JP2002509862A - ヘテロ三量体ｇタンパク質と一量体ｇタンパク質の相互作用を媒介する因子の同定 - Google Patents
ヘテロ三量体ｇタンパク質と一量体ｇタンパク質の相互作用を媒介する因子の同定Info
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Abstract
(57)【要約】
単量体ＧＴＰａｓｅグアニン・ヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）であって、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）のＲＧＳ領域に類似するＲＧＳ領域をも含むものが同定された。これらのＧＥＦタンパク質の中の１、Ｒｈｏ ＧＥＦは、ヘテロ３量体Ｇタンパク質のαサブユニットに対立するＧＡＰ活性を有するＲＧＳ配列を含むことが証明された。
Description
【０００１】 発明の背景 細胞外因子をRhoＧＴＰアーゼの活性化に結びつける信号伝達経路は、細胞増 殖制御および細胞骨格再配列に関係があるとされてきた。特に、ヘテロ三量体Ｇ
タンパク質はこれらの経路を媒介することが示されているが、しかし媒介メカニ
ズムは明らかにされてはいない。ヘテロ三量体Ｇタンパク質およびRhoＧＴＰア ーゼの両方と相互作用する因子の同定は、種々の細胞工程、例えば細胞増殖性疾
患を究明し、制御するための重要な道具を提供する。
タンパク質はこれらの経路を媒介することが示されているが、しかし媒介メカニ
ズムは明らかにされてはいない。ヘテロ三量体Ｇタンパク質およびRhoＧＴＰア ーゼの両方と相互作用する因子の同定は、種々の細胞工程、例えば細胞増殖性疾
患を究明し、制御するための重要な道具を提供する。
【０００２】 発明の要約 本発明は、例えばグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）タンパク質から得
られる新規のＲＧＳドメインのアミノ酸配列を包含するポリペプチドおよび対応
する核酸に関するが、この場合、ポリペプチドは、好ましくはdbl相同（ＤＨ） ドメインまたはプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含まない。好ましい実施
態様では、ポリペプチドは、 ＧＴＰアーゼ活性化活性、ならびにＧタンパク質 サブユニット、例えばＧαに対する結合親和性を有する。
られる新規のＲＧＳドメインのアミノ酸配列を包含するポリペプチドおよび対応
する核酸に関するが、この場合、ポリペプチドは、好ましくはdbl相同（ＤＨ） ドメインまたはプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含まない。好ましい実施
態様では、ポリペプチドは、 ＧＴＰアーゼ活性化活性、ならびにＧタンパク質 サブユニット、例えばＧαに対する結合親和性を有する。
【０００３】 ポリペプチドおよび核酸は、下記のような探索、療法および診断のための道具
として用いられ得る。 本発明は、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインと、基質、例えばＧαのような
Ｇタンパク質サブユニットとの結合を調節する分子または分子の混合物に関する
同定または検定の方法にも関する。一実施態様では、方法は、有効条件下で、Ｇ
ＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインを有する、ならびに任意にＧＥＦ活性を有す
るポリペプチドをＧαまたはその断片と一緒に、被験分子の存在下および／また
は非存在下でインキュベートし、そして被験分子の存在がポリペプチドとサブユ
ニットまたはその断片との間の結合を調節するか否かを確定することを包含する
。後述するように、種々のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド結合基質が利用され得る
。
として用いられ得る。 本発明は、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインと、基質、例えばＧαのような
Ｇタンパク質サブユニットとの結合を調節する分子または分子の混合物に関する
同定または検定の方法にも関する。一実施態様では、方法は、有効条件下で、Ｇ
ＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインを有する、ならびに任意にＧＥＦ活性を有す
るポリペプチドをＧαまたはその断片と一緒に、被験分子の存在下および／また
は非存在下でインキュベートし、そして被験分子の存在がポリペプチドとサブユ
ニットまたはその断片との間の結合を調節するか否かを確定することを包含する
。後述するように、種々のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド結合基質が利用され得る
。
【０００４】 さらに、本発明は、ＧＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドに及ぼすＧＥＦタ
ンパク質のＲＧＳドメインを包含するポリペプチドの刺激作用を調節する分子ま
たは分子の混合物に関する同定または検定の方法に関する。好ましい実施態様で
は、本方法は、有効条件下で、被験分子の存在下および非存在下でＧαサブユニ
ットおよびＧＥＦタンパク質をインキュベートし、そして被験分子の存在がＧα
サブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦタンパク質の刺激作用を調節する
か否かを確定することを包含する。
ンパク質のＲＧＳドメインを包含するポリペプチドの刺激作用を調節する分子ま
たは分子の混合物に関する同定または検定の方法に関する。好ましい実施態様で
は、本方法は、有効条件下で、被験分子の存在下および非存在下でＧαサブユニ
ットおよびＧＥＦタンパク質をインキュベートし、そして被験分子の存在がＧα
サブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦタンパク質の刺激作用を調節する
か否かを確定することを包含する。
【０００５】 本発明は、二次ポリペプチドのヌクレオチド交換因子活性に及ぼす一次ポリペ
プチド、例えば活性化ＧαサブユニットまたはＧＴＰアーゼ活性を有するポリペ
プチドの刺激作用を特異的に調節する分子に関して同定または検定する方法にも
関する。二次ポリペプチドは、好ましくはＧＥＦから得られるＲＧＳ−ＧＥＦド
メインを包含し、さらに好ましくは単量体Ｇタンパク質に関するグアニンヌクレ
オチド交換因子（ＧＥＦ）である。本方法の一実施態様では、一次検定は、被験
分子の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質とと
もに活性化Ｇαサブユニットをインキュベートすることにより実行され、二次検
定は、被験分子の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタン
パク質をインキュベートすることにより実行され、そして確定は、一次検定を二
次検定と比較した場合に、分子が異なる作用を有するか否かに関して成される。
プチド、例えば活性化ＧαサブユニットまたはＧＴＰアーゼ活性を有するポリペ
プチドの刺激作用を特異的に調節する分子に関して同定または検定する方法にも
関する。二次ポリペプチドは、好ましくはＧＥＦから得られるＲＧＳ−ＧＥＦド
メインを包含し、さらに好ましくは単量体Ｇタンパク質に関するグアニンヌクレ
オチド交換因子（ＧＥＦ）である。本方法の一実施態様では、一次検定は、被験
分子の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質とと
もに活性化Ｇαサブユニットをインキュベートすることにより実行され、二次検
定は、被験分子の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタン
パク質をインキュベートすることにより実行され、そして確定は、一次検定を二
次検定と比較した場合に、分子が異なる作用を有するか否かに関して成される。
【０００６】 本発明はさらに、単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介ヌクレオチド交換に及ぼす
活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を模倣する分子または分子の混合物に関する
同定または検定方法に関する。一例では、このような方法は、ＧＥＦタンパク質
のＲＧＳドメインに対する結合親和性を示す被験化合物を同定し、被験化合物の
存在下または非存在下でＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質をインキュ
ベートし、被験化合物が単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介ヌクレオチド交換に及
ぼす刺激作用を示すか否かを確定することを包含する。
活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を模倣する分子または分子の混合物に関する
同定または検定方法に関する。一例では、このような方法は、ＧＥＦタンパク質
のＲＧＳドメインに対する結合親和性を示す被験化合物を同定し、被験化合物の
存在下または非存在下でＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質をインキュ
ベートし、被験化合物が単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介ヌクレオチド交換に及
ぼす刺激作用を示すか否かを確定することを包含する。
【０００７】 本発明はさらに、ＧαサブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦポリペプ
チドのＲＧＳドメインの刺激作用を模倣する分子または分子の混合物に関する同
定または検定方法に関する。一例では、このような方法は、Ｇαサブユニットに
対する結合親和性を示す被験化合物を同定し、そして被験化合物の存在下または
非存在下でＧＴＰ負荷Ｇαサブユニットをインキュベートして、被験化合物が単
量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介ヌクレオチド交換に及ぼす刺激作用を示すか否か
を確定することを包含する。
チドのＲＧＳドメインの刺激作用を模倣する分子または分子の混合物に関する同
定または検定方法に関する。一例では、このような方法は、Ｇαサブユニットに
対する結合親和性を示す被験化合物を同定し、そして被験化合物の存在下または
非存在下でＧＴＰ負荷Ｇαサブユニットをインキュベートして、被験化合物が単
量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介ヌクレオチド交換に及ぼす刺激作用を示すか否か
を確定することを包含する。
【０００８】 発明の詳細な説明 Ｇタンパク質は、多数の細胞表面ヘプタヘリカル受容体から種々の細胞内エフ
ェクターに信号を伝達する。各ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、グルタミンヌクレ
オチド結合αサブユニット、ならびにβおよびγサブユニットの高親和性二量体
から成る。Ｇαサブユニットは一般に、それらのアミノ酸配列相同性および機能
を基礎にして４つの亜族（Ｇs、Ｇi、ＧqおよびＧ12）に分類される（A.G. Gilm
an, Annu. Rev. Biochem. 56, 615（1987）; Y. Kaziro et al., Annu. Rev. Bi
ochem., 60, 349（1991）; Hepler and Gilman, Trends Biochem. Sci. 17, 383
,（1992））。Ｇ12亜族は、今日まで、２つの同定済み成員Ｇ12およびＧ13から 成る。
ェクターに信号を伝達する。各ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、グルタミンヌクレ
オチド結合αサブユニット、ならびにβおよびγサブユニットの高親和性二量体
から成る。Ｇαサブユニットは一般に、それらのアミノ酸配列相同性および機能
を基礎にして４つの亜族（Ｇs、Ｇi、ＧqおよびＧ12）に分類される（A.G. Gilm
an, Annu. Rev. Biochem. 56, 615（1987）; Y. Kaziro et al., Annu. Rev. Bi
ochem., 60, 349（1991）; Hepler and Gilman, Trends Biochem. Sci. 17, 383
,（1992））。Ｇ12亜族は、今日まで、２つの同定済み成員Ｇ12およびＧ13から 成る。
【０００９】 本発明にしたがって、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニットに関するＧ
ＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）としての活性、ならびに一量体Ｇタンパ
ク質に関するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性と同様の活性を有す
るタンパク質の同定が説明されている。さらに本発明にしたがって、Ｇタンパク
質のＧ12亜族に関するＧＡＰ活性を有するタンパク質の一次同定が記載されてい
る。さらに本発明にしたがって、単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性グアニンヌ
クレオチド交換活性を刺激するヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニットの能
力が記載されている。ＧＡＰおよびＧＥＦ活性、ならびにそれらのスクリーニン
グ方法は、Berman et al, 1996, Cell 86:445およびHart et al., 1996, J. Bio
l. Chem., 271:25452に記載されている。
ＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）としての活性、ならびに一量体Ｇタンパ
ク質に関するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性と同様の活性を有す
るタンパク質の同定が説明されている。さらに本発明にしたがって、Ｇタンパク
質のＧ12亜族に関するＧＡＰ活性を有するタンパク質の一次同定が記載されてい
る。さらに本発明にしたがって、単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性グアニンヌ
クレオチド交換活性を刺激するヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニットの能
力が記載されている。ＧＡＰおよびＧＥＦ活性、ならびにそれらのスクリーニン
グ方法は、Berman et al, 1996, Cell 86:445およびHart et al., 1996, J. Bio
l. Chem., 271:25452に記載されている。
【００１０】 本発明によれば、ＧＥＦタンパク質のＧＡＰ活性は、ＧＥＦタンパク質から得
られる新規のＲＧＳドメインと相関している。本発明は、このようなＲＧＳドメ
インのすべての局面、例えばp115 Rho-ＧＥＦのようなRhoＧＥＦのすべての局面
に関する（米国特許出願第08/943,768号）（この記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる）。
られる新規のＲＧＳドメインと相関している。本発明は、このようなＲＧＳドメ
インのすべての局面、例えばp115 Rho-ＧＥＦのようなRhoＧＥＦのすべての局面
に関する（米国特許出願第08/943,768号）（この記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる）。
【００１１】 ＧＥＦタンパク質は、ＧＴＰアーゼのグアニンヌクレオチド交換活性を調節す
ることにより、in vitroおよびin vivoの両方で、細胞シグナリング経路を調節 する。本発明によれば、ヘテロ三量体ＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性も調
節するＧＥＦタンパク質が記載される。説明として、RhoＧＴＰアーゼのグアニ ンヌクレオチド交換活性ならびにヘテロ三量体Ｇタンパク質サブユニットのＧα 12 亜族のＧＴＰアーゼ活性を調節するp115 Rho−ＧＥＦが記載される。
ることにより、in vitroおよびin vivoの両方で、細胞シグナリング経路を調節 する。本発明によれば、ヘテロ三量体ＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性も調
節するＧＥＦタンパク質が記載される。説明として、RhoＧＴＰアーゼのグアニ ンヌクレオチド交換活性ならびにヘテロ三量体Ｇタンパク質サブユニットのＧα 12 亜族のＧＴＰアーゼ活性を調節するp115 Rho−ＧＥＦが記載される。
【００１２】 本発明は特に、ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインを包含するポリペプチド
またはそれらの断片、ならびに対応するアミノ酸に関する。 本発明は、例えば療法、診断における、ならびに探索道具としての、このよう
なポリペプチド、核酸またはそれらの誘導体の使用方法にも関する。本発明のそ
の他の局面は、ＧＥＦポリペプチドまたは核酸のＲＧＳドメインを認識する抗体
およびその他の配位子、ＲＧＳドメインを含有するタンパク質のＧＥＦ活性およ
び／またはＧＡＰ活性のモジュレーターの同定または検定方法、ならびにＲＧＳ
ドメインに関連した、またはそれに関する病理的症状、例えばＧαサブユニット
およびRhoＧＴＰアーゼのＧＥＦ媒介性相互作用に関する。
またはそれらの断片、ならびに対応するアミノ酸に関する。 本発明は、例えば療法、診断における、ならびに探索道具としての、このよう
なポリペプチド、核酸またはそれらの誘導体の使用方法にも関する。本発明のそ
の他の局面は、ＧＥＦポリペプチドまたは核酸のＲＧＳドメインを認識する抗体
およびその他の配位子、ＲＧＳドメインを含有するタンパク質のＧＥＦ活性およ
び／またはＧＡＰ活性のモジュレーターの同定または検定方法、ならびにＲＧＳ
ドメインに関連した、またはそれに関する病理的症状、例えばＧαサブユニット
およびRhoＧＴＰアーゼのＧＥＦ媒介性相互作用に関する。
【００１３】 本明細書中で用いる場合、「ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド」とは、例えば、Ｇ
ＥＦタンパク質に由来するＲＧＳドメインを含有するペプチド、例えばp115 Rh −ＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ０３８０またはDRhoＧＥＦ２を意味し、それは、１
つ又はそれ以上の下記の活性を有する：ポリペプチド基質、例えばＧタンパク質
サブユニット、好ましくはαサブユニット、例えばＧα12またはＧα13に対する
特異的結合親和性：ＧＴＰアーゼ活性化活性（ＧＡＰ）、例えばＧタンパク質ア
ルファサブユニットに対するＧＡＰ活性：あるいは免疫原性活性。ＲＧＳ−ＧＥ
Ｆポリペプチドは、好ましくは、ＤＨ（dbl相同）またはＰＨ（プレクストリン 相同）ドメインを含有しない。ＤＨおよびＰＨドメインは、Cerione and Zheng,
1996, Curr. Opin. In Cell Biol., 8:216に開示されている。例えば、p115 Rh
oＧＥＦのアミノ酸配列（図１０）は、アミノ酸45-170の新規のＲＧＳドメイン 、アミノ酸420-637のＤＨドメインおよびアミノ酸646-672のＰＨドメインを含有
する。「由来する」とは、アミノ酸配列が天然ＧＥＦ（例えば、p115、Ｌｓｃ、
ＫＩＡＡ３８０およびDrrhoＧＥＦ２）または天然ＧＥＦ配列を基礎にした非天 然「突然変異化」配列（即ち、異なるアミノ酸残基が、特定の位置で天然配列中
に生じるアミノ酸残基に対して置換されている）から得られることを意味する。
ポリペプチドは、「単離され」得る。即ち、その物質は、その元の環境では見出
されない、例えばより濃縮され、より精製され、または他の構成成分から分離さ
れた等の形態である。好ましいＲＧＳポリペプチドは、ＧＡＰおよびＧＥＦ活性
の両方を有し、例えば突然変異化p115 Rho-ＧＥＦである（下記参照）。
ＥＦタンパク質に由来するＲＧＳドメインを含有するペプチド、例えばp115 Rh −ＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ０３８０またはDRhoＧＥＦ２を意味し、それは、１
つ又はそれ以上の下記の活性を有する：ポリペプチド基質、例えばＧタンパク質
サブユニット、好ましくはαサブユニット、例えばＧα12またはＧα13に対する
特異的結合親和性：ＧＴＰアーゼ活性化活性（ＧＡＰ）、例えばＧタンパク質ア
ルファサブユニットに対するＧＡＰ活性：あるいは免疫原性活性。ＲＧＳ−ＧＥ
Ｆポリペプチドは、好ましくは、ＤＨ（dbl相同）またはＰＨ（プレクストリン 相同）ドメインを含有しない。ＤＨおよびＰＨドメインは、Cerione and Zheng,
1996, Curr. Opin. In Cell Biol., 8:216に開示されている。例えば、p115 Rh
oＧＥＦのアミノ酸配列（図１０）は、アミノ酸45-170の新規のＲＧＳドメイン 、アミノ酸420-637のＤＨドメインおよびアミノ酸646-672のＰＨドメインを含有
する。「由来する」とは、アミノ酸配列が天然ＧＥＦ（例えば、p115、Ｌｓｃ、
ＫＩＡＡ３８０およびDrrhoＧＥＦ２）または天然ＧＥＦ配列を基礎にした非天 然「突然変異化」配列（即ち、異なるアミノ酸残基が、特定の位置で天然配列中
に生じるアミノ酸残基に対して置換されている）から得られることを意味する。
ポリペプチドは、「単離され」得る。即ち、その物質は、その元の環境では見出
されない、例えばより濃縮され、より精製され、または他の構成成分から分離さ
れた等の形態である。好ましいＲＧＳポリペプチドは、ＧＡＰおよびＧＥＦ活性
の両方を有し、例えば突然変異化p115 Rho-ＧＥＦである（下記参照）。
【００１４】 ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドをコードする。核酸は、
センスおよびアンチセンス核酸の両方を指す。 「特異的結合親和性」という用語は、例えば、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドが
、ＧＤＰ結合状態またはヌクレオチド枯渇状態と比較した場合に、活性化状態ま
たは遷移状態のＧタンパク質サブユニットに対する結合優先選択を有することを
意味する。「ＧＥＦ活性」とは、例えばポリペプチドが単量体Ｇタンパク質、例
えばRhoからのＧＤＰの解離と、その後のＧＴＰの結合を刺激または触媒するこ とを意味する。単量体Ｇタンパク質としては、Ras、Rho/Rac、Sar、Rab、Arfお よびRan族中のＧタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味 深いのものは、下記のＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインである：ヒトp115（16
54344）（図１０、アミノ酸45-170のＲＧＳドメイン）、マウスＬｓｃ（1389756
）（図１４、アミノ酸43-168のＲＧＳドメイン）、ＫＩＡＡ３８０（2224701） （図１2、アミノ酸310-432のＲＧＳドメイン）、およびショウジョウバエDrhoＧ
ＥＦ２（2760368）（図１6、アミノ酸924-1053のＲＧＳドメイン）。
センスおよびアンチセンス核酸の両方を指す。 「特異的結合親和性」という用語は、例えば、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドが
、ＧＤＰ結合状態またはヌクレオチド枯渇状態と比較した場合に、活性化状態ま
たは遷移状態のＧタンパク質サブユニットに対する結合優先選択を有することを
意味する。「ＧＥＦ活性」とは、例えばポリペプチドが単量体Ｇタンパク質、例
えばRhoからのＧＤＰの解離と、その後のＧＴＰの結合を刺激または触媒するこ とを意味する。単量体Ｇタンパク質としては、Ras、Rho/Rac、Sar、Rab、Arfお よびRan族中のＧタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味 深いのものは、下記のＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインである：ヒトp115（16
54344）（図１０、アミノ酸45-170のＲＧＳドメイン）、マウスＬｓｃ（1389756
）（図１４、アミノ酸43-168のＲＧＳドメイン）、ＫＩＡＡ３８０（2224701） （図１2、アミノ酸310-432のＲＧＳドメイン）、およびショウジョウバエDrhoＧ
ＥＦ２（2760368）（図１6、アミノ酸924-1053のＲＧＳドメイン）。
【００１５】 本発明の別の局面は、本明細書中では「サブ−ＲＧＳコンセンサス配列」と呼
ばれる、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメイン（単数または複数）に関する新規の
コンセンサス配列に関する。「ＲＧＳドメイン」とは、本明細書中で用いる場合
、Ｇタンパク質と結合し得るかまたはそれと物理的に相互作用し得る、そして任
意に、そのタンパク質のＧＴＰアーゼ活性を刺激するタンパク質のアミノ酸配列
を示す。「サブ−ＲＧＳコンセンサス配列」とは、本明細書中で用いる場合、Ｒ
ＧＳドメインを含有するタンパク質の特定のサブユニットを同定するために用い
られ得るコンセンサス配列を指す。例えば、図１８および対応する凡例に示され
、説明されているようないくつかのタンパク質からのＲＧＳドメインの相同アラ
インメントは、いくつかのサブ−ＲＧＳコンセンサス配列が、ＧＥＦタンパク質
のＲＧＳドメイン中で明らかな13〜14個のアミノ酸のギャップにより限定され得
ることを示す。本明細書中で「ＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス１」と呼ばれるこれ
らのコンセンサス配列のうちの１つは、本明細書中では、AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-
AA6-AA7-AA8-（13個のアミノ酸のギャップ）-AA22-AA23-AA24-AA25-AA26のコン センサス配列であると定義され、式中、 AA1はＬであり； AA2はＥまたはＶであり； AA3はＫまたはＰであり； AA4はＴ、ＮまたはＲであり； AA5はＡであり； AA6はＶまたはＰであり； AA7はＬであり； AA8はＳであるかまたは13個のアミノ酸ギャップと連続したアミノ酸のギャ ップであり； AA22はＲまたはＷであり； AA23はＶまたはＹであり； AA24はＰ、ＫまたはＲであり； AA25はＶ、ＩまたはＱであり； AA26はＰまたはＤである。
ばれる、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメイン（単数または複数）に関する新規の
コンセンサス配列に関する。「ＲＧＳドメイン」とは、本明細書中で用いる場合
、Ｇタンパク質と結合し得るかまたはそれと物理的に相互作用し得る、そして任
意に、そのタンパク質のＧＴＰアーゼ活性を刺激するタンパク質のアミノ酸配列
を示す。「サブ−ＲＧＳコンセンサス配列」とは、本明細書中で用いる場合、Ｒ
ＧＳドメインを含有するタンパク質の特定のサブユニットを同定するために用い
られ得るコンセンサス配列を指す。例えば、図１８および対応する凡例に示され
、説明されているようないくつかのタンパク質からのＲＧＳドメインの相同アラ
インメントは、いくつかのサブ−ＲＧＳコンセンサス配列が、ＧＥＦタンパク質
のＲＧＳドメイン中で明らかな13〜14個のアミノ酸のギャップにより限定され得
ることを示す。本明細書中で「ＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス１」と呼ばれるこれ
らのコンセンサス配列のうちの１つは、本明細書中では、AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-
AA6-AA7-AA8-（13個のアミノ酸のギャップ）-AA22-AA23-AA24-AA25-AA26のコン センサス配列であると定義され、式中、 AA1はＬであり； AA2はＥまたはＶであり； AA3はＫまたはＰであり； AA4はＴ、ＮまたはＲであり； AA5はＡであり； AA6はＶまたはＰであり； AA7はＬであり； AA8はＳであるかまたは13個のアミノ酸ギャップと連続したアミノ酸のギャ ップであり； AA22はＲまたはＷであり； AA23はＶまたはＹであり； AA24はＰ、ＫまたはＲであり； AA25はＶ、ＩまたはＱであり； AA26はＰまたはＤである。
【００１６】 本明細書中で「ＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス２」と呼ばれる第二コンセンサス
配列は、本明細書中では、AA1-AA2-AA3-AA4-（13個のアミノ酸のギャップ）-AA1 8 -AA19のコンセンサス配列であると定義され、式中、 AA1はＡであり； AA2はＶまたはＰであり； AA3はＬであり； AA4はＳであるかまたは13個のアミノ酸ギャップと連続したアミノ酸のギャ ップであり； AA18はＲまたはＷであり； AA19はＶまたはＹである。
配列は、本明細書中では、AA1-AA2-AA3-AA4-（13個のアミノ酸のギャップ）-AA1 8 -AA19のコンセンサス配列であると定義され、式中、 AA1はＡであり； AA2はＶまたはＰであり； AA3はＬであり； AA4はＳであるかまたは13個のアミノ酸ギャップと連続したアミノ酸のギャ ップであり； AA18はＲまたはＷであり； AA19はＶまたはＹである。
【００１７】 他のＧＥＦタンパク質を含めたその他のタンパク質は、図１８に示されたよう
なＲＧＳタンパク質のＲＧＳドメインとともに整列され、そして、本明細書中に
記載した方法を用いて、それらがサブ−ＲＧＳコンセンサス配列、例えば前記の
ようなＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス１またはＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス２を含
有するか否かを確定し得る。
なＲＧＳタンパク質のＲＧＳドメインとともに整列され、そして、本明細書中に
記載した方法を用いて、それらがサブ−ＲＧＳコンセンサス配列、例えば前記の
ようなＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス１またはＲＧＳ−ＧＥＦコンセンサス２を含
有するか否かを確定し得る。
【００１８】 図１８を検討すると、ＧＥＦタンパク質ではないＲＧＳタンパク質に独特のヌ
クレオチド配列は、ＲＧＳ−ＧＥＦタンパク質中の13〜14個のアミノ酸ギャップ
に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列により示される、ということ
も明らかになる。これレアのヌクレオチド配列は、特定の型のＲＧＳタンパク質
を同定するためのプローブとして用いられ得た。
クレオチド配列は、ＲＧＳ−ＧＥＦタンパク質中の13〜14個のアミノ酸ギャップ
に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列により示される、ということ
も明らかになる。これレアのヌクレオチド配列は、特定の型のＲＧＳタンパク質
を同定するためのプローブとして用いられ得た。
【００１９】 ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、好ましくは生物学的に活性である。生物学的
に活性とは、ポリペプチド断片が生体系中で、または生体系の構成成分（単数ま
たは複数）とともに活性を保有することを意味する。生物学的活性としては、前
記のようなＧタンパク質アルファサブユニットに対する特異的結合親和性、およ
びＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＡＰ活性が挙げられるが、これ
らに限定されない。実施例に記載するように、このようなポリペプチドは、例え
ば組換え的手段により、または単離ポリペプチドのタンパク質分解的切断により
ルーチンに調製され、所望の活性に関して検定され得る。
に活性とは、ポリペプチド断片が生体系中で、または生体系の構成成分（単数ま
たは複数）とともに活性を保有することを意味する。生物学的活性としては、前
記のようなＧタンパク質アルファサブユニットに対する特異的結合親和性、およ
びＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＡＰ活性が挙げられるが、これ
らに限定されない。実施例に記載するように、このようなポリペプチドは、例え
ば組換え的手段により、または単離ポリペプチドのタンパク質分解的切断により
ルーチンに調製され、所望の活性に関して検定され得る。
【００２０】 本発明のポリペプチドとしては、P115 Rho−ＧＥＦ（図１０）、Ｌｓｃ（図１
４）、ＫＩＡＡ０３８０（図１２）またはDRhoＧＥＦ２（図１６）のアミノ酸配
列と100％未満の同一性を有するポリペプチドが挙げられる。以下の考察のため に：配列同一性とは、図１０〜１７に記載した配列中に見出される同一のヌクレ
オチドまたはアミノ酸が比較配列（単数または複数）の対応する位置に見出され
ることを意味する。図１０、１２、１４および１６に記載したアミノ酸配列と10
0％未満の配列同一性を有するポリペプチドは、種々の方法で、例えば保存的ア ミノ酸により置換され得る。同一および保存的置換残基の合計を配列中の残基の
総数で割ると、配列類似性％が得られる。配列同一性および類似性を計算するた
めに、あらゆる所望の方法、算法、コンピュータープログラム等、例えばFASTA 、BLASTAにしたがって、比較配列を整列させ、計算し得る。図１０、１２、１４
および１６に示したＧＥＦタンパク質のアミノ酸配列と100％未満のアミノ酸配 列同一性を有するポリペプチドは、例えば約60、65％配列同一性を、さらに好ま
しくは約67、70、78、80、90、92、96、99％等のアミノ酸配列類似性を包含し得
る。
４）、ＫＩＡＡ０３８０（図１２）またはDRhoＧＥＦ２（図１６）のアミノ酸配
列と100％未満の同一性を有するポリペプチドが挙げられる。以下の考察のため に：配列同一性とは、図１０〜１７に記載した配列中に見出される同一のヌクレ
オチドまたはアミノ酸が比較配列（単数または複数）の対応する位置に見出され
ることを意味する。図１０、１２、１４および１６に記載したアミノ酸配列と10
0％未満の配列同一性を有するポリペプチドは、種々の方法で、例えば保存的ア ミノ酸により置換され得る。同一および保存的置換残基の合計を配列中の残基の
総数で割ると、配列類似性％が得られる。配列同一性および類似性を計算するた
めに、あらゆる所望の方法、算法、コンピュータープログラム等、例えばFASTA 、BLASTAにしたがって、比較配列を整列させ、計算し得る。図１０、１２、１４
および１６に示したＧＥＦタンパク質のアミノ酸配列と100％未満のアミノ酸配 列同一性を有するポリペプチドは、例えば約60、65％配列同一性を、さらに好ま
しくは約67、70、78、80、90、92、96、99％等のアミノ酸配列類似性を包含し得
る。
【００２１】 特に、本発明は、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインで突然変異化され、前記
の１つ又はそれ以上のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド活性を保有するP115、Ｌｓｃ
、ＫＩＡＡ３８０およびDrhoＧＥＦ２のポリペプチドおよび対応する核酸に関す
る。「突然変異化」とは、本明細書中では、このような配列が天然ではないこと
を意味する。例えば前記の突然変異化ポリペプチドは、保存的アミノ酸、例えば
（側鎖のサイズおよび分極の程度を基礎にして）小型非極性：システイン、プロ
リン、アラニン、トレオニン；小型極性：セリン、グリシン、アスパラギン酸、
アスパラギン；大型極性：グルタミン酸、グルタミン、リシン、アルギニン；中
間極性：チロシン、ヒスチジン、トリプトファン；大型非極性：フェニルアラニ
ン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン。このような保存的置換は、
Dayhoff（Atlas of Protein Sequence and Structure 5（1978））およびArgos （EMBO J., 8, 779-785（1989））により記載されたものも含む。図１０、１２ 、１４および１６に記載したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドは、保存
的アミノ酸により、位置1、5、10、15または20で置換され得る。突然変異は、保
存コンセンサス領域中に、またはＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインのその他の
残基に導入され得る。
の１つ又はそれ以上のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド活性を保有するP115、Ｌｓｃ
、ＫＩＡＡ３８０およびDrhoＧＥＦ２のポリペプチドおよび対応する核酸に関す
る。「突然変異化」とは、本明細書中では、このような配列が天然ではないこと
を意味する。例えば前記の突然変異化ポリペプチドは、保存的アミノ酸、例えば
（側鎖のサイズおよび分極の程度を基礎にして）小型非極性：システイン、プロ
リン、アラニン、トレオニン；小型極性：セリン、グリシン、アスパラギン酸、
アスパラギン；大型極性：グルタミン酸、グルタミン、リシン、アルギニン；中
間極性：チロシン、ヒスチジン、トリプトファン；大型非極性：フェニルアラニ
ン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン。このような保存的置換は、
Dayhoff（Atlas of Protein Sequence and Structure 5（1978））およびArgos （EMBO J., 8, 779-785（1989））により記載されたものも含む。図１０、１２ 、１４および１６に記載したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドは、保存
的アミノ酸により、位置1、5、10、15または20で置換され得る。突然変異は、保
存コンセンサス領域中に、またはＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインのその他の
残基に導入され得る。
【００２２】 ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドに対する突然変異は、前記の１つ又はそれ以上の
活性、例えばＧタンパク質アルファサブユニットに対する特異的結合親和性、Ｇ
タンパク質アルファサブユニットに対するＧＡＰ活性等を有するよう選択され得
る。このような活性に関する検定は、下記のように、あるいはCerione and Zhen
g, 1996, Curr. Opin. In Cell Biol., 8:216に開示されているように実行され 得る。
活性、例えばＧタンパク質アルファサブユニットに対する特異的結合親和性、Ｇ
タンパク質アルファサブユニットに対するＧＡＰ活性等を有するよう選択され得
る。このような活性に関する検定は、下記のように、あるいはCerione and Zhen
g, 1996, Curr. Opin. In Cell Biol., 8:216に開示されているように実行され 得る。
【００２３】 ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、ＲＧＳドメインの疎水性コア中にアミノ酸置
換を導入することにより修飾され得る（図１のパネルＡ参照）。例えば、保存的
アミノ酸置換は活性に影響を及ぼすと予測されるが、一方、非保存的アミノ酸置
換、例えば疎水性残基の親水性残基への変化は、その活性を低減または排除する
と予測される。疎水性残基は、非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイ
シン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシ
ステインである。親水性残基は、極性アミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒ
スチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸である。
換を導入することにより修飾され得る（図１のパネルＡ参照）。例えば、保存的
アミノ酸置換は活性に影響を及ぼすと予測されるが、一方、非保存的アミノ酸置
換、例えば疎水性残基の親水性残基への変化は、その活性を低減または排除する
と予測される。疎水性残基は、非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイ
シン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシ
ステインである。親水性残基は、極性アミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒ
スチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸である。
【００２４】 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは対応するヌクレオチド配列に対す
る修飾、例えば突然変異は、遺伝子データバンク、例えばGenbank、EMBLからの 相同探索に基づいて調製され得る。配列相同探索は、種々の方法、例えばBLAST 族のコンピュータープログラムに記載された算法、Smith-Waterman算法等を用い
て成し遂げられ得る。例えば、保存アミノ酸は、種々のＧＥＦタンパク質のＲＧ
Ｓドメインを含有する種々の配列間で同定され得る（図１８参照）。突然変異（
単数または複数）は、次に、ポリペプチド間に保存されたアミノ酸を同定し、整
列することにより、そして次に保存化または非保存化位置のアミノ酸を修飾する
ことにより、このような配列中に導入され得る。突然変異化ＲＧＳ−ＧＥＦ配列
は、例えば相同的核酸の対応する領域間に、保存化または非保存化アミノ酸を包
含し得る。例えば、突然変異化配列は、前記のようなおよび／または適切な探索
算法から確定されるようなあらゆる数の相同配列からの保存化または非保存化残
基を包含し得る。
る修飾、例えば突然変異は、遺伝子データバンク、例えばGenbank、EMBLからの 相同探索に基づいて調製され得る。配列相同探索は、種々の方法、例えばBLAST 族のコンピュータープログラムに記載された算法、Smith-Waterman算法等を用い
て成し遂げられ得る。例えば、保存アミノ酸は、種々のＧＥＦタンパク質のＲＧ
Ｓドメインを含有する種々の配列間で同定され得る（図１８参照）。突然変異（
単数または複数）は、次に、ポリペプチド間に保存されたアミノ酸を同定し、整
列することにより、そして次に保存化または非保存化位置のアミノ酸を修飾する
ことにより、このような配列中に導入され得る。突然変異化ＲＧＳ−ＧＥＦ配列
は、例えば相同的核酸の対応する領域間に、保存化または非保存化アミノ酸を包
含し得る。例えば、突然変異化配列は、前記のようなおよび／または適切な探索
算法から確定されるようなあらゆる数の相同配列からの保存化または非保存化残
基を包含し得る。
【００２５】 対応する突然変異は、ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸の特定の領域で作製され得る。例え
ば、ＧＴＰアーゼ触媒機能または突然変異に関与するアミノ酸が、ＲＧＳ−ＧＥ
Ｆ配列とＧαサブユニットとの間の接触点として機能するアミノ酸中に作られ得
る突然変異が作製され得る。 ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたはその断片、あるいは置換ＲＧＳ−ＧＥＦポ
リペプチドまたはその断片は、種々の修飾も包含し得るが、この場合、このよう
な修飾としては、グリコシル化、共有修飾（例えば、アミノ酸のＲ基の）、アミ
ノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸付加が挙げられる。ポリペプチドに対
する修飾は、種々の方法、例えば組換え、合成、化学的方法等により成し遂げら
れ得る。
ば、ＧＴＰアーゼ触媒機能または突然変異に関与するアミノ酸が、ＲＧＳ−ＧＥ
Ｆ配列とＧαサブユニットとの間の接触点として機能するアミノ酸中に作られ得
る突然変異が作製され得る。 ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたはその断片、あるいは置換ＲＧＳ−ＧＥＦポ
リペプチドまたはその断片は、種々の修飾も包含し得るが、この場合、このよう
な修飾としては、グリコシル化、共有修飾（例えば、アミノ酸のＲ基の）、アミ
ノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸付加が挙げられる。ポリペプチドに対
する修飾は、種々の方法、例えば組換え、合成、化学的方法等により成し遂げら
れ得る。
【００２６】 本発明のポリペプチド（例えばＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド、ならびにその断
片および突然変異）は、種々の方面に、例えば下記のような抗体に対する免疫原
として、生物学的活性剤（例えば、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドに関連した１つ
又はそれ以上の活性を有する）として、対応する全長ポリペプチドの活性の阻害
剤として、用いられ得る。例えば、p115 Rho−ＧＥＦのＧαサブユニットとの結
合時に、事象のカスケードが細胞中で開始され、例えば細胞増殖および／または
細胞骨格再配列を促進する。p115 Rho−ＧＥＦおよびＧαサブユニット間の相互
作用は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたはその断片を用いることにより調節さ
れて、 p115 Rho−ＧＥＦおよびＧαサブユニット間の相互作用を抑制し得る。 このような断片は、Rhoシグナリング経路に関連した病的症状を調節するのに有 用であり得る。有用な断片は、Ｇαサブユニットを伴うp115 Rho−ＧＥＦの結合
を抑制し、またはＧαサブユニットに対するp115 Rho−ＧＥＦのＧＡＰ活性を抑
制するＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインの全長の重複断片の能力を調べること
により、ルーチンに同定され得る。これらの活性の測定は、下記にならびに実施
例に記載されている。ペプチドは、化学的に等で修飾され得る。
片および突然変異）は、種々の方面に、例えば下記のような抗体に対する免疫原
として、生物学的活性剤（例えば、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドに関連した１つ
又はそれ以上の活性を有する）として、対応する全長ポリペプチドの活性の阻害
剤として、用いられ得る。例えば、p115 Rho−ＧＥＦのＧαサブユニットとの結
合時に、事象のカスケードが細胞中で開始され、例えば細胞増殖および／または
細胞骨格再配列を促進する。p115 Rho−ＧＥＦおよびＧαサブユニット間の相互
作用は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたはその断片を用いることにより調節さ
れて、 p115 Rho−ＧＥＦおよびＧαサブユニット間の相互作用を抑制し得る。 このような断片は、Rhoシグナリング経路に関連した病的症状を調節するのに有 用であり得る。有用な断片は、Ｇαサブユニットを伴うp115 Rho−ＧＥＦの結合
を抑制し、またはＧαサブユニットに対するp115 Rho−ＧＥＦのＧＡＰ活性を抑
制するＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインの全長の重複断片の能力を調べること
により、ルーチンに同定され得る。これらの活性の測定は、下記にならびに実施
例に記載されている。ペプチドは、化学的に等で修飾され得る。
【００２７】 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、１つ又はそれ以上の構造性ドメイン
、機能性ドメイン、検出可能ドメイン、抗原性ドメインおよび／またはその他の
当該ポリペプチドを、天然には生じない、即ち非天然である配列中に包含し得る
。このような特徴を包含するポリペプチドは、キメラまたは融合ポリペプチドで
ある。このような肌理だポリペプチドは、種々の方法、例えば化学的、合成、準
合成および／または組換え法により調製され得る。キメラポリペプチドをコード
するキメラ核酸は、例えばイントロン、スプライス部位、エンハンサー等を含有
する連続または中断開放読み枠中に、種々のドメインまたは所望のポリペプチド
を含有し得る。キメラ核酸は、種々の方法により産生され得る（例えば、米国特
許第5,439,819号参照）。ドメインまたは所望のポリペプチドは、あらゆる所望 の特性、例えば触媒的、シグナリング、増殖促進、細胞ターゲッティング機能等
を含めた生物学的機能、疎水性、親水性、膜スパンニング等のような構造的機能
、受容体−配位子機能、および／または、例えば酵素、蛍光ポリペプチド、グリ
ーン蛍光タンパク質ＧＦＰと組合せた検出可能機能を有し得る（Chalfie et al.
, 1994, Science, 263:802; Cheng et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:6
06; Levy et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:610等）。さらに、ＲＧＳ −ＧＥＦ核酸またはその断片は、宿主細胞中に導入された場合に、選択可能マー
カーとして用いられ得る。例えば、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸は、
枠な遺伝子所望のコード配列に融合されて、精製、選択またはマーキングのため
のタグとして作用する。
、機能性ドメイン、検出可能ドメイン、抗原性ドメインおよび／またはその他の
当該ポリペプチドを、天然には生じない、即ち非天然である配列中に包含し得る
。このような特徴を包含するポリペプチドは、キメラまたは融合ポリペプチドで
ある。このような肌理だポリペプチドは、種々の方法、例えば化学的、合成、準
合成および／または組換え法により調製され得る。キメラポリペプチドをコード
するキメラ核酸は、例えばイントロン、スプライス部位、エンハンサー等を含有
する連続または中断開放読み枠中に、種々のドメインまたは所望のポリペプチド
を含有し得る。キメラ核酸は、種々の方法により産生され得る（例えば、米国特
許第5,439,819号参照）。ドメインまたは所望のポリペプチドは、あらゆる所望 の特性、例えば触媒的、シグナリング、増殖促進、細胞ターゲッティング機能等
を含めた生物学的機能、疎水性、親水性、膜スパンニング等のような構造的機能
、受容体−配位子機能、および／または、例えば酵素、蛍光ポリペプチド、グリ
ーン蛍光タンパク質ＧＦＰと組合せた検出可能機能を有し得る（Chalfie et al.
, 1994, Science, 263:802; Cheng et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:6
06; Levy et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:610等）。さらに、ＲＧＳ −ＧＥＦ核酸またはその断片は、宿主細胞中に導入された場合に、選択可能マー
カーとして用いられ得る。例えば、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸は、
枠な遺伝子所望のコード配列に融合されて、精製、選択またはマーキングのため
のタグとして作用する。
【００２８】 本発明のポリペプチドは、発現系、例えば本発明のin vivo、in vitro、無細 胞、組換え、細胞融合等の発現系中で産生され得る。このような系により付与さ
れるポリペプチドに対する修飾としては、グリコシル化、アミノ酸置換（例えば
、コドン使用を異にすることにより）ポリペプチドプロセッシング、例えば消化
、切断、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼ活性、脂質、リン酸塩等
を含めた化学的部分の付着が挙げられる。例えば、いくつかの細胞株は、発現ポ
リペプチドから末端メチオニンを除去し得る。
れるポリペプチドに対する修飾としては、グリコシル化、アミノ酸置換（例えば
、コドン使用を異にすることにより）ポリペプチドプロセッシング、例えば消化
、切断、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼ活性、脂質、リン酸塩等
を含めた化学的部分の付着が挙げられる。例えば、いくつかの細胞株は、発現ポ
リペプチドから末端メチオニンを除去し得る。
【００２９】 本発明のポリペプチドは、通常の方法、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノ
ール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーにより、天然
供給源、形質転換宿主細胞（培地または細胞）から回収され得る。精製中に存在
する低濃度（約0.1〜5 mM）のカルシウムイオンを有することは有用であり得る （Price, et al., J. Biol. Chem. 244:917（1969））。高速液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製工程のために用いられ得る。
ール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーにより、天然
供給源、形質転換宿主細胞（培地または細胞）から回収され得る。精製中に存在
する低濃度（約0.1〜5 mM）のカルシウムイオンを有することは有用であり得る （Price, et al., J. Biol. Chem. 244:917（1969））。高速液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製工程のために用いられ得る。
【００３０】 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは
その断片に関する完全コード配列を包含し得る。本発明の核酸は、あらゆるＲＧ
Ｓ−ＧＥＦヌクレオチド配列に対して100％相補的な、例えばアンチセンスのヌ クレオチド配列も包含し得る。 本発明の核酸は、種々の異なる供給源から得られる。それは、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、例えば組織、細胞または全生物体から単離される、例えばポリアデニル化
ｍＲＮＡから得られる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはｃＤＮＡライブ
ラリーから直接得られる。核酸は、所望の遺伝子型、表現型等を有する、発生の
特定の段階の細胞（例えば、腫瘍形成的形質転換化細胞または癌性細胞）から得
られる。核酸はさらに、化学的に合成され得る。
その断片に関する完全コード配列を包含し得る。本発明の核酸は、あらゆるＲＧ
Ｓ−ＧＥＦヌクレオチド配列に対して100％相補的な、例えばアンチセンスのヌ クレオチド配列も包含し得る。 本発明の核酸は、種々の異なる供給源から得られる。それは、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、例えば組織、細胞または全生物体から単離される、例えばポリアデニル化
ｍＲＮＡから得られる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはｃＤＮＡライブ
ラリーから直接得られる。核酸は、所望の遺伝子型、表現型等を有する、発生の
特定の段階の細胞（例えば、腫瘍形成的形質転換化細胞または癌性細胞）から得
られる。核酸はさらに、化学的に合成され得る。
【００３１】 本発明の核酸は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドに関するコード配列のみを含み
得る。ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドに関するコード配列および付加的機能性コー
ド配列賭しては、例えばリーダー配列、分泌配列、タグ配列（例えばターゲッテ
ィングタグ、酵素タグ、蛍光タグ等）が挙げられる。本発明の核酸は、ＲＧＳ−
ＧＥＦポリペプチドに関するコード配列および非コード配列、例えば５‘または
３’末端の、またはコード配列中に分散される非翻訳配列、例えばイントロンも
含み得る。
得る。ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドに関するコード配列および付加的機能性コー
ド配列賭しては、例えばリーダー配列、分泌配列、タグ配列（例えばターゲッテ
ィングタグ、酵素タグ、蛍光タグ等）が挙げられる。本発明の核酸は、ＲＧＳ−
ＧＥＦポリペプチドに関するコード配列および非コード配列、例えば５‘または
３’末端の、またはコード配列中に分散される非翻訳配列、例えばイントロンも
含み得る。
【００３２】 本発明の核酸は、前記の核酸と操作可能的に連結する発現制御配列も包含する
。「発現制御配列」という語句は、それが操作可能的に連結される核酸によりコ
ードされるポリペプチドの発現を調節する核酸配列を意味する。したがって、発
現制御配列は、ｍＲＮＡ関連素子およびタンパク質関連素子を含む。このような
素子としては、プロモーター、エンハンサー（ウイルス性または細胞性）、リボ
ソーム結合配列、転写ターミネーター等が挙げられる。発現制御配列は、コード
配列の発現を実行または達成するために発現制御配列がこのような様子で配置さ
れる場合、ヌクレオチドコード配列に操作可能的に連結される。例えば、プロモ
ーターがコード配列に対して５‘に操作可能的に連結される場合、コード配列の
発現はプロモーターにより駆動される。発現制御配列は、正常遺伝子に対して異
種または内在性であり得る。
。「発現制御配列」という語句は、それが操作可能的に連結される核酸によりコ
ードされるポリペプチドの発現を調節する核酸配列を意味する。したがって、発
現制御配列は、ｍＲＮＡ関連素子およびタンパク質関連素子を含む。このような
素子としては、プロモーター、エンハンサー（ウイルス性または細胞性）、リボ
ソーム結合配列、転写ターミネーター等が挙げられる。発現制御配列は、コード
配列の発現を実行または達成するために発現制御配列がこのような様子で配置さ
れる場合、ヌクレオチドコード配列に操作可能的に連結される。例えば、プロモ
ーターがコード配列に対して５‘に操作可能的に連結される場合、コード配列の
発現はプロモーターにより駆動される。発現制御配列は、正常遺伝子に対して異
種または内在性であり得る。
【００３３】 本発明の核酸は、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて選択され得る。一緒
にハイブリダイズする２つの一本鎖核酸調製物の能力は、それらのヌクレオチド
配列相補性の度合い、例えばＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃなどのようなヌクレオチド間の塩基
対形成度である。したがって、本発明は、図１１、１３、１５および１７に記載
したようなヌクレオチド配列を包含する核酸とハイブリダイズする核酸にも関す
る。本発明は、核酸の両鎖、例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
にハイブリダイズする２つの一本鎖核酸調製物の能力は、それらのヌクレオチド
配列相補性の度合い、例えばＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃなどのようなヌクレオチド間の塩基
対形成度である。したがって、本発明は、図１１、１３、１５および１７に記載
したようなヌクレオチド配列を包含する核酸とハイブリダイズする核酸にも関す
る。本発明は、核酸の両鎖、例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
【００３４】 本発明によれば、核酸またはポリペプチドは、図１０〜１７に記載したヌクレ
オチドまたはアミノ酸配列における１つ又はそれ以上の差を包含し得る。ヌクレ
オチドおよび／またはアミノ酸配列に対する変化または修飾は、あらゆる利用可
能な方法、例えば特定化または無作為突然変異誘発により成し遂げられ得る。 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドをコードする核酸は、天然ＧＥＦ遺伝子
、例えば天然多型、正常または突然変異体対立遺伝子（ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸）中に生じるヌクレオチド、哺乳類、例えばヒト、サル、ブタ、マウス、ラ
ットまたはウサギの自然集団中に発見される突然変異を包含し得る。天然という
用語は、核酸が天然供給源、例えば動物組織および細胞、体液、組織培養細胞、
法医学標本から得られる、ということを意味する。天然突然変異には、ヌクレオ
チド配列の欠失、置換または付加が含まれる。これらの遺伝子は、当業者に周知
の方法にしたがって、核酸ハイブリダイゼーションにより検出され、単離され得
る。他の腫瘍遺伝子とから類推して、宿主細胞および生物体に病的症状を生じる
ＧＥＦタンパク質の天然変異体は、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインにおける
欠失、置換および付加を有する変異体を含む、と認識されている。
オチドまたはアミノ酸配列における１つ又はそれ以上の差を包含し得る。ヌクレ
オチドおよび／またはアミノ酸配列に対する変化または修飾は、あらゆる利用可
能な方法、例えば特定化または無作為突然変異誘発により成し遂げられ得る。 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドをコードする核酸は、天然ＧＥＦ遺伝子
、例えば天然多型、正常または突然変異体対立遺伝子（ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸）中に生じるヌクレオチド、哺乳類、例えばヒト、サル、ブタ、マウス、ラ
ットまたはウサギの自然集団中に発見される突然変異を包含し得る。天然という
用語は、核酸が天然供給源、例えば動物組織および細胞、体液、組織培養細胞、
法医学標本から得られる、ということを意味する。天然突然変異には、ヌクレオ
チド配列の欠失、置換または付加が含まれる。これらの遺伝子は、当業者に周知
の方法にしたがって、核酸ハイブリダイゼーションにより検出され、単離され得
る。他の腫瘍遺伝子とから類推して、宿主細胞および生物体に病的症状を生じる
ＧＥＦタンパク質の天然変異体は、ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインにおける
欠失、置換および付加を有する変異体を含む、と認識されている。
【００３５】 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例え
ば天然遺伝子、転写体またはｃＤＮＡ中に見出されるコドンを含有し、あるいは
それは同一アミノ酸配列をコードする縮重コドンを含有し得る。 さらに、本発明の核酸またはポリペプチドはあらゆる所望の哺乳類生物体から
得られるが、しかし非哺乳類生物体からも得られる。哺乳類および非哺乳類生物
体からの相同体は、種々の方法により得られる。例えば、本発明のＧＥＦのＲＧ
ＳドメインまたはＲＧＳ−ＧＥＦに対して選択性であるオリゴヌクレオチド（下
記参照）とのハイブリダイゼーションは、例えばSambrook et al., Molecular C
loning, 1989, Chapter 11に記載されているような相同体を選択するために用い
られ得る。このような相同体は、予め同定されたＲＧＳドメインまたはＲＧＳ−
ＧＥＦヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する種々の量のヌクレオチドお
よびアミノ酸配列同一性および類似性を有し得る。非哺乳類生物としては、例え
ば脊椎動物、無脊椎動物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ショウジョウバエ、酵
母菌（例えばビール酵母菌）、C. elegans、回虫、原核生物、植物、イヌナズナ
、ウイルス等が挙げられる。
ば天然遺伝子、転写体またはｃＤＮＡ中に見出されるコドンを含有し、あるいは
それは同一アミノ酸配列をコードする縮重コドンを含有し得る。 さらに、本発明の核酸またはポリペプチドはあらゆる所望の哺乳類生物体から
得られるが、しかし非哺乳類生物体からも得られる。哺乳類および非哺乳類生物
体からの相同体は、種々の方法により得られる。例えば、本発明のＧＥＦのＲＧ
ＳドメインまたはＲＧＳ−ＧＥＦに対して選択性であるオリゴヌクレオチド（下
記参照）とのハイブリダイゼーションは、例えばSambrook et al., Molecular C
loning, 1989, Chapter 11に記載されているような相同体を選択するために用い
られ得る。このような相同体は、予め同定されたＲＧＳドメインまたはＲＧＳ−
ＧＥＦヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する種々の量のヌクレオチドお
よびアミノ酸配列同一性および類似性を有し得る。非哺乳類生物としては、例え
ば脊椎動物、無脊椎動物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ショウジョウバエ、酵
母菌（例えばビール酵母菌）、C. elegans、回虫、原核生物、植物、イヌナズナ
、ウイルス等が挙げられる。
【００３６】 本発明の核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、合成核酸、ペプチド核酸、修飾ヌク
レオチド、またはそれらの混合物を包含し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖
であり得る。核酸を包含するヌクレオチドは、所望の目的によって、種々の既知
の結合、例えばエステル、スルファメート、スルファミド、ホスホロチオエート
、ホスホラミデート、メチルホスホネート、カルバメート等を介して連結され得
る。連結は、例えば、ＲＮアーゼＨのようなヌクレアーゼに対する耐性ならびに
改良型in vivo安定性のために修飾され得る（例えば、米国特許第5,378,825号参
照）。
レオチド、またはそれらの混合物を包含し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖
であり得る。核酸を包含するヌクレオチドは、所望の目的によって、種々の既知
の結合、例えばエステル、スルファメート、スルファミド、ホスホロチオエート
、ホスホラミデート、メチルホスホネート、カルバメート等を介して連結され得
る。連結は、例えば、ＲＮアーゼＨのようなヌクレアーゼに対する耐性ならびに
改良型in vivo安定性のために修飾され得る（例えば、米国特許第5,378,825号参
照）。
【００３７】 ハイブリダイゼーション、検出または安定性を改良する部分に検出可能マーカ
ー（アビジン、ビオチン、放射性素子）を付着するといったような種々の修飾は
、核酸に対して成され得る。核酸はさらに、所望の方法にしたがって、固体支持
体、例えばニトロセルロース、ナイロン、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラ
テックス固体ミクロスフェア、ポリアクリルアミド等に付着され得る（例えば、
米国特許第5,470,967号、第5,476,925号、第5,478,893号参照）。
ー（アビジン、ビオチン、放射性素子）を付着するといったような種々の修飾は
、核酸に対して成され得る。核酸はさらに、所望の方法にしたがって、固体支持
体、例えばニトロセルロース、ナイロン、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラ
テックス固体ミクロスフェア、ポリアクリルアミド等に付着され得る（例えば、
米国特許第5,470,967号、第5,476,925号、第5,478,893号参照）。
【００３８】 本発明の別の局面は、オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブに関する。この
ようなオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブは、例えば被験標本中のＲＧＳ−
ＧＥＦ核酸を検出、定量または単離するために用いられ得る。検出は、種々の目
的、例えば探索、診断及びび法医学のために望ましい。診断目的のためには、組
織、細胞、体液などから得られた標本中の特定のＲＧＳ−ＧＥＦ核酸配列の存在
または量を同定するのが望ましい。好ましい実施態様では、本発明は被験標本中
の標的ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸の検出方法であって、標的およびオリゴヌクレオチド
間のハイブリダイゼーションを成し遂げるのに有効な条件下で被験標本をオリゴ
ヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを包含
する方法に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成的核酸増幅、例えばＰ
ＣＲ（例えばSaiki et al., 1988, Science, 241:53; 米国特許第4,683,20号） または鑑別表示（例えば、Liang et al., Nucl. Acid. Res., 21:3269-3275, 19
93; 米国特許第5,599,672号；WO97/18454参照）にも用いられ得る。オリゴヌク レオチドは、例えば、このような配列を含有する遺伝子生成物を鑑別的に表示し
および／または増幅するために、ＤＨ、ＰＨおよびＲＧＳ−ＧＥＦドメインに対
してルーチンに同定され得る。
ようなオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブは、例えば被験標本中のＲＧＳ−
ＧＥＦ核酸を検出、定量または単離するために用いられ得る。検出は、種々の目
的、例えば探索、診断及びび法医学のために望ましい。診断目的のためには、組
織、細胞、体液などから得られた標本中の特定のＲＧＳ−ＧＥＦ核酸配列の存在
または量を同定するのが望ましい。好ましい実施態様では、本発明は被験標本中
の標的ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸の検出方法であって、標的およびオリゴヌクレオチド
間のハイブリダイゼーションを成し遂げるのに有効な条件下で被験標本をオリゴ
ヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを包含
する方法に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成的核酸増幅、例えばＰ
ＣＲ（例えばSaiki et al., 1988, Science, 241:53; 米国特許第4,683,20号） または鑑別表示（例えば、Liang et al., Nucl. Acid. Res., 21:3269-3275, 19
93; 米国特許第5,599,672号；WO97/18454参照）にも用いられ得る。オリゴヌク レオチドは、例えば、このような配列を含有する遺伝子生成物を鑑別的に表示し
および／または増幅するために、ＤＨ、ＰＨおよびＲＧＳ−ＧＥＦドメインに対
してルーチンに同定され得る。
【００３９】 センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列はともに、本発明の一部として意
図される。本発明の独特の核酸は、ルーチンに確定され得る。ＲＧＳ−ＧＥＦ核
酸は、例えばノーザンブロットにおいて核酸の混合物を包含する標本中のＲＧＳ
−ＧＥＦヌクレオチド配列の存在を同定するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いられ得る。ハイブリダイゼーションは、プローブとの少なくとも
95％同一性（即ち相補性）を有する核酸を選択するために、緊縮条件下で実施さ
れ得るが、しかしそれより低い緊縮条件も用いられ得る。独特のＲＧＳ−ＧＥＦ
ヌクレオチド配列は、枠内で、５‘または５’末端で、種々のヌクレオチド配列
、例えば酵素に関するコード配列、または発現制御配列等と融合され得る。
図される。本発明の独特の核酸は、ルーチンに確定され得る。ＲＧＳ−ＧＥＦ核
酸は、例えばノーザンブロットにおいて核酸の混合物を包含する標本中のＲＧＳ
−ＧＥＦヌクレオチド配列の存在を同定するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いられ得る。ハイブリダイゼーションは、プローブとの少なくとも
95％同一性（即ち相補性）を有する核酸を選択するために、緊縮条件下で実施さ
れ得るが、しかしそれより低い緊縮条件も用いられ得る。独特のＲＧＳ−ＧＥＦ
ヌクレオチド配列は、枠内で、５‘または５’末端で、種々のヌクレオチド配列
、例えば酵素に関するコード配列、または発現制御配列等と融合され得る。
【００４０】 ハイブリダイゼーションは、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, 19
89に記載されたような所望の選択性によって、異なる条件下で実施され得る。例
えば、ＲＧＳ−ＧＥＦ配列を特異的に検出するために、オリゴヌクレオチドは、
ＲＧＳ−ＧＥＦ配列が得られるＧＥＦ配列とオリゴヌクレオチドがハイブリダイ
ズするだけである、例えばオリゴヌクレオチドが標的と100％相補的である条件 下で、標的核酸とハイブリダイゼーションされ得る。100％未満のヌクレオチド 相補性、例えば少なくとも約99％、97％、95％、90％、70％、67％のヌクレオチ
ド相補性を有する標的核酸を選択するのが望ましい場合には、異なる条件が用い
られ得る。ＧＥＦ遺伝子における突然変異は疾患または病的症状、例えば癌、良
性腫瘍を引き起こし得るため、本発明のオリゴヌクレオチドは診断的に用いられ
得る。例えば、癌の徴候またはRhoシグナリング経路に関連したその他の症状を 有する患者（下記参照）は、配列が正常であるかを同定するためにポリメラーゼ
連鎖反応とその後のＤＮＡシーケンシングにおいて本発明のオリゴヌクレオチド
を、その他の癌遺伝子オリゴヌクレオチド等、例えばp53、Rb、p21、Db1、MTS1 、Wt1、Bcl-1、Bcl-2、MDM2等と組合せて用いることにより、疾患に関して診断 され得る。
89に記載されたような所望の選択性によって、異なる条件下で実施され得る。例
えば、ＲＧＳ−ＧＥＦ配列を特異的に検出するために、オリゴヌクレオチドは、
ＲＧＳ−ＧＥＦ配列が得られるＧＥＦ配列とオリゴヌクレオチドがハイブリダイ
ズするだけである、例えばオリゴヌクレオチドが標的と100％相補的である条件 下で、標的核酸とハイブリダイゼーションされ得る。100％未満のヌクレオチド 相補性、例えば少なくとも約99％、97％、95％、90％、70％、67％のヌクレオチ
ド相補性を有する標的核酸を選択するのが望ましい場合には、異なる条件が用い
られ得る。ＧＥＦ遺伝子における突然変異は疾患または病的症状、例えば癌、良
性腫瘍を引き起こし得るため、本発明のオリゴヌクレオチドは診断的に用いられ
得る。例えば、癌の徴候またはRhoシグナリング経路に関連したその他の症状を 有する患者（下記参照）は、配列が正常であるかを同定するためにポリメラーゼ
連鎖反応とその後のＤＮＡシーケンシングにおいて本発明のオリゴヌクレオチド
を、その他の癌遺伝子オリゴヌクレオチド等、例えばp53、Rb、p21、Db1、MTS1 、Wt1、Bcl-1、Bcl-2、MDM2等と組合せて用いることにより、疾患に関して診断 され得る。
【００４１】 本発明のオリゴヌクレオチドは、あらゆるサイズのもの、好ましくは14〜16オ
リゴヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。このようなオリゴヌクレオチ
ドは、非天然ヌクレオチド、例えばイノシンを有し得る。本発明によれば、オリ
ゴヌクレオチドは、所望の緩衝液（例えばリン酸塩、トリス等）、検出組成物等
を含有するキットを包含し得る。オリゴヌクレオチドは、当業界で既知の放射性
または非放射性標識で標識され得るし、あるいは標識されない。
リゴヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。このようなオリゴヌクレオチ
ドは、非天然ヌクレオチド、例えばイノシンを有し得る。本発明によれば、オリ
ゴヌクレオチドは、所望の緩衝液（例えばリン酸塩、トリス等）、検出組成物等
を含有するキットを包含し得る。オリゴヌクレオチドは、当業界で既知の放射性
または非放射性標識で標識され得るし、あるいは標識されない。
【００４２】 アンチセンス核酸は、本発明の核酸から、好ましくは図１１、１３、１５およ
び１７のＲＧＳ−ＧＥＦヌクレオチド配列に対応するアンチセンスＲＧＳ−ＧＥ
Ｆヌクレオチド配列から調製され得る。アンチセンスＲＧＳ−ＧＥＦ核酸は、種
々の方法に、例えばＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質の発現を調節ま
たは調整するために、あるいは例えばin-situハイブリダイゼーションにより、 ＲＧＳ−ＧＥＦタンパク質の発現を検出するために、用いられ得る。発現の調節
または調整のためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現制御配列と操
作可能的に連結され得る。
び１７のＲＧＳ−ＧＥＦヌクレオチド配列に対応するアンチセンスＲＧＳ−ＧＥ
Ｆヌクレオチド配列から調製され得る。アンチセンスＲＧＳ−ＧＥＦ核酸は、種
々の方法に、例えばＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質の発現を調節ま
たは調整するために、あるいは例えばin-situハイブリダイゼーションにより、 ＲＧＳ−ＧＥＦタンパク質の発現を検出するために、用いられ得る。発現の調節
または調整のためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現制御配列と操
作可能的に連結され得る。
【００４３】 本発明のＲＧＳ−ＧＥＦ核酸は、所望の方法により標識され得る。核酸は、放
射性トレーサー、例えば最も一般的に用いられるトレーサーのみを記載すると、 32 Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、3Ｈまたは14Ｃを用いて標識され得る。放射性標識化は、例
えば放射能標識化ヌクレオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ（ホスファターゼに
よる脱リン酸化を用いて、または用いずに）またはリガーゼ（標識される末端に
よって）を用いて３‘または５’末端で末端標識化するといった任意の方法によ
って、実行され得る。本発明の核酸を免疫原特性を有する（抗原、ハプテン）、
ある種の試薬に対する特異的親和性を有する（配位子）、検出可能酵素反応を完
了させ得る特性を有する（酵素または補酵素、酵素基質、あるいは酵素反応に関
与するその他の物質）、あるいは特徴的物理的特性、例えば蛍光または発光、あ
るいは所望の波長での光の吸収等の特性を有する残基と組合せた非放射能標識化
も用いられ得る。
射性トレーサー、例えば最も一般的に用いられるトレーサーのみを記載すると、 32 Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、3Ｈまたは14Ｃを用いて標識され得る。放射性標識化は、例
えば放射能標識化ヌクレオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ（ホスファターゼに
よる脱リン酸化を用いて、または用いずに）またはリガーゼ（標識される末端に
よって）を用いて３‘または５’末端で末端標識化するといった任意の方法によ
って、実行され得る。本発明の核酸を免疫原特性を有する（抗原、ハプテン）、
ある種の試薬に対する特異的親和性を有する（配位子）、検出可能酵素反応を完
了させ得る特性を有する（酵素または補酵素、酵素基質、あるいは酵素反応に関
与するその他の物質）、あるいは特徴的物理的特性、例えば蛍光または発光、あ
るいは所望の波長での光の吸収等の特性を有する残基と組合せた非放射能標識化
も用いられ得る。
【００４４】 オリゴ核酸、アンチセンス核酸等を含めた本発明のＲＧＳ−ＧＥＦ核酸は、種
々の技法、例えばノーザンブロット、ＰＣＲ、in-situハイブリダイゼーション 等により全器官、組織、細胞等中でのＲＧＳ−ＧＥＦ核酸の発現を検出するため
に用いられ得る。このような核酸は、発現攪乱、例えばＲＧＳ−ＧＥＦ発現の細
胞特異的および／または細胞画分変化を検出するのに特に有用であり得る。ＲＧ
Ｓ−ＧＥＦタンパク質のレベルは、単独で、または他の遺伝子生成物（癌遺伝子
、例えばp53、Rb、Wtl等）、転写体等と組合せて確定され得る。
々の技法、例えばノーザンブロット、ＰＣＲ、in-situハイブリダイゼーション 等により全器官、組織、細胞等中でのＲＧＳ−ＧＥＦ核酸の発現を検出するため
に用いられ得る。このような核酸は、発現攪乱、例えばＲＧＳ−ＧＥＦ発現の細
胞特異的および／または細胞画分変化を検出するのに特に有用であり得る。ＲＧ
Ｓ−ＧＥＦタンパク質のレベルは、単独で、または他の遺伝子生成物（癌遺伝子
、例えばp53、Rb、Wtl等）、転写体等と組合せて確定され得る。
【００４５】 本発明の核酸は、所望の目的によって、 in vitroおよびin vivoで、種々の異
なる系で 発現され得る。例えば、核酸は、発現ベクターに挿入され、所望の宿 主に導入され、そして核酸をコードされたポリペプチドの発現を成し遂げるのに
有効な条件下で培養され得る。有効条件としては、宿主細胞によりポリペプチド
の産生を成し遂げるのに適したあらゆる培養条件、例えば有効温度、ｐＨ、培地
、宿主細胞が培養される培地への付加物（例えば、コード核酸がdhfr遺伝子に隣
接する場合、ブチレートまたはメトトレキセートのような発現を増幅または誘導
する付加物）、シクロヘキサミド、細胞密度、培養皿等が挙げられる。核酸は、
例えば、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔、注入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介
性トランスフェクション、リポソームとの融合およびウイルストランスフェクシ
ョンを含めたあらゆる有効な方法により、細胞中に導入され得る。本発明の核酸
が導入された細胞は、形質転換宿主細胞である。核酸は、染色体外にあるか、ま
たは宿主細胞の染色体（単数または複数）中に統合され得る。それは安定である
かまたは一過性であり得る。発現ベクターは、宿主細胞とのその適合性に関して
選択される。宿主細胞としては、哺乳類細胞、例えばCOS-7，CHO、HeLa、LTK、N
IH 3T3，酵母菌、昆虫細胞、例えばSf9（S. frugipeda）およびショウジョウバ エ、細菌、例えば大腸菌、ストレプトコッカス種、バシラス種、酵母菌、真菌細
胞、植物、胚幹細胞（例えば哺乳類、例えばマウスまたはヒト）、癌または腫瘍
細胞が挙げられる。Sf9発現は、Graziani et al., Oncogene, 7:229-235, 1992 から類推して成し遂げられ得る。発現制御配列は、同様に、宿主適合性および所
望の目的、例えば高コピー数、高量、誘導、増幅、制御発現に関して選択される
。用いられ得るその他の配列には、例えばSV40、CMVからのエンハンサー、誘導 性プロモーター、細胞型特異的素子、または選択的または特異的細胞発現を可能
にする配列が含まれる。
なる系で 発現され得る。例えば、核酸は、発現ベクターに挿入され、所望の宿 主に導入され、そして核酸をコードされたポリペプチドの発現を成し遂げるのに
有効な条件下で培養され得る。有効条件としては、宿主細胞によりポリペプチド
の産生を成し遂げるのに適したあらゆる培養条件、例えば有効温度、ｐＨ、培地
、宿主細胞が培養される培地への付加物（例えば、コード核酸がdhfr遺伝子に隣
接する場合、ブチレートまたはメトトレキセートのような発現を増幅または誘導
する付加物）、シクロヘキサミド、細胞密度、培養皿等が挙げられる。核酸は、
例えば、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔、注入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介
性トランスフェクション、リポソームとの融合およびウイルストランスフェクシ
ョンを含めたあらゆる有効な方法により、細胞中に導入され得る。本発明の核酸
が導入された細胞は、形質転換宿主細胞である。核酸は、染色体外にあるか、ま
たは宿主細胞の染色体（単数または複数）中に統合され得る。それは安定である
かまたは一過性であり得る。発現ベクターは、宿主細胞とのその適合性に関して
選択される。宿主細胞としては、哺乳類細胞、例えばCOS-7，CHO、HeLa、LTK、N
IH 3T3，酵母菌、昆虫細胞、例えばSf9（S. frugipeda）およびショウジョウバ エ、細菌、例えば大腸菌、ストレプトコッカス種、バシラス種、酵母菌、真菌細
胞、植物、胚幹細胞（例えば哺乳類、例えばマウスまたはヒト）、癌または腫瘍
細胞が挙げられる。Sf9発現は、Graziani et al., Oncogene, 7:229-235, 1992 から類推して成し遂げられ得る。発現制御配列は、同様に、宿主適合性および所
望の目的、例えば高コピー数、高量、誘導、増幅、制御発現に関して選択される
。用いられ得るその他の配列には、例えばSV40、CMVからのエンハンサー、誘導 性プロモーター、細胞型特異的素子、または選択的または特異的細胞発現を可能
にする配列が含まれる。
【００４６】 標識化ポリペプチドは、p115 Rho-ＧＥＦと結合または付着する物質を同定し 、in vitro、in vivoまたはin-situ系等における細胞中のp115 Rho−ＧＥＦの動
きを追跡するための、例えば結合検定に用いられ得る。 本発明の核酸またはポリペプチドは、実質的に精製され得る。実質的に精製さ
れるとは、核酸またはポリペプチドが分離され、そして本質的に他の核酸または
ポリペプチドを含有しない、即ち核酸またはポリペプチドは主要且つ活性成分で
ある。
きを追跡するための、例えば結合検定に用いられ得る。 本発明の核酸またはポリペプチドは、実質的に精製され得る。実質的に精製さ
れるとは、核酸またはポリペプチドが分離され、そして本質的に他の核酸または
ポリペプチドを含有しない、即ち核酸またはポリペプチドは主要且つ活性成分で
ある。
【００４７】 本発明の別の局面は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドが関与する生物学的経路、
特に病的症状、例えば細胞増殖（例えば癌）、増殖制御、形態形成、張繊維形成
およびインテグリン媒介性相互作用、例えば胚発生、腫瘍細胞増殖および転移、
プログラムされた細胞死、ホメオスタシス、白血球ホーミングおよび活性化、骨
吸収、凝塊退縮、ならびに機械的ストレスに対する細胞の応答の調節に関する（
例えば、Clark and Brugge, Science, 268:233-239, 1995; Bussey, Science, 2
72:225-226, 1996参照）。したがって、本発明は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド
の活性の調整方法であって、有効量のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学
的に活性なその断片、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドの活性を調整する有効量の化
合物、あるいはＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を
コードする有効量の核酸を投与することを包含する方法のすべての局面に関する
。調整されるＲＧＳ−ＧＥＦの活性には、Ｇαサブユニットとの結合またはＧα
サブユニットに対するＧＡＰ活性が含まれる。活性は、ＲＧＳ−ＧＥＦの発現ま
たは活性を増大し、低減し、相殺し、または促進することにより調整され得る。
特に病的症状、例えば細胞増殖（例えば癌）、増殖制御、形態形成、張繊維形成
およびインテグリン媒介性相互作用、例えば胚発生、腫瘍細胞増殖および転移、
プログラムされた細胞死、ホメオスタシス、白血球ホーミングおよび活性化、骨
吸収、凝塊退縮、ならびに機械的ストレスに対する細胞の応答の調節に関する（
例えば、Clark and Brugge, Science, 268:233-239, 1995; Bussey, Science, 2
72:225-226, 1996参照）。したがって、本発明は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド
の活性の調整方法であって、有効量のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学
的に活性なその断片、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドの活性を調整する有効量の化
合物、あるいはＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を
コードする有効量の核酸を投与することを包含する方法のすべての局面に関する
。調整されるＲＧＳ−ＧＥＦの活性には、Ｇαサブユニットとの結合またはＧα
サブユニットに対するＧＡＰ活性が含まれる。活性は、ＲＧＳ−ＧＥＦの発現ま
たは活性を増大し、低減し、相殺し、または促進することにより調整され得る。
【００４８】 本発明は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドを特異的に認識する抗体にも関する。
抗体、例えばポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ抗体は、あらゆ
る所望の方法により調製され得る。例えば、モノクローナル抗体の産生に関して
は、図１０、１２、１４または１６のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、免疫応答
を引き出すのに有効な量で、アジュバントを用いてまたは用いずに、皮下および
／または腹腔内投与で、マウス、ヤギまたはウサギに投与され得る。抗体は、一
本差またはＦＡｂでもあり得る。抗体は、ＩｇＧ、サブタイプ、ＩｇＧ２ａ、Ｉ
ｇＧ１などであり得る。
抗体、例えばポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ抗体は、あらゆ
る所望の方法により調製され得る。例えば、モノクローナル抗体の産生に関して
は、図１０、１２、１４または１６のＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、免疫応答
を引き出すのに有効な量で、アジュバントを用いてまたは用いずに、皮下および
／または腹腔内投与で、マウス、ヤギまたはウサギに投与され得る。抗体は、一
本差またはＦＡｂでもあり得る。抗体は、ＩｇＧ、サブタイプ、ＩｇＧ２ａ、Ｉ
ｇＧ１などであり得る。
【００４９】 ＲＧＳ−ＧＥＦに特異的な抗体とは、抗体が、ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳド
メイン内のまたはそのアミノ酸配列を含めたアミノ酸の限定配列を認識すること
を意味する。したがって、特異的抗体は、例えばイムノブロット検定により検出
および／または測定した場合、異なるエピトープ（単数または複数）よりも、Ｇ
ＥＦポリペプチドのＲＧＳドメイン中に見出されるアミノ酸配列、即ちエピトー
プと、高親和性で結合する。したがって、p115 Rho−ＧＥＦのＲＧＳドメイン内
のまたはそれを含めたエピトープに特異的な抗体は、標本、例えばp115 Rho−Ｇ
ＥＦ遺伝子生成物を含有する組織の標本中のエピトープの存在を検出し、エピト
ープが存在しない標本とそれを区別するのに有用である。
メイン内のまたはそのアミノ酸配列を含めたアミノ酸の限定配列を認識すること
を意味する。したがって、特異的抗体は、例えばイムノブロット検定により検出
および／または測定した場合、異なるエピトープ（単数または複数）よりも、Ｇ
ＥＦポリペプチドのＲＧＳドメイン中に見出されるアミノ酸配列、即ちエピトー
プと、高親和性で結合する。したがって、p115 Rho−ＧＥＦのＲＧＳドメイン内
のまたはそれを含めたエピトープに特異的な抗体は、標本、例えばp115 Rho−Ｇ
ＥＦ遺伝子生成物を含有する組織の標本中のエピトープの存在を検出し、エピト
ープが存在しない標本とそれを区別するのに有用である。
【００５０】 さらに、本発明によれば、ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインと結合する配
位子も、例えば合成ペプチドライブラリーまたはaptamerを用いて調製され得る （例えば、Pitrung et al., 米国特許第5,143,854号；Geysen et al., 1987, J.
Immunol. Methods, 102:259-274; Scott et al., 1990, Science, 249:386; Bl
ackwell et al., 1990, Science, 250:1104; Tuerk et al., 1990, Science, 24
9:505）。
位子も、例えば合成ペプチドライブラリーまたはaptamerを用いて調製され得る （例えば、Pitrung et al., 米国特許第5,143,854号；Geysen et al., 1987, J.
Immunol. Methods, 102:259-274; Scott et al., 1990, Science, 249:386; Bl
ackwell et al., 1990, Science, 250:1104; Tuerk et al., 1990, Science, 24
9:505）。
【００５１】 ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインと結合する抗体およびその他の配位子、
ならびに特に、p115 RhoＧＥＦのＲＧＳドメインと結合する抗体およびその他の
配位子は、種々の方法に用いられ得る。これらの例としては、例えば、動物、組
織、細胞等の中のp115 Rho−ＧＥＦポリペプチドのレベルを定量するための、 p
115 Rho−ＧＥＦの細胞局在化および／または分布を同定するための、 p115 Rho
−ＧＥＦまたはp115 Rho−ＧＥＦの一部を包含するポリペプチドを精製するため
の、 p115 Rho−ＧＥＦの機能を調整するため等のための療法的、診断的、なら びに商業的探索道具用途が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、ウエ
スタンブロット、ＥＬＩＺＡ、免疫沈降、ＲＩＡ等に用いられ得る。本発明は、
このような検定、組成物およびそれらの実施のためのキット等に関する。
ならびに特に、p115 RhoＧＥＦのＲＧＳドメインと結合する抗体およびその他の
配位子は、種々の方法に用いられ得る。これらの例としては、例えば、動物、組
織、細胞等の中のp115 Rho−ＧＥＦポリペプチドのレベルを定量するための、 p
115 Rho−ＧＥＦの細胞局在化および／または分布を同定するための、 p115 Rho
−ＧＥＦまたはp115 Rho−ＧＥＦの一部を包含するポリペプチドを精製するため
の、 p115 Rho−ＧＥＦの機能を調整するため等のための療法的、診断的、なら びに商業的探索道具用途が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、ウエ
スタンブロット、ＥＬＩＺＡ、免疫沈降、ＲＩＡ等に用いられ得る。本発明は、
このような検定、組成物およびそれらの実施のためのキット等に関する。
【００５２】 本発明の抗体は、組織、細胞、体液、尿、脳脊髄液を含めた種々の標本中のＧ
ＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインを含有するポリペプチドまたは断片を検出す
るために用いられ得る。本発明の方法は、結合を成し遂げるのに、当業界で既知
のような、有効な条件下で図１０、１２、１４または１６のＲＧＳ−ＧＥＦポリ
ペプチドに結合する配位子を接触させ、配位子とペプチド間の特異的結合を検出
することを包含する。特異的結合とは、例えば図１０、１２、１４または１６に
示したようなＲＧＳドメインのアミノ酸配列またはその誘導体内の、またはそれ
を含めたアミノ酸の限定配列に配位子が付着することを意味する。抗体またはそ
の誘導体は、ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質の発現を抑制するため
にも用いられ得る。ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦポリペプチドのレベルは、
単独で、または他の遺伝子生成物と組合せて確定され得る。特に、ＲＧＳドメイ
ンを含有するＧＥＦポリペプチドの量（例えば、その発現レベル）は、同一のま
たは異なる標本中の他のポリペプチド、例えばp21、p53、Rb、WT1等の量と比較 され得る（例えば、比として）。
ＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインを含有するポリペプチドまたは断片を検出す
るために用いられ得る。本発明の方法は、結合を成し遂げるのに、当業界で既知
のような、有効な条件下で図１０、１２、１４または１６のＲＧＳ−ＧＥＦポリ
ペプチドに結合する配位子を接触させ、配位子とペプチド間の特異的結合を検出
することを包含する。特異的結合とは、例えば図１０、１２、１４または１６に
示したようなＲＧＳドメインのアミノ酸配列またはその誘導体内の、またはそれ
を含めたアミノ酸の限定配列に配位子が付着することを意味する。抗体またはそ
の誘導体は、ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質の発現を抑制するため
にも用いられ得る。ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦポリペプチドのレベルは、
単独で、または他の遺伝子生成物と組合せて確定され得る。特に、ＲＧＳドメイ
ンを含有するＧＥＦポリペプチドの量（例えば、その発現レベル）は、同一のま
たは異なる標本中の他のポリペプチド、例えばp21、p53、Rb、WT1等の量と比較 され得る（例えば、比として）。
【００５３】 ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインに関する配位子は、他の抗体、例えば癌
の腫瘍学的マーカー、例えばRb、p53、c-erbB-2含有遺伝子生成物等を認識する 抗体と組合せて用いられ得る。概して、ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインに
特異的な試薬は、例えば米国特許第5,397,712号、第5,434,050号、第5,429,947 号のようなあらゆる所望の方法により、診断および／または法医学試験に用いら
れ得る。
の腫瘍学的マーカー、例えばRb、p53、c-erbB-2含有遺伝子生成物等を認識する 抗体と組合せて用いられ得る。概して、ＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメインに
特異的な試薬は、例えば米国特許第5,397,712号、第5,434,050号、第5,429,947 号のようなあらゆる所望の方法により、診断および／または法医学試験に用いら
れ得る。
【００５４】 本発明は、ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドを包含するトランスジェニック動物、
例えば非ヒト哺乳類、例えばマウスにも関する。トランスジェニック動物は、既
知の方法により、例えば１細胞胚の前核中への組換え遺伝子の前核注入、人工酵
母菌染色体の胚幹細胞中への組み入れ、遺伝子ターゲッティング法、胚幹細胞法
により調製され得る（例えば、米国特許第4,736,866号；第4,873,191号；第4,87
3,316号；第5,082,779号；第5,304,489号；第5,174,986号；第5,175,384号；第5
,175,385号；第5,221,778号；Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:738
0-7384（1980）; Palmiter et al., Cell, 41:343-345（1985）; Palmiter et a
l., Ann. Rev. Genet., 20:465-499（1986）; Askew et al., Mol. Cell. Bio.,
13:4115-4124, 1993; Games et al., Nature, 373:523-527, 1995; Valancius
and Smithies, Mol. Cell. Bio., 11:1402-1408, 1991; Stacey et al., Mol. C
ell. Bio., 14:1009-1016, 1994; Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995;
Rubinstein et al., Nucl. Acid Res., 21:2613-2617, 1993参照）。本発明の核
酸は、あらゆる非ヒト哺乳類、例えばマウス（Hogan et al., 1986, Manipulati
ng the Mouse Embryo:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York）、ブタ（Hammer et al., Nature, 315:343-345
, 1985）、ヒツジ（Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985）、畜牛、ラッ
トまたは霊長類中に導入され得る（例えば、Church, 1987, Trends in Biotech.
5:13-19; Clark et al., 1987, Trends in Biotech. 5:20-24;およびDePamphil
is et al., 1988, Bio Techniques, 6:662-680も参照）。さらに、慣例のトラン
スジェニックラットおよびマウス製品は市販されている。これらのトランスジェ
ニック動物は、例えば癌モデルとして、またはＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドの過
剰発現の作用を評価するためのモデルとして有用である。
例えば非ヒト哺乳類、例えばマウスにも関する。トランスジェニック動物は、既
知の方法により、例えば１細胞胚の前核中への組換え遺伝子の前核注入、人工酵
母菌染色体の胚幹細胞中への組み入れ、遺伝子ターゲッティング法、胚幹細胞法
により調製され得る（例えば、米国特許第4,736,866号；第4,873,191号；第4,87
3,316号；第5,082,779号；第5,304,489号；第5,174,986号；第5,175,384号；第5
,175,385号；第5,221,778号；Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:738
0-7384（1980）; Palmiter et al., Cell, 41:343-345（1985）; Palmiter et a
l., Ann. Rev. Genet., 20:465-499（1986）; Askew et al., Mol. Cell. Bio.,
13:4115-4124, 1993; Games et al., Nature, 373:523-527, 1995; Valancius
and Smithies, Mol. Cell. Bio., 11:1402-1408, 1991; Stacey et al., Mol. C
ell. Bio., 14:1009-1016, 1994; Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995;
Rubinstein et al., Nucl. Acid Res., 21:2613-2617, 1993参照）。本発明の核
酸は、あらゆる非ヒト哺乳類、例えばマウス（Hogan et al., 1986, Manipulati
ng the Mouse Embryo:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York）、ブタ（Hammer et al., Nature, 315:343-345
, 1985）、ヒツジ（Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985）、畜牛、ラッ
トまたは霊長類中に導入され得る（例えば、Church, 1987, Trends in Biotech.
5:13-19; Clark et al., 1987, Trends in Biotech. 5:20-24;およびDePamphil
is et al., 1988, Bio Techniques, 6:662-680も参照）。さらに、慣例のトラン
スジェニックラットおよびマウス製品は市販されている。これらのトランスジェ
ニック動物は、例えば癌モデルとして、またはＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドの過
剰発現の作用を評価するためのモデルとして有用である。
【００５５】 一般に、本発明の核酸、ポリペプチド、抗体等は、米国特許第5,501,969号、 第5,506,133号、第5,441,870号、WO90/00607；WO91/15582に記載されたように調
製され、使用され得る。 本発明のその他の局面は、以下の相互作用および作用を調整する分子に関して
検定し、または同定するための方法に関する：ＧＥＦのＲＧＳドメインとそのコ
グネイト結合基質との間の相互作用；ＧＥＦのＲＧＳドメインとＧαサブユニッ
トとの間の相互作用；ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質のグアニンヌ
クレオチド交換活性に及ぼすＧタンパク質サブユニット刺激の作用；Ｇタンパク
質サブユニットに関するＧＴＰアーゼ活性化タンパク質としてのＲＧＳドメイン
を有するＧＥＦタンパク質の作用。
製され、使用され得る。 本発明のその他の局面は、以下の相互作用および作用を調整する分子に関して
検定し、または同定するための方法に関する：ＧＥＦのＲＧＳドメインとそのコ
グネイト結合基質との間の相互作用；ＧＥＦのＲＧＳドメインとＧαサブユニッ
トとの間の相互作用；ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質のグアニンヌ
クレオチド交換活性に及ぼすＧタンパク質サブユニット刺激の作用；Ｇタンパク
質サブユニットに関するＧＴＰアーゼ活性化タンパク質としてのＲＧＳドメイン
を有するＧＥＦタンパク質の作用。
【００５６】 活性は、種々の方法で、例えば増強し、活性化し、刺激し、抑制し、防止し、
阻害する等で調整され得る。調整分子は、作動剤、拮抗剤であり得る化、または
その部分的活性を有し得る。調整分子は、あらゆる種類の分子であり、その例と
しては、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸等が挙げられるが、これら
に限定されない。概して、in vitro活性を有する化合物は、例えば前記の生物学
的および細胞活性に関連した病的症状を治療するために、ＲＧＳドメインを含有
するＧＥＦタンパク質に関連した生物学的経路をin vivoで調整するのに有用で ある。調整分子は、同一または異なる分子の混合物を包含し得る。
阻害する等で調整され得る。調整分子は、作動剤、拮抗剤であり得る化、または
その部分的活性を有し得る。調整分子は、あらゆる種類の分子であり、その例と
しては、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸等が挙げられるが、これら
に限定されない。概して、in vitro活性を有する化合物は、例えば前記の生物学
的および細胞活性に関連した病的症状を治療するために、ＲＧＳドメインを含有
するＧＥＦタンパク質に関連した生物学的経路をin vivoで調整するのに有用で ある。調整分子は、同一または異なる分子の混合物を包含し得る。
【００５７】 ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインのための結合基質は、ＲＧＳドメインが結
合するあらゆる物質、特に、例えばＧα１２族の成員であり得る（例えば、Stra
thman and Simon, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:5582, 1991参照）。例えば、Ｇ
タンパク質αサブユニットとＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質、例え
ばp115 Rho−ＧＥＦとの結合を調整または調節する分子に関する同定または検定
方法は、本発明にしたがって実行され得る。一実施態様では、ＧＴＰ結合αサブ
ユニットまたはその誘導体は、被験分子の存在下または非存在下で、ＲＧＳドメ
インを有するＧＥＦタンパク質またはその断片とともにインキュベートされて、
被験化合物の存在がＧＥＦタンパク質とＧタンパク質アルファサブユニットとの
間の結合を調整する。インキュベーションは、有効条件下で、即ち結合または付
着が起こる条件下で成し遂げられる。結合は、１つ又はそれ以上の方法で検出さ
れ得る。例えば、ＧＥＦタンパク質または結合基質は、検出可能的に標識される
：標識化結合構成成分は、標識化遊離構成成分から分離される：そして、結合−
検出可能的標識化ＧＥＦタンパク質または結合基質の量が確定される。検出可能
標識は、例えば放射性、蛍光等といったあらゆる所望の組成物であり得る。この
ような検定は、固相または液相で実施され得る。
合するあらゆる物質、特に、例えばＧα１２族の成員であり得る（例えば、Stra
thman and Simon, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:5582, 1991参照）。例えば、Ｇ
タンパク質αサブユニットとＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質、例え
ばp115 Rho−ＧＥＦとの結合を調整または調節する分子に関する同定または検定
方法は、本発明にしたがって実行され得る。一実施態様では、ＧＴＰ結合αサブ
ユニットまたはその誘導体は、被験分子の存在下または非存在下で、ＲＧＳドメ
インを有するＧＥＦタンパク質またはその断片とともにインキュベートされて、
被験化合物の存在がＧＥＦタンパク質とＧタンパク質アルファサブユニットとの
間の結合を調整する。インキュベーションは、有効条件下で、即ち結合または付
着が起こる条件下で成し遂げられる。結合は、１つ又はそれ以上の方法で検出さ
れ得る。例えば、ＧＥＦタンパク質または結合基質は、検出可能的に標識される
：標識化結合構成成分は、標識化遊離構成成分から分離される：そして、結合−
検出可能的標識化ＧＥＦタンパク質または結合基質の量が確定される。検出可能
標識は、例えば放射性、蛍光等といったあらゆる所望の組成物であり得る。この
ような検定は、固相または液相で実施され得る。
【００５８】 本発明の一局面では、Ｇα12族のサブユニット、例えばＧα12およびＧα13の
、ＧＥＦ、例えばp115 RhoＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０またはDrhoＧＥＦ２
との結合を調節する分子を同定するのが望ましい。検定は、ＲＧＳドメインまた
はＲＧＳドメインの生物学的活性亜断片を含有する完全ＧＥＦタンパク質または
そのあらゆる亜断片を用いて実行され得る。検定は、典型的には、ＧＴＰ結合状
態のＧαサブユニットの安定類似体、例えばＧＤＰ−ＡＩＦ4 -またはＧＴＰγＳ
に結合されたαサブユニットを用いて実行される。例えば、結合検定は、下記の
実施例５に記載された方法により実行され得るが、この場合、COS細胞は、myc−
タグ化ポリペプチド、例えばp115 RhoＧＥＦまたはその断片に関する核酸構築物
を用いてトランスフェクトされ、構成成分のうちの１つへの一次抗体を用いたあ
らゆる結合複合体の沈降、ならびに二次抗体を用いた二次結合構成成分の量の検
出により、ポリペプチドとＧαサブユニットの複合体が検出される。結合検定は
、当業界で周知の技法を用いて、例えば構成成分の１つをカラムに結合し、次に
カラムに結合した第二標識化構成成分の量を確定することにより、実施され得る
。関連検定法は、例えばBerman et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:27209にも 開示されている。
、ＧＥＦ、例えばp115 RhoＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０またはDrhoＧＥＦ２
との結合を調節する分子を同定するのが望ましい。検定は、ＲＧＳドメインまた
はＲＧＳドメインの生物学的活性亜断片を含有する完全ＧＥＦタンパク質または
そのあらゆる亜断片を用いて実行され得る。検定は、典型的には、ＧＴＰ結合状
態のＧαサブユニットの安定類似体、例えばＧＤＰ−ＡＩＦ4 -またはＧＴＰγＳ
に結合されたαサブユニットを用いて実行される。例えば、結合検定は、下記の
実施例５に記載された方法により実行され得るが、この場合、COS細胞は、myc−
タグ化ポリペプチド、例えばp115 RhoＧＥＦまたはその断片に関する核酸構築物
を用いてトランスフェクトされ、構成成分のうちの１つへの一次抗体を用いたあ
らゆる結合複合体の沈降、ならびに二次抗体を用いた二次結合構成成分の量の検
出により、ポリペプチドとＧαサブユニットの複合体が検出される。結合検定は
、当業界で周知の技法を用いて、例えば構成成分の１つをカラムに結合し、次に
カラムに結合した第二標識化構成成分の量を確定することにより、実施され得る
。関連検定法は、例えばBerman et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:27209にも 開示されている。
【００５９】 ＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドの刺激作用、例えばＧ
αサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を調整または調節する分子に関する単離また
は検定方法も、本発明にしたがって実行され得る。例えば、Ｇαサブユニットは
、被験阻害剤の存在下および非存在下で、ＧＴＰアーゼ刺激作用を有するＲＧＳ
−ＧＥＦポリペプチドとともに、有効条件下でインキュベートして、被験阻害剤
の存在がその刺激作用を調整するか否かを確定する。検定は、ＲＧＳドメインま
たはＲＧＳドメインの生物学的活性亜断片を含有する完全ＲＧＳ−ＧＥＦポリペ
プチド、ＧＥＦタンパク質またはそのあらゆる亜断片を用いて実行され得る。Ｒ
ＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、p115 Rh−ＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DRh
oＧＥＦ２またはそれらの生物学的活性断片であり得る。例えば、検定は、本明 細書中で考察する実施例に記載されたように、ならびに当業界で周知の他の変異
または検定方法を用いて、α12またはα13サブユニットと一緒にp115 RhoＧＥＦ
を用いて実行され得る。例えば、検定は、下記の実施例５にしたがって実行され
得るが、この場合、Ｇαサブユニットは、［γ−32Ｐ］ＧＴＰを負荷され、ＲＧ
Ｓ−ＧＥＦ歩麻植の存在を含めた種々の条件下での加水分解の量が、検定混合物
の延伸分離後の上清中の32Ｐｉの量を測定することにより確定された。関連検定
方法は、例えばBerman et al., 1996, J. Biol. Chem.271:27209に開示されてい
る。
αサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を調整または調節する分子に関する単離また
は検定方法も、本発明にしたがって実行され得る。例えば、Ｇαサブユニットは
、被験阻害剤の存在下および非存在下で、ＧＴＰアーゼ刺激作用を有するＲＧＳ
−ＧＥＦポリペプチドとともに、有効条件下でインキュベートして、被験阻害剤
の存在がその刺激作用を調整するか否かを確定する。検定は、ＲＧＳドメインま
たはＲＧＳドメインの生物学的活性亜断片を含有する完全ＲＧＳ−ＧＥＦポリペ
プチド、ＧＥＦタンパク質またはそのあらゆる亜断片を用いて実行され得る。Ｒ
ＧＳ−ＧＥＦポリペプチドは、p115 Rh−ＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DRh
oＧＥＦ２またはそれらの生物学的活性断片であり得る。例えば、検定は、本明 細書中で考察する実施例に記載されたように、ならびに当業界で周知の他の変異
または検定方法を用いて、α12またはα13サブユニットと一緒にp115 RhoＧＥＦ
を用いて実行され得る。例えば、検定は、下記の実施例５にしたがって実行され
得るが、この場合、Ｇαサブユニットは、［γ−32Ｐ］ＧＴＰを負荷され、ＲＧ
Ｓ−ＧＥＦ歩麻植の存在を含めた種々の条件下での加水分解の量が、検定混合物
の延伸分離後の上清中の32Ｐｉの量を測定することにより確定された。関連検定
方法は、例えばBerman et al., 1996, J. Biol. Chem.271:27209に開示されてい
る。
【００６０】 単量体Ｇタンパク質に関するＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換を有するＲＧＳ−
ＧＥＦポリペプチドに及ぼす活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を調整する分子
に関する同定または検定方法も、本発明にしたがって実行され得る。例えば、一
次検定は、活性化ＧαサブユニットをＧＥＦタンパク質（例えば、p115 RhoＧＥ
Ｆ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DrhoＧＥＦ２またはＧＥＦ活性を保持するそれら
の生物学的活性断片）および単量体Ｇタンパク質とともに、被験モジュレーター
の存在下および非存在下でインキュベートして、被験モジュレーターが、単量体
タンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換を刺激する活性化Ｇαサブユニット
の能力に阻害、増強等の作用を及ぼすか否かを確定することにより実行され得る
（例えば、Hart et al., 1996, J. Biol. Chem. 221:25452参照）。被験モジュ レーターはさらに、前記のＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質が、Ｇタ
ンパク質サブユニットを伴わずに、被験モジュレーターの存在下または非存在下
でインキュベートされて、被験モジュレーターが単量退タンパク質のＧＥＦ媒介
性ヌクレオチド交換に及ぼすいかなる作用を有したかを確定する二次検定を実行
し、、次に一次および二次検定における調整作用を比較して、一次検定における
調整作用が二次検定における調整作用と異なるか否かを確定し、それにより被験
モジュレーターが、ＧＥＦタンパク質と単量体Ｇタンパク質との相互作用よりむ
しろ、活性化ＧαサブユニットとＧＥＦタンパク質との相互作用を調整すること
を示す異により、評価され得る。例えば、ＧＥＦ媒介性グアニンヌクレオチド交
換に及ぼす刺激作用は、下記の実施例６により測定され得るが、この場合、Rho Ａは［3Ｈ］ＧＤＰを負荷され、RhoＡからのＧＤＰの解離は、インキュベーショ
ン前後に、濾過による結合ＧＤＰの確定により、種々の条件下で測定された（例
えば、Northrup et al., J. Biol. Chem. 257, 11416-11423（1982）参照）。
ＧＥＦポリペプチドに及ぼす活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を調整する分子
に関する同定または検定方法も、本発明にしたがって実行され得る。例えば、一
次検定は、活性化ＧαサブユニットをＧＥＦタンパク質（例えば、p115 RhoＧＥ
Ｆ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DrhoＧＥＦ２またはＧＥＦ活性を保持するそれら
の生物学的活性断片）および単量体Ｇタンパク質とともに、被験モジュレーター
の存在下および非存在下でインキュベートして、被験モジュレーターが、単量体
タンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換を刺激する活性化Ｇαサブユニット
の能力に阻害、増強等の作用を及ぼすか否かを確定することにより実行され得る
（例えば、Hart et al., 1996, J. Biol. Chem. 221:25452参照）。被験モジュ レーターはさらに、前記のＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質が、Ｇタ
ンパク質サブユニットを伴わずに、被験モジュレーターの存在下または非存在下
でインキュベートされて、被験モジュレーターが単量退タンパク質のＧＥＦ媒介
性ヌクレオチド交換に及ぼすいかなる作用を有したかを確定する二次検定を実行
し、、次に一次および二次検定における調整作用を比較して、一次検定における
調整作用が二次検定における調整作用と異なるか否かを確定し、それにより被験
モジュレーターが、ＧＥＦタンパク質と単量体Ｇタンパク質との相互作用よりむ
しろ、活性化ＧαサブユニットとＧＥＦタンパク質との相互作用を調整すること
を示す異により、評価され得る。例えば、ＧＥＦ媒介性グアニンヌクレオチド交
換に及ぼす刺激作用は、下記の実施例６により測定され得るが、この場合、Rho Ａは［3Ｈ］ＧＤＰを負荷され、RhoＡからのＧＤＰの解離は、インキュベーショ
ン前後に、濾過による結合ＧＤＰの確定により、種々の条件下で測定された（例
えば、Northrup et al., J. Biol. Chem. 257, 11416-11423（1982）参照）。
【００６１】 単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に及ぼす活性化Ｇαの刺
激作用を模倣する分子の同定方法も、本発明により実行され得る。その方法は、
ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインに対する結合親和性を示す被験化合物を同定
し、次にＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質を被験化合物の存在下また
は非存在下でインキュベートして、被験化合物が、単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ
媒介性ヌクレオチド交換に及ぼす刺激作用を示すか否かを確定することを包含す
る。ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインに対する結合親和性を示す被験化合物の
同定は、当業界で周知の技法を用いて成し遂げられ得る。例えば、ＲＧＳポリペ
プチドは、カラムに結合され、被験化合物のカクテルがカラムを通されて、カラ
ムに選択的に結合されたものが確定される。
激作用を模倣する分子の同定方法も、本発明により実行され得る。その方法は、
ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインに対する結合親和性を示す被験化合物を同定
し、次にＧＥＦタンパク質および単量体Ｇタンパク質を被験化合物の存在下また
は非存在下でインキュベートして、被験化合物が、単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ
媒介性ヌクレオチド交換に及ぼす刺激作用を示すか否かを確定することを包含す
る。ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインに対する結合親和性を示す被験化合物の
同定は、当業界で周知の技法を用いて成し遂げられ得る。例えば、ＲＧＳポリペ
プチドは、カラムに結合され、被験化合物のカクテルがカラムを通されて、カラ
ムに選択的に結合されたものが確定される。
【００６２】 ＧαサブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦポリペプチドのＲＧＳドメ
インの刺激作用を模倣する分子または分子の混合物の同定方法も、本発明にした
がって実行され得る。その方法は、Ｇαサブユニットに対する結合親和性を示す
被験化合物を同定し、そして被験化合物の存在下または非存在下でＧＴＰ負荷Ｇ
αサブユニットをインキュベートして、被験化合物がＧαサブユニットの刺激作
用ＧＴＰアーゼ活性を示すか否かを確定することを包含する。Ｇαサブユニット
に対する結合親和性を示す被験化合物の同定は、当業界で周知の技法を用いて成
し遂げられ得る。例えば、Ｇα12は、基質に結合されて、ＲＧＳドメインを含有
するＧＥＦポリペプチドおよび被験化合物の両方とともにインキュベートされて
、被験化合物がＧαサブユニットとの結合に関してＲＧＳドメインと競合するか
否かを確定され得る。
インの刺激作用を模倣する分子または分子の混合物の同定方法も、本発明にした
がって実行され得る。その方法は、Ｇαサブユニットに対する結合親和性を示す
被験化合物を同定し、そして被験化合物の存在下または非存在下でＧＴＰ負荷Ｇ
αサブユニットをインキュベートして、被験化合物がＧαサブユニットの刺激作
用ＧＴＰアーゼ活性を示すか否かを確定することを包含する。Ｇαサブユニット
に対する結合親和性を示す被験化合物の同定は、当業界で周知の技法を用いて成
し遂げられ得る。例えば、Ｇα12は、基質に結合されて、ＲＧＳドメインを含有
するＧＥＦポリペプチドおよび被験化合物の両方とともにインキュベートされて
、被験化合物がＧαサブユニットとの結合に関してＲＧＳドメインと競合するか
否かを確定され得る。
【００６３】 ＲＧＳ−ＧＥＦ構成成分またはその誘導体による癌遺伝子形質転換活性の調整
は、種々の既知の手法により測定され得る（例えばEva and Aaronson, Nature,
316:273-275, 1985; Hart et al., J. Biol. Chem., 269:62-65, 1994）。化合 物は、方法中のあらゆる時間に付加されて（例えば、細胞の前処理；ＲＧＳ−Ｇ
ＥＦの付加後等）、ＲＧＳ−ＧＥＦ構成成分の癌遺伝子形質転換活性に及ぼすそ
の作用が確定され得る。種々の細胞株が用いられ得る。
は、種々の既知の手法により測定され得る（例えばEva and Aaronson, Nature,
316:273-275, 1985; Hart et al., J. Biol. Chem., 269:62-65, 1994）。化合 物は、方法中のあらゆる時間に付加されて（例えば、細胞の前処理；ＲＧＳ−Ｇ
ＥＦの付加後等）、ＲＧＳ−ＧＥＦ構成成分の癌遺伝子形質転換活性に及ぼすそ
の作用が確定され得る。種々の細胞株が用いられ得る。
【００６４】 単量体ＧＴＰアーゼ媒介性信号伝達に関するその他の検定は、当業界で既知の
手法から類推して、本発明により成し遂げられ得る（例えば、米国特許第5,141,
851号、第5,420,334号、第5,436,128号および第5,482,954号；WO94/16069; WO93
/16179; WO91/15582; WO90/00607）。 したがって、本発明はさらに、ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質に
より媒介される信号伝達に関連した疾患および病的症状、例えば異常細胞増殖に
関連した疾患である癌の治療および予防に関する。例えば、本発明は、治療が必
要な被験者に、疾患を治療するのに有効な量の化合物を投与することから成る癌
の治療方法であって、化合物がＧαサブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＲＧ
Ｓを含有するＧＥＦタンパク質の刺激作用のレギュレーターであり、あるいは化
合物が単量体ＧＴＰアーゼによるＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に及ぼすＧαサ
ブユニットの刺激作用のレギュレーターである方法に関する。疾患を治療すると
は、その開始を遅延し、疾患の進行を遅延し、疾患の臨床的および病理学的徴候
を改良または遅延することを意味する。レギュレーター化合物または化合物の混
合物は、合成、天然またはそれらの組合せであり得る。レギュレーター化合物は
、アミノ酸、ヌクレオチド、炭化水素、脂質、多糖等を包含し得る。レギュレー
ター化合物は、好ましくは、ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質の発現
を調節する、例えばそのｍＲＮＡ、タンパク質発現またはプロセッシングを抑制
または増大する化合物であり、あるいはＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインとＧ
αサブユニットとの相互作用を調節する化合物である。疾患を治療するために、
化合物または混合物は、当業者には明らかなように、製薬上許容可能な担体また
はその他の賦形剤を包含する製剤組成物中に処方され得る（例えば、Remington'
s Pharmaceutical Sciences, Eighteenth Edition, Mack Publishing Company,
1990参照）。このような組成物は、特に癌の治療のために、有効量のその他の化
合物をさらに含有し得る。
手法から類推して、本発明により成し遂げられ得る（例えば、米国特許第5,141,
851号、第5,420,334号、第5,436,128号および第5,482,954号；WO94/16069; WO93
/16179; WO91/15582; WO90/00607）。 したがって、本発明はさらに、ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質に
より媒介される信号伝達に関連した疾患および病的症状、例えば異常細胞増殖に
関連した疾患である癌の治療および予防に関する。例えば、本発明は、治療が必
要な被験者に、疾患を治療するのに有効な量の化合物を投与することから成る癌
の治療方法であって、化合物がＧαサブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＲＧ
Ｓを含有するＧＥＦタンパク質の刺激作用のレギュレーターであり、あるいは化
合物が単量体ＧＴＰアーゼによるＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に及ぼすＧαサ
ブユニットの刺激作用のレギュレーターである方法に関する。疾患を治療すると
は、その開始を遅延し、疾患の進行を遅延し、疾患の臨床的および病理学的徴候
を改良または遅延することを意味する。レギュレーター化合物または化合物の混
合物は、合成、天然またはそれらの組合せであり得る。レギュレーター化合物は
、アミノ酸、ヌクレオチド、炭化水素、脂質、多糖等を包含し得る。レギュレー
ター化合物は、好ましくは、ＲＧＳドメインを含有するＧＥＦタンパク質の発現
を調節する、例えばそのｍＲＮＡ、タンパク質発現またはプロセッシングを抑制
または増大する化合物であり、あるいはＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインとＧ
αサブユニットとの相互作用を調節する化合物である。疾患を治療するために、
化合物または混合物は、当業者には明らかなように、製薬上許容可能な担体また
はその他の賦形剤を包含する製剤組成物中に処方され得る（例えば、Remington'
s Pharmaceutical Sciences, Eighteenth Edition, Mack Publishing Company,
1990参照）。このような組成物は、特に癌の治療のために、有効量のその他の化
合物をさらに含有し得る。
【００６５】 実施例 実施例１：RhoＧＥＦとＧタンパク質シグナリングを調節するタンパク質との 間の相同の同定 ＲＧＳ族のタンパク質は、Ｇタンパク質シグナリングの負のレギュレーターと
して作用する。その族の19の哺乳類成員が同定されており、それらはすべて、Ｒ
ＧＳボックスと呼ばれる相同コアドメインを含有するタンパク質をコードする。
して作用する。その族の19の哺乳類成員が同定されており、それらはすべて、Ｒ
ＧＳボックスと呼ばれる相同コアドメインを含有するタンパク質をコードする。
【００６６】 Rhoに特異的なＧＥＦであるp115−ＧＥＦの配列の検査は、ＲＧＳ４、ＲＧＳ ２、ＧＡＩＰ、ＲＧＳ１２およびＲＧＳ１４を含めたＲＧＳタンパク質の保存ド
メインと特異的相同を有するＮ末端領域を明示した（図１）。３つのその他のRh
oＧＥＦタンパク質、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０およびDrhoＧＥＦの分析も、それ らがＲＧＳタンパク質の保存領域と特異的相同を有する領域を含有することを示
した（図１）。
メインと特異的相同を有するＮ末端領域を明示した（図１）。３つのその他のRh
oＧＥＦタンパク質、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０およびDrhoＧＥＦの分析も、それ らがＲＧＳタンパク質の保存領域と特異的相同を有する領域を含有することを示
した（図１）。
【００６７】 ＲＧＳとＡＩＦ4−活性化Ｇαilとの間の複合体の結晶構造は、ＲＧＳ４（Ｒ ＧＳボックス）の機能性コアが、２つの小サブドメインに折り畳まる９つのαヘ
リックスを含有するということを明示した（Tesmer et al., Cell, 89, 251（19
97））。ＲＧＳボックスは、Ｇαサブユニットに対するＧＡＰ活性を含有するこ
とが示されている（Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7216（19
97））。ＲＧＳ族の成員に保存されるボックスの疎水性コア残基は、構造の安定
性およびＧＡＰ活性のために重要である（ Tesmer et al., Cell, 89, 251（199
7）およびSrinivasan et al., J. Biol. Chem., 273, 1529（1998））。ＲＧＳ ４は、亜その３つのスイッチ領域との相互作用により、主にＧＴＰ加水分解の遷
移状態の安定化により、ＧαilのＧＴＰアーゼ活性を刺激する（Tesmer et al.,
Cell, 89, 251（1997））。
リックスを含有するということを明示した（Tesmer et al., Cell, 89, 251（19
97））。ＲＧＳボックスは、Ｇαサブユニットに対するＧＡＰ活性を含有するこ
とが示されている（Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7216（19
97））。ＲＧＳ族の成員に保存されるボックスの疎水性コア残基は、構造の安定
性およびＧＡＰ活性のために重要である（ Tesmer et al., Cell, 89, 251（199
7）およびSrinivasan et al., J. Biol. Chem., 273, 1529（1998））。ＲＧＳ ４は、亜その３つのスイッチ領域との相互作用により、主にＧＴＰ加水分解の遷
移状態の安定化により、ＧαilのＧＴＰアーゼ活性を刺激する（Tesmer et al.,
Cell, 89, 251（1997））。
【００６８】 ＲＧＳドメインのコアを形成する疎水性残基のほとんどが、p115 RhoＧＥＦ中
に保存される（23のうち17）（図１）。アラインメント中のギャップの位置は、
ＲＧＳドメイン構造のαらせん間のループに対応する。この相同は、p115−ＧＥ
ＦのＮ末端領域がＲＧＳ４ボックスドメインと同様の構造を有し、そしてＧＡＰ
活性を保有し得る、ということを示唆した。これに対比して、Ｇαil（ＧＤＰ−
ＡＩＦ4−）のスイッチ領域と接触させられるＲＧＳ４の残基は十分には保存さ れず、p115 RhoＧＥＦのあらゆるＧＡＰ活性が独自のメカニズムを有するか、ま
たはすでに同定されているものと有意に異なる特異性を有する。
に保存される（23のうち17）（図１）。アラインメント中のギャップの位置は、
ＲＧＳドメイン構造のαらせん間のループに対応する。この相同は、p115−ＧＥ
ＦのＮ末端領域がＲＧＳ４ボックスドメインと同様の構造を有し、そしてＧＡＰ
活性を保有し得る、ということを示唆した。これに対比して、Ｇαil（ＧＤＰ−
ＡＩＦ4−）のスイッチ領域と接触させられるＲＧＳ４の残基は十分には保存さ れず、p115 RhoＧＥＦのあらゆるＧＡＰ活性が独自のメカニズムを有するか、ま
たはすでに同定されているものと有意に異なる特異性を有する。
【００６９】 遺伝子バンクの探索は、p115のＲＧＳ領域と相同の領域を有する３つのその他
のRho−ＧＥＦ成員を明示した。これらには、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０およびDrh
oＧＥＦ２が含まれる（図１）。Ｌｓｃは、p115 RhoＧＥＦのマウス相同体であ ると思われるし、ＫＩＡＡ３８０はショウジョウバエDrhoＧＥＦ２のヒト相同体
であると思われる（Whitehead et al., J. Biol. Chem., 271, 18643（1996）;
Barrett et al., Cell, 91, 905（1997））。これら４つのRho−ＧＥＦは、これ
らもRhoに関するグアニンヌクレオチド交換活性を保有するタンパク質の新規の ＲＧＳ関連族を限定する。
のRho−ＧＥＦ成員を明示した。これらには、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０およびDrh
oＧＥＦ２が含まれる（図１）。Ｌｓｃは、p115 RhoＧＥＦのマウス相同体であ ると思われるし、ＫＩＡＡ３８０はショウジョウバエDrhoＧＥＦ２のヒト相同体
であると思われる（Whitehead et al., J. Biol. Chem., 271, 18643（1996）;
Barrett et al., Cell, 91, 905（1997））。これら４つのRho−ＧＥＦは、これ
らもRhoに関するグアニンヌクレオチド交換活性を保有するタンパク質の新規の ＲＧＳ関連族を限定する。
【００７０】 ＲＧＳドメインを含有することが既知の４つのＧＥＦタンパク質（p115 RhoＧ
ＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DRhoＧＥＦ２）のＲＧＳドメインの、ＲＧＳタ
ンパク質ＲＥＴ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ７、ＲＧＳ
１０、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１４、Ｒａｐ１／２Ｂ．Ｐ．およびＧＡＩＰのＲＧＳ
ドメインとのアラインメントは、新規のサブ−ＲＧＳコンセンサス配列が４つの
ＧＥＦタンパク質のＲＧＳ配列により限定される、ということを示す（図１８）
。図１８に示した配列の下部に示したように、新規のサブ−ＲＧＳコンセンサス
配列は、ギャップの両側のアミノ酸の保存とともに、相同アラインメント中の13
〜14アミノ酸の大型ギャップにより示される。
ＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DRhoＧＥＦ２）のＲＧＳドメインの、ＲＧＳタ
ンパク質ＲＥＴ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ７、ＲＧＳ
１０、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１４、Ｒａｐ１／２Ｂ．Ｐ．およびＧＡＩＰのＲＧＳ
ドメインとのアラインメントは、新規のサブ−ＲＧＳコンセンサス配列が４つの
ＧＥＦタンパク質のＲＧＳ配列により限定される、ということを示す（図１８）
。図１８に示した配列の下部に示したように、新規のサブ−ＲＧＳコンセンサス
配列は、ギャップの両側のアミノ酸の保存とともに、相同アラインメント中の13
〜14アミノ酸の大型ギャップにより示される。
【００７１】 実施例２：RHOＧＥＦタンパク質p115 RHO−ＧＥＦはＧα13およびＧα12サブ ユニットのＧＴＰアーゼ活性を刺激する p115 RhoＧＥＦを検査して、Ｇα13およびＧα12の固有ＧＴＰアーゼ活性（Ｇ
ＡＰ活性）を刺激する場合のその能力を確定した。 Kozasa and Gilman, J. Biol. Chem., 270, 1734（1995）に記載されている ように、Ｇα12をＳｆ９細胞中で発現させて、精製した。前記のバキュウロウイ
ルス法（Singer and Miller, J. Biol. Chem., 269, 19796（1994））、ならび にＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）上でのヘテロトリマーの免疫感作後のαサブユニ
ットの洗浄および溶離中にオクチルグリコシドを用いて、同様の手法によりＧα 13 を調製した。ヒドロオキシアパタイトへの吸収およびそれからの溶離により、
溶離Ｇα13をさらに精製した。Ｇα12またはＧα13（20〜30 pmol）をそれぞれ 、5μMの［γ32Ｐ］ＧＴＰ（50〜100 cpm/fmol）とともに、5 mMＥＤＴＡの存在
下で30℃で30または40分間負荷した。次に、緩衝液Ａ（50 mMＮａHepes（ｐＨ8.
0）、1 mMジチオトレイトール、5 mMＥＤＴＡおよび0.05％ポリオキシエチレン １０−ラウリルエーテル ）で予め平衡させておいたセファデックスG50を通して
4℃での遠心分離により、標本を迅速に濾過して、遊離［γ32Ｐ］ＧＴＰおよび ［32Ｐｉ］を除去した。8 mMＭｇＳＯ4、1 mMＧＴＰおよび指示量のp115を含有 する緩衝液Ａ中に［γ−32Ｐ］ＧＴＰを負荷したＧαを付加することにより、Ｇ
ＴＰの加水分解を開始した。反応混合物を4℃または15℃でインキュベートした 。アリコート（50μl）を指示時間に取り出して、50 mMＮａＨ2ＰＯ4中の5％（w
/v）NoritＡ750μlと混合した。混合物を2000 rpmで5分間遠心分離し、32Ｐｉを
含有する上清400μlを液体シンチレーション分光測定により計数した。
ＡＰ活性）を刺激する場合のその能力を確定した。 Kozasa and Gilman, J. Biol. Chem., 270, 1734（1995）に記載されている ように、Ｇα12をＳｆ９細胞中で発現させて、精製した。前記のバキュウロウイ
ルス法（Singer and Miller, J. Biol. Chem., 269, 19796（1994））、ならび にＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）上でのヘテロトリマーの免疫感作後のαサブユニ
ットの洗浄および溶離中にオクチルグリコシドを用いて、同様の手法によりＧα 13 を調製した。ヒドロオキシアパタイトへの吸収およびそれからの溶離により、
溶離Ｇα13をさらに精製した。Ｇα12またはＧα13（20〜30 pmol）をそれぞれ 、5μMの［γ32Ｐ］ＧＴＰ（50〜100 cpm/fmol）とともに、5 mMＥＤＴＡの存在
下で30℃で30または40分間負荷した。次に、緩衝液Ａ（50 mMＮａHepes（ｐＨ8.
0）、1 mMジチオトレイトール、5 mMＥＤＴＡおよび0.05％ポリオキシエチレン １０−ラウリルエーテル ）で予め平衡させておいたセファデックスG50を通して
4℃での遠心分離により、標本を迅速に濾過して、遊離［γ32Ｐ］ＧＴＰおよび ［32Ｐｉ］を除去した。8 mMＭｇＳＯ4、1 mMＧＴＰおよび指示量のp115を含有 する緩衝液Ａ中に［γ−32Ｐ］ＧＴＰを負荷したＧαを付加することにより、Ｇ
ＴＰの加水分解を開始した。反応混合物を4℃または15℃でインキュベートした 。アリコート（50μl）を指示時間に取り出して、50 mMＮａＨ2ＰＯ4中の5％（w
/v）NoritＡ750μlと混合した。混合物を2000 rpmで5分間遠心分離し、32Ｐｉを
含有する上清400μlを液体シンチレーション分光測定により計数した。
【００７２】 10 mM全長p115を用いて、または用いずに、15℃で、Ｇα13およびＧα12に結 合したＧＴＰの加水分解を実施した（図２のパネルＡ）。ＧＴＰ結合Ｇα13およ
びＧα12の加水分解を、種々の濃度のp115の存在下で4℃で測定した（図２のパ ネルＢ）。全長p115は、Ｇα13サブユニットに予備結合させておいた［γ−32Ｐ
］の１回の加水分解を刺激し得た。Ｇα13の最も密接な相同体であるＧα12の固
有のＧＴＰ活性も、全長p115により刺激された。15℃で、Ｇα12（0.07分-1）お
よびＧα13（0.24分-1）によるＧＴＰの加水分解に関するｋcatは、10 nMのp115
によりそれぞれ5倍および10倍増大された（図２のパネルＡ）。同様の結果が、 Ｇα12およびＧα13のいくつかの調製物を用いて得られた。90℃でのp115の処理
は、このＧＡＰ活性を不活性化した。Ｇα13の急速加水分解速度のために、4℃ で検定を実施して、Ｇタンパク質によるＧＴＰアーゼ活性の初期速度に及ぼすp1
15の作用をより良好に概算した（図２のパネルＢ）。これらの条件下では、100
nMのp115は、Ｇα13のＧＴＰアーゼ活性の80〜100倍増大を生じた。これに対比 して、Ｇα12の加水分解速度は6倍だけ増大された。両タンパク質の刺激は1 nM という低いp115濃度で観察されたが、両温度での測定は、p115がＧα12よりＧα 13 に関してより有効なＧＡＰである、ということを示す。
びＧα12の加水分解を、種々の濃度のp115の存在下で4℃で測定した（図２のパ ネルＢ）。全長p115は、Ｇα13サブユニットに予備結合させておいた［γ−32Ｐ
］の１回の加水分解を刺激し得た。Ｇα13の最も密接な相同体であるＧα12の固
有のＧＴＰ活性も、全長p115により刺激された。15℃で、Ｇα12（0.07分-1）お
よびＧα13（0.24分-1）によるＧＴＰの加水分解に関するｋcatは、10 nMのp115
によりそれぞれ5倍および10倍増大された（図２のパネルＡ）。同様の結果が、 Ｇα12およびＧα13のいくつかの調製物を用いて得られた。90℃でのp115の処理
は、このＧＡＰ活性を不活性化した。Ｇα13の急速加水分解速度のために、4℃ で検定を実施して、Ｇタンパク質によるＧＴＰアーゼ活性の初期速度に及ぼすp1
15の作用をより良好に概算した（図２のパネルＢ）。これらの条件下では、100
nMのp115は、Ｇα13のＧＴＰアーゼ活性の80〜100倍増大を生じた。これに対比 して、Ｇα12の加水分解速度は6倍だけ増大された。両タンパク質の刺激は1 nM という低いp115濃度で観察されたが、両温度での測定は、p115がＧα12よりＧα 13 に関してより有効なＧＡＰである、ということを示す。
【００７３】 受容体の非存在下では、ＧＴＰγＳのＧαとの結合に際しての速度制限工程な
らびにＧＴＰの定常状態加水分解はＧＤＰの放出である。p115はＧαおよびＧα
と結合するＧＴＰγＳの速度にも、あるいはいずれのサブユニットのＧＴＰアー
ゼ活性の定常状態にも影響を及ぼさなかった。したがって、p115はＧα12および
Ｇα13の固有のＧＴＰアーゼ活性だけを刺激し、ヌクレオチド交換のそれらの速
度に作用しない。
らびにＧＴＰの定常状態加水分解はＧＤＰの放出である。p115はＧαおよびＧα
と結合するＧＴＰγＳの速度にも、あるいはいずれのサブユニットのＧＴＰアー
ゼ活性の定常状態にも影響を及ぼさなかった。したがって、p115はＧα12および
Ｇα13の固有のＧＴＰアーゼ活性だけを刺激し、ヌクレオチド交換のそれらの速
度に作用しない。
【００７４】 ＲＧＳタンパク質の保存ＲＧＳボックス領域は、in vitroでのＧＡＰ活性を示
すのに十分である（Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7216（19
97））。したがって、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびp115のＮ末
端領域の融合タンパク質（図１のパネルＢ）、ＧＳＴ−ＲＧＳを、ＧＡＰ活性に
関して検査した。この領域はＲＧＳ相同ドメインを保持するが、しかしp115のDb
lまたはＰＨドメインを保持しない。p115（10 nM）のこの「ＲＧＳドメイン」は
、 Ｇα12およびＧα13のＧＡＰ活性に関して検査した場合、全長とほぼ同様に 活性であった（図３）。これに対比して、このＮ末端を失ったp115の構築物は有
効でなかった。したがって、データは、ＲＧＳ相同領域がp115のＧＡＰ活性に関
与する、ということを示す。
すのに十分である（Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7216（19
97））。したがって、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびp115のＮ末
端領域の融合タンパク質（図１のパネルＢ）、ＧＳＴ−ＲＧＳを、ＧＡＰ活性に
関して検査した。この領域はＲＧＳ相同ドメインを保持するが、しかしp115のDb
lまたはＰＨドメインを保持しない。p115（10 nM）のこの「ＲＧＳドメイン」は
、 Ｇα12およびＧα13のＧＡＰ活性に関して検査した場合、全長とほぼ同様に 活性であった（図３）。これに対比して、このＮ末端を失ったp115の構築物は有
効でなかった。したがって、データは、ＲＧＳ相同領域がp115のＧＡＰ活性に関
与する、ということを示す。
【００７５】 実施例３：p115 Rho−ＧＥＦはＧαi、Ｇαz、ＧαqおよびＧαsサブユニット
のＧＴＰアーゼ活性を刺激しない 種々のＧタンパク質αサブユニットに対するp115のＧＡＰ活性の特異性を、以
下のように検査した。 Lee et al., Meth. Enzymol., 237, 146（1994）に記載されているように、Ｇ
αSを大腸菌中で発現させ、それから精製した。 Ｇαi、ＧαzおよびＧαqＲ１ ８３ＣをＳｆ９細胞中で発現させて、精製した（Kozasa and Gilman, J. Biol.
Chem., 270, 1734（1995）およびBiddlecome et al., J. Biol. Chem., 271, 79
99（1996））。Ｇαi、ＧαzおよびＧαqに、5 mMＥＤＴＡの存在下で20℃で20 分間、5〜10μMの［γ−32Ｐ］を負荷し、Ｇα12およびＧα13に関して前記され
たように、ＧＡＰ検定を実施した。Ｇαq上のギャップ活性を、突然変異体Ｇαq Ｒ１８３Ｃを用いて査定した。 ＧαiＲ１１７８Ｃにおける類似突然変異はＧＴ
Ｐアーゼ活性の顕著な低減を引き起こしたが、しかしＲＧＳタンパク質に対する
応答は保持された（Berman et al., Cell, 86, 445（1996））。ＧαqＲ１８３ Ｃの遅いＧＴＰアーゼ活性は、ヌクレオチド交換を促すための受容体を用いるこ
となく、Ｇαq上の［γ−32Ｐ］ＧＴＰの負荷を可能にする。ＧαqＲ１８３Ｃに
、50 mMのHepes（ｐＨ7.4）、0.1 mg/mlＢＳＡ、1 mMＥＤＴＡ、0.9 mMＭｇＳＯ 4 、30 mM（ＮＨ4）ＳＯ4、4％グリセロールおよび5.5 mMＣＨＡＰＳの存在下で 、20℃で2時間、10μM［γ−32Ｐ］を負荷した。50 mMのHepes（ｐＨ7.4）、1 m
MＥＤＴＡ 、0.9 mMＭｇＳＯ4、0.1 mg/mlＢＳＡおよび1 mMＣＨＡＰＳで平衡さ
せておいたセファデックスG50を通して、反応混合物を迅速に濾過した。
のＧＴＰアーゼ活性を刺激しない 種々のＧタンパク質αサブユニットに対するp115のＧＡＰ活性の特異性を、以
下のように検査した。 Lee et al., Meth. Enzymol., 237, 146（1994）に記載されているように、Ｇ
αSを大腸菌中で発現させ、それから精製した。 Ｇαi、ＧαzおよびＧαqＲ１ ８３ＣをＳｆ９細胞中で発現させて、精製した（Kozasa and Gilman, J. Biol.
Chem., 270, 1734（1995）およびBiddlecome et al., J. Biol. Chem., 271, 79
99（1996））。Ｇαi、ＧαzおよびＧαqに、5 mMＥＤＴＡの存在下で20℃で20 分間、5〜10μMの［γ−32Ｐ］を負荷し、Ｇα12およびＧα13に関して前記され
たように、ＧＡＰ検定を実施した。Ｇαq上のギャップ活性を、突然変異体Ｇαq Ｒ１８３Ｃを用いて査定した。 ＧαiＲ１１７８Ｃにおける類似突然変異はＧＴ
Ｐアーゼ活性の顕著な低減を引き起こしたが、しかしＲＧＳタンパク質に対する
応答は保持された（Berman et al., Cell, 86, 445（1996））。ＧαqＲ１８３ Ｃの遅いＧＴＰアーゼ活性は、ヌクレオチド交換を促すための受容体を用いるこ
となく、Ｇαq上の［γ−32Ｐ］ＧＴＰの負荷を可能にする。ＧαqＲ１８３Ｃに
、50 mMのHepes（ｐＨ7.4）、0.1 mg/mlＢＳＡ、1 mMＥＤＴＡ、0.9 mMＭｇＳＯ 4 、30 mM（ＮＨ4）ＳＯ4、4％グリセロールおよび5.5 mMＣＨＡＰＳの存在下で 、20℃で2時間、10μM［γ−32Ｐ］を負荷した。50 mMのHepes（ｐＨ7.4）、1 m
MＥＤＴＡ 、0.9 mMＭｇＳＯ4、0.1 mg/mlＢＳＡおよび1 mMＣＨＡＰＳで平衡さ
せておいたセファデックスG50を通して、反応混合物を迅速に濾過した。
【００７６】 この試験の結果は、p115（100 nM）は、ＲＧＳ４がこれらのＧαサブユニット
に関するＧＡＰとして作用する条件下では、Ｇαi、ＧαzまたはＧαqを刺激し ない、ということを示した（図４）。同様に、p115はＧαSのＧＴＰアーゼ活性 を促進せず、あるいはp115 RhoＧＥＦはRhoＡまたはrac1に対するいかなるＧＡ Ｐ活性も有さなかった。したがって、p115は、Ｇα12およびＧα13に対する特異
性を有するＧＡＰである。
に関するＧＡＰとして作用する条件下では、Ｇαi、ＧαzまたはＧαqを刺激し ない、ということを示した（図４）。同様に、p115はＧαSのＧＴＰアーゼ活性 を促進せず、あるいはp115 RhoＧＥＦはRhoＡまたはrac1に対するいかなるＧＡ Ｐ活性も有さなかった。したがって、p115は、Ｇα12およびＧα13に対する特異
性を有するＧＡＰである。
【００７７】 実施例４：ＡＩＦ4−活性化形態のＧαサブユニットによるp115ＧＡＰ活性の 選択的阻害 ＲＧＳタンパク質は、ＧＴＰ加水分解の遷移状態と同様の形状であるＧＤＰ−
ＡＩＦ4−結合形態のαサブユニットに対する高親和性を有することが示されて いる（Tesmer et al., Cell, 89, 251（1997）; Berman et al., J. Biol. Chem
., 271,27209（1996））。したがって、ＧＤＰ−ＡＩＦ4−形態のＧαは、p115 との相互作用に関してＧαＧＴＰと競合し、観察されるＧＡＰ活性を遮断する。
図５のパネルＡに示したように、 ＧＤＰ−ＡＩＦ4結合Ｇα12およびＧα13はＧ
α12に関するp115のＧＡＰ活性を有効に阻害したが、一方、同様の形態のＧαs 、ＧαiおよびＧαqは効果を伴わなかった。さらに、ＧＤＰ−ＡＩＦ4−結合形 態のＧα13はＧα12の滴定は、サブユニットがＧα13のＧＡＰ活性を阻害する場
合、等効力を示すことを実証した（図５のパネルＢ）。これらの競合検定は、２
つのＧタンパク質サブユニットがp115に対する同様の親和性を有し、図２に示し
たようなサブユニットに対するp115の見掛けの鑑別効力を支持する、ということ
を示唆する。
ＡＩＦ4−結合形態のαサブユニットに対する高親和性を有することが示されて いる（Tesmer et al., Cell, 89, 251（1997）; Berman et al., J. Biol. Chem
., 271,27209（1996））。したがって、ＧＤＰ−ＡＩＦ4−形態のＧαは、p115 との相互作用に関してＧαＧＴＰと競合し、観察されるＧＡＰ活性を遮断する。
図５のパネルＡに示したように、 ＧＤＰ−ＡＩＦ4結合Ｇα12およびＧα13はＧ
α12に関するp115のＧＡＰ活性を有効に阻害したが、一方、同様の形態のＧαs 、ＧαiおよびＧαqは効果を伴わなかった。さらに、ＧＤＰ−ＡＩＦ4−結合形 態のＧα13はＧα12の滴定は、サブユニットがＧα13のＧＡＰ活性を阻害する場
合、等効力を示すことを実証した（図５のパネルＢ）。これらの競合検定は、２
つのＧタンパク質サブユニットがp115に対する同様の親和性を有し、図２に示し
たようなサブユニットに対するp115の見掛けの鑑別効力を支持する、ということ
を示唆する。
【００７８】 実施例５：Ｇα13のin vivoでのp115 RhoＧＥＦとの結合 以下の実験は、Ｇαおよびp115 RhoＧＥＦがＧＴＰ依存方式で相互作用するこ
とを実証した。 ＲＧＳまたはＤＨドメインの欠失を有するEXV-mycタグ化（COS細胞トランスフ
ェクションのために）およびpAc-Ｇｌｕタグ化（バキュウロウイルス発現のため
）タンパク質を、Hart et al., J. Biol. Chem., 271, 25452-25458（1996）に 前記されているのと同様に、構築した。全長バージョンを同一ベクター中に構築
した。ＧＳＴとp115 RhoＧＥＦの最初の246アミノ酸との融合物を、pGEX4T-2（P
harmacia）中に構築した。Hart et al., J. Biol. Chem., 271, 25452-25458（1
996）と同様に、トランスフェクション、免疫沈降および精製を実施した。
とを実証した。 ＲＧＳまたはＤＨドメインの欠失を有するEXV-mycタグ化（COS細胞トランスフ
ェクションのために）およびpAc-Ｇｌｕタグ化（バキュウロウイルス発現のため
）タンパク質を、Hart et al., J. Biol. Chem., 271, 25452-25458（1996）に 前記されているのと同様に、構築した。全長バージョンを同一ベクター中に構築
した。ＧＳＴとp115 RhoＧＥＦの最初の246アミノ酸との融合物を、pGEX4T-2（P
harmacia）中に構築した。Hart et al., J. Biol. Chem., 271, 25452-25458（1
996）と同様に、トランスフェクション、免疫沈降および精製を実施した。
【００７９】 mycタグ化p115 RhoＧＥＦでトランスフェクトしたCOS細胞では、抗myc抗体を 用いてＧα13を特異的に免疫沈降させ得る（図６のパネルＡおよびＢ）。この相
互作用は、活性化ＧＴＰ結合状態のＧα13を模倣するよう付加されるフッ化アル
ミニウムの存在によっている。さらに、アミノ末端ＲＧＳドメインを欠くp115 R
hoＧＥＦの切頭化突然変異体は同時免疫沈降を媒介できないが、一方、ＤＨドメ
インの欠失を有する全長タンパク質は同時免疫沈降を媒介する。全長および切頭
過RhoＧＥＦタンパク質の鑑別結合は、複合体を免疫沈降するためにＧα13に対 する抗体を用いて検出され得る（図６のパネルＣ）。Ｇα12との非常に弱い相互
作用が検出されたが、一方、それらのそれぞれの抗原が全細胞様怪物中で検出可
能であるという事実にもかかわらず、Ｇαs、Ｇαi、ＧαqおよびＧαiに対する
抗体は、抗myc免疫沈降において免疫反応バンドを検出しない。p115 RhoＧＥＦ およびＧα13の同時免疫沈降は、精製Ｇα13が免疫沈降化p115 RhoＧＥＦに付加
される半精製系で再生され得る（図６のパネルＤ）が、これは直接相互作用を示
唆する。この直接相互作用は、p115 RhoＧＥＦはＧα13ＧＴＰアーゼ活性を刺激
するという観察と一致するが、しかしp115 RhoがＧα13のエフェクターであり得
るということも示す。
互作用は、活性化ＧＴＰ結合状態のＧα13を模倣するよう付加されるフッ化アル
ミニウムの存在によっている。さらに、アミノ末端ＲＧＳドメインを欠くp115 R
hoＧＥＦの切頭化突然変異体は同時免疫沈降を媒介できないが、一方、ＤＨドメ
インの欠失を有する全長タンパク質は同時免疫沈降を媒介する。全長および切頭
過RhoＧＥＦタンパク質の鑑別結合は、複合体を免疫沈降するためにＧα13に対 する抗体を用いて検出され得る（図６のパネルＣ）。Ｇα12との非常に弱い相互
作用が検出されたが、一方、それらのそれぞれの抗原が全細胞様怪物中で検出可
能であるという事実にもかかわらず、Ｇαs、Ｇαi、ＧαqおよびＧαiに対する
抗体は、抗myc免疫沈降において免疫反応バンドを検出しない。p115 RhoＧＥＦ およびＧα13の同時免疫沈降は、精製Ｇα13が免疫沈降化p115 RhoＧＥＦに付加
される半精製系で再生され得る（図６のパネルＤ）が、これは直接相互作用を示
唆する。この直接相互作用は、p115 RhoＧＥＦはＧα13ＧＴＰアーゼ活性を刺激
するという観察と一致するが、しかしp115 RhoがＧα13のエフェクターであり得
るということも示す。
【００８０】 結合は、RhoＧＥＦタンパク質、ＫＩＡＡ３８０およびα12Ｇタンパク質サブ ユニット間でも検出され得た（図９。ＫＩＡＡ３８０はＦＬ１４７として示され
ている）。mycタグかＫＩＡＡでトランスフェクトされたCOS細胞では、Ｇα12は
myc抗体を用いて特異的に免疫沈降され得る（図９のパネルＡおよびＢ。ＫＩＡ Ａ３８０はＦＬ１４７として示されている）。この相互作用は、活性化ＧＴＰ結
合状態のＧα13を模倣するよう付加されるフッ化アルミニウムの存在によってい
る。
ている）。mycタグかＫＩＡＡでトランスフェクトされたCOS細胞では、Ｇα12は
myc抗体を用いて特異的に免疫沈降され得る（図９のパネルＡおよびＢ。ＫＩＡ Ａ３８０はＦＬ１４７として示されている）。この相互作用は、活性化ＧＴＰ結
合状態のＧα13を模倣するよう付加されるフッ化アルミニウムの存在によってい
る。
【００８１】 実施例６：Ｇα13によるp115 RhoＧＥＦの刺激 RhoＡおよびp115 RhoＧＥＦを、Ｇα13を用いて、または用いずにインクとし て、グアニンヌクレオチド交換に及ぼす作用を確定することにより、p115 RhoＧ
ＥＦの交換活性に影響を及ぼすＧα13の能力を調べた。 50 mMＮａHepes（ｐＨ7.5）、50 mMＮａＣｌ、4 mMＥＤＴＡ、1 mMジチオトレ
イトールおよび0.1％トリトンＸ-100中の25μMＧＤＰ（10,000 cpm/pmol）とと もに30℃で１時間インキュベートすることにより、RhoＡ（2.5μM）に「3Ｈ」Ｇ
ＤＰを負荷した。ＭｇＣｌ2を9 mMに、オクチルグルコシドを１％に付加後、Rho
をさらに5分間インキュベートして、50 mMＮａHepes（ｐＨ7.5）、50 mMＮａＣ ｌ、1 mMＥＤＴＡ、1 mMジチオトレイトール、5 mMＭｇＣｌ2および１％オクチ ルグルコシドで予め平衡させておいたセファデックスG50を通しての迅速濾過に より、遊離ＧＤＰから分離した。RhoＡからのＧＤＰの解離を、50 mMＮａHepes （ｐＨ7.5）、50 mMＮａＣｌ、1 mMＥＤＴＡ、1 mMジチオトレイトール、5 mMＭ
ｇＣｌ2、30 mMＡｌＣｌ3、5 mMＮａＦおよび5μMＧＴＰγＳ 20μl中で30℃で
測定した。別記しない限り、他のタンパク質と混合する前に、Ｇタンパク質アル
ファサブユニットをＡＭＦ（30μMＡｌＣｌ3、5 mMＭｇＣｌ2および5 mMＮａＦ ）とともに予備インキュベートした。指示されている場合は、ＡＭＦよりむしろ
25μMのＧＴＰγＳまたはＧＤＰβＳでαサブユニットを処理し、反応物をＡＭ Ｆを用いずに、しかし5μMのそれぞれのヌクレオチドを用いてインキュベートし
た。［3Ｈ］−ＧＤＰ−RhoＡの付加により反応を開始させて、インキュベーショ
ンの前後に、濾過により結合ＧＤＰを確定した（Northup et al., J. Biol. Che
m., 257, 11416-11423（1982））。
ＥＦの交換活性に影響を及ぼすＧα13の能力を調べた。 50 mMＮａHepes（ｐＨ7.5）、50 mMＮａＣｌ、4 mMＥＤＴＡ、1 mMジチオトレ
イトールおよび0.1％トリトンＸ-100中の25μMＧＤＰ（10,000 cpm/pmol）とと もに30℃で１時間インキュベートすることにより、RhoＡ（2.5μM）に「3Ｈ」Ｇ
ＤＰを負荷した。ＭｇＣｌ2を9 mMに、オクチルグルコシドを１％に付加後、Rho
をさらに5分間インキュベートして、50 mMＮａHepes（ｐＨ7.5）、50 mMＮａＣ ｌ、1 mMＥＤＴＡ、1 mMジチオトレイトール、5 mMＭｇＣｌ2および１％オクチ ルグルコシドで予め平衡させておいたセファデックスG50を通しての迅速濾過に より、遊離ＧＤＰから分離した。RhoＡからのＧＤＰの解離を、50 mMＮａHepes （ｐＨ7.5）、50 mMＮａＣｌ、1 mMＥＤＴＡ、1 mMジチオトレイトール、5 mMＭ
ｇＣｌ2、30 mMＡｌＣｌ3、5 mMＮａＦおよび5μMＧＴＰγＳ 20μl中で30℃で
測定した。別記しない限り、他のタンパク質と混合する前に、Ｇタンパク質アル
ファサブユニットをＡＭＦ（30μMＡｌＣｌ3、5 mMＭｇＣｌ2および5 mMＮａＦ ）とともに予備インキュベートした。指示されている場合は、ＡＭＦよりむしろ
25μMのＧＴＰγＳまたはＧＤＰβＳでαサブユニットを処理し、反応物をＡＭ Ｆを用いずに、しかし5μMのそれぞれのヌクレオチドを用いてインキュベートし
た。［3Ｈ］−ＧＤＰ−RhoＡの付加により反応を開始させて、インキュベーショ
ンの前後に、濾過により結合ＧＤＰを確定した（Northup et al., J. Biol. Che
m., 257, 11416-11423（1982））。
【００８２】 大腸菌中での発現後、ＧαsおよびＧαiアルファサブユニットを精製した（Le
e et al., Meth. Enzymol., 237, 146-164（1994））。に記載されているように
、ＧαSを大腸菌中で発現させ、それから精製した。 ＧαsおよびＧαiアルファ
サブユニットをヘキサヒスチジンタグ化ベータおよびガンマサブユニットととも
にＳｆ９細胞中で同時発現させて、前記のように単離した（Kozasa and Gilman,
J. Biol. Chem., 270, 1734-1741（1995））。バキュウロウイルス法（Singer
and Miller, J. Biol. Chem., 269, 19796-19802（1994））、ならびにＮｉ−Ｎ
ＴＡ樹脂（Qiagen）上でのヘテロトリマーの免疫感作後のαサブユニットの洗浄
および溶離中にオクチルグリコシドを用いて、同様の手法によりＧα13を調製し
た。ヒドロオキシアパタイトへの吸収およびそれからの溶離により、溶離Ｇα13 をさらに精製した。3リットルの細胞から約500 ugの精製Ｇα13が得られた。Ｓ ｆ９細胞中でのＧＳＴ−RhoＡの発現、ＧＳＴタグの切断および遊離RhoＡの単離
は、Singer et al., J. Biol. Chem., 271, 4505-4510（1996）に記載されたの と同様であった。
e et al., Meth. Enzymol., 237, 146-164（1994））。に記載されているように
、ＧαSを大腸菌中で発現させ、それから精製した。 ＧαsおよびＧαiアルファ
サブユニットをヘキサヒスチジンタグ化ベータおよびガンマサブユニットととも
にＳｆ９細胞中で同時発現させて、前記のように単離した（Kozasa and Gilman,
J. Biol. Chem., 270, 1734-1741（1995））。バキュウロウイルス法（Singer
and Miller, J. Biol. Chem., 269, 19796-19802（1994））、ならびにＮｉ−Ｎ
ＴＡ樹脂（Qiagen）上でのヘテロトリマーの免疫感作後のαサブユニットの洗浄
および溶離中にオクチルグリコシドを用いて、同様の手法によりＧα13を調製し
た。ヒドロオキシアパタイトへの吸収およびそれからの溶離により、溶離Ｇα13 をさらに精製した。3リットルの細胞から約500 ugの精製Ｇα13が得られた。Ｓ ｆ９細胞中でのＧＳＴ−RhoＡの発現、ＧＳＴタグの切断および遊離RhoＡの単離
は、Singer et al., J. Biol. Chem., 271, 4505-4510（1996）に記載されたの と同様であった。
【００８３】 これらの試験は、Ｇα13が、p115 RhoＧＥＦ（図７のパネルＡ）およびＧα13 （図７のパネルＢ）の両方の濃度による方式で全長p115 RhoＧＥＦの活性を刺激
し得る、ということを実証した。密接に関連するアルファサブユニットＧα12は
、これらの実験におけるp115 RhoＧＥＦの活性の刺激に際して、有効でなかった
（図７のパネルＡ）。Rho交換の刺激も、活性状態のＧα13の一関数としてモニ タリングした。図７のパネルＣのグラフで示したデータは、交換活性の刺激がフ
ッ化アルミニウム（ＡＭＦ）またはＧＴＰγＳによっているが、しかしＧＤＰβ
Ｓにより模倣された脱活化ヌクレオチド状態により刺激されない、ということを
確証する。さらに、一連のその他のアルファサブユニット、例えばＧαq、Ｇαz 、ＧαsおよびＧαiも、p115 RhoＧＥＦの活性に影響を及ぼさなかった（図７の
パネルＤ）。これらの結果は、図６に示した活性化Ｇα13依存性結合と一致し、
Ｇα13のp115 RhoＧＥＦとの増殖性結合が活性化には十分であり得ることを示唆
する。
し得る、ということを実証した。密接に関連するアルファサブユニットＧα12は
、これらの実験におけるp115 RhoＧＥＦの活性の刺激に際して、有効でなかった
（図７のパネルＡ）。Rho交換の刺激も、活性状態のＧα13の一関数としてモニ タリングした。図７のパネルＣのグラフで示したデータは、交換活性の刺激がフ
ッ化アルミニウム（ＡＭＦ）またはＧＴＰγＳによっているが、しかしＧＤＰβ
Ｓにより模倣された脱活化ヌクレオチド状態により刺激されない、ということを
確証する。さらに、一連のその他のアルファサブユニット、例えばＧαq、Ｇαz 、ＧαsおよびＧαiも、p115 RhoＧＥＦの活性に影響を及ぼさなかった（図７の
パネルＤ）。これらの結果は、図６に示した活性化Ｇα13依存性結合と一致し、
Ｇα13のp115 RhoＧＥＦとの増殖性結合が活性化には十分であり得ることを示唆
する。
【００８４】 実施例７：p115ヌクレオチド交換活性に及ぼすp115およびＧα12のドメインの
作用 p115 RhoＧＥＦのＲＧＳドメインが通常は自己抑制性であり、そしてＧα13と
の結合がこの抑制を軽減するという理論を、Rho交換活性に関して全長Rho−ＧＥ
Ｆ対切頭化Rho−ＧＥＦの作用を比較することにより調べた。
作用 p115 RhoＧＥＦのＲＧＳドメインが通常は自己抑制性であり、そしてＧα13と
の結合がこの抑制を軽減するという理論を、Rho交換活性に関して全長Rho−ＧＥ
Ｆ対切頭化Rho−ＧＥＦの作用を比較することにより調べた。
【００８５】 p115タンパク質の調製は、前記の実施例１に記載されたもの、およびHart et
al., J. Biol. Chem., 271, 25452-25458（1996）に前記されているのと同様で あった。図８のパネルＢおよびＣに示した検定は、前記の実施例５と同様に実施
した。ＡＭＦは活性化剤であった。 これらの実験の結果は、ＲＧＳドメインを欠く切頭化p115 RhoＧＥＦが、等濃
度の全長タンパク質と比較した場合、Rho交換活性の一貫した上昇を実証する、 ということを示した（図８のパネルＡ）。さらに、単離ＲＧＳドメインの付加（
ＧＳＴ融合タンパク質として）は、Ｇα13刺激p115 RhoＧＥＦ活性の撤廃を生じ
た（図８のパネルＢ）。これらのデータはp115 RhoＧＥＦ上の付加的Ｇα13結合
部位を排除しないが、しかしそれらはＲＧＳドメインを介した作用の主要方式を
示唆する。
al., J. Biol. Chem., 271, 25452-25458（1996）に前記されているのと同様で あった。図８のパネルＢおよびＣに示した検定は、前記の実施例５と同様に実施
した。ＡＭＦは活性化剤であった。 これらの実験の結果は、ＲＧＳドメインを欠く切頭化p115 RhoＧＥＦが、等濃
度の全長タンパク質と比較した場合、Rho交換活性の一貫した上昇を実証する、 ということを示した（図８のパネルＡ）。さらに、単離ＲＧＳドメインの付加（
ＧＳＴ融合タンパク質として）は、Ｇα13刺激p115 RhoＧＥＦ活性の撤廃を生じ
た（図８のパネルＢ）。これらのデータはp115 RhoＧＥＦ上の付加的Ｇα13結合
部位を排除しないが、しかしそれらはＲＧＳドメインを介した作用の主要方式を
示唆する。
【００８６】 Ｇαサブユニットがp115 RhoＧＥＦを活性化できないということは、p115 Rho
ＧＥＦがＧα12およびＧα13の両方のＧＴＰアーゼを活性化し得るという事実に
かんがみて困惑させられた。したがって、Ｇα12をＧα13刺激p115 RhoＧＥＦ検
定に付加する実験を実行した（図８のパネルＣ）。結果は、Ｇα12がp115 RhoＧ
ＥＦとのＧα13のカップリングを阻害し得る、ということを示した。このデータ
は、Ｇα12がp115 RhoＧＥＦのＲＧＳドメインとの結合に関してＧα13と競合す
るモデルと一致する。しかしながら、Ｇα12のp115 RhoＧＥＦとの結合は明らか
に、Rho交換活性を刺激するのに十分でない。これらの結果は、Ｇα12とp115 Rh
oＧＥＦのＲＧＳドメインとの相互作用はＧα13の場合とは全く異なるか、ある いはＧα13とp115 RhoＧＥＦとの間の相互作用の付加的部位が存在し得る、とい
うことを示唆する。
ＧＥＦがＧα12およびＧα13の両方のＧＴＰアーゼを活性化し得るという事実に
かんがみて困惑させられた。したがって、Ｇα12をＧα13刺激p115 RhoＧＥＦ検
定に付加する実験を実行した（図８のパネルＣ）。結果は、Ｇα12がp115 RhoＧ
ＥＦとのＧα13のカップリングを阻害し得る、ということを示した。このデータ
は、Ｇα12がp115 RhoＧＥＦのＲＧＳドメインとの結合に関してＧα13と競合す
るモデルと一致する。しかしながら、Ｇα12のp115 RhoＧＥＦとの結合は明らか
に、Rho交換活性を刺激するのに十分でない。これらの結果は、Ｇα12とp115 Rh
oＧＥＦのＲＧＳドメインとの相互作用はＧα13の場合とは全く異なるか、ある いはＧα13とp115 RhoＧＥＦとの間の相互作用の付加的部位が存在し得る、とい
うことを示唆する。
【００８７】 核酸、ポリペプチド、抗体等のその他の局面に関しては、分子生物学、タンパ
ク質科学および免疫学の標準教科書を参照していただきたい（例えば、Davis et
al.（1986）, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publi
shing. Inc., New York; Hames et al.（1985）, Nucleic Acid Hybridization,
IL Press, Molecular Cloning, Sambrook et al.:Current Protocols in Molec
ular Biology, Edited by F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.; Cu
rrent Protocols in Human Genetics, Edited by Nicholas C. Dracopoli et al
., John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols in Protein Science; Edited
by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols i
n Immunology; Edited by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc. 参照）。本明細書中に引用した特許出願、特許および出版物の記載内容はすべて
、参照により本明細書中に含まれる。
ク質科学および免疫学の標準教科書を参照していただきたい（例えば、Davis et
al.（1986）, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publi
shing. Inc., New York; Hames et al.（1985）, Nucleic Acid Hybridization,
IL Press, Molecular Cloning, Sambrook et al.:Current Protocols in Molec
ular Biology, Edited by F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.; Cu
rrent Protocols in Human Genetics, Edited by Nicholas C. Dracopoli et al
., John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols in Protein Science; Edited
by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols i
n Immunology; Edited by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc. 参照）。本明細書中に引用した特許出願、特許および出版物の記載内容はすべて
、参照により本明細書中に含まれる。
【００８８】 前記の説明から、当業者においては、本発明の本質的特徴を容易に確証し得る
し、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、種々の用途および条件に適用す
るための本発明の種々の変更および修正が成され得る。
し、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、種々の用途および条件に適用す
るための本発明の種々の変更および修正が成され得る。
【図１】 図１のパネルＡは、ＲＧＳタンパク質からの配列のアラインメント、ならびに
ギャップに関するペナルティーを割り当てるためにＲＧＳ４の二次構造マスクを
用いてClustal Wにより実施されたようなp115 RhoＧＥＦのＮ末端領域を示す。L
sc、KIAA380およびDrhoＧＥＦ２のＲＧＳ相同配列をさらに、Clustal Wおよび手
動調節によりこのアラインメントに付加した。ＲＧＳ４の上の記号（ａ）は、Ｒ
ＧＳ４のＲＧＳドメインのαらせんを示す。濃色ボックスは、ＲＧＳ構造の疎水
性コアの保存残基を示す。淡色ボックスは、他の保存残基を示す。星印は、Ｇα il と接触するＲＧＳ４の残基を示す。アラインメントに用いられる一次配列を以
下に示す：ラットＲＧＳ４（O08849）、マウスＲＧＳ２（P49795）、ヒトＧＡＩ
Ｐ（O08774）、ラットＲＧＳ１２（O08774）、ラットＲＧＳ１４（O08773）、ヒ
トｐ１１５（1654344）、マウスＬｓｃ（1389756）、ヒトＫＩＡＡ３８０（2224
701）およびショウジョウバエDrhoＧＥＦ２（2760368）。 図１のパネルＢは、本明細書中に記載した試験に用いられたp111 RhoＧＥＦの
構築物を示す。数字は、各構築物中のp115の残基を示す。ＲＧＳ、dbl（ＤＨ） およびプレクストリン（ＰＨ）相同領域が示される。ＧＳＴ＝グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ。
ギャップに関するペナルティーを割り当てるためにＲＧＳ４の二次構造マスクを
用いてClustal Wにより実施されたようなp115 RhoＧＥＦのＮ末端領域を示す。L
sc、KIAA380およびDrhoＧＥＦ２のＲＧＳ相同配列をさらに、Clustal Wおよび手
動調節によりこのアラインメントに付加した。ＲＧＳ４の上の記号（ａ）は、Ｒ
ＧＳ４のＲＧＳドメインのαらせんを示す。濃色ボックスは、ＲＧＳ構造の疎水
性コアの保存残基を示す。淡色ボックスは、他の保存残基を示す。星印は、Ｇα il と接触するＲＧＳ４の残基を示す。アラインメントに用いられる一次配列を以
下に示す：ラットＲＧＳ４（O08849）、マウスＲＧＳ２（P49795）、ヒトＧＡＩ
Ｐ（O08774）、ラットＲＧＳ１２（O08774）、ラットＲＧＳ１４（O08773）、ヒ
トｐ１１５（1654344）、マウスＬｓｃ（1389756）、ヒトＫＩＡＡ３８０（2224
701）およびショウジョウバエDrhoＧＥＦ２（2760368）。 図１のパネルＢは、本明細書中に記載した試験に用いられたp111 RhoＧＥＦの
構築物を示す。数字は、各構築物中のp115の残基を示す。ＲＧＳ、dbl（ＤＨ） およびプレクストリン（ＰＨ）相同領域が示される。ＧＳＴ＝グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ。
【図２】 図２のパネルＡは、10 nM p115 RhoＧＥＦを用いて（●○）、または用いずに
（黒四角形□）、15℃でＧα13およびＧα12に結合されたＧＴＰの加水分解を示
すグラフである。 図２のパネルＢは、種々の濃度のp115 RhoＧＥＦの存在下での、Ｇα13（●）
およびＧα12（○）に結合されたＧＴＰの4℃での加水分解を示すグラフである 。反応の初期速度を、p115 RhoＧＥＦの濃度の関数としてプロットした。
（黒四角形□）、15℃でＧα13およびＧα12に結合されたＧＴＰの加水分解を示
すグラフである。 図２のパネルＢは、種々の濃度のp115 RhoＧＥＦの存在下での、Ｇα13（●）
およびＧα12（○）に結合されたＧＴＰの4℃での加水分解を示すグラフである 。反応の初期速度を、p115 RhoＧＥＦの濃度の関数としてプロットした。
【図３】 図３は、全長 p115 RhoＧＥＦ（●）、△Ｎp115（黒四角形）、またはＲＧＳ −p115（黒三角形）を用いて、またはいかなるp115構築物も用いずに（黒逆三角
形）、Ｇα13およびＧα12に結合されたＧＴＰの15℃での加水分解を示すグラフ
である。
形）、Ｇα13およびＧα12に結合されたＧＴＰの15℃での加水分解を示すグラフ
である。
【図４】 図４は、100 nM p115 RhoＧＥＦ（△）、100 nMＲＧＳ４（□）または緩衝液 対照（○）を用いて、ＧαilＧαz、ＧαqおよびＧαsに結合されたＧＴＰの加 水分解を示すグラフである。検定は、 ＧαilおよびＧαsに関しては4℃で、Ｇ αzに関しては15℃で、そしてＧαqに関しては20℃で実施した。
【図５】 図５は、ＡｌＦ4活性化形態のＧαサブユニットによるp115ＧＡＰ活性の選択 的抑制を示すグラフである。パネルＡ：P115（400 nM）を、30μMのＡｌＣｌ3、
10 mMのＮａＦ、および10 mMのＭｇＳＯ4の存在下で、種々のＧαサブユニット （400 nM）とともに氷上で15分間インキュベートした。混合物を20倍に稀釈し、
0.3 nMのＧα12（ＧＴＰ）と混合して、15℃で2分間インキュベーション後に、 結合ＧＴＰの加水分解を測定した。パネルＢ： P115（400 nM）を、パネルＡに 関して記載したように、種々の濃度のＧα12（ＧＤＰ−ＡＩＦ4 -）（●）または
Ｇα13（ＧＤＰ−ＡＩＦ4 -）（黒四角形）とともにインキュベートした。混合物
を20倍に稀釈し、1 nMのＧα13（ＧＴＰ）と４℃で混合して、結合ＧＴＰの加水
分解を時間を掛けて査定した。αサブユニットＧＤＰ−ＡＩＦ4 -の最終濃度に対
するＧα13のＧＴＰアーゼの初期速度をプロットした。中黒三角は、p115を伴わ
ないＧα13のＧＴＰアーゼの速度を示す。
10 mMのＮａＦ、および10 mMのＭｇＳＯ4の存在下で、種々のＧαサブユニット （400 nM）とともに氷上で15分間インキュベートした。混合物を20倍に稀釈し、
0.3 nMのＧα12（ＧＴＰ）と混合して、15℃で2分間インキュベーション後に、 結合ＧＴＰの加水分解を測定した。パネルＢ： P115（400 nM）を、パネルＡに 関して記載したように、種々の濃度のＧα12（ＧＤＰ−ＡＩＦ4 -）（●）または
Ｇα13（ＧＤＰ−ＡＩＦ4 -）（黒四角形）とともにインキュベートした。混合物
を20倍に稀釈し、1 nMのＧα13（ＧＴＰ）と４℃で混合して、結合ＧＴＰの加水
分解を時間を掛けて査定した。αサブユニットＧＤＰ−ＡＩＦ4 -の最終濃度に対
するＧα13のＧＴＰアーゼの初期速度をプロットした。中黒三角は、p115を伴わ
ないＧα13のＧＴＰアーゼの速度を示す。
【図６】 図６のパネルＡは、抗myc抗体を用いたＣＯＳ細胞中でのmycタグ化p115 RhoＧ
ＥＦ発現の検出を示すイムノブロットの画像である。 図６のパネルＢは、抗myc抗体を用いたp115 RhoＧＥＦおよびＧα13の同時免 疫沈降の検出を示すイムノブロットの画像である。 図６のパネルＣは、抗Ｇα13抗体を用いたp115 RhoＧＥＦおよびＧα13の同時
免疫沈降の検出を示すイムノブロットの画像である。 図６のパネルＤは、抗Ｇα13抗体を用いた場合の免疫沈降化p115 RhoＧＥＦに
精製Ｇα13を付加した場合のp115 RhoＧＥＦおよびＧα13結合の検出を示すイム
ノブロットの画像である。
ＥＦ発現の検出を示すイムノブロットの画像である。 図６のパネルＢは、抗myc抗体を用いたp115 RhoＧＥＦおよびＧα13の同時免 疫沈降の検出を示すイムノブロットの画像である。 図６のパネルＣは、抗Ｇα13抗体を用いたp115 RhoＧＥＦおよびＧα13の同時
免疫沈降の検出を示すイムノブロットの画像である。 図６のパネルＤは、抗Ｇα13抗体を用いた場合の免疫沈降化p115 RhoＧＥＦに
精製Ｇα13を付加した場合のp115 RhoＧＥＦおよびＧα13結合の検出を示すイム
ノブロットの画像である。
【図７】 図７のパネルＡは、100 nmのＧα13またはＧα12の存在下または非存在下での
、そして指示されたような種々の濃度のp115 RhoＧＥＦの存在下での、10分後の
100 nM RhoＡからの結合ＧＤＰの解離を示すグラフである。 図７のパネルＢは、25 nmの115RhoＧＥＦおよび指示濃度のＧα13またはＧα1 2 の存在下での、10分後の100 nM RhoＡからのＧＤＰの解離を示すグラフである
。 図７のパネルＣは、指示されたようなＡＭＦ、ＧＴＰγＳまたはＧＤＰβＳで
処理されていたp115 RhoＧＥＦおよびＧα13を用いた10分間のインキュベーショ
ン後の100 nM RhoＡからのＧＤＰの解離を示すグラフである。 図７のパネルＤは、指示されたような種々の濃度のp115 RhoＧＥＦ（25 nM） およびＧαサブユニット（100 nM）を用いた10分間のインキュベーション後の10
0 nM RhoＡからのＧＤＰの解離を示すグラフである。
、そして指示されたような種々の濃度のp115 RhoＧＥＦの存在下での、10分後の
100 nM RhoＡからの結合ＧＤＰの解離を示すグラフである。 図７のパネルＢは、25 nmの115RhoＧＥＦおよび指示濃度のＧα13またはＧα1 2 の存在下での、10分後の100 nM RhoＡからのＧＤＰの解離を示すグラフである
。 図７のパネルＣは、指示されたようなＡＭＦ、ＧＴＰγＳまたはＧＤＰβＳで
処理されていたp115 RhoＧＥＦおよびＧα13を用いた10分間のインキュベーショ
ン後の100 nM RhoＡからのＧＤＰの解離を示すグラフである。 図７のパネルＤは、指示されたような種々の濃度のp115 RhoＧＥＦ（25 nM） およびＧαサブユニット（100 nM）を用いた10分間のインキュベーション後の10
0 nM RhoＡからのＧＤＰの解離を示すグラフである。
【図８】 図８のパネルＡは、30℃で30分後に濾過により測定した場合の、指示濃度の切
頭化全長p115 RhoＧＥＦの存在下での、１nMの［32Ｐ］ＧＴＰの100 nMのRhoＡ との会合を示すグラフである。 図８のパネルＢは、指示されたような25 nMのp115 RhoＧＥＦ、20 nMのＧα13 および300 nMのＧＳＴ−ＲＧＳp115の存在下または非存在下での、10分間のイン
キュベーション後の100 nM RhoＡからの［3Ｈ］−ＧＤＰの解離を示すグラフで
ある。 図８のパネルＣは、25 nMのp115 RhoＧＥＦの存在下での、そして25 nMのＧα 13 および指示濃度のＧα12の存在下または非存在下での、10分間のインキュベー
ション後の100 nM RhoＡからの［3Ｈ］−ＧＤＰの解離を示すグラフである。
頭化全長p115 RhoＧＥＦの存在下での、１nMの［32Ｐ］ＧＴＰの100 nMのRhoＡ との会合を示すグラフである。 図８のパネルＢは、指示されたような25 nMのp115 RhoＧＥＦ、20 nMのＧα13 および300 nMのＧＳＴ−ＲＧＳp115の存在下または非存在下での、10分間のイン
キュベーション後の100 nM RhoＡからの［3Ｈ］−ＧＤＰの解離を示すグラフで
ある。 図８のパネルＣは、25 nMのp115 RhoＧＥＦの存在下での、そして25 nMのＧα 13 および指示濃度のＧα12の存在下または非存在下での、10分間のインキュベー
ション後の100 nM RhoＡからの［3Ｈ］−ＧＤＰの解離を示すグラフである。
【図９】 図９のパネルＡは、抗myc抗体を用いたＣＯＳ細胞中でのmycタグ化ＫＩＡＡ３
８０（ＦＬ147と呼ばれる）発現の検出を示すイムノブロットの画像である。 図９のパネルＢは、抗Ｇα12抗体を用いたＫＩＡＡ３８０（ＦＦ147と呼ばれ る）およびＧα12の同時免疫沈降の検出を示すイムノブロットの画像である。
８０（ＦＬ147と呼ばれる）発現の検出を示すイムノブロットの画像である。 図９のパネルＢは、抗Ｇα12抗体を用いたＫＩＡＡ３８０（ＦＦ147と呼ばれ る）およびＧα12の同時免疫沈降の検出を示すイムノブロットの画像である。
【図１０】 図１０は、p115 RhoＧＥＦに関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメイ
ンはアミノ酸45-170により示される。
ンはアミノ酸45-170により示される。
【図１１】 図１１は、 p115 RhoＧＥＦに関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメ インはアミノ酸187-564により示される。
【図１２】 図１２は、ＫＩＡＡ３８０に関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメイ
ンはアミノ酸310-432により示される。
ンはアミノ酸310-432により示される。
【図１３】 図１３は、ＫＩＡＡ３８０に関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメイ
ンはアミノ酸1673-2041により示される。
ンはアミノ酸1673-2041により示される。
【図１４】 図１４は、Ｌｓｃに関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメインはアミ
ノ酸43-168により示される。
ノ酸43-168により示される。
【図１５】 図１５は、Ｌｓｃに関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメインはアミ
ノ酸218-595により示される。
ノ酸218-595により示される。
【図１６】 図１６は、DRhoＧＥＦ２に関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメイン
はアミノ酸924-1053により示される。
はアミノ酸924-1053により示される。
【図１７】 図１７は、DRhoＧＥＦ２に関するアミノ酸配列の一覧である。ＲＧＳドメイン
はアミノ酸3185-3574により示される。
はアミノ酸3185-3574により示される。
【図１８】 図１８は、ＲＧＳドメインを有するＧＥＦタンパク質を含めたいくつかのタン
パク質（例えば、P115 RhoＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DrhoＧＥＦ）のＲ
ＧＳ領域の相同アラインメントである。アラインメントは、ＰＡＭ２５０重量表
を用いるClustal法を用いて実施した。
パク質（例えば、P115 RhoＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０、DrhoＧＥＦ）のＲ
ＧＳ領域の相同アラインメントである。アラインメントは、ＰＡＭ２５０重量表
を用いるClustal法を用いて実施した。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月４日（２０００．１０．４）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】要約書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【要約】 単量体ＧＴＰａｓｅグアニン・ヌクレオチド変換因子（ＧＥＦ）であって、Ｇ
ＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）のＲＧＳ領域に類似するＲＧＳ領域をも
含むものが同定された。これらのＧＥＦタンパク質の中のＩ，ＲｈｏＧＥＦは、
ヘテロ３量体Ｇタンパク質のαサブユニットに対するＧＡＰ活性を有するＲＧＳ
配列を含むことが証明された。
ＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）のＲＧＳ領域に類似するＲＧＳ領域をも
含むものが同定された。これらのＧＥＦタンパク質の中のＩ，ＲｈｏＧＥＦは、
ヘテロ３量体Ｇタンパク質のαサブユニットに対するＧＡＰ活性を有するＲＧＳ
配列を含むことが証明された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハート，マシュー ジェイ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94706， バークレイ，マソニック アベニュ 1210 (72)発明者 ロスコー，ウィリアム アメリカ合衆国，カリフォルニア 94115， サンフランシスコ，カリフォルニア スト リート 3099 (72)発明者 ポラキス，ポール アメリカ合衆国，カリフォルニア 94941， ミルバリー，バローン レーン 509 (72)発明者 スターンウェイス，ポール アメリカ合衆国，テキサス 75080，リチ ャードソン，フラット クリート ドライ ブ 2103 (72)発明者 コザサ，トール アメリカ合衆国，テキサス 75225，ダラ ス，センティナリー 7415 (72)発明者 ジャン，スージュン アメリカ合衆国，テキサス 75080，リチ ャードソン，ウォータービュー パークウ ェイ 2400 ＃932 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ42 QQ52 QR56 QS25 QS34 QX02 QX07 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 BA16 CA24 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 EA51 FA74
Claims (28)
- 【請求項１】 本質的にＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインから成る単離Ｒ
ＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片。 - 【請求項２】 ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインを包含するが、但しＤＨ
ドメインまたはＰＨドメインを包含しない単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまた
は生物学的に活性なその断片。 - 【請求項３】 ペプチドがp115 RhoＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３８０から成
る群から選択され、そしてペプチドがＲＧＳドメインで突然変異化され、そして
ポリペプチドがＧタンパク質アルファサブユニットに対する特異的結合親和性ま
たはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活性化活性を有す
る単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片。 - 【請求項４】 ＧＥＦタンパク質がRhoＧＥＦタンパク質である請求項１ま たは２の単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片。
- 【請求項５】 RhoＧＥＦタンパク質がp115 RhoＧＥＦである請求項４の単 離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片。
- 【請求項６】 RhoＧＥＦタンパク質がＬｓｃ、ＫＩＡＡ３８０およびDrho ＧＥＦ２から成る群から選択される請求項４の単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチド
または生物学的に活性なその断片。 - 【請求項７】 ポリペプチドがＧタンパク質αサブユニットに対する特異的
結合親和性またはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活性
化活性を有する請求項１または２の単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物
学的に活性なその断片。 - 【請求項８】 ポリペプチドがＧタンパク質αサブユニットに対する特異的
結合親和性またはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活性
化活性を有する請求項４の単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活
性なその断片。 - 【請求項９】 ポリペプチドがＧタンパク質αサブユニットに対する特異的
結合親和性またはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活性
化活性を有する請求項５の単離ＲＧＳ−ＧＥＦポリペプチドまたは生物学的に活
性なその断片。 - 【請求項１０】 ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインを包含するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列から本質的に成る単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。 - 【請求項１１】 ＧＥＦタンパク質のＲＧＳドメインを包含するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸であって、その
ポリペプチドがＤＨドメインまたはＰＨドメインを含まない核酸。 - 【請求項１２】 ＧＥＦタンパク質がRhoＧＥＦタンパク質である請求項１ ０または１１の単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。
- 【請求項１３】 RhoＧＥＦタンパク質がp115 RhoＧＥＦである請求項１２ の単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。
- 【請求項１４】 RhoＧＥＦタンパク質がＬｓｃ、ＫＩＡＡ３８０およびDrh
oＧＥＦ２から成る群から選択される請求項１２の単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。 - 【請求項１５】 ポリペプチドがＧタンパク質αサブユニットに対する特異
的結合親和性またはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活
性化活性を有する請求項１０または１１の単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。 - 【請求項１６】 ポリペプチドがＧタンパク質αサブユニットに対する特異
的結合親和性またはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活
性化活性を有する請求項１２の単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。 - 【請求項１７】 ポリペプチドがＧタンパク質αサブユニットに対する特異
的結合親和性またはＧタンパク質アルファサブユニットに対するＧＴＰアーゼ活
性化活性を有する請求項１３の単離ＲＧＳ−ＧＥＦ核酸。 - 【請求項１８】 Ｇタンパク質αサブユニットの活性の調整方法であって、
有効量の請求項１または４のポリペプチドを哺乳類に投与することを包含する方
法。 - 【請求項１９】 単量体Ｇタンパク質グアニンヌクレオチド交換因子のＧタ
ンパク質αサブユニットとの結合を阻害または増強する分子の同定または検定方
法であって、Ｇタンパク質αサブユニットまたはその断片を単量体Ｇタンパク質
ヌクレオチド交換因子またはその断片とともに、被験分子の存在下および非存在
下でインキュベートし、そして被験分子の存在が単量体Ｇタンパク質グアニンヌ
クレオチド交換因子とＧタンパク質αサブユニットとの間の結合を阻害または増
強するか否かを確定することを包含する方法。 - 【請求項２０】 ＧαサブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦの刺激
作用を阻害または増強する分子の同定または検定方法であって、Ｇαアルファサ
ブユニットまたはその断片を、ＧＥＦタンパク質またはその断片とともに、被験
分子の存在下および非存在下でインキュベートし、そして被験分子の存在がＧα
サブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦタンパク質の刺激作用を阻害また
は増強するか否かを確定することを包含する方法。 - 【請求項２１】 単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に及
ぼす活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を特異的に阻害する分子の同定または検
定方法であって、被験阻害剤の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質または
その断片、および単量体Ｇタンパク質またはその断片とともに活性化Ｇαサブユ
ニットまたはその断片をインキュベートすることにより一次検定を実行し、被験
阻害剤の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質またはその断片、および単量
体Ｇタンパク質またはその断片をインキュベートすることにより二次検定を実行
して、一次検定における被験阻害剤のあらゆる阻害作用が二次検定における被験
阻害剤のあらゆる阻害作用より大きいか否かを確定することを包含する方法。 - 【請求項２２】 単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に及
ぼす活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を特異的に増強する分子の同定または検
定方法であって、被験増強剤の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質および
その断片、ならびに単量体Ｇタンパク質またはその断片とともに活性化Ｇαサブ
ユニットまたはその断片をインキュベートすることにより一次検定を実行し、被
験増強剤の存在下および非存在下でＧＥＦタンパク質またはその断片、および単
量体Ｇタンパク質またはその断片をインキュベートすることにより二次検定を実
行して、一次検定における被験増強剤のあらゆる増強作用が二次検定における被
験増強剤のあらゆる増強作用より大きいか否かを確定することを包含する方法。 - 【請求項２３】 単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に及
ぼす活性化Ｇαサブユニットの刺激作用を模倣する分子の同定または検定方法で
あって、 ＧＥＦタンパク質またはその断片のＲＧＳドメインに対する結合親和 性を示す被験化合物を同定し、ＧＥＦタンパク質またはその断片および単量体Ｇ
タンパク質またはその断片を、被験化合物の存在下または非存在下でインキュベ
ートして、被験化合物が単量体Ｇタンパク質のＧＥＦ媒介性ヌクレオチド交換に
及ぼす刺激作用を示すか否かを確定することを包含する方法。 - 【請求項２４】 ＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性に及ぼすＧＥＦタン
パク質のＲＧＳドメインの刺激作用を模倣する分子の同定または検定方法であっ
て、Ｇαサブユニットに対する結合親和性を示す被験化合物を同定し、そして被
験化合物の存在下または非存在下でＧＴＰ負荷Ｇαサブユニットをインキュベー
トして、被験化合物がＧαサブユニットＧＴＰアーゼ活性に及ぼす刺激作用を有
するか否かを確定することを包含する方法。 - 【請求項２５】 ＧＥＦタンパク質がp115 RhoＧＥＦ、Ｌｓｃ、ＫＩＡＡ３
８０およびDrhoＧＥＦ２から成る群から選択される請求項１９、２０、２１、２
２、２３または２４の方法。 - 【請求項２６】 核酸によりコードされるポリペプチドを形質転換化宿主細
胞中で発現する方法であって、請求項１１の核酸を含有する形質転換化宿主細胞
を培養することを包含する方法。 - 【請求項２７】 請求項１１の核酸を含有する形質転換化細胞。
- 【請求項２８】 請求項１１の核酸を包含するベクター。
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