚卵母细胞，然后放入38.5℃、体积浓度为5％CO2的完全湿度培养箱中培养22h，后换入提前2h制作和平衡好的成熟液Ⅱ小滴中于培养箱中培养22h，所述成熟液Ⅰ的成分如下：mTCM 3.82mL，卵泡液500μL，胎牛血清500μL，L-半胱氨酸5μL，孕马血清促性腺激素50μL，人绒毛膜促性腺激素25μL，双抗100μL；所述成熟液Ⅱ成分如下：mTCM3.895mL，卵泡液500μL，FBS 500μL，L-半胱氨酸5μL，双抗100μL；所述mTCM是将葡萄糖0.05495g和聚乙烯醇0.10098g溶于100mL M199培养基中制成；
mTBM受精小滴采用以下方法制成：将mTBM获能液在培养皿中做成小滴，每滴上面覆盖100μL矿物油，于38.5℃、CO2体积分数为5％的完全湿度培养箱中平衡2h后，制得mTBM受精小滴。
(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成；
胚胎培养液采用以下方法制成：将氯化钠0.6318g，氯化钾0.075g，硫酸镁0.0049g，磷酸二氢钾0.005g，亚牛磺酸0.055g，碳酸氢钠0.211g，L-谷氨酰胺0.015g，丙酮酸钠0.0023g，乳酸钙五水合物0.06166g，BSA 0.3g，BME培养基2mL，MEM培养基1mL，青霉素钠0.065g，硫酸链霉素0.05g依次加入至三蒸水中，混合搅拌均匀后，继续添加三蒸水定容至100mL，制得胚胎培养液。
对比例1
冷冻基础液Ⅰ中不添加咖啡酸苯乙酯，其余操作步骤与实施例1完全相同。
对比例2
冷冻基础液Ⅰ中不添加聚乙烯吡咯烷酮，其余操作步骤与实施例1完全相同。
分别用各实施例和对比例的方法对同一只松辽黑猪的精液进行冷冻后解冻处理，然后进行体外培养，记录二细胞率、四细胞率、八细胞率和囊胚率，其中：
试验结果如表1所示：
项目 二细胞率，％ 四细胞率，％ 八细胞率，％ 囊胚率，％
实施例1 60 46 30 20
对比例1 54 39 25 13
对比例2 51 31 23 11
实施例2 62 48 31 21
实施例3 63 49 33 21
由表1可知，本发明提供的一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，将咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮联合使用后，可有效的提升解冻后猪精子的品质，进而有效的提升了猪精子体外受精的效果。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，其中冷冻基础液中还包括咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为30-50μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.4-0.6％；；
(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM液获能液重悬，调整精液浓度4-9×106个/mL，放入培养箱中获能35-45min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.4-0.9份，氯化钾0.01-0.05份，二水氯化钙0.08-0.12份，葡萄糖0.1-0.2份，丙酮酸钠0.02-0.08份，咖啡因0.005-0.010份，L-半胱氨酸0.002-0.008份，Tris 0.1-0.3份，牛血清白蛋白0.05-0.20份溶于90-110份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液；
(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存；
(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成。
2.根据权利要求1所述的一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，所述受精操作液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠6-7份，氯化钾0.1-0.3份，碳酸氢钠0.1-0.3份，磷酸二氢钠0.01-0.06份，乳酸钠1-2份，六水氯化镁0.1-0.2份，羟乙基哌秦乙硫磺酸1-4份，酚红0.005-0.015份，二水氯化钙0.1-0.3g，PVA 0.05-0.15份，山梨醇1-3份，丙酮酸钠0.01-0.03份，青霉素钠0.04-0.08份，硫酸链霉素0.04-0.06份溶于900-1100份三蒸水中，滤器过滤后，制得受精操作液。
3.根据权利要求1所述的一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，将卵丘-卵母细胞复合体培养出卵母细胞的具体操作为：将卵丘-卵母细胞复合体，在平衡好的成熟液Ⅰ中洗两遍，最后放入矿物油覆盖的成熟液Ⅰ小滴中，每个小滴30枚卵母细胞，然后放入38.5℃、体积浓度为5％CO2的完全湿度培养箱中培养22h，后换入提前2h制作和平衡好的成熟液Ⅱ小滴中于培养箱中培养22h。
4.根据权利要求3所述的一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，所述成熟液Ⅰ的成分如下：mTCM 3.82mL，卵泡液500μL，胎牛血清500μL，L-半胱氨酸5μL，孕马血清促性腺激素50μL，人绒毛膜促性腺激素25μL，双抗100μL；
所述成熟液Ⅱ成分如下：mTCM 3.895mL，卵泡液500μL，FBS 500μL，L-半胱氨酸5μL，双抗100μL；
所述mTCM是将葡萄糖0.05495g和聚乙烯醇0.10098g溶于100mL M199培养基中制成。
5.根据权利要求1所述的一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，mTBM受精小滴采用以下方法制成：将mTBM获能液在培养皿中做成小滴，每滴上面覆盖100μL矿物油，于38.5℃、CO2体积分数为5％的完全湿度培养箱中平衡2h后，制得mTBM受精小滴。
6.根据权利要求1所述的一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，胚胎培养液采用以下方法制成：将氯化钠0.6318g，氯化钾0.075g，硫酸镁0.0049g，磷酸二氢钾0.005g，亚牛磺酸0.055g，碳酸氢钠0.211g，L-谷氨酰胺0.015g，丙酮酸钠0.0023g，乳酸钙五水合物0.06166g，BSA 0.3g，BME培养基2mL，MEM培养基1mL，青霉素钠0.065g，硫酸链霉素0.05g依次加入至三蒸水中，混合搅拌均匀后，继续添加三蒸水定容至100mL，制得胚胎培养液。
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