CN117716021A - 可成型且无需支架的软骨组织的制作方法 - Google Patents

可成型且无需支架的软骨组织的制作方法 Download PDF

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Abstract

本公开开发解决以下问题的制作软骨组织的方法。1.软骨分化不受成型阻碍。2.在不利用支架的情况下，可成型为期望形状。一种人工软骨组织的制作方法，其包括：将包含软骨前体细胞的球状体接种在支撑体上，同时成型为期望形状；从接种了该球状体的面的外侧及内侧供应培养基，同时培养该球状体，使球状体彼此融合；以及，在体外使融合球状体成熟为软骨组织。

Description

可成型且无需支架的软骨组织的制作方法
技术领域
本发明涉及可成型且无需支架的软骨组织的制作方法。
背景技术
迄今为止，对于颅面部区域的软骨发育不良、四肢的剥脱性骨软骨炎和外伤性软骨损伤的根治治疗方法是自体软骨移植。由于这种方法对可采集的软骨有限制或产生采集部位的术后疼痛，因此，开发了将少量的干细胞诱导分化并扩大培养后移植的培养软骨移植法。
在开发出与水凝胶等人工支架材料组合的软骨之后，开发了不需要支架材料、更符合生理学的无支架软骨(非专利文献1)。然而，无支架软骨在使细胞团块聚集后进行三维的悬浮培养，因此无法制成期望形状。在移植到对象疾病患者时，软骨组织适合需要的形状是重要的，因此可作为最需要克服的问题点之一。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Enomura M,et al.,Int J Mol Sci.2020,21,8496
发明内容
发明要解决的课题
迄今为止，还尚未开发出无支架且可成型的软骨。本发明的目的在于解决以下问题的制作软骨组织的方法。
1.软骨分化不受成型阻碍。
2.在不利用支架的情况下，可成型为期望形状。
用于解决课题的手段
本发明人等认为，在从软骨前体细胞制作可成型且无需支架的软骨组织时，优选如下方法，即，使软骨前体细胞聚集而暂时形成小型的球状体，使其再集合，成型为目标形状。然而，在使软骨前体细胞聚集而形成球状体的情况下，直径为300μm以上时氧气无法到达，因此会产生营养不良状态所导致的细胞死亡。另外，粘附在板底面的球状体的粘附面有可能处于营养不良和低氧状态。为了解决这些问题，将软骨前体细胞接种在微图案板并使其聚集，制作成直径为200μm大小的球状体群。将制作的球状体按期望的形状排列，使球状体彼此融合。与单个细胞相比约100倍大的球状体用肉眼也可以确认，因此能够以如堆叠球的形状来形成三维结构。此时，为了不让与底面接触的球状体处于营养不良和低氧状态，在细胞培养小室上进行作业，用培养基填满小室下部。这样制作的软骨组织可以全方位进行培养基和气体交换。将用这种方法培养15-30天所制作的软骨组织移植到生物体时，成为成熟的软骨。另外，用这种方法培养56-70天的软骨组织成为肥大软骨，移植到生物体时，成为骨组织。本发明是通过这些见解完成的。
本发明的要点如下。
(1)一种制作人工软骨组织的方法，其包括：将包含软骨前体细胞的球状体接种在支撑体上，同时成型为期望形状；从接种了该球状体的面的外侧及内侧供应培养基，同时培养该球状体，使球状体彼此融合；以及，在体外使融合球状体成熟为软骨组织。
(2)根据(1)记载的方法，其中，软骨前体细胞是从胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞诱导分化的细胞。
(3)根据(1)记载的方法，其中，软骨前体细胞是将从软骨膜采集的软骨膜细胞诱导分化的细胞。
(4)根据(1)-(3)中任一项所记载的方法，其中，包含软骨前体细胞的球状体的大小为直径20-1000μm。
(5)根据(1)-(4)中任一项所记载的方法，其中，一个球状体包含100-7500个软骨前体细胞。
(6)根据(1)-(5)中任一项所记载的方法，其中，包含软骨前体细胞的球状体是在具有细胞非粘附面的培养基材中培养软骨前体细胞而制成的。
(7)根据(1)-(6)中任一项所记载的方法，其中，包含软骨前体细胞的球状体是在含有TGF-β、bFGF和Wnt/β-catenin抑制剂的培养基中培养软骨前体细胞而制成的。
(8)根据(1)-(7)中任一项所记载的方法，其中，在含有BMP的培养基中培养融合球状体，使其成熟为软骨组织。
(9)根据(1)-(8)中任一项所记载的方法，其中，用于成熟为软骨组织的融合球状体的培养期间为14-42天。
(10)根据(1)-(8)中任一项所记载的方法，其中，用于成熟为软骨组织的融合球状体的培养期间为42-84天。
(11)根据(1)-(10)中任一项所记载的方法，其包括：将在体外成熟的软骨组织移植到非人动物，使其进一步成熟。
(12)一种人工软骨组织，其是根据(1)-(11)中任一项所记载的方法制作的，其直径为6mm以上，厚度为0.5mm以上。
(13)一种人工软骨组织，其是根据(10)记载的方法制作的，其中，上述人工软骨组织移植到生物体后，其部分或全部分化为骨组织。
(14)一种组合物，其包含根据(1)-(11)中任一项所记载的方法制作的人工软骨组织，其中，上述组合物用于移植到生物体以补充生物体中软骨组织和/或骨组织的不足。
(15)根据(14)记载的组合物，其包含根据(9)所记载的方法制作的人工软骨组织，用于移植到生物体以补充生物体中软骨组织的不足。
(16)根据(14)所记载的组合物，其包含根据(10)所记载的方法制作的人工软骨组织，用于移植到生物体以补充生物体中骨组织的不足。(17)一种制作人工骨组织的方法，其包括：将根据(10)所记载的方法制作的人工软骨组织移植到非人动物，使其成熟为骨组织。
(18)一种人工骨组织，其是根据(17)所记载的方法制作的，其直径为6mm以上，厚度为0.5mm以上。
(19)一种组合物，其包含根据(17)所记载的方法制作的人工骨组织，其中，上述组合物用于移植到生物体以补充生物体中骨组织的不足。
发明效果
通过本发明，能够在体外制作具有可移植的强度的任意形状的软骨组织。通过将用本发明方法制作的人工软骨组织移植到生物体，可以成为成熟的软骨和骨组织。
本说明书包括日本专利申请JP 2021-141210的说明书和/或附图中记载的内容，该申请是本申请优先权的基础。
附图说明
[图1]示出从人iPS细胞经过人中胚层细胞的人软骨前体细胞的经时基因表达。
[图2A]示出使用Cell3 iMager Duos评估球状体形态的结果。软骨前体球状体的明视野图像。
[图2B]示出使用Cell3 iMager Duos评估球状体形态的结果。用Cell3iMager Duos测量的各球状体的直径(diameter)的结果。
[图2C]示出使用Cell3 iMager Duos评估球状体形态的结果。用Cell3iMager Duos测量的各球状体的圆度(circularity)的结果。
[图2D]示出人软骨前体球状体的组织学染色。
[图2E]示出基于人软骨前体球状体的组织学染色的标记物阳性率。
[图3]示出人软骨前体球状体的融合能力。
[图4]示出形状化软骨的体外宏观图像。
[图5A]示出形状化软骨的体外组织学染色。
[图5B]示出形状化软骨的体外组织学染色的标记物阳性率。
[图6]示出形状化软骨的体外基因表达。
[图7]示出形状化软骨的体外ELISA。
[图8A]示出形状化软骨移植后的宏观图像。摘除时的形状化软骨(箭头：软骨的轮廓)。
[图8B]示出形状化软骨移植后的宏观图像。摘除后的形状化软骨。
[图9]示出移植后的形状化骨骼的CT图像。
[图10]示出形状化骨骼移植后的免疫学染色的组织图像。
[图11]示出使用来自耳廓软骨膜的软骨前体细胞的形状化软骨的体外宏观图像。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明提供了一种制作人工软骨组织的方法，其包括：将包含软骨前体细胞的球状体接种在支撑体上，同时成型为期望形状；从接种了该球状体的面的外侧及内侧供应培养基，同时培养该球状体，使球状体彼此融合；以及，在体外使融合球状体成熟为软骨组织。
软骨前体细胞可通过如下方式得到，即，从胚胎干细胞(ES细胞)和/或诱导性多能干细胞(iPS细胞)诱导分化，或从采集自软骨膜的软骨膜细胞诱导分化。
软骨前体细胞可从胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞诱导分化。对该方法的一例进行说明。首先，通过Cell,July 14,2016,vol.166,451-467所记载的方法，将胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞诱导分化成中胚层。简单来说，在向Dulbecco`s ModifiedEagles`s Medium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)添加了1％的B27、1％的Glutamax的基础培养基中，每天更换激活素(Activin)、bFGF、Wnt促进剂(CHIR和WNT3A)等不同的添加因子种类，并每天进行培养基的更换，诱导分化开始的第五天可获得中胚层细胞。然后，将得到的中胚层细胞传代，在向Dulbecco`s Modified Eagles`s Medium/Nutrient MixtureF12(DMEM/F12)添加了TGFβ抑制剂(A8301或SB431542)、PDGFBB、IGF等的培养基中，在36-37℃下平面培养，每隔一天更换培养基，3-5天后可获得软骨前体细胞。软骨前体细胞可以表达SOX9、CD44、CD73和CD105。对于通过上述方法获得的软骨前体细胞，在向Dulbecco`sModified Eagles`s Medium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)添加了TGFβ抑制剂(A8301或SB431542)、PDGFBB、IGF等的培养基中，在36-37℃下平面培养，可以每周更换2-4次培养基。可以使用传代次数为0-5次的软骨前体细胞。
胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞主要使用来自人的细胞，但也可以是来自人以外的动物(例如，用于实验动物、宠物、使役动物、赛马、斗犬等的动物，具体而言，小鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的细胞。
软骨前体细胞可从软骨膜细胞诱导分化。对该方法的一例进行说明。首先，通过PNAS,August 20,2011,vol.108,no.35,12279-14484所记载的方法，从存在于耳廓软骨或肋软骨等组织的软骨膜采集。简单来说，将从耳廓软骨或肋软骨等软骨组织中采集的软骨膜切碎，并用胶原蛋白酶处理，将软骨膜细胞分离，经过滤回收。对于通过上述方法获得的软骨前体细胞，在向Dulbecco`s Modified Eagles`s Medium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)添加了TGFβ抑制剂(A8301或SB431542)、PDGFBB、IGF等的培养基中，在36-37℃下平面培养，每隔一天更换培养基，3-5天后可获得软骨前体细胞。软骨前体细胞可以表达SOX9、CD44、CD73和CD105。对于通过上述方法获得的软骨前体细胞，在向Dulbecco`sModified Eagles`s Medium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)添加了TGFβ抑制剂(A8301或SB431542)、PDGFBB、IGF等的培养基中，在36-37℃下平面培养，可以每周更换2-4次培养基。可以使用传代次数为0-5次的软骨前体细胞。
软骨膜细胞主要使用来自人的细胞，但也可以是来自人以外的动物(例如，用于实验动物、宠物、使役动物、赛马、斗犬等的动物，具体而言，小鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的细胞。
含有软骨前体细胞的球状体可以在不使用可粘附底物等细胞的面(无底物)的情况下制作，例如，可以在具有细胞非粘附面的培养器材中培养软骨前体细胞而制作。
具有细胞非粘附面的培养器材可以是经过低吸附表面处理的，例如，可以在培养面涂上细胞非粘附性聚合物。作为细胞非粘附性聚合物，可示例：磷脂、磷脂-高分子复合物、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇、白蛋白和光交联超亲水性聚合物等。作为具有细胞非粘附面的培养器材，有Elplasia plate(Corning)、Elplasia RB 500 400NA(kuraray)、96孔U底板或V底板(住友Bakelite)等，在本发明中可适当使用。
另外，培养器材的底部可以具有大量半球形或圆台形的凹槽。例如，使用每孔含有2885个半球形或圆台形的凹槽(凹槽的容积为0.068mm3)的6孔板的培养器材，每孔中滴加含有5-7×106个软骨前体细胞的悬浮液4-5mL，培养箱(incubator)中静置1-5天，由此可形成200μm大小的球状体。通过移液使微孔板内的球状体悬浮，回收到离心管中，使用离心机使球状体聚集在离心管底部，吸取上清液，只残留着球状体。
用于形成球状体的培养基，只要能形成球状体即可，优选使用软骨前体细胞三维培养用培养基，例如是，向Dulbecco`s Modified Eagles`sMedium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)、Dulbecco`s Modified Eagles`sMedium(DMEM)、F12-Ham、Roswell ParkMemorial Institute(RPMI-1640)、Eagle's minimum；essential medium(EMEM)、alphaModified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM)、Iscove's Modified Dulbecco'sMedium(IMDM)、F-10Ham中添加了TGFβ(TGFβ1或TGFβ3)、bFGF及Wnt/β-连环蛋白(catenin)抑制剂(Wnt-C59、IWP1、IWP2、IWP3等)的培养基。除此之外，还可以添加抗生素-抗真菌剂、ITS-X、PDGFBB、血清、L-抗坏血酸、地塞米松和胰岛素生长因子。
培养可为分批培养、半分批培养(流加培养)或连续培养(灌注培养)任一种方法。另外，也可以是静态培养、通气培养、搅拌培养、振荡培养或旋转培养的任一种，优选静置培养。
用于形成球状体的细胞的培养温度优选设为30-40℃，更优选设为37℃。
用于形成球状体的细胞的培养期间优选不超过5天，更优选设为1-5天。培养基可每一天更换一次。
一个球状体可由100-7500个(优选为1000-3000个)细胞构成，构成球状体的细胞中含有软骨前体细胞。
球状体的直径可为20-1000μm，优选直径为200-350μm。球状体的圆度适合为0.5-1.0，优选为0.8-1.0。球状体的直径和圆度可用Cell3 iMager Duo测量。球状体中SOX9的阳性率可为60％以上，优选为70-100％，更优选为80-100％。球状体的SOX9阳性率可通过以下方式计算，即，使用ImageJ从拍摄图像中切取组织部分，进行三原色(红、绿、蓝)的分离，设定测量区域的阈值，以DAPI(蓝色)的面积为分母，以SOX9(绿色)的面积为分子，由此来计算。
本发明的软骨组织的制作方法中，将包含软骨前体细胞的球状体接种在支撑体上，同时成型为期望形状。
支撑体可以是培养基成分能通过，并且对于球状体无毒性，球状体无法通过的支撑体。例如，支撑体具有多孔性膜结构时，认为由于可从上下向融合型球状体供应营养或供应氧气，因此有利于融合后的培养。作为支撑体，可示例：通过大气压下电晕放电或真空气体等离子体聚合处理(细胞粘附表面处理)，支撑体表面带负电荷，并具有亲水性的那种；支撑体表面用明胶处理过的那种；涂有细胞外基质(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等)或粘多糖(硫酸肝素、透明质酸、硫酸软骨素等)的那种；具有合成纳米纤维表面的材料；具有亲水性且中性的水凝胶层的表面的那种；胶原蛋白膜(高研)等。在支撑体具有多孔性膜结构的情况下，孔尺寸可为0.4-8μm。作为支撑体，可适当使用Falcon细胞培养板(Corning)、Falcon多细胞培养板(Corning)、Falcon细胞培养小室(Corning)。
可以使用移液管或勺子将球状体接种到支撑体上。作为期望的形状，可示例能够修复发育不良或损伤的软骨组织(例如，耳廓软骨、咽盖软骨、肋软骨、关节软骨、骺软骨、鼻软骨、气管软骨、喉软骨、椎间盘、关节唇、半月板、耻骨联合)的发育不良或损伤部位的形状(例如，棒状、板状、球状)。在需要更加精细或复杂的形状时，可将预先制作的模具放在支撑体上，然后用移液管或勺子将球状体接种在其中。
球状体可以以高密度接种在支撑体上。关于高密度，例如，在直径150μm的球状体的情况下，每1cm3空间中存在的球状体个数可为9.5×104至3.8×105个，优选为1.9×105至3.8×105个，更优选为2.9×105至3.8×105个。
球状体的个数可为两个以上，如果增加球状体的个数，则可以制作更大的融合球状体。
本发明的方法中，将包含软骨前体细胞的球状体接种到支撑体上，同时成型为期望形状后，从接种了包含软骨前体细胞的球状体的面的外侧和内侧供应培养基，同时培养，由此使球状体彼此融合。
例如，可将包含软骨前体细胞的球状体按需要的形状接种到细胞培养小室的膜上后，在膜的下部添加培养基，以将膜上的球状体浸渍于培养基的状态，将培养用板在培养箱内静置，由此可使球状体彼此融合。
“球状体彼此的融合”是指形成多个球状体连续的结构体，可确认到单个球状体轮廓的消失。通过球状体彼此融合，球状体大型化，因此通过使融合球状体成熟(即，将融合球状体中的软骨前体细胞诱导分化为软骨细胞)，可制作大型的软骨组织。
为了球状体彼此的融合而使用的培养基只要适合球状体彼此的融合即可，优选使用上述的软骨前体细胞三维培养的培养基，例如，向Dulbecco`s Modified Eagles`sMedium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)、Dulbecco`s Modified Eagles`s Medium(DMEM)、F12-Ham、Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Eagle's minimum；essential medium(EMEM)、alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM)、Iscove'sModified Dulbecco's Medium(IMDM)、F-10Ham中添加TGFβ(TGFβ1或TGFβ3)、bFGF及Wnt/β-catenin抑制剂(Wnt-C59、IWP1、IWP2、IWP3等)的培养基。除此之外，还可以添加抗生素-抗真菌剂、ITS-X、PDGFBB、血清、L-抗坏血酸、地塞米松和胰岛素生长因子。
培养可以为静置培养、振荡培养中的任一种，但优选为静置培养。
用于球状体彼此的融合的培养温度优选设为30-40℃，更优选设为37℃。
用于球状体彼此融合的培养期间优选设为12小时-4天，更优选设为12小时-1天。可以每2天进行培养基更换。
确认到球状体彼此的融合后，使融合球状体在体外成熟为软骨组织。使融合球状体成熟为软骨组织时，可将从接种了球状体的面的外侧及内侧供应的培养基改为软骨分化培养基，继续进行培养。软骨分化培养基能使融合球状体成熟为软骨组织即可，例如，向Dulbecco`s Modified Eagles`sMedium/Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)、Dulbecco`sModified Eagles`sMedium(DMEM)、F12-Ham、Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Eagle's minimum；essential medium(EMEM)、alpha Modified Eagle MinimumEssential Medium(αMEM)、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)、F-10Ham中添加BMP(BMP4或BMP2)的培养基。除此之外，还可以添加抗生素-抗真菌剂、ITS-X、TGFβ(TGFβ1或TGFβ3)、bFGF、PDGFBB、Wnt/β-catenin抑制剂(Wnt-C59、IWP1、IWP2、IWP3等)、血清、L-抗坏血酸、地塞米松和胰岛素生长因子。进而，还可添加L-脯氨酸。
向软骨的成熟可以通过HE染色、阿尔新蓝染色和免疫组织学染色(II型胶原蛋白和I型胶原蛋白)来确认。
使融合球状体成熟的软骨组织，其硬度增加，在免疫组织学上作为软骨组织的标记物的2型胶原蛋白广泛呈阳性，以组织周围为中心作为软骨膜标记物的1型胶原蛋白呈阳性，此外，作为软骨前体标记物的SOX9和作为软骨标记物的COL11A2的基因表达可增加。在免疫组织学染色中，软骨组织的2型胶原蛋白的阳性率可为60％以上，优选为70-90％，1型胶原蛋白的阳性率可为20％以下，优选为5-15％。软骨组织的2型胶原蛋白和1型胶原蛋白的阳性率可通过使用ImageJ从拍摄图像中切取组织部分，进行三原色(红、绿、蓝)的分离，设定测量区域的阈值，以蓝色的面积作为分母，以红色(2型胶原蛋白)和绿色(1型胶原蛋白)的面积作为分子来分别计算。
通过本发明的方法，可以制作直径为2mm以上、6mm以上、40mm以上、80mm以上，厚度为0.5mm以上、1mm以上、5mm以上、15mm以上的人工软骨组织。本发明提供了通过上述方法制作的人工软骨组织，其中上述人工软骨组织的直径为6mm以上，厚度为0.5mm以上。直径为6mm以上、厚度为0.5mm以上的人工软骨组织可由10-10000个直径为20-500μm的大小的球状体制成。
可以由100-30000个直径为20-1000μm的大小的球状体制作直径为0.5-15mm、长度为2-80mm的人工软骨组织。可由500-1500个直径为200-350μm的大小的球状体制作直径为2-5mm、长度为4-40mm的人工软骨组织。
人工软骨组织的硬度适合为0.2-1.0MPa，优选为0.4-0.6MPa。人工软骨组织的硬度可通过桌上试验机(株式会社岛津制作所EZ-Test EZ-SX夹具S346-57829-02)进行测量。
可以将在体外成熟的软骨组织移植到非人动物而使其进一步成熟。此外，可以将在体外成熟的软骨组织移植到非人动物而使其成熟为骨组织。作为非人动物，可示例小鼠、大鼠、猴子、猪等。将短期培养融合球状体来获得的软骨组织(形状化软骨)移植到生物体时，可成为进一步成熟的软骨。将长期培养融合球状来获得的软骨组织(形状化肥大软骨)移植到生物体时，可成为骨组织。在形状化肥大软骨中，可观察到具有肥大化的细胞质的肥大软骨细胞。关于肥大软骨细胞，一般可通过免疫组织学染色以10型胶原蛋白为标记物来观察。
用于向形状化软骨的成熟的融合球状体的培养温度优选设为30-40℃，更优选设为37℃。
用于向形状化软骨的成熟的融合球状体的培养期间优选设为14-42天，更优选设为21-28天。培养基更换可以每2-3天进行。将形状化软骨皮下移植时，可成为进一步成熟的软骨。移植期间可为14-182天，优选为28-56天。软骨的成熟可通过HE染色中的软骨小腔和免疫组织学染色中的1型胶原蛋白的消失来确认。
用于向形状化肥大软骨的成熟的融合球状体的培养温度优选设为30-40℃，更优选设为37℃。
用于向形状化肥大软骨的培养期间优选设为42-84天，更优选设为56-70天。培养基更换可以每2-3天进行。向骨组织和骨软骨过渡区成熟时，可将形状化肥大软骨皮下移植。用于向骨组织的成熟的形状化肥大软骨的移植期间为28天以上，优选为56天以上。所得到的骨组织可通过CT图像和组织学染色确认，骨软骨过渡区可通过组织学染色确认。形状化肥大软骨的直径可为1mm-20mm，优选为5mm-10mm，形状化肥大软骨的厚度可为2mm-100mm，优选为20mm-40mm。本发明还提供了通过上述方法制作的人工软骨组织、即形状化肥大软骨，其中上述人工软骨组织移植到生物体后，其一部分或全部分化为骨组织。
本发明还提供了一种制作人工骨组织的方法，其包括将通过上述方法制作的人工软骨组织移植到非人动物，使其成熟为骨组织。通过本发明的方法，可以制作直径为2mm以上、6mm以上、40mm以上、60mm以上、80mm以上，厚度为0.5mm以上、1mm以上、5mm以上、15mm以上的人工骨组织。本发明也提供了通过上述方法制作的人工骨组织，上述人工骨组织的直径为6mm以上，厚度为0.5mm以上。
通过本发明的方法制作的人工软骨组织(可以是移植到生物体的那种、非移植的那种中的任一种)和/或人工骨组织可利用于对颅面部区域的软骨发育不良的治疗、对变形性关节病等的治疗方法、形状重要的其他再生医疗等。本发明提供了包含通过上述方法制作的人工软骨组织的组合物，上述组合物用于移植到生物体以补充生物体中软骨组织和/或骨组织的不足。人工软骨组织为形状化软骨时，移植到生物体，可补充生物体中软骨组织的不足。本发明还提供了包含通过上述方法制作的人工骨组织的组合物，上述组合物用于移植到生物体以补充生物体中骨组织的不足。
具体来说，将通过本发明的方法制作的人工软骨组织移植到鞍鼻或小耳症等软骨组织的低形成区域来进行治疗。另外，对于由交通外伤和运动外伤造成的耳廓或鼻子的变形，也可以使用本发明的方法，将再现更复杂的形态的软骨组织移植而进行治疗。另外，可以将通过本发明的方法制作的人工软骨组织移植到变形性关节病等中的关节面的软骨缺损部位而进行治疗。本发明的人工骨组织可利用于“向外伤引起的面部骨缺损部位的移植”、“用于提高鼻梁的向鼻骨部的移植，用于提高颧骨的向颧骨部的移植，用于形成下颌线的向下颌骨部的移植等美容整形手术”、“对于骨折后骨愈合不全的向假关节部位的骨移植”、“对于骨肉瘤等的肿瘤摘除术时产生的骨缺损的骨移植”。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。
[实施例1]
在6孔板的每个孔中添加含有7μL Matrix-511(Nippi)和1.5μL Y-7632(富士胶片和光纯药)的AK02培养基(Ajinomoto)1.5mL，在37℃的培养箱内静置1小时。在上述6孔板的每个孔中接种5×103个人iPS细胞(京都大学iPS细胞研究所，1383D6)。每天进行利用1.5mL的AK02培养基(Ajinomoto)的培养基更换，第七天确认到多个菌落。传代时，将iPS细胞用PBS清洗后，添加Accutase(ICT)溶液500μL，在37℃的培养箱内静置6分钟。用移液管将细胞剥离后，添加AK02培养基(Ajinomoto)5mL，以900rpm转速进行离心5分钟。用AK02培养基(Ajinomoto)进行悬浮，再次进行iPS细胞的培养，或向软骨前体细胞的诱导分化。
从人iPS细胞向人中胚层细胞的分化诱导方法
在6孔板的每个孔中添加含有7μL Matrix-511(Nippi)和1.5μL Y-7632(富士胶片和光纯药)的AK02培养基(Ajinomoto)1.5mL，在37℃的培养箱内静置1小时。在上述6孔板的每个孔中接种1-1.5×105个人iPS细胞。次日，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Glutamax、1％B27、4μM CHIR(CAYMAN)、100nM PIK90(EMD Millipore)、30ng/ml Activin、20ng/ml bFGF的培养基。次日，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Glutamax、1％B27、3μM CHIR(CAYMAN)、250nM DMH1(Selleck)、20ng/mlbFGF(Wako)的培养基。次日，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Glutamax、1％B27、1μM A8301(TOCRIS)、250nM DMH1(Selleck)、250nM PD0325901(TOCRIS)、1μM C59(Cellagen Tech)的培养基。次日，更换成在DMEM/F12Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Glutamax、1％B27、1μM C59(Cellagen Tech)、5nM SAG21K(TOCRIS)的培养基，培养2天，使用人中胚层细胞标记物(HOXB5、FOXF1等)进行基因表达分析。
人耳廓软骨膜细胞的回收法
将人软骨膜检体(使用了从获得本人或家长同意后手术时剩余的人耳廓软骨得到的软骨膜。神奈川县立儿童医疗中心和横滨市立大学医学部附属医院伦理委员会已批准。)用剪刀切碎至固体块消失为止，在0.2％胶原蛋白酶溶液(Worthington)中，在37℃下以600rpm振荡2小时，将人软骨膜细胞分离。将得到的悬浮液利用40μm细胞滤网过滤，在1500rpm下进行5分钟离心分离，回收人软骨膜细胞。
人软骨前体细胞的分化诱导方法
在10cm的平底皿中注入0.1％明胶7ml，在37℃的培养箱内静置1小时。从平底皿去除上清液，添加在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％AntibioticAntimycotic Solution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、1μM A8301(TOCRIS)、20ng/ml bFGF(Wako)、30ng/ml PDGFBB(Peprotech)、1μM WntC59(Cellagen Tech)、4％Fetalbovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)的培养基8mL。在上述平底皿中接种1.2×106个人中胚层细胞或人耳廓软骨细胞，在37℃的培养箱内静置。48小时后进行培养基的更换，再过24小时后确认平底皿中的融合度，使用人软骨前体细胞标记物(SOX9、CD44、CD73、CD105)进行基因表达分析。
通过人软骨前体细胞的三维培养的人软骨前体球状体形成
将接种在10cm平底皿的软骨前体细胞(来源于人iPS细胞或人耳廓软骨均可)用PBS清洗，然后用通过3分钟的胰蛋白酶溶液处理使其分离。用含有相当于胰蛋白每溶液的3倍量的10％胎牛血清(Biowest)的DMEM/F12，使含有软骨前体细胞的胰蛋白酶溶液失活，回收到离心管中。400G条件下对其进行离心操作3分钟。去除细胞上清液，使用在DMEM/F12Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic Antimycotic Solution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、15ng/ml TGFβ1(Peprotech)、15ng/ml bFGF(Wako)、10ng/ml PDGFBB(Peprotech)、1μMWntC59(Cellagen Tech)、4％Fetal bovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/mlInsulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)的培养基以成为1.4×106/mL的方式悬浮。将5mL软骨前体细胞悬浮液(包含7×106个软骨前体细胞)注入到Elplasia板(Corning，6孔规格)的一个孔中，在37℃的培养箱内静置。次日，进行4mL培养基的更换，进一步培养24小时。
从人软骨前体球状体向人形状化软骨的诱导
用移液管将Elplasia板(Corning，6孔规格)的孔内的软骨前体球状体回收到离心管中。在1000rpm下进行离心操作2分钟，去除上清液。用移液管回收剩余的软骨前体球状体，并在0.4μm孔径的细胞培养小室(Falcon，6孔规格)的1孔的膜上以期望形状接种。向膜的下部添加在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic AntimycoticSolution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、15ng/ml TGFβ1(Peprotech)、15ng/mlbFGF(Wako)、10ng/ml PDGFBB(Peprotech)、1μMWntC59(Cellagen Tech)、4％Fetal bovineserum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)的培养基3mL，在37℃的培养箱内静置。以下，本报告以制作棒状软骨为例。接种的软骨前体球状体约在12小时彼此融合，在显微镜下可确认到球状体的轮廓消失。次日，将膜下部的培养基全量(3mL)更换。3天后，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic AntimycoticSolution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、5ng/ml TGFβ1(Peprotech)、10ng/mlbFGF(Wako)、5ng/ml PDGFBB(Peprotech)、20ng/ml BMP4、1μM WntC59(Cellagen Tech)、2％Fetal bovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)的培养基。再过3天后，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic AntimycoticSolution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、2.5ng/ml TGFβ1(Peprotech)、1ng/mlbFGF(Wako)、20ng/ml BMP4(R&D)、1％Fetal bovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin GrowthFactor(Sigma-Aldrich)、40μg/ml L-proline(Sigma-Aldrich)的培养基。再过3天后，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic Antimycotic Solution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、10ng/ml BMP4(R&D)、0.5％Fetal bovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)、40μg/ml L-proline(Sigma-Aldrich)的培养基，之后每3天进行培养基更换。在上述方法中，通过从膜接种经过20天的培养，可获得表达II型胶原蛋白和阿尔新蓝的软骨组织。
从人软骨前体球状体向人形状化肥大软骨的诱导
用移液管将Elplasia板(Corning，6孔规格)的孔内的软骨前体球状体回收到离心管中。在1000rpm下进行离心操作2分钟，去除上清液。用移液管回收剩余的软骨前体球状体，并在0.4μm孔径的细胞培养小室(Falcon，6孔规格)的1孔的膜上以期望形状接种。向膜的下部添加在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic AntimycoticSolution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、15ng/ml TGFβ1(Peprotech)、15ng/mlbFGF(Wako)、10ng/ml PDGFBB(Peprotech)、1μMWntC59(Cellagen Tech)、4％Fetal bovineserum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)的培养基3mL，在37℃的培养箱内静置。以下，本报告以制作棒状、模拟了鼻子和耳朵的形状的软骨为例。接种的软骨前体球状体约在12小时彼此融合，在显微镜下可确认到球状体的轮廓消失。次日，将膜下部的培养基全量(3mL)更换。3天后，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic Antimycotic Solution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、5ng/ml TGFβ1(Peprotech)、10ng/ml bFGF(Wako)、5ng/ml PDGFBB(Peprotech)、20ng/ml BMP4、1μMWntC59(Cellagen Tech)、2％Fetal bovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)的培养基。再过3天后，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic Antimycotic Solution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、2.5ng/ml TGFβ1(Peprotech)、1ng/ml bFGF(Wako)、20ng/ml BMP4(R&D)、1％Fetal bovineserum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)、40μg/ml L-proline(Sigma-Aldrich)的培养基。再过3天后，更换成在DMEM/F12 Ham(1:1)(Sigma-Aldrich)中含有1％Antibiotic Antimycotic Solution(Sigma-Aldrich)、1％ITS-X(GibcoTM)、10ng/ml BMP4(R&D)、0.5％Fetal bovine serum(Biowest)、40μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、40μg/ml地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml Insulin Growth Factor(Sigma-Aldrich)、40μg/ml L-proline(Sigma-Aldrich)的培养基，之后每3天进行培养基更换。在上述方法中，通过从膜接种经过50天的培养，可获得以II型胶原蛋白和阿尔新蓝呈阳性的细胞外基质和细胞质肥大的肥大软骨细胞为特征的肥大软骨。
形状化软骨的移植和摘除
通过向小鼠(NOD/SCID)或大鼠(IL2rg-KO)以吸气方式施用异氟醚(辉瑞1ml/1ml)，从而进行麻醉。对移植部位进行除毛，根据移植样本使用剪刀和带钩镊子进行皮肤的切开。将经过15-30天的三维培养的样本留置在皮下，用6-0号带线缝合线以2mm的间隔缝合。摘除时也以吸气方式施用异氟醚来进行麻醉，用剪刀和带钩镊子摘除移植样本。根据分析，将样本保存在PBS或福尔马林溶液中。
从形状化肥大软骨向形状化骨骼的诱导
通过向小鼠(NOD/SCID)或大鼠(IL2rg-KO)以吸气方式施用异氟醚(辉瑞1ml/1ml)，从而进行麻醉。对移植部位进行除毛，根据移植样本使用剪刀和带钩镊子进行皮肤的切开。将经过56-70天的三维培养的样本留置在皮下，用6-0号带线缝合线以2mm的间隔缝合。使用显微CT在移植后一个月和两个月的样本中确认到骨化。摘除时也以吸气方式施用异氟醚进行麻醉，用剪刀和带钩镊子摘除移植样本。根据分析，将样本保存在PBS或福尔马林溶液中。
基因表达分析
回收在10cm平底皿中得到的软骨前体细胞，并使用PureLink RNA mini试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化RNA。cDNA合成使用高容量cDNA反转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)。定量基因时采用作为内部标准的18S rRNA(Applied Biosystems)。使用Light Cycler(注册商标)480(Roche Life Science)进行基因的扩增和检测。
软骨前体球状体的高精度明视野分析
将Elplasia板静置在Cell3iMager Duos(SCREEN)，并进行高精度明视野分析，自动测量每个球状体的圆度(0-1.0)和直径(μm)。
软骨前体球状体的融合评价
将软骨前体球状体接种到细胞培养小室后，在12小时后和10天后用显微镜(Olympus IX73)在20x倍率下确认到形状化软骨的边缘。
形状化软骨组织的硬度测量分析
使用桌上试验机(株式会社岛津制造所EZ-Test EZ-SX夹具S346-57829-02)测量形状化软骨组织的硬度。求出以3mm/min挤压0.2mm-0.6mm时的弹性率(MPa)。
使用ELISA的形状化软骨组织的功能评价
依照分析报告(Certificate of Analysis)的要领将DuoSet(R&D)中的Capture、Detection、Standard用PBS溶液调整。在96孔板中以100μL/孔添加Capture溶液。用保鲜膜将孔板包裹，在室温下静置一晚。从各孔中去除Capture溶液，向每孔中添加200μL的PBS-Tween溶液，重复3次。将板放在擦拭纸，去除水分。以300μL/孔添加Block Ace(DC Pharma)溶液，用保鲜膜包裹，在室温下静置1小时。从板中去除溶液，向每孔中添加200μL的PBS-Tween溶液，重复3次。将板放在擦拭纸，去除水分。每孔中以100μL/孔添加Standard、Sample、Blank溶液。用保鲜膜包裹，在室温下静置2小时。从板中去除溶液，向每孔中添加200μL的PBS-Tween溶液，重复3次。将板放在擦拭纸，去除水分。以100μL/孔添加Detection溶液。从板中去除溶液，向每孔中添加200μL的PBS-Tween溶液，重复3次。将板放在擦拭纸，去除水分。以成为分析报告的工作浓度的方式，将链霉亲和素(Streptavidin，需要避光)的必要量调整，并以100μL/孔添加。用铝箔纸包裹，在室温下静置20分钟。从板中去除溶液，向每孔中添加200μL的PBS-Tween溶液，重复3次。将板放在擦拭纸，去除水分。以50μL/孔添加TMB one Solution(需要避光)。用铝箔纸包裹，在室温下观察数分钟并使其显色。确认显色后，以50μL/孔添加HCL。用读板器测量吸光度(450nm)，在540nm或570nm也测量吸光度以作参照。绘制校准曲线并计算浓度。
石蜡切片制备方法
回收的样本在福尔马林(富士胶片和光纯药)溶液中静置一晚，进行固定。对被固定的样本进行清洗处理，关于该清洗处理，在室温下用PBS溶液清洗30分钟，在室温下用70％的乙醇清洗30分钟。使用自动包埋机将样本用100％乙醇脱水1小时×7次后，在二甲苯中以1小时×3次、100％石蜡中以1小时×4次进行浸渍和包埋。将被包埋的样本用显微切片机以2-4μm的厚度薄切，在42℃下进行样本的干燥。
苏木精和伊红染色
将石蜡切片按二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇和Milli Q水的顺序去石蜡化和亲水化。用苏木精溶液(武藤化学)染色20分钟，用流水清洗10分钟后，用伊红溶液(武藤化学)染色2分钟。流水清洗后，阶段性地用乙醇进行脱水，用二甲苯溶液透彻后，在样本放置非水性密封剂和盖玻片而进行密封。
阿尔新蓝染色
将石蜡切片按二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇和Milli Q水的顺序去石蜡化和亲水化。用3％醋酸水溶液处理1分钟，然后用pH 2.5的阿尔新蓝溶液(Wako)染色40分钟。用3％醋酸水溶液处理5分钟，然后用流水清洗5分钟。用核固红(Kernechtrot)溶液(武藤化学)染色5分钟，然后用流水清洗1分钟。阶段性地用乙醇进行脱水，用二甲苯溶液透彻后，在样本放置非水性密封剂和盖玻片而进行密封。
免疫组织学分析
将石蜡切片按二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇和Milli Q水的顺序去石蜡化和亲水化。将样本用0.1％TBS-tween溶液清洗5分钟2次，然后向样本中添加胃蛋白酶(Abcam)，在室温下活化抗原20分钟。用1％TBS-tween溶液清洗5分钟后，然后在室温下进行蛋白阻断剂(Dako)处理30分钟。与稀释后的一抗(Anti-Collagen Type IIAntibody,clone 6B3(Merck)、Anti-Collagen typeI,Human,rabbit-polyclonal(ACRIS))在室温下反应2小时或在4℃下反应一晚。用1％TBS-tween溶液清洗5分钟3次后，与荧光标记的二抗在室温下反应1小时。用1％TBS-tween溶液清洗5分钟3次后，用在DAPI中含溶液的Apathy密封剂和盖玻片进行密封，并用显微镜观察。各抗体的阳性率利用Image J作为各抗体的阳性区域相对于DAPI阳性区域的比例(％)计算。
实验结果
·从人iPS细胞向人中胚层细胞、从人中胚层细胞向人软骨前体细胞的诱导分化
从人iPS细胞(第0天)经过人中胚层细胞(第5天)而进行人软骨前体细胞(第8天)的诱导分化，每天确认基因表达(图1)。确认到作为未分化标记物的OCT4和NANOG在第0天的表达高，随着时间的推移而表达降低。在人中胚层的标记物中，也观察到从初期BRACHURY、MESOGININ1、FOXF1和HOXB5随着时间的推移依次上升，得到了与发生学上升顺序不矛盾的结果。进而，第8天时，获得了作为软骨前体细胞标记物的SOX9和CD44的表达高、且表达了作为间充质(Mesenchymal)标记物的CD73和CD105的软骨前体细胞(n＝7)(图1)。
·从人软骨前体细胞向软骨前体球状体的明视野高精度评价
将软骨前体细胞接种到Elplasia板，48小时后形成大量的球状体(图2A)。用Cell3iMager Duos测量各球状体的直径(diameter)和圆度(circularity)，在37344个中，34261个(91.7％)的直径为200-300μm，36262个(97.1％)的圆度为0.8-1.0。(图2B、C)
·人软骨前体球状体的体外组织学分析
关于人软骨前体球状体，通过免疫组织学染色，确认到作为软骨前体标记物的SOX9和1型胶原蛋白呈阳性(图2D)。球状体内SOX9的阳性率为69％，1型胶原蛋白的阳性率为74％(图2E)。
·人软骨前体球状体的融合能力
将在Elplasia板制作的球状体以任意形状(本例中为棒状)接种到细胞培养小室上。在细胞培养小室上，接种时在显微镜下可确认到约200μm程度的球状体，而12小时后各球状体的边界线消失，可确认到球状体彼此的融合(图3)。
·形状化软骨的体外组织学分析
在细胞培养小室中进行20天的三维培养，结果获得了宏观图像中具有高再现性的形状化软骨(n＝24)(图4)。获得的形状化软骨被可染软骨组织的细胞外基质的阿尔新蓝染色，作为软骨组织的标记物的2型胶原蛋白广泛呈阳性，约80％为阳性。另外，作为软骨膜标记物的1型胶原蛋白也以形状化软骨的周围为中心呈阳性，约5％为阳性(n＝4)(图5A、B)。
·形状化软骨的体外功能分析
在定量RT-PCR中获得了作为软骨前体标记物的SOX9和作为软骨标记物的COL11A2在软骨前体球状体(培养开始第10天)、形状化软骨(培养开始第20天)和形状化软骨(培养开始第30天)中经时上升的结果(n＝7-29)(图6)。这些结果显示施用BMP的情况与不施用的情况相比，基因表达更高(图6)。
在ELISA中每10天测量人透明质酸和人黑色素瘤抑制活性的分泌量，确认了在形状化软骨(培养开始第20天)中分泌量增加，此后可持续到形状化肥大软骨(培养开始第50天)为止。(n＝6-20)(图7)。
·形状化软骨的移植后的组织学分析
进行皮下移植一个月的结果，得到了在宏观图像中维持形状的形状化软骨(图8A、B)。
·形状化骨骼的CT图像分析
进行形状化肥大软骨的皮下移植的结果，在移植后1个月和2个月，通过CT成像，可确认到骨化图像(图9)。
·形状化骨骼的组织学分析
进行形状化肥大软骨的皮下移植的结果，在移植后3个月，通过免疫组织学染色，可确认到骨软骨过渡区和COL1阳性的骨梁(图10)。
·使用来自人耳廓软骨膜的软骨前体细胞的形状化软骨
在使用来自人耳廓软骨膜的软骨前体球状体的情况下，也能够确认到可制作复杂的形状(本例中模拟了鼻子、耳朵和棒)(图11)。
将本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考并入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明可利用于对颅面部区域的软骨发育不良等的治疗、对变形性关节病等的治疗、形状重要的其他再生医疗等。另外，还可利用于整形外科治疗。

Claims (19)

1.一种制作人工软骨组织的方法，其包括：将包含软骨前体细胞的球状体接种在支撑体上，同时成型为期望形状；从接种了该球状体的面的外侧及内侧供应培养基，同时培养该球状体，使球状体彼此融合；以及，在体外使融合球状体成熟为软骨组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，软骨前体细胞是从胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞诱导分化的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，软骨前体细胞是将从软骨膜采集的软骨膜细胞诱导分化的细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，包含软骨前体细胞的球状体的大小为直径20-1000μm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，一个球状体包含100-7500个软骨前体细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，包含软骨前体细胞的球状体是在具有细胞非粘附面的培养基材中培养软骨前体细胞而制成的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，包含软骨前体细胞的球状体是在含有TGF-β、bFGF和Wnt/β-catenin抑制剂的培养基中培养软骨前体细胞而制成的。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在含有BMP的培养基中培养融合球状体，使其成熟为软骨组织。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，用于成熟为软骨组织的融合球状体的培养期间为14-42天。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，用于成熟为软骨组织的融合球状体的培养期间为42-84天。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其包括：将在体外成熟的软骨组织移植到非人动物，使其进一步成熟。
12.一种人工软骨组织，其是根据权利要求1-11中任一项所述的方法制作的，其直径为6mm以上，厚度为0.5mm以上。
13.一种人工软骨组织，其是根据权利要求10所述的方法制作的，其中，所述人工软骨组织移植到生物体后，其部分或全部分化为骨组织。
14.一种组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的方法制作的人工软骨组织，其中，所述组合物用于移植到生物体以补充生物体中软骨组织和/或骨组织的不足。
15.根据权利要求14所述的组合物，其包含根据权利要求9所述的方法制作的人工软骨组织，用于移植到生物体以补充生物体中软骨组织的不足。
16.根据权利要求14所述的组合物，其包含根据权利要求10所述的方法制作的人工软骨组织，用于移植到生物体以补充生物体中骨组织的不足。
17.一种制作人工骨组织的方法，其包括：将根据权利要求10所述的方法制作的人工软骨组织移植到非人动物，使其成熟为骨组织。
18.一种人工骨组织，其是根据权利要求17所述的方法制作的，其直径为6mm以上，厚度为0.5mm以上。
19.一种组合物，其包含根据权利要求17所述的方法制作的人工骨组织，其中，所述组合物用于移植到生物体以补充生物体中骨组织的不足。
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