CN104117058B - 激活素受体样激酶7（alk7）在治疗心肌肥厚中的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了激活素受体样激酶7（ALK7）在治疗心肌肥厚疾病中的功能及应用。本发明确定了ALK7基因与心肌肥厚之间的关系：心肌肥厚发生时，ALK7的表达明显下调；ALK7的干扰和过表达腺病毒分别促进和抑制心肌细胞肥大；ALK7基因敲除显著上调MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路的激活，促进心肌肥厚、纤维化，恶化心功能；ALK7基因过表达显著下调MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路的激活，抑制心肌肥厚、纤维化，改善心功能。因此，ALK7基因可作为基因治疗中的靶基因，制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了新途径。

Description

激活素受体样激酶7（ALK7）在治疗心肌肥厚中的功能及应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种激活素受体样激酶7（ALK7）在治疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。

背景技术

据世界卫生组织报告，心血管疾病已成为威胁人类生命健康的全球性慢性非传染性疾病之一。多种心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化、心脏瓣膜病、心肌病等随之进展为心力衰竭，是大多数病患住院和死亡的首要原因。心肌肥厚是指心脏在遗传、环境、多种生理及病理因素的作用下，为了适应心脏做功增加而出现的心脏重量和体积增加，主要以心肌细胞体积增大和细胞外基质增多为特征，被认为是单个心肌细胞增大所致的形态学改变而不是心肌细胞数量的增长。研究表明，心肌肥厚是冠心病、高血压、心律失常、心脏瓣膜病及心肌病等多种心血管疾病的共同病理生理过程，是多种心血管并发症的独立危险因素。心肌肥厚作为心脏应对负荷增加的一种适应性反应，在心肌肥厚发生的早期发挥了有益的代偿效应，但持续的心肌肥厚是有害的，会引起扩张性心肌病，并可能导致突然死亡；随着心脏功能的进一步恶化，会转变成心力衰竭。抑制心肌肥厚，对防止心力衰竭的发生、改善心脏功能具有重要作用。

心肌肥厚是心室肥大刺激诱导核内基因异常表达的结果，细胞内信号转导是心室肥大刺激与核内基因转录活化的重要环节。不同刺激诱导的心肌肥厚可能具有不同的分子机制。目前研究的主要分子机制有：1.Ca²⁺及其依赖的信号途径；2.丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径；3.JAK-STAT信号通路；4.蛋白激酶C（PKC）信号通路；5.磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信号通路；6.炎症、NF-κB信号通路等。MAPK是真核细胞中的一个重要信号系统，G蛋白耦联受体、酪氨酸激酶受体或离子通道耦联受体均可经过不同的中间环节引起MAPK的激活，激活的MAPK通过调节核内转录因子，致细胞增殖和生长反应信号转导通路。MAPK可分为4个亚族：细胞外信号调节激酶（ERK）、p38激酶、应急激活蛋白激酶（JNK）和ERK5。哺乳动物中，ERK广泛存在于各种组织，参与细胞的增殖、分化，调控多种生长因子受体、营养相关因子受体等。心血管疾病发病率和病死率在全世界范围内持续升高，尽管在治疗方法上有了进步，但是目前依然没有有效方法减少心血管事件的发生。因此寻找抑制心肌肥厚的特异性分子，对于进一步阐述心肌肥厚的发生发展机制，具有重大的理论意义，可为临床防治心肌肥厚提供新靶点和新策略。

激活素受体样激酶7（activinreceptor-likekinase7，ALK7）是Ⅰ型转化生长因子β（TGF-β）受体，TGF-β是目前公认的、导致多器官及组织纤维化的关键细胞因子，在调节细胞增殖、谱系分化、迁移、黏附和凋亡过程中具有重要作用，在维持代谢平衡中也发挥重要的作用。在哺乳动物中发现有7种TGF-βⅠ型受体亚型（即ALK1至ALK7），TGF-β通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体激活Smad蛋白发挥作用。Smad蛋白是TGF-β的下游信号分子之一，介导TGF-β的细胞内信号转导。研究表明，在心肌细胞受到TGF-β刺激发生肥大的过程中，信号蛋白Smad2、Smad3表达的变化与心肌细胞肥大的发生有着明显的一致性【1】，GDF1通过调控MEK-ERK1/2和Smad信号通路，在心脏重构中发挥重要作用【2】。目前有研究表明ALK7与代谢综合征及其引起的心血管重构显著相关【3】；ALK7可通过激活Smad2/3从而调控高糖诱导的H9C2心肌祖细胞的凋亡【4】；ALK7可激活Smad2/3/4从而抑制脂肪生成；ALK7的失活会激活PPARγ，从而下调炎症脂肪细胞因子，上调脂联素，而激活的PPARγ可刺激分化的脂肪细胞中甘油三酯的合成和分解从而促进脂质的转换和重构【5】。因此推测ALK7在心肌肥厚中发挥着重要的作用。

【参考文献】

1、国辉，黄俊，马业新．TGF-β及其信号蛋白Smad2，3在大鼠心肌细胞肥大中的作用．现代医学，2003，31：301-303．

2、ZhangY,ZhangXF,GaoL,etal.Growth/differentiationfactor1alleviatespressureoverload-inducedcardiachypertrophyanddysfunction.BiochimBiophysActa.2014;1842(2):232-44.

3、ZhangW,etal.ALK7genepolymorphismisassociatedwithmetabolicsyndromeriskandcardiovascularremodeling.ArqBrasCardiol.2013;101(2):134-40.

4、LiuL,etal.Activinreceptor-likekinase7mediateshighglucose-inducedH9c2cardiomyoblastapoptosisthroughactivationofSmad2/3.IntJBiochemCellBiol.2013Sep;45(9):2027-35.

5、YogosawaS,etal.Rolesofactivinreceptor-likekinase7signalinganditstarget,peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,inleanandobeseadipocytes.Adipocyte.2013;2(4):246-50。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定ALK7的表达和心肌肥厚的相互关系，提供一种ALK7在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物中的应用，提供一个用于保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的靶基因ALK7的新用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明首先通过试验确定ALK7表达与心肌肥厚之间的关系：

1、在发生心肌肥厚的情况下，ALK7的表达明显下调

本发明选用正常人和肥厚性心肌病患者以及正常小鼠和发生心肌肥厚小鼠的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别ALK7蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的抗体进行检测，测定其ALK7的表达。结果表明，在人和小鼠发生肥厚的心脏中，心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，ALK7的表达明显下调（图1、图2）。

2、ALK7的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大；ALK7的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大

本发明通过在体外分离、培养了SD乳鼠心肌细胞，构建ALK7干扰（AdshALK7）及过表达（Ad-ALK7）腺病毒，并通过结合AngⅡ刺激模拟心肌细胞肥大模型，研究ALK7在心肌细胞中的表达特征。通过在荧光显微镜下观察到AngⅡ刺激后心肌细胞明显大于PBS组，AngⅡ刺激后ALK7干扰腺病毒的心肌细胞肥大更显著，而ALK7过表达腺病毒的心肌细胞肥大则显著减小（图3）。

3、ALK7基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能；ALK7基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能

本发明选用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心脏特异性ALK7转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ALK7基因敲除/过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除ALK7基因所致的ALK7缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能；过表达ALK7基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能（图4-11）。

4、ALK7基因敲除促进MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路；ALK7基因过表达抑制MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路

本发明用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心脏特异性ALK7转基因小鼠和非转基因小鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结果显示敲除ALK7基因所致的ALK7缺陷显著促进MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路，ALK7基因过表达抑制MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路，而JUK1/2、P38则无显著变化（图12-15）。

由以上结果可知发生心肌肥厚时，ALK7表达会下调，ALK7基因缺陷促进MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路，显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ALK7基因过表达抑制MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信号通路，显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此ALK7基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ALK7基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

一种ALK7在心肌肥厚中的功能，主要体现在ALK7基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚的作用，特别是ALK7基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚发生的作用。

针对ALK7的上述功能，提供一种ALK7的应用，主要体现为ALK7在保护心脏和治疗心肌肥厚中的应用，特别是ALK7在制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。

一种保护心脏功能的药物，包含ALK7。

一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含ALK7。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明发现了ALK7基因的新功能，即ALK7基因具有能够保护心脏功能和抑制心肌肥厚的作用。

（2）基于ALK7在保护心脏功能和抑制心肌肥厚疾病中的作用，其可以用于制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物。

附图说明

图1是正常人和肥厚性心肌病患者心脏中ANP、Myh7、ALK7的表达，说明发生心肌肥厚的心脏ALK7的表达下调（*：p＜0.05vs正常人组）。

图2是小鼠在假手术（Sham）和主动脉弓缩窄手术（AB）后心脏中ANP、Myh7、ALK7的表达，说明发生心肌肥厚的心脏ALK7的表达下调；其中4W表示4周，8W表示8周（*：p＜0.05vs野生型小鼠Sham组）。

图3是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshALK7、Ad-GFP和Ad-ALK7感染，经AngⅡ刺激后的免疫荧光图，结果表明ALK7的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，ALK7的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大（*：p＜0.05vsPBS组，#：p＜0.05vsAngⅡ组）。

图4是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图5是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠AB模型4周后心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#p＜0.05vs野生型AB组）。

图6是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图7是NTG和TG小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图8是NTG和TG小鼠AB模型4周后心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图9是NTG和TG小鼠AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图10是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠AB模型4周后心功能检测结果。A是超声检测心功能结果统计柱状图；B是血流动力学检测心功能结果统计柱状图，其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率、EF为射血分数、dP/dtmax为左室内压最大上升速率及dP/dtmin为左室内压最小上升速率（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图11是NTG和TG小鼠AB模型4周后心功能检测结果。A是超声检测心功能结果统计柱状图；B是血流动力学检测心功能结果统计柱状图，其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率、EF为射血分数、dP/dtmax为左室内压最大上升速率及dP/dtmin为左室内压最小上升速率（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图12是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠Sham及AB模型4周时MEK1/2/ERK1/2信号通路蛋白Westernblot检测图，结果显示ALK7敲除会促进MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活水平，而对JNK1/2和P38的激活则无影响；其中“p-”代表磷酸化的激酶（MEK1/2，ERK1/2、JNK1/2和P38），“T-”代表总的（磷酸化的和未磷酸化的）激酶（MEK1/2，ERK1/2、JNK1/2和P38），GAPDH用作内参（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图13是NTG和TG小鼠Sham及AB模型4周时MEK1/2/ERK1/2信号通路蛋白Westernblot检测图，结果显示ALK7过表达会抑制MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活水平，而对JNK1/2和P38的激活则无影响；其中“p-”代表磷酸化的激酶（MEK1/2，ERK1/2、JNK1/2和P38），“T-”代表总的（磷酸化的和未磷酸化的）激酶（MEK1/2，ERK1/2、JNK1/2和P38），GAPDH用作内参（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图14是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠Sham及AB模型4周时Smad2/Smad3信号通路蛋白Westernblot检测图，结果显示ALK7敲除会促进Smad2和Smad3的磷酸化激活水平；其中“p-”代表磷酸化的激酶（Smad2和Smad3），“T-”代表总的（磷酸化的和未磷酸化的）激酶（Smad2和Smad3），GAPDH用作内参（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图15是NTG和TG小鼠Sham及AB模型4周时Smad2/Smad3信号通路蛋白Westernblot检测图，结果显示ALK7过表达会抑制Smad2和Smad3的磷酸化激活水平；其中“p-”代表磷酸化的激酶（Smad2和Smad3），“T-”代表总的（磷酸化的和未磷酸化的）激酶（Smad2和Smad3），GAPDH用作内参（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的心脏特异性Cre小鼠（α-MHC-Cre（命名ALK7+/+）作为对照野生型小鼠，背景为C57BL/6，购自JacksonLaboratory，货号005650）、ALK7基因敲除小鼠（ALK7-/-，购自EuropeanMouseMutantArchive（EMMA），货号：EMMA02574）、心脏特异性ALK7转基因小鼠（TG，心脏特异性ALK7转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教授实验室构建）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

心脏特异性ALK7转基因小鼠的构建：

用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGCTAACCAACGGGAAAGA；下游引物：GCCAAGCTTTACAGTCTTCCTTGA）扩增小鼠ALK7全长基因（NCBI，GeneID：269275，XM_006498086.1），把扩增的ALK7全长基因连接于心肌肌球蛋白重链（α-MHC）启动子下游，将构建的序列通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景），得到心脏特异性ALK7转基因老鼠。（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：JiangDS,BianZY,ZhangY,ZhangSM,LiuY,ZhangRetal.Roleofinterferonregulatoryfactor4intheregulationofpathologicalcardiachypertrophy.Hypertension2013;61:1193-1202.）。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SRF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1ALK7在正常人和肥厚性心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏（非心脏原因的死亡捐献的个体）和肥厚性心肌病患者心脏（做心脏移植手术病人置换的受体），对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别ALK7（Abgent，AP7102b）蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP（Millipore，AB2232）、Myh7（santacruz，sc53090）的抗体进行检测，测定其ALK7的表达，GAPDH（CellSignalingTechnology，2118）做内参。检测结果如图1所示，与正常人心脏相比，肥厚性心肌病患者心脏心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，ALK7的表达明显下调。

实施例2ALK7在野生型小鼠Sham组和AB手术4W、8W心脏中的表达

1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程：

1.1术前准备

（1）麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准（一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间）。

（2）术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

（3）气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上（加热垫需提前预热），然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

1.2主动脉弓缩窄术

取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G（25.0-27.5g小鼠）或者27G（23.5-25.0g）注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组（Sham）在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚（AB）模型组。

1.3术后护理

主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

2.取材：打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80℃冰箱保存后用于分子生物学检测。

3.ALK7在Sham小鼠和AB小鼠心脏中的表达

分别选野生型Sham小鼠和AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别ALK7蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的抗体进行检测，测定其ALK7的表达，检测结果如图2所示，心肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、Myh7的表达明显上调，ALK7的表达在AB术后明显下调。

实施例3ALK7干扰（AdshALK7）及过表达（AdALK7）腺病毒对AngⅡ刺激的原代心肌细胞ALK7表达的影响

1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

（1）新生1天Sprague-Dawley乳鼠，颈部以下75%酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mLDMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

（2）用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm³的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

（3）加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

（4）将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

（5）将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu（终浓度0.1mM），混匀之后，加入到用0.1%明胶包被的器皿中。

（6）轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5%CO₂孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2.ALK7干扰（AdshALK7）及过表达（AdALK7）腺病毒对经AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA（含shRNA（沉默RNA）的腺病毒，用作对照，SABIOSCIENCES公司）、AdshALK7（含shRNA-ALK7（沉默RNA-ALK7融合蛋白）的腺病毒，购自SABIOSCIENCES公司，货号KR44935G）、AdGFP（含GFP（绿色荧光蛋白）的腺病毒，用作对照，购自VectorBiolabs公司，货号1060）及AdALK7（含GFP-ALK7（绿色荧光蛋白-ALK7融合蛋白）的腺病毒，购自VectorBiolabs公司，货号ADV-252020）腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）（购自Sigma公司，A9525）或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明AdshALK7感染后的心肌细胞表面面积较AdshRNA对照组增加，而AdALK7感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP减少（图3）。说明ALK7的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，ALK7的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大。

实施例4小鼠心肌肥厚（AB）模型心肌肥厚及纤维化检测

1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程：

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g的野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠、心脏特异性ALK7转基因小鼠及非转基因小鼠各分成假手术组和心肌肥厚模型组，每组10只小鼠。造模方法同实施例2。

2.取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满质量分数10%KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10%KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL）。

3.病理学检测

3.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

3.2苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚、核大致位于中央的细胞，用Image-ProPlus6.0软件圈细胞面积。

3.3天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计（Image-ProPlus6.0软件）：胶原比例=胶原面积/（总面积-空白面积）×100%。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

ALK7+/+和ALK7-/-小鼠AB模型后的表型结果见图4-6。Sham（假手术）组中ALK7+/+小鼠和ALK7-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；ALK7+/+小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，ALK7-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较ALK7+/+小鼠升高（图4）。HE染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，ALK7-/-小鼠的心脏明显大于ALK7+/+组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，ALK7-/-组则比ALK7+/+组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图5）。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；ALK7-/-小鼠AB术后胶原含量及血管周围胶原含量则比ALK7+/+小鼠AB术后增加更为显著（图6）。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ALK7-/-小鼠的心肌肥厚程度大于ALK7+/+小鼠。

图7-9是NTG和ALK7-TG小鼠AB模型后的表型结果。同样TG小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图7）。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠。HE染色切片可观察到：TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组（图8）。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均小于NTG小鼠AB组（图9）。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ALK7-TG小鼠的心肌肥厚程度小于NTG小鼠。

实施例5心肌肥厚（AB）模型小鼠心功能检测

1超声检测心功能

1.1前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

1.2心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂（天津成信公司）。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）及短轴缩短率（FS）。

2心脏导管超声（PV）检测血流动力学

2.1前期准备

（1）麻醉机准备：同超声检测心功能部分。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，颈部手术区剃毛，并用湿纱布擦拭去毛。将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷以维持麻醉深度，避免麻醉过深或过浅。

2.2PV检测

碘酒及75%酒精消毒后，剪开小鼠颈部皮肤，依次分离肌肉和软组织，并游离出右颈总动脉，于血管下穿过双线并结扎远心端，同时活结结扎近心端。用血管剪在远心端剪一切口（1/3-1/2管径），于体视显微镜下将Millar1.4F超微导管迅速插入右颈总动脉，同时穿一缝线将导管和血管结扎。打开近心端活结，将导管沿右颈总动脉-升主动脉插入左心室内，连接Powerlab生物信号采集处理系统。观察记录仪上波形情况，调节导管的位置使波形图清晰且稳定。监测射血分数（EF）、左室内压最大上升速率（dP/dtmax）及左室内压最小上升速率（dP/dtmin）等指标。

本实施例运用M型超声心动图和血流动力学检测评价心肌肥厚和心功能。图10是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠AB模型后心功能检测结果图。与ALK7+/+Sham组相比，ALK7+/+小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，ALK7-/-小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度比ALK7+/+小鼠明显（图10A）。通过血流动力学指标的检测，观察到AB术后4周ALK7+/+小鼠EF、dP/dtmax和dP/dtmin均比其Sham组降低，AB术后ALK7-/-小鼠与ALK7+/+小鼠AB相比EF、dP/dtmax和dP/dtmin显著降低（图10B）。这些结果均与ALK7-/-小鼠心肌肥厚更为显著的结果一致。

图11是NTG和ALK7-TG小鼠AB模型后的超声和PV检测结果。与NTGSham组相比，NTG小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则小于NTG组（图11A）。通过血流动力学指标的检测，观察到AB术后4周NTG小鼠EF、dP/dtmax和dP/dtmin均比其Sham组降低，TG小鼠AB术后EF、dP/dtmax和dP/dtmin降低的程度则小于NTG组，差异有统计学意义（图11B）。这些结果均与TG小鼠心肌肥厚被抑制的结果一致。

实施例6ALK7基因敲除促进MEK1/2/ERK1/2信号通路；ALK7基因过表达抑制MEK/ERK信号通路

用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心脏特异性ALK7转基因小鼠和非转基因小鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），检测MAPK信号通路蛋白的表达情况，GAPDH（CellSignalingTechnology，2118）作为内参。结果显示AB手术后MEK1/2/ERK1/2信号通路被激活，敲除ALK7基因后p-MEK1/2（CellSignalingTechnology，9154）、p-ERK1/2（CellSignalingTechnology，4370）的蛋白表达水平要高于其对照野生型小鼠组，而p-JNK1/2（CellSignalingTechnology，4668）、p-P38（CellSignalingTechnology，4511）则无显著差异，总的蛋白T-MEK1/2（CellSignalingTechnology，9122）、T-ERK1/2（CellSignalingTechnology，4695）、T-JNK1/2（CellSignalingTechnology，9258）、T-P38（CellSignalingTechnology，9212）在Sham及AB的各组小鼠见均无明显差异（图12）；ALK7基因过表达后p-MEK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达水平要低于其对照NTG小鼠，而p-JNK1/2、p-P38则无显著差异，总的蛋白T-MEK1/2、T-ERK1/2、T-JNK1/2、T-P38在Sham及AB的各组小鼠见均无明显差异（图13）。这表明在心肌肥厚模型中，ALK7基因介导的MAPK信号通路，主要是通过MEK1/2、ERK1/2发挥作用，而不是JNK1/2和P38。

实施例7ALK7基因敲除促进Smad2/Smad3信号通路；ALK7基因过表达抑制Smad2/Smad3信号通路

用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心脏特异性ALK7转基因小鼠和非转基因小鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），检测Smad2/Smad3信号通路蛋白的表达情况，GAPDH（CellSignalingTechnology，2118）作为内参。结果显示AB手术后Smad2/Smad3信号通路被激活，敲除ALK7基因后p-Smad2（CellSignalingTechnology，3108）、p-Smad3（CellSignalingTechnology，9520）的蛋白表达水平要高于其对照野生型小鼠组，总的蛋白T-Smad2（Bioworld，BS1425）、T-Smad3（Bioworld，BS3255）在Sham及AB的各组小鼠间均无明显差异（图14）；ALK7基因过表达后p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平要低于其对照NTG小鼠，总的蛋白T-Smad2、T-Smad3在Sham及AB的各组小鼠间均无明显差异（图15）。

由以上结果可知发生心肌肥厚时，ALK7表达会下调，ALK7基因缺陷显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ALK7基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此ALK7基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ALK7基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>武汉大学

<120>激活素受体样激酶7（ALK7）在治疗心肌肥厚中的功能及应用

<130>1

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>上游引物

<400>1

gttgtcgacgccaccatgctaaccaacgggaaaga35

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>下游引物

<400>2

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Claims (1)

1.ALK7在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。