JP4202121B2 - 哺乳動物の配偶子および胚の培養基サプリメント、およびその使用法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、細胞の増殖に有用な環境を提供する培養基に関する。より詳細には本発明は、培養基に加えると従来の培養基の問題を回避する、通常ではない源から生成された成分を含む限定培養基サプリメントに関する。
【0002】
発明の背景
長年、哺乳動物の胚細胞を培養するための培地サプリメントは、動物の体液、特に血清から誘導されている。血清系培地サプリメントは、あるタイプの細胞および組織を培養するためにある程度効果を示してきたが、これらの培地サプリメントは、望ましくないものであることが判明した。これらの血清系培地サプリメントが、細胞を培養するための魅力的ではない候補である主な理由の1つは、生成する培地が、培地を誘導する体液中に見出される不純物、毒素および感染因子によって汚染される可能性があるためである。さらに、血液を収集する動物は異なっており、異なる環境で生きているので、これらの動物が生成する体液は、異なる濃度の異なる成分を有する。認識されてきた血清系培地の1つの重要な面は、培地中に高分子が必要であることである。血清系産物を模倣するために、研究者達はポリビニルアルコールなどの合成高分子を加えて、血清中のアルブミンなどの高分子の代用とすることを試みている。しかしながら、血清の大部分は化学的に不明確なので、培養基から血清を取り除き、相対的に大きい分子のみを取り替えることによって、必須成分を欠いているために理想的とはいえないか、あるいは多くの目的に無効な培養基が生成した。
【0003】
したがって、血液産物に基づく培養基サプリメントと同等の効果がありながら、同時に可能性のある汚染源を取り除いた培養基サプリメントが必要とされている。さらに、標準化された培養基も必要とされている。
【0004】
発明の概要
本発明は、哺乳動物の胚細胞および配偶子用の培養基用の、新規な、生理学に基づく完全に限定されたサプリメントを記載する。この培地サプリメントは、インビトロの受精培地、胚移植培地、および哺乳動物の着床前の胚の受精卵を低温保存する培地、および胚幹細胞を成長させるための培地へのサプリメント、または当分野でよく知られている任意の他の同様の培地と共に使用することができる。このサプリメントは、組み換えヒトアルブミン(rHA)、発酵生産したヒアルロナン(HYN)および/またはクエン酸(塩)、およびこれらの組合せを含む。このサプリメントを培養基に加えることによって、血液から精製した血清アルブミンを補った培地と比べて、同等の成長をもたらす。
【0005】
発明の詳細な説明
このサプリメントは、それが使用される培地に適切な任意の濃度で組み換えヒトアルブミン(rHA)を含んでよい。本明細書にさらに記載するように、本来存在するヒト血清アルブミン(HSA)ではなくrHAを使用することには数多くの利点がある。
【0006】
典型的には、サプリメントがrHAを含むとき、サプリメントは、サプリメントが加えられる培地の合計体積をベースとして、約0.1mg/mlと約20.0mg/mlの間のrHAを含む。一実施形態では、培地の合計体積をベースとして、約0.5mg/mlから約5.0mg/mlのrHAを加える。
【0007】
サプリメントに発酵生産したヒアルロナン(HYN)を加えることによって、サプリメントの効率を高めることができる。発酵生産したHYNを培地サプリメントに加えることによって、好ましい結果が示される。
【0008】
本明細書で使用する「配偶子または胚細胞の生存能力を高める」というフレーズは、本発明のサプリメントを含む培地中で胚を培養すると、サプリメントを含まない同じ培地で培養するのと比べて、培養中に胚の胚盤胞段階への成長が進むこと、透明帯から孵化する能力がインビトロで高まること、および/または胚の培養中に胚の全体的な生存能力が高まること、を含むものとして定義する。
【0009】
さらに、適切な培地に発酵生産したHYNを加えることは、胚盤胞が凍結に対し生き延びるための能力に著しく影響を及ぼす。発酵生産したHYNを使用することは、オンドリのとさかまたはへその緒などの、天然に存在する定温脊椎動物の源から精製したHYNを使用することに優るいくつかの利点がある。定温脊椎動物の源からのHYNではなく発酵生産したHYNを使用することによって、異なる源およびバッチからのHYNの、安全性および安定性を調節する能力が大幅に高まる。
【0010】
発酵生産したHYNが存在する場合、発酵生産したHYNの量は一般に、培地の合計体積をベースとして、約0.1mg/mlと約5.0mg/mlの間の濃度である。一実施形態では、培地の合計体積をベースとして、約0.125mg/mlから約1.0mg/mlの濃度で、発酵生産したHYNを培地に加える。
【0011】
クエン酸(塩)を加えることによって、サプリメントをさらに補うことができる。一実施形態では、クエン酸(塩)およびrHAの両方を培地サプリメントに加える。なぜなら、rHAを含む培地サプリメントにクエン酸(塩)を加えることによって、rHAにHSAまたはウシ血清アルブミン(BSA)の性質をきっちりと再現させることが可能であることが、驚くべきことに、予期せぬことに分かっているからである。クエン酸(塩)を加えることは、培養した細胞物質の成長に対して他の促進的な影響がある。クエン酸コリン、クエン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、およびこれらの組合せだけには限られないが、これらを含めて当分野でよく知られている、培地用に使用する任意のクエン酸(塩)を使用することができる。一実施形態では、クエン酸ナトリウムを使用する。一般には、培地の合計体積をベースとして、約0.1mMと約5.0mMの間の濃度でクエン酸(塩)を加える。一実施形態では、培地の合計体積をベースとして、約0.1mMと約1.0mMの間の濃度でクエン酸(塩)を加える。
【0012】
本発明の培地サプリメントは、任意の有用な組合せでrHA、発酵生産したHYNおよび/またはクエン酸(塩)を含む。一実施形態では、培地サプリメント、および培地サプリメントを加える培地には、非組み換え高分子または動物源から精製した高分子が入り込んでいない。他の実施形態では、培地サプリメント、および培地サプリメントを加える培地には、非組み換えHSAおよび/または発酵生産されていないHYNが存在しない。
【0013】
本発明は、前に記載した培地サプリメント、培地サプリメントを含む培地、培地サプリメントを作成する方法、培地サプリメントを含むキット、および本明細書に記載する培地サプリメントを使用して胚の物質を成長させる方法を対象とする。
【0014】
本発明は、細胞物質を培養の開始時に培地中に含むことができるか、あるいはこれらを供給バッチ法または連続的な方法で加えることができるように、本明細書に記載する培地サプリメントを使用して、細胞物質、一実施形態では胚を成長させる方法を含む。さらに、培地サプリメントの成分は、培地生成の異なる段階で一緒に、あるいは別々に加えることができる。
【0015】
このサプリメントは、任意の哺乳動物種からの胚の、胚培養基、胚移植培地、および胚を低温保存した培地(凍結および冷凍保存手順の両方を含ませるための)、および幹細胞培地だけには限られないがこれらを含めた、当分野でよく知られている任意の適切な哺乳動物細胞の物質の培養基に加えることができる。たとえば、重炭酸緩衝培地、Hepes緩衝またはMOPS緩衝培地、またはリン酸緩衝食塩水を含めた、胚または細胞の成長を促進することができる任意の培地を使用することができるであろう。培地の例は、G1.2/G2.2、KSOM/KSOMaa、M16、SOF/SOFaa、MTF、P1、Earleの培地、Hams F−10、M2、Hepes−G1.2、PBSおよび/またはWhittenの培地である(Gardner and Lane、1999;Embryo Culture Systems;Handbook of In Vitro Fertilization、CRC Press、Editor:Trounson AO and Gardner DK、2nd edition、Boca Raton、pp205−264)。
【0016】
rHAの生成は、当分野でよく知られている。一実施形態では、ヒトアルブミンタンパク質を生成する遺伝的に改変された酵母菌からrHAを得る。酵母菌からrHAを生成するための1つのこのような方法は、米国特許第5,612,197号中で教示されている。
【0017】
発酵生産したヒアルロナン(HYN)は、当分野でよく知られている任意の方法によって得られる。1つのこのような方法は、Streptococcus equiの連続的な細菌発酵である。ヒアルロナンは、N−アセチルグルコースアミンとD−グルクロン酸の繰り返し二糖単位の、天然に存在するポリマーである。これは身体中に広く分布している。典型的には、発酵生産したHYNの分子量は2.3×106kDである。StreptococcusからのHYNの生成は当分野でよく知られており、Cifonelli JA、Dorfman A.The biosynthesis of hyaluronic acid by group A Streptococcus:The uridine nucleotide of groups A Streptococcus.J.Biological Chemistry 1957;228:547−557;Kjems E、Lebech K.Isolation of hyaluronic acid from cultures of streptococci in a chemically defined medium.Acta Path.Microbiol.Scand.1976(Sect.B);84:162−164;およびMarkovitz A他、The biosynthesis of hyaluronic acid by group A Streptococcus.J.Biological Chemistry 1959;234(9):2343−2350で開示されている方法を含めた、任意のよく知られている方法を使用することができる。
【0018】
他の化合物を、本発明の培地サプリメントに加えることができる。これらは成長因子を含む。なぜなら、哺乳動物の胚および細胞は典型的には成長因子に関する多くの受容体を有しており、このような成長因子を加えることによって、培養物質の成長率を高めることができるからである。このような成長因子には、典型的には0.1から100ng/mlの量のインシュリン、典型的には0.1から100ng/mlの量のIGF II、典型的には0.1から100ng/mlの量のEGF、典型的には5から1000U/mlの量のLIF、典型的には0.1から500μMの量のPAF、およびこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。量はすべて、培地サプリメントを加える培地の合計体積をベースとする。
【0019】
培地サプリメントは2通りの方法で調製することができる。培地調製の後に培地に加えられる別の培地サプリメントとして調製することができるか、あるいは培地サプリメントの成分を、培地調製中に培養基に直接加えることができる。
【0020】
一例として、以下のように独自に培地サプリメントを調製することができる。培地サプリメントrHAを、水、食塩水または培地を加えることによってストック溶液にして、50mg/mlと約500mg/mlの間、通常は250mg/mlの濃縮ストック溶液を作成することができる。あるいは、250mg/mlのストック溶液として、溶液を得ることができる。発酵生産したHYNを水、食塩水または培地中で再構成して、10mg/mlと500mg/mlの間の、通常は500mg/mlの濃縮ストック溶液を作成する。これは水、食塩水または培地をフラスコに加え、所望量のHYNを溶液に加えることにより行う。次いでHYNを、激しい振とう、または攪拌バーを使用する混合によって溶かす。500mg/mlの溶液については、溶液1mlに500mgのHYNを加えることができる。水、食塩水または培地のいずれかを加えて、5mMと500mMの間の、通常は500mMの濃縮ストック溶液を作成することによって、ストック溶液としてクエン酸(塩)を調製する。500mMのストック溶液については、溶液10mlに0.9605gのクエン酸を加える。rHA、発酵生産したHYNおよびクエン酸(塩)のストックを一緒に加えて、1つのサプリメント溶液を作成し、これを最終培地に100倍の濃縮ストックとして加える。10mlの培地については、サプリメント100μlを加える。
【0021】
rHAは粉末として、あるいはストック溶液として、培養基に直接加えることができる。一例として、以下の実施形態を示す。ストック溶液は、250mg/mlストックの100μlとして、9.9mlの培地に加えることができる。発酵生産したHYNは粉末として、あるいはストック溶液として、培養基に直接加えることができる。粉末として、1.25mgのHYNを10mlの培地に加えることができる。あるいは125μlの1%ストック溶液を、9.9mlの培地に加えることができる。クエン酸(塩)は粉末として、あるいはストック溶液として、培養基に直接加えることができる。粉末として、9.6mgを100mlの培地に加えることができ、あるいは50mMストックの100μlを9.9mlの培地に加えることができる。
【0022】
本明細書で引用する特許および刊行物はすべて、参照によってここに組み込む。
【0023】
本明細書で引用する範囲はすべて、その範囲限界内に含まれるすべての組合せ、およびより下位組合せを含む。したがって、「約0.1mg/mlから約20.0mg/ml」という範囲は、約0.125mg/mlから約11.5mg/ml、約1.0mg/mlから約15.0mg/mlなどの範囲を含むであろう。
【0024】
本発明の培地サプリメントによって、哺乳動物の細胞、組織、胚および他の関連する細胞物質の培養の分野に存在するいくつかの問題が解決される。現在の培地に関する1つの問題は、培養した哺乳動物細胞の物質、特に胚が、ヒトアルブミンなどの高分子血液産物中に見られる、プリオンおよび/または内毒素などの汚染物質によって汚染される可能性があることである。本発明のサプリメントの1つの利点は、胚および他の哺乳動物細胞の物質を培養するために、培地中で血液産物を使用することに関する潜在的な汚染が、それによって取り除かれることである。
【0025】
現在の培地に関する他の問題は、血清アルブミンなどの血液産物または他の天然に存在する物質を使用すると、このような培地を標準化することが困難であることである。さらに、天然に存在する変化および培地の血液産物中の汚染物質が取り除かれると、本発明によって最終培養物を精製することが容易になる。
【0026】
本発明によって、他の分子によって汚染されることが多く、異なる調製物間および同じ調製物中のバッチ間で著しく異なる、生物学的タンパク質を使用するときに伴われる固有の変化が除外される。したがって、rHAなどの組み換え分子を使用することによって、標準化された方式で調製される生理学的培地を調合することができる。これらの調製物には内毒素、プリオンが入り込んでおらず、現在使用されている培地よりも生理学的により適合性がある。現在の培地は、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンなどの他の合成高分子を含み、これらの高分子は成長因子を結合するなどの必須の生理学的機能を果たすことができず、したがって、これらの培地を使用することによって、哺乳動物の細胞物質の成長が低下する結果となる。
【0027】
本発明は、以下の実施例からより良く理解される。しかしながら当業者は、論じられる具体的な組成物、方法および結果は本発明を単に例示するものであり、本発明に関する制限を意味するものではないことを容易に理解するはずである。
【0028】
実施例
実施例1
以下の表1に示す濃縮ストック溶液から、培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとして、培地9.8mlにrHAを加えた。最初の実験では、異系交配させたマウスの胚を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミンをrHAで置き換えることを調べた。rHAの3つの異なる濃度の1つで、受精卵を4日間培養した。10胚分の胚インキュベーション体積、20μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、37℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で48時間培養し、次に培地G2.2中で48時間培養した。陰性対照の処理はタンパク質なし、陽性対照の処理は5mg/mlのHSA(血液産物)であった。その結果を以下で表2に示す。
【0029】
【表1】
【0030】
ストックAおよびB
1.個々の成分の重量を量り、100mlのフラスコに入れる。
2.50mlのH2Oを加える(Extreme H2OまたはBiowittaker)。
3.成分すべてが溶けるまで充分混合する。
4.50mlのH2Oをさらに加える。
5.充分混合する。
6.0.2μmフィルタを介して濾過する。
7.4℃で保存する。
【0031】
ストックCからT
1.成分の重量を量り、10mlのチューブに入れる。
2.10mlのH2Oを加える(Extreme H2OまたはBiowittaker)。
3.溶けるまで充分混合する。
4.0.2μmフィルタを介して濾過する。
5.4℃で保存する。
【0032】
胚の培養基の調製−パート1
ストックEDTA
1.EDTA0.029gを量り、10mlのチューブに入れる。
2.NaOH0.4gを量り、別の10mlのチューブに入れる。
3.10mlのH2O(Extreme H2OまたはBiowittaker)をNaOHに加え、溶けるまで混合する。
4.220μlのNaOH溶液をEDTAに加える。
5.溶けるまで混合する。
6.9.8mlのH2OをEDTAに加える。
7.90mlのH2Oを100mlのフラスコに入れる。
8.10mlのEDTA溶液を90mlのH2Oに加える。
9.0.2μmフィルタを介して濾過する。
10.4℃で保存する。
【0033】
【表2】
【0034】
少なくとも1.25から2.5mg/mlの濃度で、培養中に胚を発生させるために、HSAをrHAで置き換えることができた。
【0035】
実施例2
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。100倍ストック溶液100μlから10mlの培地に、発酵生産したHYNを加えた。
【0036】
最初の実験では、異系交配させたマウスの胚を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミンをHYNで置き換えることを調べた。HYNの4つの異なる濃度の1つで、受精卵を4日間培養した。10胚分の胚インキュベーション体積、20μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、37℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で48時間培養し、次に培地G2.2中で48時間培養した。陰性対照処理はタンパク質なしであった。その結果を以下で表3に示す。
【0037】
【表3】
【0038】
少なくとも0.125から0.5mg/mlの濃度で、発酵生産したHYNがマウス胚の発生を刺激した。
【0039】
実施例3
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとして9.8mlの培地にrHAを加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加えた。その後の実験では、異系交配させたマウスの胚を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミンをrHAおよび発酵生産したHYNで置き換えることを調べた。受精卵は4日間培養した。10胚分の胚インキュベーション体積、20μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、37℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で48時間培養し、次に培地G2.2中で48時間培養した。その結果を以下で表4に示す。
【0040】
【表4】
【0041】
rHAおよび発酵生産したHYNを有する培地は共に、内部細胞の細胞塊(ICM)の成長を著しく高める。ICMの成長は、生命力のある胎児へと発生する能力と直線的に関係するので、ICMの%の増大は生存能力の向上を意味している可能性がある。
【0042】
実施例4
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとしてrHAを培地9.8mlに加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加えた。その後の実験では、異系交配させたマウスの胚をレシピエントマウスに移した後に発生させるために、血液から精製したアルブミンをrHAおよび発酵生産したHYNで置き換えることを調べた。受精卵は4日間培養し、次いで胚盤胞段階でレシピエントの雌マウスに移した。10胚分の胚インキュベーション体積、20μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、37℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で48時間培養し、次に培地G2.2中で48時間培養した。その結果を以下で表5に示す。
【0043】
【表5】
【0044】
rHAおよび発酵生産したHYNを有する培地によって、HSA(血液産物)を補った培地中で培養した胚と同等な胎児の成長が結果としてもたらされた。
【0045】
実施例5
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとしてrHAを9.8mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlからクエン酸(塩)を10mlの培地に加えた。rHA、発酵生産したHYNおよびクエン酸(塩)をさらに補足することによって、培養中にマウス胚の成長が高まるかどうか決定するために、実験を行った。受精卵からの胚を、クエン酸(塩)の存在下または不在下でrHAおよびHYNと共に48時間培養した。10胚分の胚インキュベーション体積、20μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、37℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で48時間培養した。その結果を以下で表6に示す。
【0046】
【表6】
【0047】
rHAおよび発酵生産したHYNを含む培地にクエン酸(塩)を加えることによって、胚の発生が有意に高まる結果となった。
【0048】
実施例6
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとしてrHAを9.8mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlからクエン酸(塩)を10mlの培地に加えた。rHA、発酵生産したHYNおよびクエン酸(塩)をさらに補足することによって、培養中にマウス胚の成長が高まるかどうか決定するために、実験を行った。受精卵からの胚を、クエン酸(塩)の存在下または不在下でrHAおよびHYNと共に48時間培養した。次いで胚を、クエン酸(塩)を含むかあるいは含まない培養基にさらに48時間移した。10胚分の胚インキュベーション体積、20μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、37℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で48時間培養し、次に培地G2.2中で48時間培養した。その結果を以下で表7に示す。
【0049】
【表7】
【0050】
表7の結果によって見ることができるように、クエン酸(塩)を加えることによって、胚の成長が著しく高まった。
【0051】
実施例7
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとしてrHAを9.8mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlからクエン酸(塩)を10mlの培地に加えた。
【0052】
ウシにおける最初の実験では、受精卵を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミン(ウシ血清アルブミン、BSA)をrHAまたは発酵生産したHYNのいずれか、あるいはrHAおよび発酵生産したHYNで置き換えることを調べた。受精卵は、6から7日間培養した。500μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、38.5℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で72時間培養し、次に培地G2.2中で72時間培養した。その結果を以下で表8に示す。
【0053】
【表8】
【0054】
rHAと発酵生産したHYNを組み合わせることによって、BSAの存在下で得られるのと同等な胚の発生が、ウシの胚の培養中に起こった。
【0055】
実施例8
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとしてrHAを9.8mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlからクエン酸(塩)を10mlの培地に加えた。
【0056】
ウシにおけるその後の実験では、受精卵を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミン(ウシ血清アルブミン、BSA)を、クエン酸(塩)を有するrHAまたはクエン酸(塩)を有さないrHAで置き換えることを調べた。受精卵は、6から7日間培養した。500μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、38.5℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で72時間培養し、次に培地G2.2中で72時間培養した。その結果を以下で表9に示す。
【0057】
【表9】
【0058】
rHAをクエン酸(塩)で補うことによって、BSAの存在下で培養した胚と比較して、同等なウシの胚の発生が培養中にもたらされた。
【0059】
実施例9
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。250mg/mlのストック溶液200μlとしてrHAを9.8mlの培地に加え、100倍ストック溶液100μlから発酵生産したHYNを10mlの培地に加え、100倍ストック溶液から10mlの培地にクエン酸(塩)を加えた。
【0060】
ウシにおけるその後の実験では、受精卵を培養中に発生させるために、発酵生産したHYNをクエン酸(塩)含有rHAに加えること、およびその後の受精卵を凍結させる能力を調べた。受精卵は、6から7日間培養した。500μlの培地において6%CO2:5%O2:89%N2で、38.5℃で胚を培養した。胚は培地G1.2中で72時間培養し、次に培地G2.2中で72時間培養した。胚盤胞を細胞数に対して染色し、あるいは凍結させ、その後解凍して生存を評価した。その結果を以下で表10に示す。
【0061】
【表10】
【0062】
培地にrHA、クエン酸(塩)および発酵生産したHYNを補うことによって、胚盤胞が凍結および解凍に対して生き延びる能力が大幅に高まった。
【0063】
実施例10
実施例1で教示したように、濃縮ストック溶液から培地G1.2/G2.2を調製した。
【0064】
この実験では、rHAおよびHYNの存在下で培養中のCF1マウス胚を成長させることの、胚が凍結および解凍に対して生き延びる能力に対する効果を調べた。CF1マウス胚を胚盤胞段階まで培養して、成長および凍結手順に対して生き延びる能力を評価した。
【0065】
【表11】
【0066】
これらの結果から、rHA、またはrHAとHYNを有する培地は、HSAと共に生育した胚盤胞と比較して、解凍後の胚盤胞の孵化率を有意に高めることを明らかに認識することができる(P<0.05)。
【0067】
低温保存後の培養中に、胚盤胞が増殖する能力も評価した。ICMおよびTE両方の増殖は、0と3の間のスコアであり、0は増殖しなかったことを表し、3は著しく増殖したことを表す。増殖は、生存能力と関係があることは示されている(LaneおよびGardner、1997)。
【0068】
【表12】
【0069】
表12から見ることができるように、rHAまたはHYNを含む培地中で胚を培養することによって、ヒト血清アルブミン中で培養した胚と比較して、ICMの成長が高まった。
【0070】
実施例11
この実施例は、rHA、HYNおよびクエン酸(塩)を含む培地によって、低温保存した過剰な胚盤胞を首尾よく広げることができることを例示する。
【0071】
この実施例では、米国特許出願第09/201,594号に教示されるように以下の点を変えて、提供された低温保存型ヒト前核胚を解凍し、培地G1.3中で48時間培養し、次に培地G2.3中で培養した。G1.2−G1.3培地は1.0から1.8のMgSO4濃度、および1.8から1.0のCaCl2濃度を有する。G2.2−G2.3培地に関する変更は、G1培地の変更と同じであり、半分の濃度で加えられる必須アミノ酸が追加されるが、ニコチンアミド、イノシトール、および葉酸は存在しない。
【0072】
両方の培地を2.5mg/mlのrHA、および0.125mg/mlのHYNで補った。胚用の凍結溶液は4.5%グリセロールおよび0.1Mスクロース(10分)、次に9%グリセロールおよび0.2Mスクロース(7分)であった。胚は−6℃の凍結機中に置き、植付け、10分間保持し、その後1分間当たり0.5℃で−32℃まで冷却した。次いで、胚を液体窒素中に押し込んだ。解凍直後に、500nlの新鮮なG2.3中で4時間、胚を個別にインキュベートし、その後、胚を10マイクロリットルのG2.3中に、一晩培養するために個別に置いた。インキュベーションはすべて、5%O2:6%CO2:89%N2で行った。培地の500nlサンプルを凍結させ、超ミクロ蛍光発光を使用して分析した。解凍した胚の、グルコースおよびピルビン酸(塩)の取り込みも測定した。
【0073】
【表13】
【0074】
実施例12
この実施例では、Gardner他、1988およびSchoolcraft1999によって概略が述べられた、IVFプロトコルを使用した。
【0075】
この実施例では、ヒトの胚の成長に関する、rHA、HYNおよびクエン酸(塩)を含む培地の利点を示す。
【0076】
【表14】
Claims (3)
- 哺乳動物の胚細胞および配偶子の培養培地のための組換えヒトアルブミンおよびクエン酸塩を含むサプリメントであって、該サプリメントを含む培養培地で培養した配偶子または胚細胞の生存能力を高め、さらに該サプリメントおよび培養培地が非組換えヒトアルブミンを含まないサプリメント。
- 請求項1に記載のサプリメントであって、該サプリメントを含む培養培地中に約0.1 mM から約1.0 mMの範囲のクエン酸塩が存在する場合に、該培養培地で培養した配偶子または胚細胞の生存能力を高めるサプリメント。
- 請求項1または2に記載のサプリメントおよび胚培養培地、胚移植培地、胚低温保存培地、幹細胞培養培地もしくはインビトロ醗酵培地を含み、非組換えヒトアルブミンを含まない哺乳動物の胚細胞および配偶子の培養のための調製物。
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