KR20180104969A

KR20180104969A - Dicam을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180104969A
Application number: KR1020170031956A
Authority: KR
Inventors: 정연관; 한승우; 한민수; 박혜리
Original assignee: (재)대구포교성베네딕도수녀회
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-09-27
Also published as: KR102000205B1; WO2018169158A1

Abstract

본 발명은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, DICAM 처리에 따른 퇴행성 관절염 치료 효과를 구체적으로 확인하였는바, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

DICAM을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising Dual Ig domain containing cell adhesion molecule for preventing or treating degenerative arthritis}

본 발명은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골관절염은 관절연골의 변성과 소실을 특징으로 하는 질환으로 가장 흔한 만성 퇴행성 관절 질환임. 골관절염이 발병은 관절은 통증, 강직, 부종, 기능 저하 등을 동반하며 노인인구에서 장애의 가장 큰 원인이 된다.

고령화 사회와 비만인구 증가로 인해 유병율이 지속적으로 증가하고 있으며 2010년 국민건강영양조사를 기초로 한 보고에 따르면 국내 50세 이상 성인의 골관절염 유병율은 28.2%로 4명당 1명이상이 골관절염을 지니고 있다. 이중 남자는 5,5%, 여자는 22.7%로 여자가 남자에 비해 4배정도 높으며, 고령층에서 자주 발생하는 관절염의 특성상 고령인구 및 기대수명 증가가 관절염 유병률에 영향을 미치기 때문에 골관절염 환자수는 점점 늘어날 전망이며 이에 따른 사회적, 경제적 손실 또한 갈수록 증가할 것으로 추정된다.

2011년 국민건강보험공단 자료에 따르면 평균 수명이 높아지면서 재수술을 하는 경우가 증가하여 5년 전 대비 무릎관절 수술 비용이 2배 이상 증가한다. 이에 따라 효과적인 치료법을 개발하기 위해 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근 GlobalData가 "골관절염 치료제 시장 : 파이프라인 분석과 시장 예측“이라는 제목의 보고서에 따르면 세계 골관절염 치료제 시장의 2011년 규모는 45억 2,100만 달러로 추산되며 그 이후 연평균 복합 성장률(CAGR) 3.7%로 성장해 2019년에는 60억 6,100만 달러에 달할 것으로 예상하고 있다.

골관절염은 통증을 동반한 만성적인 질환으로 근치요법이 없기 때문에 환자의 생활의 질 유지에 필수적인 통증 치료를 향상시킬 필요가 있으며 현재 OA 통증 치료제 시장에서는 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 코르티코스테로이드, 오피오이드 등이 초기부터 중기의 OA 통증을 효과적으로 경감시키고 있다. 그러나 이것은 연골 퇴화가 진행되고 있는 후기 OA의 통증을 충분히 완화시키지는 못하며 또 NSAID는 장기간 사용하면 부작용이 발생하는 경우가 있어 후기 OA의 통증을 치료하는 안전성 높은 신약 개발이 기대를 모으고 있다.

연골세포의 증식 및 분화에서 부착단백질의 역할에 대한 연구는 새로운 학문적 접근 뿐 아니라 골관절염의 발병기전을 이해할 수 있는 폭이 넓어지는 기회가 되었다. 현재 골관절염의 치료는 통증 완화라는 대증적 약물 치료와 수술적 방법에 중점을 두고 있으며, 연골세포 자체의 퇴행을 막는 치료로 유의한 효과를 보인 약물은 없는 실정으로, 연골세포 비대화 및 자멸사는 골관절염의 핵심 병리기전으로 이에 대한 분자적 기전이 밝혀진다면 골관절염의 병리적 이해를 넓힐 뿐 아니라 기전에 근거한 약물 개발에도 사용될 수 있다.

연골세포의 분화 과정과 골관절염의 발병 기전은 증식, 분화를 거쳐 세포사멸 및 석회화에 이르는 비슷한 과정을 거친다. 연골세포의 증식 및 분화에서 부착단백질의 역할에 대한 연구의 거의 없다. Mesenchymal stem cell에서 연골세포로 분화하기 위해서는 Condensation과정이 필수적이며 이 과정에서 부착단백질에 의한 세포 간 상호작용이 필수적이나 이에 대한 부착단백질의 역할에 대한 규명이 전혀 없다. 골관절염과 관련한 부착단백질 중 Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)에 대한 연구가 있으나(국내공개특허 제2007-0115761호), 이는 그 기능에 대한 규명이 아니라 골관절염 발병시 그 분비가 증가하여 진단 마커로 사용 가능성에 대한 연구이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 처리에 따른 퇴행성 관절염 치료 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule)을 유효성분으로 포함하는 연골세포 증식 또는 분화용 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);

S1 단계의 세포주에서 DICAM의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및

S2 단계의 DICAM의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 퇴행성 관절염 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 DICAM 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 연골세포를 증식시키거나 또는 연골세포로 분화시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 DICAM 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 연골세포 증식 또는 분화용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);

S2 단계의 DICAM의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 퇴행성 관절염 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 관절염의 치료방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule)을 포함하는 조성물의 퇴행성 관절염 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 DICAM 처리에 따른 연골세포 기질 단백질의 발현 증가와 연골 세포의 증식·분화 조절 필수 인자인 IHH-PTHrP의 발현 증가를 확인하였다. 또한 이전 연구에서 DICAM의 항염증 및 신생혈관형성 억제 기능은 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적인 타겟 치료 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 DICAM의 발현양상을 면역형광염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 Ad-LacZ와 Ad-DICAM을 처리한 후 Alcian blue 염색으로 연골세포의 증식을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 DICAM과 IHH의 시너지 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 DICAM의 기능이 IHH 신호를 통해 일어나는 것을 경골 조직배양을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 DICAM에 의한 일차섬모의 형성 및 일차섬모를 통한 IHH의 신호전달을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 DICAM에 의한 일차섬모생성을 경골 조직배양을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 DICAM 과발현 형질전환 벡터를 주입한 후 그 발현을 확인한 결과와, Tg의 Genotype을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 정상생쥐와 Col2-DICAM Tg의 전체 골 및 연골 형성 패턴을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 Wild type과 Col2-DICAM Tg에서 DICAM의 발현 정도를 면역형광 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 DICAM에 의한 연골세포의 증식과 세포사멸을 알아보기 위해서, PCNA를 면역형광염색하여 그 발현 정도를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 수술적 골관절염 모델(DMM)을 통해 골관절염을 유도한 후 DICAM의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12 위쪽은 골관절염 발병 기전에서 DICAM의 역할을 확인하기 위해 위의 방법으로 골관절염을 유도한 정상 생쥐의 무릎 관절강에 DICAM을 과발현시키는 아데노바이러스 (Ad-Dicam)와 대조군인 Ad-LacZ를 각각 주입하고 4주 후 골관절염의 중증도를 비교한 결과를 나타낸 도면이고, 아래쪽은 Col2-Dicam Tg에서 골관절염 발병 정도를 Wild type과 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은, DICAM 과발현 마우스에서 연골세포의 분화 효과를 확인하였으며, 연골세포의 분화 및 증식과 연관된 유전자 및 단백질의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 DICAM (Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩 되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 DICAM 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. DICAM 단백질의 변이체란 DICAM 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 DICAM 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem.Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 백터에 포함된 형태일 수 있다. 상기 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터, 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 관절염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 관절염에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 약학적 조성물은 퇴행성 관절염의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

상기 "후보물질"이란 퇴행성 관절염 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보 물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.

상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 관절염의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. DICAM에 의한 연골세포의 증식 및 분화 조절 기전 확인

실험에 앞서, 재조합 DICAM 단백질을 대장균주 (BL21)에서 과발현시켜 분리하고 정제하여 토끼의 피하에 주사하여 항 DICAM 다클론 항체를 제작하였다.

본 실시예에서는 먼저 태생기 15.5일과 18.5일에서 DICAM의 발현양상을 면역형광염색을 통해 확인하였다. 태생기 15.5일과 18.5일의 정강뼈(Tibia)를 분리한 후 파라핀 절편하고 상기 DICAM 항체를 이용해서 발현 위치를 확인하였다. 태생기 15.5일과 18.5일의 Tibia에서 DICAM은 휴지기와 증식기의 연골세포에서 주로 발현되는 것을 확인하였고, 분화가 진행될수록 그 발현이 줄어들어 비대기 연골세포에서 발현이 감소하여 석회화가 진행되는 후기 비대세포에서는 거의 발현이 되지 않는 것을 확인하였다. DICAM의 발현이 주요 연골기질 단백질인 제 2형 Collagen과 비슷한 양상을 나타내는 것이 특징이었다(도 1). 일차배양 연골세포 실험에서 DICAM에 의한 제 2형 collagen의 발현이 증가되는 것을 확인한 바 DICAM이 제 2형 Collagen의 발현 조절에 대한 세부 기작을 확인할 필요가 있다.

연골세포의 증식과 분화에서 DICAM의 역할을 확인하기 위해 미세배양과 일차 배양 연골세포의 배양 과정에서 DICAM을 Adenovirus를 이용해 과발현시켰다. 미세배양을 위해 임신 확인 11일 후 (태생기 11.5일) 어미쥐를 경추탈골로 희생 후 태반에서 태아를 분리하였다. 태아의 Limb bud를 분리한 후 Collagenase 처리하여 단일세포로 분리하고 ml당 2.5 x 10⁷개의 세포가 되도록 배양액을 첨가한 후 10ul씩 점 배양하였다. 배양하는 동안 DICAM을 과발현 하기 위해 Ad-DICAM을 100moi로 처리하고 대조군으로 100moi의 Ad-LacZ를 처리하여 7일 후 Alcian blue 염색을 통해 연골분화를 확인한 결과, DICAM이 과발현된 Micromass 배양에서 대조군과 비교했을 때 연골세포의 분화가 현저히 증가하는 것을 확인하였고, 6M GnHCl로 Alcian blue 염색을 녹여낸 후 ELISA Reader를 통해 측정한 결과 수치상으로도 증가되는 것을 확인하였다. 일차배양 연골세포는 태생기 15.5일의 생쥐 태아 사지에서 근육 및 연조직을 깨끗이 제거한 후 남은 연골을 Collagenase를 이용해 단일세포로 분리한 후 6well plate에 5 x 10⁵ cells/well로 Seeding 하였다. 다음날 대조군인 Ad-LacZ와 Ad-DICAM을 100moi 처리하고 7일 후 Alcian blue 염색으로 연골세포의 증식을 평가하였다. 일차배양 연골세포에서 DICAM 과발현에 의해 태생기 연골 세포의 증식 및 분화 조절 인자인 IHH(Abcam (ab51919))과 Sox9(Abcam (ab26414)) 및 제 2형 콜라겐(Abcam (ab34712))의 발현이 증가하고 콜라겐 분해 효소인 MMP13(AbCam (ab39012))의 발현은 감소하는 것을 Western blot을 통해 확인하였다. 또한 Realtime PCR을 통해 제 2형 콜라겐 및 Aggrecan (Forward: 5'-CCAGCCTACACCCCAGTG3', Reverse: 5'-GAGGGTGGGAAGCCATGT-3'/ (주)코스모진텍)의 발현이 증가하고 Mmp3 (Forward:５＇－TTGTTCTTTGATGCAGTCAGC, Reverse:５＇－GATTTGCGCCAAAAGTGC３＇/(주)코스모진텍) 및 Mmp13 (Forward: 5'-GCCAGAACTTCCCAACCAT-3', Reverse: 5'-TCAGAGCCCAGAATTTTCTCC-3'/ (주)코스모진텍)의 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (도 2).

DICAM에 의한 연골세포의 증식 및 분화의 증가가 연골세포의 주요 분화 조절인자 중 어떤 것을 통해 일어나는지 확인하기 위해 LacZ 및 DICAM 과발현 일차연골세포에서 Id1 (Forward: 5'-GCGAGATCAGTGCCTTGG-3', Reverse: 5'-CTCCTGAAGGGCTGGAGT-3'/ (주)코스모진텍), Id2 (Forward: 5'-CCCGGTCTTCCTCCTACGA-3', Reverse: 5'- CTGTGGTCCGACAGGCTGTT-3'/ (주)코스모진텍)의 발현을 통해 BMP 신호를, Hhip (5'-CCCAGACTCACAATGGAAAACTCT-3', 5'-GGTGTAGTAGCCGTTTCGACAGA-3'/ (주)코스모진텍), Ptch1 (Forward: 5'-GGAAGGGGCAAAGCTACAGT-3', Reverse: 5'-TCCACCGTAAAGGAGGCTTA-3'/ (주)코스모진텍)의 발현을 통해 IHH 신호를, Zfp521 (5'-AAGCAAGCGAAACCGAGAT-3', Reverse: 5‘-TTCTGGCCTCTTCTTGCAGT-3’/ (주)코스모진텍)의 발현을 통해 PTHrP 신호를, Dusp6 (Forward:5‘-TTTTCCCTGAGGCCATTTCTT-3’, Reverse: 5'-GATACCTGCCAAGCAATGCA-3'/ (주)코스모진텍)의 발현을 통해 FGF 신호를, Axin2 (Forward: 5'-GACGCACTGACCGACGATT-3', Reverse:5‘-TTCTTACTCCCCATGCGGTAA-3’/ (주)코스모진텍)의 발현을 통해 Wnt 신호를, Hes1 (Forward: 5'-CCAGCCAGTGTCAACACGA-3', Reverse: 5'-AATGCCGGGAGCTATCTTTCT-3'/ (주)코스모진텍)의 발현을 통해 Notch 신호를 확인하였다. 여섯 개의 주요 신호전달 체계 중 IHH 타겟 유전자인 Hhip가 DICAM에 의해 가장 많이 증가하였으며 IHH 하부 신호 단백질의 발현을 Western blot으로 확인한 결과에서도 DICAM에 의해 IHH 단백질 자체 뿐만 아니라 타겟 단백질인 Gli2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 DICAM과 IHH의 시너지 효과를 확인하기 위해 IHH 재조합단백질을 DICAM 과발현 일차배양 연골세포에 같이 처리한 결과 DICAM과 IHH 재조합 단백질을 같이 처리한 군에서 IHH 하부 단백질의 발현이 가장 높았으며 특히 연골세포의 성장과 퇴행성관절염 억제 기전을 가지는 Pthlh (PTHrP)의 발현이 가장 높은 시너지효과를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과는 DICAM이 IHH과 시너지 효과를 통해 연골세포의 증식 및 분화에 관여하는 것을 알 수 있도록 하는 것이다 (도 3).

연골세포의 증식 및 분화에서 DICAM의 역할을 확인하고 이러한 DICAM의 기능이 IHH 신호를 통해 일어나는 것을 경골 조직배양을 통해 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 태생기 15.5일의 생쥐 태아 뒷다리에서 근육 및 연조직을 깨끗이 제거한 경골을 분리하고 이를 배양액에서 6일 동안 배양하면서 Ad-DICAM을 처리하여 DICAM을 과발현시켰다. 또한 이전 실험에서 확인한 DICAM에 의한 IHH의 발현을 억제하기 위해 IHH 억제제인 Cyclopamine을 처리하였다. 조직 배양 동안 DICAM 과발현에 의해 경골의 길이가 증가하는 것을 확인하였고 특히 비대연골세포층이 증가하는 것을 확인하였다. 이때 Cyclopamine을 처리하면 DICAM에 의해 증가했던 경골의 길이 차이가 없어지는 것을 확인하였고 비대연골층의 길이 또한 감소하는 것을 확인하였다 (도 4).

인체의 대부분의 세포들은 일차섬모라는 세포외부로 돌출되어 있는 세포 소기관을 지니고 있다. 일차섬모는 일반 섬모와 달리 운동성이 없고, 기능도 없는 진화의 부산물로 간주되어 왔지만 최근의 연구결과에서 일차섬모가 세포의 증식과 분화를 조절하는 다양한 신호전달 경로들을 통제하는 Signal hub로 작용한다는 사실이 밝혀지고 있다. 연골세포도 다른 세포들과 마찬가지로 일차섬모를 가지고 있으며 최근 Ihh이 일차섬모를 통해 신호를 전달하는 것으로 알려져 있으며 DICAM에 의한 IIHH 신호의 증가는 일차섬모의 기능을 촉진할 수 있는 근거가 될 수 있어 DICAM에 의한 일차섬모의 형성 및 일차섬모를 통한 IHH의 신호전달을 확인하였다. 먼저 일차섬모에서 DICAM의 발현을 면역형광염색으로 확인한 결과 일차배양 연골세포에서 DICAM과 일차섬모 마커인 Acetylated Tubulin이 같은 위치에서 발현하는 것으로 보아 DICAM이 일차섬모에서 발현되는 것이 확인되었다. 일차섬모 형성에서 DICAM의 기능을 확인하기 위해 DICAM 과발현 일차배양 연골세포와 태생기 15.5일의 Col2-DICAM Tg의 경골 절편에서 일차섬모의 마커인 Acetylated Tubulin 과 IFT88의 발현을 확인하였다. 일차배양 연골세포에서 DICAM의 과발현에 의해 Acetylated Tubulin 양성 세포의 수가 증가되는 것을 볼 수 있고 Col2-DICAM Tg의 경골에서 또한 Acetylated Tubulin과 IFT88이 발현하는 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 바탕으로 DICAM이 in vitro 및 in vivo에서 일차섬모의 형성을 증가시키는 것을 확인하였다 (도 5).

DICAM에 의한 일차섬모생성 증가를 태생기 15.5일의 경골 조직배양 다시 확인하였다. 태생기 15.5일의 경골을 깨끗이 분리한 후 아데노 연관 바이러스로 DICAM을 과발현시키고 일차섬모의 생성을 억제하기 위해 IFT88의 발현을 억제하였다. DICAM이 과발현된 경골에서 일차섬모의 마커인 Acetylated Tubulin 발현 세포의 수가 증가하였고, IFT88의 발현을 억제시킨 경골에서 Acetylated Tubulin의 발현이 감소하였다. 그러나 IFT88 억제 경골에 DICAM의 발현을 증가시키니 Acetylated Tubulin 발현 연골세포의 수가 다시 증가하는 것을 확인하였다(도 6). 이는 DICAM에 의해 일차섬모의 생성이 증가하는 것을 다시 확인할 수 있는 결과이다.

실시예 2. Col2 - DICAM Transgenic mouse 분석을 통한 연골세포의 증식 및 분화에서 DICAM의 역할 연구

연골의 증식 및 분화에서 DICAM의 역할을 in vivo에서 확인하기 위해 제 2형 콜라겐 프로모터에 의해 DICAM 과발현되는 생쥐 (Col2-DICAM Tg)를 분석하였다. 형질전환 벡터는 pNASSb vector에 Col2 프로모터를 삽입하여 Col2-pNASSb를 클로닝한 후 Not I 자리에 DICAM을 삽입하여 DICAM 과발현 형질전환 벡터를 만들었으며, 이를 HeLa 세포에 주입하여 DICAM의 발현을 Western blot으로 확인하였다. DICAM 발현이 확인된 Col2-DICAM Tg vector를 수정 후 1일째 수정란의 정자유래 핵에 미세주입하고 수정란을 대리모의 난관에 다시 주입한 후 태어난 생쥐의 유전형을 분석하여 DICAM Tg 생쥐를 선별하였다. DICAM의 발현을 좀 더 증가시키기 위해 Col2-DICAM Tg와 Wild type을 교배해서 나온 Tg끼리 다시 교배를 해서 염색체 두쌍 모두 Col2-DICAM vector가 있는 생쥐를 선택하였다. 태어난 Tg의 Genotype은 PCR과 Genomic DNA PCR을 통해 확인하였다 (도 7).

상기 18.5일의 정상생쥐와 Col2-DICAM Tg의 전체 골 및 연골 형성 패턴을 Alcian blue/Alizarin red 염색을 통해 확인하였다. 태생기 18.5일의 정상생쥐와 Col2-DICAM Tg의 태아를 분리한 후 피부와 내장을 제거하고 95% EtOH에서 고정하였다. Alcian blue로 연골을 염색하고 2% KOH로 연조직을 제거한 후 Alizarin red로 뼈를 염색하여 전체 연골 및 골 형성 정도를 비교하였다. Col2-DICAM Tg의 전체적인 골 및 연골 형성 패턴은 정상 생쥐와 비교했을 때 차이가 없었다 (도 8).

그러나 척추와 대퇴골 및 경골의 Alcian blue/ Alizarin red 염색을 보면 형태학적 차이는 없으나 Col2-Dicam Tg에서 전체 길이가 증가된 것을 확인할 수 있었다. Wild type과 Col2-DICAM Tg에서 DICAM의 발현 정도를 면역형광 염색을 통해 확인하였다. 태생기 15.5일의 Tibia를 분리하여 파라핀 절편 후 DICAM 항체를 이용해서 면역형광 염색하였다. DICAM의 발현이 휴지기와 증식기의 연골세포에서 발현되는 것을 확인하였고, Col2-DICAM Tg에서는 그 발현 정도가 Wild type에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 연골 기질 형성 정도와 연골 분화 정도를 Safranin-O 염색을 통해 확인하였다. Col2-DICAM Tg에서 증가한 대퇴골 및 경골이 주로 비대연골층이 아닌 휴지기와 증식기 연골세포의 길이가 증가했기 때문임을 확인하였다. 또한 증식기 연골세포에서 여러 개의 세포가 규칙적으로 겹쳐져 있는 정상 생쥐에 비해 Col2-DICAM Tg의 증식기 연골세포는 겹쳐져 있는 형태가 불규칙하고 단일 또는 두세개의 세포가 산발적으로 흩어져 있는 형태를 나타내었다. 또한 전체 성장판 연골의 길이와 증식기 연골의 길이가 정상 생쥐에 비해 약간 길어져 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

DICAM에 의한 연골세포의 증식과 세포사멸을 정상생쥐와 Col2-DICAM Tg의 태생기 15.5일 경골에서 비교하고자 하였으며, 정상생쥐와 Col2-DICAM Tg의 E15.5일 경골 파라핀 절편에 PCNA를 면역형광염색하여 그 발현 정도를 비교하였다. 정상 생쥐에 비해 Col2-DICAM Tg의 경골에서 휴지기 및 증식기 연골세포 뿐 아니라 비대연골세포층에서도 PCNA의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있고 PCNA 양성 세포의 비율을 측정한 결과에서도 증가하는 것을 확인하였다 (도 10). 연골세포의 세포사멸 (Apoptosis)은 TUNEL 염색을 통해 확인하였다. 파라핀 절편한 태생기 15.5일의 Wild type과 Col2-DICAM Tg의 Femur의 슬라이드를 Rehydration하고 PBS로 세척후 20ug/ml의 Proteinase K로 3분 동안 Permiabilization 시켰으며 그 후 PBS로 2번의 세척과정을 거처 Equilibration buffer를 1분 동안 처리하고 TdT Enzyme을 1시간 동안 처리하였다. 그 후 PBS로 세척하고 Anti-Digoxigenin conjugate로 30분 동안 처리한 후 DAB로 염색하였다. 염색된 정도를 비교하면 Wild type과 Col2-DICAM Tg에서 연골세포의 세포사멸은 차이가 없었다 (도 10).

실시예 3. DICAM에 의한 골관절염 중증도 감소 확인

골관절염의 발병에서 DICAM의 기능을 확인하기 위해 생쥐의 골관절염 모델에서 DICAM의 발현을 확인하고 DICAM 과발현에 의한 골관절염의 발병 및 중증도를 평가하였다. 먼저 골관절염 모델은 인간 골관절염과 비슷한 증상을 나타내고 실험적으로 가장 많이 사용되는 수술적 골관절염 모델인 DMM (Destabilization of Medial Meniscus) 방법을 선택하였다. 8~12주령의 생쥐를 마취 후 왼쪽 무릎관절의 내측 반월상 연골의 인대를 수술용 칼로 절단하여 탈안정화 (Destabilization)시켜 골관절염을 유도 한 후 4주 또는 8주 뒤 생쥐를 희생시키고 무릎관절을 분리하여 골관절염의 중증도를 확인하였다. 분리한 무릎관절을 위의 방법과 동일하게 고정, 탈회, 파라핀 절편 과정을 거쳐 DICAM의 발현을 면역조직염색을 통해 확인하였다. DICAM은 정상 무릎관절연골에서 높은 발현을 보이나 골관절염 발병 생쥐의 무릎 관절 연골에서 발현이 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다 (도 11).

골관절염 발병 기전에서 DICAM의 역할을 확인하기 위해 위의 방법으로 골관절염을 유도한 정상 생쥐의 무릎 관절강에 DICAM을 과발현시키는 아데노바이러스 (Ad-Dicam)와 대조군인 Ad-LacZ를 각각 주입하고 4주 후 골관절염의 중증도를 비교하였다. 대조군인 Ad-LacZ에 비해 Ad-DICAM을 주입한 관절연골의 골관절염 중증도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다 (도 12).

또한 Col2-Dicam Tg에서 골관절염 발병 정도를 Wild type과 비교하였다. Wild type과 Col2-Dicam Tg 생쥐에 위의 방법으로 골관절염을 유도하고 8주 후 중증도를 비교하였을 때 Wild type에 비해 Col2-Dicam Tg 생쥐에서 골관절염의 발병이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 13).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Daegu Fatima Hospital <120> Composition comprising Dual Ig domain containing cell adhesion molecule for preventing or treating degenerative arthritis <130> YP16-1230 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Leu Leu Ser Arg Val Leu Leu Trp Lys Leu Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Ser Ala Val Leu Ser Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ala Ala Ala Ser 20 25 30 Asn Ser Leu Val Ser Glu Ser Val Val Ser Leu Ala Ala Gly Thr Gln 35 40 45 Ala Val Leu Arg Cys Gln Ser Pro Arg Met Val Trp Thr Gln Asp Arg 50 55 60 Leu His Asp Arg Gln Arg Val Val His Trp Asp Leu Ser Gly Gly Pro 65 70 75 80 Gly Ser Gln Arg Arg Arg Leu Val Asp Met Tyr Ser Ala Gly Glu Gln 85 90 95 Arg Val Tyr Glu Pro Arg Asp Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ser Pro Ser 100 105 110 Ala Phe His Asp Gly Asn Phe Ser Leu Leu Ile Arg Ala Val Glu Arg 115 120 125 Gly Asp Glu Gly Val Tyr Thr Cys Asn Leu His His His Tyr Cys His 130 135 140 Leu Asp Glu Ser Leu Ala Val Arg Leu Glu Val Thr Glu Asp Pro Leu 145 150 155 160 Leu Ser Arg Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Lys Glu Val Leu Val Val Ala 165 170 175 His Gly Ala Pro Ala Leu Met Thr Cys Ile Asn Arg Ala His Val Trp 180 185 190 Thr Asp Arg His Leu Glu Glu Ala Gln Gln Val Val His Trp Asp Arg 195 200 205 Gln Leu Pro Gly Val Ser His Asp Arg Ala Asp Arg Leu Leu Asp Leu 210 215 220 Tyr Ala Ser Gly Glu Arg Arg Ala Tyr Gly Pro Pro Phe Leu Arg Asp 225 230 235 240 Arg Val Ser Val Asn Thr Asn Ala Phe Ala Arg Gly Asp Phe Ser Leu 245 250 255 Arg Ile Asp Glu Leu Glu Arg Ala Asp Glu Gly Ile Tyr Ser Cys His 260 265 270 Leu His His His Tyr Cys Gly Leu His Glu Arg Arg Val Phe His Leu 275 280 285 Gln Val Thr Glu Pro Ala Phe Glu Pro Pro Ala Arg Ala Ser Pro Gly 290 295 300 Asn Gly Ser Gly His Ser Ser Ala Pro Ser Pro Asp Pro Thr Leu Thr 305 310 315 320 Arg Gly His Ser Ile Ile Asn Val Ile Val Pro Glu Asp His Thr His 325 330 335 Phe Phe Gln Gln Leu Gly Tyr Val Leu Ala Thr Leu Leu Leu Phe Ile 340 345 350 Leu Leu Leu Ile Thr Val Val Leu Ala Thr Arg His Arg His Ser Gly 355 360 365 Gly Cys Lys Thr Ser Asp Lys Lys Ala Gly Lys Ser Lys Gly Lys Asp 370 375 380 Val Asn Met Val Glu Phe Ala Val Ala Thr Arg Asp Gln Ala Pro Tyr 385 390 395 400 Arg Thr Glu Asp Ile Gln Leu Asp Tyr Lys Asn Asn Ile Leu Lys Glu 405 410 415 Arg Ala Glu Leu Ala His Ser Pro Leu Pro Ala Lys Asp Val Asp Leu 420 425 430 Asp Lys Glu Phe Arg Lys Glu Tyr Cys Lys 435 440 <210> 2 <211> 2192 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggtgctggc agggagaggg ggtcggctgt ttttctggag agttagagct gagtaagaca 60 aagcacgtcc cccgcaggcg ccatggaact gctgtcccgt gtcctgctgt ggaaactgct 120 gcttcttcag agctctgcag tcctgtcctc agggccttca gggaccgcag cagccagcaa 180 ctctctggtg tctgagtctg tggtgagctt ggcagccgga acccaggctg tgctacgctg 240 ccagagcccc cgcatggtgt ggacccaaga ccggctgcat gatcgccagc gcgtggtcca 300 ctgggacctc agcgggggcc cgggcagcca acggcgccga cttgtggata tgtattcggc 360 gggtgaacag cgcgtgtacg agccgcgcga tcgcgaccgc ctcctgctgt cgccttctgc 420 tttccacgac ggcaacttct cgctgctcat tcgcgctgtg gagagaggcg atgaaggggt 480 gtacacctgc aacctgcacc 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2192 <210> 3 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ihh <400> 3 Met Ser Pro Ala Trp Leu Arg Pro Arg Leu Arg Phe Cys Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Val Pro Ala Ala Arg Gly Cys Gly Pro Gly Arg 20 25 30 Val Val Gly Ser Arg Arg Arg Pro Pro Arg Lys Leu Val Pro Leu Ala 35 40 45 Tyr Lys Gln Phe Ser Pro Asn Val Pro Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser 50 55 60 Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Ala Arg Ser Ser Glu Arg Phe Lys Glu 65 70 75 80 Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn 85 90 95 Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Arg Leu Asn 100 105 110 Ser Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg 115 120 125 Val Thr Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu 130 135 140 His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg 145 150 155 160 Asn Lys Tyr Gly Leu Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp 165 170 175 Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Val His Cys Ser Val Lys Ser 180 185 190 Glu His Ser Ala 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Leu Gln Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly 945 950 955 960 Asp Asp Gly Pro Ser Gly Leu Asp Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu 965 970 975 Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg 980 985 990 Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly 995 1000 1005 Ala Pro Gly Ala Ser Gly Asp Arg Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro 1010 1015 1020 Pro Gly Leu Thr Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Arg Glu Gly Ser Pro 1025 1030 1035 1040 Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ala Ala Gly Val Lys Gly 1045 1050 1055 Asp Arg Gly Glu Thr Gly Ala Leu Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro 1060 1065 1070 Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Lys Gln Gly Asp Arg 1075 1080 1085 Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly 1090 1095 1100 Ala Arg Gly Ile Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu 1105 1110 1115 1120 Ser Gly Glu Gln Gly Glu Arg Gly Leu Lys Gly His Arg Gly Phe Thr 1125 1130 1135 Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asp Gln Gly 1140 1145 1150 Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro 1155 1160 1165 Val Gly Pro Ser Gly Lys Asp Gly Ser Asn Gly Ile Pro Gly Pro Ile 1170 1175 1180 Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Ser Gly Glu Thr Gly Pro Val Gly 1185 1190 1195 1200 Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 1205 1210 1215 Gly Ile Asp Met Ser Ala Phe Ala Gly Leu Gly Gln Arg Glu Lys Gly 1220 1225 1230 Pro Asp Pro Met Gln Tyr Met Arg Ala Asp Glu Ala Asp Ser Thr Leu 1235 1240 1245 Arg Gln His Asp Val Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn 1250 1255 1260 Gln Ile Glu Ser Ile Arg Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala 1265 1270 1275 1280 Arg Thr Cys Gln Asp Leu Lys Leu Cys His Pro Glu Trp Lys Ser Gly 1285 1290 1295 Asp Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Leu Asp Ala Met Lys 1300 1305 1310 Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Val Tyr Pro Asn Pro 1315 1320 1325 Ala Thr Val Pro Arg Lys Asn Trp Trp Ser Ser Lys Ser Lys Glu Lys 1330 1335 1340 Lys His Ile Trp Phe Gly Glu Thr Met Asn Gly Gly Phe His Phe Ser 1345 1350 1355 1360 Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Val Gln Met Thr 1365 1370 1375 Phe Leu Arg Leu Leu Ser Thr Glu Gly Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His 1380 1385 1390 Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Leu Asp Glu Ala Ala Gly Asn Leu Lys 1395 1400 1405 Lys Ala Leu Leu Ile Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Met Arg Ala Glu 1410 1415 1420 Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Ala Leu Lys Asp Gly Cys Thr Lys 1425 1430 1435 1440 His Thr Gly Lys Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Arg Ser Gln Lys 1445 1450 1455 Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Ile Ala Pro Met Asp Ile Gly Gly 1460 1465 1470 Ala Glu Gln Glu Phe Gly Val Asp Ile Gly Pro Val Cys Phe Leu 1475 1480 1485 <210> 7 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin D1 <400> 7 Met Glu His Gln Leu Leu Cys Cys Glu Val Glu Thr Ile Arg Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Thr Asn Leu Leu Asn Asp Arg Val Leu Arg Ala Met Leu 20 25 30 Lys Thr Glu Glu Thr Cys Ala Pro Ser Val Ser Tyr Phe Lys Cys Val 35 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Claims

DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DICAM 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 재조합 바이러스성 벡터는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 연골세포를 증식시키거나 또는 연골세포로 분화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 단백질 또는 DICAM 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 연골세포의 증식 또는 분화용 조성물.
DICAM(Dual Ig domain containing cell adhesion molecule) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);
S1 단계의 세포주에서 DICAM의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및
S2 단계의 DICAM의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 퇴행성 관절염 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.