JP2003510048A - 破骨細胞で発現されるｇ−タンパク質レギュレーターであるｒｇｓ１０ｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリー由来の核酸分子を提供する。該核酸分子は、診断方法、スクリーニングアッセイなどの用途や、ハイブリダイゼーションのプローブおよびプライマーとして使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 Ｇ−タンパク質ファミリーは、細胞内の信号発生経路に細胞外レセプターと結
合（link）することによって信号伝達に重要な役割を果す。Ｇタンパク質は、α
、βおよびγサブユニットから構成される。不活性状態では、αサブユニットは
、ＧＤＰに結合する。それらがＧ−タンパク質結合レセプター（リガンドに結合
）によって活性化されると、ＧＤＰの解離および続くＧＴＰの結合を引き起こさ
れ、αサブユニットが活性化される。活性化状態は、αサブユニット内に含まれ
る固有ＧＴＰアーゼ活性がＧＴＰをＧＤＰに加水分解すると終結する（Ｇｏｌｄ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７（２０）：８０２４〜８０３７頁（１９９７年
））。

【０００２】 αサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を活性化することによって、Ｇ−タンパク
質機能を調節する、Ｇ−タンパク質信号発生（ＲＧＳ）タンパク質のレギュレー
ターと称されるタンパク質のファミリーが同定された（ＤｏｈｌｍａｎおよびＴ
ｈｏｒｎｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：３８７１〜３８７４頁（１
９９７年）；Ｋｏｅｌｌｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９巻：
１４３〜１４７頁（１９９７年）；Ｎｅｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７巻：Ｒ３
１〜Ｒ３３頁（１９９７年））。これらのタンパク質は、αサブユニットの活性
化状態の期間を減少させ、Ｇ−タンパク質機能を阻害する。

【０００３】 発明の概要 様々のスクリーニング・アプローチ法を使用して、破骨細胞で選択的に発現さ
れる遺伝子をコードする部分的ｃＤＮＡ配列が同定された。これらのクローンの
１つ（クローン１４０と称する）について、完全長ｃＤＮＡ（ＲＧＳ１０Ｂと称
される）は、破骨細胞腫のライブラリーから同定された。このクローンは、ＲＧ
Ｓ１０として知られた、以前に記述された分子の異型であると思われる１８１個
のアミノ酸ポリペプチドをコードする。ＲＧＳ１０は、Ｇα１ ＧＴＰアーゼ活
性の選択的アクチベーターとして特徴づけられ、したがって、Ｇ−タンパク質信
号発生の阻害剤である（Ｈｕｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８３巻：１７５〜１７７
頁（１９９６年））。ＲＧＳ１０は、進化を通して高度に保存されるＧ−タンパ
ク質阻害剤の大型ファミリーのメンバーである。

【０００４】 ＲＧＳ１０Ｂ配列のアミノ末端は、ＲＧＳ１０のものと区別され、１６個の残
基の内のわずか３個が同一である（図１）。対照的に、残基１７〜１８１は、２
つの分子で同一であり、そしてＲＧＳ１０Ｂは、高度に保存されたＲＧＳドメイ
ンを保有する。さらに、ＲＧＳ１０Ｂの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）も、ＲＧＳ１
０のものと特徴的（unique）であり、ＲＧＳ１０Ｂが、少なくとも２個の新規エ
キソンの選択的スプライシングによって生じるようであることを示す。

【０００５】 ＲＧＳ１０Ｂのアミノ末端に対する９０塩基対プローブを用いて、多組織ノー
ザン解析を行った。ＲＧＳ１０Ｂの１ｋｂ ｍＲＮＡを、破骨細胞腫で非常に強
力に検出したが、腫瘍の基質（stromal ）細胞成分では検出されなかった。ＲＧ
Ｓ１０Ｂ ｍＲＮＡは、ＨＳＢ−２（Ｂリンパ球細胞株）およびＵ９３７（骨髄
性単球細胞株）でわずかに発現された。試験された他の全てのヒト組織および細
胞株は、ＲＧＳ１０Ｂ ｍＲＮＡに対して陰性であった。これらのデータは、Ｒ
ＧＳ１０Ｂが、ヒト破骨細胞で選択的に発現されることを示す。したがって、Ｒ
ＧＳ１０Ｂは、破骨細胞のためのマーカーを提供し、そして重要な調節機能をも
示しうる。ＲＧＳ１０Ｂを阻害することは、それが通常阻害する経路に応じて、
骨吸収をアップレギュレートまたはダウンレギュレートしうる。

【０００６】 したがって、本発明は、配列番号：１；配列番号：１の相補体；配列番号：１
のヌクレオチド１〜４８；配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体；配列
番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１；および配列番号：１のヌクレオチド５
４７〜８３１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離核酸
分子に関する。これらのヌクレオチド配列は、ＲＧＳ１０のものと区別され、そ
してＲＧＳ１０Ｂに特異的なプローブとして利用されうる。

【０００７】 本発明は、配列番号：１；配列番号：１の相補体；配列番号：１のヌクレオチ
ド１〜４８；配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体；配列番号：１のヌ
クレオチド５４７〜８３１；および配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１
の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列から本質的になる単離核酸分
子または該ヌクレオチド配列からなる単離核酸分子にも関する。

【０００８】 本発明は、さらに、配列番号：１；配列番号：１の相補体；配列番号：１のヌ
クレオチド１〜４８；配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体；配列番号
：１のヌクレオチド５４７〜８３１；および配列番号：１のヌクレオチド５４７
〜８３１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と高ストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。本発明は、さらに、配列番号
：１のヌクレオチド配列と実質的に同一であり、かつ配列番号：１のヌクレオチ
ド１〜４８を含有する核酸分子に関する。

【０００９】 本発明は、さらに、選択的ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、配列番
号：１；配列番号：１の相補体；配列番号：１のヌクレオチド１〜４８；配列番
号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体；配列番号：１のヌクレオチド５４７〜
８３１；および配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体からなる群
より選ばれるヌクレオチド配列を含む第２の核酸分子と上記試料を接触させるこ
とを含む、試料中の核酸分子（例えば、ＲＧＳ１０Ｂ）の存在をアッセイする方
法を提供する。

【００１０】 本発明は、調節配列に作動可能に連結された本発明の単離核酸分子を含むベク
ターならびに該ベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。本発明は、核酸分子
の発現に適切な条件下で、本発明の組換え宿主細胞を培養することを含む、単離
核酸分子によってコードされるポリペプチドを作製する方法をも提供する。

【００１１】 本発明は、さらに、本発明の単離核酸分子によってコードされる単離ポリペプ
チドを提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ
酸配列および配列番号：２のアミノ酸１〜１６、またはその部分からなる群より
選ばれるアミノ酸配列を含有する。本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列と実
質的に同一であり、かつ配列番号：２のアミノ酸１〜１６を含むアミノ酸配列を
含む単離ポリペプチドにも関する。

【００１２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、またはその抗
原結合断片に関し、コードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体と試料を
接触させることを含む、試料中の本発明の単離核酸分子によってコードされるポ
リペプチドの存在をアッセイする方法に関する。

【００１３】 本発明は、細胞中でＲＧＳ１０Ｂまたはその活性部分の発現を高め、それによ
りＲＧＳ１０Ｂが、Ｇタンパク質のＧαサブユニットの固有ＧＴＰアーゼ活性を
活性化し、それによりＧタンパク質活性を阻害することを含む、細胞においてＧ
タンパク質機能を阻害する方法にも関する。

【００１４】 本発明は、さらに、上記ＧαサブユニットをＲＧＳ１０Ｂまたはその活性部分
と接触させることを含む、ＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を活性化する方
法に関する。本発明は、さらに、細胞においてＲＧＳ１０Ｂまたはその活性部分
の発現を高めることを含む、細胞中のＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を活
性化する方法に関する。

【００１５】 発明の詳細な説明 本明細書で記述される場合、ＲＧＳ１０ＢをコードするｃＤＮＡは、以下のよ
うにして同定した。第一に、骨のヒト巨大細胞腫は、１）ｃＤＮＡライブラリー
を構築し、２）基質細胞⁺ 、破骨細胞⁺ プローブとして使用される³²Ｐ標識ｃＤ
ＮＡを生じ、そして３）破骨細胞を欠く基質細胞集団を生じる（培養によって）
ために使用された。巨大細胞腫中の破骨細胞の存在は、モノクローナル抗体試薬
を使用し、破骨細胞マーカー５型酒石酸耐性酸ホスファターゼ（tartrate-resis
tant acid phophatase）（ＴＲＡＰ）に対する組織学的染色によって確認され
た。

【００１６】 破骨細胞を欠く基質細胞集団は、巨大細胞腫の細胞を解離し、その後、細胞集
団が均質で線維芽細胞のようになるまで、組織培養中の細胞を成長および継代す
ることによって産生した。培養基質細胞集団は、破骨細胞を含まなかった。その
後、培養基質細胞を、基質細胞⁺ 破骨細胞^{- 32}Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作製す
るために使用された。

【００１７】 その後、骨の巨大細胞腫から作製したｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡプロ
ーブとのハイブリダイゼーションについて二連でスクリーニングされた。１つの
スクリーニングは、巨大細胞腫ｃＤＮＡプローブ（基質細胞⁺ 、破骨細胞⁺ ）を
用いて行われる一方で、２度目のスクリーニングは、培養された基質細胞ｃＤＮ
Ａプローブ（基質細胞⁺ 、破骨細胞^- ）を用いて行われた。基質細胞⁺ 、破骨細
胞^- プローブにはハイブリダイズしない基質細胞⁺ 、破骨細胞⁺ プローブに対す
るハイブリダイゼーションは、クローンが、破骨細胞によって特徴的または選択
的に発現される核酸配列を含むことを示した。選択したクローンは、破骨細胞腫
ライブラリーをスクリーニングし、そして完全長ｃＤＮＡ配列を同定するために
使用された。本明細書で記述される通り、選択したクローンの内の１つ（クロー
ン１４０）は、ＲＧＳ１０Ｂと称される完全長ｃＤＮＡ配列を同定するために使
用された。

【００１８】 本発明は、ゲノムＤＮＡを含む、ＲＧＳ１０Ｂ ＤＮＡを同定するために有用
な核酸プローブの作製および同定について有用性を示す。本明細書で記述される
核酸分子、ポリペプチドおよび抗体も、十分に確立された技術を用いて破骨細胞
を同定するために有用である。本発明の核酸分子は、遺伝子治療にも有用である
。例えば、それらは、異常型ＲＧＳ１０Ｂ遺伝子産物の例えば破骨細胞での発現
を改変させるか、またはＲＧＳ１０Ｂの異常型発現を修正するために使用されう
る。ここに記述される配列は、さらに、例えば、破骨細胞でない細胞中では通常
起らないＲＧＳ１０Ｂ発現を引起すために使用されうる。

【００１９】 本発明は、配列番号：１；配列番号：１の相補体；配列番号：１のヌクレオチ
ド１〜４８；配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体；配列番号：１のヌ
クレオチド５４７〜８３１；および配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１
の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する
。これらの核酸配列は、ＲＧＳ１０のものと区別され、そしてＲＧＳ１０Ｂに特
異的なプローブとして利用されうる。本発明は、配列番号：１；配列番号：１の
相補体；配列番号：１のヌクレオチド１〜４８；配列番号：１のヌクレオチド１
〜４８の相補体；配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１；および配列番号
：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチ
ド配列から本質的になる単離核酸分子または該ヌクレオチド配列からなる単離核
酸分子にも関する。

【００２０】 適宜、本発明の単離核酸分子は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのようなＤＮＡでありうる。ＤＮＡ分子は、二本鎖または一
本鎖でありうる。一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コーディングもしくはセンス鎖
、または非コーディングもしくはアンチセンス鎖のいずれかでありうる。核酸分
子としては、遺伝子のコーディング配列の全部または部分が挙げ得て、そしてさ
らに、イントロンおよび非コーディング３’および５’配列（例えば、調節配列
を含む）のようなさらなる非コーディング配列を包含する。さらに、核酸分子は
、マーカー配列、例えばポリペプチドの単離または精製を補助するポリペプチド
をコードする配列に融合されうる。このような配列としては、それに限定されな
いが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をコー
ドするもの、およびインフルエンザ由来のヘマグルチンＡ（ＨＡ）ポリペプチド
マーカーをコードするものが挙げられる。

【００２１】 ここで使用される場合、「単離」核酸分子は、通常天然で該核酸分子に隣接す
る核酸から分離されるものである。ゲノムＤＮＡに関して、語句「単離」は、天
然でゲノムＤＮＡが会合している染色体から分離される核酸分子をいう。例えば
、単離核酸分子は、該核酸分子が誘導される細胞のゲノムＤＮＡで該核酸分子と
隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１
ｋｂより少ないヌクレオチドを含有しうる。

【００２２】 さらに、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子のような本発明の単離核酸分子は、他の細
胞性材料、または組換え技術によって産生される場合は培養培地、または化学的
に合成される場合に化合物前駆体もしくは他の化合物を実質的に含まない可能性
がある。しかし、核酸分子は、他のコーディング配列または調節配列に融合して
いることもあり得るが、なお単離されたとみなしうる。ある種の場合には、単離
された材料は、組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出物）、バッファーシステ
ムまたは試薬混合物の一部を構成する。他の環境で、材料は、例えば、ＰＡＧＥ
またはＨＰＬＣのようなカラムクロマトグラフィーによって測定される場合に本
質的に均質になるまで精製されうる。好ましくは、単離核酸分子は、存在する全
ての巨大分子種の少なくとも約５０、８０または９０％（モル基準で）を包含す
る。

【００２３】 さらに、ベクターに含まれる組換えＤＮＡは、本明細書で使用される「単離」
の定義に含まれる。さらに、単離核酸分子としては、溶液中の部分的または実質
的に精製されたＤＮＡ分子ならびに異種宿主細胞での組換えＤＮＡ分子が挙げら
れる。「単離」核酸分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボおよびインビトロＲ
ＮＡ転写物をも包含する。

【００２４】 １つの実施形態では、バリアントが、配列番号：１、配列番号：１の相補体、
配列番号：１のヌクレオチド１〜４８、配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の
相補体、配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、およびヌクレオチド５４
７〜８３１の相補体から選択されるヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配
列に高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリ
ダイゼーションのための）下でハイブリダイズする。

【００２５】 本発明は、さらに、配列番号：１、配列番号：１の相補体、配列番号：１のヌ
クレオチド１〜４８、配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、配列番号
：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および配列番号：１のヌクレオチド５４７
〜８３１の相補体から選択されるヌクレオチド配列にストリンジェント条件、好
ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。

【００２６】 核酸分子に対するストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者に
十分に知られており、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニュー
ヨーク（１９９８年）、２．１０．１〜２．１０．１６頁および６．３．１〜６
．３．６頁のような標準テキストに見ることができ、そしてその教示は、参照に
より本明細書に組込まれる。当業者によって理解される通り、正確な条件は、経
験的に決定され得て、そしてイオン強度、温度およびホルムアミドのような不安
定化剤またはＳＤＳのような変性剤の濃度による。所望のハイブリダイゼーショ
ン条件を決定する上で考慮される他の因子としては、核酸配列の長さ、塩基組成
、ハイブリダイズ配列の間のミスマッチ率、および他の非同一配列内の配列のサ
ブセットの発生の頻度が挙げられる。したがって、同等の条件は、２つの核酸分
子の間の類似の程度の同一性または類似性を維持しながら、１つまたはそれ以上
のこれらのパラメーターを変化させることによって決定されうる。典型的には、
互いに少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なく
とも約９０％または少なくとも約９５％またはそれ以上同一な配列が、互いにハ
イブリダイズされたままであるような条件が使用される。１つの制限されない例
では、核酸分子は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳ
Ｃ）中でハイブリダイズさせた後、室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１
回またはそれ以上の低ストリンジェント洗浄、または４２℃で０．２×ＳＳＣ／
０．１％ＳＤＳで１回またはそれ以上の中程度のストリンジェント洗浄、または
高ストリンジェントでは６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄される
。

【００２７】 本発明は、さらに、配列番号：１のヌクレオチド配列に実質的に同一（好まし
くは、約８５パーセントより多く、より好ましくは約９０パーセントより多く、
そしてより好ましくは約９５パーセントより多い同一性）であり、そして配列番
号：１のヌクレオチド１〜４８を含む酢酸分子に関する。２つのヌクレオチド配
列またはアミノ酸配列の同一性の割合は、最適な比較目的のために配列を並置す
ること（例えば、ギャップが、第一配列の配列に導入されうる）によって決定さ
れうる。その後、対応の位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸が、比較され、そ
して２つの配列の間の同一性の割合は、配列によって共有される同一位置の数の
関数である（すなわち、同一率（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）。
ある種の実施形態では、比較目的のために並置される配列の長さは、対照配列の
少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも
６０％、そしてより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％の長さ
である。２つの配列の実際の比較は、例えば、数学的アルゴリズムを用いて、周
知の方法によって遂行されうる。そのような数学的アルゴリズムの好ましい、制
限されない例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁（１９９３年）で記述される。このような
アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
、２５巻：３８９〜３４０２頁（１９９７年）で記述される通りＮＢＬＡＳＴお
よびＸＢＬＡＳＴプログラム（２．０版）に組込まれている。ＢＬＡＳＴおよび
ギャップ（Ｇａｐｐｅｄ）・ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれの
プログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルト・パラメーターが使用されう
る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照。１つの
実施形態では、配列比較についてのパラメーターは、スコア＝１００、語長＝１
２に設定されうるか、または変更（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）しうる。

【００２８】 配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、制限され
ない例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）のアル
ゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＣＧＣ配列並置ソフトウエアパッ
ケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に組込まれている。アミ
ノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０
重量残渣表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティー１２、およびギ
ャップペナルティー４が使用される。配列解析のためのさらなるアルゴリズムは
、当該技術分野で知られており、そしてＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ
（１９９４年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１０巻：３〜５頁に
記述されるようなＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；およびＰｅａｒｓｏｎおよび
Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年）ＰＮＡＳ、８５巻：２４４４〜８頁に記述されるよ
うなＦＡＳＴＡが挙げられる。

【００２９】 別の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性の割合は、Ｂｌｏｓｓｏ
ｍ６３マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いたＣＧＣ
ソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）
中のＧＡＰプログラムならびに１２、１０、８、６または４のギャップ重さ(gap
weight) 、および２、３または４の長さ重量(length weight) を用いて達成
されうる。さらに別の実施形態では、２つの核酸配列の間の同一性の割合は、ギ
ャップ重さ５０および長さ重量３を用いて、ＣＧＣソフトウエアパッケージ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムを用い
て達成されうる。

【００３０】 本発明は、配列番号：１、配列番号：１の相補体、配列番号：１のヌクレオチ
ド１〜４８、配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、配列番号：１のヌ
クレオチド５４７〜８３１、および配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１
の相補体から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸配列に、高ストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする断片または部分を含む単離核酸分子をも提供する
。本発明の核酸断片は、長さ、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１８
、２０、２３または２５ヌクレオチドであり、そして３０、４０、５０、１００
、２００またはそれ以上のヌクレオチドでありうる。長い断片、例えば、本明細
書で記述される抗原性タンパク質またはポリペプチドをコードする長さ３０また
はそれ以上のヌクレオチドは有用である。

【００３１】 関連局面では、本発明の核酸分子は、ここに記述されるもののようなアッセイ
でのプローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」は、塩基特異的
様式で、核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。こ
のようなプローブとしては、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、１
４９７〜１５００頁（１９９１年）で記述されるようなポリペプチド核酸が挙げ
られる。典型的には、プローブは、配列番号：１、配列番号：１の相補体、配列
番号：１のヌクレオチド１〜４８、配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補
体、配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および配列番号：１のヌクレ
オチド５４７〜８３１の相補体から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子
の少なくとも約１５、典型的には約２０〜２５、そしてより典型的には約４０、
５０または７５の連続したヌクレオチドに、高ストリンジェント条件下でハイブ
リダイズするヌクレオチド配列の領域を包含する。プローブは、好ましくは、ヌ
クレオチド配列にハイブリダイズする分子の能力を妨害しない、該分子の片方ま
たは両方の末端に別のヌクレオチドをも包含しうる。より典型的には、プローブ
は、さらに、標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子
を含有する。

【００３２】 ここで使用される場合、語句「プライマー」は、周知の方法（例えば、ＰＣＲ
、ＬＣＲ）を用い、鋳型指向性ＤＮＡ合成の開始の時点として作用する一本鎖オ
リゴヌクレオチドをいい、そしてここに記述されるものに限定されないがそれを
含めたものが挙げられる。プライマーの適切な長さは、具体的な用途に依存する
が、しかし、典型的には、約１５から３０ヌクレオチドの範囲である。

【００３３】 上に記述されるもののような本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術
および配列番号：１で提供される配列情報を用いて同定および単離されうる。例
えば、核酸分子は、配列番号：１、配列番号：１の相補体、配列番号：１のヌク
レオチド１〜４８、配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、配列番号：
１のヌクレオチド５４７〜８３１、および配列番号：１のヌクレオチド５４７〜
８３１の相補体で提供される配列の内の１つまたはそれ以上に基づいて設計され
る合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって
増幅および単離されうる。概略は、ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅についての原理およ
び応用（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｈ．
Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、フリーマン・プレス、ニューヨーク州、ニューヨーク、１
９９２年）；ＰＣＲプロトコール：方法および応用についての指針（ＰＣＲ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓら編、アカデミック・プレス、カリフォルニア
州サンディエゴ、１９９０年）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、１９巻：４９６７頁（１９９１年）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１巻：１７頁（１９９１
年）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬプレス、オックスフォード）；
および米国特許第４，６８３，２０２号参照。核酸分子は、鋳型としてｃＤＮＡ
、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いて増幅され、適切なベクターにクローニン
グされ、そしてＤＮＡ配列解析によって特徴づけられうる。

【００３４】 他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａ
ｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻：５６０頁（１９８９年）、Ｌａｎｄｅｇ
ｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７頁（１９８８年）参照）、転写
増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：
１１７３（１９８９年））、および自家配列複製（self-sustained sequence re
plication ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、８７巻：１８７４（１９９０年）および核酸基本の配列増幅（nucleic ac
id based sequence amplification ）（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。後者の２つ
の増幅方法は、等温転写に基づいた等温反応を伴い、そしてそれは、それぞれ、
約３０または１００対１の比で、増幅産物として一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）お
よび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を生じる。

【００３５】 増幅ＤＮＡは、放射性標識され得、破骨細胞、例えばヒト破骨細胞に由来する
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブ、ｚａｐ発現におけ
るｍＲＮＡ、ＺＩＰＬＯＸまたは他の適切なベクターとして使用されうる。対応
するクローンは、単離され得て、ＤＮＡは、インビボ切除後に得られ、クローン
化挿入物は、適切な分子量のタンパク質をコードする正しい読み枠を同定ための
、当該技術分野で認識された方法により、一方向または両方向で配列決定されう
る。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接解析は、市販で入手で
きる周知の方法を用いて達成されうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クロ
ーニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（２版、ＣＳＨＰ、ニューヨーク、１９８９
年）；Ｚｙｓｋｉｎｄら、組換えＤＮＡ実験室マニュアル（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（アカデミック・プレス
、１９８８年）参照。これらまたは類似の方法を用いて、タンパク質およびタン
パク質をコードするＤＮＡは、単離され、配列決定され、そしてさらに特徴づけ
られうる。

【００３６】 本発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号：１のヌクレオチド配列、配列番
号：１の相補体、または配列番号：１のヌクレオチド１〜４８のような、その部
分、配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、配列番号：１のヌクレオチ
ド５４７〜８３１、および配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体
を用いて設計され得て、そして当該技術分野で知られる手順を用いて、化学的合
成および酵素的連結反応を用いて構築しうる。例えば、アンチセンス核酸分子
（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドまたは分
子の生物学的安定性を増大するため、もしくはアンチセンスとセンス核酸、例え
ばホスホロチオエート誘導体とアクリジン置換ヌクレオチドとの間で形成される
二本鎖の物理的安定性を増大するために設計された種々に修飾されたヌクレオチ
ドを用いて、化学的に合成されうる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、核酸
分子が、アンチセンス方向でサブクローニングされた（すなわち、挿入核酸分子
から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向となる）発
現ベクターを使用して生物学的に作製しうる。

【００３７】 一般に、単離核酸配列は、サザンゲルでの分子量マーカーとして、そして関連
する遺伝子の位置の地図作成をするために標識される染色体マーカーとして使用
されうる。核酸配列は、遺伝性疾病を同定するために患者における内因性ＤＮＡ
配列と比較するために、そして関連ＤＮＡ配列をハイブリダイズおよび発見する
か、または試料から既知配列を減じる(subtract out)ようなプローブとしても
使用されうる。核酸配列は、さらに、遺伝的フィンガープリンティングのための
プライマーを誘導し、ＤＮＡ免疫化技術を用いて抗タンパク質抗体を生じさせる
ため、および抗ＤＮＡ抗体を生じるか、または免疫応答を引出すための抗原とし
て使用されうる。さらに、本発明のヌクレオチド配列は、解析、特徴付け、また
は治療用途のための組換えタンパク質を同定および発現するために、または対応
タンパク質が、構成的に、組織分化の間中、または病気に罹った状態のいずれか
で発現される組織のためのマーカーとして使用されうる。

【００３８】 本発明の別の態様は、配列番号：１および配列番号：１の相補体（またはその
部分）からなる群より選ばれる核酸分子を含む核酸構築物に関連する。構築物は
、本発明の配列が、センスまたはアンチセンス方向に挿入されたベクター（例え
ば、発現ベクター）を包含する。本明細書で使用される場合、語句「ベクター」
は、それが結合される別の核酸を輸送する能力のある核酸分子のことをいう。ベ
クターの１つの型は、「プラスミド」であり、別のＤＮＡセグメントが連結され
うる環状二本鎖ＤＮＡループのことをいう。別の型のベクターは、別のＤＮＡセ
グメントが連結されうるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが
導入される宿主細胞で自律複製の能力がある（例えば、複製の細菌性起点を有す
る細菌性ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例え
ば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入によって宿主細胞
のゲノムに組込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定
のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に結合される遺伝子の発現を指
示する能力がある。一般に、組換えＤＮＡ技術での有益な発現ベクターは、しば
しば、プラスミドの形態にある。しかし、本発明は、等価の機能の役割を果すウ
イルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデ
ノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのかかる他の形態を含むことが意図され
る。

【００３９】 本発明の好ましい組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸分子の発現に
適する形態の本発明の核酸分子を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現の
ために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される１つまたはそれ以上の調節
配列を含むことを意味し、それは発現されるべき核酸配列に作動可能に連結され
る。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」は、目的のヌクレオチド
配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系で、またはベ
クターが宿主細胞に導入されるときに宿主細胞で）を可能にする手段で調節配列
（群）に連結されることを意味することが意図される。語句「調節配列」は、プ
ロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シ
グナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック・プレス、カリフォル
ニア州サンディエゴ、（１９９０年）で記述されている。調節配列としては、多
くの型の宿主細胞のヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定
の宿主細胞（例えば、組織特異的調節配列）でのみ核酸配列の発現を指示するも
のが挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、
および望まれるタンパク質の発現レベルのような因子に依存しうることは、当業
者に認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、それにより
本明細書に記述される核酸分子によってコードされる融合タンパク質またはペプ
チドを含むタンパク質またはペプチドを産生し得る。

【００４０】 本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞、例えば大腸菌のよ
うな細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いた）、酵母細胞
または哺乳類細胞で本発明のポリペプチドの発現のために設計されうる。適切な
宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、上記でさらに検討される。選択的には、組換え発
現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用
いて、インビトロで転写され、翻訳されうる。

【００４１】 本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関
する。語句「宿主」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で相互変換可能に使
用される。このような語句は、特定の対象細胞に対するのみでなくこのような細
胞の子孫または潜在的子孫こともいうことが理解される。特定の修飾は、突然変
異または環境の影響のいずれかにより世代を継ぐ上で起りうるので、このような
子孫は、実際に、親細胞と同一でないであろうが、しかし、なお、本明細書に使
用される語句の範囲内に含まれる。

【００４２】 宿主細胞は、いずれかの原核細胞または真核細胞でありうる。例えば、本発明
の核酸分子は、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞
（チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など）で発現
されうる。他の適切な宿主細胞が、当業者に知られている。

【００４３】 ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して、原核細胞ま
たは真核細胞に導入されうる。本明細書で使用される場合、語句「形質転換」お
よび「形質移入」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共同沈殿、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン指向性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレー
ションを含めて、外来核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための
当該技術分野で認識された技術をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換ま
たは形質移入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、および他
の実験室マニュアルに見出しうる。

【００４４】 哺乳類細胞の安定な形質移入に対して、使用される発現ベクターおよび形質移
入技術によって、細胞のほんの小さな分画が、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組
み込みうることが分かる。これらの組込み体を同定および選択するために、選択
マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性について）をコードする遺伝子は、一
般に、目的の遺伝子と一緒に、宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーと
しては、Ｇ４１８、ヒグロマイシン(hygromycin)およびメトトレキサートのよう
な薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核
酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクターで宿主細胞に導入されうるか、また
は別のベクターで導入されうる。導入された核酸分子で安定に形質移入された細
胞は、薬物選択性（例えば、選択マーカー遺伝子を組込んだ細胞は生存する一方
で、他の細胞は死滅する）によって同定されうる。

【００４５】 培養での原核宿主細胞または真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、本発
明のポリペプチドを産生（すなわち、発現）するために使用されうる。したがっ
て、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いてポリペプチドを産生する方法
を提供する。１つの実施形態では、その方法は、ポリペプチドが産生されるよう
な適切な培地で本発明の宿主細胞（本発明のポリペプチドをコードする組換え発
現ベクターが導入されている）を培養することを包含する。別の実施形態では、
その方法は、さらに、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離することを包
含する。

【００４６】 本発明の宿主細胞は、非ヒト・トランスジェニック動物を産生するためにも使
用されうる。例えば、１つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸
分子が導入された受精卵細胞または胚性幹細胞である。その後、このような宿主
細胞は、外因性ヌクレオチド配列がゲノムに導入された非ヒト・トランスジェニ
ック動物、または内因性核酸配列が改変された相同組換え動物を作り出すことに
使用されうる。このような動物は、ヌクレオチド配列および配列によってコード
されるポリペプチドの機能および／または活性を研究するために、そしてそれら
の活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明
細書で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１つまた
はそれ以上が、導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好
ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物
の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、トリおよび両生
類が挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生し、そして成熟
動物のゲノムで残り、それによりトランスジェニック動物の１つまたはそれ以上
の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指示する、細胞の
ゲノムに組込まれる内因性ＤＮＡである。本明細書で使用される場合、「相同組
換え動物」は、内因性遺伝子が、動物の発生の前に、動物の細胞、例えば動物の
胚性細胞に導入される内因性遺伝子と外因性ＤＮＡ分子の間の相同組換えによっ
て改変された、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはマウスであ
る。

【００４７】 胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、特
にマウスのような動物を発生する方法は、当該技術分野で常套になり、そして例
えば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、米国特
許第４，８７３，１９１号で、そしてＨｏｇａｎ、マウス胚の操作（Ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ）（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、１９８６年）に記述されている。相同組換えベクターを構築する方法お
よび相同組換え動物は、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉ
ｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻：８２３〜８２９頁で、
そしてＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１３５４号、ＷＯ９１／０１１４０号、ＷＯ
９２／０９６８号、およびＷＯ９３／０４１６９号でさらに記述される。本明細
書で記述される非ヒト・トランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕ
ｔら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ、３８５巻：８１０〜８１３頁およびＰＣＴ公
開番号ＷＯ９７／０７６６８号およびＷＯ９７／０７６６９号で記述される方法
によって産生されうる。

【００４８】 本発明は、本発明の核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドおよびバ
リアントおよびその断片をも提供する。例えば、上に記述される通り、ヌクレオ
チド配列は、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡをクローン化および発
現するプライマーを設計するために使用されうる。

【００４９】 本明細書で使用される場合、ポリペプチドは、それが組換えおよび非組換え細
胞から単離されるときに細胞の材料を実質的に含まないか、またはそれが化学的
に合成されるときに化合物前駆体または他の化合物を含まない場合に、「単離」
または「精製」されると言われる。しかし、ポリペプチドは、それが、細胞内で
通常に会合(associated)されない別のポリペプチドに連結されうるが、「単離」
または「精製」されたものでありうる。

【００５０】 本発明のポリペプチドは、等質になるまで精製されうる。しかし、ポリペプチ
ドが、等質になるまで精製されない調製品が有用であることは理解される。重要
な特徴は、調製品が、他の成分の相当量の存在下でさえ、そのポリペプチドの所
望の機能を可能にすることである。したがって、本発明は、種々の程度の純度を
包含する。１つの実施形態では、ポリペプチドは、細胞の材料を実質的に含まず
、約３０％（乾燥重量で）未満の他のタンパク質（すなわち、混入タンパク質）
、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５
％未満の他のタンパク質を有するポリペプチド調製品を含む。

【００５１】 ポリペプチドが組換え的に産生される場合、それはまた培養培地を実質的に含
まない可能性があり、すなわち、培養培地は、タンパク質製品の約２０％未満、
約１０％未満、または約５％未満の容積を表わす。１つの実施形態では、ポリペ
プチドは、化合物前駆体または他の化合物を実質的に含まず、それの合成に関与
される化合物前駆体または他の化合物から分離されるポリペプチドの調製品を含
む。１つの実施形態では、言語「化合物前駆体または他の化合物を実質的に含ま
ない」は、約３０％（乾燥重量で）未満の化合物前駆体または他の化合物、約２
０％未満の化合物前駆体または他の化合物、約１０％未満の化合物前駆体または
他の化合物、または約５％未満の化合物前駆体または他の化合物を有するポリペ
プチドの調製品を含む。

【００５２】 １つの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号：１および配列番号：１のヌ
クレオチド１〜４８およびその相補体および部分、例えば配列番号：２またはそ
の部分（例えば、配列番号：２のアミノ酸１〜１６）からなる群より選ばれるヌ
クレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を包含する。
しかし、配列が、ＲＧＳ１０Ｂ配列（例えば、配列番号：２のアミノ酸１〜１６
）の特徴的特性を含む場合には、本発明は、配列バリアントをも包含する。バリ
アントとしては、生物の同じ遺伝子座によってコードされる実質的に相同なタン
パク質、すなわち、対立遺伝子バリアントが挙げられる。バリアントは、生物で
の他の遺伝子座に由来するが、配列番号：１およびその相補体および部分からな
る群より選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペ
プチドに実質的に相同性を有するタンパク質をも包含する。バリアントは、これ
らのポリペプチドと実質的に相同または同一であるが、別の生物に由来するタン
パク質、すなわち、オーソログ(ortholog)をも含む。バリアントは、化学的合成
によって生成されるこれらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるタン
パク質も挙げられる。バリアントは、組換え方法によって産生されるこれらのポ
リペプチドに実質的に同一であるタンパク質も挙げられる。

【００５３】 ２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列の相同性または同一性の割合を
測定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャッ
プが、１つのタンパク質または核酸分子の配列で、他のタンパク質または核酸分
子との最適な整列のために導入されうる）。その後、対応のアミノ酸位置または
ヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。１つの配列
での位置が、他の配列の対応する位置の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドに
よって占められる場合、分子は、その位置に相同である。本明細書で使用される
場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と
等価である。２つの配列の間の相同性の割合は、配列によって共有される同一の
位置の数の関数である（すなわち、相同性または同一性の割合は、同一の位置の
数／位置の総数の１００倍に等しい）。

【００５４】 本発明は、低い程度の同一性を有するが、本発明の核酸分子によってコードさ
れるポリペプチドによって行われるのと同じ機能の１つまたはそれ以上を行うた
めに十分な類似性を有するポリペプチドをも包含する。類似性は、保存アミノ酸
置換によって測定される。このような置換は、ポリペプチドでの所定のアミノ酸
を同様の特徴の別のアミノ酸によって置換するものである。保存的置換は、表現
型でサイレントであるようである。保存的置換として一般に見られるのは、脂肪
族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の、１つのものから別のも
のへの置換；水酸残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧ
ｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓおよ
びＡｒｇの相互交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間での置換である。ア
ミノ酸交換が、表現型でサイレントのようであることに関する指針は、Ｂｏｗｉ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）で見出
される。

【００５５】 バリアントポリペプチドは、１つまたはそれ以上の置換、欠失、挿入、逆位、
融合、および切断またはこれらのいずれかの組合せによってアミノ酸配列が異な
りうる。さらに、バリアントポリペプチドは、十分に機能性があるか、または１
つまたはそれ以上の活性で機能を欠く可能性がある。十分に機能性のあるバリア
ントは、典型的に、保存的変異、または非決定的(non-critical)残基もしくは非
決定的領域での変異のみを含む。機能性のあるバリアントは、機能において変化
がないか、またはわずかな変化を生じる類似のアミノ酸の置換をも含みうる。あ
るいは、このような置換は、ある程度まで機能にポジティブまたはネガティブに
影響を及ぼしうる。非機能性バリアントは、典型的に、１つまたはそれ以上の非
保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、または切断、または決定的残基または
決定的領域における置換、挿入、逆位、または欠失を含む。

【００５６】 機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン−走査
突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１
〜１０８５頁（１９８９年））のような当該技術分野で知られる方法によって確
認されうる。後者の手段は、分子中の各々の残基で単一アラニン突然変異を導入
する。その後、生じる突然変異分子を、インビトロでの生物学的活性、またはイ
ンビトロ増殖活性について試験した。ポリペプチド活性について重要である部位
は、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．、２２４巻：８９９〜９０４頁（１９９２年）；ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２５５巻：３０６〜３１２頁（１９９２年））のような構造的解析に
よっても決定されうる。

【００５７】 本発明は、ポリペプチドの部分および本発明のポリペプチドの断片をも包含す
る。本明細書で使用される場合、語句「断片」および「部分」は、等価であるこ
とが意図される。断片は、配列番号：１またはその部分およびその相補体を含む
核酸分子によってコードされるポリペプチドから誘導されうる。しかし、本発明
は、本明細書に記述されるポリペプチドの全てのバリアントの断片をも包含する
。本明細書で使用される場合、断片または部分は、少なくとも６個の隣接アミノ
酸を含む。有用な断片としては、ポリペプチドの生物学的活性の１つまたはそれ
以上を保有するもの、並びにポリペプチド特異的抗体を生じる免疫原として使用
されうる断片が挙げられる。

【００５８】 生物学的に活性な断片（例えば、６、９、１２、１５、１６、２０、３０、３
５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上の長さのアミ
ノ酸であるペプチド）は、周知の方法を用いてポリペプチド配列の解析によって
同定されたドメイン、セグメント、またはモチーフ、例えばシグナルペプチド、
細胞外ドメイン、１つまたはそれ以上の膜貫通セグメントまたはループ、リガン
ド結合領域、ジンクフィンガードメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、アシル化部位、
グリコシル化部位、またはリン酸化部位を包含しうる。

【００５９】 断片は、はっきり分離されうるか（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合さ
れていない）、またはより大きなポリペプチド内にありうる。さらに、数種の断
片が、単一のより大きなポリペプチド内に含まれうる。１つの実施形態では、宿
主での発現について設計される断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合さ
れる異種のプレ−およびプロ−ポリペプチド領域、および断片のカルボキシル末
端に融合される別の領域を有しうる。

【００６０】 したがって、本発明は、キメラまたは融合タンパク質を提供する。これらは、
ポリペプチドに実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動
可能に結合される本発明のポリペプチドを包含する。「作動可能に結合した」は
、ポリペプチドタンパク質および異種タンパク質が、インフレームで融合される
ことを示す。異種タンパク質は、ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合
されうる。１つの実施形態では、融合タンパク質は、本質的にはポリペプチドの
機能に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質は、ポリペプチド配列がＧＳ
Ｔ配列のＣ−末端に融合されるＧＳＴ−融合タンパク質でありうる。他の型の融
合タンパク質としては、それに制限されないが、酵素的融合タンパク質、例えば
β−ガラクトシダーゼ融合、酵母２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリ−Ｈｉｓ融
合およびＩｇ融合が挙げられる。このような融合タンパク質、特にポリ−Ｈｉｓ
融合は、組換えポリペプチドの精製を促進しうる。ある種の宿主細胞（例えば、
哺乳類宿主細胞）では、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル
配列を用いることによって増大されうる。したがって、別の実施形態では、融合
タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。

【００６１】 ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６５ ５３３号は、免疫グロブリン定常領域の種々の部分を
含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃは治療および診断で有用であり、したがっ
て、例えば、改善された薬物動態特性（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２号）をもた
らす。薬剤の発見において、例えば、ヒトタンパク質は、アンタゴニストを同定
する高処理量スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合された。Ｂ
ｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉ
ｔｉｏｎ、８巻：５２〜５８頁（１９９５年）およびＪｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７
０、１６：９４５９〜９４７１頁（１９９５年）。したがって、本発明は、本発
明のポリペプチドおよび免疫グロブリンの種々のサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖および軽鎖の定常領域の種々の部分を含む可溶性融合タ
ンパク質をも包含する。

【００６２】 キメラまたは融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技術によって産生されうる
。例えば、様々のタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を、従来の技術によっ
てインフレームで一緒に連結させる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化
ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成されうる。代替的に、核酸断片の
ＰＣＲ増幅は、２つの連続的核酸断片の間の相補的オーバーハングを生じるアン
カープライマーを用いて行われえ、それは続いてアニーリングされ、そして再増
幅されて、キメラ核酸配列を生じうる（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２年参
照）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）をすでにコードする多く
の発現ベクターが、市販で入手できる。本発明のポリペプチドをコードする核酸
分子は、融合部分が、ポリペプチドタンパク質にインフレームで連結されるよう
な発現ベクターにクローニングされうる。

【００６３】 単離ポリペプチドは、破骨細胞からのようなそれを自然に発現する細胞から精
製されえ、それ（組換え体）を発現するために改変された細胞から精製されえ、
または既知タンパク質合成方法を用いて合成されうる。１つの実施形態では、タ
ンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、ポリペプチドをコ
ードする核酸分子が発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターが宿主細胞
に導入され、そしてタンパク質が宿主細胞で発現される。その後、タンパク質は
、標準タンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって細胞から単離さ
れうる。

【００６４】 一般に、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野で認識され
た方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの、または分子ふるいゲル濾過カラム
での分子量マーカーとして使用されうる。本発明のポリペプチドは、抗体を生じ
るか、または免疫応答を引出すために使用されうる。ポリペプチドは、生物体液
中でそれが結合するタンパク質または分子（例えば、レセプターまたはリガンド
）のレベルを定量的に測定するアッセイで、試薬、例えば標識試薬としても使用
されうる。ポリペプチドは、組織分化の間に構築的に、または疾患状態でのいず
れかで、対応するタンパク質が優先的に発現される細胞および組織についてのマ
ーカーとしても使用されうる。ポリペプチドは、例えば相互作用トラップアッセ
イでのように、対応する結合相手、例えばレセプターまたはリガンドを単離する
ために、そして結合相互作用のペプチドまたは小型分子アンタゴニストもしくは
アゴニストについてスクリーニングするために使用されうる。

【００６５】 別の局面では、本発明は、例えば、配列番号：１の全部または部分を含む核酸
分子によってコードされるアミノ酸配列を有する、本発明のポリペプチドおよび
ポリペプチド断片に対する抗体を提供する。本明細書で使用される場合、語句
「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な
部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子のことをいう
。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドまたはその
断片に結合するが、試料、例えば生物学的試料中で他の分子に実質的に結合しな
い分子であり、そしてそれは、ポリペプチドを当然含む。免疫グロブリン分子の
免疫学的に活性な部分の例は、抗体をペプシンのような酵素によって処理するこ
とによって発生されうるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）₂ 断片が挙げられる。本
発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナル
抗体を提供する。本明細書で使用される場合、語句「モノクローナル抗体」また
は 「モノクローナル抗体組成物」は、本発明のポリペプチドの特定のエピトー
プと免疫反応しうる１種のみの抗原結合部位を含む抗体分子の集団のことをいう
。したがって、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する本発明の特定
のポリペプチドについての単一結合親和性を典型的に示す。

【００６６】 ポリクローナル抗体は、所望の免疫原、例えば本発明のポリペプチドまたはそ
の断片で適切な対象を免疫化することによって上に記述される通り作製されうる
。免疫された対象での抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いた固相酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準技術によって時間に対して監視されうる
。所望の場合、ポリペプチドに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば血液か
ら）単離され得て、そしてさらに、ＩｇＧ分画を得るためのプロテインＡクロマ
トグラフィーのような周知の方法によって精製される。免疫化の後の適切な時点
で、例えば抗体力価が最高である場合、抗体産生細胞は、対象から得ることがで
き、そしてＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、
２５６巻：４９５〜４９７頁によって最初に記述されたハイブリドーマ技術、ヒ
トＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１
９８５年）、「モノクローナル抗体および癌療法」（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、Ａｌａｎ Ｒ
，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）またはトリオーマ技術のような標準技術
によってモノクローナル抗体を作製するために使用されうる。ハイブリドーマを
産生する技術は周知である（一般に、「免疫学における最近のプロトコール」（
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９９
４年）、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ，インク
．、ニューヨーク州ニューヨーク、参照）。簡潔には、不死化細胞株（典型的に
、骨肉腫）を、上に記述されるような免疫原で免疫化された哺乳動物から得られ
るリンパ球（典型的に、脾臓細胞）に融合させ、生じたハイブリドーマ細胞の培
養上清を、スクリーニングして、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。

【００６７】 リンパ球および不死化細胞株を融合するために使用される多くの周知のプロト
コールのいずれかは、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を発生
させる目的のために使用されうる（例えば、「免疫学における最近のプロトコー
ル」、上記；Ｇａｌｆｒｅら（１９７７年）Ｎａｔｕｒｅ、２６６巻：５５０５
２頁；Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、モノクローナル抗体で：生物学的解析における
新たな次元（Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｓｅｓ）、プレナム・パブリッシング，コープ．、ニューヨーク州ニ
ューヨーク（１９８０年）；およびＬｅｎｅｒ（１９８１年）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４巻：３８７〜４０２頁参照）。さらに、当業者は、有用
でもあるような方法の多くの変動があることを理解するだろう。

【００６８】 モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ、本発明のポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体を作製する代替手段は、ポリペプチドを用いて組換えコンビナト
リアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージ表示ライブラリー）
をスクリーニングすることによって同定および単離され、それによりポリペプチ
ドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離しうる。ファージディ
スプレイライブラリーを作製およびスクリーニングのためのキットは、市販で入
手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａ
ｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１号
；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｕｒＺＡＰ（登録商標）ファージ・ディスプ
レイ・キット、カタログ番号２４０６１２号）。さらに、抗体ディスプレイライ
ブラリーを作製およびスクリーニングする上で使用するために特に扱いやすい方
法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番
号第ＷＯ９２／１８６１９号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９１／１７２７１号；ＰＣ
Ｔ公開番号第ＷＯ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／１５６７９
号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９３／０１２８８号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／０
１０４７号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／０９６９０号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ
９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら、（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、９巻：１３７０〜１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２年）、Ｈｕｍ．Ａｎ
ｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻：８１〜８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８
９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５〜１２８１頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ
ｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．、１２巻：７２５〜７３４頁に見出されうる
。

【００６９】 さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製されうるヒトおよび非ヒト部
分の両方を包含する、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗
体のような組換え抗体は、本発明の範囲内にある。このようなキメラおよびヒト
化モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られる組換えＤＮＡ技術によって産
生されうる。

【００７０】 一般に、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティーク
ロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準技術によって本発明のポリペプチ
ドを単離するために使用されうる。ポリペプチド特異的抗体は、細胞から天然ポ
リペプチドの、および宿主細胞で発現される組換え生産されたポリペプチドの精
製を促進できる。さらに、本発明のポリペプチドに特異的である抗体は、ポリペ
プチドの発現の量およびパターンを評価するために、ポリペプチド（例えば、細
胞の溶解物、細胞上清、または組織試料中）を検出するために使用されうる。抗
体は、臨床試験手順の一部として組織でのタンパク質濃度をモニターするために
、例えば、所定の治療計画の効力を測定するために、診断で使用されうる。検出
は、抗体を、検出可能な物質に結合させることによって促進されうる。検出可能
な物質の例は、種々の酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、
および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワザビ・ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、（−ガラクトシダーゼ、またはアセチル
コリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子団複合体の例としては、スト
レプトビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光材
料の例としては、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオ
シアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシ
ルクロリドまたはフィコエリスリンが挙げられる；発光材料の例としては、ルミ
ノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリ
ンおよびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性材料の例は、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ
、³⁵Ｓ、または³Ｈが挙げられる。

【００７１】 本明細書で同定されるヌクレオチド配列（および対応の完全遺伝子配列）の部
分または断片が、ポリヌクレオチド試薬として数多くの方法で使用されうる。例
えば、これらの配列は、（ｉ）染色体上でそれらの個々の遺伝子をマッピングし
、したがって、遺伝子疾患に関連した遺伝子領域を位置付けし；（ｉｉ）ごくわ
ずかの生物学的試料から個体を同定し（組織タイプ分け）；そして（ｉｉｉ）生
物学的試料の法医学的同定で支援するために使用されうる。

【００７２】 本発明は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）という状況では
、本発明のタンパク質および／または核酸発現、並びにタンパク質の活性を測定
する診断的アッセイにも関し、それにより個体が、疾患または障害にさいなまれ
るかどうか、または異常な発現または活性に関連して障害を発生する危険にある
かを決定する。本発明は、個体が、本発明のタンパク質または核酸分子の活性ま
たは発現に関連した障害を発生する危険にあるかどうかを決定する予後（または
推定）アッセイをも提供する。

【００７３】 本明細書に記述される方法によって治療または診断されうる障害としては、そ
れに限定されないが、大理石骨病、骨硬化症、ピクノダイソストシス(pyknodyso
stosis) 、骨髄硬化、高ホスファターゼ症、進行性骨幹形成異常、メロレオスト
ーシス、オステオポイキリー、内前頭骨過骨症、硬化症、マックキューン−オー
ルブライト症候群、および脊椎骨端形成異常を含む骨密度における増加によって
特徴づけられる疾患；変形性関節症、マロトー−ラミー症状群および骨粗鬆症を
含めた骨密度における減少によって特徴づけられる障害；骨形成不全、縫合頭蓋
骨癒合(sutural craneosynostosis)、骨軟化症、および鎖骨頭蓋骨形成不全(cle
idocranial dysplasia) を含む骨形成の障害、および骨肉種のような骨の癌が挙
げられる。さらに、本明細書に記述される方法は、癌、神経性食欲不振、および
自己免疫障害に関連した骨障害の治療または診断のために有用でありうる。

【００７４】 例えば、遺伝子における突然変異は、生物学的試料でアッセイされうる。この
ようなアッセイは診断的または推定目的のために使用され、それにより本発明の
核酸分子またはタンパク質の発現または活性によって特徴づけられるか、または
関連した障害の発生の前に個体を予防的に治療しうる。

【００７５】 生物学的試料における本発明のタンパク質または核酸分子の存在または非存在
を検出する例示の方法は、試験対象から生物学的試料を得て、そして生物学的試
料を、タンパク質または核酸分子の存在が生物学的試料で検出されるように、タ
ンパク質もしくはタンパク質をコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ）を検出する能力のある化合物または薬剤に接触させることを含む。ｍＲ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい薬剤は、本明細書に記述され
るｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力のある標識された
核酸プローブである。例えば、核酸プローブは、完全長核酸分子、または少なく
とも長さ１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドのオリゴ
ヌクレオチドのようなその部分であり得、そして適切なｍＲＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分であ
りうる。例えば、核酸プローブは、配列番号：１の全部もしくは一部、または配
列番号：１の相補体、もしくはその一部でありうる。本発明の診断的アッセイで
使用するための他の適切なプローブは、本明細書に記述される。

【００７６】 １つの実施形態では、本発明のタンパク質を検出する薬剤は、タンパク質に結
合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は
、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルでありうる。無傷の抗
体、またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂ ）が使用されうる。
プローブまたは抗体に関して、語句「標識された」は、検出可能な物質をプロー
ブまたは抗体と結合させる（すなわち、物理学的に連結させる）ことによるプロ
ーブまたは抗体の直接標識、並びに直接的に標識される別の試薬との反応性によ
るプローブまたは抗体の間接標識を包含することが意図される。間接標識の例と
しては、蛍光で標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光で標識
されたストレプトビジンで検出されうるようにビオチンを用いたＤＮＡプローブ
の末端標識が挙げられる。語句「生物学的試料」は、対象から単離される組織、
細胞および生物体液、並びに、対象内に存在する組織、コールズ（calls ）およ
び体液を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ並
びにインビボで生物学的試料中の本発明のｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノム
ＤＮＡを検出するために使用されうる。例えば、ｍＲＮＡの検出のためのインビ
トロ技術は、ノーザン・ハイブリダイゼーションおよびインサイチュー・ハイブ
リダイゼーションが挙げられる。タンパク質の検出のためのインビトロ技術は、
固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタン・ブロット、免疫沈降、および
免疫蛍光が挙げられる。ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザン
・ハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、タンパク質の検出のためのイ
ンビボ技術は、標識抗タンパク質抗体を、対象に導入することが挙げられる。例
えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が、標準画像形成技術によって
検出されうる放射活性マーカーで標識されうる。

【００７７】 １つの実施形態では、生物学的試料は、試験対象由来のタンパク質分子を含む
。あるいは、生物学的試料は、試験対象から得られるｍＲＮＡ分子、または試験
対象から得られるゲノムＤＮＡ分子を含みうる。好ましい生物学的試料は、血清
試料または対象から従来の手段により単離される肺組織生検である。

【００７８】 別の実施形態では、方法は、さらに、対照対象から対照生物学的試料を得るこ
と；タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が、生物学的試料で検出さ
れるように、本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力
のある化合物または薬剤に対照試料を接触させること；および対照試料中のタン
パク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中のタンパク質、ｍＲ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。

【００７９】 本発明は、生物学的試料中の本発明のタンパク質または核酸分子の存在を検出
するためのキットをも包含する。例えば、キットは、生物学的試料中のタンパク
質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中の量を測
定するための手段；および試料中の量を、標準と比較するための手段とを含みう
る。化合物または薬剤は、適切な容器に包装されうる。キットは、さらに、タン
パク質または核酸分子を検出するキットを使用するための説明書を含みうる。

【００８０】 本明細書に記述される診断方法は、さらに、本発明のタンパク質および核酸分
子の異常な発現または活性に関連した疾患または障害を有するか、またはその発
生の危険のある対象を同定するために利用されうる。例えば、先述の診断的アッ
セイまたは以下のアッセイのような本明細書に記述されるアッセイは、増殖性障
害のようなタンパク質または核酸発現または活性に関連した障害、分化または発
生の障害、または造血障害を有するか、またはその発生の危険のある対象を同定
するために利用されうる。他方、診断用アッセイは、分化または増殖性疾患（例
えば、癌）、特に骨の疾患を有するか、またはその発生の危険のある対象を同定
するために利用され得る。したがって、本発明は、試験試料が、対象から得られ
、そしてタンパク質または核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出
され、タンパク質または核酸分子の存在が、本発明のタンパク質または核酸配列
の異常な発現または活性に関連した疾患または障害を有するか、またはその発生
の危険のある対象の診断的に役立つ、本発明のタンパク質または核酸分子の異常
な発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供する。本明細
書で使用される場合、「試験試料」は、目的の対象から得られる生物学的試料を
いう。例えば、試験試料は、生物体液（例えば、血清）、細胞試料（例えば、破
骨細胞）または組織試料でありうる。

【００８１】 本発明は、本明細書に記述される核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質に
結合するか、または例えば、本発明の核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質
の発現または活性に対し刺激または阻害効果を示すモジュレーター、すなわち、
候補または試験化合物または薬剤（例えば、アンチセンス、ポリペプチド、ペプ
チド模倣体、小分子または他の薬物）を同定する方法（「スクリーニングアッセ
イ」としてもここに称される）を提供する。

【００８２】 １つの実施形態では、本発明は、本明細書に記述されるタンパク質またはポリ
ペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性に結合またはそれを調節する候
補または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。本発明の試験化
合物は、当該技術分野で知られるコンビナトリアルライブラリー法での数多くの
アプローチ法のいずれかを使用して得られ得、当該ライブラリー法には、生物学
上のライブラリー；スペイシャリー アドレッサブル パラレル ソリッド フ
ェーズ オア ソリューション フェーズ ライブラリー（spatially addressa
ble parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボリューシ
ョン(deconvolution) 脱旋回を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ・１
化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用い
た合成ライブラリー法が挙げられる。生物学上のライブラリーアプローチ法は、
ポリペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４つのアプローチ法は、ポ
リペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに使用
できる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓ．，１２巻：１４５頁）。

【００８３】 別の実施形態では、アッセイは、本明細書に記述される特定の標的分子を発現
する細胞を、試験化合物と接触させ、そして標的分子の活性を調節または改変
（例えば、刺激または阻害）する試験化合物の能力を決定することを含む細胞系
のアッセイである。標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定すること
は、例えば、標的分子に結合するか、またはそれを相互作用する既知リガンドの
能力を測定することによって達成されうる。例えば、ＧαサブユニットのＧＴＰ
アーゼ活性と相互作用するおよび／またはそれを活性化するＲＧＳ１０Ｂの能力
が測定されうる。

【００８４】 さらに別の実施形態では、本発明のアッセイは、本発明のタンパク質またはそ
の生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、そしてタンパク質またはその
生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力を測定する無細胞アッセイで
ある。タンパク質に対する試験化合物の結合は、上に記述される通り直接的に、
または間接的にのいずれかで測定されうる。１つの実施形態では、アッセイは、
タンパク質を結合してアッセイ混合物を形成する既知化合物と、タンパク質また
はその生物学的に活性な部分を接触させること、試験化合物とアッセイ混合物と
を接触させること、そしてタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定す
ることを含む。タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することは、
既知化合物に比べると、タンパク質またはその生物学的に活性な部分に優先的に
結合する試験化合物の能力を測定することを含む。

【００８５】 別の実施形態では、アッセイは、本発明のタンパク質またはその生物学的に活
性な部分を試験化合物と接触させ、そしてタンパク質またはその生物学的に活性
な部分の活性を調節または改変（例えば、刺激または阻害）する試験化合物の能
力を測定する無細胞アッセイである。タンパク質の活性を調節する試験化合物の
能力を決定することは、例えば、直接結合を決定するための上に記述される方法
の内の１つにより、既知標的分子に結合するタンパク質の能力を測定することに
よって、達成されうる。他の実施形態では、本発明のタンパク質の活性を調節す
る試験化合物の能力を測定することは、標的分子の活性をさらに調節するタンパ
ク質の能力を測定することによって達成されうる。例えば、適切な基質での標的
分子の触媒的／酵素的活性は、先に記述される通り測定されうる。

【００８６】 さらに別の実施形態では、無細胞アッセイは、タンパク質を結合してアッセイ
混合物を形成する既知化合物と、本発明のタンパク質またはその生物学的に活性
な部分を接触させること、試験化合物とアッセイ混合物とを接触させること、お
よびタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、タンパ
ク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することには、標的分子の活性に優
先的に結合またはそれを調節するタンパク質の能力を測定することを含む。

【００８７】 本発明の上記アッセイ法の１つ以上の実施形態では、１つまたは両方のタンパ
ク質の未複合形態からの複合体の分離を促進し、並びにアッセイの自動化を提供
するために、タンパク質またはその標的分子のいずれかを固定することが望まし
いと考えられる。タンパク質への試験化合物の結合、または候補化合物の存在お
よび非存在下での標的分子とのタンパク質の相互作用は、反応体を含むのに適す
る任意の容器中で達成されうる。このような容器の例としては、マイクロタイタ
ープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態では、一
方または両方のタンパク質がマトリックスに結合するのを可能にするドメインを
加える融合タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タ
ンパク質）が提供されうる。

【００８８】 別の実施形態では、本発明の核酸分子の発現のモジュレーターは、細胞を候補
化合物と接触させ、そして細胞中の適切なｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測
定する方法で同定される。候補化合物の存在下での適切なｍＲＮＡまたはタンパ
ク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのｍＲＮＡまたはタンパク質の発
現レベルと比較される。その後、候補化合物は、この比較に基づいた発現のモジ
ュレーターとして同定されうる。例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、
候補化合物の非存在下より候補化合物の存在下でより大きい（統計的に有意に大
きい）場合、候補化合物は、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のスティミュレータ
ーまたはエンハンサーとして同定される。他方、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発
現が、候補化合物の非存在下より候補化合物の存在下でより少ない（統計的に有
意に少ない）場合、候補化合物は、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤とし
て同定される。細胞中のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ｍＲＮＡま
たはタンパク質を検出するための本明細書で記述される方法によって測定されう
る。

【００８９】 本発明は、さらに、上に記述されるスクリーニングアッセイによって同定され
る新規薬剤に関する。したがって、適切な動物モデルでの本明細書に記述される
通り同定される薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、
本明細書に記述される通り同定される薬剤（例えば、調節剤、アンチセンス核酸
分子、特異的抗体、またはタンパク質結合パートナー）は、このような薬剤での
治療の効力、毒性または副作用を測定する動物モデルで使用されうる。他方、本
明細書で記述される通り同定される薬剤は、このような薬剤の作用機序を測定す
るために動物モデルで使用されうる。さらに、本発明は、本明細書で記述される
通り治療のための、上で記述されるスクリーニングアッセイによって同定される
新規薬剤の使用に関する。

【００９０】 本発明は、本発明のタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性に関連
した障害の危険性がある（または罹りやすい）か、または障害を有する対象を治
療する予防法および治療法の両方を提供する。１つの態様では、本発明は、本発
明の遺伝子またはタンパク質の発現または少なくとも１つの活性を調節する薬剤
を対象に投与することによって、対象で、本発明の遺伝子またはタンパク質の異
常な発現または活性に関連した疾患または症状を予防する方法を提供する。異常
な遺伝子発現またはタンパク質活性によって引き起こされるか、または寄与され
る疾患の危険がある対象は、例えば、本明細書に記述される診断的アッセイまた
は予後アッセイのいずれか、または組合せによって同定されうる。予防剤の投与
は、疾患または障害が防止されるか、あるいはその進行が遅延されるように異常
に特徴的な徴候が明示される前に起りうる。異常性の型により、例えば、アゴニ
スト剤またはアンタゴニスト剤が、対象を治療するために使用されうる。適切な
薬剤は本明細書で記述されるスクリーニングアッセイに基づいて決定されうる。

【００９１】 本発明の別の態様は、治療目的について本発明の遺伝子またはタンパク質の発
現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞に関連した特
異的タンパク質の活性の１つまたはそれ以上を調節する薬剤と細胞を接触させる
ことを含む。タンパク質活性を調節する薬剤は、核酸分子またはタンパク質、本
明細書中に記述されるタンパク質の天然に存在する標的分子、ポリペプチド、ペ
プチド模倣体、または他の小型分子のような本明細書中に記述される薬剤であり
うる。１つの実施形態では、薬剤は、１つまたはそれ以上のタンパク質活性を刺
激する。このような刺激剤の例としては、活性タンパク質、並びに細胞に導入さ
れたタンパク質をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態では、薬剤は
、１つまたはそれ以上のタンパク質活性を阻害する。このような阻害剤の例とし
ては、アンチセンス核酸分子および抗タンパク質抗体が挙げられる。これらの調
節方法は、インビトロ（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによって）で、
またはあるいは、インビボ（例えば、対象に薬剤を投与することによって）で行
われうる。このように、本発明は、本発明のタンパク質または核酸分子の異常な
発現または活性によって特徴づけられる疾患または障害に罹った個体を治療する
方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、薬剤（例えば、本明細書に記
述されるスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）、または本発明の遺
伝子またはタンパク質の発現または活性を調節（例えば、上方調節または下方調
節）する薬剤の組合せを投与することに関与する。別の実施形態では、本方法は
、タンパク質または核酸分子の減少したもしくは異常な発現または活性を補う治
療として、本発明のタンパク質または核酸分子を投与することを含む。

【００９２】 タンパク質活性の刺激は、タンパク質が、異常に下方調節され、および／また
は増大したタンパク質活性が、有益な効果を示すようであるという状況で望まし
い。同様に、タンパク質活性の阻害は、タンパク質が、異常に上方調節され、お
よび／または減少したタンパク質活性が、有益な効果を示すようであるという状
況で望ましい。このような状況の１つの例は、対象が、異常な発生または細胞の
分化によって特徴づけられる障害を有する場合である。本明細書で記述されるス
クリーニングアッセイによって同定されるタンパク質活性（例えば、遺伝子発現
）に対する刺激または阻害効果を有する本発明の分子、並びに薬剤、またはモジ
ュレーターは、異常なタンパク質活性に関連した障害（例えば、増殖または発生
障害）を治療（予防的にまたは治療的に）するために個体に投与されうる。

【００９３】 本発明は、以下の限定されない実施例によって、さらに記述される。本明細書
に引用される全ての出版物の教示は、それらの全体を参照して本明細書に組込ま
れる。

【００９４】 実施例 破骨細胞ｃＤＮＡライブラリー構築物 ヒト・破骨細胞腫（骨の巨大細胞腫瘍）から得られるメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）は、破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用された
。破骨細胞腫は、活性な骨吸収性腫瘍であるが、しかし通常には非転移性である
。低温槽区分では、破骨細胞腫は、破骨細胞についてインビボで特異的な、広範
に利用される表現型マーカーである、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）
に陽性である約３０％多核細胞から構成される（Ｍｉｎｋｉｎ、Ｃａｌｃｉｆ．
Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．３４巻：２８５〜２９０頁（１９８２年））。残りの細
胞は、線維芽細胞／間葉の形態学を示す細胞型の混合物である特徴付けされてな
い基質細胞である。

【００９５】 モノクローナル抗体試薬は、長骨の巨大細胞腫瘍における多核細胞の表面表現
型を部分的に特徴付けるために使用された。凍結切片、全ての多核細胞は、破骨
細胞およびマクロファージの両方に特異的な抗原を定義することが先に報告され
た（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｍ．Ａ．およびＭ．Ｈ．Ｈｅｌｆｒｉｃｈ、破骨細胞の生物
学および生理学で（Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ），Ｂ．Ｒ．ＲｉｆｋｉｎおよびＣ．Ｖ．Ｇ
ａｙ編集者、シーアールシー・プレス，インク．フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）、３３〜５４頁（１９９２年））、ＣＤ６８を発現した
。対照的に、巨大細胞の染色は、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４表面抗原について観
察されず、そしてそれは、単細胞／マクロファージおよび顆粒細胞（Ａｒｎａｏ
ｕｔ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３７巻：３０５頁（１９
８８年）；Ｈａｚｉｏｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１巻：５４７頁
（１９８８年））で現れる。ヒト末梢血単細胞の細胞遠心調製物は、ＣＤ６８、
ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４に陽性であった。これらの結果は、破骨細胞腫の多核
巨大細胞が、マクロファージのものと区別される表現型を示し、そして破骨細胞
のものと一致することを示す。

【００９６】 破骨細胞腫組織は、液体窒素で素早く凍結され、そして標準方法によってポリ
Ａ⁺ ｍＲＮＡを製造するために使用された。ｐｃＤＮＡＩＩベクターへのｃＤＮ
Ａクローニングは、市販で入手可能なキット（Ｌｉｂｒａｒｉａｎ、インビトロ
ゲンを使用して行われた。およそ２．６×１０⁶ 個のクローンが得られ、その＞
９５％は、平均長０．６ｋＢの挿入物を含んだ。

【００９７】 基質細胞ｍＲＮＡ製品 各破骨細胞腫の部分は、ｍＲＮＡ調製物のために液体窒素で素早く凍結された
。腫瘍の残りは、簡潔なトリプシン処理および機械的解離を用いて解離され、そ
して組織培養に注いだ。これらの細胞を、１０％新生仔ウシ血清（ＭＡバイオプ
ロダクツ）、ゲンタマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、１−グルタミン（２ｍＭ）
および非必須アミノ酸（０．１ｍＭ，ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））で補足されたダル
ベッコのＭＥＭ（高グルコース、シグマ）で拡張された。基質細胞集団を、少な
くとも５回で継代し、その後、多核細胞を含まない同種の線維芽細胞探査細胞集
団を示した。基質細胞は、単核であり、酸ホスファターゼに陰性と試験され、そ
してアルカリ性ホスファターゼ陽性と可変に(variably)試験された。これらの知
見は、増殖した基質細胞（すなわち、培養中に継代される基質細胞）が、非破骨
細胞および非活性化であることを示す。

【００９８】 破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーの差次的スクリーニングによるＤＮＡの同定 破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーから抜取られた総数１２，０００個のクロー
ンは、（１）巨大細胞腫瘍ｍＲＮＡ（基質細胞⁺ 、ＯＣ⁺ ）および（２）同じ腫
瘍から培養された基質細胞（基質細胞⁺ 、ＯＣ^- ）から得られるｍＲＮＡから誘
導される混合³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いて、差次的ハイブリダイゼーショ
ンによってスクリーニングした。プローブを、約１０⁹ ＣＰＭ／μｇの活性にラ
ンダム初回感作によって³²［Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。これらの１２，０００ク
ローンの中で、１９５は、巨大細胞（すなわち、破骨細胞および基質細胞）ｍＲ
ＮＡで陽性ハイブリダイゼーションシグナルが得られたが、しかし基質細胞ｍＲ
ＮＡでは得られなかった。さらに、これらのクローンは、上皮細胞、線維芽細胞
、リンパ球、骨髄単球細胞、破骨細胞、および神経芽腫細胞を含めた多様な無関
連のヒト細胞型から誘導されるｍＲＮＡから産生されるｃＤＮＡにハイブリダイ
ズしなかった。他の細胞型から由来するｍＲＮＡから産生されるｃＤＮＡにこれ
らのクローンがハイブリダイズしなかったことは、これらのクローンが、破骨細
胞に独特または選択的にのいずれかで発現されるという結論を支持する。

【００９９】 破骨細胞（ＯＣ）ｃＤＮＡライブラリーを、以下のとおり、ＯＣ ｃＤＮＡ（
基質細胞⁺ 、ＯＣ⁺ ）に対する差次的ハイブリダイゼーション、および基質細胞
ｃＤＮＡ（基質細胞⁺ 、ＯＣ^- ）についてスクリーニングした。

【０１００】 ＮＹＴＲＡＮフィルター（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）を、
成長培地およびアンピシリンを含む寒天プレートに載せた。ＯＣライブラリーか
ら得られる個々の細菌コロニーを、任意に取り出し、そして三連で、予め決定さ
れる格子を有するフィルターに、そしてその後マスター寒天プレートに移行させ
た。２００個までのコロニーを、これらの技術を使用して単９０ｍｍフィルター
／プレートに接種させた。プレートを、逆転(invert)させ、そして細菌接種物が
、０．５〜１．０ｍｍの直径まで（フィルターで）成長するまで、３７℃でイン
キュベートした。

【０１０１】 その後、コロニーを溶解させ、そしてＤＮＡを、最初に、５分間、０．５Ｎ
ＮａＯＨで飽和された２片のワットマン３ＭＭペーパーの頂上にフィルターを置
くことによって、フィルターに結合させた。フィルターを、３〜５分間、１Ｍト
リス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で飽和された２片のワットマン３ＭＭペーパーに載
せることによって中和した。中和後、３〜５分間、１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８
．０）／１．５Ｍ ＮａＣｌで飽和された別の組のワットマン３ＭＭペーパー上
でインキュベートした。その後、フィルターは、２×ＳＳＣで簡潔に洗浄された
。

【０１０２】 ＤＮＡを、３０分間、８０℃でフィルターをベークすることによって、フィル
ターに固定した。フィルターは、すぐに良好に使用されたが、しかしそれらは、
室温で、真空瓶で１週間まで保存され得た。

【０１０３】 フィルターを、加熱封印性バッグで２〜４時間、フィルター当たり５〜８ｍｌ
のハイブリダイゼーション溶液で予備ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼー
ションバッグに添加された各々の別のフィルターについて別の２ｍｌの溶液を添
加した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、５×ＳＳＣ、５×ダルベッコ溶液、
１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性異種ＤＮＡから構成された。

【０１０４】 ハイブリダイゼーションの前に、１００℃で５分間、１×ＳＳＣで加熱するこ
とによって、標識プローブを変性させ、その後すぐに氷で冷却させた。変性プロ
ーブを、ハイブリダイゼーション溶液中のフィルターに添加し、そしてフィルタ
ーを、６５℃で、１２〜２０時間、連続通気させながらハイブリダイズさせた。

【０１０５】 ハイブリダイゼーションの後に、フィルターを、３０分間、５０〜６０℃で２
×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄し、続いて６０分間、６０℃で０．２×ＳＳＣ
／０．２％ＳＤＳで洗浄した。その後、フィルターを、空気乾燥させ、そして一
夜−７０℃で、増感スクリーンを用いてオートラジオグラフィーにかけた。

【０１０６】 選択クローンのＤＮＡ配列決定 腫瘍細胞ｃＤＮＡにハイブリダイズするが、しかし基質細胞ｃＤＮＡに対して
はハイブリダイズしないクローンは、シーケナーゼ（ユーエス・バイオケミカル
（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））を用いてＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４巻：５４６３頁（１９７７年）のジデオキ
シ鎖終結法によって配列決定された。ＤＮＡＳＩＳ（ヒタチ）プログラムを、配
列解析およびジーンバング／ＥＭＢＬデータベースでのホモロジー検索を行うた
めに使用した。

【０１０７】 この方法によって同定されるクローンの１つ（クローン１４０と命名）につい
て、完全長ｃＤＮＡ（ＲＧＳ１０Ｂと命名）を、破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリ
ーから同定した。ＲＧＳ１０Ｂのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、図２
に示される。ＲＧＳ１０Ｂは、ＲＧＳ１０として知られる先に記述された分子の
イソ型を表すようである１８１個のアミノ酸ペプチドをコードする。しかし、Ｒ
ＧＳ１０Ｂ配列のアミノ末端は、ＲＧＳ１０のものと異なり、そして１６残基の
３つのみが同一である（図１）。対照的に、残基１７〜１８１は、２つの分子で
同一であり、そしてＲＧＳ１０Ｂは、高度に保存されたＲＧＳドメインを保有す
る。さらに、ＲＧＳ１０Ｂの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ＲＧＳ１０のものと
は異なり、ＲＧＳ１０Ｂが、少なくとも２つの新規エキソンのオルタナティブス
プライシングによって発生されるようであることを示す。

【０１０８】 ノーザンブロット解析 多組織ノーザン解析を、ＲＧＳ１０Ｂのアミノ末端に対する９０塩基対プロー
ブを用いて行った。ＲＧＳ１０Ｂについての１ｋｂ ｍＲＮＡは、破骨細胞腫で
非常に強力に検出されたが、しかし、腫瘍の基質細胞成分では検出されなかった
。ＲＧＳ１０Ｂ ｍＲＮＡは、ＨＳＢ−２（Ｂリンパ球細胞株）およびＵ９３７
（骨髄単球細胞株）で最小限に発現された。試験された全ての他のヒト組織およ
び細胞株は、ＲＧＳ１０ＢｍＲＮＡについて陰性であった。これらのデータは、
ＲＧＳ１０Ｂが、ヒト破骨細胞で選択的に発現されることを示す。

【０１０９】 本発明は、その好ましい実施形態に関して特に示されそして記述したが、形態
および詳細での種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明
の概念および範囲から逸脱せずに、本明細書で行われうることは当業者に理解さ
れる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＲＧＳ１０Ｂ（上部列；配列番号：２）とＲＧＳ１０（下部列；配列
番号：３）とのアミノ酸配列の比較を示す。ダッシュ記号は、アラインメントを
最大限にするために導入されたギャップを示す。

【図２】 図２は、ＲＧＳ１０Ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）とＲＧ
Ｓ１０Ｂの推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA12 HA12 4B063 QA01 QA17 QQ02 QQ08 QQ27 QQ43 QR08 QR14 QR31 QR42 QR56 QR62 QR72 4B065 AA90Y CA23 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA01 DA75 EA50

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ） 配列番号：１、 ｂ） 配列番号：１の相補体、 ｃ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８、 ｄ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、 ｅ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および ｆ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体 からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有してなる単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１記載の単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 ａ） 配列番号：１、ならびに ｂ） 配列番号：１の相補体、 ｃ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８、 ｄ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、 ｅ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および ｆ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体 からなる群より選ばれるヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸分子
   。
4. 【請求項４】 ａ） 配列番号：１、ならびに ｂ） 配列番号：１の相補体、 ｃ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８、 ｄ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、 ｅ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および ｆ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体 からなる群より選ばれるヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 ａ） 配列番号：１、ならびに ｂ） 配列番号：１の相補体、 ｃ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８、 ｄ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜４８の相補体、 ｅ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および ｆ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体 からなる群より選ばれるヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブ
   リダイズする核酸分子。
6. 【請求項６】 試料を、 ａ） 配列番号：１、 ｂ） 配列番号：１の相補体、 ｃ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜１６、 ｄ） 配列番号：１のヌクレオチド１〜１６の相補体、 ｅ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１、および ｆ） 配列番号：１のヌクレオチド５４７〜８３１の相補体 からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有してなる第２の核酸分子と選択
   的ハイブリダーゼーションに適した条件下で接触させる工程を含む、試料中の核
   酸分子の存在をアッセイする方法。
7. 【請求項７】 調節配列に作動可能に連結した請求項１記載の単離された核
   酸分子を含有してなるベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
9. 【請求項９】 単離された核酸分子にコードされるポリペプチドを調製する
   方法であって、該核酸分子の発現に好適な条件下で請求項８記載の組換え宿主細
   胞を培養する工程を含む方法。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の単離された核酸分子にコードされる単離さ
    れたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列を含有する単離されたポリペ
    プチド。
12. 【請求項１２】 配列番号：２の配列のアミノ酸１〜１６を含有する単離さ
    れたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号：２のアミノ酸配列との同一性が約９３％を超え
    るアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項１記載の単離された核酸分子にコードされるポリペ
    プチドもしくは該ポリペプチドの部分に選択的に結合する抗体またはその抗原結
    合断片。
15. 【請求項１５】 配列番号：２のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列の部
    分に選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
16. 【請求項１６】 請求項１記載の単離された核酸分子にコードされるポリペ
    プチドの存在を試料中においてアッセイする方法であって、該コードされたポリ
    ペプチドに特異的に結合する抗体と試料を接触させる工程を含む方法。
17. 【請求項１７】 ＲＧＳ１０Ｂまたはその活性部分の該細胞での発現を高め
    、それによりＲＧＳ１０ＢがＧタンパク質のＧαサブユニットの固有ＧＴＰアー
    ゼ活性を活性化することによりＧタンパク質活性を阻害する工程を含む、細胞に
    おいてＧタンパク質機能を阻害する方法。
18. 【請求項１８】 ＧαサブユニットをＲＧＳ１０Ｂまたはその活性部分と接
    触させる工程を含む、ＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を活性化する方法。
19. 【請求項１９】 細胞におけるＲＧＳ１０Ｂまたはその活性部分の発現を高
    める工程を含む、細胞におけるＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を活性化す
    る方法。