CN102688524A - 包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含间充质干细胞(MSC)样去分化细胞的人工软骨及其制备方法，所述去分化细胞通过传代培养肋软骨细胞获得。

Description

包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法。
背景技术
关节软骨损伤是一种非常常见的影响数百万人关节的问题。由于在这些组织中没有血管和缺少干细胞，成熟软骨的再生能力受到了限制。虽然扩大到软骨下骨的缺损会激发纤维或纤维软骨组织的形成，其还是将经受早期退化，因为该修复组织在生物化学和生物力学方面不同于透明软骨。
已经开发了各种用于修复关节软骨缺损的临床处理，但成就有限。骨髓刺激方法(精细关节整形外科和钻孔关节整形外科)穿透软骨下骨，并刺激骨髓内的多能干细胞把缺损修复成为纤维组织或纤维软骨。然而，这些方法具有如下缺点：修复的纤维软骨缺乏如同正常透明软骨具有的生物化学和生物力学性质。更进一步，对大面积缺损、骨关节炎和年老的病人，它们的作用也没有被证明。对于小尺寸的缺损，骨软骨/软骨的移植是简单和有效的，但是如果组织是从低重量部位向高重量部位移动，由于移植部位的非生理承重，将引起有害的压缩。骨膜和软骨膜移植具有引起新细胞集结的潜在益处，所述新细胞集结能够构造软骨，但也具有缺点：透明样修复组织有通过软骨骨发生而钙化的趋势。
此外，已经发展了几个基于细胞的利用软骨细胞、间充质干细胞(MSC)、骨膜细胞和软骨膜细胞的工艺。成软骨祖细胞例如间充质干细胞、骨膜细胞和软骨膜细胞作为修复骨软骨缺损的潜在细胞源变得越来越流行。然而，所述祖细胞构造关节软骨细胞的能力是受限的，而且病人的年龄与临床结果直接相关。更进一步，据报道该修复透明样组织有钙化的趋势。
自体关节软骨细胞移植(ACT)已经被临床应用于关节软骨的小缺损，但仅有限的成就被报道。虽然关节软骨细胞可以被轻易地通过酶消化从成熟关节软骨中分离，但是采集和移植这两步需要侵入关节，并且是相当昂贵的。因此自体关节软骨细胞移植不能被应用到超过两个的小损伤、尺寸大于10cm2的损伤、类风湿性或免疫相关的关节炎病人和由于随年龄增长关节软骨退化的老年病人。
此外，仅关节软骨体积的百分之一到二是软骨细胞，其中对于培养物，大约2000细胞/mg人关节软骨可以被分离用于培养。对于自体关节软骨细胞移植步骤，如果以类似于正常人膝关节发现的细胞密度植入，平均3cm2的缺损需要9×106细胞。事实上，由于26％的年龄小于40的有IV级软骨软化损伤的病人具有多处损伤，自体关节软骨细胞移植需要更多的细胞。因此，为以类似于正常人关节软骨所示细胞密度来充分填充缺损的体积，需要大量的软骨细胞。
在用于细胞扩充的连续单层培养期间，软骨细胞趋于停止表达软骨特异蛋白多糖和II型胶原，并转到表达产生少量蛋白多糖的I型胶原。这种去分化是限制体外细胞扩充和自体关节软骨细胞移植应用的主要问题。
更进一步，肋软骨是哺乳动物体内最大的永久透明软骨，其已经被建议作为关节软骨、外耳和气管的重构中用于自体移植的可能的替代供给源。肋软骨已经被用于修复小关节，例如拇指指节间关节和颞下颌关节中骨软骨的缺损。肋软骨作为供给组织看起来与关节软骨相比有几个优点。甚至在80岁或更老的病人中也检测到了活动的增殖软骨细胞，而且小于60岁的病人有大量的肋软骨可用。另外，肋软骨是充足的，而且其容易的外科可及性允许对供体部位较小的损害。因此，如果肋软骨具有与关节软骨的透明软骨相同的表现型，它可以被认为是用于治疗各种关节软骨紊乱病最有益的来源，例如类风湿性关节炎、骨关节炎和关节软骨缺损。
然而，迄今为止，仅进行了移植肋软骨本身到关节软骨部分的自体组织移植，还没有尝试从肋软骨分离软骨细胞通过组织工程方法来再生关节软骨。
此外，单独软骨细胞或软骨形成细胞的移植已经被证明在兔模型中是成功的，但由于移植细胞存活力的损失和在缺损部位固定软骨细胞的困难，治愈率是有限的。为克服与外科步骤相关的困难和找到保持软骨细胞于缺损部位不在关节腔内外流的方法，已经研究了新的作为支架的不同生物材料载体方法，细胞被接种到所述支架上。理想的支架将是生物相容的、生物可吸收的或可塑的，并且提供促进新组织生长的骨架。它们还应该显示与关节软骨功能相容的材料和机械性能。各种生物材料，自然产生的例如基于胶原的生物材料；I和II型胶原或胶原/葡萄糖胺聚糖(GAG)复合物和合成的例如聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLLA)，或它们的复合混合物，PLGA(聚D，L-乳酸-乙醇酸共聚物)，已经被引入作为软骨修复的潜在的细胞载体物质。它们在体外和体内实验中都显示了，软骨特异的细胞外基质(ECM)组分例如II型胶原和GAG在调节软骨细胞表现型的表达和支持软骨形成中起到了关键的作用。
壳聚糖是几丁质的碱性去乙酰化产品，是去乙酰程度和分子量不同的聚-D-葡糖胺单元的族。许多研究者建议壳聚糖可能被考虑作为用于结缔组织修复的结构生物材料，因为其结构类似于在细胞外基质中发现的GAG。壳聚糖和某些它的降解产品可以用于关节液体组分的合成，例如软骨素、硫酸软骨素、硫酸肤质素、硫酸角质素和透明质酸(HA)。这些物质是软骨营养所必需的。事实上，壳聚糖是聚阳离子的，其结构类似于透明质酸，所述透明质酸是关节软骨细胞外基质的重要分子，对软骨组织工程具有特别的重要性。最近已经评论了基于壳聚糖的间质在透明软骨的组织工程中的用途。Lahiji et al.(2000)报道了，在壳聚糖薄膜上培养的软骨细胞保持了分化表现型并表达软骨特异的细胞外基质蛋白质例如I I型胶原和硫酸蛋白多糖。壳聚糖用于强化新软骨形成的研究已经揭示了，当生长在壳聚糖薄膜上时，壳聚糖具有促进软骨细胞表现型维持和软骨特异细胞外基质组分生物合成的能力(Lahiji et al.2000)。壳聚糖还表现为强化骨祖细胞分化和加强骨形成。
透明质酸在许多生物进程中起重要作用，例如组织水合作用、在细胞外基质中的蛋白多糖(PG)机化和细胞分化。它还是健康关节软骨的组成部分。Patti et al.(2001)报道了透明质酸在体外改善基质粘附能力和人软骨细胞的增生活性。透明质酸还在关节炎早期改善临床功能(Patti et al.，2001)。
更进一步，对于结缔组织细胞和间充质干细胞，成纤维细胞生长因子(FGF)是强促细胞分裂剂(J.Cell Biol.100，477-485，1985)。在细胞扩充期间，成纤维细胞生长因子抑制F肌动蛋白结构的形成，以维持关节软骨细胞的软骨形成潜力。(Exp.Cell Res.253，681-688，1999)。并且，成纤维细胞生长因子已知在许多有丝分裂中维持间充质干细胞的多族分化(multifamilydifferentiation)。
发明概要
首先，本发明的发明人已经研究了获得自肋软骨的软骨细胞是否可以用作组织工程人工软骨的细胞源。并且，他们已经研究了解决问题的方法，所述问题为由于在传代期间的去分化，软骨细胞趋于失去软骨细胞表现型。更进一步，他们还继续评价了接种肋软骨细胞的基于壳聚糖的支架是否可以被用于关节软骨再生。
结果，他们发现获得自肋软骨的软骨细胞与获得自关节软骨的软骨细胞相比，更适合作为软骨修复的供体细胞源。并且，通过在分化可诱导培养基中将它们再分化成为期望的细胞他们发现在传代期间去分化的软骨细胞显示间充质干细胞性质，以证实它们用作细胞治疗剂以及人工软骨的能力。另外，本发明人证实加载软骨细胞的基于壳聚糖的支架，当被移植到关节缺损时，显示了有效的关节再生，以实现本发明。
因此，本发明的目地是提供一种包含间充质干细胞样去分化细胞的人工软骨及其制备方法，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。
附图说明
图1显示关节软骨细胞(AC)和肋软骨细胞(CC)体外细胞扩充能力的比较。
图2和3显示关节软骨细胞和肋软骨细胞在各自的传代中的形态变异和II型胶原的表达。
图4显示在P7的肋软骨细胞形态学，图5和6显示I、II型胶原和平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体的表达。
图7显示在达尔伯克改良伊格尔培养基-胎牛血清(DMEM-FBS)、间质干细胞生长培养基(MSCGM)和间质干细胞生长培养基-成纤维细胞生长因子(MSCGM-FGF)中的细胞扩充率。
图8和9分别显示在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中培养的细胞的I型胶原、II型胶原和平滑肌肌动蛋白抗体表达。
图10显示番红精-O对葡萄糖胺聚糖染色的结果，以确认在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中细胞培养物分化为软骨细胞的情况。
图11显示P7肋软骨细胞在软骨分化培养基中以团块形式，再分化为软骨的结果。
图12显示番红精-O对葡萄糖胺聚糖染色的结果，以证实分化为软骨细胞。
图13显示作为成骨分化初始标记物的细胞中的碱性磷酸酶的表达，所述细胞被诱导以分化为成骨细胞，图14显示作为成骨细胞分化标记物的茜红染色的结果。
图15显示油红O对细胞中脂类小滴染色的结果，所述细胞被诱导分化为脂肪细胞。
图16显示通过肋软骨细胞加载的基于壳聚糖的支架来修复关节软骨缺损的方法。
图17为通过MTT分析显示在胶原-葡萄糖胺聚糖海绵(COL-GAG)、壳聚糖海绵(CS)和透明质酸包被的壳聚糖海绵(CS-HA)中软骨细胞生长率的比较。
图18显示前胶原I型C-肽(PIP)和GAG的测量结果。
图19显示苏木精和伊红(H & E)染色后的细胞形态。
图20显示通过番红精-O染色和固绿染色显示葡萄糖胺聚糖的累积量。
图21和22分别显示对I型胶原和II型胶原免疫染色的结果。
图23显示关节软骨缺损的修复组织的总体外观。
图24到26显示光学显微镜下关节软骨缺损的修复组织。
图27显示对在关节软骨缺损的修复组织中葡萄糖胺聚糖分布，用番红精-O染色的结果。
图28显示对关节软骨缺损的修复组织中的I型和II型胶原，用免疫染色的结果。
图29是人工软骨的目视图片，所述人工软骨来自于在软骨形成培养基中加载于基于壳聚糖的支架上的间充质干细胞样去分化的细胞。
图30显示对在软骨形成培养基中再分化的软骨细胞内的葡萄糖胺聚糖，用番红精-O染色的结果。
图31是兔关节软骨缺损在移植间充质干细胞样去分化的加载于基于壳聚糖的支架上的细胞6周后的目视图片。
发明内容
第一，本发明涉及一种包含间充质干细胞样去分化细胞的人工软骨，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。优选，肋软骨细胞在MSCGM中传代，特别是，包含成纤维细胞生长因子(FGF)的MSCGM更有利于细胞扩充及分化为软骨。
第二、本发明涉及一种包含再分化软骨细胞的人工软骨，所述再分化软骨细胞通过在软骨形成培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。在一个具体方案中，间充质干细胞样去分化细胞是在软骨形成培养基中聚集培养的。
第三，本发明涉及一种人工软骨，其中软骨细胞被加载到基于壳聚糖的支架上。所述基于壳聚糖的支架优选选自：壳聚糖海绵；包含转化生长因子-β(TGF-β)的壳聚糖海绵；透明质酸(HA)包衣的壳聚糖海绵；硫酸软骨素包衣的壳聚糖海绵和壳聚糖-胶原复合海绵。更优选，基于壳聚糖的支架是透明质酸包衣的壳聚糖海绵或透明质酸包衣的壳聚糖-胶原复合海绵。
第四，本发明涉及一种制备人工软骨的方法，包括传代肋软骨细胞以获得间充质干细胞样去分化细胞的步骤。在一个具体方案中，将肋软骨细胞在MSCGM或包含成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代。在另一个具体方案中，通过传代肋软骨细胞获得的间充质干细胞样去分化细胞通过在软骨形成培养基中培养来再分化，优选通过在软骨形成培养基中聚集培养。在另一个具体方案中，该方法包括加载间充质干细胞样去分化细胞到基于壳聚糖的支架的步骤。
第五，本发明涉及一种包含间充质干细胞样去分化细胞的细胞治疗剂，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。在一个具体方案中，该细胞治疗剂包含再分化软骨细胞，所述再分化软骨细胞通过在软骨形成培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。在另一个具体方案中，该细胞治疗剂包含成骨细胞，所述成骨细胞通过在成骨培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。在另一个具体方案中，该细胞治疗剂包含脂肪细胞，所述脂肪细胞通过在脂肪形成培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。
下面，本发明被更详细的解释。
在自体关节软骨细胞移植中对于关节软骨修复的主要技术限制是不在膝关节承受重量的供体软骨具有低的细胞生长量，和按照在体外细胞扩充期间的软骨细胞去分化，难以获得合适数量的软骨细胞用于覆盖软骨缺损。另外，自体关节软骨细胞移植应用的成功受到患者年龄和供体部位有限的限制。
因此，在本发明中，首次评估肋软骨是否可以用作自体关节软骨细胞移植的供体细胞源，所述肋软骨在其存在期间保持较长的生长量而且在体内有较大的供体组织。首先，基于原始细胞产量、细胞扩充率和去分化，评价分离自肋软骨的软骨细胞是否可以用作组织工程关节软骨的潜在细胞源。特别的，在本发明中，将获得自肋软骨的软骨细胞的原始细胞产量和在单层培养中的细胞扩充率与从关节软骨获得的软骨细胞进行比较。另外，通过细胞形态和II型胶原的表达来评估体外细胞培养期间的去分化率。
结果，肋软骨的原始细胞产量是关节软骨的2.6倍。在体外细胞培养期间，肋软骨细胞(CC)与关节软骨细胞(AC)相比生长更快，而且细胞扩充至P4的速度大约是关节软骨的3倍。在连续培养期间，关节软骨细胞和肋软骨细胞包逐渐地失去它们的软骨细胞表现型，相反转变为成纤维细胞样细胞，而且II型胶原的表达减少。肋软骨细胞与关节软骨细胞相比它们原始表现型丢失得更快。比较相同的传代数，肋软骨细胞与关节软骨细胞相比去分化更快。
由来自相同兔的关节软骨细胞和肋软骨细胞的比较代表的首次培养的结果显示肋软骨能用作骨关节炎修复的潜在细胞源，所述第一培养物的结果具有按照体外细胞扩充传代的去分化和生长分布图。
在进一步研究中，本发明人证实通过传代肋软骨获得的去分化细胞具有间充质干细胞的性质。间充质干细胞是软骨形成祖细胞，意味着可以作为用于修复骨软骨缺损的潜在细胞源。因此，在本发明中，首先公开了获得自肋软骨细胞的间充质干细胞样去分化细胞是软骨形成祖细胞，所述软骨形成祖细胞能被用于骨软骨缺损的修复。
根据本发明的间充质干细胞样去分化细胞能分化为成骨细胞和脂肪细胞以及软骨细胞。因此，在本发明中，术语“间充质干细胞样去分化细胞”指通过传代去分化的和具有分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等等的潜能的细胞，如间充质干细胞。也就是说，这个术语指多能细胞。
在进一步的研究中，本发明人公开当肋软骨细胞特别是在包含成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代时，细胞扩充率是显著的，向软骨细胞的分化是优秀的。可以预料，如果向其中添加成纤维细胞生长因子，包含DMEM的正常细胞培养基可以具有相同的结果。
此外，在本发明中，作为用于加载软骨细胞的支架，基于壳聚糖的支架，特别是海绵形态的透明质酸包衣的壳聚糖支架被用于评价被加载到透明质酸包衣的壳聚糖复合支架上的培养自体肋软骨细胞，在修复动物模型中承受重量位置的全层关节软骨缺损的作用。兔膝模型已经被广泛应用于软骨修复的评估，4至6个月龄的兔髌骨凹槽中全层3mm直径的软骨缺损在6至8周之内自然痊愈。因此，需要这个时期揭示表面上愈合软骨的大多数退化故障。在如下的设计动物模型试验中(4mm直径骨软骨的缺损)，可以表明，根据本发明在基于壳聚糖的支架内的自体肋软骨细胞非常有效的修复了在承受重量位点的全层关节软骨缺损。
以下，本发明将参考下述实施例被更详细的描述，但本发明的范围将不会被解释为借此以任何方式限制。
具体实施方式
实施例
实施例1：评价肋软骨细胞是否可以作为修复关节软骨的供体细胞源材料和方法
软骨细胞的分离
从3至4个月大的新西兰白兔中获得关节软骨和肋软骨，然后称重。为了采集肋软骨，动物被通过静脉注射甲苯噻嗪盐酸盐(2mg/kg体重，Rompun，Bayer，Korea)和氯胺酮盐酸盐(6-10mg/kg体重，ketalar，Yuhan Co.，Korea)的混合物麻醉。将胸部附近的皮肤刮净，用酒精清洗，并用聚维酮碘溶液备皮。打开右胸的背侧，暴露第9和第10肋软骨，在移除软的粘附组织之后，称重肋软骨。这些软骨被切碎为1-2mm3的块，并在D-PBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水；Jeil Biotech services Inc.，Taegu，Korea)中漂洗3次。漂洗后，将切碎的软骨在多酶鸡尾酒溶液37℃和5％CO2条件下消化整夜，所述多酶鸡尾酒溶液包括胶原酶D(2mg/ml，Roche Diagnostic GmbH，Germany)，透明质酸酶(1mg/ml，Roche)，和脱氧核糖核酸酶(0.75mg/ml，Roche)。将所述溶液通过53μm的尼龙网孔，分离的细胞用补充有10％胎牛血清(FBS；Hyclonetechnologies，U.S.A.)和1％青霉素/链霉素/两性霉素B鸡尾酒(Gibco)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium；Gibco Life Technologies，GrandIsland，NY，U.S.A.)洗涤2次，活细胞在血球计上基于锥虫蓝排除法计数。细胞以5×105细胞/100mm直径平皿的细胞密度接种，每隔一天更换培养基，每次更换时添加新配制的50μg/ml的L-抗坏血酸(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)。汇合的原生细胞传代培养直到P4。
MTT分析
将各自传代的关节软骨细胞和肋软骨细胞以1×105细胞每孔的细胞密度种植到6孔培养平板上培养5天。细胞的生长根据MTT分析测定(Mosman T.Rapidcolormetric assay for cellular growth and survival，application toproliferation and cytotoxicity assays，J.Immunol.Methods 1983；65：55-63)。为了以光密度(O.D.)校准细胞数目，在1到8×105细胞范围内绘制标准曲线，将光密度被转化为细胞数目。
II型胶原的免疫荧光染色
对于免疫荧光染色，将各自传代的软骨细胞铺板在盖玻片上，培养2天，用3.7％福尔马林磷酸盐缓冲盐水固定10分钟，并用0.2％Triton X-100磷酸盐缓冲盐水透化。用20％正常山羊血清培养透化细胞以阻断非特异性反应并以单克隆抗II型胶原抗体(monoclonal anti-mouse antibody；Chemiconinternational Inc.，Temecula，CA，U.S.A.)作为初级抗体。以标记了异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗鼠IgG结合物(Vector Lab.，Burlingame，CA，U.S.A.)作为第二抗体，盖玻片用4′，6二脒基-2-苯吲哚(DAPI；1g/ml；SigmaChemical Co.，St.Louis，MO，U.S.A.)培养5分钟用于核染色。细胞在荧光显微镜下观察(Olympus Optical Co.，Japan)。
统计
用不配对t检验进行统计分析，以确定各试验中的变量是否具有显著性差异(p＜0.05)。
结果
分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞的原始细胞产量和细胞扩充率的比较
为了寻找成人体内适合自体软骨细胞移植的供体部位，对分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞产量进行比较(表1)。
表1.分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞原始细胞产量的比较
Figure BDA00001627590400101
a：三个独立的细胞分离的平均值±标准差。按t检验(p＜0.05)进行统计分析。
如表1所示，关节软骨和肋软骨的原始细胞产量分别为8800±3278细胞/mg和22900±2753细胞/mg，在肋软骨中的细胞产量相当于关节软骨中的约2.6倍。因此，依据原始细胞产量，肋软骨与关节软骨相比似乎是更好的自体软骨细胞的供体部位。
然后，比较关节软骨或肋软骨的软骨细胞的体外扩充性。将各自传代的细胞分别以1×105细胞每孔的密度铺板在6孔盘上，在接种后的第5天进行MTT分析(图1)。在整个细胞传代中，肋软骨细胞的总体增长率高于关节软骨细胞的总体增长率。在P0，肋软骨细胞的生长率大约两倍于关节软骨细胞的那些。在P2，关节软骨细胞的生长率类似于肋软骨细胞的那些，但P3生长率比P2减少。
为了评价分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞的扩充性，比较在接种相同的细胞数目后达到汇合的时间和每个细胞传代的细胞总数量(表2)。
表2：比较关节软骨细胞和肋软骨细胞达到汇合的时间和在汇合时的总细胞扩充率。
Figure BDA00001627590400102
a：来自三个独立试验的平均值±标准差。
如上面表2所示，在体外细胞扩充方面，肋软骨细胞与关节软骨细胞相比似乎是更好的供体软骨细胞。
在体外扩充期间关节软骨细胞与肋软骨细胞的软骨细胞表现型的丢失的比较
在体外细胞扩充期间，软骨细胞常常丢失它们在体内的性质例如圆的形状，II型胶原和葡萄糖胺聚糖的表达。在关节软骨细胞和肋软骨细胞的每个传代都调查形态变化和II型胶原的表达(图2和3)。从P2，细胞的某些组开始丢失它们原始的圆形，而转变为成纤维细胞的梭形(图2)。在P4，多数肋软骨细胞实际上改变它们的形态成为成纤维细胞表现型。然而，关节软骨细胞的这个形态变化比肋软骨细胞缓慢得多。因此，关节软骨细胞与肋软骨细胞相比在体外更缓慢的扩充，并更缓慢的改变它们的形态。
为进一步证实成纤维细胞形态变化是否伴随着II型胶原表达的丢失，用抗II型胶原抗体进行免疫荧光染色(图3)。在P0，99％获得自肋软骨或关节软骨的原生软骨细胞表达II型胶原。在P2，表达II型胶原的软骨细胞的数目快速的减少，在肋软骨细胞中尤为明显。在P4，大多数肋软骨细胞不表达II型胶原，而某些关节软骨细胞维持表达II型胶原。
DAPI阳性软骨细胞中表达II型胶原的细胞数量(表3)。
表3：在不同细胞传代，表达II型胶原的细胞数目(％)
  关节软骨细胞(％)   肋软骨细胞(％)
  P0   98.6±1.1a   97.2±2.4
  P1   53.5±7.8   37.6±5.4
  P2   23.6±4.6   10.0±3.3
  P3   14.3±3.0   5.1±0.7
  P4   10.4±2.8   1.0±0.4
a：平均值±标准差
如上面表3所示，软骨细胞在体外扩充期间逐渐丢失它们的原始表现型例如圆的细胞形态和I I型胶原表达能力，肋软骨细胞此过程比关节软骨细胞快得多。
实施例2：证实完全去分化的肋软骨细胞是否显示间充质干细胞性质
材料和方法
软骨细胞的分离
从4到5个月大的新西兰白兔处获得肋软骨。将胸部附近的皮肤刮净，用酒精清洗，并用聚维酮碘溶液备皮。打开右胸的背侧，暴露第9和第10肋软骨。移除软的粘附组织之后，称重肋软骨。这些软骨被切碎成1-2mm3的块并在D-PBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水；Jeil Biotech services Inc.，Taegu，Korea)中漂洗3次。漂洗之后，将切碎的软骨在多酶鸡尾酒溶液37℃和5％CO2下整夜消化，所述多酶鸡尾酒溶液包括胶原酶D(2mg/ml，Roche DiagnosticGmbH，Germany)、透明质酸酶(1mg/ml，Roche)和脱氧核糖核酸酶(0.75mg/ml，Roche)。然后将溶液通过53μm尼龙网眼，分离的细胞用补充有10％胎牛血清(FBS；Hyclone technologies，U.S.A.)和1％青霉素/链霉素/两性霉素B鸡尾酒(Gibco)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium；Gibco LifeTechnologies，Grand Island，NY，U.S.A.)清洗2次，并且活细胞在血球计上基于锥虫蓝排除法计数。细胞以5×105细胞/100mm直径平皿的细胞密度被涂敷，每隔一天更换细胞培养基，每次培养基更换时添加新配制的50μg/ml的L-抗坏血酸(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)。汇合的原生细胞传代培养到P7。
I、II型胶原和平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体的表达
将P7的肋软骨细胞铺板在盖玻片上，培养2天，用3.7％福尔马林磷酸盐缓冲盐水固定10分钟，并用0.2％Triton X-100磷酸盐缓冲盐水透化。抗I型胶原抗体(多克隆抗山羊抗体：southern)，抗II型胶原抗体(单克隆抗小鼠抗体：Chemicon international Inc.，Temecular，U.S.A.)或抗平滑肌肌动蛋白抗体(单克隆抗小鼠抗体：DAKO)应用到标本，4℃过夜，用第二抗体培养，然后用抗生蛋白链菌素-过氧化物酶培养1小时，并用0.1％3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB；Chromogen，DAKO Corp.，CA，U.S.A.)磷酸盐缓冲盐水显影5分钟。用坚牢红染料(Vector Lab.，Burlingame，CA，U.S.A)复染色。
结果
证实肋软骨细胞的去分化和间充质干细胞性质的表达
如图4所示，在P7的肋软骨细胞丢失它们的原始圆的形状，转变为成纤维细胞的纺锤形。由此可见肋软骨细胞完全的去分化了。图5和6显示了在去分化的软骨细胞中I、II型胶原和平滑肌肌动蛋白抗体的表达。在每个细胞中，I型胶原仍被表达，而II型胶原完全不被表达。间充质干细胞的一个特征，平滑肌肌动蛋白的表达在许多细胞中被观察到(图6)。如上所述，I型胶原和平滑肌肌动蛋白的表达证实了传代肋软骨细胞显示了间充质干细胞的性质。
实施例3：不同培养条件(DMEM+10％FBS，MSCGM或包含成纤维细胞生长因子的MSCGM)下对肋软骨细胞的扩充和去分化为软骨情况进行评价
材料和方法
软骨细胞的分离和培养
软骨细胞按如上所述的方法分离，活细胞在血球计上基于锥虫蓝排除法计数。软骨细胞以5×105细胞/100mm直径平皿的细胞密度被铺板，并分别在DMEM(DMEM-FBS)、MSCGM(Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.，MD，U.S.A.)、或添功加了1ng/ml FGF(R & D System Inc.，MN，U.S.A.)的MSCGM中培养。
不同培养基的细胞扩充率
当细胞充满培养皿时，通过胰蛋白酶-EDTA(Gibco)移除细胞，活细胞在血球计上基于锥虫蓝排除法计数，以评价细胞扩充率。然后，细胞以5×105细胞/100mm直径平皿的细胞密度铺板，并在相同培养基中培养。
I和II型胶原和平滑肌肌动蛋白抗体的表达
将在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中培养的各代肋软骨细胞分别涂覆在盖玻片上，培养2天，用3.7％福尔马林磷酸盐缓冲盐水固定10分钟，并用0.2％Triton X-100磷酸盐缓冲盐水透化。透化细胞用20％正常山羊血清培养以阻断非特异性反应，抗平滑肌肌动蛋白抗体(单克隆抗小鼠抗体：DAKO)用做初始抗体并应用到标本4℃整夜。标记了异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗鼠IgG结合物作为第二抗体，将盖玻片用4′，6二脒基-2-苯吲哚(DAPI；1g/ml；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，U.S.A.)培养5分钟用于核染色。细胞在荧光显微镜下观察(Olympus Optical Co.，Japan)。
用磷酸盐缓冲盐水冲洗平皿底部2次后，在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中培养的各自传代的肋软骨细胞用细胞溶解缓冲液(Biolabs；20mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1％Triton，2.5mM焦磷酸钠，1mM Na3VO4，1mMβ-甘油磷酸酯，1μg/ml亮肽素)溶解，添加2mM的苯甲基磺酰氟化物(PMSF)用于抑制蛋白质降解酶的活性，并离心取上清液用于胶原分离。蛋白质加载到10％SDS-PAGE，转膜，并用抗I型胶原抗体和抗II型胶原抗体(多克隆抗山羊抗体：Southern)进行western免疫印迹法检测。
分化诱导为软骨细胞
将在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中扩充至P7或P8的肋软骨细胞制成团块，并在软骨形成培养基中诱导3周以分化为软骨。番红精-O染色评估分化为软骨的程度。
结果
不同培养基的细胞扩充率
当细胞充满培养皿时，用胰蛋白酶-EDTA(Gibco)移除细胞，活细胞在血球计上基于锥虫蓝排除法计数，评价细胞扩充率。
如图7所示，为达到P7，需在MSCGM-FGF中培养约30天，其中细胞扩充约107倍，在MSCGM中需要约38天，其中细胞扩充约105倍。然而，在DMEM-FBS中，在大约1个月中，细胞几乎不发生抛物线状的扩充图，在P7，细胞扩充仅约103倍。
因此，在肋软骨细胞的培养中，在MSCGM中的肋软骨细胞扩充率好于在DMEM+10％FBS中的。另外，当在添加了FGF的MSCGM中培养时，肋软骨细胞的扩充率显著增高。可以预期，如果肋软骨细胞在添加了FGF的DMEM中培养时，将获得同样的结果。
I和II型胶原和抗平滑肌肌动蛋白抗体的表达
测定分别在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中培养的肋软骨细胞其I和II型胶原和抗平滑肌肌动蛋白抗体的表达程度。
如图8所示，随着传代的增加II型胶原的表达减少，肋软骨细胞的II型胶原表达减少率按MSCGM-FGF、MSCGM和DMEM-FBS的次序增高。
在扩充于MSCGM和DMEM-FBS中的肋软骨细胞内，平滑肌肌动蛋白表达细胞约为90％，就是说，许多细胞表达平滑肌肌动蛋白。然而，在MSCGM-FGF中，随着传代仅有极少数的肋软骨细胞表达平滑肌肌动蛋白。
如图9所示，在扩充于DMEM-FBS和MSCGM的肋软骨细胞内，随着传代的增加I型胶原的表达增加，在P7，几乎所有的细胞表达I型胶原。相反，仅60至70％的扩充于MSCGM-FGF中的细胞表达I型胶原。
葡萄糖胺聚糖的表达
如图10所示，扩充于DMEM-FBS的肋软骨细胞主要在团块的外壁显示葡萄糖胺聚糖的表达，在高倍显微图象中大多数的外壁细胞显示软骨细胞形态。扩充于MSCGM中的肋软骨细胞在3周的软骨分化后在某些团块表面显示了低的葡萄糖胺聚糖表达，和非常小数目的细胞显示软骨细胞的形态。相反，扩充于MSCGM-FGF中的细胞在3周的软骨分化后在大多数团块中显示了强的葡萄糖胺聚糖表达，并显示软骨细胞形态。
从而，以添加lng/mlFGF的MSCGM为扩充肋软骨细胞的培养基时，当细胞扩充约2×107倍后软骨细胞分化能力被保持。
实施例4：完全去分化的肋软骨细胞的再分化
材料和方法
软骨细胞的分离
用实施例2中使用的方法，去分化细胞被培养直至P7。
完全去分化的肋软骨细胞分化为软骨细胞
为了完全去分化的肋软骨细胞再分化为软骨细胞，接种细胞至1×106细胞/15ml试管，并聚集培养。培养基被更换为软骨形成培养基(高葡萄糖DMEM，1％ITS+3(Sigma)，100nM地塞米松(Sigma)，50μg/ml维生素C(Sigma)，40μg/ml果仁糖(Si gma)，10ng/ml TGFβ3(R & D system，Inc.，MN，U.S.A.))，对照组添加基础培养基(DMEM-HG，10％FBS)。一周更换2次培养基，并在2和3周观察。
为确证分化为软骨细胞，在2和3周，用3.7％福尔马林磷酸盐缓冲液固定三维结构，制备成石蜡标本，并切为5μm厚度。薄片被去石蜡和用番红精-O和固绿(Sigma)染色，用于观察葡萄糖胺聚糖分布。
完全去分化的肋软骨细胞分化为成骨细胞
为了再分化为成骨细胞，将P7的肋软骨细胞以2×104细胞/cm2的细胞密度接种6孔和24孔，在成骨培养基(DMEM，10％FBS，100nM地塞米松(Sigma)，10mM β-磷酸甘油(Sigma)，50μg/ml维生素C(Sigma))中培养。一周更换2次培养基，并在2和3周观察。基础培养基(DMEM，10％FBS)被用于对照组。
为确证分化为成骨细胞，细胞分化初始标记物用碱性磷酸酶染色。用碱性磷酸酶测量试剂盒(SIGMA-ALDRICH，St.Louis，MO，U.S.A.)观察组织化学的表达程度。并且，用茜素磺酸钠(SIGMA-ALDRICH)染色细胞，所述茜素磺酸钠能够染色成骨细胞成熟期间分泌的矿物成分，以观察分化为成骨细胞的程度。
完全去分化的肋软骨细胞分化为脂肪细胞
为了再分化为脂肪细胞，P7的肋软骨细胞以2×104细胞/cm2的细胞密度接种6孔和24孔，并在脂肪形成培养基(高葡萄糖DMEM(Gibco)，10％FBS，10mg/ml胰岛素(Sigma)，100nM地塞米松(Sigma)，0.2mM消炎痛(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)，500μm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Wako))中培养3天，并在脂肪形成培养基中(高葡萄糖DMEM，10％FBS)重复1天的培养。基础培养基(DMEM-HG，10％FBS)被用于对照组，并在2和3周观察。
为确证分化为脂肪细胞，细胞用油红O染色，所述油红O特别适合染色脂类小滴。
结果
分化为软骨细胞
图11显示了P7肋软骨细胞分化诱导3周成为软骨细胞的目视图。细胞互相形成团块，软骨诱导组中的团块尺寸与对照组(基础培养基：DMEM，10％FBS)相比更大。
图12显示对葡萄糖胺聚糖番红精-O染色的结果。在分化诱导的3周，在团块的外壁观察葡萄糖胺聚糖的表达。细胞显示软骨细胞形态。对照组不表达葡萄糖胺聚糖，也不显示软骨细胞形态。
分化为成骨细胞
为确证分化为成骨细胞，观察碱性磷酸酶的活性。图13显示通过碱性磷酸酶测量试剂盒(SIGMA-ALDRICH，St.Louis，MO，U.S.A.)测量碱性磷酸酶。碱性磷酸酶的活性，作为成骨分化的初始标记物，在分化的2周强烈的表达，在3周趋于稍微降低。培养于基础培养基的对照组不表达碱性磷酸酶的活性。
更进一步，图14显示用茜素红染色剂进行矿物染色的结果。在分化2周时没有观察到表达，但在3周的部分染色确证了成熟分化为成骨细胞。
分化为脂肪细胞
为确证分化为脂肪细胞，细胞用油红O染色，所述油红O适合染色脂类小滴。如图15所示，在细胞内显现的许多油红O染色的脂类小滴确证了分化为脂肪细胞。
实施例5：基于壳聚糖支架内的肋软骨细胞对关节软骨缺损的修复作用的评价
材料和方法
实施例5的步骤与图16图解视图的相同。图16显示肋软骨细胞被分离，培养直到P2，去分化的细胞被接种到基于壳聚糖的支架上，培养，然后将支架移植到缺损的关节软骨中以修复软骨缺损。
软骨细胞的分离
在采取如上述实施例1相同的步骤后，汇合的原代细胞传代培养直到P2。
海绵形式支架的制备
COL-GAG海绵：
多孔胶原基质(
Figure BDA00001627590400171
Integra Lifesciences Co.，U.S.A.)由交联的牛腱胶原和葡萄糖胺聚糖(软骨素-6-硫酸盐)的纤维制成，所述牛腱胶原被制备具有一定孔隙和预定的降解速率。支架(COL-GAG)通过4mm活检冲床(S.F.M.，Germany)制备和通过精细镊移除硅层。
CS海绵：
壳聚糖(Korea chitosan Co.，Korea，1.5％w/v)溶于0.1％乙酸水液中。充分搅拌完全溶解后，溶液通过0.4μm滤膜(Millipore Co.，U.S.A.)并分配到模型中。成型凝胶在-80℃放置24小时，然后在冷冻干燥器中冻干24小时。支架用酒精和蒸馏水洗去残酸，并添功加乙酸酐以乙酰化。支架用酒精和蒸馏水洗去副产物酸，并冻干。壳聚糖支架(Cs)的厚度约为2mm。壳聚糖支架的精细结构和孔径大小通过扫描电子显微镜法(扫描电镜；图8)获得。通过4mm活检冲床制备4mm直径的支架。在细胞培养实验之前，支架(CS)暴露在紫外光下30分钟灭菌，并用培养基浸泡10分钟。制备的支架应立即使用。
CS-HA海绵：
在制备4mm直径的壳聚糖支架后，被用50％乙醇浸泡，再用0.1％透明质酸(HA；Sigma，St Louis，MO，U.S.A.)磷酸盐缓冲盐水浸泡。支架在-80℃放置24小时，冷冻干燥器中冻干24小时。在细胞培养实验之前，支架(CS-HA)暴露在紫外光下30分钟灭菌，并用培养基浸泡10分钟。制备的支架应立即使用。
在支架上接种软骨细胞并培养
将含有2×106二代肋软骨细胞的培养基20μl接种到COL-GAG、CS和CS-HA(4mm直径×2mm厚)上培养基中的，预先放入在37℃的5％CO2的6-孔盘中2小时。随后，向每个孔中添加6mL培养基，细胞培养4周。每周更换培养基和在整个培养期间每72小时向培养基添加新鲜的L-抗坏血酸。在第2、7、14和28天获得培养物汤和细胞支架结构，和结构仅在第2天获得。
MTT分析、Blyscan分析、细胞支架结构的组织学的和免疫组织化学的染色以及前胶原I型C-肽(PIP)的ELISA分析
MTT分析
每个支架内的细胞增殖率根据MTT分析(Mosman T.Rapid colormetricassay for cellular growth and survival，appl icat ion to proliferation andcytotoxicity assays，J.Immunol.Methods 1983；65：55-63)测定。
前胶原I型C-肽(PIP)的ELISA分析
为了定量测定从新合成胶原中释放的前C-肽，使用前胶原I型C-肽(PIP)EIA试剂盒(Takara Bio.Inc.，Japan)。培养基用蒸馏水稀释到1∶100，其余的步骤按照制造商的说明书操作。在450nm用酶标仪(microplate reader)(Bio Rad Lab.，Richimond，CA，U.S.A.)测量吸光度。在0-640ng PIP/mL范围内的以标准曲线来校准肽的释放量。
Blyscan分析
使用1，9-次甲基蓝分析(
Figure BDA00001627590400191
Glycosaminoglycan Assay，Biocolor，U.K.)定量测定葡萄糖胺聚糖的含量。等份300μl的培养基按照厂家的说明来分析，并用标准曲线来校准，所述标准曲线是通过0.1、0.2、0.3、0.5、1和2μg的鲨鱼硫酸软骨素(Sigma Chemical Co.St Louis，U.S.A.)绘制的。
统计
用不配对t检验来进行统计分析，确定试验中各变量是否有显著性差异(p＜0.05)。
动物的饲养
使用24只新西兰白兔(初始重量2.2到2.5kg，约4到5月大)。动物被认为是年轻成年的，因为在4个月大之后通常不再发生直立骨骼的生长(Masoudet al.，1986)。在试验前1至2周获取动物，并饲养在固定温度22土2℃和湿度50±7％和固定亮暗周期(上午7:00-下午7:00，光照期)下。动物可以自由进食和饮水(标准实验室饮食(团块类型，Purina Co.Korea))，并允许在地上自由活动。根据批准的动物饲养国家指南喂养、管理和处理动物。
手术步骤
兔按上述实施例1描述的方法麻醉。辅助麻醉是静脉注射赛拉嗪和氯胺酮的混合物。在手术前，动物肌内注射应用抗生素(头孢唑啉(cefazoline)，Jonggun-dang，汉城，韩国)一次。
刮净膝部附近的皮肤，用酒精清洗，并用聚维酮碘溶液备皮。手术方法类似于Shapiro et al.所描述的。在作出一个中央的膝盖旁切口后，髌骨被横向脱位以暴露股骨的髌骨凹槽。使用低速钻在髌-股骨接合点的承重区域制造直径为4mm的缺损。在兔中的所述区域是间歇的承受重量，并与髌骨接触。圆锥形的全层缺损从关节软骨的表面通过密质软骨下骨进入在股骨远端的骨髓腔中的松质骨内。缺损的深度大约为2.0到2.5mm。在钻孔之后，用冷盐水(NaCl0.9％w/v)大面积的冲洗伤口以移除脱落的碎片。在缺损处滴入一滴纤维蛋白粘合系统(Kit，Baxter AG，Austria)以将移植结构固定到缺损，并且将支架立即插入缺损中。在对照的缺损中，仅使用纤维蛋白密封剂(图16)。髌骨脱位被复位且关节囊与皮肤层状缝合。不使用任何模具，兔子在从麻醉复原之后，立即允许自由活动。肌肉注射5天头孢唑啉，每天两次。动物的膝盖被分为三个组：(1)未治疗缺损(对照)；(2)用CS-HA单独治疗；或(3)用加载了肋软骨细胞的CS-HA治疗。在植入的6和12周，兔子在深度麻醉下通过注射MgSO4安乐死。
修复组织的组织学评价
在动物处死之后，检查膝盖一般形态学(颜色、完整性、轮廓和光滑度)、缺损的修复和周围软骨的外观。植入区域的标本被解剖、摄影和用10％缓冲福尔马林在室温下固定一周。然后冲洗标本以清除过量的固定剂，并用Calci-Clear Rapid(National Diagnotics，U.S.A.)脱钙一周。用梯度乙醇和二甲苯脱水，并用石蜡包埋。通过切片机切成6μm厚的片用于组织学研究。切片用苏木精和伊红(H & E)染色来研究形态细节，用番红精-O和固绿染色来评价葡萄糖胺聚糖分布。
软骨缺损的评价
按照Pineda等(1992)和Wakitani等(1994)的改良的组织等级评分法由研究者对切片进行盲法评价。所述等级评分是全部由5类组成，分值从0(正常软骨)到14(未修复组织)(表4)。
表4：对于软骨缺损的组织等级评分
  类别   评分
  细胞形态
  透明软骨   0
  主要是透明软骨   1
  主要是纤维软骨   2
  主要是非软骨   3
  仅有非软骨   4
  间质染色(异染性)
  正常(与宿主邻近软骨相比)   0
  轻微减少   1
  显著减少   2
  无异染性染色   3
  表面规则度
  平滑(＞3/4a)   0
  中等的(1/2＜3/4a)   1
  不规则的(1/4＜1/2a)   2
  严重不规则的(＜1/4a)   3
  软骨厚度
  0＞2/3b   0
  1/3＞2/3b   1
  ＜1/3b   2
  供体与宿主邻近软骨的完整性
  两边都完整   0
  单边完整   1
  任何边都不完整   2
总分值 14
a、修复软骨的总平滑面积与软骨缺损的总面积之比。
b、修复软骨的平均厚度与周围软骨的平均厚度之比。
统计分析
通过使用t检验来评价统计显著性。显著性水平是p＜0.05。
结果
培养在海绵支架中的肋软骨细胞
使用MTT分析在培养的1、2和4周比较在三种不同支架：胶原-葡萄糖胺聚糖海绵(COL-GAG)、壳聚糖海绵(CS)和透明质酸包被的壳聚糖海绵(CS-HA)中的肋软骨细胞的增殖率(图17)。
图17中的值显示了在这些支架内的细胞增殖。CS和CS-HA的光学密度值随培养时间延长而逐渐增加，两种支架之间没有显著的差异。在COL-GAG中发现了类似的趋势，但初始水平较低。在培养28天时的光学密度值与培养第7天的相比，在COL-GAG、CS和CS-HA中分别增加了大约1.30、1.43和1.40倍。
为了评价接种了细胞的复合支架的新合成胶原，通过ELISA分析(图18)测量前胶原I型C-肽(PIP)。在培养第7天，CS和CS-HA的胶原合成大于COL-GAG中的合成，有显著的差异。然而，第14天，在CS中的胶原合成比在COL-GAG和CS-HA中的大的多(CS＞CS-HA＞COL-GAG)。第14天的胶原合成与在培养第7天的相比显著的减少。在四周的培养期间，CS中向培养基的胶原分泌在逐渐的减少，相反地，在COL-GAG和CS-HA中，胶原释放在第1和第2周之间显著的减少，然后在第2和第4周之间有所增加。
Blyscan分析显示了接种了肋软骨细胞的三种不同支架向培养上清液中持续一周释放的GAG量。在培养的第1周，两种壳聚糖支架比COL-GAG释放更多的GAG。在第14天，三种支架中GAG释放的量近似，但在培养的28天，在COL-GAG中释放的GAG量与CS和CS-HA中的相比非常小。
在兔肋软骨细胞被接种到COL-GAG、CS和CS-HA上并培养28天期间，在整个培养时间内，CS和CS-HA的尺寸大于COL-GAG的。
苏木精和伊红(H&E)染色的组织学检查显示了标本的形态特征(图19)。在图19中，S代表表面，C代表中心，刻度条代表50μm，黑色箭线代表纤维组织，白色箭线代表死亡细胞，黑色箭头代表圆形细胞和白色箭头代表梭形细胞。在软骨细胞培养2天后，接种细胞主要存在于两种基于壳聚糖的支架和特别是COL-GAG的表面区域。圆形和梭形细胞间杂，和在第2天软骨陷窝中没有细胞。在第2天的标本中，在CS和CS-HA中心的细胞是聚集的，而在COL-GAG中，中心的细胞是稀少和分散的。
在培养7天后，在支架的周缘内的细胞数目的增加是显著的，并且新的细胞周围间质包围了大部分细胞。在CS和CS-HA支架的中心和周缘，绝大多数的接种细胞还维持它们的球状形态，占据软骨陷窝并合成充足的基质。然而，在COL-GAG中，周缘的细胞是圆形的，但它们不占据陷窝，中心的细胞是梭形的且不聚集。
在培养的第14天，在两种基于壳聚糖支架的中心和周缘的大多数细胞还维持它们的球形形态，占据陷窝并合成非常充足的细胞外基质。但在COL-GAG中，周缘的细胞是球形形态，占据陷窝和合成充足的细胞外基质，但中心的细胞还是梭形的，占据小的陷窝和合成少量的细胞外基质。
在试验的末尾(28天)，两种基于壳聚糖支架的表面被薄纤维组织覆盖。在中心以及周缘的细胞变为小的、仍占据较大的陷窝。在COL-GAG中，周缘细胞减少了细胞构成，具有非常小而圆的形态和不占据陷窝。中心内的细胞与第14天的类似。
通过番红精-O固绿(S/O)对软骨细胞外基质的葡萄糖胺聚糖进行的组织学染色，在整个培养期间在CS和CS-HA支架中心检测到葡萄糖胺聚糖(图20)。在图20中，白色箭头代表番红精-O染色的结构，黑色箭线代表纤维组织、白色箭线代表固绿染色的细胞，刻度条代表100μm。在两种基于壳聚糖的支架中，2天培养标本的中心的细胞被S/O染色。然而，在COL-GAG中心内的细胞不被S/O染色。在三种类型的支架中随培养时间的增加，积累葡萄糖胺聚糖的量也增加。在培养的28天，支架的周围不被固绿染色。
组织学检测在没有软骨细胞的CS和CS-HA中没有检测到葡萄糖胺聚糖，但COL-GAG的框架被用S/O阳性着色，因为它们与硫酸软骨素相结合。
I型和II型胶原的免疫染色
在两种基于壳聚糖的支架中，1和2周的标本内没有检测到I型胶原。相反，在两种基于壳聚糖的支架中，在1至2周的培养期内抗II型胶原抗体是强阳性的。在第4周，在支架表面和中心内的部分细胞集合体对抗I型胶原抗体呈阳性。然而，在4周的标本中，抗II型胶原抗体还是阳性的，但变弱了。
在COL-GAG的1、2和4周的标本内都检测到了I型胶原。在第1周抗II型胶原抗体阳性仅在表面显现，在第2周在周缘的间质和中心的少许细胞内显阳性。在第4周的标本内，抗II型胶原抗体显非常弱的阳性(图21和22)。在图21中，黑色箭线代表纤维组织，黑色箭头代表I型胶原表达细胞，白色箭线代表COL-GAG结构，图21和22中的刻度条代表100μm。
由上述组织学观察的结果可知，当去分化软骨细胞被接种到三种类型的海绵形式支架(CS、CS-HA和COL-GAG)上时，在两种基于壳聚糖支架中，接种的细胞在形态、葡萄糖胺聚糖合成和II型胶原表达中会再分化1至2周。然而，在COL-GAG中，内部细胞接种效率不高，中心内的细胞的再分化效果不好。直到第4周，细胞开始丢失合成细胞外基质的活性(陷窝的尺寸变得更小)。
体内结果
本研究将评价培养肋软骨细胞-壳聚糖复合物在修复承重动物模型内全层关节软骨缺损中的作用。
将P2的肋软骨细胞接种到CS-HA支架上，培养2周。在兔股骨的髌骨凹槽上手术制作软骨缺损。在第6和12周动物被安乐死，并获取膝关节。标本作目视、组织学和免疫组织化学分析。
临床试验
所有试验动物中都没有发生手术后并发症。在研究期间，没有观察到关节脱臼或残疾的症状。
肉眼外观
依据肉眼观察，在任何关节都没有观察到滑膜流出或滑膜炎。虽然没有进行滑膜组织的组织学检查，但无炎症反应迹象。肉眼观察，所有关节内的滑液在量、粘性和颜色方面都是正常的。
在图23到图26中，对照代表对照组，S代表CS-HA移植的缺损，和S-CELL代表肋软骨细胞接种的CS-HA移植的缺损。
空白(对照)缺损
在移植后第6周，在对照组中，缺损可见光滑表面。缺损在修复组织和邻近关节软骨之间有缝隙或缺乏连续性。缺损的边缘是可辨别的。修复组织与邻近正常软骨相比更白和稍微不透明(图23)。在移植后12周，对照组中的修复组织可以容易的与正常邻近软骨区分，因为它们具有白色和不透明的外观。缺损中完全充满了平滑的白色修复组织(图23)。
CS-HA移植的缺损
在第6周肉眼观察，某些缺损没有完全充满修复组织，在某些区域软骨下骨暴露。缺损中修复组织的表面与周围正常组织相比更不规则，修复组织的边缘也不平滑。修复组织为白色至粉红色的、半透明的(图23)。在12周，CS-HA移植缺损的修复组织还是可辨别的，但在外观和质地上是透明的。缺损被填充至邻近正常软骨的水平。它们某些的表面比6周标本的更平滑。某些情况下(1/8)，修复组织由骨，而不是软骨填充(图23)。
肋软骨细胞加载的CS-HA移植的缺损
在第6周，所有的缺损被充满了修复组织，缺损的边缘是可以从邻近正常软骨辨别出来的。修复组织的表面和边缘是粗糙和不规则的。修复组织在外观和质地上是透明的(图23)。在第12周肉眼观察，所有的修复组织达到了周围正常软骨的水平。修复组织的表面和边缘比6周标本更平滑。修复组织还可以从周围正常软骨辨别出来。但与6周标本相比修复软骨的边缘更加平滑的，与正常软骨接合更好(图23)。
在第6周，CS移植缺损的肉眼外观类似于细胞加载CS移植缺损的肉眼外观：两者均是白色的和一定程度不规则的。通常，直至12周，对照缺损的表面与CS移植缺损的相比平滑的多，所述CS移植缺损的表面是突出和不规则的。对照缺损的表面是白色外观，但移植缺损的是粉红外观的。在细胞加载移植缺损中的修复组织的颜色和质地类似于邻近正常软骨。
形态学
对照缺损
在移植后6周，在移植接合部可见附加的类似纤维软骨组织形成。缺损在修复组织和邻近关节软骨之间的单侧或双侧有缝隙或缺乏连续性。这个观测表明周围关节软骨和修复组织之间整合度的下降。在修复软骨和邻近正常软骨之间的界面偶尔显示纤丝状的连续性。修复组织的表面由3至5层扁平的细胞组成，并是纤丝化的。修复组织由纤维组织和多细胞纤维软骨的混合物组成。某些缺损在纤维和纤维软骨修复软骨内显示裂缝缺口。修复组织较好的重新覆盖了软骨下骨(图24至26)。
在12周，某些软骨缺损在修复组织和邻近正常的软骨之间有缝隙或缺乏连续性。修复组织的表面是平滑的且纤丝化较明显。缺损充满了软骨细胞和间质。然而，成纤维细胞主要在表面层，大部分表面由纤维基质组成。修复组织具有类似纤维化软骨的细密细胞外基质和圆的、相对成熟的软骨细胞样细胞。因此，在12周的对照组的修复组织主要由纤维组织和纤维软骨组织组成(图24至26)。
CS-HA支架移植的缺损
在第6周，修复组织与邻近正常软骨整合良好。在显微视图下，修复组织是多细胞组分。用基于壳聚糖海绵治疗的骨软骨缺损中，修复组织主要是肥大软骨细胞和扁平表层细胞。修复组织的底部由梭形细胞组成，所述梭形细胞具有不规则细胞外基质和类似于不成熟的实质细胞。修复组织是透明的纤维化的软骨。缺损表面上的少许细胞层是小且扁平的，细胞外基质被H&E染色。在修复组织的表面可以发现几乎所有的纤维组织。修复组织的中间层具有透明软骨样的组织，其包含圆而大的细胞核、相对不成熟的软骨细胞样细胞(图24至26)。然而，修复软骨偶尔可见垂直裂缝。
在第12周，修复组织与邻近正常软骨整合良好。在移植12周后，用基于壳聚糖海绵治疗的骨软骨缺损中的修复组织主要为不成熟的软骨细胞和扁平表层细胞。长形的成纤维细胞与表面平行排列，和缺损充满了高密度不成熟的软骨细胞和透明样间质。修复软骨的底部包括肥大软骨细胞并很好的向软骨下骨再生。某些情况下缺损由覆盖有薄纤维组织的骨组织组成，而不是由软骨组织组成(图24至26)。
肋软骨细胞加载的CS-HA支架移植的缺损
在6周的标本中，修复组织内的软骨细胞与邻近正常软骨内的相比更多，呈柱状排列。表面某些部分有纤丝化的证据。修复软骨显示了与周围正常软骨和骨部分的正常整合。任何缺损在修复软骨内显示了裂缝缺口(图24至26)。在松质骨中可见骨小梁在移植的深层区域发育，包含小残留软骨细胞。
在12周，用培养细胞加载的CS-HA治疗的缺损完全充满了细胞和基质。修复组织与软骨下骨和邻近正常软骨正常的整合。任何缺损在修复软骨内显示了裂缝缺口。修复组织在单个陷窝内包含单或多个软骨细胞，修复组织由同源细胞群组成并呈柱状排列。修复组织具有充足的细胞外基质和整齐排列的软骨细胞，虽然还是可见稍粗糙表面但没有检测到纤丝化表面。在表面内2至4层的软骨细胞是小而扁平形的，并包括陷窝。修复组织底部内的软骨细胞是大而圆的细胞，并比表面的细胞肥大、数量多。修复软骨主要是透明软骨。在这些缺损中形成的透明软骨的厚度与邻近正常软骨的相比更薄(图24至26)。
葡萄糖胺聚糖(GAG)分布-番红精-O染色
对照缺损
在第6周，对照缺损中，仅修复组织底部内的某些区域被S/O染色。其他修复组织不被S/O染色，修复组织的表面被固绿染色，相反的染色颜色。在对照缺损切片中异染性中度-严重丢失明显缓解(图27)。在12周，修复组织的表面仍被固绿染色。仅在一例中，修复组织被S/O染色，其他例对S/O是负性染色(图27)。
CS-HA支架移植的缺损
在第6周，充满肥大软骨细胞的区域被S/O阳性染色，与周围正常软骨的连接是弱染色的。在缺损底部的肥大软骨细胞区域内番红精-O和固绿染色是主要的(图27)。第12周与第6周相比，修复组织的底部和与周围正常软骨的连接处被S/O更强的染色(图27)。
肋软骨细胞加载的CS-HA支架移植的缺损
在6周，所有的修复组织被S/O染色，但与周围正常软骨相比稍微或适度的降低，并且修复组织的底部对S/O呈强阳性染色。与邻近正常软骨相比修复软骨的染色强度稍微或适度的降低(图27)。在第12周除了某些中心的区域，修复组织用S/O染色达到了周围正常软骨的水平。大部分修复软骨是透明样的，在半径区域内缺损显示垂直的柱状软骨细胞。
I型和II型胶原的免疫染色
对照缺损
在移植后6周，修复组织的上部的一半区域和与正常软骨的邻接处对抗I型胶原是阳性的。除了钙化软骨外的其他部分对抗II型胶原是阳性的(图28)。在12周，修复组织的所有细胞对抗I型胶原是阳性的(图28)。
CS-HA移植的缺损
在6周，修复组织的边缘和上部对抗I型胶原是阳性的。肥大部分对抗I型胶原也是阳性的(图28)。在12周，修复组织的表面对抗I型胶原是阳性的，其他部分对抗II型胶原呈阳性(图28)。
肋软骨细胞加载的CS-HA支架移植的缺损
在6周，修复组织表面的某些部分对抗I型胶原是阳性的。与邻近正常软骨相比修复组织抗II型胶原的表达降低了(图28)。在12周，表面的小范围内，抗I型胶原呈弱阳性表达。修复组织对抗II型胶原的表达类似于正常软骨水平(图28)。
组织学等级评分(平均分)的结果见表5。
表5：组织学等级评分的结果
Figure BDA00001627590400291
a、代表标准差
实施例6：基于壳聚糖支架内的间充质干细胞样去分化细胞对关节软骨缺损的修复作用的评价
材料和方法
软骨细胞的分离和培养
如同实施例1，用酶处理从肋分离肋软骨细胞，以5×105细胞/100mm直径平皿的细胞密度铺板，并在添加了1ng/ml成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代培养直至P8，如实施例3，以获得间充质干细胞样去分化细胞。
在基于壳聚糖支架内的间充质干细胞样去分化细胞的制备和培养
如同实施例5，制备壳聚糖海绵并包被透明质酸。5mm直径的CS-HA海绵被接种2×106的在P8的间充质干细胞样去分化细胞，以获得在支架内的间充质干细胞样去分化细胞，并在包含TGF-β的软骨形成培养基中培养2周以诱导产生软骨分化。为了评估分化为软骨的程度，进行番红精-O染色。
对关节软骨缺损的修复作用
如同实施例1，兔被麻醉，并在手术前给予抗生素。在两个股骨的髌骨凹槽上制作缺损(5mm直径、大约2.0至2.5mm深)，并在支架内移植间充质干细胞样去分化细胞(已经分化为软骨)，如实施例2。
结果
再分化为软骨细胞
图29是包含再分化软骨细胞的人工软骨的目视图，所述再分化软骨是通过将肋软骨细胞的间充质干细胞样去分化细胞加载到壳聚糖海绵上，并在软骨形成培养基中再分化获得的。
图30显示对在软骨形成培养基中再分化的软骨细胞内的葡萄糖胺聚糖，用番红精-O染色的结果。在2周的软骨形成分化后，海绵内的间充质干细胞样去分化细胞再分化为软骨细胞。
关节软骨缺损修复
图31将加载了间充质干细胞样去分化细胞的基于壳聚糖的支架移植到兔关节软骨缺损6周后的目视图片。修复组织与邻近正常组织平滑地整合，在外观和质地可见为透明软骨。
工业实用性
在本发明中，首先公开了肋软骨与关节软骨相比提供高细胞产量和细胞扩增率，因此对软骨修复来说肋软骨与关节软骨相比是更好的细胞源。在本发明之前，在现有技术中已知去分化率，也就是说，在软骨细胞培养期间的软骨细胞表现型的损失是非常高的，其限制了自体关节软骨细胞移植的应用。然而，本发明意外证实获得自肋软骨的肋软骨细胞传代期间产生的去分化的软骨细胞显示了间充质干细胞的性质，因此，这种完全去分化的肋软骨细胞可以被分化为期望的分化细胞例如成骨细胞、脂肪细胞等等，以及当在分化条件下再培养时成为软骨细胞。从而，本发明提供一种包含间充质干细胞样去分化细胞的人工软骨和细胞治疗剂，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。
另外，本发明显示，自体肋软骨细胞加载的基于壳聚糖的支架，当被移植入软骨缺损时，能非常有效的修复承重位点内的全层关节软骨缺损。

Claims (15)

1.一种人工软骨，包含通过肋软骨细胞传代获得的间充质干细胞(MSC)样去分化细胞。
2.如权利要求1所述的人工软骨，其中所述间充质干细胞样去分化细胞是通过在MSCGM或包含成纤维细胞生长因子(FGF)的MSCGM中传代肋软骨细胞获得的。
3.如权利要求1或2所述的人工软骨，其包含通过在软骨形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的再分化软骨细胞。
4.如权利要求3所述的人工软骨，其中所述再分化软骨细胞通过在软骨形成培养基中聚集培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得。
5.如权利要求3所述的人工软骨，其中所述软骨细胞被加载到基于壳聚糖的支架上。
6.如权利要求5所述的人工软骨，其中所述基于壳聚糖的支架选自：壳聚糖海绵；包含转化生长因子-β(TGF-β)的壳聚糖海绵；透明质酸(HA)包衣的壳聚糖海绵；硫酸软骨素包衣的壳聚糖海绵；和壳聚糖胶原复合海绵。
7.一种用于制备人工软骨的方法，包括传代肋软骨细胞以获得间充质干细胞样去分化细胞的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中将所述肋软骨细胞在MSCGM或包含成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代。
9.如权利要求7或8所述的方法，其包含在软骨形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞以获得再分化软骨细胞的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其包含在软骨形成培养基中聚集培养所述间充质干细胞样去分化细胞以获得再分化软骨细胞的步骤。
11.如权利要求7或8所述的方法，其包含加载所述间充质干细胞样去分化细胞到基于壳聚糖的支架上的步骤。
12.一种细胞治疗剂，包含通过传代肋软骨细胞获得的间充质干细胞样去分化细胞。
13.如权利要求12所述的细胞治疗剂，其包含通过在软骨形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的再分化软骨细胞。
14.如权利要求12所述的细胞治疗剂，其包含通过在成骨培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的成骨细胞。
15.如权利要求12所述的细胞治疗剂，其包含通过在脂肪形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的脂肪细胞。
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