KR20130115327A - 재생 연골의 평가방법 - Google Patents

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후지소프트 가부시키가이샤
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Abstract

실시 형태에 따른 재생 연골을 평가하는 방법은, 이개 연골세포를 포함한 세포군을 배지의 존재하에서 방치하는 것, 그 후, 상기 배지로부터 액체 성분의 적어도 일부를 채취하는 것, 채취한 상기 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량을 측정하는 것, 및 상기 GFAP 함유량에 기초하여 상기 세포군으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 판단하는 것을 포함한다.

Description

재생 연골의 평가방법{METHOD FOR EVALUATION OF REGENERATED CARTILAGE}
본 발명은 재생 연골을 평가하는 방법에 관한 것이다.
악안면에 있어서의 선천성 형태형성 이상이나 악성 종양 절제후의 악안면 결손에 대해서는, 지금까지 자가 조직 이식에 의한 조직 수복(修復) 및 재건이 행해져 왔다. 그러나, 자가 조직 이식에는, 채취 가능한 조직의 크기의 한계, 또는 이식하는 부위에의 침습(侵襲) 등과 같은 과제가 남아 있다. 그 중에서도 연골 재생 의료는 비교적으로 임상 응용이 진행되고 있으며, 현재, 자가 연골세포를 이용한 이식법(ACI, Autologous Chondrocyte Implantation)이 세계적으로 보급되고 있다. ACI 원법(原法)은 1995년에 스웨덴의 연구그룹에 의해서 처음으로 보고되었다. ACI 원법은 스포츠 외상 등에 의한 관절 연골의 국소 결손에 대하여, 자가 배양 연골세포를 세포 현탁액으로서 결손부에 투여하고, 추가로 누출을 막기 위해 골막(骨膜) 패치(patch)로 피복하는 방법이다.
악안면 영역에서의 결손 및 이상에 관해서는, 실리콘 임플란트에 의한 융비술 재생 수술예나 안비(鞍鼻) 등에 대하여 자가 연골세포의 현탁액을 주입한 응용예가 보고되어 있다.
배양된 연골세포의 특성 평가에는, 예컨대, 유전자 발현 및 표면 마커(marker)가 이용되어 왔다. 그러나, 이들은 정량성이 부족하여, 최종적으로 얻고자 하는 세포군의 일부를 희생할 필요가 있는 것이 현상이다.
이러한 기술의 관련기술은 예컨대 이하의 문헌에 기재되어 있다.
Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L. 1994. Treatment of deep cartilage defect in the knee with autologous chondrocytes transplantation. N Engl J Med 331(14):889-895. Yanaga H, Yanaga K, Imai K, Koga M, Soejima C, Ohmori K. 2006. Clinical application of cultured autologous human auricular chondrocytes with autologous serum for craniofacial or nasal augmentation and repair. Plast Reconstr Surg 117(6):2019-2030.
본 발명의 목적은, 재생 연골 또는 그 재료가 되는 연골세포의 일부를 희생함이 없이, 정량적으로 재생 연골을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 태양에 따르면, 이개 연골세포를 포함한 세포군을 배지의 존재하에서 방치하는 것, 그 후, 상기 배지로부터 액체 성분의 적어도 일부를 채취하는 것, 채취한 상기 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량을 측정하는 것, 및 상기 GFAP 함유량에 기초하여 상기 세포군으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 판단하는 것을 포함하는 재생 연골의 평가방법이 제공된다.
도 1은 각종 세포에 있어서의 GFAP 유전자의 발현량을 나타내는 도면이다.
도 2는 유래가 다른 인간 이개 연골세포에 있어서의 GFAP 유전자의 발현량을 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 이개 연골세포에 의해 생산된 GAG와 GFAP의 상관관계를, 배양된 인간 이개 연골세포를 이용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 인간 이개 연골세포에 의해 생산된 COL2와 GFAP의 상관관계를, 배양된 인간 이개 연골세포를 이용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 이개 연골세포에 의해 생산된 GAG와 GFAP의 상관관계를, 인간 이개 연골세포를 배양함으로써 얻어진 배양 상청(上淸)을 이용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 배양된 인간 이개 연골세포에 의해 생산된 COL2와 GFAP의 상관관계를, 인간 이개 연골세포를 배양함으로써 얻어진 배양 상청을 이용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 연골세포 및 섬유아세포의 각각을 배양하여 얻은 배양 상청 중의 GFAP량의 측정결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 도 7에서 나타낸 배양 연골세포 #1을 이식한 후의 재생 조직의 영상을 나타내는 도면이다.
도 9는 도 7에서 나타낸 배양 연골세포 #2를 이식한 후의 재생 조직의 영상을 나타내는 도면이다.
도 10은 도 7에서 나타낸 배양 연골세포 #3을 이식한 후의 재생 조직의 영상을 나타내는 도면이다.
도 11은 도 7에서 나타낸 배양 섬유아세포 #1을 이식한 후의 재생 조직의 영상을 나타내는 도면이다.
도 12는 도 7에서 나타낸 배양 섬유아세포 #2를 이식한 후의 재생 조직의 영상을 나타내는 도면이다.
도 13은 도 7에서 나타낸 배양 섬유아세포 #3을 이식한 후의 재생 조직의 영상을 나타내는 도면이다.
도 14는 일 태양에 따른 이개 연골 재생 제품의 제조공정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
1. 개요
종래, 연골을 재건하는 재생 의료로서는, 연골세포를 주입하는 방법이 행해지고 있었다.
그러나, 연골세포 그 자체는 충분한 크기 및 충분한 강도를 가지지 않기 때문에, 연골세포를 주입하는 것만으로는 조직 재건의 목적을 충분히 다할 수 없을 가능성이 여전히 높다. 이러한 상황에서, 본 발명자들은, 충분한 크기나 강도가 있는 「임플란트」와 같은 재생 연골을 제공하기 위한 수단을 개발하여 왔다. 그 개발에 있어서, 우선, 연골세포가 체내에 이식될 때에, 일정한 품질이 보증되고 있을 필요가 있는 것에 착안했다. 이 품질이란, 구체적으로는, 재생 연골이 연골 특성을 갖고 있다는 것이다. 여기서 「연골 특성」이라는 말은 「연골로서의 특성」, 「연골의 특성」, 「연골로서의 성질」, 「연골의 성질」의 말과 교환 가능하게 사용된다. 「연골 특성」이란, 이식에 적합한 연골로서의 특이적인 성질을 말한다. 구체적으로는, 안전하게 이식할 수 있고, 이식 후에 연골을 형성하여, 체내에서 연골로서 생착(生着) 가능한 성질을 말한다. 일례에 의하면, 「연골 특성」이란, 이식 후, 체내에서 왕성한 연골 재생을 나타내는 성질을 말한다. 또한, 「연골 특성」은 이식 타당성으로 해석되어도 좋다. 재생 연골이 연골 특성을 갖기 위해서는, 이물질, 예컨대 다른 세포의 혼입이 없고, 또 과증식하지 않는 것이 필요하다.
연골세포는, 재생 연골의 특성과 기능을 좌우하는 연골기질을 분비하는 중요한 구성요소이다. 예컨대, 연골세포가 과증식한 경우, 탈분화하여 연골 특성이 감약화(減弱化)되고, 더욱이는 연골 특성이 상실된다. 또한, 연골세포 단리 시에 섬유아세포가 혼입되어, 섬유아세포가 배양 중에 과증식한 경우, 목적하는 연골세포를 구축하여 버린다고 하는 제조공정상의 리스크가 있다. 섬유아세포에 의해서 연골세포가 구축된 배양 조직을 이식한 경우에는, 연골세포 대신에 섬유아세포가 이식되게 된다. 그와 같은 이식 조직은 연골로서 생착할 수 없다. 따라서, 제조된 재생 연골제품이, 연골세포를 구축하는 정도의 양의 다른 세포를 포함하지 않으면서 연골세포를 충분한 양으로 포함하여, 이식 후, 과증식함이 없이 연골 특성을 유지할 수 있는 것을, 이식 전에 미리 판별하는 것이 필요 불가결하다.
본 발명자들은, 연골세포, 특히 이개 연골세포를 포함한 세포군을 사용하여 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 나타내는 지표가 되는 특이적인 마커를 발견했다. 본 발명은 이 발견에 근거한다. 이 마커에 의하면, 최종적으로 얻고자 하는 목적물을 희생함이 없이, 상기 세포군을 사용하여 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골의 연골 특성을 정량적으로 평가하는 것이 가능하다.
2. 이개 연골세포에 특이적인 마커
전술한 연골세포, 특히 이개 연골세포에 특이적인 마커는 글리아세포 섬유성 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein(GFAP))이다.
GFAP는, 일반적으로 신경계, 예컨대 아스트로사이트(astrocyte)나 슈반(Schwann) 세포에 특이적으로 국재하는 단백질이다.
본 발명자들은, GFAP가 연골 재생 의료의 유용한 세포원인 배양 이개 연골세포에서 특이적으로 또 높은 양으로 발현한다는 것, 및 계대(繼代)배양(subculture)에 따라 서서히 GFAP 유전자의 발현량 및 GFAP 단백질량이 감소해 간다는 것을 발견했다.
이 GFAP 단백질량을 정량함으로써, 섬유아세포 등의 다른 세포의 혼입이나 이개 연골세포의 과증식에 따르는 연골 특성의 감약화 등을 검출할 수 있다. 이것에 의해, 재생 연골제품의 연골 특성을 평가하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 하나의 태양에 의하면, 이개 연골세포를 포함한 세포군을 배지의 존재하에서 방치하는 것, 그 후, 상기 배지로부터 액체 성분의 적어도 일부를 분리하는 것, 분리한 상기 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량을 측정하는 것, 및 상기 GFAP 함유량에 기초하여 상기 세포군으로부터 얻어지는 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 판단하는 것을 포함하는 재생 연골의 평가방법이 제공된다.
이 방법에 있어서, 액체 성분, 예컨대 배양 상청에 포함되는 GFAP 함유량을 측정함으로써, 정량적으로 연골기질의 축적량에 대한 정보를 얻을 수 있다.
여기서 「연골기질」이란, 연골 구조의 기반이 되는 물질을 총칭한다. 연골기질은, 예컨대 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG), II형 콜라겐(COL2)이다.
후술하는 예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 기초가 되는 연구에 있어서, 배양 상청 중의 GFAP 함유량이 GAG 및 COL2의 축적량에 상관한다는 것을 새로운 지견으로서 발견했다. 이러한 지견에 근거하여, 액체 성분, 예컨대 배양 상청 중의 GFAP 함유량을 측정함으로써 연골 특성을 평가하는 것이 가능해졌다.
예컨대, 재생 연골의 제조에 사용되고 있는 인간 관절 연골세포에 있어서, 발현이 증강되는 마커로서 CD10, CD26, CD44, CD49c, CD81, CD166 등을, 발현이 감소하는 것으로서 CD94a, CD106 등을 들 수 있다. 이들은 세포 접착 분자이며, 세포 표면 마커로서 사용된다. 세포 표면 마커는 유동 세포 분석법(flow cytometry)에 의해 해석되고, 별도로 해석된 다른 계를 정량적으로 비교하는 것은 곤란하다. 또한, 세포의 접착 상태 등 배양 환경에 의해서 변동해 나갈 가능성도 있어, 일정한 기준을 설치하는 것도 곤란하다.
또한, 상기 세포 접착 분자 외에, 세린 프로테아제 인히비터(Serpin) A1 및 A3, 섬유아세포 성장인자-18(FGF-18)이나 멜라노마 억제 활성인자(MIA) 등이 확인되어 있다. 특히, FGF-18은 평면배양을 거듭해 가는 것에 의해, 유전자 발현량이 증가하는 인자이기 때문에, 연골세포의 기질 생산능을 나타내는 지표로서 사용할 수 있을 가능성이 있다. 그러나, 이들의 인자를 지표로서 이용하는 경우, 유전자 레벨로 평가하는 것이 되기 때문에, 정량성에 과제가 남는다. 또한, 이들은 어느것이나 분비 단백이다. 증식 중의 배양 연골세포로부터 분비되는 생리 활성물질은 극히 소량이다고 예상되어, 배양 상청을 샘플로서 이용하여 그것에 포함되는 단백량을 측정할 수 있을 가능성은 있지만, 검출하기가 어렵다. 이러한 이유 때문에, GFAP가 지표로서 채용되었다.
GFAP는, 이개 연골세포에 비하여 관절 연골세포에서의 발현량이 적고, 계대배양에 의한 발현량의 변화도 작다. 따라서, 재생 연골의 공급원으로서는, 이개 연골세포가 사용된다.
이상과 같은 이유 때문에, 재생 연골의 공급원으로서 이개 연골세포를 사용하고, 재생 연골의 연골 특성의 지표로서 GFAP를 사용하는 일 태양에 따른 평가방법이 유리하다는 것은 명백하다.
3. 연골세포
여기에서 사용되는 연골세포는 이개 연골세포이다.
연골세포의 공급원은 어떠한 포유동물이어도 좋다. 포유동물은, 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 원숭이 및 인간이며, 바람직하게는 인간이다.
연골세포의 공급원인 포유동물은, 연골세포에 의해 구성된 재생 연골을 이식하는 대상이 되는 포유동물에 의존하여 선택된다. 연골세포에 의해 구성된 재생 연골에 대한 설명은 후술한다.
인간이 이식의 대상인 경우에는, 인간 유래의 이개 연골세포(이하, 「인간 이개 연골세포」), 보다 바람직하게는 인간 유래의 자가 이개 연골세포이다. 여기서, 「자가 이개 연골세포」란, 연골세포에 의해 구성되는 재생 연골을 이식하고자 하는 대상의 이개로부터, 이식 및 재생 연골의 제조에 앞서 채취된 세포를 말한다.
연골세포는, 예컨대 다음과 같이 하여 단리된다. 우선, 도우너(donor)인 포유동물로부터 연골편을 외과적으로 채취한다. 다음으로, 채취한 연골편을 무균 상황하에서 세편화하고, 필요에 따라 원하는 소화효소, 예컨대 콜라게나제 및/또는 젤라티나제, 트립신, 펩신 및 아그레카나제에 의해 소화시킨다. 그것에 의해, 개개로 유리된 각각의 연골세포를 포함한 세포군 및/또는 결합된 복수의 연골세포에 의해 형성되는 미세 조직편을 적어도 일부에 포함한 세포군을 얻는다.
4. 연골세포의 배양
계속해서, 이개 연골세포를 포함한 세포군을 배지의 존재하에서 방치한다.
여기서, 배지는 세포분열을 생기게 하는 것이어도, 세포분열을 생기게 하지 않는 것이어도 좋다. 예컨대, 배지는 세포군의 생존에 필요한 성분을 포함한 완충액이다.
「방치」란, 세포를 특정한 조건하에 유지하는 것을 말한다. 이 유지에 있어서, 전형적으로는, 세포분열이 생긴다. 즉, 방치는 배양이어도 좋다. 또한, 이 유지에 있어서, 세포분열이 생기지 않아도 좋다. 예컨대, 재생 연골의 제조에 필요한 연골 생세포수가 이미 얻어져 있는 경우에는, 이 유지에 있어서, 세포분열이 생기지 않아도 좋다. 특정한 조건하의 유지에 있어서, 세포분열이 생기는 경우, 즉, 배양이 행해지는 경우, 배양의 방법은, 재생 연골의 제조에 필요한 연골 생세포수를 얻을 수 있는 한, 당업자에게 이미 알려진 임의의 방법일 수 있다. 배양의 방법은, 예컨대, 필요한 생세포수를 얻기 위해서 계대배양일 수 있다. 계대배양은, 일례에 의하면, 단리된 연골세포를 3주간 평면배양에 의해 배양하고, 1회 계대하고, 추가로 3주간 배양하여 약 1000배로 증식시키는 것에 의해 행해진다. 또한, 추가적인 계대배양이 행해져도 좋다. 배양의 형태는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 배양의 형태는, 예컨대, 병 중에서의 부유 배양, 배양 접시에서의 평면 및/또는 부유 배양(단층 배양), 펠렛 배양, 하이드로겔 등에 의한 3차원 배양이다.
사용되는 배지는, 그 자체 공지된 연골세포의 배양에 적합한 배지이다. 배지는, 바람직하게는 DMEM, MEM, DMEM/F12 및 혈청 함유 DMEM/F12이다. 배지의 양은, 연골세포를 포함한 세포군의 부피 1mL에 대하여 20 내지 20,000mL이다.
방치는, 예컨대, 3 내지 7%의 CO2 존재하에서 습도 80 내지 100%, 온도 36℃ 내지 38℃에서 행한다. 방치의 시간은, 예컨대, 배양이 행해지는 경우, 배양에 요하는 시간이다. 또한, 방치 중에, 배지를 교반하여도, 하지 않아도 좋지만, 교반을 행하는 것이 바람직하다.
상기 방치 후의 연골세포를 포함한 세포군은, 서로 결합하여 적어도 부분적으로 조직을 형성하고 있어도 좋고, 또는 개개로 유리된 연골세포이어도 좋다. 또한, 연골세포를 포함한 세포군은 초대 배양물 및/또는 계대 배양물이어도 좋다.
세포군에 포함되는 연골세포의 생존율, 즉 세포군에 포함되는 연골세포 중 연골 생세포가 차지하는 비율은, 바람직하게는 80% 이상이다. 연골세포의 생존율이 80% 미만이면, 건전한 연골의 재생이 예상되지 않을 가능성이 있다. 생존율의 측정방법은, 그 자체 공지된 임의의 방법이다. 생존율의 측정방법은, 예컨대 뉴클레오카운터(Nucleocounter)를 사용한 PE 측정법이다.
연골세포를 포함한 세포군은, 예컨대 2억 4000만개 이상의 연골 생세포를 포함하고 있다. 이러한 세포군은, 재생 연골의 제조에 필요한 수의 연골 생세포를 포함하고 있고, 이것을 사용하는 것에 의해 재생 연골을 제조할 수 있다.
5. GFAP량의 측정
계속해서, 전술한 배지로부터 액체 성분의 적어도 일부를 채취한다. 여기서, 액체 성분은 배지로부터 적어도 세포를 제거하여 얻을 수 있다. 배지는, 배양중인 배지이어도 좋고, 배양의 도중, 일시적으로 그 자체 공지된 생리적 조성을 갖는 완충액으로 배지를 치환하고, 추가로 원하는 시간에 걸친 인큐베이션을 행한 후의 당해 완충액이어도 좋다. 액체 성분은, 예컨대 배양 상청이다.
액체 성분을 배지로부터 채취하는 방법으로서는, 배지로부터 세포군을 포함하지 않도록 배지를 취득하는 임의의 방법이 사용된다. 예컨대, 액체 성분을 배지로부터 채취하는 방법으로서는, 원심분리법이 사용된다.
배지로부터 액체 성분을 채취하는 시기는, 연골세포를 포함한 세포군의 단리 후, 배양 전, 배양 중, 배양 후, 배양 종료 시, 초대배양 중, 계대배양 전, 계대배양 후, 계대배양 중, 재생 연골 형성 전, 재생 연골 형성 후, 재생 연골의 이식 전 및 재생 연골의 이식 후 중에서 선택되는 적어도 하나의 시기일 수 있다. 예컨대, 연골세포를 포함한 세포군을 단리한 직후, 완충액 중에 세포군을 현탁하여, 얻어진 현탁액 중의 액체 성분이 채취된다. 단리 직후에 액체 성분을 채취하여, GFAP량의 측정에 제공하는 경우, 단리된 세포군에 있어서의 연골세포의 순도를 조사할 수 있다. 세포군의 단리 직후에 더하여, 예컨대 배양 중 및/또는 재생 연골의 형성 후, 이식의 직전에 액체 성분을 채취하여, 하기의 측정에 제공할 수도 있다. 이식 직전에 액체 성분을 채취하여 측정에 제공하는 경우, 재생 연골의 품질을 관리할 수 있다.
다음으로, 이렇게 하여 분리된 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량을 측정한다. GFAP 함유량을 측정하는 방법은, GFAP량을 측정하는 것이 가능한 그 자체 공지된 임의의 방법이다. 예컨대, GFAP 함유량을 측정하는 방법은, ELISA법, PR-PCR법 및 웨스턴 블로팅(western blotting)법이다.
계속해서, 전술한 바와 같이 하여 측정된 GFAP 함유량에 근거하여, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 판단한다. 예컨대, 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량이 액체 성분 1mL당 0.05ng 이상인 경우, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골이 이식에 적합하다고 판단된다. 바람직하게는, 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량이 액체 성분 1mL당 0.5ng 이상인 경우, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골이 이식에 적합하다고 판단된다. 보다 바람직하게는, 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량이 액체 성분 1mL당 5ng 이상인 경우, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골이 이식에 적합하다고 판단된다.
액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량이 액체 성분 1mL당 0.05ng 이상이면, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 또는 얻어진 재생 연골은, 이식 후, 연골로서 생착하고, 바람직하게는 왕성한 연골 재생을 나타낸다. 한편, GFAP 함유량이 액체 성분1mL당 0.05ng 미만인 경우, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 재생 연골은, 이식 후, 연골로서 생착하지 않거나, 원하는 연골 재생을 나타내지 않을 가능성이 높다.
이식에 적합하다고 판단된 세포군은, 그 후, 이하에 설명하는 재생 연골의 형성에 사용된다. 한편, 이식에 적합하지 않다고 판단된 세포군은 재생 연골의 형성에 사용되는 경우는 없다.
또한, 재생 연골에 대하여 상기 평가를 행한 경우로서, 재생 연골이 이식에 적합하지 않다고 판단된 경우, 그 재생 연골은 이식되는 경우는 없다.
6. 재생 연골의 형성
재생 연골은, 배지의 존재하에 방치된 연골세포를 포함한 세포군을 사용하여 형성된다. 여기서 사용되는 세포군은, 전술한 바와 같이 하여, GFAP 함유량에 근거하여, 세포군으로부터 얻어질 수 있는 재생 연골이 이식에 적합하다고 판단된 세포군이다.
예컨대, 재생 연골은, 연골세포를 포함한 세포군을 3차원 배양하는 것에 의해 형성된다. 3차원 배양은 스캐폴드(scaffold) 소재를 사용하여 실시된다. 구체적으로는, 3차원 배양은, 스캐폴드 소재의 위 또는 내부에서 연골세포를 배양하는 것에 의해 실시된다. 사용되는 스캐폴드 소재의 재료, 성상, 형상, 구조, 크기 등은 제한되지 않고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 스캐폴드 소재의 재료는, 예컨대 아텔로콜라겐, 피브린, 히알루론산 및 생분해성 폴리머 다공체이다. 생분해성 폴리머 다공체는, 예컨대 PLLA, PGA 및 PLGA이다. 스캐폴드 소재는, 임의의 공지된 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 3차원 배양은, 또한, 겔화제를 사용하여 실시되어도 좋다. 예컨대, 겔화제와 연골세포를 포함한 세포군을 혼합하여, 스캐폴드 소재에 접촉시킴으로써, 안정된 3차원 배양을 행하여, 안정된 재생 연골을 얻는 것이 가능하다. 겔화제는, 예컨대 아텔로콜라겐 및 알지네이트이다. 3차원 배양은, 예컨대 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간의 조건하에 실시된다.
이상과 같이 하여, 이식에 적합한 재생 연골이 제조된다.
이렇게 하여 제조된 재생 연골은 어느 정도의 크기를 가지고, 임플란트로서 사용할 수 있는 것이 바람직하다. 재생 연골은, 현탁액 형태 또는 고체 형태일 수 있지만, 고체 형태인 것이 바람직하다.
제조된 재생 연골은, 예컨대 연골 결손 또는 연골 손상 부위를 보충 또는 보강하기 위한 의료용 이식소재로서 사용할 수 있다. 특히, 선천성 형태형성 이상, 예컨대 구순구개열(口唇口蓋裂)의 코 변형을 위한 의료용 이식소재로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 재생 연골은 미용 성형용 이식소재로서 사용할 수도 있다.
연골 재생 의료는 주로, (1)환자로부터의 연골 채취, (2)연골세포의 단리와 배양, (3)배양 연골세포의 회수 또는 재생 연골의 형성, (4)환자에의 이식의 4개의 프로세스를 포함한다. 2번째의 연골세포의 단리와 배양은 세포 프로세싱 센터(processing center)라는 특수한 시설에서 실시되는 재생 의료제품 제조를 위한 본질적 부분이다. 따라서, 가장 엄밀한 품질관리가 요구되는 공정이기도 한다.
종래, 연골세포 이외의 다른 세포의 혼입이나 연골세포의 과증식 때문에, 재생 연골의 품질이 보증되지 않고, 예정된 의료를 환자에게 제공할 수 없거나, 또는 이식 후 연골형성이 저하된다고 하는 문제가 생기고 있었다. 다른 세포의 혼입은, 연골세포의 순도를 나타내는 지표가 미확립이기 때문에 판별할 수 없었다. 다른 세포는 연골세포의 증식 및 세포집단의 연골로의 분화를 방해한다. 또한, 연골세포의 과증식은, 배양한 세포집단의 탈분화를 현저히 진행시키고, 그 결과, 연골로서의 특성의 감약화를 발생시킨다. 과증식은, 단리 시의 연골세포수의 정확한 계측이 곤란하기 때문에 생기고 있었다. 즉, 단리 시의 연골세포수를 실제보다도 과다하게 견적하여, 계대배양에 의해 목표로 하는 세포수를 입수한 결과, 연골세포의 과증식을 발생시키고 있었다.
전술한 재생 연골을 평가하는 방법에 의하면, 배양 연골세포로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 재생 연골의 연골 특성을 평가할 수 있기 때문에, 전술한 바와 같이 종래 생기고 있었던 문제를 해결할 수 있다. 구체적으로는, 상기 평가방법은, GFAP 함유량을 측정함으로써 세포군에 있어서의 연골세포의 순도를 나타내는 정량적인 지표를 얻을 수 있기 때문에, 다른 세포가 연골세포를 구축하는 정도의 양으로 포함되어 있는 세포군을 배제할 수 있다. 그리고, 연골세포를 포함한 세포군을 사용하여 제조되는 재생 연골은, 이식에 적합한지의 판단이 이루어지고 있기 때문에, 이식 후, 체내에서 연골형성이 저하된다고 하는 상황을 회피할 수 있다.
또한, 연골 특성의 평가에는, 연골세포를 포함한 세포군을 사용하는 것이 아니고, 배지로부터 분리되고 또한 연골세포를 포함하지 않는 액체 성분, 예컨대 배양 상청을 사용하고 있다. 그 때문에, 재생 연골제품의 귀중한 원재료가 되는 세포를 손상하는 일이 없다고 하는 점에서, 재생 연골의 제조에 있어서 매우 유리하다.
게다가, 전술한 연골 특성의 평가방법을 사용하여 제조된 재생 연골은, 품질이 보증되어 있다. 그 때문에, 이러한 재생 연골은 의료용 및 미용용 이식소재로서 안전하게 사용할 수 있다.
[예]
이하, 본 발명의 예에 대하여 설명한다.
<실시예 1>
예 1. 재생 연골제품의 구성세포가 이개 연골세포인 것을 판정하기 위한 지표의 검토
재생 연골제품의 제조에 이용하는 배양 후 1000배 증식한 이개 연골세포에서 고발현하는 유전자를 이하의 방법에 의해 검색했다.
이개 연골세포, 섬유아세포, 피부 각화세포, 기관 상피세포, 관절 연골세포, 늑연골세포, 아스트로사이트(성상교세포)에 대하여, 단층 배양법에 의해 약 1주일에 1회 계대하여, 장기 연속 계대배양을 실시했다. 제2계대(PS) 및 제8계대(P8)의 시점에서 각 배양 세포로부터 Total RNA를 채취하여, Affymetrix사제 GeneChip(등록상표) Human Genome U133 plus Array를 이용한 마이크로어레이법에 의해, 각각의 세포에서 고발현하고 있는 유전자를 검색했다.
그 결과, 섬유아세포 증식인자(FGF)-18, 글리아세포 섬유성 산성 단백질(GFAP) 등의 유전자가 검출되었지만, 그 중에서도 특히 발현이 높은 유전자는 GFAP 유전자였다.
또한, GFAP 유전자의 발현량을 Real Time PT-PCR법에 의해 측정했다. 각 세포에 대하여 3샘플의 측정을 행하여, 측정치의 평균과 표준편차를 얻었다.
각 세포에 대하여 얻은 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1로부터, GFAP의 발현량은, 이개 연골세포, 섬유아세포, 피부 각화세포, 기관 상피세포, 관절 연골세포, 늑연골세포 및 아스트로사이트 중, 이개 연골세포에서 현저히 높다는 것이 나타났다.
이 결과로부터, GFAP를 검출함으로써, 배양 중에 이개 연골세포가 섬유아세포에 의해서 구축되어, 의도하지 않게 섬유아세포가 투여되어 버린다고 하는 리스크를 제외할 수 있다는 것이 시사되었다.
예 2. GFAP 유전자의 연골기질 생산의 지표로서의 적성의 검토
유래가 다른 6예의 이개 연골세포를 5% 혈청 및 FGF-2 및 인슐린 함유 DMEM/F12 배양액에서 약 1주일에 1회 계대하여, 단층 배양법으로 제8계대(P8)까지 장기 연속 계대배양했다. 기질 생산량이 풍부한 배양 후 100배 증가 정도의 이개 연골세포(P2)와 1억배 정도의 세포(P8)의 시점에서 배양 세포로부터 Total RNA를 채취하여, GFAP 유전자의 발현량을 Real Time PT-PCR법에 의해 측정했다.
결과를 도 2에 나타낸다. 도 2로부터, 전체 예에서 P2의 발현이 높다는 것이 나타났지만, 같은 배양조건에서 배양했음에도 불구하고, P2에서의 유전자 발현은 카피(copy)수로 7.2×103 내지 1.321×106으로, 세포 사이에 매우 격차가 크다는 것이 나타났다.
여기서, 측정상의 격차를 억제하기 위해, 단백 레벨에서의 평가를 검토했다.
예 3. 단백질 레벨에서의 GFAP의 발현 측정
제공자가 다른 18예의 인간 이개 연골세포에 대하여, 5% 혈청 및 FGF-2 및 인슐린 함유 DMEM/F12 배양액에서 약 1주일에 1회 계대하여, 장기에 걸친 배양을 제3계대까지 실시했다. 배양한 이개 연골세포를 트립신 처리하여 회수하고, 1×107세포/mL의 농도로 1% 아텔로콜라겐 겔에 혼화했다. 이 세포 혼화 겔을 20㎕씩 시험관에 나누어 넣고, 골형성 단백질(BMP-2(Bone morphogenetic protein-2), 인슐린(insulin), 갑상선호르몬(T3(Triiodothryonine))를 포함하는 BMP-2/insulin/T3 함유 연골세포 기질 생산 유도 배지에서 고밀도 포매(包埋)배양을 실시했다. 3주간 후, 연골세포가 분비된 GAG량 및 COL2량을 비색법 및 ELISA법에 의해 측정했다. 또한 아텔로콜라겐에 포매한 것과 동일한 P3 배양 연골세포를 1×104 세포 분취하여, 이 세포 용해액 중의 GFAP량을 ELISA법으로 측정했다. 제공자가 다른 18예의 이개 연골세포로 동일 시험을 행하여, 배양 세포가 분비된 GAG량, COL2량과 세포중 GFAP량의 상관을 SSRI사제 엑셀 통계에 의해 계산했다. 결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다.
도 3 및 도 4로부터, 세포 중 GFAP량과 GAG의 상관계수는 0.507, COL2와의 상관계수는 0.590이며, 양 값 사이에는 중 정도의 상관이 있다는 것이 나타났다. 이것으로부터 재생 연골을 구성하는 연골세포의 GFAP를 단백질 레벨로 측정함으로써, 연골세포의 기능적인 평가가 가능해진다는 것이 시사되었다.
예 4. GFAP 함유량을 평가하기 위한 샘플의 검토
제공자가 다른 18예의 이개 연골세포에 대하여 제3계대(P3)까지 배양하고, 배양한 이개 연골세포를 트립신 처리에 의해 회수하고, 1×107세포/mL의 농도로 1% 아텔로콜라겐 겔에 혼화했다. 이 세포 혼화 겔을 20㎕씩 시험관에 나누어 넣고, BMP-2/insulin/T3 함유 연골세포 기질 생산 유도 배지에서 고밀도 포매배양을 실시했다. 3주간 후, 연골세포가 분비된 GAG량 및 COL2량을 비색법 및 ELISA법에 의해 측정했다. 또한 아텔로콜라겐에 포매한 것과 동일한 P3 배양 연골세포의 배양 상청을 일부 분취하여, 이 배양 상청에 함유되는 GFAP량을 ELISA법에 의해 측정했다. 제공자가 다른 18예의 이개 연골세포로 동일 시험을 행하여, 배양 세포가 분비된 GAG량, COL2량과 배양 상청 중 GFAP량의 상관을 계산했다. 결과를 도 5 및 도 6에 나타낸다.
도 5 및 도 6으로부터, 배양 상청 중 GFAP량과 GAG의 상관계수는 0.767, COL2와의 상관계수는 0.735이며, 양 값 사이에는 강한 상관이 있다는 것이 나타났다. 또한, 배양 상청 중의 GFAP 함량이 높으면 높을수록, 왕성한 연골 재생이 나타났다.
따라서, 배양 상청의 일부를 채취하여, GFAP량을 ELISA로 측정함으로써, 세포나 조직을 손상함이 없이, 출하 판정할 수 있다는 것이 나타났다.
예 5. 연골 특성의 평가를 위한 GFAP 단백질량의 역치 결정
제2계대(P2)의 배양 이개 연골세포 및 배양 섬유아세포를 각각 3예, 연골 증식배지에서 5% 혈청 및 FGF-2 및 인슐린 함유 DMEM/F12 배양액에서 1주일 배양을 행했다. 이 배양 세포로부터 배양 상청을 1mL 분취하고, 그 후 트립신 처리에 의해 배양 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1×108세포/mL의 농도로 1% 아텔로콜라겐 겔에 혼화한 것을 다공체형 스캐폴드 소재에 투여하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션하여 겔화시켰다. 이것을 누드 마우스 등부분 피하에 이식했다.
2개월 후, 이식물을 적출하여, 반으로 나누어 한쪽은 톨루이딘 블루 염색에 의한 조직학 평가에 이용했다. 다른 한쪽은 GAG량, II형 콜라겐량의 단백질 정량평가에 이용했다. 분취한 배양 상청이 함유하는 GFAP량은 ELISA법으로 측정했다. 결과를 도 7 및 도 8 내지 13에 나타낸다.
도 7의 배양 상청 중의 GFAP량의 결과 및 도 8 내지 13의 조직학적 평가로부터, 이개 연골세포의 전체 예에서, 배양 상청으로부터 GFAP가 검출되고, 누드 마우스 이식에 의해 연골형성이 보인다는 것이 나타났다. 한편, 섬유아세포에서는 전체 예에서 GFAP는 검출되지 않고, 연골형성도 볼 수 없었다.
또한, 도 7 내지 13으로부터, 이식 후에 연골형성하고 또 왕성한 연골 재생을 나타낸 배양 인간 이개 연골세포에서는, 배양 상청 중에 GFAP가 적어도 0.05ng/mL 이상 존재하고 있다는 것이 나타났다. 이들로부터, 배양 상청에 GFAP가 0.05ng/mL 이상 포함되면, 재생 연골을 형성하는 배양 인간 이개 연골세포가 함유되어 있다는 것이 시사되어, 배양 상청 중에 포함되는 GFAP량의 값을 재생 연골의 품질 판정의 기준으로서 이용할 수 있다는 것이 분명해졌다.
<실시예 2>
이하의 순서에 따라서, 재생 연골이 제조되었다. 도 14는 당해 재생 연골의 제조공정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
환자 이개 연골의 일부(약 1cm×5mm×2mm)을 채취하고, 콜라게나제 처리에 의해 연골세포를 단리했다. 단리한 연골세포는, 5% 자기혈청 및 FGF-2, 인슐린 함유 DMEM/F12 배양액에서 약 3 내지 6주간 배양한다. 배양하여, 약 1000배의 세포수로 증식시킨 세포를 회수했다. 회수한 배양 연골세포를 PLLA제 스캐폴드 소재에 투여하여, 재생 연골을 형성했다(도 14).
한편, 배양 후 39일(이식 3일전)에서 배양액 검사로서, ELISA를 이용하여 배양 상청 중에 함유되는 GFAP의 단백 농도를 측정했다. 배양 후 39일(이식 3일전)에서, 배양 상청 중에 GFAP가 0.05ng/mL 이상 포함되는 것을 확인함으로써, 안전하게 이식 가능하고, 이식 후, 체내에서 연골을 형성하고, 재생 연골로서 생착 가능하다고 판단했다.

Claims (7)

  1. 이개 연골세포를 포함한 세포군을 배지의 존재하에서 방치하는 것,
    그 후, 상기 배지로부터 액체 성분의 적어도 일부를 채취하는 것,
    채취한 상기 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량을 측정하는 것, 및
    상기 GFAP 함유량에 기초하여 상기 세포군으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 판단하는 것
    을 포함하는 재생 연골의 평가방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 판단은, 상기 GFAP 함유량이 상기 액체 성분 1mL당 0.05ng 이상인 경우에, 이식에 적합하다고 판단하는 재생 연골의 평가방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 판단은, 상기 GFAP 함유량이 상기 액체 성분 1mL당 0.5ng 이상인 경우에, 이식에 적합하다고 판단하는 재생 연골의 평가방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 판단은, 상기 GFAP 함유량이 상기 액체 성분 1mL당 5ng 이상인 경우에, 이식에 적합하다고 판단하는 재생 연골의 평가방법.
  5. 이개 연골세포를 포함한 세포군을 배지의 존재하에서 방치하는 것,
    그 후, 상기 배지로부터 액체 성분의 적어도 일부를 채취하는 것,
    채취한 상기 액체 성분에 포함되는 GFAP 함유량을 측정하는 것,
    상기 GFAP 함유량에 기초하여 상기 세포군으로부터 얻어지는 재생 연골이 이식에 적합한지 여부를 판단하는 것, 및
    재생 연골을 형성하는 것
    을 포함하는 재생 연골의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 재생 연골을 형성하는 것이, 스캐폴드 소재를 이용하여 연골세포를 3차원 배양하는 것을 포함하는 재생 연골의 제조방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 제조방법에 의해 제조되는 재생 연골.
KR1020137018892A 2011-01-19 2012-01-17 재생 연골의 평가방법 KR101555768B1 (ko)

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