CN1293709A - 介导异源三体g蛋白和单体g蛋白相互作用的因子的鉴定 - Google Patents

Abstract

单体GTP酶鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)已被鉴定,它也含有一个与GTP酶激活蛋白(GAP)类似的RGS区。这些GEF蛋白之一的Rho GEF已被证明含有对异源三体G蛋白的α亚单位具有GAP活性的RGS序列。

Description

介导异源三体G蛋白和单体G蛋白相互作用的因子的鉴定

发明背景

使胞外因子与Rho GTP酶的激活相联系的信号传导途径与细胞生长的控制和细胞骨架的重排有关。特异地，尽管介导的机制还不清楚，已表明异源三体G蛋白介导这些途径。鉴定与异源三体G蛋白和Rho GTP酶均相互作用的因子将为调查和控制各种细胞过程，包括细胞增生性疾病提供重要的工具。

发明概述

本发明涉及一种含有新的RGS结构域的氨基酸序列的多肽，以及相应的核酸，该结构域可以从如鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)蛋白中得到，其中多肽优选地不包括dbl同源(DH)结构域或普列克底物蛋白同源(PH)结构域。在一个优选实施方案中，该多肽具有GTP酶激活活性和对G蛋白亚单位(如Gα)的结合亲和性。

如下面所讨论的，该多肽和核酸可被用作研究、治疗和诊断的工具。

本发明还涉及鉴定或检测调节GEF蛋白的RGS结构域与底物如G蛋白亚单位(如Gα)结合的分子或分子混合物的方法。在一个实施例中，该方法包括在有效条件下，将具有GEF多肽的RGS结构域，或者任选地具有GEF活性的多肽，在存在和／或不存在供试分子时，与Gα亚单位或其片段进行温育；检测供试分子的存在是否调节多肽与亚单位或其片段的结合。如后面所讨论的，可以采用各种RGS-GEF多肽结合底物。

另外，本发明涉及鉴定或检测能够调节含有GEF蛋白RGS结构域的多肽对具有GTP酶活性的多肽的刺激作用的分子或分子混合物的方法。在一个优选实施例中，该方法包括在有效条件下，将Gα亚单位和GEF蛋白在存在和不存在供试分子时进行温育，并检测供试分子的存在是否调节GEF蛋白对Gα亚单位的GTP酶活性的刺激作用。

本发明还涉及鉴定或检测能够特异地调节第一种多肽，如被激活的Gα亚单位或具有GTP酶活性的多肽，对第二种多肽的核苷酸交换因子活性的刺激作用的分子的方法。第二种多肽优选地含有来自GEF的RGS-GEF结构域，更优选地是单体G蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。在该方法的一个实施例中，第一次检测是将被激活的Gα亚单位与GEF蛋白和单体G蛋白在存在和不存在供试分子的情况下温育；第二次检测将GEF蛋白和单体G蛋白在存在和不存在供试分子的情况下温育，比较两次检测，确定供试分子是否具有不同的作用。

本发明进一步涉及鉴定或检测能够模拟被激活的Gα亚单位对GEF介导的单体G蛋白的核苷酸交换的刺激作用的分子或分子混合物的方法。在一个实施例中，该方法包括鉴定对GEF蛋白的RGS结构域显示结合亲和性的供试化合物，将GEF蛋白和单体G蛋白在存在或不存在供试化合物的情况下温育，测定供试化合物是否表现出对GEF介导的单体G蛋白的核苷酸交换具有刺激作用。

本发明进一步涉及鉴定或检测能够模拟GEF多肽的RGS结构域对Gα亚单位的GTP酶活性的刺激作用的分子或分子混合物的方法。在一个实施例中，该方法包括鉴定对Gα亚单位显示结合亲和性的供试化合物，将GTP承载的Gα亚单位在存在或不存在供试化合物的情况下温育，以测定供试化合物是否表现出对GEF介导的单体G蛋白的核苷酸交换具有刺激作用。

附图简述

图1，A描述通过Clustal W进行的RGS蛋白的序列和p115 RhoGEF的N-端区的排列比较，使用RGS4的二级结构框架(mask)分配罚区间。进一步将Lsc、KIAA380和DrhoGEF2的RGS同源序列通过Clustal W和手工调整加入序列对比中。RGS4上面的(a)符号表示RGS4的RGS结构域的α螺旋。深色阴影框表示RGS结构疏水核心的保守残基。浅色阴影框表示其他保守残基。星号标出了与Gα_il接触的RGS4的残基。序列对比中采用的原始序列如下：大鼠RGS4(SwissProt登记号P49799)，小鼠RGS2(008849)，人GAIP(P49785)，大鼠RGS12(O08773)，人p115(1654344)，小鼠Lsc(1389756)，人KIAA380(2224701)和果蝇DrhoGEF2(2760368)。

图1，B描绘此处所述研究中采用的p115 Rho GEF构件。数字表示各个构件中p115的残基。图中指出了RGS、dbl(DH)和普列克底物蛋白(PH)同源区。GST=谷胱甘肽-S-转移酶。

图2，A表示在15℃、有(●○)或没有(■□)10nM p115 RhoGEF时与Gα₁₃和Gα₁₂结合的GTP的水解。

图2，B表示在4℃、存在不同浓度的p115 Rho GEF时与Gα₁₃(●)和Gα₁₂(○)结合的GTP的水解。将初始反应速率以p115 RhoGEF浓度的函数作图。

图3表示在15℃、在有全长的p115 Rho GEF(●)、Np115(■)、或RGS-p115(▲)，或者没有任何p115构件(_)时与Gα₁₃和Gα₁₂结合的GTP的水解。

图4表示用100nM p115 Rho GEF(△)、100nM RGS4(□)，或缓冲液对照(○)与Gα_il，Gα_z，Gα_q和Gα_s结合的GTP的水解。对Gα_il和Gα_s的检测在4℃下进行，Gα_z在15℃，而Gα_q在20℃。

图5表示被AlF4激活形式的Gα亚单位对p115 GAP活性的选择性抑制。A：在存在30μM AlCl₃，10mM NaF和10mM MgSO₄下将P115(400nM)与不同的Gα亚单位(400nM)冰上温浴15分钟。混合物稀释20倍，与0．3nM Gα₁₂(GTP)混合，15℃温育2分钟后测定结合GTP的水解。B：P115(400nM)与不同浓度的Gα₁₂(GDP-AIF4^-)(●)或Gα₁₃(GDP-AIF4^-)(■)按A中所述温育。混合物稀释20倍，在4℃下与1nM Gα₁₃(GTP)混合，测定经过一段时间后结合GTP的水解。将Gα₁₃的GTP酶的初始速率对α亚单位GDP-AIF4^-的终浓度作图。填充的三角形表示没有p115时Gα的GTP酶速率。

图6，A是表示利用抗-myc抗体检测myc-标记的p115 Rho GEF在COS细胞中表达的免疫印迹图象。

图6，B是表示利用抗-myc抗体检测p115 Rho GEF和Gα₁₃共免疫沉淀的免疫印迹图象。

图6，C是表示利用抗-Gα₁₃抗体检测p115 Rho GEF和Gα₁₃共免疫沉淀的免疫印迹图象。

图6，D是表示利用抗-Gα₁₃抗体，将纯化的Gα₁₃加入到共免疫沉淀的p115 Rho GEF中时，检测p115 Rho GEF和Gα₁₃结合的免疫印迹图象。

图7，A表示在存在或不存在100nM Gα₁₃或Gα₁₂时以及存在不同浓度的p115 Rho GEF时，10分钟后结合的GDP从100nM RhoA中的解离情况。

图7，B表示在存在25nM p115 Rho GEF和所示浓度的Gα₁₃或Gα₁₂时，10分钟后GDP从100nM RhoA中的解离情况。通过下部虚线表示未刺激的GDP从RhoA的解离。

图7，C表示如所述与经AMF、GTPγS或GDPβS处理过的p115 Rho GEF和Gα₁₃温育10分钟后GDP从100nM RhoA中的解离情况。

图7，D表示与p115 Rho GEF(25nM)和不同Gα亚单位(100nM)温育10分钟后GDP从100nM RhoA中的解离情况。

图8，A表示在所示浓度的截短的全长p115 Rho GEF存在时，1nM[³²P]GTP与100nM RhoA的结合情况，测定是30分钟后在30℃下通过过滤进行的。

图8，B表示存在或不存在25nM p115 Rho GEF、20nM Gα₁₃和300nM GST-RGSp115时，温育10分钟后[³H]-GDP从100nM RhoA中的解离情况。

图8，C表示存在25nM p115 Rho GEF、存在或不存在25nM Gα₁₃以及所示浓度的Gα₁₂时，温育10分钟后[³H]-GDP从100nM RhoA中的解离情况。

图9，A是表示利用抗-myc抗体检测myc-标记的KIAA380(命名为FL147)在COS细胞中表达的免疫印迹图象。

图9，B是表示利用抗-Gα₁₂抗体检测KIAA380(命名为L147)和Gα₁₂共免疫沉淀的免疫印迹图象。

图10是p115 Rho GEF的氨基酸序列的序列表。RGS结构域为45-170位氨基酸。

图11是p115 Rho GEF的核酸序列的序列表。RGS结构域由187-564位核苷酸编码。

图12是KIAA380的氨基酸序列的序列表。RGS结构域为310-432位氨基酸。

图13是KIAA380的核酸序列的序列表。RGS结构域由1673-2041位核苷酸编码。

图14是Lsc的氨基酸序列的序列表。RGS结构域为43-168位氨基酸。

图15是Lsc的核酸序列的序列表。RGS结构域由218-595位核苷酸编码。

图16是DRhoGEF2的氨基酸序列的序列表。RGS结构域为924-1053位氨基酸。

图17是DRhoGEF2的核酸序列的序列表。RGS结构域由3185-3574位核苷酸编码。

图18是几种蛋白质的RGS区的同源序列对比，这些蛋白质包括具有RGS结构域的GEF蛋白(例如p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF)。序列对比采用Clustal法进行，并利用PAM250残基权重表。

发明详述

G蛋白将信号从大量的细胞表面七螺旋受体传导至各种胞内效应物上。每个七螺旋G蛋白由一个鸟嘌呤核苷酸结合α亚单位和一个高亲和性的β和γ亚单位二聚体组成。根据其氨基酸序列的同源性和功能，Gα亚单位通常分为四个亚种(G_s，G_i，G_q和G₁₂)(A．G．Gilman，生物化学年度评述(Annu．Rev．Biochem．)，56，615(1987)；Y．Kaziro等人，生物化学年度评述，60，349(1991)；Hepler和Gilman，生化科学进展(Trends Biochem．Sci．)，17，383(1992))。G₁₂亚种含有两个已被鉴定的成员，G₁₂和G₁₃。

根据本发明，描述了既对异源三体G蛋白的α亚单位具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性，又对单体G蛋白具有鸟嘌呤核苷酸交换因子活性的蛋白质的鉴定。还根据本发明，描述了对G蛋白的G₁₂亚种具有GAP活性的蛋白质的首次鉴定。还根据本发明，描述了异源三体G蛋白的α亚单位刺激由GEF介导的单体G蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换活性的能力。GAP和GEF活性，以及其筛选方法在文献Berman等人，1996，细胞(Cell)和Hart等人，1996，生物化学杂志(J．Biol．Chem．)271：25452中有描述。

根据本发明，GEF蛋白的GAP活性与从GEF蛋白获得的新的RGS结构域有关。本发明涉及这样一个RGS结构域的所有方面，包括Rho GEF如p115 Rho-GEF的所有方面(美国专利08／943，768，在此引入作为参考)。

通过调节GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换活性，GEF蛋白在体外和体内都能调节细胞信号传导途径。根据本发明，描述了还调节异源三体Gα亚单位的GTP酶活性的GEF蛋白。通过阐述的方法，对调节Rho GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换活性以及异源三体G蛋白的Gα亚种的GTP酶活性之p115 Rho-GEF进行了描述。

本发明尤其涉及含有GEF多肽的RGS结构域或其片段的多肽，以及相应的核酸。

本发明还涉及利用这些多肽、核酸，或其衍生物的方法，例如用于治疗、诊断和作为研究工具。本发明的其他方面涉及识别GEF多肽的RGS结构域或核酸的抗体和其他配体，鉴定或检测含有RGS结构域的蛋白质的GEF活性和／或GAP活性调节物(modulator)的方法，以及处理涉及RGS结构域或与其有关的病理条件的方法，例如由GEF介导的Gα亚单位和Rho GTP酶的相互作用。

如此处所用的，“RGS-GEF多肽”是指，例如，含有衍生自GEF蛋白的RGS结构域的多肽，例如p115 Rho-GEF，Lsc，KIAA0380，或DRhoGEF2，并且该多肽具有一种或多种下列活性：对多肽底物(如G蛋白亚单位)，优选地是α亚单位(如G₁₂或G₁₃)的特异结合亲和性；GTP酶激活活性(GAP)，例如对G蛋白α亚单位的GAP活性；或者免疫原性活性。RGS-GEF多肽优选地不含有(dbl同源的)DH或(普列克底物蛋白同源的)PH结构域。DH和PH结构域在Cerione和Zheng，1996，细胞生物学现代观点(Curr．Opin．In CellBiol．)，8：216中被公开。例如，p115 Rho-GEF的氨基酸序列(图10)在47-170位氨基酸处含有新的RGS结构域，在420-637位氨基酸处有DH结构域，并在646-672位氨基酸处有PH结构域。“衍生的”是指氨基酸序列来自天然形成的GEF(例如p115 Rho-GEF，Lsc，KIAA0380，和DRhoGEF2)或者是根据天然形成的GEF而“突变的”、非天然形成的序列(即在特定的位点将天然形成的序列中的氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基)。多肽可以是“被分离的”，就是说该材料的形式不同于其所在的原始环境中，例如，更加浓缩的，更加纯化的，或是从其他组分中分离的，等等。优选的RGS多肽既具有GAP活性又具有GEF活性，例如突变的p115 Rho-GEF。参见下文。

RGS-GEF核酸编码RGS-GEF多肽。该核酸既指有义核酸又指反义核酸。

术语“特异结合亲和性”是指，例如，与GDP-结合态或核苷酸缺乏态相比，RGS-GEF多肽对于G蛋白亚单位的激活态或过渡态具有结合偏好性。“GEF活性”是指，例如，多肽刺激或催化GDP从单体G蛋白如Rho的解离，并且随后结合GTP。单体G蛋白包括但并不限于Ras，Rho／Rac，Sar，Rab，Arf，和Ran家族的G蛋白。特别感兴趣的是下列GEF蛋白的RGS结构域：人p115(1654344)(图10，在45-170位氨基酸处的RGS结构域)，小鼠Lsc(1389756)(图14，在43-168位氨基酸处的RGS结构域)，KIAA380(2224701)(图12，在310-432位氨基酸处的RGS结构域)以及果蝇DrhoGEF2(2760368)(图16，在924-1053位氨基酸处的RGS结构域)。

本发明的另一方面涉及GEF蛋白的RGS结构域的新的共有序列，此处指“亚RGS共有序列”。此处采用的“RGS结构域”指蛋白质的氨基酸序列，该蛋白能够结合到G蛋白或与G蛋白物理上相互作用，任选地，它刺激G蛋白的GTP酶活性。此处采用的“亚RGS共有序列”指能够被用于鉴定含有RGS结构域的特异亚类(subset)蛋白质的共有序列。例如，来自图18和相应的图例中所示和描述的几种蛋白质的RGS结构域的同源序列对比，显示几种亚RGS共有序列可以根据GEF蛋白的RGS结构域中明显的13至14个氨基酸的缺口加以定义。这些共有序列之一，此处命名为“RGS-GEF共有序列1”，被定义为共有序列AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-(13个氨基酸的缺口)-AA22-AA23-AA24-AA25-AA26，其中：

AA1是L；

AA2是E或V；

AA3是K或P；

AA4是T，N，或R；

AA5是A；

AA6是V或P；

AA7是L；

AA8是S或是一个氨基酸的缺口，与13个氨基酸缺口相邻；

AA22是R或W；

AA23是V或Y；

AA24是P，K，或R

AA25是V，I，或Q；

AA26是P或D。

另一个共有序列，此处命名为“RGS-GEF共有序列2”，被定义为共有序列AA1-AA2-AA3-AA4-(13个氨基酸的缺口)-AA18-AA19，其中：

AA1是A；

AA2是V或P；

AA3是L；

AA4是S或一个氨基酸的缺口，与13个氨基酸缺口相邻；

AA18是R或W；

AA19是V或Y。

其他蛋白质，包括其他GEF蛋白可以与图18中所示的RGS蛋白的RGS结构域进行序列对比，并且利用此处描述的方法，确定它们是否含有亚-RGS共有序列，例如上面定义的RGS-GEF共有序列1或RGS-GEF共有序列2。

检查图18时，同样很明显的是非GEF蛋白的RGS蛋白所特有的核苷酸序列表示为编码相应于RGS-GEF蛋白中13-14氨基酸缺口的氨基酸的核苷酸序列。这些核苷酸序列可以用作鉴定特定类型的RGS蛋白的探针。

RGS-GEF多肽优选地具有生物学活性。有生物学活性是指多肽片段在活的系统中或是与活的系统的组分一起具有活性。生物学活性包括，但不限于上面所定义的对G蛋白α亚单位的特异结合亲和性，以及对G蛋白α亚单位的GAP活性。如实施例中所述，这种多肽可以通过常规方法制备，例如通过重组方法或通过对分离的多肽进行蛋白水解切割，然后检测所需的活性。

本发明的多肽包括与p115 Rho-GEF(图10)，Lsc(图14)，KIAA0380(图12)，或DRhoGEF2(图16)的氨基酸序列的相同性小于100％的多肽。为了进行下列讨论：序列的相同性指在图10-17中所示序列中可见的相同的核苷酸或氨基酸，在所比较的序列的相应位置上也能找到。具有与图10，12，14和16列出的氨基酸序列相同性小于100％的多肽可以通过各种方式被替换，例如，通过保守的氨基酸。相同的和保守性替换的残基总数被序列中的残基总数除，结果等于序列的相似性百分比。为了计算序列的相同性和相似性，被比较的序列可以作序列对比，并根据任何所需的方法、法则、计算机程序等等进行计算，包括，如FASTA，BLASTA。与图10，12，14，和16所示的GEF蛋白的氨基酸序列的相同性小于100％的多肽可以具有，例如，大约60％，65％的序列相似性，而更优选地为大约67％，70％，78％，80％，90％，92％，96％，99％等等的序列相似性。

特别地，本发明涉及p115 Rho-GEF，Lsc，KIAA0380和DRhoGEF2的多肽及相应的核酸，它们的GEF蛋白的RGS结构域发生了突变，并且具有一种或多种上述RGS-GEF多肽活性。术语“突变的”在此处指这种序列不是天然形成的。例如所述突变的多肽中一个或多个天然形成的位点可以被保守性的氨基酸替换，例如，(根据侧链的大小和极化的程度)小的非极性氨基酸：半胱氨酸，脯氨酸，丙氨酸，苏氨酸；小的极性氨基酸：丝氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺：大的极性氨基酸：谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸；中等极性氨基酸：酪氨酸，组氨酸，色氨酸；大的非极性氨基酸：苯丙氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸。这种保守性的替换还包括Dayhoff在《蛋白质序列与结构图集5》(1978)和Argos在EMBOJ．，8，779-785(1989)中描述的那些。具有图10，12，14，和16中的氨基酸序列的多肽可以在1，5，10，15，或20个位点上被保守性氨基酸替换。突变可以被引入到GEF蛋白RGS结构域的保守性共有区或是其他的残基中。

选择对RGS-GEF多肽的突变使其具有一种或多种上述的活性，例如，对G蛋白α亚单位的特异结合亲和性，对G蛋白α亚单位的GAP活性等等。这种活性的检测可以按下述方法或按Cerione和Zheng，1996，细胞生物学现代观点，8：216中所述进行。

通过向RGS结构域的疏水核心引入氨基酸替换可以对RGS-GEF多肽进行修饰(图1，A)。例如，一个保守性氨基酸的替换预期不会影响活性，而非保守性的氨基酸替换，例如，将疏水残基变为亲水残基，预期将会降低或消除其活性。疏水残基是非极性的氨基酸如苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，和半胱氨酸。亲水残基是极性氨基酸如赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷氨酸，以及天冬氨酸。

对本发明的RGS-GEF多肽或相应核苷酸序列的修饰，例如，突变，还可以根据从基因数据库如GenBank，EMBL中进行同源性搜索而完成。序列同源性搜索可以利用各种方法实现，包括计算机程序BLAST系列中的算法，Smith-Waterman算法，等等。例如，保守性氨基酸可以从各种含有GEF蛋白的RGS结构域的不同序列中鉴定出来(见图18)。通过鉴定和比较多肽之间保守的氨基酸，然后在保守或非保守的位点修饰氨基酸，可以将突变引入到这种序列中。突变的RGS-GEF序列含有保守的或非保守的氨基酸，例如，在同源核酸的相应区域之间。例如，突变的序列可以含有来自上述同源序列任何位点的和／或从合适的搜索算法确定的保守的或非保守的残基。

相应的突变可以在RGS-GEF核酸的特异区域中进行。例如，突变也可以发生在参与GTP酶催化功能的氨基酸上或者突变可以发生在作为RGS-GEF序列和Gα亚单位之间的接触点的氨基酸上。

一个RGS-GEF多肽或其片段，或者被替换的RGS-GEF多肽或其片段，还可以含有各种修饰，其中这些修饰包括糖基化，共价修饰(例如氨基酸的R-基团)，氨基酸替换，氨基酸缺失，或氨基酸添加。对多肽的修饰可以根据各种方法，包括重组，合成，化学等方法来完成。

本发明的多肽(例如RGS-GEF多肽，或其片段和突变体)可以各种方式加以利用，例如，作为下述抗体的免疫原，作为生物活性剂(例如具有一种或多种与RGS-GEF多肽有关的活性)，作为相应的全长多肽活性的抑制剂。例如，随着p115 Rho-GEF与Gα亚单位的结合，在细胞内启动了级联反应，例如促进细胞繁殖和／或细胞骨架的重排。p115 Rho-GEF和Gα亚单位之间的相互作用可通过利用RGS-GEF多肽或其片段来进行调节，以抑制p115 Rho-GEF和Gα亚单位之间的相互作用。这样的片段对于调节与Rho信号传导途径有关的病因性条件是有用的。有用的片段可以用常规方法进行鉴定，即通过测试全长GEF蛋白RGS结构域的重叠片段抑制p115 Rho-GEF与Gα亚单位的结合的能力或者抑制p115 Rho-GEF对Gα亚单位GAP活性的能力。活性的测量在下面的实施例中进行描述。肽可以被化学修饰等等。

本发明的RGS-GEF多肽可以包含一个或多个结构结构域，功能结构域，可检测结构域，抗原结构域，以及／或者其他目的多肽，其排列方式不是在自然界中形成的，即非天然形成的。具有这种特征的多肽是嵌合多肽或融合多肽。这些的嵌合多肽可以根据各种方法进行制备，包括化学的，合成的，半合成的，和／或重组的方法。编码嵌合多肽的嵌合核酸可以在连续的或有中断的开放阅读框中含有各种结构域或目的多肽，例如，含有内含子，剪接位点，增强子等等。嵌合核酸可以根据各种方法产生。参见如美国专利5，439，819。结构域或目的多肽可以拥有任何所需的特性，包括生物学功能如催化、信号传导、刺激生长、细胞定向，等等，结构功能如疏水性，亲水性，跨膜性等，受体-配体功能，以及／或可检测功能，例如与酶、荧光多肽、绿色荧光蛋白GFP结合(Chalfie等人，1994，科学(Science)，263：802；Cheng等人，1996，自然生物技术(Nature Biotechnology)，14：606；Levy等人，1996，自然生物技术，14：610，等等)。另外，RGS-GEF核酸，或其片段，被引入宿主细胞中时可用作选择性标记。例如，编码本发明的氨基酸序列的核酸可以符合读框地融合到所需编码序列上，作为纯化、选择或制备时的标记。融合区编码一个切割位点。

本发明的多肽可以在表达系统中产生，例如，根据本发明的体内、体外、无细胞、重组、细胞融合等系统。通过这种系统对多肽进行的修饰包括糖基化，氨基酸替换(例如通过改变密码子的使用)，多肽加工如消化、切割、肽链内切酶或肽链外切酶活性，附着化学基团，包括脂类、磷酸等。例如，一些细胞系可以从表达的多肽中去除末端的甲硫氨酸。

本发明的多肽可以根据常规方法从天然材料、转化的宿主细胞(培养基或细胞)中回收，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。在纯化时低浓度(大约0．1-5mM)的钙离子的存在可能有用(Price等人，生物化学杂志244：917(1969))。高效液相层析(HPLC)可用于最终的纯化步骤。

本发明的RGS-GEF核酸可以包括RGS-GEF多肽的完整的编码序列，或者是其部分片段。本发明的核酸还包括与任何RGS-GEF核苷酸序列100％互补的核苷酸序列，例如反义序列。

本发明的核酸可以从各种不同的途径获得。可以从DNA或RNA，例如多聚腺嘌呤化的mRNA中获得，例如从组织、细胞，或完整生物体中分离。该核酸可以直接从DNA或RNA，或从cDNA文库中获得。该核酸可以从处于特定发育期、具有所需基因型、表型的细胞(例如被致癌转化的细胞或癌细胞)中获得，等等。该核酸还可以经化学合成。

本发明的核酸可包括只有RGS-GEF多肽的编码序列；RGS-GEF多肽的编码序列和附加的功能编码序列，包括，例如前导序列，分泌序列，标记序列(如导向标记，酶标记，荧光标记等等)。本发明的核酸还包括RGS-GEF多肽的编码序列和非编码序列，例如5’端或3’端的非翻译序列或分布在编码序列之中的非翻译序列，例如内含子。

本发明的核酸还包括与上述核酸有效相连的表达控制序列。词组“表达控制序列”指这样的核酸序列，它调节由与之有效相连的核酸所编码多肽的表达。表达的调节可以在mRNA水平上或是在多肽水平上。因此，表达控制序列包括与mRNA有关的元件和与蛋白质有关的元件。这些元件包括启动子，增强子(病毒的或细胞的)，核糖体结合序列，转录终止子等等。表达控制序列被有效连接到核苷酸编码序列上，调整表达控制序列的定位方式，使之影响编码序列的表达或使编码序列得到表达。例如，当一个启动子有效连接到编码序列的5’端时，编码序列由启动子驱动开始表达。表达控制序列对于正常基因来说可以是异源的也可以是内源的。

本发明的核酸可以根据核酸杂交进行选择。两条单链核酸样品相互杂交的能力是它们的核苷酸序列互补性，例如核苷酸之间的碱基配对如A-T，G-C等等的一个量度。本发明因此还涉及与包含图11，13，15和17中所列核苷酸序列的核酸杂交的核酸。本发明包括核酸的两条链，例如有义链和反义链。

根据本发明，核酸或多肽可以与图10-17中的核苷酸或氨基酸序列有一处或多处不同。对核苷酸和／或氨基酸序列的改变或修饰可以通过任何可行的方法来实现，包括定点诱变或随机诱变。

编码本发明的RGS-GEF多肽的核酸可以包含天然形成的GEF基因产生的核苷酸，例如天然形成的多态性，正常或突变体等位基因(核苷酸或氨基酸)，在天然哺乳动物如人、猴子、猪、小鼠、大鼠或兔的群体中发现的突变。术语天然形成的是指该核酸是从天然材料例如动物组织或细胞，体液，组培细胞，法医学样品中得到的。天然形成的突变包括核苷酸序列的缺失，替换，或添加。这些基因可以根据本领域的技术人员所熟知的方法通过核酸杂交进行检测并分离。我们认识到，与其他癌基因相似，天然形成的GEF蛋白的变体将包括在GEF蛋白的RGS结构域中具有缺失，替换，和添加的变体，这些变体在宿主细胞和生物体中产生病理条件。

编码本发明的RGS-GEF多肽的核苷酸序列可含有在例如天然形成的基因，转录物，或cDNA中发现的密码子，或者含有编码相同氨基酸序列的简并密码子。

另外，本发明的核酸或多肽可以从任何所需的哺乳动物以及非哺乳动物体中得到。哺乳动物和非哺乳动物中的同系物可以根据各种方法得到。例如，与本发明的GEF的RGS结构域，或是RGS-GEF的寡核苷酸选择性杂交可用于选择这种同系物，例如在Sambrook等人，分子克隆(Molecular Cloning)1989，第11章中描述的方法。这种同系物与前面鉴定的RGS结构域或RGS-GEF核苷酸或多肽序列相比可以具有不同的核苷酸和氨基酸序列同一性和相似性。非哺乳动物体包括，如脊椎动物，无脊椎动物，斑马鱼，鸡，果蝇，酵母(如酿酒酵母)，线虫(C．elegans)，蛔虫，原核生物，植物，拟南芥(Arabidopsis)，病毒，等等。

本发明的核酸可以包括，例如，DNA，RNA，合成的核酸，肽核酸，修饰的核苷酸，或者其混合物。DNA可以是双链的或是单链的。组成核酸的核苷酸可以通过各种已知的方法连接起来，例如，根据不同的目的采用酯，氨基磺酸盐，硫酰胺，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基磷酸酯，氨基甲酸酯，等等。连接方式可以根据不同的目的加以改变，例如抵抗核酸酶如RNase H和增加体内的稳定性，参见如美国专利5，378，825。

可以对核酸进行各种修饰，例如附着可检测的标记(抗生物素蛋白，生物素，放射性元素)，和改善杂交、检测或稳定性的基团。该核酸还可以根据所需的方法附着到固体支持物上，例如硝酸纤维素，尼龙，琼脂糖，重氮化纤维素，乳胶固形微球体，聚丙烯酰胺等等。参见美国专利5，470，967，5，476，925，5，478，893。

本发明的另一方面涉及寡核苷酸和核酸探针。这种寡核苷酸或核酸探针可用于如检测、定量、或分离测试样品中的RGS-GEF核酸。检测是各种不同的目的，包括研究、诊断、和法医学所需要的。对于诊断目的来说，需要从组织、细胞、体液等获得的样品中鉴定特异RGS-GEF核酸序列的存在或其数量。在一个优选方法中，本发明涉及在测试样品中检测靶RGS-GEF核酸的方法，该方法包括在能够使靶与寡核苷酸有效杂交的条件下将测试样品与寡核苷酸接触，并检测杂交情况。根据本发明的寡核苷酸还可用于合成核酸的扩增如PCR中，例如Saiki等人，1988，科学，241：53；美国专利4，683，20，或者用于差异显示中(参见如Liang等人，核酸研究(Nucl．Acid Res．)，21：3269-3275，1993；USP 5，599，672；WO97-18454)。寡核苷酸可以经常规鉴定，例如，差异显示DH、PH、和RGS-GEF结构域以及／或扩增含有这种序列的基因产物。

有义和反义核苷酸序列都是本发明的一部分。本发明的特定的核酸可用常规方法确定。RGS-GEF核酸可用作杂交探针从含有核酸混合物如Northern杂交的样品中鉴定RGS-GEF核苷酸序列的存在。杂交可在严谨条件下进行以选择与探针具有至少95％同一性(即互补性)的核酸，但是也可以采用低严谨条件。特定的RGS-GEF核苷酸序列可以在其5’端或3’端符合读框地融合到各种核苷酸序列上，包括，例如，酶或表达控制序列等等的编码序列。

根据所需的选择性不同，杂交可以在不同的条件下进行，例如，按Sambrook等人，分子克隆，1989中所述。例如，为了特异地检测RGS-GEF序列，寡核苷酸与靶核酸的杂交是在寡核苷酸仅仅与衍生RGS-GEF序列的GEF序列杂交的条件下进行的，例如，在该条件下寡核苷酸与靶100％互补。如果需要选择具有小于100％的核苷酸互补性，至少约99％，97％，95％，90％，70％，67％的靶核酸，可以采用不同的条件。因为GEF基因的突变会引起疾病或病理条件，例如，癌症，良性肿瘤，所以本发明的寡核苷酸可被用于诊断。例如，具有癌症或其他与Rho信号传导途径有关(见下面)条件症状的患者可以使用本发明的寡核苷酸来诊断疾病，进行聚合酶链反应然后进行DNA测序，并与其他癌基因寡核苷酸相结合，例如p53，Rb，p21，Db1，MTS1，Wt1，Bcl-1，Bcl-2，MDM2等等，以鉴定该序列是否正常。

本发明的寡核苷酸的大小可以是任意所需的，优选地14-16寡核苷酸长，或者更长。这种寡核苷酸可以有非天然形成的核苷酸，例如肌苷。根据本发明，寡核苷酸可以包含一个试剂盒，其中含有所需的缓冲液(例如，磷酸，三羟甲基氨基甲烷，等等)，检测组合物等等。寡核苷酸可以用本领域已知的放射性或非放射性标记物加以标记，或者不标记。

反义核酸也可以从本发明的核酸中制备，优选相应于图11，13，15，和17的RGS-GEF核苷酸序列的反义RGS-GEF核苷酸序列。反义RGS-GEF核酸可以各种方式加以利用，例如调节或调控含有RGS结构域的GEF蛋白的表达，或者用于检测RGS-GEF蛋白的表达，包括原位杂交。为了调节或调控表达，反义寡核苷酸可被有效地连接到表达控制序列上。

本发明的RGS-GEF核酸可以根据任何所需的方法加以标记。核酸可用放射性示踪物加以标记，例如³²P，³⁵S，¹²⁵I，³H，或¹⁴C，这些仅仅是最常用的示踪物。放射性标记可根据任何方法进行，例如，使用放射性标记的核苷酸，多核苷酸激酶(用磷酸酶脱磷或不脱磷)或连接酶(根据要标记的末端)在3’端或5’端进行末端标记。还可以采用非放射性标记，使本发明的核酸与具有免疫特性(抗原，半抗原)、对某种试剂具有特异亲和性(配体)、使可检测的酶反应进行完全的特性(酶或辅酶，酶底物，或其他参与酶反应的物质)、或者具有如荧光或发射或吸收所需波长的光的典型物理特性的残基结合起来。

本发明的RGS-GEF核酸，包括寡核苷酸，反义核酸，等等，可用于检测完整器官、组织、细胞等的RGS-GEF核酸的表达，采用各种技术检测，包括Northern杂交，PCR，原位杂交，等等。这种核酸在检测失调表达时特别有用，例如RGS-GEF表达的细胞特异的和／或亚细胞的变化。RGS-GEF蛋白的水平可以单独检测或与其他基因产物(癌基因如p53，Rb，Wt1，等等)、转录物等等一起检测。

根据所需目的不同，本发明的核酸可以在各种不同的系统中进行体外和体内表达。例如，核酸可以被插入表达载体中，导入所需宿主，并在使该核酸编码的多肽有效表达的条件下培养宿主。有效条件包括任何适于宿主细胞产生多肽的培养条件，包括有效的温度，pH，培养基，培养宿主细胞的培养基的添加物(例如，提高或诱导表达的添加物如丁酸，或如果编码核酸靠近dhfr基因则添加氨甲喋呤)，放线菌酮(cyclohexamide)，细胞密度，培养皿等等。可以通过任何有效的方法将核酸导入细胞中，例如，磷酸钙沉淀法，电穿孔法，注射法，DEAE-葡聚糖介导的转染法，脂质体融合，以及病毒转染法。导入了本发明的核酸的细胞是被转化的宿主细胞。该核酸可以存在于宿主细胞的染色体外或者整合到染色体上。可以是稳定存在的或者是短暂存在的。根据与宿主细胞的相容性选择表达载体。宿主细胞包括，哺乳动物细胞，如COS-7，CHO，HeLa，LTK，NIH3T3，酵母，昆虫细胞，如Sf9(S．frugipeda)和果蝇，细菌，如大肠杆菌，链球菌，芽孢杆菌，酵母，真菌细胞，植物，胚胎干细胞(如哺乳动物，如小鼠或人)，癌细胞或肿瘤细胞Sf9的表达可以采用类似于Graziani等人，癌基因(Oncogene)，7：229-235，1992的方法进行。相似地，表达控制序列的选择根据与宿主的相容性和所需的目的，例如高拷贝数，高含量，诱导，提高，控制表达。可以使用的其他序列包括增强子如SV40、CMV、可诱导启动子，细胞类型特异元件，或能够选择性表达或特异细胞表达的序列。

被标记的多肽可用于，例如结合检测中，如鉴定与p115 Rho-GEF结合或附着的物质，用于追踪p115 Rho-GEF在细胞中的运动，用于体外、体内、或原位系统中，等等。

本发明的核酸或多肽还可以为基本上纯化。基本上纯化是指该核酸或多肽被基本上从其他核酸或多肽中分离出来，就是说，该核酸或多肽是主要的和有活性的成分。

本发明的另一方面涉及RGS-GEF多肽参与的生物学途径的调节，特别是病理条件，例如细胞增殖(如癌)，生长控制，形态发生，应力纤维形成，以及整联蛋白介导的相互作用，如胚胎发育，肿瘤细胞生长和转移，程序化细胞死亡，止血，白细胞归巢(homing)和激活，骨吸收，血块凝缩，以及细胞对机械应力的反应。参见，例如，Clark和Brugge，科学，268：233-239，1995；Bussey，科学，272：225-226，1996。因此，本发明涉及调节RGS-GEF多肽活性的方法的所有方面，包括给予有效剂量的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，有效剂量的调节RGS-GEF多肽活性的化合物，或者有效剂量的编码RGS-GEF多肽或其生物学活性片段的核酸。被调节的RGS-GEF的活性包括与Gα亚单位结合或对Gα亚单位的GAP活性。对活性的调节可以是提高，降低，拮抗，和促进RGS-GEF的表达或活性。

本发明还涉及特异识别RGS-GEF多肽的抗体。抗体，如多克隆的、单克隆的、重组的、嵌合的抗体，可以根据任何所需的方法进行制备。例如，为了制备单克隆抗体，可以将图10，12，14，或16的RGS-GEF多肽经皮下和／或腹膜内施用给小鼠，山羊，或兔子，使用佐剂或不使用佐剂，多肽的剂量要能够有效引起免疫反应。抗体也可以是单链或Fab。抗体可以是IgG，亚型，IgG2a，IgG1等等。

RGS-GEF特异的抗体指该抗体识别GEF多肽RGS结构域的氨基酸序列内的特定的氨基酸序列，或是识别包括GEF多肽RGS结构域的氨基酸序列在内的特定的氨基酸序列。因此，特异抗体对见于GEF多肽的RGS结构域的氨基酸序列即表位的结合，与对通过免疫印迹检测检测到的和／或测量的不同表位的氨基酸序列相比，具有更高的亲和性。因此，特异于p115 Rho-GEF的RGS结构域内部的表位，或者是包括RGS结构域在内的表位的抗体可用于检测样品中表位的存在，例如，可以将含有p115 Rho-GEF基因产物的组织样品同不含该表位的样品区分开来。

另外，根据本发明，可以制备与GEF多肽的RGS结构域结合的配体，例如，利用合成肽库或aptamer(例如Pitrung等人，美国专利5，143，854；Geysen等人，1987，免疫学方法杂志(J．Immunol．Methods)102：259-274；Scott等人，1990，科学，249：386；Blackwell等人，1990，科学，250：1104；Tuerk等人，1990，科学，249：505)。

与GEF多肽的RGS结构域结合的抗体和其他配体，以及与p115Rho-GEF的RGS结构域结合的特异抗体和其他配体，可以各种方式加以利用。它们包括，但不限于，作为治疗、诊断和商业研究的工具，例如，测定p115 Rho-GEF多肽在动物、组织、细胞内等的水平，鉴定p115 Rho-GEF的细胞定位和／或分布，纯化p115 Rho-GEF或含有部分p115 Rho-GEF的多肽，调节p115 Rho-GEF的功能，等等。抗体可用于Western杂交、ELIZA、免疫沉淀、RIA，等等。本发明涉及这些检测方法、组合物和进行检测的试剂盒，等等。

本发明的抗体可用于在各种样品，包括组织、细胞、体液、血液、尿、脑脊液中检测含有GEF多肽的RGS结构域的多肽或片段。本发明的方法包括在本领域已知的有效条件下，接触与图10，12，14，或16的RGS-GEF多肽结合的配体，以结合、检测配体和肽之间特异的结合。特异结合，是指配体附着到特定的氨基酸序列上，例如图10，12，14，或16中所示的RGS结构域内的氨基酸序列，或者是包括这些序列在内的氨基酸序列，或其衍生物。抗体或其衍生物因此可用于抑制含有RGS结构域的GEF蛋白的表达。含有RGS结构域的GEF多肽的水平可以单独检测或与其他基因产物一起检测。特别地，含有RGS结构域的GEF多肽的量(例如其表达水平)，可以与相同或不同样品，如p21、p53、Rb、WT1等中其他多肽的量相比(例如作为比值)。

GEF多肽的RGS结构域的配体可以与其他抗体一起使用，例如识别癌的致癌标记的抗体，包括Rb，p53，c-erbB-2，癌基因产物，等等。一般地，对GEF多肽的RGS结构域特异的试剂可用于诊断和／或法医学研究，研究可以根据任何所需的方法，例如美国专利5，397，712；5，434，050；5，429，947。

本发明还涉及转基因动物，例如，非人哺乳动物，例如含有RGS-GEF多肽的小鼠。转基因动物可以根据已知的方法制备，包括，例如，将重组基因注射到1-细胞胚胎的原核中，将人工酵母染色体掺入胚胎干细胞中，基因定向(targeting)方法，胚胎干细胞方法学。参见如美国专利4，736，866；4，873，316；5，082，779；5，304，489；5，174，986；5，175，384；5，175，385；5，221，778；Gordon等人，美国国家科学院院报(proc．Natl．Acad．Sci．)77：7380-7384(1980)；Palmiter等人，细胞，41：343-345(1985)；Palmiter等人，遗传学年度评述(Ann．Rev．Genet．)20：465-499(1986)；Askew等人，分子细胞生物学(Mol．Cell．Bio．)13：4115-4124，1993；Games等人，自然，373：523-527，1995；Valancius和Smithies，分子细胞生物学，11：1402-1408，1991；Stacey等人，分子细胞生物学，14：1009-1061，1994；Hasty等人，自然，350：243-246，1995；Rubinstein等人，核酸研究，21：2613-2617，1993。本发明的核酸可被导入任何非人哺乳动物，包括小鼠(Hogan等人，1986，《小鼠胚胎操作实验手册》(Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，猪(Hammer等人，自然，315：343-345，1985)，羊(Hammer等人，自然，315：343-345，1985)，牛，大鼠，或灵长类。另参见，例如，Church，1987，生物技术进展，5：13-19；Clark等人，生物技术进展，5：20-24；以及DePamphilis等人，1988，生物技术(BioTechniques)，6：662-680。另外，定做的(custom)转基因大鼠和小鼠能够从商业上得到。这些转基因动物可用于癌症模型或作为模型评价RGS-GEF多肽过量表达的效果。

一般地，本发明的核酸，多肽，抗体，等等可按美国专利5，501，969，5，506，133，5，441，870；WO 90／00607；WO 91／15582中所述进行制备和利用。

本发明的其他方面涉及调节下列相互作用和效果的分子的检测或鉴定方法：GEF的RGS结构域与其同源结合底物的相互作用；GEF的RGS结构域与Gα亚单位的相互作用；G蛋白亚单位对含有RGS结构域的GEF蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换活性的刺激效果；具有RGS结构域的GEF蛋白对G蛋白亚单位的GTP酶激活蛋白的效果。

活性可以各种方式进行调节，例如增强、激活、刺激、阻遏、预防、抑制，等等。调节分子可以是激动剂、拮抗剂，或具有其部分活性。调节分子可以是任何类型的分子，包括但不限于小分子、蛋白质、肽、抗体、核酸，等等。一般地，具有体外活性的化合物可用于体内调节与含有RGS结构域的GEF蛋白有关的生物学途径，例如，治疗与上述生物学和细胞活性有关的病理条件。调节分子可以含有相同或不同分子的混合物。

GEF蛋白RGS结构域的结合底物是能够被RGS结构域特异结合的任何物质，包括Gα12家族的成员。参见，例如，Strathman和Simon，美国国家科学院院报，88：5582，1991。例如，鉴定或检测调控或调节G蛋白α亚单位与含有RGS结构域的GEF蛋白结合分子的方法，如p115 Rho-GEF，可以根据本发明进行。在一个实施例中，GTP结合的α亚单位或其衍生物与含有RGS结构域的GEF蛋白或其片段在存在或不存在供试分子时一起温育，确定供试分子的存在是否调节GEF蛋白和G蛋白α亚单位的结合。温育是在有效条件下进行的，就是说，是在结合或附着可以发生的条件下进行的。结合可以以一种或多种方式检测。例如，GEF蛋白或结合底物被标记使其可以被检测；将被标记的结合的组分从被标记的自由组分中分离出来；并确定被可检测结合标记的GEF蛋白或结合底物的量。可检测的标记物可以是任何所需的成分，例如，放射性的，荧光的，等等。这种检测可以在固相或液相中进行。

在本发明的一个方面，需要鉴定调节Gα₁₂家族亚单位如Gα₁₂和Gα₁₃与GEF(例如p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、或DrhoGEF2)的结合的分子。进行检测时可以使用完整的GEF蛋白，或其含有RGS结构域、或RGS结构域的生物学活性亚片段的任何亚片段。进行检测时通常是用Gα亚单位的GTP结合状态的稳定类似物，包括与GDP-AIF₄ ^-或GTPγS结合的α亚单位。例如，结合检测可以根据下面实施例5中描述的步骤进行，其中COS细胞被用myc-标记多肽(如p115 Rho GEF)或其片段的核酸构件转染，多肽和α亚单位的复合体检测是通过沉淀第一抗体对一种组分形成的任何结合复合体，并检测与第二抗体形成的第二结合组分的量。结合检测还可以利用本领域熟知的技术进行，例如通过将一种组分结合到柱子上，然后确定与柱子结合的第二个标记组分的量。相关的检测方法还在如Berman等人，1996，生物化学杂志，271：27209中被公开。

分离或检测调控或调节RGS-GEF多肽对GTP酶活性(如Gα亚单位的GTP酶活性)的刺激作用的分子的方法，也可以根据本发明进行。例如，在有效条件下Gα亚单位与具有GTP酶刺激作用的RGS-GEF多肽在存在或不存在供试抑制剂时温育，确定供试抑制剂的存在是否调控其刺激作用。进行检测时可以使用完整的RGS-GEF多肽、GEF蛋白，或其含有RGS结构域、或RGS结构域的生物学活性亚片段的任何亚片段。RGS-GEF多肽可以是p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF2，或其生物学活性片段。例如，检测进行时可以利用p115 Rho GEF与α12或α13亚单位按照此处讨论的实施例中描述的方法，以及利用本领域熟知的其他变化或检测方法进行。例如，检测可以根据下面的实施例5进行，加入Gα亚单位与[γ-^32P]GTP，在各种条件下，包括存在RGS-GEF多肽时，通过离心检测混合物后测定上清液中³²Pi的量，来确定其水解程度。相关的检测方法在如Berman等人，1996，生物化学杂志，271：27209中也被公开。

鉴定或检测调控激活的Gα亚单位对具有GEF介导的单体G蛋白核苷酸交换的RGS-GEF多肽的刺激作用的分子的方法，也可以根据本发明进行。例如，第一步检测是通过将激活的Gα亚单位与GEF蛋白(例如p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF2，或是其保留了GEF活性的生物学活性片段)和单体G蛋白在存在或不存在供试调控物时温育，确定供试调控物是否对激活的Gα亚单位刺激GEF介导的单体蛋白核苷酸交换的能力具有抑制、增强等作用。参见Hart等人，1996，生物化学杂志221：25452。供试调控物还可以通过第二次检测加以评价，在检测中所述GEF蛋白和单体G蛋白，没有G蛋白亚单位，在存在或不存在供试调控物下温育以确定供试调控物是否对GEF介导的单体蛋白的核苷酸交换具有任何作用，然后比较第一次检测和第二次检测中的调控作用以确定第一次检测中的调控作用是否有别于第二次检测中的调控作用，从而说明，供试调控物调控的是激活的Gα亚单位与GEF蛋白的相互作用而不是GEF蛋白与单体G蛋白的相互作用。例如，对GEF介导的鸟嘌呤核苷酸交换的刺激作用可以根据下面的实施例6进行测定，其中RhoA与[³H]GDP一起加入，在各种条件下通过在后面的温育之前用过滤法确定结合的GDP，而测定GDP从RhoA的解离。(参见例如，Northrup等人，生物化学杂志257，11416-11423(1982))。

鉴定能够模拟激活的Gα亚单位对GEF介导的单体G蛋白的核苷酸交换的刺激作用的分子的方法，也可以根据本发明进行。该方法包括鉴定对GEF蛋白的RGS结构域表现出结合亲和性的供试化合物，然后将GEF蛋白和单体G蛋白在存在或不存在供试化合物时温育，确定供试化合物是否表现出对GEF介导的单体G蛋白的核苷酸交换具有刺激作用。对GEF蛋白的RGS结构域表现出结合亲和性的供试化合物的鉴定可以利用本领域熟知的技术完成。例如，将RGS多肽结合到柱子上，将供试化合物的混合物过柱确定是否有化合物选择性地结合柱子。

鉴定能够模拟GEF多肽的RGS结构域对Gα亚单位的GTP酶活性刺激作用的分子或分子混合物的方法，也可以根据本发明进行。该方法包括鉴定对Gα亚单位表现出结合亲和性的供试化合物，然后将GTP承载的Gα亚单位在存在或不存在供试化合物时温育，确定供试化合物是否表现出对Gα亚单位的GTP酶活性的刺激作用。对Gα亚单位表现出结合亲和性的供试化合物的鉴定可以利用本领域熟知的技术完成。例如，可将Gα₁₂结合到一种底物上，并与含有RGS结构域的GEF多肽和供试化合物一起温育，以确定供试化合物是否与RGS结构域竞争与Gα亚单位的结合。

RGS-GEF组分或其衍生物对致癌转移活性的调控可以根据各种已知的步骤测定，例如Eva和Aaronson，自然，316：273-275，1985；Hart等人，生物化学杂志，269：62-65，1994。在该方法中可以在任何时间加入某一化合物(例如在细胞预处理时，加入RGS-GEF以后，等等)以确定它对RGS-GEF组分的致癌转移活性的作用。还可以使用各种细胞株。

单体GTP酶介导的信号传导的其他检测方法可以根据本发明通过本领域已知的类似方法完成，例如，如在美国专利5，141，851；5，420，334；5，436，128；以及5，482，954；WO94／16069；WO93／16179；WO91／15528；WO90／00607中所述。

本发明因此还涉及对与含有RGS结构域的GEF蛋白介导的信号传导有关疾病和病理学条件的治疗和预防，例如，癌，与非正常细胞增殖有关的疾病。例如，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给需要治疗的对象给予一定量的能够有效治疗疾病的化合物，其中的化合物是含有RGS的GEF蛋白对Gα亚单位GTP酶活性刺激作用的调控物，或者该化合物是Gα亚单位对GEF介导的单体GTP酶核苷酸交换刺激作用的调控物。治疗疾病指延缓它的发生、延缓疾病的发展、改善或延缓疾病的临床和病理学症状。调控化合物，或化合物的混合物可以是合成的、天然形成的、或是二者的结合。调控混合物包括氨基酸、核苷酸、碳氢化合物、脂类、多糖，等等。调控化合物优选调节含有RGS结构域的GEF蛋白表达的化合物，例如，抑制或增加其mRNA、蛋白质的表达或加工，或是调节GEF蛋白的RGS结构域与Gα亚单位相互作用的化合物。为了治疗疾病，该化合物或混合物可以制成药物组合物，它含有药学上可接受的载体和其他对于熟练工人来说很明白的赋形剂。参见，例如《雷氏药物科学》(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)第八版，Mack出版公司，1990。这种组合物还可以含有有效剂量的其他化合物，特别是对于癌症的治疗。

实施例实施例1．鉴定Rho GEF与调节G蛋白信号传导的蛋白质之间的同源性

RGS家族蛋白是G蛋白信号传导的负调节物。已鉴定了本家族的19个哺乳动物成员，它们都编码含有被称为RGS盒的同源性核心的蛋白质。

对一种Rho特异的GEF，p115-GEF序列的检查显示一个对RGS蛋白的保守结构域具有特异同源性的N-端区，RGS蛋白包括RGS4、RGS2、GAIP、RGS12，和RGS14(图1)。对另外三种Rho GEF蛋白，Lsc、KIAA380，和DrhoGEF的分析也显示它们含有对RGS蛋白的保守结构域具有特异同源性的区域(图1)。

RGS4和AIF4-激活的Gα_il复合体的晶体结构显示，RGS4的功能核心(RGS盒)含有折叠为两个小亚结构域的9个α-螺旋(Tesmer等，细胞，89，251(1997))。RGS盒显示出具有对Gα亚单位的GAP活性(Popov等人，美国国家科学院院报，94，7216(1997))。RGS盒的疏水核心残基在RGS家族成员中是保守的，它们对于结构和GAP活性的稳定性很重要(Tesmer等，细胞，89，251(1997)和Srinivasan等人，生物化学杂志，273，1529(1998)。RGS4通过与Gα_il的三个转换区相互作用，主要是通过稳定GTP水解的过渡态而刺激Gα_il的GTP酶活性(Tesmer等，细胞，89，251(1997))。

形成RGS结构域的核心的大多数疏水残基在p115 Rho GEF中是保守的(23个残基中有17个是保守的)(图1)。序列对比中缺口的位置相应于RGS结构域结构的α-螺旋的环。这种同源性提示p115 GEF的N-端区可能具有与RGS4盒结构域相似的结构，并拥有GAP活性。相反，RGS4与Gα_il(GDP-AIF4^-)的转换区相接触的残基的保守性不高，而且p115 Rho GEF的任何GAP活性都将具有独特的机制或与以前鉴定的那些具有显著不同的特异性。

基因文库搜索显示另外三个具有与p115的RGS区同源的Rho-GEF成员。它们包括Lsc、KIAA380，和DrhoGEF2(图1)。Lsc似乎是p115 Rho GEF的小鼠同系物而KIAA380似乎是果蝇DrhoGEF2的人同系物(Whitehead等人，生物化学杂志，271，18643(1996)；Barret等人，细胞，91，905(1997))。这四种Rho-GEF构成新的也拥有Rho鸟嘌呤核苷酸交换活性的RGS相关家族蛋白。

四种已知含有RGS结构域的GEF蛋白(p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF2)与RGS蛋白RET-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS7、RGS10、RGS12、RGS14、Rap1／2B．P．，和GAIP的RGS结构域的序列对比显示，四种GEF蛋白的RGS序列构成新的亚RGS共有序列(图18)。如图18中底部的序列所示，新的亚RGS共有序列在同源序列对比中以13至14个氨基酸的大缺口表示，缺口的两边是保守氨基酸。实施例2．RHO GEF蛋白p115 RHO GEF刺激Gα₁₃和Gα₁₂亚单位的GTP酶活性。

测试p115 Rho GEF以确定其刺激Gα₁₃和Gα₁₂亚单位固有的GTP酶活性(GAP活性)的能力。

在Sf9细胞中表达Gα₁₂并按Kozasa和Gilman，生物化学杂志270，1734(1995)中所述将其纯化。Gα₁₃的制备步骤相似，利用前面描述的杆状病毒法(Singer和Miller，生物化学杂志，269，19796(1994))，将异源三体固定在Ni-NTA树脂(Qiagen)上以后的洗涤和洗脱α亚单位时利用辛基糖苷(octylglucoside)。洗脱下来的Gα₁₃进一步通过羟基磷灰石吸收和洗脱加以纯化。Gα₁₂或Gα₁₃(20-30pmol)在30℃下并且存在5mM EDTA时分别与5μM[γ-32P]GTP(50-100cpm／fmol)温育30或40分钟。然后将样品迅速在4℃通过Sephadex G50柱离心过滤，G50柱事先用缓冲液A(50mMNaHepes(pH8．0，1mM二硫苏糖醇，5mM EDTA，0．05％聚氧乙烯10-月桂基醚)平衡，以除去游离的[γ-³²P]GTP和[³²Pi]。加入含有8mM MgSO₄、1mM GTP和指定量p115的缓冲液A溶解的Gα和[γ-³²P]GTP使GTP开始水解。反应混合物在4℃或15℃下温育。在指定时间取出一等份(50微升)与50mM NaH₂PO₄中的750μl 5％(w／v)Norit A混合。将混合物以2000转／分离心5分钟，400微升含有³²Pi的上清液用液体闪烁计数法计数。

与Gα₁₃和Gα₁₂结合的GTP的水解是在15℃、有或没有10nM全长p115(图2，A)下进行的。在4℃、存在各种浓度的p115下测定与Gα₁₃和Gα₁₂结合的GTP的水解(图2，B)。全长的p115能够刺激一轮预先结合到Gα₁₃亚单位的[γ-³²P]GTP的水解。与Gα₁₃同源性最近的Gα₁₂的固有的GTP酶活性也受全长的p115刺激。在15℃下，Gα₁₂(0．07min^-1)和Gα₁₃(0．24min^-1)对GTP水解的K_cat被p115刺激分别增加了5倍和10倍(图2，A)。用几种Gα₁₂和Gα₁₃制品获得了相似的结果。90℃处理p115可使该GAP活性失活。因为Gα₁₃的水解速率很迅速，检测在4℃进行以更好地估计p115对G蛋白的GTP酶活性初始速度的影响(图2，B)。在这些条件下，100nMp115使Gα₁₃的GTP酶活性增加80倍。相反，Gα₁₂的水解速度仅增加6倍。尽管在p115的浓度低至1nM也能观察到对两种蛋白的刺激作用，但是在两种温度下的检测说明与Gα₁₂相比，p115是Gα₁₃的更有效的GAP。

在没有受体时，GTPγS与Gα结合和GTP的稳态水解的限速步骤是GDP的释放。p115既不能影响GTPγS与Gα₁₃和Gα₁₂结合的速度，也不能影响各亚单位的GTP酶活性的稳态。因此，p115仅仅刺激Gα₁₃和Gα₁₂固有的GTP酶活性，而不影响它们的核苷酸交换速度。

RGS蛋白保守的RGS盒在体外足以表现GAP活性(Popov等人，美国国家科学院院报，94，7216(1997))。所以，谷胱甘肽-硫-转移酶和p115的N端区的一个融合蛋白GST-RGS用于检测GAP活性。该区含有RGS同源结构域但不是p115的Db1或PH结构域。在测试对Gα₁₂和Gα₁₃的GAP活性时，p115的这个“RGS结构域”(10nM)几乎与全长的p115具有同样的活性(图3)。相反，一个缺失了N端区的p115构件是无效的。因此，该数据显示RGS同源区负责p115的GAP活性。实施例3．p115 RHO-GEF不能刺激Gα_i、Gα_z、Gα_q和Gα_s亚单位的GTP酶活性

p115的GAP活性对不同G蛋白亚单位的特异性的检测如下。

Gα_s按Lee等人，酶学方法(Meth．Enxymol．)，237，146(1994)中所述在大肠杆菌中表达并纯化。Gα_i、Gα_z和Gα_qR183C按Kozasa和Gilman，生物化学杂志270，1734(1995)和Biddlecome等人，生物化学杂志，271，7999(1996)中所述在Sf9细胞中表达并纯化。Gα_i、Gα_z和Gα_s与5-10μM[γ-³²P]GTP于5mM EDTA存在下在20℃(Gα_s)或30℃(Gα_I和Gα_z)下温育20分钟，并按上述Gα₁₂和Gα₁₃的方法检测GAP活性。对Gα_q的GAP活性检测用突变的Gα_qR183C进行。在Gα_iR1178C中一个相似的突变显著降低了GTP酶活性，但保留了对RGS蛋白的反应(Berman等人，细胞，86，445(1996))。Gα_qR183C的低GTP酶活性使得[γ-³²P]GTP对Gα_q载承不用受体以加速核苷酸交换。Gα_qR183C与10μM[γ-³²P]GTP在存在50mM Hepes(pH7．4)，0．1mg／ml BSA，1mM DTT，1mM EDTA，0．9mM MgSO₄，30mM(NH₄)₂SO₄，4％甘油，和5．5mMCHAPS时，在20℃下温育2小时。将反应混合物迅速通过SephadexG50柱过滤，G50柱事先用50mM Hepes(pH7．4)，1mM DTT，1mMEDTA，0．9mM MgSO₄，0．1mg／ml BSA，和1mM CHAPS平衡。

此研究的结果说明在RGS4作为这些Gα亚单位的GAP的条件下，p115(100nM)不能刺激Gα_i、Gα_z或Gα_q的GTP酶活性(图4)。相似地，p115不能增加Gα_s的GTP酶活性，p115 Rho GEF对RhoA或racl也不具有GAP活性。因此，p115是对Gα₁₂和Gα₁₃特异的GAP。实施例4．AIF₄ ^-激活形式的Gα亚单位选择性抑制p115的GAP活性

RGS蛋白已被证明具有对GDP-AIF₄ ^-结合形式的α亚单位具有高亲和性，α亚单位的这种构象与GTP水解的过渡态相似(Tesmer等人，细胞，89，251(1997)，Berman等人，生物化学杂志，271，27209(1996))。因此，GDP-AIF₄ ^-形式的Gα亚单位应该同GαGTP竞争与p115的相互作用，并阻断所观察到的GAP活性。如图5，A中所示，被GDP-AIF₄ ^-结合的Gα₁₂和Gα₁₃有效地抑制了p115对Gα₁₂的GAP活性，而对形式相似的Gα_s、Gα_i和Gα_q无效。另外，对GDP-AIF₄ ^-结合形式的Gα₁₂和Gα₁₃的滴定分析，表明这些亚单位在抑制Gα₁₃的GAP活性方面具有相同的能力(图5，B)。这些竞争分析显示两种G蛋白亚单位对p115具有相似的亲和性，并且支持图2中所示p115对亚单位不同的表观效率。实施例5．体内Gα₁₃与p115 Rho GEF的结合

下面的实验证明Gα₁₃与p115 Rho GEF以依赖GTP的方式相互作用。

按前面在Hart等人，生物化学杂志271，25452-25458(1996)中所述，构建了缺失了RGS或DH结构域的、EXV-myc标记的(对于COS细胞转染)和pAc-Glu标记的(对于杆状病毒表达)蛋白。在相同的载体中构建了全长的蛋白。在pGEX4T-2(Pharmacia)中构建了GST与p115 Rho GEF的前246个氨基酸的融合体。转染，免疫沉淀和纯化按前面在Hart等人，生物化学杂志271，25452-25458(1996)中所述进行。

在用myc标记的p115 Rho GEF转染的COS细胞中，Gα₁₃可以使用抗-myc抗体进行特异性免疫沉淀(图6，A和B)。这种相互作用有赖于氟化铝的存在，将氟化铝加入以模拟Gα₁₃的被激活的GTP结合状态。另外，p115 Rho GEF的一种缺少RGS结构域氨基端的截短突变体不能够介导共免疫沉淀，而缺失了DH结构域的全长蛋白介导共免疫沉淀。全长的和截短的Rho GEF蛋白的不同结合也可以利用Gα₁₃的抗体免疫沉淀复合体来检测(图6，C)。与Gα₁₂非常弱的相互作用是可检测的，而Gα_s、Gα_i、Gα_q和Gα_z的抗体在抗myc免疫沉淀中检测不到免疫活性带，尽管事实上它们各自的抗原在全细胞裂解物中是可检测到的。p115 Rho GEF和Gα₁₃的共免疫沉淀可以在一种半纯化系统中重现，在该系统中加入纯化的Gα₁₃以免疫沉淀p115 Rho GEF(图6，D)，这提示直接的相互作用。直接的相互作用与观察到的p115 Rho GEF刺激Gα₁₃的GTP酶活性相一致，还说明p115 Rho可能是Gα₁₃的效应物。

Rho GEF蛋白KIAA380和α₁₂G蛋白亚单位之间的结合也可以检测到(图9中KIAA380称为FL147)。在用myc标记的KIAA380转染的COS细胞中，可以利用抗-myc抗体将Gα₁₂特异地免疫沉淀下来(图9，A和B，KIAA380为FL147)。这种相互作用有赖于氟化铝的存在，加入的氟化铝模拟Gα₁₃被激活的GTP结合态。实施例6．Gα₁₃对p115 Rho GEF活性的刺激

通过将RhoA和p115 Rho GEF在有或没有Gα₁₃时温育，确定对其鸟嘌呤核苷酸交换的影响，来检测Gα₁₃影响p115 Rho GEF的交换活性的能力。

RhoA(2．5μM)与[³H]GDP在30℃温育1小时，25μMGDP(10，000 cpm／pmol)溶解于50mM NaHepes，pH7．5，50mM NaCl，4mM EDTA，1mM二硫苏糖醇和0．1％ Triton X-100中。添加MgCl₂至9mM、辛基糖苷至1％后，将Rho再温育5分钟，通过Sephadex-G50快速将Rho与游离GDP分开，Sephadex-G50事先用50mM NaHEPES，pH7．5，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，5mMMgCl₂，和1％辛基糖苷平衡。GDP从RhoA的解离在30℃下，在20微升的50mM NaHEPES，pH7．5，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，5mM MgCl₂，30mM AlCl₃，5mM NaF，和5μMGTPγS中进行测定。除非特定说明，G蛋白α亚单位与AMF(30μM AlCl₃，5mM MgCl₂，和5mM NaF)在与其它蛋白混合前进行预温育。如所示，用25μM GTPγS或GDPβS而不是AMF处理α亚单位，而且反应不与AMF而是与5μM各种核苷酸温育。加入[³H]-GDP-RhoA启动反应，结合的GDP通过在温育前和温育后进行过滤来测定(Norhtup等人，生物化学杂志，257，11416-11423(1982))。

Gα_s和Gα_i亚单位在大肠杆菌中表达以后被纯化(Lee等人，酶学方法，237，146-164(1994))。Gα_q和Gα_z亚单位是在Sf9细胞中与六组氨酸标记的β和γ亚单位共表达的，并按(Kozasa和Gilman，生物化学杂志，270，1734-1741(1995))所述加以分离。Gα₁₃的制备步骤与Gα₁₂相似，将异源三体固定在Ni-NTA树脂(Qiagen)上后，在洗涤和洗脱α亚单位时利用杆状病毒(Singer等人，生物化学杂志，269，19796-19802(1994))和辛基糖苷。洗脱的Gα₁₃通过羟基磷灰石的吸附和洗脱被进一步纯化。从3升细胞中可以得到大约500μg纯化的Gα₁₃ GST-RhoA在Sf9细胞中的表达，GST标记的切割和自由RhoA的分离按Singer等人，生物化学，271，4505-4510(1996)中所述进行。

这些研究表明Gα₁₃能够刺激全长p115 Rho GEF的活性，其方式依赖于p115 Rho GEF(图7，A)和Gα₁₃(图7，B)的浓度。与Gα₁₃非常接近的α亚单位Gα₁₂在这些实验中不能刺激p115 RhoGEF的活性(图7，A)。对Rho交换能力的刺激还可以被监测为Gα₁₃激活态的函数。图7，C所绘的数据证实对交换活性的刺激依赖于氟化铝(AMF)或GTPγS，但不受GDPβS所模拟的失活的核苷酸态所刺激。一系列的其它α亚单位包括Gα_q、Gα_z、Gα_s和Gα_I也不影响p115 Rho GEF的活性(图7，D)。这些结果与图6中激活的依赖Gα₁₃的结合相一致，并说明Gα₁₃与p115 Rho GEF的有效结合足以进行激活。实施例7．p115和Gα₁₂的结构域对p115核苷酸交换活性的影响

p115 Rho GEF的RGS结构域通常是自我抑制的，而与Gα₁₃的结合则减轻这种抑制作用，对这一理论的检查是通过比较全长的Rho-GEF与截短的Rho-GEF对Rho交换活性的影响。

p115蛋白的制备按上面实施例1中所述和Hart等人，生物化学杂志，271，25452-25458(1996)中所述进行。检测结果示于图8，B和C按上面的实施例5中所述进行。AMF为激活剂。

这些实验的结果说明，缺少了RGS结构域的截短的p115 RhoGEF与相同浓度的全长蛋白相比，表现出大大升高的Rho交换活性(图8，A)。另外，加入所分离的RGS结构域(以GST融合蛋白的形式)导致受Gα₁₃刺激的p115 Rho GEF活性消失(图8，B)。这些数据并不排除在p115 Rho GEF上存在其它的Gα₁₃结合位点，但是它们确实暗示了通过RGS结构域的基本作用方式。

根据p115 Rho GEF能够激活Gα₁₂和Gα₁₃的GTP酶这一事实，Gα₁₂不能激活p115 Rho GEF是令人困惑的。因此，进行了一个实验，将Gα₁₂加入到受Gα₁₃刺激的p115 Rho GEF的检测中(图8，C)。结果说明Gα₁₂能够抑制Gα₁₃与p115 Rho GEF的偶联。该数据与一个模型相一致，在该模型中，Gα₁₂同Gα₁₃竞争与p115Rho GEF的RGS结构域的结合。但是，Gα₁₂与p115 Rho GEF的结合很明显不足以刺激Rho的交换活性。这些结果说明或者是Gα₁₂与p115 Rho GEF的RGS结构域的相互作用与Gα₁₃有很大的不同，或者是存在另外的Gα₁₃与p115 Rho GEF相互作用位点。

对于核酸、多肽、抗体等等的其它方面，可参考分子生物学、蛋白质科学和免疫学的标准教科书。参考，例如，Davis等人(1986)，分子生物学基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevir科学出版公司，纽约；Hames等人(1985)，核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)，IL出版社，分子克隆，Sambrook等人；现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)，F．M．Ausubel等人编著，John Wiley & Sons出版公司；现代人类遗传学技术(CurrentProtocols in Human Genetics)，Nicholas C．Dracopoli等人编著，JohnWiley & Sons出版公司；现代蛋白质科学技术(Current Protocols inProtein Science)，John E．Coligan等人编著，John Wiley & Sons出版公司；现代免疫学技术(Current Protocols in Immunology)，John E．Coligan等人编著，John Wiley & Sons出版公司。此处引用的所有专利申请、专利和出版物的完整公开在此将其引入作为参考。

通过前面的描述，本领域的技术人员能够很容易地掌握本发明的基本点，并且能够在不违背本发明的精神和范围的情况下，对本发明进行各种改变或改造，以适应各种用途和条件的要求。

Claims (27)

1．一种分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，它基本上由GEF蛋白的RGS结构域组成。

2．一种分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，它含有GEF蛋白的RGS结构域，前提是该多肽不含有DH结构域或PH结构域。

3．一种分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中多肽选自p115 Rho-GEF、Lsc、KIAA380，并且该多肽在RGS结构域中突变，而且该多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

4．根据权利要求1或2的分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中GEF蛋白是Rho GEF蛋白。

5．根据权利要求4的分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中Rho GEF蛋白是p115 Rho-GEF。

6．根据权利要求4的分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中Rho GEF蛋白选自Lsc、KIAA380和DrhoGEF2。

7．根据权利要求1或2的分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

8．根据权利要求4的分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

9．根据权利要求5的分离的RGS-GEF多肽或其生物学活性片段，其中多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

10．一种分离的RGS-GEF核酸，它基本上由编码含有GEF蛋白RGS结构域的多肽的核苷酸序列组成。

11．一种分离的RGS-GEF核酸，它含有编码具有GEF蛋白RGS结构域的多肽的核苷酸序列，其中多肽不包括DH结构域或PH结构域。

12．根据权利要求10或11的分离的RGS-GEF核酸，其中GEF蛋白是Rho GEF蛋白。

13．根据权利要求12的分离的RGS-GEF核酸，其中Rho GEF蛋白是p115 Rho GEF。

14．根据权利要求12的分离的RGS-GEF核酸，其中Rho GEF蛋白选自Lsc、KIAA380和DrhoGEF2。

15．根据权利要求10或11的分离的RGS-GEF核酸，其中多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

16．根据权利要求12的分离的RGS-GEF核酸，其中多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

17．根据权利要求13的分离的RGS-GEF核酸，其中多肽对G蛋白α亚单位具有特异结合亲和性，或者是对G蛋白α亚单位具有GTP酶激活活性。

18．一种调控G蛋白α亚单位活性的方法，包括给哺乳动物施用有效剂量的权利要求1或4的多肽。

19．一种鉴定或检测抑制或增强单体G蛋白鸟嘌呤核苷酸交换因子与G蛋白α亚单位结合的分子的方法，包括将G蛋白α亚单位或其片段与单体G蛋白核苷酸交换因子或其片段在存在或不存在供试分子的情况下温育，确定供试分子的存在是否抑制或增强单体G蛋白鸟嘌呤核苷酸交换因子与G蛋白α亚单位的结合。

20．一种鉴定或检测抑制或增强GEF对Gα亚单位GTP酶活性的刺激作用的分子的方法，包括将Gαα亚单位或其片段与GEF蛋白或其片段在存在或不存在供试分子的情况下温育，确定供试分子的存在是否抑制或增强GEF蛋白对Gα亚单位GTP酶活性的刺激作用。

21．一种鉴定或检测特异地抑制激活的Gα亚单位对单体G蛋白GEF介导的核苷酸交换的刺激作用的分子的方法，包括进行第一次检测，将激活的Gα亚单位或其片段与GEF蛋白或其片段以及单体G蛋白或其片段在存在或不存在供试抑制剂下温育，进行第二次检测，将GEF蛋白或其片段和单体G蛋白或其片段在存在或不存在供试抑制剂的情况下温育，确定是否供试抑制剂在第一次检测中的抑制作用比供试抑制剂在第二次检测中的抑制作用更强。

22．一种鉴定或检测特异地增强激活的Gα亚单位对单体G蛋白GEF介导的核苷酸交换的刺激作用的分子的方法，包括进行第一次检测，将激活的Gα亚单位或其片段与GEF蛋白或其片段以及单体G蛋白或其片段在存在或不存在供试增强剂条件下温育，进行第二次检测，将GEF蛋白或其片段和单体G蛋白或其片段在存在或不存在供试增强剂的情况下温育，确定是否供试增强剂在第一次检测中的增强作用比供试增强剂在第二次检测中的增强作用更强。

23．一种鉴定或检测模拟激活的Gα亚单位对单体G蛋白GEF介导的核苷酸交换刺激作用的分子的方法，包括鉴定对GEF蛋白的RGS结构域或其片段表现出结合亲和性的供试化合物，将GEF蛋白或其片段与单体G蛋白或其片段在存在或不存在供试化合物的情况下温育，确定供试化合物是否表现出对单体G蛋白GEF介导的核苷酸交换具有刺激作用。

24．一种鉴定或检测模拟GEF蛋白RGS结构域对Gα亚单位GTP酶活性刺激作用的分子的方法，包括鉴定对Gα亚单位表现出结合亲和性的供试化合物，将GTP和Gα亚单位在存在或不存在供试化合物的情况下温育，确定供试化合物是否对Gα亚单位的GTP酶活性具有刺激作用。

25．根据权利要求19、20、21、22、23，或24的方法，其中GEF蛋白选自p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380，和DrhoGEF2。

26．一种在转化的宿主细胞中表达由核酸编码的多肽的方法，包括培养含有权利要求11的核酸的转化的宿主细胞。

27．一种含有权利要求11的核酸的转化的宿主细胞。

28．一种含有权利要求11的核酸的载体。

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