KR20220047811A - 유리질 연골 조직의 시험관내 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 연골 조직의 시험관내 생산을 위한 신규한 방법, 및 이와 같이 생산된 연골 조직을 사용하는 치료적 용도 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

유리질 연골 조직의 시험관내 생산 방법
본 발명은 유리질 연골 조직(cartilage tissue)("카르티비드(Cartibead)")의 시험관내 생산을 위한 신규한 방법, 및 이렇게 생산된 연골 조직을 사용한 치료적 용도 및 스크리닝(screening) 방법에 관한 것이다.
유리질 연골은 연골세포라고 하는 특수 세포로 구성되어 있고, 세포외 매트릭스로 둘러싸여 있다. 이 매트릭스는 연골세포에 의해 합성 및 분비되고, 주로 유형 II 콜라겐 섬유, 글리코스아미노글리칸(GAG) 및 60-80%의 물로 구성된다. 유리질 연골은, 연골하골 상부의 표층, 중간층, 심층 및 석회화 층의 4개 층이 있다. 관절 연골의 생체역학적 특성은 세포외 매트릭스의 구성과 완전성에 크게 의존한다.
연골은 자가 복구 능력이 매우 제한적이고, 손상시 종종 골관절염(OA)으로 전개한다. 노화 및 반복적 외상(예: 집중적 스포츠의 연습 중에 발생)은 무릎의 연골 변성의 주요 위험 인자이다. OA는 다수의 사람들에게 영향을 미치고, 고령자에서 가장 빈번하게 발생하지만(60세 이상 사람의 유병률 >10%), 젊은 사람들은 일반적으로 관절 손상 후의 OA에 영향을 받는다.
외과적 치료에는 인공관절에 의한 관절 치환술이 포함된다. 그러나, 인공관절의 수명은 15~20년으로 제한된다. 추가로, 대다수의 환자에서 통증 완화는 완전히 경감되지 않고; 무릎 인공관절을 갖는 환자의 20~30%는 여전히 불쾌함 또는 통증을 지속한다. 치료는 주로 완화적이고, 통증 완화를 목적으로 한다. 중간엽 줄기 세포, 히알루론산 또는 혈소판 풍부 혈장 주사 등의 일부 생물학적 약제는 관절 열화를 지연시킬 수 있지만, 조직의 재생을 촉진하지는 않는다.
현재, 결함을 메우기 위해 외부 및 합성 스캐폴드를 사용하는 전략은 만족스럽지 않고, 관절 연골의 생체역학적 특성을 불완전하게 모방한다. 고전적 치료법에는 줄기 세포의 병변 부위로의 이동을 자극하는 미세-골절 수술 또는 연골세포의 직접 이식이 포함된다.
미세골절 수술은 연골 내의 골 수질로부터 중간엽 줄기 세포의 이동을 자극하여 새로운 연골세포를 형성하고 손상된 조직을 치환하는 것을 목적으로 하여, 연골 하골에 작은 구멍을 내는 것으로 구성된다.
자가 연골세포 이식(ACI)에서는 연골세포를 연골로부터 추출하고, 제한된 수의 계대에서 배양하고, 병변에 이식했다. 이 방법을 개선하기 위해, 연골세포를 배양하기 위한 유형 I/III 돼지 콜라겐 또는 히알루론산 등의 매트릭스를 사용할 수 있다[참조: Kon E, et al., 2009, American Journal of Sports Medicine 37(1):33-41; Hettrich CM, Crawford D, & Rodeo SA, 2008, 16(4):230-235]. 이러한 매트릭스는 미세골절 수술 후에 병변에 직접 적용되거나, 재이식 전에 연골세포를 배양하기 위해 시험관내에서 사용된다[참조: Ekkers JE, et al. 2013, Osteoarthritis Research Society 21(7):950-956].
자가 연골세포 이식(ACI)을 사용한 세포-기반 요법은 2제곱센티미터 초과의 큰 연골 병변에 대해 표시된다[참조: Armoiry X. et al. 2019, Pharmacoeconomics 37, 879-886]. 연골세포는 연골 재생을 위한 논리적 세포 공급원을 나타낸다. 실제로, 이러한 유형의 연골 세포만이 유리질 연골 기질의 유지에 관여한다.
주요 문제는 연골세포가 배양 중에 섬유아세포-유사 세포(fibroblastic-like cell)로 탈분화되는 경향이 있고, 통상 2차원 세포 배양 시스템에서 2회차 또는 3회차 세포 계대에서 기능이 급속히 소실된다는 것이다[참조: Munirah, S. et al. 2010. Tissue & cell 42, 282-292]. 탈분화된 연골세포는 글리코스아미노글리칸(GAG)의 손실, 및 유리질 연골의 주성분인 유형 II 콜라겐의 생성을 특징으로 하고[참조: Wu, L. et al. 2014. Tissue Eng Part C Methods 20, 160-168; Benya, P. D et al. 1978. Cell. 15, 1313-1321], 이는 섬유연골에 존재하는 유형 I 콜라겐으로 치환되어 있다. 실제로, 증폭 단계에서, 연골세포는 원래 표현형을 상실함으로써 탈분화하고, 유전자 발현(중간엽 줄기 세포(MSC)의 특성화에 사용되는 CD73, CD90, CD105 등의 세포 표면 마커의 발현)에서 줄기 세포-유사 특징을 갖는 섬유아세포-유사 세포(신장 세포)로 되는 경향이 있다. 예를 들면, 환자의 관절 연골로부터 추출한 연골세포는 시험관내 배양에서 수회 계대 후에 특정 유리질 매트릭스(hyaline matrix) 연골을 합성하는 연골형성 능력을 신속하게 상실한다. 섬유연골은 유리질 연골과는 생체역학적으로 상이하고, 기능부전 수복을 유도하기 때문에, 효과적인 장기 치료로서 간주되지 않는다. 대조적으로, 연골세포 유리질 특성은, 생체내 환경을 모방하는 3차원 배양 시스템[참조: Benya, P. D. & Shaffer, J. D. 1982. Cell 30, 215-224]에서 보존되는 것으로 공지되어 있다.
배양에서 연골형성 능력의 상실은 특히 고령 환자에게 해당된다. 따라서, 연골세포 기반 세포 요법의 또 다른 과제는 고령 환자로부터 세포를 확장하고 분화하는 것이 곤란하고, 이 모집단에서 이들의 사용을 제한한다는 것이다. 결과적으로, 대부분의 임상 시험은 환자의 포함을 55세로 제한한다.
연골세포를 사용하여 연골을 생산한다는 아이디어는 원래 표현형의 유지와 함께 세포 증폭을 수행될 수 있다면 의미가 있다. 따라서, 모든 연령대의 환자에게 고유한 특성을 모방하는, 고품질 유리질-유사 연골 조직(높은 수준의 GAG 검출을 특징으로 함)을 생성하는 연골 생산을 위한 표준화 방법을 개발할 필요성이 남아 있다.
본 연구의 주요 성과는 확장 중의 연골세포 표현형의 상실(연골세포의 탈분화)을 역전시킬 수 있는 방법이다. 이것은 연골세포를 출발 물질로 사용하는 세포 치료에서 직면하는 중요한 문제를 해결한다. 현재의 데이터는 환자의 연령과 관절의 관절염 상태에 관계없이 신규한 3단계 방법으로 유리질 특성을 갖는 고품질의 연골을 생성할 수 있음을 입증한다.
카르티비드(Cartibead) 방법에서는, 종래의 인간 연골세포-기반 세포 요법에서 평균 260mg인 것과 대조적으로, 연골 채취의 매우 소량의 샘플(전임상 미니피그 연구에서 약 30mg)로부터 세포 확장이 가능하고[참조: Brittberg, M. 2018. Injury 39 Suppl 1, S40-49] 이는 공여자 부위의 이환율을 감소시킨다. 본 방법은 이전에 보고된 연골 미세조직보다 20배 더 높은 GAG/카르티비드의 비율을 나타내고, 이는 이러한 연골 미세조직이 덜 유리질성이고 더 많은 섬유연골을 함유하는 것을 시사한다[참조: Bartz, C. et al. 2016. J Transl Med 14, 317]. 이러한 결과와 일치하여, 본 발명자들은, 평균하여, 기타 공개된 방법보다 평균적으로 적어도 3배 더 높은 GAG/DNA 비율을 수득했다(도 2B)[참조: Mumme, M. et al. 2016. Lancet 388, 1985-1994; Dang, P. N et al. 2014. Tissue engineering. Part A 20, 3163-3175).
재분화는 FGF-2의 제거로 인한 것이다. 그러나, 3D 배양에서의 제거는 2-단계 방법에서 유리질 매트릭스 합성을 유도하기에 충분하지 않았다. 연골세포의 재분화에는 매트릭스 코팅 플라스크에 대한 세포 부착 및 2D 배양에서 특정 세포 신호전달 경로(signaling pathway)의 유도가 필요할 가능성이 가장 높다.
본 발명자는 배양물 중의 연골세포를 증폭하고 이를 환자 연령과 관계없이 연골의 소편(약 30mg)으로부터 이들의 연골형성 능력을 회복시키기 위한 신규한 방법을 개발했다. 제1 단계에서, 세포는 FGF-2의 서포트에 의해 세포외 매트릭스에서 2차원 배양으로 증폭시키고, 이어서 세포 증폭에 사용되는 FGF-2를 제거함으로써 제2 단계에서 원래 표현형에 대해 사전-재분화시킨다. 최종 단계에서, 완전한 재분화는 미세조직을 형성하기 위해 자발적 세포 응집을 수반하는 3차원(3D) 배양으로 달성된다. 특히 2D 배양의 제2 단계에서 FGF-2 성장 인자를 제거함으로써, 본 발명자는 놀랍게도, 연골세포가 GAG와 관련된 단백질인 아그레칸(aggrecan)을 합성함으로써 원래 기능을 회복하기 시작하고, 제3 단계에서 FGF-2 제거를 유지함으로써 콜라겐 II가 GAG의 조합으로 합성되어 관절 연골에 특이적인 유리질 매트릭스를 생성하는 것을 밝혀냈다. 본 발명자는 추가로, FGF-2의 제거가 Wnt 신호전달 경로, 바람직하게는 증폭 단계 후의 Wnt7B 신호전달의 불활성화를 유도하고, 따라서 생체내 연골을 고도로 대표하는 균질한 유리질 연골의 생산을 가능하게 하는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 Wnt7B가 탈분화 배지(ME)에서 활성화되고, 재분화전 배지(MR)에서 적어도 10배, 성숙 배지(MI)에서 적어도 40배 감소한다는 것을 밝혀냈다. 천연 연골의 특성에 가능한 한 유사한 특성을 구비한 고품질 유리질 미세조직의 이식은 연골 병변의 치료에서 장기적 성공을 예상하기 위한 열쇠이다[참조: Negoro, T et al. 2018.. npj Regenerative Medicine 3, 17; Madeira, C et al. 2015. Trends in biotechnology 33, 35-42].
따라서, 조작된(engineered) 연골("카르티비드")은 이식 후의 연골 병변에 완전히 통합될 가능성이 높다.
따라서, 본 발명은 연골 조직의 시험관내 생산 방법으로서, 바람직하게는 대상체(subject)로부터, 보다 바람직하게는 인간 또는 말(horse) 대상체의 연골 조직으로부터 단리된 연골세포를, Wnt 신호전달 경로를 활성화하여 섬유아세포-유사 세포를 수득하는 탈분화 배양 배지(dedifferentiation culture medium) 중의 부착성 배양 시스템(adherent culture system) 상에서 바람직하게는 10 내지 15일 동안 배양하는 제1 단계; Wnt 신호전달 경로를 불활성화하여 연골세포를 수득하는 재분화 배양 배지 중의 부착성 배양 시스템 상에서 바람직하게는 4 내지 8일 동안 상기 섬유아세포-유사 세포를 배양하는 제2 단계; 및 Wnt 신호전달 경로를 불활성화시키는 성숙 배양 배지 중의 3차원 배양 시스템에서 바람직하게는 10 내지 15일 동안 상기 제2 단계에서 수득된 상기 연골세포를 배양하는 제3 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 탈분화 배양 배지는 FGF-2를 포함하고, 바람직하게는 상기 재분화 배양 배지 및/또는 성숙 배양 배지는 FGF-2 비함유 배지이다. 상기 탈분화 배양 배지는 PDGF-BB, TGF-β 및 EGF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성장 인자를 포함할 수 있다. 상기 재분화 배지 및 성숙 배양 배지는 TGF-β, 바람직하게는 TGF-β3, 보다 바람직하게는 TGF-β3 및 FGF-7을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 재분화 배지는 혈소판 용해물을 포함할 수 있다. 특히, 상기 기재된 바와 같은 모든 배양 배지는 혈청을 포함할 수 있다. 상기 성숙 배지는 인슐린, IGF-1, BMP-2, 셀레늄, 트랜스페린 및 에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 연골세포는 10% 미만의 O2(v/v)를 포함하는 저산소 대기(hypoxia atmosphere)에서 제3 단계에서 배양된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 적어도 15의 GAG/이본쇄(double strand) DNA 비율을 나타내는 구상(spheroid)(Cartibead) 형태의 조작된 연골 조직에 관한 것이다. 상기 조작된 연골 조직은 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결함 및 연골 변성 질환의 치료, 바람직하게는 자가 이식에서 사용될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한, 상술한 바와 같이 조작된 연골 조직을 하나 이상의 후보 분자(candidate molecule)와 접촉시키고, 연골 변성 공정(process)을 억제하는 분자를 선택하는 것을 포함하는, 연골 변성 공정을 억제하는 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
도 1. 3단계 방법으로 설계된 카르티비드의 특성화. a, 탈분화된 연골세포로부터 유래하는 카르티비드를 생성하기 위한 3단계 방법의 도식: 단계 1(확장), 단계 2(재분화)는 2D 및 산소(21%)의 대기 조건에서 수행하고, 단계 3(카르티비드 형성)은 3D 배양 및 산소(5%)의 저산소 조건에서 수행되었다. b, 전임상 연구의 도면: SCID 마우스에서의 안전성과 미니피그에서의 효능을 평가하기 위한 인간 카르티비드의 사용. c, 고정된 샘플로부터 카르티비드의 조직학적 분석. GAG의 사프라닌-O 염색(상부 패널) 및 유리질 연골을 특징으로 하는 유형 II 콜라겐의 강력한 면역 검출(DAB 염색, 중간) 및 3명의 독립적 공여자로부터 수득된 카르티비드의 약한 유형 I 콜라겐 검출(하부 패널)의 대표적 이미지. 스케일 바 200㎛. d, 15명의 공여자(흑색 도트) 및 3명의 천연 연골 대조군(사각형)으로부터, 디메틸메틸렌 블루 검정(DMMB)으로 측정한, μg/mg 조직으로 표시된 카르티비드의 글리코스아미노글리칸(GAG) 함량의 생화학적 정량화. e, 카르티비드의 생체역학적 특성은 카르티비드의 탄성을 측정하는 압축 시험(영률)에 의해 결정된다. 응력-변형률 곡선은 3명의 공여자로부터 표시되고, 보다 큰 카르티비드에서 제약의 증가를 나타낸다.
도 2. 모든 공여자로부터의 카르티비드에서 GAG의 양. a, DMMB 검정에 의한 카르티비드당 GAG 함량의 생화학적 정량화. b, GAG/DNA 비율(μg/μg)로 표시된, DNA 함량으로 정규화된 카르티비드의 GAG 함량의 생화학적 정량화.
도 3. 높은 산소 수준과 낮은 산소 수준, 및 3단계 및 2단계 방법에서 생성된 카르티비드의 비교. a, 3명의 공여자에 대해 저산소 조건에서 3단계 방법으로 생성된 카르티비드의 거시적 관찰. b, 카르티비드 섹션에서 GAG의 사프라닌 O 염색은 1명의 공여자에 대해 4개의 상이한 조건하에 생성되었다. 카르티비드는 높은 산소 수준과 낮은 산소 수준(21% 및 5%)의 배양 조건하에 3단계 및 2단계 방법으로 생성되었다. 사진은 3명의 공여자를 대표한다. 스케일 바 200㎛. c, 4개의 상이한 조건하에 3명의 공여자에 대한 GAG/카르티비드의 양 평가.
도 4. 카르티비드의 안정성. a, 3단계 방법의 완료 후 카르티비드 및 폐쇄된 수용자에서 37℃(5% O2의 인큐베이터) 및 4℃ 및 실온(RT)에서 추가로 6일 동안 방치된 카르티비드에서 GAG의 생화학적 정량화. b, 카르티비드 내부의 사멸 세포의 수는 적색 형광 염료 염색에 의해 정량적으로 평가했다. 사멸 세포에 대한 양성 대조군은 형광 염색 전에 10% 트리톤으로 사전 처리된 카르티비드였다. 스케일 바 100㎛.
도 5. 2단계 방법과 비교한 3단계 방법으로부터 조작된 카르티비드의 유리 질 특성의 개선. a, 카르티비드를 생성하기 위한 2단계 방법의 도식. 연골세포는 배지 E의 단계 1에서 확장되었고, 카르티비드 생성을 위해 배지 I의 단계 2에서 직접 사용되었다. b, 3단계 대 2단계 발현에 기반한 유전자 세트 농후화 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 유의한 농축이 발견된 각 유전자 패밀리에 대한 유전자 수를 나타낸다. 연회색에서는, 3단계 방법으로부터 카르티비드에서의 발현 수준이 더 높은 유전자, 암회색에서는, 발현 수준이 더 낮은 유전자. c, 통계적 유의성(FDR<0.001) 대 변화의 크기(>2배 변화)를 나타내는 볼케이노 플롯을 사용한 RNAseq 결과의 시각화. 볼케이노 플롯은, 2단계 및 감소되는 COL1A1과 비교하여 3단계 방법에서 증가되는 ACAN, COL2A1 등의 통계적으로 유의한 배수 변화를 수반하는 유전자를 강조 표시한다. ***p<0.001; **p<0.01 d, e, f 3단계 및 2단계 방법에서 ACAN(d), COL2A1(e) 및 COL1A1(f) 유전자에 대한 mRNA 발현 수준(RPKM 내)을 비교하는 RNASeq 분석으로부터의 데이터. NA(해당 없음)는 단계 자체의 부재에 기인하는 분석의 부재를 지칭한다. g, 3-단계 방법과 2-단계 방법으로 제조된 카르티비드 중의 GAG의 사프라닌-O 염색. 스케일 바 100㎛
도 6. MSC 마커 발현. a, CD73, CD90 및 CD105를 각각 좌측으로부터 우측으로 나타내는 유세포 분석. b, 지방 줄기 세포(ASC), 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 골세포, 지방세포 및 연골세포를 제공하는 연골세포 잠재력을 비교하는 분화 연구. 알리자린 레드 S는 성숙한 골세포의 지표인 칼슘 침착물의 염색에 사용되는 염료(상부 패널), 지방세포의 오일 레드 O 염색된 중성 지질 특성(중앙 패널) 및 연골세포의 사프라닌-O 염색된 GAG(하부 패널)이다. 스케일 바 100㎛.
도 7. WNT 신호전달의 억제는 유리질 매트릭스 성분의 생산을 증강시킨다. a, 3단계 방법에서 배지 R 대 배지 E의 차등적 발현 수준을 기반으로 하는 유전자 세트 농후화 분석 및 기능적 그룹화. 그래프는 각 유전자 패밀리에 대한 농후화를 나타낸다(차등적으로 발현되는 유전자의 수). ***p<0.001; **p<0.01 b, RNAseq의 볼케이노 플롯은 3-단계 방법에서 배지 R 대 배지 E의 연골세포로부터 수득된다. c. RNAseq 분석으로부터의 데이터는 ki67(증식 마커)(상부 패널). TCF4(wnt/베타 카테닌 경로의 하류에 관여)(중간 패널), SOX9(매트릭스 생산에 관여하는 전사 인자)(하부 패널)에 대한 RPKM의 mRNA 발현을 나타낸다. d, e, f RNAseq 분석으로부터의 데이터는 3단계 및 2단계 방법에서 배지 E, R 및 I의 연골세포에서 WNT5A(d), WNT5B(e) 및 WNT7B(f)에 대한 RPKM의 mRNA 발현을 나타낸다. NA(해당 없음)는 단계 자체의 부재에 기인하는 분석의 부재를 나타낸다. g, 면역블롯은 연골세포에서 WNT 신호전달 억제제 XAV-939(10㎛)의 존재하에 지시된 단백질의 발현을 나타낸다. 히스토그램은 대조군과 비교한 β-카테닌 및 액신의 농도측정 분석을 나타낸다. h, i, ACAN 및 COL2A1의 mRNA 발현은 배지 E, 배지 E +XAV-939에서 배양 4일 후의 연골세포, 및 배지 E 및 배지 +XAV-839에서 배양한 연골세포로부터의 카르티비드(2단계 방법)에서 qPCR에 의해 결정되었다. j, 배지 R(3단계 방법) 및 배지 E +XAV-939(2단계 방법)에서 배양된 연골세포로부터 생성된 카르티비드에서 GAG의 사프라닌-O 염색의 대표적 이미지. 스케일 바 100㎛. k, 도식은, 연골세포가 배지 R 또는 배지 E+ XAV939에서 배양된 경우, 배지 E 및 WNT 억제에서 WNT 신호전달 경로에 대한 분자적 기초를 요약하여, ACAN 및 유형 II 콜라겐을 함유하는 유리질 매트릭스의 생성을 가능하게 한다.
도 8. 생체외 인간 무릎에서 카르티비드 이식 실현가능성. a, 수술 기구를 사용하여 수동으로 생성된 병변(좌측), 1일차에 이식된 카르티비드(중앙), 회전 배양 후 이식 1개월 후의 비드에 의한 병변(우측)을 나타내는 원위 대퇴골 총 슬관절 치환술 후의 거시적 관찰. 스케일 바 4mm b, 생체외 시료의 단면 샘플에 대한 GAG의 사프라닌-O 염색은, 보다 높은 배율(좌측 및 우측 패널)로 나타낸 바와 같이, 함께 융합된 카르티비드가 유리질을 잔류시키고 천연 연골과 통합하는 것을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타낸다. 스케일 바 1mm.
도 9. 면역결핍 마우스에서 이식 후의 인간 카르티비드의 종양형성성의 부재. a, 마우스의 배측에서 피하 이식(흑색 화살표, 좌측 패널) 후에 이식 2개월 후의 카르티비드(0,2 × 106 연골세포/카르티비드)(상부 패널) 및 이식 6주 후의 A549의 5개 비드(0,2 × 106 A549 세포/비드)로부터 유래하는 종양(하부 패널)의 대표적 사진. b, 1개의 카르티비드, SCID 마우스당 1 또는 5개 비드의 A549 세포의 피하 이식 후의 종양 발달(하나의 카르티비드 공여자에 대해 n=10 내지 14마리 마우스 및 A549 비드당 2× n=4 마우스). c, 이식 전(중앙 패널) 및 이식 후(우측 패널) 카르티비드에서 GAG의 사프라닌-O 염색. 스케일 바 200㎛.
도 10. 자가 카르티비드 이식 후의 미니피그의 무릎에서 유리질 이식편의 통합. a, 도식은 카르티비드의 생성에 사용되는 생검의 1차 부위와, 무릎당 5개 병변의 생성 및 자가 카르티비드 이식을 조합한 2차 수술을 설명한다. b, 6마리 미니피그에 대한 GAG(μg/카르티비드)의 생화학적 정량화. c-d, 거시적 관찰(좌측 패널) 및 미니피그 무릎 절편의 GAG의 사프라닌-O 염색(중앙 패널), 확대된 세그먼트는 이식 후 3개월 및 6개월에서의 조직 리모델링을 나타낸다. 이식 부위는 흑색 원으로 표시되고, 백색 원은 대조군으로서의 공 병변을 나타낸다(우측 패널). 이식된 병변(중앙 패널) 및 공 병변(우측 패널)에 대한 대표적 염색은 3개월(c) 및 6개월(d)에 제시된다. 스케일 바 200㎛.
도 11. 미니피그에서 돼지 카르티비드 이식은 유리질 통합 이식편을 생성한다. a, 이 연구에 사용된 6마리 미니피그에 대해 이식 전의 카르티비드에서 GAG의 사프라닌-O 염색(상부 패널, 스케일 바 200㎛) 및 무릎의 거시적 관찰(중앙 패널) 및 이식된 병변에서 GAG의 사프라닌-O 염색(하부 패널, 스케일 바 200㎛).
본 발명은 하기 기재된 바와 같은 3단계의 연골세포 배양을 포함하는 연골 조직의 시험관내 생산 방법에 관한 것이다.
연골세포는 주로 이들이 생산하는 세포외 매트릭스의 유형에 기초한 특징적 표현형을 갖는 중간엽 세포로부터 유래한다. 전구체 세포는 유형 I 콜라겐을 생성하지만, 연골세포 계통에 관여하면, 유형 I 콜라겐의 생성을 감소시키고, 유리질 세포외 매트릭스의 실질적 단백질을 구성하는 유형 II 콜라겐의 합성을 개시한다. 또한, 구속된 연골세포는 고도로 설페이트화된 글리코스아미노글리칸과 관련된 아그레칸인 프로테오글리칸을 생성한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "연골세포"는 유리질 매트릭스를 합성하는 완전한 능력을 갖는 연골로부터 수득된 분화된 세포(구속된 연골세포)를 지칭한다. 용어 연골세포는 1차 배양(생검으로부터 새롭게 단리된 것), 및 유전자 변형, 불멸화, 선택, 보존 등을 포함하여 시험관내에서 증식된 세포를 지칭한다.
대상체 연골 세포의 단리
본 발명의 방법에 따르면, 제1 단계에서 연골세포는 대상체로부터, 바람직하게는 대상체의 무릎, 발목, 엉덩이, 손가락 또는 어깨로부터, 보다 바람직하게는 인간 또는 말 대상체로부터 단리된다. 연골세포는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 데옥시리보뉴클레아제, 엘라스타제 및 히알루로니다제 등의 조직의 효소적 소화를 사용하여 종래의 방법에 따라 성숙 연골 조직의 생검으로부터 단리된다. 연골 조직은 매우 작은 조각일 수 있고, 바람직하게는 직경 5mm 미만(약 30mg에 상당)이다. 연골 조직은 바람직하게는 포유동물이고, 보다 바람직하게는 인간 연골 또는 말 연골이다. 연골 조직은 건강한 공여자 또는 환자로부터, 바람직하게는 환자의 무릎, 발목, 엉덩이, 손가락, 어깨, 보다 바람직하게는 환자의 무릎 또는 발목으로부터 수집될 수 있다.
제1 단계 : 탈분화 배지에서의 부착 배양
단리된 연골세포는 먼저 탈분화 배양 배지 중의 부착성 배양 시스템에서 배양된다.
본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 부착성 배양 시스템은 부착성 단층 배양 시스템 또는 공급기 세포 상의 배양 시스템, 바람직하게는 부착성 단층 배양 시스템일 수 있다. 배양 시스템은 본 발명에 따른 방법에 적합한 임의의 형태, 특히 플라스크, 다중-웰 플레이트 또는 접시의 형태일 수 있다.
바람직한 실시형태에 따르면, 부착성 배양 시스템은 부착성 단층 배양 시스템이다. 이 시스템은 세포 부착을 촉진하는 매트릭스 또는 기질로 통상 코팅된, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱 등의 고체 지지체를 포함한다. 기질은 부착 인자로 이루어지고 지지체에 대한 세포의 부착을 촉진하는 단백질 기질일 수 있다. 이러한 부착 인자는 특히 폴리-L-리신, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 또는 젤라틴으로부터 선택될 수 있다.
세포외 매트릭스를 모방하고 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 매트릭스는 당업자에게 공지되어 있고, 다수의 종류가 상업적으로 이용가능하다. 이러한 매트릭스는, 예를 들면, Matrigel™, Geltrex® 유형, CELLstart™, 또는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 아미노글리칸 또는 비트로넥틴 등의 하나 이상의 고정 단백질을 포함하는 기타 매트릭스를 포함한다. 3차원 하이드로겔 유형의 매트릭스도 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에 따르면, 매트릭스는 Matrigel™ 유형 또는 CELLstart™ 기질이다.
연골세포는 섬유아세포 상태(섬유아세포-유사 형태)라고 하는 전구세포/미분화 상태의 세포를 증폭 및 탈분화할 수 있도록 하는 배지 중의 부착성 배양 시스템에서 배양된다. 특히, 탈분화 배지는 연골세포의 증식 및 탈분화를 섬유아세포-유사 세포로 모두 가능하게 하는 배양 배지이고, 섬유아세포-유사 세포의 형태를 갖는 탈분화 연골세포이고, 줄기 세포의 특성을 나타내는 섬유아세포-유사 연골세포라고도 한다. 바람직하게는, 탈분화 배지는 연골세포를, CD105, CD90 및/또는 CD73 등의 중간엽 줄기 세포 표면 마커를 발현하는 섬유아세포-유사 세포로 탈분화시키는 것을 가능하게 한다. 섬유아세포-유사 세포는 유리질 매트릭스(콜라겐 2 및 GAG) 합성 능력을 상실한 탈분화 연골세포이다. 탈분화 배지는 연골세포가 미분화 상태에서 증폭 및 탈분화하는 것을 가능하게 하는 하나 이상의 성분을 포함하는 기초 배지이다.
다수의 기초 배지가 상업적으로 입수가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 이 배지는 특히 무기염, 아미노산, 비타민 및 세포에 필수적인 탄소원, 및 pH 조절을 위한 완충 시스템을 포함하는 최소 배지일 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는 기초 배지에는, 예를 들면, DMEM/F12 배지, DMEM 배지, RPMI 배지, 햄스 F12 배지, IMDM 배지 및 녹아웃(KnockOut™) DMEM 배지(Life Technologies)가 포함된다.
사용되는 배지에 따라, 글루타민, 비타민 C, 스트렙토마이신, 페니실린 등의 하나 이상의 항생제 및/또는 펀기존(Fungizone)(암포테리신 B) 등의 항진균제를 첨가하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다.
본 발명에 따르면, 탈분화 배지는 Wnt 신호전달 경로를 활성화시킨다.
활성 상태에서, Wnt 리간드는 프리츨드 수용체와 이들의 보조 수용체인 지단백질-수용체-관련 단백질(LRP) 5/6에 결합한다. 이것은 산란된 (DSH)를 활성화하고, 이어서 GSK3β 활성과 β-카테닌 포스포릴화를 억제한다. β-카테닌은 핵으로 전좌되고, 전사 인자 TCF/LEF(T-세포 특이적 전사 인자/림프계 인핸서 결합 인자)와 상호작용한다. 비활성 상태에서, β-카테닌은 글리코겐 신타제 키나제(GSK) 3β에 의해 포스포릴화되고, 포스포릴화된 β-카테닌은 후속적 유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해를 받는다.
바람직한 실시형태에서, 탈분화 배지는 Wnt 신호전달, 바람직하게는 Wnt7B 신호전달을 활성화하는 하나의 화합물을 포함하는 기초 배지이다.
Wnt 신호전달 경로의 활성화는 탈분화 연골세포에서 wnt RNA, 특히 wnt7B, wnt5A 또는 wnt5B, 바람직하게는 wnt7B RNA 및 TCF4 등의 Wnt 신호전달 경로의 하류 표적 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. Wnt 신호전달 경로는 표적 유전자의 발현 수준이 상기 화합물 부재하에 배양된 세포보다 적어도 1,5배 또는 2, 3, 4, 5배 더 높은 경우에 세포에서 활성화된다.
mRNA의 발현 수준은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 통상, 이러한 방법은 mRNA의 양을 측정하는 것을 포함한다. mRNA의 양을 결정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 샘플에 포함된 핵산은 먼저 표준 방법에 따라, 예를 들면, 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 추출되거나, 또는 제조원의 지시에 따라 핵산 결합 수지에 의해 추출된다. 이어서, 추출된 mRNA는 하이브리드화(예: 노던 블롯 분석), 증폭(예: RT-PCR) 또는 서열분석(RNA-seq)에 의해 검출된다.
표적 유전자 단백질의 수준은 또한, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 통상, 이들 방법은 세포 샘플, 바람직하게는 세포 용해물을, 샘플 중에 존재하는 표적 유전자 단백질과 선택적으로 상호작용할 수 있는 결합 파트너와 접촉시키는 것을 포함한다. 결합 파트너는 일반적으로 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 단백질의 양은, 예를 들면, 반정량적 웨스턴 블롯, 효소-표지 및 매개된 면역검정, 예를 들면, ELISA, 비오틴/아비딘 유형 검정, 방사선면역검정, 면역전기영동 또는 면역침전 또는 단백질 또는 항체 어레이에 의해 측정될 수 있다.
특히, Wnt 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 화합물은 Wnt 수용체 또는 소분자 GSK-3β 길항제, 바람직하게는 WNT7B, WNT5A 또는 WNT5B, 보다 바람직하게는 WNT7B에 결합하는 Wnt 단백질일 수 있다.
Wnt 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 상기 화합물은 염화리튬(CAS No. 7447-41-8), CHIR99021(CAS No. 252917-06-9), SB-216763(CAS No. 280744-09-4), BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥심)(CAS 번호 667463-62-9)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 화합물은 bFGF 또는 염기성 형태의 섬유아세포 성장 인자로서도 공지된 FGF2(섬유아세포 성장 인자-2)이다.
Wnt 신호전달 경로의 활성화에 의해, 연골 세포를 섬유아세포-유사 세포로 증폭 및 탈분화시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 탈분화 배지는 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL의 FGF-2를 포함한다. 바람직하게는, 배지는 5 내지 100ng/mL의 FGF-2, 바람직하게는 20ng/mL의 FGF-2를 포함한다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 태양에서 FGF2 분자와 유사한 방식으로 연골세포에 작용하는, 바람직하게는 본 발명의 방법에서 연골세포를 증폭시키기 위해 폴리펩티드 등의 임의의 분자를 사용할 수 있다.
연골세포가 미분화 상태에서 세포를 증폭 및 탈분화하는 데 도움이 되는 추가 성분은 특별히 제한되지 않고, 목적에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 성분의 예에는 골 형성 단백질(BMP), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 인슐린 성장 인자 1(IGF-1) 등이 포함된다. 상술한 기타 성분들은 각각 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 이들의 복수는 Wnt 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 탈분화 배지는 EGF, TGF-β 및 PDGF-BB 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, EGF, PDGF-BB 및 TGF-β는 각각 1 내지 100ng/mL의 범위, 바람직하게는 5 내지 50ng/mL 범위의 농도로 존재한다. 보다 특정한 실시형태에서, 상기 TGF-β는 TGF-β3이다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에서, 인간 연골세포는 FGF-2, PDGF-BB 및 TGF-β3, 바람직하게는 5 내지 100ng/mL의 FGF-2, 1 내지 100ng/mL의 PDGF-BB 및 1 내지 100ng/mL의 TGF-β3, 더욱 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 FGF-2, 5 내지 50ng/mL의 PDGF-BB 및 5 내지 50ng/mL의 TGF-β3를 포함하는 탈분화 배지에서 배양된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에서, 말 연골세포는 FGF-2 및 EGF, 바람직하게는 5 내지 100ng/mL의 FGF-2, 및 1 내지 100ng/mL의 EGF, 보다 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 FGF-2 및 1 내지 100ng/ml의 EGF, 보다 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 FGF-2 및 5 내지 50ng/mL의 EGF를 포함하는 탈분화 배지에서 배양된다.
바람직한 실시형태에 따르면, 탈분화 배지는 동물 기원의 혈청을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 자가 혈청이 사용된다. 이종 또는 동종 혈청을 사용하는 것도 가능하다. 특히, 인간 연골세포의 배양을 위해, 인간 환자로부터의 자가 혈청 또는 풀링된 인간 혈청이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 말 연골세포 배양을 위해, 소태아 혈청이 사용될 수 있다. 배지는 바람직하게는 2 내지 20%, 바람직하게는 5 내지 15%, 더욱 바람직하게는 10%의 혈청을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 연골세포는 탈분화 배지와 10 내지 20일 동안, 바람직하게는 10 내지 15일 동안 접촉된다.
세포는 바람직하게는 배양물이 컨플루언스에 도달하는 것을 방지하기 위해, 즉 이용 가능한 표면 전체를 커버하는 것을 방지하기 위해 정기적으로 계대배양된다. 실제로, 컨플루언스는 증식의 중지와 원하지 않는 대사 변화를 유도한다. 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여, 세포를 계대배양할 수 있다. 이들은 특히 콜라게나제 IV 등의 효소의 작용에 의해, 또는 PBS 또는 EDTA를 함유하는 기타 효소 비함유 용액(예: ReleSR, (STEMCELL Technologies))에서의 기계적 통과에 의해, 또는 TrypLE™ Express(Life Technologies) 등의 상용 세포 분리 배지의 작용에 의해 매트릭스 또는 지지체로부터 분리되고, 원심분리에 의해 수집되고, 기계적으로 분리되고, 새로운 배양 시스템에 다시 파종될 수 있다.
제2 단계 : 재분화 배지에서의 부착 배양
배양의 제2 중간 단계에서 세포 증폭을 위한 탈분화 배지에 사용된 Wnt 신호전달 경로를 불활성화함으로써, 본 발명자들은 놀랍게도, 3차원 시스템 배양 후, 연골 세포가 완전한 원래 표현형 및 유리질 매트릭스를 합성하는 완전한 능력을 회복하는 것을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 제1 단계에서 수득된 섬유아세포-유사 세포를, Wnt 신호전달 경로, 바람직하게는 Wnt7B, Wnt5A 또는 Wnt5B, 바람직하게는 Wnt7B 신호전달 경로를 불활성화하는 재분화 배지를 사용하여 상기 기재된 바와 같은 부착성 배양 시스템에서 배양하는 중간 단계를 추가로 포함한다. 연골세포를 이 재분화 배지와 접촉시켜 섬유아세포 표현형을 역전시키고, 섬유아세포-유사 세포를 유리질 매트릭스를 합성할 수 있는 완전한 능력을 갖는 연골세포로 재분화시킨다. 이 제2 단계에서, 세포는 형태를 변화시키고, 광학현미경하에서 세포질에서 외관상 과립형 소포체와 함께 덜 신장하고 보다 커지며, 따라서 높은 수준의 단백질 합성 활성을 신호전달한다. 연골세포는 GAG와 관련된 프로테오글리칸인 아그레칸을 재발현하기 시작한다. 콜라겐 II는 제2 단계가 종료될 때까지 재발현되지 않는다.
바람직하게는, 접촉은 단순히 배양 배지를 교환함으로써 수행한다. 또는, 이는 복귀 배지를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 부착성 배양 시스템에서 계대배양함으로써 수행될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 부착성 배양 시스템은 전술한 바와 같은 부착성 단층 배양 시스템이다. 바람직한 실시형태에 따르면, 매트릭스는 Matrigel™ 유형 또는 CELLstart™ 기질이다.
제1 실시형태에서, 재분화 배지는 전술한 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 화합물이 제거된 기초 배지를 포함하는 재분화 배지일 수 있다.
화합물을 제거함으로써, 상기 재분화 배지는 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 가능하게 하지 않는 농도의 화합물을 포함하도록 의도된다.
보다 바람직한 실시형태에서, 상기 재분화 배지는 FGF-2 비함유 재분화 배지이다. 상기 FGF-2 비함유 재분화 배지는 0.5ng/mL 미만의 FGF-2, 바람직하게는 0.4, 0.3, 0.2, 0.1ng/mL 미만의 FGF-2를 포함하는 기초 배지를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 재분화 배지는 Wnt 신호전달 경로의 억제제를 포함하는 기초 배지이다.
상기 Wnt 신호전달 경로의 억제제는 NSC668036(CAS No. 144678-63-7), 3289-8625(CAS No. 294891-81-9), J01-017a, TMEM88, KY-02061, KY-02327, BMD4702(CAS No. 335206-54-7), 나클로스아미드(CAS No. 50-65-7), DK-520, 술린닥(CAS No. 38194-50-2 등의 DvI 단백질)을 표적화하는 화합물; 피르비늄(Pyrvinium)(CAS No. 7187-62-4) 등의 β-카테닌 파괴 복합체를 표적화하는 화합물; 데리신(CAS No. 34211-25-1), 데리시딘(CAS No. 38965-74-1), 카르노신산(CAS No. 3650-09-7) 등의 천연 화합물; ICG-001(CAS No. 847591-62-2), PNU-74654(CAS No. 113906-27-7), 윈도르펜(CAS No. 19881-70-0) 등의 TCF/LEF 전사 리포터를 표적화하는 화합물; IWP-L6(CAS No. 1427782-89-5), Wnt-C59(CAS No. 1243243-89-1), LGK974(CAS No. 1243244-14-5), ETC-159(CAS No. 1638250-96-0) 등의 Pren을 표적화하는 화합물, XAV939(CAS No. 284028-89-3), E7449(CAS No. 1140964-99-3), 바람직하게는 XAV939 등의 TNKS를 표적화하는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소분자일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 작은 억제 RNA(siRNA)를 사용하여, Wnt 경로 신호전달에 관여하는 적어도 하나의 단백질의 유전자 발현 수준을 또한 감소시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 Wnt 신호전달 단백질 유전자 발현은 세포에 작은 이본쇄 RNA(dsRNA), 또는 Wnt 신호전달 경로가 불활성화되도록(즉, RNA 간섭 또는 RNAi) 작은 이본쇄 RNA의 생산을 유발하는 벡터 또는 작제물을 도입함으로써 감소될 수 있다. 적절한 dsRNA 또는 dsRNA-코딩 벡터를 선택하는 방법은 이의 서열이 공지되어 있는 유전자에 대해 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Tuschl, T. et al.(1999); Elbashir, S. M. et al.(2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al.(2002); Brummelkamp, TR. et al.(2002), 미국 특허 제6,573,099호 및 제6,506,559호, 국제 특허 공개공보 제WO 01/36646호, 제WO 99/32619호 및 제WO 01/68836호].
또 다른 실시형태에서, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 또한 사용하여, Wnt 신호전달 단백질의 유전자 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 RNA 간섭(RNAi)을 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 턴을 수행하는 RNA 서열이다. 세포에서 shRNA의 발현은 일반적으로 플라스미드의 전달에 의해 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 달성된다. 프로모터 선택은 강력한 shRNA 발현을 달성하기 위해 필수적이다. 최초에는, U6 및 HI 등의 폴리머라제 III 프로모터가 사용되었지만; 그러나, 이러한 프로모터는 공간적 및 시간적 제어를 결여한다. 이와 같이, shRNA의 발현을 조절하기 위해 폴리머라제 II 프로모터를 사용하도록 시프트되어 있다.
바람직한 실시형태에서, siRNA는 Wnt5B, Wnt7B, Wnt5A 또는 β-카테닌, 바람직하게는 Wnt7B의 유전자 발현 수준을 저하시키기 위해 사용된다.
기초 배양 배지는 특히 미네랄 염, 아미노산, 비타민 및 세포에 필수적인 탄소원 및 pH 조절을 위한 완충 시스템을 포함하는 최소 배지일 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는 기초 배지에는, 예를 들면, 이들로 한정되지 않지만, DMEM/F12 배지, DMEM 배지, RPMI 배지, 햄스 F12 배지, IMDM 배지 및 KnockOut™ DMEM 배지(Life Technologies)가 포함된다.
특정 실시형태에서, 재분화 배지는 0.5ng/mL 미만의 FGF-2를 포함하는 기초 배지를 포함하고, 섬유아세포-유사 세포가 연골세포로 재분화하는 것을 촉진하는 적어도 하나 이상의 성분을 포함하는 FGF-2 비함유 재분화 배지이다.
특정 실시형태에서, 재분화 배지는 형질전환 성장 인자 β(TGFβ), 보다 바람직하게는 TGF-β3을 포함한다. 바람직하게는, 재분화 배지는 1 내지 100ng/mL의 TGF-β3, 더욱 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 TGF-β3을 포함한다.
보다 특정한 실시형태에서, 재분화 배지는 케라티노사이트 성장 인자로서도 공지되어 있는 FGF-7을 추가로 포함한다. FGF-7은 세포 증식 및 세포 분화에 관여한다. 바람직하게는, 재분화 배지는 1 내지 100ng/mL의 FGF-7, 더욱 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 FGF-7을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 사용된 재분화 배지는 상기 기재된 바와 같은 동물 기원의 혈청을 추가로 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TGF-β, FGF-7 및/또는 혈청은 혈소판 용해물에 의해 치환된다. 혈소판 용해물은 동결/해동 사이클 후의 혈소판으로부터 유래하는 성장 인자-풍부 세포 배양 보충제이다. 동결/해동 사이클에 의해 혈소판을 용해시켜, 세포 확장에 필요한 대량의 성장 인자를 방출시킨다. 바람직한 실시형태에서, 재분화 배지는 5 내지 20%, 바람직하게는 10%의 혈소판 용해물을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 혈소판 용해물은 풀링된 인간 혈소판 용해물이다.
연골세포 분화에 영향을 미칠 수 있는 성분은 특별히 제한되지 않고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 성분의 예에는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), 형질전환 성장 인자 β, 골형성 단백질(BMP), 셀레늄, 트랜스페린, 에탄올아민, 혈소판 유래 성장 인자가 포함된다. 상술한 기타 구성요소 각각은 단독으로 사용될 수도 있고, 또는 이들의 복수를 조합하여 사용될 수도 있다.
특정 실시형태에 따르면, 연골세포는 재분화 배지와 2 내지 10일 동안, 바람직하게는 3 내지 7일 동안, 더욱 바람직하게는 7일 동안 접촉된다.
배양물이 컨플루언스에 도달하는 것을 방지하기 위해, 즉 이용 가능한 표면 전체를 커버하는 것을 방지하기 위해, 세포를 정기적으로 계대배양할 수 있다. 실제로, 컨플루언스는 증식의 정지와 원치 않는 대사 변화를 유도한다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 계대배양될 수 있다.
제3 단계 : 유도/성숙 배지에서의 3D 배양 시스템
연골 조직 형성을 가능하게 하기 위해, 제2 단계에서 수득된 연골세포를 유도 배지라고도 하는 성숙 배지 중의 3차원 배양 시스템 상에서 배양한다. 이 단계에서는, 연골세포가 독자의 세포외 기질을 생성하여 연골 조직을 형성하고, 특히 이들은 유형 II의 콜라겐 합성을 개시한다. 수득된 연골 조직은 다양한 크기의 3차원 조직이고, 이를 회전타원체(spheroid)라고 할 수 있다. 상기 회전타원체는 회전타원체에 포함된 세포와 이들 세포에 의해 형성된 유리질 매트릭스로 구성된다.
성숙 배지는 연골세포가 유리질 매트릭스를 생성하고 연골 조직을 형성하는 것을 가능하게 하는 적어도 하나 이상의 성분을 포함하는 기초 배지이다.
특히, 성숙 배지는 Wnt 신호전달 경로를 불활성화한다. 일 실시형태에서, 성숙 배지는 전술한 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 화합물이 제거된 기초 배지를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 성숙 배지는 전술한 바와 같이 Wnt 신호전달 경로의 억제제를 포함하는 기초 배지이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 성숙 배지는 FGF-2 성장 인자가 제거된 기초 배지이다. 다시 말해서, 성숙 배지는 0.5ng/mL 미만의 FGF-2, 바람직하게는 0.4, 0.3, 0.2, 0.1ng/mL 미만의 FGF-2를 포함하는 기초 배지이다.
연골세포 성숙에 영향을 미칠 수 있는 성분은 특별히 제한되지 않고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 성분의 예에는 TGF-β 성장인자, 인슐린, 인슐린-유사 성장인자(IGF-1), 형질전환 성장인자 β, 골형성 단백질(BMP), 셀레늄, 트랜스페린, 에탄올아민, 상피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 등이 포함된다. 상술한 기타 성분 각각은 단독으로 사용될 수도 있거나, 또는 이들의 복수를 조합하여 사용될 수도 있다.
특정 실시형태에 따르면, 성숙 배지는 TGF-β, 바람직하게는 TGF-β3을 추가로 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 기초 배양 배지이다.
바람직하게는, 성숙 배지는 1 내지 100ng/mL의 TGF-β3, 더욱 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 TGF-β3을 포함한다.
일 실시형태에 따르면, 연골세포 성숙 배지는 TGF-β3, IGF-1, BMP-2 및 인슐린을 포함하는 기초 배양 배지이다. 바람직하게는, 연골세포 성숙 배지는 TGF-β3, 인슐린, IGF-1, BMP-2, 셀레늄, 트랜스페린 및 에탄올아민, 보다 바람직하게는 TGF-β3, 인슐린, 셀레늄, 트랜스페린 및 에탄올아민을 포함한다.
바람직하게는, 성숙 배지는 1 내지 100ng/mL의 TGF-β3, 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 TGF-β3, 1 내지 100ng/mL의 IGF-1, 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 IGF-1, 및/또는 1 내지 100ng/mL, 바람직하게는 5 내지 50ng/mL의 BMP-2를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 연골세포는 성숙 배지 중에서 10 내지 20일 동안, 바람직하게는 10 내지 15일 동안 3차원 배양 시스템 상에서 배양된다.
3D 배양은 연골세포에 의한 세포외 매트릭스 합성을 촉진하기 위해, 세포가 서로 연결되는 것을 가능하게 한다. 3D 배양 시스템은 정적이거나 동적일 수 있다. 정적 방법은 정적 물리적 힘으로 인해 응집체를 형성하는 양식을 세포에 제공하는 것을 의미한다. 정적 방법에는 행잉 드롭(hanging drop) 방법, 한천 또는 아가로스의 얇은 코팅 등의 비접착성 기질 상에서의 액체 배양, 낮은 부착성 표면 플레이트상에서의 배양이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 동적 방법은 강제적 세포 응집을 의미한다. 동적 방법에는 스피너 플라스크 배양, 회전 벽 용기 및 펠렛 배양이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 3D 배양 시스템은 펠렛 배양이다. 펠렛 배양에서는 연골세포를 플레이트에 분주하고, 원심분리하여 세포를 응집시키고 펠렛을 형성한다.
바람직한 실시형태에서, 성숙 배지에서의 3D 배양은 연골 형성을 개선하기 위해 저산소 대기에서 수행된다. 바람직한 실시형태에서, 연골세포는 10%(v/v) O2 미만, 더 바람직하게는 7% O2 미만, 더 바람직하게는 5% O2의 대기 중의 성숙 배지에서 3D 배양 시스템에서 배양된다.
세포는 연골 조직이 수득될 때까지 연골세포 성숙 배지에서 유지된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 연골은 유리질 연골을 지칭한다. 이 기간 동안 및 종래의 방식으로, 배양 배지는 정기적으로, 바람직하게는 2 또는 3일마다 교환될 수 있다.
수득된 연골 조직의 품질은 조작된 연골 조직 중의 글리코스아미노글리칸(GAG) 및 콜라겐 II의 함량을 측정함으로써 시험할 수 있다. 연골 조직의 질과 양은 또한 GAG/미세조직의 양을 측정함으로써 또는 GAG/이본쇄 DNA 비율을 측정함으로써 결정될 수 있다. GAG, 콜라겐 또는 이본쇄 DNA의 존재는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, GAG는 사프라닌-O 착색에 의해 또는 디메틸메틸렌 블루 검정(DMMB)를 사용하여 GAG의 투여량에 의해 더 정량적으로 밝혀질 수 있다. 콜라겐 II는 면역염색 또는 ELISA 등의 보다 정량적 검정에 의해 평가할 수 있다.
따라서, 임의로, 본 발명에 따른 방법은 조작된 연골 조직에서 GAG 및/또는 콜라겐 II의 존재를 측정 또는 평가하는 것으로 이루어진 추가 단계를 포함할 수 있다.
조작된 연골 조직( 카르티비드 )
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 조작된 연골 조직에 관한 것이다.
본 발명은 회전타원체 형태의 조작된 연골 조직에 관한 것이고, 상기 회전타원체는 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20㎍/회전타원체, 바람직하게는 10 내지 100㎍/회전타원체, 보다 바람직하게는 15 내지 60㎍/회전타원체의 회전타원체당 GAG 함량을 나타낸다.
본 발명은 회전타원체 형태의 조작된 연골 조직에 관한 것이고, 상기 회전타원체는 적어도 10, 15 또는 20, 바람직하게는 10 내지 100, 보다 바람직하게는 10 내지 80의 GAG/이본쇄 DNA 비율을 나타낸다.
연골 조직의 상기 회전타원체는 1 내지 2mm의 직경을 갖고, 50,000 내지 250,000개 세포, 우선적으로는 200,000개 세포를 포함한다.
약제학적 조성물
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명의 조작된 연골 조직, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적으로 허용되는 부형제는 세포와 적합성이 있어야 하고, 예를 들면, 배양 배지, 완충 용액 또는 생리식염수 용액일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여, 바람직하게는 피하 경로에 의한, 특히 연골 또는 골 조직에 대한 직접 투여에 적합하다. 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 표준 약제학적 관행에 따라 제형화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 생체적합성 매트릭스에 캡슐화된 본 발명의 연골 조직을 포함한다.
약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 추가 활성 화합물, 예를 들면, 세포의 생존 또는 증식을 개선하거나, 또는 오염을 방지하는 것으로 공지되어 있는 화합물을 포함할 수 있다.
치료적 적용
또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 특히 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료를 위한 본 발명의 조작된 연골 조직 또는 상기 조작된 연골 조직을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조작된 연골 조직에 관한 것이다. 이는 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 자가 연골 조직 이식에 특히 적합하다. 본 발명의 자가 조작된 연골 조직의 이식에서, 연골세포는 먼저 상기 대상체로부터, 바람직하게는 상기 대상체의 성숙한 연골 조직의 생검으로부터 단리된다. 이어서, 연골세포를 본 발명의 방법에 따라 배양하여 자가 조작된 연골 조직을 수득하고, 상기 환자의 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료에 사용한다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료를 위한, 본 발명의 자가 조작된 연골 조직, 또는 상기 자가 조작된 연골 조직을 포함하는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시형태에서, 동종이계 이식은 이를 필요로 하는 대상체에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "연골 결손 및 연골 변성 질환"은 연골 병변, 관절증, 류머티즘 또는 골관절염을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조작된 연골 조직 또는 이의 약제학적 조성물은, 보철물의 제한된 수명에 기인하여 60세 미만의 환자에게 일반적으로 제안되지 않는 전체 무릎 치환술을 지연 또는 회피하기 위해, 국소성 관절 연골 병변 또는 초기 골관절염에 의해 영향을 받는 환자에 대해 지시된다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 연골 결손 및 연골 변성 질환은 국소성 관절 연골 병변 또는 초기 골관절염이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료"는 통증 및 운동성 저하, 질환 진행의 지연, 질환 진행의 정지 또는 질환의 소실 등의 증상의 개선 또는 소실을 지칭한다. 이 용어에는 예방적 치료와 치료적 치료도 모두 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 명세서에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물을 지칭한다. 개시된 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물 종에는 인간, 유인원, 침팬지, 원숭이 및 오랑우탄 등의 비-인간 영장류, 개 및 고양이를 포함하는 가축, 게다가 말, 소, 돼지, 양 및 염소 등의 가축, 또는 제한 없이 낙타, 마우스, 랫트, 기니 피그, 래빗, 햄스터 등을 포함하는 기타 포유동물 종이 포함된다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 인간 또는 말이다.
본 발명은 또한, 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 약물의 제조를 위한 본 발명의 연골 조직 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 치료 유효량의 본 발명에 따른 조작된 연골 조직 또는 약제학적 조성물을 치료될 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 연골 결손 및 연골 변성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다시 말해서, 본 발명은 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결손 및 연골 변성 질환을 치료하는 방법으로서,
i) 상기 대상체로부터 연골세포를 단리하는 단계;
ii) 섬유아세포-유사 세포를 수득하기 위해 전술한 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 탈분화 배양 배지 중의 부착성 배양 시스템 상에서 상기 연골세포를 배양하는 단계;
iii) 연골세포를 수득하기 위해 전술한 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 불활성화하는 재분화 배양 배지에서 부착성 배양 시스템 상에서 상기 섬유아세포-유사 세포를 배양하는 단계;
iv) 연골 조직을 수득하기 위해 전술한 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 불활성화하는 성숙 배지 중의 3D 배양 시스템에서 상기 단계 iii)의 연골세포를 배양하는 단계, 및
v) 치료 유효량의 연골 조직을 치료 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 연골 결손 및/또는 연골 변성 질환을 나타내는 대상체의 통증 증상을 감소시키거나, 또는 이동성을 증가시키기에 충분한 양을 지칭한다.
바람직한 실시형태에서, 직경이 약 1 내지 2mm인 연골 조직의 10 내지 50개 회전타원체가 병변의 cm²당 이를 완전히 커버하도록 투여된다. 회전타원체는 연골 하골 및 연골 병변의 내부 엣지에 자체 접착된다.
본 발명의 조작된 연골 조직 또는 약제학적 조성물은 상기 연골을 연골 또는 지지 매트릭스의 표면, 또는 대상체의 연골 또는 지지 매트릭스의 국소 환경에 직접 이식함으로써 투여될 수 있다.
본 발명의 조작된 연골 조직 또는 약제학적 조성물은 개방-관절 수술 절차에 의해, 또는 관절경검사를 통해, 바람직하게는 관절경검사에 의해 환자의 보다 신속한 회복을 가능하게 하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
생체내 이식되면, 연골 조직 내부의 연골세포는 손상된 조직의 표면까지 전체 두께 결함을 충전하기 위해 매트릭스를 계속 생성함으로써 기계적 부하에 반응하고, 생체내에서 완전히 융합하여 균질한 연골 조직을 형성할 가능성이 있다.
키트
또한, 본 발명은 연골 조직의 시험관내 생산용 키트에 관한 것이다. 이 키트에는
- 상기한 바와 같은 탈분화 배지에 존재하는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 FGF-2, 보다 바람직하게는 FGF-2 및 EGF, TGF-β3 및 PDGF-BB 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 성장 인자를 함유하는 제1 용기,
- 상기 기재된 바와 같은 재분화 배지에 존재하는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 TGFβ3, 더욱 바람직하게는 TGFβ3 및 FGF-7을 함유하는 제2 용기(상기 TGF-β3 및/또는 FGF-7은 혈소판 용해물로 치환될 수 있다),
- 상기 기재된 바와 같은 성숙 배지에 존재하는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 TGF-β3, 더욱 바람직하게는 TGF-β3 및 IGF-1, BMP-2, 인슐린, 셀레늄, 트랜스페린 및 에탄올아민 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 화합물, 또한 더 바람직하게는 TGF-β3 및 인슐린, 셀레늄, 트랜스페린 및 에탄올아민을 함유하는 제3 용기가 포함된다.
바람직하게는, 키트는 각각이, 분화 및/또는 성숙 배지의 재구성 및/또는 사용, 및 본 발명에 따른 방법의 실행을 용이하게 하는 농도 또는 양으로 하나 이상의 화합물을 포함하는 용기를 포함한다. 본 발명에 따른 키트는 또한 상기 기재된 바와 같은 기초 배지를 함유하는 용기를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 또한, 특히 플라스크, 멀티웰 플레이트 또는 접시의 형태의 부착성 배양 시스템을 포함할 수 있다.
키트는 또한, 본 발명의 방법에 따른 연골 조직의 시험관내 생산을 위한 분화 또는 성숙 배지를 제조 및/또는 사용하기 위한 방법을 지시하는 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따른 연골세포의 시험관내 생산을 위한 본 발명에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
치료적 관심의 분자를 스크리닝하는 방법.
또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 치료적 관심의 분자를 스크리닝하기 위한 본 발명의 연골 조직의 용도에 관한 것이다.
치료적 관심 분자는, 특히 연골 변성 질환에서 퇴행성 공정을 억제하는 분자일 수 있다. 이들 분자는 상술한 연골 결손 또는 연골 변성 질환의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.
따라서 본 발명은 관심 분자를 스크리닝하는 방법으로서,
i) 본 발명의 연골 조직을 후보 분자와 접촉시키는 단계 및
ii) 목적하는 활성을 갖는 분자를 선택하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 연골 변성 공정을 억제하는 분자를 스크리닝하는 방법으로서,
i) 본 발명의 연골을 하나 이상의 후보 분자와 접촉시키는 단계, 및
ii) 연골 변성 공정을 억제하는 분자를 선택하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
연골 조직의 생성은, 예를 들면, GAG 또는 콜라겐 II를 측정하는 것을 포함하는 방법 등의 당업자에게 공지된 기술에 의해 평가될 수 있다.
찾고자 하는 분자의 성질에 따라, 연골 조직을 생성하기 위해 사용되는 연골세포는 건강한 대상체 또는 상기 정의된 연골 결손 또는 연골 변성 질환을 갖는 대상체로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 출원에 참조로서 도입된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 비제한적 예시로서 제공된 하기 실시예를 읽는 것에 의해 더욱 명백해질 것이다.
실시예
재료 및 방법
화학물질
XAV939는 시그마(Sigma)에서 입수하였고, 배지 E의 2D 배양에서 4일 동안 10μM의 농도로 사용했다.
카르티비드 생산
표 1에 기재된 하기 배지가 실시예에 사용되었다.
실시예에 사용된 배지의 조성
배지 연골세포의 기원 조성
분화 배지(배지 1, 또한 배지E라 함) 인간 연골세포 -DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-10%의 풀링된 인간 혈청
-20ng/ml의 FGF-2
-10ng/ml의 PDGF-BB
-5 ng/ml의 TGF 베타 3; 또는

-DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-10%의 풀링된 인간 혈청
-20ng/ml의 FGF-2
말 연골세포 -DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-10%의 소태아 혈청
-20ng/ml의 FGF-2
-20ng/ml의 EGF.
분화 배지(연골형성 위탁 배지라고도 함) (배지 2, 배지 R이라고도 함) 인간 연골세포 -DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-10%의 풀링된 인간 혈소판 용해물
말 연골세포 -DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-10%의 소태아 혈청
성숙 배지(배지 3, 배지 I이라고도 함) 인간 연골세포 -DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-ITS-X (인슐린, 셀레늄, 트랜스페린, 에탄올아민) 1x
-10-100 ng/ml의 TGF 베타 3
-10-100 ng/mL의 IGF
- 10-100 ng/ml의 BMP-2 또는

-DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-ITS-X (인슐린, 셀레늄, 트랜스페린, 에탄올아민) 1x
-10-100ng/ml의 TGF 베타 3
말 연골세포 -DMEM 4,5g/l의 글루코스
-Glutamax
-비-필수 아미노산
-ITS-X (인슐린, 셀레늄, 트랜스페린, 에탄올아민) 1x
-10-100ng/ml의 TGF 베타 3
-10-100ng/mL의 IGF I
-10-100ng/ml의 BMP-2
샘플 수집
인간 연골 샘플은 다양한 적응증에 대해 정형외과적 수술 후의, 생명에 동의한 공여자(18세 내지 80세)로부터 입수했다(표 2).
성별, 연령 및 병리를 포함하는 공여자의 특징
ID 성별 연령 병리
공여자 1 M 21 외상
공여자 2 M 47 외상
공여자 3 M 29 외상
공여자 8 F 65 무릎 관절증
공여자 9 M 80 무릎 관절증
공여자 13 F 64 무릎 관절증
공여자 14 M 69 무릎 관절증
공여자 15 M 87 대퇴골 괴사
공여자 17 F 28 외상(슬개골 전위)
공여자 18 M 58 변성 초점 병변
공여자 19 F 60 무릎 관절증
공여자 20 M 38 박리성 연골염
공여자 21 M 68 무릎 관절증
공여자 23 M 63 무릎 관절증
공여자 24 F 74 무릎 관절증
공여자 27 M 82 무릎 관절증
공여자 31 M 76 거골(발목 관절증)
공여자 37 F 70 거골(발목 관절증)
공여자 39 M 74 거골(발목 관절증)
수집된 연골은, 실온에서 통상의 생리식염수(NaCl 0.9%) 중의 멸균 수용자의 실험실로 옮겼다. 인간 연골 샘플의 수집은 스위스 윤리 위원회(BASEC, 2016-00656)에 의해 승인되었다.
미니피그의 연골은 미니피그의 우측 무릎으로부터 채취한 측면 활차 홀더(약 30mg)로부터 수득되었다.
연골(약 30mg)을 작은 조각(1mm)으로 슬라이싱하여, 효소 소화에 의한 연골세포의 추출을 용이하게 하고, 이어서 항생물질(겐타마이신, 50ug/ml) 및 항진균제(암포테리신 B 또는 펀지존®, 0,250ug/ml)를 함유하는 배지 E 중의 유형 II 콜라게나제(400U/ml, ThermoFisher)를 사용하여 37℃에서 밤새 회전시켰다.
세포 배양 및 카르티비드의 생산
세포를 세척하고, 세포외 매트릭스(MaxGel™, Sigma)으로 사전 코팅된 T25 cm2 플라스크에 플레이팅(p0)하고, 이어서 세포 확장 5일 후에 제거되는 겐타마이신 및 펀지존®을 갖는 배지 E에서 12 내지 16일 동안 배양했다. 모든 2D 세포 배양은 세포외 매트릭스-코팅된 플라스크에서 수행되었다. 컨플루언스에서, 세포는 1 T75(p1)에서 계대하고, 이후에 2× T75(p2)에서 분할하여 컨플루언스에 도달했다. 이 단계에서, 백업을 위해 세포를 동결할 수 있다(p3). E 배지(단계 1)에서 세포 확장 후, 단계 2에서 세포를 R 배지에서 7일 동안 배양하고, 단계 3에서 3D 배양으로 진행하기 전에 성장의 감소를 관찰했다. 단계 3에서, 연골세포를 수집하고, 배지 I에서 응집시켜, 원뿔형 96웰 플레이트(약 20×106 세포/플레이트)에서 0,2×106 세포/웰을 수득했다. 96웰 플레이트를 300g에서 5분 동안 원심분리하여, 3D 배양에서 15일 후에 세포의 응집 및 카르티비드의 형성을 가능하게 했다. 연골세포로부터 계대 8까지 카르티비드를 수득했다. 이들 비드를 96웰 플레이트로부터 제거하고, 함께 풀링하고, 배지 I에서 4 내지 23℃(실온)에서 최대 6일 동안, 높은 안정성으로 유지할 수 있다.
GAG 정량화
글리코스아미노글리칸(GAG) 함량은 디메틸메틸렌 블루 검정(DMMB)(Sigma, 341088)에 의해 평가되었다. 콘드로이틴 설페이트 A(Sigma, C9819)를 사용하여 0 내지 50μg/mL 농도 범위의 6개 표준을 생성했다. 콘드로이틴 설페이트 C(Sigma, C4384)를 사용하여, 저농도 및 고농도의 내부 품질 관리(IQC)를 각각 15 및 35μg/mL 생성했다. 카르티비드를 트리스-HCl, 50mM, pH 8(Sigma) 중의 프로테이나제 K(1mg/ml)(Promega, V3021)로 56℃에서 15±2시간 동안 소화했다. 효소 소화는 97℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 중지시켰다. 이어서, 수득된 샘플을, 검정을 위해 트리스-HCl, 50mM, pH 8에서 희석(1/5 내지 1/10)했다. 1mL DMMB 용액과 5분 동안 반응시킨 후, 100μL의 표준, ICQ 및 샘플을 분광광도계로 3회(λ = 525nm) 판독했다. 이어서, GAG 함량을, PicoGreen-Qubit 검정으로 측정한 DNA 양에 대해 정규화했다. 표준 및 ICQ는 2개의 별도의 조제물에서 송아지 흉선 DNA으로부터 제조되었다. 표준 및 ICQI는 200mM 트리스-HCl, 20mM EDTA, pH 7.5, (TE) 완충액에서 제조되었고; 샘플은 프로테이나제 K 소화로부터의 것이고, TE 완충액에서 1/15로 희석되었다. 이 검정을 위해, 100μL의 표준, IQC 및 샘플을 채취하여 3개 분획으로 나누었다. 이어서, 100μL의 1/200 희석된 피코그린(PicoGreen) Quant-It®(ThermoFischer, P11496)를 첨가했다. 이어서, 샘플을 5분 동안 인큐베이팅하고, 이 시간 동안 인터칼런트를 DNA와 복합체화했다. 마지막으로, 판독은 Qubit 4 Fluorometer(ThermoFischer, Q33238)에서 수행되고, 여기 피크는 485nm였다.
카르티비드의 세포 생존율
살아있는 세포에는 비투과성이지만, 손상된 막을 갖는 세포에는 투과성이 있는 아민 반응성 형광 염료인 적색 형광 염료, 좀비에 아쿠아(Zombie Aqua™)(Biolegend, 423101)를 사용한 검정에 의해 샘플의 생존율을 시험하고, 따라서 살아있는 세포와 죽은 세포를 평가한다. 3차원 샘플을 단계 3이 종료할 때까지 수집하고, 이어서 PBS로 세척하고, 이어서 PBS(1:100)에 희석된 좀비 염료를 20분 동안 첨가하고, 샘플을 암소에서 보관했다. 이어서, 샘플을 크리오스타트 마이크로톰을 통해 3㎛의 두께로 절단하고, 슈퍼프로스트 플러스 슬라이드에 마운트했다. 이어서, 이들을 포르몰 4%로 고정하고, PBS(1:2000)으로 희석한 훽스트(Hoescht)(Molecular probe, H3570Thermofisher)로 10분간 처리했다. 좀비 염료 단계를 개시하기 전에, Triton™(Sigma, X100-100ML)을 PBS 중의 10%에서 실온(RT)에서 1시간 동안 첨가함으로써 검정의 제어를 달성했다.
면역조직화학 염색
포르말린 고정 파라핀 포매 연골 조직 및 카르티비드의 면역조직화학 염색을 위해, 샘플을 포함하는 파라핀 블록을 5㎛의 마이크로톰으로 절단했다. 슬라이드를 47℃에서 밤새 건조시켰다. 슬라이드를 크실롤(Xylol)에 의해 탈파라핀화하고, 연속적 알콜 욕(농도 100%, 95% 및 70%)에 의해 재수화했다. 마스킹 해제의 2개의 기술이 사용되었다. 미니피그로부터 유래한 천연 연골의 경우, 본 발명자들은 0.1M 인산염 완충액 중 히알루로니다제의 20mg/mL 용액을 사용하고, 37℃에서 1시간 동안 슬라이드에 위치시켰다. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 2회 세정하여, 히알루로니다제를 제거했다. 카르티비드 샘플을 pH=6의 0.01M 시트르산 완충액에 침지시키고, 620w의 마이크로웨이브에서 각각 5분씩 3회 가열한 후, 빙욕에서 20분 동안 냉각했다. 이어서, 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 세정했다. 이어서, 1차 항체를 사용했다(Collagen I Abcam, ab6308; Collagen II Abcam ab85266 및 ThermoFischer MA5-12789). 주목해야 하는 것으로, 사용된 2개의 유형 II 콜라겐 항체는 유사한 결과를 나타냈다. 항체를 상이한 샘플에 위치시키고, 0.3% 트리톤:PBS에 1:100으로 1시간 동안 희석했다. PBS로 5분간 세정한 후, 2차 항체, 즉 비오틴-접합된 항 마우스(Vector lab, BA-2000), 항-래빗 IgG(Vector lab BA-1000), 3,3'-디아미노벤지딘 기질(Vector Labs)을 갖는 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 검출 시스템을 사용했다. 샘플은 헤마톡실린으로 대비염색했다. 탈수는 알콜 욕(농도 95% 및 100%)에서 랙을 10 내지 20회 진탕시켜 격렬하게 탈수하고, 이어서 유키트(Eukitt) 수지(배치 A1113, KiNDO1500)로 슬라이드를 조립할 때까지 크실롤 욕에서 수행했다. 이미징에는 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) C1 공초점 현미경과 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TE2000-E를 사용했다.
사프라닌-O 염색
5㎛ 파라핀 조각 상의 글리코스아미노글리칸(GAG)을 밝히기 위해, 연골 구 및 천연 연골 포르말린-고정 파라핀-포매 샘플의 사프라닌-O 염색을 수행했다. 슬라이드를 크실롤에 의해 탈파라핀화하고, 최종 5분간의 증류수 욕으로 연속 알콜 욕(농도 100%, 95% 및 70%)에 의해 재수화했다. 이어서, 핵 대비염색에는 헤마톡실린 염색을 사용하고, 이어서 열탕으로 5분간 세척했다. 패스트 그린(Fast Green)(Sigma F7252)을 사용하여 세포질을 염색하고, 이어서 아세트산으로 세척했다. 슬라이드는 즉시 증류수로 세척했다. 수욕 중의 사프라닌-O 0.1%(Sigma S2255)를 GAG 염색에 2분 30초 동안 적용하고, 이어서 증류수로 반복하여 세척했다. 탈수는 알콜 욕(농도 95% 및 100%)에서 랙을 10 내지 20회 격렬하게 진탕시키고, 이어서 유키트 수지(배치 A1113, KiNDO1500)로 슬라이드를 조립할 때까지 크실롤 욕(Xylol bath)에서 수행했다.
다능성 평가
단층 확장 인간 MSC/ASC/연골세포는, 이들의 다능성을 평가하기 위해, 연골형성, 지방형성 및 골형성의 운명으로 분화되었다. 골형성 분화는 알리자린 레드 S(Merck, TMS-008-C) 염색을 사용하여 평가했다. 지방형성 분화는 오일 레드 O(Sigma, O1391) 염색을 사용하여 평가되고, 연골형성 분화는 사프라닌-O(Sigma, S2255)/패스트 그린 염색(Sigma F7252)을 사용하여 평가되었다.
생체역학 측정
압축 시험은 직경 0.68mm 내지 1.54mm 범위의 연골 비드 및 고유 연골에 1N 로드 세포를 구비한 MTS 기준 풀-푸시(pull-push) 기계(모델 42)을 사용하여 수행된다. 압축 속도는 0.01mm.s-1로 설정되고, 최대 부하 압축은 0.2N으로 적용되고; 프로빙된 표면적을 증가시키기 위해, 시험당 최대 10개의 비드를 사용했다. 원래의 유지 시스템은 비드의 슬라이딩을 방지하고 시험 중에 등방성 압축을 보장하기 위해 커스텀-메이드였다. 변위의 함수로서의 압축력은 생 데이터로서 측정되었다. 이어서, 응력-변형률 곡선을 계산하여, 선형 영역에서 데이터 세트의 기울기를 샘플의 표면적과 정규화 목적으로 비드 수로 나눈 것을 고려하여, 연골의 영률을 추정했다. 영률의 계산(Young's modulus)은 다음과 같이 수행되었다:
E= σ / ε, 여기서 σ는 압축 응력(kPa)이고, E는 영률(kPa)이고, ε는 정규화된 신도에 대응하는 변형률(단위 없음)이다.
면역블롯팅
포스파타제 및 프로테아제 억제제(완전한 항-프로테아제 칵테일; Roche)를 보충한 빙냉 RIPA 완충액(Life Technologies)에서 아이스 상에서 세포를 30분 동안 용해시켰다. 단백질(10μg)을 SDS-PAGE(BioRad)로 분리하고, PVDF 막(Amersham)으로 전달했다. 블롯은 항-포스포-β-카테닌(세포 신호전달; 5651T), TCF-4(세포 신호전달; 2569), Axin1(세포 신호전달; 2087), β-액틴 HRP(Sigma-Aldrich) 및 GADPH(세포 신호전달; 2118)(1:1000), 이어서 HRP-래빗 또는 마우스 접합 항체(1:5000)로 프로빙되었다.
유세포 분석
100,000개의 세포를 PFA 4%로 고정하고, 이어서 FAC 완충액(BSA-Azide-PBS)에서 실온에서 1시간 동안 CD73-CFS, CD90-APC 및 CD105-PerCP(Cell Sigma)에 대해 염색했다. 갈리오스(Gallios) 유세포 분석기로 최소 10,000개의 살아있는 세포를 취득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행했다. 결과는 CD73 및 CD90에 대한 3개의 독립적 실험의 평균을 나타낸다. CD105에 대해 2개의 독립적 실험을 수행했다. 게이팅 전략을 위해, 먼저 살아있는 세포를 선택하고, 이어서 FSC-W 및 FSC-A를 기반으로 단일 세포를 특정하여 이중선을 제거했다. 양성 염색은 CD73-CFS, CD90-APC 및 CD105-PerCP의 각각에 대한 음성 대조군 IgG-CFS, IgG-APC 및 IgG-PerCP를 기반으로 정의되었다.
RNASeq
전술한 바와 같이, SR100 - 라이브러리 TruSeqHT 스트랜드 - 일루미나(Illumina) HiSeq 4000을 사용하고, 서열분석 품질 관리를 FastQC v.0.11.5[참조: Cosset, E. et al. 2016. Biomaterials 107, 74-87]로 수행했다. 판독에 따른 품질 분포는 모든 샘플에 대해 평가 및 검증되었다. UCSC 인간 hg38 참조를 사용하여, STAR 정렬기 v.2.5.3a를 사용한 판독을 참조 게놈에 맵핑했다. 평균 맵핑률은 93.54%였다. 전사체 메트릭스는 피카드(Picard) 도구 v.1.141로 평가되고, 차등 발현 분석은 통계 분석 R/Bioconductor 팩키지 edgeR v. 3.18.1로 수행했다[참조: Gentleman, R. C. et al. 2004. Genome Biol 5, R80, Huber, W. et al. 2015. Nat Methods 12, 115-121]. 간단히 말해서, 카운트는 라이브러리 크기에 따라 정규화되고, 필터링되었다. 적어도 3개의 샘플에서 100만 판독당 카운트(cpm)를 초과하는 카운트를 갖는 유전자는 분석을 위해 유지되었다. 세트의 생 유전자 번호는 26'485였다. 발현이 불충분 또는 발현되지 않는 유전자는 제외되었다. 최종적 데이터 세트는 13,884개의 유전자로 구성되었다. 차등적으로 발현된 유전자 시험은 음의 이항 분포를 사용하여 정확한 시험으로 수행되었다. 차등적으로 발현된 유전자의 p-값은 5% FDR(거짓 발견율)에 의한 다중 검정 오차에 대해 보정된다. 사용된 보정은 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg; BH)이다. 차등적으로 발현된 유전자 시험은 음의 이항 분포를 사용하여 edgeR로 수행되었다. 차등적으로 발현된 유전자의 p-값은 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg; BH) 거짓 발견율(FDR)을 사용하여 다중 검정 오차에 대해 수정되었다.
팬테르(Panther) 분석을 사용하여, 각 유전자 패밀리(실체 수)에 대한 농후화도를 결정했다[참조: Mi, H. et al. 2017. Nucleic Acids Res 45, D183-D189].
RNA 추출 및 RT- PCR
총 RNA의 단리는 Qiagen의 RNeasy 키트를 제조원의 지시에 따라 사용하여 수행하고, 분광계를 사용하여 측정했다. 500ng의 총 RNA를 사용하여, PrimeScript RT 시약 키트(Takara)를 제조원의 프로토콜에 따라 사용하여 cDNA를 합성했다.
실시간(Real-time) PCR은 게노믹(Genomic) 플랫폼 코어 시설(University of Geneva)에서 QuantStudio 12K Flex 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 PowerUp SYBR 그린 마스터 믹스(Green Master Mix)(Applied Biosystems)로 수행되었다. 먼저, 효능 시험은 이용 전의 검증을 위해 모든 프라이머에 대해 수행했다. 각 샘플의 상대적 수준은 적어도 2개의 하우스키핑 유전자(ALAS1)로 정규화되었다. RT-PCR 반응은 적어도 기술적 및 생물학적으로 3회 수행되고, 평균 사이클 역치(CT) 값이 결정되었다.
안전성 연구를 위한 SCID /NOD 마우스에 인간 카르티비드의 이식
56마리의 수컷 SCID/NOD 마우스를 사용하여, 현재 표준화된 카르티비드의 안전성을 시험했다. 44마리의 마우스가 피하 이식에 의해 인간 카르티비드를 제공받았다. 1개의 대조군을 사용하고, 여기서 8마리의 동물에 비드로 명명된 응집된 A549 선암종 세포를 제공받았다(그룹당 마우스의 수를 표 3에 요약했다).
SCID 마우스에 이식된 카르티비드 공여자의 목록.
하기로부터의 마이크로조직 세포 계대 이식된 마우스 종양 (6개월)
공여자 #1 (M, 29) p6 10 0
공여자 #2 (M, 47) p3 10 0
공여자 #4 (M, 38) P6 14 0
공여자 #12 (F,74) P4 10 0
공여자 #13 (F,60 ) P3 10 0
A549 (선암) 8 100% (6주)
상이한 공여자 및 세포 계대(3 내지 6)로부터의 카르티비드를 SCID/NOD 마우스(그룹당 n=8 내지 14마리 마우스)에게 피하 주사했다. 선암종 세포주 A549를 양성 대조군으로 사용하고, 100%의 종양을 생성했다. 6개월에서 동물의 안락사 후, 카르티비드 이식으로 인한 체중 감소, 촉진에 의한 이상 또는 고통의 징후를 나타내는 마우스는 없었다. 또한, 폐, 심장, 간, 신장 및 비장에서 이상 또는 종양 존재의 증거는 관찰되지 않았다.
이식된 모든 인간 카르티비드는 표준화된 3단계 방법에 따라 배양되었고, 동일한 방식으로 이식되었다. 전신 마취는 4% 이소플루란, 이어서 5% 산소를 포함하는 마스크하에 2% 이소플루란으로 달성되었다. 70% 알콜로 배측을 면도한 후의 피부를 국소 소독한다. 후두부로부터 미측으로 0.5cm의 피부 절개를 수행했다. 생성된 200,000개 세포의 조직(카르티비드 및 선암종 비드)을 각각 멸균 피펫(1개 비드/동물)으로 피하 이식했다. 이어서, 피부를 외과용 접착제(Histoacryl, B. Braun Surgical S.A.)로 봉합했다. 피부 샘플의 부위와 방향을 특정하기 위해, 본 발명자들은 멸균된 26 게이지 바늘과 녹색 타투 잉크를 사용하여 4개 방위 기점의 타투를 수행했다. 대조군의 마우스는 4 내지 6주에 안락사시키고, 카르티비드 그룹의 마우스는 최대 6개월까지 추적했다. 피부와 장기를 채취하고, 각 단계에서 2명의 연구 구성원이 검사했다. 샘플은 모두 4% 포르몰로 1/3 보존하고, -20℃에서 건조 상태로 2/3 보존했다. 동물 절차는 스위스 연방 수의국(GE/12/18)에 의해 승인되었다.
비교 게놈 하이브리드화 어레이
게놈 안정성은, 어레이 비교 게놈 하이브리드화(CGH)를 사용하여, FBS 10% 또는 PRP 10%로 6일 동안 처리된 정상 인간 피부 섬유아세포와 비교하여 결정되었다. DNA는 QIAGEN QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen, Hilden)를 사용하여 제조원의 프로토콜에 따라 추출했다. 어레이 CGH는 아길런트 슈어프린트(Agilent SurePrint) G3 인간 CGH 마이크로어레이 키트 4_44K(디자인 ID 014950)를 사용하여 43Kb 전체 중앙 프로브 간격(Agilent Technologies)으로 수행되었다. 실제 해상도는 약 200kb였다. 환자의 DNA 및 성별을 일치시킨 대조군(각각 1㎍)의 DNA를, 각각 Cy3-dUTP 및 Cy5-dUTP(Sure Tag 표지 키트, Agilent Technologies)로 표지했다. 표지된 생성물은 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 30 K 필터(Millipore)에 의해 정제했다. 하이브리드화는 아길런트에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행했다. 환자 및 대조군 DNA를 풀링하고, 65℃에서 24시간 동안 회전시키면서 2mg의 인간 Cot-I DNA와 하이브리드화했다. 어레이는 아길런트 슈어스캔 마이크로어레이(Agilent SureScan Microarray) 스캐너와 아길런트 피쳐 추출(Agilent Feature Extraction) 소프트웨어(v11.5)를 사용하여 분석하고, 결과는 아길런트 게노믹 워크벤치(Agilent Genomic Workbench)(v.7.0)에 의해 제시되었다.
효능 연구를 위한 미니피그에서 자가 카르티비드의 이식
본 연구에서는 6마리의 성체 암컷 미니피그(37-48kg)가 사용되었다. 동물을 세보플루란으로 마취하고, 절개 30분 전에 예방적 항생물질(세파졸린: 2g/kg)를 정맥내 투여했다. 그들은 완전한 마취 상태에서 수술되었고, 피부 봉합의 5분 후에 발관되었다. 피부 소독을 3회 반복하고, 무균 드레이핑을 배출가능한 수술용 드레이프로 수행했다.
1단계 수술
1차 수술은 상외측 슬개골 접근법을 선택했다. 연골 채취는 외측 활차면의 외측 경계에서 수행되어, 2차 수술 단계 동안에 이후의 연골 병변과의 잠재적 충돌을 방지했다. 연골 생검은 추가 처리를 위해 배양 배지 E 용액에 넣었다. 단계적 봉합을 수행했다. 붕대는 적용되지 않았다.
2단계 수술
연골 채취의 5~6주 후, 미니피그는 내측 슬개골 건 접근법을 통해 2차 수술을 받았다[참조: Bonadio, M. B. et al. 2017. J Exp Orthop 4, 11]. 이 접근법에 의해, 공여자 부위의 범위에 기인하는 1개를 제외한 모든 미니피그에서 각각 내측 및 외측 대퇴부 활차 상의 2개의 병변이 생성되었다. 병변의 크기는 직경 6mm이고, 작은 큐렛에 의해 생성되고, 이어서 4-5개의 카르티비드의 단일 층으로 완전히 충전되었다. 더 빠른 부착을 위해, 티쎌(Tisseel)(Baxter)의 박층이 각 결함에 추가되었다. 이어서, 5차 병변이 내측 대퇴과에 생성되고, 동일한 방식으로 카르티비드로 충전되었다. 각 동물에서, 1개의 병변은 음성 대조군 병변으로서 상이한 위치에서 중공 상태로 유지되었다. 단계적 봉합을 수행했다. 붕대는 적용되지 않았다.
재활치료
마취가 종료된 직후에, 활동을 제한하지 않고 완전한 체중 부하가 가능해졌다.
안락사
3마리의 미니피그는 2차 수술의 3개월 후에 안락사시켰고, 나머지 3마리는 6개월 후에 안락사시켰다. 수술한 무릎을 절단하고, 원위 대퇴골을 추가 분석을 위해 포르밀 알데히드 용액에 넣었다.
동물 절차는 스위스 연방 수의국(GE/60/18)에 의해 승인되었다.
결과
카르티비드의 조작 및 특성화
이 연구에서, 본 발명자들은 GAG 함량 및 콜라겐 II 발현에 의해 정의되는 개선된 유리질 연골 특성을 갖는, 카르티비드로 명명된 연골 미세조직을 생성했다. 카르티비드 방법은 혁신적 3단계 프로토콜(도 1A)이고, 이는 (단계 1) 세포 탈분화를 특징으로 하는 2차원 배양(2D)에서의 연골세포 확장, 이어서 (단계 2) 연골형성 헌신으로 정의된 2D에서의 세포 재분화, 및 마지막으로 (단계 3) 연골세포의 응집에 의한 카르티비드 형성을 가능하게 하는 3차원 배양(3D)으로 이루어진다. 따라서, 인간 연골세포는 수술 폐기물로부터 효소적으로 추출하고 단계 1 및 2에서 대기 산소 조건(21%)에서 2D로 배양되고, 이어서 저산소 수준(5%)에서 3D 배양되었다.
연골세포는 유전자 발현에서 줄기 세포의 특성을 갖는 "섬유아세포"로 되고, 중간엽 줄기 세포 표면 마커(CD105, CD90, CD73)를 발현한다(도 6). 배지 1(배지 E)에서 배양한 후, 3주에 100,000개의 세포를 추출하고, 6,000만 내지 1억개의 세포를 수득할 수 있다.
제2 단계는 대규모 세포 증폭 단계 후의 섬유아세포 표현형의 연골세포 표현형으로의 "복귀"에 대응한다. 세포를 재분화(배지 2)로 3 내지 7일 동안 플레이팅한다. 0일차에, 2백만개의 세포를 T75 cm2 플라스크에 플레이팅하여 컨플루언스에 도달하고, 4일차로부터 8일차까지 컨플루언트로 유지한 후, 3D 배양을 위해 세포를 분리한다. T75 cm2 플라스크로부터, 단계 2에서 600만 내지 1000만개의 세포가 수득된다. 대조적으로, 탈분화 배지의 제1 단계에서는 컨플루언시에 도달했을 때에 T75에서 1200만 내지 1600만개의 세포가 수득된다. 재분화 배지(배지 R)에서의 FGF-2 성장 인자의 제거는 세포의 성장을 감소시키고, 연골 세포 완전 분화로의 표현형의 복귀 및 재분화를 가능하게 한다. 세포는 배양의 제2 단계에서 형태를 변경하고, 광학 현미경하에서 세포질에 명백한 과립형 소포체를 수반하여 덜 신장되고 더 커져서, 높은 수준의 단백질 합성 활성을 신호전달한다. 연골세포는 GAG와 관련된 프로테오글리칸인 아그레칸의 재발현을 개시한다(데이터 RNAseq). 2D 배양의 이 제2 단계에서, 콜라겐 II는 아직 재발현되지 않는다.
제3 단계에서, 세포를 배지 2(배지 R)의 배양물로부터 분리하고, 3D 배양물에 접종한다. 100 000 내지 200 000개 세포를 재분화 배양 배지(배지 3, 배지 I이라고도 함)의 폴리프로필렌 원뿔형 96웰 플레이트에 분주한다. 96웰 플레이트를 5분 동안, 300g 원심분리하여 세포를 응집시키고 펠렛을 형성한다. 96웰 플레이트는 세포가 웰 표면에 부착하는 것을 방지하기 위해 폴리프로필렌 소재로 제작된다. 배양물을 저산소 대기(5% O2)에서 인큐베이팅하여, 미세조직을 사용하기 전의 15일 동안 유리질 연골 생성을 증가시킨다.
연골세포로부터 조작된 카르티비드는 연골 병변을 치료하기 위한 ATMP로서의 가능성을 갖고 있다. 따라서, 이의 안전성 및 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 동물 모델(SCID 마우스 및 미니피그)을 사용했다(도 1B). 카르티비드를 더 잘 특성화하기 위해, 조직학적 정성 분석이 수행되었다. 사프라닌-O-염색된 GAG의 균질한 분포를 수반하는 유리질 특징의 존재가 나타나고, 유형 II 콜라겐의 강력한 면역검출과 상관되는 반면, 유형 I 콜라겐은 희미했다(도 1C).
본 발명자들은, 골관절염(OA) 환자를 포함하여, 80세 이하의 공여자로부터의 유사한 품질의 연골 조직(카르티비드로 명명됨)을 조작할 수 있었다. 카르티비드의 정량적 분석에 의해, GAG 함량이 높은 것으로 나타났고, 이는 환자 연령 및 관절의 골관절염 상태와 무관했다(도 1D, 표 2). 본 발명자들은 평균 40㎍의 GAG/카르티비드 및 평균 GAG/DNA 50(10;140)을 측정했다(도 2).
카르티비드의 생체역학적 특성을 특성화하기 위해, 본 발명자들은 압축 시험 후의 카르티비드의 탄성을 정량화하기 위해 적합시킨 커스텀-제작 주형을 갖는 장치를 사용했다. 영률은 압축 응력을 곡선의 탄성 부분의 변형률(정규화된 신장)로 나누어 계산했다[참조: Lee, J. K. et al. 2017, Nature Materials, 16:864-873]. 이 방법은 연골 탄성 시험에 일반적으로 사용되고, 이의 세포외 기질(ECM) 조성을 반영한다. 본 발명자들은 더 많은 GAG를 포함하는 카르티비드에 의한 제약 조건에 대한 저항의 증가를 관찰했고, 이는 기타 공개된 연구[참조: Omelyanenko, NP et al. 2018, Cartilage, 1947603518798890]와 일치하는 GAG 양을 증가시키는 이점을 시사한다(도 1E).
저산소증-유발 인자 1-알파(HIF-1α)는 ECM 성분을 유도하는 것으로 공지되어 있기 때문에[참조: Madeira et al. 2015, Trends in Biotechnology, 33:35-42], 본 발명자들은 대기 조건과 비교하여 카르티비드의 품질에 대한 3D 배양(5% 산소) 중의 저산소 수준의 영향을 평가했다. 예상된 바와 같이, 결과는 저산소 조건에서의 연골 비드의 유리질 품질의 개선을 나타냈다(도 3A-C). 주목할 것으로, 대기 조건에서의 표준 배양 조건은 실제에는 고산소증에 대응하고, 이는 천연 연골 조직에 기록된 산소 수준이 깊이에 따라 0.5 내지 5%이기 때문이다[참조: Lafont, J.E. 2010, Int. J. exp. Pathol. 91(2):99-106].
세포 치료에서, 이식되는 재료의 세포 성분의 안정성은 필수적이다. 따라서, 본 발명자들은 상이한 조건에서 카르티비드의 안정성 및 생존 세포의 비율을 평가했다. 본 발명자들은 성숙 단계의 종료 후 0일차의 카르티비드 중의 GAG 양을, 카르티비드를 추가로 6일간 4℃ 및 23℃로 유지하여 비교했다(도 4A). 결과는 GAG의 농도가 시간 및 무관심한 온도 변화에 따라 변화하지 않은 상태, 평균 55μg/카르티비드로 유지되는 것으로 나타났고, 이는 안정성을 나타낸다. 이러한 조건에서는 약간의 수의 죽은 세포만이 검출되었고(13%), 이는 카르티비드에서 연골세포의 양호한 생존을 시사한다(도 4B).
3단계 카르티비드 방법의 전사체 분석에 의해, 유리질 매트릭스의 품질과 관련된 중요한 경로로서 WNT 유전자의 낮은 수준 발현이 확인되었다.
유리질 연골의 생산 증가와 관련하는 분자 경로를 확인하기 위해, 3단계 카르티비드 방법을, 조직 공학에서 전통적으로 사용되는 2단계 방법과 비교했다(도 5A). 형태 면에서, 3단계 방법은 2단계 방법(직경 0.5 내지 1mm)보다 더 큰 백색 카르티비드(직경 1 내지 2mm)와 더 많은 양의 GAG/비드를 생성했다(도 2A-C). 3단계 방법에서의 카르티비드 유리질 품질의 개선은 주로 FGF-2에 의한 광범위한 세포 확장 후의 추가 단계의 도입으로 인한 것이다. 기아 단계에 대응하는 이 단계는 FGF-2를 포함하지 않는 배지 "R"을 사용하고, 이에 의해 연골 세포의 재분화 및 유리질 매트릭스 생산을 촉진한다. 양 방법 모두에서, 최종 단계는 TGF-β3 보충제를 포함하는 성숙 배지 I에서 2주간의 3D 배양으로 구성된다(도 5A).
카르티비드의 생산을 가능하게 하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 본 발명자들은 양 방법의 중요한 각 단계에서 3개의 공여자 샘플을 사용하여 RNA 서열분석(RNAseq) 분석을 수행했다. RNA는 3단계 카르티비드 방법의 상이한 시점에서 추출되었다: (i) 단계 1의 종료(증폭된 연골세포, 배지 E), (ii) 배지 R에서의 단계 2의 종료, 및 (iii) 단계 3의 15일 후(비드, 배지 I). 2단계 방법에서는 2개의 시점이 선택되었다: 단계 1(증폭된 연골세포, 배지 E) 및 단계 2의 종료(비드, 배지 I). 본 발명자들은 먼저 배지 I에서 양 방법에 의해 생성된 연골 미세조직을 비교했다(도 5B 및 C).
이들은 카르티비드(COL1A1, COL2A1, COL4A1, MMP1, MMP13, MMP11)의 ECM 조직과 함께 콜라겐 및 ECM의 분해/형성에 관여하는 유전자의 유의하게 높은 수준을 관찰했다. 차등 유전자 발현 분석은 3단계 방법이 카르티비드에서 훨씬 더 높은 수준의 유형 II 콜라겐(COL2A1)과 아그레칸(ACAN)을 유도하는 반면, 섬유연골에 특이적인 유형 I 콜라겐(COL1A1)은 2단계 방법에서 더 높은 것으로 나타났다(도 5C-F). GAG의 증가된 수준에 의해, 3단계 카르티비드 방법에서 연골 분화가 개선되는 것이 확인되었다(도 5G, 도 2A-C). 3단계 방법(M1+M2+M3)에서는 SOX9(매트릭스 생성에 관여하는 전사 인자)도 증가한다(도 7C).
이러한 데이터는 COL1A1 발현의 검출 및 유형 COL2A1 및 ACAN, GAG-연관 단백질 등의 유리질 연골 마커의 부재를 수반하는 배지 E(FGF-2 함유)에서 연골세포의 탈분화를 확인했다(도 5D-F). 본 발명자들은 유세포 분석에 의해 배지 E에서 탈분화 세포의 농후화를 확인했고, 이는 국제 세포 요법 학회(International Society for Cell Therapy; ISCT)에 의해 정의 제안된 바와 같이, 중간엽 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 세포의 비율이 확장기의 종료시에 전체 세포 모집단의 90% 이상이었음을 나타낸다(도 6A, 표 4).
탈분화된 연골세포의 유세포 분석.
공여자 27 공여자 14 공여자 18
CD73 99.7 99.8 99.6
CD90 93.2 99.7 99.7
CD105 89.2 92.9 90.7
표는 3명의 공여자로부터의 CD73, CD90 및 CD105에 대한 탈분화 연골세포의 유세포 분석을 나타낸다.
추가로, 이 탈분화된 연골세포 모집단의 다능성의 특성은 MSC와 비교하여 이 가능성이 낮게 유지되더라도, 기타 중간엽 줄기 세포(MSC) 파생 세포(골세포, 지방세포 및 연골세포)로 분화할 수 있는 능력이 있다는 사실에 의해 확인되었다(도 6B).
본 발명자들은 배지 R(재분화 단계)에서 배양된 세포의 유전자 발현을 배지 E(확장 단계)와 비교했을 때, 재분화 동안 염증 과정(인터페론 신호전달과 함께 인터루킨 및 사이토카인 신호전달)에 관여하는 유전자의 보다 높은 수준의 발현을 발견했다. 병행하여, 본 발명자들은 세포 사이클에 관여하는 유전자(MI67, CDK, CCNB1)의 낮은 발현 수준을 발견했고, 이는 유리질 매트릭스 생성이 세포 사이클의 종료와 관련된 세포 염증과 조직 리모델링 사이의 동적 밸런스를 필요로 한다는 것을 나타낸다(도 7A).
확장기를 재분화기와 비교함으로써, 본 발명자들은 확장기(단계 1, 배지 E, 양 방법 모두) 동안 WNT5A, WNT5B 및 WNT7B 유전자의 높은 발현 수준을 관찰했다(도 7B, D-F). 이들 유전자는 3D 배양에서 중간 발현을 나타내는 WNT5B(단계 3, 배지 I)를 제외하고 재분화 단계(배지 R, 3단계 방법) 및 3D 배양(배지 I, 양 방법 모두) 동안 강력하게 하향조절되었다(도 7E).
KI67(증식성 마커) 및 TCF4(wnt/베타 카테닌 경로의 하류에 관여)의 발현도 재분화 단계 동안 감소된다(도 7C). 가장 중요한 것으로, 탈분화 및 재분화 단계(M1+M2)의 후, 성숙 단계(M3)에서 구체의 형성 전에 KI67 및 WNT7B/WNT5B가 감소된다는 것이다. 세포를 사용하여 탈분화기(M1)로부터 직접 회전타원체를 형성하는 경우에도, KI67 및 WNT7B/WNT5B를 고도로 발현하고, 유리질 매트릭스 생성이 더 적어진다.
이러한 결과는 FGF-2 처리시의 WNT의 상향조절을 보고한 이전 연구와 일치한다[참조: Buchtova, M. et al. 2015. Biochim Biophys Acta 1852, 839-850; Deng, Y. et al. 2019. Biomaterials 192, 569-578]. 실제로, WNT 신호전달은 줄기-유사 표현형에 관여한다[참조: Buchtova, M. et al. 2015. Biochim Biophys Acta 1852, 839-850]. 따라서, 배지 R에서 FGF-2의 제거는 재분화기 동안 WNT 신호전달 하향조절을 유도했다. 본 발명자들은 3단계 방법과 비교하여 2단계 방법에서 더 낮은 수준의 COL2A1 및 ACAN 발현을 검출했다(도 5C-E). 그러나, 이들은 배지 I의 3D 분화 단계 동안 2단계 방법에서 WNT5A, WNT5B 및 WNT7B 유전자의 동등한 감소를 관찰했다(도 7B).
재분화기(배지 R) 동안 WNT 경로 하향조절의 역할을 검증하기 위해(도 1A), 본 발명자들은 배지 R을 10μM의 XAV-939, WNT 경로 억제제를 4일 동안 보충한 배지 E로 교환했다(도 7G). XAV-939 처리시, 본 발명자들은 WNT 신호전달 차단의 공지된 지표인 포스포-β-카테닌 및 액신(도 7G)의 증가를 관찰했다[참조: Huang, S. M. et al. 2009. Nature 461, 614-620]. 따라서, 배지 R과 유사하게, WNT의 약리학적 억제는 2D 및 3D 배양 후의 2단계 방법에서 ACAN 및 COL2A1 발현의 증가를 유도했다(도 7H, I). 결과적으로, WNT의 약리학적 억제는 GAG 사프라닌-O 염색에 의해 확인된 바와 같이 XAV-939의 존재하에 2단계 방법에서 수득된 비드의 유리질 특징의 존재를 초래했다(도 7J).
전체적으로, 전사체 분석에 의해, 연골세포의 탈분화 및 재분화에서 WNT 신호전달 경로의 관여 및 이의 조절이 이 반응의 잠재적 주요 매개인자로서 기능하는 WNT5A, WNT5B 및 WNT7B와 함께 확인되었다(도 7D-F). XAV-939를 보충한 배지 E는 배지 R의 효과를 모방하지만(도 7K), 3단계 방법에서는 고가의 약리학적 분자를 사용하지 않고 7일내에 WNT 유전자의 하향조절을 자연적으로 유도했다.
인간 연골 결손에서 생체외 실현가능성 연구
카르티비드의 임상 적용의 맥락에서, 본 발명자들은 카르티비드가 융합하고 생체외 인간 무릎 관절에서 생성된 병변으로 통합하는 능력을 평가했다. 병변은 8mm 외과적 펀치 생검으로 생성하고, 건조 상태에서 20 내지 50개의 카르티비드로 충전했다. 카르티비드를 그 상태에서 20분 동안 유지하여, 카르티비드의 병변 부위로의 부착을 촉진하고(도 8A, 좌측 및 중앙 패널), 이어서 배지 I을 첨가했다. 이어서, 병변이 카르티비드로 충전된 표본 전체를 영양소의 대량 이동을 촉진하기 위해 1개월 동안 회전으로 배양했다. 이식의 1개월 후, 본 발명자들은 골-연골 조직을 분석하고(도 8A, 우측 패널), 충전된 병변의 수준에서 사프라닌-O 염색을 수행했다(도 8B). 본 발명자들은 병변 내의 유리질 특성의 유지, 및 카르티비드와 본래의 주변 조직과의 어느 정도의 통합 및 카르티비드 상호간의 융합을 관찰했다(도 8B).
시험관내 및 생체내에서의 카르티비드의 전임상 안전성 연구
시험관내에서 확장된 세포의 이식은 잠재적 제어되지 않은 증식의 문제를 제기한다. 카르티비드의 안전성은 전임상 연구를 통해 평가되었다. CGH(비교 게놈 하이브리드화) 어레이 분석은 11 계대까지의 세포 증폭 동안 연골세포의 유전적 안정성을 나타냈다(표 5).
CGH-어레이에 의해 분석된 공여자 카르티비드의 목록
CGH-어레이에 의해 분석된 공여자 세포 계대
공여자 3 (M, 29) P4 & P8
공여자 2 (M, 47) P3 & P11
공여자 20 (M, 38) P4
공여자 18 (M, 58) P4
공여자 23 (M, 63) P3 (Y 손실)
공여자 13 (F, 64) P5
공여자 8 (F, 65) p4
공여자 21 (M, 68) P5 (Y 손실)
공여자 14 (M, 69) P5
공여자 9 (M, 80) P4 (Y 손실)
연골세포의 유전적 안정성은 FGF-2의 존재하에서 배지 E를 광범위하게 확장한 후, 계대 3으로부터 11까지 배양된 10개의 공여자 샘플에서 비교 게놈 하이브리드화(CGH) 어레이 분석을 수행함으로써 평가했다.
이전 연구와 일치하여, 염색체 Y의 손실은 남성의 정상 노화에서 일반적 후천적 돌연변이이고, 고령 공여자의 일부(43%)에서 관찰되었다[참조: Thompson, D. J. et al. 2019. Nature 575, 652-657; Stumm, M. et al. 2012. Osteoarthritis and cartilage 20, 1039-1045].
생체내 연구에서, 본 발명자들은 SCID 마우스에서 이식된 인간 카르티비드의 잠재적 종양형성 효과를 평가했다. 카르티비드는 확장되지 않았고, SCID 마우스에 이식 6개월 후에는 대부분 감지할 수 없었고, 따라서 6개월의 추적 조사에서 잠재적 종양형성성의 부재를 확인했다(도 9A-C, 표 5).
생체내 전임상 효능 연구
임상 적용을 향해 진행하기 위해, 본 발명자들은 연골 성숙도 및 인간과 유사한 무릎 해부학을 위해 선택된 성체 괴팅겐 미니피그에서 전임상 효능 연구를 수행했다[참조: Christensen, B. B. et al. 2015. Journal of Experimental orthopedics 2, 13; Pfeifer, C. G. et al. 2017. Tissue engineering. Part C, Methods 23, 745-753]. 6마리의 암컷이 연구에 사용되었다. 무릎으로부터 연골 생검(약 30mg)을 수집하여 자가 미니피그 카르티비드를 생산하기 위해, 1차 수술이 수행되었다. 동물/우측 무릎당 4 내지 5개의 병변을 유도하고 자가 카르티비드를 이식하기 위해, 2차 수술이 수행되었다. 미니피그는 3개월 내지 6개월 사이에 추적되었다(도 10A, 도 11). 이식 전에 미니피그 카르티비드의 GAG 양을 정량화하고, 평균 40 내지 50μg/비드의 범위였다(도 10B). 이식후 3개월에서, 본 발명자들은 사프라닌-O 염색에 의해 미니피그 카르티비드로 이식된 병변의 유리질 특징을 확인했다(도 10C). 유사한 결과가, 이식후 6개월의 이식된 병변으로부터 수득되었다(도 10D). 카르티비드의 완전한 융합과 주변의 천연 연골 및 연골하 골로의 이의 통합이 3개월 및 6개월의 추적 기간에 모든 미니피그에서 관찰되었다(도 10C-D). 종합적으로, 자가 카르티비드는 이들의 유리질 품질을 유지하면서 병변으로의 생착과 관련하여 이들의 효능을 입증했다. 또한, 2명의 독립적 조작자에 의해 거시적 검사에서, 관절의 변성(도 11, 중앙 패널)이나 이소성 또는 비후성 조직 형성도 확인되지 않았기 때문에, 안전한 것이 입증되었다(데이터는 표시되지 않음).
토론 및 결론
본 연구의 주요 성과는 확장 중의 연골세포 표현형의 손실(연골세포의 탈분화)을 역전시킬 수 있는 방법이다. 이것은 연골세포를 출발 물질로 사용하는 세포 치료에서 직면하는 중요한 문제를 해결한다. 현재의 데이터는 환자의 연령과 관절의 관절염 상태에 관계없이 신규한 3단계 방법이 유리질 특성을 갖는 고품질의 연골을 생성할 수 있음을 나타낸다.
카르티비드 방법에서는, 종래의 인간 연골세포 기반 세포 요법에서 평균 260mg인 것과 대조적으로, 매우 작은 연골 채취 샘플(전임상 미니피그 연구에서는 약 30mg)으로부터 세포 확장이 가능하고[참조: Brittberg, M. 2008. Injury 39 Suppl 1, S40-49], 이는 공여자 부위의 이환율을 저하시킨다. 본 방법은 이전에 보고된 연골 미세조직보다 20배 더 높은 GAG/카르티비드의 비율을 나타냈고, 이는 이러한 연골 미세조직이 덜 유리질이고 더 많은 섬유연골을 함유하는 것을 시사한다[참조: Bartz, C. et al. 2016. J Transl Med 14, 317]. 이러한 결과와 일치하여, 본 발명자들은 기타 공개된 방법보다 적어도 3배 더 높은 GAG/DNA 비율을 평균적으로 수득했다(도 2B)[참조: Mumme, M. et al. 2016. Lancet 388, 1985-1994; Dang, P. N., Solorio, L. D. & Alsberg, E. 2014. Tissue engineering. Part A 20, 3163-3175].
재분화는 FGF-2의 제거로 인한 것이다. 그러나, 3D 배양에서 제거하는 것은 2-단계 방법에서 유리질 매트릭스 합성을 유도하기에 충분하지 않았다. 연골세포의 재분화는 매트릭스에서 코팅된 플라스크에 대한 세포 부착 및 2D 배양에서 특정 세포 신호전달 경로의 유도를 필요로 할 가능성이 가장 높다. FGF-2의 기아는 WNT 신호전달 경로의 몇몇 유전자를 포함하여 다능성 및 줄기세포성에 관여하는 유전자를 차단한다. WNT 신호전달은 성체 전구 세포의 연골형성 분화의 억제 및 자극 모두에 관여한다[참조: Day, T. F. et al. 2005. Developmental cell 8, 739-750; Hill, T. P., et al. 2005. Developmental cell 8, 727-738; Hu, H. et al. 2005. Development, 132, 49-60]. 배아에서 보는 바와 같이, 높은 수준의 WNT/β-카테닌 신호전달은 줄기 세포의 연골형성 분화를 억제하는 반면, 이 경로의 하향조절은 연골형성을 유도한다[참조: Hartmann, C. 2007. Molecules and cells 24, 177-184; Johnson, M. L. & Rajamannan, N. 2006. Reviews in endocrine & metabolic disorders 7, 41-49, Westendorf, J. J., Kahler, R. A. & Schroeder, T. M. 2004. Gene 341, 19-39].
본 연구에서, 본 발명자들은 WNT5A, WNT5B 및 WNT7B를 이 메커니즘에 관여하는 가능한 WNT 이소형으로 동정했다. WNT 경로의 하향조절과 병행하여, 본 발명자들은 염증 경로에 관여하는 유전자(인터류킨, 사이토카인)의 발현 증가를 관찰했다. 창상 치유 및 조직 수복에서는 염증 유발 인자와 항염증 인자 사이의 동적 밸런스가 효과적 치유에 필수적이다[참조: Gerhard T. Laschober et al. 2011. Rejuvenation Research 14, 119-131; Bosurgi, L. et al. 2017. Science 356, 1072-1076]. 따라서, 본 데이터는 염증이 유리질 매트릭스 생합성과 관련되는 조직 재생을 위한 전제조건인 것을 시사한다[참조: Karin, M. & Clevers, H. 2016. Nature 529, 307-315].
인간 카르티비드는 SCID 마우스에 이식되었을 때에 증식하지 않았고, 6개월 후에도 소실되었고, 이는 유사한 연구와 일치한다[참조: Zscharnack, M. et al. 2015. J Transl Med 13, 160]. 또한, 미니피그에서 카르티비드의 자가 이식은 병변으로의 안정한 통합을 나타내고, 높은 수준의 GAG를 유지하고, 이식 후 6개월에서 연골 손상을 성공적으로 수복했다. 요약하면, 본 발명자들은 대형 동물 모델에서 높은 수준의 GAG를 함유하는 카르티비드 이식의 실현가능성을 밝혀냈고, 이는 장기적 연골 수복의 가능성을 뒷받침했다. 결과적으로, 카르티비드는 연골 수복의 분야에서 획기적 제품이고, 연골 손상의 환자에서 자가 연골 이식을 위한 임상 시험 1상(First-in-Human)에 진입할 수 있다.

Claims (13)

  1. 연골 조직(cartilage tissue)을 시험관내 생산하기 위한 방법으로서,
    i) Wnt 신호전달 경로(signaling pathway)를 활성화하는 탈분화 배양 배지(dedifferentiation culture medium) 중의 부착성 배양 시스템(adherent culture system) 상에서 연골세포를 배양하여, 섬유아세포-유사 세포(fibroblastic-like cell)의 형태를 갖는 연골세포를 수득하는 단계;
    ii) Wnt 신호전달 경로를 불활성화하는 재분화 배양 배지 중의 부착성 배양 시스템 상에서 상기 섬유아세포-유사 연골세포를 배양하여, 유리질 매트릭스(hyaline matrix)를 재합성하는 전체 능력(full capacity)을 갖는 연골세포를 수득하는 단계;
    ii) 단계 ii)에서 수득된 상기 연골세포를, Wnt 신호전달 경로의 불활성화를 유지하는 유도/성숙 배양 배지 중의 3차원 배양 시스템에서 배양하는 단계를 포함하는, 연골 조직을 시험관내 생산하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탈분화 배양 배지가 FGF-2를 포함하고, 재분화 배양 배지 및 유도/성숙 배양 배지가 FGF-2 비함유 배지인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈분화 배양 배지가 FGF-2, PDGF-BB, TGF-β 및 EGF, 바람직하게는 FGF2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재분화 및 성숙 배양 배지가 TGF-β, 바람직하게는 TGF-β3, 보다 바람직하게는 TGF-β3 및 FGF7을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재분화 배양 배지가 혈소판 용해물을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈분화, 재분화 및/또는 성숙 배양 배지가 혈청을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 배지가 인슐린, IGF-1, 셀레늄, 트랜스페린 및 에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골세포가 단계 iii)에서 10% 미만의 O2(v/v)를 포함하는 저산소 대기(hypoxia atmosphere)에서 배양되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골세포가 단계 i)에서 10 내지 15일 동안, 단계 ii)에서 4 내지 8일 동안 및/또는 단계 iii)에서 10 내지 15일 동안 배양되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)의 연골세포가 대상체(subject)로부터, 바람직하게는 인간 또는 말(horse) 대상체의 연골 조직으로부터 단리되는, 방법.
  11. 적어도 15의 GAG/이본쇄(double strand) DNA 비율을 나타내는 구상(spheroid) 형태의 조작된(engineered) 연골 조직.
  12. 제11항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체에서 연골 결손 및 연골 변성 질환의 치료에 사용하기 위한, 바람직하게는 자가이식에 사용하기 위한, 조작된 연골 조직.
  13. 연골 변성 공정(process)을 억제하는 분자를 스크리닝(screening)하는 방법으로서,
    i) 제11항의 연골 조직을 하나 이상의 후보 분자(candidate molecule)와 접촉시키는 단계 및
    ii) 연골 변성 공정을 억제하는 분자를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
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