KR20090124439A - ＤＩＣＡＭ과 αｖβ3 인테그린과의 상호작용을 저해하여αｖβ3 인테그린에 의한 신호전달을 억제하는 물질의스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DICAM (dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule)과 αvβ3 인테그린(integrin)과의 상호작용을 억제하는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의하면 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 후보물질을 대량/고속(highthroughput)의 방식으로 효율적으로 탐색할 수 있다. 본 발명에 의해 탐색된 물질은 DICAM와 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제함으로써 αvβ3 인테그린에 의한 신호전달을 의해 발생될 수 있는 혈관신생, 암세포의 전이, 파골세포의 분화를 억제하는 항암제, 항염증제 및 골다공증 치료제 개발에 유용하게 응용될 수 있다.

DICAM, 세포 부착, αvβ3 인테그린

Description

ＤＩＣＡＭ과 αｖβ3 인테그린과의 상호작용을 저해하여 αｖβ3 인테그린에 의한 신호전달을 억제하는 물질의 스크리닝 방법{Method for Screening Materials That Inhibit the Signal Transduction via αvβ3 integrin by prohibiting the interaction between DICAM and αvβ3}

본 발명은 DICAM(dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule)과 αvβ3 인테그린(integrin)과의 상호작용을 억제하여 αvβ3 인테그린에 의한 신호전달을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

세포 부착(cell adhesion)은 다세포 유기체에서 세포의 운명을 결정하는 중요한 요소이다. 세포들은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 또는 다른 세포의 세포 표면 단백질에 선택적으로 결합할 수 있고, 이는 정상 조직의 조직 패턴화, 형태형성 및 유지와 같은 사건에서 중요한 역할을 담당한다(Gumbiner, 1996; Takai et al., 2003). 과거 수십년에 걸친 연구에 의해 다양한 종류의 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)를 확인하였다. 세포 부착 분자는 이들의 각각의 특 성 및 구조에 기초하여 다음의 네가지의 주요한 패밀리로 나눌 수 있다; 케드헤린(cadherin), 인테그린(integrin), 실렉틴(selectin) 및 면역글로블린(Ig) 수퍼패밀리(Elangbam et al., 1997). 이들 단백질들은 이들의 특이 도메인 구조에 의해 세포 또는 ECM에 결합한다. 이러한 세포 부착 분자들중에 Ig 수퍼패밀리 일원 단백질은 척추동물의 백혈구의 수용체와 다른 조직에서의 많은 세포 부착 분자의 약 1/3을 차지하는 세포 표면 분자들 중에서 가장 많은 단백질이다(Chretien et al., 1998; Holness and Simmons, 1994). 이들 중에서, 예를 들어, NCAM은 신경계에서 축색 가이드(axon guidance) 및 신경돌기 성장을 촉진하는 능력을 가진다(Rutishauser, 1985). 넥틴(nectin)은 세포 부착 분자일 뿐만 아니라 폴리오바이러스에 대한 수용체로서도 작용한다(Takai et al., 2003). FGF 수용체는 면역 글로블린 유사 도메인을 갖는다(Bernard et al., 1991). 접합부 부착 분자(Junctional adhesion molecules, JAM)는 면역글로블린 수퍼 패밀리(immunoglobulin superfamily, IgSF) 단백질에 속하며 백혈구의 표면 뿐만 아니라 상피 및 내피 세포의 세포 접합부에서도 발현된다(Mandell and Parkos, 2005). JAM 단백질은 세포외 영역에서 시그널 펩타이드, C- 및/또는 V-타입 면역글로블린 도메인으로 구성되는 타입 I 트랜스막(transmembrane) 단백질이다. 단일의 트랜스막 부위, 짧은 세포질 말단 및 수개의 글리코실레이션 부위에 대해 그 특성이 밝혀졌다(Bazzoni, 2003).

JAM 단백질들은 다-기능성 단백질들로서 세포-세포 부착, 밀착연접(tight junction)에서의 장애막 기능, 백혈구 이동, 혈소판 활성화, 혈관신생 및 레오바이 러스 결합과 같은 다양한 세포 현상에 관련되어 있다(Mandell and Parkos, 2005).

본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 HCS-2/8 연골세포 라이브러리로부터 신규 후보 유전자 ASP3 (adipocyte specific protein 3, 지방세포 특이 단백질 3)의 특성을 연구하였다(Jung et al., 2004). ASP3는 어떠한 기능적 분석 없이 지방세포 분화에 있어서 상향 조절되는 유전자들중의 하나로 인정되어 왔다(Tsuruga, 2001). 조직 특이적 발현과는 대조적으로, ASP3는 연골을 포함하여 많은 조직에서 발현된다. NCBI 데이터베이스에서 몇 가지 종으로부터의 서열의 다중-정렬(multi-alignment)에 의하면 ASP3는 5 가지의 척추동물 종(인간, 마우스, 랫트, 개구리, 닭) 중에서 높게 보존된 것으로 밝혀졌다. 뉴클레오타이드 서열에 의해 단일-스팬 트랜스막 부위에 이어지는 2개의 N-말단 변동(V)-타입 Ig-형 도메인을 갖는 세포외 도메인과 비교적 짧은 세포질 도메인을 포함하는 442 아미노산의 타입 I 트랜스막 단백질이 예측되었다. 서열 상동성 및 중요 구조적 잔기에 기초하여, ASP3는 JAM 패밀리 단백질과 밀접하게 관련된 것으로 밝혀졌다. ASP3의 구조는 2개의 Ig-루프, 단일 트랜스막 부위 및 비교적 짧은 세포질 꼬리를 갖는 JAM 패밀리 일원과 유사하다. ASP3로도 알려진 리미트린(limitrin)은 성상세포(astrocyte)에서 말단 풋(end foot)의 하나의 구성원인 것으로 보인다(Yonezawa et al., 2003). ASP3 및 리미트린은 이의 발현 패턴 및 기능에 대한 연관성에 대해 제한된 표시를 가진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조 로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 DICAM 단백질의 세포내에서의 기능을 밝히고자 예의 연구 노력한 결과 DICAM 단백질이 세포의 밀착연접(tight junction) 부위에서 αvβ3 인테그린(integrin)과의 상호작용에 의해 세포 부착 단백질(cell adhesion molecule)로 기능한다는 것을 실험적으로 확인하였으며, DICAM 단백질과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝 하는 시스템을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 DICAM 단백질과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하여 αvβ3 인테그린에 의한 신호전달을 억제하는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 DICAM(dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule)과 αvβ3 인테그린(integrin)과의 상호작용(interaction) 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) DICAM의 Ig 도메인 (immunoglobulin domain) I, Ig 도메인 II, 또는 Ig 도메인 I 및 II을 포함하는 폴리펩타이드를 플레이트(plate)상에 코팅하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 플레이트상에 후보물질을 첨가한 후 인큐베이션 하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 플레이트상에 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하고 인큐베이션 하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 플레이트를 세정하고, 플레이트상에 부착된 세포의 수를 측정하는 단계.

본 발명자들은 DICAM 단백질의 세포내에서의 기능을 밝히고자 예의 연구 노력한 결과 DICAM 단백질이 세포의 밀착연접(tight junction)부위에서 αvβ3 인테그린(integrin)과의 상호작용에 의해 세포 부착 단백질(cell adhesion molecule)로 기능한다는 것을 실험적으로 확인하였으며, DICAM 단백질과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝하는 시스템을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

(a) DICAM 의 Ig 도메인 ( immunoglobulin domain ) I, Ig 도메인 II , 또는 Ig 도메인 I 및 II 을 포함하는 폴리펩타이드를 플레이트(plate)상에 코팅하는 단계

본 발명의 명세서에서 "DICAM (dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule)" 단백질은 Tsuruga에 의해 지방세포 라이브러리에서 ASP3 (adipocyte-specific protein 3, 지방세포-특이 단백질 3)(또는 리미트 린(limitrin))으로 확인되었던 단백질(Tsuruga, H, 2001)로서, 본 발명자들이 이 단백질이 인테그린(integrin) 단백질을 통해 강한 세포 부착 활성을 갖는다는 것을 최초로 확인하여, DICAM으로 재명명한 단백질이다. 본 발명에서 상기 DICAM 단백질은 바람직하게는 포유동물 유래의 DICAM 단백질이며, 보다 바람직하게는 인간 또는 마우스 유래의 DICAM 단백질이며, 서열목록 제 1 서열에 나타낸 442 아미노산 서열로 이루어진 단백질이다.

본 발명의 DICAM 단백질은 하나의 시그널 펩타이드(signal peptide), 세포외부영역(extracellular region)에서 2개의 v-타입 Ig-유사(Immunoglobulin-like) 도메인, 1 개의 트랜스막(transmembrane) 영역 및 비교적 짧은 80 아미노산의 세포질 테일(tail)로 구성되어 있다(도 1b 참조). 본 발명의 DICAM 단백질의 서열 및 구조적 특징은 Ig 수퍼 패밀리에 속하는 CTX 단백질 패밀리와 유사하며, 다중-정렬(multi-alignment)에 기초한 계통 발생학적 분석(phylogenetic analysis)에 의해 JAM 그룹에 대해 더욱 큰 상동성을 갖는 것으로 확인된 단백질이다(도 2a 및 도 2b 참조).

본 발명의 명세서에서 용어 DICAM의 "Ig 도메인(immunoglobulin domain) I"은 본 발명의 DICAM 단백질의 두 개의 Ig 유사 도메인 중 첫 번째의 Ig 유사 도메인을 의미하며, 서열목록 제 1 서열의 38번째 아미노산 - 156번째 아미노산 서열로 이루어져 있다.

본 발명의 명세서의 용어 DICAM의 "Ig 도메인 II"은 본 발명의 DICAM 단백질의 두 개의 Ig 유사 도메인 중 두 번째의 Ig 유사 도메인을 의미하며, 서열목록 제 1 서열의 170번째 아미노산 - 291번째 아미노산 서열로 이루어져 있다.

본 발명의 단계 (a)에서는 상기 DICAM 단백질의 Ig 도메인 I, Ig 도메인 II 또는 Ig 도메인 I 및 II을 포함하는 단백질을 플레이트상에 코팅한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 DICAM 단백질의 Ig 도메인을 포함하는 단백질을 플레이트상에 코팅하는 단계에서, 음성 대조군으로서 BSA(Bovine Serum Alumine)와 양성 대조군으로서 피브로넥틴(fibronectin)을 플레이트상에 코팅한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, DICAM의 Ig 도메인 I, Ig 도메인 II 또는 Ig 도메인 I 및 II을 포함하는 단백질은 대장균(E.coli)에서 발현시켜 분리 정제한 것을 사용한다. 분리한 단백질은 1X PBS (Phosphate Buffered Serin)를 사용하여 예를 들어 5 ㎍/㎖의 농도가 되도록 희석하여 사용한다. 희석한 단백질을 96 웰 ELISA 플레이트상에 100 ㎕씩 로딩한다. 이때 2％ BSA (Bovine Serum Alumine)를 음성 대조군으로, 5㎍/㎖의 피브로넥틴(fibronectin)을 양성 대조군으로 사용한다. 플레이트는 37 ℃에서 1시간 이상 또는 4 ℃에서 16시간 이상 인큐베이션한후 1X PBS로 3 회 세정한다. 이어서, 2％ BSA로 37℃에서 1시간 블로킹(blocking) 한 후 다시 1X PBS로 3회 세정한다.

(b) 상기 단계 (a)의 플레이트상에 후보물질을 첨가한 후 인큐베이션 하는 단계

상기 단계 (a)에서 제조한, DICAM 단백질의 Ig 도메인 I, Ig 도메인 II, 또는 Ig 도메인 I 및 II을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 플레이트상에 후보물질을 첨가한 후 일정 시간 인큐베이션한다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 단계 (b)는 다음과 같이 실시한다. 후보물질을 1X PBS에 농도별로 희석한 후, 희석된 후보물질을 코팅된 플레이트에 100㎕씩 로딩한다. 이어서, 37℃에서 1시간 이상 또는 4℃에서 16시간 이상 인큐베이션한다. 인큐베이션한 플레이트를 1X PBS로 3번 세척한다.

본 발명에서 상기 "후보물질"은 DICAM 단백질의 Ig 도메인 I 및 Ig 도메인 II와 세포 표면상의 αvβ3 인테그린과의 상호작용(결합)을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

(c) 상기 단계 (b)의 플레이트상에 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하고 인큐베이션 하는 단계

상기 단계 (b)의 후보물질을 첨가하여 인큐베이션을 행한 플레이트에 세포를 접종하고 더욱 인큐베이션 한다.

상기 접종하는 세포는 αvβ3 인테그린를 발현하는 세포이면 충분하고 특정 세포로 한정되지 않는다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 상기 αvβ3 인테그린 발현 세포는 MDCK (Madin-Darby canine kidney)세포이다. MDCK 세포는 α2β1, α3β1, αvβ3, α6β4 및 β1과 결합할 수 있는 다른 인테그린 α서브유닛을 포함하여 다양한 인테그린을 발현한다(Schoenenberger et al., 1994).

본 명세서에서 사용되는 용어 "인테그린(integrin)"은 세포외 기질(extracellular matrix)과 상호작용하고 다양한 세포내 신호를 매개하는 세포 표면 수용체 단백질을 의미한다. 이 단백질은 세포의 형태, 이동성 및 세포주기(cell cycle)를 조절하는 기능을 가지며, 특히 하나의 세포가 다른 세포 또는 다른 조직(tissue)에 부착하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 인테그린은 부착 기능 이외에도 세포외기질로부터의 받은 신호를 세포내부로 변환하는 신호전달(signal transduction)에서도 중요한 역할을 한다. 또한, 인테그린은 종양 세포의 침투(invasion) 및 전이(metastasis)에도 관여되는데, 종양 세포는 침투 및 전이시에 다른 세포들의 표면에 있는 다양한 타입의 세포외기질(ECM) 단백질 및 분자에 부착한다. 인테그린은 현재 다양한 종류가 확인되어 있으며 다양한 종류의 인테그린을 세포 표면에 갖고 있다.

인테그린은 α(알파) 및 β(베타) 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머(heterodimer)로 이루어지고, 포유동물에서 19 개의 α서브유닛 및 8 개의 β 서브유닛이 현재까지 알려져 있다. 여러 종류의 인테그린 가운데 αvβ3 인테그린은 인 비보 및 인 비트로에서 가장 많이 연구되어온 분자로서, 비트로넥틴(vitronectin), 피브로넥틴(fibronectin), von Willebrand factor, 피브리노겐(fibrinogen), 오스테오폰틴(osteopontin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), RGD를 포함하는 펩타이드에 결합할 수 있는 인테그린이다. 이러한 물질과 결합에 의해 자극 받은 αvβ3 세포내에서 여러 가지 활성을 유도하는데, 세포내 pH, 칼슘, 리피드 이노시톨의 합성을 증가시키고, Shc, p130 CAS, Crk II와 같은 연결단백질과 FAK(focal adhesion kinase), Src 키나아제(kinase)와 같은 비-수용체(non receptor)형 티로신 키나아제(tyrosine kinase)의 인산화를 유도한다. 또한, Ras/Mitogen-activated protein(MAP) 경로를 포함하는 여러 가지 하위 신호전달 기 작에도 관여하며, 혈관신생을 유도하는 다양한 성장인자의 발현에도 관련되는 것으로 알려져 있다(Nancy J. Boudreau and Lloyc Joens, Extracellular matrix and integrin signalling : the shape of things to come (1999) Biochem. J. 339:481-488; Filippo G. Glancotti and Erkki Ruoslahti. Integrin Signaling (1999) Science 285:1028-1032; Li-Huei Tsai. Stuck on the ECM (1998) Trends in Cell Biology 8 : 292-295). 또한, αvβ3 인테그린은 파골세포(osteoclast) 분화에도 중요한 조절자로 알려져 있다(Faccio et al., 2002; Faccio et al., 2003; Kim et al., 2003).

본 발명자들은 세포 표면 단백질인 DICAM이 αvβ3 인테그린 단백질과의 상호작용(결합)을 통해 세포의 부착(adhesion) 기능을 발휘한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 스크리닝 되는 물질은 DICAM 단백질과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 방해하여 세포 부착 기능을 저해하는 기능을 갖는 물질이며, 동시에 αvβ3 인테그린에 의한 신호전달 기작을 저해할 수 있으므로, αvβ3 인테그린 신호전달에 의해 발생될 수 있는 혈관신생, 암세포의 전이, 파골세포의 분화를 억제하는 항암제, 항염증제 및 골다공증 치료제 개발에 유용하게 응용될 수 있는 물질이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 추가 접종하는 세포는 트립신으로 처리한 후에 접종한다. 트립신 처리에 의해 세포를 단일 세포로 분리함으로써 후술하는 단계 (d)에서의 세정시에 플레이트상에 미부착된 세포를 용이하게 제거할 수 있다.

세포의 인큐베이션 시간은 αvβ3 인테그린 발현세포가 DICAM의 Ig 도메인과 상호작용하여 이에 결합하기 충분한 시간이며 특정의 시간 범위로 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 단계 (c)는 다음과 같이 실시할 수 있다. 우선, 100 mm 플레이트에 약 70％ 정도 자란 MDCK (Madin-Darby canine kidney)세포를 트립신(trypsin)을 이용해서 분리시키고, 분리된 세포의 수를 혈구계산기를 이용하여 측정한다. 분리된 세포를 상기 단계 (b)의 플레이트에 2 x 10⁴ 개의 세포를 접종(seeding)한 후 37℃에서 인큐베이션한다.

(d) 상기 단계 (c)의 플레이트를 세정하고, 플레이트상에 부착된 세포의 수를 측정하는 단계

다음에 상기 단계 (c)에서 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하여 인큐베이션한 후에 플레이트를 세정하여 미부착된 세포를 씻어내고, 플레이트상에 부착된 세포의 수를 측정한다. 상기 부착된 세포의 수를 측정하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 행하며, 예를 들어, 현미경을 사용한 직접 계수법 또는 헥소사미니다아제 분석법(hexosaminidase assay)에 의해 행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 시시예에 의하면, 단계 (d)는 다음과 같이 실시할 수 있다. 단계 (c)를 행한 후 부착되지 않은 세포를 1X PBS로 세정하여 씻어내고, 부착된 세포를 현미경 상에서 그 수를 직접적으로 측정하거나, 헥소사미니다아제 분 석법으로 살아있는 세포의 수를 간접적으로 측정한다.

헥소사미니다아제 분석법은 다음과 같이 실시할 수 있다. 헥소사미니다아제 효소의 기질로 7.5 mM의 p-nitrophenol-N-acetyl-B-D-glucoseaminide를 0.1M 시트레이트 완충액 (citrate buffer), pH 5.0 에 녹이고 0.5％ Triton X-100과 동량으로 혼합한다. 60㎕의 기질을 플레이트에 로딩(loading)한 후 37 ℃에서 1시간 인큐베이션한다. 이어서, 90㎕의 블로킹(blocking) 용액 (50mM glycine buffer, 5mM EDTA, pH=10.4)을 넣고 효소반응을 종료시킨다. 405nm 파장에서 측정값을 계산하여 간접적인 세포수를 측정한다.

(e) 상기 단계 (d) 이후에, 상기 단계 (b)에서 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 후보물질을 첨가한 경우에 부착된 세포의 수가 감소하는 후보물질을 선별하는 단계

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (d) 이후에, 상기 단계 (b)에서 후보물질을 첨가하지 않는 경우에 비해 후보물질을 첨가한 경우에 부착된 세포의 수가 감소하는 후보물질을 선별하는 단계 (e)를 추가로 포함한다.

후보물질이 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 저해한다면 αvβ3 인테그린 발현세포의 DICAM Ig 도메인 코팅 플레이트에의 부착능이 저해된다. 따라서, 본 발명에서 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 후보물질의 스크리닝은 상기 단계 (b)에서 후보물질을 첨가하지 않고 인큐베이션한 경우에 비해, 후보물질을 첨가하여 인큐베이션한 경우에서 플레이트상에 부착된 세포의 수가 감소하는 후보물질을 선별함으로써 이루어진다.

상기 후보물질은 DICAM의 Ig 도메인과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제함으로써 세포의 부착을 저해하는 작용을 하는 물질이며, 동시에 αvβ3 인테그린에 의한 신호전달을 저해할 수 있으므로, αvβ3 인테그린 신호전달에 의해 발생되는 혈관신생, 암세포의 전이, 파골세포의 분화를 억제하는 항암제, 항염증제 및 골다공증 치료제 개발에 유용하게 응용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) DICAM이 발현된 세포를 플레이트에 접종하여 플레이트상에 이 세포의 단일층을 형성하도록 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 세포가 배양된 플레이트상에 후보물질을 첨가하여 인큐베이션 하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 플레이트상에 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하여 배양하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 플레이트를 세정한 후 플레이트상에 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수를 측정하는 단계.

이하에서 본 발명을 단계에 따라 구체적으로 설명한다.

(a) DICAM이 발현된 세포를 플레이트에 접종하여 플레이트상에 이 세포의 단일층을 형성하도록 배양하는 단계

용어 "DICAM"에 대한 내용은 상기 본 발명의 다른 발명인 "DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질의 스크리닝 방법"에서 설명된 내용과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, DICAM이 세포 표면에 발현된 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 DICAM 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 사용한다. 상기 "DICAM 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열"은 바람직하게는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제 2 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

상기 용어"프로모터"는 DICAM 유전자의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일반적인 프로모터 부위는 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다. 즉, ATG 모티프를 포함하는 추정의 개시코돈이 확인되어 있고, 이 개시코돈으로부터 업스트림이 추정 프로모터 부위이다. 프로모터는 인접 및 원거리의 업스트림 엘리먼트(element)들로 구성되어 있다. 인접 엘리먼트로서는 통상적으로 RNA 중합효소 II가 적합한 전사 개시 위치에서 RNA의 합성을 개시할 수 있게 하는 TATA 박스(box)를 포함한다. 원거리 엘리먼트은 인헨서(enhancer)라고도 불리우는 조절 서열을 포함하는데, 이는 TATA 박스의 업스트림 부위에 조직 특이적 또는 시간 특이적 발현에 관여하는 추가 조절 엘리먼트이다. 인헨서는 프로모터의 활성을 촉진할 수 있는 DNA 서열이고, 프로모터의 고유의 엘리먼트이거나, 프로모터의 조직-특이성이나 발현 수준을 향상시키기 위해서 삽입되는 이종기원(heterologous)의 엘리먼트일 수 있다. 프로모터는 본래의 유전자로부터 그 전체가 유래한 것일 수 있고, 또는 자연계에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래한 상이한 엘리먼트들로 구성될 수도 있고, 심지어 합성 DNA를 포함할 수도 있다. 당업자라면 각각 상이한 프로모터는 각각 상이한 조직 또는 세포 타입에서, 또는 발달단계의 상이한 단계에서, 또는 상 이한 환경조건에 대응하여서 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 DICAM 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용 가능한 프로모터로는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서 열을 일반적으로 갖는다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4ㅇλB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균 주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic.Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 DICAM이 세포 표면에 발현 된 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 DICAM 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 세포이다. 상기 DICAM 단백질은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면 상기 형질전환 숙주세포는 CHO (Chinese hamster ovary) 세포이다.

(b) 상기 단계 (a)의 세포가 배양된 플레이트상에 후보물질을 첨가하여 인큐베이션 하는 단계

상기 단계 (a)에서 DICAM 발현 세포를 플레이트에 접종하여 플레이트상에 세포 단일층을 형성하도록 배양한 후에 플레이트상에 후보물질을 추가로 첨가하여 인큐베이션한다.

상기 용어 "후보물질"은 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질을 의미하며, 이와 관련된 내용은 상기 본 발명의 다른 스크리닝 발명에서 설명한 것과 동일한 내용이므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

(c) 상기 단계 (b)의 플레이트상에 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하여 배양하는 단계

DICAM 발현 세포를 배양한 플레이트상에 후보물질을 첨가하여 인큐베이션한 후, αvβ3 인테그린을 세포 표면에 발현하는 세포를 추가 접종하여 배양한다. 배양시에 후보물질이 DICAM과 αvβ3 인테그린의 상호작용을 방해한다면 이들 단백질을 표면에 발현하는 세포들의 부착을 억제하게 될 것이다.

상기 αvβ3 인테그린을 발현하는 세포는 αvβ3 인테그린을 세포 표면에 정 상적으로 발현하는 세포이면 어떠한 세포라도 사용 가능하며 특정의 세포로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, αvβ3 인테그린 발현 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 αv 및 β3 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 상기 αvβ3 인테그린 발현 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 β3 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 αv 인테그린 서브유닛을 내재적으로(endogenously) 발현하는 세포를 형질전환시킨 세포이다.

상기 "αv 인테그린 서브유닛"은 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 "αv 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열"은 상기 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 서열이며, 바람직하게는 서열목록 제 4 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

상기 "β3 인테그린 서브유닛"은 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 "β3 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열"은 상기 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 서열이며, 바람직하게는 서열목록 제 6 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

상기 αv 및 β3 인테그린 서브유닛을 발현하는 세포와 관련된 프로모터, 벡터, 형질전환, 숙주세포 등에 대한 내용은 상기 "DICAM이 세포 표면에 발현된 세포"에서 설명된 내용과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이에 대한 설명을 생략한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 αvβ3 인테그린을 발현하는 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 β3 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 αv 인테그린 서브 유닛을 내재적으로(endogenously) 발현하는 숙주세포에 형질전환시켜 제조한 세포를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 αvβ3 인테그린 발현 세포는 트립신(trypsin) 처리하고, 형광물질(fluorescent material)로 라벨링(labelling, 표지)시킨 후에 접종한다. αvβ3 인테그린 발현 세포를 트립신 처리하여 단일 세포로 분리함으로써 후술하는 단계 (d)에서의 세정시에 플레이트상에 미부착된 세포를 용이하게 제거할 수 있다. 또한, αvβ3 인테그린 발현 세포를 형광물질 라벨링함으로써 부착된 세포의 수를 용이하게 측정할 수 있다.

(d) 상기 단계 (c)의 플레이트를 세정한 후 플레이트상에 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수를 측정하는 단계

다음으로, αvβ3 인테그린 발현 세포를 플레이트에 접종하여 배양한 후 플레이트를 세정하여 미부착된 세포를 씻어내고 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수를 측정한다.

부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명의 접종하는 αvβ3 인테그린 발현 세포를 형광물질로 라벨링하여 사용함으로써, 라벨링된 형광물질의 형광에 의해 세포의 수를 측정한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 단계 (d) 이후에, 상 기 단계 (b)에서 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 후보물질을 첨가한 경우에 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수가 감소하는 후보물질을 선별하는 단계 (e)를 추가로 포함한다.

본 발명에서 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 후보물질의 선별은 상기 단계 (b)에서의 후보물질을 첨가하지 않고 인큐베이션한 경우에 비해 후보물질을 첨가하여 인큐베이션한 경우에서 플레이트상에 부착된 세포의 수가 감소한 후보물질을 스크리닝함으로써 이루어진다. 상기 후보물질은 DICAM의 Ig 도메인과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제함으로써 세포의 부착을 저해하는 작용을 하는 물질이며, 동시에 αvβ3 인테그린에 의한 신호전달을 저해할 수 있으므로, αvβ3 인테그린 신호전달에 의해 발생되는 혈관신생, 암세포의 전이, 파골세포의 분화를 억제하는 항암제, 항염증제 및 골다공증 치료제 개발에 유용하게 응용될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의하면 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질을 고속/대량(highthroughput) 방식으로 스크리닝 할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 선별된 후보물질은 DICAM의 Ig 도메인과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 저해하는 물질로써, αvβ3 인테그린에 의한 신호전달에 의해 발생될 수 있는 혈관신생, 암세포의 전이, 파골세포의 분화를 억제하는 항암제, 항염증제 및 골다공증 치료제 개발에 유용하게 응용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

인 실리코 분석(in silico analysis)

DICAM DNA 및 단백질의 전체 서열을 NCBI 데이터 베이스에서 검색하였다. DICAM의 도메인 구조를 SMART 데이터 베이스(http://smart.embl-heidelberg.de) 및 pfam(http://pfam.wustl.edu)을 사용하여 검색하였다. 마우스 지놈 정렬 및 엑손 구조는 UCSC 마우스 지놈 데이터베이스(http://genome.ucsc.edu) 및 ENSEMBL 데이터 베이스(http://www.ensembl.org)에서 검색하였다. DICAM의 모티브를 검색하기 위해서, SCANSITE 프로그램을 사용하였다(http://scansite.mit.edu). 다른 종 및 마우스 EST 서열에서 DICAM 상동성 유전자를 찾기 위해 EST에서 NCBI의 BLASTn 및 nr 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하였다.

인간, 마우스, 랫트, 닭 및 개구리에서 발견된 DICAMs의 다중 서열 정렬은 MultAlin 정렬 툴(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin)을 사용하여 수행하였 다. CTX 패밀리 유전자들과의 DICAM의 계통발생학적 분석은 clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw)를 사용하여 수행하였고, 이들의 결과는 TreeView 프로그램(http://texonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)에 의해 제조되었다.

세포 배양

CHO (Chinese hamster ovary) 세포, MDCK 세포 및 HEK293T 세포들을 사용하였다. CHO 세포는 100 units/㎖ 페니실린, 100 μg/㎖ 스트렙토마이신 및 10％ 우태아혈정을 포함하는 modified Eagle's 배지α에서 배양하였다. MDCK 및 HEK293T 세포들을 100 units/㎖ 페니실린, 100 μg/㎖ 스트렙토마이신, 및 10％ 우태아혈청을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 유지하였다. 배지는 모든 실험기간 중 매 2-3일 간격으로 교환하였다.

전장 DICAM의 클로닝, 형질전환(tranafection) 및 안정된 세포주의 제조

마우스 DICAM cDNA는 제조자의 프로토콜에 따라 RT-PCR 키트를 사용하여 역전사 PCR에 의해 연골세포 ATDC5 세포주의 mRNA 로부터 역전사 PCR에 의해 얻었다. mDICAM의 코딩 서열을 EcoR I 및 Hind III의 제한효소 자리를 갖는 센스(5'-TAAgaattcCGCCATGGAACTGCTGTC-3') 및 안티센스 (5'-TGCATGCaagcttTGCAGTAC TCCT-3') 프라이머와 다음의 PCR 조건 : 95℃에서 5 분간; 95℃에서 30초간 35 사이클, 59℃에서 30초간, 72℃에서 1분간; 72℃에서 10분간 1 사이클 하에서 증폭하였다. 증폭된 PCR 생성물은 각각의 제한효소로 절단하고 동물 발현 벡터 pcDNA3.1- myc/his-C (Invitrogen, USA)안으로 라이게이션하였다. E. coli 시스템에서 재조합 DICAM 단백질의 유도를 위해, DICAM의 전체 및 몇 개의 절단된 형태를 pET28 (a) 벡터(Novagen, USA)안으로 삽입하였다. pcDNA3.1-myc/his-C-DICAM를 제조자의 프로토콜에 따라 Lipofectamin 2000 (Clontech, USA)과 함께 CHO 세포안으로 일시적 형질전환시켰다. 안정된 세포주의 제조를 위해, DICAM- 및 벡터- 형질전환된 CHO 세포들을 약 2 주간 G418 (Invitrogen, USA) (400μg/㎖) 처리하고 단일 클론을 선택하였다. 안정된 세포주의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다.

DICAM 폴리클로날 항체 생성

래빗 항-마우스 DICAM 폴리클로날 항체는 DICAM 단백질의 N-말단 (DICAM-N)으로부터의 192 아미노산의 재조합 단백질로 제조하였다. 간략하게 설명하면, DICAM-N 재조합 단백질은 E. coli의 BL 21 균주에서 발현시키고 제조자의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 레진(QIAGEN, USA)을 사용하여 정제하였다. 래빗을 완전 프로인드 보조액(complete Freund's adjuvant)(Invitrogen, USA)내의 250μg의 정제된 DICAM-N 재조합 단백질로 면역화한 후, 면역화 4 주후에, 불완전 프로인드 보조액(incomplete Freund's adjuvant) (Invitrogen, USA)내의 250μg의 정제된 DICAM-N 단백질로 4주 후에 4주 간격으로 2회 부스팅(boosting)하였다. 총 12주 후에, 면역화된 래빗 혈청을 얻고 제조자의 프로토콜에 따라 Protein A 세파로스 친화 크로마토 그래피(Amersham Phamacia, UK)을 사용하여 IgG를 정제하였다. 항-DICAM 항체의 타이터(titer) 및 특이도(specificity)는 재조합 DICAM-N 단백질 및 DICAM-형질 전환된 CHO 세포들로부터의 세포 용해물을 사용하여 테스트하였다.

노던 블롯 분석(northern blot analysis)

노던 블롯 혼성화(northern blot hybridization)는 1kb 마우스 DICAM cDNA에 대응하는 프로브로 수행하였다. 다양한 마우스 조직(뇌, 비장, 폐, 대장, 신장, 심장, 소장, 간, 위 및 배아)으로부터 얻은 총 RNA (10μg)를 1％ 아가로스-포름알데히드 젤에서 전기영동하고, 20X SSC (sodium chloride sodium ditrate buffer, pH 7)을 사용하여 모세관 방법을 사용하여 나일론 막(Amersham, UK)에 이동시키고, UV 조사(UV StratalinkerTM 1800, Stratagene, USA)에 의해 가교시켰다. 총 25 ng의 마우스 DICAM cDNA를 랜덤 프라이밍 Megaprime DNA 라벨링 키트(Amersham, UK)를 사용하여 30 μCi의 [α-³²P] dCTP로 라벨링하였다. Nick 컬럼(Pharmacia biotech, UK)으로 여과한 후, 라벨된 프로브를 RNA막과 함께 혼성화하였다. 혼성화(hybridization)를 ExpressHybTM (Clontech, USA)을 사용하여 68℃에서 2시간 동안 수행하고, 37℃에서 고염도 용액(2X SSC내에서의 0.05％ SDS)내에서 막을 세정하고, 저염도 용액(0.1X SSC내에서의 0.1％ SDS)내에서 다시 세정한다. 막을 -70℃ 저온냉장고에서 X-레이 필름에 1-2일간 노출시켜 현상하였다.

화학적 가교( chemical cross - linking )

화학적 가교를 언급된 바와 같이 수행하였다(Miyahara et al., 2000). 간략 히 설명하면, pcDNA3.1-myc/his-C-DICAM 형질전환된 CHO 세포들을 0.2％ 트립신/ 1mM EDTA로 분리하고 약한 파이펫팅에 의해 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 세포(1 x 10⁶ cells/㎖)를 상온에서 3mM 비스-설포석시니딜 기질(bis-sulfosuccinimidyl substrate (BS³)) (Pierce, Rockford, IL, USA)를 포함하는 PBS에서 20분간 일정하게 교반하면서 인큐베이션하였다. 반응은 20mM Tris-HCl (pH 7.5)을 첨가하여 중지시키고 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 단일 세포 현탁액이 제조되었는지 확인하기 위해, 화학적 가교 반응의 전 및 후에 위상차 현미경(phase contrast microscopy)으로 관찰하였다.

인 시투 면역형광 염색(In situ immunofluorescence staining)

단일세포내 및 MDCK 세포의 컨플루언트 단일층에서 DICAM의 위치를 조사하기 위해 면역형광염색을 실시하였다. 컨플루언트(confluent) 및 성기게(sparse) 배양된 세포를 웰 당 약 4 X 10⁵ 세포 및 4 X 10³ 세포를 8-챔버 슬라이드(Nunc, USA)에 각각 접종하였다. 1일 후에, 챔버 슬라이드내의 세포들을 PBS로 세정하고, PBS/pH 7.4내의 4％ 파라포름알데히드로 10분간 고정하고 PBS내의 0.25％ 트리톤 X-100으로 5분간 얼음에서 투과성화 하였다. 1 시간 동안 2％ BSA/PBS로 블록킹한 후에 슬라이드를 상온에서 1％ BSA내의 항-DICAM 폴리클로날 항체(1:200), 항-ZO1 모노클로날 항체(1:200) (Zymed, USA) 또는 항-myc 모노클로날 항체(1:200) (Invitrogen, USA) 또는 정상 마우스 및 래빗 IgG (1:200) (Santa cruz, USA)으로 1시간 인큐베 이션 하였다. 세포를 PBS로 3회 세정하고, 1％ BSA/PBS내의 Alexa Fluor 488/594 donkey 항-래빗 또는 항-마우스 IgG 항체 (1:200) (Invitrogen, USA)와 함께 상온에서 40분간 인큐베이션하고, 다시 3회 세정하였다. 세포들을 DAPI (1:10,000) (Sigma, USA)로 3 분간 대비염색하고, 항-페이드(fade) 마운팅 용액(Invitrogen, USA)으로 마운팅하고, 형광 현미경(Olympus, Japan)하에서 사진을 찍었다.

웨스턴 블롯 분석(western blot analysis)

세포 용해물 또는 기관(organ) 용해물을 SDS-PAGE를 행하고 니트로 셀룰로오스 막(Amersham, UK)상으로 이동시켰다. 이동된 막을 5％ 탈지유를 사용하여 상온에서 적어도 1시간 동안 블로킹하고 항-myc 모노클로날 항체 또는 항-DICAM-N 폴리클로날 항체로 1시간 동안 진탕배양기에서 바인딩시켰다. 막을 5분간 3회 세정하고 퍼옥시다아제-콘쥬게이트된 항-래빗 또는 항-마우스 IgG 항체(Amersham, UK)로 1시간 동안 바인딩시킨 후 다시 세정하였다. 막을 5초 내지 10분간 X-레이 필름에 노출시키고 현상시켰다.

면역조직화학(Immunohistochemistry)

다양한 마우스 조직에서 DICAM의 발현을 확인하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 면역조직화학을 수행하였다. 각 마우스 조직을 6-주령 C57BL/6 마우스로부터 얻었다. 이들 조직들을 0.1M 소디엄 포스페이트 버퍼내의 4％ 파라포름알데히드에서 4℃에서 1일간 고정시키고, 탈수시킨 후 섹션(section)을 위해 파라핀에 봉입하 였다. 파라핀 봉입된 샘플의 3μm 두께의 섹션에서 파라핀을 제거하고 메탄올내의 1％ H₂O₂ 에서 퀀칭한 후 PBS(phosphate buffered saline)(pH 7.8)내에서 세정하고, 블로킹을 위해 정상 고우트(goat) 혈청으로 상온에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 샘플을 IgG 정제된 래빗 항-마우스 DICAM 항혈청(1:1000)으로 4 ℃에서 밤샘 배양하였고, PBS에서 희석된 비-면역 래빗 IgG (1:1000)를 네가티브 대조군으로 사용하였다. 슬라이드를 PBS로 3회 세정하고 VETASTAIN elite ABC Reagent (Vector Laboratories, USA)에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세정한 후, 모든 슬라이드를 DAKO Liquid DAB SUBSTRATECHROMOGEN SYSTEM (DAKO, Denmark)를 사용하여 현상하였다. 대비염색을 2차 증류수(ddH2O)내의 1％ 메틸그린으로 행하였다.

세포 부착 및 기능적 블로킹 분석( cell adhesion and functional blocking assay)

상술한 바와 같이 재조합 DICAM 단백질의 전체 형태 및 절단된 형태를 유도하고 정제하였다. 플레이트 (96 웰, Costar, USA)를 재조합 D-N1 (Ig 도메인 I 포함), D-N2 (Ig 도메인 II 포함), D-N1, 2 (Ig 도메인 I 및 II 포함), 또는 음성(negative) 대조군으로서 10μg의 BSA (sigma, USA), 양성(positive) 대조군으로서 피브로넥틴(sigma, USA)으로 37℃에서 2 시간 동안 코팅하고, 2％ BSA/PBS으로 추가 1 시간 동안 블로킹하였다. 세포들을 트립신 처리하고 2 X 10⁴ 세포/웰의 수로 접종하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 웰을 세정한 후, 60㎕의 기질 용액 (3.75mM p-니트로페닐-N-아세틸 G-D-글라이코사미니드 [헥소사미니다아제 기질(hexosaminidase substrate)] 및 0.25％ Triton X-100을 포함하는 50 mM 시트레이트 버퍼(pH 5.0))를 첨가하였다. 효소 활성을 90㎕의 중지용액(5mM EDTA를 포함하는 50mM 글라이신 버퍼 (pH 10.4)) 블록킹하고 마이크로플레이트 리더(microplate reader) 550 (Biorad, CA, USA)내에서 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

인테그린 β3-과발현된 HEK293-T 세포 (HEK293-β3)와 DICAM-과발현된 CHO 세포와의 부착은 다음과 같이 평가하였다. CHO-벡터(CHO-V)의 세포 또는 CHO-DICAM (CHO-D #1, 2, 3) 세포를 2 X 10⁴ 세포의 농도로 96웰 배양 플레이트내에서 접종하고 2일간 배양하여 100％ 컨플루언트 단일층을 얻었다. HEK293-β3 세포들을 트립신 처리하고 세포수를 측정한 후 세포 라벨링 키트(Invitrogen, USA)로 형광 라벨링하였다. 라벨링된 HEK293-β3 세포(2 X 10⁴ 세포)를 배양된 CHO-벡터 세포 또는 CHO-DICAM 세포에 첨가하고, 두 가지의 세포들이 10 내지 15 분간 접촉하도록 하였다. 부착되지 않은 세포들을 버리고 부착된 세포를 계수하였다. 블로킹 분석(blocking assay)을 위해서, 다양한 인테그린에 대한 항체를 세포와 함께 상온에서 30분간 프리-인큐베이션(pre-incubation)하고 상술한 바와 같은 부착 분석(adhesion assay)를 실시하였다.

실험 결과

DICAM 은 Ig 수퍼패밀리에 속하고 JAM 패밀리와 상동성을 갖는다.

DICAM은 차감된 지방세포 라이브러리에서 ASP3 (adipocyte specific protein 3; 지방세포 특이적 단백질 3)로 최초 확인되었다(Tsuruga, 2001). 본 발명자들은 HCS-2/8 인간 연골세포 라이브러리에서 DICAM을 확인하였다(Jung et al., 2004). 인간 및 마우스 DICAM은 염색체 1p36 및 염색체 4 (83.0cM)에 각각 위치하고, 10 엑손으로 구성되어 있다(도 1a 참조). 인간 및 마우스 DICAM의 mRNA 길이는 각각 2,290 및 2,192 염기쌍이고 공통적으로 442 아미노산을 코딩한다. 인간 및 마우스 DICAM의 서열은 높은 정도로 보존되어 있고 서로 78.1％의 동일성과 84.2％의 유사성을 나타낸다(데이터 제시하지 않음). DICAM은 하나의 시그널 펩타이드, 세포외부 영역에서 2개의 v-타입 Ig-유사 도메인, 1개의 트랜스막(transmembrane) 영역 및 비교적 짧은 80 아미노산의 세포질 테일(tail)로 구성되어 있다(도 1b 참조). DICAM은 아미노산 118 및 305에서 2개의 잠재적 N-글라이코실레이션 자리(NX(S/T), X는 P가 아님)와 아미노산 302, 307, 310, 311, 318 및 320 위치에서 6개의 잠재적 O-글리코실레이션 자리를 갖는다. 또한 세린 324 위치에 잠재적 PKC-μ 결합 자리를 가진다(도 1c 참조). 이러한 DICAM의 서열 및 구조적 특징은 Ig 수퍼패밀리에 속하는 CTX 단백질 패밀리와 유사하다. 또한, 다중-정렬(multi-alignment)에 기초한 계통발생학적 분석(phylogenetic analysis)에 의해 DICAM이 단백질의 JAM 그룹에 대해 더욱 큰 상동성을 갖는 이러한 패밀리의 새로운 일원임을 확인하였다(도 2).

DICAM 은 다양한 조직 및 세포에서 발현되었다.

DICAM mRNA의 발현을 체크하기 위해 다양한 마우스 조직내에서 다중-조직 노던 블롯 분석을 수행하였다. 1kb 마우스 DICAM cDNA에 대응하는 프로브를 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. 도 3a에서 보여지는 바와 같이 오직 하나의 mRNA 밴드가 18s 및 28s 리보좀 RNA에서 검출되었고 이의 크기는 약 2.2 kbp인 것으로 예측되었다. DICAM mRNA는 어느 조직에서나 발현되었는데, 특히 폐, 신장, 심장 및 배아 전체에서 높게 발현되었고 간에서 비교적 낮게 발현되었다(도 3a). DICAM의 mRNA 발현과 단백질 수준의 대응성을 평가하기 위해 N-말단 부위로부터 DICAM의 129 아미노산를 인지하는 항체를 제조하였다. 이 항체의 특이도를 테스트하기 위해 웨스턴 블롯팅 분석을 DICAM 과발현된 CHO 세포내에서 수행하였다. pcDNA-3.1-myc/his-C-DICAM으로 일시적으로 형질전환시킨 후에 CHO 세포로부터 얻은 총 세포 용해물내에서 약 60kDa 및 70kDa의 DICAM의 2개의 밴드를 검출하였다. 이중밴드가 DICAM 폴리클로날 항체에 의해 검출되었고, 이는 동일한 세포 용해물에 대해서 상업적 모노클로날 항-myc 항체를 사용하여 추가 확인하였다(도 3b). 대조군 벡터(pcDNA-3.1-myc/his-C)로 형질전환된 세포 또는 형질전환되지 않은 세포의 용해물내에서는 어떠한 시그널도 검출되지 않았다. 시그널 펩타이드 없는 DICAM의 예상되는 사이즈는 47 kDa이다. 따라서 DICAM의 이중 밴드는 번역후 변형(posttranslational modification)에 기인한 것이고 이는 번역후 변형인지를 추가적으로 연구할 필요가 있다. 다양한 조직내에서 DICAM의 발현을 결정하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 3a 및 도 3b에 나타나 있는 바와 같이, DICAM은 이의 mRNA 발현과 비교하여 상이한 크기 및 패턴으로 어느 조직에서든 발현되었다. 주요 밴드는 약 55 kDa의 밴드가 검출된 부갑상선(parathyroid gland, PTG)을 제외하고 대부분의 기관에서 약 70 kDa 이었다. 흥미롭게도, 이자(pancreas)는 주요 밴드로서 60kDa 밴드를 나타내었다(도 3c). 다양한 조직내에서 많은 상이한 크기의 DICAM이 존재한다는 것은 이것이 비특이적 시그널이 아니라면 이는 각 조직내에서 활동적인 번역후 프로세싱(posttranslational processing)을 암시하는 것이다. DICAM는 상피세포(MDCK 및 TM3), 내피세포(HUVEC), 단핵세포(THP1 및 RAW264.7) (도 3d) 및 MC3T3-E1 세포 및 ATDC5를 포함하는 뼈 세포를 포함하여 다양한 세포주에서 발현된다(데이타 제시하지 않음). MDCK, RAW264.7 및 TM3 세포의 경우에, DICAM는 상이한 크기의 분자량을 갖는 2개 또는 3개의 밴드로서 검출되었다. 다양한 조직에서 검출된 바와 같이, 이들 세포주는 상이한 분자량의 DICAM이 검출되었다. 상이한 크기의 밴드들이 검출되는 이유에 대해서는 현재 해결되어 있지 않다. 그러나 택일적 스플라이싱(alternative splicing) 또는 번역후 변형에 기인한 많은 이소형태일 수 있다. 실제로, DICAM은 상술한 바와 같이 2개의 N-글리코실레이션 자리 및 6개의 O-글리코실레이션 자리를 갖고 있다(도 1c). 따라서, DICAM은 JAM 패밀리 일원과 유사하게 당단백질일 수 있다.

DICAM의 발현에 대한 글로벌 탐색을 수행하기 위해서 NCBI 마우스 EST 데이터베이스내에 등록된 DICAM ESTs을 검색하였다. 다양한 라이브러리내에서 총 213개의 DICAM ESTs(E-value＜e-8)를 발견하였다. 배아(embryo) 라이브러리내에서 총 21개의 ESTs가 발견되어 가장 높은 빈도를 보였고, 차례로 뇌(18 ESTs), 유선(12 ESTs) 및 신장(11 ESTs) 라이브러리의 순의 빈도로 발견되었다. 세포 타입에 의해 검색한 경우에, 활액 섬유아세포(synovial fibroblast)라이브러리가 11 ESTs로서 가장 높은 빈도를 기록하였다. 흥미롭게도, DICAM는 파골세포(osteoclast)유사 세포 라이브러리에서도 발견되었다. 마우스 DICAM의 EST 서열 검색에서 총 11 종류의 택일적 스플라이싱 형태를 발견하였다(데이터 제시하지 않음). DICAM ESTs는 높은 빈도로 배아(embryo) 라이브러리의 E13.5 내지 E14.5 일로부터 검출되었다. 일반적으로 배아 발달의 전체 기간을 통해 이들을 검출할 수 있었다(표 1). 이들을 종합하면, DICAM은 어디에서나 발현되고 단백질 수준에서 활동적으로 프로세싱되어 다양한 크기의 단백질을 보여준다는 것을 알 수 있었다.

다양한 기관에서의 DICAM 발현의 면역조직화학적 분석

간을 제외하고 DICAM mRNA가 높게 발현되는 조직인 폐, 심장, 간, 신장 및 소장과 같은 다양한 마우스 기관의 단일 세포 수준에서의 내재성 DICAM 발현을 측정하였다(도 3a). 각 조직은 4주령 마우스로부터 얻었고 4％ 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)에서 1일간 고정하고 파라핀에 봉입하였다. 폐에서, DICAM은 기관지(bronchus) 상피세포에서 특이적으로 발현되었으나 폐포에서는 발현되지 않았다(도 4의 패널 A). 심장에서 DICAM은 개재판(intercalated disc)에서 포지티브 염색으로 검출되었고(도 4의 패널 B), DICAM은 간의 간세포의 접촉부위에서 약하게 염색되었다(도 4의 패널 C). 흥미롭게도, 이자(pancreas)에서 DICAM은 은밀 한 글루카곤으로 알려진 랑게르한스(Langerhans)의 섬(islet)의 F-세포에서 특이적으로 검출되었다(도 4의 패널D). DICAM는 신장내의 인접 소용돌이형 세관(proximal convoluted tubule)의 브러쉬 경계(도 4-E)와 소장의 상피(도 4-F)에서 포지티브하게 검출되었다. 이러한 결과들은 DICAM이 다양한 기관의 상피세포에서 높은 수준으로 발현된다는 것을 나타낸다.

배양된 상피세포에서의 DICAM의 국재화(localization)

DICAM의 세포내에서의 국재화(localization)를 검사하기 위해 인 시투 면역형광염색을 수행하였다. JAM 패밀리 단백질은 연결 복합체 영역(junctional complex region)에서 검출되고 백혈구의 접합적 집합(junctional assembly), 안정화(stabilization), 이동(transmigration) 등에서 기능을 담당한다(Bazzoni, 2003). 따라서, DICAM의 기능이 JAM 패밀리 단백질들과 유사할 수 있다는 것이 강조된다. 세포 접합 복합체의 연구를 위해 일반적으로 사용되어왔고 그 특성이 잘 연구되어 있기 때문에 DICAM의 세포내의 위치를 검출하기 위해 면역형광 염색용으로 MDCK 세포를 선택하였다. MDCK세포내에서의 DICAM의 내재적 발현은 도 3-D에서 나타내었다. MDCK 세포의 컨플루언트 단일층에서, DICAM은 핵 및 세포-세포 접촉 부위에서 관찰되었다(도 5a). 핵내에서 DICAM의 발현이 예기치 않은 것이지만 세포-세포 접촉 영역내에서의 DICAM 발현의 특성을 연구하는데 초점을 맞추었다. DICAM이 밀착연접에 위치하는 지를 테스트하기 위해서, 특성이 잘 연구된 밀착 연접 단백질 ZO-1과 DICAM의 공동 국재화를 측정하였다(Stevenson and Goodenough, 1984), (Stevenson et al., 1986). ZO-1는 배양된 MDCK 세포내의 밀착 연접을 나타내는 세포 가장자리에 명확하게 위치하여 있었다. 실제로, DICAM은 내재성 발현 환경하에서 Z0-1과 공동으로 위치하고 있었다(도 5a). 세포-세포 연접 영역내에서 DICAM의 위치는 MDCK 세포내에서 myc-tag된 DICAM으로 일시적 형질전환한 후에 인 시투 면역형광 염색에 의해 확인하였다(도 5b). 이러한 결과는 DICAM가 밀착 연접 복합체의 구성요소중의 하나일 수 있다는 것을 나타낸다.

DICAM는 세포간(intercellular)이 아닌 세포내(intracellular) 동형 상호작용( homophilic interaction )을 나타낸다.

많은 세포 부착 단백질들은 동형(homophilic) 또는 이형(heterophilic)의 상호작용을 통해 기능을 하기 때문에, DICAM의 시스(cis)- 또는 트랜스(trans)- 동형 상호작용을 테스트하였다. DICAM 발현 CHO 세포들은 절단되지 않는 막-불투과성 가교 링커 BS³으로 처리하고 DICAM의 이량체화 형성을 측정하였다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, 세포들을 BS³으로 처리한 경우에 DICAM의 단량체 및 이량체 형태가 검출되었다. 그러나 BS³의 부존재의 경우에 DICAM의 오직 하나의 밴드가 검출되었다. 이러한 결과는 상이한 폴리클로날 DICAM 및 myc-tag 폴리클로날 항체를 사용한 2개의 상이한 실험하에서도 동일하였다.

다음에 DICAM 안정 세포주를 사용하여 DICAM의 동형 상호작용을 측정하였다. 세포 응집 분석에서, 트랜스-동형 상호작용의 어떠한 증거도 얻지 못하였다(데이터 제시하지 않음). 따라서, DICAM이 인접하는 세포들 사이의 트랜스-동형 상호작용이 아니라 시스-동형 방식(이량체의 형성)으로 상호작용한다는 결론을 얻었다.

DICAM 은 이형 상호작용( heterophilic interaction )을 통해 세포 부착을 증가시킨다.

DICAM은 다양한 조직내의 상피세포와, 인 비트로 세포 배양 시스템에서 세포-세포 접촉 부위에서 발현되었다. DICAM의 기능중 하나의 기능은 세포 부착일 수 있다. DICAM의 세포부착 기능을 테스트하기 위해, 96-웰 플레이트를 재조합 DICAM으로 코팅하였다. 피브로넥틴(fibronectin) 및 2％ BSA를 각각 포지티브 및 네가티브 대조군으로 사용하였다. 코팅된 96-웰 플레이트상에 MDCK 세포를 접종한 후, 부착성 세포를 상기 실험방법에서 설명한 바와 같이 평가하였다. 재조합 DICAM의 부착 기능은 피브로넥틴의 약 60％이었다(도 7의 패널 A). 이러한 결과는 DICAM의 세포외 도메인이 세포 부착 기능을 가지며 이의 재조합 단백질은 기능적으로 활성이라는 것을 나타낸다.

다음으로, 몇몇의 JAM 패밀리는 인테그린(integrin)에 결합할 수 있기 때문에(Bazzoni, 2003), 인테그린이 MDCK 세포내에서 DICAM 매개 세포 부착에 관련되어 있는 지를 검사하였다. MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포는 α2β1, α3β1, αvβ3, α6β4 및 β1과 결합할 수 있는 다른 가능한 인테그린 α서브유닛(Schoenenberger et al., 1994)을 포함하여 다양한 인테그린을 발현한다. 이러한 인테그린 발현 프로파일에 기초하여, 기능적 블로킹 연구를 수행하기 위해 α2, α 5, αv, β1, α2β1, α5β1 인테그린을 포함하는 다양한 항-인테그린 항체를 선택하였다. 각 인테그린 항체로 블로킹 실험을 행함으로써 αvβ3 인테그린이 DICAM과 상호작용한다는 것을 발견하였다. 즉, αvβ3 항체 또는 αv 항체가 존재하는 경우에 항체는 세포 부착을 거의 완전히 블로킹하였다(도 7의 패널 B). 정상 IgG는 MDCK 세포에서 세포 부착에 대해 아무런 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 DICAM 매개 세포 부착이 αvβ3 인테그린의 결합에 기인한다는 것을 암시한다.

DICAM 의 αvβ 3와의 상호작용은 RGD 모티프 독립적이었다.

DICAM의 어느 부분이 세포 부착 특성에 관련되어 있는지를 검사하기 위해 세포 부착과 관련된 DICAM 세포외 부분을 절단하여 상세히 분석하였다. DICAM의 세포외 영역의 재조합 단백질을 제조하였다. 재조합 단백질은 트랜스막 영역으로부터 N-말단에서의 Ig 도메인 1 (D-N1), Ig 도메인 2 (D-N2) 및 양쪽 Ig 도메인들을 포함하는 것(D-Ecto)이었다. 각각의 재조합 단백질의 RGE로서 RGE 돌연변이를 제조하였다(도 7의 패널 C).

첫째, 어떠한 Ig 도메인이 세포 부착 활성에 관련되어 있는지를 측정하였다. 각 DICAM 재조합 단백질을 사용하여 MDCK 세포로 세포 부착 분석을 수행하였다. D-Ecto는 세포 부착을 증가시켰는데, 이는 피브로넥틴의 약 60％ 수준이었다. (도 7의 패널 D). 흥미롭게도, D-N2에 의한 세포 부착은 D-Ecto와 유사하거나 이 보다 우수한 부착 활성을 보였다. 그러나, D-Ecto의 다른 한쪽 절반 도메인인 D-N1은 D-N2의 절반 수준이었다(도 7의 패널 D). 이는 D-N1 및 D-N2 사이의 2개의 높은 상동 성 도메인이 존재하여도 이 도메인이 상이한 세포 부착 능력을 갖는다는 것을 의미한다. 다음으로 각 Ig 도메인에서의 RGD 서열이 세포 부착에 관련되는지 여부를 확인하였다. D-N1 및 이의 RGE 돌연변이는 차이를 나타내지 않았다. 그러나, D-N2 변이체는 D-N2 야생형에 비해 약 50％ 정도 세포 부착이 감소하였다. 이러한 결과는 D-Ecto N2 변이체와 유사한 것이었다. 이는 D-N2 RGD가 세포 부착에 중요하다는 것을 나타낸다.

마지막으로, 이러한 RGD 돌연변이에 의해 αvβ3 매개 세포 부착에 영향을 미칠 수 있는지를 측정하였다. 재조합 야생형 또는 변이체 단백질 매개 세포 부착이 αvβ3 항체에 의해 기능적으로 블로킹되었다(도 7의 패널 D). 이는 DICAM의 αvβ3과의 상호작용 도메인이 RGD 독립적이라는 것을 암시한다.

세포와 세포간 부착 분석에서 DICAM 및 αvβ3 사이의 직접 상호작용

DICAM 매개된 세포 부착이 αvβ3와의 직접적인 상호작용에 부분적으로 기인한 것인지를 결정하기 위해 세포와 세포 사이의 상호작용 분석을 수행하였다. 상이한 발현수준을 갖는 DICAM-과발현된 CHO 세포(CHO-D#1, 2, 3)와 αv 인테그린을 내재적으로 발현하는 인테그린 β3-과발현된 HEK293-T 세포(HEK293-β3 세포)를 모두 제조하였다. 각각의 안정된 세포주에서의 DICAM 및 β3의 발현은 각각 myc-tag 항체 및 β3 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅 분석에 의해 확인하였다(도 8의 패널 A 및 B). CHO-D 세포는 컨플루언트까지 배양하고 그 위에 HEK293-β3 세포들을 접종하였다. 인서트 없는 벡터(CHO-V)를 가진 안정한 세포를 대조군으로 사용하였다. HEK293-β3를 CHO-V 또는 CHO-DICAM #1, 2, 3에 10 분간 부착시킨 후, 비부착성 세포들을 버리고 부착성 세포들을 계수하였다. 도 8에서 보여지는 바와 같이, 유지된 HEK293 세포들의 수는 DICAM 발현의 수준과 상관관계를 이루었다. 가장 높은 정도로 DICAM-발현된 CHO 세포(CHO-D#3)는 β3-과발현된 HEK293-T 세포에 대해 가장 높은 부착 활성을 보였다(도 8의 패널 C, D). 이러한 실험결과와 일관되게, DICAM이 낮은 수준으로 발현된 세포들은 HEK293-β3 세포를 낮은 정도로 보유하였다. 이러한 결과는 DICAM이 인테그린 αvβ3와 직접 상호작용하며 DICAM 매개 세포 부착 결과를 가져온다는 것을 강하게 암시하는 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1a - 도 1c은 마우스 DICAM의 서열분석을 보여준다.

도 1a는 DICAM의 지놈 구조를 보여준다. 각 숫자는 뉴클레오타이드의 수를 나타낸다. DICAM은 마우스 염색체 4에서 10개의 엑손(exon)으로 구성되어 있다.

도 1b는 DICAM의 1차 단백질 구조를 보여준다. 각 숫자는 아미노산 잔기의 수를 나타낸다. DICAM은 하나의 시그널 펩타이드(SP), 2개의 v-타입 면역글로블린 도메인(v-type Ig domain I & II), 하나의 트랜스막 영역(TM) 및 비교적 짧은 세포질 테일(tail)을 가진 442 아미노산으로 구성되어 있다.

도 1c는 DICAM의 아미노산 서열이다. 시그널 펩타이드는 빨간색으로 표시되어 있다. V-타입 Ig 도메인(v-type Ig domain I) 및 2차 Ig 도메인 (v-type Ig domain II)은 녹색 및 밝은 녹색 및 트랜스막 영역은 파란색으로 표시하였다. 밑줄은 각 Ig 도메인에서 시스테인 잔기를 나타낸다. 추정의 O-글리코실레이션 및 N-글리코실레이션 자리는 각각 백색 및 흑색 사각형점으로 표시하였다. 별표는 추정의 PCK-μ 결합 자리를 나타내고 RGD 모티프는 직사각형으로 표시하였다. 괄호안의 각 숫자는 아미노산의 수를 나타낸다.

도 2a 및 도 2b는 마우스 DICAM 및 마우스 CTX 패밀리의 다른 일원(member)의 아미노산 서열의 다중 서열 정렬을 나타낸다. 도 2a의 다중정렬은 CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)로 시행한 결과이다. 동일한 잔기는 수직축과 동일한 색깔에 의해 표시하였다. 오른쪽의 수는 각 단백질의 아미노산 수를 나타낸다. 도 2b는 DICAM과 CTX 패밀리내의 다른 마우스 상동체 사이의 연관성을 보여주는 계통발생학적 나무를 나타낸다. CTX 패밀리 단백질은 세 개의 그룹 CTX, JAM 및 CAR 그룹으로 분류된다. DICAM는 다른 두 개의 그룹 보다 JAM 그룹 단백질고 더 많은 상동성을 갖는다.

도 3a 내지 도 3d는 다양한 조직 및 세포주에서 마우스 DICAM의 발현을 나타낸다. 도 3a는 마우스 DICAM의 다수 조직에서의 노던 블롯 분석이다. 18S 및 28S 화살표는 대응하는 rRNAs를 나타낸다. 도 3b는 제조된 폴리클로날 항-마우스 DICAM 항체의 특이도를 나타낸다. 세포용해물을 DICAM-myc, 인서트 없는 벡터 및 형질전환되지 않은 CHO 세포로부터 얻었다. 항-마우스 폴리클로날 DICAM 항체(왼쪽 패널)의 특이도를 모노클로날 항-myc 항체(오른쪽 패널)로 검증하였다. 도 3c 및 도 3d는 다양한 조직 및 세포주에서의 DICAM의 단백질 발현수준을 나타낸다. 총 11개의 마우스 조직(도 3c) 및 상피세포(MDCK, TM3), 내피세포(HUVEC) 및 단핵세포(THP1 및 RAW264.7 세포)(도 3d)를 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 폴리클로날 항-마우스 DICAM 항체(1:2000)를 본 분석에 사용하였다. 분자량(kDa)은 각 웨스턴 블롯 분석에서 왼쪽에 나타내었다. G-액틴을 내부 대조군으로 사용하였다.

도 4는 다양한 마우스 조직내에서 마우스 DICAM 발현의 면역조직화학적 분석으로 나타낸다. 다양한 조직을 4주령의 마우스로부터 분리하고, 4％ PFA에서 고정시키고 파라핀으로 봉입하였다. 폐(A), 심장(B), 간(C), 이자(D), 신장(E) 및 소장(F)으로부터의 섹션을 폴리클로날 항-마우스 DICAM 항체로 염색하였다. 화살표는 동일한 위치를 표시하고 각 사진에서 포지티브 염색을 표시한다.

A; 폐포, B; 폐의 기관지, ID; 심장의 개재판(intercalated disc), V; 말단 간세포 세정맥(venule), H; 간의 간세포(hepatocyte), 이자의 랑게르한스 섬의 α 세포 및 β 세포, PCT; 근위세뇨관(proximal convoluted tubule), BB; 신장에서의 브러시 보더(brush border), V; 융모, E; 소장의 상피. 확대비율 X 400.

도 5a 및 도 5b는 배양된 MDCK 세포에서 외인성- 및 내재성 DICAM 발현의 세포내 위치를 보여준다. 밀집하게 배양된 MDCK 세포의 단일층을 4％ PFA으로 고정시키고 0.25％(V/V) Triton X-100으로 침투시키고 폴리클로날 항-DICAM (녹색) 및 항-ZO-1 (빨간색) 항체로 염색하였다(도 5a). DICAM-형질전환된 MDCK 세포를 배양하고 myc-tag 항체로 염색시켰다(도 5b). 각 항체로 염색시킨 후 핵을 DAPI으로 대비 염색시키고 병합한 이미지를 만들었다. 확대비율 X400.

도 6은 DICAM의 cis-동종 상호작용을 보여준다. DICAM- 또는 벡터-형질전환된 CHO 세포들을 트립신으로 처리하고 BS³ 없이 또는 BS³ 와 함께 인큐베이션하였다. 이량체화는 폴리클로날 항-DICAM 항체 및 모노클로날 항-myc 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다.

도 7은 재조합 DICAM 단백질에 대한 세포 부착(cell adhesion)을 보여준다.

패널 A : 2％ BSA, 피브로넥틴 및 재조합 DICAM 단백질을 96 웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 MDCK 세포들을 접종하였다. 약 1 시간 후에 비-부착 세포들을 버리고 생존 세포들을 실험방법에서 기술한 방법과 같이 측정하였다.

패널 B : 기능적 블로킹 분석. DICAM과 다른 인테그린과의 상호작용을 확인 하기 위해, MDCK 세포의 재조합 DICAM 단백질에 대한 부착을 몇 개의 인테그린 항체로 블로킹하였다.

패널 C : 정제한 재조함 DICAM 단백질의 모식도. 실험방법에서 기술한 방법과 같이 7개의 상이한 재조합 단백질을 제조하였다. 모든 재조합 단백질들은 정제를 위해 6x His tag를 포함시켰다. 별표는 각 도메인에서 RGD 모티프의 RGE 변이를 표시한다.

패널 D : DICAM의 세포 부착 특성에서 관여하는 도메인을 결정하기 위해, 분리된 두 개의 Ig 도메인으로 DICAM의 재조합 단백질을 제조하였다. DICAM과 αvβ3와의 상호작용을 확인하기 위해, DICAM의 RGD 모티프를 RGE로 변이시키고 부착 분석 및 αvβ3 블로킹 분석을 실시하였다. D-N1 및 D-N2은 N-말단으로부터 말단 Ig 도메인과 인접 Ig 도메인을 포함하는 DICAM의 재조합 단백질을 각각 표시한다. D-ecto는 2개의 세포외부 Ig 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 표시한다. Mut은 각 Ig 도메인에서 RGD 모티프가 RGE 서열로 변화된 것을 표시하였다. 단백질에 대한 세포의 부착은 405nm 에서의 흡광도를 측정한 후에 피브로넥틴에 대한 ％ 값으로 표시하였다. 데이터는 평균±S.D.(n=5)이다. 유사한 결과를 3회의 독립적인 실험에 의해 얻었다.

도 8은 각각 안정되게 형질전환된 세포에서 DICAM과 β3와의 직접 상호작용을 나타낸다.

패널 A : CHO-DICAM 안정된 세포주에서 DICAM의 발현수준을 myc-tag 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 테스트하였다. 안정하게 형질전환된 CHO 세포 (CHO-D #1, 2, 3)에서 DICAM 발현은 낮은 수준으로부터 높은 수준의 벡터-형질전환된 CHO 세포로 랭크되었다. 대조군 벡터 세포(CHO-V)는 검출되지 않았다.

패널 B : HEK293-G3 안정화된 세포에서 β3 발현의 검출은 β3 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 테스트하였다. β3 단백질은 HEK293-G3 안정화된 세포내에서 검출되었으나, HEK293-T 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다.

패널 C 및 D : 형광 염색제 라벨링된 HEK293-G3 세포들을 밀도있게 배양된 CHO-V 및 CHO-D 안정된 세포주에 대해 첨가하고 10 분간 인큐베이션하였다. CHO 세포에 대해 비부착성 HEK293-G3 세포를 배지로 세정하여 버리고, 나머지 세포들에 대해 사진을 촬영하고(C) 형광 현미경상에서 카운팅하였다(D). 데이터는 평균±S.D. (n=5)이었다. 유사한 결과를 3회 별개의 실험으로부터 얻었다.

<110> Kyungpook National University <120> Method for screening materials that inhibit the signal transduction via alpha v beta 3 integrin by prohibiting the interaction between DICAM and alpha v beta 3 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 442 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Leu Leu Ser Arg Val Leu Leu Trp Lys Leu Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Ser Ala Val Leu Ser Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ala Ala Ala Ser 20 25 30 Asn Ser Leu Val Ser Glu Ser Val Val Ser Leu Ala Ala Gly Thr Gln 35 40 45 Ala Val Leu Arg Cys Gln Ser Pro Arg Met Val Trp Thr Gln Asp Arg 50 55 60 Leu His Asp Arg Gln Arg Val Val His Trp Asp Leu Ser Gly Gly Pro 65 70 75 80 Gly Ser Gln Arg Arg Arg Leu Val Asp Met Tyr Ser Ala Gly Glu Gln 85 90 95 Arg Val Tyr Glu Pro Arg Asp Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ser Pro Ser 100 105 110 Ala Phe His Asp Gly Asn Phe Ser Leu Leu Ile Arg Ala Val Glu Arg 115 120 125 Gly Asp Glu Gly Val Tyr Thr Cys Asn Leu His His His Tyr Cys His 130 135 140 Leu Asp Glu Ser Leu Ala Val Arg Leu Glu Val Thr Glu Asp Pro Leu 145 150 155 160 Leu Ser Arg Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Lys Glu Val Leu Val Val Ala 165 170 175 His Gly Ala Pro Ala Leu Met Thr Cys Ile Asn Arg Ala His Val Trp 180 185 190 Thr Asp Arg His Leu Glu Glu Ala Gln Gln Val Val His Trp Asp Arg 195 200 205 Gln Leu Pro Gly Val Ser His Asp Arg Ala Asp Arg Leu Leu Asp Leu 210 215 220 Tyr Ala Ser Gly Glu Arg Arg Ala Tyr Gly Pro Pro Phe Leu Arg Asp 225 230 235 240 Arg Val Ser Val Asn Thr Asn Ala Phe Ala Arg Gly Asp Phe Ser Leu 245 250 255 Arg Ile Asp Glu Leu Glu Arg Ala Asp Glu Gly Ile Tyr Ser Cys His 260 265 270 Leu His His His Tyr Cys Gly Leu His Glu Arg Arg Val Phe His Leu 275 280 285 Gln Val Thr Glu Pro Ala Phe Glu Pro Pro Ala Arg Ala Ser Pro Gly 290 295 300 Asn Gly Ser Gly His Ser Ser Ala Pro Ser Pro Asp Pro Thr Leu Thr 305 310 315 320 Arg Gly His Ser Ile Ile Asn Val Ile Val Pro Glu Asp His Thr His 325 330 335 Phe Phe Gln Gln Leu Gly Tyr Val Leu Ala Thr Leu Leu Leu Phe Ile 340 345 350 Leu Leu Leu Ile Thr Val Val Leu Ala Thr Arg His Arg His Ser Gly 355 360 365 Gly Cys Lys Thr Ser Asp Lys Lys Ala Gly Lys Ser Lys Gly Lys Asp 370 375 380 Val Asn Met Val Glu Phe Ala Val Ala Thr Arg Asp Gln Ala Pro Tyr 385 390 395 400 Arg Thr Glu Asp Ile Gln Leu Asp Tyr Lys Asn Asn Ile Leu Lys Glu 405 410 415 Arg Ala Glu Leu Ala His Ser Pro Leu Pro Ala Lys Asp Val Asp Leu 420 425 430 Asp Lys Glu Phe Arg Lys Glu Tyr Cys Lys 435 440 <210> 2 <211> 2192 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gggtgctggc agggagaggg ggtcggctgt ttttctggag agttagagct gagtaagaca 60 aagcacgtcc cccgcaggcg ccatggaact gctgtcccgt gtcctgctgt ggaaactgct 120 gcttcttcag agctctgcag tcctgtcctc agggccttca gggaccgcag cagccagcaa 180 ctctctggtg tctgagtctg tggtgagctt ggcagccgga acccaggctg tgctacgctg 240 ccagagcccc cgcatggtgt ggacccaaga ccggctgcat gatcgccagc gcgtggtcca 300 ctgggacctc agcgggggcc cgggcagcca acggcgccga cttgtggata tgtattcggc 360 gggtgaacag cgcgtgtacg agccgcgcga tcgcgaccgc ctcctgctgt cgccttctgc 420 tttccacgac ggcaacttct cgctgctcat tcgcgctgtg gagagaggcg atgaaggggt 480 gtacacctgc aacctgcacc atcactactg ccacctcgat gagagcctgg ctgtgcgcct 540 cgaggttaca gaggatcccc tattaagtcg cgcatactgg gacggtgaga aggaagtgtt 600 ggtggtggcc catggcgcgc cggcactgat gacctgcatc aaccgtgcgc acgtgtggac 660 tgaccgccat ttagaggagg cgcagcaggt ggtccattgg gaccgacagc tacctggagt 720 gtcacacgac cgcgccgacc gcctgcttga cctgtatgca tctggcgagc gccgcgccta 780 tgggccgccc ttcctgcgtg atcgcgtgtc agtgaacacc aacgcttttg cacgcggtga 840 cttctcccta cgcatcgatg agctggagcg agctgatgag ggcatctatt cctgccacct 900 gcaccatcac tactgtggcc tccacgagcg ccgagtcttc cacctacagg tcacagagcc 960 tgcctttgag ccaccagctc gtgcttctcc tggcaatggg tctggtcaca gcagtgctcc 1020 tagcccagat cccaccctga cccgaggcca cagcatcatc aatgtcattg tcccagagga 1080 ccacacacat ttcttccagc aactgggcta cgtgttggcc acgctgctgc tcttcatctt 1140 gctgctcatc actgtagtcc tggctacacg acatcgtcac agcggaggat gcaagacgtc 1200 ggacaaaaaa gctgggaagt caaaggggaa ggatgtgaac atggtggagt ttgctgtagc 1260 cacaagggat caggctccat ataggactga ggacatccag ctagattaca aaaacaacat 1320 cctgaaggag agggctgagc tggcccatag tcctctgcct gccaaggatg tggatctgga 1380 taaagagttc aggaaggagt actgcaaata aatggaccct gagcttctgg ctgggccagc 1440 agctctgtat caaaggacat ctccctgacc ctcctgcggt attcctggct cttctcagcg 1500 gctggtccga cttacctaga aacttggcct aaacttggca gagcagctgc ctgtactttg 1560 cccttcctag aatcgccacc cctcatcttg gtgagcaact gtgggttccc tagagactct 1620 ggtatagtac gattgctgcc cttcagtcac ctgtgcccac tgatggtcgt acccccaact 1680 taaacacaac aaagatccct tgttaatatc caccaaatgc aaagtccctc gtggcctctt 1740 actgctaggg tcaggaagac acttaaaaat tccaggtaag actccctagc caccagttaa 1800 acacattagc cattgtcctg ggggggggtc ttcctgagct gcatcgtgcc tgtgtactgc 1860 tcagagccct gctgttatag gttctgactc atgggcccgc cttgctgctt tgggcaactt 1920 gaggctagcc cagggccctt tctctgcttc tgattccttt ctgcccaatg cctcccaaga 1980 gctacaccag cagttactgg gtaccgtatg acccttggcc ttgacatccc tccctaggct 2040 ggagtctggg gttggggccc catttgtcct ctgttttggc tgaagatggg gtgaagattt 2100 ggctgagtgg cctatgctgt cacatcaaac agctatcatt tactcctact tgggaagttt 2160 tcatgtgaca ataaaagata catctgactt tt 2192 <210> 3 <211> 1044 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Ala Ala Pro Gly Arg Leu Leu Leu Arg Pro Arg Pro Gly Gly Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Gly Leu Leu Leu Pro Leu Ala Asp Ala Phe Asn 20 25 30 Leu Asp Val Glu Ser Pro Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Glu Gly Ser Tyr 35 40 45 Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Glu Pro Ser Thr Ser Ser Arg Met 50 55 60 Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile 65 70 75 80 Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Glu Cys Ser Ser Ser Arg Arg 85 90 95 Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ser Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys 100 105 110 Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val 115 120 125 Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp 130 135 140 Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu 145 150 155 160 Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Lys Asn 165 170 175 Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp 180 185 190 Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr 195 200 205 Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Ile Ser Lys 210 215 220 Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr 225 230 235 240 Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val 245 250 255 Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Glu Asp Phe Val Ser Gly 260 265 270 Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly 275 280 285 Lys Asn Met Ser Ser Leu His Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala 290 295 300 Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr 305 310 315 320 Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp 325 330 335 Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala 340 345 350 Val Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala 355 360 365 Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly 370 375 380 Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys 385 390 395 400 Gly Leu Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ser Val 405 410 415 Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Gln Ser Met Pro Pro 420 425 430 Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly 435 440 445 Tyr Pro Asp Leu Val Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Val Leu 450 455 460 Tyr Arg Ala Arg Pro Val Val Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr 465 470 475 480 Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Ile Cys Pro Leu Pro Gly Thr 485 490 495 Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp 500 505 510 Gly Lys Gly Thr Leu Pro Arg Lys Leu His Phe Gln Val Glu Leu Leu 515 520 525 Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu 530 535 540 His Asn Arg Ser Pro Val His Ser Lys Thr Met Thr Val Phe Arg Gly 545 550 555 560 Gly Gln Met Gln Cys Glu Glu Leu Val Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser 565 570 575 Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg 580 585 590 Leu Asp Gln Arg Thr Ala Ala Asp Ala Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu 595 600 605 Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Val Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu 610 615 620 Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val 625 630 635 640 Asn Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr 645 650 655 Leu Thr Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu 660 665 670 Leu Ile Val Ser Ile Pro Pro Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg 675 680 685 Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn 690 695 700 Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly 705 710 715 720 Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu 725 730 735 Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Lys Ile Gln Ser Ser Asn Ser 740 745 750 Phe Asp Asn Val Ser Pro Val Val Ser Tyr Lys Val Asp Leu Ala Val 755 760 765 Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe 770 775 780 Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu Tyr Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu 785 790 795 800 Asp Val Gly Pro Ile Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly 805 810 815 Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Ile Leu Asn Leu Gln Trp Pro Tyr Lys 820 825 830 Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly 835 840 845 Pro Met Asn Cys Thr Ala Asp Thr Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys 850 855 860 Thr Pro Glu Lys Asn Asp Thr Ala Ala Ala Gly Gln Gly Glu Arg Asn 865 870 875 880 His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Thr Leu Arg Glu Gly Asp Val His 885 890 895 Thr Leu Gly Cys Gly Ile Ala Lys Cys Leu Gln Ile Thr Cys Gln Val 900 905 910 Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr Val Lys Ser Leu 915 920 925 Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln Asn His Ser Tyr 930 935 940 Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Ile Ile Glu Phe Pro Tyr Lys 945 950 955 960 Asn Leu Pro Ile Glu Asp Leu Phe Asn Ser Thr Leu Val Thr Thr Asn 965 970 975 Ile Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val Pro Val Trp Val 980 985 990 Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Val 995 1000 1005 Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg Val Arg Pro Pro Gln 1010 1015 1020 Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu Asn Gly Glu Gly 1025 1030 1035 1040 Asn Ser Glu Thr <210> 4 <211> 7054 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 ttcggcgggg cggcccggcc tggccggctc ctcctcctcc ccggcctcct cccccagtcc 60 gggctgctca cggttccgag gtactgtgct cgccccgcca cttctcagcg ccaggcaccg 120 cgcgagccag cgacagagcc ggagtcccgg gtcggacacc gctcctcctg ggtgccgccc 180 ggctcagctt cgcgccgccc ggccgccccg ccgcccttga ccgcaagcgc acagcacagc 240 tcggcagttc gggggcgcgc aggcggcggg ccgcggccac cgagcaccgg gacagggact 300 gaagtctttc ggctctgcgc cccgcgcgcg ccccggcgat ggctgctccc gggcgcctgc 360 tgctacgccc tcgccccggc ggcctcctgc tgctgctgcc gggtctcctg ctgcccctcg 420 ccgacgcctt caacctggac gtcgaaagtc ccgccgagta tgcgggtccc gagggaagtt 480 acttcggatt cgccgtggac ttcttcgagc ccagcacgtc ctccaggatg tttctcctgg 540 tgggagcccc caaagcgaac acgacccagc ctgggattgt agaaggaggg caagttctca 600 aatgtgaatg ctcatccagc cgccggtgcc agcccattga gtttgattca acaggcaatc 660 gagattatgc caaagatgac ccactggagt ttaagtccca ccagtggttt ggagcctctg 720 tgaggtcaaa gcaggataaa 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ctcaaatcct cgaggggcag tgggctgctc 1620 agagcatgcc cccaagcttt ggctattcaa tgaagggagc tacagatgta gacaggaatg 1680 gatatccaga cttagttgta ggagcttttg gtgtggatcg agctgtctta tacagagcca 1740 gacccgttgt cactgtaaat gctggccttg aagtgtaccc tagcatttta aatcaagaca 1800 ataagatctg cccgttgcct gggacagctc tcaaggtttc ctgttttaat gtcagattct 1860 gcttaaaggc agatggcaag ggaacccttc ctcggaagct ccacttccag gtggagcttc 1920 tactggataa actcaagcag aagggagcca tccgacgagc actgtttctc cataacaggt 1980 ccccggtcca ctccaagacc atgactgttt tcaggggggg acagatgcag tgtgaggaac 2040 tggtcgccta tcttcgggat gaatctgaat ttagagacaa gctcactccc atcaccattt 2100 tcatggagta tcggttggac cagagaacgg ctgctgatgc cacaggcttg cagcccatcc 2160 tgaaccagtt cactccggcc aacgtcagtc ggcaggctca tattctactt gactgtggtg 2220 aagacaatgt ctgtaaacct aaattggaag tttctgtaaa tagtgatcaa aagaagatct 2280 atattgggga cgacaaccct ctgacactga ctgtgaaggc gcagaatcaa ggggaaggcg 2340 cctatgaagc tgagctcatc gtttctatcc caccgcaggc tgacttcatc ggggttgtcc 2400 ggaacaacga agccttagca agactgtcct gtgcatttaa gacagaaaac caaactcggc 2460 aggtggtgtg cgaccttgga aacccgatga aggctggaac tcaactgctc gctggtcttc 2520 gtttcagcgt gcaccagcag tcagagatgg atacttctgt gaagtttgac ttgaaaatcc 2580 agagctctaa ttcttttgac aatgtaagtc cagttgtgtc ttacaaggtt gacctcgccg 2640 ttttggctgc tgtggagata agaggagttt caagtccaga tcatatcttt cttccaattc 2700 caaattggga gtacaaggaa aaccctgaga ctgaagaaga cgttgggcct attgttcagc 2760 acatatatga gctgagaaac aatggtccaa gttcattcag caaggcaatt ctaaatctcc 2820 agtggcctta caaatacaac aacaacactc tgttgtacat tcttcattac gacattgacg 2880 ggccaatgaa ctgcacggca gatacagaga tcaacccttt gagaatcaag acacccgaaa 2940 agaatgacac agcggcggcg ggacagggag aaaggaatca tctcatcacc aagcgggatc 3000 tcaccctcag agagggagat gttcacactt tgggctgtgg aatcgccaag tgcttgcaga 3060 tcacctgcca ggttggtcga ctggatagag gcaagagcgc aatcctgtac gtgaaatccc 3120 tgctgtggac cgagacgttc atgaacaagg agaaccagaa ccattcctat tcgctgaagt 3180 catctgcttc ctttaatatc atagaattcc cttacaagaa cctgccgatc gaggatctct 3240 tcaactctac actagtcacc actaacatca cctggggcat tcagccggcg cccatgcctg 3300 tgcctgtgtg ggtgatcatc ttggcagttc tcgcagggct gctgctactg gctgtgttgg 3360 tatttgtaat gtacaggatg ggctttttca aacgtgtccg accacctcaa gaagagcaag 3420 aaagagaaca gcttcagcct catgagaatg gcgaaggaaa ctctgaaacc taaggtgctt 3480 cttaagtggc gccacttctg tccgctccaa gttcaccacc gtggtggtgg atttcaacat 3540 ctctcgtgaa cagtgaaatc ccaggactgt attgctgaga gcacccagca gtctcagttt 3600 atccacaaaa ttgaaatgga tatttgtcga cttctcttta tgaataagtt cagattacat 3660 ttacttcgcc tacactaacg tgtgttctta gggacttaag tgatggaatt tcaagtgatt 3720 atctttgttc agtgtacata agacagacag cactgagtca gcacgttaca tagcatagta 3780 cctcttcagt tactgttcct aattgactgt gtggggtttc tctcttcgac gttacgttag 3840 ggcaattagg attgtaaagc agttcaaatt tagaccatca gtaagtttgc acaggcactt 3900 agaacaggta cacattacac tacagttgac ttcataagct actgaagact ttgcaattgc 3960 atggacttag attttaatat catttacaca gtagaacttt taaataacac gataccatca 4020 aaattctttc ctgggactat agctcacttc gaagcgtgtg caactccctg ggttcaatcc 4080 tgcacactgg gaggaaaacc agcagtttcc tgtattaaca atggtacagt atttttatat 4140 gaaagttagg tttttattta tgtgtagtct gcattgtgtc ttattgtatt ttaacttttg 4200 taatttaaat tctacatcaa atcctttaag tcgtttcctg cagaaaattt tataattaaa 4260 aatacccgtt aagtaatagt gtggtctcag ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgact 4320 gaagcccgtg gagttggaag gggtttttga agtacatcta ttccctttgt ttggctgcct 4380 gcaatgtgga aaagccctgg agactctcca tgggtctcta ctctaactgc tcatcaaaaa 4440 gacattcttt aattggacca gagcgtttaa ttattagtaa tttattttcc tcctgtcctc 4500 atattttcct tccacttcca aaactgagaa tggctcaaga ccttcttcat aacctatagg 4560 aacctggatc tcgcgccctt accccacgag agatgcctgg gacccacatt ccaaaggtgg 4620 ctcatgggat ggtttctagc aatagcatgg tagaacctca ggttaagcaa ggtgatctat 4680 aaaacctgcc tccactgtca gaaagaatgc tacaaaggtg tttttgtaag cagttcttgt 4740 tccttaaacc ttctaactct gtcttacatt ttttaattta aattaccttt ctgggacttt 4800 aatagaggca gcagaggaag cacgggaccg tcttaagtgg tggtgattta ttcacagttc 4860 ctcaaggccc cgggataact atcaattata gctctatttt tgtgcaatta catcatgtta 4920 tgcattggaa gttgagaatt ttaatagctt tttaaaatgc tgtcctcatt aagcaatgaa 4980 aaatatttct cttaaataat tgaatatttt tctacatttt aaaagtaatt gaagtttgtc 5040 tcaccgtatc ttaggctaat tccatgtgca tatggatgag ctaatttgga gaatatattt 5100 tcataacatg aagcacattt atgtgagttg tacgaattag aatatagaca ggaccctata 5160 tttagcttta ataaaatttt aaattaatga gttctggctt gaaagatcat aatcatatat 5220 gcaataatta tttttttaaa ccaatacatt taaattcttt taagaaacat tttggtctta 5280 gggacaagtg tctctaagct acttaggact accacacagg tcactaagtt ggcctataca 5340 aacttttacc ttctttgtct gtcaacataa tagttgtcat tcctgaaaat caatgaaatt 5400 cattctttgt aaaaatcaat attgattttt acagttattc ctattatggc ttctatgcca 5460 aggaataact ttctgttaga gattgaaaga tatttgtaat tggaaattaa catgatgtag 5520 ttttcaacaa tagcatggat tttcttttaa aaaatataaa tttgtatctc tgtaaactta 5580 ggaactgtaa tttgagagtt aacactctga aaaaaatgtt gagatactct ttatcccata 5640 acagcatagg catgtagtca acaaaatagc aagagattat tttagattca tatttgtaat 5700 ttaccaataa ttaacattta tttctaagca taaaattttc ataatatagg ttaattaaag 5760 aaattgattg atccagagga catttgacac atgtgaggaa tattaacgtg gatactgatt 5820 tcttatagag atatttattt tagagttggt actttaaaac atctgtgtga gggttacttt 5880 cctcccttat gtttaattat catcataatt ctgattgtgt tctgaatgac tacggaaggt 5940 gaaacagtca aaatattgtc ttaaatctac ctgtattaca atattactta ttaatagtaa 6000 atcctcatga atacattatt tatataatga ggaaaatcac taagagcaga caagagtttg 6060 ttgccgcctt acgagaacag tgtgagtttc tgtagtgagt ctaaccccga ggagggaatt 6120 tagtggcaaa gtatatattg gtagagcaac tggttcttgt agggcaacag aaggccaagg 6180 tggcatccat ccccatttga gagaattctg gggagagcct caaggagaag gaaaggaagt 6240 tgttctagag tctctgtgtg tggccattgc ctatctctgt gtcaccttgt tcttactcgt 6300 ggctagcttg tacatttaat ttgatgagta aggggagatg accaaaatgt attatgggat 6360 ctaaaaagac aaatacaatt gcttgatgtc tagtaatttg taaaggtttc tttggacttg 6420 gtccttttat ttgaaccatg aacctgtggc tatgccatct gcagtataca ctggcattca 6480 ttataatttc tgatatgtca tggacttcct gtgaggtact gaatctttga attttgttgt 6540 cattgttctt aagtgcaata taacaatgta acgaaactta aatataagtc actatttagt 6600 aatcttaatc cgaaatttat tagtattttt ttgttagcag aaaagaacaa ctctgctgta 6660 gttgtagata tataggtgaa attttttgtt ttttgctttt tctttgcttt tttttttttg 6720 tttgtttgtt ttttttacct ctaaaccatc caatctgcat tttattttag gtggaagatg 6780 aactattcct taccagtttt aaaacacttt cagtatatta aggtaacttg gaagctgtgt 6840 gtatcaaatt cttttgctcg ctaagtaacc tggaagataa ttttttttgg cttctctcgt 6900 gatcacccac attgggtgag acataagatg agtctctcct gaaatctgtc atttgctaac 6960 ttgttttgag ttagtaaaag caggtaccat gttctgcttt gtttccagtg tgtaacttgt 7020 gactgtacaa taaacttgaa cgtgtggtgc cagc 7054 <210> 5 <211> 787 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Arg Ala Gln Trp Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Gly Val Val Val Gly Glu Ser Asn Ile Cys Thr Thr 20 25 30 Arg Gly Val Asn Ser Cys Gln Gln Cys Leu Ala Val Ser Pro Val Cys 35 40 45 Ala Trp Cys Ser Asp Glu Thr Leu Ser Gln Gly Ser Pro Arg Cys Asn 50 55 60 Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn Cys Ala Pro Glu Ser Ile Glu 65 70 75 80 Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Ile Leu Glu Ala Arg Pro Leu Ser Ser 85 90 95 Lys Gly Ser Gly Ser Ser Ala Gln Ile Thr Gln Val Ser Pro Gln Arg 100 105 110 Ile Val Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp Ser Lys Ile Phe Ser Leu Gln 115 120 125 Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp 130 135 140 Leu Ser Phe Ser Met Lys Asp Asp Leu Ser Ser Ile Gln Thr Leu Gly 145 150 155 160 Thr Lys Leu Ala Ser Gln Met Arg Lys Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile 165 170 175 Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile 180 185 190 Ser Pro Pro Gln Ala Ile Lys Asn Pro Cys Tyr Asn Met Lys Asn Ala 195 200 205 Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His Val Leu Thr Leu Thr Asp Gln 210 215 220 Val Ser Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys Lys Gln Ser Val Ser Arg Asn 225 230 235 240 Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met Gln Ala Thr Val 245 250 255 Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn Asp Ala Ser His Leu Leu Val 260 265 270 Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala 275 280 285 Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly His Cys His Ile Gly Thr Asp Asn 290 295 300 His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met 305 310 315 320 Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr 325 330 335 Glu Asn Val Val Ser Leu Tyr Gln Asn Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly 340 345 350 Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Asp Asp Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu 355 360 365 Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu Glu Val 370 375 380 Arg Asp Leu Pro Gly Glu Leu Ser Leu Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu 385 390 395 400 Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys Ser Cys Val Gly Leu Lys Ile 405 410 415 Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys Pro 420 425 430 Gln Glu Lys Glu Gln Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp 435 440 445 Ser Leu Thr Val Gln Val Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala 450 455 460 Phe Ala Gln Pro Ser Ser Pro Arg Cys Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe 465 470 475 480 Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Asp Gln Gly Trp Leu Gly Ser Met Cys 485 490 495 Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln Glu Glu Cys Ser 500 505 510 Pro Lys Glu Gly Gln Pro Ile Cys Ser Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys 515 520 525 Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys 530 535 540 Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met 545 550 555 560 Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Asn Cys Gly Asp Cys Val Cys Asp Ser 565 570 575 Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys 580 585 590 Met Ser Thr Asn Gly Leu Leu Cys Ser Gly Arg Gly Asn Cys Glu Cys 595 600 605 Gly Ser Cys Val Cys Val Gln Pro Gly Ser Tyr Gly Asp Thr Cys Glu 610 615 620 Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys Ser Phe Lys Lys Glu Cys Val 625 630 635 640 Glu Cys Lys Lys Phe Asn Arg Gly Thr Leu His Glu Glu Asn Thr Cys 645 650 655 Ser Arg Tyr Cys Arg Asp Asp Ile Glu Gln Val Lys Glu Leu Thr Asp 660 665 670 Thr Gly Lys Asn Ala Val Asn Cys Thr Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys 675 680 685 Val Val Arg Phe Gln Tyr Tyr Glu Asp Thr Ser Gly Arg Ala Val Leu 690 695 700 Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val 705 710 715 720 Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile Leu Leu Ile Gly Leu Ala Thr 725 730 735 Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr Ile His Asp Arg Lys Glu Phe 740 745 750 Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn 755 760 765 Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr 770 775 780 Arg Gly Thr 785 <210> 6 <211> 2615 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggcgcgcgcg cggcgtgaag ggcggcggac aggatgcgag cgcagtggcc gggacaactc 60 tgggcggctc tgctggcgct gggggcgctg gcgggcgttg ttgttggaga gtccaacatc 120 tgtaccacac gaggcgtgaa ctcctgccag cagtgtctgg ctgtgagtcc tgtgtgtgcc 180 tggtgctcag atgagacttt gtctcagggc tcaccccgat gtaacctgaa ggagaacctg 240 ctgaaggaca attgtgctcc agagtctatt gagttcccag tcagtgaggc ccagatcctg 300 gaggctaggc cactcagcag caagggctct ggaagcagcg cccagatcac tcaagtcagc 360 cctcagagga ttgtccttcg actacggcca gatgattcga agatcttctc acttcaagtg 420 cggcaggtgg aggattaccc cgtggacatc tactacttga tggacctgtc tttctccatg 480 aaggatgatc tgtccagcat ccagaccctg ggtaccaagt tggcctctca gatgcgcaag 540 cttactagca accttcggat tggctttggg gccttcgtgg acaagcctgt atcgccgtac 600 atgtacatct ccccaccaca ggcaatcaaa aacccctgtt acaatatgaa gaatgcctgc 660 ttgcccatgt ttggctacaa acacgtgctg acgctaaccg accaggtgtc ccgcttcaat 720 gaagaagtga agaaacagag cgtgtcccgt aatcgagatg ccccagaggg cggctttgac 780 gccatcatgc aggctacagt atgtgatgaa aaaattggct ggaggaatga cgcatcccat 840 ttgctagtgt ttaccacgga tgccaagacc catattgccc tggatggaag actggcaggc 900 attgtcctgc ccaatgatgg gcactgtcac attggcaccg acaaccacta ctctgcctcc 960 actaccatgg actacccatc tctggggctg atgactgaga aactatccca gaaaaacatt 1020 aacttgatct ttgcagtgac tgaaaatgtc gtcagccttt accagaatta tagtgagctc 1080 attcctggga ccacagtggg agtcctgtct gatgactcaa gcaacgtcct ccagctcatt 1140 gttgatgctt acgggaaaat ccgctctaaa gtggagctgg aagtacgtga cctgccggga 1200 gagctgtcac tgtccttcaa tgccacctgc ctcaacaacg aggttatccc gggcctcaag 1260 tcttgtgtgg gcctcaagat tggagacacg gtgagcttta gtatcgaggc caaggtgcgt 1320 ggctgccccc aggagaagga gcagtctttc actatcaagc ctgtgggctt taaggacagc 1380 ctcaccgtcc aggtgacctt cgactgtgac tgtgcctgcc aggcctttgc ccagccttcc 1440 agcccacgct gcaacaatgg gaacgggact tttgagtgtg gggtgtgccg ctgtgaccag 1500 ggctggctgg ggtccatgtg tgagtgctct gaggaggatt accgaccctc tcagcaggaa 1560 gagtgcagcc ccaaggaggg ccagcccatc tgcagccagc ggggagagtg cctctgtggc 1620 cagtgtgtct gccatagcag cgacttcggc aagatcactg gcaagtactg tgagtgcgat 1680 gacttctcct gcgtccgcta caaaggggag atgtgttccg gccatgggca atgtaactgt 1740 ggggactgcg tgtgtgactc ggactggact ggctactact gcaactgtac tacacgcact 1800 gacacctgca tgtccaccaa tgggctgctg tgcagcggcc ggggcaactg cgagtgcggc 1860 agctgtgtgt gcgtccagcc aggctcctat ggagacacct gtgagaagtg ccccacctgc 1920 ccagatgcct gctcctttaa gaaggagtgt gtggagtgta agaagttcaa ccggggaacg 1980 ctccatgaag aaaacacctg cagccgctac tgccgggatg acatcgagca ggtgaaagag 2040 ctgacggata ctggtaaaaa cgccgtgaat tgtacctaca agaacgagga tgactgtgtc 2100 gtcagattcc agtactacga agacaccagt gggagggcag tcctctatgt ggtggaagag 2160 cctgagtgtc ccaagggtcc tgatatcctg gtggtactgc tgtcagtgat gggggccatc 2220 ctgctcattg gccttgctac tctgctcatc tggaagctac tcatcaccat tcatgaccgg 2280 aaggaatttg ctaaatttga ggaagaacga gccagagcta agtgggacac agcaaacaac 2340 ccgctgtata aagaggccac ctccaccttc accaatatca cctaccgggg gacttaatga 2400 gaccacttca gatgacgcca ggaccgtggg actctctgcc attatgttta cagaggacaa 2460 tttgtgtgtg tgtgtatggg tgggatttgg ggcgtgggtt gggctgggct ggaagaatgt 2520 cagtatgtgg gaatgtatct ctctgtgtgt acttatgtgt gtgacgagtg tggggaaatg 2580 tgtaatttaa aacttgtgat gtgtctcaca ggcag 2615

Claims (14)

1. 다음의 단계를 포함하는 DICAM (dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule)과 αvβ3 인테그린(integrin)과의 상호작용(interaction) 억제 물질의 스크리닝 방법.

   (a) DICAM의 Ig 도메인 (immunoglobulin domain) I, Ig 도메인 II, 또는 Ig 도메인 I 및 II을 포함하는 폴리펩타이드를 플레이트(plate)상에 코팅하는 단계;

   (b) 상기 단계 (a)의 플레이트상에 후보물질을 첨가한 후 인큐베이션 하는 단계;

   (c) 상기 단계 (b)의 플레이트상에 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하고 인큐베이션 하는 단계; 및

   (d) 상기 단계 (c)의 플레이트를 세정하고, 플레이트상에 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수를 측정하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d) 이후에 상기 단계 (b)에서 후보물질을 첨가하지 않는 경우에 비해 후보물질을 첨가한 경우에 부착된 세포의 수가 감소하는 후보물질을 선별하는 단계 (e)를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 DICAM 단백질은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어지고, DICAM 단백질의 Ig 도메인 I은 서열목록 제1서열의 38번째 아미노산 - 156번째 아미노산으로 이루어지고, DICAM 단백질의 Ig 도메인 II은 서열목록 제1서열의 170번째 아미노산 - 291번째 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 플레이트에 접종하는 αvβ3 인테그린 발현 세포는 MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 플레이트에 접종하는 세포는 트립신(trypsin) 처리된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 부착된 세포수의 측정은 헥소사미니다아제 분석법(hexosaminidase assay)에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 다음의 단계를 포함하는 DICAM과 αvβ3 인테그린과의 상호작용을 억제하는 물질의 스크리닝 방법:

   (a) DICAM이 발현된 세포를 플레이트에 접종하여 플레이트상에 이 세포가 단일층을 형성하도록 배양하는 단계;

   (b) 상기 단계 (a)의 세포가 배양된 플레이트상에 후보물질을 첨가하여 인큐베이션 하는 단계;

   (c) 상기 단계 (b)의 플레이트상에 αvβ3 인테그린 발현 세포를 접종하여 배양하는 단계; 및

   (d) 상기 단계 (c)의 플레이트를 세정한 후 플레이트상에 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수를 측정하는 단계.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (d) 이후에, 상기 단계 (b)에서 후보물질을 첨가하지 않는 경우에 비해 후보물질을 첨가한 경우에 부착된 αvβ3 인테그린 발현 세포의 수가 감소하는 후보물질을 선별하는 단계 (e)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 DICAM이 발현된 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 DICAM 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형 질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 DICAM 단백질은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
11. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 αvβ3 인테그린 발현 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 αv 및 β3 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
12. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 αvβ3 인테그린 발현 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 β3 인테그린 서브유닛 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 αv 인테그린 서브 유닛을 내재적으로(endogenously) 발현하는 세포를 형질전환시킨 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 αv 인테그린은 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 β3 인테그린은 서열목록 제 5 서열의 아미 노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
14. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 αvβ3 인테그린 발현 세포는 트립신(trypsin) 처리되고 형광물질(fluorescent material)로 표지(label)된 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

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