KR20220154487A - 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법 - Google Patents

동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220154487A
KR20220154487A KR1020210062084A KR20210062084A KR20220154487A KR 20220154487 A KR20220154487 A KR 20220154487A KR 1020210062084 A KR1020210062084 A KR 1020210062084A KR 20210062084 A KR20210062084 A KR 20210062084A KR 20220154487 A KR20220154487 A KR 20220154487A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cartilage
model
cartilage model
cultured
stage
Prior art date
Application number
KR1020210062084A
Other languages
English (en)
Inventor
강선웅
심혜은
이병석
한지석
장수미
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020210062084A priority Critical patent/KR20220154487A/ko
Priority to PCT/KR2022/006348 priority patent/WO2022240058A1/ko
Publication of KR20220154487A publication Critical patent/KR20220154487A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 동시 배양하는 단계를 포함하는 연골모델 제조방법; 상기 제조방법으로 제조된 연골모델; 및 상기 연골모델에 시험 물질을 처리하는 단계를 포함하는 시험 물질의 활성 또는 독성을 검사하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 연골모델 제조방법을 이용하면 동물 모델을 대체할 수 있는 성숙한 연골 또는 노화한 연골모델을 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 연골모델을 사용하여 시험물질의 유효성 및 안전성을 정확하게 검증할 수 있는바, 신약개발, 질병 연구 및 인공장기 개발 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법 {Cartilage model as a substitute for animal test and method for evaluating drug toxicity using the same}
본 발명은 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 동시 배양하는 단계를 포함하는 연골모델 제조방법; 상기 제조방법으로 제조된 연골모델; 및 상기 연골모델에 시험 물질을 처리하는 단계를 포함하는 시험 물질의 활성 또는 독성을 검사하는 방법에 관한 것이다.
연골은 연골세포와 연골기질로 구성된 조직으로, 연골은 탄력성이 높아 주어진 힘에 대해 완충작용을 하고 관절 연골의 마찰 계수가 매우 낮아 마찰이 거의 없는 상태에서 관절이 움직일 수 있도록 도움을 준다. 관절 연골은 많은 연골 기질과, 연골 기질 사이에 드문드문 분포한 특수하게 분화된 세포인 연골 세포로 구성된다. 연골 기질의 주요 구성성분에는 물, 단백다당과 교원질이 있으며 그 외에도 기타 단백질과 당단백이 있다. 관절 연골은 깊이에 따라 관절면으로부터 연골밑뼈까지 표재층, 중간층, 심층 및 석회화층의 네 층으로 구성된다. 광학현미경으로 관찰하여 보면, 심층과 석회화층 사이에는 물결 모양의 호염기성 파란 선이 관찰되는데 이를 타이드마크라 하며 나이가 들수록 그 수가 증가하게 된다. 연골 세포는 관절 연골을 만들고 유지하는 역할을 한다.
이처럼 관절을 보호하고 있는 연골은 손상이나 퇴행성 변화에 의해 관절염 등의 질환이 발생할 수 있는데, 관절염 치료 물질의 유효성을 평가하기 위해서는 골절 또는 관절염이 유도된 동물 모델에서 동물 시험이 필수적이다. 이러한 동물 시험을 위한 모델 제작은, 외과적 수술, 인위적 늑골 골절과 같은 늑골 골절, 인위적 연골 파괴로 관절염을 유도하거나, 보바인 타입 II 콜라겐 (Bovine type II collagen)을 주입하는 방식으로 이루어진다. 일 예로, 동물 시험에 골관절염이 유도된 흰쥐 또는 토끼를 사용하며, 8주 내지 12주 동안 시험 물질을 투여한 후, 혈청의 히알루론산, 펜토시딘, MMP9 등의 생화학적 지표를 확인하고, 병리조직학적 관찰 등을 진행한다. 그러나, 이러한 동물시험은 짧은 시험물질 투여기간으로 인하여 정확한 약물의 유효성을 평가하는데 어려움이 있고 신속하게 약효를 평가하는 것이 불가능하다는 한계점이 있다.
한편, 3차원 장기 유사체인 오가노이드(Organoid)는 세포외 기질을 모사하는 마트리젤과 같은 물질에서 배양되고, 이런 3차원적인 배양기술은 기존의 2차원적 세포 배양방법과 달리 핵형변화가 극히 적고 자발적인 암화과정이 없는 것으로 보고되고 있다. 따라서 장기 유사체 배양은 현재까지 제시된 어떤 세포배양법보다 체내 특징을 장기적으로 보존하는데 유리한 것으로 여겨지고 있다. 최근 3차원 장기모사 장기 유사체는 질병 이해의 기초적인 연구뿐 아니라 환자 맞춤형 치료를 구현함에 있어서 필수적인 질병 모사 모델이 될 수 있기 때문에 향후 정밀의료분야에서 유용하게 적용될 것으로 예상되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 동물실험을 대체할 수 있는 모델을 개발하기 위해 노력한 결과, 조직공학적 기법으로 재생된 연골모델 및 이를 이용한 시험 물질의 체외 유효성 또는 안전성 평가법을 완성하기에 이르렀다.
대한민국 공개특허공보 제10-2020-0113558호
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 동시 배양하는 단계를 포함하는 연골모델 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 제조방법으로 제조된 연골모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 연골모델에 시험 물질을 처리하는 단계를 포함하는 시험 물질의 활성 또는 독성을 검사하는 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 동시 배양하는 단계를 포함하는 연골모델 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "천연 고분자"는 천연에 존재하거나 생물에 의하여 생산되는 고분자 물질을 의미하는 것으로, 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 키토산, 알긴산 및 히알루론산 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "연골"은 연골세포와 연골기질로 구성된 조직으로, 연골은 탄력성이 높아 주어진 힘에 대해 완충작용을 하고 관절 연골의 마찰 계수는 매우 낮아 마찰이 거의 없는 상태에서 관절이 움직일 수 있도록 도움을 주는 신체 기관이다. 구체적으로, 연골 세포는 관절 연골을 만들고 유지하는 역할을 하는데, 연골 모세포에서 세포 분열이 일어나나 일단 성장이 멈추면 연골 세포는 정상적인 환경에서 더 이상 분열하지 않는다.
본 발명에서 "연골모델"은, 연골로부터 분리한 연골세포를 조직공학적으로 배양하여 얻은 연골조직체 또는 연골유사구조체로, 이러한 연골모델은 성장단계 연골모델, 성숙단계 연골모델, 노화단계 연골모델, 또는 퇴화단계 연골모델일 수 있다.
본 발명의 용어 "성장단계 연골모델"은 연골로부터 분리한 연골세포를 조직공학적으로 배양하여, 성장단계의 동물 연골 조직을 모사한 연골 조직체를 의미한다. 본 발명에서 이러한 성장단계 연골모델은, 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 5개월 미만, 구체적으로 2 내지 3개월 동안 배양하여 제조할 수 있다.
상기 성장단계 연골모델은 연골 외측층의 두께가 증가하는 단계(도 3)의 모델인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 성장단계 연골모델은 세포 증식능을 확인하는 인자인 Ki67에 양성으로 나타나(도 6) 많은 세포들이 증식하는 단계이고, TUNEL 염색에서 음성 반응을 나타내며(도 7), 사프라닌 오 염색에서도 탈색 부위 없이 염색이 고르게 나타나는 것(도 4)을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "성숙단계 연골모델"은 연골로부터 분리한 연골세포를 조직공학적으로 배양하여, 성숙단계의 동물 연골 조직을 모사한 연골 조직체를 의미한다. 본 발명에서 이러한 성숙단계 연골모델은, 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 3 내지 7개월, 구체적으로 5 내지 7개월 동안 배양하여 제조할 수 있다.
상기 성숙단계 연골모델은 연골 외측층의 두께가 증가 또는 감소 없이 유지되는 단계(도 3)의 모델인 것을 특징으로 할 수 있다. 성숙단계 연골모델은 세포의 형태가 라쿠나 구조를 잘 유지하고, GAG도 잘 형성된 것을 특징으로 할 수 있다(도 2a, 도 2b 및 도 4). 또한, 성숙단계 연골모델은 콜라겐 타입 II를 발현하고(도 5), Ki67 염색 결과 증식하는 세포가 거의 없는 것으로 나타나며(도 6), TUNEL 염색에서 아포토시스(apoptosis) 양성 세포가 나타나기 시작하는 것(도 7)을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "노화단계 연골모델"은 연골로부터 분리한 연골세포를 조직공학적으로 배양하여, 노화단계의 동물 연골 조직을 모사한 연골 조직체를 의미한다. 본 발명에서 이러한 성숙단계 연골모델은, 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 7 내지 9개월 동안 배양하여 제조할 수 있다.
상기 노화단계 연골모델은 연골 외측층의 두께가 감소하는 단계(도 3)의 모델인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 노화단계 연골모델은 콜라겐 타입 II의 발현이 감소하기 시작하고(도 5), TUNEL 염색에서 아포토시스(apoptosis) 양성 세포가 증가하여 더욱 많은 세포들이 사멸하며(도 7), 사프라닌 오 염색에서 연골 외측측의 색이 연해지면서 붉은 색 층이 감소하는 것(도 4)을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "퇴화단계 연골모델"은 연골로부터 분리한 연골세포를 조직공학적으로 배양하여, 퇴화단계의 동물 연골 조직을 모사한 연골 조직체를 의미한다. 본 발명에서 이러한 퇴화단계 연골모델은, 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 10개월 이상 배양하여 제조할 수 있다.
상기 퇴화단계 모델은 대부분의 세포가 아포토시스(apoptosis) 양상을 나타내는 단계로, 외측층의 표피가 벗겨져 외측층의 두께가 감소된 상태로 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다. 퇴화단계 연골모델은 표층 세포가 현저히 감소하고, 심지어는 벗겨지는 것을 특징으로 할 수 있다(도 2a 및 2b). 또한, 콜라겐 타입 II 발현은 감소하면서 콜라겐 타입 I이 발현되고(도 5), 사프라닌 오 염색에서 연골 외측측의 붉은 색이 현저히 감소하는 것(도 4)을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 연골모델의 외측층 두께 변화를 확인하여, 성장단계 또는 성숙단계 또는 노화단계 또는 퇴화단계의 연골모델로 각각 선발하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 배양된 연골모델에서 콜라겐 타입 I 및 콜라겐 타입 II의 발현을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 예시로, 상기 배양된 연골모델 중, 콜라겐 타입 I은 발현이 거의 없지만, 콜라겐 타입 II가 발현되는 연골모델은 성장단계, 성숙단계 또는 노화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 배양된 연골모델 중, 콜라겐 타입 I은 발현되나, 콜라겐 타입 II가 거의 발현되지 않는 연골모델은 퇴화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함할 수 있다.
추가적으로, 상기 배양된 연골모델에서 라쿠나(lacuna) 및/또는 GAG(Glycosaminoglycan) 형성을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 예시로, 상기 배양된 연골 모델 중, 라쿠나 구조를 유지하거나, GAG가 형성된 연골모델은 성숙단계 연골모델로 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 배양된 연골모델에서 Ki67의 발현을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 예시로, 상기 배양된 연골모델 중, Ki67이 발현되어 세포 증식이 관찰되는 연골모델은 성장단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 배양된 연골모델 중, Ki67이 거의 발현되지 않아 세포 증식이 거의 관찰되지 않는 연골모델은 성숙단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 배양된 연골모델에서 TUNEL 어세이를 통해 연골세포의 아포토시스(apoptosis)를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 예시로, 상기 배양된 연골모델 중, 연골세포의 아포토시스가 관찰되지 않는 연골모델은 성장단계 연골모델로 선발하는 단계; 아포토시스 양성 세포가 나타나기 시작하는 연골모델은 성숙단계 연골모델로 선발하는 단계; 아포토시스 양성 세포가 증가하여 세포 사멸이 많아진 연골모델은 노화단계 연골모델로 선발하는 단계; 및/또는 세포 대부분이 아포토시스 양상을 나타내는 연골모델은 퇴화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 언급한 단계들은, 적절한 성장, 성숙, 노화, 퇴화단계 연골모델을 제조하는데 일부 또는 전부 수행될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 연골모델을 제공한다.
본 발명에 따른 연골모델은 성장, 성숙, 노화 또는 퇴화 연골 조직의 특징을 나타내고 있어, 동물 모델을 대체하여 시험 물질의 반복적 또는 순차적 처리에 따른 영향을 평가하는데 사용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 연골모델에 시험 물질을 처리하는 단계를 포함하는 시험 물질의 활성 또는 독성을 검사하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "활성 또는 독성을 검사하는 방법"은 그 종류를 제한하지 않으며, 연골모델을 이용하여 활성 또는 독성을 검사하는 경우 연골 구성 성분, 연골세포의 증식, 연골세포 사멸, 조직의 형태, 조골세포 및 파골세포의 활동성, 연골조직의 병변 등에 기반한 평가법일 수 있다.
이러한 방법에 있어서, 성장단계, 성숙단계, 노화단계, 퇴화단계 연골모델의 준비는 앞서 언급한 연골모델 제조방법을 참조하여 준비한다.
본 발명에서 상기 시험 물질의 활성은 약물대사 활성 측정 또는 약물 상호작용 평가일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 연골모델 제조방법을 이용하면 동물 모델을 대체할 수 있는 성숙한 연골 또는 노화한 연골모델을 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 연골모델을 사용하여 시험물질의 유효성 및 안전성을 정확하게 검증할 수 있는바, 신약개발, 질병 연구 및 인공장기 개발 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
다만, 본 명세서에 개시된 기술의 일 실시예에 따른 효과는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 토끼 연골에서 분리된 연골세포를 초대배양한 결과이다.
도 2a 및 2b는 기간별로 조직배양된 연골모델의 조직 염색 결과이다.
도 3은 기간별로 조직배양된 연골모델의 외측층의 두께를 측정한 결과이다.
도 4는 기간별로 조직배양된 연골모델의 GAG 함량 확인을 위한 사프라닌오 염색 결과이다.
도 5는 기간별로 조직배양된 연골모델의 콜라겐 타입 I 및 타입 II의 발현을 비교한 결과이다.
도 6은 기간별로 조직배양된 연골모델의 세포 증식을 확인하기 위한 Ki67 발현 확인을 위한 면역조직염색 결과이다.
도 7은 기간별로 조직배양된 연골모델의 퇴화를 확인하기 위한 TUNEL 어세이 결과이다.
도 8a, 8b 및 8c는 기간별로 조직배양된 연골모델의 live/dead 어세이 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 다공성 콜라겐 지지체를 이용한 연골모델 제작
다공성 콜라겐 지지체를 이용하여 3차원 배양 시스템을 구축하였으며, 상기 3차원 배양 시스템은 일반적으로 이용되는 2차원 환경에서 배양된 것 보다 구조가 향상되어 인접 세포와 더 긴밀한 상호작용을 하고 3차원적 형태를 더 잘 유지한다.
실시예 1-1: 연골세포 초대배양
토끼를 안락사시킨 후, 양뒷다리 뼈를 분리하였다. 토끼 넙다리뼈(Femur)의 관절구에 존재하는 연골조직을 멸균된 블레이드(balde)를 사용하여 얇게 박리하였다. 깨끗한 페트리디쉬에 조각난 연골조직을 블레이드로 다져 더 작은 크기로 잘게 절단하였고, 이 때, 연골조직은 PBS와 같은 완충용액으로 충분히 적신 상태로 사용하였다. 잘게 조각난 연골조직을 0.05% 콜라게나제 타입 II(Collagenase type Ⅱ)가 포함된 DMEM 배지에 넣어 매트릭스가 전부 분해될 때까지 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 18 내지 24시간 동안 배양하였다. 우혈청(FBS)이 들어간 배양배지를 사용하여 콜라게나제를 불활성화 시킨 후, 70㎛ 필터를 이용해 깨끗한 50ml 코니칼튜브로 세포 현탁액을 여과시켰다. 실온에서 1200rpm으로 10분 동안 원심분리하여 연골세포를 수득하고, 0 내지 2 passage까지 DMEM 배지에서 배양하였다. 초대배양으로 토끼 연골에서 분리된 연골세포는 도 1에 나타낸 바와 같다.
실시예 1-2: 다공성 콜라겐 지지체(콜라겐 스폰지) 준비
콜라겐 스폰지(Collacote)를 면도칼을 이용하여 5x5x5 mm으로 잘라 지지체를 준비하였다. 지지체 특성상 매우 부드러운 성질을 가지고 있기 때문에 면도칼에 힘을 가하지 않고 천천히 잘라 콜라겐 스폰지의 모양을 유지할 수 있도록 하였다.
실시예 1-3: 연골모델 배양
배양된 토끼연골 초대배양 세포의 배양 배지를 모두 흡인하여 제거한 후 PBS로 2회 세척하고, 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 배양접시 바닥면에 부착된 연골세포를 떼어냈다. 세포가 부유하면 10% FBS가 포함된 배양배지(DMEM)로 트립신-EDTA를 불활성화 시킨 후, 새 50 ml 코니칼 튜브에 수거하여 1000 rpm에서 3분간 원심 분리하였다. 튜브의 상등액 배지는 흡인하여 제거하였으며, 새 배지를 첨가하여 세포 펠릿을 재부유시켰다. 세포현탁액의 20㎕를 잘라둔 콜라겐 스폰지에 분주하여 60mm Ultra-low attatchment dish 또는 페트리디쉬에 옮겼다. 세포현탁액이 분주된 콜라겐 스폰지를 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 상기 배양 중 30분 간격으로 새 배양배지를 10 ㎕씩 콜라겐 스폰지 위에 분주하면서 세포가 스폰지에 부착될 수 있는 최소한의 배지와 시간을 주었다. 세포가 부착된 콜라겐 스폰지가 배지에 충분히 잠길 수 있게 8ml 이상의 배양 배지를 디쉬에 채웠다. 광학현미경을 통해 세포 현탁액이 분주된 콜라겐 스폰지의 세포 부착여부를 확인하고, 2~3일 간격으로 새 배지로 교환하면서 배양하여 연골모델을 완성하였다. 여기서, 성장 단계는 2-3개월 이내, 성숙단계는 5 내지 7개월 동안, 노화단계는 7 내지 9개월동안, 퇴화단계는 10개월이상 배양하여 연골모델을 제작하였다.
실시예 2: 슬라이드 이미징 방법
염색법을 통해 얻은 염색된 슬라이드를 광학현미경에서 관찰하고, 다음의 방법 중 하나로 슬라이드의 이미지를 얻었다.
1) 광학 현미경에 부착된 카메라(DP74, Olympus)를 통해 시료의 부분 이미지를 얻거나;
2) 슬라이드 스캐너(Aperio Scanscope XT, Vista)에서 20x 또는 40x의 대물 렌즈를 이용한 전 슬라이드 스캔을 실시하여 유리 슬라이드를 디지털 슬라이드 파일로 변환하고, 이후 원하는 위치와 확대 배율로 이미지를 얻었다.
실험예 1: H&E 염색법을 통한 본 발명에 따른 연골모델의 관찰
상기 실시예 1의 방법에 따라 제조된 연골모델을 4% 글루타르알데하이드로 하루 이상 고정시켰다. 자동 조직 처리기를 통해 탈수(70%, 80%, 90%, 95%, 100% 에탄올) 및 투명화(자일렌)와 파라핀 침투 과정을 수행한 뒤, 포매하여 파라핀 블록을 제작하고, 3-4 micron의 두께로 박절하여 슬라이드 글라스에 얹고 상온에서 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다.
40℃ 건조 오븐에 1시간 동안 방치한 후, 탈파라핀(자일렌 2회)과 함수(100%, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올)과정을 단계적으로 실시한 뒤, 물로 옮겼다. Harris’ Hematoxylin 용액에 10분간 담궈 염색시킨 뒤 물에 10분간 두었다. 과염색된 Harris’ Hematoxylin을 염산알콜용액(37% 염산수용액 5ml과 80% 에탄올 995ml의 혼합액)에 30초간 씻어낸 뒤 물로 옮기고, 이후 0.5% 암모니아수에 30초간 두어 블루잉(Bluing) 시킨 뒤 물로 옮겼다. 3분 동안 에오신으로 염색하고, 탈수 (95%, 100% 에탄올, 각3회) 및 청명 (자일렌 2회)과정을 단계적으로 실시한 후 봉입하여 광학 현미경을 통해 관찰하였다.
기간별로 제조된 연골모델을 H&E 염색을 통해 관찰한 결과, 연골세포의 대표적인 특징인 라쿠나(lacuna)가 생성됨을 확인하였고, 외측층(outer layer)의 두께가 기간이 지남에 따라 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 배양 5개월까지는 외측층의 두께가 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 구체적으로 5개월까지 100 내지 120um까지 증가함을 확인할 수 있었다. 이후 5개월 내지 7개월에서는 100 내지 120um로 두께가 유지됨을 확인할 수 있었으며, 7개월 내지 9개월에서는 외측층의 두께가 60 내지 80um로 감소되었고, 9개월 이상에서는 60 내지 80um로 유지됨을 확인할 수 있었다. 즉, 연골모델의 성장, 성숙, 노화, 퇴화 단게별로 두께가 변화함을 확인할 수 있었다 (도 2a, 도 2b 및 도 3).
실험예 2: 사프라닌오 염색법을 통한 본 발명에 따른 연골모델의 GAG 확인
실험예 1과 같은 방법으로 슬라이드 글라스에 부착된 3-4 micron의 파라핀 절편을 제조한 후, 탈파라핀(자일렌 2회)과 함수(100%, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올)과정을 단계적으로 실시하였다.
Weigert’s iron hematoxylin solution으로 10분간 염색한 후, 흐르는 수돗물로 10분 동안 세척하였다. 이어서, 0.05% Fast Green (FCF) 수용액으로 5분간 염색하고, 1% acetic acid 수용액으로 10-15초 동안 세척하였다. 0.1% Safranin O 수용액으로 5분간 염색을 진행하고, 탈수 (70%, 80%, 90%, 95%, 100% 에탄올) 및 청명 (자일렌 2회)과정을 단계적으로 실시한 후 봉입하여 광학 현미경을 통해 관찰하였다.
사프라닌오 염색을 통해 본 발명에 따른 연골모델의 GAG 존재 확인결과, 기간별로 연골의 주요성분인 GAG가 생성되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 조직의 중앙부분은 변화가 없었으며, 10개월 이후부터 외측층의 표피에서 색이 연해지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 면역 염색법을 통한 본 발명에 따른 연골모델의 콜라겐 및 Ki67 발현 비교
실험예 1과 같은 방법으로 슬라이드 글라스에 부착된 3-4 micron의 파라핀 절편을 제조한 후, 파라핀 절편을 48.5℃로 맞춰둔 슬라이드 워머에 40-50분간 두어 슬라이드 글라스에 부착시켰다. 기기가 인식할 수 있는 바코드 라벨을 붙인 슬라이드 글라스를 슬라이드 자동면역염색기기 (DISCOVERY XT, Roche Ventana)의 슬라이드 트레이에 올리고, 자동 면연염색기를 통해 파라핀제거와 함수, 항원리트리벌(citrate buffer, CC2, 28분) 과정을 진행하였다. 1차 항체 단계에서 트레이를 열어 각 슬라이드에 직접 100ul씩, 0.01%의 Tween20에 희석한 1차 항체를 넣어주었고, 사용한 각 항체와 비율은 다음과 같다 (Collagen II Antibody (5B2.5), NB600-844, Novus, 1:50; Collagen I alpha 1 Antibody (COL-1), NB600-450, Novus, 1:100; beta-Galactosidase-1 Antibody (OTI1C9), NBP2-45731, Novus, 1:100). 자동 면역염색기의 프로그램을 계속 수행하여 1차 항체 반응(2시간), 2차항체 반응(UltraMap anti-Ms HRP, 20분), DAB 발색(ChromoMap DAB kit) 및 카운터 염색(Hematoxylin & Bluing reagent, 12분)을 진행하였다. 염색이 완료된 슬라이드를 자동 면역염색기기에서 꺼낸 뒤, 세제가 포함된 수돗물로 조심스럽게 수세하여 Ventana사의 liquid coverslip (REF 650-010) 성분을 제거하였다. 이어서, 탈수 (70%, 80%, 90%, 95%, 100% 에탄올) 및 청명 (자일렌 2회)과정을 단계적으로 실시한 후 봉입하여 광학 현미경을 통해 관찰하였다.
상기 면역 염색법에 따라 본 발명에 따른 연골모델의 기간별 콜라겐 타입 I 및 타입 II의 발현을 비교한 결과, 1개월, 9개월에서는 콜라겐 타입 I은 잘 발현되지 않고, 콜라겐 타입 II가 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었으나, 9개월 이후에는 역전되어, 콜라겐 타입 I의 발현이 증가하고 오히려 콜라겐 타입 II는 잘 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 상기 면역 염색법에 따라 세포 증식능을 확인할 수 있는 인자인 Ki67의 발현여부를 본 발명에 따른 연골모델의 배양 기간별로 확인한 결과, 1.5개월까지 대부분의 세포가 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 2개월부터 증식하는 세포의 수가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
실험예 4: TUNEL 어세이를 통한 본 발명에 따른 연골모델의 세포사멸 확인
TUNEL 어세이는 사멸하는 세포를 확인할 수 있는 방법으로, 본 발명에 따른 연골모델을 기간별로 TUNEL 어세이를 통해 확인한 결과, 8개월부터는 조직염색을 통해 여러군데에 갈색으로 염색된 부분을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 연골세포의 세포사멸 즉 노화가 일어남을 확인할 수 있는 결과이다(도 7).
실험예 5: LIVE/DEAD 어세이를 통한 본 발명에 따른 연골모델의
상기 실시예 1의 방법에 따라 제조된 연골모델 중 일부를 LIVE/DEAD 형광 염색 (Invitrogen™, LIVE/DEAD™ Viability/Cytotoxicity Kit)을 통해 죽은 세포(red-fluorescent ethidium homodimer-1)와 살아있는 세포(green-fluorescent calcein-AM)를 염색하여 배양중인 세포체의 상태를 확인하였다.
-20℃에 보관중인 Component A(4 mM calcein AM stock)와 Component B(2 mM EthD-1 stock solution)를 꺼내 실온에 두었다. 샘플 수에 맞춰 50ul/샘플로 5x live-dead assay mixture를 만들었는데, 새 배양액 1ml 당 Component A 2.5 ul 및 Component B 10 ul를 넣어 10 uM calcein AM과 20 uM EthD-1를 함유하도록 제조하였다. 8-well chamber slide (ibidi, μ-Slide 8 Well)에서 분석할 샘플의 수와 동일한 개수의 챔버를 각각 200ul의 새 배양액으로 채워두었다. 각 챔버 당 연골모델이 하나씩 담기도록, 플레이트에 배양중인 연골모델을 옮겨담는다. 각 챔버에 준비한 5x Mixture 50 ul를 넣고 피펫으로 섞어준 뒤 37℃에서 10분간 배양하였다. 최종적으로는 2 uM calcein AM과 4 uM EthD-1이 포함된 배양액이 되었다. 공초점 현미경에서 살아있는 세포(calcein 염색)는 Alexa Fluor 488세팅으로, 죽은세포(EthD-1 염색)은 Alexa Fluor 594세팅으로 이미지를 확인하였고, 대략적 모양 확인을 위한 Transmitted light detector 이미지도 확인하였다. 공초점 현미경의 레이저를 통해 관찰할 수 있는 연골모델 표면에 위치한 세포들의 전체이미지를 얻기 위해 Z-stack 이미지를 찍은 후 projection을 수행하였다.
그 결과, 도 8a 내지 도 8c에 나타낸 바와 같이, 대부분의 세포는 녹색 형광을 나타내고 있어 살아있는 상태로 배양되고 있음을 알 수 있고, 1주, 1달, 2달까지는 세포의 밀도가 증가하는 것을 알수 있다. 이는 세포가 증식을 통해 개체수가 증가하였기 때문이다.

Claims (22)

  1. 다공성 천연 고분자 지지체 및 연골세포를 동시 배양하는 단계를 포함하는, 연골모델 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 천연 고분자는 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 키토산, 알긴산 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 연골모델은 성장단계, 성숙단계, 노화단계 또는 퇴화단계의 연골모델인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 5개월 이내, 5 내지 7개월동안, 7 내지 9개월동안, 또는 10개월 이상 배양하는 것인, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델에서 외측층(outer layer)의 두께 변화를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 연골모델의 외측층 두께 변화를 확인하여, 성장단계 또는 성숙단계 또는 노화단계 또는 퇴화단계의 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델에서 콜라겐 타입 I 및 콜라겐 타입 II의 발현을 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, 콜라겐 타입 I은 발현이 거의 없지만, 콜라겐 타입 II가 발현되는 연골모델은 성장단계, 성숙단계 또는 노화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, 콜라겐 타입 I은 발현되나, 콜라겐 타입 II가 거의 발현되지 않는 연골모델은 퇴화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델에서 라쿠나(lacuna) 또는 GAG(Glycosaminoglycan) 형성을 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 배양된 연골 모델 중, 라쿠나 구조를 유지하거나, GAG가 형성된 연골모델은 성숙단계 연골모델로 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델에서 Ki67의 발현을 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, Ki67이 발현되어 세포 증식이 관찰되는 연골모델은 성장단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, Ki67이 거의 발현되지 않아 세포 증식이 거의 관찰되지 않는 연골모델은 성숙단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델에서 TUNEL 어세이를 통해 연골세포의 아포토시스(apoptosis)를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, 연골세포의 아포토시스가 관찰되지 않는 연골모델은 성장단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, 아포토시스 양성 세포가 나타나기 시작하는 연골모델은 성숙단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, 아포토시스 양성 세포가 증가하여 세포 사멸이 많아진 연골모델은 노화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 배양된 연골모델 중, 세포 대부분이 아포토시스 양상을 나타내는 연골모델은 퇴화단계 연골모델로 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는, 제조방법.
  20. 제1항 내지 제19항중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 연골모델.
  21. 제20항에 따른 연골모델에 시험 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 시험 물질의 활성 또는 독성을 검사하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 활성은 약물대사 활성 측정 또는 약물 상호작용 평가인 것인, 시험 물질의 활성 또는 독성을 검사하는 방법.
KR1020210062084A 2021-05-13 2021-05-13 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법 KR20220154487A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210062084A KR20220154487A (ko) 2021-05-13 2021-05-13 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법
PCT/KR2022/006348 WO2022240058A1 (ko) 2021-05-13 2022-05-03 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210062084A KR20220154487A (ko) 2021-05-13 2021-05-13 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220154487A true KR20220154487A (ko) 2022-11-22

Family

ID=84029300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210062084A KR20220154487A (ko) 2021-05-13 2021-05-13 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20220154487A (ko)
WO (1) WO2022240058A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200113558A (ko) 2019-03-25 2020-10-07 주식회사 카티프라임 체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0309728A (pt) * 2002-05-01 2005-04-26 Verigen Ag Composição implantável, e, métodos para produzir a mesma, e para o tratamento eficaz de cartilagem de superfìcie de junta articulante
WO2007052935A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 Modern Cell & Tissue Technologies Inc. Artificial cartilage containing chondrocytes obtained from costal cartilage and preparation process thereof
KR101660877B1 (ko) * 2014-10-08 2016-09-28 한국화학연구원 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로젤 미립구, 이의 제조방법 및 이를 이용한 스페로이드 형성방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200113558A (ko) 2019-03-25 2020-10-07 주식회사 카티프라임 체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022240058A1 (ko) 2022-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mancuso et al. Decellularized ovine arteries as small-diameter vascular grafts
Zvarova et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds
Davies et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system ‘Zetos’: systems and culture preparation
Sun et al. Structural integrity, immunogenicity and biomechanical evaluation of rabbit decelluarized tracheal matrix
RU2498808C9 (ru) Способ лечения состояния ротовой полости больного (варианты)
CN106362211A (zh) 生物基质支架
US20060228339A1 (en) Methods of preparing transplantable product for treatment of skin defects
Polisetti et al. A decellularized human corneal scaffold for anterior corneal surface reconstruction
JP7058397B2 (ja) 組織再生培養細胞シート、製造方法及びその利用方法
EP3950711A1 (en) Cell construct and cell construct production method
Massie et al. Advanced imaging and tissue engineering of the human limbal epithelial stem cell niche
Song et al. Development of novel apoptosis-assisted lung tissue decellularization methods
Brand‐Saberi et al. Blood vessel formation in the avian limb bud involves angioblastic and angiotrophic growth
Nayakawde et al. In vitro regeneration of decellularized pig esophagus using human amniotic stem cells
JP2021525100A (ja) 増殖性肝細胞を培養する方法
KR20220154487A (ko) 동물 대체 연골모델 및 이를 이용한 약물의 유효성 또는 독성 평가 방법
McKay et al. Assembly and Application of a Three‐Dimensional Human Corneal Tissue Model
Hernandez et al. Confocal scanning of intervertebral disc cells in 3D: Inside alginate beads and in native microenvironment
Makarov et al. Collagen fiber autofluorescence level in evaluating the biological properties of tissue grafts
KR100818636B1 (ko) 중간엽줄기세포를 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법
KR20210119210A (ko) 오가노이드 투명화 키트, 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법 및 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법
EP2198013A1 (en) An in vitro beating heart model
Zhang et al. 3D Bioprinting of Corneal Decellularized Extracellular Matrix (CECM): GelMA Composite Hydrogel for Corneal Stroma Engineering
Shah et al. Rapid and inexpensive method of studying dedifferentiation in rabbit articular chondrocytes
Ponyatovskaya et al. Transplant of limbal epithelial stem cells on bioresorbable scaffold