TWI431116B - Methods for assessing regenerative cartilage - Google Patents

Methods for assessing regenerative cartilage Download PDF

Info

Publication number
TWI431116B
TWI431116B TW101102243A TW101102243A TWI431116B TW I431116 B TWI431116 B TW I431116B TW 101102243 A TW101102243 A TW 101102243A TW 101102243 A TW101102243 A TW 101102243A TW I431116 B TWI431116 B TW I431116B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cartilage
chondrocytes
gfap
transplantation
regenerated
Prior art date
Application number
TW101102243A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201245446A (en
Inventor
Kazuto Hoshi
Tsuyoshi Takato
Motohiro Harai
Original Assignee
Fujisoft Inc
Univ Tokyo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujisoft Inc, Univ Tokyo filed Critical Fujisoft Inc
Publication of TW201245446A publication Critical patent/TW201245446A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI431116B publication Critical patent/TWI431116B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Description

評估再生軟骨之方法
本發明係有關評估再生軟骨之方法。
對於顱顏面的先天型態形成異常，及切除惡性腫瘤後之顱顏面缺損，至今係採用以自體組織移植之組織修復以及再建。然而，自體組織移植目前仍殘存著可採組織面積的限制，以及對採取部位造成侵襲性等課題。其中軟骨再生醫療，相對地在臨床應用持續進步，目前，世界普及的方法係使用自體軟骨細胞移植術(ACI(autologous chondrocyte implantation))。ACI原法係於1995年首先由瑞典的研究團隊發表報告。ACI原法係對於因運動外傷等造成之關節軟骨的局部缺損，將自體培養軟骨細胞製成細胞懸濁液投予至缺損部，進而為防止外漏而披覆骨膜貼片(patch)之方法。
有關顱顏面範圍的缺損以及異常，目前報告有使用矽膠植入物(stlicone implant)之隆鼻術再生手術例，以及對馬鞍鼻(saddle nose)等注入自體軟骨細胞之懸濁液之應用例。
有關評估經培養之軟骨細胞特性，至今已利用例如基因表現以及表面標記(surface marker)。然而，現狀是該等方法缺乏定量性，且最終必須犧牲一部分欲獲得的細胞群。
該等技術的相關技術係例如下術文獻所記載之技術。
Brittberg M,Lindahl A,Nilsson A,Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L.1994.Treatment of deep cartilage defect in the knee with autologous chondrocytes transplantation.N Engl J Med 331(14)：889-895.
Yanaga H,Yanaga K,Imai K,Koga M,Soejima C,Ohmori K.2006.Clinical application of cultured autologous human auricular chondrocytes with autologous serum for craniofacial or nasal augmentation and repair.Plast Reconstr Surg 117(6)：2019-2030.
本發明之目的係提供一種無需犧牲再生軟骨或成為其材料之軟骨細胞的一部分，且定量地評估再生軟骨之方法。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種評估再生軟骨之方法，其係包含將含有耳廓軟骨細胞之細胞群於培養基存在下進行放置，其後，自前述培養基中採取至少一部分之液體成分，及測定採取之前述液體成分中所含之GFAP含量，以及以前述GFAP含量為基礎，判斷自前述細胞群獲得或可得之再生軟骨是否適合移植。
1.概要
以往再建軟骨之再生醫療係採用注入軟骨細胞之方法。
然而，由於軟骨細胞本身未具有充分的大小以及充分的強度，僅以注入軟骨細胞，依然存在極高的無法充分達成組織再建目的之可能性。在如此之狀況下，本發明團隊開發了提供具有充分的大小及強度之如同「植入物」般之再生軟骨之方法。於該開發中，首先，將軟骨細胞移植入體內時，著眼於必須可保證一定的品質。該品質具體而言係指再生軟骨具有軟骨特性。此處「軟骨特性」之用語係可與「做為軟骨之特性」、「軟骨之特性」、「作為軟骨之性質」、「軟骨之性質」等用語互換使用。「軟骨特性」係指作為適合移植之軟骨之特異的性質。具體而言係可安全地進行移植，且於移植後形成軟骨，於體內具有可作為軟骨生著之性質。試舉一例，「軟骨特性」係指移植後於體內顯示有旺盛的軟骨再生之性質。另外，「軟骨特性」亦可被理解為移植妥當性。為使再生軟骨具有軟骨特性，無需摻混異物，例如摻混其他細胞，且無過度增殖之需要。
軟骨細胞係分泌可左右再生軟骨之特性與功能之軟骨基質的重要構成要素。例如軟骨細胞過度增殖時，分化(dedifferentiation)後會減弱軟骨特性，進而失去軟骨特性。另外，於分離軟骨細胞時混入纖維母細胞(fibrobllst )，並使纖維母細胞於培養中過度增殖時，可能出現排擠目標之軟骨細胞此一製造步驟上之風險。而移植經藉由纖維母細胞排擠軟骨細胞後的培養組織時，會造成纖維母細胞取代軟骨細胞而被移植。該等移植組織無法作為軟骨而生著。因此，於進行移植前預先判斷所製造之再生軟骨製品，不僅未含有與被排擠的軟骨細胞相等量之其他細胞，且含有充分量的軟骨細胞，以及於移植後可維持不會過度增殖的軟骨特性是不可或缺的。
本發明團隊發現一種可作為顯示軟骨細胞，特別係使用含耳廓軟骨細胞之細胞群後可得或獲得的再生軟骨是否適合移植之指標之具特異性的標記。本發明係以該發現為基礎。根據該標記，無需犧牲最終欲獲得之目標物，且可定量地評估使用前述細胞群可得或獲得的再生軟骨之軟骨特性。
2.具耳廓軟骨細胞特異性之標記
上述軟骨細胞，特別為具耳廓軟骨細胞特異性之標記係神經膠質微纖維酸性蛋白質(Glial fibrillary acidic protein)(GFAP))。
GFAP一般係具特異性地局部存在於神經系統，例如星狀細胞(astrocyte)及許旺氏細胞(Schwann cell)之蛋白質。
本發明團隊發現GFAP在可利用於軟骨再生醫療之細胞源之培養耳廓軟骨細胞中具有特異性且大量表現，以及 伴隨繼代培養(subculture)，GFAP基因的表現量及GFAP蛋白質量會緩慢地逐漸減少。
藉由定量該GFAP蛋白質量，可檢出纖維母細胞等其他細胞之混入，及伴隨耳廓軟骨細胞過度增殖之軟骨特性減弱化等。藉此提供評估再生軟骨製品之軟骨特性之方法。
根據本發明之其中一實施方式，可提供一種評估再生軟骨之方法，其係包含將含有耳廓軟骨細胞之細胞群於培養基存在下進行放置，其後，自前述培養基中分離至少一部分之液體成分，及測定採取之前述液體成分中所含之GFAP含量，以及以前述GFAP含量為基礎，判斷自前述細胞群可得之再生軟骨是否適合移植。
於該方法中，藉由測定液體成分例如培養上清液中所含之GFAP含量，可得知針對定量的軟骨基質之堆積量資訊。
此處「軟骨基質」係指成為軟骨構造之基礎物質之總稱。軟骨基質係例如氨基葡聚糖(GAG)、第Ⅱ型膠原蛋白(COL2)。
如後述所示之例，於作為本發明基礎之研究中，發現培養上清液中之GFAP含量，與GAG及COL2之堆積量有關此一新穎的實際發現。以該實際發現為基礎，藉由測定液體成分例如培養上清液中之GFAP含量，可評估軟骨特性。
例如，用於製造再生軟骨之人類關節軟骨細胞，可舉 出標記之表現量增強之CD10、CD26、CD44、CD49c、CD81、CD166等，及表現量減少之CD94a、CD106等。該等標記係細胞黏著分子，並用作細胞表面標記。細胞表面標記係可藉由流式細胞儀分析，但難以定量地比較經個別分析之不同組群。另外，由於細胞的黏著狀態等可能因培養環境而不斷變動，亦難以設定一定的標準。
進而，除上述之細胞黏著分子之外，亦正確認絲胺酸蛋白酶抑制劑(Serpin)A1及A3、纖維母細胞生長因子-18(FGF-18)與抑制黑色素活性因子(MIA)等。尤以FGF-18係藉由使平面培養持續重疊，為增加基因表現量之因子，而具有使用作為表示軟骨細胞之基質生產能力指標之可能性。然而，使用該等因子為指標時，為可以基因層級進行評估，而殘留定量性之課題。另外，該等因子均為分泌型蛋白質。預期自增殖中的培養軟骨細胞所分泌之生理活性物質極為少量，雖然使用培養上清液為檢體可測定其中所含之蛋白質量，但難以檢出。基於該等理由而採用GFAP作為指標。
與耳廓軟骨細胞相比，關節軟骨細胞之GFAP的表現量較少，因繼代培養表現量之變化亦較小。因此，使用耳廓軟骨細胞作為再生軟骨的供給源。
自上述理由，使用耳廓軟骨細胞作為再生軟骨的供給源，可明確得知有利於使用作為再生軟骨之軟骨特性指標之GFAP及與一實施方式有關之評估方法。
3.軟骨細胞
此處所使用之軟骨細胞係耳廓軟骨細胞。
軟骨細胞之供給源可為任一種哺乳動物。哺乳動物可舉出例如小鼠、大鼠、兔子、犬、貓、馬、牛、猴子及人類，以人類為佳。
軟骨細胞之供給源之哺乳動物，係依照作為移植由軟骨細胞構成之再生軟骨之對象之哺乳動物而選擇。針對由軟骨細胞構成之再生軟骨之說明如後所述。
以人類為移植對象時，可使用來自人類之耳廓軟骨細胞「以下稱作人類耳廓軟骨細胞」，更佳係來自人類之自體耳廓軟骨細胞。此處「自體耳廓軟骨細胞」係指自欲移植由軟骨細胞構成之再生軟骨之對象的耳廓，於移植及製造再生軟骨之前所採取之細胞。
軟骨細胞可依例如後述之方法分離。首先，以外科手術採取來自捐贈者哺乳動物之軟骨片。其次，將採得之軟骨片於無菌狀態下進行細片化，可因應需要以期望的消化酵素，例如膠原蛋白酶及/或明膠酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及蛋白聚醣酶(aggrecanases)進行消化分解。藉此可獲得含有至少一部分之含各自游離之各個軟骨細胞之細胞群，及/或藉由結合複數的軟骨細胞所形成之微小組織片之細胞群。
4.軟骨細胞之培養
接著，將含有耳廓軟骨細胞之細胞群於培養基存在下 進行放置。
此時培養基可為使細胞產生細胞分裂者，亦可為不使細胞產生細胞分裂者。例如，培養基為含有細胞群生存必須成分之緩衝液。
「放置」係指將細胞維持於特定條件下。於該維持中，典型係發生細胞分裂。亦即，放置亦可為培養。另外於該維持中，亦可不發生細胞分裂。例如，可獲得製造再生軟骨必須之軟骨活細胞數時，於該維持中，亦可不發生細胞分裂。於特定條件下之維持中發生細胞分裂時，亦即進行培養時，培養方法只要是可獲得製造再生軟骨必須之軟骨活細胞數，可為相關業者習知之任一種方法。培養方法例如可為為獲得必須之活細胞數之繼代培養。繼代培養之一例係可藉由將分離之軟骨細胞以平面培養進行培養3星期，進行繼代1次，進而再培養3星期後使其增殖約1000倍。另外亦可進行更進一步的繼代培養。並未特別限制培養型態，可因應目的適當選擇。培養型態例如於培養瓶中之懸浮培養、於培養皿中之平面及/或懸浮培養(單層培養)、丸狀方式(pellet culture)培養、以水性凝膠(hydrogel)等之三維立體培養等。
使用之培養基係其本身周知之適於培養軟骨細胞之培養基。培養基較佳係DMEM、MEM、DMEM/F12以及含血清之DMEM/F12。培養基之量相對於含軟骨細胞之細胞群體積1mL，為20至20,000mL。
放置可於3~7% CO2 存在下，濕度80~100%，溫度 36~38℃下進行。放置時間例如於進行培養時，為培養所需時間。另外於放置期間，可攪拌培養基亦可不進行攪拌，但以進行攪拌為佳。
上述放置後之含軟骨細胞之細胞群，可為互相結合，及至少逐漸形成部分的組織，或可為各自游離之軟骨細胞。另外，含軟骨細胞之細胞群，可為初代培養物及/或繼代培養物。
細胞群中所含軟骨細胞之生存率，亦即細胞群中所含之軟骨細胞中，軟骨活細胞所佔比例較佳係80%以上。軟骨細胞生存率未達80%時，預計健全的軟骨再生可能無法達成。生存率之測定方法例如使用自動細胞計數器(NucleoCounter)之PE測定法。
含軟骨細胞之細胞群例如為含有2億4千萬個以上之軟骨活細胞。該等細胞群由於含有製造再生軟骨所必須的軟骨活細胞，可藉由使用其而製造再生軟骨。
5. GFAP之測定
接著，自上述培養基採取至少一部分液體成分。
此處之液體成分係自培養基至少去除細胞後可得。培養基可為培養中之培養基，亦可於培養過程中，一時性地以具有其本身周知之生理組成的緩衝液取代培養基，進而亦可為以期望的時間進行恆定培育後之該緩衝液。液體成分為例如培養上清液。
自培養基採取液體成分之方法，可使用自培養基以不 含細胞群而可取得培養基之任一種方法。例如自培養基採取液體成分之方法，可使用離心分離法。
自培養基採取液體成分的時間點，可為選自分離含軟骨細胞的細胞群之後、培養前、培養中、培養後、培養結束時、初代培養中、繼代培養前、繼代培養後、繼代培養中、形成再生軟骨前、形成再生軟骨後、再生軟骨移植前以及再生軟骨移植後之至少一個時期。例如於分離含軟骨細胞的細胞群後，立即使細胞群懸濁於緩衝液中，再採取所得懸濁液中之液體成分。於分離後立即採取液體成分供予測定GFAP量時，可分析遭分離的細胞群中軟骨細胞之純度。亦可於分離後立即加上採取例如培養中及/或再生軟骨形成後、移植前之液體成分，供予下述測定。採取移植前之液體成分提供測定時，可管理再生軟骨之品質。
其次，測定以經如下所述方法分離之液體成分中所含之GFAP量。測定GFAP量可使用其周知之任一種方法。測定GFAP量之方法例如ELISA法、PR-PCR法以及西方墨點法。
其次，以經如上所述方式測定之GFAP含量為基礎，判斷自細胞群可得或獲得之再生軟骨是否適合移植。例如液體成分中所含之GFAP含量，每1mL液體成分為0.05 ng以上時，判斷自細胞群可得或獲得之再生軟骨適合移植。較佳係液體成分中所含之GFAP含量，每1mL液體成分為0.5 ng以上時，判斷自細胞群可得或獲得之再生軟骨適合移植。更佳係液體成分中所含之GFAP含量，每 1mL液體成分為5 ng以上時，判斷自細胞群可得或獲得之再生軟骨適合移植。
液體成分中所含之GFAP含量，每1mL液體成分為0.05 ng以上時，顯示自細胞群可得或獲得之再生軟骨，於移植後可成為軟骨並生著，更佳係表示其具有旺盛的軟骨再生。反之，GFAP含量為每1mL液體成分未達0.05 ng時，顯示自細胞群獲得之再生軟骨，於移植後無法成為軟骨並生著，或極可能無法表現所期望之軟骨再生。
經判斷為適於移植之細胞群，其後可使用於形成以下說明之再生軟骨。反之，經判斷為不適於移植之細胞群，則無法使用於形成再生軟骨。
另外針對再生軟骨進行上述之評估時，判斷再生軟骨不適用於移植時，即不移植該再生軟骨。
6.再生軟骨之形成
再生軟骨係使用含經於培養基存在下進行放置之軟骨細胞之細胞群而形成。此處所使用之細胞群係如上所述之以GFAP含量為基礎，判斷自細胞群獲得之再生軟骨適合移植之細胞群。
例如再生軟骨可將含軟骨細胞之細胞群，藉由立體培養而形成。立體培養係使用支架材料進行。具體而言，立體培養係藉由於支架材料之上或內部培養軟骨細胞而進行。並未限制所使用支架材料的材料、性狀、形狀、構造、大小等，可因應目的適當地選擇。支架材料之材料可 為例如去端肽膠原蛋白(atelocollagen)、纖維蛋白、玻尿酸以及具生物分解性之聚合物多孔體。具生物分解性之聚合物多孔體係例如PLLA、PGA及PLGA。支架材料可使用任一種周知之方法形成。立體培養可進而使用凝膠化劑而進行。例如混合凝膠化劑與含軟骨細胞之細胞群後，再藉由使其與支架材料接觸，進行安定的立體培養，可獲得安定的再生軟骨。凝膠化劑係例如去端肽膠原蛋白以及藻酸鹽(Alginate)。立體培養可以於37℃、5% CO2 存在下孵育2小時之條件進行。
如上所述，可製造適於移植之再生軟骨。
經如上述方式製造之再生軟骨，具有相當程度的大小，可做為植入物(implant)而使用。再生軟骨可為懸濁液型態或固體型態，但以固體型態為佳。
製造之再生軟骨，可作為例如為填補或補強軟骨缺損或軟骨損傷部位之醫療用移植材料。特別係可使用於先天性型態形成異常，例如因脣顎裂之鼻變形之醫療用移植材料。另外，該相關之再生軟骨亦可使用為美容整形用移植材料。
軟骨再生醫療主要包含(1)自患者採取軟骨、(2)分離與培養軟骨細胞、(3)回收培養的軟骨細胞或形成再生軟骨、(4)移植至患者等4個步驟。第2步驟之分離與培養軟骨細胞係於細胞培養處理中心(Cell Processing Center)此一特殊的設施內進行，且為製造再生醫療製品的本質部份。因此，為要求最嚴密的品質管理之步驟。
以往，由於混入軟骨細胞以外之其他細胞，及軟骨細胞過度增殖，無法保證再生軟骨的品質，亦無法提供患者預定之醫療，或於移植後發生軟骨形成能力下降等問題。有關其他細胞混入，由於尚未確立顯示軟骨細胞純度之指標已往尚無法判斷。其他細胞會妨礙軟骨細胞增殖及細胞團分化為軟骨。另外，軟骨細胞過度增殖係培養之細胞團進行顯著的分化，其結果，發生減弱軟骨特性。過度增殖係由於難以正確計測分離時之軟骨細胞數而產生。亦即，將分離時之軟骨細胞數預測為較實際為多，且以繼代培養獲得目標細胞數時，結果為發生軟骨細胞過度增殖。
根據上述評估再生軟骨的方法，由於可評估自培養軟骨細胞獲得或可得之再生軟骨的軟骨特性，可解決如上所述之已往發生的問題。具體而言，由於上述之評估方法係藉由測定GFAP含量，獲得顯示細胞群中軟骨細胞純度之定量的指標，而可排除所含之與其他細胞排擠軟骨細胞等量之細胞群。因此，由於使用含軟骨細胞之細胞群製造的再生軟骨，已經是否適合用於移植之判斷，可避免移植後在體內軟骨形成能力降低之狀況。
另外，評估軟骨特性不僅使用含軟骨細胞的細胞群，亦使用自培養基分離且未含有軟骨細胞之液體成分，例如上清液。因此，自不會耗損再生軟骨製品貴重原料之細胞此一觀點，非常有利於再生軟骨的製造。
進而，使用上述軟骨特性評估方法所製造之再生軟骨，可保證其品質。因此該等再生軟骨可安全的使用於醫 療用以及美容用移植材料。
 [實施例]
以下針對本發明之例進行說明。
<實施例1>
例1. 檢討為判定再生軟骨製品之構成細胞係耳廓軟骨細胞之指標
以下述方法，檢索用於製造再生軟骨製品之經培養後增殖1000倍之耳廓軟骨細胞中大量表現之基因。
針對耳廓軟骨細胞、纖維母細胞、皮膚角質細胞、氣管上皮細胞、關節軟骨細胞、肋軟骨細胞、星狀細胞，藉由單層培養法於約一週內進行一次繼代培養，再進行長期連續繼代培養。在第二次繼代(PS)以及第8次繼代(P8)的時間點，自各培養細胞萃取Total RNA，使用Affymetrix公司製之GeneChip(登記商標)Human Genome U133 plus Array，以微陣列法(microarray)，個別檢索細胞大量表現之基因。
其結果，檢測出纖維母細胞生長因子(FGF)-18、神經膠質微纖維酸性蛋白質(GFAP)等基因，但其中表現量特高之基因係GFAP基因。
進而使用Real Time PT-PCR法測定GFAP基因的表現量。對各細胞進行3個檢體測定，獲得測定值之平均與 標準差。各細胞獲得結果示於圖1。
圖1顯示GFAP的表現量在耳廓軟骨細胞、纖維母細胞、皮膚角質細胞、氣管上皮細胞、關節軟骨細胞、肋軟骨細胞及星狀細胞中，以耳廓軟骨細胞有顯著高的表現量。
自該結果可得知藉由檢測GFAP，暗示可消除培養中耳廓軟骨細胞遭纖維母細胞排擠，而意外移植未預期的纖維母細胞此一危險因子。
例2. 檢討將GFAP基因作為產生軟骨基質之指標之適用性
將來源相異的6例耳廓軟骨細胞，使用含5%血清、FGF-2以及胰島素之DMEM/F12培養液，於約一週內進行一次繼代培養，再以單層培養法進行至第8次繼代(P8)為止的長期連續繼代培養。在產生豐富的基質產生量之培養後倍增約100倍的耳廓軟骨細胞(P2)，與1億倍程度之細胞(P8)時間點，自培養細胞萃取Total RNA，以Real Time PT-PCR法測定GFAP基因的表現量。
結果示於圖2。自圖2可知，全例均顯示P2的表現量高，但無關相同條件下之培養，P2基因表現之基因複製數(copy number)自7.2×103 ~1.321×106 ，細胞間存在相當大的差異。
因此，為抑制測定上之差異性，檢討於蛋白質層次之評估。
例3. 測定蛋白質層次之GFAP表現
針對捐贈者相異之18例人類耳廓軟骨細胞，使用含5%血清、FGF-2以及胰島素之DMEM/F12培養液，於約一週內進行一次繼代培養，再以經長期培養進行至第3次繼代。將培養之耳廓軟骨細胞以胰蛋白酶處理後回收，以細胞濃度為1×107 細胞/mL與1%去端肽膠原蛋白凝膠混合。將該與細胞混合之凝膠每20μl分注至試管內，再以含成骨蛋白(BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)、胰島素(insulin)、三碘甲狀腺胺酸(T3(Triiodothryonine))之BMP-2/insulin/T3之誘導產生軟骨細胞基質培養基，進行高密度包埋培養。3周後，以比色法及ELISA法測定軟骨細胞分泌之GAG量以及COL2量。另外取出與經去端肽膠原蛋白包埋者相同之P3培養軟骨細胞1×104 細胞，以ELISA法測定該細胞溶解液中GFAP量。以捐贈者相異之18例耳廓軟骨細胞進行相同試驗，採用SSRI公司製之Excel統計計算培養細胞分泌之GAG量、COL2以及細胞中GFAP量之相關性。結果示於圖3以及圖4。
自圖3以及圖4可得知細胞中GFAP量與GAG量之相關係數為0.507，與COL2之相關係數為0.590，顯示二值間之相關性為中等程度相關。由此可知，藉由於蛋白質層次測定構成再生軟骨之軟骨細胞的GFAP，暗示可對軟骨細胞進行功能性的評估。
例4. 檢討為評估GFAP含量之檢體
將捐贈者相異之18例耳廓軟骨細胞，培養至第3次繼代(P3)，再將培養之耳廓軟骨細胞以胰蛋白酶處理後回 收，以細胞濃度為1×107 細胞/mL與1%去端肽膠原蛋白凝膠混合。將該與細胞混合之凝膠每20μl分注至試管內，再以含BMP-2/insulin/T3之誘導產生軟骨細胞基質培養基，進行高密度包埋培養。3周後，以比色法及ELISA法測定軟骨細胞分泌之GAG量以及COL2量。另外取出與經去端肽膠原蛋白包埋者相同之P3培養軟骨細胞之培養上清液的一部分，以ELISA法測定該培養上清液中所含GFAP量。以捐贈者相異之18例耳廓軟骨細胞進行相同試驗，計算培養細胞分泌之GAG量、COL2以及培養上清液中GFAP量之相關性。結果示於圖5以及圖6。
自圖5以及圖6可知，培養上清液中GFAP量與GAG之相關係數為0.767，與COL2之相關係數為0.735，顯示二值間具有相當強烈的相關性。另外，培養上清液中GFAP含量愈高，顯示愈具有旺盛的軟骨再生。
因此，採取一部分的培養上清液，藉由以ELISA測定GFAP量，顯示可不損及細胞及組織，判定是否可出貨。
例5. 決定為評估軟骨特性之GFAP蛋白質量之閥值
分別使用3例之第2次繼代(P2)之培養耳廓軟骨細胞以及培養纖維母細胞，使用含5%血清、FGF-2以及含胰島素之DMEM/F12培養液進行一週培養。自該培養細胞取出1mL培養上清液，其後以胰蛋白酶處理後回收培養 細胞。將該回收之細胞以濃度為1×108 細胞/mL與1%去端肽膠原蛋白凝膠混合後，投入多孔體型支架材料，於37℃下孵育2小時後使其凝膠化。並將其移植入裸鼠背部皮下。
2個月後，取出移植物，切半後一半以甲苯胺藍(Toluidine blue)染色供於組織學評估。另一半則用於GAG量、第Ⅱ型膠原蛋白量之蛋白質定量評估。以ELISA法測定取出之培養上清液中所含GFAP量。結果示於圖7以及圖8至13。
自圖7之培養上清液中GFAP量的結果以及圖8至13之組織學評估，耳廓軟骨細胞之全例均於培養上清液中檢測出GFAP，顯示藉由移植至裸鼠可發現軟骨形成。反之，纖維母細胞全例均未檢測出GFAP，亦未發現軟骨形成。
另外，自圖7至13於移植後形成軟骨且顯示旺盛的軟骨再生之培養人類耳廓軟骨細胞，顯示培養上清液中GFAP至少存在0.05ng/mL以上。自該等結果，若培養上清液中含GFAP為0.05ng/mL以上，暗示含有可形成再生軟骨之培養人類耳廓軟骨細胞，可明確得知可將培養上清液中所含GFAP量之值，使用為判定再生軟骨品質之標準。
<實施例2>
根據下述順序製造再生軟骨。圖14係概略顯示該再 生軟骨之製造步驟之圖。
自患者採取耳廓軟骨的一部分(約1cm×5mm×2mm)，再藉由膠原蛋白酶處理而分離軟骨細胞。將經分離之軟骨細胞以含5%自體血清、FGF-2以及含胰島素之DMEM/F12培養液培養約3~6週。培養時回收使其增殖約1000倍細胞數之細胞。將該回收之培養軟骨細包，投入PLLA製之支架材料，形成再生軟骨(圖14)。
且於培養後39天(移植前3天)進行培養液檢查，使用ELISA測定培養上清液中所含之GFAP蛋白質濃度。藉由於培養後39天(移植前3天)確認培養上清液中GFAP含量為0.05ng/mL以上，判斷可安全進行移植，且移植後於體內形成軟骨，能夠以再生軟骨形式生著。
[圖1]圖1係表示各種細胞中GFAP基因之表現量圖。
[圖2]圖2係表示來源相異的人類耳廓軟骨細胞中GFAP基因之表現量圖。
[圖3]圖3係表示使用經培養之人類耳廓軟骨細胞，評估由人類耳廓軟骨細胞所產生之GAG與GFAP之相關性之結果圖。
[圖4]圖4係表示使用經培養之人類耳廓軟骨細胞，評估由人類耳廓軟骨細胞所產生之COL2與GFAP之相關性之結果圖。
[圖5]圖5係表示使用藉由培養人類耳廓軟骨細胞可得之培養上清液，評估由人類耳廓軟骨細胞所產生之GAG與GFAP之相關性之結果圖。
[圖6]圖6係表示使用藉由培養人類耳廓軟骨細胞可得之培養上清液，評估由人類耳廓軟骨細胞所產生之COL2與GFAP之相關性之結果圖。
[圖7]圖7係表示分別培養軟骨細胞及纖維母細胞後所得之培養上清液中GFAP量之測定結果圖。
[圖8]圖8係移植以圖7所示之經培養的軟骨細胞#1後之再生組織之示意圖。
[圖9]圖9係移植以圖7所示之經培養的軟骨細胞#2後之再生組織之示意圖。
[圖10]圖10係移植以圖7所示之經培養的軟骨細胞#3後之再生組織之示意圖。
[圖11]圖11係移植以圖7所示之經培養的纖維母細胞#1後之再生組織之示意圖。
[圖12]圖12係移植以圖7所示之經培養的纖維母細胞#2後之再生組織之示意圖。
[圖13]圖13係移植以圖7所示之經培養的纖維母細胞#3後之再生組織之示意圖。
[圖14]表示與一實施方式有關之耳廓軟骨再生製品之製造步驟之概略圖。

Claims (6)

  1. 一種評估再生軟骨之方法，包含將含有耳廓軟骨細胞之細胞群於培養基存在下進行放置，與之後自前述培養基中採取至少一部分之液體成分，及測定採取之前述液體成分中所含之GFAP含量，以及以前述GFAP含量為基礎，判斷自前述細胞群獲得或可得之再生軟骨是否適合移植。
  2. 如申請專利範圍第1項之評估再生軟骨之方法，其中前述判斷係當前述GFAP含量為前述液體成分每1mL為0.05ng以上時，判斷為適合移植。
  3. 如申請專利範圍第1項之評估再生軟骨之方法，其中前述判斷係當前述GFAP含量為前述液體成分每1mL為0.5ng以上時，判斷為適合移植。
  4. 如申請專利範圍第1項之評估再生軟骨之方法，其中前述判斷係當前述GFAP含量為前述液體成分每1mL為5ng以上時，判斷為適合移植。
  5. 一種再生軟骨之製造方法，包含將含有耳廓軟骨細胞之細胞群於培養基存在下進行放置，與之後自前述培養基中採取至少一部分之液體成分，及測定採取之前述液體成分中所含之GFAP含量，以及以前述GFAP含量為基礎，判斷自前述細胞群可得之再生軟骨是否適合移植，及 形成再生軟骨。
  6. 如申請專利範圍第5項之再生軟骨之製造方法，其中形成前述之再生軟骨係包含使用支架材料使軟骨細胞進行立體培養。
TW101102243A 2011-01-19 2012-01-19 Methods for assessing regenerative cartilage TWI431116B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011009253A JP5388233B2 (ja) 2011-01-19 2011-01-19 再生軟骨の軟骨特性を評価する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201245446A TW201245446A (en) 2012-11-16
TWI431116B true TWI431116B (zh) 2014-03-21

Family

ID=46515727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101102243A TWI431116B (zh) 2011-01-19 2012-01-19 Methods for assessing regenerative cartilage

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8921038B2 (zh)
EP (1) EP2667191B1 (zh)
JP (1) JP5388233B2 (zh)
KR (1) KR101555768B1 (zh)
CN (1) CN103328977B (zh)
SG (1) SG191970A1 (zh)
TW (1) TWI431116B (zh)
WO (1) WO2012099104A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6312710B2 (ja) * 2013-12-27 2018-04-18 株式会社日立製作所 生体分子解析装置
ES2676318T3 (es) * 2014-02-20 2018-07-18 Merck Patent Gmbh FGF-18 en procedimientos de trasplante de injertos y de ingeniería tisular
TWI723967B (zh) * 2014-11-12 2021-04-11 英商邊緣生物科技有限公司 用於組織自修復及再生之經取代芳族化合物及醫藥組合物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2373045C (en) * 1999-05-03 2016-07-26 Tissuegene, Inc. Gene therapy using tgf-.beta.
US20080226611A1 (en) * 1999-06-30 2008-09-18 Moon Jong Noh Gene Therapy Using TGF-beta
AU2003284875A1 (en) * 2002-10-17 2004-05-04 Vacanti, Joseph P. Biological scaffolding material
JP3680067B2 (ja) * 2003-04-15 2005-08-10 矢永博子 移植用軟骨細胞の製法
AU2004252570C1 (en) * 2003-06-27 2012-03-01 Ethicon, Incorporated Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells
EP1792977A4 (en) 2004-08-24 2007-11-21 Fujisoft Inc MEDIUM FOR THE RE-DIFFERENTIATION OF DEDIFFERENCED CHONDROCYTES TO CHONDROCYTES
JP2006314759A (ja) * 2005-04-11 2006-11-24 Hiroko Yanaga 移植用軟骨組成物

Also Published As

Publication number Publication date
TW201245446A (en) 2012-11-16
EP2667191A4 (en) 2015-03-18
SG191970A1 (en) 2013-08-30
CN103328977A (zh) 2013-09-25
US20130302834A1 (en) 2013-11-14
KR20130115327A (ko) 2013-10-21
JP2012150019A (ja) 2012-08-09
WO2012099104A1 (ja) 2012-07-26
EP2667191B1 (en) 2016-12-21
KR101555768B1 (ko) 2015-09-25
US8921038B2 (en) 2014-12-30
EP2667191A1 (en) 2013-11-27
CN103328977B (zh) 2015-07-29
JP5388233B2 (ja) 2014-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Giovannini et al. Micromass co-culture of human articular chondrocytes and human bone marrow mesenchymal stem cells to investigate stable neocartilage tissue formation in vitro
Tsaryk et al. Biological performance of cell‐encapsulated methacrylated gellan gum‐based hydrogels for nucleus pulposus regeneration
JP2019088310A (ja) 瘻の治療における脂肪組織由来間質幹細胞の使用
EP3397294B1 (en) A method for preparing 3d cartilage organoid block
CN104937095B (zh) 肾细胞群及其用途
Kokubo et al. Characterization of chondrocyte sheets prepared using a co‐culture method with temperature‐responsive culture inserts
US20200216816A1 (en) Immunoprivileged bioactive renal cells for the treatment of kidney disease
US20200291359A1 (en) Ectodermal mesenchymal stem cells and method for producing same
Sanjurjo-Rodriguez et al. Ovine mesenchymal stromal cells: morphologic, phenotypic and functional characterization for osteochondral tissue engineering
Park et al. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in a hydrogel construct: neocartilage formation in animal models as both mice and rabbits
Asnaghi et al. Biomarker signatures of quality for engineering nasal chondrocyte-derived cartilage
TWI431116B (zh) Methods for assessing regenerative cartilage
KR102081356B1 (ko) 포자를 닮은 세포들의 계군 및 그 용도
Hou et al. Cartilage regeneration characteristics of human and goat auricular chondrocytes
JP2021505344A (ja) 軟骨の欠損を修復するための組成物及び方法
JP2006122147A (ja) 移植用材料及び未分化間葉系幹細胞の培養方法
Chiu et al. Direct and indirect co-culture of bone marrow stem cells and adipose-derived stem cells with chondrocytes in 3D scaffold-free culture
CN114555783A (zh) 体外生产透明软骨组织的方法
US8637065B2 (en) Dermis-derived cells for tissue engineering applications
KR20130019459A (ko) 양수-유래 중간엽 줄기세포의 증식방법 및 이를 포함하는 이식용 구조체의 제조방법
Ann Application of Size-Based Sorted Zonal Chondrocytes for Articular Cartilage Repair
Wang Cell-based meniscus characterization and regeneration: basic science, tissue engineering and clinical applications
Sykes Advancing cartilage cell therapy through chondrocyte culture and patient reported outcome measures (PROMs)
WO2022251537A1 (en) Production processes for highly viable, engraftable human chondrocytes from stem cells