KR101455144B1

KR101455144B1 - 줄기세포 및 태아에서 유래된 심근세포 및 예정 심근세포의 제조방법

Info

Publication number: KR101455144B1
Application number: KR20127027002A
Authority: KR
Inventors: 후미유키 핫토리; 게이이치 후쿠다
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤; 각고호우징 게이오기주크
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2014-10-27
Also published as: JP2013143968A; EP1983042B1; WO2007088874A1; CN103409368B; SG169359A1; AU2007210580A1; IL193095A; KR20120123608A; RU2426784C2; KR20080097197A; BRPI0706801A2; BRPI0706801B8; BRPI0706801B1; EP1983042A1; CA2640644C; AU2007210580B2; US9115342B2; KR101348325B1; JPWO2007088874A1; CN103409368A

Abstract

본 발명은 종래에 심근세포를 정제하는 목적으로 이용할 수 없었던 여러 성질이나 새로 찾아낸 여러 성질을 이용하여, 유전자조작을 거치지 않고 특별한 단백질 및 생리 활성물질을 첨가하지 않고도, 태아 및 줄기 세포에서 유래하는 심근세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근세포를 고순도인 동시에 고효율로 정제하는 방법을 개발하는 것을 과제로 한다. 본 발명의 발명자들은 저혈청 조건, 저당 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건, 약산성 pH 조건, 유산 첨가 조건, 아스파라긴산·글루탐산 첨가 조건 및/또는 피루브산 첨가 조건의 배양액 중에서 배아 줄기세포 유래의 심근세포를 배양함으로써, 효율적인 동시에 고순도의 심근세포를 선택·정제할 수 있는 것을 발견하였다. 또한 배아 줄기세포로 찾아낸 방법이 태아유래의 심근세포의 선택·정제나 성체 줄기 세포 유래의 심근세포의 선택·정제에 응용가능한 것을 발견하였다.

Description

줄기세포 및 태아에서 유래된 심근세포 및 예정 심근세포의 제조방법{METHOD FOR PURIFYING CARDIAC MYOCYTE AND PRESUMPTIVE CARDIAC MYOCYTE DERIVED FROM STEM CELL AND FETUS}

본 발명은 줄기 세포 및 태아에서 유래하는 세포군으로부터의 심근세포 정제 방법과 이용 방법에 관한 것이다.

성체의 심근세포는 증식 활성을 가지고 있지 않아서 중증의 심근 경색, 심근증 등의 질환에는 심장을 이식할 수 밖에 없다. 그러나, 현재로서는 심장의 도너(donor) 부족의 문제 극복이 어려워 심장 이식 이외의 치료방법을 발견하는 것이 급선무이다.

따라서 심근세포를 체외에서 제작·정제하고, 심근세포를 보충하는 것은 심장을 이식하지 않으면 안 되는 환자를 구제하는 방법 중 가장 유망한 방법으로 여겨지고 있다. 심근세포를 얻기 위해서는 줄기 세포(배아 줄기세포나 각종 성체 줄기 세포)을 분화시키는 방법, 태아에게서 수득하는 방법 등이 검토, 연구되고 있다.

마우스 배아 줄기세포에서 분화를 억제하는 인자(피더 세포, 백혈병 억제 인자: LIF 등)를, 인간 배아 줄기세포에서 분화를 억제하는 인자(피더 세포, 염기성 섬유아세포성장 인자: bFGF, 트랜스포밍 성장 인자: TGF 등)를 배양액 안에서 제거하고 세포 덩어리(배양체(胚樣體))를 형성시켜 적극적으로 분화를 야기할 수 있다.

시험관 내(in vitro)에서 분화의 양식은 일부 생리적인 발생을 따르고 있어서, 특히 발생 초기에 수정란세포에서 일어나는 생리적 발생과 시험관 내에서의 분화의 양식과의 사이에는 공통점이 많다. 시험관 내에서의 심근세포에의 분화 계보는 생리적 발생과 같이, 우선 미분화된 중배엽 세포가 형성되고 그 일부가 심근세포(전심장 중배엽)를 거친 후 심근세포로 분화된다. 그러나 배아 줄기세포는 장기를 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있기 때문에 한 종류의 세포로만 분화되게 하는 것은 기술적으로 곤란하다.

또한, 비생리적 조건(시험관 내)에서는 모든 세포를 분화시키기 어려워서 일부 미분화된 세포가 잔존할 수 있다. 또한, 골수나 탯줄에 존재하는 간엽계 줄기 세포나 각 조직에 존재하는 조직 줄기 세포(신경관 세포, 지방간세포, 골격근 줄기 세포 등)가 심근세포로 분화될 수 있다고 생각되는 성체 줄기 세포이며, 심근세포 뿐 아니라 그 밖의 다양한 종류의 세포로 분화된다고 한다. 어떠한 성체 줄기 세포도 심근세포로의 분화 메커니즘은 상세히 밝혀져 있지 있지만, 각각 일정 기간의 변이 상태를 거쳐서 심근세포나 다른 분화 세포, 미분화 세포를 포함하는 세포집단을 형성한다.

요약하면, 모든 줄기 세포는 부산물로서 심근세포 이외의 세포를 만들거나 미분화된 세포를 잔존시키는, 임상적 응용에 유해한 성질을 가지고 있다는 공통점이 있다. 미분화된 세포는 증식 활성을 가지는 동시에 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있어서 분화 유도한 심근세포를 포함하는 세포집단을 그대로 생체에 이식하거나 치료에 이용하기가 곤란하다.

따라서 줄기 세포를 이용한 치료를 안전하게 실행하고 이상적인 치료 효과를 얻기 위해서는 심근세포만을 세포집단으로부터 정제하는 방법을 찾아내는 것이 필요하다.

현재까지는 GFP 등의 형광 마커를 심근세포에 특이적으로 발현되게 하여 형광 마커를 발현한 세포를 셀 소터(sorter)를 이용하여 정제하는 방법(비특허문헌 1), 또는 항생 물질 내성 단백질을 심근세포에 특이적으로 발현시켜서 항생 물질을 이용하여 선택적으로 정제하는 방법(비특허문헌 2)으로 심근세포를 정제하고 있다. 그러나, 이들 방법에서는 유전자 조작을 행하지 않으면 안 되고 이에 따른 안전성의 문제가 존재하기 때문에 실제 이식에 이용할 수 없다. 또한, 이 방법은 모두 유전자조작에 의한 방법이지만, 유전자(genome)를 조작하는 것은 그 자체에 윤리적인 문제가 있고 세포 전이율의 변화 등 예측 불가능한 중대한 위험을 수반한다(비특허문헌 3).

심장은 골격근 등의 타 장기가 생성한 유산(乳酸)을 에너지원으로서 이용할 수 있다고 알려져 있지만(비특허문헌4) 이 성질을 이용하여 심근세포의 정제를 시험해 본 전례는 없다.

또한 심장, 간장, 신장에서는 미토콘드리아 내에의 NADH 수송에 아스파라긴산과 글루탐산을 이용, 타 장기와 다른 메커니즘을 가진다(비특허문헌 5). NADH의 미토콘드리아 내에의 수송은 미토콘드리아의 에너지 생산에 필수적이다. 지금까지 이 메커니즘의 차이를 이용하여 심근세포의 정제를 시험해 본 전례는 없다.

비특허문헌 1: Muller M, et al., FASEB J. 2000; 14:2540-2548

비특허문헌 2: K1ug MG, et al., J. Clin. Invest. 1996; 98:216-224

비특허문헌 3: Schroder AR, et al., Cell. 2002; 110: 521-529

비특허문헌 4: Khairallah M, et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004; 286, H1461-1470

비특허문헌 5: Chatham JC, et al., J Biol Chem 1995; 270:7999-8008

본 발명은 종래에 심근세포를 정제하는 목적으로 이용할 수 없었던 여러 성질이나 새로 찾아낸 여러 성질을 이용하여, 유전자 조작을 거치지 않고 특별한 단백질 및 생리 활성물질을 첨가하지 않고도 태아 및 줄기 세포에서 유래하는 심근세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근세포를 고순도인 동시에 고효율로 정제하는 방법을 개발하는 것을 과제로 한다.

본 발명의 발명자들은 배아 줄기세포에서 유래한 심근세포를 효율적으로 생산하기 위하여 배양액의 조성을 종합적으로 검토하였다. 그 중에서 배양액의 조성을 변화시켜 여러 가지 배양액 조성 성분을 검토하고 적응해야 할 시기를 검토하여 이하의 현상을 찾아내었다:

(1) 저·무혈청 조건에서 비심근세포의 세포분화 증식 억제 및 세포사 유도가 일어나는 현상;

(2) 약산성 배양액에서 비심근세포의 세포사 유도가 일어나는 현상;

(3) 저칼슘 배양액에서 비심근세포의 세포분화 증식 억제 및 세포사 유도가 일어나는 현상;

(4) 저영양 배양액에서 배양하였을 경우에 비심근세포가 선택적으로 사망하는 현상;

(5) 저칼슘 환경에서 심근세포를 배양하였을 경우에 심근세포의 자율 박동이 감소하여 약해지고 에너지 소비가 억제되는 현상;

(6) 저·무혈청화가 심근세포의 자기집합 덩어리 형성을 촉진하는 현상; 및

(7) 심근 세포 덩어리를 조각조각 분산시킨 경우 심근세포의 생존율이 현저하게 저하하는 현상을 발견하였다.

본 발명의 발명자들은 이들 현상에 대한 방법을 조합, 최적화하여 배아 줄기세포 유래의 심근세포를 효율적인 동시에 고순도로 선택·정제할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 배아 줄기세포에서 찾아낸 방법이 태아에서 유래한 심근세포의 선택·정제나 성체 줄기 세포에서 유래한 심근세포의 선택·정제에 응용할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

보다 구체적으로, 본 발명의 한 양태는 배아 줄기세포 유래, 성체 줄기 세포 유래 또는 태아 유래의 심근세포와 비심근세포를 포함하는 세포 혼합물에서 심근세포를 선택하는 방법으로서, 상기 세포 혼합물을 (i) 저당 조건; 및 (ii) 저칼슘 조건, 저영양 조건, 유산첨가 조건, 아스파라긴산·글루탐산 첨가 조건 및 피루브산 첨가 조건으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 조건을 가지는 배양액에서 배양하는 것을 특징으로 하는 심근세포를 선택하는 방법을 제공한다. 이 양태에서 상기 세포 혼합물을 배아 줄기세포에서 분화 유도하여 예정 심근세포(미분화 중배엽)를 포함하는 배양체를 형성하고 이 배양체를 저혈청 조건 및/또는 약산성 pH 조건의 배양액 중에서 배양하여 조제할 수 있다.

본 발명의 다른 한 양태는 배아 줄기세포 유래의 심근세포를 선택하는 방법으로서 배아 줄기세포로 분화 유도하여 미분화 중배엽을 포함하는 배양체를 형성한 후, 이 배양체를 저혈청 조건 및/또는 약산성 pH 조건의 배양액 중에서 배양하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 조제하고 동일한 배양액 중에서 해당세포 혼합물의 배양을 계속하여 심근세포를 얻는 것을 특징으로 하는 상기심근세포를 선택하는 방법을 제공한다.

발명의 실시 형태

심근세포로 분화할 수 있는 줄기 세포(배아 줄기세포, 골수줄기 세포 등의 성체 줄기 세포)에 적절한 심근세포 분화 유도 처리를 하면 심근세포로 분화하게 된다. 즉, 예를 들어 마우스 배아 줄기세포를, 백혈병억제 인자(LIF)을 배양액 안에서 제거하고 부유 배양시켜서 세포 덩어리(배양체)를 형성시키는 행잉 드롭(hanging drop)법으로 배아 줄기세포의 심근세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또는 명주원숭이(marmoset)의 배아 줄기세포나 인간 배아 줄기세포를 사용하여 동일하게 배아 줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도할 수도 있다.

본 발명의 방법은 포유동물 유래의 줄기 세포 어느 것에도 적용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법은 마우스, 소, 염소, 개, 고양이, 명주원숭이, 붉은털원숭이, 인간 유래의 줄기 세포에 대하여 사용할 수 있고 이들 동물종 유래의 줄기 세포만으로 한정되지 않는다. 예를 들어 본 발명에 이용할 수 있는 줄기 세포로서는 기존에 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유동물 유래 ES 세포를 들 수 있다.

마우스 유래 ES 세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포, J1 세포 등을 들 수 있다. 본원 발명에 의한 마우스 유래 ES 세포는 예를 들면 American Type Culture Collection(ATCC)이나 Chemicon사, Cel1 & Molecular Technologies사 등으로부터 입수할 수 있다.

원숭이 유래 ES 세포로서는 붉은털원숭이(rhesusmonkey: Macacamulatta)(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:7844)나 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey: Macacafascicularis)(Suemori et al., Dev. Dyn. 2001; 222:273-279), 명주원숭이(common marmoset: Callithix jacchus)(Sasaki et al., Stem Cel1s. 2005; 23 1304-1313)에서 수립되어 있고 사용가능하다. 예를 들어 명주원숭이 ES 세포는 재단법인 실험 동물 중앙연구소에서도 입수할 수 있다.

현재, 인간 유래 ES 세포는 전세계에서 수십 종 이상이 수립되어 있고, 예를 들면 미국 국립위생 연구소의 리스트(http://stemce11s.nih.gov /registry/index.asp)에는 다수의 주가 등록되어서 사용 가능하고 Cellartis사나 ES Cell Internationa1사, Wisconsin Alumni Research Foundation 등으로부터 구입할 수 있다. 또한 일본의 국립 대학법인 교토 대학 재생 의과학 연구소 부속 줄기세포 의학 연구센터에서도 입수할 수 있다(Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006; 345:926-932).

또한, 소(Mitalipova et al., C1oning 2001; 3:59-67), 새(Petitte et al., Mech. Dev. 2004; 121:1159-1168), 제브라 피쉬(Fishman, M. C., Science 2001; 294: 1290-1291)에서도 ES 세포의 수립이 보고되어 있다.

일반적으로 ES 세포는 초기 배아를 배양하여 수립되지만 체세포의 핵을 핵 이식한 초기 배아로부터도 ES 세포를 제작할 수 있다(Munsie et al., Curr. Biol. 10:989,2000; Wakayama et al., Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303:1669, 2004). 또한, 단위(parthenogenetic) 발생 배아를 배반포기와 동등한 단계까지 발생시켜 ES 세포를 제작하는 시도(미국 특허공개 제 02/168763호; Vrana K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11911-6)나 ES 세포와 체세포를 융합시켜 체세포 핵의 유전 정보를 가지는 ES 세포를 만드는 방법도 보고되어 있다(국제공개 번호 제00/49137호 Tada et al., Curr. Biol. 11:1553, 2001). 본 발명에서 사용할 수 있는 ES 세포에는 이러한 방법에 의해 제작된 ES 세포 또는 ES 세포의 염색체상의 유전자를 유전자공학적 방법에 의해 개변한 것도 포함된다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는 줄기 세포는 ES 세포만으로 한정되지 않고 포유동물의 성체 장기나 조직의 세포, 골수세포, 혈액세포, 또는 배아나 태아의 세포 등에서 유래하는 ES 세포와 유사한 형질을 소유하는 모든 줄기 세포가 포함된다. 이 경우에 ES 세포와 유사한 형질로는 ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재나 ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 또는 테라토마(teratoma) 형성능이나 키메라 마우스 형성 기능이라고 하는 ES 세포 특이적인 세포생물학적 성질을 가지는 것으로 정의할 수 있다. 그 구체적인 예로서는, 원시(primordial) 생식 세포로부터 만들어지는 EG 세포, 정소의 생식 세포로부터 만들어지는 GS 세포 및 섬유아세포 등의 체세포로부터 특수한 유전자조작에 의해 제작되는 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells: iPS 세포) 등을 들 수 있다. 이 방법에서 LIF를 제거하고 부유 배양하여 분화유도를 시작한 후 3 - 6일의 배양체에는 미분화 중배엽 또는 예정 심근세포 등의 장래 심근세포로 분화되는 세포가 포함되는 것으로 여겨지고 있다. 그리고, 배아 줄기세포를 유도할 때에 분화 유도 시작 후 7일째(인간 배아 줄기세포에서는 10일째)에 심근세포가 나타나는 것으로 알려져 있다. 그러나 이렇게 하여 배아 줄기세포로 형성된 배양체에는 상기의 세포 이외에 미분화 세포, 내피 상피모양 세포, 신경 세포 등의 심근세포로 분화되지 않는 세포가 포함되어 있다. 본 발명에서는 심근세포 및 장래 심근세포로 분화되는 세포(미분화 중배엽, 예정 심근세포) 이외의 이들 모두의 세포를 "비심근세포"라고 부른다.

본 발명의 발명자들은 상술 한 바와 같이 형성된 배양체 중에 혼합되어 있는 비심근세포로부터 심근세포 혹은 장래 심근세포로 분화되는 세포만을 선택하기 위하여 심근분화가 일어나는 때에 저혈청 조건, 저당 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건 및 약산성 pH 조건이 심근세포의 선택에 미치는 작용을 검토하였다.

그 결과, 본 발명의 발명자들은 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 저혈청 조건, 저당 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건, 약산성 pH 조건 중, 각각 단독조건, 또는 몇 개의 조합, 혹은 모든 조합의 조건하에서 배양한 경우 비심근세포에 비하여 심근세포 혹은 장래 심근세포로 분화되는 세포만이 세포상해를 받기 어렵다는 것을 발견하였다.

이에 근거하여 본 발명의 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 저당 조건, 저혈청 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건, 및 약산성 pH 조건의 각 배양 조건 중 하나 또는 여러 조건의 조합에서 세포 혼합물을 구성하는 세포 중, 이들 조건 하에서도 생존하는 세포집단을 예정 심근세포 또는 심근세포의 세포집단으로서 선택할 수 있었다.

해당 선택방법은 심근세포가 생리적으로 내성을 가지는 조건에서 선택된 것이기 때문에 생리적 내성 선택법이라 한다. 본 발명의 생리적 내성 선택법은 저당 조건, 저혈청 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건, 또는 약산성 pH 조건의 배양액 중에서 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 배양하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 "저당 조건"이란 배양액 중의 당류(즉 다당류, 단당류(글루코스, 갈락토스, 프록토스, 만노스 등)를 포함하는 물질군으로서 생체 내·세포 내에서 화학분해·변환되어 최종적으로 해당계에서 이화되는 것)의 농도가 저하된 배양액 중에서 배양하는 조건을 말하고, 바람직하게는 상기 당류를 포함하지 않는 배양액중에서 배양하거나 또는 분화 유도시에 이용한 배양액 중의 당류의 조건에 비하여 당류의 농도를 1% 미만까지 저하시킨 배양액 중에서 배양하는 조건을 말한다. 본 조건의 당류 중 최소한 글루코스는 가능한 한 제외되는 것이 바람직하다. 예를 들면 일반적으로 세포배양에 있어서 사용되는 시판의 배양액 중 α-MEM, MEM[Hank's BSS], DMEM 등의 배양액의 경우에는 D-글루코스가 1g/L(5.56mM), RPMI 1640의 경우에는 D-글루코스가 2.0g/L(11.12mM), Ham's F-12의 경우에는 D-글루코스가 1.82g/L(10.12 mM)가 각각 당류로서 함유된다. 따라서, 당류농도를 1%까지 저하시킨 배양액이라고 하는 경우 당류를 55.60 - 111.20μM 함유하는 조건의 배양액을 말한다.

본 발명에서는 그러한 일반적인 배양액 중의 당류의 조건에 비하여 당류를 1% 미만까지 저하시킨 경우, 비심근세포는 세포사를 일으키지만 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포는 배양액 중에서 생존할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 본 발명에서는 저당 조건을 만들기 위하여 예를 들면 RPMI 배양액(무당), DMEM 배양액(무당)(각각, GIBCO)을 사용할 수 있다.

본 발명에서 혈청성분은 혈청 또는 동물이나 인간의 혈청에 함유되는 생리활성 물질군 뿐만 아니라, 그들의 생리활성 물질군이며 인공적으로 제작된 물질군을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서 "저혈청 조건"은 "무혈청 조건"을 포함하는 용어이며 미분화 중배엽을 얻을 때까지의 단계에 있어서 배양액에 첨가한 혈청 또는 혈청성분 또는 인공적인 생리활성 물질군의 농도를 100%로 산출했을 경우에 0% - 10%로 하는 것을 말한다. 따라서, 예를 들어 미분화 중배엽을 얻을 때까지의 단계에 있어서 배양액에 10%의 농도의 혈청이 함유되어 있는 경우, 예정 심근세포 또는 심근세포를 선택하기 위하여 배양액 중의 혈청농도를 1%이하로 설정하는 것을 말한다. 본 발명에서 일반적인 배양액 중의 혈청성분에 비하여 배양액 중의 혈청성분을 10% 이하로 저하시켰을 경우 비심근세포는 세포사를 일으키지만 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포는 배양액 중에서 생존할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명에서 "저영양 조건"이란 일반적인 배양액(RPMI 배양액, DMEM 배양액, MEM 배양액, F12 배양액이나 α-MEM 배양액)에 함유되는 모든 영양성분이, 일반적인 배양액 중의 영양성분에 비하여 10% 이하까지 저하된 것을 말하고, 바람직하게는 10%까지 저하된 것을 말한다. 본 발명에서 일반적인 배양액 중의 영양성분에 비하여 영양성분을 10%까지 저하시켰을 경우, 비심근세포는 세포사를 일으키지만 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포는 배양액 중에서 생존할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 "저영양 조건"의 배양액은, 일반적인 배양액(RPMI 배양액, DMEM 배양액, MEM 배양액, F12 배양액이나 α-MEM 배양액)을 생리적 염류용액(예를 들면 Hank's BSS 무당이나 PBS 등)을 이용하여 10배까지 희석하여 조제할 수 있다.

본 발명의 "저칼슘 조건"이란 배양액 중의 칼슘 농도가 0.3 - 1.3mM인 것을 의미한다. 일반적으로 심근세포를 분화시킬 때에 사용되는 배양액(DMEM 배양액, MEM 배양액이나 α-MEM 배양액)은 배양액 중의 칼슘 농도가 1.8mM이며, 심근세포를 분화시킬 때는 배양 기간 전반에 걸쳐 칼슘 농도를 이 농도로 유지한다고 알려져 있다. 본 발명에서는 일반적인 배양액 중의 칼슘 농도에 비하여 유의적으로 낮은 0.3 - 1.3mM의 칼슘 농도로 한 경우에 비심근세포는 세포사를 일으키지만 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포는 배양액 중에서 생존할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 "저칼슘 조건"의 배양액으로는 RPMI 배양액이나 F12 배양액(모두 GIBCO) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 "약산성 pH 조건"이란 배양액의 pH가 pH6 - 7인 것을 의미한다. 일반적으로 심근세포를 분화되게 하는 배양액(RPMI 배양액, DMEM 배양액, MEM 배양액, F12 배양액이나 α-MEM 배양액)의 pH는 생리적 조건인 pH7.5정도로 유지하는 것으로 알려져 있다. 이 기본 BSS는 5% CO₂ 배양기 내에서 pH가 6.5정도 된다. 본 발명에서는 일반적인 배양액의 pH에 비하여 산성인 6.5까지 저하시켰을 경우, 비심근세포는 세포사를 일으키지만, 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포는 배양액 중에서 생존할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명의 "약산성 pH 조건"의 배양액은 Hank's Balanced Sa1ts So1ution(Hank's BSS)을 이용해서 만들어진다.

상술한 세포 혼합물을 적절한 2 이상의 배양액 조건을 사용하는 방법(생리적 내성선택법)을 임의로 조합하여 보다 효율적으로 심근세포를 정제할 수 있다.

본 발명의 발명자들은 배양액 중에서 당류를 제거하면 배아 줄기 세포 유래의 배양체 중에서 비심근세포가 세포사를 일으키는 것을 찾아내었지만, 배양체 중에서의 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포의 선택성을 더욱 향상시키는 목적으로 심근세포에 선택적으로 에너지를 공급할 수 있는 다른 기질의 검토를 행하였다.

그 결과, 당류 대신에 유산(Lactate, 0.1 - 5mM) 또는 아스파라긴산(20 - 100mg/L)과 글루탐산(20 - 100mg/L)의 조합, 또는 피루브산(0.5 - 5mM) 또는 그들의 조합을 배양액 중에 첨가하는 것이 유효하다는 것을 발견하였다. 이에 의하여 심근세포에 선택적으로 영양을 공급할 수 있다고 생각된다.

해당 선택방법은 심근세포의 대사 능력을 이용하여 선택하는 것이기 때문에 대사적 선택법이라 한다. 본 발명의 대사적 선택법은 유산첨가 조건, 아스파라긴산·글루탐산첨가 조건 또는 피루브산 첨가 조건의 배양액 중에서 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 배양하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 두 가지 심근세포 선택방법(즉, 생리적 내성선택법과 대사적 선택법)을 조합하여 심근세포를 고순도로 정제할 수 있고 상기의 방법을 반복하여 보다 고순도로 정제가능하다.

본 발명에서 심근세포의 기원으로서 이용하는 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포를 포함하는 세포 혼합물은 줄기 세포 또는 태아로부터 조제할 수 있다. 여기에서 단지 줄기 세포라고 하는 경우 어떤 세포형으로도 분화할 수 있는 성질을 가지는 전능성을 소유하는 세포(예를 들면 배아 줄기세포 등) 외에 복수의 특정한 형태의 세포로 분화할 수 있는 성질을 소유하는 다능성을 소유하는 세포(예를 들면 골수 유래의 성체 줄기 세포 등)가 포함되지만 이들에 한정되지는 않는다.

배아 줄기세포로부터 심근세포를 조제할 경우, 심근세포로의 분화가 진행됨에 따라서 미분화 중배엽, 예정 심근세포를 거쳐서 심근세포로 분화된다고 여겨지고 있다. 여기에서, 미분화 중배엽은 미분화 중배엽에 특이적인 Brachyury 단백질의 발현이 확인되는 단계를 말한다. 한편, 예정 심근세포는 Brachyury 등의 미분화 중배엽에 특이적인 단백질의 발현이 확인되는 동시에 동일세포에서 Nkx 2.5나 액티닌 등의 심근세포 특이적 단백질의 발현이 확인되지 않는 세포이며, 배양액에 대하여 새로 물질이 첨가되는 것을 필요로 하지 않고, 다만 심근세포로 분화되는 능력을 가지는 세포를 의미하고, 심근세포는 살아있는 세포의 경우에는 자율 박동을 가고 있는 세포를, 고정 후에는 Nkx 2.5, GATA4, 액티닌 등의 마커를 발현하는 세포를 의미한다.

예를 들면, 본 발명에서 마우스 배아 줄기세포를 심근세포의 기원으로 사용하는 경우, 마우스 배아 줄기세포를 LIF를 배양액 중에서 제거하여 분화를 유도한 후, 4일 - 7일의 마우스의 배아 줄기세포 유래 배양체를 상술한 생리적 내성선택법 및/또는 대사적 선택법으로 배양하여 배양체를 구성하는 세포 중에서 이들의 조건 하에 있어서도 생존하는 세포집단을 예정 심근세포 또는 심근세포의 세포집단으로서 선택할 수 있다.

하나의 예로서 분화 유도 5일째로부터 저당 조건과, 저혈청 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건, 및 약산성 pH 조건의 각 배양 조건 중 한가지 또는 조합에 의해 24시간 선택된 세포는 박동성을 가지지 않는 세포이었지만, 선택된 박동성을 가지지 않는 세포집단을 미분화 중배엽 마커인 Brachyury에 대한 면역염색법을 이용해서 염색한 바, 대부분 모든 세포가 Brachyury 양성이었다. 이것은 본원발명의 방법이 미분화 중배엽을 선택하는 방법이라는 것을 나타낸다.

또한, 상기의 Brachyury 양성세포를 현재 알려져 있는 가장 발생 조기에 발현되는 심근세포 특이적 호메오틱(homeotic) 단백질인 Nkx 2.5에 대한 면역염색을 행한 바, 염색 음성이었다. 그럼에도 불구하고, 이 세포를 더욱 배양하면 상기 세포내 약 80 - 90%이 심근세포로 분화된 것이기 때문에 해당 방법에 의해 선택된 미분화 중배엽은 미지인 가장 원시적일 예정 심근세포라고 생각된다.

또 다른 하나의 예로는 심근세포를 선택하기 위하여 분화 유도 후 4 - 6일째의 배아 줄기세포 유래의 배양체를 ITS{인슐린(10mg/L), 트렌스페린(5.5mg/L), 아셀렌산나트륨(6.7mg/L)}(GIBCO사)를 첨가한 무혈청의 MEM(Minimum Essential Medium)[Hank's BSS](Invitrogen): α-MEM(SIGMA)=9:1부터 1:9로 혼합한 배양액(이 경우의 칼슘 농도는 약 1.3mM이었다)을 이용하여 3일 정도 배양할 수 있다. 이 배양액의 조건은 저혈청 조건, 저칼슘 조건 및 약산성 pH 배양 조건에 해당한다. 이 방법으로 조제된 예정 심근세포는 다시 같은 배양액 중에서 배양을 계속하여 심근세포로 분화될 수 있다. 분화 유도 5일째 이후에, 특히 자율 박동하는 심근세포가 유도된 후에 상기의 조작을 행한 경우 MEM[Hank's BSS]만을 이용하여 저혈청 조건, 및 약산성 pH 배양 조건으로 배양하여 심근세포를 효율적으로 선택할 수 있다. 이 방법으로 제작한 심근세포는 다시 상술한 MEM과 α-MEM과의 혼합 배양액 중에서 배양을 계속하여 심방근 및 심실근으로 분화될 수 있다.

또 다른 하나의 예로 배아 줄기세포 유래의 배양체를 무당의 Hank's BSS(GIBCO) 등에서 세정해 충분히 당류를 제거한 후 저혈청 조건, 저영양 조건(예를 들면, 보통 시판의 배양액을 등장 완충액으로 10배에 희석한 것), 약산성 pH 조건, 저칼슘 조건의 배양액(Hank's BSS[무당]/DMEM무당]=9:1)에 유산 1mM(유산첨가 조건), 아스파라긴산 20mg/L와 글루탐산 20mg/L(아스파라긴산·글루탐산첨가 조건), 또는 피루브산 1mM(피루브산 첨가 조건)을 첨가한 배양액에서 3 - 7일간 배양하여 심근세포를 효율적으로 선택할 수 있다.

골수 유래의 성체 줄기 세포를 이용하여 심근세포를 제작하는 경우에도 세포 혼합물에서 심근세포를 선택할 때에 상술한 본 발명의 방법을 적용할 수 있었다. 여기에서 마우스 골수 유래의 심근세포는 국제 공개 WO01/048151(PCT/JP00/09323)에 기재된 세포 및 방법을 이용하여 유도하였다. 즉, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(GIBCO)에 소 태아 혈청 20%을 첨가해서 조정한 배지에서 CMG세포(CMG세포의 수립 방법은 J. Clin. Invest., 1999, Vol. 103, p697-705 참조)를 배양하여 최종농도 3μmol/l의 5-아자사이티딘(azacytidine)(SIGMA)을 24시간 첨가하고, 5-아자사이티딘을 포함하지 않는 상기배양액에서 2 - 3주일 배양함으로써 자율 박동하는 심근세포를 분화 유도할 수 있다. 자율 박동하는 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 상술한 생리적 내성선택법 및/또는 대사적 선택법으로 배양하여 심근세포를 얻을 수 있다.

또한, 마우스 태아로부터 심근세포를 얻는 경우, 처음 심근세포가 출현하는 태생 7일째(인간에서는 수정 후 16일째에 해당한다)에 이하와 같이 처리하여 선택·정제 할 수 있었다. 즉, 마우스의 태아를 무균적으로 추출하고, Hank's BSS[무당]로 4회 세정하였다. 세정 중에 1Om1의 피펫을 이용해서 수회 피펫팅하여 태아를 흩어진 세포 덩어리로 만든다. 이러한 세포 덩어리를 상술한 생리적 내성선택법 및/또는 대사적 선택법으로 배양하여 심근세포를 얻을 수 있다.

와 같이 본 발명의 심근세포의 기원으로서 이용하는 미분화 중배엽, 예정 심근세포 및 심근세포를 포함하는 세포 혼합물을 상기의 생리적 내성선택법 및/또는 대사적 선택법으로 배양하여 심근세포끼리 결합한 심근세포 덩어리가 얻어진다. 이런 방법으로 얻어진 심근세포 덩어리는 주위에 세포사를 일으키는 비심근세포의 층으로 덮혀 있어서, 얻어진 심근세포 덩어리를 이식에 사용할 경우에 이 비심근세포의 층을 제거하지 않으면 안 되는 점을 더욱 검토하였다.

본 발명의 발명자들은 일반적인 세포확산 방법인 트립신(Trypsin) 등 무작위로 단백질을 소화하는 효소나 EDTA 등의 이온 킬레이트제를 이용하여 세포 덩어리를 각각의 세포로 분리하면 심근세포의 생존율이 현저하게 저하되는 현상을 발견하였다. 이에 심근세포 덩어리를 유지하면서 주위에 부착한 죽은 세포를 효율적으로 제거하는 새로운 방법이 필요하게 되었다.

일반적으로 세포와 세포는 세포외 매트릭스라고 불리는 콜라겐이나 피브로넥틴, 엘라스틴 등으로 결합되거나 막 단백질의 직접적인 결합에 의하여 결합되어 있다고 여겨지고 있어서 본 발명의 발명자들은 심근세포 덩어리를 기질 단백질에 대한 특이성이 높은 콜라게나제나 엘라스타제를 이용하여 소화시켜 본 바, 세포가 조각조각으로 분산되지 않고 심근세포의 세포 덩어리를 유지하면서, 주위에 부착한 비심근세포의 죽은 세포를 효율적으로 제거할 수 있었다. 이러한 점에서 심근세포끼리의 결합은 주로 N-카드헤린(cadherin)이나 컨넥신(connexin) 등에 의한 직접적인 결합에 의한 것이라고 추측되었다.

본 발명에서는 예를 들어 0.01 - 0.1%의 III형 콜라게나제(Wartington)을 이용하여 37℃의 항온조에서 진탕처리를 20분간 행하여 심근세포를 죽은 세포와 분리하고 콜라게나제를 충분히 세정하기 위해서 원심과 상청교환을 4회 반복해 최종산물을 얻어 죽은 세포를 효율적으로 제거할 수 있었다.

단, 콜라게나제로 처리한 후에도 심근세포만으로 이루어지는 세포 덩어리에 비심근세포의 죽은 세포가 잔존하는 응집체가 회수될 경우가 있다. 이 죽은 세포가 잔존하는 응집체가 회수되는 것은 대사적 선택기간이 길어지면 길어질수록 출현 빈도가 증가하는 경향이다. 본 발명의 발명자들은 이러한 죽은 세포가 잔존하는 응집체의 밀도를 조사한 바, 이 경우의 죽은 세포는 살아있는 세포보다 고밀도·고비중인 것을 알아내어 적당한 밀도구배 원심분리로 살아있는 세포와 죽은 세포를 분리할 수 있다는 것을 찾아냈다. 이러한 밀도구배 원심분리로 살아있는 세포와 죽은 세포를 분리하기 위해서 사용할 수 있는 시약으로서는, Percoll^TM(Pharmacia사), Ficoll^TM(Pharmacia사), Optiprep(GIBCO) 등이 있고 이들에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 접착 배양한 배양체 중의 심근세포의 존재 양식을 나타낸 것이다.
도 2는 무혈청에서 배양한 접착 배양체에서의 심근세포 존재 양식을 나타낸 것이다.
도 3은 무혈청화에 의한 예정 심근세포의 선택을 나타낸 것이다.
도 4는 저칼슘 환경의 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 배아 줄기세포에 있어서의, 무혈청·약산성 pH 조건에 의한 예정 심근세포의 선택을 나타낸 것이다.
도 6a는 배아 줄기세포에 있어서의, 무혈청·약산성 pH 조건에 의한 예정 심근세포의 분석을 나타낸 것이다.
도 6b는 배아 줄기세포에 있어서의, 무혈청·약산성 pH 조건에 의한 예정 심근세포의 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 배아 줄기세포에 대하여 무혈청·약산성 pH 조건에 의하여 선택된 심근세포 덩어리를 나타낸 것이다.
도 8은 무당·무혈청의 유산을 첨가한 배양 조건에서의 심근세포의 선택을 나타낸 것이다.
도 9는 무당·무혈청의 유산을 첨가한 배양 조건에서 선택·회수된 세포에 대한 심근세포 특이적 염색을 나타낸 것이다.
도 10은 무혈청·약산성·저칼슘·무당 조건이고, 유산을 첨가한 배양 조건에서 선택된 직후의 심근세포 덩어리와 죽은 세포 덩어리를 나타낸 것이다.
도 11은 죽은 세포 덩어리인 고밀도 응집체를 밀도구배 원심분리(density-gradient centrifugation)으로 제거하는 방법을 나타낸 것이다.
도 12a는 무혈청·약산성·저칼슘·무당 조건이고, 유산을 첨가한 배양 조건에서 선택된 심근세포 덩어리를 나타낸 것이다.
도 12b는 무혈청·약산성·저칼슘·무당조건이고, 유산을 첨가한 배양 조건에서 선택된 심근세포 덩어리를 나타낸 것이다.
도 13은 무혈청·약산성·저칼슘·무당조건이고, 아스파라긴산·글루탐산을 첨가한 배양 조건으로 정제한 심근세포를 나타낸 것이다.
도 14는 골수 줄기 세포 유래 심근세포의 정제를 나타낸 것이다.
도 15은 태아에서 유래된 심근세포의 정제를 나타낸 것이다.
도 16은 무혈청·약산성·저칼슘·무당 조건이고, 피루브산을 첨가한 배양 조건으로 배양하였을 때의 자율 박동하는 세포영역을 나타낸 것이다.
도 17은 무당·무혈청 조건이고, 유산을 첨가한 배양 조건에서 15일간의 배양 후 선택된 명주원숭이(marmoset)의 심근세포 덩어리를 나타낸 것이다.
도 18은 무당·무혈청 조건이고 유산을 첨가한 배양 조건에서 선택·회수된 명주원숭이 세포에 대한 심근세포 특이적 염색을 나타낸 것이다.
도 19는 무당·무혈청이고 유산을 첨가한 배양 조건에서 선택·회수된 명주원숭이 세포가 수용자(recipient)의 심장 내부에서 생존한 것을 나타낸 것이다.
도 20은 유당(有唐)(대조)조건으로 배양한 인간 배아 줄기세포 유래의 세포 덩어리(대조)와 무당(심근선택)조건 하에서 15일간의 심근세포를 선택 배양한 인간 배아 줄기세포 유래의 세포 덩어리(심근선택조건)의 상태를 나타낸 것이다.
도 21은 무당(심근선택)조건 하에서 인간 배아 줄기세포에 대하여 15일간 심근세포를 선택 배양한 후, 배양액 조건을 변경하고나서 자율 박동을 재개한 심근세포가 형성하는 인간 배아 줄기세포 유래의 각 세포 덩어리의 항 액티닌 항체 및 항Nkx 2.5 항체에 의한 염색상을 나타낸 것이다.

실시예 1: 마우스 배아 줄기세포에 있어서의 저· 무혈청 배양 조건을 이용한 심근세포 선택적인 응집 덩어리의 형성

본 실시예에서는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거한 배양액 중에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈의 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)로 심근세포를 선택할 때에 있어서의 혈청고갈의 작용에 대하여 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포(세포주 명 EB3, Nat Genet 2000; 24:372-376)는 독립 행정법인·이화학연구소의 니와 히토시 박사로부터 분양받아 사용하였다. 이 마우스 배아 줄기세포를 기존의 방법(Differentiation 2001, 68, p31-43)과 유사한 방법, 즉, 배양액[α-MEM(Minimum Essential Medium)(SlGMA), 10% FBS(EQUlTEC BIO), 100units/m1 페니실린, 50μg/m1 스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 총 7일간 배양하였다. 이 방법으로 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 한 후, 배양체를 상기 배양액을 이용해서 배양 접시에 접착시켜서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 3 - 5일간 배양하였다. 이상을 기존의 심근세포 분화 방법으로 한다. 이 조건에 의하여 만들어진 세포 덩어리를 도 1에 나타내었다. 도 1A에 배양체의 현미경 상을 나타내었고, 도 1B에는 배양체의 심근세포를 항 액티닌 항체(SIGMA)을 이용하여 특이적으로 형광 면역 염색한 결과 나타내어진 배양체에 있어서의 심근세포 존재 영역을 윤곽선으로서 나타내었고, 그리고 도 1C에서는 배양체에 있어서의 심근세포를 상기 면역염색에 의해 나타내어진 심근세포의 존재 영역을 도 1A의 위상차 현미경 상의 윤곽을 추적하였다. 이들을 검토한 결과, 도 1D에서 접착한 배양체에의 심근세포의 존재 양식을 모식도에 나타낸 바와 같이 심근세포는 다른 세포의 내부에 파묻혀서 존재하여 배양체로 분리 정제하는 것이 용이하지 않았다.

한편, 마우스 배아 줄기세포를 동일한 조건에서 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 한 후, 배양 접시에 접착시켜 5일간 배양하고 분화된 심근세포를 포함하는 배양체의 배양 환경에서 혈청을 제거하여 3일간 더 배양하였다.

이 결과를 도 2에 나타내었다. 여기에서 도 2A는 상기 조건으로 선택 배양한 접착 배양체의 현미경 상을 나타내고, 도 2B는 배양체에 있어서의 심근세포를 비디오 촬영으로 밝혀진 자율 박동하는 심근영역을 윤곽선으로 나타내었다. 이들을 검토한 결과, 도 2C는 해당 선택 배양한 배양체에 있어서의 심근세포의 존재 양식을 나타낸 것으로 배양체의 표면에 심근세포 집단이 존재하는 동시에 심근세포끼리 덩어리를 형성하는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 마우스 배아 줄기세포에서 저· 무혈청배양 조건을 이용한 예정 심근세포 선택적인 응집 덩어리의 형성과 심근세포를 높은 비율로 함유하는 응집 덩어리의 형성

본 실시예는 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)을 혈청을 제거한 배양액 중에서 배양하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈의 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)로부터 예정 심근세포를 선택할 때에 있어서의 혈청고갈의 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 실시예 1의 통상적인 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여, EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 5일간 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 기존의 배양 방법(실시예 1에서 기술함)으로 분화 배양 7일째에 자율 박동하는 세포가 관찰되었다. 자율 박동하는 심근세포가 아직 관찰되지 않고 있는 분화 배양 5일째(4일부터 6일째도 같은 결과를 얻었다)에 배양 환경에서 혈청을 제거하고 1일(24시간) 배양하였다. 도 3A는 통상의 배양 조건으로 6일간 배양한 배양체를 나타내고, 도 3B은 배양 5일째에 혈청을 제거하여 1일(24시간) 배양한 도 3A과 동 시기의 배양체를 나타낸다.

배양 5일째에 혈청을 제거하고(배양체를 포함하는 용액을 원심분리관에 옮기고 자연 침강시킨 후 상청을 제거하고 무혈청 배지[α-MEM(SIGMA), 인슐린·트렌스페린·셀레늄(GIBCO) 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]로 한번 세정하고 동일한 배지에 치환) 1일(24시간)동안 배양한 도 3B에 나타낸 세포 덩어리를 1 - 4일간 더 배양하면 자율 박동을 하는 심근세포를 높은 비율로 함유하는 세포 덩어리로 분화된다. 이러한 점에서 마우스 배아 줄기세포를 배양 5일째에 혈청을 제거해서 1일(24시간) 배양하여 자율 박동을 하지 않지만 장래 심근세포로 분화될 예정 심근세포를 높은 비율로 함유하는 세포 덩어리를 형성할 수 있는 것을 나타내었다.

실시예 3: 마우스 배아 줄기세포의 저칼슘 배양액을 이용한 심근세포 이외의 세포의 선택적 분화·증식 억제

본 실시예는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 칼슘 농도를 저하시킨 배양액 중에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 칼슘 농도 저하의 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)에서 심근세포를 선택할 때의 칼슘 농도 저하의 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 실시예 1의 통상적인 방법으로 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 총 7일간 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 심근세포를 분화되게 하는 배양액 중의 칼슘 농도는 1.8mM이었다. 이 배양 방법에서 심근세포의 함유량은 10% 정도이며 다른 세포는 미분화 세포나 신경 세포, 상피세포 등이었다.

이에 대하여, 본 실시예에서는 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 분화 시작 후 5일째의 배양체를 플레이트에 접착시키고 동일한 배양액 중에서 1일(24시간)간 더 배양하였다. 분화 시작 후 6일째, 즉 배양체 접착 후 1일(24시간) 경과 후에 대조군에서는 10% FBS를 포함하는 RPMI 배양액(칼슘 농도 1.8mM)으로 8일째까지 배양하고(도 4A), 실험군에서는 배양액을 10% FBS를 포함하는 RPMI 배양액(칼슘 농도 0.4mM; GIBCO)으로 치환하여 배양하였다(도 4B). 이 결과 처리되지 않은 배양체에 비하여 처리한 배양체에서는 배양체의 주변(periphery)에 존재하는 편평세포의 성장이 억제되고 신경 세포에의 분화도 억제되었다(도 4B).

실시예 4: 마우스 배아 줄기세포에서 무혈청 ·약산성 pH 배양 조건에 의한 예정 심근세포의 선택

본 실시예는 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거한 동시에 약산성인 배양액 중에서 배양하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈 및 약산성 pH의 복합적인 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)에서 예정 심근세포를 선택할 때에 있어서의 혈청고갈 및 약산성pH의 복합적인 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 분화 시작 후 5일째의 것을 사용하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 본 실시예에서는 자율 박동하는 심근세포가 아직 관찰되지 않는 분화 배양 5일째(4일부터 6일째라도 같은 결과를 얻었다)에 배양액을 MEM(Minimum Essential Medium)(GIBCO)에 인슐린·트렌스페린·셀레늄(GIBCO)을 첨가한 것으로 교환하고 1일(24시간) 더 배양하였다. 이 배양액은 5% 탄산 가스 환경에서는 pH6.5 정도가 되는 특징을 지니기 때문에 5% 탄산 가스 환경에서 약산성화된 이 배양액 중에서 배양하였다.

그 결과, 자율 박동을 실시하지 않는 예정 심근세포를 높은 비율로 함유하는 세포 덩어리를 형성하였다. 도 5A는 보통의 조건으로 배양한 접착 배양체를 나타내고, 도 5B는 1일(24시간) 무혈청에서 배양한 배양체를, 도 5C는 2일간(48시간) 무혈청에서 배양한 배양체를 각각 나타낸다. 이 조건에서는 배양체의 표면 주변의 세포는 선택적으로 세포사를 나타내었지만, 배양체 중심부의 세포는 세포사를 일으키지 않았다(도 5). 도 5D는 도 5C를 기초로 예정 심근세포의 영역을 둘러싸고 죽은 세포가 존재하는 영역을 화살표로 나타내었다.

배양체 형성 후 5일 후부터 무혈청·약산성 pH 조건으로 24시간 배양하여 선택된 세포 덩어리와 이것을 3일간(72시간) 더 계속 배양한 세포 덩어리를 채취하였다. 이들 세포 덩어리의 동결 절편을 제작하고, 항 Brachyury 항체(Santacruz사)를 이용하여 미분화 중배엽 마커인 Brachyury에 대한 면역염색을 행하였다(도 6A - 6D). 그 결과, 무혈청·약산성 pH 조건으로 24시간 배양한 세포(도 6B 및 6D)는 혈청함유·중성 배양액으로 24시간 배양한 세포(도 6A 및 6C)에 비하여 Brachyury 양성세포의 비율이 현저하게 높았다. 3일간 더 계속 배양하여 선택된 세포 덩어리의 대부분의 세포는 Brachyury 양성이었다(도시하지 않음). 이 3일간 계속 배양한 세포 덩어리에서 가장 발생 초기의 예정 심근세포에서 발현된다고 알려진 Nkx2.5에 대한 항체(항 Nkx2.5 항체(Santacruz사))를 이용하여 면역염색을 행하였다(도 6E - 6N). 상기 Nkx 2.5는 심근세포로 분화한 후에도 발현이 유지된다는 것이 이미 알려져 있는 마커이다. 도 6E - H에는 혈청함유·중성 배양액으로 24시간 배양한 EB을 3일간 더 배양한 EB을 나타내었다. 이들의 배양 조건에서는 EB내 일부 세포가 심근세포로 분화된 것을 알 수 있다. 또한, 이 심근세포로 분화된 세포의 비율은 Brachyury에 양성이었던 세포(도 6A 및 6C)와 같았다. 이에 대하여, 도 6I - N에 나타내어지는 무혈청·약산성 pH 조건으로 24시간 배양한 EB에서는 심근세포로 분화된 세포는 전체의 세포의 약 80%로 증가하였고, 이것은 Brachyury 양성세포의 비율(도 6B 및 6D)과 같았다.

상기 5일+1일(24시간)로 선택된 세포는 항 Brachyury 항체에 대하여 양성이었지만 항 Nkx2.5 항체에 대하여는 음성이었다(도 6O열P열). 반대로 5일+1일(24시간)+3일의 세포 덩어리는 항 Brachyury 항체에 대하여 음성이었지만 항 Nkx 2.5 항체에 대하여는 양성이었다.

이 세포 덩어리를 1 - 4일간 더 배양하면 자율 박동을 실시하는 심근세포를 높은 비율로 함유하는 세포 덩어리로 분화되었다. 따라서, 5일 +1일(24시간)로 선택된 세포는 예정 심근세포인 것이 확인되었다.

실시예 5: 마우스 배아 줄기세포에 있어서의 무혈청 ·약산성 pH 배양 조건에 의한 심근세포의 선택

본 실시예에서는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거한 동시에 약산성인 배양액 중에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈 및 약산성 pH의 복합적인 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)로 심근세포를 선택할 때에 혈청고갈 및 약산성 pH의 복합적인 작용에 대하여 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 분화 시작 후 5일째의 것을 사용하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 본 실시예에서는 자율 박동하는 심근세포가 아직 관찰되지 않는 분화 배양 5일째(4일부터 6일째라도 같은 결과를 얻었다)에 배양액을 무혈청의 MEM 배양액(GIBCO)에 인슐린·트렌스페린·셀레늄(GIBCO)을 첨가한 것으로 교환하고 2일간 더 배양하였다. 얻어진 예정 심근세포 덩어리를 2일간 더 배양하고 심근세포로 분화되게 하였다. 도 7A는 상기에서 제작한 심근세포 덩어리의 현미경 상을 나타내고, 도 7B은 도 7A를 가로방향으로부터 본 모식도를 나타낸다.

이 조건에서는 심근 이외의 세포는 선택적으로 세포사를 나타내었지만, 반대로 심근세포는 자율 박동을 강하게 하여 세포사를 일으키지 않는 것을 알았다. 결과로서 심근세포를 많이 포함하는 세포 덩어리가 형성되었다(도 7A 및 도 7B).

실시예 6: 무당· 무혈청이며 유산을 첨가한 배양 조건에 있어서의 심근세포의 선택과 심근세포의 조정

본 실시예에서는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거한 동시에 당류를 제거한 배양액 중에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈 및 당류고갈의 복합적인 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)에서 심근세포를 선택할 때에 있어서의 혈청고갈 및 당류고갈의 복합적인 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 총 7일간 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 분화 시작 10일째까지 배양한 배양체에서 배양액 중의 당류를 완전히 제거하기 위하여 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(무당)배양액(GIBCO)로 4 - 5회 세정하고 최종적으로 유산 1mM을 첨가한 D-MEM 배양액(GIBCO) 중에서 7일간(복수회의 실험에서 자율 박동하는 심근세포의 생존율과 다른 세포의 생존율을 확인하고, 5 - 10일간의 범위에서 조절할 필요가 있다) 배양하였다. 생체 내의 유산농도는 생리적 조건 하에서 4mM정도까지 상승하기 때문에 이 유산의 농도는 생리적인 것이다.

그 결과, 도 8과 같이 살아있는 세포로서 심근세포로부터 만들어진 돔(dome)상의 세포망이 형성되었다. 도 8A는 선택된 망 모양이 된 심근세포를 나타내고, 도 8B은 도 8A를 옆에서 본 모식도를 나타낸다.

실시예 7: 심근세포 덩어리에 부착된 죽은 세포의 제거

실시예 6에서 제작한 세포 덩어리에는 죽은 세포나 세포 외 매트릭스가 부착되어 있다. 이것을 제거하여 심근세포 덩어리만을 정제할 필요가 있다. 그러나, 사전적 검토에서 트립신 등의 단백질을 비선택적으로 소화하는 효소를 이용했을 경우에는 심근세포의 생존율이 현저하게 저하되는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 실시예에서는 죽은 세포나 세포 외 매트릭스를 선택적으로 제거할 수 있는 조건을 검토하는 것을 목적으로 하였다.

실시예 6에서 제작하여 도 8에서 나타낸 세포 덩어리를 세포 외 매트릭스의 하나인 콜라겐을 선택적으로 소화하는 콜라게나제 0.01 - 0.1%을 이용하여 37℃에서 20분간 처리하였다. 콜라게나제만을 처리한 후 생리적 침투압을 가지는 임의의 등장액으로 세정하였다. 이 단계에서 심근세포는 세포 덩어리(지름 40μm 이상)을 유지하고 있기 때문에, 세정은 지름 40μm의 구멍을 가지는 시판의 막을 통하여 액을 교환하여 분산된 심근세포 이외의 세포를 선택적으로 제거하였다. 이 세정 작업은 4 - 5회 진행되었다. 회수된 세포 덩어리를 배양하고 심근세포의 지표가 되는 항 근절(sarcomere)-액티닌 항체(SIGMA)을 이용하여 면역염색하였다(적색[세포질의 황문섬유를 염색], 청색[핵을 DAPI(Molecu1arprobe사)에 의해 염색]).

그 결과 본 방법으로 정제한 심근세포 덩어리는 심근세포를 80% 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다(도 9).

실시예 8: 무혈청 ·약산성· 저칼슘 ·무당이며, 유산을 첨가한 배양 조건에 있어서의 심근세포의 정제

본 실시예는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거하고 약산성이며, 칼슘을 제거하는 동시에 당류를 제거한 배양액에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈, 약산성 pH, 저칼슘 및 당류고갈의 복합적인 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)로 심근세포를 선택할 때에 있어서의 혈청고갈, 약산성 pH, 저칼슘, 및 당류고갈의 복합적인 작용에 대하여 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 배양액[α-MEM(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 분화 시작 후 5일째의 것을 사용하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 본 실시예에서는 자율 박동하는 심근세포가 아직 관찰되지 않는 분화 배양 5일째(4일부터 6일째라도 같은 결과를 얻었다)에 배양액을 무혈청의 MEM배양액(GIBCO)에 인슐린·트렌스페린·셀레늄(GIBCO)을 첨가한 것으로 교환하고, 2일간 더 배양하였다. 얻어진 예정 심근세포 덩어리를 2일간 배양하고, 심근세포로 분화되게 하였다. 이 단계에서 심근세포를 매우 고농도로 함유하는 세포 덩어리가 형성되었다.

다음으로 배양액 중의 당류농도를 끝까지 제거하기 위하여 D-MEM 배양액(무당)(GIBCO)으로 4 - 5회 세정하고 최종적으로 유산 1mM을 더한 D-MEM 배양액(GIBCO) 중에서 7일간(복수회의 실험에서 자율 박동하는 심근세포의 생존율과 다른 세포의 생존율을 확인하고, 5 - 10일간의 범위에서 조절할 필요가 있다) 배양하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 살아있는 세포로서 심근세포만으로 이루어지는 심근세포 덩어리가 형성되었다.

이것을 세포 외 매트릭스의 하나인 콜라겐을 선택적으로 소화하는 콜라게나제 0.01 - 0.05%을 이용해서 37℃에서 20분간 처리하였다. 콜라게나제 처리 후 생리적 침투압을 가지는 버퍼(116mM NaC1, 20mM Hepes, 12.5 mM NaH₂PO₄, 5.6 mM 글루코스, 5.4mM KC1, 0.8mM MgSO₄, pH7.35)로 세정하였다. 세정은 지름 40μm의 구멍을 가지는 시판의 막을 통해서 액을 교환하여 총 4 - 5회 실시한다. 그 결과, 심근세포만으로 이루어지는 세포 덩어리와 죽은 세포로부터 이루어지는 고밀도의 응집체가 회수되었다(도 10A). 도 10A의 사각형 부분의 확대사진을 도 10C에 나타내었다. 그리고, 도 10A 및 10C의 죽은 세포의 위치를 도 10B 및 10D에 각각 나타내었다.

도 10에 나타낸 죽은 세포 덩어리인 고밀도의 응집체를 적절한 밀도구배 원심분리, 구체적으로는 Percoll^TM(Pharmacia사) 58.5%을 사용하는 밀도구배 원심분리를 하여 선택적으로 제거할 수 있다는 것이 밝혀졌다(도 11). 계속하여 얻어진 세포 덩어리를 배양하고 심근세포의 지표가 되는 항 근절-액티닌 항체와 항 GATA4 항체(Santacruz사)을 이용한 면역염색을 행하였다. 도 12A는 접착된 심근세포 덩어리를 나타낸다. 접착세포 덩어리의 주위에는 띄엄띄엄 부유된 죽은 세포가 있지만 접착된 비심근세포는 존재하지 않는다. 도 12B는 도 12A를 근절-액티닌(적색; 세포질)과 DAPI(Molecular probe사)(청색; 핵)로 면역염색한 것이다. 도 12C은 도 12A를 GATA4(적색; 핵)과 DAPI(청색; 핵)로 면역염색한 것이다. 공염색된 핵은 자색이 된다. 그 결과, 본 방법으로 정제한 심근세포 덩어리는 심근세포를 99.0% 함유하는 것이 밝혀졌다(도 12C).

실시예 9: 무혈청 ·약산성· 저칼슘 ·무당이며, 아스파라긴산·글루탐산을 첨가한 배양 조건에 있어서의 심근세포의 정제

본 실시예는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거하고, 약산성이며, 칼슘을 제거한 동시에 당류를 제거한 배양액 중 아스파라긴산·글루탐산을 첨가하여 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 아스파라긴산·글루탐산의 대상성의 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)로 심근세포를 선택할 때에 있어서의 아스파라긴산·글루탐산의 대상성의 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 배양액[α-MEM(SIGMA) 10% FBS(EQUITEC BIO)페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 분화 시작 후 5일째의 것을 사용하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 본 실시예에서는 자율 박동하는 심근세포가 아직 관찰되지 않는 분화 배양 5일째(4일부터 6일째라도 같은 결과를 얻었다)에 배양액으로부터 혈청을 제거하고 약산성 pH 저칼슘 환경에서 3일간 배양하였다. 이 단계에서 심근세포를 매우 고농도로 함유하는 세포 덩어리가 형성되었다. 다음으로 배양액 중의 당류농도를 완전히 제거하기 위하여 D-MEM 배양액(무당)(GIBCO)에서 4 - 5회 세정하였다. 세정은 지름 40μm의 구멍을 가지는 시판의 막을 통해서 액을 교환하였다. 최종적으로, DMEM 배양액(무당)에 글루탐산(SIGMA) 20mg/L 및 아스파라긴산(SIGMA) 20mg/L을 첨가하고 5일간(복수회의 실험에서, 자율 박동하는 심근세포의 생존율과 다른 세포의 생존율을 확인하고, 3 - 10일간의 범위에서 조절할 필요가 있다) 배양하였다. 그 결과, 심근세포만으로 이루어지는 심근세포 덩어리가 형성되었다. 이것을 세포 외 매트릭스의 하나인 콜라겐을 선택적으로 소화하는 콜라게나제 0.03%로, 37℃ 항온조에서 진탕으로 20분간 처리하였다. 콜라게나제 처리 후 생리적 침투압을 가지는 임의의 버퍼(116mM NaC1, 20mM Hepes, 12.5mM NaH₂PO₄, 5.6mM 글루코스, 5.4mM KC1, 0.8mM MgSO₄, pH7.35)로 세정하였다. 세정은 지름 40μm의 구멍을 가지는 시판의 막을 통해서 액을 교환하여 총 4 - 5회 행하였다. 이 결과, 심근세포만으로 이루어지는 세포 덩어리가 회수되었다. 얻어진 세포 덩어리를 배양하고, 심근세포의 지표가 되는 항 근절-액티닌 항체와 항 GATA4 항체를 이용한 면역염색을 행하였다(도 13).

또한, 세포를 통계적으로 처리하여 이미 알려져 있는 데이터와 비교하였다(도 13). 도 13A는 자율 박동을 하는 심근세포 콜로니의 현미경 상을 나타내고, 도 13B은 자율 박동을 하는 심근세포 콜로니의 근절-액티닌 염색(적색; 세포질), GATA-4 염색(녹색; 핵)과 DAPI 염색(청색; 핵)을 나타낸다.

그 결과 본 방법으로 정제한 심근세포 덩어리는 심근세포를 99.8% 함유하는 것을 알아내었다. 이 정제율은 기존의 심근세포 정제 방법(예를 들면, FASEB J. 2000; 14:2540-2548; J Clin Invest. 1996; 98:216-224; FASEB J. 2003; 17:740-742; J Mol Cell Cardiol. 2003; 35:1461-1472)에서 나타난 정제 결과 중 어느 것보다도 높은 것이 밝혀졌고, 본 방법이 고순도로 정제 가능한 동시에 고수율인 것으로 나타내어졌다(표 1).

표 1: αMHC-promoter/neo법과의 순도·회수량 비교

Field et al.(J. Clin. Invest. 1996. Vol. 98, 216-224)

	근절 미오신 양성 세포	근절 미오신 음성 세포	심근세포 비율
선택 없음	11	2000	0.55
물리적 분리	68	2000	3.4
G418 선택	791	3	99.6
본 발명	근절 액틴 GATA4 양성 세포	근절 액틴 GATA4 음성 세포
	5041	10	99.8
	사용한 ES 세포	수득된 심근세포
Field et al.	10⁶	≒10⁶
본 발명	7500	≒15000

실시예 10: 마우스 골수유래 성체 줄기 세포로부터 제작한 심근세포의 정제

본 실시예에서는 간엽계 줄기 세포라 일컬어지는 마우스 골수유래 성체 줄기 세포로 심근세포를 제작하고 선택·정제하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 골수유래 성체 줄기 세포(수컷 C3H/He마우스)로부터 분화되게 한 심근세포는 국제공개 WO01/048151에 기재된 세포 및 방법을 이용하여 유도하였다. 즉, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(GIBCO)에 소태아혈청 20%을 첨가하여 조정한 배지에서 CMG세포(CMG세포의 수립 방법은 J Clin Invest., March 1999, Vol.103, p697-705를 참조)를 배양하고 최종농도 3μmo/l의 5-아자사이티딘(SIGMA)을 24시간 첨가하고, 5-아자사이티딘을 포함하지 않는 상기 배양액에서 2 - 3주일 배양하여 심근세포의 분화를 유도하였다. 자율 박동 심근세포를 확인한 후 배양 환경에서 혈청을 제거하고 약산성 pH·저칼슘·무당이고, 유산 1mM을 첨가한 D-MEM 배양액(GIBCO) 중에서 5일간 배양하였다. 배양 후 죽은 세포를 제거하고 잔존하는 살아있는 세포에 심근세포의 지표가 되는 항 근절-액티닌 항체를 이용한 면역염색을 행하였다.

도 14A는 선택 전의 배양 세포의 모양을 나타낸 것이다. 박동세포를 포함하는 영역을 점선으로 나타내었다. 도 14B - C은 선택된 세포를 나타낸다. 도 14B는 위상차 현미경 상을, 도 14C는 도 14B와 같은 시야의 근절-액티닌 형광면역염색 상을 각각 나타내었다. 그 결과, 본 방법으로 제작한 세포의 약 90%가 심근세포인 것으로 밝혀졌다(도 14).

실시예 11: 마우스 태아 유래 심근세포의 정제

본 실시예는 마우스 태아에서 심근세포를 정제하는 것을 목적으로 하였다.

우선, 태생 7 - 9일의 마우스 배아를 모체자궁 내에서 꺼내고 조심스럽게 배아 외 조직과 분리한 후, 피펫팅하여 각각 흩어진 세포 덩어리로 만들었다. 얻어진 세포 덩어리를 무혈청·약산성 pH·저칼슘·무당의 유산 0.5mM을 첨가한 배양액 중에서 5일간(복수회의 실험에서 자율 박동하는 심근세포의 생존율과 다른 세포의 생존율을 확인하고, 3 - 10일간의 범위에서 조절할 필요가 있다) 배양하였다. 이 배양액은 Hank's BSS[무당]:RPMI[무당]=9:1의 비율로 혼합하여 제작하였다. 정제 심근세포를 접착배양하고 배양 후의 죽은 세포를 제거하고, 잔존하는 살아있는 세포에 대하여 심근세포의 지표가 되는 근절-액티닌 형광면역염색(녹색; 세포질) 및 DAPI 염색(적색; 핵)을 하였다.

도 15A는 2개의 다른 콜로니에 대해서, 박동하는 세포군의 위상차 현미경 상을 나타내었다. 도 15B은 4개의 다른 콜로니에 대해서, 근절-액티닌과 DAPI 염색을 중첩하여 한 것을 나타내었다. 그 결과, 본 방법으로 제작한 세포의 약 99%가 심근세포인 것으로 밝혀졌다(도 15).

실시예 12: 무혈청 ·약산성· 저칼슘 ·무당이며, 피루브산을 첨가한 배양 조건에 있어서의 심근세포의 정제

본 실시예는 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거하고, 약산성이며, 칼슘을 제거한 동시에 당류를 제거한 배양액 중에 피루브산을 첨가하여 배양함으로써, 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 피루브산의 대상성(compensation)의 작용, 보다 구체적으로는 세포 덩어리(배양체)에서 심근세포를 선택할 때에 있어서의 피루브산의 대상성의 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기세포를 배양액[α-MEM(SIGMA) 10% FBS(EQUITEC BIO) 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여 EB당 75개의 ES 세포를 행잉 드롭법으로 세포 덩어리로서 분화 시작 후 5일째의 것을 사용하여 예정 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)로 분화되게 하였다. 본 실시예에서는 자율 박동하는 심근세포가 아직 관찰되지 않는 분화 배양 5일(4일부터 6일째라도 같은 결과를 얻었다)에 배양액을 무혈청의 MEM 배양액(GIBCO)에 인슐린·트렌스페린·셀레늄(GIBCO)을 첨가한 것으로 교환하고 2일간 더 배양하였다. 얻어진 예정 심근세포 덩어리를 2일간 더 배양하여 심근세포로 분화되게 하였다. 이 단계에서 심근세포를 매우 고농도로 함유하는 세포 덩어리가 형성되었다. 다음으로 배양액 중의 당류농도를 완전히 제거하기 위하여 D-MEM 배양액(무당)(GIBCO)으로 4 - 5회 세정하였다. 세정은 지름 40μm의 구멍을 가지는 시판의 막을 통하여 액을 교환하였다. 세정 후 D-MEM 배양액(무당)(GIBCO)에 최종적으로 피루브산 1mM을 첨가하고 5일간 배양을 행하였다.

다음으로 세포 외 매트릭스의 하나인 콜라겐을 선택적으로 소화하는 콜라게나제 Type3(Worthington Biochemical Corp) 0.05%를 이용하여 37℃에서 20분간 진탕하였다. 콜라게나제 처리 후 생리적 침투압을 가지는 버퍼(116mM NaC1, 20mM Hepes, 12.5mM NaH₂PO₄, 5.6mM 글루코스, 5.4mM KC1, 0.8mM MgSO₄, pH7.35)로 세정하였다. 그 결과, 본 방법으로 정제한 심근세포 덩어리는 심근세포를 약 90% 이상의 자율 박동세포를 포함하는 것이 밝혀졌다(도 16).

실시예 13: 무당· 무혈청이며 유산을 첨가한 배양 조건에서 영장류 명주원숭이 배아 줄기세포 유래 심근세포의 선택과 심근세포의 조제

본 실시예에서는 영장류 명주원숭이의 배아 줄기세포유래 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거한 동시에 당류를 제거한 배양액 중에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈 및 당류고갈의 복합적인 작용, 보다 구체적으로는 영장류 명주원숭이의 배아 줄기세포유래의 세포 덩어리(배양체)에서 심근세포를 선택할 때에 있어서의 혈청고갈 및 당류고갈의 복합적인 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 한다.

명주원숭이 배아 줄기세포는 재단법인·실험 동물 중앙연구소에서 입수하였다. 이 명주원숭이의 배아 줄기세포를 마이토마이신C를 처리하여 증식 불활성화시킨 마우스 배아성 섬유아세포(mouse embyonic fibroblast; MEF)을 이용하여 미분화를 유지하면서 배양하였다. 배양액[KO-DMEM(GIBCO), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6mM L-글루타민, 0.1mM 비필수 아미노산(MEM), 0.2mM β-머캅토 에탄올(2-ME; Sigma), 100IU/ml 페니실린, 100μg/m1 황산 스트렙토마이신 및 8ng/m1 재조합 인간 백혈병 저지 인자(LIF; Chemicon), 재조합 인간 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF; Peprotech)]을 이용하였다. 계속하여 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)를 처리하여 37℃에서 l0분 작용시키고 ES 콜로니를 분리하였다.

계속하여, MEF와 ES를 분리하기 위하여 기공 사이즈 100μm의 망에 통과시켜 액을 수득하고 기공 사이즈 40μm의 망을 통과하지 못한 세포 덩어리를 수득하였다. 이 세포 덩어리가 순수한 ES 세포 덩어리이다. 분화 중에 EB 당 50 - 1000개의 ES 세포 덩어리를 박테리아 디쉬법으로 배양체로서 총 15 - 30일간 배양하여 심근세포를 포함하는 배양체로 분화되게 하였다. 이 때의 배양액은 본 실시예의 상술한 배양액으로부터 bFGF를 제외한 것[KO-DMEM(GIBCO), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM), 0.2mM β-머캅토 에탄올(2-ME; Sigma), 100IU/m1 페니실린, 100μg/m1 황산 스트렙토마이신, 및 8ng/m1 재조합 인간 백혈병 저지 인자(LIF;Chemicon)]을 사용하였다.

배양액 중의 당류를 완전히 제거하기 위해서 배양체를 원심 분리관으로 옮기고, D-MEM 배양액(무당)(GIBCO)로 5회 세정하고 최종적으로 유산 1mM을 첨가한 D-MEM배양액(무당)(GIBCO) 중에서 15일간 배양하였다. 생체내의 유산농도는 생리적 조건 하에서 4mM 정도까지 상승하기 때문에, 이 유산농도는 생리적인 것이며 이 농도까지의 범위에서 조정할 필요가 있다.

15일간 배양 후의 세포 덩어리의 상태를 도 17에 나타내었다. 이 결과, 도 17과 같이 살아있는 세포로서 심근세포로부터 만들어지는 기포상태의 세포구조가 형성되었다. 즉, 도 17A - C은 무당+유산 1mM의 배양액 중에서 선택적으로 생존하는 기포상태가 된 심근세포를 나타낸다. 도 l7A에서는 광투과성이 매우 낮은 부분이나 배양체는 이미 선택적으로 세포사를 일으키고 있다. 또한 도 17B 및 도 17B에 나타낸 배양체는 배양체 표면의 기포상태의 세포가 생존하고 있다. 도 17B을 더욱 확대하여 17C에 나타내었다.

이에, 상기 배양액(bFGF 불포함)을 동량 첨가하여 3 - 7일간 배양하였다. 생존하는 심근세포가 자율 박동을 재개하고 안정화되면 강제적으로 교반하면서 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)을 이용하여 37℃에서 10분간 처리하고 죽은 세포와 살아있는 세포를 분리한다. 죽은 세포는 실시예 8에 기재된 방법으로 제거하였다. 피브로넥틴(Sigma)으로 코팅된 디쉬에 접착시켰다(도 18 좌). 4% 파라포름알데히드에서 고정시킨 후, 실시예 8과 동일하게 항 액티닌 항체(Sigma)로, 실시예 4과 동일하게 항 Nkx2.5 항체(Santacruz)로 면역염색을 행하였다(각각, 도 18 우).

그 결과, 명주원숭이 배아 줄기세포를 무당·무혈청이며 유산을 첨가한 배양 조건 하에서 배양하여 세포를 정제, 심근세포를 선택적으로 수득할 수 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 14: 영장류 명주원숭이 배아 줄기세포 유래 심근세포의 면역부전 마우스 심장에의 이식과 생존 확인

본 실시예는 영장류 명주원숭이의 배아 줄기세포 유래 심근세포의 이용 방법인 심장에의 이식과 생존에 관한 검토를 목적으로 하였다.

29 게이지의 주사기 실린지(테루모사)내에서 실시예 13에서 제작한 명주원숭이 정제 심근세포를 0.2% III형 콜라게나제(Wortington), 0.125% 트립신( GIBCO)이 되도록 생리적 침투압을 가지는 버퍼(116mM NaC1, 20mM Hepes, 12.5mM NaH₂PO₄, 5.6mM 글루코스, 5.4mM KC1, 0.8 mM MgSO₄, pH7.35)에 현탁한 용액으로 37℃에서 20분 교반 처리하여 1 - 30개 정도의 심근세포로 구성되는 소세포 덩어리를 만들어 이식에 이용하였다. 이 심근세포가 포함된 생리적 염분농도의 상기 버퍼 100μL을 흡인하였다.

면역부전 마우스인 NOD-SCID(클리어사, 일본) 7주령의 수컷을 포레인(FORANE, isooflurane)(애보트사)을 이용하여 흡입 마취하였다. 그 후, 기관 내에 삽관하여 인공 호흡하에서 개흉하여 노출된 심장의 심선부로 부터 주사침을 심기부로 향하도록 심벽 내에 삽입하고 1개소에 부착하여 30μL정도를 주입하였다. 가슴을 닫고 마취에서 깨어나게 하여 계속 사육하였다.

이식 후, 15일째에 마취하여 심장을 적출하고 4% 파라포름알데히드로 조직을 고정하였다. 두께 10μm의 동결 절편을 제작하고 1차 항체로서 염소 항 Nkx 2.5 항체(Santacruz)를 ２차 항체로서 당나귀 항 염소 항체-Alexa488(녹색으로 발색)(Molecular probes)를 사용한 면역염색(도 19B), 또는 1차 항체로서 마우스 항 근절-액티닌 항체(Sigma)를 ２차 항체로서 토끼 항 마우스 항체-Alexa594(적색으로 발색)(Molecular probes)를 사용한 면역염색(도 19D) 중 어느 하나를 행하였다.

한편 마우스 항 인간핵 항원 항체(영장류 전반의 핵 항원에 반응)(Chemicon)과 염소 항 마우스 항체-Alexa633(Molecular probes)를 시험관 내에서 반응시켜 복합체를 형성하였다. 계속해서 정상 마우스 혈청을 이용하여 남은 염소 항 마우스 항체-Alexa633(적외)의 반응성을 저해하였다. 이 조작으로 제작한 항체 복합체를 상기의 절편에 반응시켜 총 3색의 염색을 행하였다(도 19B - 19D).

모든 면역염색에 공초점 현미경(CarlZeiss)의 영상을 도 19에 나타내었다.

그 결과, 도면의 큰 핵을 가지는 세포가 명주원숭이로부터 유래된 것이 밝혀졌다. 즉, 이 도면에서 심근마커인 Nkx 2.5을 발현하는 영장류 세포가 액티닌에 의해 염색된 심근세포 중에서 보여지는 것이 밝혀졌다. 이것은 명주원숭이 ES 세포유래의 심근세포가 마우스 심장 내에서 생존을 확인한 것을 의미한다.

실시예 l5 : 무당· 무혈청이며 유산을 첨가한 배양 조건에서 인간 배아 줄기세포 유래의 심근세포의 선택과 심근세포의 조제

본 실시예는 인간 배아 줄기세포 유래 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)를 혈청을 제거한 동시에 당을 제거한 배양액 중에서 배양하여 심근세포를 포함하는 세포 덩어리(배양체)에 대한 혈청고갈 및 당 고갈의 복합적인 작용, 보다 구체적으로는 인간 배아 줄기세포 유래의 세포 덩어리(배양체)로 심근세포를 선택할 때의 혈청고갈 및 당 고갈의 복합적인 작용에 대해 검토하는 것을 목적으로 하였다.

인간 배아 줄기세포는 국립 대학법인·교토 대학 재생 의과학 연구소부속 줄기 세포 의학 연구센터(내셔널 바이오 리소스 프로젝트에 의한 ES 세포 센터)로부터 입수하였다. 이 인간 배아 줄기세포를 마이토마이신C를 처리하여 증식 불활성화시킨 마우스 배아성 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast; MEF)을 이용해서 미분화를 유지하면서 배양하였다. 배양액[F12/DMEM(Ll)(SIGMA, 제품번호 D6421), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6mM L-글루타민, 0.lmM 비필수 아미노산(MEM), 0.1mM β-머캅토 에탄올(2-ME; Sigma), 100IU/m1 페니실린, 100μg/m1 황산 스트렙토마이신 및 재조합 인간 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF; Peprotech)]을 이용하였다. 계속하여 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)를 37℃에서 l0분 처리하여 ES 콜로니를 분리하였다.

계속하여 MEF와 ES를 분리하기 위하여 기공 사이즈 40μm의 망을 통과하지 못하는 세포 덩어리를 수득하였다. 이 세포 덩어리가 순수한 ES 세포 덩어리이다. 분화 중에 EB 당 50 - 1000개의 ES 세포 덩어리를 박테리아 디쉬법으로 배양체로서 총 15 - 30일간 배양(상기 배양액을 이용한다. 단 bFGF 불함유)하여 심근세포를 포함하는 배양체로 분화되게 하였다. 배양액 중의 당을 완전히 제거하기 위해 배양체를 원심분리관에 옮기고, D-MEM 배양액(무당)(GIBCO, 제품번호 11966)로 5회 세정하고, 최종적으로 유산 1mM을 더한 D-MEM 배양액(무당)(GIBCO, 제품번호 11966) 중에서 15일간 배양하였다. 생체 내의 유산농도는 생리적 조건 하에서 4mM 정도까지 상승하기 때문에 이 유산농도는 생리적인 것이며 이 농도까지의 범위에서 조정 할 필요가 있다.

당(糖) 존재 조건에서 배양한 세포 덩어리(대조 조건)과 상기 무당조건 하에서 15일간의 심근세포를 선택배양한 세포 덩어리(심근선택조건)의 상태를 위상차 상으로 도 20 왼쪽에 나타내었다. 이들 세포의 생사를 나타내기 위하여 생존 지표인 막전위를 검출해서 형광을 발하는 TMRM(Molecular Probes사)으로 염색하고 도 20 오른쪽에 각각 나타내었다. 이 결과 도 20의 상단과 같이 유당(대조) 조건군에서는 모든 배양체가 형광을 띄고(즉, 모든 배양체가 살아있는 세포로 구성된다), 도 20 하단과 같이, 무당(심근선택)조건에 있어서의 배양으로 형광을 띄지 않는 세포 덩어리(즉, 죽은 세포로 구성되는 세포 덩어리)가 나타났다. 또한, 무당(심근선택)조건에서 생존하는 세포 덩어리는 모두 자율 박동을 하고 있었다.

이에 대하여 상기의 배양액(bFGF 불함유)을 동량 첨가하여 3 - 7일간 배양하였다. 생존하는 심근세포가 자율 박동을 재개하고 안정화되면 강제적으로 교반하면서 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)를 이용해서 37℃에서 10분간 처리하고, 죽은 세포와 살아있는 세포를 분리한다. 죽은 세포는 실시예 8에 기재된 방법으로 제거하고 피브로넥틴(Sigma)으로 코팅된 디쉬에 부착시켰다.

4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 실시예 8과 동일하게 항 액티닌 항체(Sigma)로, 실시예 4과 동일하게 항 Nkx 2.5 항체(Santacruz)로 면역염색을 하고 각 세포 덩어리의 염색상을 도 21에 나타내었다. 이 도면에서 나타내어진 바와 같이 DAPI로 염색된 세포핵(도 21a)은 모두 심근 마커인 항 Nkx 2.5 항체에 의해 면역염색된 세포핵(도 21c)과 중첩되었다. 그리고 다른 심근 마커인 항 액티닌 항체에서의 면역염색 상(도 21d)과 항 Nkx 2.5 항체에 의해 면역염색 상을 비교하여 본 바, 항 Nkx 2.5 항체에 의해 면역염색된 세포와 항 액티닌 항체에서 면역염색된 세포와는 완전히 중첩되는 것으로 나타났다(도 21e).

이 결과 인간 배아 줄기세포를 무당·무혈청이며 유산을 첨가한 배양 조건 하에서 배양하여 세포를 정제, 심근세포를 선택적으로 수득할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

Claims

배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 태아, 또는 배아 생식세포(embryonic germ cells: EG 세포), 생식선 줄기세포(germline stem cells: GS 세포) 및 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells: iPS 세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 유래의 심근 세포와 비심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포를 수득하는 방법으로서,
상기 세포 혼합물을, 하기 (i) 및 (ii)의 조건을 가지는 배양액 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법:
(i) 당류를 0~111.20 μM 함유하는 저당 조건 및 혈청 성분의 농도가 0%~1%인 저혈청 조건,
(ii) 유산 첨가 조건, 아스파라긴산과 글루탐산 첨가 조건, 및 피루브산 첨가 조건으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 조건.
삭제
제1항에 있어서,
상기 세포 혼합물을,
(iii) 액중의 칼슘 농도가 0.3~1.3 mM인 저칼슘 조건, 및 배양액으로서 RPMI 배양액, DMEM 배양액, MEM 배양액, F12 배양액 또는 α-MEM 배양액을 이용하는 경우, 해당 배양액에 함유되는 모든 영양 성분이, 해당 배양액 중의 영양성분과 비교하여 10% 이하까지 저하된 조건인 저영양 조건으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 조건
을 가지는 배양액 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
콜라게나제를 이용하여 심근 세포에 부착된 죽은 세포를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
삭제
제4항에 있어서,
심근 세포의 비중에 비해 죽은 세포의 비중이 더 높은 것을 이용하여 죽은 세포를 제거하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
삭제
제1항에 있어서,
배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 또는 배아 생식세포(embryonic germ cells: EG 세포), 생식선 줄기세포(germline stem cells: GS 세포) 및 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells: iPS 세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포를 분화 유도하여 Brachyury+/Nkx2.5- 세포를 포함하는 배양체를 형성하고, 이 배양체를, pH 6~7의 약산성 pH 조건, 또는 상기 저혈청 조건 및 상기 약산성 pH 조건의 조합인 배양액 중에서 배양하여, 심근 세포와 비심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 조제하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
제1항에 있어서,
상기 유산 첨가 조건이, 유산을 0.1~5 mM 첨가하는 조건인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
제1항에 있어서,
상기 아스파라긴산과 글루탐산의 첨가 조건이, 아스파라긴산을 20~100 mg/L, 글루탐산을 20~100 mg/L 첨가하는 조건인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
제1항에 있어서,
상기 피루브산 첨가 조건이, 피루브산을 0.5~5 mM 첨가하는 조건인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
제1항에 있어서,
배아 생식세포(embryonic germ cells: EG 세포), 생식선 줄기세포(germline stem cells: GS 세포) 및 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells: iPS 세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포가, 배아줄기세포(ES 세포)에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재, ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 테라토마(teratoma) 형성능, 및 키메라 마우스 형성 기능으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질을 가지는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 수득 방법.
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