JP2008537481A - Gタンパク質シグナリングを阻害する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
哺乳動物のGタンパク質βサブユニット(37kDa)の5つのアイソフォーム及びGタンパク質γ(7.8kDa)の12のアイソフォームが同定された(Offermanns (2003) Prog Biophys Mol Biol 83:101-30)。Gタンパク質βおよびγサブユニットで構成される偏性ヘテロダイマー(Gβγ)は、真核細胞の種々の経路において調節分子として機能する(Neves et al. (2002) Science 296:1636-9;Clapham and Neer (1997) Annu Rev Pharmacol Toxicol 37:167-203)。最初にグアニンヌクレオチド解離阻害因子(GDI)として性状が明らかにされたように、Gβγは、GDP結合Gタンパク質αサブユニット(Gα)と堅固に結合し、それによって、GαもGβγもシグナリングにおいて活性をもたないGタンパク質ヘテロダイマーの基本形を構成する。アゴニスト刺激Gタンパク質カップリング形成レセプター(GPCR)は、Gα上でGDPとGTPとの交換及びヘテロトリマーからGβγの遊離を触媒し、2つの活性なシグナリング種:Gα・GTP及びGβγを解き放つ。Gβγシグナリングの標的には以下が含まれる:Gタンパク質調節内向き整流カリウムチャネル(GIRK)(Krapivinsky et al. (1993) J Biol Chem 273:16945-52);アデニルシクラーゼI型、II型及びIV型アイソフォーム(Tang and Gilman (1991) Science 254:1500-3;Sunahara et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:461-80);マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)(Schwindinger and Robishaw (2001) Oncogene 20:1653-60);ホスホチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3K)(Schwindinger and Robishaw (2001)上掲書);フォスデュシン(Schulz (2001) Pharmacol Res 43:1-10);Gタンパク質レセプターキナーゼ(GRK)ファミリーの少なくとも2つのメンバー(Koch et al. (1993) J Biol Chem 268:8256-60;Inglese et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3637-41);及び他のプレキシトリンホモロジー(PH)ドメイン含有タンパク質[ダイナミン(Lin et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:5057-60;Scaife and Margolis (1997) Cell Signal 9:395-401)及びホスホリパーゼC β(PLC β)のβ1、β2及びβ3アイソフォーム(Sternweis and Smrcka (1992) Trends Biochem Sci 17:502-6;Li et al. (1998) J Biol Chem 273:16265-72)を含む]、並びにその他多くのもの。
ドーピング変異導入及び再スクリーニング手法を用いて、Gβ1γ2に対しより高い親和性を有するSIRKペプチド類似ペプチドを誘導した。このペプチドの配列はSer-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp(配列番号:2)(SIGK)である。SIGKを用いたin vitro実験は、前記もまたヘテロトリマー複合体からGαilを追い出し、さらにヘテロトリマー形成を効率的に妨げることができることを示した(Ghosh et al. (2003) 上掲書)。SIRK/SIGKがGβ1γ2からGαil・GDPの解離を仲介するメカニズムは不明であるが、ペプチドの存在下でGαilサブユニットの解離速度の増加を説明するためにGβ1γ2サブユニットにおける配座変化が必要であることが提唱された(Ghosh et al. (2003) 上掲書)。
本発明は、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定する方法に関する。本方法は、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と接触させ、さらに前記物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かを決定し、それによってGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定することを含む。
本発明はまた、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定する方法に関する。本方法は、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合するペプチドの存在下で接触させる工程、及び前記物質が、前記ペプチドとβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基との結合を阻害するか否かを決定し、それによってβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定する工程を含む。
本発明はさらに、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する方法に関する。本方法は、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量とGタンパク質を接触させることを含む。
本発明はまた、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患(disease)若しくは症状(condition)を予防又は治療する方法に関する。本方法は、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患又は症状を有するか、又は前記を有するリスクが有る患者に、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量を投与し、それによって少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患若しくは症状を予防又は治療することを含む。Gタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患又は症状には心不全、中毒、炎症、及びオピオイド耐性が含まれる。
βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定するキットもまた提供される。本発明のキットは、SIGKペプチド又はSIGKペプチド誘導体を含む。
さらに本発明のスクリーニング方法にしたがって同定される物質も提供され、ここで前記物質は式I、II又はIIIの構造を有する。
Gタンパク質のためのタンパク質相互作用部位は今や理解されている。SIGKと結合したGβγの構造が解明され、SIGKは、ヘテロトリマー内のGαのスイッチIIドメインのαヘリックス領域が占有する場所で、Gαの相互作用表面を縦断するαヘリックスのようにGβγと結合していることを示した。SIGKの存在下及び非存在下のGβγの配座は非常に類似している。したがって、結晶構造は、どのようにしてペプチドがGα−Gβγ相互作用をブロッキングするかを明らかにする。前記構造はさらに、多様なタンパク質パートナーとの相互作用のためにGβは高度に反応性で特殊化した表面を進化させてきたことを示している。この特殊化された表面は、本明細書では“タンパク質相互作用部位”又は“Gβのタンパク質相互作用部位”と称される。前記タンパク質相互作用部位の種々の特徴の解析によって、好ましい相互作用表面としてのこの表面の基本は、この部位の固有の配座可撓性でも異常に高い表面接近許容性でもなく、むしろこの単一結合表面で多数のタイプの潜在的相互作用化学が存在し得ることであるということが理解されるに至った。このタンパク質相互作用部位におけるアミノ酸配列の認識のために要求されるこの表面の特定のアミノ酸の組合せもまた決定された。さらにまた、ヘテロトリマーの解離又はタンパク質複合体形成の促進に必要な固有の分子相互作用が示された。
MGEMEQLKQE AEQLKKQIAD ARKACADITL AELVSGLEVV GRVQMRTRRT
LRGHLAKIYA MHWATDSKLL VSASQDGKLI VWDTYTTNKV HAIPLRSSWV
MTCAYAPSGN FVACGGLDNM CSIYSLKSRE GNVKVSRELS AHTGYLSCCR
FLDDNNIVTS SGDTTCALWD IETGQQKTVF VGHTGDCMSL AVSPDYKLFI
SGACDASAKL WDVREGTCRQ TFTGHESDIN AICFFPNGEA ICTGSDDASC
RLFDLRADQE LTAYSHESII CGITSVAFSL SGRLLFAGYD DFNCNVWDSL
KCERVGVLSG HDNRVSCLGV TADGMAVATG SWDSFLKIWN
(GenBank アクセッション番号AAA62620;配列番号:3)、この配列でタンパク質相互作用部位の残基には下線が付されている。
同様に、これらの残基は、以下のアミノ酸配列を有するヒトGβで同じ場所に配置されている:
MSELEQLRQE AEQLRNQIRD ARKACGDSTL TQITAGLDPV GRIQMRTRRT
LRGHLAKIYA MHWGTDSRLL VSASQDGKLI IWDSYTTNKV HAIPLRSSWV
MTCAYAXSGN FVACGGLDNI CSIYSLKTRE GNVRVSRELP GHTGYLSCCR
FLDDNQIITS SGDTTCALWD IETGQQTVGF AGHSGDVMSL SLAPNGRTFV
SGACDASIKL WDVRDSMCRQ TFIGHESDIN AVAFFPNGYA FTTGSDDATC
RLFDLRADQE LLMYSHDNII CGITSVAFSR SGRLLLAGYD DFNCNIWDAM
KGDRAGVLAG HDNRVSCLGV TDDGMAVATG SWDSFLKIWN
(GenBank アクセッション番号AAA35922;配列番号:4)、この配列でタンパク質相互作用部位の残基には下線が付されている。
物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かの決定は、Gβγサブユニットと前記サブユニットと相互作用することが判明している他のペプチド又はタンパク質(例えばSIGKペプチド、Gαサブユニット又は下流のタンパク質)との間のタンパク質-タンパク質相互作用を検出することによる種々のin vitro又はin vivoアッセイを用いて達成することができる。例示的なin vitroアッセイは本明細書で開示されている。このアッセイは以下の工程から成る:単離されたGβγ複合体を入手する工程;βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合するペプチド(例えばSIGKペプチド又は配列番号:1、配列番号:2、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、若しくは配列番号:13のSIGKペプチド誘導体)の存在下で、前記Gβγ複合体をテスト物質と接触させる工程;及び前記ペプチドとβサブユニットのタンパク質相互作用部位との結合を阻害する物質の能力を、例えばELISAアッセイを用いて検出する工程。最初のスクリーニングで同定された他のファージディスプレーペプチド(Scott et al. (2001) 上掲書)もまた用いることが可能である。
さらに別のスクリーニング、例えば確立されたコンピューターによるスクリーニング、又はG-タンパク質依存下流タンパク質の活性(例えばPLC β酵素活性)を検出するスクリーニングもまた、本明細書に開示したアッセイと併用することができる。
本発明の方法にしたがってスクリーニングすることができるテスト物質(本明細書では化合物とも称される)は、一般的には物質ライブラリー又は化合物ライブラリーに由来する。そのようなライブラリーは、純粋物質の集合物又は混合物質の集合物のいずれかを含むことができる。純粋物質の例にはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、合成若しくは半合成化学物質、及び精製された天然の生成物が含まれるが、ただしこれらに限定されない。混合物質の例には、原核若しくは真核細胞及び組織の抽出物が、発酵ブロス及び細胞若しくは組織培養上清と同様に含まれるが、ただしこれらに限定されない。混合物質の場合には、本発明の方法は、所望の活性を有する粗混合物を同定するために用いられるだけでなく、治療薬としての性状決定及び開発のために前記混合物から活性物質の精製をモニターするための手段もまた提供する。特に、そのようにして同定した混合物を、当業者に一般的に知られている方法により引き続いて分画することができる。前記方法には、沈殿、遠心分離、ろ過、限外ろ過、選択消化、抽出、クロマトグラフィー、電気泳動、又は複合体形成が含まれるが、ただしこれらに限定されない。得られた各サブフラクションを、純粋で生物学的に活性な物質が得られるまで、所望の活性について最初のアッセイを用いて分析することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて同定される化合物の有効性をさらに判定するために、Gタンパク質シグナリングが中心的に関与する具体的な任意の疾患又は異常のモデル系を利用して、化合物の吸着、分布、代謝及び排泄と同様、その潜在的毒性を急性、亜急性及び慢性実験で判定することができることは、当業者には理解されよう。例えば、NG108-15/D2細胞及びラットの海馬ニューロン初代細胞におけるβγ阻害因子の過剰発現は、アデニルシクラーゼのβγ活性化を妨げることによって、δ-オピオイド及びカンナビノイドレセプター誘発PKA Cα転座並びに遺伝子発現を遮断することが示された(Yao et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:14379-84)。したがって、中毒の治療における本発明の化合物の有効性を分析するために、NG108-15/D2細胞及び/又はラットの海馬ニューロン初代細胞を前記化合物と接触させ、PKA Cα転座に対する影響が決定される。δ-オピオイド及びカンナビノイドレセプター誘発PKA Cα転座を遮断する化合物は、中毒の治療で有用であろう。
オピオイド耐性を防ぐ本発明の化合物の有効性は、急性(Jiang et al. (1995) J Pharmacol Exp Ther 273:680-8)及び慢性(Wells et al. (2001) J Pharmacol Exp Ther 297:597-605)依存性モデル系で解析することができる。前記モデル系では、本発明の化合物がマウスの脳室内に注射され、選択オピオイド(例えばモルヒネ)に対する耐性が決定される。鎮痛効果を達成するために必要なオピオイド量を低下させる化合物はオピオイド耐性の防止に有用であろう。
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Gβサブユニットのタンパク質相互作用部位と結合して、関連するタンパク質の相互作用(例えばGαサブユニットおよびPLC β相互作用)を妨害するか、又は前記反応を生理学的に強化し、それによってGタンパク質シグナリング経路の活性を調節する種々の化合物が今や同定された。
本発明の例示的化合物は、Gβの新規なタンパク質相互作用部位と結合するリガンドを同定するために、先ず初めにコンピューターによるスクリーニングから選択された。前記コンピュータースクリーニングは、本明細書に開示するX-線構造で決定されるようなGβのタンパク質相互作用部位のモデルを作成するために、SYBYL分子モデリングソフトを用いることを必要とした。コンピュータードッキングスクリーニングは、米国立癌研究所の1900の化合物ライブラリーを用いて実施された。この場合、化合物は、ドッキングについてはFLEXXTM(Tripos, Inc., St. Louis, MO)を用い、さらにドッキングさせた構造のエネルギー学及び適合の評価にはCSCORETM(Tripos, Inc.)を用いて、Gβのタンパク質相互作用部位とのドッキングについて試験した。Gβのタンパク質相互作用部位と相互作用すると予想される化合物のアルゴリズム依拠リスト及び前記相互作用の構造的モデルを作成した。続いて、選別化合物を本明細書に開示するファージELISA結合アッセイで解析し、これらの化合物がGβのタンパク質相互作用部位と結合し、その表面でのタンパク質相互作用を妨害し得るか否かを判定した。化合物NSC201400及びNSC119916は、IC50値がそれぞれ100nM及び5μMであり、残余の化合物は、ELISA系アッセイで少なくとも50μMの親和性でGβγと結合し、タンパク質相互作用部位でペプチド相互作用を妨害することが見出された(図1)。これらの化合物をファージELISAアッセイでさらに分析し、Gβのタンパク質相互作用部位に対して高い親和性を有することが見出され、SIGKと類似のアミノ酸残基と相互作用した。
PI3Kγ及びPLC-β2/-β3のGβγ調節活性は、ケモアトラクタント誘引応答及び炎症で重要である。PI3KγはTI-IgλLの産生に必要であり、PI3Kγ欠損マウスでは好中球の遊走は見られない(Li et al. (2000) Science 287:1046-9)。PLC経路は、化学走性の抑制調節及び過剰炎症症状において中心的に関与する(Li et al. (2000) 上掲書)。したがって、NSC119910がGβγ/PLC相互作用を阻害し、PLC活性化を遮断することができるか否かが決定された。fura-2系実験から得られたデータによって、FMLP-刺激好中球における細胞質ゾルCa2+の急激に生じる増加(細胞内貯蔵から放出される陽イオンによる応答である(Anderson and Mahomed (1997) Clin Exp Immunol 110:132-138;Geiszt et al. (1997) J Biol Chem 272:26471-26478))は、10μMのNSC119910によって抑制されることが示された(図4)。ATPによる[Ca2+]の増加はNSC119910の存在下で顕著には抑制されず(図4)、FMLP依存Ca2+増加における前記化合物の作用は特異的であることを示唆している。さらに、蛍光がピーク値の半分に低下するために要する時間は実質的な影響を受けなかった(図5)。これらの結果は、NSC119910は、PLCのin vivo活性化をもたらすPLC/G-タンパク質相互作用を阻害することを示している。
NSC119910は効果的にG-タンパク質相互作用を調節することを示したので、NSC119910の一連の構造的類似体(モデリングソフトを用いて同定した)をGβのタンパク質相互作用部位との結合について分析した。これらの類似体及びGβγに対するそれらの対応する親和性は以下のとおりであった:
本明細書で用いられる、アルキルは直鎖又は分枝炭化水素鎖を指し、前記はもっぱら炭素及び水素原子から成り、置換を含まず、1つから8つの炭素原子を有する。
アルケニルは、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む脂肪族炭化水素基を指すことが意図され、さらに前記は2つから約10の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖であり得る。
シクロアルキルは、約3から12の炭素原子の非芳香族単環式又は多環式環系を指す。
本明細書で用いられる、シクロアルケニルという用語は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有し約3から12の範囲の炭素原子を含む単環式又は多環式環系を指す。
置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル又はシクロアルケニル中の置換基にはヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン(例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素)、又は置換若しくは非置換アルキルが含まれるが、ただしこれらに限定されない。NSC157411及びNSC122390を例外とし、NSC119910の類似体は、一般的には、式IIIのR2及びR3の位置にヒドロキシル基を(前記は結合を促進するようであった)、さらに式IIIのR1にカルボキシル置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル又はシクロアルケニル置換基(前記は活性を調節するようであったが、結合には必要とされなかった)を含んでいた。
PLC-β2及び-β3の活性を選択的に調節するNSC119910類似体の能力を分析した。このアッセイでは、PLC-β2及び-β3を精製し、PLC酵素活性を精製βγの存在下又は非存在下及び類似体の存在下又は非存在下で測定した。この分析の結果は、NSC119911はPLC-β2の活性化をPLC-β3の活性化よりも効果的に遮断するようであり、NSC201400は、βγとのペプチドの結合を遮断するにもかかわらず、選択的にPCL-β3活性化を強化することを示した。さらにまた、NSC119910、NSC及び類似体NSC119893はCa2+の動員を遮断するが、それらはfMLP依存ERK活性化を妨害することなくCa2+の動員を達成する。同様に、NSC119911、NSC158110及びNSC201400もまたfMLP依存ERK活性化を妨害しない。
本明細書に開示した化合物は、Gβのタンパク質相互作用部位と結合しこの表面でのタンパク質相互作用を妨害することが判明した化合物と同様に、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節(すなわち遮断若しくは抑制、又は強化若しくは潜在的強化)する方法で用いることができる。そのような方法は、Gタンパク質をβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量とin vitro又はin vivoで接触させ、それによってGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節することを必要とする。物質の有効量とは、Gタンパク質の活性を10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%低下又は増加させる量である。そのような活性は、タンパク質-タンパク質相互作用、又は下流タンパク質の活性を検出する酵素アッセイによりモニターすることができる。
医薬組成物は、医薬的に許容される塩及び複合体の形で、さらに医薬的に許容される担体中で適切な用量で提供することができる。そのような医薬組成物は、当業者に公知の方法で調製され、さらに当業者に公知の担体を含むことができる。一般的に周知されているそのような方法及び成分の概説は以下のものである(Remington, TheScience and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, ed., 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000)。医薬的に許容できる担体、組成物又はベヒクル、例えば液状若しくは固体充填剤、稀釈剤、賦形剤又は溶媒被包化物質は、ある器官又は身体の部分から別の器官又は身体の別の部分へ対象化合物を運搬又は輸送する場合に必要とされる。各担体は、処方物の他の成分と適合し、さらに患者にとって有害ではないという意味で許容可能でなければならない。
本発明の組成物は、標準的な医療技術にしたがって、非経口的に(例えば静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内注射)、局所的に(頬部および舌下を含む)、経口的に、鼻内に、膣内に又は直腸内に投与することができる。
当分野で通常の技量を有する医師又は獣医師は、必要とされる本医薬組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要な用量よりも低レベルの用量の化合物で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることができる。前記は当業者の技術範囲内であると考えられ、さらに、最適用量を決定するために特定の化合物又は類似の化合物に関して存在する文献を精査することができる。
本開示を熟読するとき当業者には理解されるところであるが、本明細書に例示した化合物以外のまた別の化合物が、本明細書に教示したスクリーニング方法にしたがって日常的に特定されよう。さらにまた別のスクリーニング用化合物を、当業者は、コンピューターによる予想を基に、及び/又はそれらが有する式I、II若しくはIIIの構造又は本明細書開示の例示的化合物の構造と類似する構造を基にランダムに選択することができる。
本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに詳しく説明する。
ペプチドは、Alpha Diagnostic International(San Antonio, TX)又はSIGMA(商標)-Genosys(St. Louis, MO)から購入し、90%以上に精製し、質量は質量分析計で確認した。Ni-NTAアガロースはQIAGEN(商標)(Valencia, CA)から得た。ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズはSpherotec(Libertyville, IL)から得た。HRP-結合抗M13抗体はAmersham Biosciences(Piscataway, NJ)から得た。HRP-結合ニュートラビジンはPierce(Rockford, IL)から得た。全ての分子生物学試薬は、特段の指示がないかぎりINVITROGENTM(Carlsbad, CA)から得た。
実施例2:Gβ 1 γ 2 及びSIGKペプチドの発現と精製
野生型ウシGβ1及びN-末端(His)6タグ付加ウシGγ2のためのcDNAを保有するバキュロウイルスを用いて、前記のタンパク質を生成した。High5細胞(INVITROGENTM, Carlsbad, CA;2x106細胞/mL)に高力価のGβ1及びGγ2バキュロウイルスを感染させた。標準的方法(Kozaza and Gilman (1995) J Biol Chem 270:1734-41)に改変を加えてGβ1γ2を精製した。全工程を4℃で実施した。細胞を感染後60時間で遠心分離(2600g)によって採集し、続いて細胞培養1リットルにつき50mLの溶解緩衝液(20mMのHEPES(pH8)、150mMのNaCl、5mMのβ-ME、1mMのEDTA、1mLのSIGMA(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテルP-2714)に再懸濁した。超音波処理によって細胞を溶解し、2600gで遠心して膜を沈殿させた。膜の再懸濁及び均質化は、100mLの溶解緩衝液中でドウンスホモジナイーザーを用いて達成された。攪拌しながら1%のルブロール(C12E10, SIGMA, St. Louis, MO)を添加して膜を溶解し、得られた溶液を125,000gで超遠心分離して清澄にした。溶解緩衝液+1%ルブロールで平衡化したNi-NTAアガロース(QIAGEN(商標)(Valencia, CA))に上清をローディングした。前記カラムを洗浄し、さらに、緩衝液Ni-A(20mMのHEPES(pH8)、0.4MのNaCl、5mMのβ-ME、0.5%ルブロール、0.15%コール酸塩)及びNi-B(20mMのHEPES(pH8)、0.1MのNaCl、5mMのβ-ME、0.25%ルブロール、0.3%コール酸塩)を用いて、ルブロールをコール酸ナトリウムと交換した。Gβ1γ2はNi-C(20mMのHEPES(pH8)、0.01MのNaCl、5mMのβ-ME、1%コール酸塩、200mMのイミダゾール)に溶出させた。QA(20mMのHEPES(pH8)、5mMのβ-ME、0.7%のCHAPS、1mMのEDTA)で平衡化させたHITRAPTM Q(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)カラムに前記溶出液をローディングした。Gβ1γ2はQB(QA+1.0MのNaCl)を用いたグラジエントで溶出させた。Gβ1γ2を含む分画をSDS-PAGEで分析し、プールした。緩衝液GF+CHAPS(20mMのHEPES(pH8)、150mMのNaCl、10mMのβ-ME、1mMのEDTA、0.7%のCHAPS)で平衡化したSEPHADEX(商標)75:SEPHADEX(商標)200タンデムカラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いてゲルろ過を実施した。精製収量は、典型的には細胞培養1リットル当り1mgのGβ1γ2であった。
SIGKペプチド(Ser-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp;配列番号:2)は、十分に確立された方法を用いて合成した。ペプチド末端に改変は加えず、精製はVYDAC(商標)C4半調製用カラムで逆相HPLCクロマトグラフィーにより実施した。
SIGKペプチドをGβ1γ2に1.5モル過剰で加え、Gβ1γ2・SIGK複合体を結晶化のために7mg/mLで用いた。等体積(2μL)のタンパク質溶液及び溜め液(15−17%のPEG 4000、100mMのHEPES(pH7.5)、0.01−0.05Mの酢酸ナトリウム、10%のグリセロール)を用い、20℃で蒸気拡散によって結晶を成長させた。1週間以内に寸法が150μmx50μmx20μmの結晶が得られた。15%のグリセロールで結晶を凍結から保護し、液体窒素中で凍結させた。
生成されたそのままのGβ1γ2・SIGKの結晶を、Advanced Light Source(ALS)ビームライン8.2.1及び8.2.2(Berkeley, CA)及びAdvanced Photon Source(APS)ビームラインBM-19(Chicago, IL)でスクリーニングした。ALS8.2.2のデータ一式を用いて構造を決定した。100を超える結晶をスクリーニングした。回折限界は7Åから構造決定に用いた2.7Åデータセットまで変動した。回折データを指数化し、統合し、ソフトウェアパッケージHKL2000を用いて評価した(Otwinowski and Minor (1997) In: Methods in Enzymology, Vol. 276:307-326)(表4)。結晶の空間群はP212121であった。
最終モデルは、(340残基の)Gβ1の残基2-340、(68残基の)Gγ2の残基7−52、(15残基の)SIGKの残基1−13及び37の水分子を含んでいた。
1カッコ内の数はもっとも高い解像殻2.8−2.7Åに対応する。
2Rsym=Σh Σi|Ii(h)−<I(h)>|/Σh Σi Ii(h)、式中、Ii(h)及び<I(h)>は、それぞれith及び反射hの強度の平均測定値である。
3最終モデルは、(340残基の)Gβ1の残基2-340、(68残基の)Gγ2の残基7−52、(15残基の)SIGKの残基1−13を含んでいた。
4Rwork=Σh||Fo(h)−|Fc(h)||/Σh|Fo(h)|、式中、Fo(h)及びFc(h)は、それぞれ観察及び計算で得られた構造係数である。Ι/σカットオフはR係数の最終的計算では用いられなかった。
5Rfreeは、ランダムに選択した8%のデータのから成る反射のテスト一式について得られたR係数である。
6N-末端(Gβ1残基2−41及びGγ2残基7−13を含む)のB-係数は80Å2よりも大きい。
野生型Gβ1及びGβ1変異体をバキュロウイルスベクターPDW464で作出した(前記は、Gβ1のアミノ末端の上流のリジンでビオチニル化部位をコードする)(Goubaeve et al. (2003) 上掲書)。変異体は、オーバーラップ伸長PCRにより標準的プロトコルを用いて作出された。野生型及び変異体Gβ1構築物は、ラットのGβ1サブユニットのアミノ末端にin-frame融合された20アミノ酸のビオチンアクセプターペプチド(BAP)配列から成っていた。Sf9細胞でビオチンホロ酵素シンターゼ(BirA)と一緒に発現されたとき、Gβ1サブユニットは、BAP内の特定のリジンアクセプター残基でin vivoで共有結合によりビオチニル化される。このアプローチを用いて、Sf9昆虫細胞1リットル当り1−2mgの精製タンパク質を得ることができる。45ngのタンパク質をファージELISAアッセイで用いるとき、10,000から30,000の結合アッセイのためにただ1回の精製で十分である。
バキュロウイルスはBAC-TO-BAC(商標)システムを用い、製造業者(GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)の指示にしたがって作成した。Sf9細胞(200mL)は、(His)6-Gαi1をコードする0.5mLのバキュロウイルス、4mLのGγ2ウイルス及び4mLの野生型若しくは変異Gβ1ウイルスで三重に感染させた。Gβ1γ2ダイマーは、十分に確立された方法に表示の改変を加えた方法を用いて感染60時間後に精製した(Kozasa and Gilman (1995) 上掲書)。細胞ペレットを4mLの溶解緩衝液(50mMのHEPES(pH8.0)、3mMのMgCl2、10mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEDTA、100mMのNaCl、10μMのGDP、及びプロテアーゼ阻害剤)中で液体窒素にて凍結-融解を4サイクル実施することによって溶解した。1%のコール酸ナトリウムを用いて膜を可溶化し、100,000gで20分超遠心分離して清澄にし、0.5%ルブロール含有緩衝液で稀釈し、さらにNi-NTA樹脂と混合した。十分に洗浄した後、50mMのMgCl2、10mMのNaF、10μMのAlCl3、1%のコール酸塩及び5mMのイミダゾールを含む緩衝液とビーズを室温にて1時間混合することによってGβ1γ2サブユニットを結合-Gαi1から溶出させた。b-βγ及びb-βγ変異体の濃度は、競合的イムノブロッティング及びケミルミネッセンスによって分析した。タンパク質はSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに移し、HRP-結合ニュートラビジン(Pierce, Rockford, IL)で調べた。ケミルミネッセンスシグナルは、EPI-CHEM IITM暗室システム(UVP Bioimaging Systems, Upland, CA)を用いて測定した。溶出b-βγダイマーの濃度は、少なくとも2つの別個のゲルから得た完全精製100%ビオチニル化Gβ1γ2の標準曲線と比較することによって決定した。
野生型及び変異体b-βγとのペプチド結合の判定に用いたファージELISAアッセイは、標準的方法にしたがって実施した(Smrcka and Scott (2002) Methods Enzymol 344:557-76)。簡単に記せば、1μgのストレプトアビジンを96ウェルプレートのウェルに4℃で一晩固定した。前記ウェルをトリス緩衝食塩水(TBS)中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)100μLで1時間4℃にてブロッキングし、続いて1xのTBS/0.5%TWEEN(商標)で3回洗浄した。TBS/0.5%TWEEN(商標)中の25nMのbGβ1γ2(40μL)を各ウェルに添加し、1.5時間4℃でインキュベートした。ウェルを洗浄し、続いて1x106から1x1010のファージ粒子を添加し、3時間4℃でインキュベートした。続いてウェルをTBS/0.5%TWEEN(商標)で6回洗浄し、次に1:5000希釈の抗M13抗体(Pharmacia, Uppsala, Sweden)40μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、続いて40μLの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン)-6-スルホン酸(ABTS)を添加し、比色反応を405nmでモニターした。非特異的結合を各読取り値から差し引いた。
部分精製したb-βγサブユニットにより得たシグナルは、完全精製b-βγサブユニットから得たシグナルと同様であった。Gαi・Gβ1γ2結合の遮断は、SIGKの存在下又は非存在下で50pMの固定b-βγに200pMのFITC-Gαi1を同時添加し、ビーズに結合したFITC-Gαiの量をフローサイトメトリーで標準的方法にしたがって測定することによって判定した(Ghosh et al. (2003) 上掲書;Sarvazyan et al. (1998) J Biol Chem 273:7934-40)。
特段の指示がなければ、接頭辞“s”をもつアミノ酸残基はSIGK残基であることを示している。
Gβ1は、7つの4本鎖βシート(“ブレード”)及びGγ2と強く相互作用するN-末端伸長ヘリックスを含むβ-プロペラーである。各シートは、種々の長さのループによって連結されたWD-40リピートを含む。Gβ1の残基2−340は前記モデルに含まれている。Gβ1のコア全体のB係数は40Å2未満である。B係数が>60Å2である残基は以下の3つのループ領域で見出されている:ブレード2内のLys127−Ser136、ブレード4内のArg214−Met217、及びブレード6とブレード7を連結するループ内のSer265−Ile269。Gγ2は、残基Asn24−Lys29によって作られる捩れをもつヘリックス及び残基His44で始まるコイル領域を形成する。Gγ2分子内の平均B係数は44Å2である。Gγ2のN-末端の7つの残基及びC-末端の16残基、又はGγ2のC-末端におけるプレニル脂質改変については、電子密度は観察されなかった。
SIGKは、10位のグリシンによって破壊されるαヘリックスを形成する。C-末端の3つの残基は伸長構造を形成し、前記構造はGβ1分子から伸びており、sPro12とAsp13の間で対称関係のGβ1分子のThr47及びLys337との結晶接触によって支えられている。SIGKのN-末端(sSer1、sIle2)及びC-末端(sGly10−Asp13)残基のB係数は50Å2より大きい(他の全ての残基のB係数は30−50Å2である)。残基1−13における主鎖原子の電子密度は明瞭に規定されているが、Gβ1と接触しないSIGK側鎖の3つ(sIle2、sLys7及びsAsp13)は無秩序である。ペプチドはGβ1の“最上部”面を横断して結合し、溶媒が接近し得る全表面積の970Å2に埋没する。ペプチドはGγ2サブユニットとは接触しない(前記はGβ1トーラスの“底部”表面と結合する)。
Gβ1上のSIGK接触表面は以下の2つの領域に分けられる:ペプチドのN-末端と相互作用するGβ1上の酸性領域及びペプチドのC-末端と相互作用する主に非極性の領域。総合すれば、13のGβ1残基はSIGKと直接接触し、β-プロペラーの7つのブレードのうち6つが寄与する(表5)。
SIRK及びSIGKペプチドの変異解析によって、今はSIGK・Gβ1γ2構造に関して説明することができる(Scott et al (2001) 上掲書;Goubaeva et al. (2003) 上掲書)。野生型SIRKペプチドは、Gβ1γ2によるPLC β2の活性化を5μMのIC50で阻害する。SIRKペプチドのsLys4のアラニンによる置換はこのペプチドのIC50を1/12に低下させ、sAla5のグリシンへの変異はIC50を1/13に低下させる。sIle2のアラニンへの変異はこのペプチドのIC50を1/4に低下させ、sSer1のアラニンへの変異はIC50に影響を与えない(Scott et al. (2001) 上掲書)。SIGK・Gβ1γ2構造は、sSer1の主鎖並びにsIle2、sLts4及びsAla5の側鎖がGβ上の多数の残基と接触することを示し、それによってこの変異データを説明する。
Gβ1γ2・SIGK複合体のための結合エネルギーに対する、Gβ1γ2・SIGK接触面で観察されるGβ1残基の寄与を測定するために、2つのアプローチを利用した。第一に、ELISAアッセイを用いて、固定Gβ1γ2サブユニットとSIGK配列をディスプレーするファージとの結合を測定した(表6)。次にこのELISA結合データを、Gβ1γ2とGαi1との結合の競合物質としてSIGKのIC50値と相関させた(表7)。続いて、Gβ1サブユニット内に変異を含むGβ1γ2ヘテロダイマーを用いて両アッセイを実施した。N-末端結合表面において、Gβ1のAsn230のアラニンへの変異はペプチドに対するGβ1γ2の親和性を1/10に低下させた(表6)。Gβ1残基Asp186、Met188、Tyr145及びLeu117のアラニンへの単一変異はまた、SIGKに対する親和性が劇的に低下するGβ1γ2ダイマーを生じた(表6)。Asp228又はAsp246のどちらかがアラニンで置換されたGβ1変異体はGγ2とダイマーを形成せず、したがって解析されなかった。しかしながら、Asp228がセリンで置換された変異体は、SIGKペプチドに対する結合親和性においてわずかな低下を引き起こしただけであった(表6)。したがって、N-末端のSIGK結合接触面を作り出すGβ1残基の多くは結合エネルギーに大きく寄与する。
SIGKペプチドと接触するアミノ酸を個々にアラニンに(又はAsp246のためにはセリンに)変異させ、ファージELISAを用いてペプチドとの結合をアッセイした。固定b-βγをSIGKペプチドディスプレーファージと一緒にインキュベートした。ファージの結合をα-ファージ抗体を用いて検出した。未加工データは405nmでの吸収であった。表示のデータは3つの別個の実験から得たトリプリケートの測定値の平均±SDである。
代表的なGβ1サブユニット変異体とのFITC-Gαi1Gβ1γ2相互作用に対するSIGKの競合。野生型又は変異体b-βγタンパク質を被覆したストレプトアビジンビーズにSIGK及びFITC-Gαi1を同時に添加し、ビーズに結合したFITC-Gαi1をフローサイトメトリーでアッセイした。データは代表的な実験のトリプリケートの測定値の平均±標準偏差として示されている。実験は2回(Met188A)又は3回(野生型、Arg314A、Trp332A)繰り返され、同様な結果が得られた。SIGK結合親和性領域に広がる変異体の選別に対する2つのアッセイの比較によって、結合の50%低下はIC50の5倍増加になり、結合の75%低下は10倍増加に相当し、90%低下は20倍のシフトであり、98%低下は50倍のシフトであることが示された。IC50値は以下のとおりである:野生型=0.47μM、Arg314A=1.5μM、Trp332A=9μM、及びMet188A=22μM。
SIGK C-末端結合表面を構成するGβ1内のアミノ酸の変異はSIGKペプチドに対する親和性の低下をもたらすが、ただしその程度は様々である。Leu117、Met188又はTro332のアラニンへの変異はSIRK結合をほとんど停止させ、Lys57、Tyr59、Met101及びArg314の変異体はより軽度の影響を示した(表6及び表8)。Trp99は親和性を1/4に低下させた。本明細書で提示した全Gβ1変異(すなわちアラニンへの変換)及びそれらの影響の要旨は表8に列挙される。
Gβ1γ2・SIGK複合体におけるGβ1の結合表面はSIGKの結合に際して顕著には変化しない。Gβ1γ2・SIGK複合体内のGβ1のコア残基と複合体未形成Gβ1γ2ヘテロダイマーのコア残基(1TBG(Sondek et al. (1996) Nature 379:369-74);Val40−Asn340, Cαのみ)との間のRMSDは0.88Åである。しかしながら、Trp99、Tyr59、Asn228、Leu117及びMet101の側鎖は回転してSIGKを収容し、これらの残基内の原子は、複合体未形成Gβ1のそれらに位置と比較してそれぞれ最大4.0Å、3.6Å、2.9Å、2.8Å及び2.3Åの変位を受ける。SIGK結合表面の残基に対するB係数は複合体に対する全体平均に近い。しかしながら、Trp99のB係数は、対応する構造の標準化B係数の比較によって示されるように、SIGKとの結合に際して1/2に低下する。この分析では、SIGK結合に際してGβにおける大きな配座変化も又は無秩序秩序転移も存在しない。SIGK・Gβ1γ2複合体は、以下の5つのGβ1γ2複合体とタンパク質標的との複合体と比較することができる:Gβ1γ2・Gαi1ヘテロダイマー(1GG2)(Wall et al. (1995) 上掲書;Wall et al. (1998) 上掲書)及びGβ1γ2・Gαt/iヘテロトリマー(1GOT)(Lambright et al. (1996) 上掲書)、Gβ1γ2・フォスデュシン複合体(1AOR及び2TRC)(Loew et al. (1998) 上掲書;Gaudet et al. (1996) 上掲書)、並びにGβ1γ2・GRK2複合体(1OMW)(Lodowski et al. (2003) 上掲書)。これらの構造の各々を有するGβ1γ2・SIGKのスーパーポジションは、Gβ1残基40−340について1.0Å(Cαのみ)未満の平均RMS偏差を生じる。Gβ1γ2・フォスデュシン複合体に必要とされるいくつかの残基を例外として、Gβγヘテロダイマーは、タンパク質標的と結合するために顕著な構造的再編成を受けず、Gβ1γ2・SIGK構造においても顕著な構造的再編成を受けない。
蛍光標識Gαi1(Fαi1)を標準的方法にしたがって調製した(Sarvazyan et al. (1998) 上掲書)。Gα-Gβγ相互作用に対するペプチドの作用を決定するために用いたアッセイには競合アッセイ及び解離アッセイが含まれていた(Ghosh et al. (2003) 上掲書)。簡単に記せば、競合によるアッセイのためには、100pMのFαi1及び表示の濃度のペプチドを50pMのb-Gβ1γ2(1mL当たり105のビーズに固定)に添加し、室温で30分インキュベートして平衡させた。続いて、ビーズ結合蛍光をBD Biosciences FACSCALIBURTMフローサイトメトリーで記録した。バックグラウンド蛍光についてデータを修正し、Graph Padプリズム4を用いてS字形用量応答曲線に合わせた。b-Gβ1γ2からFαi1の解離を測定するために、100pMのFαi1を50pMの固定b-Gβ1γ2と室温で15−20分インキュベートした。結合したFαi1サブユニットの蛍光を測定し、続いて200倍過剰の非標識Gαi1又はペプチドを添加し、ビーズに結合したままのFαi1の量を表示の時間に測定した。
SIGKペプチド結合のための接触面は以下の2つの広い相互作用に分割されることが判明したので、前記ペプチド認識のための分子的根拠を明らかにした:C-末端結合接触面(前記はペプチドの疎水性コアと接触する;アミノ酸8−10、Ile-Leu-Gly)及びN-末端接触面(前記はペプチドのN-末端(主としてLys4)と結合する)。したがって、Gβ1の共通の結合表面を個々にアラニンで置換し、どのアミノ酸が、Gβ1γ2と9つの別個のSIGKペプチド誘導体との相互作用にもっとも重要であるかを決定した(表9)。
*下線を付した残基はN-末端と接触するリジン残基及び疎水性コア残基を示す
以前に同定された種々のコンセンサスペプチド群(Scottらの文献(上掲書(2001);表9を参照されたい)を代表する9つのペプチドを選択し、コンセンサス群内又は群間で結合の特徴を比較した。これらのペプチドをディスプレーするファージと野生型Gβ1γ2との結合は、異なっているが同様な範囲に入るELISAシグナルを生じた(ファージ3.14に対して25%から100%の結合)。本明細書に開示するように、ELISAアッセイで得られた結合シグナルを、溶液系アッセイにおけるペプチドの反応態様と前記の結果を比較することによって親和性の低下に対して修正した。例えば、ELISAで80%の結合低下を示す変異体は、溶液のペプチド親和性では10倍シフトに一致した。本開示の目的のために、野生型の結合の20%未満の結合に低下させるいずれの置換も当該ペプチドにとって決定的な結合接触であると判断した。この分析から得られたデータは表10に提示される。
野生型又はアラニン置換ビオチニル化Gβ1γ2サブユニットをストレプトアビジン被覆96ウェルプレートに固定し、続いてファージを添加した。ファージの結合を本明細書に記載するように判定した。データはファージのプレートとの非特異的結合について修正し、野生型結合のパーセントとして表した。提示したデータは3つの別個の実験のデュープリケートの決定値の平均±SDである。
SIGKのN-末端は、以下の2つの主要な接触を介してGβサブユニットと相互作用する:βAsp186及びβTyr145とsSer1の相互作用、並びにファンデルワールス相互作用によるβMet188と、及び水素結合又は荷電を介する相互作用によるβAsn230、βAsp246及びβAsp228とsLys4の相互作用。本明細書で利用される発現系では、Asp228Ala及びAsp246Alaはガンマによりダイマー化されることはなく精製できなかったが、しかしながらAsp246Serは発現され精製された。一般的に、I、II及びIV群のペプチドはN-末端領域との結合のために相当な要求を示し(Met188Ala及びAsp246Ser(SIGKを除く)変異体とのほぼ完全な結合消失によって示される)、さらにAsn230に対しては種々の要求を示す。
I、II及びIV群のペプチドは保存モチーフを有し、前記モチーフでリジンは疎水コアモチーフから3アミノ酸置いて配置される(表9参照)。SIGK内のこのモチーフは、N-末端結合表面と相互作用するリジンとC-末端と相互作用するIle-Leu-Glyモチーフとの間の単一αヘリックスターンで適切な間隙を提供する。他のペプチドのいくつかも、この間隙を決定的に重要なものとし得る同様なαヘリックス構造を採用すると考えられる。III群のペプチドはC-末端の相互作用領域と結合するが、Met188に対する要求を欠き、Asn230及びAsp246に対しては最小限の要求を示し、III群ペプチドはβとそれらの相互作用のためにN-末端結合表面を用いないことを示唆している。
SIGKと外見的には直接結合しない2つのアミノ酸、Arg314およびHis311もまた解析した。Arg314の置換はSIGK結合の軽度の低下をもたらすが、他のペプチドについてはArg314は絶対的に要求され、それらペプチドはこのアミノ酸と直接相互作用し得ることを示唆している。His311は、SIGKペプチド結合部位の十分に外側に存在するが、βγサブユニットの配座変化におけるその潜在的な必要性のために変異させた(Gaudet et al. (1996) 上掲書;Loew et al. (1998) 上掲書)。His311のイミダゾール側鎖はArg314のグアニド窒素から13Å離れている(Arg314は前記ペプチドのいずれとも明瞭に相互作用するもっとも近傍のアミノ酸である)。His311がファージディスプレー由来ペプチドのアミノ酸と直接相互作用することは、おそらくなさそうである。それにもかかわらず、His311のアラニンへの変異は多様なペプチドの結合に種々の程度で影響を与えた。その結合がHis311Aによって影響を受けるペプチドはまた結合のためにArg314を要求した(おそらくArg314の位置における変化による作用)。
N-末端ペプチド結合接触表面とのペプチドの結合の重要性をより直接的に判定するために、SIRKのsLys4残基をアラニンに変異させ、N-末端結合ポケットとの極めて重要な接触を排除した。このペプチドは、Gα-Gβγ相互作用の遮断についてはSIRKよりもはるかに低い親和性を示した(IC50は1.4μMに対して60μM)が、高濃度においては前記ペプチドはSIRKのレベルに近いレベルで遮断した。Gα-Gβγ相互作用の遮断にもかかわらず、SIRK(Lys4Ala)はヘテロダイマーの解離を加速することができなかった。Fαi1の見かけの脱離速度は、固有の解離速度と比較してSIRK(Lys4Ala)については遅いように見える。これは、SIRK(Lys4Ala)は低親和性ブロッカーであるためかもしれず、Fαi1の再結合を防止するには有効ではない。SIRK(Lys4Ala)の低親和性が解離を加速できないことの原因ではないことを確認するために、SIRK(Lys4Ala)に対して相応の親和性を有するペプチド、SIRK(Gly10Ala)(IC50約80μM)を調べた。このペプチドはLys4を有するが、10位でGlyがAlaで置換されている。したがってSIRK(Gly10Ala)はN-末端接触表面との結合を維持するが、C-末端領域との相互作用の低下のために親和性が低下している。SIRK(Gly10Ala)は高いペプチド濃度でヘテロダイマーの形成を遮断し、Gβγに対する低親和性にもかかわらず、ヘテロトリマー解離を加速することができた。
本明細書に開示したGβ1サブユニット変異体は、Gγ2と6ヒスチジンタグ付加Gαi1との複合体として昆虫細胞から単離され、結晶構造から予想されるサブユニット間のこれらの接触の多くは、それぞれ1つ1つはGαサブユニット結合にとって重大ではないことを示した。どのアミノ酸が、解離速度定数を増加させるペプチドの能力に寄与するかを決定するために、個々に置換したb-β1γ2変異体の各々からのFαi1の解離速度定数(Koff)を測定した。野生型についての固有の脱離速度は0.123 s-1であり、以前の測定値によく対応している(Sarvazyan et al. (1998) J Biol Chem 273:7934-7940)。これら変異体の全てのデータは表11に示されている。
**4つの別個の実験の平均±SD。
#ワンウェーANOVAに続いて独立直線対比によって決定したとき野生型と比較して統計的に有意である。
*F-αiの十分に安定な結合が検出できなかったのでKoffは測定できなかった。
ファージELISAアッセイを用いて、コンピュータースクリーニングで同定された小分子がGβγタンパク質相互作用表面と相互作用することができるか否かを決定した。SIGKをディスプレーするファージを既に確立された方法にしたがって用いた(Scott et al. (2001) 上掲書;Smrck and Scott (2002) 上掲書)。スクリーニングは、Gβγサブユニット及びファージを含むウェルの光学密度(OD)の低下によった。各プレートでは、3つのウェルが結合について陽性コントロールを含み、前記コントロールはb-βγサブユニット、SIGK-ファージ及び適切な量のベヒクルを含んでいた。3つのバックグラウンドウェルはβγサブユニットを含んでいなかった。
本明細書に開示したように、ビオチニル化Gβγサブユニットをストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレートの表面に固定し、続いて、Gβγ結合ペプチドをディスプレーするファージを添加し、テスト化合物の存在下及び非存在下で結合を抗ファージ抗体により検出した。
弁別したHL-60好中球培養(0.2x106細胞/mL)の35mL培養を2組使用してCa2+流を測定した。細胞はDMSO(1.2%)を添加して3日間培養し、HSSで洗浄し、さらに2mLのHBSSに7x106細胞/mLの濃度で再懸濁した。増殖培養液へのDMSOの添加は、これら細胞の形態学的及び機能的に成熟した好中球への分化を誘発した(Collins et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:2458;Collins et al. (1979) J Exp Med 149:969)。好中球にはfura-2(蛍光性Ca2+感受性インジケーター)(1μM)(Suh et al. (1996) J Biol Chem 271:32753)を45分間予めローディングし、HBSSで洗浄し、さらに2mLのインジケーター非含有HBSSに再懸濁した。140μLの細胞を総量2mLのHBSSに添加した。340及び380nmの二重励起並びに510nmの発光によって蛍光比を得た。安定な基準線が得られた後、DMSO又はNSC119910のどちらかを添加し、5分インキュベートした。続いて、fMLP又はATPアゴニストのどちらかを添加して細胞内貯蔵からCa2+の放出を活性化させた。
Claims (7)
- Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定する方法であって、前記方法が、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と接触させ、さらに前記物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かを決定し、それによってGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定することを含む、前記同定方法。
- 請求項1に記載の方法によって同定される物質。
- βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定する方法であって、前記方法が、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合するペプチドの存在下において接触させ、さらに、前記物質が、前記ペプチドとβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基との結合を阻害するか否かを決定し、それによってβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定することを含む、前記同定方法。
- 請求項3に記載の方法によって同定された物質。
- SIGKペプチド又はSIGKペプチド誘導体を含む、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定することを目的とするキット。
- Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する方法であって、前記方法が、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質とGタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量とを接触させることを含む、前記調節方法。
- 少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患若しくは症状を予防又は治療する方法であって、前記方法が、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患又は症状を有するか、又は前記を有するリスクが有る患者に、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量を投与し、それによって少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患若しくは症状を予防又は治療することを含む、前記予防又は治療方法。
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