CN105194652B - A20结合的核因子抑制蛋白3（abin3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种A20结合的核因子抑制蛋白3（ABIN3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了ABIN3的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明抑制ABIN3表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进ABIN3过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此，ABIN3可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

Description

A20结合的核因子抑制蛋白3（ABIN3）在治疗心肌肥厚中的功 能及应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种A20结合的核因子抑制蛋白3（A20-Binding Inhibitors of NF-κB 3，ABIN-3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用。

背景技术

心肌肥厚是心肌细胞应对神经体液因子刺激及机械应力负荷改变所做出的适应性代偿反应，是一个复杂的而且合并众多因素参与调节的动态过程，同时也是高血压病、瓣膜病、心肌梗死、心肌病等大多数心血管疾病发生发展中所需要共同经历的病理过程[1]。心肌肥厚是心脏对血流动力学负荷、血管紧张素、生长因子以及激素等多种心血管刺激因素所做出的适应性代偿反应，能够使心室壁压力降低，维持甚至能够提高心脏排血量；然而长期的应激将会导致持续性病理性心肌肥大，并伴随有心脏形态和功能上的恶化，表现出炎症、纤维化及异常基因表达等变化。持续的心肌肥厚能导致扩张性心肌病、心力衰竭甚至猝死，因此心肌肥厚明显增加了心力衰竭的发病率和病死率，已经成为了心力衰竭等心血管疾病的独立危险因素及不良预后的信号[2]。近几十年来，随着我国人民生活水平的提高，饮食习惯随之改变，高血压、冠心病等常见心血管疾病的发病率的不断提高，心肌肥厚继而导致的室性心律失常、心源性猝死、心肌缺血及心力衰竭等心血管事件的发生率正在逐年上升，较之前提高了6~10倍[3-5]。近年来，全世界众多学者对心肌肥厚的发生发展机制开展了大量研究，发现了一些参与心肌肥厚病理生理过程的关键基因及重要信号传导通路，并且对其中的可干预因素进行了深入研究 [6-8]。然而，心肌肥厚的发生发展机制至今仍未完全明确，现有的研究及发现在临床实践中仍具有一定的局限性，尚不能形成真正有效的针对心肌肥厚的防治措施。因此，发现参与心肌肥厚的特异性分子及信号传导通路，对进一步系统阐明心肌肥厚发生发展机制，从细胞分子水平对心肌肥厚进行调控，探索新的防治心肌肥厚的治疗靶点，具有非常重要的理论和实践意义。

A20结合的核因子抑制蛋白3（A20-Binding Inhibitors of NF-κB 3，ABIN-3）最初发现于感染了李斯特杆菌的人单个核细胞中，其编码基因位于人染色体4q27，是ABIN家族的三个成员（ABIN-1、ABIN-2和ABIN-3）之一。ABIN-3含有AHD1、AHD2、AHD3和AHD-4等4个结构域，但其功能尚不清楚。尽管在结构上与ABIN家族的另外两个成员ABIN-1和ABIN-2相似，但到目前为止尚不清楚ABIN-3在细胞生命活动及疾病中究竟具有何种作用。

参考文献：

1. Heineke J, Molkentin JD. Regulation of cardiac hypertrophy byintracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7(8):589-600.

2. Hill JA, Olson EN. Cardiac Plasticity. N Engl J Med.2008;358(13):1370-80.

3. Zile MR, Gottdiener JS, Hetzel SJ, McMurray JJ, Komajda M,McKelvie R, Baicu CF, Massie BM, Carson PE. Prevalence and significance ofalterations in cardiac structure and function in patients with heart failureand a preserved ejection fraction. Circulation. 2011;124(23):2491-501.

4. Mudd JO, Kass DA. Tackling heart failure in the twenty-firstcentury.Nature. 2008;451(7181):919-928.

5. van Berlo JH, Maillet M, Molkentin JD.Signaling effectorsunderlying pathologic growth and remodeling of the heart. J Clin Invest.2013;123(1):37-45.

6. Maillet M, van Berlo JH, Molkentin JD.Molecular basis ofphysiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nat Rev MolCell Biol. 2013;14(1):38-48.

7. Shah AM, Mann DL.In search of new therapeutic targets andstrategies for heart failure: recent advances in basic science. Lancet. 2011;378(9792):704-12.

8. Song K, Nam YJ, Luo X, Qi X, Tan W, Huang GN, Acharya A, Smith CL,Tallquist MD, Neilson EG, Hill JA, Bassel-Duby R, Olson EN.Heart repair byreprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 2012;485(7400):599-604。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定ABIN3的表达和心肌肥厚的相互关系，提供一种ABIN3在制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物中的新应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过试验确定了ABIN3表达与心肌肥厚之间的关系：

1、ABIN3基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能

本发明选用野生型小鼠、ABIN3基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组（sham）和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术（AB），假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ABIN3基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除ABIN3基因所致的ABIN3缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能（图1、图2、图3、图4）。

2、ABIN3基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能

本发明选用心脏特异性ABIN3转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ABIN3基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达ABIN3基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能（图5、图6、图7、图8）。

由以上结果可知在发生心肌肥厚的模型中，抑制ABIN3表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进ABIN3过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此ABIN3具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ABIN3具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

一种ABIN3在心肌肥厚中的功能，主要体现在ABIN3具有保护心功能和抑制心肌肥厚的作用，特别是ABIN3具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚发生的作用。

针对ABIN3的上述功能，提供一种ABIN3的应用，主要体现为ABIN3在保护心脏、抗心脏纤维化和治疗心肌肥厚中的应用，特别是ABIN3在筛选或制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。所述的应用包括ABIN3直接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的有效成分，能够促进ABIN3表达的化学物质间接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的有效成分。

一种保护心脏功能的药物，包含ABIN3。

一种抗心脏纤维化的药物，包含ABIN3。

一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含 ABIN3。

本发明具有如下有益效果：

本发明发现了ABIN3基因的新功能，即ABIN3基因具有能够保护心脏功能、抗心脏纤维化和抑制心肌肥厚的作用。因此，ABIN3可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

附图说明

图1是野生型小鼠（WT）和ABIN3基因敲除小鼠（ABIN3-KO）采用主动脉弓缩窄术（AB）建立心肌肥厚模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；其中，HW为心脏质量，BW为体重，LW为肺脏总量，TL为胫骨长度（*：p＜0.05 vs野生型Sham组，#：p＜0.05 vs野生型AB组）。

图2是野生型小鼠（WT）和ABIN3基因敲除小鼠（ABIN3-KO）AB手术4周后心室横截面以及心脏组织HE染色、WGA染色和心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05 vs野生型Sham组，# p＜0.05 vs野生型AB组）。

图3是野生型小鼠（WT）和ABIN3基因敲除小鼠（ABIN3-KO）AB手术4周后心脏组织天狼星红染色图。

图4是野生型小鼠（WT）和ABIN3基因敲除小鼠（ABIN3-KO）AB手术4周后心功能检测结果的统计柱状图；FS为短轴缩短率，EF为射血分数，LVEDd为左室舒张末期内径（*：p＜0.05 vs野生型Sham组，#：p＜0.05 vs野生型AB组）。

图5是NTG和TG小鼠AB手术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；其中，HW为心脏质量，BW为体重，LW为肺脏总量，TL为胫骨长度（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组）。

图6是NTG和TG小鼠AB手术4周后心室横截面以及心脏组织HE染色、WGA染色和心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTG AB组）。

图7是NTG和TG小鼠AB手术4周后心脏组织天狼星红染色图。

图8是NTG和TG小鼠AB手术4周后心功能检测结果的统计柱状图；FS为短轴缩短率，EF为射血分数，LVEDd为左室舒张末期内径（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTGAB组）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的野生型小鼠（WT）、全身性ABIN3基因敲除小鼠（ABIN3-KO）、心脏特异性ABIN3转基因小鼠（TG）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

（1）全身性ABIN3基因敲除小鼠的构建：

利用CRISPR-Cas9技术构建全身性ABIN3基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）预测小鼠ABIN3的引导序列，设计2条单链oligo：

oligo1：TAGGTCCCATTGTTGATTGACATCC，

oligo2：AAACGGATGTCAATCAACAATGGGA。

oligo1和oligo2退火形成双链DNA，将双链DNA连入经BsaI酶切的pUC57-sgRNA（Addgene 51132）构建sgRNA表达载体。

以上述构建的sgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段：

Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG，

Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。

以所扩增的PCR产物为模板使用MEGAshortscript Kit（Ambion，AM1354）进行体外转录；Cas9质粒（Addgene 44758）通过T7 Ultra kit（Ambion，Am1345）进行转录。将转录得到的Cas9和引导序列RNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit（Qiaen，217084）纯化后，通过FemtoJet 5247显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内。选取经显微注射后存活的受精卵，将其移植到健康雌鼠输卵管中，经过21天妊娠之后得到F0代小鼠。

F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定，野生型小鼠包含一段长192bp的DNA序列，而突变小鼠（ABIN3基因敲除小鼠）含有154bp的DNA序列，最终蛋白产物通过western blot进行检测鉴定。其中，PCR鉴定引物如下：

ABIN3-F：5’-AGCTGCCTTTATCTACGGCT-3’，

ABIN3-R：5’-TTCATATTTCGGAATTGCTGGT-3’。

实验所用小鼠为突变体纯合子。

（2）心脏特异性ABIN33转基因小鼠的构建：

以小鼠ABIN3基因cDNA（Open Biosystems，MMM1013-211693062）为模板，用如下引物PCR扩增小鼠ABIN3全长基因（NCBI，ABIN3 mus，GENE ID：414084）：

上游引物：TGCTCTAGAGCCACCATGTCTGGACTGAGTGCG，

下游引物：TGCTCTAGACTACAGGTCGGTTTTCCT。

扩增的ABIN3全长基因及pCAG-loxP-CAT-loxP质粒（pCAG-loxP-CAT-loxP质粒由北京协和医学院基础学院杨青林老师提供，制备过程参见文献：Kim T, Zhelyabovska O,Liu J, et al. Generation of an Inducible, Cardiomyocyte-Specific TransgenicMouse Model with PPAR b/d Overexpression[J]. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs), 57.）经XbaI（NEB，# R0145L）酶切并连接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-ABIN3-hGHpA载体（CAG(chicken beta-actin)-CAT(chloramphenicolacetyltransferase)-ABIN3-hGHpA），将构建的质粒通过显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内，该受精卵移植入健康雌鼠中，发育得到F0代小鼠。将得到的F0代小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交，并通过他莫昔芬诱导（他莫昔芬80mg/kg/天，腹腔注射，连续刺激5天）得到心脏特异性ABIN3转基因老鼠（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role ofinterferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiachypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.）。

饲养环境：SPF级实验动物中心，SPF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1 小鼠心肌肥厚模型的建立

采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型，模型操作流程如下：

1.1 动物选择

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g的野生型小鼠（WT）、ABIN3基因敲除（ABIN3-KO）小鼠、心脏特异性ABIN3转基因小鼠（ABIN3-TG）及非转基因小鼠（NTG）各分成假手术组（sham）和AB术心肌肥厚模型组，即WT sham组、WT AB组，ABIN3-KO sham组、ABIN3-KO AB组，ABIN3-TG sham组、ABIN3-TG AB组，NTG sham组、NTG AB组，每组10只小鼠。

1.2 术前准备

（1）麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准（一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间）。

（2）术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

（3）气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上（加热垫需提前预热），然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

1.3主动脉弓缩窄术（AB）

AB术心肌肥厚模型组：取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G（25.0-27.5g小鼠）或者27G（23.5-25.0g）注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。

假手术组（Sham）在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同AB术心肌肥厚模型组。

1.4 术后护理

手术中主动脉弓降支结扎后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。术后4周分别进行各项指标（心肌肥厚及纤维化，心功能）的检测。

实施例2 心肌肥厚模型小鼠心肌肥厚及纤维化检测

1. 取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满质量分数10% KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL）。

2. 病理学检测

2.1 制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2 苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。

2.3 麦胚凝聚素（WGA）染色

主要步骤：将经60℃烘烤30min的石蜡标本切片置于二甲苯 5min×3次→100%乙醇 5min×2次→95%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水漂洗5min×2次→PBS漂洗5min→PBS漂洗10min→弃去 PBS，滴加胰酶工作液（DIG-3008，福州迈新）37℃避光孵育20min→PBS漂洗5min×3次→取出切片，用滤纸擦干组织周围的液体（组织切勿干燥），用组化笔划圈平放于湿盒中→滴加 WGA-Alexa Flour 488工作液（10μg/mL）37℃避光孵育2h→弃去染液，PBS漂洗5min×3次→SlowFade Gold antifade reagent with DAPI 封片→荧光镜下观察，显微镜拍照。

2.4 天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计（Image-Pro Plus 6.0软件）：胶原比例=胶原面积/（总面积-空白面积）×100%。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

WT及ABIN3-KO小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果见图1-3。Sham（假手术）组中WT及ABIN3-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，ABIN3-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠上升（图1）。HE及WGA染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，ABIN3-KO小鼠的心脏明显大于WT组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，ABIN3-KO组则比WT组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图2）。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；ABIN3-KO小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB术后增加较多（图3）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ABIN3-KO小鼠的心肌肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。

图5-7是NTG和ABIN3-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果。同样NTG小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图5）。HE及WGA染色切片可观察到：AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠；TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组（图6）。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量小于NTG小鼠AB组（图7）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ABIN3-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。

实施例3 心肌肥厚模型小鼠心功能检测

超声检测心功能

1. 前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

2. 心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂（天津成信公司）。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径（LVEDd）、射血分数（EF）及短轴缩短率（FS）。

图4是WT和ABIN3-KO小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后心功能的超声检测结果。与WT Sham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd增加，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，ABIN3-KO小鼠的心功能恶化程度大于WT小鼠。

图8是NTG和ABIN3-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后心功能的超声检测结果。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则小于NTG组。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，ABIN3基因缺陷显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ABIN3基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此ABIN3基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ABIN3基因具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.A20结合的核因子抑制蛋白3在筛选抗心脏纤维化的药物中的应用，其特征在于：所述的应用为非疾病的诊断和治疗的目的。

2.A20结合的核因子抑制蛋白3在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括A20结合的核因子抑制蛋白3作为抗心脏纤维化的药物的有效成分。

4.A20结合的核因子抑制蛋白3在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用，其特征在于：所述的应用为非疾病的诊断和治疗的目的。

5.A20结合的核因子抑制蛋白3在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括A20结合的核因子抑制蛋白3作为预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分。