KR20200113558A - 체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 외 골관절염 실험 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 세포 배양 배지; 및 콘드로이티나제(chondroitinase)를 포함하는 생체 외(in vitro) 골관절염 모델 조성물, 이를 활용한 생체 외 3차원 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 생체 외(in vitro) 골관절염 모델 조성물 및 3차원 골관절염 모델은 실제 골관절염 환자의 연골에서 나타나는 다양한 형태학적 또는 분자생리학적 변화들을 매우 유사하게 모사하므로, 골관절염의 병태 연구, 골관절염 치료제의 효능 검증 등에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.

Description

체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법{In vitro osteoarthritis condition model and drug screening method for osteoarthritis using the same}
본 발명은 체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 세포 배양 배지; 및 콘드로이티나제(chondroitinase)를 포함하는 인 비트로(in vitro) 관절염 모델 조성물, 이를 활용한 생체 외 3차원 관절염 모델 및 이를 이용한 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
골관절염(Osteoarthritis, OA)은 과도한 기계적 스트레스에 반응하여 연골세포(chondrocyte)의 비대화 분화(hypertrophic differentiation)에 이은 연골세포 사멸 및 연골의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 손상을 특징으로 하는 가장 흔한 퇴행성 관절 질환이다. 비대화된 연골세포에서 분비되는 MMP-13 및 ADAMTS5와 같은 단백분해효소는 골관절염의 발생에 핵심적인 역할을 수행한다. 이는 기계적 스트레스에 의해 연골세포에서 생성되는 질산(nitric oxide) 성분과 활성산소(reactive oxygen species)가 연골세포 주위 기질인 콘드로이틴 설페이트의 분해를 증가시키며, 이러한 작용이 골관절염 발생 기전에 중요하게 작용함을 시사한다.
유리질 관절 연골(hyaline cartilage)의 세포 외 기질은 주로 제2형 콜라겐, 프로테오글리칸 및 물 분자로 구성된다. 연골 세포외 기질에서 가장 풍부한 콜라겐 단백질인 2형 콜라겐은 관절 연골에 인장 강도를 제공하는 골격 역할을 한다. 가장 풍부한 프로테오글리칸은 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)와 케라틴 설페이트(keratin sulfate)가 선형 단백질 줄기에 결합하여 구성되는 어그리칸(aggrecan)이다. 골관절염 진행과정에서 연골 세포외 기질의 파괴에 관여하는 주요 단백질 분해효소는 콜라겐의 경우 MMP-13이고 어그리칸의 경우 ADAMTS5이다. 이러한 단백분해효소에 의한 연골 세포외 기질의 파괴는 손상관련 분자 양상(damage-associated molecular patterns; DAMPs)으로 작용할 수 있는 콜라겐 및 글리코사미노글리칸 절편을 생성할 수 있다. DAMPs로 작용할 수 있는 분자는 골관절염에서 비글리칸(biglycan), 피브로넥틴(fibronectin), 저분자량 히알루론산 및 테나신 C(tenascin C) 등이 포함된다. DAMPs는 Toll-양 수용체의 활성화를 통해 낮은 등급의 염증 및 단백분해효소의 생산을 유도하여 OA 진행에 관여한다.
한편, 콘드로이틴 설페이트 (chondroitin sulfate, CS)는 긴 분지형 다당류인 황산화된 GAG의 일종으로 연골 프로테오글리칸의 주성분이다. 분광학적 분석에 따르면 CS 함량이 젊은 관절연골의 35% 무게/건조 중량(w/dw)과 인간 성인 관절연골의 20% w/dw를 차지한다. 뿐만 아니라 연골 세포외 기질 GAG 가운데 연골세포와 가장 밀접하게 상호작용을 한다. 연골세포-부착 기질 GAG 분석 결과, 콘드로이틴 설페이트는 히알루론산과 케라틴 설페이트 비해 연골세포와의 결합이 5-7배 더 많았다. 연골의 세포외 기질에서 연골세포에 멀리 떨어진 프로테로글리칸의 반감기는 100-800일로 매우 길지만, 연골세포에 접한 프로테로글리칸은 반감기가 4-30일로 비교적 짧다. 그러므로 연골에 풍부하고 연골세포에 바로 접해있는 콘드로이틴 설페이트의 분해는 연골세포의 생리에 중요한 역할을 할 가능성이 있으며, 골관절염의 진행에도 핵심적일 수 있다.
이와 같이, 관절 연골의 세포외 기질을 구성하는 주요한 성분인 콘드로이틴 설페이트가 골관절염 환자의 연골에서 그 발현량이 줄어들어 있고 체인의 길이가 짧아져 있다는 것은 많이 보고된 바가 있지만, 골관절염 환자의 연골에서 콘드로이틴 설페이트의 이러한 변화가 관절세포의 형태학적 변화나 단백분해효소의 발현에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자는 관절 연골의 세포 외 기질을 구성하는 콘드로이틴 설페이트의 분해가 연골세포에 미치는 영향을 규명하던 중, 콘드로이틴 설페이트의 분해 생성물이 DAMPs로 작용하여 그 자체만으로도 골관절염 유사 병리현상을 유도할 수 있음을 발견하였고, 이를 통해서 1) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 기반 3차원 하이드로겔 조건에서 연골세포 배양을 통해 연골유사 환경을 제공하고, 여기에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하여 체외 조건에서 관절염 모델 조성물을 제공할 수 있다는 것과 2) 이를 이용하여 골관절염 치료 약물의 체외 스크리닝 시스템을 구축할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 세포 배양 배지; 및 콘드로이티나제(chondroitinase)를 포함하는 인 비트로(in vitro) 관절염 모델 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 인 비트로(in vitro) 3차원 관절염 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 관절염 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(e) 3차원 구조체 내 연골세포의 형태학적 특성; 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량; 및 상기 배양 배지 내 NO 생성량으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 평가항목에 대한 미처리 대조군과 관절염 치료제 후보물질 처리군의 차이를 비교하는 단계를 포함하는 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 세포 배양 배지; 및 콘드로이티나제(chondroitinase)를 포함하는 인 비트로(in vitro) 관절염 모델 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 골관절염 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(e) 3차원 구조체 내 연골세포의 형태학적 특성; 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량; 및 상기 배양 배지 내 NO 생성량으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 평가항목에 대한 미처리 대조군과 골관절염 치료제 후보물질 처리군의 차이를 비교하는 단계를 포함하는 골관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate, 이하 “CS”라 함)와 함께 배양된 연골세포에 콘드로이티나제를 처리하여 CS를 분해한 결과, 골관절염(이하 “OA”라 함) 환자의 연골에서 나타나는 것과 동일하게 연골세포의 비대성 형태학적 변화(hypertrophic morphological change)가 관찰되었다. 또한, 상기 연골세포에서 유전자의 발현 변화를 평가한 결과, OA의 핵심 특징인 연골세포 외 기질 (extracellular matrix, 이하 “ECM”이라 함) 분해를 담당하는 MMP-13 및 ADAMTS5의 발현, 산화 스트레스의 마커인 Fth1, Hmox1 및 Txn의 발현이 크게 증가하였고, 배양 상등액 내 NO 수준 또한 크게 증가되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해서, CS가 콘드로이티나제로 분해되는 조건 하에서 연골세포는 실제 골관절염에서와 유사한 형태학적 및 분자생리학적 변화가 나타난다는 것을 확인할 수 있었다.
종래, 골관절염 환자의 연골에서 CS의 발현량이 감소되어 있고 CS의 쇄 길이가 짧아져 있다는 것은 알려져 있었지만, CS의 분해산물이 연골세포에 어떠한 영향을 미치는지에 대해서는 보고된 바가 없었다. 특히, 콘드로이타나제에 의한 CS 분해 생성물 그 자체만으로도 연골세포에 골관절염과 유사한 병리학적 변화을 유발할 수 있다는 것은 종래 보고된 바가 없으며 이러한 발견은 본 발명자가 본 발명을 통해서 최초로 보고하는 바이다.
이에 본 발명자들은 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 기반의 3차원 연골세포(chondrocyte) 하이드로겔 배양법을 확립하고, 여기에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하여 골관절염 상황에서 발생하는 세포외 기질의 손상을 유도하는 조건에서 골관절염 치료 후보 물질을 처리하고 골관절염 발생에 중요한 단백분해 효소의 발현에 미치는 작용을 확인하여 후보물질의 골관절염 치료제로서의 스크리닝에 사용될 수 있는 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 세포 배양 배지; 및 콘드로이티나제(chondroitinase)를 포함하는 생체 외(in vitro) 골관절염 모델 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 콘드로이틴 설페이트는 D-글루로닉산과 N-아세틸 갈락토사민, 설페이트로 이루어진 황산화 글리코사미노글리칸으로서 연골과 결합조직에 많이 함유되어 있다. 특히, CS는 동물모델에서 항염증 효과가 보고되었으며 FDA 승인된 화상치료용 피부 대체제의 피층(dermal layer)의 한 성분으로 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 콘드로이틴 설페이트는 그 종류 및 분자량이 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 콘드로이틴 설페이트 A (chondroitin-4-sulfate), 콘드로이틴 설페이트 C (chondroitin-6-sulfate), 콘드로이틴 설페이트 D (chondroitin-2,6-sulfate) 및 콘드로이틴 설페이트 E (chondroitin-4,6-sulfate) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 연골에는 콘드로이틴 설페이트 C 가 가장 많아서 가장 바람직하다(A&R 1988;31:1028).
본 발명에서 상기 콘드로이틴 설페이트 유도체란 그 자체로 가교결합을 형성할 수 있는 관능기가 도입된 콘드로이틴 설페이트를 의미하는 것으로서, 상기 가교결합을 형성할 수 있는 관능기란 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 메타크릴기(methacryl group), 아크릴기(acrylate group), 사이올기(thiol group)을 포함할 수 있다.
가교결합을 형성할 수 있는 관능기가 도입된 콘드로이틴 설페이트 유도체의 제조방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 통상의 기술자가 이들 공지기술을 활용하여 본 발명에 적용할 수 있을 것임은 자명하게 이해되어야 한다.
본 발명에서 상기 세포 배양 배지는 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 바람직하게는, 상기 기본배지는 그 구성성분과 함량이 명확하게 확인된 화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)일 수 있다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 구매 가능한 화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면 둘베코인산 완충 식염수, 얼 균형화 염, 행크 균형화 염, 티로드 염, 알시버 용액, 게이 균형화 염 용액, 크랩-헨젤라이트 변성 완충제, 크랩-링거 중탄산 완충제, 퍽 식염수, 둘베코 변성 이글 배지, 둘베코 변성 이글 배지/영양소 F-12 Ham, 영양소 혼합물 F-10Ham(Ham's F-10), 배지 199, 이글 최소 필수 배지, RPMI-1640 배지, 에임즈 배지, BGJb 배지(Fitton-JacksonModification), 클릭 배지, CMRL-1066 배지, 피셔 배지, 글라스코우 최소 필수배지(GMEM), 이스코브 변성 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이 5A 변성 배지, NCTC 배지, 스윔S-77 배지, 웨이마우스 배지,윌리엄 배지 E, MEM 배지 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명의 상기 세포 배양 배지에는 당업계에서 세포 배양을 위해 배지에 첨가하는 임의의 첨가물질이 추가로 포함이 될 수 있다. 배양액 중의 다른 성분으로서 구체적으로는, 예를 들어 L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-오르니틴, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-트레오닌, L-트립토판, L-발린 등, 바람직하게는 L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-트레오닌, L-트립토판, L-발린 등의 아미노산류 ; i-이노시톨, 비오틴, 엽산, 리포산, 니코틴아미드, 니코틴산, p-아미노벤조산, 판토텐산 칼슘, 염산 피리독살, 염산 피리독신, 리보플라빈, 염산 티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등, 바람직하게는 비오틴, 엽산, 리포산, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 염산 피리독살, 리보플라빈, 염산 티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등의 비타민류 ; 염화 콜린, 타르타르산 콜린, 리놀산, 올레산, 콜레스테롤 등, 바람직하게는 염화 콜린 등의 지질 인자 ; 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스 등, 바람직하게는 글루코오스 등의 에너지원 ; 염화 나트륨, 염화 칼륨, 질산 칼륨 등, 바람직하게는 염화 나트륨 등의 침투압 조절제) ; EDTA 철, 시트르산 철, 염화 제 1 철, 염화 제 2 철, 황산 제 1 철, 황산 제 2 철, 질산 제 2 철 등, 바람직하게는 염화 제 2 철, EDTA 철, 시트르산 철 등의 철원류 ; 탄산 수소 나트륨, 염화 칼슘, 인산 2수소 나트륨, HEPES, MOPS 등, 바람직하게는 탄산 수소 나트륨 등의 pH 완충제를 예시할 수 있다.
상기 성분 이외에, 예를 들어 황산 구리, 황산 망간, 황산 아연, 황산 마그네슘, 염화 니켈, 염화 주석, 염화 마그네슘, 아규산 나트륨 등, 바람직하게는 황산 구리, 황산 아연, 황산 마그네슘 등의 미량 금속 원소 ; Tween80, 플루로닉 F68 등의 계면 활성제 ; 및 재조합형 인슐린, 재조합형 IGF, 재조합형 EGF, 재조합형 FGF, 재조합형 PDGF, 재조합형 TGF-, 염산 에탄올아민, 아 (亞) 셀렌산 나트륨, 레티노인산, 염산 푸트레신 등, 바람직하게는 아셀렌산 나트륨, 염산 에탄올아민, 재조합형 IGF, 염산 푸트레신 등의 증식 보조 인자 ; 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘 등의 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다. 또한 상기 본 발명의 적합예에 있어서는, 스트렙토마이신, 페니실린 G 칼륨 및 겐타마이신 등의 항생 물질이나, 페놀 레드 등의 pH 지시약을 포함하고 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 콘드로이티나제는 콘드로이틴 설페이트를 분해하는 효소를 의미하는 것으로서, 그 종류가 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지된 콘드로이티나제, 또는 향후 새롭게 밝혀질 신규 콘드로이티나제를 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 콘드로이티나제는 콘드로이티나제 B, 콘드로이티나제 C, 콘드로이티나제 AC 및 콘드로이티나제 ABC로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 콘드로이티나제 ABC일 수 있다.
본 발명의 상기 골관절염 모델 조성물에서 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 10%(w/v)로 포함되고, 상기 연골세포는 1ⅹ105 내지 1ⅹ109 cell/mL 및 상기 콘드로이티나제는 0.001 내지 1 unit/ml로 포함이 될 수 있다.
바람직하게는 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 7%(w/v)로 포함되고, 상기 연골세포는 1ⅹ106 내지 1ⅹ108 cell/mL 및 상기 콘드로이티나제는 0.01 내지 0.5 unit/ml로 포함이 될 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 5%(w/v)로 포함되고, 상기 연골세포는 1ⅹ107 내지 1ⅹ108 cell/mL 및 상기 콘드로이티나제는 0.05 내지 0.3 unit/ml로 포함이 될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 내지 (d) 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
상기 (a) 단계는 본 발명의 생체 외 3차원 골관절염 모델의 원료들을 혼합하는 단계로서, 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체, 연골세포에 대해서는 전술한 바가 동일하게 적용이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 가교제는 열가소성 고분자의 분자체와 화학적으로 반응하여 분자체를 상호 연결시키는 물질을 의미하는 것으로서, 본 발명에서는 상기 (a) 단계에서 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체 상호간; 상기 생체적합성 고분자 상호간; 및/또는 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체와 상기 생체적합성 고분자 상호간을 연결시키는 물질을 의미한다.
본 발명에서 상기 가교제는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 수산화알루미늄, 수산화알루미늄겔, 함수규산알루미늄, 카올린, 아세트산알루미늄, 락트산알루미늄, 스테아르산알루미늄, 염화캄슘, 염화마그네슘, 염화알루미늄, 메타규산알루민산마그네슘, 규산알루민산마그네슘 등과 같은 다가 금속염일 수도 있고, 주석산, 글리콜산, 글루탐산, 젖산, 말레산, 구연산 등과 같은 유기산일 수도 있다.
본 발명에서 상기 광개시제는 빛에 노출됨에 따라 신속한 가교결합을 유발하는 물질을 의미한다. 적절한 광학개시제의 비제한적인 예시로는, 아세토페논, 벤조인 메틸 에티르, 디에톡시아세토페논, 벤조일 포스핀 옥사이드 및 1-히드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트, 벤질디메틸케탈, 아세토페논, 벤조인메틸에테르, 디에톡시아세토페논, 벤조일 포스핀 옥사이드, 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로판 등을 들 수 있다. 첨가되는 광학개시제의 양은 노출되는 빛의 파장 및 시간에 따라 달라질 수 있다. 가교결합을 위한 바람직한 자외선의 파장은 300 nm 내지 400 nm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 350 nm 내지 400 nm, 350 nm 내지 390 nm, 355 nm 내지 380 nm, 360 nm 내지 370 nm, 가장 바람직하게는 365 nm일 수 있다.
본 발명에서 상기 생체적합성 고분자는 3차원 구조체의 골격이 되는 하이드로겔을 형성할 수 있고, 연골세포의 성장에 부정적인 영향을 미치지 않는 고분자 물질을 의미한다. 본 발명에서 상기 생체적합성 고분자는 당업계에서 세포배양, 의료용품 제조 등에 활용이 되고 있는 생체적합성 고분자라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 알긴산, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 아가로오스, 실크단백질, 글리코사미노글리칸, 셀룰로오스, 펙틴, 폴리에틸렌글리콜 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 생체적합성 고분자의 유도체란 전술한 콘드로이틴 설페이트의 유도체와 동일한 의미로 해석이 될 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계의 조성물에서 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 10%(w/v), 상기 연골세포는 1ⅹ105 내지 1ⅹ109 cell/mL, 상기 가교제 또는 광개시제는 0.01 내지 10%(w/v) 및 상기 생체적합성 고분자는 1 내지 10%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
바람직하게는 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 7%(w/v), 상기 연골세포는 1ⅹ106 내지 1ⅹ108 cell/mL, 상기 가교제 또는 광개시제는 0.01 내지 5%(w/v) 및 상기 생체적합성 고분자는 1 내지 8%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
더 바람직하게는, 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 5%(w/v)로 포함되고, 상기 연골세포는 1ⅹ107 내지 1ⅹ108 cell/mL, 상기 가교제 또는 광개시제는 0.01 내지 1%(w/v) 및 상기 생체적합성 고분자는 3 내지 8%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체(CS-MA; chondroitin sulfate-methacrylate)는 3%(w/v)로 포함되고, 상기 연골세포는 1.5ⅹ107 cell/mL, 그리고 광개시제는 0.05%(w/v) 및 상기 생체적합성 고분자는 5%(w/v)로 포함될 수 있다.
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서의 조성물에 온도변화, 화학적 변화 또는 광 조사 등의 방법을 통해서 고분자 물질의 가교결합을 유도하는 단계로서 상기 (a) 단계의 조성물에 포함이 되는 고분자 물질의 종류, 가교제의 종류, 광개시제의 종류 등에 따라서 구체적인 가교방법은 통상의 기술자가 예의 적절하게 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 3차원 구조체의 형상과 크기, 그리고 제조방법이 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 상기 (a) 단계에서 제조된 조성물을 3차원 프린터에 충전하여 일정한 형상으로 3차원 프린팅한 후 가교결합을 유도하여 제조될 수도 있고, 또는 일정한 형상을 갖는 몰드에 충전하여 가교결합을 유도하여 제조될 수도 있다.
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 제조된 3차원 구조체를 세포 배양 배지 내에 위치시켜 3차원 구조체 내에 포함된 연골세포가 정상적으로 성장할 수 있는 환경을 제공해주는 단계이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 배양된 연골세포는 정상적으로 성숙하여 비정상적 형태로 변형이 되지 않는다는 것이 확인되었다.
본 발명에서 상기 세포 배양 배지는 전술한 바가 동일하게 적용이 될 수 있다.
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하는 단계;
상기 (d) 단계는 콘드로이틴 설페이트 기반의 3차원 구조체 내에서 성장 중인 연골세포에 골관절염과 유사한 환경을 조성해주는 단계로서, 구체적으로는 상기 3차원 구조체에 콘드로이티나제를 처리해 줌으로써 콘드로이틴 설페이트가 분해되어 연골세포에 골관절염과 유사한 병리학적 반응을 유도하는 단계이다.
본 발명에서 상기 콘드로이티나제는 전술한 바가 동일하게 적용이 될 수 있다.
간략하게, 상기 콘드로이티나제는 세포 배양 배지에 0.001 내지 1 unit/ml으로 처리가 될 수 있고, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 unit/ml, 가장 바람직하게는 0.05 내지 0.3 unit/ml로 처리가 될 수 있다.
또한, 상기 콘드로이티나제가 처리된 세포 배양 배지는 일정한 주기에 따라 교환될 수 있으며, 예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일에 한 번씩 콘드로이티나제가 처리된 세포 배양 배지가 교환될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 3차원 구조체를 배양 배지에서 1 내지 2주 동안 배양한 후, 콘드로이티나제를 1 내지 2주간 처리한 결과 골관절염과 유사한 병리학적 현상들이 관찰되는 것이 확인된 바 있다.
따라서, 본 발명의 상기 (c) 단계는 1 내지 5주 동안 유지되며, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계 개시일로부터 1일 내지 2주 경과 후 시작되는 것이 바람직할 수 있다.
더 바람직하게는 본 발명의 상기 (c) 단계는 1 내지 4주 동안 유지되며, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계 개시일로부터 1일 내지 2주 경과 후 시작이 될 수 있다.
가장 바람직하게는 본 발명의 상기 (c) 단계는 2 내지 3주 동안 유지되며, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계 개시일로부터 1일 내지 2주 경과 후 시작이 될 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 내지 (d) 단계를 거쳐 총 3주간 배양된 3차원 골관절염 모델은, 실험 종료 시점에 골관절염 환자의 연골에서 나타나는 것과 동일하게 연골세포의 비대성 형태학적 변화(hypertrophic morphological change)가 관찰되었고, 상기 연골세포에서 유전자의 발현 변화를 평가한 결과, 골관절염의 핵심 특징인 연골세포 외 기질 (extracellular matrix, 이하 “ECM”이라 함) 분해를 담당하는 MMP-13 및 ADAMTS5의 발현, 산화 스트레스의 마커인 Fth1, Hmox1 및 Txn의 발현이 크게 증가하였고, 배양 상등액 내 NO 수준 또한 크게 증가되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해서, 콘드로이틴 설페이트가 콘드로이티나제로 분해되는 조건을 제공하는 본 발명의 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델은 실제 골관절염에서와 유사한 형태학적 및 분자생리학적 변화를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 또한 (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
(c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
(d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 골관절염 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(e) 3차원 구조체 내 연골세포의 형태학적 특성; 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량; 및 상기 배양 배지 내 NO 생성량으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 평가항목에 대한 미처리 대조군과 골관절염 치료제 후보물질 처리군의 차이를 비교하는 단계를 포함하는 골관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
전술한 본 발명의 생체 외 3차원 골관절염 모델은 실제 골관절염에서 나타나는 형태학적 및 분자생리학적 변화를 거의 그대로 모사하기 때문에, 골관절염 치료제 후보물질의 스크리닝에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
본 발명의 상기 스크리닝 방법의 (a) 내지 (d) 단계는 전술한 3차원 골관절염 모델에서 설명한 바가 동일하게 적용이 될 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 (d) 단계에서 골관절염 치료제 후보물질을 처리하는 방법은 치료제 후보물질의 효과에 따라서 변경이 될 수 있으며, 예를 들어 콘드로이티나제 처리와 동시에 진행이 될 수도 있고, 치료제 후보물질을 먼저 처리한 후 콘드로이티나제를 처리할 수도 있으며, 또는 콘드로이티나제를 처리한 후 치료제 후보물질을 처리할 수도 있다.
본 발명에서 상기 골관절염 치료제 후보물질은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 천연물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 박테리아 또는 진균의 대사물 및 생활성 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 (e) 단계는 골관절염 치료제 후보물질 처리군과 미처리 대조군에서 관찰되는 여러가지 생리학적 또는 병리학적 변화들을 비교하는 단계로서, 상기 생리학적 또는 병리학적 변화란 3차원 구조체 내 연골세포의 형태학적 특성; 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량; 및 상기 배양 배지 내 NO 생성량으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
보다 구체적으로는 상기 연골세포의 형태학적 특성은 비대성 변화(hypertrophic change)이고; 상기 산화성 스트레스 마커는 Rth1, Hmox1 및 Txn으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고; 상기 세포 외 기질 분해효소는 MMP-13 또는 ADAMTS5 일 수 있다.
한편, 상기 (e) 단계에서 미처리 대조군과 비교해 골관절염 치료제 후보물질 처리군에서 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 만족하는 결과가 나타난 경우, 상기 후보물질이 골관절염 치료효과를 나타내는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(i) 3차원 구조체 내 연골세포의 비대성 변화(hypertrophic change)의 억제;
(ii) 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량 감소, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 감소 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량 감소; 및
(iii) 배양 배지 내 NO 생성량 감소.
본 발명의 생체 외(in vitro) 골관절염 모델 조성물 및 3차원 골관절염 모델은 실제 골관절염 환자의 연골에서 나타나는 다양한 형태학적 또는 분자생리학적 변화들을 매우 유사하게 모사하므로, 골관절염의 병태 연구, 골관절염 치료제의 효능 검증 등에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
도 1a 내지 1c를 포함하는 도 1은 연골세포가 포함된 콘드로이틴 설페이트 (CS) 기반 3차원 하이드로겔을 7주간 배양하면서 나타나는 연골세포의 형태학적 변화와 연골세포 분화 마커 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 1a에서는 CS-기반 3차원 하이드로겔에 연골세포를 배양하기 위해 3% (w/v)의 CS 및 5% (w/v)의 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 3차원 하이드로겔 솔루션 (solution)을 1.5 X 107 cell/mL 농도의 연골세포와 광개시제와 혼합한다. 자체 제작한 몰드의 하단을 Autoclave로 멸균한 PCR 필름으로 밀봉 후 상기 혼합물을 각각 100 ul/well의 양을 넣고 365nm의 UV에 5 내지 20분간 노출시켜 가장 적합한 UV 노출 시간을 확인하였다.
도 1b는 1a에서 제시한 방법으로 만든 CS 기반 3차원 하이드로겔에서 배양한 연골세포의 시간에 따른 형태학적 변화 및 연골기질의 생성 정도를 H&E 와 Safranin-O 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 1c는 연골세포의 분화 마커 유전자의 발현 변화를 RT-qPCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2a 내지 2f를 포함하는 도 2는 콘드로이틴 설페이트(CS)로 이루어진 세포외 기질(ECM)의 분해만으로도 연골세포의 비대성 변화(hypertrophy-like changes), 연골세포 내에서 MMP-13, ADAMTS5 및 산화 스트레스의 증가를 유발하기에 충분하다는 것을 보여주는 일련의 실험 결과를 나타낸다.
도 2a는 CS-기반의 3차원 하이드로겔 배양 시스템에 콘드로이티나제 ABC(ChABC)를 처리하는 스케쥴을 간략하게 나타낸 모식도이다. E15.5 마우스의 긴 뼈에서 분리한 1차 연골세포를 3% (w/v)의 CS 및 5% (w/v)의 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 3차원 하이이드로겔 배양 시스템에 1.5 X 107 cell/mL의 농도로 연골세포를 3주간 배양한다. ChABC는 도 1a에 도시된 바와 같이 1주간 또는 2주간 3차원 하이드로겔 배양 시스템에 처리한다.
도 2b는 3차원 하이드로겔 배양 시스템 내에서 연골세포의 전체적인 형태를 헤마톡실린&에오신 염색을 통해 관찰한 도면이다.
도 2c는 연골세포-특이적인 연골성 분화(chondrogenic differentiation)의 마커 유전자의 발현 정도를 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 2d는 연골세포와 관련된 주요 신호전달체계에 포함된 표적 유전자들의 RNA 발현량을 분석한 결과이다.
도 2e는 연골세포의 비대화 및 산화 스트레스에 대한 마커인 MMP-13 및 8-oxo-dG를 면역형광염색법으로 관찰한 결과이다.
도 2f는 전체 세포 대비 MMP-13 또는 8-oxo-dG로 염색된 세포들의 비율을 정량화하여 나타낸 도면이다.
도 3a 내지 3d를 포함하는 도 3은 3차원 연골세포 배양 시스템에서 CS 기반의 ECM 분해는 TLR2 및 TLR4를 통해서 MMP-13, ADAMTS5, 산화 스트레스 및 NO 생성을 증가시킨다는 것을 확인한 결과이다.
도 3a는 연골세포의 전체적인 형태학적 변화 관찰을 위한 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다. CS 기반의 3차원 하이드로겔 배양 시스템에서 배양된 1차 연골세포에 OxPAPC(TLR2 및 TLR4 저해제) 또는 LPS-RS(TLR4-MD2 저해제)의 존재 하에서 콘드로이티나제 ABC(ChABC)를 2주간 처리했다. 상부 도면에서 검정색 사각형 부분을 확대하여 하부 도면에 나타낸 것이다.
도 3b는 표시된 표적 유전자들의 RNA 발현을 실시간 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 3c는 3차원 하이드로겔 배양 시스템의 배양 상등액에서 NO 농도를 측정한 결과이다.
도 3d는 3차원 하이드로겔 배양 시스템의 동결 절편에서 8-oxo-dG, MMP-13 및 ADAMTS5를 면역형광염색하여 관찰한 도면 및 염색이 양성으로 판단된 세포의 비율을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 4e를 포함하는 도 4는 CS 분해에 의한 연골세포의 이화성 변화(catabolic changes)는 MAPK, NF-kB, STAT4 및 NO 신호체계 의존적임을 확인한 결과이다.
도 4a는 다양한 신호전달계 저해제의 존재 하에서 ChABC를 처리한 3차원 하이드로겔 배양 시스템의 동결-절편을 H&E로 염색하여 관찰한 결과이다.
도 4b는 다양한 신호전달계 저해제의 존재 하에서 ChABC를 처리한 3차원 하이드로겔 배양 시스템에서 배양된 연골세포에서 표시된 유전자의 발현량을 실시간 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 4c는 다양한 신호전달계 저해제의 존재 하에서 배양된 3차원 하이드로겔 배양 시스템의 배양 상등액에서 NO 농도를 측정한 결과이다.
도 4d는 MMP-13(붉은색 염색) 또는 8-oxo-dG(연두색)을 면역형광염색하여 관찰한 결과이다. DAPI(파란색)를 핵 대조염색으로 사용하였다.
도 4e는 상기 면역형광염색 실험에서 표적(MMP-13 또는 8-oxo-dG)-양성 세포/DAPI 양성세포의 비율을 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 5a 및 5b를 포함하는 도 5는 NO의 저해는 MAPK 및 NF-kB 신호체계의 인산화를 완화하지만, STAT3 신호체계는 그렇지 않다는 것을 확인한 결과이다.
도 5a는 iNOS 저해제인 1400w의 존재 또는 부존재 하에서 LPS에 의한 MAPK, IkBa 및 STAT3의 인산화 여부를 시간 흐름에 따라 관찰한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5b는 CS 기반의 ECM의 분해에 의한 연골세포의 이화성 작용의 기전을 나타낸 모식도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 실험방법
(1) 연골세포의 1차 배양(primary chondrocyte culture)
1차(primary) 연골세포는 E15.5 마우스의 긴 뼈에서 분리하였다. 0.2% BSA, 0.25mM 아스코르빈산, 1mM β-글리세로포스페이트, 0.25% L-글루타민 및 0.25% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 α-MEM-기반 장기 배양배지에서 뼈 (상완골 반경, 대퇴골 및 경골)를 단리하고 평형화시켰다. 37℃, 5% CO2에서 하루 밤샘 배양하였다. 이들 배양세포를 trypsin-EDTA 37℃에서 15분간 부드럽게 흔들어 항온 배양한 후 콜라게나제 P(Worthington, Lakewood, NJ) 3 mg/ml 및 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 2시간 동안 소화(digest)시켰다. 단편화 된 긴 뼈를 40-μm 나일론 메쉬(BD Bioscience, San Jose, CA)로 여과하고 세포를 원심분리로 수집하였다. 세포를 10% FBS와 0.25% L-glutamine을 포함한 2:3 DMEM:F12 배지에서 배양하였다. 탈분화를 최소화하기 위해 passage 0의 1차 연골세포를 실험에 사용하였다.
(2) 1차 연골세포가 충진된 3차원 하이드로겔 배양 및 콘드로이티나제(chondroitinase) ABC의 처리
콘드로이틴 설페이트-메타크릴레이트(chondroitin sulfate-methacrylate, CS-MA) 중합체는 종래 보고된 방법에 따라 합성하였다. 간략하게, 2-모르폴리 노 에탄술폰산 (MES, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 염화나트륨을 증류수에 교반하여 완전히 용해시켰다. 콘드로이틴 설페이트 소디움(Sigma-Aldrich), N-히드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide, NHS, Sigma-Aldrich) 및 1-에틸-3-(3- 디메틸아미노프로필)-카르보디이미드히드로클로라이드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC, Sigma-Aldrich)를 상기 용액에 첨가하고 5분간 교반한 후, 2-아미노에틸메타크릴레이트(aminoethyl methacrylate, AEMA, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 빛을 차단한 상태로 유지하고, 증류수에서 4일간 투석한 후 0.22μm 주사기 필터로 여과하였다. CS-MA를 진공 오븐에서 및 실온에서 하룻밤 건조시킨 후 -20℃에서 보관하였다.
연골세포를 내포시키기 위해 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 (poly(ethylene glycol diacrylate), PEGDA, Laysan Bio) 5% (w/v), CS-MA 중합체 3% (w/v) 및 광개시제(2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로판(Sigma-Aldrich) 0.05% (w/v)를 PBS에 첨가하고 볼텍싱(vortexing)하여 완전히 용해시킨 후, 1차 연골세포를 1.5 x 107 세포/ml의 밀도로 상기 혼합액에 첨가하였다. 1차 연골 세포가 포함된 상기 하이드로겔 용액을 30번 완전히 섞은 후 100μl의 상기 세포-하이드로겔 현탁액을 PCR 필름으로 실링한 자체 제작-겔 몰드에 넣고, 장파장 웨이브 자외선 램프 (UVP, LLC, California, USA)를 이용하여 10분 동안 3 mW/cm2의 UV(365 nm 파장)에 노출시켜 폴리머화 하였다. 이후, 겔 몰드에서 PCR 필름을 제거하고 PBS가 들어있는 100mm 플레이트에 겔을 위치시켰다. 세포가 가득찬 상기 하이드로겔을 1 차 연골세포 성장배지 1.5ml가 첨가된 24-well plate에서 3주간 배양하였다.
콘드로이티나제 ABC (ChABC, 0.1 unit/ml, Sigma-Aldrich)는 다양한 저해제(30μg/ml of OxPAPC for TLR2/4, and 10μg/ml LPS-RS for TLR4-MD2 from Invitrogen, 10μM SB203580 for p38 MAPK from Sigma-Aldrich, 20nM PD98059 for ERK1/2 MAPK from Cell Signaling Technology, and 20μM SP600125 for JNK MAP kinase, 10μM JSH-23 for NF-kB, 50μM 1400w for NOS, 3mM N-acetyl-cysteine (NAC) for ROS and 5μM Stattic for Stat3 from Sigma-Aldrich)의 존재 하에서 1 또는 2주간 처리하였다. 배지는 3일마다 교환했다.
(3) 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 분석(Real-time qPCR analysis)
Easy Blue 시약 (iNtRON biotechnology, Korea)을 사용하여 배양된 1차 연골세포가 함유된 3D 하이드로겔에서 총 RNA를 분리하였다. cDNA는 random hexameter와 oligod(T) 프라이머 및 역전사 키트(ELPIS Biotech, Korea)를 사용하여 총 RNA 2μg에서 합성하였으며, 실시간 qPCR은 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 ViiA7 machine(Applied Biosystems, Waltham, MA)에서 수행하였다. 표적 유전자의 발현은 Gapdh로 표준화하였다. RT-qPCR에 사용된 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
Gene GenBank Acc. No. Sequences Amplicon (bp)
Sox9 NM_011448 Forward: 5'-CAGCCCCTTCAACCTTCCTC-3'
Reverse: 5'-TGATGGTCAGCG- TAGTCGTATT-3'		 94
Col2 NM_031163 Forward: 5'-CGGTCCTACGGTGTCAGG-3'
Reverse: 5'-TTATACCTCTGCCCATTCTGC-3'		 70
Agc NM_007424 Forward: 5'-CCAGCCTACACCCCAGTG-3'
Reverse: 5'-GAGGGTGGGAAGCCATGT-3'		 66
Ihh NM_010544 Forward: 5'-TGCATTGCTCTGTCAAGTCTG-3'
Reverse: 5'-GCTCCCCGTTCTCTAGGC-3'		 93
Col10 NM_009925 Forward: 5'-GCATCTCCCAGCACCAGA-3'
Reverse: 5'-CCATGAACCAGGGTCAAGAA-3'		 85
Mmp13 NM_008607 Forward, 5'-GCCAGAACTTCCCAACCAT-3'
Reverse: 5'-TCAGAGCCCAGAATTTTCTCC-3'		 92
Runx2 NM_001146038 Forward: 5'-GCCCAGGCGTATTTCAGA-3'Reverse: 5'-TGCCTGGCTCTTCTTACTGAG-3' 82
Col1a1 NM_007742 Forward: 5'-CTTCACCTACAGCACCCTTGTG-3'Reverse: 5'-TTGGTGGTTTTGTATTCGATGACT-3' 80
Atf4 NM_009716 Forward: 5'-TCGATGCTCTGTTTCGAATGG-3'Reverse: 5'-AAGATCACATGTGTCATCCAACGT-3' 80
Gadd45b NM_008655 Forward: 5'-GAGGATGATATCGCTCTGCAGAT-3'Reverse: 5'-ACCCGGACGATGTCAATGTC-3' 80
Axin2 NM_015732 Forward: 5'-GACGCACTGACCGACGATT-3'Reverse: 5'-TTCTTACTCCCCATGCGGTAA-3' 80
Wisp1 NM_018865 Forward: 5'-GACCTGACCGAGTTGCCTAATG-3'
Reverse: 5'-GCGAAGTCTTCCCCATCGT-3'		 80
Wnt5a NM_009524 Forward: 5'-CATTGGAGAAGGTGCGAAGAC-3'
Reverse: 5'-CCACTGTGCTGCAGTTCCAT-3'		 80
Csf1 NM_007778 Forward: 5'-TCCTCATGAGCAGGAGTATTGC-3'
Reverse: 5'-CAGGACCTTCAGGTGTCCATTC-3'		 80
Stat1 NM_001205313 Forward: 5'-TGAGATGTCCCGGATAGTGG-3'
Reverse: 5'-CGCCAGAGAGAAATTCGTGT-3'		 80
Irf1 NM_008390 Forward: 5'-GGAAGGGAAGATAGCCGAAGA-3'
Reverse: 5'-ATCCCTTGCCATCGATGTGT-3'		 80
Socs3 NM_007707 Forward: 5'-CCGCTTCGACTGTGTACTCAAG-3'Reverse: 5'-CCGTGGGTGGCAAAGAAA-3' 80
Gata3a NM_008091 Forward: 5'-CGGAAGAGGTGGACGTACTTTT-3'Reverse: 5'-CGTAGCCCTGACGGAGTTTC-3' 80
Bax NM_007527 Forward: 5'-GTGAGCGGCTGCTTGTCT-3'
Reverse: 5'-GGTCCCGAAGTAGGAGAGGA-3'		 68
Ccnd1 NM_007631 Forward: 5'-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3'
Reverse: 5'-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3'		 80
Pcna NM_011045 Forward: 5'-TTTGAGGCACGCCTGATCC-3'
Reverse: 5'-GGAGACGTGAGACGAGTCCAT-3'		 80
Hes1 NM_008235 Forward: 5'-CCAGCCAGTGTCAACACGA-3'Reverse: 5'-AATGCCGGGAGCTATCTTTCT-3' 80
Hey1 NM_010423 Forward: 5'-GCGCGGACGAGAATGGAAA-3'
Reverse: 5'-TCAGGTGATCCACAGTCATCTG-3'		 80
Ptch1 NM_008957 Forward: 5'-GGAAGGGGCAAAGCTACAGT-3'
Reverse: 5'-TCCACCGTAAAGGAGGCTTA-3'		 62
Gli1 NM_010296 Forward: 5'-CTGACTGTGCCCGAGAGTG-3'Reverse: 5'-CGCTGCTGCAAGAGGACT-3' 64
Hhip NM_020259 Forward: 5'-CCCAGACTCACAATGGAAAACTCT-3'
Reverse: 5'-GGTGTAGTAGCCGTTTCGACAGA-3'		 80
Fth1 NM_010239 Forward: 5'-TGACCACGTGACCAACTTACG-3'
Reverse: 5'-CCAGGGTGTGCTTGTCAAAGA-3'		 80
Hmox1 NM_010442 Forward: 5'-TGACCACGTGACCAACTTACG-3'
Reverse: 5'-CCAGGGTGTGCTTGTCAAAGA-3'		 80
Txn NM_011660 Forward: 5'-ATCAAGCCCTTCTTCCATTCC-3'
Reverse: 5'-TCCTGGCAGTCATCCACATC-3'		 80
Arnt NM_001037737 Forward: 5'-CCTGGCTCGAAAACCAGACA-3'Reverse: 5'-TGTTGCCAGTTCCCCTCAAG-3' 80
Serpine1 NM_008871 Forward: 5'-ATGACTGGGTGGAAAGGCATAC-3'
Reverse: 5'-CAGGCGTGTCAGCTCGTCTA-3'		 80
Vegfa NM_001025250 Forward: 5'-GCAGCTTGAGTTAAACGAACG-3'
Reverse: 5'-GGTTCCCGAAACCCTGAG-3'		 94
Cycs NM_007808 Forward: 5'-GGTGATGTTGAAAAAGGCAAGAA-3'
Reverse: 5'-TTATGCTTGCCTCCCTTTTCC-3'		 80
AtpsynF1 NM_007505 Forward: 5'-CCTGGAATTATCCCCCGAAT-3'Reverse: 5'-CCAATGGGCACCAGGCTAT-3' 80
Cox4i NM_009941 Forward: 5'-TCACTGCGCTCGTTCTGAT-3'
Reverse: 5'-CGATCGAAAGTATGAGGGATG-3'		 80
Pepck NM_011044 Forward: 5'-CTGGCCAAGATTGGTATTGAACT-3'
Reverse: 5'-GATATGCCCATCCGAGTCATG-3'		 80
G6pase NM_008061 Forward: 5'-CATGTACCGGAAGAGCTGCAA-3'
Reverse: 5'-GGACCAAGGAAGCCACAATG-3'		 80
Sod1 NM_011434 Forward: 5'-GCGGTGAACCAGTTGTGTTG-3'
Reverse: 5'-CCCATACTGATGGACGTGGAA-3'		 80
Sod2 NM_013671 Forward: 5'-CCACACATTAACGCGCAGAT-3'Reverse: 5'-TCGGTGGCGTTGAGATTGT-3' 80
Gpx1 NM_008160 Forward: 5'-AAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA-3'
Reverse: 5'-GGGTCGTCACTGGGTGTTG-3'		 80
Catalase NM_009804 Forward: 5'-GGCCTCGCAGAGACCTGAT-3'
Reverse: 5'-ACCCCGCGGTCATGATATTA-3'		 80
Hk2 NM_013820 Forward: 5'-CACGGAGCTCAACCAAAACC-3'
Reverse: 5'-CCGGAACCGCCTAGAAATCT-3'		 100
Ldha NM_010699 Forward: 5'-CTCAAGGACCAGCTGATTGTGA-3'
Reverse: 5'GCACCAACCCCAACAACTGT-3'		 80
Pgk1 NM_008828 Forward: 5'-TGGACAAGCTGGACGTGAAG-3'Reverse: 5'-GCCTTGATCCTTTGGTTGTTTG-3' 100
iNos NM_010927 Forward: 5'-GCAAGCATGACTTCCGAGTGT-3'
Reverse: 5'-GCCCAAGGTAGAGCCATCTG-3'		 100
Gapdh NM_008084 Forward: 5'-TGTCCGTCGTGGATCTGAC-3'
Reverse: 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'		 75
(4) 동결 절편 및 H&E 염색
배양된 연골세포 함유 하이드로겔을 PBS로 세척하고 4% 파라포름 알데히드(Merck, Darmstadt, Germany)로 고정시켰다. 조직 기저의 몰드 위에서 OCT 컴파운드 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 고정된 하이드로겔 전체를 덮고 드라이아이스로 냉각시킨 2-메틸-부탄(Thermo Fisher Scientific)으로 저온에서 동결시켰다. 5-μm 단면은 Cryostat (Micron HM350, Thermo Fisher Scientific)에 의해 제작했다. 절편을 실온에서 밤새 자연 건조시킨 다음, 헤마톡신 및 에오신으로 염색하였다.
(5) 면역형광염색
세포가 포함된 하이드로겔의 미세 절단된 동결 절편을 Mof13, Adamts5 및 8-oxo-dG의 발현을 검출하기 위한 면역형광염색을 수행하였다. 간략하게, 37℃ 오븐에서 1시간 동안 건조된 부분을 냉 아세톤으로 20분간 고정시키고 PBS로 2 회 세척하였다. 1% BSA로 1시간 블로킹한 후, 연골세포 분화상태를 검출하기 위해 Mmp13 (ab39012), Adamts5 (ab41037, Abcam, Cambridge, UK)에 대한 항체를, 또는 산화적 스트레스를 분석하기 위해 DNA 산화 정도를 분석하고자 8-옥소-데옥시구아노신(4354-MC- 050, Trevigen, Gaithersburg, MD)를 상기 절편과 함께 4℃에서 밤샘 처리하였다. 상기 절편을 PBS로 세척하고 Alexa Fluor 488 또는 594-접합 2차 항체 (Thermo Fisher Scientific)와 1시간 동안 항온 배양한 후 DAPI로 대조염색 하였다. 상기 절편을 anti-fade 마운팅 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 처리하고, Nikon ECLIPSE Ni 형광현미경(Nikon, Japan) 하에서 영상화하고 정량화 하였다.
(6) 산화 질소 어세이
산화 질소 어세이는 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다. 간략하게, 1차 연골세포 함유-하이드로겔을 3주 동안 배양하고 배양 배지에서 NO의 안정한 대사 산물인 아질산염의 양을 NO 생성의 지표로 측정했다. 100μl의 배양액을 96 웰 플레이트에서 같은 양의 Griess 시약 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)과 혼합하고 실온에서 10분간 배양하고 마이크로 플레이트 판독기 (BioTek, Winooski)로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 신선한 배지를 모든 실험에서 블랭크로 사용하였다. 아질산염의 양은 아질산나트륨 표준곡선으로부터 결정하였다.
(7) LPS를 이용한 TLR4 신호 활성화 및 웨스턴 블롯
1차 연골세포를 50μM의 1400W 존재 또는 부존재하에 지시된 시점(0, 5, 15, 30, 60 및 120 분)동안 LPS (Sigma-Aldrich) 1 μg/ml로 처리한 후, RIPA 프로 테아제 및 포스파타제 억제제(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)가 첨가된 완충액으로 용해하였다. 각각의 샘플에서 같은 양의 세포 용해물을 10% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 5% 탈지유로 블로킹한 후, 아래에 나열된 1차 항체와 함께 항온 배양하였다. 멤브레인을 TBS-T로 세척한 후, 막을 HRP-접합 2차 항체 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 1시간 동안 배양하고 다시 세척하였다. 막상의 신호는 화학 발광 용액(Amersham Biosciences)을 사용하여 시각화하고 FluorChem FC2 (Alpha Inotech)에서 검출하였다. p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204), p-Ikb (Ser32/36), p-Stat3 (Tyr705)에 대한 1차 항체를 Cell Signaling Technology로부터, β-Actin은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
(8) 통계학적 분석
Mann-Whitney U 검사 또는 Kruskal-Wallis ANOVA 검사를 사용하여 평균값들 사이의 차이를 분석하였다. 모든 분석은 SPSS 버전 14.0 소프트웨어 (SPSS, Chicago, IL)를 사용하여 수행되었다. 결과는 평균±표준편차S.Es로 나타내었고 p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성을 인정하였다.
2. 실험결과
(1) CS-기반의 ECM 분해는 MMP-13의 발현 및 산화적 스트레스를 동반하는 연골세포의 비대적(hypertrophic) 변화를 유발함
본 발명은 CS 기반의 3D 하이드로겔 지지체 배양 조건 하에서 1차 연골 세포의 표현형 특성을 조사하였다. Safranin-O로 염색된 GAG의 내용물은 3주 째부터 증가하여 5주 째부터 감소하였다. GAG의 감소는 H&E 염색에서 연골세포의 형태학적 변화와 동반되었다. Sox9, Col2, Aggrecan(Agc)과 같은 연골성 유전자는 5주 째까지 감소되었으나 이후 7주 째까지 증가하였다. 연골세포의 전-비대성 마커인 Ihh는 3주 째에 증가했다. 비대성 마커인 type X 콜라겐(Col10), MMP-13 및 Runx2, 조골세포 마커, type I 콜라겐 a1(Col1a1)는 7주 째에 증가하였다(도 1a 내지 1c).
이러한 결과는 본 발명에서 사용한 3차원 하이드로겔 배양 시스템이 연골세포의 성숙을 유도하는데 적합하다는 것과, 적어도 3주간의 배양 기간 동안은 연골세포의 비대화를 유도하지 않는다는 것을 확인시켜 주었다.
CS 분해가 연골세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 콘드로이티나제 ABC(ChABC)를 CS 기반의 3차원 하이드로겔 배양 시스템에 1주 내지 2주 동안 처리하였다(도 2a). 그 결과, CS의 분해로 인해 세포질의 부피 증가처럼 보이는 연골세포의 비대화가 관찰이 되었다(도 2b).
연골세포 마커 유전자의 발현을 평가한 결과, MMP-13의 발현은 ChABC 처리에 의해 현저하게 증가하였고, ADAMTS5의 발현은 ChABC의 1주간 처리에 의해 증가되었고 2주간의 처리에 의해서는 감소되었다(도 2c).
CS 분해에 따른 신호전달 경로의 영향을 평가하기 위해 본 발명자는 연골세포 생리에서 주요 신호전달 경로에 의해 조절되는 표적분자의 발현을 평가했다.
그 결과, Socs3 RNA 발현이 현저하게 증가하여 STAT3 신호전달이 활성화 되었음이 확인되었으며, Fth1, Hmox1 및 Txn과 같은 산화 스트레스 마커의 발현이 모두 증가했다. 그러나 Wnt, Notch, Hedgehog 신호의 표적분자는 오히려 감소하였고 세포증식의 마커인 cyclinD1도 감소하였다. TGFβ, NFkB 및 저산소증과 관련된 유전자 발현에는 차이가 없었다(도 2d).
단백질의 상대적 수준을 정량화하기 위한 면역형광염색 실험결과, ChABC에 의한 CS 분해가 MMP-13뿐만 아니라 산화적 스트레스에 대한 마커인 8-oxo-dG의 발현을 증가시켰다(도 2e, 2f).
(2) 콘드로이티나제에 의한 CS의 분해 생성물은 TLR2 및 TLR4를 통해서 DAMPs(damage associated molecular patterns)로서 작용함
그 다음으로, 본 발명자는 CS 분해 생성물이 단백분해효소 및 산화 스트레스의 증가를 초래할 수 있는 DAMPs으로서 기능할 수 있는지를 시험하였다. 이전 연구에서, 본 발명자는 TLR2 및 TLR4에 대한 리간드가 연골세포에서 MMP-3 및 MMP-13의 발현에 유의하게 관련된다는 것을 보고한 바 있다(Sci Rep. 2018;8(1):487). 이를 바탕으로 TLR2와 TLR4의 이중 저해제인 OxPAPC, 또는 MD2 저해를 통해 TLR4를 기능적으로 저해하는 LPS-RS를 이용하여 TLR2 및 TLR4의 기능을 저해한 다음에, 콘드로이티나제 처리에 따른 연골세포의 표현형을 관찰하였다.
형태학적으로, OxPAPC와 LPS-RS는 콘드로이티나제에 의해 유도된 CS 분해에 의한 연골세포의 비대성 변화를 부분적으로 억제하였다(도 3a). CS의 분해로 인한 MMP-13과 ADAMTS5의 증가는 OxPAPC와 LPS-RS에 의해 유의하게 감소되었다. 뿐만 아니라 OxPAPC와 LPS-RS는 Fth1, Hmox1, Txn과 같은 산화 스트레스 마커의 증가를 크게 억제했다(도 3b).
연골 퇴화에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려진 잘 알려진 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)는 콘드로이티나제에 의한 CS 분해에 의해 RNA 수준에서 크게 증가하였으나, 이러한 증가는 OxPAPC 및 LPS-RS에 의한 TLR2 및 TLR4 저해에 의해 크게 억제되었다(도 3b).
배양 상등액 내 NO 수준은 TLR2 및 TLR4 저해제 의해 유의하게 감소되었다(도 3c). 면역형광 염색법 실험결과, CS 분해에 의해 현저하게 유도된 8-oxo-dG, MMP-13 및 ADAMTS5가 OxPAPC 및 LPS-RS에 의해 상당히 억제되는 것으로 확인되었다(도 3d).
이러한 결과는 CS의 분해 생성물이 TLR2 및 TLR4를 통해서, MMP-13 및 ADMATS5와 같은 단백분해효소의 증가 및 산화적 스트레스에 밀접하게 관여하고 있는 DAMPs로서 작용한다는 것을 나타낸다.
(3) CS 분해가 연골세포의 표현형에 미치는 영향은 MAP 키나아제, NF-kB, STAT3 및 NO 신호체계에 의존함
그 다음으로, TLR 하류 신호전달이 CS 분해와 관련된 연골세포의 표현형 변화에 관여하는지를 확인하기 위해 저해제 분석(inhibitor assay)을 수행했다. TLR2 및 TLR4의 주요 하류 시그널인 MAP 키나아제 및 NF-kB 시그널링은 p38 MAPK의 경우 SB203580, MEK1/ERK의 경우 PD98059, JNK의 경우 SP600125 및 NFkB의 경우 JSH-23으로 저해되었다. iNOS에 의한 NO 생산은 1400W, 산화 스트레스는 N-아세틸-시스테인(NAC), 그리고 STAT3의 활성은 Stattic에 의해 억제되었다 (도 4a). JSH-23 및 NAC를 제외한 상기 저해제들은 CS 분해에 의한 연골세포의 비대성 형태학적 변화를 저해하였다(도 4a).
또한, ChABC-매개 CS 분해에 의한 MMP-13 RNA 발현은 이와 같은 저해제들에 의해서 억제되었다. ADAMTS5 발현은 p38 및 JNK MAP 키나아제의 저해제에 의해서 감소되었고, NF-kB 및 NO는 RNA 수준에서 저해된 반면에, 이들은 ERK1/2 및 STAT3 저해제에 의해서 증가하였다. Fth1, Hmox1의 발현 및 산화 스트레스의 마커들은 상기 저해제들에 의해서 감소되었으나, JSH-23에 의해서는 영향을 받지 않았고, NAC에 의해서는 오히려 증가하였다. 다른 산화 스트레서의 마커인 Txn은 ERK1/2 MAP 키나아제 저해제에 의해서만 감소되었다. iNOS 발현은 NAC를 제외한 모든 저해제들에 의해서 감소되었다(도 4b).
이러한 실험 결과는 3차원 하이드로겔 배양 시스템의 배양 상등액에서의 NO 농도에서도 동일하게 재현이 되었다(도 4c).
면역형광염색에 의해서 평가된 MMP-13의 발현은 p38, ERK1/2, JNK MAP 키나아제, NF-kB, iNOS 및 STAT3 저해제들에 의해서 약화된 반면에, 항산화제인 NAC에 의해서는 영향을 받지 않았다. 전술한 모든 저해제들은 산화 스트레스의 마커인 8-oxo-dG의 발현을 저해하였다(도 4d)
이러한 결과들은 MAP 키나아제, NF-kB, NO 및 STAT3-관련 신호체계가 CS 분해와 관련된 연골세포의 이화성 표현형 변화(catabolic phenotype change)에 매우 중요한 역할을 하고 있음을 제시한다.
(4) NO는 MAP 키나아제 및 NF-kB 신호체계의 활성화를 강화함
TLR4 활성화에서 NO와 MAPKase, NFkB 및 STAT3와 같은 다른 이화반응 경로 사이의 상호작용을 밝히기 위해, 1차 연골세포의 단층 배양 조건에서 각 신호의 LPS-매개 인산화에 대한 iNOS의 억제 효과를 1400w를 이용하여 평가했다. 1차 연골세포에의 LPS 처리는 약 30분 내에 p38 및 JNK MAP 키나아제를 인산화 시켰지만, iNOS-NO 시스템의 억제는 이러한 활성화를 지연시켰다. 또한, NO 억제는 5분 이내 까지는 EK1/2 MAP 키나아제의 최초 활성화에 영향을 미치지 않았으나, 30분 이내에 두 번째 활성화를 지연시켰다. Canonical NF-kB 신호체계를 구성하는 IkB의 인산화는 NO 억제에 의해 유의하게 억제되었다. 그러나, STAT3 인산화는 NO 억제에 의해 영향을 받지 않았다(도 5a).
이러한 결과는 MAP 키나아제와 NF-kB 신호가 iNOS 매개 NO 생성을 증가시킬 뿐만 아니라 NO가 MAP 키나아제와 NF-kB 신호체계의 활성화를 증가시키는 NO 신호전달을 가진 양성 피드백 루프를 가지고 있음을 시사한다
이상 살펴본 바와 같이, CS 기반의 하이드로겔 배양 시스템에서 CS의 분해는 그 자체만으로도 연골세포의 비대성 형태학적 변화를 유발할 뿐만 아니라, 연골세포 내에서 MMP-13 및 ADAMTS5의 생성을 유도하기에 충분한 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 CS 기반의 하이드로겔 배양 시스템에서, CS의 분해 생성물은 TLR2 및 TLR4를 통한 DAMPs로서 작용하여 MAP 키나아제, NF-kB 및 STAT3를 활성화시키며, 이는 NO 신호체계와 함께 양성 피드백 루프를 형성한다.
실제 골관절염 환자의 연골 조직에서 연골세포의 비대화와 세포 외 기질의 파괴가 관찰되고, 연골세포에서 MMP-13, ADMATS-5와 같은 단백분해효소의 증가가 골관절염의 발생에 중요하다(Lancet. 2015;386(9991):376, Arthritis Rheum. 2009;60(12):3723, Nature 2005;434:644). 본 발명에서 콘드로이티나제 처리로 세포 외 기질의 파괴를 유도한 결과 연골세포의 형태학적 비대화가 유도되었고, 이는 진정한 연골세포의 비대화가 아닌 수분 증가로 인한 가성 비대화임을 확인하였다. 최근 연구에 의하면 연골세포의 비대화는 두가지 단계를 거치는데 첫 번째는 비대화 관련 유전자와 단백의 발현이 같이 증가되는 진성비대화로 연골 분화 초기에 발생한다(Nature. 2013;495(7441):375). 두번째는 유전자나 단백의 증가없이 외부의 수분 유입으로 인해 발생하는 가성비대화로 본 발명 세포 외 기질의 파괴에 동반한 비대화는 이에 기인한 바가 크다. 또한 본 연구의 특기할 사항은 이러한 가성 비대화 과정에서 Runx2, Ihh, Wnt 신호 등 비대화 관련 신호의 증가없이 MMP-13과 ADMATS-5 같은 단백분해효소가 증가되는 점이며, 이는 골관절염 병태생리의 가장 특징적인 부분과 일치하는 것이다.
이러한 결과는 본 연구의 3차원 하이드로겔 구조에 콘드로이티나제 처리하여 연골세포외 기질을 파괴하는 모델이 인체 골관절염 연골의 특성을 그대로 재현할 수 있음을 시사한다.
따라서, 연골세포를 포함하는 CS 기반의 하이드로겔 배양 시스템에 CS 분해효소를 처리하는 본 발명의 실험 모델은, 골관절염 환자의 연골에서 나타나는 병리학적 현상을 거의 동일하게 모사하고 있어 골관절염의 병리학적 기전 연구, 골관절염 치료제의 효능 스크리닝 평가 등에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 생체 외(in vitro) 골관절염 모델 조성물 및 3차원 골관절염 모델은 실제 골관절염 환자의 연골에서 나타나는 다양한 형태학적 또는 분자생리학적 변화들을 매우 유사하게 모사하므로, 골관절염의 병태 연구, 골관절염 치료제의 효능 검증 등에 매우 유용하게 활용이 될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (12)

  1. 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 세포 배양 배지; 및 콘드로이티나제(chondroitinase)를 포함하는 생체 외(in vitro) 골관절염 모델 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트는 콘드로이틴 설페이트 A (chondroitin-4-sulfate), 콘드로이틴 설페이트 C (chondroitin-6-sulfate), 콘드로이틴 설페이트 D (chondroitin-2,6-sulfate) 및 콘드로이틴 설페이트 E (chondroitin-4,6-sulfate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골관절염 모델 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콘드로이티나제는 콘드로이티나제 B, 콘드로이티나제 C, 콘드로이티나제 AC 및 콘드로이티나제 ABC로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골관절염 모델 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 10%(w/v)로 포함되고, 상기 연골세포는 1ⅹ105 내지 1ⅹ109 cell/mL 및 콘드로이티나제는 0.001 내지 1 unit/ml로 포함이 되는 것을 특징으로 하는 골관절염 모델 조성물.
  5. (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase)를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 알긴산, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 아가로오스, 실크단백질, 글리코사미노글리칸, 셀룰로오스, 펙틴, 폴리에틸렌글리콜 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델.
  7. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 조성물에서 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 유도체는 1 내지 10%(w/v), 상기 연골세포는 1ⅹ105 내지 1ⅹ109 cell/mL, 상기 가교제 또는 광개시제는 0.01 내지 10%(w/v) 및 상기 생체적합성 고분자는 1 내지 10%(w/v)로 포함이 되는 것을 특징으로 하는 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델.
  8. 제5항에 있어서 상기 (c) 단계는 1 내지 5주 동안 유지되며, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계 개시일로부터 1일 내지 2주 경과 후 시작되는 것을 특징으로 하는 생체 외(in vitro) 3차원 골관절염 모델.
  9. (a) 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) 또는 이의 유도체; 연골세포(chondrocyte); 가교제 또는 광개시제; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a)의 조성물의 가교결합을 유도하여 3차원 구조체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 3차원 구조체를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (d) 상기 세포 배양 배지에 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 골관절염 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (e) 3차원 구조체 내 연골세포의 형태학적 특성; 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량; 및 상기 배양 배지 내 NO 생성량으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 평가항목에 대한 미처리 대조군과 골관절염 치료제 후보물질 처리군의 차이를 비교하는 단계를 포함하는 골관절염 치료제 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 콘드로이티나제와 골관절염 치료제 후보물질은 동시에 처리되거나 또는 각각 별도로 처리되는 것을 특징으로 하는 골관절염 치료제 스크리닝 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 연골세포의 형태학적 특성은 비대성 변화(hypertrophic change)이고; 상기 산화성 스트레스 마커는 Rth1, Hmox1 및 Txn으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고; 및 상기 세포 외 기질 분해효소는 MMP-13 또는 ADAMTS5인 것을 특징으로 하는 골관절염 치료제 스크리닝 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 미처리 대조군과 비교해 골관절염 치료제 후보물질 처리군에서 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 만족하는 결과가 나타난 경우, 상기 후보물질이 골관절염 치료효과를 나타내는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골관절염 치료제 스크리닝 방법:
    (i) 3차원 구조체 내 연골세포의 비대성 변화(hypertrophic change)의 억제;
    (ii) 연골세포 내 산화성 스트레스 마커의 발현량 감소, 유도성 질소 산화물 합성효소(iNOS)의 발현량 감소 또는 세포 외 기질 분해효소의 발현량 감소; 및
    (iii) 배양 배지 내 NO 생성량 감소.
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