CN105126079B - G蛋白信号转导调节蛋白14（rgs14）在治疗心肌肥厚中的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种G蛋白信号转导调节蛋白14（RGS14）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了RGS14的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明在发生心肌肥厚的模型中，RGS14的表达和正常组相比显著降低；抑制RGS14表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进RGS14过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此，RGS14可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

Description

G蛋白信号转导调节蛋白14（RGS14）在治疗心肌肥厚中的功能 及应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种G蛋白信号转导调节蛋白14（RGS14）在治疗心肌肥厚中的功能及应用。

背景技术

《中国心血管病报告•2014》显示全国有心血管病患者209亿，每5个成人中有1人患心血管病[1]。心肌肥厚是众多心血管疾病发展的重要阶段，如不能进行有效控制，将最终导致心力衰竭，甚至死亡。因此，阐明心肌肥厚的发病机制，寻找新治疗靶点对防控心肌肥厚，保护心功能及改善预后具有非常重要的现实意义。

G蛋白信号转导是细胞外信号引发细胞生理功能改变的共同途径之一，广泛存在于机体各处。心血管系统中大约有100多种不同类型的G蛋白偶联受体（G-protein-coupledreceptor，GPCR）[2]。GPCR包含一个有α、β、γ三个亚基组成的异源三聚体复合物。根据不同家族成员中G_α亚基的序列相似性，G蛋白分为四个家族（Gs、Gi、Gq和G12）。GPCR和配体结合后被激活，刺激核苷交换和α亚基与β、γ亚基复合体解离，分离的G_α亚单位和β、γ二聚体分别调节下游的效应分子，从而引起相应的生理学效应。G_α亚单位作为分子转换器结合和水解GTP，活化性的G_α-GTP不被GTP酶活性水解为GDP的时间直接决定G蛋白信号转导的持续时间。G蛋白信号转导调节蛋白（Regulators of G protein signaling, RGS）是G蛋白信号转导的负调节因子，能够抑制GDP的解离而阻断G蛋白激活或激活GTP酶加速G蛋白失活。RGS家族蛋白大小不一，其氨基酸长度从152个（RGS21）到1376个（RGSl2）长短不等。根据其结构域的序列相似性，RGS蛋白可分为五个不同的亚家族：R4、R7、R12、RZ和RL[3]。它们的结构中除包含高度保守的RGS结构域外，还存在多种作用各异的其他结构域如GGL（G-protein γsubunit like domain，Gγ样结构域）、RGSl2结合磷酸酪氨酸的结构域（PIB）等。RGS结构域与RGS蛋白的GTPase激活蛋白（GTPase activating proteins，GAP）活性有关，其他结构域的作用则较为复杂多变。

GPCR和RGS蛋白都是心血管系统中信号转导调节因子。目前所有已知的RGS蛋白基因都能够在哺乳动物的心脏中被检测出来[4, 5]。已有的证据表明，RGS蛋白参与维持正常的心血管功能，并在不同的心血管疾病中作出相应的变化。例如RGS2、4、5和19已被证实参与心肌肥厚，心力衰竭、心律失常以及高血压等心血管疾病[6-8]。RGS14与RGS10、12均属于R12亚族，有两个与G_α结合的部分：RGS结构域和GoLoco结构域。GRS14主要分布在神经元、巨噬细胞等免疫系统以及心肌细胞。近年研究表明，RGS14可通过抑制CA2区神经元突触可塑性影响海马区记忆和空间学习能力[9]，此外，RGS14也是有丝分裂的重要调节蛋白，作为微管结合蛋白可以调节小鼠胚胎有丝分裂纺锤体的首次分裂[10]。然而，RGS14在心肌中的作用尚不明确，其在心肌细胞中到底发挥何种作用有待进一步研究探讨。揭示RGS14在心肌肥厚中的作用及机制，可为开发以RGS14为靶点的新治疗药物、手段奠定基础。

参考文献：

1. 国家心血管病中心.《中国心血管病报告•2014》[M].北京：中国大百科全书出版社. 2014:1-2.

2. Tang CM, Insel PA. GPCR expression in the heart; "new" receptorsin myocytes and fibroblasts. Trends Cardiovasc Med. 2004 Apr;14(3):94-9.

3. Zhang P, Mende U. Regulators of G-protein signaling in the heartand their potential as therapeutic targets. Circ Res. 2011 Jul 22;109(3):320-33.

4. Mittmann C, Chung CH, Hoppner G, Michalek C, Nose M, Schuler C,Schuh A, Eschenhagen T, Weil J, Pieske B, Hirt S, Wieland T. Expression often RGS proteins in human myocardium: functional characterization of anupregulation of RGS4 in heart failure. Cardiovasc Res. 2002 Sep;55(4):778-86.

5. Riddle EL, Schwartzman RA, Bond M, Insel PA. Multi-tasking RGSproteins in the heart: the next therapeutic target? Circ Res. 2005 Mar 4;96(4):401-11.

6. Zhang P, Su J, King ME, Maldonado AE, Park C, Mende U. Regulatorof G protein signaling 2 is a functionally important negative regulator ofangiotensin II-induced cardiac fibroblast responses. Am J Physiol Heart CircPhysiol. 2011 Jul;301(1):H147-56.

7. Ji YR, Kim MO, Kim SH, Yu DH, Shin MJ, Kim HJ, Yuh HS, Bae KB, KimJY, Park HD, Lee SG, Hyun BH, Ryoo ZY. Effects of regulator of G proteinsignaling 19 (RGS19) on heart development and function. J Biol Chem. 2010 Sep10;285(37):28627-34.

8. Tokudome T, Kishimoto I, Horio T, Arai Y, Schwenke DO, Hino J,Okano I, Kawano Y, Kohno M, Miyazato M, Nakao K, Kangawa K. Regulator of G-protein signaling subtype 4 mediates antihypertrophic effect of locallysecreted natriuretic peptides in the heart. Circulation. 2008 May 6;117(18):2329-39.

9. Vellano CP, Lee SE, Dudek SM, Hepler JR. RGS14 at the interface ofhippocampal signaling and synaptic plasticity. Trends Pharmacol Sci. 2011Nov;32(11):666-74.

10. Martin-McCaffrey L, Willard FS, Oliveira-dos-Santos AJ, NataleDR, Snow BE, Kimple RJ, Pajak A, Watson AJ, Dagnino L, Penninger JM,Siderovski DP, D'Souza SJ. RGS14 is a mitotic spindle protein essential fromthe first division of the mammalian zygote. Dev Cell. 2004 Nov;7(5):763-9。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定RGS14的表达和心肌肥厚的相互关系，提供一种RGS14在制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物中的新应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过试验确定了RGS14表达与心肌肥厚之间的关系：

1、发生心肌肥厚时心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，RGS14的表达明显下调

本发明分别选用正常人和扩张型心肌病患者心脏，正常假手术（Sham）小鼠和通过主动脉弓缩窄手术（AB）造成心肌肥厚的小鼠心脏，分别检测了ANP、β-MHC、RGS14的蛋白表达情况。结果表明，扩张型心肌病患者和发生心肌肥厚的小鼠心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，RGS14的表达明显下调（图1、图2）。

2、RGS14基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能

本发明选用野生型小鼠、RGS14基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究RGS14基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除RGS14基因所致的RGS14缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能（图3、图4、图5、图6）。

3、RGS14基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能

本发明选用心脏特异性RGS14转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究RGS14基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达RGS14基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能（图7、图8、图9、图10）。

由以上结果可知在发生心肌肥厚的模型中，RGS14的表达和正常组相比显著降低；抑制RGS14表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进RGS14过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此RGS14具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是RGS14具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

一种RGS14在心肌肥厚中的功能，主要体现在RGS14具有保护心功能和抑制心肌肥厚的作用，特别是RGS14具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚发生的作用。

针对RGS14的上述功能，提供一种RGS14的应用，主要体现为RGS14在保护心脏、抗心脏纤维化和治疗心肌肥厚中的应用，特别是RGS14在筛选或制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。所述的应用包括 RGS14直接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的有效成分，能够促进RGS14表达的化学物质间接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的有效成分。

一种保护心脏功能的药物，包含RGS14。

一种抗心脏纤维化的药物，包含RGS14。

一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含RGS14。

本发明具有如下有益效果：

本发明发现了RGS14基因的新功能，即RGS14基因具有能够保护心脏功能、抗心脏纤维化和抑制心肌肥厚的作用。因此，RGS14可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

附图说明

图1是正常人和扩张型心肌病（扩心病）患者心脏中ANP、β-MHC、RGS14的表达情况及统计柱状图，GAPDH作为内参，扩张型心肌病患者心脏RGS14的表达下调（*：p＜0.05 vs正常人组）。

图2是野生型小鼠在假手术（Sham）和主动脉弓缩窄手术（AB）后心脏中ANP、β-MHC、RGS14的表达情况及统计柱状图，GAPDH作为内参；其中4W表示4周，8W表示8周；发生心肌肥厚的心脏RGS14的表达下调（*：p＜0.05 vs野生型小鼠Sham组）。

图3是RGS14+/+和RGS14-/-小鼠AB术8周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（*：p＜0.05 vs RGS14+/+ Sham组，#：p＜0.05 vs RGS14+/+ AB组）。

图4是RGS14+/+和RGS14-/-小鼠AB术8周后心室横截面HE染色、心肌细胞WGA染色和心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05 vs RGS14+/+ Sham组，# p＜0.05 vs RGS14+/+ AB组）。

图5是RGS14+/+和RGS14-/-小鼠AB术8周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图（*：p＜0.05 vs RGS14+/+ Sham组，#：p＜0.05 vs RGS14+/+ AB组）。

图6是RGS14+/+和RGS14-/-小鼠AB术8周后心功能检测结果；LVDd为左室舒张末期内径，LVDs为左室收缩末期内径，FS为短轴缩短率（*：p＜0.05 vs RGS14+/+ Sham组，#：p＜0.05 vs RGS14+/+ AB组）。

图7是NTG和TG小鼠AB术8周后 HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（*：p＜0.05 vsNTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTG AB组）。

图8是NTG和TG小鼠AB术8周后心室横截面HE染色、心肌细胞WGA染色和心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTG AB组）。

图9是NTG和TG小鼠AB术8周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTG AB组）。

图10是NTG和TG小鼠AB术8周后心功能检测结果；LVDd为左室舒张末期内径，LVDs为左室收缩末期内径，FS为短轴缩短率（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTG AB组）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的野生型小鼠（RGS14+/+）、全身性RGS14基因敲除小鼠（RGS14-/-）、心脏特异性RGS14转基因小鼠（RGS14-TG）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

（1）全身性RGS14基因敲除小鼠的构建：

利用CRISPR-Cas9技术构建全身性RGS14基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）预测小鼠RGS14的引导序列，设计2条单链oligo：

oligo1：TAGGCCTGGGAACCTGCAGTGC，

oligo2：AAACGCACTGCAGGTTCCCAGG。

oligo1和oligo2退火形成双链DNA，将双链DNA连入经BsaI酶切的pUC57-sgRNA（Addgene 51132）构建sgRNA表达载体。

以上述构建的sgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段：

Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG，

Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。

以所扩增的PCR产物为模板使用MEGAshortscript Kit（Ambion，AM1354）进行体外转录；Cas9质粒（Addgene 44758）通过T7 Ultra kit（Ambion，Am1345）进行转录。将转录得到的Cas9和引导序列RNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit（Qiaen，217084）纯化后，通过FemtoJet 5247显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内。选取经显微注射后存活的受精卵，将其移植到健康雌鼠输卵管中，经过21天妊娠之后得到F0代小鼠。

F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定，野生型小鼠包含一段长405bp的DNA序列，而突变小鼠（RGS14基因敲除小鼠）含有400bp的DNA序列，最终蛋白产物通过western blot 进行检测鉴定。其中，PCR鉴定引物如下：

RGS14-F：5’-CTGTGTGGACACTCCCATCC-3’，

RGS14-R：5’-ACCACAGAGAGAAGCAGCAC-3’。

实验所用小鼠为突变体纯合子。

（2）心脏特异性RGS14转基因小鼠的构建：

以野生型C57BL/6小鼠RGS14基因cDNA为模板，用如下引物PCR扩增小鼠RGS14全长基因（NCBI，Gene ID：mus NM_016758.3）：

上游引物：TCCCCCCGGGGCCACCATGCCAGGGAAGCCCAAG，

下游引物：CGCGGATCCCTATGGTGGAGCCTCCCG。

把扩增的RGS14全长基因及pCAG-loxP-CAT-loxP质粒（pCAG-loxP-CAT-loxP质粒由北京协和医学院基础学院杨青林老师提供，制备过程参见文献：Kim T, ZhelyabovskaO, Liu J, et al. Generation of an Inducible, Cardiomyocyte-SpecificTransgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J]. PeroxisomeProliferator-Activated Receptors (PPARs), 57.）经XmaI（NEB，# R0180L）和BamHI（NEB，# R0136L）双酶切后连接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-RGS14-hGHpA载体（CAG(chickenbeta-actin)-CAT(chloramphenicol acetyltransferase)-RGS14-hGHpA），将构建的质粒通过显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内，该受精卵移植入健康雌鼠中，发育得到F0代小鼠。将得到的F0代小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交，并通过他莫昔芬诱导（他莫昔芬80mg/kg/天，腹腔注射，连续刺激5天）得到心脏特异性RGS14转基因老鼠（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, ZhangR et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation ofpathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.）。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在SPF级实验动物中心，SPF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1 RGS14在正常人和心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏（非心脏原因的死亡捐献的个体，Donor）和扩张型心肌病患者心脏（做心脏移植手术病人置换的受体，DCM），对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot），结合特异性识RGS14蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP（Millipore，AB2232）、β-MHC（santa cruz，sc53090）的抗体进行检测，测定其RGS14（AVIVA，OAAF04168）的表达，GAPDH（Cell Signaling Technology，2128）作为内参。检测结果如图1所示，扩张型心肌病患者心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，RGS14的表达则明显下调。

实施例2 RGS14在野生型小鼠假手术组和心肌肥厚模型组心脏中的表达

1. 采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型，模型操作流程：

1.1 术前准备

（1）麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准（一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间）。

（2）术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

（3）气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上（加热垫需提前预热），然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

1.2 主动脉弓缩窄术（AB）

AB术心肌肥厚模型组：取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G（25.0-27.5g小鼠）或者27G（23.5-25.0g）注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。

假手术组（Sham）在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同AB术心肌肥厚模型组。

1.3 术后护理

手术中主动脉弓降支结扎后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

2. 取材

打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80℃冰箱保存后用于分子生物学检测。

3. RGS14在Sham组小鼠和心肌肥厚模型组小鼠心脏中的表达

分别选野生型小鼠Sham组和心肌肥厚模型组AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot），结合特异性识别RGS14蛋白及心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的抗体进行检测，测定其RGS14的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图2所示，心肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、β-MHC的表达明显上调，RGS14的表达在AB术后明显下调。表明发生心肌肥厚的心脏RGS14的表达下调。

实施例3 心肌肥厚模型小鼠心肌肥厚及纤维化检测和心功能检测

1. 采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g的野生型小鼠（RGS14+/+）、RGS14基因敲除小鼠（RGS14-/-）、心脏特异性RGS14转基因小鼠（RGS14-TG）及非转基因小鼠（NTG）各分成假手术组（Sham）和AB术心肌肥厚模型组，即RGS14+/+ Sham组、RGS14+/+ AB组，RGS14-/- Sham组、RGS14-/- AB组，RGS14-TG Sham组、RGS14-TG AB组，NTG Sham组、NTG AB组，每组10只小鼠。造模方法同实施例2。AB术后8周分别进行心肌肥厚及纤维化的检测和心功能的检测。

2. 取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满质量分数10% KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL）。

3. 病理学检测

3.1 制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

3.2苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

3.3麦胚凝集素（WGA）染色

主要步骤：将经60℃烘烤30min的石蜡标本切片置于二甲苯 5min×3次→100%乙醇 5min×2次→95%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水漂洗5min×2次→PBS漂洗5min→PBS漂洗10min→弃去 PBS，滴加胰酶工作液（DIG-3008，福州迈新）37℃避光孵育20min→PBS漂洗5min×3次→取出切片，用滤纸擦干组织周围的液体（组织切勿干燥），用组化笔划圈平放于湿盒中→滴加 WGA-Alexa Flour 488工作液（10μg/mL）37℃避光孵育2h→弃去染液，PBS漂洗5min×3次→SlowFade Gold antifade reagent with DAPI 封片→荧光镜下观察，显微镜拍照。

3.4天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计（Image-Pro Plus 6.0软件）：胶原比例=胶原面积/（总面积-空白面积）×100%。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

RGS14+/+和RGS14-/-小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果见图3-5。Sham（假手术）组中RGS14+/+小鼠和RGS14-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；RGS14+/+小鼠AB术后8周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后8周，RGS14-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较RGS14+/+小鼠升高（图3）。HE染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏增大，RGS14-/-小鼠的心脏明显大于RGS14+/+组小鼠；WGA染色显示：AB术后8周，RGS14+/+组与RGS14-/-组相比较，心肌细胞排列整齐，细胞及细胞核形态规整，心肌细胞面积显著减小（p<0.05）（图4）。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；RGS14-/-小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比RGS14+/+小鼠AB术后增加明显（图5）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，RGS14-/-小鼠的心肌肥厚及纤维化程度大于RGS14+/+小鼠。

图7-9是NTG和RGS14-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果。TG小鼠AB术后8周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后8周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显低于NTG小鼠（图7）。HE染色切片可观察到：TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组；WGA染色显示：AB组与Sham组相比较，心肌细胞排列紊乱，细胞及细胞核形态不规整，心肌细胞面积显著增大（p<0.05），表明造模成功；AB术后8周，TG组与NTG组相比较，心肌细胞排列整齐，细胞及细胞核形态规整，心肌细胞面积显著减小（p<0.05），表明RGS14能显著抑制由 AB术诱导的心肌肥厚（图8）。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量少于NTG小鼠AB组（图9）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，RGS14-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。

4. 超声检测心功能

4.1 前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

4.2 心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂（天津成信公司）。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径（LVDd）、左室收缩末期内径（LVDs）及短轴缩短率（FS）。

图6是RGS14+/+和RGS14-/-小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的心功能检测结果。与RGS14+/+ Sham组相比，RGS14+/+小鼠AB术后8周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVDd、LVDs均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后8周，RGS14-/-小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度大于RGS14+/+小鼠。

图10是NTG和RGS14-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的心功能检测结果。与NTG Sham组相比，NTG小鼠AB术后8周表现出心功能减弱和心肌肥厚。AB术后8周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则小于NTG组。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，RGS14基因缺陷显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，RGS14基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此RGS14基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是RGS14基因具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.G蛋白信号转导调节蛋白14在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括G蛋白信号转导调节蛋白14作为抗心脏纤维化的药物的有效成分。

3.G蛋白信号转导调节蛋白14在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：包括G蛋白信号转导调节蛋白14作为预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分。