JP2013143968A - 幹細胞及び胎児由来の心筋細胞及び予定心筋細胞の精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の発明者らは、低血清条件、低糖条件、低栄養条件、低カルシウム条件、弱酸性pH条件、乳酸添加条件、アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件、および/またはピルビン酸添加条件の培養液中で胚性幹細胞由来の心筋細胞を培養することにより、効率的且つ高度に心筋細胞を選択・精製できることを見いだした。更に、胚性幹細胞で見出した方法が、胎児由来の心筋細胞の選択・精製や、成体幹細胞由来の心筋細胞の選択・精製に応用可能であることを見出した。
【選択図】 なし
Description
[0009] 現在までのところ、GFPなどの蛍光マーカーを心筋細胞に特異的に発現させて、蛍光マーカーを発現した細胞をセルソーターを用いて精製する方法(非特許文献1)、または抗生物質耐性タンパク質を心筋細胞に特異的に発現させて、抗生物質を用いて選択的に精製する方法(非特許文献2)により、心筋細胞の精製が行われていた。しかしながら、これらの方法では、遺伝子改変を行わなければならず、それによる安全性の問題が存在するため、実際の移植のためには利用することができない。また、これらの方法はいずれも遺伝子改変を伴う方法であるが、ゲノムを改変することは、それ自体に倫理的な問題を持つ上、細胞ガン化率の変化等、予測不可能な重大リスクを伴う(非特許文献3)。
Muller M,et al., FASEB J. 2000; 14: 2540-2548 Klug MG,et al., J. Clin. Invest. 1996; 98: 216-224 Schroder AR, et al., Cell. 2002; 110: 521-529 Khairallah M, et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 286, H1461-1470 Chatham JC, et al., J Biol Chem 1995; 270: 7999-8008
(1)低・無血清条件において非心筋細胞に志向性を有する細胞分化増殖抑制並びに細胞死誘導が起こる現象;
(2)弱酸性培養液における非心筋細胞に志向性を有する細胞死誘導が起こる現象;
(3)低カルシウム培養液における非心筋細胞に志向性を有する細胞分化増殖抑制並びに細胞死誘導が起こる現象;
(4)低栄養培養液で培養した場合に非心筋細胞が選択的に死亡する現象;
(5)低カルシウム環境で心筋細胞を培養した場合に心筋細胞の自律拍動が減弱し、エネルギー消費が抑制される現象;
(6)低・無血清化が心筋細胞の自己集合塊形成を促進する現象;及び
(7)心筋胞細胞塊をバラバラに分散した場合心筋細胞の生存率が著しく低下する現象;
を見出した。
(i)低糖条件;および
(ii)低カルシウム条件、低栄養条件、乳酸添加条件、アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件、およびピルビン酸添加条件、からなる群から選択される1または複数の条件;
を有する培養液中で培養することを特徴とする、心筋細胞を選択する方法。
[3] 心筋細胞の比重と比較して、死細胞の比重が高比重であることを利用して、死細胞を除去する、[2]に記載の心筋細胞を選択する方法。
[5] 培養液の(ii)の条件がアスパラギン酸・グルタミン酸添加条件である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
[7] 胚性幹細胞に対して分化誘導して、予定心筋細胞(未分化中胚葉)を含む胚様体を形成し、この胚様体を低血清条件および/または弱酸性pH条件の培養液中で培養することにより前記細胞混合物を調製する、[1]に記載の心筋細胞を選択する方法。
[11] 低栄養条件が、培養液としてRPMI培養液、DMEM培養液、MEM培養液、F12培養液又はα-MEM培養液を用いる場合、当該培養液に含有されるすべての栄養成分が、当該培養液中の栄養成分と比較して10%以下まで低下している条件である、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
[13] アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件が、アスパラギン酸を20〜100 mg/L、グルタミン酸を20〜100 mg/L添加する条件である、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
[15] 低血清条件が、血清を含まない条件、または未分化中胚葉を得るまでの段階において培養液に添加した血清または血清成分の濃度を100%として算出した場合に血清または血清成分の濃度が0%〜10%の条件である、[8]に記載の心筋細胞を選択する方法。
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去した培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇の作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際における血清枯渇の作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、予定心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去した培養液中で培養することにより、予定心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇の作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から予定心筋細胞を選択する際における血清枯渇の作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、カルシウム濃度を低下させた培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対するカルシウム濃度の低下の作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際におけるカルシウム濃度の低下の作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、予定心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、かつ弱酸性である培養液中で培養することにより、予定心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇および弱酸性pHの複合的な作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から予定心筋細胞を選択する際における血清枯渇および弱酸性pHの複合的な作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、かつ弱酸性である培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇および弱酸性pHの複合的な作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際における血清枯渇および弱酸性pHの複合的な作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、かつ糖類を除去した培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇および糖類枯渇の複合的な作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際における血清枯渇および糖類枯渇の複合的な作用、について検討することを目的とした。
実施例6にて作製した細胞塊には、死細胞や細胞外マトリックスが付着している。これを除去し心筋細胞塊のみを精製する必要がある。しかしながら、事前の検討において、トリプシン等のタンパク質を非選択的に消化する酵素を用いた場合、心筋細胞の生存率は著しく低下することが明らかになった。
[0079] 実施例6において作製し図8で示した細胞塊を、細胞外マトリクスの一つであるコラーゲンを選択的に消化するコラゲナーゼ0.01〜0.1%を用いて、37℃にて20分消化した。コラゲナーゼのみで処理した後、生理的浸透圧を有する任意の等張液によって洗浄を行った。この段階で、心筋細胞は、細胞塊(直径40μm以上)を維持しているため、洗浄は直径40μmの穴を有する市販の膜を介して液交換を行うことによって行い、分散した心筋細胞以外の細胞を選択的に除去した。この洗い作業は4〜5回行った。回収された細胞塊を培養し、心筋細胞の指標となる抗サルコメア-アクチニン抗体(SIGMA)を用いた免疫染色を行った(赤色[細胞質の横紋繊維を染色]、青色[核をDAPI(Molecular probe社)により染色])。
[0081] 実施例8 無血清・弱酸性・低カルシウム・無糖であり、乳酸を添加した培養条件における心筋細胞の精製
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、弱酸性であり、カルシウムを除去し、かつ糖類を除去した培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇、弱酸性pH、低カルシウム、および糖類枯渇の複合的な作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際における血清枯渇、弱酸性pH、低カルシウム、および糖類枯渇の複合的な作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、弱酸性であり、カルシウムを除去し、かつ糖類を除去した培養液中にアスパラギン酸・グルタミン酸を添加して培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対するアスパラギン酸・グルタミン酸の代償性の作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際におけるアスパラギン酸・グルタミン酸の代償性の作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、間葉系幹細胞と言われるマウス骨髄由来成体幹細胞から、心筋細胞を作製し、選択・精製することを目的として行った。
本実施例においては、マウス胎児から、心筋細胞を精製することを目的として行った。
[0094] まず、胎生7〜9日のマウス胚を母体子宮内から取り出し、丁寧に胚外組織と分離した後、ピペッティングによってバラバラの細胞塊とした。このようにして得られた細胞塊を、無血清・弱酸性pH・低カルシウム・無糖であるが、乳酸0.5 mMを添加した培養液中で、5日間(複数回の実験から、自律拍動する心筋細胞の生存率と、他の細胞の生存率を目視で確認し、3〜10日間の範囲で調節を行う必要がある。)培養を行った。この培養液はHank's BSS[無糖]:RPMI[無糖]=9:1の比で混合して作製した。このようにして精製心筋細胞を接着培養し、培養後、死細胞を除去し、残存する生細胞に対し、心筋細胞の指標となるサルコメア-アクチニン蛍光免疫染色(緑色;細胞質)、およびDAPI染色(赤色;核)を行った。
本実施例においては、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、弱酸性であり、カルシウムを除去し、かつ糖類を除去した培養液中にピルビン酸を添加して培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対するピルビン酸の代償性の作用、より具体的には細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際におけるピルビン酸の代償性の作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、霊長類マーモセット胚性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、かつ糖類を除去した培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇および糖類枯渇の複合的な作用、より具体的には霊長類マーモセット胚性幹細胞由来の細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際における血清枯渇および糖類枯渇の複合的な作用、について検討することを目的とした。
本実施例においては、霊長類マーモセット胚性幹細胞由来心筋細胞の利用方法である心臓に対する移植と生着に関する検討を目的とした。
[0112] この結果、図の大きな核を有する細胞がマーモセット由来であることが判明した。すなわち、この図において、心筋マーカーであるNkx2.5を発現する霊長類細胞が、アクチニンにより染色される心筋細胞の中に見られることが明らかになった。これは、マーモセットES細胞由来の心筋細胞が、マウス心臓内に生着したことが確認されたことを意味する。
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)を、血清を除去し、かつ糖を除去した培養液中で培養することにより、心筋細胞を含む細胞塊(胚様体)に対する血清枯渇および糖枯渇の複合的な作用、より具体的にはヒト胚性幹細胞由来の細胞塊(胚様体)から心筋細胞を選択する際における血清枯渇および糖枯渇の複合的な作用、について検討することを目的とした。
Claims (15)
- 胚性幹細胞(ES細胞)に類似した形質を有する幹細胞由来の心筋細胞と非心筋細胞とを含む細胞混合物から、心筋細胞を選択する方法であって、前記細胞混合物を、
(i)糖類を含まない条件または分化誘導時に用いた培養液中の糖類の条件と比較して糖類を1%未満まで低下させた条件である低糖条件;および
(ii)培養液中のカルシウム濃度が0.3〜1.3 mMの条件である低カルシウム条件、培養液に含有されるすべての栄養成分が、当該培養液中の栄養成分と比較して10%以下まで低下している条件である低栄養条件、乳酸添加条件、アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件、およびピルビン酸添加条件、からなる群から選択される1または複数の条件;
を有する培養液中で培養することを特徴とする、心筋細胞を選択する方法。 - 胚性幹細胞(ES細胞)に類似した形質が、ES細胞に特異的な表面(抗原)マーカーの存在、ES細胞特異的な遺伝子の発現、テラトーマ(teratoma)形成能、キメラマウス形成能からなる群から選択される、請求項1に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 幹細胞が、EG細胞、GS細胞、及び誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells:iPS細胞)からなる群から選択される、請求項1または2に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 更にコラゲナーゼを用いて心筋細胞に付着する死細胞を除去することからなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 心筋細胞の比重と比較して、死細胞の比重が高比重であることを利用して、死細胞を除去する、請求項4に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 培養液の(ii)の条件が乳酸添加条件である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 培養液の(ii)の条件がアスパラギン酸・グルタミン酸添加条件である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 培養液の(ii)の条件がピルビン酸添加条件である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 心筋細胞と非心筋細胞とを含む細胞混合物を、胚性幹細胞(ES細胞)に類似した形質を有する幹細胞に対して分化誘導して、Nkx2.5陰性かつBrachyury陽性の細胞を含む胚様体を形成し、この胚様体を血清を含まない条件、またはNkx2.5陰性かつBrachyury陽性の細胞を得るまでの段階において培養液に添加した血清または血清成分の濃度を100%として算出した場合に血清または血清成分の濃度が0%〜10%の条件である低血清条件およびpH6.5〜7の範囲のpH条件の培養液中で培養することにより調製する、請求項1に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 胚性幹細胞(ES細胞)に類似した形質を有する幹細胞由来の心筋細胞を選択する方法であって、胚性幹細胞(ES細胞)に類似した形質を有する幹細胞に分化誘導してNkx2.5陰性かつBrachyury陽性の細胞を含む胚様体を形成した後、この胚様体を血清を含まない条件、またはNkx2.5陰性かつBrachyury陽性の細胞を得るまでの段階において培養液に添加した血清または血清成分の濃度を100%として算出した場合に血清または血清成分の濃度が0%〜10%の条件である低血清条件およびpH6.5〜7の範囲のpH条件の培養液中で培養することにより予定心筋細胞を含む細胞混合物を調製し、そして同一の培養液中で当該細胞混合物の培養を継続することにより心筋細胞を得ることを特徴とする、前記心筋細胞を選択する方法。
- 培養液が、RPMI培養液、DMEM培養液、MEM培養液、F12培養液およびα-MEM培養液からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- 乳酸添加条件が、乳酸を0.1〜5 mM添加する条件である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件が、アスパラギン酸を20〜100 mg/L、グルタミン酸を20〜100 mg/L添加する条件である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- ピルビン酸添加条件が、ピルビン酸を0.5〜5 mM添加する条件である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の心筋細胞を選択する方法。
- pH条件がpH6.5の条件である、請求項9または10に記載の心筋細胞を選択する方法。
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