BRPI0706801A2

BRPI0706801A2 - método de purificação de cardiomiócitos ou cardiomiócitos programados derivado de células tronco ou fetos

Info

Publication number: BRPI0706801A2
Application number: BRPI0706801-8A
Authority: BR
Inventors: Fumiyuki Hattori; Keiichi Fukuda
Original assignee: Asubio Pharma Co Ltd; Univ Keio
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2011-04-05
Also published as: JP2013143968A; KR101455144B1; EP1983042B1; WO2007088874A1; CN103409368B; SG169359A1; AU2007210580A1; IL193095A; KR20120123608A; RU2426784C2; KR20080097197A; BRPI0706801B8; BRPI0706801B1; EP1983042A1; CA2640644C; AU2007210580B2; US9115342B2; KR101348325B1; JPWO2007088874A1; CN103409368A

Abstract

MéTODO DE PURIFICAçãO DE CARDIOMIõCITOS OU CARDIOMIóCITOS PROGRAMADOS DERIVADO DE CéLULAS- TRONCO OU FETOS A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um método para purificar cardiomiácitos com alto grau de purificação e com alto rendimento a partir de uma mistura celular compreendendo cardiomiócitos derivados de fetos e de células-tronco usando várias características as quais não foram anteriormente esperadas para serem usadas para a purificação de cardiomiócitos, ou as quais são recentemente descobertas, em que o referido método é executado sem sofrer qualquer modificação genética ou sem adicionar quaisquer proteínas ou agentes biologicamente ativos especiais. Os inventores da presente invenção descobriram que os cardio-miócitos foram altamente selecionados e purificados de forma eficaz pelo cultivo de cardiomiácitos derivados de células-tronco embrionárias no meio de cultura sob uma condição selecionada de uma condição selecionada com pouco soro, uma condição suplementada com pouca glicose, uma condição nutricional baixa, uma condição com pouco cálcio, uma condição com pH brandamente ácido, uma condição suplementada com ácido lático, uma condição suplementada com ácido aspártico/ácido glutâmico e/ou uma condição suplementada com ácido pirúvico. Os inventores da presente invenção ainda descobriram que o método inventado acima, em relação às células-tronco embrionárias, foi aplicável para selecionar e purificar cardiomiácitos derivados de fetos ou de células-tronco adultas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DEPURIFICAÇÃO DE CARDIOMIÓCITOS OU CARDIOMIÓCITOS PROGRAMADOS DERIVADO DE CÉLULAS-TRONCO OU FETOS".

GAMPQ TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um método para purificar cardi-omiócitos de uma população de células derivada de células-tronco e fetos etambém a um método para os seus usos.

TÉCNICA ANTERIOR

Uma vez que o cardiomiócito perde a capacidade proliferativanum corpo adulto, é necessário efetuar um transplante cardíaco no trata-mento de uma doença cardíaca séria, tal como enfarte cardíaco ou cardio-miopatia. Entretanto, atualmente, uma vez que há doadores de coraçõesinsuficientes, há atualmente uma necessidade urgente de desenvolver ummétodo de tratamento diferente de transplanta cardíaco.

Por outro lado, o recrutamento dos cardiomiócitos produzidos exvivo é esperado para ser o método mais promissor de proporcionar alíviopara pacientes necessitados de transplante cardíaco. Vários métodos depreparo de cardiomiócitos foram investigados, tal como um método de dife-renciação de células-tronco (células-tronco embrionárias ou várias células-tronco adultas) em cardiomiócitos ou um método para isolar cardiomiócitosde fetos.

A diferenciação dos cardiomiócitos das células-tronco embrioná-rias é positivamente induzida através da formação de uma massa celular(um corpo embrionário) pela eliminação de fatores de supressão de diferen-ciação do meio de cultura (tais como células alimentadoras, fator inibitório deleucemia: LIF) no caso de células-tronco embrionárias de camundongo oufatores de supressão de diferenciação (tais como células alimentadoras, fa-tor de crescimento de fibroblasto básico: bFGF, fator de crescimento trans-formante: TGF) no caso de células-tronco embrionárias humanas.

Um modo de diferenciação in vitro segue parcialmente um modode desenvolvimento fisiológico. Especialmente, em relação aos eventos dedesenvolvimento iniciais, existe uma variedade de semelhanças entre o mo-do de desenvolvimento fisiológico em óvulos fertilizados e o modo de dife-renciação in vitro. No curso de diferenciação do cardiomiócito in vitro, comotambém no desenvolvimento fisiológico, células de mesoblasto não-diferenciadas são primeiramente geradas, uma parte das quais é alteradaem cardiomiócitos programados (células de mesoblasto pré-cardíacas) e, aseguir, diferenciadas nos cardiomiócitos. Entretanto, uma vez que as célu-las-tronco embrionárias podem se diferenciar em quaisquer tipos de célulasas quais constroem um órgão num corpo é tecnicamente difícil diferenciar ascélulas-tronco embrionárias em somente um tipo individual de células.

Além disso, uma vez que também é difícil sob condições não-fisiológicas (in vitro) induzir a diferenciação das células-tronco embrionáriasem todos os tipos de células, então parcialmente restam células não-diferenciadas. Além disso, as células-tronco mesenquimais presentes namedula óssea ou no cordão umbilical e células-tronco teciduais presentesem vários tipos de tecidos (tais como célula-tronco neural, células-troncoderivadas adiposas e células-tronco do músculo esquelético) são considera-das como sendo as células-tronco adultas, as quais são consideradas comotendo uma capacidade de se diferenciar nos cardiomiócitos. Acredita-se queessas células se diferenciem não somente nos cardiomiócitos, mas tambémem vários tipos de células. Embora os detalhes dos mecanismos de diferen-ciação de quaisquer células-tronco adultas nos cardiomiócitos não estãocompletamente elucidados, sabe-se que essas células formam os cardiomi-ócitos, outras células diferenciadas e uma população celular contendo célu-las não-diferenciadas depois de sofrer certo período de fase de transição.

Em resumo, todas as células-tronco causam algumas caracterís-ticas deletérias para aplicações clínicas de modo que existem células dife-rentes dos cardiomiócitos as quais são geradas das células-tronco comosubprodutos ou células não-diferenciadas. Uma vez que as células não-diferenciadas têm uma atividade proliferativa e têm uma capacidade de sediferenciar em muitos tipos de células, uma população celular contendo oscardiomiócitos gerados por indução de diferenciação mão pode ser trans-plantada num corpo vivo na terapia.Conseqüentemente, para executar seguramente o tratamentousando células-tronco e alcançar um efeito de tratamento ideal, é necessáriodesenvolver um método de purificação dos cardiomiócitos da população celular.

Até o momento, os cardiomiócitos foram purificados por um mé-todo de purificação dos cardiomiócitos pela expressão de modo específicode um marcador fluorescente tal como GFP nos cardiomiócitos e a seleçãode uma célula expressando um marcador fluorescente usando um separadorcelular (documento de não-patente 1) ou um método de purificação dos car-diomiócitos pela expressão específica de uma proteína resistente a antibióti-co nos cardiomiócitos e a seleção de células usando o antibiótico (documen-to de não-patente 2). Entretanto, uma vez que esses métodos têm que en-volver numa alteração genética, a qual causa uma discussão relacionadacom a segurança, esses métodos podem não ser usados para preparar oscardiomiócitos para o transplante no campo clínico. Além disso, uma vez queesses métodos envolvem uma alteração genética, uma questão ética e al-guns riscos sérios imprevisíveis, tais como alteração na taxa de transforma-ção, estão associados com uma alteração genômica (documento de não-patente 3).

Sabe-se na técnica que o coração pode usar ácido lático geradopor um tecido diferente do coração (tal como músculo esquelético) comofonte de energia (documento de não-patente 4). Entretanto, não existe ne-nhuma técnica anterior para tentar purificar cardiomiócitos usando essa ca-racterística.

Também no coração, no fígado e no rim, ácido aspártico e ácidoglutâmico são usados para transportar NADH para a mitocôndria, o meca-nismo do qual é diferente daquele do outro tecido (documento de não-patente 5). O transporte de NADH para dentro da mitocôndria é indispensá-vel para a produção de energia na mitocôndria. Entretanto, não há nenhumatécnica anterior para tentar purificar cardiomiócitos usando essa diferençanesse mecanismo.

Documento de não-patente 1: Muller M, et al., FASEB J. 2000;14: 2540 a 2548.

Documento de não-patente 2: Klug MG, et al., J. Clon. Invest.1996; 98: 216 a 224.

Documento de não-patente 3: Schroder AR1 et al., Cell. 2002;110:521 a 529.

Documento de não-patente 4: Khairallah M, et al., AM J. PhysiolHeart Circ Physiol 2004; 286, H1461 a 1470.

Documento de não-patente 5: Chatham JC, et al., J. Biol. Chem1995; 270: 7999 a 8008.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

UM PROBLEMA A SER RESOLVIDO PELA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é desenvolver um método depurificação de cardiomiócitos num grau elevado de purificação e com umrendimento elevado de uma mistura celular compreendendo cardiomiócitosderivados de fetos e células-tronco usando várias características as quaisnão foi esperado anteriormente que fossem usadas para a purificação decardiomiócitos ou as quais foram recentemente descobertas, em que o refe-rido método é executado sem sofrer qualquer alteração genética ou sem a-dicionar quaisquer proteínas especiais ou agentes biologicamente ativos.

FORMAS DE RESOLVER O PROBLEMA

Os inventores da presente invenção efetuaram um estudo e-xaustivo para as composições de vários tipos de meios de cultura para cons-truir um sistema para produzir eficientemente cardiomiócitos derivados decélulas-tronco embrionárias. Baseando-se nos resultados considerando umestudo para uma concentração de cada componente dos vários meios decultura ou um estudo para a regulação do ritmo de alterações numa concen-tração de cada componente de vários meios de cultura obtidos pela altera-ção das composições dos componentes de vários meios de cultura, os in-ventores da presente invenção descobriram os seguintes eventos:

(1) Um evento no qual uma inibição da diferenciação/cresci-mento celular e uma indução da morte celular não direcionada a cardiomióci-tos ocorre, quando uma mistura celular contendo os cardiomiócitos e os não-cardiomiócitos é cultivada numa condição suplementada com pouco soro ounuma condição sem soro;

(2) Um evento no qual uma indução de morte celular direcionadaa não-cardiomiócitos ocorre, quando uma mistura celular contendo os cardi-omiócitos e os não-cardiomiócitos é cultivada num meio e cultura levementeácido;

(3) Um evento no qual uma inibição da diferenciação/crescimen-to celular e uma indução da morte celular direcionada a não-cardiomiócitosocorre, quando uma mistura celular contendo os cardiomiócitos e os não-cardiomiócitos é cultivada num meio de cultura com pouco cálcio;

(4) Um evento no qual não-cardiomiócitos seletivamente sofremmorte celular, quando os cardiomiócitos são cultivados num meio de culturanutricionalmente pobre;

(5) Um evento no qual o consumo de energia é inibido pelo en-fraquecimento da pulsação autônoma em cardiomiócitos, quando os cardio-miócitos são cultivados numa condição com pouco cálcio;

(6) Um evento no qual uma formação de massa celular espontâ-nea de cardiomiócitos é intensificada sob uma condição suplementada compouco soro ou sob uma condição livre de soro; e

(7) Um evento no qual uma viabilidade de um cardiomiócito ésignificativamente reduzida quando os cardiomiócitos são cultivados depoisde dispensar uma massa celular dos cardiomiócitos.

Os inventores da presente invenção descobriram que os cardio-miócitos derivados das células-tronco embrionárias podem ser selecionadosou purificados eficientemente e num alto grau pelo método otimizado usandoum ou mais processos correspondendo a esses eventos. Além disso, os in-ventores também descobriram que os métodos desenvolvidos das proprie-dades das células-tronco embrionárias também são aplicáveis para selecio-nar ou purificar cardiomiócitos derivados de fetos ou para selecionar ou puri-ficar cardiomiócitos derivados das células-tronco adultas. Baseando-se nes-sas descobertas, os inventores completaram a presente invenção.

Mais especificamente, numa modalidade, a presente invençãoproporciona um método para selecionar cardiomiócitos de uma mistura celu-lar contendo cardiomiócitos e não-cardiomiócitos derivados de células-troncoembrionárias, fetos ou células-tronco adultas, em que a referida mistura ce-lular é cultivada no meio de cultura sob as seguintes condições: (i) uma con-dição suplementada com pouca glicose; e (ii) uma ou mais condições sele-cionadas do grupo consistindo em uma condição com pouco cálcio, umacondição nutricionalmente pobre, um condição suplementada com ácido láti-co, uma condição suplementada com ácido aspártico/ácido glutâmico e umacondição suplementada com ácido pirúvico. Nessa modalidade, a misturacelular pode ser preparada pela indução da diferenciação das células-troncoembrionárias, formando corpos embrióides compreendendo cardiomiócitosprogramados (células de mesoblasto não-diferenciadas), o cultivo dos cor-pos embrióides no meio de cultura sob uma condição suplementada compouco soro e/ou uma condição de pH levemente ácida.

Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um mé-todo para selecionar cardiomiócitos derivados de células-tronco embrioná-rias, em que os cardiomiócitos são selecionados pelos seguintes passos de:induzir a diferenciação das células-tronco embrionárias para formar corposembrióides compreendendo células de mesoblasto não-diferenciadas; a se-guir o cultivo dos corpos embrióides no meio de cultura sob uma condiçãosuplementada com pouco soro e/ou uma condição de pH levemente ácidopara preparar uma mistura celular compreendendo cardiomiócitos progra-mados; e a continuação da cultura da mistura celular no mesmo meio decultura para obter os cardiomiócitos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 apresenta um modo de apresentação dos cardiomióci-tos num corpo embrióide após a adesão da cultura.

Figura 2 mostra um modo de apresentação dos cardiomiócitosnos corpos embrióides aderidos os quais foram cultivados sob uma condiçãosem soro.

Figura 3 mostra uma seleção bem-sucedida dos cardiomiócitosprogramados sob uma condição sem soro.Figura 4 mostra um efeito de condição de pouco cálcio.

Figura 5 mostra uma seleção bem sucedida dos cardiomiócitosprogramados na massa de células-tronco embrionárias sob uma condiçãosem soro/de pH levemente ácido.

Figura 6-1, mostra uma análise dos cardiomiócitos programadosna massa de células-tronco embrionárias sob uma condição sem soro/compH levemente ácido.

Figura 6-2 mostra uma análise dos cardiomiócitos programadosna massa de células-tronco embrionárias sob uma condição sem soro/compH levemente ácido.

Figura 7 mostra uma massa de cardiomiócitos a qual é selecio-nada pelo cultivo de células-tronco embrionárias sob uma condição sem so-ro/com pH levemente ácido.

Figura 8 mostra uma seleção de cardiomiócitos pelo cultivo decélulas sob uma condição em açúcar, sem soro e suplementada com ácidolático.

Figura 9 mostra imagens com manchamento específico de car-diomiócitos para células as quais são selecionadas e coletadas durante ocultivo das células sob uma condição sem açúcar/sem soro e suplementadacom ácido lático.

Figura 10 mostra as massas de cardiomiócitos e as massas decélulas mortas as quais são exatamente sélecionadas pelo cultivo das célu-las sob uma condição em soro/levemente ácida/com pouco cálcio/sem açú-car e suplementada com ácido lático.

Figura 11 mostra um resultado de um método para eliminar a-gregados de alta densidade consistindo nas massas das células mortas u-sando centrifugação por gradiente de densidade.

Figura 12-1 mostra as massas dos cardiomiócitos selecionadaspelo cultivo das células sob uma condição sem soro/levemente ácida/compouco cálcio/sem açúcar e suplementada com ácido lático.

Figura 12-2 mostra as massas dos cardiomiócitos selecionadospelo cultivo das células sob uma condição sem soro/levemente ácida/compouco cálcio/sem açúcar e suplementada com ácido lático.

Figura 13 mostra os cardiomiócitos purificados pelo cultivo dascélulas sob uma condição sem soro/levemente ácida/com pouco cálcio/semaçúcar e uma suplementada com ácido aspártico/ácido glutâmico.

Figura 14 mostra os resultados da purificação dos cardiomiócitosdas células-tronco da medula óssea.

Figura 15 mostra os resultados da purificação dos cardiomiócitosdos fetos.

Figura 16 mostra regiões contendo células pulsantes autonomi-camente sob uma condição sem soro/levemente ácida/com pouco cál-cio/sem açúcar e uma suplementada com ácido pirúvico.

Figura 17 mostra as massas de cardiomiócitos de sagüi, osquais são selecionados pelo cultivo das células por 15 dias sob uma condi-ção sem açúcar/sem soro e uma suplementada com ácido lático.

Figura 18 mostra imagens de manchamento específicas de car-diomiócitos para células de sagüi as quais são selecionadas e coletadas pe-lo cultivo das células sob uma condição sem açúcar/sem soro e uma suple-mentada com ácido lático.

Figura 19 mostra que a células de sagüi, as quais são selecio-nadas e coletadas pelo cultivo sob uma condição sem açúcar/livre de soro euma suplementada com ácido lático são enxertadas com sucesso no cora-ção de um receptor.

Figura 20 mostra imagens das massas celulares derivadas decélulas-tronco embrionárias humanas, as quais foram obtidas pelo cultivosob uma condição contendo açúcar (controle) (isto é, condição de controle) ea aparência das massas celulares derivadas das células-tronco embrionáriashumanas, as quais foram obtidas pela cultura seletiva de cardiomiócito sobuma condição sem açúcar (seleção de cardiomiócito) por 15 dias (isto é,condição de seleção de cardiomiócito).

Figura 21 mostra imagens de imunomarcação das massas celu-lares derivadas das células-tronco embrionárias humanas usando um anti-corpo antiactinina e um anticorpo anti-Nkx2.5, em que as massas celularesforam formadas pelos cardiomiócitos os quais reiniciam a pulsação autonô-mica. As massas celulares foram preparadas pelo cultivo das células-troncoembrionárias humanas sob uma condição sem açúcar (seleção de cardiomi-ócito) por 15 dias e, a seguir, pela alteração da condição do meio de cultura.

MODALIDADES DE IMPLEMENTAÇÃO DA INVENÇÃO

Um tratamento apropriado para induzir a diferenciação de cardi-omiócitos geralmente causa a diferenciação das células-tronco com umacapacidade de se diferenciar nos cardiomiócitos (isto é, células-tronco em-brionárias e células-tronco adultas, tais como células-tronco da medula ós-sea) nos cardiomiócitos. É possível induzir a diferenciação das células-tronco embrionárias nos cardiomiócitos usando o método de gota suspensa,no qual, por exemplo, as células-tronco embrionárias de camundongo sãoincubadas na cultura de suspensão sob uma condição na ausência do fatorinibitório de leucemia (LIF) para formar uma massa celular (um corpo embri-óide). Também, da mesma forma, as células-tronco embrionárias de sagüiou as células-tronco embrionárias humanas podem ser usadas para induzir adiferenciação das células-tronco embrionárias nos cardiomiócitos.

O presente método pode ser aplicado às células-tronco deriva-das de qualquer espécie de mamífero. Por exemplo, os exemplos da espéciede mamífero da qual as células-tronco são derivadas, usadas no presentemétodo incluem, porém não estão limitadas, ao camundongo, vaca, cabra,cachorro, gato, sagüi, macaco rhesus, humano e assim por diante. Os e-xemplos das células-tronco usadas para a presente invenção incluem célu-las ES de mamíferos, as quais são amplamente usadas na técnica comocélulas ES de camundongo, células ES de macaco e células ES humanas.

Os exemplos específicos das células ES de camundongo inclu-em células EB3, células E14, células D3, células CCE, células R1, células129SV, células J1 e assim por diante. As células ES de camundongo usadaspara a presente invenção são disponíveis da American Type Culture Collec-tion (ATCC), Chemicon1 e Cell & Molecular Technologies, e assim por diante.

Os exemplos das células ES de macaco incluem células ES es-tabelecidas de macaco rhesus (Macaca mulatta) (thomson et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 1995; 92: 7844), células ES estabelecidas de macaco cino-mólogo (Macaca fascicularis) (Suemori et al., Dev. Dyn. 2001; 222; 273 a279) e células ES estabelecidas de sagüis comuns (Callithrix jacchus) (Sa-saki et al., Stem Cells. 2005; 23: 1304 a 1313), as quais são todas disponí-veis da técnica. Por exemplo, as células ES de sagüi são disponíveis doCentral Institute for Experimental Animais (Kawasaki, Japão).

Até o momento, várias dúzias de células ES humanas foram es-tabelecidas no mundo, e uma quantidade de linhagens celulares ES huma-nas são registradas na lista do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Uni-dos (United States National Institute of Health)(HTTP://stemcells.nih.gov/registry/index.asp) e estão disponíveis. Nos Esta-dos Unidos, algumas linhagens celulares ES humanas também são comer-cialmente disponíveis de Cellartis, ES Cell International, Wisconsin AlumniResearch Foundation, e etc. Também no Japão, algumas linhagens de célu-las ES humanas são disponíveis do Centro de Pesquisa de Células-tronco (oInstitute for Frontier medicai Sciences, Universidade de Kyoto) (Suemori etal., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006; 345: 926 a 932).

Além disso, as células ES de vaca (Mitalipova et al., Cloning2001; 3: 59 a 67), células ES de galinha (Petittc et al., Mech. Dev. 2004; 121 :1159 a 1168) e células ES de peixe paulistinha (zebrafish) (Fishman, M. C.Science 2001; 294: 1290 a 1291) também foram estabelecidas.

De um modo geral, as células ES são estabelecidas pelo cultivode embriões prematuros. Em adição a este método, é possível produzir célu-las ES do embrião prematuro as quais sofrem o transplante de núcleo donúcleo de células somáticas (Munsie et al., Curr. Biol. 10: 989, 2000; Waka-yama et al., Science 292: 740, 2001; Hwang et al., Science 303: 1669,2004). Também há alguns relatórios que tentam isolar células-troncos comose segue: um método para produzir células ES das células embrionárias par-tenogenéticas as quais são desenvolvidas até um estágio equivalente aoestágio de blastocisto (Publicação de Patente Americana N°. 02/168763;Vrana et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 11911-6, 2003) e um métodopara produzir células ES com informação genética originalmente contida nonúcleo de células somáticas pela fusão das células ES e das células somáti-cas (WO 00/49137; Tada et al., Curr. Biol. 11: 1553, 2001). Os exemplos dascélulas ES usadas na presente invenção incluem células ES preparadas pe-lo método descrito acima ou células nas quais um ou mais genes no cro-mossomo das células ES são alterados pela técnica de engenharia genética.

Além disso, os exemplos das células-tronco usadas no métododa presente invenção incluem não somente células ES, mas também quais-quer células-tronco com características similares àquelas das células ES, asquais são derivadas de células de órgãos ou tecidos adultos mamíferos, cé-lulas da medula óssea, células sangüíneas e células de embriões ou fetos.Nesse contexto, a frase "características similares àquelas das células ES"pode ser definida por características de biologia celular específicas para ascélulas ES (tal como a presença de um marcador de superfície (antígeno)específico para as células ES, a expressão de gene específico de células ESou uma capacidade de formar teratoma ou camundongo quimérico). Os e-xemplos específicos das células-tronco com características similares àque-las das células ES incluem células EG produzidas a partir de células germi-nativas primordiais, células GS produzidas de células germinativas testicula-res e células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) produzidas a partirde células somáticas tais como fibroblastos usando uma técnica de enge-nharia genética especial. É considerado que, nesse método, corpos embriói-des depois de 3 a 6 dias do início da indução da diferenciação, induzida pelocultivo das células-tronco pela cultura de suspensão na ausência de LIF,incluem células de mesoblasto não-diferenciadas e cardiomiócitos progra-mados os quais se diferenciação em cardiomiócitos no futuro. Sabe-se natécnica que, no caso de indução das células-tronco embrionárias, um cardi-omiócito aparece depois de 7 dias a partir do início da indução da diferencia-ção (no caso das células-tronco embrionárias humanas, depois de 10 diasdo início da indução da diferenciação). Entretanto, os corpos embrióidespreparados dessa forma usando as células-tronco embrionárias incluem nãosomente os cardiomiócitos descritos acima, porém também as células asquais não têm a capacidade de se diferenciar nos cardiomiócitos (tais comoas células não-diferenciadas, as células tipo endotélio-epitélio e as célulasneuronais). Na presente invenção, quaisquer células diferentes dos cardio-miócitos ou células as quais se diferenciam nos cardiomiócitos no futuro (taiscomo células de mesoblasto não-diferenciadas, os cardiomiócitos programa-dos) são referidos como um "não-cardiomiócito".

Os presentes inventores estudaram os efeitos das condições decultivo tais como uma condição suplementada com pouco soro, uma condi-ção suplementada com pouca glicose, uma condição nutricionalmente pobre,uma condição com pouco cálcio, uma condição com pH levemente ácido naseleção dos cardiomiócitos, para discriminar especificamente os cardiomióci-tos ou células os quais se diferenciam nos cardiomiócitos no futuro a partirde não-cardiomiócitos contidos nos corpos embrióides preparados dessaforma.

Como resultado, ós presentes inventores descobriram que quan-do uma mistura celular contendo a célula de mesoblasto não-diferenciada,os cardiomiócitos programados e os cardiomiócitos são cultivados sob umaou mais condições as quais são selecionadas do grupo consistindo em umacondição suplementada com pouco soro, uma condição suplementada compouca glicose, uma condição nutricionalmente pobre, uma condição compouco cálcio, uma condição com pH levemente ácido, sozinhas ou em qual-quer combinação, os cardiomiócitos ou células os quais se diferenciam noscardiomiócitos no futuro são menos sensíveis ao efeito citotóxico em compa-ração com os não-cardiomiócitos sob tal condição.

Com base nessa descoberta, na presente invenção, células asquais são viáveis mesmo sob as condições acima foram capazes de ser se-lecionadas como cardiomiócitos programados e cardiomiócitos de uma mis-tura celular contendo a célula de mesoblasto não-diferenciada, os cardiomi-ócitos programados e os cardiomiócitos, pelo cultivo da mistura celular sob acondição de uma condição suplementada com pouca glicose juntamentecom qualquer uma ou quaisquer combinações de uma condição suplemen-tada com pouco soro, uma condição nutricional pobre, uma condição compouco cálcio e uma condição de pH levemente ácida.O método de seleção acima descrito é para selecionar as célulasde interesse pelo cultivo da mistura celular sob a condição à qual os cardio-miócitos são fisiologicamente resistentes e, conseqüentemente, é referidacomo "método de seleção baseado na resistência fisiológica". O método deseleção baseado na resistência fisiológica da presente invenção é caracteri-zado pelo cultivo da mistura celular contendo os cardiomiócitos no meio decultura sob a condição selecionada de uma condição suplementada compouca glicose, uma condição suplementada com pouco soro, uma condiçãonutricional baixa, uma condição com pouco cálcio ou uma condição de pHlevemente ácido.

Na presente invenção, o termo "uma condição suplementadacom pouca glicose" é definida como sendo uma condição sob a qual a mistu-ra celular é cultivada no meio de cultura com nível reduzido de açúcares (istoé, grupo de substâncias incluindo polissacarídeos e monossacarídeos (taiscomo glicose, galactose, frutose, manose), os quais se dissolvem bioquimi-camente e convertidos in vivo ou intracelularmente para finalmente seremcatabolizados pelo sistema glicolítico). Na modalidade preferida, o termo "u-ma condição suplementada com pouca glicose" significa que a mistura celu-lar é cultivada no meio de cultura na ausência dos açúcares acima ou nomeio de cultura no qual o nível de açúcar é limitado a menos de 1% emcomparação com o nível de açúcares no meio de cultura usado para a indu-ção da diferenciação. Na presente invenção, é desejável eliminar glicose,dentre outros, o tanto quanto for possível para o meio de cultura. Por exem-plo, os meios de cultura comercialmente disponíveis os quais são geralmen-te usados na técnica (tais como a-MEM, MEM, [BBS de Hank], DMEM) con-têm 1 g/L de D-glicose (5,56 mM), RPMI 1640 contém 2,0 g/L de D-glicose(11,12 mM) e F-12 de Ham contém 1,82 g/L de D-glicose (10,12 mM), res-pectivamente. Conseqüentemente, o meio de cultura com o nível de açúca-res sendo reduzido até 1% significa o meio de cultura contendo de 55,60 a111,20 de 55,60 a 111,20 μΜ de açúcares.

Os presentes inventores descobriram que, quando a mistura ce-lular é cultivada no meio de cultura sob o nível limitado de açúcares menordo que 1% em comparação com o nível de açúcares geralmente usado natécnica, os não-cardiomiócitos sofrem morte celular, enquanto a célula domesoblasto não-diferenciada, os cardiomiócitos programados e os cardiomi-ócitos podem sobreviver no meio de cultura sob tal condição. Na presenteinvenção, uma condição suplementada com pouca glicose pode ser alcan-çada pelo uso, por exemplo, de meio de cultura RPMI (livre de açúcar) emeio de cultura DMEM (livre de açúcar) (ambos da GIBCO).

Conforme aqui utilizado, o termo "componente do soro" inclui opróprio soro, componentes de agentes biologicamente ativos contidos nosoro animal ou humano e componentes produzidos recombinantemente ouartificialmente do agente biologicamente ativo. No presente relatório descriti-vo, o termo "uma condição suplementada com pouco soro" refere-se à con-dição onde o nível de soro ou o componente do soro, ou os componentesproduzidos recombinantemente ou artificialmente do agente biologicamenteativo é limitado a 0% a 10% em comparação com os níveis de soro os quaissão suplementados com o meio de cultura usado para obter células de me-soblasto não-diferenciadas é considerado como sendo 100%, e inclui, porexemplo, uma "condição sem soro". Conseqüentemente, um exemplo de"uma condição suplementada com pouco soro" é o caso quando 10% desoro é suplementado com o meio de cultura para obter as células de meso-blasto não-diferenciadas, a concentração de soro no meio de cultura é limi-tada a menos de 1% para selecionar os cardiomiócitos programados ou oscardiomiócitos. Os presentes inventores descobriram que, quando os níveisdos componentes de soro contidos no meio de cultura são limitados a menosde 10% em comparação com os níveis dos componentes de soro no meio decultura geralmente usados na técnica, os não-cardiomiócitos sofrem mortecelular, enquanto que a célula não-diferenciada, os cardiomiócitos progra-mados e os cardiomiócitos podem sobreviver no meio de cultura.

Na presente invenção, o termo "uma condição nutricionalmentepobre" refere-se à condição onde os níveis de cada componente nutricionalcontido nos meios de cultura os quais são geralmente usados na técnica(tais como meio de cultura RPMI, meio de cultura DMEM, meio de culturaMEM1 meio de cultura F12 e meio de cultura a-MEM) são limitados a menosde 10%, em comparação com os níveis dos componentes nutricionais nomeio de cultura geralmente usados na técnica. Na presente invenção, é de-sejável limitar os níveis dos componentes nutricionais até 10%. Os presentesinventores descobriram que, quando os níveis dos componentes nutricionaisno meio de cultura são limitados a 10% em comparação com os níveis doscomponentes nutricionais no meio de cultura geralmente usado na técnica,os não-cardiomiócitos sofrem morte celular, enquanto que a célula de meso-blasto não-diferenciada, os cardiomiócitos programados e os cardiomiócitospodem sobreviver no meio de cultura. Tal "condição nutricional pobre" domeio de cultura pode ser preparada pela diluição de 1 volume do meio decultura geralmente usado na técnica (meio de cultura RPMI, meio de culturaDMEM, meio de cultura MEM, meio de cultura F12 e meio de cultura a-MEM)usando 9 volumes de salina fisiológica (tal como BSS de Hank (sem açúcar)ou PBS).

Na presente invenção, o termo "uma condição com pouco cálcio"refere-se à condição onde a concentração de cálcio contida no meio de cul-tura varia entre 0,3 e 1,3 mM. O meio de cultura geralmente usado para adiferenciação nos cardiomiócitos (tal como meio de cultura DMEM, meio decultura MEM e meio de cultura a-MEM) contém concentração de 1,8 mM decálcio no meio de cultura. É conhecido na técnica que a concentração decálcio é mantido em torno de 1,8 mM, por todo o período de cultivo para adiferenciação nos cardiomiócitos. Os presentes inventores descobriram quequando a concentração de cálcio no meio de cultura está limitada entre 0,3 a1,3 mM da concentração de cálcio, os valores dos quais são significativa-mente mais baixos do que a concentração de cálcio no meio de cultura ge-ralmente usadas na técnica, os não-cardiomiócitos sofrem morte celular, en-quanto que a célula de mesoblasto não-diferenciada, os cardiomiócitos pro-gramados e os cardiomiócitos podem sobreviver no meio de cultura. O meiode cultura RPMI e o meio de cultura F12 (ambos da GIBCO) podem ser usa-dos como os exemplos do meio de cultura com uma "condição com poucocálcio" da presente invenção.Na presente invenção, o termo "uma condição de pH levementeácido" refere-se à condição onde o pH do meio de cultura varia entre 6 e 7.Sabe-se da técnica que a condição de pH do meio de cultura geralmenteusada para a indução da diferenciação dos cardiomiócitos (tal como meio decultura RPMI) meio de cultura DMEM, meio de cultura MEM, meio de culturaF12 e meio de cultura a-MEM) é requerida para ser mantida por volta de pH7,5, a qual é a mesma que a condição fisiológica. O pH do BSS básico é a-justado para ser em torno de pH 6,5 no incubador com CO2 5%. Os presen-tes inventores descobriram que, quando o pH do meio de cultura é abaixadopara pH 6,5, o qual é mais ácido do que o pH do meio de cultura geralmenteusado na técnica, os não-cardiomiócitos sofrem morte celular, enquanto quea célula de mesoblasto não-diferenciada, os cardiomiócitos programados eos cardiomiócitos podem sobreviver no meio de cultura. O meio de culturacom "uma condição de pH levemente ácida" da presente invenção pode serpreparado pelo ajuste do pH do meio de cultura usando a Solução de SaisBalanceada de Hank (BBS de Hank).

Na presente invenção, os cardiomiócitos podem ser purificadosmais eficientemente pela exposição da mistura celular acima mencionada aqualquer combinação de duas ou mais condições adequadas do meio decultura (isto é, o método de seleção baseado na resistência fisiológica).

Os presentes inventores descobriram que quando o meio de cul-tura é privado de açúcares, os não-cardiomiócitos sofreram morte celularnos corpos embrióides derivados das células-tronco embrionárias. Os pre-sentes inventores ainda estudaram um substrato alternativo o qual pode pre-ferivelmente fornecer aos cardiomiócitos uma energia diferente de açúcares,para o propósito de melhorar ainda mais a seletividade da célula de meso-blasto não-diferenciada, os cardiomiócitos programados e os cardiomiócitoscontidos nos corpos embrióides,

Como resultado, os presentes inventores descobriram que é efi-caz suplementar o meio de cultura com ácido lático (lactato, 0,1 a 5 mM),uma combinação de um ácido aspártico (200 a 100 mg/L) e ácido glutâmico(20 a 100 mg/L) ou ácido pirúvico (0,5 a 5 mM), ou qualquer combinaçõesdesses no lugar dos açúcares. Baseando-se nessas descobertas, é conside-rado que tais substituintes de açúcar podem especificamente fornecer aoscardiomiócitos os nutrientes necessários.

O método de seleção descrito acima é referido como "método deseleção baseado em metabolismo", uma vez que o método usa a capacida-de metabólica dos cardiomiócitos para selecionar os cardiomiócitos. O mé-todo de seleção baseado em metabolismo da invenção é caracterizado pelocultivo da mistura celular contendo os cardiomiócitos sob uma condição su-plementada com ácido láctico, uma condição suplementada com ácido as-pártico/ácido glutâmico ou uma condição suplementada com ácido pirúvico.

Na presente invenção, os dois tipos de métodos para selecionaros cardiomiócitos (isto é, o método de seleção baseado na resistência fisio-lógica e o método de seleção baseado no metabolismo) podem ser usadosem combinação para purificar os cardiomiócitos num alto grau de pureza.Também os métodos acima são repetidamente executados para alcançarum grau mais alto de purificação.

A mistura celular contendo a célula de mesoblasto não-diferen-ciada, os cardiomiócitos programados e os cardiomiócitos os quais são usa-dos na presente invenção como uma origem dos cardiomiócitos pode tam-bém ser preparada a partir das células-tronco ou fetos. Nesse contexto, otermo "células-tronco" inclui, porém não está limitado, a células totipotentesas quais podem se diferenciar em quaisquer tipos de células (tais como célu-las-tronco embrionárias) e células pluripotentes as quais podem se diferen-ciar em múltiplos tipos particulares de células (tais como células-tronco adul-tas da medula óssea).

Acredita-se que, durante a preparação dos cardiomiócitos a par-tir das células-tronco embrionárias, conforme a diferenciação progride, ascélulas-tronco embrionárias podem se diferenciar no mesoblasto não-diferenciado, e a seguir subseqüentemente ser modificadas nos cardiomióci-tos programados, e finalmente formar os cardiomiócitos. Aqui, "célula demesoblasto não-diferenciada" refere-se às células as quais expressam aproteína Brachyury (um marcador específico para as células de mesoblastonão-diferenciadas).

Entretanto, "cardiomiócitos programados" refere-se às células asquais expressam as proteínas específicas de células de mesoblasto não-diferenciadas, tais como a proteína Brachyury, porém não expressam as pro-teínas específicas de cardiomiócitos, tais como a Nkx2.5 e Actinina. Os car-diomiócitos programados têm a capacidade de se diferenciar exclusivamentenos cardiomiócitos sem a necessidade de suplementar quaisquer substân-cias adicionais no meio de cultura. "Cardiomiócitos" refere-se a células depulsação autonômica quando as células são viáveis e também a células ex-pressando alguns marcadores, tais como Nkx2.5, GATA4 e actinina, asquais podem ser detectadas após fixação.

Por exemplo, quando as células-tronco embrionárias de camun-dongo são usadas como a origem dos cardiomiócitos, a população celular aqual pode sobreviver sob essas condições de cultivo pode ser selecionadacomo uma população celular consistindo nos cardiomiócitos programados oudos cardiomiócitos das células consistindo nos corpos embrióides pelos se-guintes passos: indução da diferenciação das células-tronco embrionárias decamundongo pela eliminação de LIF do meio de cultura, a seguir incubaçãopor 4 a 7 dias das células-tronco embrionárias de camundongo para gerarcorpos embrióides e o cultivo dos corpos embrióides sob o método de sele-ção baseado na resistência fisiológica e/ou no método de seleção baseadono metabolismo para selecionar a população de células viável como os car-diomiócitos programados ou os cardiomiócitos.

A título de exemplo, depois de 5 dias do início da indução dediferenciação, as células foram selecionadas por mais 24 horas sob umacondição suplementada com pouca glicose e qualquer uma ou quaisquercombinações dos quatro tipos de condições (isto é, uma condição suplemen-tada com pouco soro, uma condição nutricional pobre, uma condição compouco cálcio e uma condição com pH levemente ácido). Embora as células-tronco fossem aquelas sem capacidade de pulsação, a população celularsem capacidade de pulsação foi imunomarcada usando um anticorpo contraBrachyury, o marcador da célula de mesoblasto não-diferenciada, resultandoem imagens positivas de Brachyury em quase todas as células. Isso significaque o presente método é um método para selecionar efetivamente as célulasde mesoblasto não-diferenciadas.

Além disso, as células Brachyury positivas foram imunomarca-das usando um anticorpo contra a Nkx2.5 (a qual é um marcador de proteínahomeótico de desenvolvimento prematuro atualmente conhecido específicopara os cardiomiócitos), resultando em imagens negativas em quase todasas células. Todavia, o cultivo continuado das células resultou na diferencia-ção de cerca de 80 a 90% das células nos cardiomiócitos. Conseqüentemen-te, é considerado que as células de mesoblasto não-diferenciadas no méto-do acima são desconhecidas, porém os cardiomiócitos programados maisprimitivos.

A título de outro exemplo, para selecionar os cardiomiócitos, oscorpos embrióides derivados das células-tronco embrionárias depois de 4 a 6dias do início da indução de diferenciação podem ser cultivados por cerca de3 dias no meio de cultura sem soro preparado pela mistura de MEM (meioessencial mínimo) [BSS de Hank] (Invitrogen) e um a-MEM (SIGMA) na pro-porção de MEM [BSS de Hank]:a-MEM = 9:1 a 1:9, suplementado com ITS[insulina (10 mg/L), transferrina (5,5 mg/L) e selenita de sódio (6,7 mg/L)](GIBCO) (nesse caso, a concentração de cálcio foi de cerca de 1,3 mM). Essacondição de meio de cultura corresponde a uma condição suplementada compouco soro, uma condição com pouco cálcio e uma condição de pH levemen-te ácido. Os cardiomiócitos programados preparados dessa forma podem sercontinuamente cultivados no mesmo meio de cultura para se diferenciaremnos cardiomiócitos. Quando a manipulação da mistura celular é efetuada de-pois de 5 dias do início da indução da diferenciação, especialmente depois daindução dos cardiomiócitos de pulsação autonômica, é possível selecionareficientemente o cardiomiócito pelo simples cultivo em MEM [BSS de Hank]sob uma condição suplementada com pouco soro e uma condição de pH Ie-vemente ácido. Os cardiomiócitos preparados dessa forma podem ser conti-nuamente cultivados no meio de cultura misturado de MEM e a-MEM para sediferenciar em músculo atrial e em músculo ventricular.A título de outro exemplo, os corpos embrióides derivados dascélulas-tronco embrionárias foram lavados usando um meio sem açúcar talcomo BSS de Hank (GIBCO) para eliminar completamente açúcares e, aseguir, foram cultivados por 3 a 7 dias no meio de cultura (BSS de Hank[sem açúcar]/DMEM [sem açúcar] = 9:1 sob uma condição suplementadacom pouco soro, uma condição nutricional pobre (tal como aquelas prepara-das pela diluição de 10 vezes de um meio de cultura comercialmente dispo-nível com solução de tampão isotônico), uma condição de pH levemente á-cido e uma condição com pouco cálcio, as quais foram suplementadas com1 mM de ácido lático (uma condição suplementada com ácido lático), 20mg/L de ácido aspártico e 20 mg/L de ácido glutâmico (uma condição su-plementada com ácido aspártico/ácido glutâmico) ou 1 mM de ácido pirúvico(uma condição suplementada com ácido pirúvico). Como resultado, é possí-vel selecionar eficientemente o cardiomiócito pelo método acima.

Numa tentativa de preparar os cardiomiócitos usando as células-tronco resultantes derivadas da medula óssea, os métodos descritos acimatambém são aplicáveis para selecionar os cardiomiócitos da mistura celulardas células-tronco adultas. Aqui, os cardiomiócitos derivados da medula ós-sea de camundongo foram induzidos usando as células e o método confor-me descrito em W001/048151 (PCT/JP00/09323). Em outras palavras, célu-las CMG são cultivadas em IMDM (meio Dulbecco modificado de Iscove)(GIBCO) suplementado com 20% de soro bovino fetal (a respeito do métodopara estabelecer as células CMG, ver J. Clin. Invest., 1999, Vol. 103, ρ 697 a705) cultivado por mais 24 horas num meio de cultura suplementado comuma concentração final de 3 μηΊθΙ/L de 5-azacitidina (SIGMA), a seguir culti-vadas por 2 a 3 semanas no meio de cultura acima sem 5-azacitidina. Comoresultado, esse método de seleção permite a indução da diferenciação dascélulas em cardiomiócitos de pulsação autonômica. É possível obter os car-diomiócitos pelo cultivo adicional da mistura celular contendo os cardiomióci-tos de pulsação autonômica sob o método de seleção baseado na resistên-cia fisiológica e/ou no método de seleção baseado no metabolismo.

Além disso, durante a preparação dos cardiomiócitos a partir dosfetos de camundongo, os cardiomiócitos podem ser selecionados e purifica-dos a partir do 7Q dia de vida embrionária (o ponto de tempo quando os car-diomiócitos aparecem primeiro; o ponto de tempo corresponde ao dia 16 de-pois da fertilização no caso de seres humanos) pelo seguinte procedimento:isto é, remoção de modo asséptico dos fetos de camundongo, lavagem de-les usando BSS de Hank [sem açúcar] quatro vezes, pipetagem de váriasvezes usando uma pipeta de 10 mL para dispersar os fetos para separar asmassas celulares, cultivo das massas celulares sob o método de seleçãobaseado na resistência fisiológica e/ou no método de seleção baseado emmetabolismo e seleção dos cardiomiócitos.

Deste modo, na presente invenção, a mistura celular contendo acélula de mesoblasto não-diferenciada, os cardiomiócitos programados e oscardiomiócitos usados como origem dos cardiomiócitos é cultivada sob ométodo de seleção baseado na resistência fisiológica e/ou no método deseleção baseado no metabolismo para ganhar massas dos cardiomiócitos,as quais são formadas pela adesão dos cardiomiócitos uns nos outros. En-tretanto, uma vez que as massas preparadas dessa forma dos cardiomióci-tos são cobertas por uma camada dos não-cardiomiócitos mortos, é neces-sário eliminar a camada de não-cardiomiócitos mortos das massas antes detransplantar as massas dos cardiomiócitos. Considerando esse assunto ospresentes inventores estudaram adicionalmente conforme descrito abaixo.

Os presentes inventores descobriram ainda que, quando massascelulares são tratadas com um método de dispersão celular geral (tais comoaqueles usando enzimas proteolíticas aleatórias tais como Trypsin ou agen-tes quelantes de íons, tais como EDTA), as células dispersas perdem signifi-cativamente a viabilidade das células. Conseqüentemente, existe necessi-dade por um novo método para eliminar eficientemente as células mortasaderidas na superfície dos corpos embrióides enquanto se mantém as mas-sas dos cardiomiócitos.

É geralmente considerado que a conjugação célula-célula é al-cançada pela ligação através da matriz extracelular (tal como colágeno, fi-bronectina e elastina) ou pela ligação direta entre as proteínas de membra-na. Os presentes inventores descobriram que a digestão das massas doscardiomiócitos usando colagenase ou elastase (as quais apresentam umaelevada especificidade para as proteínas de matriz) poderiam eliminar efici-entemente os não-cardiomiócitos mortos aderidos na superfície das massascelulares dos cardiomiócitos enquanto mantêm as formas das massas semserem dispersas em células separadas. A partir dos resultados, a adesãocélula-célula entre os cardiomiócitos é formada pela ligação direta através deN-caderina ou conexina.

Na presente invenção, é possível eliminar eficientemente as cé-lulas mortas, por exemplo, somente pela agitação dos corpos embrióides napresença de 0,01 a 0,1% da colagenase tipo III (Wartington) por 20 minutosem banho-maria de 37-C, pela separação das células mortas dos cardiomió-citos, pela repetição da centrifugação e substituição do sobrenadante quatrovezes para remover por lavagem completamente a colagenase e pela obten-ção do produto final.

Entretanto, mesmo depois do tratamento da colagenase, os a-gregados obtidos dessa forma podem possivelmente e indesejavelmenteconter as células mortas dos não-cardiomiócitos. Quanto mais longo é efetu-ada a seleção baseada no metabolismo, mais freqüentemente os agregadoscontendo células mortas podem aparecer. Examinando a densidade de taisagregados contendo células mortas, os presentes inventores descobriramque a densidade e a gravidade específica das células mortas é maior do queaquelas das células vivas e também descobriram que as células vivas po-dem ser separadas das células mortas usando um método de centrifugaçãopor gradiente de densidade adequado. Um agente usado para separar célu-las viáveis das células mortas através do método de centrifugação por gradi-ente de densidade inclui, porém não está limitado, a Percoll® (Pharmacia),Ficoll™ (Pharmacia), Optiprep (GIBCO).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: formação de agregados seletivos de cardiomiócitos pelo culti-vo das células-tronco embrionárias de camundongo sob uma condição su-plementada com pouco soro ou uma condição sem soroEsse Exemplo tem por objetivo estudar o efeito da depleção desoro nas massas celulares contendo os cardiomiócitos (corpos embrióides),mais especificamente o efeito da depleção de soro na seleção dos cardiomi-ócitos das massas celulares (os corpos embrióides), pelo cultivo das massascelulares (os corpos embriódies) no meio de cultura livre de soro.

As células-tronco embrionárias de camundongo (o nome da li-nhagem celular é EB3, Nat. Genet. 2000; 24: 372 a 376) foram gentilmentefornecidas pelo Dr. Hitoshi Niwa de RIKEN, Japão. As células-tronco embri-onárias humanas são cultivadas por um total de 7 dias usando um métodosemelhante ao método existente (Differentiation 2001, 68, p31 a 43), isto é,75 células ES por uma EB foram cultivadas como as massas celulares porum total de 7 dias no meio de cultura [a-MEM (meio mínimo essencial)(SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO), penicilina 100 unidades/mL, estrepto-micina 50 μg/mL (GIBCO)] usando o método de gota suspensa. Depois dadiferenciação nas massas celulares (os corpos embrióides) contendo os car-diomiócitos usando o método acima, os corpos embrióides foram cultivadossem ficarem aderidos na placa de cultura usando o meio de cultura descritoacima por 3 a 5 dias a 37eC em 5% de CO2. O método descrito acima é ométodo de diferenciação de cardiomiócito convencional. Figura 1 mostra aaparência das massas celulares obtidas sob o método convencional acima.Aqui, a Figura 1A mostra a aparência microscópica do corpo embrióide; Fi-gura 1B mostra o esboço da região de existência dos cardiomiócitos no cor-po embrióide, o qual foi detectado pela imunomarcação fluorescente especí-fica usando o anticorpo antiactinina (SIGMA); e Figura 1C mostra o esboçoda região de existência de cardiomiócitos no corpo embrióide, a qual foi i-dentificada pela imunomarcação fluorescente, e foi delineada numa imagemmicroscópica de contraste de fase da Figura 1A. Conforme mostrado no es-quema de um modo de existência dos cardiomiócitos num corpo embrióideaderido (Figura 1D), os cardiomiócitos foram rodeados por outras células efoi difícil de separá-los e purificados do corpo embrióide.

Por outro lado, as células-tronco embrionárias de camundongoforam diferenciadas mas massas celulares (os corpos embrióides) contendoos cardiomiócitos sob a mesma condição, foram cultivadas por 5 dias fican-do aderidas numa placa de cultura e foram, a seguir, cultivadas por mais 3dias no meio de cultura sem soro para as células embrióides contendo oscardiomiócitos.

Os resultados estão apresentados na Figura 2. Aqui, a Figura 2Amostra imagens microscópicas dos corpos embrióides aderidos submetidosà cultura seletiva sob a condição acima, e Figura 2B mostra o esboço daregião de cardiomiócito de pulsação autonômica nos corpos embrióides aqual foi identificada pela análise de vídeo. Conforme mostrado no esquemade um modo de existência dos cardiomiócitos nos corpos embrióides depoisda cultura seletiva (Figura 2C), a população celular dos cardiomiócitos existena região da superfície dos corpos embrióides, onde os cardiomiócitos foramconsiderados como estando agregados uns aos outros.

EXEMPLO 2: Formação dos agregados seletivos de cardiomiócitos progra-mados e formação dos agregados contendo os cardiomiócitos numa altataxa pela cultivo das células-tronco embrionárias de camundongo sob umacondição suplementada com pouco soro ou uma condição sem soro

Esse exemplo visa estudar o efeito da depleção do soro nasmassas celulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomiócitos pro-gramados, mais especificamente o efeito da depleção de soro na seleçãodos cardiomiócitos programados das massas celulares (os corpos embriói-des), pelo cultivo das massas celulares (os corpos embrióides) contendo oscardiomiócitos programados no meio de cultura sem soro.

As células-tronco embrionárias de camundongo foram cultivadaspor 5 dias usando um método padrão descrito no Exemplo 1 no meio de cul-tura [a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO), penicilina/estreptomicina(GIBCO), isto é, 75 células ES por uma EB foram cultivadas como as mas-sas celulares no meio de cultura acima usando o método de gota suspensapor 5 dias a 37-C em 5% de CO2 para formar os corpos embrióides. As célu-las de pulsação autonômica foram observadas nos corpos embrióides em 7dias após o início da cultura de diferenciação das células usando o meio decultura existente (conforme definido no Exemplo 1). A seguir, depois de 5dias a partir do início da cultura de diferenciação das células, o estágioquando quaisquer cardiomiócitos de pulsação autonômica não foram obser-vados, as células foram cultivadas sob a condição sem soro por mais 1 dia(24 horas) (os mesmos resultados são produzidos em ambas as situaçõesquando a cultura se iniciou em 4 dias ou 6 dias a partir do início da culturade diferenciação). Figura 3A mostra a aparência morfológicâ dos corpos em-brióides, os quais forma cultivados na condição suplementada com soronormal por 6 dias, enquanto que a Figura 3B mostra a aparência morfológicâdos corpos embrióides aproximadamente no mesmo estágio que na Figura3A, os quais foram cultivados sob uma condição livre de soro por mais 1 dia(24 horas) no 5Q dia a partir do início do cultivo.

Quando as massas celulares mostradas na Figura 3B, as quaisforam preparadas pelo cultivo sob uma condição sem soro por um dia adi-cional (24 horas) no 5S dia do início do cultivo (isto é, pelos seguintes pas-sos: transferência do meio de cultura contendo os corpos embrióides paraum tubo de centrífuga seguido pela precipitação espontânea, remoção dosobrenadante, lavagem uma vez usando meio de cultura sem soro [a-MEM(SIGMA), insulina/transferrina/selênio (GIBCO) e penicilina/estreptomicina(GIBCO)], e a seguir pela substituição com o mesmo meio de cultura) foramainda cultivadas por mais 1 a 4 dias, as células cultivadas são diferenciadasnas massas celulares contendo cardiomiócitos de pulsação autonômica emalto índice. Conseqüentemente, os resultados demonstram que as massascelulares contendo os cardiomiócitos programados, os quais não pulsamautonomicamente porém são programados para se diferenciar nos cardiomi-ócitos posteriormente, com uma alta proporção podem ser formados pelocultivo das células-tronco embrionárias de camundongo sob uma condiçãosem soro por mais 1 dia (24 horas) no 5g dia a partir do início do cultivo.

EXEMPLO 3: Inibicão seletiva da diferenciação/crescimento das células quenão são cardiomiócitos pelo cultivo de células-tronco embrionárias de ca-mundongo sob uma condição de meio de cultura com pouco cálcio

Esse exemplo visa o estudo do efeito da concentração de cálcioreduzida nas massas celulares (os corpos embrióides) contendo os cardio-miócitos, mais especificamente o efeito da concentração de cálcio reduzidana seleção dos cardiomiócitos das massas celulares (os corpos embrióides)pelo cultivo das massas celulares (os corpos embrióides) no meio de culturasob a concentração de cálcio reduzida.

As células-tronco embrionárias de camundongo foram cultivadaspor um total de 7 dias usando um método padrão descrito no Exemplo 1 nomeio de cultura [a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO), penicili-na/estreptomicina (GIBCO)], isto é, 75 células ES por uma EB foram cultiva-das como amassas celulares no meio de cultura usando o método de gotasuspensa por um total de 7 dias para formar corpos embrióides, os quaisforam, a seguir, diferenciados em massas celulares (os corpos embrióides)contendo os cardiomiócitos. A concentração de cálcio no meio de culturapara a diferenciação do cardiomiócito foi de 1,8 mM. No caso desse métodode cultivo, o conteúdo de cardiomiócitos foi de cerca de 10%, enquanto ou-tras células foram feitas de células não-diferenciadas, das células neuronaise das células epiteliais.

Por outro lado, nesse Exemplo, 75 células ES de camundongopor uma EB foram cultivadas como as massas celulares por 5 dias no meiode cultura [a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO), penicilina/estrepto-micina (GIBCO)] para formar os corpos embrióides usando o método de gotasuspensa, as quais foram a seguir aderidas na placa de cultivo, e adicional-mente cultivadas no mesmo meio de cultura por mais 1 dia (24 horas). A se-guir, 6 dias depois do início da cultura de diferenciação, isto é, 1 dia (24 ho-ras) depois de aderir os corpos embrióides na placa, no grupo de controle,os corpos embrióides foram cultivados em meio de cultura RPMI (concentra-ção de cálcio de 1,8 mM) suplementado com FBS 10% pelo dia 8 de cultivo(Figura 4A), enquanto que no grupo experimental, os corpos embrióides fo-ram cultivados em meio de cultura RPMI (concentração de cálcio de 0,4 mM;GIBCO) suplementado com FBS 10% (Figura 4B). Como resultado, em com-paração com os corpos embrióides não-tratados, no caso dos corpos em-brióides tratados com uma condição com pouco cálcio, o crescimento decélulas de forma plana foi suprimido ao redor da periferia dos corpos embri-óides, ou a diferenciação dos corpos embrióides nas células neuronais foiinibida (Figura 4B).

EXEMPLO 4: Seleção dos cardiomiócitos programados a partir das células-tronco embrionárias de camundongo sob uma condição sem soro/levementeácida

Esse Exemplo visa o estudo do efeito complexo da depleção desoro e uma condição de pH levemente ácida nas massas celulares (os cor-pos embrióides) contendo os cardiomiócitos programados, mais especifica-mente o efeito complexo da depleção de soro e de um pH levemente ácidona seleção dos cardiomiócitos programados das massas celulares (os cor-pos embrióides), pelo cultivo das massas celulares (os corpos embrióides)no meio de cultura sob uma condição sem soro e de um pH levemente ácido.

Nesse Exemplo, 75 células ES de camundongo por uma EB fo-ram cultivadas como as massas celulares por 5 dias a partir do início da dife-renciação no meio de cultura [a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEG BIO),penicilina/estreptomicina (GIBCO)] usando o método de gota suspensa paraformar corpos embrióides, os quais foram, a seguir, diferenciados nas mas-sas celulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomiócitos programa-dos. Nesse Exemplo, 5 dias depois do início da cultura de diferenciação dascélulas, o estágio onde quaisquer cardiomiócitos de pulsação autonômicaainda não foram observados, as células foram ainda cultivadas em MEM(meio essencial mínimo) (GIBCO) suplementado com insuli-na/transferrina/selênio (GIBCO) por mais 1 dia (24 horas) de meio de cultura(os mesmos resultados são produzidos em ambas as situações quando acultura foi iniciada em 4 dias ou 6 dias a partir do início da cultura de diferen-ciação). Uma vez que a condição de pH desse meio de cultura é ajustadapara estar em torno de pH 6,5 sob uma condição de 5% de CO2, as célulasforam cultivadas no meio de cultura levemente ácido sob uma condição de5% de CO2-

A cultura resultou na formação de massas celulares contendo oscardiomiócitos programados sem a pulsação autonômica numa taxa eleva-da. Figura 5A mostra a aparência morfológica do corpo embrióide aderido oqual foi cultivado na condição suplementada com soro normal, Figura 5Bmostra a aparência morfológica do corpo embrióide, o qual foi cultivado por 1dia (24 horas) sob uma condição sem soro, e Figura 5C mostra a aparênciamorfológica do corpo embrióide o qual foi cultivado por 2 dias (48 horas) sobuma condição sem soro, respectivamente. Sob a condição apresentada naFigura 5C, as células adjacentes à superfície do corpo embrióide sofreramseletivamente morte celular, enquanto que as células na parte central docorpo embrióide não sofreram morte celular (Figura 5). Figura 5D mostra oesboço da região dos cardiomiócitos programados baseando-se na análisemostrada na Figura 5C, e também mostra as células mortas indicadas pelassetas.

Os inventores obtiveram dois tipos de massas celulares nesseExemplo: um tipo de massa celular foi selecionada pelo cultivo dos corposembrióides depois de 5 dias a partir de sua formação por mais 24 horas sobuma condição sem soro/de pH levemente ácido; o outro tipo de massa celu-lar foi selecionado pelo cultivo adicional das massas celulares obtidas acimapor mais 3 dias (72 horas). As seções congeladas dessas massas celularesforam preparadas por imunomarcação usando um anticorpo anti-Brachyury(Santacruz) contra a proteína Brachyury (a qual é um marcador de célulasde mesoblasto não-diferenciado) (Figs. 6A a 6D). Como resultado, a propor-ção das células Brachyury positivas cultivadas por 24 hortas sob uma condi-ção sem soro/de pH levemente ácido (Figs. 6B e 6D) foi significativamentemaior em comparação com aquela das células Brachyury positivas cultiva-das por 24 horas no meio de cultura contendo soro suplementado e na con-dição de pH natural (Figs. 6A e 6C). Quase todas as células das massascelulares selecionadas pelo cultivo por mais 3 dias são células Brachyurypositivas (dados não apresentados). As massas celulares cultivadas pormais 3 dias foram imunomarcadas usando um anticorpo contra Nkx2.5 (anti-corpo anti-Nkx2.5 (Santacruz)) (Figs. 6E a 6N). Acredita-se que o marcadorNkx2.5 seja um marcador de desenvolvimento inicial expresso nos cardiomi-ócitos programados e é conhecido por ser continuamente expresso nos car-diomiócitos diferenciados. Figs. 6E a H mostram a aparência morfológicados corpos embrióides (EB), os quais foram preparados pelo cultivo por 24horas no meio de cultura contendo soro e o pH neutro, seguido pelo cultivopor mais 3 dias no mesmo meio de cultura. É mostrado que uma parte dascélulas dentro do EB foi diferenciada nos cardiomiócitos sob essas condi-ções de cultivo. Além disso, a proporção das células diferenciadas nos car-diomiócitos foi similar àquela das células Brachyury positivas (Figs. 6A e6C). Por outro lado, no caso de EBs as quais foram cultivadas por 24 horassob uma condição de pH sem soro/levemente ácida (mostrada nas Figs. 61 aN), a proporção das células diferenciadas nos cardiomiócitos foi consideradacomo sendo tão grande quanto 80% da quantidade total das células, a qualtambém foi semelhante àquela das células Brachyury positivas (Figs. 6B e6D).

As células selecionadas pelo procedimento de 5 dias + 1 dia (24horas) foram positivas para o anticorpo anti-Brachyury, porém foram negati-vas para o anticorpo anti-Nkx2.5 (Figs. 6, linhas O e P). Enquanto isso, asmassas celulares selecionadas pelo procedimento de 5 dias + 1 dia (24 ho-ras) + 3 dias foram negativas para o anticorpo anti-Brachyury, porém forampositivas para o anticorpo anti-Nkx2.5.

Deste modo, as massas celulares contendo os cardiomiócitos depulsação autonômica numa alta taxa foram diferenciados pelo cultivo dessasmassas celulares por mais 1 a 4 dias. Conseqüentemente, as células sele-cionadas pelo procedimento de 5 dias + 1 dia (24 horas) foram confirmadascomo sendo cardiomiócitos programados.

EXEMPLO 5. Seleção dos cardiomiócitos a partir das células-tronco embrio-nárias de camundonqo pelo cultivo sob uma condição sem soro/de pH leve-mente ácido

Esse Exemplo visa o estudo do efeito complexo de uma condi-ção de depleção de soro e de pH levemente ácido nas massas celulares (oscorpos embrióides) contendo os cardiomiócitos, mais especificamente o efei-to complexo de uma depleção de soro e de uma condição de pH levementeácido na seleção dos cardiomiócitos das massas celulares (os corpos embri-óides) pelo cultivo das massas celulares (os corpos embrióides) no meio decultura sem soro sob uma condição de pH levemente ácido.

Nesse Exemplo, 75 células ES de camundongo por uma EB fo-ram cultivadas como as massas celulares por 5 dias a partir do início da dife-renciação no meio de cultura [a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO),penicilina/estreptomicina (GIBCO)] usando o método de gota suspensa paraformar corpos embrióides, os quais foram, a seguir, diferenciados nas mas-sas celulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomiócitos programa-dos. Nesse Exemplo, depois de 5 dias do início da cultura de diferenciaçãodas células, o estágio quando quaisquer cardiomiócitos de pulsação auto-nômica não foram ainda observados, as células foram ainda cultivadas nomeio de cultura MEM sem soro (GIBCO) suplementado com insuli-na/transferrina/selênio (GIBCO) por mais 2 dias (os mesmos resultados sãoproduzidos em ambas as situações quando a cultura foi iniciada em 4 diasou dias a partir do início da cultura de diferenciação). As massas celularesdos cardiomiócitos programados obtidas dessa forma foram ainda cultivadaspor mais 2 dias para se diferenciar nos cardiomiócitos. Figura 7A mostrauma imagem de microscópio da massa de cardiomiócitos preparada dessaforma, e Figura 7B mostra um esquema da aparência lateral do corpo embri-óide da Figura 7A.

Sob a condição acima, as células diferentes dos cardiomiócitossofreram seletivamente morte celular, enquanto que os cardiomiócitos exi-bem uma pulsação forte e autonômica sem sofrer morte celular. Como resul-tado, as massas celulares contendo uma alta proporção de cardiomiócitossão geradas nesse Exemplo (Figura 7A e Figura 7B).

EXEMPLO 6: Seleção dos cardiomiócitos pelo cultivo sob uma condição semaçúcar/sem soro e suplementada com ácido lático e preparação dos cardio-miócitos

Esse exemplo visa o estudo do efeito complexo da depleção desoro e da depleção de açúcar nas massas celulares (os corpos embrióides)contendo os cardiomiócitos, mais especificamente o efeito complexo da de-pleção de soro e da depleção de açúcar na seleção dos cardiomiócitos dasmassas celulares (os corpos embrióides) pelo cultivo das massas celulares(os corpos embrióides) num meio sem açúcar e sem soro.

Nesse exemplo, 75 células ES de camundongo por uma EB co-mo massa celular foram cultivadas por um total de 7 dias no meio de cultura[a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO), penicilina/estreptomicina(GIBCO)] usando o método de gota suspensa para formar corpos embriói-des, os quais foram, a seguir, diferenciados nas massas celulares (os corposembrióides) contendo os cardiomiócitos. Os corpos embrióides cultivadospor 10 dias a partir do início da diferenciação foram lavados de 4 a 5 vezesusando o meio de cultura D-MEM (meio Eagle modificado da Dulbecco)(sem açúcar) (GIBCO) para eliminar completamente açúcares no meio decultura e, a seguir, foram cultivados por 7 dias em meio de cultura D-MEM(GIBCO) suplementado com ácido lático numa concentração final de 1 mM(é necessário medir visualmente a viabilidade dos cardiomiócitos de pulsa-ção autonômica e outras células nas múltiplas vezes de experimentos e paraajustar o período de cultura entre 5 a 10 dias com base na viabilidade). Umavez que a concentração in vivo de ácido lático aumenta até cerca de 4 mMsob a condição fisiológica, a concentração de ácido lático de "1 mM" usadano método desse Exemplo cai dentro da faixa fisiológica.

Conforme mostrado na Figura 8, uma rede celular em forma ar-queada consistindo no cardiomiócito viável foi formada. Em outras palavras,a Figura 8A mostra uma imagem de uma estrutura tipo rede formada peloscardiomiócitos selecionados, e Figura 8B mostra um esquema da vista late-ral do corpo embrióide da Figura 8A.

EXEMPLO 7: Eliminação das células mortas aderidas às massas dos cardi-omiócitos

Uma vez que as massas celulares preparadas no Exemplo 6estavam aderidas pelas células mortas ou pelas proteínas da matriz extrace-lular, é necessário remover as células mortas ou as proteínas da matriz ex-tracelular das massas dos cardiomiócitos para purificar as massas. Entretan-to, foi demonstrado por estudos preliminares que uma enzima que causa aproteólise não-específica (tal como Trypsin) diminui significativamente a via-bilidade dos cardiomiócitos.

Desse modo, este exemplo visa o estudo de uma condição pararemover seletivamente as células mortas ou a proteína da matriz extracelulardas massas contendo os cardiomiócitos.

As massas celulares preparadas no Exemplo 6 (mostrado naFigura 8) foram tratadas com 0,01 a 0,1% de colagenase, a qual digere sele-tivamente o colágeno, uma das proteínas da matriz extracelular a 37-C por20 minutos. Depois do tratamento somente com colagenase, as massas ce-lulares foram lavadas com uma solução isotônica com uma pressão osmóti-ca fisiológica. Nesse estágio, uma vez que os cardiomiócitos formam asmassas celulares (não menos do que 40 μηι de diâmetro), as massas celula-res foram lavadas pela troca de solução através da membrana comercial-mente disponível com poros de 40 μηι de diâmetro, e a seguir as células di-ferentes dos cardiomiócitos dispersas foram seletivamente removidas. Opasso de lavagem foi repetido de 4 a 5 vezes. As massas celulares coleta-das foram cultivadas e, a seguir, foram imunomarcadas usando um anticorpoanti-sarcômero-actinina (SIGMA) como um indicador dos cardiomiócitos(Vermelho: [marcação da fibra estriada-cruzada no citoplasma], azul: [mar-cação dos núcleos com DAPI (sonda molecular)]}.

Como resultado, foi demonstrado que a proporção dos cardiomi-ócitos nas massas purificadas por esse Exemplo contabilizaram 80% daquantidade total das células (Figura 9).

EXEMPLO 8: Purificação dos cardiomiócitos pelo cultivo sob uma condiçãosem soro/levemente ácida/com pouco cálcio/sem açúcar e suplementadacom ácido lático

Esse exemplo visa o estudo do efeito complexo da depleção desoro, uma condição de pH levemente ácido, uma condição com pouco cálcioe a depleção de açúcar nas massas celulares (os corpos embrióides) con-tendo os cardiomiócitos, mais especificamente o efeito complexo da deple-ção de soro, uma condição de pH levemente ácido, uma condição com pou-co cálcio e depleção de açúcar na seleção dos cardiomiócitos das massascelulares (os corpos embrióides) pelo cultivo das massas celulares (os cor-pos embrióides) no meio de cultura sob uma condição sem soro, levementeácida, sem cálcio e sem açúcar.

Nesse Exemplo, 75 células ES de camundongo por urría EB fo-ram cultivadas como as massas celulares por 5 dias a partir do início da dife-renciação no meio de cultura [a-MEM (SIGMA), FBS 10% (EQUITEC BIO),penicilina/estreptomicina (GIBGO)] usando o método de gota suspensa paraformar corpos embrióides, os quais foram a seguir diferenciados em massascelulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomiócitos programados.

Nesse Exemplo, depois de 5 dias a partir do início da cultura de diferencia-ção das células, o estágio quando quaisquer cardiomiócitos de pulsação au-tonômica não foram ainda observados, as células foram ainda cultivadas nomeio de cultura MEM em soro (GIBCO) suplementado com insuli-na/transferrina/selênio (GIBCO) por mais 2 dias (os mesmos resultados sãoproduzidos em ambas as situações quando a cultura foi iniciada em 4 diasou em 6 dias a partir do início da cultura de diferenciação). As massas doscardiomiócitos programados obtidas dessa forma foram cultivadas por mais2 dias para se diferenciarem nos cardiomiócitos. Nesse estágio, as massascelulares contendo os cardiomiócitos numa alta taxa foram geradas.

A seguir, as massas celulares foram lavadas de 4 a 5 vezes u-sando meio de cultura D-MEM (sem açúcar) (GIBCO) para eliminar comple-tamente açúcares do meio de cultura, e a seguir foram cultivadas por 7 diasem meio de cultura D-MEM (GIBCO) suplementado com ácido lático numaconcentração final de 1 mM (é necessário medir visualmente a viabilidadedos cardiomiócitos de pulsação autonômica e outras células nos múltiplostempos do experimento e ajustar o período de cultura entre 5 a 10 dias combase na viabilidade). Conforme mostrado na Figura 10, as massas dos car-diomiócitos consistindo somente do cardiomiócito viável foram formadas.

As massas celulares foram tratadas com 0,01 a 0,1% de colage-nase, a qual digere seletivamente o colágeno, uma das proteínas da matrizextracelular, a 37eC por 20 minutos. Depois do tratamento com colagenase,as massas celulares foram lavadas usando o tampão com uma pressão os-mótica fisiológica (NaCI 116 mM, Hepes 20 mM, NaH2PO4 12,5 mM, glicose5,6 mM, KCI 5,4 mM, MgSO4 0,8 mM, pH 7,35). As massas celulares foramlavadas de 4 a 5 vezes por troca de solução através da membrana comerci-almente disponível com poros de 40 μιτι de diâmetro. Como resultado, asmassas celulares consistindo somente dos cardiomiócitos e agregados dealta densidade consistindo em células mortas foram coletadas (Figura 10A).A Fig 10C mostra uma imagem aumentada da região retangular emolduradana Figura 10A. Além disso, a localização das células mortas nas Figs. 10A e10C estão mostradas nas Figs. 10B e 10D, respectivamente.

Foi demonstrado nesse Exemplo que os agregados de alta den-sidade consistindo nas células mortas mostradas na Figura 10 poderiam serseletivamente removidos usando uma centrifugação por gradiente de densi-dade apropriada, mais especificamente usando a centrifugação por gradien-te de densidade com 58,5% de Percoll® (Pharmacia) (Figura 11). A seguir,as massas celulares obtidas dessa forma foram cultivadas e imunomarcadasusando o anticorpo anti-sarcômero-Actinina e um anticorpo anti-GATA4(Santacruz) como um indicador dos cardiomiócitos. Figura 12A mostra mas-sas aderidas dos cardiomiócitos. Houve algumas células mortas suspensasem torno da periferia das massas aderidas, enquanto não foi observado ne-nhum não-cardiomiócito aderido. Figura 12B mostra imagens fluorescentesdesenvolvidas por imunomarcação das massas celulares da Figura 12A comsarcômero-actinina (vermelho; citoplasma) e DAPI (Molecular probe) (Azul;núcleos). Figura 12C mostra imagens fluorescentes desenvolvidas por imu-nomarcação das massas celulares da Figura 12A com GATA4 (vermelho;núcleos) e DAPI (azul; núcleos). Os núcleos co-marcados apresentam corpúrpura. Como resultado, foi demonstrado que a proporção dos cardiomióci-tos nas massas purificadas por esse Exemplo formaram 99,0% da quantida-de total das células (Figura 12C).

EXEMPLO 9: Purificação dos cardiomiócitos pelo cultivo sob uma condiçãosem soro/levemente ácida/com pouco cálcio/sem açúcar e suplementadacom ácido aspártico/ácido qlutâmico

Esse Exemplo visa estudar o efeito de compensação de um áci-do aspártico/ácido glutâmico nas massas celulares (os corpos embrióides)contendo os cardiomiócitos, mais especificamente o efeito de compensaçãode um ácido aspártico/ácido glutâmico na seleção dos cardiomiócitos dasmassas celulares (os corpos embrióides) pelo cultivo das massas celulares(os corpos embrióides) no meio de cultura suplementado com ácido aspárti-co/ácido glutâmico sob uma condição sem soro, levemente ácida, sem cálcioe sem açúcar.

Nesse Exemplo, 75 células ES de camundongo por uma EB fo-ram cultivadas como as massas celulares por 5 dias a partir do início da dife-renciação no meio de cultura [a-MEM (SIGMA) FBS 10% (EQUITEC BIO)penicilina/estreptomicina (GIBCO)] usando o método de gota suspensa paraformar corpos embrióides, as quais foram então diferenciadas nas massascelulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomiócitos programados.

Nesse Exemplo, depois de 5 dias a partir do início da cultura de diferencia-ção das células, o estágio quando quaisquer cardiomiócitos pulsáteis auto-nomicamente ainda não haviam sido observados, as células foram cultiva-das no meio de cultura sob uma condição sem soro, com pH levemente áci-do com pouco cálcio por 3 dias (os mesmos resultados são produzidos emambas as situações quando a cultura se iniciou em 4 dias ou 6 dias a partirdo início da cultura dê diferenciação). Nesse estágio, as massas celularesgeradas continham os cardiomiócitos numa taxa extremamente alta. A se-guir, as massas celulares foram lavadas de 4 a 5 vezes usando meio de cul-tura D-MEM (sem açúcar) (GIBCO) para eliminar totalmente açúcares nomeio de cultura pela troca de solução através da membrana comercialmentedisponível com poros de 40 μηι de diâmetro. Finalmente, as massas celula-res foram cultivadas por 5 dias em meio de cultura DMEM (sem açúcar) su-plementado com 20 mg/L de ácido glutâmico (SIGMA) e 20 mg/L de ácidoaspártico (SIGMA) (é necessário medir visualmente a viabilidade dos cardi-omiócitos de pulsação autonômica e outras células nos vários tempos deexperimentos e ajustar o período de cultura entre 3 a 10 dias com base naviabilidade). Como resultado, as massas formadas dos cardiomiócitos con-sistiram somente dos cardiomiócitos. As massas celulares foram tratadas,durante a agitação, a 37QC em banho-maria por 20 minutos, com 0,03% decolagenase, a qual digeriu seletivamente o colágeno, uma das proteínas damatriz extracelular. Depois do tratamento com colagenase, as massas celu-lares foram lavadas com uma solução isotônica com uma pressão osmóticafisiológica (NaCI 116 mM, Hepes 20 mM, NaH2PO4 12,5 mM, glicose 5,6mM, KCI 5,4 mM, MgSO4 0,8 mM, pH 7,35). As massas celulares foram la-vadas de 4 a 5 vezes por troca de solução através da membrana comercial-mente disponível com poros de 40 μιτι de diâmetro. Como resultado, asmassas celulares coletadas consistiam somente dos cardiomiócitos. Asmassas celulares obtidas dessa forma foram cultivadas e imunomarcadasusando o anticorpo anti-sarcômero-actinina e o anticorpo anti-GATA4 comoindicadores dos cardiomiócitos (Figura 13).

Além disso, as células foram submetidas à análise estatística, naqual os presentes dados foram comparados com os dados conhecidos (Figu-ra 13). Figura 13A mostra imagens microscópicas de colônias dos cardiomi-ócitos de pulsação autonômica, e a Figura 13B mostra imagens de man-chamento com sarcômero-actinina (vermelho; citoplasma), marcação comGATA-4 (verde; núcleos) e marcação com DAPI (azul; núcleos) para as co-lônias dos cardiomiócitos de pulsação autonômica.

Como resultado, foi demonstrado que a proporção dos cardiomi-ócitos nas massas purificadas por esse Exemplo compunham 99,8% daquantidade total das células. É demonstrado que esse grau de purificação foimais alto do que os graus apresentados por quaisquer outros métodos parapurificar os cardiomiócitos (por exemplo, FASEB J. 2000; 14: 2540 a 2548; JClin Invest. 1996; 98: 216 - 224; FASEB J. 2003; 17: 740 742; J Mol CellCardiol. 2003; 35: 1461 - 1472). Conseqüentemente, o método desse E-xemplo permite a purificação dos cardiomiócitos num alto grau de purificaçãoe com um alto rendimento (Tabela 1).

Tabela 1

Tabela 1: Comparação da pureza e do rendimento entre o méto-do da presente invenção e um método promotor-MHC/neo.Field et al. (J. Clin. Invest. 1996; Vol. 98, 216 - 224)<table>table see original document page 38</column></row><table>

Exemplo 10. Purificação dos cardiomiócitos produzidos a partir de células-tronco adultas derivadas da medula óssea de camundongo

Esse Exemplo visa à produção dos cardiomiócitos a partir decélulas-tronco adultas derivadas da medula óssea de camundongo, chama-das de células-tronco mesenquimais, as quais são a seguir selecionadas epurificadas.

Os cardiomiócitos diferenciados das células-tronco adultas deri-vadas da medula óssea de camundongo (camundongos C3H/He fêmeas)foram induzidos usando as células e o método descrito em W00t/048151.

Em outras palavras, as células CMG foram cultivadas no meio de cultura deIMDM (Meio Dulbecco Modificado de Iscove) (GIBCO) suplementado com20% de soro bovino fetal (em relação ao método para estabelecer célulasCMG, ver J Clin Invest, Março de 1999, Vol. 103, ρ 697 - 705), cultivadaspor mais 24 horas num meio de cultura suplementado com uma concentra-ção final de 3 μιτιοΙ/Ι_ de 5-azacitidina (SIGMA), a seguir cultivadas por 2 a 3semanas no meio de cultura acima sem 5-azacitidina, resultando na induçãoda diferenciação dos cardiomiócitos. Depois da confirmação dos cardiomióci-tos de pulsação autonômica, as células são cultivadas por 5 dias em meio decultura D-MEM (GIBCO) suplementado com 1 mM de ácido lático sob umacondição sem soro/com pH levemente ácido/com pouco cálcio/sem açúcar.

Depois do período de cultivo, as células mortas foram removidas e as célu-las viáveis remanescentes foram imunomarcadas usando o anticorpo anti-sarcômero-actinina como um indicador dos cardiomiócitos.

Figura 14A mostra a aparência das células cultivadas antes daseleção. Na Figura 14A, a região contendo as células pulsáteis estão apre-sentadas pela linha pontilhada. As Figs. 14B - C mostram as células sele-cionadas. Figura 14B mostra uma imagem de microscópio de contraste defase, e a Figura 14C mostra uma imagem fluorescente imunomarcada parasarcômero-actinina para o mesmo campo de visão da Figura 14B, respecti-vamente. Como resultado, foi demonstrado que a proporção dos cardiomió-citos nas massas produzidas por esse Exemplo responderam por cerca de90% da quantidade total das células (Figura 14).

EXEMPLO 11. Purificação dos cardiomiócitos derivados de fetos de camundonqo

Esse Exemplo visa à purificação dos cardiomiócitos a partir defetos de camundongos.

Primeiro, o embrião de camundongo no 7- ao 9Õ dia de vida em-brionária foi removido do útero materno, a partir do qual o tecido extra-embrionário foi cuidadosamente retirado, a seguir pipetado para dispersar osfetos em massas celulares separadas. As massas celulares obtidas dessaforma foram cultivadas por 5 dias no meio de cultura suplementado com 0,5mM de ácido lático sob uma condição sem soro/de pH levemente ácido/compouco cálcio/sem açúcar (é necessário medir visualmente a viabilidade doscardiomiócitos de pulsação autonômica e outras células nos vários temposdos experimentos e ajustar o período de cultura entre 3 a 10 dias com basena viabilidade). O meio de cultura usado foi preparado pela mistura de BSSde Hank [sem açúcar]: RPMI [sem açúcar] = 9:1. Os cardiomiócitos purifica-dos foram submetidos à cultura de adesão, e depois do cultivo, as célulasmortas foram removidas e s células viáveis remanescentes foram imuno-marcadas para sarcômero-actinina (verde; citoplasma) como indicador doscardiomiócitos, e DAPI (vermelho; núcleos).

Figura 15A mostra imagens microscópicas de contraste de fasede duas colônias apresentando a população celular pulsátil. Figura 15B mos-tra imagens fundidas de marcação com sarcômero-actinina e marcação comDAPI para quatro colônias. Como resultado, foi demonstrado que a propor-ção dos cardiomiócitos nas massas produzidas por esse Exemplo corres-pondiam a cerca de 99% da quantidade total das células (Figura 15).

EXEMPLO 12: Purificação dos cardiomiócitos sob uma condição sem so-ro/levemente ácida/com pouco cálcio/sem açúcar e suplementada com ácidopirúvico

Esse Exemplo visa o estudo do efeito de compensação do ácidopirúvico nas massas celulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomi-ócitos, mais especificamente o efeito de compensação de um ácido pirúvicona seleção dos cardiomiócitos das massas celulares (os corpos embrióides)pelo cultivo das massas celulares (os corpos embrióides) no meio de culturasuplementado com ácido pirúvico sob uma condição sem soro, de pH leve-mente ácido, sem cálcio e sem açúcar.

Nesse Exemplo, 75 células ES de camundongo por um EB fo-ram cultivadas como as massas celulares por 5 dias a partir do início da dife-renciação no meio de cultura [a-MEM (SIGMA) FBS 10% (EQUITEC BIO)penicilina/estreptomicina (GIBCO)] usando o método de gota suspensa paraformar corpos embrióides, as quais foram a seguir diferenciadas nas massascelulares (os corpos embrióides) contendo os cardiomiócitos programados.

Nesse Exemplo, depois de 5 dias a partir do início da cultura de diferencia-ção das células, o estágio quando quaisquer cardiomiócitos de pulsação au-tonômica não foram ainda observados, as células foram cultivadas por mais2 dias no meio de cultura num meio de cultura MEM sem soro (GIBCO) su-plementado com insulina/transferrina/selênio (GIBCO) (os mesmos resulta-dos são produzidos em ambas as situações quando a cultura foi iniciada em4 dias ou 6 dias a partir do início da cultura de diferenciação). As massasdos cardiomiócitos programados obtidas dessa forma foram cultivadas pormais 2 dias para se diferenciar nos cardiomiócitos. Nesse estágio, as mas-sas celulares geradas continham s cardiomiócitos numa proporção extre-mamente alta. A seguir, as massas celulares foram lavadas de 4 a 5 vezesusando meio de cultura D-MEM (sem açúcar) (GIBCO) para eliminar comple-tamente os açúcares no meio de cultura pela troca de solução através damembrana comercialmente disponível com poros de 40 μηι de diâmetro.Depois do passo de lavagem, as massas celulares foram cultivadas por 5dias em meio de cultura D-MEM (sem açúcar) (GIBCO) suplementado comuma concentração final de 1 mM de ácido pirúvico.

As massas celulares foram, a seguir, tratadas, durante a agita-ção, com 0,05% de colagenase Tipo 3 (Worthington Biochemical Corp) aqual seletivamente digere o colágeno, uma das proteínas da matriz extrace-lular, a 37eC por 20 minutos. Depois do tratamento com colagenase, asmassas celulares foram lavadas com uma solução isotônica com pressãoosmótica fisiológica (NaCI 116 mM, Hepes 20 mM, NaH2PO4 12,5 mM, glico-se 5,6 mM, KCI 5,4 mM, MgSO4 0,8 mM, pH 7,35). Como resultado, foi de-monstrado que a proporção das células pulsáteis autonômicas nas massaspurificadas por esse Exemplo correspondiam a mais de 90% da quantidadetotal das células (Figura 16).

EXEMPLO 13: Seleção e purificação dos cardiomiócitos derivados das célu-las-tronco embrionárias de sagüi primata sob uma condição sem açúcar/semsoro e suplementada com ácido lático

Esse exemplo visa estudar o efeito complexo da depleção desoro e da depleção de açúcar nas massas celulares (os corpos embrióides)contendo os cardiomiócitos, mais especificamente o efeito complexo da de-pleção de soro e da depleção de açúcar na seleção dos cardiomiócitos dasmassas celulares (os corpos embrióides) derivados das céíulas-tronco em-brionárias de sagüi primatas pelo cultivo das massas celulares (os corposembrióides) no meio de cultura sem soro e sem açúcar.

As células-tronco embrionárias de sagüi são disponíveis do Cen-tral Institute For Experimental Animais (Kawasaki, Japão). As células-troncoembrionárias de sagüi foram cultivadas durante a manutenção do estadonão-diferenciado usando os fibroblastos embrionários de camundongo inati-vados (MEF), os quais foram tratados com um tratamento com mitomicina C.

O meio de cultura [KO-DMEM (GIBCO), KO-SERUM 20% (GIBCO), L-glutamina 1,6 mM, aminoácidos não-essenciais 0,1 mM (MEM), β-mercaptoetanol 0,2 mM (2-ME; Sigma), penicilina 100 UI/mL, sulfato de es-treptomicina 100 μρΛηΙ. e 8 mg/mL de um fator inibitório de leucemia huma-no recombinante (LIF; Chemicon), um fator de crescimento de fibroblastobásico humano recombinante (bFGF; Peprotech)] foi usado. Na passagem,colagenase tipo Ill 0,1% (Wortington) foi usada a 379C por 10 minutos paraseparar as colônias de ES.

Subseqüentemente, para separar MEF e ES um do outro, a solu-ção foi passada através de uma malha com poros de 100 μττι de diâmetro,deste modo foram obtidas as massas as quais não podem passar pela malhacom poros de 40 μηι de diâmetro. Essas massas celulares são exatamente asmassas purificadas de células ES. Na diferenciação, as massas celulares con-tendo 50 a 1.000 das células ES por uma EB foram cultivadas como um corpoembrióide por um total de 15 a 30 dias usando o método de placa bacteriana,a seguir para diferenciar nos corpos embrióides contendo os cardiomiócitos. Omeio de cultura usado para a diferenciação foi o mesmo que o meio de culturadescrito no presente Exemplo, exceto para o bFGF [isto é, KO-DMEM (GIB-CO), KO-SERUM 20% (GIBCO), L-glutamina 1,6 mM, aminoácidos não-essenciais 0,1 mM (MEM), β-mercaptoetanol 0,2 mM (2-ME; Sigma), penicili-na 100 UI/mL, sulfato de estreptomicina 100 μg/mL e 8 ng/mL de um fator ini-bitório de leucemia humana recombinante (LIF; Chemicon)].

Para eliminar os açúcares o tanto quanto for possível do meio decultura, os corpos embrióides foram transferidos para um tubo de centrífuga,foram lavados cinco vezes com meio de cultura D-MEM (sem açúcar) (GIB-CO) e foram finalmente cultivados por 15 dias em meio de cultura D-MEM(sem açúcar) GIBCO suplementado com 1 mM de ácido lático. Uma vez q ea concentração in vivo do ácido lático aumenta até cerca de 4 mM sob acondição fisiológica, a concentração do ácido lático de "1 mM" usada no mé-todo desse Exemplo fica dentro da faixa fisiológica.

A aparência das massas celulares depois do cultivo por 15 diasestá mostrada na Figura 17. Conforme mostrado na Figura 17, foi demons-trado a partir desse resultado que a estrutura tipo bolha formada das célulasconsistia dos cardiomiócitos como células viáveis. Em outras palavras, Figs.17A a C mostram que os cardiomiócitos formando a estrutura tipo bolha fo-ram seletivamente viáveis no meio de cultura sob uma condição de suple-mento sem açúcar + ácido lático (1 mM). Figura 17A mostra que uma partede ou todos os corpos embrióides com transparência ótica grandemente re-duzida já sofreram morte celular. Também nos casos dos corpos embrióidesmostrados na Figura 17B e na Figura 17B', as células com a estrutura tipobolha na superfície do corpo embrióide foram viáveis. Figura 17G é uma vis-ta amplificada da Figura 17B.

Os corpos embrióides obtidos dessa forma foram cultivados por 3a 7 dias no mesmo volume do mesmo meio de cultura (sem bFGF). Os cardi-omiócitos viáveis reiniciaram a pulsação autonômica. Depois de alcançar oestado estabilizado, as células mortas foram separadas dos cardiomiócitospela agitação dos corpos embrióides na presença da colagenase tipo Ill 0,1%(Wortington) por 10 minutos a 375C. As células mortas foram eliminadas pelométodo revelado no Exemplo 8. Os corpos embrióides obtidos dessa formaforam aderidos numa placa de cultura de células revestida com fibronectina(Sigma) (Figura 18, esquerda). Depois da fixação com 4% de paraformaldeí-do, os corpos embrióides foram marcados com o anticorpo antiactinina (Sig-ma) como no Exemplo 8 e foram marcados com o anticorpo anti-Nkx2.5 (San-tacruz) como no Exemplo 4 (Figura 18, à direita, respectivamente).

Como resultado, foi demonstrado que os cardiomiócitos foramseletivamente obtidos pelo cultivo das células-tronco embrionárias de sagüisob uma condição sem açúcar/sem soro e suplementada com ácido lático.

EXEMPLO 14. Transplante dos cardiomiócitos derivados de células-troncoembrionárias de sagüi primatas no coração de um camundonqo imunodefici-ente e confirmação do seu enxerto

Esse Exemplo visa estudar o transplante dos cardiomiócitos de-rivados das células-tronco embrionárias de sagüi primatas no coração e en-xerto no corpo.

Os cardiomiócitos de sagüi purificados preparados pelo métododo Exemplo 13 foram suspensos numa solução tamponante com pressãoosmótica fisiológica (NaCI 116 mM, Hepes 20 mM, NaH2PO4 12,5 mM, glico-se 5,6 mM, KCI 5,4 mM, MgSO4 0,8 mM, pH 7,35) suplementada com cola-genase tipo Ill 0,2% (Wortington) e Trypsín 0,125% (GIBCO). A solução su-plementada foi tratada, durante a agitação, por 20 minutos a 37QC numa se-ringa acoplada com uma agulha de medida 29 (Terumo). Cerca de 1 a 30pequenas massas celulares consistindo nos cardiomiócitos foram prepara-das para uso para o transplante. 100 μΙ_ do tampão acima com concentraçãode sal fisiológica contendo os cardiomiócitos foram aspirados.

Um camundongo NOD-SCID macho de 7 semanas de idade,camundongos imunodeficientes (Clea Japan, Inc.) foram anestesiados porinalação do anestésico FORANE (isoflurano) (Abbott Japão). A seguir, o tó-rax do camundongo foi aberto sob controle de respiração de um respiradorartificial usando intubação intra-traqueal. Uma agulha de injeção foi inseridana parede do coração exteriorizada na direção do ápice cardíaco para a ba-se cardíaca, e a seguir cerca de 30 μΙ_ da solução suspensa por sítio foi inje-tada na parede do tecido cardíaco. A seguir o tórax do camundongo foi fe-chado, a anestesia terminou e o camundongo continuou sustentado.

Depois de 15 dias do transplante, o coração do camundongo foiextirpado sob anestesia, o qual foi fixado em paraformaldeído 4%. Seçõescongeladas de 10 μηι de espessura foram preparadas e imunomarcadasusando um anticorpo anti-Nkx2.5 de cabra (Santacruz) como anticorpo pri-mário e um anticorpo anti-cabra de macaco Alexa 488 (desenvolvido emverde) (Molecular probes) como o segundo anticorpo (Figura 19B), ou imu-nomarcadas usando um anticorpo anti-sarcômero-actinina de camundongo(Sigma) como um anticorpo primário e um anticorpo anti-camundongo decoelho - Alexa 594 (desenvolvido em vermelho) (Molecular probes) como osegundo anticorpo (Figura 19D).

Por outro lado, um anticorpo de antígeno anti-humano nuclearde camundongo (o qual reage com qualquer antígeno nuclear em toda a es-pécie de primata) (Chemicon) e um anticorpo anti-camundongo de cabra -Alexa 633 (Molecular probes) reagem juntos in vitro para formar um comple-xo. Depois um soro de camundongo normal foi usado para inibir a reativida-de do excesso de anticorpo anti-camundongo de cabra - Alexa 633 (infra-vermelho). O complexo de anticorpo preparado dessa forma reagiu com asseções congeladas acima para desenvolver três cores (Figs. 19B a 19D).

Todas as imagens de imunomarcação foram tomadas usandoum microscópio confocal (Carl Zeiss). Os resultados estão mostrados naFigura 19.

Como resultado, foi demonstrado que as células com um núcleomaior mostradas na figura foram derivadas de sagüi. Em outras palavras, foidemonstrado nessa figura que algumas células primatas expressandoNkx2.5, um marcador indicador específico para os cardiomiócitos, foram vis-tas nos cardiomiócitos marcados com Actinina. Isso significa que os cardio-miócitos derivados de células ES de sagüis foram enxertadas com sucessono coração do camundongo.

EXEMPLO 15: Seleção e preparação dos cardiomiócitos derivados de célu-las-tronco embrionárias humanas sob uma condição sem açúcar/sem soro esuplementada com ácido lático

Esse exemplo visa o estudo do efeito complexo da depleção desoro e da depleção de açúcar nas massas celulares (os corpos embrióides)contendo os cardiomiócitos, mais especificamente o efeito complexo da de-pleção de soro e da depleção de açúcar na seleção dos cardiomiócitos dasmassas celulares (os corpos embrióides) derivados de células-tronco embri-onárias humanas, pelo cultivo das massas celulares (os corpos embrióides)num meio de cultura sem soro e sem açúcar.

Células-tronco embrióides humanas foram obtidas do Centro dePesquisa de Células-tronco (Stem Cell Research Center) (Institute for Fron-tier medicai Sciences, Universidade de Kyoto) (o Centro para as células ESbaseado no Projeto de Biorrecursos Nacional (National Bioresource Pro-ject)). As células-tronco embrionárias humanas foram cultivadas durante amanutenção do estado não-diferenciado usando os fibroblastos embrionáriosde camundongo inativados de crescimento (MEF), os quais foram tratadoscom um tratamento com mitomicina C. A cultura foi conduzida usando ummeio de cultura [F12/DMEM (1:1) (SIGMA, número do produto D6421), KO-SERUM 20% (GIBCO), L-glutamina 1,6 mM, aminoácidos não-essenciais 0,1mM (MEM), β-mercaptoetanol 0,1 mM (2-ME; Sigma), penicilina 100 UI/mL,sulfato de estreptomicina 100 μς/ιτιί e um fator de crescimento de fibroblas-to básico humano recombinante (bFGF, Peprotech)]. Na passagem, colage-nase tipo Ill 0,1% (Wortington) foi usada a 37QC por 10 minutos para separaras colônias de ES.

Subseqüentemente, para separar MEF e ES um do outro, a so-lução foi passada através e uma malha com poros de 40 μηπ, deste modoobtendo massas celulares as quais poderiam não passar através da malhacom poros de 40 μιτι de diâmetro. Essas massas celulares foram massaspurificadas de célula ES. Na diferenciação, as massas celulares contendo de50 a 1.000 células ES por uma EB foram cultivadas como um corpo embriói-de por um total de 15 a 30 dias usando o método da placa bacteriana (usan-do o meio de cultura descrito acima, exceto pela ausência de bFGF), a se-guir para diferenciar nos corpos embrióides contendo os cardiomiócitos. Pa-ra eliminar os açúcares o quanto antes possível do meio de cultura, os cor-pos embrióides foram transferidos para um tubo de centrífuga, foram lavadoscinco vezes com meio de cultura D-MEM (sem açúcar) (GIBCO, número deproduto 11966) e foram finalmente cultivados por 15 dias em meio de culturaD-MEM (sem açúcar) (GIBCO, número de produto 11966) suplementadocom 1 mM de ácido lático. Uma vez que a concentração in vivo de ácido láti-co aumenta até cerca de 4 mM sob as condições fisiológicas, a concentra-ção de ácido lático de "1 mM" usada no método desse Exemplos fica dentroda faixa fisiológica.

As aparências das massas celulares cultivadas sob uma condi-ção contendo açúcar (condição de controle) e as massas celulares cultiva-das por 15 dias sob uma condição sem açúcar para a seleção de cardiomió-citos (condição seletiva de cardiomiócitos) estão mostradas na Figura 20,painel esquerdo, como imagens de contraste de fase. Para demonstrar seessas células são viáveis ou não, as células foram marcadas com TMRM(Molecular Probes), as quais podem detectar o potencial de membrana (umindicador de células viáveis) e gerar fluorescência dependendo do potencialde membrana (Figura 20, painel direito). Conforme mostrado na Figura 20,painel superior, todas as células embrióides do grupo da condição contendoaçúcar (controle) geraram fluorescência (isto é, todos os corpos embrióidessão compostos de células viáveis); enquanto isso, conforme mostrado naFigura 20, painel inferior, as massas celulares as quais não geram fluores-cência (isto é, as massas celulares consistindo em células mortas) aparece-ram pelo cultivo sob a condição sem açúcar (seleção de cardiomiócitos). A-lém disso, todas as massas celulares as quais foram viáveis sob a condiçãosem açúcar (seleção de cardiomiócitos) apresentaram pulsação autonômica.

Os corpos embrióides obtidos dessa forma foram cultivados por3 a 7 dias no mesmo volume do mesmo meio de cultura (sem bFGF). Oscardiomiócitos viáveis reiniciaram a pulsação autonômica. Depois de alcan-çar o estado estabilizado, as células mortas foram separadas dos cardiomió-citos pela agitação das células embrióides na presença de colagenase tipoIll 0,1% (Wortington) por 10 minutos a 37eC. As células mortas foram elimi-nadas pelo método revelado no Exemplo 8. A seguir, os corpos embrióidesforam aderidos numa placa de cultura revestida com fibronectina (Sigma).

Depois da fixação com 4% de paraformaldeído, os corpos em-brióides foram marcados com o anticorpo antiactinina (Sigma) como no E-xemplo 8 e foram marcados com o anticorpo anti-Nkx2.5 (Santacruz) comono Exemplo 4 (Figura 21). Conforme mostrado nessa figura, os núcleos celu-lares marcados com DAPI (Figura 21a) foram necessariamente sobrepostoscom os núcleos celulares imunomarcados com o anticorpo anti-Nkx2.5, ummarcador indicador específico para os cardiomiócitos (Figura 21c). Quandonuma imagem imunomarcada com o anticorpo antiactinina, outro marcadorindicador específico para os cardiomiócitos (Figura 21 d) foi fundido com umaimagem imunomarcada com o anticorpo anti-Nkx2.5, foi descoberto que ascélulas imunomarcadas com o anticorpo anti-Nkx2.5 foram completamentesobrepostas com as células imunomarcadas com o anticorpo antiactinina(Figura 21 e).

É claramente demonstrado a partir desse resultado que, quandocélulas-tronco embrionárias humanas são purificadas pelo cultivo sob umacondição de cultura sem açúcar/sem soro e suplementada com ácido lático,os cardiomiócitos podem ser seletivamente coletados.

Claims

1. Método para selecionar cardiomiócitos a partir de uma misturade células contendo cardiomiócitos e não-cardiomiócitos derivados de célu-las-tronco embrionárias, células-tronco adultas ou fetos, em que a referidamistura de células é cultivada no meio de cultura sob as seguintes condições:(i) uma condição suplementada com pouca glicose; e(ii) uma ou mais condições selecionadas do grupo consistindoem uma condição com pouco cálcio, uma condição pouco nutricional, umacondição suplementada com ácido lático, uma condição suplementada comácido aspártico/ácido glutâmico e urria condição suplementada com ácidopirúvico.

2. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com a rei-vindicação 1, compreendendo ainda a etapa de eliminar células mortas ade-ridas aos cardiomiócitos usando colagenase.

3. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com a rei-vindicação 2, em que as células mortas são eliminadas baseando-se no fatode que o peso específico das células mortas é maior do que o dos cardiomi-ócitos.

4. Método de seleção de cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 3, em que a condição (ii) do meio decultura é uma condição suplementada com ácido láctico.

5. Método de seleção de cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 3, em que a condição (ii) do meio decultura é uma condição suplementada com ácido aspártico/ácido glutâmico.

6. Método de seleção de cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 3, em que a condição (ii) do meio decultura é uma condição suplementada com ácido pirúvico.

7. Método de seleção de cardiomiócitos, de acordo com a reivin-dicação 1, em que a mistura celular é preparada pelos seguintes passos de:induzir a diferenciação das células-tronco embrionárias;formar corpos embrionários compreendendo cardiomiócitos pro-gramados (células do mesoblasto não-diferenciadas);preparar a mistura celular pelo cultivo dos corpos embrióides nomeio de cultura sob uma condição suplementada com pouco soro e/ou umacondição de pH brandamente ácida.

8. Método de seleção de cardiomiócitos derivado das células-tronco embrionárias, em que os cardiomiócitos são selecionados seguindoas etapas de:induzir a diferenciação das células-tronco embrionárias paraformar corpos embrióides compreendendo células do mesoblasto não-diferenciadas;a seguir preparar uma mistura celular compreendendo cardiomi-ócitos programados pelo cultivo dos corpos embrióides no meio de culturasob uma condição suplementada com pouco soro e/ou uma condição de pHbrandamente ácida; econtinuar a cultura da mistura celular no mesmo meio de culturapara obter os cardiomiócitos.

9. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a condição suplementadacom pouca glicose é uma condição sem açúcar, ou uma condição em que oconteúdo de açúcar é reduzido até menos de 1% em comparação com acondição de açúcar do meio de cultura usado para indução de diferenciação.

10. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a condição de pouco cálcio éuma condição em que a concentração de cálcio no meio de cultura varia de-0,3 a 1,3 mM.

11. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a condição pouco nutricionalé uma condição em que, ao usar um meio de cultura selecionado do grupoconsistindo em meio de cultura RPMI, meio de cultura DMEM, meio de cultu-ra MEM, meio de cultura F12 e meio de cultura MEM como meio de cultura,os conteúdos de cada componente nutricional incluído no meio de culturasão reduzidos até 10% ou menos em comparação com os conteúdos de ca-da componente nutricional originalmente incluído nesses meios de cultura.

12. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a condição suplementadacom ácido làtico é uma condição em que de 0,1 a 5 mM de ácido lático ésuplementado no meio de cultura.

13. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a condição suplementadacom ácido aspártico/ácido glutâmico é uma condição em que de 20 a 100mg/L de ácido aspártico e de 20 a 100 mg/L de ácido glutâmico são suple-mentados no meio de cultura.

14. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a condição suplementadacom ácido pirúvico é uma condição em que de 0,5 a 5 mM de ácido pirúvicoé suplementado no meio de cultura.

15. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com a rei-vindicação 8, em que a condição suplementada com pouco soro é uma con-dição sem soro, ou uma condição em que, quando a concentração de soroou componentes do soro suplementado no meio de cultura usado no proces-so para obter células de mesoblasto não-diferenciadas é considerada como-100%, a concentração do soro ou dos componentes do soro é reduzida parade 0% a 10%.

16. Método para selecionar cardiomiócitos, de acordo com a rei-vindicação 8, em que a condição de pH brandamente ácida é uma condiçãode pH 6,5.