JP2002531384A - ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域との相互作用を変調するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及びＰＤＺ領域含有蛋白質を包含する複合体；ＰＤＺ領域結合部位を有するＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用に干渉するペプチド；及びペプチドと複合体の使用に関する。ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変調する方法、並びに化合物について、相互作用を変調する能力を評価する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、ＰＤＺ領域結合部位を有するＢクラスｅｐｈｒｉｎ及びＰＤＺ領域
含有蛋白質を包含する複合体；ＰＤＺ領域結合部位を有するＢクラスｅｐｈｒｉ
ｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用に干渉するペプチド；及びそのペプチド
と複合体の使用に関する。

【０００２】発明の背景 後生生物中に同定される多数の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のうち、Ｅ
ｐｈ族は幾つかの点で特殊である。Caenorhabditis elegansゲノムによってコー
ドされるＥｐｈ ＲＴＫのみ（ｖａｂ−１遺伝子産物（２））が知られているが
、脊椎動物は一般に１４個のＥｐｈ受容体遺伝子を有する。このことは、これら
のチロシンキナーゼが複雑な細胞相互作用を制御するのに重要であることを示唆
している（３、４）。この可能性と一致して、C. elegansＶＡＢ−１は、腹側閉
鎖時に形態形成上の細胞移動を調整する（２）一方で、脊椎動物のＥｐｈ受容体
は、軸索の誘導及び繊維束形成の制御；中枢神経系内の配置の指定；発達におけ
る神経冠細胞の移動の組織化；口蓋閉鎖時における上皮組織膜の直接的融合；及
び血管形成に関与している（５−１５）。

【０００３】 ＥｐｈＢ２（かつてはＮｕｋと呼ばれた）の、発現パタ−ンに関する初期の研
究は、この受容体がマウス中脳の発達における細胞−細胞接合部位に密集してい
ることを示唆しており、Ｅｐｈ受容体が、直接的な細胞−細胞間相互作用によっ
て誘導されたシグナルを媒介している可能性を挙げている（５）。Ｅｐｈ受容体
は通常、隣接する細胞表面に物理的に関連するリガンドによって活性化される、
ということを支持する証拠が幾つも挙がっている。Ｅｐｈ受容体に対する公知の
リガンド（ｅｐｈｒｉｎと称される）は全て、配列上の関連があるが、Ｃ末端モ
チーフに基づいて２つのグループに分けることができる。Ａクラスｅｐｈｒｉｎ
リガンドは、Ｃ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基によっ
て改変され、その基を通じてリガンドはリガンドを発現した細胞表面上に固着す
る（７、９、１６）。これに対してＢ型ｅｐｈｒｉｎは、膜貫通要素、及びＣ末
端８２−８８残基を包含する高度に保存された細胞質内テールを有する（１７−
２２）。次にＥｐｈ受容体は、配列の類似性、並びに溶解性のＡ型又はＢ型ｅｐ
ｈｒｉｎに結合する傾向に基づいて、それぞれＡ群及びＢ群に分けることができ
る（４、２３、２４）。しかし、可溶性ｅｐｈｒｉｎが対応する受容体にしっか
り結合しても、Ｅｐｈチロシンキナーゼ活性を確実に活性化させるには、リガン
ドを人工的にオリゴマー内に密集させるか、受容体を発現する細胞を、膜関連ｅ
ｐｈｒｉｎを発現する細胞と共に培養することが必要である（１８）。これらの
データは、ｅｐｈｒｉｎが集合し、それによりＥｐｈ受容体を活性化させる能力
が細胞表面への固着に依存していることを示唆しており、Ｅｐｈ受容体シグナリ
ングが細胞−細胞相互作用に関与しているという見解に一致する。マウスの胚発
生において、Ｅｐｈ受容体及びそのリガンドは、機能的なしかし相補的なパター
ンで発現されるが、このことはＥｐｈ受容体が、Ｅｐｈとｅｐｈｒｉｎ発現細胞
が隣接する境界において、活性化されている可能性を示している（２３、２５）
。

【０００４】 C. elegans及びマウスにおけるＥｐｈ受容体機能の遺伝子分析は、Ｅｐｈ受容
体がキナ−ゼ依存性及びキナーゼ非依存性両方のシグナリング形態を有すること
を示しており、Ｂ型Ｅｐｈ受容体及びｅｐｈｒｉｎが双方向性の細胞−細胞シグ
ナリングを媒介する可能性を示している（２、６）。興味深いことに、Ｅｐｈ受
容体の膜貫通ｅｐｈｒｉｎＢ１又はＢ２への結合、並びに血小板由来成長因子（
ＰＤＧＦ）によるｅｐｈｒｉｎＢ発現細胞の処理はいずれも、高度に保存された
細胞質テール内のチロシン残基上でｅｐｈｒｉｎをリン酸化する（２６、２７）
。更に、繊維芽細胞成長因子で処理して抑制して、XenopusｅｐｈｒｉｎＢ分子
が細胞質内で発現すると、Xenopus胚における固着性が著しく失われる（２８）
。

【０００５】発明の概要 Ｂクラスｅｐｈｒｉｎは、ＢクラスＥｐｈ受容体チロシンキナーゼのリガンド
として機能し、固有のシグナリング機能を有する。Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのカルボキ
シル末端の配列は、ＰＤＺ結合部位を含んでおり、その部位を通じて膜貫通ｅｐ
ｈｒｉｎが細胞質蛋白質と相互作用する。１０．５日マウス胚発現ライブラリー
を、ｅｐｈｒｉｎＢ３のＣ末端に相当するビオチン化ペプチドでスクリ−ンした
。分子ＧＲＩＰの断片、蛋白質ｓｙｎｔｅｎｉｎ及びＰＨＩＰ（Caenorhabditis
elegans ＰＡＲ−３に関連した新規なＰＤＺ領域含有蛋白質）の、３個の正の
ｃＤＮＡが、複数のＰＤＺ領域を有するポリペプチドをコードした。更に、定方
向（oriented）ライブラリー法（１）によって予想されたＰＤＺ領域の結合特異
性は、チロシンホスファターゼＦＡＰ−１をＢ型ｅｐｈｒｉｎの潜在的な結合相
手として同定した。生体外の研究によって、ＦＡＰ−１の第５のＰＤＺ領域及び
全長ｓｙｎｔｅｎｉｎが、Ｃ末端モチーフを通じてｅｐｈｒｉｎＢ１と結合する
ことが示された。最後に、ｓｙｎｔｅｎｉｎ及びｅｐｈｒｉｎＢ１は、トランス
フェクトされたＣｏｓ−１細胞から共免疫沈降できるが、このことは細胞内でＢ
型ｅｐｈｒｉｎがＰＤＺ領域に結合することを意味する。これらの結果は、Ｂ型
ｅｐｈｒｉｎのＣ末端モチーフが、特異的なＰＤＺ領域含有蛋白質に対する結合
部位を有しており、これにより潜在的に、Ｅｐｈ受容体に対する相互作用のため
の膜貫通リガンドが局在化され、ｅｐｈｒｉｎＢ発現細胞内でのシグナリングに
関与していることを示唆している。

【０００６】 該して、本発明は、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との複合体
に関する。本発明は更に、ＢクラスｅｐｈｒｉｎのＰＤＺ結合領域に由来するペ
プチドに関する。本発明は更に、本発明の複合体及びペプチドに特異的な抗体を
企図する。

【０００７】 本発明は更に、有効量の下記から選ばれる１個以上を投与することを包含する
、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用に干渉する方法を
提供する。（ａ）Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及びＰＤＺ領域含有蛋白質を包含する複
合体；（ｂ）ＢクラスｅｐｈｒｉｎのＰＤＺ結合領域に由来するペプチド；又は
（ｃ）ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用のエンハンサ
ー又は抑制剤。

【０００８】 本発明は更に、（ａ）複合体を、複合体に結合する可能性のある少なくとも１
個の物質に、物質と複合体との結合を可能にする条件下で反応させ、そして（ｂ
）結合を検出する（ここで結合の検出は、物質が複合体に結合することを意味す
る）ことを包含する、ＢクラスｅｐｈｒｉｎＢ及びＰＤＺ領域含有蛋白質を包含
する複合体に結合する物質を同定する方法を提供する。結合は、物質−複合体共
役体、あるいはＢクラスｅｐｈｒｉｎＢ又はＰＤＺ含有蛋白質の活性化を検定す
ることによって検出することができる。本発明は又、本発明の複合体に相互作用
する他の細胞内蛋白質に結合する物質を同定する方法を企図する。

【０００９】 更に本発明は、ある化合物が、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質
との相互作用を変調する能力を有するかどうかを評価する方法を提供する。例え
ば、本発明の複合体内で分子間の相互作用を阻害する又は増加させる物質、ある
いは本発明の複合体内の分子に結合する物質を、評価することができる。ある態
様においては、本発明の複合体を複合体に結合する物質、及び試料化合物と共に
、物質と複合体との共役体を形成することが可能な条件に提供し；共役体を除去
及び／又は検出することを本方法は包含する。他の態様においては、Ｂクラスｅ
ｐｈｒｉｎ、ＰＤＺ領域含有蛋白質、及び試験化合物を、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ
とＰＤＺ領域含有蛋白質との結合を可能にする条件に提供し；（ｂ）結合を検出
する（ここで試験化合物の非存在下における結合に比較して、増加した又は減少
した結合が検出されたとき、試験化合物がＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含
有蛋白質との相互作用を変調することを意味する）ことを包含する。

【００１０】 本発明は更に、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用に
干渉する、式Ｉで表わされるペプチドを企図する。 Ｘ−Ｘ^１−Ｘ^２−Ｋ−Ｖ Ｉ ここでＸは０〜７０、好ましくは０〜５０、より好ましくは２〜２０個のアミノ
酸であり、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれチロシン又はホスホチロシンを表わす。本発
明は更に、本発明のペプチドの類似体に関する。

【００１１】 更に本発明は、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎの末端アミノ酸Ｖａｌを変化させること
を包含する、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変調
する方法に関する。

【００１２】 本発明の、複合体、ペプチド及び抗体、並びに本発明の方法を用いて同定した
物質及び化合物を、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用
の変調に用いることができ、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及び／又はＰＤＺ領域含有蛋
白質に関連する細胞の細胞作用（特に軸索形成、神経細胞相互作用及び再生にお
ける、例えば増殖、成長及び／又は分化）の変調に用いることができる。

【００１３】 従って、複合体、抗体、ペプチド、物質及び化合物を調合して、中枢神経系の
疾患（例えば神経変性や神経損傷）などのＢクラスｅｐｈｒｉｎに関連した疾患
を有する患者に投与するための組成物とすることができる。従って本発明は、本
発明の複合体、ペプチド又は抗体、あるいは本発明の方法を用いて同定した物質
又は化合物１以上、並びに薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を包含す
る組成物に関する。Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及び／又はＰＤＺ領域含有蛋白質に関
連した細胞の増殖、成長及び／又は分化を変調する方法としては又、本発明の複
合体、ペプチド又は抗体、あるいは本発明の方法によって同定した化合物又は物
質、あるいはそれらを含む組成物を細胞に導入することを包含するものが提供さ
れる。本発明の組成物を用いて、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及び／又はＰＤＺ領域含
有蛋白質に関連した、増殖及び／又は分化の疾患を処理する方法も、提供される
。

【００１４】 本発明のその他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明から明らかになる
であろう。しかし、詳細な説明及び特異な例は本発明の好ましい態様を示すため
に例証として記載したものであり、本発明の精神及び範囲内で様々な改変を行う
ことが詳細な説明から当業者には自明である、ということが理解されて然るべき
である。

【００１５】発明の詳細な説明 定義 特に記さない限りは、本明細書で用いた全ての用語は、本発明の分野で通常の
知識を有する者が用いるのと同じ意味で用いられる。実施者は特に、Current Pr
otocols in Molecular Biology（Ａｕｓｕｂｅｌ）の定義及び技術用語を参照さ
れたい。

【００１６】 アミノ酸残基の省略形は、当分野において２０の一般的なＬアミノ酸のそれぞ
れに用いられている、標準的な三文字及び／又は一文字のものである。同様に、
核酸の省略形も、当分野で用いられている標準的なコードである。

【００１７】 「抗体」とは、未反応の、モノクローナル又はポリクローナル分子、免疫学的
に活性を有する断片（例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ）_２断片）、抗体Ｈ鎖及び抗体
Ｌ鎖、遺伝子工学的に作成した単鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４，
９４６，７７８号）、又はキメラ抗体（例えばネズミ抗体に特異的に結合する部
位を有するが、残りの部分がヒト由来である抗体）を意味する。モノクローナル
及びポリクローナル抗体、断片並びにキメラ等の抗体は、当業者に公知の方法で
調製することができる。本発明の複合体又はペプチドに結合する抗体は、目的と
する免疫化抗原を含む未反応のペプチド又は断片を用いて調製することができる
。動物を免疫化するのに用いるポリペプチド又はオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻
訳によって、又は化学的に合成して得ることができ、望ましい場合には担体蛋白
質に結合させることができる。ペプチドに化学的に結合させることのできる好ま
しい担体の例としては、ウシ血清アルブミン及びチログロブリン、スカシガイ科
ヘモシアニンが挙げられる。このようにして結合されたペプチドを、動物（例え
ばマウス、ラット、ウサギなど）の免疫化に用いることができる。

【００１８】 「Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ」とは、Ｅｐｈ受容体に結合し、膜貫通要素と、Ｃ末
端８２−８８残基を包含する、高度に保存された細胞質テールを有する蛋白質族
である（１７−２２）。Ｂクラスｅｐｈｒｉｎの例としては、ｅｐｈｒｉｎＢ１
（ＬＥＲＫ−２Ｅｌｋ−Ｌ、ＥＦＬ−３、Ｃｅｋ−Ｌ及びＳＴＲＡ１としても知
られる）、ｅｐｈｒｉｎＢ２（Ｈｔｋ−Ｌ、ＥＬＦ−２、ＬＥＲＫ−５及びＮＬ
ＥＲＫ−１としても知られる）及びｅｐｈｒｉｎＢ３（ＮＬＥＲＫ−２、Ｅｌｋ
−Ｌ３、ＥＦＬ−６、ＥＬＦ−３及びＬＥＲＫ−８）が挙げられる。この族には
、実質的に配列同一性を有する蛋白質（すなわち同族体）、蛋白質の断片（例え
ば配列番号１５、１６及び１７参照）も含まれる。本発明の複合体及び方法に用
いられるＢクラスｅｐｈｒｉｎは、ＰＤＺ領域含有蛋白質に結合する結合領域を
有する。結合領域は、コンセンサス配列ＹＹＫＶを有する。

【００１９】 本明細書において「単離された」とは、天然の環境から取り出されあるいは単
離され、天然において関連のある他の構成要素を少なくとも６０％、好ましくは
７５％、最も好ましくは９０％含んでいない、核酸又はアミノ酸配列のことをい
う。

【００２０】 本明細書において「変調する」とは、蛋白質の生物学的活性における変化又は
変性のことをいう。変調は蛋白質活性の増加又は減少であってもよいし、結合特
性における変化であってもよいし、蛋白質のその他の生物学的、機能的又は免疫
学的特性における変化であってもよい。

【００２１】 本明細書において「アゴニスト」とは、本発明の複合体又は複合体中の分子に
結合した時に、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ又はＰＤＺ領域含有蛋白質の活性量を増加
させる又は活性期間を延長させる、あるいは複合体形成を増加させる分子のこと
をいう。アゴニストには、蛋白質、核酸、炭水化物、あるいは複合体又は複合体
分子に結合する他の分子などが含まれる。さらにアゴニストには、Ｂクラスｅｐ
ｈｒｉｎのＰＤＺ結合領域に由来するペプチド又はペプチド断片が含まれるが、
野生型分子の全長配列は含まれない。ペプチド模倣体（mimetics）、特定のペプ
チドの構造特徴を模倣するように企図した物理的構造を有する合成分子も、アゴ
ニストとして用いることができる。刺激は直接的であっても間接的であってもよ
いし、その機構は拮抗的であっても非拮抗的であってもよい。

【００２２】 本明細書において「アンタゴニスト」とは、本発明の複合体又は複合体中の分
子に結合した時に、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ又はＰＤＺ領域含有蛋白質の活性量を
減少させる又は活性期間を短縮させる、あるいは複合体形成を減少させる分子の
ことをいう。アンタゴニストには、蛋白質、核酸、炭水化物、あるいはＢクラス
ｅｐｈｒｉｎ又はＰＤＺ領域含有蛋白質に結合する他の分子などが含まれる。さ
らにアゴニストには、ＢクラスｅｐｈｒｉｎのＰＤＺ結合領域に由来するペプチ
ド又はペプチド断片が含まれるが、野生型分子の全長配列は含まれない。ペプチ
ド模倣体、特定のペプチドの構造特徴を模倣するように企図した物理的構造を有
する合成分子も、アンタゴニストとして用いることができる。抑制は直接的であ
っても間接的であってもよいし、その機構は拮抗的であっても非拮抗的であって
もよい。

【００２３】 「ＰＤＺ領域含有蛋白質」とは、ＰＤＺ領域として知られる特徴的な構造モチ
ーフを包含する又は構造モチーフからなる蛋白質、ペプチド又はその断片のこと
をいう（領域の特徴については、Structural Classification of Proteins（Ｓ
ＣＯＰ）データベース参照）。このような蛋白質の例としては、ＧＲＩＰ、ｓｙ
ｎｔｅｎｉｎ、ＦＡＰ−１及びその同族体あるいはその部分が挙げられる。他の
ＰＤＺ領域含有蛋白質は、ＧＥＮＰＥＰＴやＥＮＴＲＥＺ等の公共のデータベー
スを用いて選択することもできる。本発明者らは、本明細書に詳述する、新規な
ＰＤＺ領域含有蛋白質（「ＰＨＩＰ」と称する）を単離した。ＰＤＺ領域含有蛋
白質の例としては、ＧＲＩＰ、ＧＲＩＰ ＰＤＺ６及びＰＤＺ７（配列番号２２
及び２３）、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５（配列番号２１）、ｓｙｎｔｅｎｉｎのアミ
ノ酸残基１〜２９９、ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１及びＰＤＺ２（配列番号２６
及び２７）、ＰＨＩＰ ＰＤＺ２（配列番号２４）並びにＰＨＩＰ ＰＤＺ３（
配列番号２５）が挙げられる。

【００２４】 「結合領域」とは、直接的又は間接的に本発明の複合体の他の分子と相互作用
する、本発明の複合体の分子部分のことをいう。結合領域は分子の連続した部位
すなわち隣接するアミノ酸配列であってもよいし、配座的、すなわち天然の状態
で本発明の複合体分子と相互作用する構造を形成する、非隣接のアミノ酸配列の
組み合わせであってであってもよい。

【００２５】 結合領域から「由来する」とは、本発明の複合体中の分子の、天然の結合領域
と同一であるか、実質的に同等である、あらゆる分子のことをいう。特異的な結
合領域に由来するペプチドには、天然に存在する結合部位のアミノ酸配列、その
結合部位のあらゆる部分、又は関連する分子に結合するように機能する他の分子
が含まれる。そのような結合部位に由来するペプチドは、天然の結合領域を模倣
するような方法で、関連分子と直接的又は間接的に相互作用する。そのようなペ
プチドには、競合阻害剤、ペプチド模倣体などが挙げられる。

【００２６】 「相互作用する」とは、例えば生理学的条件下における、静電気の、疎水性の
、イオン性の及び／又は水素結合の相互作用による、２分子間の安定した関係の
ことをいう。ある相互作用性分子は、１個以上が刺激を受けた時にのみ、相互作
用する。例えば、ＰＤＺ領域含有蛋白質は、基質がリン酸化されている場合には
、基質のみと結合する。

【００２７】 「ペプチド模倣体」とは、分子間の相互作用においてペプチドの代替となる構
造物のことをいう（Ｍｏｒｇａｎ他（１９８９）、Ann.Reports Med.Chem.２４
：２４３−２５２参照）。ペプチド模倣体としては、アミノ酸及び／又はペプチ
ド結合を有しても有さなくてもよいが、本発明のペプチド又はアゴニスト又はア
ンタゴニストの構造及び機能的特性を保持する合成構造体が挙げられる。ペプチ
ド模倣体としては更に、ペプトイド、オリゴペプトイド（Simon他（１９７２）P
roc.Natl.Acad.Sci.USA８９：９３６７）；及び本発明のペプチド又はアゴニス
ト又はアンタゴニストに相当するアミノ酸の可能な配列を表す、企図された長さ
のペプチドを含むペプチドライブラリーが挙げられる。

【００２８】 「基準配列」及び「実質的な配列同一性」の用語は、２個以上の核酸分子又は
蛋白質間の配列関係を述べるために用いている。「基準配列」とは、配列を比較
する基準として用いられるある確定した配列である。基準配列は大きな配列のサ
ブセット（例えば配列リストにある全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント）
であってもよいし、完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列を包含するものであってもよ
い。比較用ウインドウの整列に最適な、配列の整列方法としては、Ｓｍｉｔｈ及
びＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムに基づくもの（（１９８１）Ａ
ｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃ
ｈの相同性整列アルゴリズムに基づくもの（（１９７０）J.Mol.Biol.４８：４
４３）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法によるもの（（１９８
８）Proc.Natl.Acad.Sci.（ＵＳＡ）８５：２４４４）又はこれらのアルゴリズ
ムをコンピューター処理したインプリメンテーションによるもの（GAP、BESTFIT
、FASTA及びTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release７.
０、Genetics Computer Group、５７５Science Dr., Madison、Wis；Clustal W
program（５５）；及びGenestream Align Program）が挙げられる。ポリペプチ
ドについて用いられる、「実質的な配列同一性」とは、例えばＧＡＰ又はＢＥＳ
ＴＦＩＴプログラムによって、デフォールトギャップを用いたとき、２個のペプ
チド配列が、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配
列同一性、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有することを意味する。好
ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なるもので
ある。例えば、類似した荷電又は極性等の化学的特性を有するアミノ酸の置換は
、蛋白質の特性に影響を与えない。そのようなアミノ酸の組み合わせの例として
は、グルタミンとアスパラギン；グルタミン酸とアスパラギン酸が挙げられる。

【００２９】 本発明の複合体 本発明の複合体は、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ蛋白質及びＰＤＺ領域含有蛋白質を
包含する。複合体は、相互作用性分子の結合領域及び（複合体の活性を保持する
のに必要な）その両脇の配列のみを包含するものであってもよいことは、理解さ
れよう。

【００３０】 本発明の一つの態様においては、複合体中のＰＤＺ領域含有蛋白質としては、
ＧＲＩＰ、ＧＲＩＰ ＰＤＺ６及びＰＤＺ７（配列番号２２及び２３）、ＦＡＰ
−１ ＰＤＺ（配列番号２１）、ｓｙｎｔｅｎｉｎのアミノ酸残基１〜２９９、
ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１およびＰＤＺ２（配列番号２６及び２７）、ＰＨＩ
Ｐ ＰＤＺ２（配列番号２４）並びにＰＨＩＰ ＰＤＺ３（配列番号２５）が挙
げられる。本発明の複合体の例としては、ｅｐｈｒｉｎ Ｂ３／ＧＲＩＰ；ｅｐ
ｈｒｉｎ Ｂ３／ＧＲＩＰ ＰＤＺ６及びＰＤＺ７（配列番号２２及び２３）；
ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１／ＦＡＰ−１ ＰＤＺ（配列番号２１）；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ
１又はＢ３／ｓｙｎｔｅｎｉｎのアミノ酸残基１〜２９９；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１
又はＢ３／ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１およびＰＤＺ２（配列番号２６及び２７
）；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又はＢ３／ＰＨＩＰ ＰＤＺ２（配列番号２４）；並び
にｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又はＢ３／ＰＨＩＰ ＰＤＺ３（配列番号２５）が挙げら
れる。複合体はＢクラスｅｐｈｒｉｎ又は本発明のペプチドを包含することがで
きる。例えば、複合体はＹＹＫＶ（配列番号５）、ＧＰＰＱＳＰＰＮＩｐＹＹＫ
Ｖ（配列番号６）、ＮＩｐＹｐＹＫＶ（配列番号７）、ＮＩｐＹＹＫＶ（配列番
号８）、ＮＩＹｐＹＫＶ（配列番号９）、ＮＩＹＹＫＶ（配列番号１０）、ＧＮ
ＩＹＹＫＶ（配列番号２８）、ＧＮＩｐＹｐＹＫＶ（配列番号２９）、ＧＮＩｐ
ＹＹＫＶ（配列番号３０）及びＧＮＩＹｐＹＫＶ（配列番号３１）を包含するこ
とができる。そのような複合体の例としては、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ／ＮＩＹＹＫ
Ｖ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ／ＮＩＹＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎＰＤＺ１及びＰＤＺ２
／ＮＩＹＹＫＶ、ＰＨＩＰ ＰＤＺ３／ＧＮＩＹＹＫＶ、並びにＰＨＩＰ ＰＤ
Ｚ２／ＧＮＩＹＹＫＶが挙げられる。

【００３１】 本発明で例証するように、本発明の複合体中のＢクラスｅｐｈｒｉｎ又はその
部分、又は本発明のペプチドは、リン酸化することができる。従って、ＰＤＺ領
域含有蛋白質を１構成要素として包含する本発明の複合体は、リン酸化Ｂクラス
ｅｐｈｒｉｎ又はその部分、又は本発明のペプチドをリン酸化したものを他の構
成要素として包含してもよい。例えば、複合体は、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ／ＮＩｐ
ＹＹＫＶ、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ／ＮＩｐＹｐＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ／ＮＩＹ
ＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ／ＮＩｐＹＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１及び
ＰＤＺ２／ＮＩＹＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１及びＰＤＺ２／ ＮＩｐ
ＹＹＫＶ、ＰＨＩＰ ＰＤＺ３／ＧＮＩｐＹｐＹＫＶ及びＰＨＩＰ ＰＤＺ３／
ＧＮＩｐＹＹＫＶを包含してもよい。

【００３２】 本発明は更に、本発明の複合体に特異な抗体を企図する。抗体は未反応の、モ
ノクローナル又はポリクローナル抗体、免疫学的に活性を有する断片（例えばＦ
ａｂ又は（Ｆａｂ）_２断片）、抗体Ｈ鎖及び抗体Ｌ鎖、遺伝子工学的に作成した
単鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４，９４６，７７８号）、又はキメ
ラ抗体（例えばネズミ抗体に特異的に結合する部位を有するが、残りの部分がヒ
ト由来である抗体）を意味する。モノクローナル及びポリクローナル抗体、断片
並びにキメラ等の抗体は、当業者に公知の方法で調製することができる。

【００３３】 本発明の複合体に特異な抗体を用いて、組織中の複合体を検出し、組織内の分
布を調べることができる。本発明の抗体を用いるインヴィトロ及びインシトゥー
の検出法によって、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎに関連した増殖及び／又は分化の疾患
（例えば神経系の疾患）を、予後及び／又は診断評価を行うことができる。ある
遺伝疾病には本発明の複合体中の相互作用性分子の結合領域における突然変異が
ある。従って、本発明の複合体が遺伝疾病に関連している場合、結合領域のＤＮ
ＡをＰＣＲによって増幅し、その領域の１つに突然変異が含まれているかどうか
を迅速に調べることができる。その領域の両脇の領域に相当するプライマーを作
成し、配列決定法を用いて突然変異が存在するかどうかを調べることができる。
この方法では、変質遺伝子の染色体地図を予め作る必要がなく、欠陥蛋白質をコ
ードする遺伝子全体の配列決定を行う必要がなく、時間を節約できる。

【００３４】 ＰＨＩＰ蛋白質 概して、本発明は図２Ｄ及び配列番号１に示すアミノ酸配列を包含する単離蛋
白質を企図する。本発明は、本発明の蛋白質の末端切断体（即ち部分）、類似体
、対立遺伝子又は種上の変異体、又は本発明の蛋白質と実質的に同一の配列を有
する蛋白質（すなわち同族体）、又はその末端を切断したものを企図する。（こ
こでは、末端切断体、類似体、対立遺伝子又は種上の変異体、及び同族体を「Ｐ
ＨＩＰ関連蛋白質」と総称する。）

【００３５】 末端切断蛋白質は、トリペプチドから７０ｍｅｒポリペプチドの範囲に渡る、
３〜７０のアミノ酸残基のペプチドを包含していてもよく、１２〜２０アミノ酸
が好ましい。本発明の一つの態様にあっては、図２Ｄ及び配列番号１からの少な
くとも５個連続するアミノ酸の配列を有するＰＨＩＰ蛋白質の断片が提供される
。ここでは、断片中に存在する５個以上、６個以上、７個以上、又は８個以上の
連続するアミノ酸配列は、ＰＨＩＰ蛋白質以外の蛋白質には存在しない。本発明
の一つの態様においては、断片は特定の配列（例えば図２Ｄで下線を引いた配列
）からの少なくとも１２〜２０個の連続する一連のアミノ酸残基である。断片は
、免疫原性であってもよく、好ましくはＰＨＩＰ蛋白質以外の蛋白質に対して免
疫反応性である抗体に、免疫反応性を示さないものである。

【００３６】 本発明の一つの特徴において、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質をコー
ドする配列を包含する単離核酸（例えば配列番号３３、その断片、相補性及び相
同性を有する配列）が提供される。

【００３７】 本発明の核酸は、適当なベクターに挿入することができる。ベクターは挿入し
たコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むことができる。従って、ベクタ
ーは本発明の核酸を包含し、１個以上の転写及び翻訳要素を核酸分子に連結する
ように作成することができる。

【００３８】 本発明のベクターを用いて、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質を発現す
る形質転換宿主細胞を調製することができる。従って、本発明によって更に本発
明のベクターを含む宿主細胞が提供される。

【００３９】 本発明は更に、生殖細胞及び体細胞が、本発明の核酸分子（特にＰＨＩＰ蛋白
質の類似体、又はＰＨＩＰ蛋白質の末端切断体をコードする核酸分子）を包含す
る組換え分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳類を企図する。

【００４０】 ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質は、天然細胞源から単離することが出
きるが、好ましくは組換え法によって作成する。本発明の一つの特徴においては
、本発明の単離核酸分子をもちいた、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質を
調製する方法が提供される。一つの態様において、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ
関連蛋白質を調製する方法は、下記を包含する。 （ａ）ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
有する、本発明のベクターを宿主細胞内に移転し； （ｂ）非形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択し； （ｃ）選択した形質転換宿主細胞を、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質の
発現が可能な条件下で培養し；そして （ｄ）ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質を単離する。

【００４１】 本発明は更に、本発明の方法により得た組換えＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関
連蛋白質を企図する。

【００４２】 本発明のＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質を、蛋白質などの他の分子と
連結させ、融合蛋白質又はキメラ蛋白質を調製することができる。これは例えば
Ｎ末端又はＣ末端融合蛋白質を合成することによって達成することができる。

【００４３】 本発明は更に、本発明のＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質のエピトープ
に対して特異的な抗体を企図する。抗体は検出可能な物質で標識付けし、組織又
は細胞内にある本発明の蛋白質の検出に用いることができる。

【００４４】 本発明は更に、本発明の核酸及従って本発明の蛋白質に特異なヌクレオチドプ
ローブの作成を可能にする。従って、本発明は更に本発明の蛋白質又はその部分
をコードする核酸配列を包含するプローブに関する。プローブは、例えば検出可
能な物質で標識付けすることができ、ヌクレオチド配列の混合物から、本発明の
蛋白質の１個以上の特性を呈示する蛋白質をコードする核酸分子を含む、本発明
の核酸分子を選択するのに用いることができる。

【００４５】 本発明は更に、蛋白質を、その蛋白質に結合する可能性のある少なくとも１個
の物質に、物質と蛋白質との結合を可能にする条件下で反応させ；そして結合を
検出する（ここで結合の検出は、物質が蛋白質に結合することを示す）ことを包
含する、本発明の蛋白質に結合する物質を同定する方法を提供する。結合は、蛋
白質−物質複合体、又は蛋白質の活性化を検定することによって検出することが
できる。本発明は更に、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質と相互作用する
他の細胞内蛋白質に結合する物質を同定する方法を企図する。方法は、遺伝子調
節配列（例えばプロモーター配列）に結合する化合物を同定するのに用いること
もできる。

【００４６】 本発明は更に、化合物に、本発明のＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質の
生物学的活性を変調する能力があるかどうかを評価する方法を提供する。例えば
、化合物は、蛋白質に結合する物質であってもよいし、蛋白質（例えばＢクラス
ｅｐｈｒｉｎ）と蛋白質に結合する物質との相互作用を阻害又は促進する物質で
あってもよい。ある態様においては、本方法は、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関
連蛋白質、蛋白質の結合する物質及び試験化合物を、物質と蛋白質との結合が可
能な条件下で提供し；結合を検出することを包含する（ここで、試験化合物の非
存在下で検出した結合に比較して、増加した又は減少した結合が検出されたとき
、試験化合物がＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質の活性を変調したことを
意味する）。結合は、物質−蛋白質複合体、未結合の物質、及び／又は未結合の
蛋白質、あるいは蛋白質の活性化を検定することによって検出することができる
。

【００４７】 ＰＨＩＰ又はＰＨＩＰ関連蛋白質の活性化は、蛋白質のリン酸化、蛋白質の細
胞蛋白質への結合を測定することによって、又は細胞に与える生物学的影響（例
えば増殖、分化又は移動の阻害又は誘導など）を検定することによって、調べる
ことができる。

【００４８】 本発明の蛋白質の生物学的活性を変調する化合物は、本発明の方法を用いて同
定することができる。組織内又は細胞内における本発明のＰＨＩＰ蛋白質又はＰ
ＨＩＰ関連蛋白質の発現パターン及びレベルを、化合物の存在下と非存在下で比
較して同定する。

【００４９】 本発明の方法を用いて同定した物質及び化合物は、本発明のＰＨＩＰ蛋白質又
はＰＨＩＰ関連蛋白質の生物学的活性を変調するのに用いることができる。また
、ＰＨＩＰ蛋白質又はＰＨＩＰ関連蛋白質（例えばＢクラスｅｐｈｒｉｎ）に結
合する蛋白質又は他の分子の変調を必要とする状態の治療に用いることができる
。

【００５０】 ペプチド 本発明は、本発明の複合体中の分子に結合し、分子の相互作用を阻害するペプ
チド分子を提供する。分子は、ＰＤＺ領域含有蛋白質に結合するＢクラスｅｐｈ
ｒｉｎの結合領域に由来する。例えば、本発明のペプチドには、ＰＤＺ領域含有
蛋白質に結合するｅｐｈｒｉｎＢ１、Ｂ２又はＢ３のアミノ酸ＹＹＫＶが含まれ
る。これらの結合領域配列を含む他の蛋白質は、例えばGenBank又はSwissProt等
の利用可能なデータベースで、蛋白質相同性を検索して同定することができる。
また、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ（ＧＣＧ配列分析パッケージの一部として入手可
能。ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、又はＥＮＴＲＥＺ（
National Center for Biotechnology information、National Library of Medic
ine、National Institutes of Health、メリーランド州ベセズダ）等の様々な検
索アルゴリズム及び／又はプログラムを用いることができる。

【００５１】 本発明の態様に従って、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及びＰＤＺ領域含有蛋白質への
結合を媒介する特異なペプチドが企図される。特に、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及び
ＰＤＺ領域含有蛋白質に干渉する、式Ｉのペプチドが提供される。 Ｘ−Ｘ^１−Ｘ^２−Ｋ−Ｖ Ｉ ここでＸは０〜７０、好ましくは０〜５０、より好ましくは２〜２０個のアミノ
酸であり、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれチロシン又はホスホチロシンを表わす。特異
な態様にあっては、Ｘ^１はチロシンであり、Ｘ^２はホスホチロシンであるか；Ｘ ^１ はホスホチロシンで、Ｘ^２はチロシンであるか；又はＸ^１及びＸ^２はホスホチ
ロシンである。

【００５２】 本発明の一つの態様において、式ＩのペプチドにおいてＸはＮＩ、ＧＮＩ、Ｃ
ＰＨＹＥＫＶＳＧＤＹＧＨＰＶＹＩＶＱ（Ｅ，Ｄ）（Ｍ，Ｇ）ＰＰＱＳＰ（Ａ，
Ｐ）Ａ（配列番号２）、ＧＤＹＧＨＰＶＹＩＶＱ（Ｅ，Ｄ）（Ｍ，Ｇ）ＰＰＱＳ
Ｐ（Ａ，Ｐ）Ａ（配列番号３）、ＰＰＱＳＰ（Ａ，Ｐ）Ａ（配列番号４）、ＧＰ
ＰＱＳＰＰＮＩ（配列番号３２）を表わす。

【００５３】 本発明の好ましいペプチドとしては、ＹＹＫＶ（配列番号５）、ＧＰＰＱＳＰ
ＰＮＩｐＹＹＫＶ（配列番号６）、ＮＩｐＹｐＹＫＶ（配列番号７）、ＮＩｐＹ
ＹＫＶ（配列番号８）、ＮＩＹｐＹＫＶ（配列番号９）、ＮＩＹＹＫＶ（配列番
号１０）、ＧＮＩＹＹＫＶ（配列番号２８）、ＧＮＩｐＹｐＹＫＶ（配列番号２
９）、ＧＮＩｐＹＹＫＶ（配列番号３０）、及びＧＮＩＹｐＹＫＶ（配列番号３
１）が挙げられる。

【００５４】 本発明の全てのペプチド、並びにこれらのペプチドに実質的に相同性を有する
、相補性を有する、あるいは機能的又は構造的に同等である分子を、本発明の目
的に用いることができる。本発明の全長ペプチドに加えて、本発明はペプチドの
末端切断体を企図する。末端を切断されたペプチドは、約７〜１０アミノ残基の
ペプチドを包含してもよい。

【００５５】 末端を切断されたペプチドは、そのアミノ末端に、アミノ基（−ＮＨ_２）、疎
水基（例えばカルボベンゾイル、ダンシル又はＴ−ブチルオキシカルボニル）、
アセチル基、９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＰＭＯＣ）基、又は高分
子（例えば脂質−脂肪酸結合体、ポリエチレングリコール又は炭水化物など。但
しこれらに限定されるものではない）を有していてもよい。末端を切断されたペ
プチドは、そのカルボキシル末端に、カルボキシル基、アミノ基、Ｔ−ブチルオ
キシカルボニル基、又は高分子（例えば脂質−脂肪酸結合体、ポリエチレングリ
コール又は炭水化物など。但しこれらに限定されるものではない）を有していて
もよい。

【００５６】 本発明のペプチドは、本発明のペプチドの類似体及び／又はそのペプチドの末
端切断体も含む。ここでペプチド類似体には、１個以上のアミノ酸の挿入、付加
、又は欠失、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるもので
はない。本発明のペプチドの類似体は、例えばＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領
域含有蛋白質との相互作用への干渉といった、本発明のペプチドに特徴的な活性
を示し、さらには生物学的利用能、安定性の増加、宿主免疫認識の低下といった
、追加の利点を有することができる。１個以上のアミノ酸挿入を、本発明のペプ
チドの導入することができる。アミノ酸挿入は、１個のアミノ酸残基であっても
よいし、連続したアミノ酸であってもよい。

【００５７】 １個以上のアミノ酸、好ましくは１〜５個のアミノ酸を、本発明の右又は左末
端に付加することができる。欠失においては、ペプチド配列から１個以上のアミ
ノ酸、又は不連続の部分を除去される。欠失したアミノ酸は、隣接しているもの
であってもしていないものであってもよい。その結果得られる、欠失突然変異を
有する類似体の長さの下限は、約７アミノ酸である。

【００５８】 ＮＩＸ^１Ｘ^１ＫＶ配列外の配列においてアミノ酸の挿入又は欠失があった場合
には、得られるペプチド類似体は本発明のペプチドの活性を示すことが予想され
る。

【００５９】 本発明は更に、選択された蛋白質と又は選択可能なマーカー（下記参照）と結
合して、融合蛋白質を形成するペプチドを含む。

【００６０】 本発明のペプチドは組換えＤＮＡ法を用いて調製することができる。従って、
本発明のペプチドをコードする核酸分子は、公知の方法で、ペプチドの十分な発
現を確実にする適当な発現ベクター内に挿入することができる。発現ベクターと
しては、用いられる宿主細胞に適合性のあるものであれば、どのようなコスミド
、プラスミド又は改変したウィルスを用いてもよいが、これらに限定されるもの
ではない。発現ベクターは、本発明のペプチドをコードする核酸分子、並びに挿
入された蛋白質配列を転写及び翻訳するのに必要な調節配列を含む。好ましい調
節配列は、バクテリア、菌類、ウィルス、哺乳類、昆虫等の様々な遺伝子等から
得ることができる（例えば、Goeddel、Gene Expression Technology：Methods i
n Enzymology１８５、Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９
０）に記載の調節配列参照）。適当な調節配列は、選択された宿主細胞に応じて
選択されるが、当業者には自明のことであろう。例えば複製の母体、更なるＤＮ
Ａ制限酵素部位、エンハンサー及び転写を誘導する配列といった他の配列も、発
現ベクターに組み込むことができる。

【００６１】 組換え発現ベクターは、形質転換した又はトランスフェクトした宿主細胞の選
択を可能にする、選択可能なマーカー遺伝子を更に含んでもよい。好適な選択可
能マーカー遺伝子としては、ある種の薬剤に耐性を与えるＧ４１８、ハイグロマ
イシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ、ホタルルシフェラーゼ、あるいは免疫グロブリン又はその部分（例えば免
疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分）といった蛋白質をコードする遺伝
子が挙げられる。選択可能なマーカーは、目的とする核酸とは異なるベクター内
に導入してもよい。

【００６２】 組換え発現ベクターは、組換えペプチドの発現を増加させ；組換えペプチドの
溶解性を増加させ；及び／又は親和性精製においてリガンドとして作用すること
により組換えペプチドの精製を助ける、融合蛋白質をコードする遺伝子を含むこ
ともできる。例えば、蛋白質分解性の切断部位を組換えペプチドに挿入すること
で、融合蛋白質の精製後に、融合部分から組換えペプチドを分離することが可能
になる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Amrad Corp.、オーストラ
リア国メルボルン）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs、マサチューセッツ州ベ
ヴァリー）及びｐＲＩＴ５（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）
が挙げられる。これらはそれぞれグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）、マルト−スＥ結合蛋白質、又は蛋白質Ａを組換え蛋白質に融合させる。

【００６３】 組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換宿主細胞を作成すること
ができる。形質転換宿主細胞には、本発明の組換え発現ベクターによって形質転
換又はトランスフェクトした原核細胞又は真核細胞が含まれる。ここでいう「形
質転換した」「トランスフェクトした」及び「形質転換」とは、多数存在する公
知の技術の１つを用いて、核酸（例えばベクター）を、細胞内に導入することを
含む。例えば、原核細胞を、電気穿孔法又は塩化カルシウム媒介形質転換によっ
て核酸で形質転換することができる。核酸を、リン酸カルシウム又は塩化カルシ
ウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチ
ン、電気穿孔又はミクロ注入等の従来法によって哺乳動物細胞に導入することが
できる。宿主細胞を形質転換及びトランスフェクトする好適な方法は、Sambrook
他（Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor L
aboratory press（１９８９））及び他の実験テキストを参照されたい。

【００６４】 好適な宿主細胞には、様々な原核及び真核宿主細胞が含まれる。例えば、本発
明のペプチドは、大腸菌等のバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウィルスを用
いる）、酵母菌又は哺乳動物細胞内で発現してもよい。他の好適な宿主細胞は、
Goeddel、Gene Expression Technology： Methods in Enzymology １８５, Acad
emic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９１）を参照されたい。

【００６５】 本発明のペプチドは、Reedijk他.（The EMBO Journal １１（４）：１３６５
、１９９２）に記載の方法で、チロシンをリン酸化してもよい。例えば、チロシ
ンリン酸化は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミ
ドを有するバクテリアを、Ｅｌｋチロシンキナ−ゼの細胞質領域をコードするλ
ｇｔ１１バクテリオファージで感染させることによって、ＬａｃＺ−Ｅｌｋ融合
として誘導することができる。リソゲンとしてプラスミド及びバクテリオファー
ジを含むバクテリアを単離する。リソゲンの誘導に続いて、発現されたペプチド
はEｌｋチロシンキナーゼによってリン酸化される。

【００６６】 本発明のペプチドは、従来法によって合成してもよい。例えばペプチドは、固
相ペプチド合成を用いた化学合成によって合成してもよい。従来方法では、固相
又は液相合成法のいずれかを用いている（例えば固相合成法についてはJ. M. St
ewart及びJ.D. Young、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Ch
emical Co.、イリノイ州ロックフォード（１９８４）；G. Barany及びR.B. Merr
ifield、The Peptides：Analysis Synthesis、Biology editors E. Gross and J
. Meienhofer Vol.２ Academic Press、ニューヨーク、１９８０、pp. ３−２５
４；古典的な液体合成については and M Bodansky, Principles for Peptide Sy
nthesis, Springer−Verlag、ベルリン１９８４；E. Gross及びJ. Meienhofer編
、The Peptides：Analysis, Synthesis, Biologu,、上述、Ｖｏｌ．１参照）。
例えば、ペプチドは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相化学
によって、ホスホチロシンをＮ−フルオレニルメトキシ−カルボニル−Ｏ−ジメ
チルホスホノ−Ｌ−チロシン誘導体として直接導入して合成してもよい。

【００６７】 他の分子に結合させた本発明のペプチドを包含するＮ末端又はＣ末端融合蛋白
質は、組換え法によってペプチドのＮ末端又はＣ末端と、望ましい生物学的機能
を有する選択した蛋白質又はマーカー蛋白質とを融合させることによって、調製
してもよい。得られる融合蛋白質は、本明細書に記載するように、選択した蛋白
質又はマーカー蛋白質に融合したペプチドを含んでいる。融合蛋白質の調製に用
いることのできる蛋白質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、血球凝集素（ＨＡ）及び末端切断ｍｙｃが挙げら
れる。

【００６８】 本発明のペプチドの環化誘導体も、本発明に含まれる。環化によって、ペプチ
ドが、本発明の複合体中の分子に関連した配座としてより好ましい形態をとるこ
とが可能になる。環状は、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。例え
ば、結合していないスルフヒドリル基を有する２個の適当に離れた構成部分の間
に、ジスルフィド結合を形成してもよいし、１個の構成部分のアミノ基と他の構
成部分のカルボキシル基との間にアミド結合を形成してもよい。環化は、アゾベ
ンゼン含有アミノ酸を用いて行うこともできる（Ulysse, L., 他., J. Am. Chem
. Soc. １９９５, １１７, ８４６６−８４６７参照）。Ｔｙｒの側鎖及びＡｓ
ｎの側鎖を連結して環状ペプチドを形成してもよい。結合を形成する構成要素と
しては、アミノ酸の側鎖、、非アミノ酸構成要素、またはそれらの組み合わせが
挙げられる。本発明の態様にあっては、環状ペプチドは、右位置にβ回転を有す
るものを企図する。β回転は、右位置にアミノ酸Ｐｒｏ−Ｇｌｙを付加すること
によって本発明のペプチドに導入することができる。

【００６９】 上記した、ペプチド結合を含む環状ペプチドと比較して、より柔軟な環状ペプ
チドを作成するのが望ましい。より柔軟なペプチドは、ペプチドの右位置及び左
位置にシステインを導入し、２個のシステイン間にジスルフィド架橋を形成する
ことによって、調製することができる。２個のシステインは、βシート及び回転
を変形しないような配置にする。ジスルフィド結合が長く、βシート部分の水素
結合の数が少ないので、ペプチドはより柔軟なものになる。環状ペプチドの相対
的柔軟性は、分子動力学シミュレーションによって調べることができる。Ｌアミ
ノ酸によるＤアミノ酸の系統的置換、異なる電気的特性を有する基による側鎖の
置換、アミノ結合によるペプチド結合の系統的置換によって得られるデータに基
づいて、ペプチド模倣体を設計することができる。局所的な配座の制約を、ペプ
チド模倣体の候補の活性に必要な配座条件を調べるのに用いることもできる。模
倣体には、逆回転を安定又は促進させ、分子の安定化を助ける等配電子のアミノ
結合、又はＤアミノ酸が含まれる。環状アミノ酸類似体を用いて、アミノ酸残基
を特定の配座状態に制限することができる。模倣体には、阻害蛋白質の二次構造
を有する模倣体も含まれる。これらの構造は、３次元方向のアミノ酸残基を蛋白
質の公知の二次配座に変えることができる。Ｎ置換アミノ酸のオリゴマーである
ペプトイドを用いて、化学的に多様な新規な分子のライブラリーを作成するモチ
ーフとすることができる。

【００７０】 本発明の複合体分子と相互作用するペプチドは、生物学的発現系を用いて作成
することができる。これらの系を用いることによって、ランダムペプチド配列の
大型のライブラリーの作成と、特定の蛋白質に結合するペプチド配列についての
これらのライブラリーのスクリーニングが可能になる。ライブラリーは、ランダ
ムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適当な発現ベクター内にクローンする
ことによって作成することができる（Christian他、１９９２、J.Mol.Biol.２２
７：７１１；Devlin他、１９９０ Science２４９：４０４；Cwirla他、１９９０
, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,８７：６３７８参照）。ライブラリーは、オーバー
ラッピングペプチドの並行合成によって作成することもできる（米国特許第４,
７０８,８７１号参照）。

【００７１】 本発明のペプチドを用いて、薬剤作成のための導入化合物を同定することがで
きる。ここに記載したペプチドの構造は、ＮＭＲ及びＸ線結晶学等の多くの方法
によって容易に調べることができる。配列が類似するが、標的分子に対して引き
起こす生物学的活性が異なるペプチドの構造を比較することによって、標的の構
造−活性関係についての情報を得ることができる。構造−活性関係を調べること
によって得られる情報は、改変したペプチドの作成に用いることもできるし、標
的分子に関連して予想される特性について試験することのできる、他の小分子又
は導入化合物の作成に用いることもできる。導入化合物の活性は、ここに記載し
たものと類似のアッセイによって評価することができる。

【００７２】 構造−活性関係に着いての情報は、共結晶化研究からも得ることができる。こ
れらの研究において、望まれる活性を有するペプチドを、標的分子に関連して結
晶化し、複合体のＸ線構造を調べる。得られる構造を、天然状態の標的分子の構
造と比較する。比較によって得られた情報を、望まれる活性を有することが期待
される化合物の作成に用いることができる。

【００７３】 本発明のペプチドは、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸等の無機酸、あるいは
蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコ−ル酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、コハク酸
、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、
トルエンスルホン酸等の有機酸と反応させることによって、薬学的な塩に変換さ
せることができる。

【００７４】 本発明のペプチドを用いて、抗体を調製することもできる。抗体の調製には従
来法を用いることができる。

【００７５】 本発明のペプチド及びペプチドに特異な抗体は、様々な酵素、蛍光物質、発光
物質及び放射性物質を用いて標識付けすることができる。好ましい酵素、蛍光物
質、発光物質及び放射性物質は、当業者に公知のものである。本発明のペプチド
に特異な抗体及び標識付けた抗体を用いて、ＰＤＺ領域結合部位を含む蛋白質を
スクリーンすることができる。

【００７６】 当分野で公知のコンピューターモデル技術（例えばＨｏｍｏｌｏｇｙ Ｉｎｓ
ｉｇｈｔ ＩＩ及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＢｉｏＳｙｍ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ製）を
用いて、本発明のペプチド、末端切断体及びその類似体と、本発明の複合体中の
分子（例えばＰＤＺ領域含有蛋白質）との相互作用を観察することもできる。コ
ンピューターモデルが強い相互作用を示す場合には、ペプチドを合成して、ここ
で議論した複合体の分子に対する結合を干渉する能力があるかどうかについて、
試験することができる。

【００７７】物質／化合物の同定及び評価方法 ここに記載した方法は、本発明の複合体の活性を変調する、従ってＢクラスｅ
ｐｈｒｉｎ及び／又はＰＤＺ領域含有蛋白質に関連した細胞の活動に潜在的に影
響を与える、物質及び化合物を同定することを企図している。従って、複合体中
の分子に結合する、あるいは分子と相互作用する他の蛋白質、あるいは複合体中
の分子又は分子と相互作用する他の蛋白質の相互作用を阻害するか促進する化合
物に結合する、新規な物質を企図している。

【００７８】 本発明の方法を用いて同定される物質及び化合物には、可溶性ペプチド（Ｉｇ
テールを有する融合ペプチド等）、ランダムペプチドライブラリーやＤ及び／又
はＬ配置アミノ酸の組み合わせ化学由来分子ライブラリーからのペプチド、ホス
ホペプチド（ランダム又は部分的縮重の、定方向ホスホペプチドライブラリーか
らのペプチド等）などのペプチド；抗体［ポリクローナル、モノクローナル、ヒ
ト化、抗イディオタイプ、キメラ性、単鎖抗体、断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２及
びＦａｂ発現ライブラリーの断片、そのエピトープ結合断片等）］、有機又は無
機の小分子等が含まれるが、これらに限定されるものではない。物質及び化合物
は、内因性の生理的化合物であってもよいし、天然に存在する又は合成した化合
物であってもよい。

【００７９】 本発明の複合体の活性を変調する物質は、複合体中の分子に結合する能力に基
づいて同定することができる。従って、本発明は更に、複合体中の分子に結合す
る新規な物質を同定する方法を提供する。本発明の方法を用いて同定した物質は
、従来法を用いて単離、クローニング及び配列決定することができる。

【００８０】 本発明の複合体中の分子に結合することのできる新規な物質は、１個以上の分
子を、分子に結合すると思われる試験物質と、両者の結合を可能にする条件下で
反応させ、結合を検出することによって同定することができる。結合は、物質−
分子結合体、未反応の物質、未結合の分子、又は分子の活性を検定することによ
って検出することができる。物質−分子結合体の形成を可能にする条件は、物質
及び分子の性質及び量などの要素を考慮に入れた上で選択することができる。

【００８１】 物質−分子結合体、未反応の物質、又は未結合の分子は、塩析、クロマトグラ
フィー、電気泳動、ゲル濾過、分別、吸収、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
凝集又はそれらの組み合わせといった、従来の単離法によって単離することがで
きる。構成要素の検定を促進するために、分子又は物質に対する抗体、標識付け
した分子、又は標識付けした物質を利用することができる。抗体、蛋白質又は物
質は、上記したように検出可能な物質で標識付けすることができる。

【００８２】 活性は、分子のリン酸化、受容体又は細胞蛋白質による分子への結合を測定す
ることによって、あるいは細胞アッセイにおいては、細胞に与えられる生物学的
影響（増殖、分化、移動等の阻害又は誘導等）を検定することによって、調べる
ことができる。

【００８３】 本発明の分子又は複合体、あるいは本発明の方法に用いられる物質は、不溶化
することができる。例えば、分子又は物質を、アガロース、セルロース、デキス
トラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロースポリスチ
レン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチック膜、プラスチック管、ガラスビーズ
、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合
体、エチレン−マレイン酸共重合体、ナイロン、シルク等の好適な担体に結合さ
せることができる。担体は、例えば管、試験プレート、ビーズ、円盤、球体等の
形状をとることができる。不溶化した蛋白質又は物質は、公知の化学又は物理法
（例えばブロモシアンカップリング）を用いて、材料を好適な不溶性担体に反応
させることによって調製することができる。

【００８４】 本発明は更に、ある化合物が、本発明の複合体の生物学的活性を変調する能力
があるかどうかを評価する方法を企図している。複合体中の分子の結合における
アゴニスト又はアンタゴニストを検定することによって評価を行う。化合物が、
本発明の複合体に含まれる分子の結合のアゴニストであるかアンタゴニストであ
るかの基本的な評価方法は、分子及び試験化合物を含む反応混合物を、分子が結
合して複合体が形成できる条件で調製することである。試験化合物は予め混合物
に添加してもよいし、分子の添加に続いて添加してもよい。試験化合物を含まな
い又はプラシーボを含む対照反応混合物も調製することができる。複合体の形成
を検出した結果、対照反応において複合体の形成が検出されたが、反応混合物に
検出されなかったということは、試験化合物が分子の相互作用に干渉するという
ことを意味する。対照反応に比較して複合体の形成が増加したということは、試
験化合物が分子の相互作用を促進したことを意味する。反応は、液相又は分子内
で行ってもよいし、本明細書に記載したように試験化合物を固定してもよい。

【００８５】 本発明の方法を用いて検定することのできるアゴニスト及びアンタゴニストは
、複合体内で相互作用する分子の１個以上の結合部位（例えばアゴニスト結合部
位、競合アンタゴニスト結合部位、非競合アンタゴニスト結合部位、又はアロス
テリック部位）に作用する可能性があることは理解されよう。

【００８６】 更に本発明は、本発明の複合体に含まれる分子の相互作用に対するアゴニスト
の効果を阻害するアンタゴニストをスクリーンすることを可能にする。従って本
発明を用いて、本発明の複合体に含まれる分子の同じ結合部位に対して競合する
化合物を検定することができる。

【００８７】 本発明は更に、本発明の複合体の分子に相互作用する蛋白質に結合する新規な
化合物を同定する方法を企図している。蛋白質−蛋白質相互作用は、勾配又はク
ロマトグラフィーカラムを通じた共免疫沈降、架橋及び共精製等の従来法を用い
て同定することができる。分子に相互作用する蛋白質をコードする遺伝子を、同
時に同定することのできる方法も用いることができる。これらの方法には、標識
付けした分子を用いる探索（probing）発現ライブラリーがある。更に、Ｘ線結
晶学研究を、物質及び分子の相互作用を評価する方法として用いることができる
。例えば、本発明の複合体中の組換え分子を精製したものは、好適な形状に結晶
化した時、Ｘ線結晶学による細胞内相互作用の検出に用いることができる。分光
分析法を用いて、相互作用を検出することもできるが、特に四重極／飛行時間ハ
イブリッド装置（ＱｑＴＯＦ）を用いることができる。

【００８８】 ２ハイブリッド系を用いて、生体内の蛋白質相互作用を検出することができる
。一般に、２ハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドを作成する。第一のハ
イブリッド蛋白質は、本発明の複合体中の分子に融合する転写活性蛋白質のＤＮ
Ａ結合領域からなり、第二のハイブリッド蛋白質は、ｃＤＮＡライブラリーの一
部としてプラスミド内に組み換えたｃＤＮＡによってコードされる未知の蛋白質
に融合する、転写活性蛋白質の活性領域からなる。プラスミドを、調節領域が転
写活性結合部位を含む、レポーター遺伝子（例えばｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、
アルカリホスファタ−ゼ、セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ）を有する酵母菌株
（例えばS. cerevisiae）内に形質転換する。ハイブリッド蛋白質単独ではレポ
ーター遺伝子の転写を活性化することができない。しかし、２ハイブリッド蛋白
質の相互作用は、機能活性蛋白質を再構成し、レポーター遺伝子が発現される。
これはレポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される。

【００８９】 融合蛋白質及び組換え融合蛋白質を、上記の方法に用いることができることは
理解されよう。本発明の複合体は組換え分子を用いて生体外で再構成することが
でき、試験物質の効果を再構成した系内で評価できることも理解されよう。

【００９０】 物質及び化合物を評価する本発明の方法に好適に用いることのできる試薬は、
必要な材料を好適な容器内に梱包した便利なキットにすることができる。キット
は更に、本発明の方法の実施に有用な、好適な補助を含んでいてもよい。

【００９１】組成物及び治療法 本発明の複合体、ペプチド及び抗体、本発明の方法を用いて同定した物質及び
化合物を用いて、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎs及び／又はＰＤＺ領域含有蛋白質に関
連した細胞の増殖、成長及び／又は分化の過程（特に軸索形成、神経細胞相互作
用及び神経系再構成）を変調することができる。従って、化合物や物質を導入し
て被験者の治療を行うことができる。従って物質は、例えば神経系の疾患（神経
変性、神経損傷）といった、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎに関連した疾患の治療に用い
ることができる。

【００９２】 従って、被験者への投与を目的として、複合体、ペプチド、物質、抗体及び化
合物を、生体内投与に適した生物学的に適合性のある形態の薬学的な組成物に調
合することができる。「生体内投与に適した生物学的に適合性のある形態」とは
、治療効果よりも毒性を重視した、物質の投与形態のことをいう。物質は、ヒト
、動物を含む生物体に投与することができる。本発明の薬剤組成物の「治療上の
活性量」とは、望ましい結果が得られるのに必要な用量及び期間での、有効量と
定義される。例えば、物質の治療上の活性量は、個人の疾病の状態、年齢、性別
及び体重といった要因、並びに個人に望ましい応答を引き起こす抗体の能力に応
じて変化する。投与様式は、最適な治療応答が得られるように調整される。例え
ば、数回に分割した用量を毎日投与してもよいし、治療状況の緊急性に応じて比
例的に用量を減少させてもよい。

【００９３】 活性物質は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入法、経皮塗布又は直腸
投与といった、便利な方法で投与することができる。投与経路に応じて、活性物
質を、酵素、酸又は化合物を不活化する他の天然条件から保護する材料に被覆す
ることができる。

【００９４】 ここに記載した組成物は、本質が知られる従来方法によって調製することがで
きる。被験者に投与することのできる薬学的に許容可能な組成物を調製し、有効
量の活性物質を薬学的に許容可能な賦形剤と合わせて混合物とする。好ましい賦
形剤については、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（Remington's P
harmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、アメリカ合衆国ペンシル
バニア州イーストン、１９８５）に記載がある。これに基づくと、組成物の例と
して、１個以上の薬学的に許容可能な賦形剤、又は希釈液に関連した；及び、好
ましいｐＨにあり、生理液と等浸透性の緩衝液中に含まれる、物質又は化合物の
溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【００９５】 本発明の複合体、物質、化合物、抗体及び組成物の活性は、動物実験モデル系
において確認することができる。

【００９６】 本発明は更に、本発明の複合体の機能を研究する方法を提供する。分子中に特
異な欠失又は挿入突然変異を有する、本発明の組換え発現ベクターを用いて、複
合体又は複合体中分子を部分的に欠損する細胞、組織、非ヒト動物を作成するこ
とができる。組換え発現ベクターを用いて、相同的組換えによって内因性遺伝子
を不活化又は変性することができ、よって複合体欠損細胞、組織又は動物を作成
することができる。零対立遺伝子を、細胞中に作成することができ、トランスジ
ェニック非ヒト動物の作成に用いることができる。

【００９７】 下記実施例によって本発明を例証するが、本発明を制限するものではない。 実施例 実験手順 ペプチド合成 ビオチン−Aca−GPPQSPPNIpYYKV（配列番号６）の配列を有するＢ型ｅｐｈｒ
ｉｎ Ｃ末端ペプチドプロ−ブ、関連ペプチドNIpYpYKV（配列番号７）、NIpYYK
V（配列番号８）、NIYpYKV（配列番号９）、NIYYKV（配列番号１０）及びDHQpYp
YND（配列番号１１）を、文献（２９）の記述に従って合成した。

【００９８】 ＰＤＺ領域をコードするｃＤＮＡクローンの単離 λＥＸｌｏｘ１０．５日マウス胚発現ライブラリー（Novagen）を、１０，０
００プラーク形成単位／１５ｃｍぺトリプレートの初期濃度で植えた。Ｓｐａｒ
ｋｓ他（３０）に記載のものと同様の手順で、ストレプトアビジン−アルカリホ
スファタ−ゼに結合したビオチン化ペプチドプロ−ブを用いてライブラリースク
リーニングを行った。ＰＨＩＰをコードする配列をさらに単離するために、ＰＨ
ＩＰｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１断片（アミノ酸残基４６２−６０２をコー
ドする）を［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで放射性同位元素標識付けし、λＥＸｌｏｘ
１０．５日マウス胚発現ライブラリーをスクリーンするのに用いた。正のクロー
ンのＤＮＡ配列決定は、ＡＬＦ自動ＤＮＡシーケンサー（Amersham Pharmacia B
iotech）を用いて行った。

【００９９】 抗体、構造体及び突然変異誘発 抗リガンド抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を、ｈｅｐｈｒｉｎ Ｂ１の残基３
２９−３４６に対して作成した。抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体は、East
man Kodak Company製のものを用いた。ベクターｐＪＦＥ１４中のｅｐｈｒｉｎ
Ｂ１ ｃＤＮＡの発現構造体については、文献（１８）に記載がある。標準的
なクローン法を用いて、全長ｓｙｎｔｅｎｉｎ ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベク
ターｐＦＬＡＧ ＣＭＶ２（Eastman Kodak）内の枠にサブクローンした。ＧＳ
Ｔ融合構造体については、ｓｙｎｔｅｎｉｎのｃＤＮＡ配列（全長：残基１−２
９９；ＰＤＺ１＋２：残基１０１−２９９；ＰＤＺ１：残基１０１−２１１；Ｐ
ＤＺ２：残基１７２−２９９）を、ｐＧＥＸ４Ｔ２（Amersham Pharmacia Biote
ch）内にクローンした。ＦＡＰ−１（Ｆａｓ関連ホスファタ−ゼ）ＰＤＺ３及び
ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５構造体については、文献（１）に記載がある。ＰＣＲ媒介
プロトコルを用いて、Ｃ末端Ｖ３４６をコードするヌクレオチドを除去すること
によって、ｅｐｈｒｉｎＢ１ Ｖａｌ欠失突然変異体を作成した。突然変異した
領域を有するＰｐｕＭＩ／ＥｃｏＲＩＰＣＲ断片を、ｐＪＦＥ１４内の全長ｅｐ
ｈｒｉｎＢ１ｃＤＮＡ内にサブクローンした。この突然変異及び全ての融合構造
体を、影響を受けた領域の両鎖の配列決定によって確認した。

【０１００】 免疫沈降及びウエスタンブロット分析 １０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ内に、Ｃｏｓ−１細胞を保
持した。一時的なトランスフェクションを、リポフェクチン試薬及びＯｐｔｉ−
ＭＥＭ培養基（Life Technologies Inc.）を用いて、説明書に従って行った。生
体内で発現したＥｐｈＢ受容体の結合による、又は血清成長因子の誘導による、
ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１のリン酸化を減少させるため、トランスフェクションの２４
時間後に、トランスフェクトした細胞を１０〜１５ｃｍのプレートに移し、細胞
溶解まで１２時間、ＤＭＥＭ０．５％ＦＢＳ内で血清を飢餓させた。トランスフ
ェクト細胞をＰＢＳＡで１回洗浄し、１０μｇ／ｍｌのアプロトニン（aprotoni
n）、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム及び１ｍ
Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニルを添加したＰＬＣ溶解緩衝液（５）で溶解
した。１μｇの抗ｅｐｈｒｉｎＢ１抗体又は１μｇの抗ＩＬ−３受容体α抗体を
蛋白質Ａ−セファロースと用いて、免疫沈降を４℃にて１時間行った。グルタチ
オンセファロース上に固定した５〜１０μｇの融合蛋白質と共に、溶解物を４℃
で１時間培養して、ＧＳＴ混合実験を行った。ペプチド競合実験として、ＧＳＴ
融合蛋白質とともにペプチドを保温した（最終濃度を１００μＭとした）。免疫
沈降及びＧＳＴ混合実験の両方で得られた顆粒をＨＮＴＧ緩衝液で２、３回洗浄
した（５）。蛋白質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、イモビロン−Ｐ
膜（Millipore）上に移転させ、適当な抗体で免疫ブロットを行った。ブロット
は強化化学ルミネセンス（Ｐｉｅｒｃｅ）によって顕出させた。

【０１０１】 蛍光偏光分析 結合定数の決定と、ペプチド競合の研究を、１００μｌ試料室を備えたＢｅａ
ｃｏｎ２０００Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（Ｐａｎ Ｖｅｒａ、ウィスコンシン州）上で蛍光偏光を用いて行った。
フルオレセイン標識化プローブは、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎ Ｃ末端ペプチドと５−（
及び６−）カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（分子プロー
ブ、ＯＲ）との反応によって調製し、逆相ＰＨＬＣによって精製した。フルオレ
セイン標識化ペプチドプローブの忠実性は、質量分析法によって確認した。結合
の研究において、フルオレセイン標識化ペプチドプローブを、２０ｍＭリン酸塩
（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＤＴＴに２５ｎＭの濃度で
溶解し、公知の量のＧＳＴ融合蛋白質を添加した。各測定の前に、反応混合物を
室温にて１０分静置した。フルオレセイン偏光の測定は、全て２２℃で行った。

【０１０２】結果 Ｂ型ｅｐｈｒｉｎの推定ＰＤＺ結合部位に対する潜在的結合相手の同定 Ｂ型ｅｐｈｒｉｎの細胞質テールに相互作用する蛋白質を同定する一つの方法
として、細胞内シグナリング蛋白質のモジュラー領域に結合するであろう保存ペ
プチドモチーフに関して、膜貫通ｅｐｈｒｉｎのＣ末端領域をまず調べるものが
ある。公知の３個のＢ型ｅｐｈｒｉｎのカルボキシル末端の最末端部分は、ＰＤ
Ｚ領域の公知の又は予想されている結合部位を思わせる、保存配列を有している
（図１）。Ｂ型ｅｐｈｒｉｎを認識する能力があるＰＤＺ領域含有蛋白質を同定
するのに、２つの方法を用いた。第一に、ＰＤＺ領域に対する公知の結合特異性
を、定方向ペプチドライブラリー方法を用いて予測したものと比較した結果、細
胞質チロシンホスファタ−ゼＦＡＰ−１（Ｆａｓ関連ホスファターゼ）の第５の
ＰＤＺ領域がｅｐｈｒｉｎBの潜在的結合相手であることが判明した（図２Ａ）
。ＦＡＰ−１（ＰＴＰ−ｂａｓ及びＰＴＰ−Ｌ１としても知られる）は、少なく
とも６個のＰＤＺ領域、Ｂａｎｄ４．１細胞骨格ペプチド、Ｃ末端チロシンホス
ファターゼ領域を有している（３１−３３）。第５のＰＤＺ領域は、コンセンサ
スＥ−（Ｉ／Ｙ／Ｖ）−Ｙ−（Ｙ／Ｋ）−（Ｖ／Ｋ／Ｉ）を有するペプチドと生
体外で結合する。この配列は、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎの保存されたＣ末端（ＹＹＫＶ
）とほぼ一致している（１）。

【０１０３】 １０．５日マウス胚からのｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ｅｐｈｒｉｎＢ３の
推定ＰＤＺ領域結合部位に基づくペプチドプローブを用いてスクリーニングし、
ｅｐｈｒｉｎＢ結合蛋白質をより直接的に単離した。プローブはビオチン化ペプ
チドである、ビオチン−Ａｃａ−GPPQSPPNIpYYKV （配列番号６）で、ストレプ
トアビジン−アルカリホスファタ−ゼに結合している。個のペプチドは、Ｃ末端
バリンから−３位置にホスホチロシン残基を含んでいたが、スクリーニングに用
いられたアルカリホスファターゼは、少なくとも部分的にプローブを脱リン酸化
し、チロシンリン酸化依存性及び非依存性結合の両方の検出を可能にすることが
予想される。約５００，０００ｃＤＮＡクローンのスクリーニングによって、ｅ
ｐｈｒｉｎＢ３のＣ末端ペプチドに結合する、４個の異なるｃＤＮＡ産物が得ら
れる。そのうちの３個は、配列分析によって、ＰＤＺ領域を含んでいることが分
かった（図２Ｂ及び２Ｃ）。これらのｃＤＮＡの１個は、６番目のＰＤＺ領域か
らカルボキシル末端（アミノ酸残基６４２−１１１２）の、アダプター蛋白質Ｇ
ＲＩＰの部分をコードする。ＧＲＩＰは、７個のＰＤＺ領域からなる約１８０ｋ
Ｄａの蛋白質であり、もともとは、ＰＤＺ領域４及び５を通じてＡＭＰＡ受容体
のＣ末端に結合する能力によって、同定されていた（３４）。この方法によって
単離された第二のｃＤＮＡは、ＰＤＺ領域含有蛋白質ｓｙｎｔｅｎｉｎのコード
配列全体を含んでいた。ｓｙｎｔｅｎｉｎは、黒色腫分化中にダウンレギュレー
トされた転写（Ｍｄａ−９と称される）として報告されたのが最初であり、のち
に２個のＰＤＺ領域を通じて膜貫通シンデカン蛋白質のＣ末端と相互作用するこ
とが示されている（３５、３６）。このスクリーニングによって同定された第３
のクローンは、新規なＰＤＺ領域含有蛋白質（ｅｐｈｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔ
ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎから、ＰＨＩＰと称する）のカルボキシル末端断片をコ
ードする部分ｃＤＮＡであった。ＰＨＩＰ ｃＤＮＡ断片の配列分析によって、
２個の隣接するＰＤＺ領域と、それに続くＣ末端の５０アミノ酸の存在が明らか
になった。ＰＨＩＰ ｃＤＮＡ断片を、次いでプローブとして用い、１０．５日
マウス胚ライブラリーからの転写を単離した。予想されたＰＨＩＰの配列は、合
計３個のＰＤＺ領域をコードし、ＰＡＲ−３（初期胚の極性調節に関与するC. e
legans蛋白質）に密接に関係していることを示している（図２Ｄ）（３７）。こ
れらの候補のうち、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及びｓｙｎｔｅｎｉｎについて、Ｂ型
ｅｐｈｒｉｎへの結合を更に調べた。

【０１０４】 Ｓｙｎｔｅｎｉｎ及びＦＡＰ−１ ＰＤＺ５は生体外でｅｐｈｒｉｎＢ１へ結合
する ｓｙｎｔｅｎｉｎ又はＦＡＰ−１がｅｐｈｒｉｎＢ１と生体外で相互作用する
かどうかを調べるために、５番目のＰＤＺ領域又は全長ｓｙｎｔｅｎｉｎを含む
ＧＳＴ−融合を、ｅｐｈｒｉｎＢ１でトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞の溶
解物と共に培養した。固定化ＧＳＴ融合蛋白質を回収し、抗ｅｐｈｒｉｎＢ１抗
体を用いて関連蛋白質の免疫ブロットを得たところ、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及び
全長ｓｙｎｔｅｎｉｎの両方が、未反応のｅｐｈｒｉｎＢ１に結合できることが
わかった（図３Ａ及び３Ｃ）。ｅｈｐｒｉｎＢ１との結合に必要なｓｙｎｔｅｎ
ｉｎの領域について、ｓｙｎｔｅｎｉｎ蛋白質の確定している断片を含むＧＳＴ
融合を用いてマップを作成した。強力な相互作用に必要な最小の配列は、ｓｙｎ
ｔｅｎｉｎのＰＤＺ領域を両方とも含んでいたが、蛋白質アミノ末端の３番目は
含んでいなかった（図３Ｄ）。興味深いことに、ｓｙｎｔｅｎｉｎのＰＤＺ領域
は両方とも、シンデカンのＣ末端配列の結合に必要であり、２個のＰＤＺ領域が
１個の標的部位の結合に関与しているということは、ｓｙｎｔｅｎｉｎ相互作用
に共通の特徴であることを示唆している（３６）。ｓｙｎｔｅｎｉｎのＰＤＺ１
領域のみではｅｐｈｒｉｎＢ１に関与できない一方で、ｓｙｎｔｅｎｉｎの第二
のＰＤＺ領域のみでは、非常に弱い相互作用を示した。

【０１０５】 これらの実験から、ＧＳＴのみ又はＧＳＴとＦＡＰ−１ ＰＤＺ領域の融合の
いずれについても、ｅｐｈｒｉｎＢ１への結合がほとんど検出できないことが示
された。ＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３によって認識される約５０ｋＤのバンド
は解明されていないが、その大きさから、３つの公知のＢ型ｅｐｈｒｉｎとは関
係がないことは明らかである。この知見に一致して、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３の結
合特異性は、定方向ペプチドライブラリーで調べたように、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ
５についての結果と有意に異なり、Ｆａｓ抗原中のＱＳＬＶ−ＣＯＯＨモチーフ
等を標的配列にする傾向が見られる（１、３３）。ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３領域が
ｅｐｈｒｉｎＢ１に結合できないということは、ＰＤＺ領域によるｅｐｈｒｉｎ
Ｂ１の認識に特異性の程度の差があることを示している。

【０１０６】 多くのＰＤＺ領域結合部位に顕著な特徴は、側鎖及びＣ末端カルボン酸塩基を
通じてＰＤＺ領域に接触する、Ｃ末端疎水性残基を必要とすることである（１、
３８、３９）。かつては、ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端Ｖａｌがｓｙｎｔｅｎｉｎ
及びＦＡＰ−１ ＰＤＺ５との特異的結合に関与しているということは、末端Ｖ
ａｌ残基を欠損するｅｐｈｒｉｎＢ１の欠失突然変異体をＣｏｓ−１細胞内で発
現することによって調べられていた。全長ｅｐｈｒｉｎＢ１からＣ末端Ｖａｌを
除去したところ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ及びＦＡＰ−１ ＰＤＺ５ ＧＳＴ融合蛋白
質の両方への結合が阻害された（図３Ｂ及び３Ｃ）。

【０１０７】 ＰＤＺ領域蛋白質と相互作用するｅｐｈｒｉｎＢ１の特異性を調べる別の方法
として、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのＣ末端上に形成された特異なペプチドを、競合実験
に用いた。そのために、ｅｐｈｒｉｎＢ１にトランスフェクトした細胞の溶解物
を、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのＣ末端６残基配列に相当するペプチドの存在下又は非存
在下で、ＧＳＴ−ｓｙｎｔｅｎｉｎ又はＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５のいずれ
かと培養した。１００μＭのペプチド濃度で、ペプチドはｓｙｎｔｅｎｉｎ及び
ＦＡＰ１ ＰＤＺ５の結合を阻害した（図４Ａ及び４Ｂ）。関係のないペプチド
DHQpYpYND（配列番号１１）を添加したところ、結合は減少しなかった（図４Ａ
）。このことは、ペプチド競合の特異性を意味している。

【０１０８】 ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及びｓｙｎｔｅｎｉｎはホスホペプチドに対して異なる（d
ifferential）結合を呈示する Ｂ型ｅｐｈｒｉｎが同源ＥｐｈB受容体へ結合する、活性化Srcチロシンキナ−
ゼが発現する、又はＰＤＧＦによりリガンド発現細胞を処理する結果、ｅｐｈｒ
ｉｎ細胞質領域中の残基のチロシンリン酸化が起こる（２６、２７）。ｅｐｈｒ
ｉｎＢ１テール中のＴｙｒ残基が特異的に置換されるという予備的な事実は、Ｐ
ＤＺ領域結合部位内の−２及び−３位置にある２個のチロシンは、リン酸化部位
のひとつであるということを示している。これら残基のチロシンリン酸化がＰＤ
Ｚ領域結合に影響を与えているかどうかを調べるために、上記したペプチド競合
に用いたＣ末端ペプチドを、２及び３チロシン残基の片方又は両方がリン酸化さ
れるように合成した。リン酸化及び非リン酸化ペプチドをフルオレセインで標識
付けし、蛍光偏光実験に用いてＦＡＰ−１及びｓｙｎｔｅｎｉｎＰＤＺ領域に対
する親和性の定量的測定値を得た。

【０１０９】 ＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５は、フルオレセイン標識化NIYYKV（配列番号１
０） ペプチドに９.９±１.０μＭの親和性で結合した一方、ＧＳＴ−ＦＡＰ−
１ ＰＤＺ３の結合はかなり低かった（６５.０±９.６μＭ）（図５Ａ）。この
結果は、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３がｅｐｈｒｉｎＢ１と安定的に相互作用しないこ
とを示したＧＳＴ混合実験と一致する。３個の異なるリン酸化ペプチドへの結合
を調べたところ、同様の結果が得られた。このことは、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎＣ末端
配列の別のチロシンリン酸化状態が、ＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５への結合に
ほとんど影響を与えないことを示している。NIpYYKV、NIYpYKV及びNIpYpYKV（そ
れぞれ配列番号８、９及び７）ペプチドについて、それぞれ６.８±０.８μＭ、
１５.４±３.４μＭ及び８.４±２.５μＭと、同じような結合親和性が得られた
。

【０１１０】 フルオレセイン標識化ＮＩＹＹＫＶ（配列番号１０）及びNIpYYKV（配列番号
８）ペプチドに結合するＧＳＴ−ｓｙｎｔｅｎｉｎ融合蛋白質を蛍光偏光実験で
測定した結果、同一の曲線が得られた（図５Ｂ）。１７.７±１.２μＭ及び１５
.４±０.５μＭの親和性が得られたが、このことは−３位置のチロシンのリン酸
化が、ＰＤＺ領域相互作用に有意な影響を与えないことを示している。しかしＧ
ＳＴ−ｓｙｎｔｅｎｉｎ融合蛋白質はかなり低い親和性（１５１.０±２０.９μ
Ｍ）でpYpYKV（配列番号１２）ペプチドに結合しており、このことは−２Tyrに
おけるリン酸化がｓｙｎｔｅｎｉｎへの結合に有害な影響を与えうるということ
を示している。同様に低い親和性相互作用が、YpYKVペプチドについても観察さ
れた。

【０１１１】 ｅｐｈｒｉｎＢ１及びｓｙｎｔｅｎｉｎは細胞内で関連しうる Ｂ型ｅｐｈｒｉｎは、ＰＤＺ領域蛋白質と生体内で相互作用しうるということ
を、ｅｐｈｒｉｎＢ１及びｓｙｎｔｅｎｉｎがＣｏｓ−１細胞内で共発現した時
に関連しあっているかを検定することによって調べた。ｅｐｈｒｉｎＢ１及びｓ
ｙｎｔｅｎｉｎ（Ｎ末端をＦＬＡＧエピトープで標識付けした）で共トランスフ
ェクトした細胞中で、ｅｐｈｒｉｎＢ１の免疫沈降は特異的にｓｙｎｔｅｎｉｎ
と共沈降した（図６）。蛋白質Aセファロースのみ又は任意に選択した抗体によ
る沈降では、検出可能なｓｙｎｔｅｎｉｎは得られなかった。このことは相互作
用が特異的であることを示している。さらに、ｅｐｈｒｉｎＢ１ Ｖａｌ欠失突
然変異体を用いた共免疫沈降実験では、生体外でのＰＤＺ領域との相互作用が得
られなかったが、このことはＣ末端のＶａｌを欠失するｅｐｈｒｉｎＢ１が、検
出可能な程度にはｓｙｎｔｅｎｉｎとは関連していないことを示している（図６
）。ｅｐｈｒｉｎＢ１に対する抗体によって、末端切断した蛋白質が免疫沈降し
た一方で、突然変異蛋白質によってｓｙｎｔｅｎｉｎは共免疫沈降しなかった。
これらの結果は、ｅｐｈｒｉｎＢ１及びｓｙｎｔｅｎｉｎが細胞内で関連してい
ることを実証しており、生体内でのｓｙｎｔｅｎｉｎとの相互作用には、ｅｐｈ
ｒｉｎＢ１内の未反応のＰＤＺ領域結合部位が必要であることを示している。

【０１１２】 考察 ｅｐｈｒｉｎＢ機能に寄与しうる細胞質領域の構成要素を同定する過程におい
て、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのＣ末端残基が、特異的な蛋白質−蛋白質相互作用を媒介
することが知られる蛋白質モジュールの一種である、ＰＤＺ領域の結合部位を構
成することが実証された。公知の３種のＢ型ｅｐｈｒｉｎ全てに保存されるＣ末
端YYKV配列が、ＰＤＺ領域結合部位をあらわすことを幾つかの証拠が示している
。第一に、ｅｐｈｒｉｎＢ３のＣ末端残基に相当する配列を有するビオチン化ペ
プチドプロ−ブは、公知のＰＤＺ領域含有蛋白質ｓｙｎｔｅｎｉｎ及びＧＲＩＰ
をコードするｃＤＮＡを同定しただけでなく、新規なＰＤＺ領域含有蛋白質、Ｐ
ＨＩＰのｃＤＮＡを同定した。更に、第四のＰＤＺ含有蛋白質ＦＡＰ−１が、予
想された第５のＰＤＺ領域の結合特異性に基づいて、結合候補と同定された。

【０１１３】 第二に、ｓｙｎｔｅｎｉｎ及びＦＡＰ−１についての生体外研究は、これらの
蛋白質のＰＤＺ領域がｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端と特異的に相互作用することを
実証している。ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端Ｖａｌ残基が、これらの相互作用に絶
対的に必要であるという知見は、結合が、他のＰＤＺ領域によるＣ末端標的配列
との相互作用に特徴的な方法で起こることを示している。同様の結果がｅｐｈｒ
ｉｎＢ２を用いた生体外結合実験によっても得られたが、このことはＰＤＺ領域
相互作用が全てのＢ型ｅｐｈｒｉｎに共通である可能性を示唆している。別のＧ
ＲＩＰ ＰＤＺ６及びＧＲＩＰ ＰＤＺ７のＧＳＴ融合を用いて、生体外実験を
行った。ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又は蛍光GNIYYKV（配列番号１３）ペプチドとの相互
作用は、ＧＳＴ混合及び蛍光偏光実験では検出されなかった。両方のｓｙｎｔｅ
ｎｉｎＰＤＺ領域が結合に必要であるのと同様に、ｅｐｈｒｉｎＢ１との結合は
、ＧＲＩＰのＰＤＺ６及びＰＤＺ７両方を必要とするであろう。最後に、ｓｙｎ
ｔｅｎｉｎは全長ｅｐｈｒｉｎＢ１と共に共免疫沈降するが、ＰＤＺ領域標的部
位内を末端切断したｅｐｈｒｉｎＢ１とは沈降しないので、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎ−
ＰＤＺ領域相互作用が生体内で起こりうることが実証されている。

【０１１４】 ＰＤＺ領域標的配列のＣ末端Ｖａｌに対して−２及び−３位置にある２個の隣
接するチロシンをリン酸化して得られる影響を、蛍光偏光アッセイを用いて調べ
た。ＰＤＺ領域の構造研究の結果は、ＰＤＺ領域とＣ末端標的部位の−２及び−
３位置の残基との相互作用が結合特異性を与えていることを示唆している（３８
−４０）。これらの位置の残基をセリンリン酸化した場合、ＰＤＺ領域結合を調
節することが報告されている。PSD−９５の第二のＰＤＺ領域と、内向整流のカ
リウム（Ｋ^＋）チャンネルＫｉｒ２．３との特異的な関連は、Kir２.３のＣ末端
から−２位置のｋｅｙセリン残基を、蛋白質キナ−ゼＡを媒介したリン酸化する
ことによって分断される（４１）。Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ、ＰＤＺ領域蛋白質で
あるＦＡＰ−１及びｓｙｎｔｅｎｉｎについて得られた結果は、ＰＤＺ領域結合
部位内での残基のリン酸化が、異なるＰＤＺ領域に異なる効果を与えることを示
唆している。ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５について得られた結果は、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎ
の結合部位中のチロシンに接触するＰＤＺ領域残基は、２個の追加のリン酸基を
受容できることを示唆している。これは、AF−６の１個のＰＤＺ領域が、コンセ
ンサス標的配列AYYV（配列番号１４）を有する非リン酸化ペプチド、および２Ty
r残基においてリン酸化した対応するペプチドに、およそ同等の親和性で結合す
ることと一致する。これに対して、ＧＳＴ−ｓｙｎｔｅｎｉｎは、ＰＤＺ領域結
合部位の−２残基においてリン酸化したペプチドへの結合量は有意に少ないこと
を示した。これらのデータは、ｅｐｈｒｉｎＢ１のチロシンリン酸化が、モジュ
ラー細胞質蛋白質との相互作用を調節する一つの機構を示している。ＰＤＺ領域
−ｅｐｈｒｉｎＢの関連が果たす役割は、ＰＤＺ領域の公知の機能に基づいて予
想できる。幾つかの例で、膜貫通蛋白質の適当な局在化及び密集における、ＰＤ
Ｚ領域の相互作用の重要性が明らかにされている（４２、４３）。例えば、シナ
プス後末端におけるＮＭＤＡ受容体及びＫ^＋チャンネルの位置決定は、これらの
受容体とＰＤＺ領域含有蛋白質との特異な相互作用に依存する傾向にある（３４
、４４−４７）。Drosophilaの幼生において、ＰＤＺ蛋白質discs−largeをコー
ドする遺伝子に無発現変異がある場合、ＳｈａｋｅｒＫ^＋チャンネルの誤局在化
（mislocalization）が起こる（４８）。ＰＤＺ領域相互作用を介したＳｈａｋ
ｅｒＫ^＋チャンネルの密集は、PSD−９５又はｃｈａｐｓｙｎ１１０のいずれか
の結合相手と共にチャンネルを発現するＣＯＳ７細胞においても実証されている
（４９）。

【０１１５】 正しい局在化及び密集に必要な条件は、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎの提案された機
能において顕著に現われている。ｅｐｈｒｉｎＢ−ＥｐｈＢの相互作用は直接的
な細胞−細胞間接触に関与しているため、受容体発現細胞の接触部位においてｅ
ｐｈｒｉｎが存在する必要がある。この局在化は、ＰＤＺ領域とＢ型ｅｐｈｒｉ
ｎのＣ末端との関連性によって媒介されうる。これに関して、ＰＨＩＰは、初期
胚中の非対称性、及び極性を調節するC. elegans蛋白質であるPAR−３に密接し
た系統であるという興味深い事実がある。ＰＤＺ領域結合モチーフを有する蛋白
質の非対称的な分散の調節において、ＰＨＩＰが哺乳動物細胞と同じ機能を有し
うる。ｅｐｈｒｉｎの細胞外領域の可溶性形態に関する研究によって、受容体の
活性化におけるリガンドの密集に必要な条件があきらかになっている。受容体発
現細胞を可溶性リガンドで処理しても、受容体の活性化及びそれに続く自己リン
酸化は起こらないが、抗体を密集させて可溶性のｅｐｈｒｉｎを人工的に凝集さ
せることによって、受容体の活性化が可能になる（１８）。ｅｐｈｒｉｎ発現細
胞をＥｐｈ受容体発現細胞と共に培養することで受容体が活性化されるので、膜
固着リガンドもある方法で密集状態になっているはずである。更に、腎臓内皮細
胞系における近年の研究により、ｅｐｈｒｉｎＢ１のオリゴマー化状態が、選択
的（alternative）受容体シグナリング複合体の決定、並びに受容体産生細胞に
おける固着及び集合応答に重要であることが示されている（５０）。リガンド二
量体及び高次のオリゴマーが受容体の自己リン酸化を起こすが、リガンドが四量
体の形状をしているときのみ、固着応答を誘導し、低分子量ホスホチロシンホス
ファターゼの活性化受容体への集合を誘導することができる。膜貫通蛋白質の密
集におけるＰＤＺ領域に公知の役割があるとすると、ｅｐｈｒｉｎＢ１とのＰＤ
Ｚ領域の相互作用は、正しいオリゴマー形態のリガンドを呈示して受容体発現細
胞内で特異的な応答を引き起こす、という役割を果たしているかもしれない。

【０１１６】 ＰＤＺ領域含有蛋白質にあるとされる他の役割は、骨格として作用してシグナ
リング複合体を形成することである。このことは、Drosophila複眼の光伝達経路
における蛋白質ＩｎａＤの機能によって詳しく例証されている。過渡的受容体電
位（ＴＲＰ）カルシウムチャンネルを含む、このカスケードの鍵となる構成要素
である、眼型（eye form）蛋白質キナーゼＣ及びホスホリパーゼＣ−βは、Ｉｎ
ａＤのＰＤＺ領域に結合して、区画化されたシグナリング複合体を形成する（５
１、５２）。結合を破壊する、特異なInaD ＰＤＺ領域における突然変異がある
と、光伝達カスケードの動力学に欠点が生じる。Ｂ型ｅｐｈｒｉｎの場合、生化
学の研究の結果得られた遺伝子上の証拠は、細胞内領域におけるチロシン残基が
受容体結合によってリン酸化されることを示しており、ＰＤＧＦ処理によって、
Ｂ型ｅｐｈｒｉｎの細胞質テールは固有のシグナリング機能を有するという仮説
が導き出されている（２、６、２６、２７）。リン酸化されたチロシン残基は、
ＳＨ２やＰＴＢ領域などのホスホチロシン認識モジュールを有する蛋白質用の、
潜在的な結合部位に相当する。この潜在的なホスホチロシン依存性シグナリング
経路の下流構成要素は、ＩｎａＤ複合体と同様の方法でＰＤＺ領域含有蛋白質に
結合し（assembled around）うる。さらに、グルタミン酸受容体及びＫ^＋チャン
ネルに関連するＰＤＺ領域含有蛋白質PSD−９５も又、そのＰＤＺ領域を通じて
、ニューロンの酸化窒素シンターゼ及びＲａｓ ＧＴＰアーゼ活性蛋白質（ｐ１
３５SynGAP）に相互作用する（５３、５４）。従って、ＰＤＺ領域含有蛋白質を
アダプターとして用い、直接的にシグナリング回路を活性化することができる。
これに関連して、ｓｙｎｔｅｎｉｎを用いた結果が示唆するのと同様に、Ｃ末端
ｅｐｈｒｉｎＢ１モチーフのＴｙｒ残基のリン酸化が、ＰＤＺ領域との相互作用
を調節しうるということは興味深いことである。

【０１１７】 本発明の原理を好ましい態様において例証し説明したが、本発明がその組み合
わせ、詳細に関して、原理から外れることなく改変できることは当業者には自明
であろう。付属の請求項の範囲に含まれるあらゆる改変を、請求の対象とする。 本明細書に記載した全ての出版物、特許及び特許出願は、参照して説明に代え
る。

【０１１８】 図の詳細な説明 図１：ヒトＢ型ｅｐｈｒｉｎの細胞質領域のアミノ酸配列。３個のＢ型ｅｐｈ
ｒｉｎにおいて、保存残基を強調してある。星印は潜在的なリン酸化部位である
チロシンを表す。潜在的なＰＤＺ領域結合部位に下線を記した。

【０１１９】 図２Ａ−Ｄ：ｅｐｈｒｉｎＢに結合するＰＤＺ領域含有候補の同定。図２Ａ：
全長ＦＡＰ−１蛋白質チロシンホスファターゼを表わす概略図と、その下にＦＡ
Ｐ−１ ＰＤＺ５の好ましい結合配列を示す。ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５領域の特異
性は、定方向ペプチドライブラリー法から演繹した（１）。Ｂ型ｅｐｈｒｉｎの
Ｃ末端配列に適合する、最適な結合配列内の残基を、太字で記した。この図にお
いて示されるＦＡＰ−１のＰＤＺ領域の構成は、Sato他（３３）に記載の番号付
けに従っている。図２Ｂ：ｅｐｈｒｉｎＢ３ Ｃ末端配列のビオチン化ペプチド
プローブによる発現スクリーニングを通じて同定したＰＤＺ領域含有蛋白質の略
図である。括弧は、スクリーニングによって単離されたｃＤＮＡによってコード
される蛋白質の部分を示す。ＰＤＺ領域は灰色の箱で表わす。図２Ｃ：発現スク
リーン中で単離されたＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及びＰＤＺ領域のアミノ酸配列を整
列させたものである。ＰＤＺ領域の数字は、図２Ｂに示したものである。保存残
基にハイライトを入れてある。整列はClustal Wプログラムを用いて行った（５
５）。図２Ｄ：ＰＨＩＰ及びＰＡＲ−３のアミノ酸配列を整列させたものである
。保存残基にハイライトを入れ、ＰＤＺ領域に下線を引いてある。整列はGenest
ream整列プログラムを用いて行った。

【０１２０】 図３Ａ−Ｄ：ＧＳＴ混合において、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及びｓｙｎｔｅｎｉ
ｎはｅｐｈｒｉｎＢ１へ特異的に結合する。Ｃｏｓ−１細胞を野生型ｅｐｈｒｉ
ｎＢ１（W.T.）又はｅｐｈｒｉｎＢ１ Val欠失（ValΔ）のいずれかで一時的に
トランスフェクトした。トランスフェクトしないものも用意した。細胞溶解を上
記したようにＧＳＴ融合蛋白質と培養し、抗ｅｐｈｒｉｎＢ１抗体を用いた免疫
ブロットによって分析した。正の対照として、免疫沈降したｅｐｈｒｉｎＢ１又
はｅｐｈｒｉｎＢ１ ValΔを含有させた。図３Ａ及び３Ｂ：ＦＡＰ−１の融合蛋
白質とのＧＳＴ混合。図３Ｃ及び３Ｄ：ｓｙｎｔｅｎｉｎの融合蛋白質とのＧＳ
Ｔ混合。

【０１２１】 図４Ａ及び４Ｂ：ｅｐｈｒｉｎＢ１へのＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及びｓｙｎｔｅ
ｎｉｎの結合は、Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのＣ末端配列に相当するペプチドを添加する
ことで阻害が可能である。配列を示したペプチドを、１００μＮの濃度で、ＧＳ
Ｔ融合蛋白質とｅｐｈｒｉｎＢ１でトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞の溶解
と共に培養した。関連する蛋白質を１０％ ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上
で分離し、ｅｐｈｒｉｎＢ１に対する抗体を用いた免疫ブロットによって分析し
た。図４Ａ：配列を示したペプチドを用いた、ｅｐｈｒｉｎＢ１へのＦＡＰ−１
ＰＤＺ５の結合の競合。配列DHQpYpYNDを有するペプチドを負の対照として１
００μＭの濃度で添加した。ｅｐｈｒｉｎＢ１の免疫沈降は、正の対照として含
有させた。図４Ｂ：ｅｐｈｒｉｎＢ１への全長ｓｙｎｔｅｎｉｎの結合の競合。

【０１２２】 図５Ａ及び５Ｂ：ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端に相当するフルオレセイン標識化
ペプチドに結合するＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３、ＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤ
Ｚ５及びＧＳＴ−ｓｙｎｔｅｎｉｎの蛍光偏光分析。図５Ａ：２５ｎＭフルオレ
セイン標識化NIYYKVペプチドプロ−ブ、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７.０）、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む混合物中で、
示した最終濃度のＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３（○）又はＧＳＴ−ＦＡＰ−１
ＰＤＺ５（●）融合蛋白質を含む溶液を、２２℃の蛍光偏光にてモニターした
。ＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５融合蛋白質に関しては、リン酸化ペプチドNIpY
YKV（▼）、NiYpYKV（▲）及びNIpYpYKV（■）への結合についても調べた。ＧＳ
Ｔ−融合蛋白質の存在しないペプチドについて得られた蛍光偏光の値を、表示さ
れた蛍光偏光の値から引いた。図５Ｂ：蛍光偏光によって測定した、全長ｓｙｎ
ｔｅｎｉｎのＧＳＴ融合によるNIYYKV（●）、NIpYYKV（▼）及びNIpYpYKV（■
）ペプチドへの結合。

【０１２３】 図６：ｓｙｎｔｅｎｉｎ−FLAGと、ｅｐｈｒｉｎＢ１との共免疫沈降。上に記
載したように、Ｃｏｓ−１細胞をｅｐｈｒｉｎＢ１及びｓｙｎｔｅｎｉｎ−FLAG
、あるいはｅｐｈｒｉｎＢ１ Val 欠失及びｓｙｎｔｅｎｉｎFLAGのいずれかと
共に、トランスフェクトした。細胞溶解は、ｅｐｈｒｉｎＢ１又はＩＬ−３受容
体αに対する抗体で免疫沈降したか、あるいは蛋白質Ａセファロースのみで処理
した。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）にかけ、抗FLAG抗体でブロット
した。

【０１２４】 図７：ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端に相当するフルオレセイン標識化ペプチドに
結合するＧＳＴ−ＰＨＩＰ ＰＤＺ３の蛍光偏光分析。２５nMフルオレセイン標
識化ペプチドプロ−ブ、２０mMリン酸塩（ｐＨ７.０）、１００mM NaCl及び２mM
DTTを含む混合物中で、示した最終濃度のＧST−ＰＨＩＰ ＰＤＺ３融合蛋白質
を含む溶液を、２２℃の蛍光偏光にてモニターした。ＧＳＴ−ＰＨＩＰ ＰＤＺ
３融合蛋白質に関して、リン酸化ペプチドNIpYYKV（▼）、NiYpYKV（▲）及びNI
pYpYKV（■）並びに非リン酸化NIYYKVペプチド（●）への結合について調べた。
ＧＳＴ−融合蛋白質の存在しないペプチドについて得られた蛍光偏光の値を、表
示された蛍光偏光の値から引いた。

【０１２５】 図８：ＧＳＴ混合において、ＰＨＩＰ ＰＤＺ３はV−Srcリン酸化ｅｐｈｒｉ
ｎＢ１に特異的に結合する。COS−１細胞をV−Src及び、野生型ｅｐｈｒｉｎＢ
１又はｅｐｈｒｉｎＢ１ Val欠失（VA）のいずれかと共に一時的にトランスフェ
クトした。あるいは、野生型ｅｐｈｒｉｎＢ１又はｅｐｈｒｉｎＢ１ Val 欠失
のいずれかのみとトランスフェクトした。細胞溶解を上記したようにＧＳＴ融合
蛋白質と培養し、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロットによって分析した
。正の対照として、免疫沈降したｅｐｈｒｉｎＢ１を含有させた。

【０１２６】本明細書における参考文献の一覧 １. Songyang, Z., Fanning, A.S., Fu, C., Xu, J., Marfatia, S.M., Chisht
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【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＢ型ｅｐｈｒｉｎの細胞質領域のアミノ酸配列（配列番号１５、１６及び
１７）を示す。

【図２Ａ】 ＦＡＰ−１蛋白質チロシンホスファターゼ全体の概略図と、その下にＦＡＰ−
１ ＰＤＺ５の好ましい結合配列（配列番号１８、１９及び２０）を示す。

【図２Ｂ】 ｅｐｈｒｉｎＢ３ Ｃ末端配列のビオチン化ペプチドプローブによる発現スク
リーンによって同定したＰＤＺ領域含有蛋白質の略図である。

【図２Ｃ】 発現スクリーン中で単離されたＦＡＰ−１ ＰＤＺ５及びＰＤＺ領域のアミノ
酸配列を整列させたものである（配列番号２１−２７）。

【図２Ｄ】 ＰＨＩＰ及びＰＡＲ−３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び３４）を整
列させたものである。

【図３Ａ】 ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５ ＧＳＴ融合蛋白質によるｅｐｈｒｉｎＢ１への結合を
示すブロットである。

【図３Ｂ】 ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５融合蛋白質によるｅｐｈｒｉｎＢ１への結合を示すブロ
ットである。

【図３Ｃ】 ｓｙｎｔｅｎｉｎＧＳＴ蛋白質によるｅｐｈｒｉｎＢ１への結合を示すブロッ
トである。

【図３Ｄ】 ｓｙｎｔｅｎｉｎＧＳＴ蛋白質によるｅｐｈｒｉｎＢ１への結合を示すブロッ
トである。

【図４Ａ】 Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのＣ末端配列に相当するペプチドを付加することによって、
ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５によるｅｐｈｒｉｎＢ１への結合が阻害されたことを示す
ブロットである。

【図４Ｂ】 Ｂ型ｅｐｈｒｉｎのＣ末端配列に相当するペプチドを付加することによって、
ｓｙｎｔｅｎｉｎによるｅｐｈｒｉｎＢ１への結合が阻害されたことを示すブロ
ットである。

【図５Ａ】 ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端に相当するペプチドをフルオレセイン標識化したも
のに対する、ＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ３及びＧＳＴ−ＦＡＰ−１ ＰＤＺ５
による結合の蛍光偏光分析を示すグラフである。

【図５Ｂ】 ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端に相当するペプチドをフルオレセイン標識化したも
のに対する、ＧＳＴ−ｓｙｎｔｅｎｉｎによる結合の蛍光偏光分析を示すグラフ
である。

【図６】 ｓｙｎｔｅｎｉｎ−ＦＬＡＧとｅｐｈｒｉｎＢ１との共免疫沈降を示すブロッ
トである。

【図７】 ｅｐｈｒｉｎＢ１のＣ末端に相当するペプチドをフルオレセイン標識化したも
のに対する、ＧＳＴ−ＰＨＩＰ ＰＤＺ３による結合の蛍光偏光分析を示すグラ
フである。

【図８】 ＧＳＴ混合物中でＰＨＩＰ ＰＤＺ３がＶ−Ｓｒｃリン酸化ｅｐｈｒｉｎＢ１
に特異的に結合することを示す免疫ブロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 5/10 7/08 7/06 14/00 7/08 19/00 14/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 19/00 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/06 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アントニー ポーソン カナダ国 エム６ピー ３シー６ オンタ リオ、トロント、グレンウッド アベニュ ー 34 Ｆターム(参考） 4B065 AB10 AC20 BA30 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 BA01 BA09 BA10 BA17 BA18 BA22 BA23 BA41 BA44 BA50 CA17 CA23 CA53 CA56 CA59 DC01 DC29 DC32 MA02 MA13 MA52 MA57 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA011 ZA201 ZB211 ZC011 ZC021 ZC201 ZC421 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA40 BA41 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 EA65 FA20 FA74

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ及びＰＤＺ領域含有蛋白質を包含する
   単離複合体。
2. 【請求項２】 該ＢクラスｅｐｈｒｉｎがｅｐｈｒｉｎＢ１又はｅｐｈｒｉ
   ｎＢ３であることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
3. 【請求項３】 該ＰＤＺ領域含有蛋白質が、ＧＲＩＰ、ＧＲＩＰ ＰＤＺ６
   及びＰＤＺ７（配列番号２２及び２３）、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ（配列番号２１）
   、ｓｙｎｔｅｎｉｎのアミノ酸残基１−２９９、ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１及
   びＰＤＺ２（配列番号２６及び２７）、ＰＨＩＰ ＰＤＺ２（配列番号２４）又
   はＰＨＩＰ ＰＤＺ３（配列番号２５）であることを特徴とする、請求項１又は
   ２に記載の複合体。
4. 【請求項４】 ｅｐｈｒｉｎ Ｂ３／ＧＲＩＰ；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ３／ＧＲＩ
   Ｐ ＰＤＺ６及びＰＤＺ ７（配列番号２２及び２３）；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１／Ｆ
   ＡＰ−１ ＰＤＺ（配列番号２１）；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又はＢ３／ｓｙｎｔｅ
   ｎｉｎ ＰＤＺ１及びＰＤＺ２（配列番号２６及び２７）；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又
   はＢ３／ｓｙｎｔｅｎｉｎの残基１−２９９；ｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又はＢ３／Ｐ
   ＨＩＰ ＰＤＺ２（配列番号２４）；又はｅｐｈｒｉｎ Ｂ１又はＢ３／ＰＨＩＰ
   ＰＤＺ３（配列番号２５）である、請求項３に記載の複合体。
5. 【請求項５】 ＢクラスｅｐｈｒｉｎのＰＤＺ結合領域に由来するペプチド
   。
6. 【請求項６】 ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用
   に干渉する、式Ｉの合成ペプチド。 Ｘ−Ｘ^１−Ｘ^２−Ｋ−Ｖ Ｉ （ここでＸは０〜７０個のアミノ酸であり、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれチロシン又
   はホスホチロシンを表わす。）
7. 【請求項７】 Ｘが２〜２０個のアミノ酸であることを特徴とする、請求項
   ６に記載のペプチド。
8. 【請求項８】 ＸがＮＩ、ＧＮＩ、ＣＰＨＹＥＫＶＳＧＤＹＧＨＰＶＹＩＶ
   Ｑ（Ｅ，Ｄ）（Ｍ，Ｇ）ＰＰＱＳＰ（Ａ，Ｐ）Ａ（配列番号２）、ＧＤＹＧＨＰ
   ＶＹＩＶＱ（Ｅ，Ｄ）（Ｍ，Ｇ）ＰＰＱＳＰ（Ａ，Ｐ）Ａ（配列番号３）、ＰＰ
   ＱＳＰ（Ａ，Ｐ）Ａ（配列番号４）、又はＧＰＰＱＳＰＰＮＩ（配列番号３２）
   であることを特徴とする、請求項７に記載のペプチド。
9. 【請求項９】 ＹＹＫＶ（配列番号５）、ＧＰＰＱＳＰＰＮＩｐＹＹＫＶ（
   配列番号６）、ＮＩｐＹｐＹＫＶ（配列番号７）、ＮＩｐＹＹＫＶ（配列番号８
   ）、ＮＩＹｐＹＫＶ（配列番号９）、ＮＩＹＹＫＶ（配列番号１０）、ＧＮＩＹ
   ＹＫＶ（配列番号２８）、ＧＮＩｐＹｐＹＫＶ（配列番号２９）、ＧＮＩｐＹＹ
   ＫＶ（配列番号３０）、又はＧＮＩＹｐＹＫＶ（配列番号３１）である、請求項
   ７に記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 請求項６、７、８又は９に記載のペプチド及びＰＤＺ領域
    含有蛋白質を包含する複合体。
11. 【請求項１１】 該ＰＤＺ領域含有蛋白質が、ＧＲＩＰ、ＧＲＩＰ ＰＤＺ
    ６及びＰＤＺ７（配列番号２２及び２３）、ＦＡＰ−１ ＰＤＺ（配列番号２１
    ）、ｓｙｎｔｅｎｉｎのアミノ酸残基１−２９９、ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ１
    及びＰＤＺ２（配列番号２６及び２７）、ＰＨＩＰ ＰＤＺ２（配列番号２４）
    ；又はＰＨＩＰ ＰＤＺ３（配列番号２５）であることを特徴とする、請求項１
    ０に記載の複合体。
12. 【請求項１２】 ＦＡＰ−１ ＰＤＺ（配列番号２１）／ＮＩｐＹＹＫＶ、
    ＦＡＰ−１ ＰＤＺ（配列番号２１）／ＮＩｐＹｐＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ／
    ＮＩＹＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ／ＮＩｐＹＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ ＰＤＺ
    １及びＰＤＺ２（配列番号２６及び２７）／ＮＩＹＹＫＶ、ｓｙｎｔｅｎｉｎ
    ＰＤＺ１及びＰＤＺ２（配列番号２６及び２７）／ＮＩｐＹＹＫＶ、又はＰＨＩ
    Ｐ ＰＤＺ３（配列番号２５）／ＧＮＩｐＹｐＹＫＶ又はＰＨＩＰ ＰＤＺ３（配
    列番号２５）／ＧＮＩｐＹＹＫＶである、請求項１０に記載の複合体。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載の複合体を有効量投与することを包含する
    、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変調する方法。
14. 【請求項１４】 請求項６に記載のペプチドを有効量投与することを包含す
    る、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変調する方法
    。
15. 【請求項１５】 （ａ）複合体を、該複合体に結合する可能性のある少なく
    とも１個の物質に、該物質と該複合体との結合を可能にする条件下で反応させ、
    そして（ｂ）結合を検出する（ここで結合の検出は、該物質が該複合体に結合す
    ることを意味する）ことを包含する、請求項１に記載の複合体に結合する物質を
    同定する方法。
16. 【請求項１６】 物質−複合体連結、あるいはＢクラスｅｐｈｒｉｎＢ又は
    ＰＤＺ領域含有蛋白質の活性を検定することによって結合を検出することを特徴
    とする、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１、２又は３に記載の複合体を、該複合体に結合す
    る物質ならびに試験化合物と共に、該物質と該複合体との連結体の形成を可能に
    する条件下に提供し；そして連結体を除去し及び／又は検出することを包含する
    、化合物について、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用
    を変調する能力を評価する方法。
18. 【請求項１８】 （ａ）Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ、ＰＤＺ領域含有蛋白質、及
    び試験化合物を、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との結合を可能
    にする条件下に提供し；そして（ｂ）結合を検出する（ここで試験化合物の非存
    在下における結合に比較して、増加した又は減少した結合が検出されたとき、試
    験化合物がＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変調す
    ることを意味する）ことを包含する、化合物について、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎと
    ＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変調する能力を評価する方法。
19. 【請求項１９】 Ｂクラスｅｐｈｒｉｎの末端アアミノ酸Ｖａｌを変えるこ
    とを包含する、ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作用を変
    調する方法。
20. 【請求項２０】 ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域含有蛋白質との相互作
    用を変調する薬剤の調製における、請求項１に記載の複合体又は請求項６に記載
    のペプチドの使用。
21. 【請求項２１】 Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ又はＰＤＺ領域含有蛋白質に関連す
    る細胞の、細胞過程を変調する薬剤の調製における、請求項１に記載の複合体又
    は請求項６に記載のペプチドの使用。
22. 【請求項２２】 該細胞過程が、軸索形成、神経細胞相互作用、及び神経細
    胞の再生である請求項２１に記載の使用。
23. 【請求項２３】 請求項１に記載の複合体又は請求項６に記載のペプチド、
    及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈液を包含する、Ｂクラスｅｐｈｒ
    ｉｎに関連した疾患を有する個人への投与に効果的な組成物。
24. 【請求項２４】 請求項１に記載の複合体又は請求項６に記載のペプチドを
    細胞に導入することを包含する、Ｂクラスｅｐｈｒｉｎ又はＰＤＺ領域含有蛋白
    質に関連した細胞の増殖、成長又は分化を変調する方法。
25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の組成物を用いて、Ｂクラスｅｐｈｒｉ
    ｎ又はＰＤＺ領域含有蛋白質に関連した増殖又は分化の疾患を治療する方法。
26. 【請求項２６】 配列番号１のアミノ酸配列を包含する単離蛋白質。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の蛋白質の末端切断体、類似体、対立遺
    伝子又は種上の変異体、又は請求項２６に記載の蛋白質と実質的に同一の配列を
    有する蛋白質。
28. 【請求項２８】 蛋白質に連結した、請求項２６に記載の単離蛋白質を包含
    する、融合蛋白質。
29. 【請求項２９】 請求項２６に記載の蛋白質のエピトープに対して特異性を
    有する抗体。
30. 【請求項３０】 蛋白質を、該蛋白質に結合する可能性のある少なくとも１
    個の物質に、該物質と該蛋白質との結合を可能にする条件下で反応させ、結合を
    検出する（ここで結合の検出は、該物質が該蛋白質に結合することを意味する）
    ことを包含する、請求項２６に記載の蛋白質に結合する物質を同定する方法。
31. 【請求項３１】 請求項２６に記載の蛋白質、該蛋白質に結合する物質なら
    びに試験化合物を、該物質と該蛋白質との結合を可能にする条件下に提供し、結
    合を検出する（ここで試験化合物の非存在下における結合に比較して、増加した
    又は減少した結合が検出されたとき、試験化合物が蛋白質の活性を変調すること
    を意味する）ことを包含する、化合物について、該蛋白質の生物学的活性を変調
    する能力を評価する方法。