CN105209607A - 产生软骨细胞谱系细胞和/或类软骨组织的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

一种产生软骨细胞和/或软骨，任选地类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：a.采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，任选地CD56+，PDGFRα+KDR-类原条中胚层群，所述混合物包含：i.FGF激动剂；ii.BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和iii.任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，rWP2，或XAV939；以特化表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群；b.产生软骨细胞前体群，包括：i.将表达CD73，CD105和/或PDGFR-β的所述近轴中胚层群按照高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；ii.采用TGFβ3激动剂将所述高细胞密度CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层群培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和c.或者i.采用所述TGFβ3激动剂培养所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；或ii.采用BMP4激动剂培养所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。

Description

产生软骨细胞谱系细胞和/或类软骨组织的方法和组合物
相关申请的交叉引用
这是专利合作条约申请，其基于2013年4月5日提交的美国临时专利申请第61/809050的优先权，要求35U.S.C.§119的权益，该专利申请以其全部内容结合于本文中作为参考。
技术领域
本公开涉及由人多能干细胞产生软骨细胞和软骨，并且具体而言产生关节软骨细胞和类关节软骨的组织以及肥大软骨细胞和生长板软骨类似组织的方法。
背景技术
在体外由多能干细胞高效地并且可重复地产生分化的细胞类型的能力已经对开发用于治疗广大范围内的退化和衰弱疾病的细胞基疗法敞开了大门。骨关节炎(OA)是这种治疗的候选，因为它影响至少十分之一的成年人(Lawrence，Felsonetal.2008)，由于与关节运动有关的疼痛而使患者生命质量较差。OA的致病标志包括作为关节的内衬的关节软骨的胞外基质(ECM)的退化，伴随有下面的软骨下骨增厚和骨赘(骨刺)的形成。关节软骨通过早期特异性发育并在整个成人生命中保持的称为关节软骨细胞(ACs)的独特亚群细胞产生。虽然AC的功能是保持关节软骨在正常情况下的完整性，但它们却表现出极低的修复受伤或疾病导致的软骨受损的能力。因此，随着疾病的发展，软骨的损伤如此广泛以至于经常需要进行诸如关节置换的手术治疗才能提高所述患者的生命质量。ACs不同于生长板软骨细胞(GPCs)，其原生功能是通过软骨内骨化的过程形成骨(Colnot，2005)。有趣的是，随着OA的发作，ACs似乎会获得GPC的一些特性，包括肥大，这可能对这种疾病的发病机理推波助澜。
软骨细胞和软骨替换代表一种OA的潜在新疗法，其可能会在某些时候显著降低对机械装置的需要。然而，这种类型的疗法依赖于合适的组织的使用和足够数量的高度富含ACs。公认的是，成人间充质干细胞(MSCs)可以体外分化为软骨细胞，然而，目前还不清楚，它们是否可以产生AC，这是由于由它们产生的类软骨组织过早地发生肥大的AC((Pelttari，Winteretal.2006，Steinert，Ghivizzanietal.2007，Pelttari，Stecketal.2008)。另外，ACs已直接收获自患者并用于离体组织生成，但是它们增殖的能力有限。通过传代软骨细胞产生的组织表现出纤维软骨特性，这对于患者在短期内可以提高生命质量，但最终还会发生降解，因为它缺乏足够的承重能力((Tins，McCalletal.2005，LaPrade，Burschetal.2008)。诸如胚胎的多能干细胞(PSCs)和诱导的多能干细胞(ESCs，iPSCs)可以代表用于治疗应用的软骨细胞和组织的一种新的且潜在的无限来源，因为这些细胞可以在体外的适当条件下产生广谱的细胞类型。
软骨细胞在侧板中胚层(LPM)注定产生造血细胞和心血管谱系产生之后才从早期胚胎中诱导的近轴中胚层按照有序时间模式发育((Lawson，Menesesetal.1991，Kinder，Tsangetal.1999)。诱导后，近轴中胚层的条就分成体节(KulesaandFraser2002)。体节发育会部分受到转录因子paraxis(TCF15)和TBX18调节，这些转录因子的表达会与近轴中胚层的诱导一致((Burgess，Rawlsetal.1996，Bussen，Petryetal.2004，Singh，Petryetal.2005)。各个体节然后被图案化成形成包括软骨和脊柱的轴骨骼的腹侧骨节，和发育成骨骼肌和背部真皮的所述背侧生皮肌节(Hirsinger，Jouveetal.2000)。所述骨节的规格由两个转录因子，Meox1((Mankoo，Skuntzetal.2003)和Nkx3.2(Bapx1)的表达标记。具有软骨形成潜能的胶原蛋白2(Col2a1)阳性间充质细胞的群由骨节衍生细胞在小鼠发育的E12.5处发育((Akiyama，Chaboissieretal.2002，Dao，Jonasonetal.2012)。
虽然分化祖细胞成软骨形成谱系的方法已经建立，但所述特化AC，以及最终稳定含非肥大软骨细胞的软骨组织的能力，仍然知之甚少。AC衍生自域间细胞，形成于滑膜关节的未来位点的纤维变性的细胞群，由Wnt9A/14以及生长和分化因子5(GDF5/BMP14)的上调标记((Archer，Dowthwaiteetal.2003，Pacifici，Koyamaetal.2006)，生长和分化因子5(GDF5/BMP14)是TGFB超家族的成员。谱系追踪研究表明，GDF5-表达域间细胞会产生几个包括ACs的关节组织，但不会贡献于所述GPC群(Koyama，Shibukawaetal.2008)。GPCs，相比之下，由浓缩的软骨形成间质发育并表达BMP2,4和7，以及肥大相关的基因，包括胶原蛋白10。ACs和GPCs的独特域在二次骨化中心开始形成时7-8个出生日龄那么早就会观察到(Murakami，Balmesetal.2004，Blumer，Longatoetal.2007)。这些观察结果间接表明，ACs和GPCs是由不同的祖群在发育期间产生的，而因此，可以代表不同的谱系。
大量的研究已经表明，有可能从小鼠(m)和人ESCs和iPSCs体外衍生软骨细胞。然而，大多数都使用血清基培养基支持分化的早期阶段，导致混合谱系末期培养基的生成((Kramer，Hegertetal.2000，zurNieden，Kempkaetal.2005，Hwang，Kimetal.2006，Hwang，Vargheseetal.2008，Jukes，Bothetal.2008，Yamashita，Krawetzetal.2008)。最近的研究已经报道了使用含有特异性路径激动剂和拮抗剂的已定义培养基介质引导分化((Nakayama，Duryeaetal.2003，Darabi，Gehlbachetal.2008，Tanaka，Jokubaitisetal.2009)。在mESCs中，Tanaka等(Tanakaetal，2009)证明，Wnt信令与BMP抑制的组合导致具有软骨形成潜能的近轴中胚层生成，通过PDGFRα的表达和Flk-1的表达的缺乏进行识别。这种中胚层还表现出一些心脏潜力，但没有表现出产生造血细胞的能力，这表明对BMP信令的依赖型会区分不同类型的中胚层。
Oldershaw等(Oldershaw，Baxteretal.2010)使用了无血清方案。使用Oldershaw的所述方法没有体外或体内获得组织。
Umeda等(Umeda，Zhaoetal.2012)使用了采用PDGF刺激的方法，产生了含有Runx2表达细胞的结节。
骨关节炎是退化性疾病，主要影响关节的内衬关节的关节软骨。关节软骨一旦受伤具有自身再生的能力有限，因此细胞和组织替换策略是有效替换这个组织的唯一手段。由多能干细胞产生人软骨的方法目前仍缺乏，但是在患有诸如骨关节炎的关节疾病的患者中，却非常需要这样的组织以用于药物恢复和软骨替换策略。
发明内容
本申请的一个方面提供了一种产生软骨细胞谱系细胞和/或类软骨组织，任选地类关节的非肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
(a)采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层细胞群(例如，第2阶段)，任选地CD56+，PDGFRα+类原条中胚层细胞群，所述混合物包含：
(i)FGF激动剂；
(ii)BMP抑制剂，任选地头蛋白(Noggin)，LDN-193189,和/或Dorsomorphin；和
(iii)任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431542；和Wnt抑制剂，任选地IWP2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙酰胺；Sigma)；Dickkopf-相关蛋白1(DKK1；R&D系统),和/或XAV939(3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-硫代吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮；Sigma)；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层细胞群；
(b)由表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层细胞群产生软骨细胞前体群，所述产生所述软骨细胞前体群包括：
(i)在无血清或含血清培养基中，以高细胞密度培养表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层细胞群；
(ii)在无血清培养基中采用TGFβ激动剂，任选地TGFB1，TGFB2和/或TGFB3培养所述高细胞密度CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层细胞群，以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群(例如，阶段3)；和
(c)
(i)将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂(任选地TGFβ1，TGFβ2和/或TGFβ3)培养一段延长的时间而产生类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织；或
(ii)采用BMP4激动剂将所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨组织(例如，阶段4)。
另一方面包括一种产生类软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，任选地类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
(a)采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群，以诱导表达CD56和/或PDGFR-α的类原条中胚层细胞群(例如，阶段1)；
(b)采用特化混合物的近轴中胚层培养表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层细胞群，所述混合物包含：
(i)FGF激动剂；
(ii)BMP抑制剂，任选地头蛋白，LDN-193189,和/或Dorsomorphin；和
(iii)TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2和/或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层细胞群；
(c)由表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层细胞群产生软骨细胞前体群，产生软骨细胞前体群包括：
(i)将表达CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层细胞群按照高细胞密度培养于无血清或含血清培养基中；
(ii)将高细胞密度CD73+，CD105+和PDGFRβ+近轴中胚层细胞群采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
(d)
(i)将高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织；或
(ii)将高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述方法用于产生类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。在另一个实施例中，所述方法用于产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用所述TGFβ激动剂进行培养的所述延长的一段时间为至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周，至少9周，至少10周，至少11周，至少12周或更长，以产生表达例如润滑素和CILP2的类非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用所述BMP4激动剂进行培养的所述延长的一段时间为至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周，至少9周，至少10周，至少11周，至少12周或更长，以产生表达胶原蛋白2的类软骨的组织或者表达胶原蛋白10的肥大软骨细胞的细胞。
一种产生类软骨细胞的细胞的方法，包括：
(a)将所述软骨细胞的前体细胞按照高细胞密度培养于无血清或含血清培养基中；
(b)将所述高细胞密度软骨细胞的前体细胞采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中；和
(c)
(i)将所述软骨细胞的前体细胞采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节软骨的软骨细胞；或
(ii)将所述软骨细胞的前体细胞采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生肥大软骨细胞谱系细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述软骨细胞的前体细胞是原生胎儿软骨细胞或传代胎儿软骨细胞。
在一个实施例中，将产生的细胞和/或组织给药于受试者。
在另一个实施例中还提供了根据本文中描述的方法产生的一种类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的独立的群。
进一步的方面包括含有类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，和载体，任选地PEG，水凝胶，骨支架，骨替代支架和/或基质胶的群的组合物。在一个实施例中，所述载体是医药级的。
在一个实施例中，所述分离的群包含于一种含有稀释剂或载体，任选地药物稀释剂的组合物中。在一个实施例中，所述稀释剂是培养基介质，任选地含有冷冻保存剂，诸如甘油和/或DMSO，血清和白蛋白，诸如人血清白蛋白。
进一步的方面包括含有本文中所述的细胞或组合物的软骨和/或骨组织产品，以及支架。
另一方面包括用于改善症状和/或治疗有需要的受试者的方法，包括给药使用本文中所述的方法产生的细胞和/或组织和/或植入本文中所述的软骨和/或骨组织产品。
另一方面中还提供了本文中所述的方法产生的细胞和/或组织和/或含有所述细胞和/或组织的软骨和/或骨组织产品用于改善症状和/或治疗有需要的受试者的用途。
进一步的方面包括一种产生近轴中胚层细胞群的方法，包括：
(a)采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层细胞群(例如，第0阶段)；
(b)采用特化混合物的近轴中胚层培养表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层细胞群，所述混合物包含：
(i)FGF激动剂；和
(ii)BMP抑制剂，任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
(iii)TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2,和/或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层细胞群。
还提供了分离出细胞的方法和筛选分析法。
本发明公开的其他特征和优点由以下的详细描述将变得显而易见。然而，应当理解的是，所述详细描述和具体实施例尽管指示本发明公开的优选实施例但仅仅通过举例说明的方式提供，因为本公开的精神和范围内的各种变化和修改由这些详细描述对于本领域内那些技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
现在将关于附图描述本发明公开的实施例，其中：
图1.近轴中胚层,软骨细胞祖细胞，和软骨组织由人多能干细胞(hPSCs)的无血清分化。(A)hPSCs在包括使用活化素A，BMP4和碱性(b)FGF从分化的第1～4天作为类胚体的类原条中胚层群(第1阶段)诱导的第4阶段分化。在第4天(T4)，通过流式细胞仪(B)通过CD56和PDGFRA在细胞表面上的表达监测中胚层群。通过从第4～6天处理Dorsomorphin，BMP抑制剂，TGFβ抑制剂SB431542，和bFGF和从第4～15天处理bFGF(第2阶段)，将第4天中胚层细胞特化为单层培养中的近轴中胚层命运(fate)。第15天近轴中胚层细胞通过以高密度“斑”(称为微团)接种，或通过在TGFB3的存在下接种于胶原蛋白涂覆的膜过滤器(未示出)上约10天就可以产生软骨细胞祖细胞(第3阶段)。软骨细胞祖细胞可以在分化的第4阶段期间通过延长用TGFB3(关节)或BMP3(类生长板)的刺激例如12周而特化为软骨组织形式中的关节软骨细胞或类生长板软骨细胞。组织一直保持于培养基中至少7个月。类原条群由hESCs(C)和hIPSCs(D，E)的有效诱导通过CD56和PDGFRa通过流式细胞仪在分化的第3天的表达而证实。hESCs经过诱导而产生具有以下细胞因子的原条群：活化素A(2ng/mL)，BMP4(3ng/mL)和碱性(b)FGF(5ng/mL)。使用用活化素A(3ng/mL)，BMP4(1ng/mL)和bFGF(5ng/mL)在所述Wnt路径激动剂CHIR99061(1μM)的存在(C)或不存在(D)下从分化的第1～3天诱导hiPSCs产生类原条中胚层群作为类胚体(第1阶段)。
图2.衍生自hPSCs的近轴中胚层的表征。用无其他因子(0DM，noFGF)，FGF，4μMDM，或4μMDM+FGF处理的第5天中胚层的流式细胞仪分析。第5天的分布曲线描绘KDR和PDGFRa的表达，双阳性群(门控的)指示具有心电位(20)的中胚层。以FGF处理导致在第5天的PDGFRa表达更少。(B)在分化的第15天，细胞表面标记物CD73，CD105，和PDGFR-β在中胚层群上的表达。(C)Wnt抑制也可以改善CD73和CD105表达的效率。在第4天至第6天期间的实验细胞处理包括Dorsomorphin，bFGF和TGFβ抑制剂(SB431542)在所述Wnt路径抑制剂IWP2的存在或不存在下的组合。CD73和CD105的流式细胞仪分析，在第15天中如所示衍生的中胚层群。(D)在所示因子中衍生的第15天中胚层群的基因表达分析。Nkx2.5是心脏转录因子，Meox1和Nkx3.2是近轴中胚层和体节转录因子。(E)显微照片描绘了衍生于如所示的第15天的中胚层群的1日龄微团和1周龄微团。(F)衍生于如所示的第15天的中胚层群的1周龄微团中的心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达的衍生流式细胞仪分析。(G)衍生于DM+FGF-处理的近轴中胚层的4周龄微团产生软骨组织，但仅用FGF特化的中胚层并不产生类软骨的组织(见非粘附聚集体)。
图3.CD73+CD105+Pβ+细胞含有软骨细胞的潜力和体外生成类软骨的组织的潜力。(A)DM+FGF处理的近轴中胚层在第12天和第15天的流式细胞仪分析。双阳性(CD73+CD105+和CD73+Pβ+)群通过细胞分选和接种于微团培养基中而从双阴性群分离出来。(B)10天培养之后的微团培养基。(C)2周培养之后的团培养基。(D)5周培养之后衍生于分选的群的软骨组织的照片。
图4.TGFB3和BMP4用关节软骨和生长板软骨的表型特化软骨细胞和类软骨的组织。(A)采用TGFB3或BMP4衍生的20×放大的5周龄微团的显微照片。(B)采用TGFB3或BMP4衍生的13周龄软骨组织的组织病理(甲苯胺蓝染色)。甲苯胺蓝因温变色地因温变色染色软骨组织，和这些组织部分呈粉红色/紫色的颜色，表明软骨组织存在。(C)3周和5周龄微团的正向和侧向细胞散射参数的流式细胞仪分析。侧向散射指示细胞粒度而正向细胞散射指示细胞尺寸。(D)hPSC衍生的微团组织与胎原生软骨细胞衍生的微团组织和所述发育的人胎股骨软骨的比较。关节软骨区相比于类生长板区似乎有更小的细胞尺寸，其包含的细胞出现增大(肥大)。在微团中以及在所述胎股骨中的软骨组织用所述甲苯胺蓝染色进行均匀染色(图像是粉红色/紫色的颜色并显示软骨蛋白的存在)。所述BMP4处理的微团组织含有大量的增大细胞，其类似于所述胎软骨的底板，这代表生长板软骨。TGFB3处理的微团培养基包含，如果存在，更少的增大的软骨细胞，并看起来类似于所述胎软骨的上面板，这是关节软骨的位置。(E)采用GDF5代替BMP4生成肥大软骨细胞的显微照片。(F)12周后衍生于用甲苯胺蓝染色的hiPSCs的软骨组织的组织学分析。(G，H)hESC-衍生的软骨组织对于II型胶原蛋白(G，8周组织)，和润滑素(H，12周组织)的免疫组织化学染色。
图5.分别在第3和第4阶段期间在TGFB3或BMP4的存在下软骨细胞特化的基因表达分析。一般软骨细胞基因Sox9(A)和胶原蛋白2(B)，肥大基因胶原蛋白10(C)，Runx2(D)，osterix(E)和碱性磷酸酶(F)，关节软骨相关基因润滑素(G)和软骨中间层蛋白2(CILP2)(1H)，区间-相关(关节祖细胞)基因GDF5(Ⅰ)，ERG(J)和Wnt9a(K)。表达是相对于TBP的拷贝数(n＝3～8生物学复制)并且对比于原生胎儿软骨细胞(年龄16～19周，n＝4)，原生健康成年人关节软骨细胞(n＝2)，和由成年人的髂嵴(n＝1)分离的类生长板的软骨细胞。T15中胚层指示第15天hESC衍生的近轴中胚层(DM+FGF-处理的)。误差条指示平均数标准误差。
图6.CD73由关节软骨细胞表达。原生软骨细胞(A)健康成人关节软骨细胞和类髂嵴GPC的软骨细胞，(B)原生胎儿软骨细胞，原生(C)或传代(传代(P)2，D)胎儿软骨细胞在TGFB3或BMP4存在下经9到10周的微团培养后，和(E,F)hPSC-衍生的软骨细胞在TGFB3或BMP4的存在下衍生11周之后的流式细胞仪分析。(G)CD73和PDGFR-β细胞表面在T12和T15近轴中胚层群上的表达，和用TGFB3处理的微团培养基在3天，10天，和2周之后的时间过程。(H)CD73在TGFB3处理的微团上的表达的3天，7天，10天，和2至5周之后的时间过程。
图7.hPSC衍生的软骨细胞体内保持各自的关节或肥大软骨细胞的表型。用TGFβ3或BMP4处理的微团组织(年龄8-12周)通过胶原蛋白酶处理进行解离和软骨细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中12周。在12周之后，收获移植物并对移植物进行组织学分析。切片用甲苯胺蓝(A，C)染色以指示蛋白聚糖和vonKossa(B)的存在，以识别矿化的区域。Ⅱ型(D)和X型胶原蛋白(E)进行免疫组织化学检测。体内12周之后，TGFβ3处理的软骨细胞衍生的移植物对于Ⅱ型胶原蛋白(D)染色呈阳性并用甲苯胺蓝(A，C)因温变色地因温变色染色，而未发现vonKossa(B)或X型胶原蛋白阳性(E)的区域。矿化(B)的区域，(vonKossa阳性，黑色)在12周之后识别于衍生于BMP4处理的软骨细胞的植入物中，但这些区域几乎不含蛋白聚糖(A，C)和对II型(D)和X型胶原蛋白(E)染色阳性，表明钙化软骨的发育。
图8.TGFβ1，TGFβ2，和TGFβ3由hPSC衍生的近轴中胚层产生关节软骨细胞。在TGFβ激动剂存在下12周的微团培养之后的COL2A1，润滑素，和CILP2的基因表达，如所示(10ng/mL)。数值代表相对于TBP的mRNA拷贝数。误差条表示平均数标准误差。
图9.hPSC衍生的类关节的软骨适当响应促炎性分子IL1β。(A)描述了所述实验方案。关节软骨组织在TGFβ3的存在下从于hPSCs衍生10周。软骨组织(微团)用TGFβ3或IL1β(10ng/mL)处理2周(第10-12周)，如所示。软骨组织进行组织学分析或解离以用于基因表达分析。hPSC衍生的关节软骨细胞响应外源性IL1β(F，G)而显著上调MMP13(B)，MMP2(C)，ADAMTS4(D)和ADAMTS5(E)的表达。响应IL1β.(H，I)，显著下调基因编码胞外基质组分，COL2A1和ACAN。浅表区软骨细胞基因PRG4(润滑素)和CILP2的表达在IL1β的存在下显著下调。(J)VEGF在IL1β的存在下被上调。数值代表相对于TBP的mRNA复制数(n＝7)。误差条表示平均数标准误差。(K)12周组织在处理之后的组织学分析，如所示。因温变色的甲苯胺蓝染色指示蛋白聚糖。
具体实施方式
1.定义
如本文中所用的术语“类原条中胚层细胞群”是指表达Brachyury和所述细胞表面标记CD56和PDGFRα的中胚层细胞群。例如，所述类原条中胚层细胞群可以包含至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或约90％表达CD56的细胞而PDGFRα软骨分化已经采用所述公开的方法使用例如50％CD56/PDGFRα+细胞而获得。
如本文中所用的术语“表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层细胞群”是指表达CD73，CD105和/或PDGFR-β的中胚层细胞和所述近轴中胚层转录因子Meox1。例如，所述近轴中胚层细胞群包含表达Meox1，CD73，CD105和/或PDGFR-β的至少70％的细胞。如图2D中所示。相比于非FGF和Dorsomorphin处理的细胞，Meox1表达在FGF和Dorsomorphin处理的细胞中增大。
如本文中所用的所述术语“表达”是指细胞中多核苷酸的转录或多肽的翻译，如此而使所述分子的水平在表达所述分子的细胞中比它们在并不表达所述分子的细胞中显著更高。测定分子表达的方法在本领域内对于那些普通技术人员而言是众所周知的，并且包括但不限于，RNA印迹法，RT-PCR，原位杂交，免疫印迹法，和免疫组织化学如FACS。
如本文中所用的所述术语“表达”也表示为“+”，是指相对于细胞蛋白水平，相比于并不表达所述蛋白的细胞可检测的蛋白表达，例如这通过FACS分析测定。使用FACS分析，如果所述信号的平均荧光比并未用所述抗体染色的细胞(未染色对照物)或用所述抗体染色但并未将所述蛋白表达于所述细胞表面上的细胞更明亮时，细胞认为阳性表达所述蛋白于所述细胞表面上。相对于细胞群，如本文中所用的“表达”是指所述细胞群中至少50％的所述细胞表达所述标记。在一个实施例中，所述细胞表达例如细胞表达CD73的或其他标记经过排序而使，例如70％，80％或更多的所述细胞呈阳性而表达所述标记。
如本文中所用的术语“缺乏表达”也表示为“-”是指相对于细胞蛋白水平，相比于表达所述蛋白的细胞检测不到的蛋白表达，例如，这通过FACS分析测定。相对于细胞群，如本文中所用的“缺乏表达”是指细胞群中小于25％，小于20％，小于15％，小于10％，小于5％或小于1％的细胞表达所述标记。
如本文中所用的术语“培养”是指在贴壁，悬浮或3D培养基上培养和/或传代细胞。如本文中所用的所述术语“贴壁培养”是指细胞培养系统，藉此细胞培养于固体表面，所述固体表面可以涂布有不可溶基板，该不可溶基板可以进而涂布有基板的另一表面涂层，诸如下面列出的那些，或任何其他使细胞增殖或可以稳定于培养基中的化学或生物材料。所述细胞可以或不可以仅仅附着于所述固体表面或所述基板上。对于贴壁培养的基板可以包含组织培养物处理的塑料，多聚鸟氨酸，层粘连蛋白，多聚赖氨酸，纯化胶原蛋白，明胶，纤连蛋白，肌腱蛋白，玻连蛋白，巢蛋白，肝素硫酸蛋白多糖，多糖酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)的任何一种或组合。在一个实施例中，所述细胞接种于涂层板上。在另一个实施例中，所述细胞接种于纤连蛋白涂层板上。细胞可以培养于过滤器培养基和微团培养基上。在一个实施例中，细胞接种于膜过滤器上，任选地是放置于组织培养皿中作为跨室系统的部分的那些(微孔，alvatex是两种品牌)。所述基板也可能是骨支架替代物，诸如CPP(聚磷酸钙)或医药上可用的支架。微团培养基由细胞的高密度悬浮液构成，容许贴附至小面积的所述基板(例如，200000-500000个细胞贴附至基板的0.2～1cm直径的圆形区域)。任何形状或大小的基板都可以使用，例如通过3D打印技术制备的基板。所述术语“悬浮液”用于细胞培养的语境中，按照其本领域内的意义使用。即，细胞培养基悬浮液是细胞培养基环境，其中所述细胞不会贴附于表面。本领域内的技术人员将熟悉悬浮液培养技术，包括，但不限于，如果必要，诸如流罩，培养箱的设备和/或用于保持所述细胞于恒定运动的设备(例如，转子平台，摇床)等的使用。
术语“接触”或“用…培养”预想用于包括体外一起培养所述组分和细胞/组织(例如，将所述化合物加入到培养基中的细胞中)而“接触”或“用...培养”的步骤可以按照任何合适的方式进行实施。例如，所述细胞可以在贴壁培养基，或悬浮培养基，或3D培养基中处理；可以时间上基本同时(例如，在混合物中一起)或依次(例如，从加入第一组分的1h，1天或更长的时间内)添加所述组分。所述细胞也可以与另一种试剂(如生长因子或其他分化剂)或用于稳定细胞或进一步分化所述细胞的环境接触并包括在现有技术中已知的条件下培养所述细胞。第1阶段例如通常是在悬浮培养基中实施。第2阶段在一个实施例中是在悬浮液内实施。第3阶段和/或第4阶段，例如，如果所述细胞以颗粒形式，而不是微团或过滤形式聚集，则例如，可以在悬浮培养基中实施。微球培养基是可以在管中的悬浮液内漂浮的高密度的细胞簇。在一个实施例中，部分阶段以悬浮液或混合悬浮液和任选地贴壁3D培养中进行实施。例如，一些组织随时间将变成非贴壁的，而由此对于第4阶段的某些培养时期却处于悬浮液内。
如本文中所用的术语“高细胞密度”是指在每约0.2cm至约2cm直径的表面区域(2D)上约200000个细胞至约1000000个细胞，或相对于微团是至少约100000个细胞/约20μL培养基，或例如高达约2000000个细胞/约20μL培养基以允许细胞贴附于微团“斑(spot)”容许的小表面区域。对于膜过滤器，所述区域依赖购买的商业可获取的膜，例如约400000至约2000000个细胞在例如1至约2cm的含筒状膜过滤器的插入件中可以接种于约200μL至约500μL的培养基中而允许细胞贴壁。在微团和膜过滤器两种培养基中，细胞贴附在约1至5个细胞层中而组织允许在贴附之后生长“更厚”。类似的细胞密度可以用于接种到诸如CPP的骨替代物支架上。
如本文中所用的，“无血清”是指溶液中不存在血清，例如用于培养所述给定的细胞群的培养基。例如，无血清介质或环境可以包含小于4，3，2，或1％的血清。在一个优选实施例中，所述无血清组合物，根据加入到所述定义的介质(例如，含有0％的所加血清)中的组分分离，不含有血清，或仅仅含有痕量的血清。
如本文中所用的术语“BMP抑制剂”是指BMP信令的任何抑制剂并包括例如1型BMP受体抑制剂，BMP配体和/或可溶性BMP受体，任选地选自dorsomorphin(DM)，头蛋白，腱蛋白，LDN-193189，可溶性BMPRIa，和/或可溶性BMPRIb。
如本文中所用的术语“FGF激动剂”是指一种诸如细胞因子的分子，包括，例如，活化FGF信令通道，例如结合和活化FGF受体的FGF，或小分子。
如本文中所用的术语“FGF”是指任何成纤维细胞生长因子，和任选地bFGF，FGF2，FGF4，FGF9和/或任选地FGF19，21，3，5，6，8a，16-18，20和/或23，例如人FGF1(基因ID:2246)，FGF2(还有已知的bFGF；基因ID:2247)，FGF3(基因ID:2248)，FGF4(基因ID:2249)，FGF5(基因ID:2250)，FGF6(基因ID:2251)，FGF7(基因ID:2252)，FGF8(基因ID:2253)，FGF9(基因ID:2254)和FGF10(基因ID:2255)，任选地包括活性的缀合物和其片段，包括天然的缀合物和片段。在某些实施例中，FGF是bFGF，FGF2，FGF4,和/或FGF9。如本文中所用，“FGF活性缀合物和片段”包括结合和活化FGF受体并任选地活化FGF信令的成纤维细胞生长因子的缀合物和片段。
如本文中所用的术语“TGFβ激动剂”或TGFb激动剂是促进TGFβ信令并包括例如TGFb1，TGFb2和/或TGFb3的任何分子。
如本文中所用的术语“TGFβ抑制剂”是指抑制受体ALK4和ALK7和/或TGF-βRI的任何分子，例如SB431542(SigmaAldrich)A83-01(Tocris，2929)，D4476，GW788388，LY364947，RepSox，SB505124，SB525334(SigmaAldrich)和SD208。
如本文中所用的术语“BMP4激动剂”是指活化BMP4的受体的任何分子，任选地任何BMP或GDF，包括例如GDF5，GDF6，GDF7，BMP4，BMP2，BMP6，BMP7和/或，BMP10。
如本文中所用的术语“BMP4”(例如基因ID:652)是指骨形态生成蛋白4，例如人BMP4，以及活性缀合物及其片段，任选地包括可以例如活化BMP4受体信令的天然活性缀合物和片段。
如本文中所用的术语“nodal激动剂”是指活化nodal信号传导的任何分子，诸如肝细胞谱系细胞中的“nodal”(例如，人nodal，诸如基因ID:4338)或“活化素”。
如本文中所用的所述术语“活化素”或“ActA”是指“活化素A”(例如基因ID:3624)，例如，人活化素，以及活性缀合物及其片段，任选地包括可以例如活化nodal信号传导的天然活性缀合物及其片段，以及活性缀合物及其片段，包括天然活性缀合物及其片段。
如本文中所用的所述术语“wnt激动剂”是指在软骨细胞谱系细胞中活化wnt/β-联蛋白受体信令并包括例如Wnt3a和以及GSK3选择性抑制剂如CHIR99021(StemoleculeTMCHIR99021Stemgent)，6-溴靛红-3’-肟(BIO)(CaymanChemical(cat:13123))，或StemoleculeTMBIO(Stemgent)(cat:04003)的任何分子。CHIR99021是GSK3的选择性抑制剂。所设想的GSK3选择性抑制剂是例如在Wnt信令通道中GSK-30/β的选择性抑制剂。
术语“Wnt3a”如本文中所用的是指无翅型MMTV整合位点家族，成员3A因子(例如，基因ID:89780)，例如人Wnt3a，以及活性缀合物及其片段，包括天然活性缀合物及其片段。
如本文中所用的术语“Wnt拮抗剂”或“wnt抑制剂”是指在软骨细胞谱系细胞中抑制wnt/β联蛋白受体信令的任何分子，包括例如IWP2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙酰胺；Sigma)；Dickkopf-相关蛋白1(DKK1；R&D系统),和/或XAV939(3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-硫代吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮；Sigma)。
如本文中所用的术语“激动剂”是指一种，例如，通道或信令分子的活化剂。分子的激动剂可以基本保持所述分子(例如，nodal)相同，或子系列生物活性。例如，nodal激动剂是指选择性活化nodal信令的分子。
如本文中所用的术语“抑制剂”是指，例如，通道或信令分子的选择性抑制剂。分子的抑制剂或拮抗剂(例如，BMP4抑制剂)可以抑制所述分子天然形式的一种或多种活性。例如，BMP4抑制剂是选择性抑制BMP4信令的分子。
如本文中所用的术语“选择性抑制剂”是指与相关分子相比，所述抑制剂抑制所述选择性实体或通道更有效至少1.5X，2X，3X，4X或10X。
如本文中所用的术语“特化”是使细胞朝向特定的细胞命运发展的过程，在此之前所述细胞类型尚未确定，而具有朝向某些命运的任何偏性的该细胞可以逆转或转化至另一命运。特化会诱导所述细胞命运不能在典型条件下改变的状态。特化是分化的第一步骤。
如本文中所用的所述术语“干细胞”，是指可以增殖，自我更新和产生更多祖细胞或前体细胞的未分化细胞，祖细胞或前体细胞有能力产生大量的母细胞，母细胞可以进而产生分化的，或可分化的子细胞。所述子细胞可以例如经过诱导而增殖和产生后代细胞，后代细胞随后分化成一种或多种成熟的细胞类型，而同时还保持一种或多种具有父代发育潜力的细胞。所述术语“干细胞”包括胚胎干细胞和多能干细胞。
术语“胚胎干细胞”用于是指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(参见，例如，美国专利号5843780,6200806)。这样的细胞也可以获自衍生于体细胞核转移的胚泡的内部细胞团(参见，例如，美国专利号5945577,5994619,6235970)。
如本文中所用的术语“多能干细胞”是指在不同条件下具有分化为多个不同细胞类型的能力，和例如分化为三种生殖细胞层的细胞类型特性的能力的细胞。多能干细胞通过它们的使用例如裸鼠畸胎瘤形成分析法分化为不只一种细胞类型的能力来表征。多能性也通过胚胎干(ES)细胞标记的表达证明。多能干细胞包括诱导的多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞。在一个实施例中，所述多能干细胞衍生于体细胞。在一个实施例中，所述多能干细胞衍生于人体细胞。
如本文中所用的术语“iPSC”和“诱导的多能干细胞”互换使用并是指由非多能细胞，通常是成人体细胞，例如，通过诱导一种或多种包括POU4F1/OCT4(基因ID；5460)结合，但不限于，SOX2(基因ID；6657)，KLF4(基因ID；9314)，cMYC(基因ID；4609)，NANOG(基因ID；79923)，LIN28/LIN28A(基因ID；79727))的基因的表达进行人工衍生(例如，诱导或通过完全反转)的多能干细胞。所述表达可以通过强迫基因表达或使用小分子，小RNAs，非整合基因表达载体，或蛋白进行诱导。
如本文中所用的术语“类软骨细胞”是指细胞化学类似的和表达软骨细胞标记，包括例如Sox9和胶原蛋白2的软骨细胞和细胞，并作为软骨细胞发挥功能。所述软骨细胞可以是类关节软骨软骨细胞或前体或能够增大的软骨细胞或其前体(任选地称为类GPC的细胞)。
如本文中所用的术语“类软骨的组织”是指是组织学类似的和表达软骨标记，例如，胶原蛋白2和蛋白聚糖的软骨组织和组织，并作为软骨发挥功能，包括关节软骨组织和/或类生长板软骨的组织。
如本文中所用的术语“类关节软骨细胞的细胞和/或软骨组织”是指，任选地富含的或混合的群，该群含有关节软骨细胞和/或类关节软骨细胞的细胞包括例如，含有类关节软骨细胞的细胞的类软骨的组织。
如本文中所用的术语“类肥大软骨细胞的细胞和/或软骨组织”或“类GPC的细胞和/或软骨组织”是指，任选地富含的或混合的群，该群含有肥大软骨细胞和/或类肥大软骨细胞的细胞(例如，髂嵴软骨细胞)包括例如，含有类肥大软骨细胞的细胞的类软骨的组织。
术语“类关节软骨的组织”或“含类非肥大软骨细胞的细胞的软骨”是组织类似的和表达关节软骨标记诸如润滑素和/或CILP2的并作为关节软骨发挥功能。例如，关节软骨被维持为体内稳定软骨。
如本文中所用的术语“类生长板软骨的组织”是指是组织类似的并表达于生长板软骨组织中的软骨标记，包括胶原蛋白X，RUNX2，SP7和/或碱性磷酸盐的软骨组织和如同生长板软骨发挥功能。例如，生长板软骨在体内发挥作用提供新骨将会形成在其上的支架。
如本文中所用的相对于分离的细胞群的所述术语“分离的群”是指混合的或混杂的的细胞群已经去除并分离出的细胞群。在一些实施例中，分离的群是相比于所述细胞由其分离或富含的所述混杂群的基本纯化的细胞群。
关于具体细胞群的所述术语“基本纯的”，是指关于组成总细胞群的细胞的至少约65％，优选至少约75％，至少约85％，更优选至少约90％，和最优选至少约95％纯的细胞群。
术语“富含”或“被富含的”可以在本文中互换使用并是指相对于起始培养基或制剂中该类型的细胞的分数，一种类型的细胞的产率(分数)增加至少约至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％或至少约60％。富含和部分纯化可以互换使用。
该细胞群可以基于标记使用诸如细胞表面标记(例如，FACS分选等)的不同方法进行富集。
如本文中所用的术语“受试者”包括动物王国的所有成员，包括哺乳动物，诸如并且包括灵长类动物，诸如人，猴或猿，狗，猫，牛，马，羊，猪，兔，羊或啮齿动物，诸如大鼠老鼠，并合适地是指人。
术语“处理”，“治疗”，“治疗”等，这适用于一种独立的细胞，包括将所述细胞经受任何类型的过程或条件或对所述细胞执行任何操作或方法步骤。正如施用于受试者，该术语是指向受试者提供医疗或手术照顾，护理，或管理。
如本文中所使用的施用于受试者的术语“治疗”，是指获得的有益或所需结果的方法，包括临床结果，并包括医疗程序和应用，包括例如药物干预，手术，放射疗法和自然疗法的干预措施以及治疗关节/骨疾病的测试治疗。有益的或所需的临床结果可以包括，但不限于，无论可检测的或不可检测的，缓解或改善一种或多种症状或病状，降低疾病的程度，稳定(即，不恶化)疾病状态，防止疾病传播，延迟或减缓疾病进展，改善或减轻所述疾病状态，和暂时康复(无论部分或总的)。
如本文中所用的术语“给药(administering)”，“植入”和“移植”在上下文中是可以互换使用，上下文包括通过使所引入的细胞的在所需位点至少部分局域化的方法或路径将本文中所述的细胞组织和/或产品传递至受试者内。所述细胞可以直接植入关节，或替代地通过任何导致递送至所述受试者中的所需位点处的至少部分所述植入细胞或细胞组分保持活力的合适路径进行给药。
在理解本发明公开的范围时，如本文中所用的术语“含有”及其衍生词，预期是指定所述部件，元件，组分，组，整数，和/或步骤的存在的开放式术语，但不排除其他未明示的部件，元件，组分，组，和整数/或步骤的存在。上述也适用于具有类似意义的词，诸如所述术语，“包括”，“含有”及其衍生词。最后，如本文中所用的程度术语如“基本上”，“约”，“大约”是指所修饰的术语的合理偏离量，以至于所述最终结果并没有显著变化。如果这种偏离并不会否定其修饰的这个词的意义，这些程度术语应视为包括所述修饰术语至少±5％的偏离。
在理解本发明公开的范围时，如本文中所用的术语“由…构成”及其衍生词，预期是指定所述部件，元件，组分，组，整数和/或步骤的存在的封闭式术语，并也排除其他未明示的部件，元件，组分，组，整数和/或步骤的存在。
本文中通过端点引述数字范围包括纳入所述范围的所有数字和分数(例如，1至5包括1，1.5，2，2.75，3，3.90，4，和5)。还应该理解的是，其所有数字和分数均认为通过所述术语“约”修饰。此外，应该理解的是“一”，“一种“，“这种”包括复数指代物，除非另有明确规定。所述术语“约”是指所指示的所述数字的+或-0.1％至50％，5％～50％，或10％～40％，优选10％～20％，更优选10％或15％。
此外，具体章节中的定义和实施例预期适用于由本领域内技术人员所理解的它们适合的本文中所述的其他实施例。例如，在以下段落中，本发明的不同方面进行了更详细的定义。如此定义的每个方面可以与任何其他方面或多个方面组合，除非明确表示相反。具体而言，任何所指优选或有利的特征可以与其他指示作为优选或有利的任何其他特征或多个特征组合。
2.方法和产品
本文中描述了由人多能干细胞(PSCs)生产近轴/软骨中胚层细胞的方法；产生体外表达关节软骨标记润滑素和在组织上不能例如与人膝关节软骨组织区分的类关节软骨的组织的方法；以及制成具有类生长板性质的类软骨组织的方法，这是发现于人类中的第二类软骨，并由于其会发生肥大和表达胶原蛋白10的倾向而是负责长骨生长的所述软骨。使用本文中所述的方法制备的软骨细胞进一步证明在移植后是稳定的并维持其类关节软骨或类生长板软骨特性。此外，发现CD73细胞表面标记是由关节软骨细胞表达的。
本文中已经证实，CD73由原生成人和胎儿健康软骨细胞以及hESCs衍生的类软骨细胞表达而并不表达于衍生于hWSCs的类生长板的软骨细胞。
在一个实施例中，该方法使用无血清方法产生近轴/软骨中胚层(CD73、CD105+PDGFRβ+)，以及类似于例如所述其关节的人软骨的组织化的类软骨的组织。本文中所公开的无血清方法用于基于细胞和组织的工程设计策略并可以用于例如关节软骨置换。这些细胞也用于识别可能参与骨关节炎患者中软骨退化的分子，可以容许这些软骨细胞体外扩展而用于自体软骨细胞移植手术的潜在应用的分子，或可以缓解骨关节炎的药物的药物发现应用。此外，对多能干细胞衍生的关节和类生长板的软骨组织的深入理解将允许开发治疗骨关节炎或其他关节和骨病症的基于细胞和组织的疗法。
据本文中证实，例如，可以在含TGFb3，TGFb2或TGFb1的无血清培养基中的近轴中胚层群的高密度培养物的短暂的时期(例如，10天)内完成软骨细胞特化。持续或扩展的TGFb激动剂刺激产生具有关节软骨特性(组织学和基因表达)的软骨组织，而同时采用BMP4的刺激会诱导含肥大软骨细胞的类生长板的软骨组织。
扩展的培养基实施，例如超过12周，或更长，任选地14周的时间，在此期间，证实组织成熟为润滑素+或胶原蛋白10+软骨组织。
使用本文中所述的方法与其他细胞共培养不是必需的，也不调节培养基或支架，但是这些可以用于一些实施例中。
CD73表达，一种细胞表面标记，已经证明会标记健康原生成人和胎儿关节软骨细胞，但不表达于髂嵴的成人生长板软骨细胞中。类似于原生健康关节软骨细胞，hESC衍生的类关节的软骨细胞(TGFβ3-处理的)表达CD73。相反，hESC衍生的类生长板的软骨细胞(BMP4处理的)显著地较少表达CD73。该标记可以用于区分这些两种软骨细胞子种群，在这种情况下原生的和hESC衍生的关节软骨细胞表达CD73，但并不(基本上)表达于类生长板的软骨细胞上。
因此，所公开的一方面包括一种产生软骨细胞和/或软骨，任选地类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
(a)采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层细胞群，任选地CD56+和/或PDGFRα+类原条中胚层群，所述混合物包含：
(i)FGF激动剂；
(ii)BMP抑制剂，任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
(iii)任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431542；和wnt抑制剂；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群；
(b)产生软骨细胞前体群，包括：
(i)将表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群按照高细胞密度培养于无血清或含血清培养基中；
(ii)使用TGFβ激动剂将高细胞密度CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层群培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
(c)
(i)将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用所述TGFβ激动剂培养一段延长的时间而产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；或
(ii)采用BMP4激动剂将所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述TGFβ激动剂选自TGFb1，TGFb2，TGFb3和/或其组合。在一个实施例中，所述TGFβ激动剂是TGFb1。
在本文所述的方法中，激动剂，抑制剂或组分可以在具体时间段的一段时间的第1天加入或例如随着培养基变化在一段时间期间内重复加入。例如，FGF在例如第4天需要并采用培养基介质置换加入直至第15天。
在一个实施例中，一种或多种或所有步骤中使用的所述培养基是无血清的。已经证实，当诱导衍生于诱导的PSCs的原条中胚层群时，wnt拮抗剂(例如，wnt通道抑制剂)可以提高CD73和CD105表达。
在一个实施例中所述方法用于产生类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，而步骤c)包括将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用所述TGFβ激动剂培养一段延长的时间而产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织。
在另一个实施例中，所述BMP4激动剂是BMP4。
在另一个实施例中所述方法用于产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，而步骤c)包括将所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用BMP4激动剂培养一段延长的时间而产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述TGFβ抑制剂选自SB431542A83-01，D4476，GW788388，LY364947，RepSox，SB431542，SB505124，SB525334，SD208(例如，ALK4和ALK7和/或TGF-3RI的任何抑制剂受体)。
所述与中胚层特化混合物接触的类原条的中胚层是例如CD56+和PDGFRα+但不会表达心肌细胞特异性前体分化标记。
在一个实施例中，所述中胚层特化混合物中包含TGFβ抑制剂，任选地SB431524。
在一个实施例中，所述类原条中胚层细胞群采用所述TGFβ抑制剂进行培养至少2天(任选地T3-5)，3天或4天。
在一个实施例中，所述中胚层特化混合物进一步包含Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939。在一个实施例中，如果，例如表达CD73和CD105或PDGFR的细胞百分比低于60％，50％，低于40％，低于30％或低于20％时，就加入Wnt抑制剂。
如果在分化的第2阶段期间使用Wnt拮抗剂例如约两天，就会提高表达CD73和CD105或PDGFRβ的细胞百分比。在一个实施例中，所述中胚层特化混合物包含wnt抑制剂，任选地持续2天，3天或4天。
在一个实施例中，所述起始类原条的中胚层群诱导至约第4天(例如，KDR+/PDGFRα+细胞例如出现于第5天)，这例如会诱导所述CD73，CD105和PDGFR-β标记以在所述近轴中胚层特化阶段响应于BMP抑制作用和FGF进行上调。
在一个实施例中，所述近轴中胚层群包含于类胚体，单层培养和/或其组合中。
可以使用基于细胞表面标记的表达的细胞分选方法，从任何培养基(包括从无效分化中)中分离近轴中胚层群，细胞表面标记包括例如CD73和CD105和/或PDGFR-β。例如，通过富集CD73，CD105和PDGFRβ细胞。所述近轴中胚层群还可以由从受试者诱导的多能干细胞(iPSCs)产生。
因此，进一步的方面包括一种产生软骨细胞和/或软骨，任选地类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
(a)采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层群；
(b)采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，所述混合物包含：
(i)FGF激动剂；
(ii)BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
(iii)任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524，和wnt抑制剂；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群；
(c)产生软骨细胞前体群，包括：
(i)将表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群按照高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；
(ii)将所述高细胞密度CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层群采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
(d)
(i)将高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；或
(ii)将高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述方法用于产生类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织而步骤d)包括将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂，任选地TGFβ1，TGFβ2和/或TGFβ3，培养一段延长的时间而产生类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。在不同步骤中使用的TGFβ激动剂可以是相同或不同的。在一个实施例中，所述用于产生软骨细胞前体群的TGFβ激动剂是与用于培养一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织相同的TGFβ激动剂。在另一个实施例中，所述用于产生软骨细胞前体群的TGFβ激动剂是与用于培养一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织不同的TGFβ激动剂。
在另一个实施例中，所述方法用于产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，和包括将所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述诱导混合物的原条包括nodal激动剂，诸如活化素A，BMP4激动剂，FGF激动剂和wnt激动剂。
根据本文中所公开的所述方法，通常有多大4个“阶段”用于产生软骨细胞和/或类关节的软骨和肥大软骨，这取决于起始群的阶段，并包括1.原条诱导；2.近轴中胚层特化；3.产生类软骨细胞的细胞和4.产生类软骨的组织。根据起始群，所述方法也可以包括第0阶段，其包括由体细胞产生诱导的多能干细胞，要么通过由hPSCs在培养基中产生类胚体，要么通过在自我更新的培养基介质的存在或不存在下在培养基中由hPSCs产生单细胞悬浮液以产生产生PSCs的聚集。
在一个实施例中，所述本文中的方法用于由人ESC和组织产生软骨细胞和软骨组织。一个包括这些阶段的实施例将会在以下进行进一步的详细描述。
第1阶段–原条诱导
通过例如在分化的第1天至第4天之间和/或上，将所述多能干细胞与原条诱导混合物例如与活化素，BMP4和碱性FGF接触，而诱导人原条中胚层。在一些实施例中，例如，如果所述CD56+/PDGFRA+群产生较早，所述接触是在第1至第3天的期间。在内源性Wnt信令不存在或较低的细胞系和起始群中，添加Wnt激动剂可以提高从PSCs形成原条的效率，和用拮抗剂阻断Wnt信令来抑制原条形成。内源性Wnt信令，例如，在实施例中描述的细胞系(例如，HES2)中是足够的。据发现，使用iPSC细胞系，Wnt激动剂当从第1天至第3天加入时会改善CD56+PDGFRA+类原条群的发育。
在一个实施例中，所述wnt激动剂是Wnt3a或GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021(StemoleculeTMCHIR99021Stemgent)，6-溴靛红-3’-肟(BIO)(CaymanChemical(cat:13123))，或StemoleculeTMBIO(Stemgent)(cat:04003)。
Brachyury表达也在这段时间期间内诱导，这通过在约第2～3天的基因表达，和通过第4天细胞表面标记PDGFRa和CD56的表达进行监测。在人PSCs中，类PS的中胚层诱导依赖于活化素和wnt信令(参见，例如，1920)，并通过Brachyury和PDGFRa表达监测。例如，CD56可以用于监测例如人原条细胞形成。
第2阶段–近轴中胚层
所述下一阶段是近轴中胚层的生成，特征在于转录因子Meox1和Nkx3.2的表达。所述类原条(PS)细胞可以例如在单层培养中特化至近轴命运，而在此阶段(例如，第4-6天)，BMP信令可以使用诸如Dorsomorphin的小分子抑制，而TGFb信令可以使用诸如SB431542的小分子抑制。人近轴中胚层需要添加FGF(诸如bFGF)并在例如，单层培养的第4～15天之间将其加入培养基介质。在一些实施例中也加入wnt拮抗剂。通过包括CD73，CD105，和PDGFRβ的细胞表面标记的表达进行标记人近轴中胚层的出现。
人近轴中胚层可以采用所述BMP抑制剂Dorsomorphin(例如，第4～6天)和bFGF在例如分化的第4～15天之间的单层培养期间特化。第15天人近轴中胚层特征在于第15天的细胞表面标记CD73，CD105，PDGFRβ和Meox1的表达和Nkx3.2基因表达。这些标记的表达例如开始于第12天并例如，在约第15天最大。
第3阶段–产生软骨细胞和第4阶段—产生组织
近轴中胚层例如从第15天，可以直接接种于高细胞密度软骨组织形成分析培养基上，诸如微团或过滤器培养基。软骨生成在一个实施例中采用TGFb激动剂，例如通过采用TGFb3培养约10天至约2周而诱导，并且通过Sox9和胶原蛋白2的表达来表征。转换至BMP4激动剂，诸如含BMP4或GDF的培养基会诱导肥大软骨细胞表型。扩展的TGFb激动剂，任选地具有TGFb1或TGFb3，处理会在hESC衍生的软骨细胞和软骨组织中诱导类关节软骨细胞的表型，而GDF5也会诱导肥大表型。
通过第15天以高细胞密度将CD73+/CD105+或CD73+/PDGFRβ+细胞直接接种于含有诸如TGFb1或TGFb3的TGF激动剂的无血清介质中的微团或过滤器培养基中产生来自人近轴中胚层的软骨细胞。在这高细胞密度培养阶段的期间通过采用TGFb激动剂或BMP4激动剂的扩展处理产生软骨组织。
任何人胚干细胞群可以用作包括诱导的多能干细胞群的起始群。在一个实施例中，所述起始群是人胚干细胞群(hESC)或诱导的多能干细胞群(iPSCs)，任选地原生hESC和/或原生iPSC。许多人ESC细胞系是市售的，并列于，例如，所述NIHHESC登记表中。在一个实施例中，所述人ESC群是任选地选自HES2，H1，H9，或任何NIHESC登记表可可获得的hESC细胞系的细胞系；或任何人iPS细胞系，诸如任何市售的iPS细胞系，例如，购自SystemBiosciences。
在一个实施例中，所述起始群群集于类胚体中。在另一个实施例中，所述起始群培养于单层中。
在一个实施例中，所述起始群与诱导混合物的原条接触约1至约5天并先于心肌细胞特化。在一个实施例中，诱导混合物的原条包括活化素激动剂，任选地活化素A或nodal，BMP4激动剂，任选地BMP4，BMP2，BMP6，BMP7和/或，BMP10，和FGF激动剂，任选地bFGF，FGF2，FGF4，FGF9和/或任选地FGF19，21，3，5，6，8a，16-18，20和/或23。在一个实施例中，诱导混合物的原条进一步包含wnt激动剂，任选地选自Wnt3a和GSK3b抑制剂如例如CHIR-99021(StemoleculeTMCHIR99021Stemgent)，6-溴靛红-3’-肟(BIO)(CaymanChemical(cat:13123))，和/或StemoleculeTMBIO(Stemgent)(cat:04003)。
当例如通过流式细胞仪(图1B)测定时，类原条中胚层群同时表达CD56和PDGFRα。在一些细胞系中，所述诱导取自T1(第1天)至T4(正如实例中所用的HES2hESC细胞系的情况)。在其他细胞系中，诸如iPSCs例如，这种诱导仅仅可能需要两天(从T1-T3)。诸如CD56和PDGFRα的细胞表面标记的出现指示第1阶段完成而第2阶段可以开始。
hiPSCs采用图1A中所示方案的以下修改进行分化；所述Wnt通道激动剂CHIR99061(1微摩尔)加入到所述第1阶段培养基中而第1阶段由3天缩短至2天。通过从第3天至第5天用Dorsomorphin(DM)和SB431542处理，和从从第3天至第14天(第2阶段)用FGF处理，使该近轴中胚层命运在所述单层培养中特化。
在一个实施例中，所述iPSCs接受3天诱导，而在另一个实施例中，iPSC群接受2天诱导。在一个实施例中，hESC群接受2天诱导而在另一个实施例中，所述hESC群接受3天诱导。
第2阶段可以看成两个步骤，其导致产生由CD73，CD105,和/或PDGFR-β的表达标记的细胞群。所述细胞可以在BMP抑制剂(例如，诸如Dorsomorphin)和FGF激动剂(诸如碱性FGF)存在下接种于单层培养中。Dorsomorphin，例如，在第4天至第6天的窗口(T4-T6)之间有效抑制心肌细胞特化，而采用Dorsomorphin的处理可以限制于这两天的时间段。例如，对于所述单层培养的持续期，需要FGF激动剂，任选地碱性FGF，以特化中胚层群至近轴中胚层命运。
因此，在一个实施例中，所述近轴中胚层特化于单层培养中。
在另一个实施例中，所述BMP抑制剂是1型BMP受体抑制剂和/或可溶性BMP受体，任选地选自dorsomorphin(DM)，头蛋白，腱蛋白，LDN-193189，可溶性BMPRIa，和/或可溶性BMPRIb。
在另一个实施例中，所述类原条中胚层群与所述BMP抑制剂接触约1，2，3或4天以抑制心肌细胞特化。
在一个实施例中，特化类原条中胚层群和/或近轴中胚层群的FGF激动剂选自FGF2，bFGF，FGF4和/或FGF9。
正如所述，这种近轴中胚层的出现可以通过检测CD73，CD105和/或PDGFR-β表达于所述细胞表面(通过流式细胞仪观察，例如，如图2B，3A中所示)上而进行监测。当表达这些3个标记的中胚层的群出现(到第15天/T15)时，这个阶段就结束了。图3A表明T12和T15之间的这些标记的上调。这些标记并未表达于T4和T10之间的细胞的显著部分上。在单层分化阶段(例如，T4-T15)中，检测到Meox1和Nkx3.2的上调，表达于近轴中胚层的两个转录因子和体节。这些标记在培养基中的表达，例如到第15天，表明近轴中胚层已经产生。
在一个实施例中，类原条中胚层群与所述FGF激动剂接触至少5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天或更长(例如T3-T14)，从而相比于FGF激动剂未处理的细胞，提高细胞表达CD73和/或CD105的比例，例如，提高至少20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％或65％。
在一个实施例中，近轴中胚层群还表达转录因子Meox1和Nkx3.2而对Nkx2.5呈阴性。
近轴中胚层群可以以任何高细胞密度形式接种，包括，例如，包括接种于微团培养基，微球培养基或过滤器培养基中。例如，为了产生微团组织，通常会将介于约200,000至约500,000个细胞接种于一个20微升的“斑”以开始组织形成。较多些的细胞，它们由于在斑/组织培养基塑料区域内可利用的面积缺乏而不会发生贴附，细胞越少，则所述‘斑’将不会与细胞汇集。作为另一实例，在膜过滤器培养基中，最低接种为约500,000个细胞，而所述最大值为约2百万个细胞/12mm直径过滤器。
在一个实施例中，所述近轴中胚层群按照1千万个细胞/mL和5千万个细胞/mL，任选地至少1千万万个细胞/1mL，2千万个细胞/mL，3千万个细胞/mL，4千万个细胞/mL或5千万个细胞/mL的细胞密度例如接种于胚细胞微团培养基中。在一个实施例中，约500,000～2百万个细胞，任选地约500,000，约750,000，约1百万，约1.25百万，约1.5百万，约1.75百万，约2百万个细胞接种于12mm直径的膜过滤器培养基中。
在某些实施例中，无血清方法例如用于由类原条中胚层群使用例如bFGF和BMP抑制产生CD73+CD105+PDGFRΒ+近轴中胚层。
在一个实施例中，任选地，在第3和/或第4阶段期间所述培养基是无血清并包括基本培养基，任选地高葡萄糖DMEM+地塞米松，抗坏血酸，胰岛素，转铁蛋白，硒，和脯氨酸。基本培养基的实例提供于例如参考文献18中。
如本文中所用的，基本培养基是指为细胞提供正常细胞代谢必不可少的水和某些大量无机离子，保持细胞内外渗透压平衡，提供作为能量来源的碳水化合物，和提供维持在生理pH范围中的缓冲系统的盐的混合物。基础培养基的实例包括，但不限于，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，最低必需培养基(MEM)，基础培养基Eagle(BME)，RPM11640，HamF-10，HamF-12，α-最低必需培养基(aMEM)，格拉斯哥最小必需培养基(O-MEM)，和Iscove氏改性Dulbecco氏培养基(IMDM)，StemPro及其混合物。在一个具体实施例，所述基础盐营养液为约50:50的DMEM和HamF12的混合物。在一个具体实施例中，所述基础培养基是高葡萄糖DMEM。
在另一个实施例中，所述培养基包括含有胰岛素，转铁蛋白和任选的硒结合DMEM，Stem，Mesofate(Stemgent)，RMPI1640或IMDM的基础培养基。
据设想，所述培养基和/或组合物可以进一步包括微量元素。微量元素可以商购，例如，获自Mediatech。微量元素非限制性的实例包括但不限于含有铝，氯，硫酸根，铁，镉，钴，铬，锗，钠，钾，钙，磷酸根和镁的化合物。含有微量元素的化合物的具体实例包括，但不限于，AlCl3，AgNO3，Ba(C2H3O2)2，CdCl2，CdSO4，CoCl2，CrCl3，Cr2(SO4)3，CuSO4，柠檬酸铁，GeO2，Kl，KBr，LI，钼酸，MnSO4，MnCl2，NaF，Na2SiO3，NaVO3，NH4VO3，(NH4)6Mo7O24，NiSO4，RbCl，硒，Na2SeO3，H2SeO3，亚硒酸Na，硒代蛋氨酸，SnCl2，ZnSO4，ZrOCl2，及其混合物和盐。
据设想，氨基酸可以加入到所述定义的培养基中。这种氨基酸的非限制性实例是甘氨酸，L-丙氨酸，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺/Glutamax，L-盐酸精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-羟基脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸。在某些实施例中，所述氨基酸是L-异亮氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-羟基脯氨酸，L-缬氨酸，及其混合物。
还据设想，所述基础培养基可以包含抗坏血酸。
此外，所述组合物和方法还可以包含其他组分，诸如白蛋白，转铁蛋白，L-谷氨酰胺，脂质，抗生素，β巯基乙醇，维生素，矿物质，ATP和可以存在的类似组分。在另一个具体实施例中，所述组合物和方法含有维生素D3和ATP。
在一个实施例中，高细胞密度斑维持约0至4天，例如，近轴中胚层群按照高细胞密度培养约0至约4天，任选地0，1，2，3，或4天之后才加入TGFβ3激动剂。
在一个实施例中，所述CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层群采用所述TGFβ激动剂培养于无血清培养基中至少3天，或约3天至约14天，任选地至少一周，以产生Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群。
正如本文中所证实，扩展的TGFβs信令可以导致类关节的软骨组织的产生。在一个实施例中，所述Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂培养的一段延长的时间为至少4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，13周，14周或更长以产生类关节软骨的组织。在一个实施例中，所述软骨细胞前体群采用所述TGFb激动剂进行培养直至润滑素和/或软骨中间层蛋白2(CILP2)被表达.在一个实施例中，所述近轴中胚层群和/或所述Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用选自TGFb3，TGFb2和/或TGFb1的TGFb激动剂进行培养。
将所述培养基从含有TGFb激动剂转换至含有BMP激动剂，诱导类生长板的肥大软骨细胞群。在一个实施例中，所述类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织采用所述BMP4激动剂进行培养以产生胶原蛋白10+和/或Runx2+类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。在一个实施例中，所述高细胞密度Sox9+胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用所述BMP4激动剂，任选地BMP4或GDF5进行培养的所述延长的一段时间，为至少2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，13周，14周或更长以产生表达胶原蛋白2的软骨组织和/或表达胶原蛋白10的肥大软骨细胞群。
例如，第3阶段可以包括2-3天的“起斑”阶段，这可以在含2％血清培养基，或无血清培养基中完成。这容许高细胞密度细胞贴附于例如小面积的组织培养皿或膜过滤器。在任选地3天(+3天)的这个阶段结束时，微团中的大多数和/或基本上所有细胞都表达CD73，CD105，和PDGFRβ。在一个实施例中，这个步骤实施于无血清培养基的TGFB激动剂处理之后任选地至少约1周(例如，+10天，所述培养基处于第25天)的一段时间之后。到约两周(从约10天至约14天)，表达早期软骨细胞基因，诸如Sox9和胶原蛋白2。所述培养基可以要么维持于诸如TGFb3的TGFb激动剂中例如在几周至几个月的一段时间以产生类关节软骨(AC)的组织(例如，第4阶段)。例如，在微团培养的约5～10周之后检测到AC基因润滑素的上调。
在这个延长的时间内的组织学分析表明相比于6周要更长时间培养，例如12周之后才产生更高质量的组织。
通过将含有TGFb激动剂的培养基转换为代替地含有BMP4激动剂的培养基而实现类肥大生长板的软骨组织的产生。所述BMP4激动剂转换通常发生于以诸如TGFb3的TGFb激动剂刺激所述细胞至少1周之后的约第25天。所述转换导致所述微团细胞转换为肥大软骨细胞表型，这是表达与生长板分化(例如，胶原蛋白10和Runx2)相关的基因的一种放大的细胞(例如，参见图4C)。
据发现，以BMP4直接刺激微团约3天(在通常加入TGFb3激动剂时)导致微团起球，变得非贴壁的，和/或没有存活和/或制成组织。在第三阶段培养的任何时间例如约10天至6周之间向BMP4的转换能够诱导TGFb激动剂处理的微团中的这种肥大响应。在一个实施例中，所述向BMP4激动剂，任选地BMP4的转换在约第25天以产生类生长板的软骨。
胶原蛋白10表达，指示生长板肥大软骨细胞，例如在几周(例如，在实施例1中所述细胞系中的9～12周)之后进行表达；类似于TGFb激动剂处理的微团中润滑素的类似计时智慧。因此，扩展的BMP4激动剂处理导致由hPSCs产生表达类生长板的软骨组织的胶原蛋白10。
因此，在一个实施例中，所述软骨细胞前体培养于TGFβ激动剂或BMP4激动剂中以用于软骨组织形成。
可以对处于一个或多个阶段的所需细胞群进行富集。例如，所述CD73+CD105+细胞和/或CD73+PDGFR-β+可以，任选地通过流式细胞仪，从表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的所述近轴中胚层群中在高细胞密度培养之前进行分离。
例如对于使用其他方法产生和/或从受试者分离出来的软骨细胞前体细胞，也也可以使用所描述的方法。
因此，在另一方面中，本公开包括一种产生类软骨细胞的细胞的方法，包括：
(a)将软骨细胞的前体细胞按照高细胞密度，培养于无血清或含血清培养基中；
(b)将所述高细胞密度的所述软骨细胞的前体细胞采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中；和
(c)要么
(i)将所述软骨细胞的前体细胞采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节软骨的软骨细胞群；或
(ii)将所述软骨细胞的前体细胞采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生肥大软骨细胞的细胞群和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述软骨细胞的前体细胞是原生胎儿软骨细胞或传代胎儿软骨细胞。在另一个实施例中，所述软骨细胞的前体细胞是获自具有软骨或骨病症或疾病的受试者的原生细胞。获自受试者的细胞在高细胞密度培养之前经历诱导多能性的方法。例如，原生软骨细胞可以从患者分离出来并直接使用所述微团方法进行测试，或患者的任何体细胞可以用于制备患者特异性的iPS细胞，其随后将使用所述本文中所述方法的所述四个阶段进行分化而产生软骨组织。获自受试者例如来自疾病位点的细胞可以用于改善药物的测试和/或进行培养，例如，其中所述受试者患有骨关节炎，而滑液流体组分或其他测试物质试图识别增殖和/或改善一种或多种症状的组分。细胞或流体组分也可以获自受试者，例如获自非疾病位点并且用于产生自体同源软骨细胞移植的细胞和/或组织，例如，在这种情况下所述产生的细胞和/或组织给药于受试者。在一个实施例中，所述细胞用于同种异体移植。
所述步骤可以体外实施。可选地，含有所述细胞或组织的细胞和/或组合物可以例如在完全类软骨的组织形成之前给药于受试者并对体内软骨形成进行监测。例如，使用本文中所述的方法制备细胞并任选地在给药之前进行解离。
也可以采用所述方法以产生近轴中胚层的细胞群。在一个实施例中，所述方法包括：
(a)采用诱导原条的混合物培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条的中胚层群；
(b)采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，所述混合物包含：
(i)FGF激动剂；
(ii)BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，或Dorsomorphin；和
(iii)任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和/或Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群。
在一个实施例中所述方法进一步包括富集CD73，CD105和/或PDGFRβ表达细胞。
在一个实施例中，所使用的组分(例如，激动剂，抑制剂，等)的浓度是有效量，例如有效诱导指示所需细胞类型的标记的表达。
在一个实施例中，所述FGF激动剂是FGF。
在一个实施例中，FGF的浓度是约2ng/mL至约100ng/mL之间的任何浓度，任选地约20ng/mL。
在一个实施例中，所述BMP抑制剂是Dorsomorphin(DM)。
在一个实施例中，DM的浓度为介于约0.5μM至约5μM之间的任何浓度，任选地约4μM(例如，微摩尔)。
在一个实施例中，所述TGFb激动剂是TGFb1，2和/或3。
在一个实施例中，TGFb1，2和/或3的浓度是约1ng/mL至约50ng/mL之间的任何浓度，任选地约10ng/mL。
指定范围内的任何数字包括例如每个0.1或每个0.5单位增量。
在一个实施例中，TGFβ3的浓度是约1ng/mL和约50ng/mL之间的任何浓度，任选地约10ng/mL。
在一个实施例中，所述BMP4激动剂是BMP4。
在一个实施例中，BMP4的浓度是约10ng/mL和约100ng/mL之间的任何浓度，任选地约50ng/mL。
这些方法也可以包括，例如，通过VonKossa染色，任选地体内或体外，监测蛋白聚糖生产，和/或钙化和/或矿化的步骤。例如vonKossa染色可以用于确认矿化并指示类生长板的软骨的发育。
本公开的进一步方面使用包括本文中所述的方法产生的细胞群或组织，任选地用于本文所述的功用。
因此，本文中提供了一种类软骨细胞的细胞的分离的群，任选地类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，或根据本文中所述的方法产生的前体群。
在一个实施例中，所述分离的群是表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群。
在一个实施例中，类软骨细胞的细胞的所述分离的群包括表达一种或多种软骨细胞标记和/或基因的细胞，例如GDF5，WNT9A，和/或类似于关节间区细胞的ERG，润滑素Meox1和/或类似于关节软骨细胞的CIP2，或RUNX2，SP7，碱性磷酸盐(ALP/ALPL)，和/或类似于肥大软骨细胞的COL10A1的细胞。
进一步的方面是一种组合物，该组合物含有类关节非类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的群，和/或根据本文中所述的方法产生的前体细胞物；和载体。取决于所述用途，所述载体可以任选地是聚乙二醇(PEG)，水凝胶，骨支架，骨替代支架和/或基质胶。其他载体包括载体，该载体例如包含由透明质酸钠，透明质酸及其衍生物，明胶，胶原蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，缓冲的PBS，葡聚糖和聚合物组成的组中的一种或多种。例如，所述载体可以是适用于在移植中应用的载体，例如，医药级载体。所述载体也可以适用于稳定用于运输和/或储存的细胞。细胞可以例如是低温冷冻的和/或组织可以室温和/或室温与约4℃之间的任何温度下运输。
所述组合物可以例如处于浆液中，例如，所述组合物包括给药至受试者的解离细胞。在一个实施例中，所述组合物可以含有其他细胞，例如，内皮细胞和/或成纤维细胞，例如，其用于生长板细胞/软骨移植。
进一步的方面包括含有本文中所述的细胞和/或组织和支架或膜的软骨或骨组织产品。例如，在移植应用期间，软骨细胞可以结合膜(例如，胫骨骨膜或生物膜)给药于受损的区域或预接种于支架基质中。在一个实施例中，所述支架是骨替代物。
根据本文中公开的所述方法产生的细胞和组织可以例如适用于改善患有关节或骨病症的受试者中的症状。
因此另一方面包括一种改善症状和/或治疗有需要的受试者的方法，包括给药本文中所述的细胞群和/或组织和/或插入/移植含有所述细胞的产品。
另一方面中还提供了所述细胞，组织和产品的用途。在一个实施例中，所述公开内容提供本文中所述的所述细胞群和/或组织或组合物或产品的用于改善症状和/或治疗有需要的受试者的用途。
在一个实施例中，例如将被给药至受试者的本文中描述用途或方法的细胞群由自体同源细胞诱导。
在一个实施例中，富集所述细胞群以用于类关节的类非肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在一个实施例中，所述受试者患有关节病症，诸如骨关节炎，剥脱性骨软骨炎，多软骨炎，和其他软骨病，或影响所述软骨的关节损伤。
在进一步的实施例中，富集所述细胞群以用于类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
在又一实施例中，所富集的类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，粘附于支架或膜。
在另一个实施例中，所述受试者患有骨病症，诸如骨裂，骨折或例如由于恶性肿瘤或创伤，软骨发育不全，成骨不全，骨质疏松或其他骨病需要骨替换。
所述产生的细胞可以任选地永生化和/或改性例如以稳定表达可操作地连接至通常表达于类关节软骨细胞的细胞中的基因的启动子(诸如润滑素启动子)和/或通常表达于肥大软骨细胞(诸如胶原蛋白10)启动子的报告基因(例如，报告系统)，从而提供模型细胞，其可以例如用于测试候选物质启动，抑制，维持关节软骨细胞或肥大软骨细胞的能力或者关节软骨细胞或肥大软骨细胞中活性的能力。大量的报告基因在本领域内是已知的，包括例如荧光蛋白，诸如GFP，RFP，dsRed等，萤光素酶。报告基因分析法是通用且灵敏的方法并可以用于在高通量药物筛选程序中分析测试众多候选物质。
本文还提供了试剂盒，该试剂盒包括根据本文中所述的方法产生的一种或多种细胞或组织，包括所产生的细胞或组织的产品或组合物，任选地含有报告系统或其他修改物，根据本文中所述的方法，选自激动剂，抑制剂，介质，设备或其他可以用于本文中所述的方法中的组分中的至少两个的组合，说明书，小药瓶或其他容器，其中说明书可以用于例如说明如何生成所述细胞，执行分析测试或给药所述细胞，组织，组合物，或产品；小药瓶或其他容器用于盛装这些上述细胞，组织，组合物，产品，激动剂，抑制剂，介质等之一。
根据本文中所述的方法产生的所述细胞和组织可以用于各种应用。例如所述细胞和组织可以用于预测药物毒理学和药物发现。例如，富集的hPSC衍生的软骨细胞，关节或类生长板的群，可以用于预测性药物毒理学筛选以及用于旨在识别影响软骨细胞生物学和生理学的新化合物的筛选。任选地在一种或多种疾病介导子存在下进行培养的促进关节软骨细胞增殖，而且还保持增殖的药物将会受到关注，因为在过去患者的原生关节软骨细胞的扩展已经导致所述软骨细胞去分化为类间充质的表型，并导致更少的理想软骨替换。
因此，一个实施例包括一种测试候选软骨形成调节物质的方法，所述方法包括：
a)将测试物质与软骨细胞前体谱系细胞群接触，所述测试物质和所述软骨细胞前体谱系细胞群在本文中所述方法中的任何步骤中接触；
b)相比于不存在测试物质下产生的对照物群，评价所述测试物质对软骨细胞增殖，保持和/或分化的影响；和
c)如果所述测试物质相比于所述对照物提高或降低增殖,和/或影响软骨细胞保持或分化，则确定所述测试物质作为候选软骨形成调节物质。
所述调节物质可以例如用于疾病介导子或具有保护性活性的组分。疾病介导子也可以在测试物质存在或不存在之下用于筛选抑制和/或降低所述疾病介导子的疾病诱导效果的药物试剂。
所述细胞和组织任选地用于评价细胞移植方案并可以用于细胞移植。例如，这些方法将允许例如比较：a)，移植类关节或生长板的hPSC衍生的软骨细胞或软骨组织相对于自体软骨细胞移植或成人间充质干细胞衍生的软骨细胞或软骨组织的影响和效率，b)移植类关节软骨组织和/或软骨细胞-细胞浆液治疗动物模型或患有不同水平的关节疾病，包括骨关节炎的患者中各种关节软骨缺损的效果，c)类hESC衍生的生长板的软骨细胞或类软骨的组织用于骨再生(经由软骨模板中间体)的能力。
所述细胞和组织可以例如用于组织工程应用。例如由hPSC培养基富集的软骨细胞群可以产生并例如以软骨细胞和其他细胞类型或支架的定义比例用于工程结构。所述hPSC衍生的软骨细胞可以接种于例如骨替代物上，例如，可以允许体外或体内软骨/骨接口。这样的产品能移植到具有骨-软骨相连受损的患者或动物中。
所述方法可以用于(通过由患者例如对于含有遗传组分的疾病产生iPS细胞系)建立患者特异性的疾病模型。类软骨细胞的细胞和组织群可以使用本文中所述的方法由人患者建立。为了分析这些病变细胞的所述分化和表型，近轴中胚层群可以产生并且那些细胞可以使用本公开中所述的方案特化至软骨细胞的命运，而最终特化至类关节或生长板的软骨组织。
本文中所述的方法也可以用于建立软骨疾病(例如，肥大)的通用模型，包括与骨关节炎相关联的那些。不希望受到理论的束缚，BMP4可以诱导类关节的软骨细胞和软骨组织中的肥大命运，这是骨关节炎的发作时通常在关节软骨中上调的通道。作为另一实例，向本文中所述的培养基中加入从骨关节炎患者分离出来的因子可以用于确定代谢活性的化合物(诸如在OA患者的膝关节中发现的脂肪垫)是否可以体外影响所述组织的质量。
另外，由于已CD73发现识别类关节软骨细胞的细胞，通过流式细胞仪使用CD73，以及通过流式细胞仪定量测定指示肥大的细胞尺寸，可以有助于促进类关节或生长板的命运的因子的高通量筛选，以及所述组织本身通过标记基评估方法的组织学。肥大与例如小鼠模型中的骨关节炎相关，而被认为是患者中的类似致病因。这些应用可以例如用于识别肥大的调节剂。
在一个实施例中，所述候选软骨形成调节物质是从具有病变软骨或骨的受试者中分离出来的因子。在一个实施例中，所述因子从患有关节炎和/或肥胖症的受试者或从作为对照物的健康受试者的关节，任选地膝关节中的脂肪垫分离出来。在另一个实施例中，所述测试物质与所述BMP4激动剂和所述测试物质一起加入，相比于不存在所述测试物质之下进行处理的对照物对其抑制肥大的能力进行评价。在还有的另一实施例中，使用流式细胞仪，任选地通过评价正向和侧向散射，对肥大进行评价。
在另一个实施例中，所述方法包括一种评价候选关节软骨细胞增殖诱导剂的方法，包括：
(a)获得根据本文中所述方法产生的类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织，
(b)用测试物质培养所述类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；
(c)测定所述类关节的类非肥大软骨细胞的细胞的增殖；
(d)检测相比于不存在所述测试物质之下培养的类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织的增殖的增长，该增殖的增长指示所述测试物质是候选关节软骨细胞增殖诱导剂。
一个进一步的实施例包括一种评价候选肥大软骨细胞增殖诱导剂的方法，包括：
(a)获得根据本文中所述的方法产生的类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，
(b)采用测试物质培养所述类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织；
(c)测定肥大软骨细胞，细胞增殖；
(d)检测相比于在不存在所述测试物质下培养的类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的增殖的增长，该增殖的增长指示所述测试物质是候选肥大软骨细胞增殖诱导剂。
在一个实施例中，类CD73关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织在采用所述测试物质培养之前，任选地通过流式细胞仪分离而分离出来。
在另一个实施例中，所述类关节的非肥大软骨细胞和/或类肥大软骨细胞的细胞包含功能上偶联至关节软骨细胞特异性启动子，任选地润滑素启动子元件的报告基因(即，关节软骨细胞报告系统)和/或功能上偶联至肥大软骨细胞特异性启动子，任选地胶原蛋白10启动子元件的报告基因(即，肥大软骨细胞报告系统)；和诱导关节软骨细胞分化的化合物(通过测定所述关节软骨细胞报告系统活性识别)和/诱导肥大软骨细胞分化的化合物(例如，通过测定肥大软骨细胞报告系统活性识别)。
在一个实施例中，增殖增长使用一种或多种以下方法进行测定：3H胸苷掺入法；5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)掺入法；和碘化丙啶分析法。
一个进一步的实施例包括一种评价测试化合物的AC细胞和/或GPC细胞毒性或保护性活性的方法，包括：
(a)根据本文中所述的方法产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类GPC的细胞和/或生长板软骨；
(b)采用所述测试物质培养所述类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或GPC细胞；
(c)测定所述测试物质的细胞毒性和/或细胞保护性活性；
(d)检测相比于不存在所述测试物质下培养的类关节的非肥大软骨细胞和/或GPC细胞和/或组织的细胞毒性的增长，细胞毒性的增长指示所述测试物质对关节软骨细胞和/或GPC细胞具有毒性或检测相比于不存在所述测试物质下培养的类关节的非肥大软骨细胞和/或GPC细胞和/或组织的保护性活性的增长(例如，细胞毒性降低)，保护性活性的增长指示所述测试物质是保护性。
在一个实施例中，细胞毒性使用以下分析方法之一进行测定:台盼蓝染料分析法；萤光素酶分析法；四唑盐转化分析法，诸如MTT分析法和WST-1分析法。
正如本文中所证实，IL-1β可以诱导软骨细胞群中类骨关节炎的变化。Il-1b和其他介导子，例如其他细胞因子和膝关节脂肪垫组分(例如，疾病介导子)以及机械破碎可以用于本文中所述的筛选方法。例如，使用本文中所述的方法产生的细胞可以在存在或不存在测试物质下与这种疾病介导子或机械破碎接触(例如，要么在加入所述疾病介导子或机械破碎之前加入，或在所述细胞已经接触和/或机械破碎之后加入以评价所述测试物质抑制或反转所述疾病介导子功能的能力)。
在一个实施例中，所述类AC的软骨细胞和/或类软骨的组织或所述类肥大的软骨细胞和/或类软骨的组织任选地在采用所述测试物质培养之前与疾病介导子接触。
在一个实施例中，所述疾病介导子是细胞因子，任选地是IL-1β。在另一个实施例中，所述疾病介导子是关节脂肪垫组分，任选地是膝关节脂肪垫组分。
在一个实施例中，所述筛选分析法包括一种或多种的以下分析或分析法:组织学分析，生化分析法，诸如定量糖胺聚糖和蛋白聚糖的生产的那些，基因表达分析法，通过显微镜法或流式细胞仪法的诸如润滑素或胶原蛋白10的荧光报告子的增益/损失，CD73细胞表面受体表达的增益/损失法，细胞死亡的分析法，和可以指示软骨细胞肥大的细胞尺寸的流式细胞仪法。
CD73可以用作用于细胞分选实验以富集类关节的软骨细胞的阳性选择标记。这些标记可以促进关节的软骨细胞从组织的原生源中分离出来，以在使用中与同种异体或自体同源软骨修复策略结合使用。
因此，进一步的方面包括一种分离出关节软骨细胞的方法，包括：将含有软骨细胞的混合细胞群与在容许形成抗体(或其他结合分子):CD73细胞络合物的条件下结合CD73的抗体(或其他结合分子)接触；和分离出所述抗体CD73细胞络合物。这可以通过多种本领域中熟知的已知免疫学方法，包括基于细胞分选的方法完成。
在一个实施例中，所述混合细胞群包含非软骨细胞，类非关节软骨细胞的细胞，和/或类肥大软骨细胞的细胞。
在一个实施例中，所述抗体偶联至例如有助于分离的标记，诸如珠子，诸如琼脂糖珠或磁性珠。
CD73，CD105，和PDGFR-β的组合可以用作从其他细胞系或其他细胞系的祖细胞分离出近轴/软骨生成中胚层的阳性选择标记。由于诸如心脏谱系的其他细胞系经常使用用于产生近轴中胚层的那些类似的方案诱导，通过使用这些细胞表面标记的细胞分选，近轴中胚层的分离提供了用于富集这些群的方式。例如，所述细胞使用流式细胞仪进行富集。
因此，一个实施例包括一种分离出近轴软骨形成中胚层的细胞群的方法，包括：将含有近轴软骨形成中胚层细胞的细胞群与含有CD73特异性结合剂，CD105特异性结合剂，和PDGFRβ特异性结合剂的混合物接触；以及富集CD73+，CD105+和PDGFRβ+细胞。在一个实施例中，所述结合剂是抗体。在另一个实施例中，所述细胞使用流式细胞仪进行富集。还提供的是一种根据本文中所述的方法制备的并可以包含于本文中所述的组合物或产品的分离的近轴软骨形成中胚层的细胞群。这些细胞也可以用于本文中所述的筛选分析法中。所述近轴中胚层群例如可以用于产生其他细胞类型，例如用于产生骨骼肌祖细胞，脂肪细胞祖细胞(脂肪细胞)和潜在的骨祖细胞(造骨细胞)。
此外，具体章节中描述的定义和实施例旨在适用于本文中描述的其对此适合的其他实施例，这对于本领域技术人员将会是理解的。不同的激动剂，抑制剂和/或其他组分包括例如定义中所引述的激动剂，抑制剂等的选择和组合也是所设想的。例如，在以下的段落中，本发明的不同方面会进行更详细的定义。除非明确有相反的指出，这样定义的每个方面可以与任何其他方面或多个方面进行组合。具体而言，任何指出是优选或有利的特征，可以与指示为优选或有利的任何其他特征或多种特征组合。
上述公开内容概述性地描述了本申请。更完整的理解可以通过参考以下具体的实施例获得。这些实施例仅仅描述用于举例说明之目的，而并不意在限制本申请的范围。形式上的变化和等同替换都设想，因为这些情况可能会建议或递呈权宜之计。尽管本文中使用了特定术语，但这样的术语旨在是描述意义的，而不是为了限制的目的。
以下非限制性的实施例举例说明本发明公开：
实例
实例1
结果
软骨细胞的体外形成包括类原条(PS)群诱导为类胚体(第1阶段)，在单层培养中特化近轴中胚层(第2阶段)，在高细胞密度微团培养基中或在胶原蛋白涂覆的膜过滤器上产生软骨细胞祖细胞(第3阶段)，和在微团或过滤器培养基中的特化关节和生长板软骨细胞和软骨组织(第4阶段)(图1A)。
在从多能干细胞(PSC)状态的分化中的第一步骤是形成PS群，其在所述胚胎中，发生于三个胚层(内胚层，中胚层和外胚层)形成时的原肠胚形成期间。所述PS群和内胚层和中胚层子集可以由PSCs使用活化素A(活化素，Nodal的替代物)，Wnt，和BMP信令分子的组合进行诱导((Nostro，Chengetal.2008，Kattman，Wittyetal.2011，Craft，Ahmedetal.2013)。用活化素，BMP4和bFGF诱导的PS群可以通过细胞表面标记CD56和PDGF受体α(PDGFRA)的表达(图1B)进行观察。
hESC衍生的原条(PS)中胚层表达CD56，PDGFRα和KDR，如图1C中所示。hIPSCs在诱导的第1天和第3天期间使用活化素A(3ng/mL)，BMP4(1ng/mL)，碱性FGF(5ng/mL)和CHIR99061(1微摩尔)，小分子Wnt激动剂诱导至PS中胚层群。hiPSCs被诱导两天的时间段(第1天至第3天)，而不是三天的时间段(第1天至第4天)，这正是HES2hES细胞系的情况(图1C)。hIPSC衍生的PS中胚层还表达CD56，PDGFRα和KDR(图1D)，然而，如果hiPSCs在没有CHIR99061存在下进行诱导(图1E)，则这些细胞表面标记不被表达。
无其他因子培养超过4天，包含于此群中的祖细胞可以特化至心源性命运，这通过所述细胞表面标记KDR和PDGFRa在T5处的共表达(图2A，0DM，0FGF)，和心肌转录因子Nkx2.5在第15天(T15)的随后表达进行观察((Kattman，Wittyetal.2011)，图2C)。
为了生成软骨细胞，有必要首先特化该PS群至近轴中胚层的命运。以往的研究表明，表达细胞表面标记的中胚层群往往发现于间充质干细胞，CD73和CD105上，并且有软骨形成潜力(Hwang，Kimetal.2006)。使用这两种细胞表面标记的表达，以及转录因子Meox1和Nkx3.2的表达结合Nkx2.5的表达缺乏以监控近轴中胚层群的出现。以前在小鼠ESC模型系统中的实验已证明抑制BMP信令通路在FGF信令的背景中防止心脏中胚层的出现和促进近轴中胚层的发育的重要性(Craft，Ahmedetal.2013)。加入I型BMP受体Dorsomorphin(DM)的抑制剂从T4至T6(分化的第4天～第6天)为期2天的一段时间，通过与T5一样早地改变了PDGFRa和KDR的表达模式，因为所述细胞比未处理的中胚层表达较少的PDGFRa(图2A)。加入bFGF并没有改变PDGFRA/KDR群急剧下降。极少数细胞在未处理的中胚层条件下表达CD73和CD105(7.46％，图2B)。然而，用DM的处理仅仅稍微提高这个群，用FGF从第4天直至第15天进行处理，急剧提高了表达CD73和CD105的细胞的比例(52％，图2B)。这些表面标记的表达的变化会伴随着近轴基因Meox1和Nkx3.2的上调(图2C)。用DM从T4-T6和用bFGF从T4-T15都进行处理，导致更强健的CD73/CD105群(67％)和Meox1和Nkx3.2甚至更高的表达(图2C)，这表明BMP抑制和FGF处理对于由所述PS群的近轴中胚层特化都是所需的。除了CD73/CD105表达之外，衍生于FGF-或DM+FGF-处理的单层的CD73-阳性细胞也表达所述PDGF受体β(PDGFR-β，Pβ)，这表明近轴中胚层也表达该细胞表面标记(图2B)。
在单层培养中的近轴中胚层特化期间，据观察，Wnt信号通路抑制(在PS中胚层诱导之后的两天时间期间(对于hESC第4天至第6天，对于hIPSCs第5天至第7天))导致在分化的第15天细胞表达细胞表面标记CD73和CD105的百分比增加(图2C)。因此，在一些细胞系中，所述近轴中胚层特化的效率可以在Wnt通道拮抗剂存在下紧接在所述PS中胚层诱导阶段之后得以改善。
以往的研究表明，需要TGFβ/BMP信令以由近轴中胚层产生软骨细胞祖细胞。据发现，TGFB3(以及TGFβ1或TGFβ2)刺激是第3阶段所需的(例如，起始于第15天)，因为这种中胚层直接接种于含有BMP4的培养基导致没有形成软骨组织的非贴壁细胞聚集体的发育。在TGFb3处理10天(总计第25天)之后，培养基可以转化至含有BMP4的培养基或维持于TGFb3(第4阶段)中以特化软骨细胞的子集(关节/非肥大或生长板/肥大)。为了确定第15天中胚层群的所述软骨细胞潜力，所述细胞以高细胞密度按照20μL体积接种于组织培养基处理的培养皿中长达1h(微团)，并然后将所述“斑”用培养基浸没/覆盖。在我们的最初的研究中，所述细胞“种斑”于含有2％胎牛血清的培养基。然而，这种短血清暴露可以随着后期阶段对软骨形成无影响而省略，从而使这种方案任选地是无血清。在2至3天后，将含有TGFB3的无血清培养基加入所述培养基中以产生软骨细胞祖细胞。由所述4种不同的中胚层(0DM+/-FGF；4μMDM+/-FGF)衍生的细胞群在这种微团分析法中进行测试。尽管所有四种中胚层群在1天培养内就贴附于所述培养皿(图2D)，但不同表型在1周后才观察到。通过流式细胞仪以心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达(图2E)进行量化的收缩(跳动)心肌细胞，在衍生于未处理的中胚层(0DM，0FGF)的微团中观察到。单独用DM处理的中胚层并未保持贴附以形成软骨细胞，而相反却以长链聚集，随着培养基变化而被冲洗掉。FGF-处理的，以及DM+FGF-处理的细胞作为贴附细胞层而幸存于胚细胞微团培养的第一周，并且未产生任何心肌细胞。经过4周的微团培养，在单层阶段中采用DM+FGF处理的细胞产生了可以用肉眼观察到(约1cm直径)的类软骨的组织。在单层阶段单独用FGF处理的细胞没有保持软骨组织的表型，并从所述培养基培养皿分离开(图2F)。虽然FGF-处理和DM+FGF-处理的单层培养表达了类似水平的CD73/CD105/PDGFR-β，但在第15天的所述近轴基因表达，以及所述软骨组织的总体存活，间接表明BMP抑制(本文中以DM处理的形式)和FGF刺激二者对于特化具有体外形成类软骨的组织的潜力的近轴中胚层命运都是必需的。
为了确定CD73，CD105和Pβ是否表达于在所述hESC分化培养中具有软骨细胞的潜力的所述细胞群上，CD73+CD105+和CD73-CD105-和CD73+Pβ+和CD73-Pβ-部分都在第15天从DM+FGF-处理的单层中分离出来并在胚细胞微团培养基中分析检测(图3A)。10天之后在微团中所述CD73+CD105+细胞和所述CD73+Pβ+细胞贴壁并存活。所述两个实验中的双阴性细胞未能在这些条件(图3B)下存活。两周之后，软骨组织发育于由所述CD73+CD105+和CD73+Pβ+分选的细胞衍生的培养基中(要么保持于TGFB3中，要么转换至含有BMP4的培养基中)。与此相反，所述双阴性细胞在这两种情况下都未能形成任何软骨组织(图3C)。生成软骨组织的潜力的差异如图3D中所示。这些数据表明，所述CD73+CD105+Pβ+细胞具有产生软骨细胞和类软骨的组织的潜力，而缺乏这些标记的表达的细胞并不具有潜力。
对在第2阶段结束时衍生的合适近轴中胚层群的有效使用，和在第3阶段结束时产生软骨细胞祖细胞，提供了一个研究软骨细胞两种亚型，关节软骨细胞(ACs)和生长板软骨细胞(GPCs)的发育的机会。在所述近轴中胚层细胞用TGFb3刺激约10天之后，这些软骨细胞/软骨培养基可以要么保持于含TGFb3的培养基中，要么转换至含BMP4的培养基中保持几个月(第4阶段)。TGFB3或BMP4-处理的培养基在12周的过程中形成类软骨的组织，这可以使用指示软骨特异性胞外基质存在的染色(甲苯胺蓝)，和通过与关节软骨或生长板软骨相关的基因表达进行组织学分析。形态学上，在TGFb3-处理的软骨组织中发现的软骨细胞具有小的类成纤维细胞的表型，而BMP4-处理的软骨细胞是圆形，具有类鹅卵石的外观(图4A)。甲苯胺蓝均匀染色的TGFb3-处理的软骨含有均匀地分散于整个组织内的小细胞(软骨细胞)(13周龄组织，图4(B))。与此相反，所述BMP4-处理的组织包含增大的肥大软骨细胞。在BMP4-处理的软骨组织中软骨细胞尺寸的显著增加可以指示软骨细胞肥大，正常的过程涉及GPC分化。体内的生长板的肥大软骨细胞通过胶原蛋白10表达进行标记。所述生长板分化程序最终导致细胞死亡，留下在其上可以形成新骨的钙化基质。通过流式细胞仪分析法使用活细胞正向和侧向散射图(图4C)也在BMP4-处理的软骨组织中观察到肥大。TGFb3-处理的软骨细胞形成较小的较少的颗粒细胞的紧细胞群，而BMP4-处理的细胞表现出更大的前向散射(FSC)，代表较大的细胞尺寸，以及更大的侧向散射(SSC)，代表着在评价的所有时间点的更高的细胞粒度(示出了3周和5周微团)。
组织学上，TGFb3-处理的软骨组织似乎具有许多老化19周的胎股骨的关节软骨的未来位点的相同特性(上面板，图4D)，而BMP4-处理的软骨中发现的肥大软骨细胞类似于在胎股骨(下图)的亚软骨骨区附近发现的所述生长板软骨细胞的外观。这些表型间接表明，具有所述两种独特亚型软骨的特性的软骨组织由人PSCs体外产生。由所述膝关节分离的原生胎儿软骨细胞也培养于微团分析法中，类似于第15天hPSC衍生的近轴中胚层所用的方案，并也体外产生软骨组织。组织学上，TGFb3-处理的和BMP4-处理的胎儿软骨细胞衍生的软骨组织看起来非常相似于源于hPSCs的软骨组织。图4E表明，用GDF5替换BMP-4产生了类似于图4A中的那些的肥大软骨细胞。
细胞尺寸和形态中的类似差异在12周龄的软骨组织中观察到，软骨组织采用TGFβ3和BMP4从人hiPSCs细胞产生。采用指示蛋白聚糖存在的甲苯胺蓝因温变色地染色组织(图4F)。正如所料，II型胶原蛋白存在于在这两种条件下都产生的hPSC衍生组织中(图4G)。X型胶原蛋白在这个时间点都未在每个组织中检测到。润滑素蛋白存在于TGFβ3-处理而未在BMP4-处理的微团组织中(图4H)，并优先发现于排列于该组织结构的顶部的扁平化细胞中。总的来说，这些研究结果对解释持续的TGFβ3信令促进可以产生类关节软骨的组织的关节软骨细胞的发育，而BMP4信令诱导形成具有生长板特性的软骨的肥大(增大)软骨细胞的分化提供有力的支撑。
在所述两个条件下产生的所述组织接着通过qRT-PCR(图5)对基因表达方式进行分析，并通过免疫组织化学和免疫染色(图4)对与软骨发育相关的特异性蛋白的存在进行分析。SOX9和COL2A1的表达，由关节和肥大软骨细胞都表达的基因，通过在TGFβ3-和BMP4-处理的组织中进行的2周的培养进行上调(图5A-B)。表达的水平类似于原生的人胎ACs，健康成人ACs，和髂骨(肥大)软骨细胞中发现的那些。与肥大软骨细胞相关的包括RUNX2，SP7，碱性磷酸酶(ALP/ALPL)，和COL10A1的基因的表达在所述8～12周龄的BMP4-处理的组织中比保持于TGFb3中的组织中显著更高(图5C-F)。对已知由浅表区关节软骨细胞包括润滑素(PRG4)和软骨中间层蛋白2(CILP2)表达的基因(图5G-H)，以及在关节域间的细胞中表达的那些，所述ACs，诸如GDF5，WNT9A，和ERG的祖群都观察到反转模式(图1-K)。
总之，衍生于TGFb3-处理的细胞和BMP4-处理的细胞的hPSC衍生的软骨的所述组织学和基因表达分析表明，两种独特的软骨细胞群和类软骨的组织已经体外产生。TGFB3-处理的软骨组织成熟一段延长的时间(高达12周)允许成熟的AC基因，诸如润滑素和CILP2表达。所述TGFB3培养基用BMP4处理诱导的肥大响应，很容易通过组织学和通过与在生长板中，胶原蛋白10和Runx2中发现的肥大软骨细胞相关的基因的上调观察到。因此，用TGFB3处理衍生的hPSC衍生软骨组织采代表类关节的软骨，而BMP4-处理的软骨组织代表类生长板的肥大软骨。
在确定可以利用于从hPSC分化培养基，或由从患者分离的软骨组织富集ACs用于自体软骨细胞移植为目的的细胞表面标记的努力中，我们实施了包括350种抗体的流式细胞术基的抗体筛选。对来自所述膝关节的原生软骨细胞的几个源进行了筛选，包括至少两个用于异体移植的人体健康成人关节软骨的样品，至少4个老化16-19周龄的人胎儿软骨细胞，和1个由所述臀部的髂嵴分离的人体成人软骨细胞的样品，其具有生长板的特性。根据这些筛选，我们确定CD73作为关节软骨细胞的标记(图6)。CD73由几乎所有的(>96％)由所述膝分离的健康成人关节软骨细胞表达，但它通过仅约22％的类髂嵴GPC的软骨细胞表达(图6A)。CD73通过约一半的胎儿软骨细胞表达(图6B)，这可能代表不纯的关节软骨细胞群，因为如果所述次生骨化中心尚未僵化，这发生于青春期，则很难正好从所述生长板软骨细胞中分离出这些细胞。
原生(P0)和传代(P2)的胎儿软骨细胞也可以培养于具有TGFB3或BMP4的微团中，类似于如何形成hPSC衍生的软骨组织。TGFB3-处理的胎P0衍生的或胎P2衍生的软骨组织含有超过93％的CD73阳性细胞，而同时BMP4处理分别将CD73+细胞的百分比降低至70％和61％(图6C，图6D)。CD73表达也通过超过98％用TGFB3处理衍生的hPSC衍生软骨组织进行表达(图6E)。CD73+细胞的百分比在BMP4处理后仅仅降低至约57％的细胞。因此，CD73会标记原生健康成人ACs，一定比例的健康胎儿软骨细胞，作为在TGFB3中的微团培养的胎儿软骨细胞或传代胎儿软骨细胞，和由人PSCs衍生的TGFB3-处理的类关节软骨细胞的细胞。
有趣的是，诸如CD73的间充质细胞表面标记会标记早期在所述分化中的所述hPSC衍生的近轴中胚层以及衍生于那个中胚层的终末期类关节的软骨细胞。近轴中胚层在第12天(T12)和第15天(T15)都表达CD73和PDGFR-β，并在为期三天的“出斑”阶段(总计第18天)后，所有细胞都是CD73+PDGFR-β+(图6F)。有趣的是，两种这些细胞表面受体在10天～2周的胚细胞微团培养之后都下调。在4至5周之后，CD73重新表达于TGFB3-处理的胚细胞微团培养基中(图6G)，这表明CD73在所述软骨细胞祖细胞朝着关节软骨细胞命运分化时可能会被表达。
为了进一步表征所述两种类型的软骨细胞的潜力，来自解离的8～12周龄组织的细胞皮下注射到NSG免疫缺陷的小鼠中。这两个细胞群都产生富含蛋白聚糖而表达II型胶原蛋白的软骨组织，在移植之后到4周没有显著矿化。在12周的移植后在所述移植物中观察到独特的差异。衍生于BMP4-处理的软骨细胞的组织几乎没有保持蛋白聚糖(图7A，图7C)并且含有钙化/矿化的区域和正如分别通过阳性vonKossa(图7B)和X型胶原蛋白染色(图7E)揭示的肥大。有趣的是，来自TGFβ3-处理的软骨细胞的移植物保持了蛋白聚糖-(图7A，图7C)和II型胶原蛋白富含的ECM(图7D)，而没有钙化/矿化或肥大的证据(图7B，图7E)。所述来自这些移植研究的结果表明，所述两种软骨细胞群功能不同，并提供额外的证据证明，TGFβ3-处理的细胞代表了关节软骨细胞，因为它们体内产生和维持稳定的软骨超过12周。在BMP4存在下发育的软骨细胞，相比而言，表现出了在所述生长板中发现的那些特性，因为它们产生了体内引发软骨内骨化的组织。
COL2A1，PRG4(润滑素)和CILP2也在用TGFβ1和TGFβ2处理12周的微团组织中上调(图8)，表明由hPSC衍生的近轴中胚层响应产生关节软骨细胞并不是配体特异性的。
对无限供应hPSC衍生的类关节的软骨的接近提供了建立分析已知在骨关节炎(OA)早期阶段中发挥作用的促炎性细胞因子如白介素1a(IL1β)的影响作用的平台的机会。在不存在TGFb3下用IL1β处理10周龄hPSC衍的生ACs两周(图9A)导致分解代谢酶的表达的上调，分解代谢酶包括基质金属肽13(MMP13)(图9B)和MMP2(图9C)，和ADAMTS4&S5(图9D，图9E)。这些酶裂解在软骨胞外基质(ECM)中发现的蛋白质，诸如胶原蛋白和聚集蛋白聚糖，这导致软骨组织的退化。只有在不存在TGFβ3之下才观察到MMP13和ADAMTS4的显著上调。ADAMTS5在TGFβ3存在或不存在下都被诱导。润滑素(PRG4)和CILP2的表达也在不存在(图9H-I)或存在TGFβ3下将IL1β加入到组织中时发生下调。加入IL1β也导致COL2A1和ACAN表达降低(图9F-G)，血管内皮生长因子(VEGF)表达增加(图9J)，和所述组织中蛋白聚糖的显著损失(图9K)。总之，这些发现表明，IL1β信令可以引发从合成代谢环境向所述hPSC衍生的AC中的分解代谢状态的转换，这类似于在早期OA发病期间天然软骨中观察到的情况。
实例2
CD73+细胞代表关节非肥大软骨细胞，而缺乏CD73阳性可以识别类生长板的肥大软骨细胞。
类软骨细胞和软骨的组织可以使用本文中所述的方法例如实例1中所述的方法产生。关节软骨细胞可以从前体或类生长板的软骨细胞中使用所述CD73细胞标记分离和/或分隔出来。正如本文中所述，当类AC的细胞采用BMP4刺激时它们就变得肥大并失去CD73在其细胞表面上的表达。一种可以使用的监测所述CD73细胞表面标记的表达的方法是荧光活化的细胞分选(FACS)分析法。
实例3
hESC衍生的软骨细胞或软骨的用于药物毒性筛选的用途
使用本文中所述的例如实例1中的方法获得的HESC衍生的软骨细胞可以用于前瞻性的药物毒理学筛选以及药物发现。例如，类生长板软骨组织细胞系的典型软骨组织和/或肥大软骨细胞以及其前体可以与测试物质接触并测定一种或多种生物学端点，诸如细胞死亡。例如，细胞死亡可以使用例如活细胞染料排除分析法，诸如所述台盼蓝(TrypanBlue)分析法进行测定。例如，暴露于测试物质(药物)的类AC的软骨细胞可以在所需时间点之后通过计数所述可渗透台盼蓝染料的细胞而对细胞毒性进行监测。其他分析法包括四唑鎓盐转化分析法。这种分析法的实例包括MTT分析法以及WST-1分析法。所述分析法可以被自动化以用于高通量筛选。
实例4
hESC衍生的软骨细胞或软骨在通过测试物质诱导的细胞增殖的测试 中的用途
hESC衍生的软骨细胞的用途的另一个实例是那些对细胞分化或增殖具有影响作用的药物的测试。尤其感兴趣的将是，对可以影响原生关节软骨细胞在关节软骨组织内的增殖的药物的测试，这通过使用所述指示类AC命运的CD73标记来监测。各种细胞增殖分析法都是可以利用的，并可以监测对所关注的测试物质的响应。例如，所述3H胸苷掺入法监测采用测试物质或生长因子处理之后的细胞增殖。在这样的处理之后，细胞用3H-胸苷培养16～24小时。一种替代分析法是5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)掺入法。还有的另一替代方法是使用碘化丙啶测试的用法。荧光与所述样品中的DNA含量成正比。监测细胞增殖的这种方法可以具体用于hESC衍生的软骨细胞的环境中，因为它可以与在单层上生长的细胞一起使用。
实例5
软骨细胞的尺寸和粒度作为区分细胞谱系的方式的用途
本公开描述了用于产生不同软骨细胞的谱系，更具体而言，是类AC软骨细胞以及类生长板的软骨细胞的方法。这些谱系可以例如基于尺寸进行区分。例如，使用hESC衍生的软骨细胞的前向散射(FSC-A)和侧向散射(SSC-A)，在不存在活细胞的流式细胞仪分析期间观察到的抗体基染色之下可以使用。TGFB3处理的类AC的细胞群显示为紧密细胞群，通常具有均匀尺寸和粒度，而BMP4-处理的肥大软骨细胞显示为异质细胞群，通常具有较大的FSC-A和SSC-A属性。因此，活细胞的FSC-A和SSC-A属性可以是诱导或阻止软骨细胞肥大的因子进行测试的实验中的有用示值读数。
实例6
细胞发育和细胞谱系使用报告基因分析法的监测
报告基因分析法可以与本文中所述的方法一起使用以识别保持或改变软骨细胞特异性基因的表达的因子和物质，软骨细胞特异性基因包括诸如润滑素或胶原蛋白10的成熟软骨基因。例如，靶向hESC线的润滑素启动子-RFP(红色荧光蛋白)可以用于筛选诱导润滑素启动子活性和通过荧光显微镜法可检测的RFP的表达的测试物质。润滑素启动子的RFP+表达，荧光的增加，或表达润滑素启动子RFP+的细胞百分比增加，将指示显示出类非肥大关节的软骨细胞特性的细胞百分比的增加。相反，润滑素启动子RFP+的损失可以指示这些细胞和/或类关节的软骨细胞特性的损失。
因此，胶原蛋白10报告子(诸如胶原蛋白10启动子-绿色荧光蛋白-GFP)将会适用于检测胶原蛋白10在软骨细胞或组织中表达水平的升高或降低。胶原蛋白10-GFP+表达，荧光的升高，或表达胶原蛋白10-GFP的细胞百分比的增加，将指示显示肥大软骨细胞特性的细胞百分比的增加。相反，胶原蛋白10-GFP的损失可以指示肥大的损失。
所述报告子谱系也可以用于基于流式细胞术的筛选。
另外，非肥大软骨细胞的细胞和/或肥大软骨细胞的细胞可以采用报告基因系统进行临时或稳定转染，其中所述报告基因功能上偶联至关节软骨细胞特异性启动子(即，关节软骨细胞报告系统)，任选地润滑素启动子元件和/或功能上偶联至肥大软骨细胞特异性启动子的报告基因，任选地胶原蛋白10启动子元件(即，肥大软骨细胞报告系统)。所述细胞可以进行选择并随后与测试物质接触。诱导关节软骨细胞分化的测试物质可以通过测定所述关节软骨细胞报告系统活性(例如，相对于对照物)而识别并且诱导肥大软骨细胞分化的测试物质可以通过测定肥大软骨细胞报告系统活性(例如，相对于对照物)而识别。
虽然本申请已经参照本文中描述为优选实施例的实施例进行了描述，但应该理解的是本申请并不限于所述公开的实施例。与此相反，所述申请预想涵盖包括于所附权利要求的范围和精神内的各种修改和等效排布设计。
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Claims (74)

1.一种用于产生软骨细胞和/或软骨，任选地类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
a.采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，任选地CD56+和PDGFRα+类原条中胚层群，所述混合物包含：
i.FGF激动剂；
ii.BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
iii.任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431542；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群；
b.产生软骨细胞前体群，包括：
i.将表达CD73，CD105和/或PDGFR-β的所述近轴中胚层群以高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；
ii.采用TGFβ激动剂将高细胞密度CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层群培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
c.
i.采用TGFβ激动剂培养高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；或
ii.采用BMP4激动剂培养所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
2.根据权利要求1所述的用于产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织的方法，其中，步骤c)包括采用TGFβ激动剂培养所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织，所述一段延长的时间任选地大于3周。
3.根据权利要求1所述的用于产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，
其中，步骤c)包括采用BMP4激动剂培养所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述近轴中胚层群包含于类胚体，单层培养和/或它们的组合中。
5.根据权利要求1所述的用于产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
a.采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层群；
b.采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，所述混合物包含：
i.FGF激动剂；
ii.BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
iii.TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群；
c.产生软骨细胞前体群，包括：
i.将所述表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群按照高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；
ii.将高细胞密度CD73+，CD105+和PDGFRβ+近轴中胚层群采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
d.将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织。
6.根据权利要求1所述的用于产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的方法，所述方法包括：
a.采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层群；
b.采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，所述混合物包含：
i.FGF激动剂；
ii.BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
iii.任选地TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群；
c.产生软骨细胞前体群，包括：
i.将表达CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群按照高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；
ii.将所述高细胞密度CD73+，CD105+和PDGFRβ+近轴中胚层群采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
d.将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
7.根据权利要求1所述的用于产生软骨细胞的方法，所述方法包括：
a.采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层群；
b.采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，所述混合物包含：
i.FGF激动剂；
ii.BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
iii.TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和PDGFR-β的近轴中胚层群；
c.产生软骨细胞前体群，包括：
i.将表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群按照高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；
ii.将高细胞密度CD73+，CD105+和PDGFRβ+近轴中胚层群采用TGFβ激动剂培养于无血清培养基中以产生高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群；和
d.
i.将高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；或
ii.将所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述起始群是人胚干细胞群(hESC)或诱导的多能干细胞群(iPSC)，任选地原生hESC和/或iPSC。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述hESC群选自HES2H1，H9，或任何人iPS细胞系。
10.根据权利要求5～9中任一项所述的方法，其中，所述起始群聚集至类胚体内。
11.根据权利要求5～10中任一项所述的方法，其中，所述起始群与所述诱导混合物的原条接触约1天至约5天。
12.根据权利要求5～11中任一项所述的方法，其中，所述诱导混合物的原条包括活化素激动剂，任选地活化素A或nodal，BMP4激动剂，任选地BMP4，BMP2，BMP6，BMP7和/或，BMP10，和FGF激动剂，任选地bFGF，FGF2，FGF4，FGF9和/或任选地FGF19，21，3，5，6，8a，16-18，20和/或23。
13.根据权利要求5～12中任一项所述的方法，其中，所述诱导混合物的原条进一步包含wnt激动剂，任选地选自Wnt3a和GSK3b抑制剂，诸如CHIR-99021(StemoleculeTMCHIR99021Stemgent)，6-溴靛红-3’-肟(BIO)(CaymanChemical(cat:13123))，或StemoleculeTMBIO(Stemgent)(cat:04003)。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，在单层培养中特化所述近轴中胚层。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂是1型BMP受体抑制剂，BMP配体和/或可溶性BMP受体，任选地选自dorsomorphin(DM)，头蛋白，腱蛋白，LDN-193189，可溶性BMPRIa，可溶性BMPRIb。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述类原条中胚层群与所述BMP抑制剂接触约1天，2天，3天或4天以抑制心肌细胞特化。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，用于特化所述类原条中胚层群和/或所述近轴中胚层群的FGF激动剂选自FGF2，bFGF，FGF4和FGF9。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，所述类原条中胚层群与所述FGF激动剂接触至少5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天或更长以使表达CD73和/或CD105的细胞的比例相比于FGF激动剂未处理的细胞增加至少20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％或65％。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，所述近轴中胚层群还表达转录因子Meox1和Nkx3.2而对Nkx2.5呈阴性。
20.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，所述近轴中胚层群接种于微团培养基、微球培养基或过滤器培养基中或以任何高细胞密度格式接种。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述近轴中胚层群以介于1千万个细胞/mL和5千万个细胞/mL之间，任选地以至少每1mL1千万个细胞，2千万个细胞/mL，3千万个细胞/mL，4千万个细胞/mL或5千万个细胞/mL的细胞密度接种于微团培养基中；或以介于500,000和2百万，任选地约500,000，约750,000，约1百万，约1.25百万，约1.5百万，约1.75百万，约2百万的细胞密度接种于膜过滤器培养基中。
22.根据权利要求1～21中任一项所述的方法，其中，所述群培养于含有胰岛素，转铁蛋白和任选地硒(ITS)的无血清基础培养基中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述基础培养基包括具有胰岛素，转铁蛋白，硒补充，脯氨酸和地塞米松的DMEM。
24.根据权利要求1～23中任一项所述的方法，其中，在加入TGFb3激动剂之前，近轴中胚层群按照高细胞密度培养约0天至约4天，任选地0，1，2，3，或4天。
25.根据权利要求1～24中任一项所述的方法，其中，所述CD73+，CD105+和/或PDGFRβ+近轴中胚层群采用所述TGFβ3激动剂培养于无血清培养基中至少3天，或约3天至约14天，任选地至少一周，以产生Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群。
26.根据权利要求1，2，4至24中任一项所述的方法，其中，所述Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用TGFβ激动剂培养的所述延长的时间为至少4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周或更长以产生类关节软骨的组织。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述软骨细胞前体群采用所述TGFb激动剂进行培养直至表达润滑素和/或软骨中间层蛋白2(CILP2)。
28.根据权利要求1～27中任一项所述的方法，其中，所述近轴中胚层群和/或所述Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用选自TGFb3，TGFb1,和/或TGFb2的TGFb激动剂进行培养。
29.根据权利要求1，3～27中任一项所述的方法，其中，采用所述BMP4激动剂培养类G肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，以产生胶原蛋白10+和/或Runx2+类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
30.根据权利要求1，3～27和29中任一项所述的方法，其中，所述高细胞密度Sox9+，胶原蛋白2+软骨细胞前体群采用所述BMP4激动剂进行培养的所述延长的时间为至少2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周或更长以产生表达胶原蛋白2的软骨组织或表达胶原蛋白10的肥大软骨细胞群。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的方法，其中，CD73+CD105+细胞和/或CD73+PDGFR-β+细胞，任选地通过流式细胞仪，在高细胞密度培养之前从表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的所述近轴中胚层群中分离出来。
32.根据权利要求1～31中任一项所述的方法，其中，将所述软骨细胞前体培养于TGFβ激动剂或BMP4激动剂中以形成软骨组织。
33.根据权利要求1所述的用于产生类软骨细胞的细胞的方法，包括：
a.将软骨细胞的前体细胞按照高细胞密度任选地培养于无血清或含血清培养基中；
b.将高细胞密度软骨细胞的前体细胞采用TGFβ3激动剂培养于无血清培养基中；和
c.
i.将所述软骨细胞的前体细胞采用TGFβ激动剂培养一段延长的时间以产生类关节软骨的软骨细胞群；或
ii.将所述软骨细胞的前体细胞采用BMP4激动剂培养一段延长的时间以产生肥大软骨细胞的细胞群和/或类软骨的组织。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述软骨细胞的前体细胞是原生胎儿软骨细胞或传代胎儿软骨细胞。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述软骨细胞的前体细胞是获自具有软骨或骨病症或疾病的受试者的原生细胞。
36.根据权利要求1～35中任一项所述的方法，其中，在体外实施各步骤。
37.根据权利要求1～36中任一项所述的方法，其中，将所产生的细胞和/或组织给药于受试者。
38.一种根据权利要求1～37中任一项所述的方法产生的类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的单独的群。
39.一种组合物，包括类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织的群，和任选地稀释剂或载体，任选地PEG，水凝胶，骨支架，骨替代支架或基质胶。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中，所述组合物是细胞浆。
41.根据权利要求38所述的单独的细胞群或根据权利要求39或40所述的组合物，进一步包括内皮细胞或成纤维细胞。
42.一种软骨或骨组织产品，其包括权利要求1～41中任一项所述的细胞或组合物，和支架。
43.根据权利要求42所述的骨组织产品，其中，所述支架是骨替代物。
44.一种用于改善症状和/或治疗有需要的受试者的方法，包括施用权利要求38～41中任一项所述的细胞群和/或组织和/或插入权利要求42或43所述的产品。
45.根据权利要求38～41中任一项所述的细胞群和/或组织或组合物和/或根据权利要求42或43所述的产品用于改善症状和/或治疗有需要的受试者的用途。
46.根据权利要求44或45中所述的方法或用途，其中，由自体细胞诱导所述细胞群。
47.根据权利要求44～46中任一项所述的方法或用途，其中，所述细胞群富含类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织。
48.根据权利要求44～47中任一项所述的方法或用途，其中，所述受试者具有关节病症，诸如骨关节炎，剥脱性骨软骨炎，多软骨炎，和其他软骨病，或影响软骨的关节损伤。
49.根据权利要求44～45中任一项所述的方法或用途，其中，所述细胞群富含类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织。
50.根据权利要求49所述的方法或用途，其中，富含的所述类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织附着于支架。
51.根据权利要求44～46和50中任一项所述的方法或用途，其中，所述受试者具有诸如骨裂，骨折或例如由于恶性肿瘤，创伤或具有软骨发育不全，成骨不全，骨质疏松或其他骨病而需要骨替换的骨病症。
52.一种产生近轴中胚层的细胞群的方法，包括：
a.采用诱导混合物的原条培养多能干细胞的起始群以诱导表达CD56和PDGFR-α的类原条中胚层群；
b.采用特化混合物的近轴中胚层培养类原条中胚层群，所述混合物包含：
i.FGF激动剂；
ii.BMP抑制剂；任选地头蛋白，LDN-193189，Dorsomorphin；和
iii.TGFβ抑制剂中的一种或多种，任选地SB431524；和Wnt抑制剂，任选地DKK1，IWP2，或XAV939；
以特化表达细胞表面CD73，CD105和/或PDGFR-β的近轴中胚层群。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述方法进一步包括富集CD73，CD105和/或PDGFRβ表达细胞。
54.一种分离近轴软骨形成中胚层的细胞群的方法，包括：
a.将包括近轴软骨形成中胚层细胞的细胞群与含有CD73特异性结合剂，CD105特异性结合剂和PDGFRβ特异性结合剂的混合物接触；以及
b.富集CD73+，CD105+和PDGFRβ+细胞。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中，使用流式细胞仪富集所述细胞。
56.一种根据权利要求52～55中任一项所述的方法制备的单独的近轴软骨形成中胚层的细胞群。
57.一种测试候选软骨形成调节物质的方法，所述方法包括：
a.将测试物质与软骨细胞前体谱系细胞群接触，所述测试物质与所述软骨细胞前体谱系细胞群在权利要求1～37，52和53中任一项所述的方法中的任何步骤中接触；
b.相比于在不存在测试物质下产生的对照物群，评价所述测试物质对软骨细胞增殖，保持和/或分化的影响；以及
c.如果所述测试物质相比于对照物提高或降低增殖，和/或影响软骨细胞的保持或分化，则将所述测试物质确定为候选软骨形成调节物质。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述候选软骨形成调节物质是从具有病变软骨或骨的受试者中分离出来的因子。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述因子是从患有关节炎和/或肥胖症的受试者或从作为对照物的健康受试者的关节，任选地膝关节，中的脂肪垫分离出来的。
60.根据权利要求57所述的方法，其中，所述测试物质添加了所述BMP4激动剂，并且相比于在不存在所述测试物质下处理的对照物，评价所述测试物质抑制肥大的能力。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，使用流式细胞仪，任选地通过评价前向和侧向散射来评价肥大。
62.一种分离关节软骨细胞的方法，包括：
a.在容许形成抗体:CD73细胞络合物的条件下，将包括软骨细胞的混合细胞群与结合CD73的抗体接触；以及
b.分离出所述抗体:CD73细胞络合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述混合细胞群包含类非软骨细胞的细胞，类非关节软骨细胞的细胞和类肥大软骨细胞的细胞。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中，所述抗体偶联至诸如珠子的标记，所述珠子诸如琼脂糖珠或磁性珠。
65.一种评价候选关节软骨细胞增殖诱导剂的方法，包括：
a.获得根据权利要求1，2，4～37中任一项所述的方法产生的类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；
b.用测试物质培养所述类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织；
c.测定所述类关节的类非肥大软骨细胞的细胞增殖；和
d.相比于在不存在所述测试物质下培养的类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织，检测增殖的增长，所述增殖的增长表明所述测试物质是候选的关节软骨细胞增殖诱导剂。
66.一种评价候选肥大软骨细胞增殖诱导剂的方法，包括：
a.获得根据权利要求1，3～37中任一项所述的方法产生的类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织；
b.采用测试物质培养所述类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织；
c.测定肥大软骨细胞的细胞增殖；和
d.相比于在不存在所述测试物质下培养的类肥大软骨细胞的细胞和/或类软骨的组织，检测增殖的增长，所述增殖的增长表明所述测试物质是候选的肥大软骨细胞增殖诱导剂。
67.根据权利要求65所述的方法，其中，在采用所述测试物质进行培养之前，将CD73类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织分离出来，任选地通过流式细胞仪分离。
68.根据权利要求65～67中任一项所述的方法，其中，所述类关节的非肥大软骨细胞和/或类肥大软骨细胞的细胞，细胞包含功能上偶联至关节软骨细胞特异性启动子的报告基因(即，关节软骨细胞报告系统)，任选地润滑素启动子元件和/或功能上偶联至肥大软骨细胞特异性启动子的报告基因，任选地胶原蛋白10启动子元件(即，肥大软骨细胞报告系统)；并且通过测定所述关节软骨细胞报告系统活性来识别诱导关节软骨细胞分化的化合物，并且通过测定肥大软骨细胞报告系统活性来识别诱导肥大软骨细胞分化的化合物。
69.根据权利要求65～68中任一项所述的方法，其中，增殖的增长是通过使用以下方法中的一种或多种进行测定的:3H胸苷掺入法；5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)掺入法；碘化丙啶分析法。
70.一种评价测试化合物的AC细胞和/或GPC细胞保护性活性和/或毒性的方法，包括：
a.根据权利要求1～37中任一项所述的方法产生类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或类GPC的细胞和/或生长板软骨；
b.采用所述测试物质培养所述类关节的非肥大软骨细胞和/或类软骨的组织和/或GPC细胞和/或类软骨的组织；
c.测定所述测试物质的细胞/组织毒性或软骨细胞保护性活性；以及
d.相比于在不存在所述测试物质下培养的类关节的非肥大软骨细胞和/或GPC细胞和/或组织，检测细胞毒性的增长，细胞毒性的增长表明所述测试物质对关节软骨细胞和/或GPC细胞具有毒性，或相比于在不存在所述测试物质下培养的类关节的非肥大软骨细胞和/或GPC细胞和/或组织，检测保护活性的增长(例如，细胞毒性降低)，保护活性的增长表明所述测试物质是保护性的。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，细胞毒性使用以下分析方法之一测定:台盼蓝染料分析法；萤光素酶分析法；诸如MTT分析法和WST-1分析法的四唑盐转化分析法。
72.根据权利要求65～70中任一项所述的方法，其中，使用一种或多种以下分析或检测法评价增殖，细胞毒性和/或保护性活性:组织学分析，诸如量化糖胺聚糖和蛋白聚糖的产量的生化分析法，基因表达分析，通过显微镜或流式细胞仪的诸如润滑素或胶原蛋白10的荧光报告子的增益/损失，CD73细胞表面受体表达的增益或损失，细胞死亡分析法，用于可以指示软骨细胞肥大的细胞尺寸的流式细胞术。
73.根据权利要求65-72中任一项所述的方法，其中，所述类AC的软骨细胞和/或类软骨的组织或所述类肥大的软骨细胞和/或类软骨的组织与疾病介导子任选地在采用所述测试物质培养之前接触。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述疾病介导子是细胞因子，任选地IL-1β，或关节脂肪垫组分。
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