KR101010077B1 - 미분화 인간배아줄기세포 유래 배양 조성물을 이용한 소 난자의 체외 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 증식 단계의 인간 배아줄기세포 콜로니를 제1 배양액으로 배양하는 줄기세포 배양 단계, 상기 줄기세포 배양 단계로부터 생성된 용액 상의 미분화 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물을 회수하는 단계, 상기 회수된 배양 조성물을 소 난자의 체외 배양 시 체외 배양액으로 사용되는 제2 배양액에 첨가하여 상기 소 난자를 체외 배양하는 단계를 포함하는 소 난자의 체외 배양 방법을 제공한다.

Description

미분화 인간배아줄기세포 유래 배양 조성물을 이용한 소 난자의 체외 배양 방법{Method of external cultivation for cow's egg cell by using cultivation composition derived from undifferentiated human stem cell}

본 발명은 소 난자의 체외 배양 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소 난자의 체외 배양 환경을 개선하고 배양 효율을 증가시킬 수 있는 소 난자의 체외 배양 방법에 관한 것이다.

배아줄기세포는 남성의 생식세포인 정자와 여성의 생식세포인 난자가 결합하여 생성된 수정란에서 유래한다. 그리고 배아줄기세포는 착상 전 배반포기배의 내부 세포괴로부터 획득되며 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 배양조건만 주어진다면 분화되지 않은 상태로 무한대로 증식이 가능한 아직 분화되지 않은 세포를 말한다. 다시 말해서 특수 분화 배양 환경에서는 원하는 방향으로 세포 분화가 유도되어 신경, 당뇨, 혈액과 같은 질환의 세포 치료제로 이용될 수 있어서 한 개의 배아줄기세포주만으로도 수많은 환자의 치료에 이용될 수 있다고 기대되는 만능세포이다.

수정란의 체외 배양은 체내 배양에 비해서 배양효율이 떨어진다. 체외 배양 환 경을 개선 시키기 위해서 배양용 배지의 조성과 알부민 또는 우태아혈청 같은 단백질 첨가제 그리고 항산화제와 성장인자 등과 같은 다양한 물질에 대한 연구가 이루어지고 있다. 그러한 예로써, 일반적으로 배양환경에서 생성되는 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS) 감소에 베타 메르캅토에탄올과 비타민 E (Kitagawa 등 2004), 알파토코페롤과 아스코르비산 (Hossein 등 2007), 플라보노이드 (Ohshima H 등 1998; Williams RJ 등 2004) 같은 항산화제 첨가가 유효하게 작용하여 체외 수정란 발달효율이 향상된다고 보고된 바 있다. 우태아 혈청 및 화학적으로 정제된 합성 혈청 대사물과 상피세포 성장인자를 같이 넣은 배양액을 이용하여 소 난자의 배 발달율 증가와 성장관련 유전자 증가 등 긍정적인 영향을 얻었다고 보고한 바 있다. 또한 소 복제수정란을 체외배양 할 때 배양액에 생쥐의 상피세포 성장 인자 (EGF; epidermal growth factor)와 생쥐의 과립세포-대립세포 집락자극인자 (GM-CSF: granulocyte macrophage-colony stimulating factor) 를 첨가 하였을 경우 세포 수 증가 등 발달에 있어서 긍정적인 영향을 주었다고 보고된 바 있다. 이러한 체외 배양 환경 개선에 대한 최종 연구 목적은 최대한 체내 환경과 유사한 환경을 제공함으로써 건강한 배아 즉 정상적인 생명체 발생이 용이한 배양 환경을 만들고자 함에 있다.

본 발명은 전술한 바와 같이, 소 난자의 체외 배양 기술을 개선하고자 이루어진 것으로서, 소 난자의 체외 배양 환경을 개선하여 체외 배양 효율을 증가시킬 수 있는 소 난자의 체외 배양 방법을 제공함을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 소 난자의 체외 배양 시 체외 배양 환경을 개선하고 배양 효율을 증가시킬 수 있는 첨가제를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따른 소 난자의 체외 배양 방법은 증식 단계의 인간 배아줄기세포 콜로니를 제1 배양액으로 배양하는 줄기세포 배양 단계, 상기 줄기세포 배양 단계로부터 생성된 용액 상의 미분화 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물을 회수하는 단계, 상기 회수된 배양 조성물을 소 난자의 체외 배양 시 체외 배양액으로 사용되는 제2 배양액에 첨가하여 상기 소 난자를 체외 배양하는 단계를 포함한다.

상기 줄기세포 배양 단계에서는 적어도 90% 이상 증식된 인간 배아 줄기세포를 1 내지 3일 배양할 수 있다. 또한, 상기 미분화 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물은, 제1 배양액 및 상기 줄기세포 배양 단계에서 발생한 상기 인간 배아줄기세포의 대사 산물을 포함한다. 한편, 상기 제1 배양액은 불-필수 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 소 난자 체외 배양용 첨가제는 증식 단계의 인 간 배아줄기세포 콜로니를 제1 배양액으로 배양하는 줄기세포 배양 단계 및 상기 줄기세포 배양 단계로부터 생성된 용액 상의 물질을 회수하는 단계로부터 수득 되고, 제1 배양액 및 상기 줄기세포 배양 단계에서 발생한 상기 인간 배아줄기세포의 대사 산물을 포함한다.

본 발명에 따르면, 소 난자의 체외 배양 시 배양 환경을 개선함으로써 배양 효율을 극대화할 수 있다. 나아가 소뿐만 아니라 다른 동물들에도 유사하게 적용이 가능할 것으로 기대하고 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명에 따르면, 소 난자의 체외 배양 단계에서 소 난자의 체외 배양액에 추가로 미분화 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물을 첨가함으로써 소 난자의 체외 배양 효율을 증가시킬 수 있다.

상기 미분화 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물은 증식 중인 인간 배아줄기세포 콜로니를 줄기세포 배양액에 바람직하게는 1 내지 3일 정도 배양함으로써 수득될 수 있다. 상기 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물은 상기 줄기세포 배양액뿐만 아니라 상기 인간 배아줄기세포의 배양 과정에서 생성되는 대사 산물을 포함한다. 상기 인간 배아줄기세포 콜로니는 증식 중인 인간 배아줄기세포로서, 적어도 90% 이상 증식이 완료된 인간 배아줄기세포 콜로니를 사용하는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이 상기 인간 배아줄기세포 콜로니를 1 내지 3일 배양한 후, 인 간 배아줄기세포 콜로니를 제외한 용액 상의 물질을 회수함으로써 상기 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물을 수득할 수 있다.

상기 인간 배아줄기세포 유래 배양 조성물은 소 난자의 체외 배양시 일종의 첨가제로서 기본 배양액에 혼합되어 사용된다.

이하, 구체적인 실시예들을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하도록 한다.

[실시예]

[실시예 1]

1. 미분화 인간배아줄기세포배양 유래 조성물의 준비

미분화 인간배아줄기세포 유래 배양 조성물은 5% 마트리젤이 코팅된 배양 용기 내에 90% 이상 증식된 인간 배아줄기세포 콜로니를 줄기세포 배양액으로 2일 동안 배양하여 획득하였다. 줄기세포 배양액은 DMEM/F12 (Gibco)에 1% 불-필수 아미노산(non-essential amino acid), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1%의 페니실린/스트렙토마이신(Pennicilin/streptomycin), 20%의 혈청대체물질(knock-out serum replacement 와 8ng/ml의 파이브로블라스트 성장 인자 II(fibroblast growth factor II) 가 첨가된 것을 사용하였다.

2. 소 난자의 채취 및 성숙배양

소 난소의 표면에 육안으로 보이는 3-6 mm크기 다수의 난포로부터 난구세포-난자 복합체 (cumulus-oocyte complexes) 를 18 게이지(gauge) 주사기를 이용하여 채취하였다. 회수된 난구세포-난자 복합체는 1mg/ml 소혈청 알부민이 들어있는 TL- HEPES 버퍼로 3회이상 충분히 세척하고 우태아혈청 10%와 0.2mM 피루브산 나트륨, 1㎍/ml 난포자극 호르몬, 1㎍/ml 에스트라디올, 25㎍/ml 젠타마이신이 들어간 TCM-199 체외성숙용 배양액에 넣어 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기내에서 24시간 동안 성숙 배양하였다.

3. 소 난자의 단위발생 및 체외 배양

소 난자의 단위발생을 위해 체외 성숙 배양된 난구세포-난자 복합체는 1 mg/ml 의 히알루로니다제를 이용해서 먼저 난구세포를 제거하고 TL-HEPES버퍼로 충분히 세척한 다음 10 μM 칼슘아이오마이신이 들어있는 CR1aa 배양액에서 5분 동안 활성화를 유도하고 2 μM 6-디메틸아미노퓨린(6-dimethylaminopurine)이 들어있는 CR1 aa 배양액에서 3시간 동안 배양하였다. 이때에 사용된 CR1aa 배양액 내에는 3mg/ml 지방산이 제거된 (fatty acid free) 소혈청 알부민이 함유되어 있고 본 실험의 기본 배양액으로 이용되었다. 활성화시킨 난자는 CR1aa 기본 배양액에 넣어 2일간 배양시키고 4-8세포로 분열된 난자를 다시 CR1aa 기본 배양액 (대조군)과 10% 미분화 배아줄기세포 유래 조성물이 들어있는 배양액 (실험군) 으로 나누어 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기내에서 6일간 추가 배양하여 체외 배양 8일째 배반포기배까지의 배 발달상태를 비교 조사하였다.

4. 이중염색

대조군과 실험군의 체외 배양 8일째 발달된 배반포기배의 질적인 차이를 조

사하기 위해 영양배엽세포와 내부 세포괴 수를 동시에 검토할 수 있는 이중 염색을 실시하였다. 2중염색은 2단계로 실시되었다. 각 군의 배반포기배는 1% 트리톤-X(triton X-100)와 100㎍/ml 프로피디움 요오드화물이 포함된 TL-HEPES 용액에서 30초간 처리하고 (1단계) 25㎍/ml 비스벤자마이드 (Hoechst 33258)가 포함된 TL-HEPES 용액에 넣어 4℃에서 다음날까지 반응시켰다 (2단계). 염색된 배반포기배는 글리세롤로 세척한 다음 슬라이드 그라스에 올려 놓고 커버슬립으로 덮어 형광 현미경의 blue 필터 (excitation field-350 nm, emission field-461 nm) 하에서 관찰하여 세포 수를 세었다.

5. 실험 결과

미분화 줄기세포 배양 조성물이 소 단위발생란의 발달에 미치는 영향

*대조군; CR1aa +FAF-BSA 3mg/ml,

실험군; CR1aa +FAF-BSA 3mg/ml + 미분화배아줄기세포 조성물 10%

**p<0.01

도 1은 미분화 배아줄기세포 유래 배양 조성물 첨가 유무에 따른 소 단위발생란의 발달과정을 보여주는 사진이다. 도 1에서, 대조군은 A, C, E 및 G, 실험군은 B, D, F 및 H이며 체외배양 2일 째 (A, B), 체외배양 4일 째 (C, D), 체외배양 6일 째 (E, F), 체외배양 8일 째 (G, H)를 각각 나타내고 있다.

상기 표 1 및 도 1을 참조하면, 체외에서 생산된 소 단위발생란의 발달에 미분화 배아줄기세포 조성물이 미치는 영향을 총 3회에 걸쳐 조사하였던 바 체외 배양 4일, 6일과 8일로 진전됨에 따라 대조군과 실험군 간에 배 발달율이 현저하게 차이가 있음을 알 수 있었다. 본 실험에 사용된 실험군 배양액은 CR1aa 배양액에 미분화배아줄기세포 유래 배양 조성물 10% 가 첨가된 것으로 배양 8일째 배반포기배형성율(도 1의 H 참조)은 대조군 7.3%에 비해 34.1% 로서 유의하게 높았다 (p<0.01).

도 2는 미분화 배아줄기세포 유래 배양 조성물 첨가 유무에 따른 소 단위발생란의 발달과정을 보여주는 이중 염색 사진이다. 도 2에서, 가)는 대조군 나)는 실험군이다.

도 2를 참조하면, 대조군과 실험군의 체외배양 8일째 배반포기배의 질적인 차이를 조사하기 위해 이중염색으로 영양배엽세포수와 내부세포괴수를 조사하였던 바, 이 둘을 합한 총 세포수는 미분화배아줄기세포 유래 배양 조성물 10% 첨가된 실험군이 129.6±36.7로서 대조군 38.3±5.0 에 비해 3.3배 이상 유의하게 많았다 (p<0.01). 특히, 장차 태아로 발생될 내부세포괴 수의 경우 대조군 12.3±6.4 에 비해 44.1±5.7 로서(도 2의 B)) 미분화배아줄기세포 유래 배양 조성물 첨가 실험군에서 3.5배 이상 증가된 유의한 수치를 나타내었다 (p<0.01). 이러한 결과는 미분화배아줄기세포 유래 배양 조성물의 첨가가 영양배엽 세포와 내부세포괴 발생에 유의하게 작용하였음을 나타낸다.

이와 같은 결과를 종합해보면, 미분화 인간배아줄기세포 배양 유래 배양 조성물은 배반포기배 중 태아로 발생될 부위의 내부세포괴로부터 무한 증식된 배아줄기세포의 배양 산물로 태아발생에 유용한 성장인자, 싸이토카인, 아미노산 및 미지성분들이 다수 포함되어 있을 것으로 기대된다. 이러한 성분들이 체외에서 생산된 소 단위발생란의 배반포기형성율, 총세포수 및 내부세포괴의 세포수의 발달에 유의한 영향을 미친 것으로 사료된다.

도 1은 미분화 배아줄기세포 유래 배양 조성물 첨가 유무에 따른 소 단위발생란의 발달과정을 보여주는 사진이다.

도 2는 미분화 배아줄기세포 유래 배양 조성물 첨가 유무에 따른 소 단위발생란의 발달과정을 보여주는 이중 염색 사진이다.

Claims (5)

1. 증식 단계의 인간 배아줄기세포 콜로니를 배양하는 줄기세포 배양 단계;

   상기 줄기세포 배양 단계에서 생성된 미분화 인간 배아줄기세포의 대사 산물을 포함하는 배양액을 회수하는 단계;

   상기 회수된 배양액을 소 난자의 체외 배양 시 사용되는 체외 배양액에 첨가하여 상기 소 난자를 체외 배양하는 단계를 포함하는 소 난자의 체외 배양 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 줄기세포 배양 단계는 적어도 90% 이상 증식된 인간 배아 줄기세포를 1 내지 3일 배양하는 것을 특징으로 하는 소 난자의 체외 배양 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   상기 대사 산물을 포함하는 배양액은 불-필수 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 소 난자의 체외 배양 방법.
5. 증식 단계의 인간 배아줄기세포 콜로니를 배양하는 줄기세포 배양 단계 및 상기 줄기세포 배양 단계로부터 생성된 용액 상의 물질을 회수하는 단계로부터 수득되고,

   상기 용액 상의 물질을 포함하는 소 난자 체외 배양용 첨가제.

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