BG106907A

BG106907A - Nogo рецептор - медиирана блокада на аксоналния растеж

Info

Publication number: BG106907A
Application number: BG106907A
Authority: BG
Inventors: Stephen Strittmatter
Original assignee: Yale University
Priority date: 2000-01-12
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2003-05-30
Also published as: AU784349C; HUP0203863A3; WO2001051520A3; AU784349B2; CN1404488A; KR20020097157A; CN100354307C; SK9992002A3; MXPA02006885A; HUP0203863A2; JP2003519481A; EA200200755A1; EP1248803B1; ATE466882T1; GEP20063830B; CA2397199A1; AU2940101A; YU53502A; EE200200386A; CZ20022438A3

Abstract

Изобретението се отнася до препарати и методи, приложими при лечение на черепни и мозъчни травми, увреждания на гръбначния мозък, инсулт или демиелинизиращо заболяване. Изобретението се отнася също до Nogo рецепторни белтъци и биологично активни Nogo (лиганд) белтъчни фрагменти, до препарати и методи за моделиране експресията или активността на Nogo и Nogo рецепторния белтък, както и до пептиди, които блокират Nogo-медиирано инхибиране на аксоналното нарастване.

Description

ОБЛАСТ HA ТЕХНИКАТА

Изобретението е специфично свързано с нови човешки и 0 миши гени, които кодират рецептор за Nogo белтък, този рецептор е способен да регулира аксоналния растеж. Тези Nogo рецепторни гени селективно се експресират в аксоните и дендритите на нервните клетки на централната нервна система при аксоналния растеж. Изобретението е свързано също с комбинация от методи за селективната блокада на Nogo рецептор-медиирано инхибиране на аксоналния растеж, чрез блокиране взаимодействието на Nogo с Nogo рецептора. Блокадата на взаимодействието на Nogo с неговия рецептор води до блокада на инхибиторните ефекти на Nogo върху аксоналния растеж, като предизвиква последващо увеличение на аксоналния растеж.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Аксони и дендрити са дълги клетъчни израстъци на невроните. В дисталния край на един удължаващ се аксон или неврит има една специализирана област, известна като растежен конус. Растежните конуси са отговорни за усещане на локалната заобикаляща среда и придвижването към клетката, която е прицелна за неврона. Растежните конуси имат формата на ръчичка, с няколко дълги филоподии, които диференцирано прилепват към ® повърхностите на ембриона. Растежните конуси могат да бъдат чувствителни към няколко насочващи знаци, например повърхностно прилепване, растежни фактори, невротрансмитери и елекгрични полета. Напътването на растежа при конуса зависи от различни класове молекули на прилепване, междуклетъчни сигнали, както и фактори, които стимулират и инхибират растежните конуси. Растежният конус локализиран на края на растящият неврит напредва в различна степен, но обикновено със скорост от един до два милиметра дневно. Конусът се състои от обширно плоско разширение, с многобройни дълги микро шипчета или филоподии, Q които се изтеглят като острия. Тези филоподии са непрекъснато активни. Докато някои филоподии се ретрахират обратно в растежния конус, други продължават да се източват през слоя. Удълженията между различни филоподии образуват ламелиподии.

Растежният конус може да изследва зоната, която е пред него от двете страни с неговите ламелиподии и филоподии. Когато едно удължение дойде в контакт с благоприятна повърхност, то продължава да се източва и може да манипулира растежния конус, който се движи в това направление. Така, растежният конус може да бъде управляван от малки промени в свойствата на повърхността на субстрата. Когато растежният конус достигне съответна прицелна клетка се създава синаптичен контакт.

Увредени неврони не регенерират в централната нервна система (ЦНС) след нараняване дължащо се на травма и заболяване. Отсъствието на аксонална регенерация след увреждане може да бъде приписана на наличието на инхибитори на аксоналния растеж. Тези инхибитори преимуществено са свързани с миелина и съставляват важна бариера за регенерация. Инхибитори на аксоналния растеж присъствуват в миелин от централната нервна Ф система и плазмената мембрана на олигодендроцитите, които синтезират миелин в ЦНС (Schwab et al., (1993) Amm.Rev.Neurosci. 16, 565-595).

Миелинът на ЦНС е удължение на клетъчната мембрана на олигодендроцита. Един олигодендроцит миелинизира до тридесет различни аксонални сегменти на ЦНС. Мембранните източвания на олигодендроцита обвиват аксоните концентрично за образуване на миелинова обвивка. Плътно прилепналият зрял миелин се състои от паралелни слоеве на бимолекулни липиди разположени към слоеве от хидратиран белтък. Активна миелинова синтеза започва in utero и ф продължава през първите две години от живота. По-бавна синтеза продължава по време на детството и юношеството, като обмяна на зрелия миелин продължава в бавна степен по време на зрелия живот. Развиващите се и зрелите форми на миелин са податливи на увреждане от заболяване или физическа травма, което води до деградиране на миелина обвиващ аксона.

Изглежда, че свързани с миелин инхибитори първично допирнасят за отслабване аксоналната регенерация на ЦНС in vivo, след прекъсване цялостта на аксона, докато други инхибитори на немиелин свързан аксонален растеж в ЦНС, могат да имат по-малка роля. Тези инхибитори блокират аксоналната регенерация след невронално увреждане от травма, инсулт или вирусна инфекция.

Многобройни инхибитори на миелин-производен аксонален растеж, са характеризирани (виж, за обзор David et di., (1999) WO995394547; Bandman et al., (1999) U.S. Patent 5,858,708; Schwab, (1996) Neurochem.Res. 21, 755-761). Описани са няколко компоненти на бялото вещество на ЦНС, N135, N1250 (Nogo) и миелин-свързан гликопротеин (MAG), които имат инхибиторна активност при аксоналното удължаване (Schwab et al., (1990) W09005191] Schwab et ф al., (1997) U.S. Patent 5,684,133). В частност, Nogo e 250 kDa миелинсвързан инхибитор на аксоналния растеж, който е клониран и характеризиран (Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364; Schwab, (1990) Exp.Neurol. 109, 2-5). Nogo кДНК за пръв път е идентифицирана чрез случаен анализ на мозъчна кДНК и е нямала предполагаема функция (Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364).

Schwab и колеги са публикували последователността на шест пептиди, случайни производни от протеолитична хидролиза на предполагаем говежди N1250 (Nogo) белтък (Spillmann et al., (1998) J.Biol.Chem. 273, 19283-19293). Наскоро бе депозирана в GenBank ц предполагаема пълноверижна кДНК последователност за този белтък. Този 4.1 килобаза човешки кДНК клон, KIAA0886, произхожда от усилието на Kazusa DNA Research Institute да секвенира произволна високомолекулна мозъчна кДНК (Nagase et al., (1998) DNA Res. 31, 355-364). Този нов кДНК клон кодира 135 kDa белтък, който включва всичките шест пептидни последователности, произхождащи от говежди Nogo.

Човешката Nogo-A последователност споделя висока хомология върху нейната карбоксилна трета с Reticulon (Rtn) белтъчното семейство. Rtn 1 също е наречен невро-ендокринен специфичен белтък (NSP) поради това, че той се експресира изключително в невро-ендокринни клетки (Van de Velde et al., (1994) J.Cell.Sci. 107, 2403-2416). Всички Rtn белтъци споделят една област от 200 аминокиселинни остатъци на последователността при карбоксилния край на белтъка (Van de Velde et al., (1994) J.Cell.Sci. 107, 2403-2416; Roebroek et al., (1996) Genomics 32, 191-199; Roebroek et al., (1998) Genomics 51, 98-106; Moreira et al., (1999) Genomics 58, 73-81; Morris et al., (1991) Biochim.Biophys.Acta 1450, 68-76). Разпознати са сродни последователности в геномите на мухата и червея (Moreira et al., (1999) Genomics 58, 73-81). Тази област е © приблизително 70% идентична с Rtn семейството. Амино крайните области не са свързани една с друга и произхождат от различни алтернативни РНК снаждащи процеси.

Предсказани са три форми на Nogo белтък от анализи на последователности депозирани в GenBank и по хомология с публикуваните Rtn 1 изоформи (Nogo-А, Nogo-B, Nogo-C). Nogo-B от 37 kDa е възможно да съответствува на N135 и обяснява антигенната свързаност на инхибиторната активност върху N135 и N1250 (Nogo-A) аксоналното нарастване. Nogo-C-Myc показва електрофоретична подвижност съответна на 25 kDa при SDS-PAGE © и е описан по-рано като Rtn4 и vp2015. Способността на Nogo-A белтъкът да инхибира аксоналната регенерация е призната наскоро (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444; Chen et al., (2000) Nature 403, 434-439; Prinjha et al., (2000) Nature 403, 483-484).

Отсъствието на отново удължаване на аксона през лезии на ЦНС, след увреждане е прието като причина за постоянните вредни ефекти свързани с травма, инсулт и демиелинизиращи заболявания. Описана е модулация на NI250 като средство за лечение регенерация на неврони, увредени от травма, инфаркт и дегенеративни заболявания на ЦНС (Schwab et al., (1994) WO9417831; Tatagiba et al., (1997) Neurosurgery 40, 541-546) както и злокачествени тумори в

ЦНС, като глиобластома (Schwab et al., (1993) U.S.Patent 5,250,414; Schwab et al., (2000) U.S.Patent 6,025,333).

Съобщено е, че антитела, които разпознават NI250 са полезни при диагнозата и лечението на нервни увреди в резултат на травма, инфаркт и дегенеративни заболявания на ЦНС (Schnell & Schwab, (1990) Nature 343, 269-272; Schwab et al., (1997) U.S.Patent 5,684,133). При аксони, коит стават миелинизирани, има корелация между развитието на миелин и появата на Nogo. След блокиране на Nogo с антитела, невроните могат отново да изпращат израстък през © нарушения, предизвикани от нервно увреждане (Varga et al., (1995) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92,10959-10963).

Механизмът на действие, по който Nogo инхибира аксоналния растеж не е напълно изяснен. Идентифицирането и характеризирането този механизъм на действие и биохимичните пътища, свързани с ефектите на Nogo, биха били полезни при лечение на болестни състояния, свързани с аксонапно увреждане и аксонална демиелинизация.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ф Настоящето изобретение се основава на откритието на Nogo рецепторни белтъци и биологично активни Nogo белтъчни (лигандни) фрагменти. Изобретението предоставя изолирана молекула нуклеинова киселина, подбрана от група състояща се от изолирана молекула нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20; изолирана молекула нуклеинова киселина, която кодира фрагмент от най-малко шест, напр. десет, петнадесет, двадесет, двадесет и пет, тридесет, четиридесет, петдесет, шестдесет или седемдесет аминокиселини на SEQ ID N0:2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20; изолирана молекула нуклеинова киселина, която хибридизира с молекула нуклеинова киселина съдържаща комплемента на SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 или 19 при условия на висока строгост; и изолирана молекула нуклеинова киселина, с най-малко седемдесет и пет, например, осемдесет, осемдесет и пет, деветдесет или деветдесет и пет процента идентичност на аминокиселинната последователност с SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 или 19. В предпочитано изпълнение, изобретението включва изолирана молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотиди 166 до 1584 на SEQ ID NO: 1 или нуклеотиди 178 до 1596 на SEQ ID NO: 3.

Настоящето изобретение по-нататък включва молекулите нуклеинови киселини, оперативно свързани с един или повече контролни елементи на експресията, включително вектори съдържащи изолираните молекули нуклеинови киселини. Изобретението по-нататък включва клетки гостоприемници, трансформирани да съдържат молекулите нуклеинови киселини на изобретението и методи за получаване на белтък, характеризиращ се с етап за култивиране на клетка гостоприемник, трасформирана с молекула нуклеинова киселина на изобретението, в условия, при които белтъкът е експресиран.

Настоящето изобретение включва изолиран полипептид, подбран от групата състояща се от изолиран пептид съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20; изолиран полипептид съдържащ фрагмент от наймалко шест, например, десет, петнадесет, двадесет, двадесет и пет, тридесет, четиридесет, петдесет, шестдесет или седемдесет аминокиселини на SEQ ID N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20; изолиран полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20, съдържаща наймалко една, например пет, десет, петнадесет или двадесет консервативни аминокиселинни замени; изолиран полипептид съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 съдържаща една, например пет, десет, петнадесет или двадесет естествено срещащи се замени на аминокиселинната последователност; и един изолиран полипептид с най-малко седемдесет и пет, например осемдесет, осемдесет и пет, деветдесет или деветдесет и пет процента идентичност на аминокиселинната последователност със SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20. Изобретението включва също химерни полипептиди, съдържащи аминокиселинната последователност на © SEQ ID N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20.

Изобретението по-нататък предоставя антитела, които се свързват с Nogo белтък и антитела, които се свързват с Nogo рецепторен белтък. Антителата могат да бъдат моноклонални или поликлонални антитела. В допълнение, антитялото може да бъде хуманизирано. Изобретението включва също фрагменти от антитяло, които проявяват антиген свързваща активност.

Изобретението включва метод за идентифициране на агент, който модулира Nogo белтък или експресия на Nogo рецепторен белтък, характеризиращ се с това, че има етапи за предоставяне на © клетка експресираща Nogo белтък или Nogo рецепторен белтък;

контактуване на клетката с кандидат-агент; и откриване нарастване или намаление нивото на Nogo белтъка или експресията на Nogo рецепторен белтък в присъствието на кандидат-агента, по отношение нивото на Nogo белтък или експресия на Nogo рецепторен белтък в отсъствието на кандидат-агента.

Изобретението включва също метод за идентифициране агент, който модулира най-малко една активност на Nogo белтък или Nogo рецепторен белтък, характеризиращ се с това, че има етапи предоставящи клетка експресираща Nogo белтък или Nogo рецепторен белтък; контактуване на клетката с кандидат-агент; и откриване нарастване или намаление нивото на Nogo белтък или активност на Nogo рецепторен белтък в присъствието на кандидатагента, в сравнение с нивото на Nogo белтък или активността на Nogo рецепторен белтък в отсъствието на кандидат агента. В едно изпълнение на изобретението, активността е придвижване на растежния конус. В едно изпълнение, агентът е подбран от група състояща се от Nogo белтъчен фрагмент, анти-Nogo антитяло и антиNogo рецепторно антитяло.

По-нататък изобретението включва метод за идентифиО циране на свързващ участник за Nogo рецепторен белтък, характеризиращ се с етапите за предоставяне на Nogo рецепторен белтък; контактуване на Nogo рецептора с кандидат свързващ участник; и откриване на свързване на кандидат свързващия участник с Nogo рецепторния белтък. В едно изпълнение, свързващият участник е подбран от група, състояща се от Nogo белтъчен фрагмент, едно анти-Nogo антитяло, един фрагмент на анти-Nogo рецепторно антитяло; и едно хуманизирано анти-Nogo рецепторно антитяло.

Изобретението включва метод за лечение нарушение в © централната нервна система у бозайник, характеризиращ се с това, че има етап на въвеждане на ефективно количество от агент, който модулира експресията на Nogo белтък или Nogo рецепторен белтък. В някои изпълнения на изобретението, експресията е понижена, докато в други изпълнения, тя е повишена.

По-нататък изобретението включва метод за лечение нарушение на централната нервна система у бозайник, характеризиращ се с това, че има етап на въвеждане на ефективно количество от агент, който модулира активността на Nogo белтък или Nogo рецепторен белтък. Активността може да бъде повишена или понижена. Ако активността е понижена, агентът може да бъде например полипептид, съдържащ аминокиселинна последователност на SEQ ID NO: 8, 10, 12, 18 или 20; един пълноразмерен Nogo рецепторен белтък; фрагмент от Nogo рецепторен белтък; един разтворим фрагмент от Nogo рецепторен белтък; или анти-Nogo рецепторно антитяло или негов активен фрагмент. Ако активността е повишена, агентът е полипептид, подбран от група състояща се от SEQ ID N0:14 и 16.

Един разтворим Nogo рецепторен белтък може да включва фрагмент от най-малко шест, например десет, петнадесет, двадесет, двадесет и пет, тридесет, четиридесет, петдесет, шестдесет или седемдесет аминокиселини на SEQ ID N0: 2 или 4; аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20; аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2, 4, 8,10,12,14, 16, 18 или 20, включваща най-малко една или например, пет, десет, петнадесет или двадесет консервативни аминокиселинни замени; аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2, 4, 8,10, 12, 14, 16, 18 или 20 включваща най-малко една, например пет, десет, петнадесет или двадесет естествено срещащи се аминокиселинни замени на последователността.

В някои изпълнения, нарушение на централната нервна система е резултат на черепна или мозъчна травма, увреждане на гръбначния мозък, инсулт или демиелинизиращо заболяване. Примери на демиелинизиращи заболявания са множествена склероза, монофазна демиелинизация, енцефапомиелит, мултифокална левкоенцефалопатия, паненцефалит, болест на Marchiafava-Bignami, понтинна миелинолиза, адренолевкодистрофия, болест на PelizaeusMerzbacher, спонгиозна дегенерация, болест на Alexander, болест на Canavan, метахроматична левкодистрофия и болест на Krabbe.

По-нататък изобретението включва изолиран пептид, който специфично се свързва с Nogo рецепторен белтък. Специфичното свързване на пептида с Nogo рецепторен белтък, предпочитано има най-малко един от следните ефекти: инхибиране свързането на Nogo белтък с Nogo рецепторен белтък, блокада на Nogo-медиирано инхибиране на аксоналния растеж, модулиране експресията на Nogo белтък, или модулиране експресията на Nogo рецепторен белтък. В някои изпълнения, изолираният пептид съдържа аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20, или една от гореспоменатите с една или повече, например пет, десет, петнадесет или двадесет последователни аминокиселинни замени © или естествено срещащи се аминокиселинни замени.

ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 - Сравнение на Νοοο домени (а) е схематична диаграма, която обобщава особености на Nogo белтъци, използувани в това проучване. (Ь) е фотография на NIH-3T3 фибробласти, култивирани върху повърхности с АминоNogo, GST-Nogo-66 или без белтък и оцветени за филаментозен актин (скала полоса 40μπη). (с) е фотография на пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий, култивиран върху повърхности покрити с © Амино-Nogo, GST-Nogo-66 или без белтък (субстрат-свързан) или с 100пМ Nogo белтък (разтворим) (скала полоса, 40pm). (d) е фотография на гел и на един имуноблот, където пречистен АминоNogo-Myc-His белтък е подложен на SDS-PAGE и е оцветен с Commassie Brilliant Blue (СВВ) или е направен имуноблот с анти-Мус антитела (Мус) (маркери за молекулни тегла от 200, 116, 97, 65 & 45 kDa са отляво), (е) е графика представяща експериментални данни, където процентът на ЗТЗ фибробласти с площ по-голяма от 1200 μπι²(разгъната) е измерен от експерименти като в (Ь) върху Nogo-покрити повърхности (черно) или с разтворим ЮОпМ Nogo препарати (синьо) (AM, Amino-Nogo; АМ+Мус, Amino-Nogo, преинкубирани с анти-Мус антитяло; AM+Myc+Mo, АМ+Мус, преинкубирани с анти-мишо IgG антитяло; Мус+Мо, анти-Мус антитяло плюс анти-мишо IgG антитяло), (f) е графика представяща експериментални данни, където процентът на разстлани COS-7 клетки е определен след култура върху Nogoпокрити повърхности или с разтворими 100пМ Nogo препарати, (д) е графика представяща експериментални данни, където ефектите на пречистени препарати от GST-Nogo-66 или Amino-Nogo върху морфологията на растежните конуси е определена при култури от Е12 дорзален коренчев ганглий в указаните концентрации след тридесет минути. Това показва, че GST-Nogo-66 е по-мощен два порядъка от величината на Amino-Nogo в този тест, (h) е графика представяща експериментални данни, където нарастването на неврита на клетка в култури от Е13 дорзален ганглий, е определено количествено от експерименти както в (с) върху Nogo-покрити повърхности или с разтворими 100пМ Nogo препарати, (i) е графика представяща експериментални данни, където са измерени ефектите на Nogo препарати върху нарастване на неврита в церебеларни неврони.

Фигура 2 - Nogo фрагменти антагонизират действието на Noqo и миелин на UHC (а) е фотография на експланти от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий, които са култивирани и е определен колапс на растежния конус, както е описано във Фигура 4. Културите са третирани със следните препарати за тридесет минути преди фиксиране и оцветяване с родамин-фалоидин (rhodamine-phalloidin): буфер само (контрола); 15пМ GST-Nogo (Nogo); 1μΜ от всеки Рер1, Рер2 и РерЗ (Рер); 15 пМ GST-Nogo плюс 1μΜ от всеки Рер1, Рер2 и РерЗ (Nogo+Pep). Отбележете, че колапс на растежния конус с Nogo е блокиран от добавката на пептид. Рер1, остатъци 1-25 на екстрацелуларния домен; Рер2, 11-35; и РерЗ, 21-45. (Ь) е графика, която количествено оценява резултатите от тестовете за колапс на растежния конус както в (а). Отделните пептиди са включени като 4μΜ, и пептид 1-3 сместа е 1 μΜ от всеки пептид. Получен е миелин от ЦНС както е описано и указаните общи концентрации на тоталния миелинов белтък са включени в културите. Всички резултати са средните + ср.станд.откл., изчислени от четири до седем определения. Тези стойности значимо различни от съответните стойности със същата концентрация на Nogo или миелин са показани, но без пептид (звездичка, р<0.05, Student’s двустранен t тест).

Фигура 3 - Noqo антагонист Рер2-41 (а) е графика показваща резултатите от тестове за колапс на растежен конус на Е12 дорзапен коренчев ганглий. Тези тестове са проведени и количествено оценени както при GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444. Тестовете са проведени без добавка (контрола), 156 пМ GST-Nogo (Nogo) или 15nm GST-Nogo плюс 1μΜ Рер2-41 (Nogo-Pep).Стойностите са средни + ср.станд.откл. изчислени от четири определения. (Ь) е графика представяща резултатите от свързващи експерименти, където свързването на ЮпМ AP-Nogo с пилешки неврони от Е12 дорзален коренчев ганглий е определено както е описано във Фигура 4, с добавката на указаните концентрации на Рер2-41.

Фигура 4 - Noqo Рер2-41 предотвратява Noqo & UHC миелин инхибиоане на невритното нарастване

Тази фигура е графика, която представя резултатите от тестове за нарастване, където неврони са култивирани в присъствието на указаните концентрации Рер2-41, пречистен GSTNogo (GST-Nogo-66) белтък и суров ЦНС миелинов протеин. Неврони от пилешки Е13 дорзален коренчев ганглий са култивирани при стандартни условия. За тестова за нарастване, неврони са култивирани в присъствието на указаните концентрации Рер-41, пречистен GST-Nogo (GST-Nogo-66) белтък и суров ЦНС миелинов протеин. Това показва, че Рер-41 може да снеме инхибирането на невритното нарастване с GST-Nogo или тотален ЦНС миелин.

Фигура 5 - Лиганд свързващ тест за аксонални Noqo рецептори (а) е фотография на гел и имуноблот, където His-AP-Nogo (66 аминокиселина) белтък е експресиран в НЕК293Т клетки и пречистен от кондицонираната среда върху никел-съдържаща смола чрез His tag. Пречистен блтък е подлаган на SDS-PAGE и е оцветяван за общ белтък с СВВ или е правен имуноблот с анти-Nogo- антитела (антиNogo). От лявата страна са показани маркери за молекулни тегла 200, 116, 97, 65 и 45 kDa и от дясната страна е показана миграцията на AP-Nogo. (b) е фотография на дисоциирани неврони от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий, които са инкубирани с ЮпМ AP-Nogo или 10 пМ AP-Nogo + 160 пМ GST-Nogo за 60 минути на 23°С. Клетките са измити, фиксирани и инкубирани на 60°С, за инактивиране на ендогенния АР. Свързаният AP-Nogo е откриван чрез инкубация с нитротетразолово синьо (NBT). Забележете интензивното невронално оцветяване с AP-Nogo , което е изместено от небелязания лиганд. (с) е графика, представяща експериментални данни, при които е определяна потентността на AP-Nogo и GST-Nogo в тестове с колапс на растежен конус от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий, както е описано в Примерния раздел. Определено е, че ЕС50 на AP-Nogo е 1пМ или по-малка. Илюстрирани са средните стойности + средното стандартно отклонение, изчислени от пет до осем определения, (d) е графика представяща експериментални данни, при които свързването на 10 пМ AP-Nogo с неврони от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий е определяно самостоятелно или в присъствието на 100 пМ GST-Nogo, или в присъствието на 4μΜ Рер2, което е определено от експерименти както в (Ь) с метода описан в Експерименталния раздел. Представени са средните стойности + средното стандартно отклонение от осем определения, (е) е графика представяща експериментални данни, при които AP-Nogo свързване с неврони от дорзален коренчев ганглий е определяно като функция от концентрацията на AP-Nogo. О Това е един от шест експеримента със сходни резултати, (f) е графика обобщаваща данните от (е) преразпределени за Scatchard анализ. Видимото Кц за AP-Nogo свързване с неврони от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий е 3 пМ.

Фигура 6 - Nogo свързване с COS-7 експресираши Nogo рецептора

Тази фигура е фотография на COS-7 клетки, които са трансфекгирани с експресионен вектор, кодиращ миши Nogo рецептор. Два дни след трансфекцията е определяно свързване на ф AP-Nogo или АР, както е описано в Примерния раздел за неврони от дорзален коренчев ганглий. Отбележете селективното свързване на Nogo с Nogo рецептор експресиращи клетки. Свързването е силно намалено в присъствието на излишък от Nogo пептид, който не е слет сАР.

Фигура 7 - Структура на Noqo рецептора

Тази схематична диаграма илюстрира структурните особености на Nogo рецептора.

Фигура 8 - Разпространение на Noqo рецепторна мРНК.

Тази фигура е фотография на Northern blot на Nogo рецепторна мРНК за полиА-РНК проби, от указаните миши тъкани от лявата страна и за проби от тотална РНК от различни зони на мозъка на плъх в дясната страна. Отляво е показана миграцията на различни размери РНК маркери.

Фигура 9 - Имунохистология на Nooo-66 рецептор (а) е фотография на имуноблот, при който са анализирани © мембранни фракции (Юцд белтък) _от указаните клетки или пилешки тъкани с анти-Иодо-бб рецепторен имуноблот (в дясно са маркери за молекулни тегла в kDa). (b) е фотография на COS-7 клетки, експресиращи Myc-Nogo-бб рецептор или експланти от пилешки Е5 гръбначен мозък (осем дни in vitro), оцветени с анти-Иодо-бб рецептор, анти-Мус или олигодендроцит-специфично 04 антитяло. Долните три блока показват двойно белязана имунохистохимия на същото поле ( скала блокче, 40 цт за горните три блока и 80 μπι за долните три блока), (с) е фотография на фиксирани с параформалдехид срези с вибратом, на препарат от зрял мозък или © гръбначен мозък, оцветен с анти-Иодо-бб рецептор. Това демонстрира оцветяване на аксонални профили (стрелкички) в моста и гръбначния мозък. Оцветяването е драматично намалено в присъствието на 10 pg/ml GST-Nogo-бб рецепторен антиген.

Фигура 10 - Noqo-66 рецептор медиира колапс на растежния конус с Nogo-66 (а) е фотография на пилешки Е12 DRG (дорзален ганглий) експланти, изложени на Nogo-66 след пре-третиране с PI-PLC или буфер. Илюстрирано е оцветяване на F-актин в аксони (скала блокче, 40 μπι). (b) е графика обобщаваща експерименталните резултати от свързване на 3 пМ АР или AP-Nogo с дисоциирани неврони от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий. Където е указано, културите са пре-третирани с PI-PLC или 150 пМ GST-Nogo-66 е включен в инкубацията с AP-Nogo. (с) е графика обобщаваща измервания на колапс на растежния конус от експерименти както в (а). Култури от Е12 DRG са третирани със или без PI-PLC, преди излагане на 30 пМ GST-Nogo-66 или 100 рМ Sema3A. (d) е фотогафия на клетъчни експланти от Е7 ретинален ганглий, инфектирани с контролен вирус (HSV-PlexinA1) или с HSV-Myc-Nogo-66 рецептор и след това са © инкубирани със или без Nogo-66. Илюстрирано е оцветяване с фалоидин на аксоналните растежни конуси (скала блокче, 25 цт). (е) е графика определяща количествено колапса на растежния конус в неинфектирани, или инфектирани с вирус Е7 ретинални неврони както в (d).

Фигура 11 - Структура-функция анализ на Nogo-66 рецептор (а) е схематична диаграма на различни Nogo-66 рецепторни делетирани мутанти. Тези мутанти са тестирани за ниво на експресия чрез имуноблот и за AP-Nogo свързване. Отбележете, че левцин © богатите повтори и богатият на левцин повтор карбокси край е необходим за Nogo свързване, но остатъкът от белтъка не е. Вторият белтък е тестиран след пречистване и имобилизиране. (Ь) е диаграма на предсказаната три-димензионална структура за първите седем богати на левцин повтори на Nogo-66 рецептора. Това произтича от компютерно моделиране въз основа на предсказаната структура на сродните богати на левцин повтори на леутропиновия рецептор (Jiang et al., (1995) Structure 3, 1341-1353). Моделирането е направено с Swiss-Model при . Указани са също областите с бета лента и алфа спираловидна вторична структура.

Фигура 12 - Разтворим Noqo рецептор блокира Nogo-66

Пилешки Е13 DRG неврони, култивирани при стандартни условия. В тестове за колапс на растежни конуси, е добавяна кондиционирана среда от НЕК 293Т клетки секретиращи 1-348 аминокиселинен ектодомен фрагмент на мишия Nogo рецептор или контролна кондиционирана среда заедно със 100 пМ Nogo-66. В долната част на левия блок, данните в графата демонстрират, че Nogo-индуциран колапс е блокиран от разтворим рецепторен фрагмент. За тестове с нарастване, неврони са култивирани в © присъствието на контролен или Nogo рецепторен ектодомен кондиционирана среда заедно с Nogo-66 белтък (50 пМ) или миелин от централната нервна система (15 pg тотален белтък/ ml). Горните четири блока показват фотографии демонстриращи, че миелин от централната нервна система инхибира нарастването и че то е блокирано от наличието на Nogo рецепторен ектодомен белтък. Нарастването е определено количествено на графиката при долния десен блок.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО © I. Дефиниции

Ако друго не е указано, всички технически и научни термини използувани тук имат същото значение както обичайно се разбира от специалиста в тази област, към която принадлежи изобретението. Въпреки че всякакви методи и материали, сходни или еквивалентни на описаните тук, могат да бъдат използувани в практиката или тестирането на настоящото изобретение, предпочитаните методи и материали са описани.

Както тук е използуван, терминът “аксон” се използува за дълго клетъчно източване от неврона, където еферентни (излизащи) акционни потенциали се провеждат от клетъчното тяло към прицелни клетки.

Както тук се използува, терминът “аксонален растеж” се отнася до удължаване на дългия израстък или аксон, произлизащ от клетъчното тяло и предшествуван от растежния конус.

Както тук е използуван, терминът “нарушение на централната нервна система” се отнася до всяко патологично състояние, свързано с абнормна функция на централната нервна система (ЦНС). Терминът включва, но не се ограничава до променена функция на ЦНС, в резултат на физична травма на мозъчната тъкан, вирусна инфекция, автоимунен механизъм, генетична мутация и невродегенеративни заболявания или нарушения.

Както тук е използван, терминът “химерен белтък” се отнася за всеки полипептид, който не е напълно хомоложен на аминокиселинно ниво, за неговата див-тип последователност или е кодиран от нуклеинова киселина, която произхожда от снаждане на два отделни източника на нуклеинови киселини. Терминът включва, но не се ограничава до фузия на белтъци и белтъци планирани да съдържат една или повече аминокиселиинни замени, които отличават тяхната аминокиселинна последователност от последователността на дивия тип.

Както тук е използуван терминът “демиелинизиращо заболяване” се отнася за патологично нарушение, характеризиращо се с деградация на миелиновата обвивка на олигодендроцитната клетъчна мембрана.

Както тук е използуван терминът “растежен конус” се отнася до специализирана област на края на растящия неврит, която е отговорна за усещане на заобикалящата среда и придвижване на аксона към съответна синаптична прицелна клетка.

Както тук е използуван терминът “движение на растежния конус” се отнася за източване или колапс на растежния конус към прицелна клетка на неврона.

Както тук е използуван терминът “неврит” се отнася за израстък, растящ извън неврона. Тъй като понякога е трудно да се разграничи един дендрит от аксон в култура, терминът неврит се използува и за двете.

Както тук е използуван терминът “олигодендроцит” се отнася за невроглиялна клетка на централната нервна система, чиято © функция е до миелинизира аксоните на централната нервна система.

Както тук е използуван, терминът “полипептид” се отнася за пептид, който при хидролиза освобождава повече от две аминокиселини, наречени трипептиди, тетрапептиди и т.н. съответно на броя на аминокиселините съдържащи се в полипептида. Терминът “ полипептид” се използува синонимно с термина “белтък” и “пептид” навсякъде в спецификацията.

II. Специфични изпълнения

A. Noqo рецепторен белтък и пептидни агенти за Noqo 0 рецепторния белтък

Настоящето изобретение предоставя изолиран белтък, алелни варианти на белтъка и консервативни аминокиселинни замени на белтъка. Както тук е използуван, белтъкът или полипептидът се отнася за Nogo рецепторен белтък, който има човешка аминокиселинна последователност представена в SEQ ID NO: 2 или мишата аминокиселинна последователност, представена в SEQ ID NO: 4. Белтъкът или полипептидът се отнася също за пептидите идентифицирани като Nogo рецепторни пептидни агенти, които имат аминокиселинните последователности изобразени в SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20. Изобретението включва също природно срещащи се алелни варианти и белтъци, които има слабо различаваща се аминокиселинна последователност в сравнение със специфично представените по-горе. Алелни варианти, въпреки че притежават слабо различаваща се аминокиселинна последователност, от представената по-горе, ще имат същите или сходни биологични функции, свързани с човешкия и мишия Nogo рецепторни белтъци и Nogo рецепторните пептидни агенти представени в SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20.

Както ту е използувано, семейството белтъци свързани с Nogo рецепторните белтъци, се отнася за белтъци, които са изолирани от организми в допълнение на човешки и миши. По-долу са описани методите използувани за идентифициране и изолиране на други членове на семейството белтъци, свързани с Nogo рецепторните белтъци.

Nogo рецепторните белтъци и пептидни агенти на настоящето изобретение, предпочитано са в изолирана форма. Както тук е използуван, белтък или лиганд се казва, че е изолиран, когато са използувани физични, механични или химични методи, за отстраняване на белтъка от клетъчните съставки, които нормално са свързани с белтъка. Специалистът в тази област може направо да използува стандартни методи за пречистване за получаване на изолиран белтък или лиганд.

Белтъците на настоящето изобретение включват освен това консервативни варианти на описаните тук белтъци и лиганди. Както тук е използувано, консервативен вариант се отнася за промени в аминокиселинната последователност, които не повлияват неблагоприятно биологичните функции на белтъка. Една замяна, инсерция или делеция се казва, че повлиява неблагоприятно белтъка, когато променената последователност предотвратява или нарушава биологичната функция свързана с белтъка. Например, общият заряд, структура или хидрофобни-хидрофилни свойства на белтъка могат да бъдат променени без неблагоприятно да се повлиява дадена биологична активност. Съответно, аминокиселинната последователност може да бъде променена, например да превърне пептида похидрофобен или хидрофилен, без неблагоприятно повлияване биологичните активности на белтъка.

Обикновено, алелните варианти, вариантите с консервативни замени и членовете на белтъчното семейство, ще имат аминокиселинна последователност, съдържаща най-малко © седемдесет и пет процента идентичност на амонокиселинната последователност с човешки и миши последователности, представени в SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20, попредпочитано най-малко осемдесет процента, още по-предпочитано деветдесет процента и най-предпочитано поне деветдесет и пет процента. Идентичност или хомоложност по отношение на такива последователности е определена тук като процент на аминокиселинни остатъци в последователността кандидат, които са идентични с известните пептиди, след подреждане последователностите и въвеждането на празнини, ако е необходимо, за постигане ф максимален процент хомоложност и без да се разглеждат всякакви консервативни замени като част от идентичността на последователността. N-крайни, С-крайни или вътрешни удължавания, делеции или инсерции в пептидната последователност, няма да бъдат разглеждани като повлияващи хомологията.

Така, белтъците и пептидите на настоящето изобретение включват молекули, съдържащи аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20; нейни фрагменти притежаващи една последваща последователност от най-малко около 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или повече аминокиселинни остатъци на Nogo рецепторни белтъци и пептидни агенти; варианти на аминокиселинна последователност на такива последователности, където най-малко един аминокиселинен остатък е свързан чрез инсерция N- или С-крайно или в рамките на представената последователност: варианти на аминокиселинната последователност на представените последователности, или техни фрагменти, както е определено по-горе, които са заменени с друг остатък. Планирани варианти по-нататък включват такива съдържащи предварително определени мутации чрез, например хомоложна рекомбинация, място-насочена или PCR мутагенеза и съответните белтъци на други © животински видове, включително, но без да се ограничават до заешки, плъши, свински, говежди, овчи, конски и не-човешки приматни видове, апелите или други природно срещащи се варианти на семейството белтъци; и производни, където белтъкът е ковалентно модифициран чрез замяна, химични, ензимни или други подходящи начини с една част, различна от естествено срещащата се аминокиселина (например, откриваема част като ензим или радиоизотоп).

Както е описано по-долу, могат да бъдат използувани членове от семейството белтъци: (1) за идентифициране агенти, ф които модулират най-малко една активност на белтъка, (2) при методи за идентифициране свързващи участници за белтъка, (3) като антиген за предизвикване на поликлонални или моноклонапни антитела и (4) като терапевтичен агент.

В. Молекули нуклеинови киселини

По-нататък настоящето изобретение предоставя молекули нуклеинови киселини, които кодират белтъци и пептиди, съдържащи аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, 4, 8,10, 12, 14, 16, 18 и 20 и сродните белтъци описани тук, предпочитано в изолирана форма. Както тук е използувано “нуклеинова киселина” включва геномна ДНК, кДНК, мРНК и антисенз молекули, както и нуклеинови киселини базирани на алтернативни основни вериги или включвайки алтернативни бази производни от природни източници или синтезирани.

Хомология или идентичност е определена с BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) анализ, като е използуван алгоритъм употребяван от програмите blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Karlin et al., (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 2264-2268 и Altschul, (1993) J.MoI.Evol. 36, 290-300 включени изцяло чрез цитат), които са © оформени за търсене сходство на последователността. Подходът използуван от BLAST програмата е първо да разгледа сходните сегменти между въпросна последователност и една база данни последователност, след това да се оцени статистическата значимост на всички съвпадения, които са идентифицирани и накрая да се обобщат само онези съвпадения, които удовлетворяват един предварително подбран праг на значимост. За обсъждане на основни издания в търсене на сходство на база данни за последователност, виж Altschul et al., (1994) Nature Genetics 6, 119-129 , която изцяло е включена чрез цитат. Търсещите параметри за хистограма, описания, © подреждане, очакване ( т.е. прага на статистическа значимост за съобщените съвпадения спрямо база данни последователности), cutoff, matrix и filter са при отсъствуващите условия. Отсъствуващият оценяващ матрикс използуван от blastp, blastx, tblastn и tblastx е BLOSUM62 матрикс (Henikoff et al., (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 10915-10919, изцяло включена чрез цитат). Четири blastn параметри са нагласени както следва: Q=10( gap creation penalty); R=10 (gap extension penalty); wink = 1 (много бързо, за нула време, мигане)(генерира word hits на всяка wink^th позиция по дължината на въпросителната); и gapw = 16 (да се постави ширината на прозорчето в рамките, на която се генерира поредица на последователността).

Еквивалентните условия на Blastp параметър бяха Q=9; R=2; wink = 1; и gapw = 32. Bestfit сравнение между последователности, които са на разположение в GCG package version 10.0, използува ДНК параметри GAP=50 (gap creation penalty) и LEN=3 (gap extension penalty) и еквивалентните условия при сравнения на белтъци са j GAP=8 и LEN=2.

Както тук е използувано “условия на висока строгост”

I означава хибридизация при 42°С в присъствието на 50% формамид, последвана от първо измиване на 65°С с 2 х SSC съдържащ 1% © натриев SDS, последвано от второ измиване при 65°С с 0.1 х SSC.

Както тук е използувано, молекула нуклеинова киселина се j казва, че е “изолирана“ когато молекулата нуклеинова киселина е

J съществено отделена от примес на нуклеинова киселина кодираща

I ! други полипептиди от източника на нуклеинова киселина.

По-нататък настоящото изобретение предоставя фрагменти от молекулата на кодиращата нуклеинова киселина. Както тук е

I използувано, фрагмент на молекула кодираща нуклеинова киселина се отнася за част от цялата белтък кодираща последователност. Размерът на фрагмента ще се определя от предвиденото Q приложение. Например, ако фрагментът е подбран така, че да кодира активна част от белтъка, фрагментът ще е необходимо да бъде достатъчно голям да кодира функционалната област(и) на белтъка. Ако фрагментът ще бъде използуван като сонда нуклеинова киселина или PCR праймер (зародиш), тогава дължината на фрагмента се I подбира така, че да се получат сравнително малък брой погрешни ί

удължавания при зараждане/индуциране на синтезата (probing/ priming).

i

Фрагменти от молекули на кодиращата нуклеинова киселина на настоящото изобретение (т.е. синтетични олигонуклеотиди), които са използувани като сонди или специфични праймери за полимеразна верижна реакция (PCR), или да синтезират генни последователности, кодиращи белтъци на изобретението, могат лесно да бъдат синтезирани с химични техники, например, фосфотриестерния метод на Matteucci et al., (1981) J.Am.Chem.Soc. 103, 3185-3191 или като се използуват автоматизирани синтетични методи. В допълнение, поголеми ДНК сегменти могат да бъдат получени с добре известни методи, като синтеза на група олигонуклеотиди, които определят различни модулни сегменти на гена, последвана от лигиране на олигонуклеотиди за изграждане на завършения модифициран ген.

© Кодиращите молекули нуклеинова киселина на настоящото изобретение могат по-нататък да бъдат модифицирани, така че да съдържат откриваем маркер за диагностични цели или като сонди. Разнообразие от такива маркери са известни на специалиста в тази област и могат да бъдат използувани с описаните тук кодиращи молекули. Подходящи маркери включват, но не се ограничават, до биотин, радиоактивно белязани нуклеотиди и подобни. Специалистът в тази област може да използува всеки от известните маркери, за да получи белязана кодираща молекула нуклеинова киселина.

Модификации на самата първична структура чрез делеция, © добавяне или промяна на включените аминокиселини в белтъчната последователност при транслация, могат да бъдат направени без да се нарушава активността на белтъка. Такива замени или промени имат за резултат белтъци, притежаващи аминокиселинна последователност, кодирана от нуклеинова киселина, попадаща в рамките на планирания обхват на настоящото изобретение.

С. Изолиране на други сродни молекули нуклеинова киселина

Както е описано по-горе, идентифицирането на молекула човешка нуклеинова киселина, притежаваща SEQ ID N0: 1, 3, 7, 9, 11,

13, 15, 17 и 19, позволява на специалиста да изолира молекули нуклеинова киселина, които кодират други членове на семейството на Nogo рецепторния белтък, в допълнение на описаните тук последователности. По-нататък, представените понастоящем молекули нуклеинова киселина позволяват на специалиста да изолира молекули нуклеинова киселина, които кодират други членове на семейството на Nogo рецепторните белтъци и пептидни агенти.

По същество, специалистът може да използува аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 или техни епитоп-съдържащи фрагменти, за създаване на антитяло сонди за скриниране експресионни библиотеки, получени от подходящи клетки. Обикновено, поликлонален антисерум от бозайници като зайци, имунизирани с пречистения белтък (както е описано по-долу) или моноклонални антитела, могат да бъдат използувани за синтеза кДНК от бозайници или геномна експресионна библиотека, като lambda gtll библиотека, за получаване на подходяща кодираща последователност за други членове на белтъчното семейство. Кпонираната кДНК последователност може да бъде експресирана като слет белтък, експресирана директно, като се С използува нейните собствени контролни последователности или експресирана чрез конструкции използуващи контролни последователности, подходящи за дадения гостоприемник, използуван за експресия на ензима.

Алтернативно, част от кодиращата последователност описана тук, може да бъде синтезирана и използувана като сонда за поправка на ДНК кодираща един член на белтъчното семейство от всякакъв организъм на бозайник. Олигомери, съдържащи например, приблизително 18-20 нуклеотиди (кодиращи едно около шест до седем аминокиселинно удължаване), могат да бъдат получени и използувани да скринират геномна ДНК или кДНК библиотеки, за получаване хибридизация при строги условия или условия на достатъчна строгост за елиминиране на неподходящо ниво на погрешни позитиви.

Допълнително, могат да бъдат получени чифтове на олигонуклеотидни праймери, за употреба в полимеразна верижна реакция (PCR), селективно да клонират кодираща молекула нуклеинова киселина. Един PCR денатуриращ/свързващ/удължаващ цикъл за използуване на такива PCR праймери е добре известен на специалиста в тази област и може да бъде адаптиран за приложение при изолиране на други кодиращи молекули нуклеинова киселина.

D. Рекомбинантни ДНК молекули, съдържащи една молекула нуклеинова киселина

Настоящето изобретение по-нататък предоставя рекомбинантни ДНК молекули (рДНК), които съдържат една кодираща последователност. Както тук е използувано, рДНК молекула е ДНК молекула, която е била подложена на молекулярна манипулация. Методи за генериране на рДНК молекули са добре известни в тази област, например виж Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. В предпочитаните рДНК молекули, една кодираща ДНК последователност е оперативно свързана с контролни последователности на експресията и векторни последователности.

Изборът на вектор и контролни последователности на експресията, за които една от белтъчното семейство кодиращи последователности на настоящото изобретение, е оперативно свързана, зависи пряко, както е добре известно в тази област, от желаните функционални свойства (например, белтъчна експресия и клетката гостоприемник, която да бъде трансформирана). Един вектор на настоящото изобретение може да бъде най-малко способен да насочва репликацията или инсерцията в хромозомата гостоприемник и предпочитано също експресия на структурния ген, включен в рДНК молекулата.

Контролни елементи на експресията, които са използувани за регулиране експресията на оперативно свързана белтък кодираща последователност, са известни в тази област и включват, без да се ограничават до индуцируеми промотори, конститутивни промотори, секреционни сигнали и други регулаторни елементи. Предпочитно, индуцируемият промотор е пряко контролиран, като такъв, който е отговарящ спрямо хранителна съставка в средата на клетката гостоприемник.

В едно изпълнение, векторът съдържащ молекула кодираща нуклеинова киселина, ще включва прокариотен репликон, т.е. една ДНК последователност, притежаваща способността да насочва автономна репликация и подръжка на рекомбинантната ДНК молекула, екстрахромозомна в прокариотна клетка гостоприемник, като бактериална клетка гостоприемник, трансформирана след това. Такива репликони са добре известни в тази област. В допълнение, вектори, които включват прокариотен репликон, могат също да включват един ген, чиято експресия придава откриваем маркер, като такъв за лекарствена резистентност. Типични бактериални гени за лекарствена резистентност, са такива, които придават резистентност спрямо ампицилин или тетрациклин.

Вектори, които включват прокариотен репликон, могат понататък да включват един прокариотен или бактериофаген промотор, способен да насочва експресията (транскрипция или транслация) на кодиращите генни последователности в бактериална клетка гостоприемник, като E.coli. Един промотор е експресионен контролен елемент, образуван от една ДНК последователност, която позволява да се появи свързване на РНК полимераза и транскрипция.

Промоторни последователности съвместими с бактериални гостоприемници, обикновено се осигуряват в плазмидни вектори, съдържащи удобни рестрикционни места за инсерция (вмъкване) на ДНК сегмент от настоящето изобретение. Примери за такива векторни плазмиди са pUC8, pUC9, pBR322 и pBR329 (Biorad Laboratories), pPL и pKK223 (Pharmacia). Може да бъде използуван всеки подходящ прокариотен гостоприемник да експресира една рекомбинантна ДНК молекула, кодираща белтък на изобретението.

Експресионни вектори съвместими с еукариотни клетки, предпочитано такива съвместими с клетки от гръбначни, може също да бъдат използувани за формиране на рДНК молекули, които съдържат една кодираща последователност. Експресионни вектори на еукариотни клетки са добре известни в тази област и се предоставят от няколко търговски източници. Обикновено, такива вектори са предоставени, съдържащи удобни рестрикционни места за инсерция на желания ДНК сегмент. Примери за такива вектори са pSVL и pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC 31255) и подобните еукариотни експресионни вектори.

Еукариотни клетъчни експресионни вектори, използувани за конструиране на рДНК молекули на настоящето изобретение, могат по-нататък да включват селекционен маркер, който е ефективен в еукариотна клетка, предпочитано селекционен маркер за лекарствена резистентност. Един предпочитан маркер за лекарствена резистентност е генът, чиято експресия води до резистентност към неомицин, т.е. неомицин фосфотрансферазния (пео) ген. (Southern et al., (1982) J.Mol.Anal.Genet. 1, 327-341). Алтернативно, селекгируемият маркер може да присъствува върху отделен плазмид, двата вектора въведени чрез ко-трансфекция в клетката гостоприемник и

НММЙМШ трансфектанти, подбрани чрез култивиране в подходящо лекарство за селектируем маркер.

Е. Клетки гостоприемници, съдържащи екзогенно доставена молекула кодираща нуклеинова киселина

Настоящето изобретение по-нататък предоставя клетки гостоприемници, трансформирани с молекула нуклеинова киселина, която кодира белтък на настоящето изобретение. Клетката гостоприемник може да бъде прокариотна или еукариотна. © Еукариотни клетки, приложими за експресия на белтък на настоящето изобретение не са ограничени, доколкото клетъчната линия е съвместима с методите на клетъчно култивиране и съвместима с развъждането на експресионния вектор и експресията на генния продукт. Предпочитани еукариотни клетки гостоприемници включват, но не се ограничават до, дрожди, насекоми и клетки от бозайници, предпочитано клетки от гръбначни, като такива от мишка, плъх, маймуна или човешка клетъчна линия. Примери за полезни еукариотни клетки гостоприемници включват Chinese hamster ovary (СНО) клетки, които се доставят от АТСС като CCL61, NIH Swiss Q mouse embryo cells NIH-3T3 (ембрионални клетки от швейцарска мишка NIH-3T3), достъпни от АТСС като CRL1658, бъбречни клетки от бебе хамстер (ВНК) и подобни еукариотни тъканни култури от клетъчни линии.

Трансформация на подходяща клетки гостоприемници с рДНК молекула на настоящето изобретение, е извършена с добре известни методи, които обикновено зависят от вида на използувания вектор и използуваната система гостоприемник. По отношение на трансформация на прокариотни клетки гостоприемници, могат да бъдат използувани елекгропорация и методи за солево третиране (виж, например, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cohen et al., (1972) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69, 2110-2114). По отношение трансформация на клетки от гръбначни с вектори съдържащи рДНК, могат да бъдат използувани елекгропорация, методи за катйонно липидно или солево третиране (виж, например Graham et al., (1973) Virology 52, 456-467; Wigler et al., (1979) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76, 1373-1376).

Успешно трансформирани клетки, т.е. клетки, които съдържат рДНК молекули на настоящето изобретение, могат да © бъдат идентифицирани с добре известни техники, включващи селекция на селектируем маркер. Например, клетки получени от въвеждане на една рДНК на настоящето изобретение могат да бъдат кпонирани за произвеждане на единични колонии. Клетки от такива колонии могат да бъдат събрани, лизирани и тяхното ДНК съдържание да бъде изследвано за наличие на рДНК, като се използува метод, като такъв описан от Southern, (1975) J.Mol.Biol. 98, 503-517 или белтъците, получени от клетката тестирани с имунологичен метод.

ф F. Получаване на рекомбинантни белтъци като се използува рДНК молекула

Настоящето изобретение по-нататък предоставя методи за произвеждане белтък на настоящето изобретение, като се използват молекули нуклеинова киселина, описани тук. Общо, получаването на рекомбинантна форма на белтък, обикновено включва следните етапи:

Първо, получава се молекула нуклеинова киселина, която кодира белтък на изобретението, като молекулата нуклеинова киселина представена в SEQ ID N0: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 или 19 или нуклеотиди 166-1584 на SEQ ID N0: 1 и нуклеотиди 178-1596 на

SEQ ID NO: 3. Ако кодиращата последователност е прекъсната от интрони, тя директно е подходяща за експресия в гостоприемника.

Молекулата нуклеинова киселина след това предпочитано е поставена в оперативна връзка с подходящи контролни последователности, както е описано по-горе, за формиране на експресионна единица, съдържаща белтъчната отворена рамка за четене. Експресионната единица е използувана да трансформира подходящ гостоприемник и трансформираният гостоприемник е култивиран в условия, които позволяват продукцията на © рекомбинантния белтък. По избор, рекомбинантният белтък е изолиран от средата или от клетките; в някои случаи може да не е необходимо отделяне и пречистване на белтъка, където онечистванията могат да бъдат допустими.

Всеки от горните етапи може да бъде изпълнен по различни пътища. Например, желаните кодиращи последователности могат да бъдат получени от геномни фрагменти и направо да бъдат използувани в подходящи гостоприемници. Конструирането на експресионни вектори, които са опериращи в различни гостоприемници, е извършвано като са използувани подходящи © репликони и контролни последователности, както са представени погоре. Контролните последователности, експресионни вектори и методи за трансформация са зависими от типа на клетката гостоприемник, използувана да експресира гена и са обсъдени подробно по-рано. Подходящи рестрикционни места могат, ако нормално не са налице, да бъдат добавени към краищата на кодиращата последователност, така че да осигурят един ген, които може да бъде изрязан, да бъде вмъкнат в тези вектори. Специалистът в тази област може направо да адаптира всяка гостоприменик/експресионна система в тази област, за приложение с молекули нуклеинова киселина на изобретението, за произвеждане на рекомбинантен белтък.

С. Методи за идентифициране на свързващи участници

Настоящето изобретение предоставя методи за приложение при изолиране и идентифициране на свързващи участници на белтъци на изобретението. В някои изпълнения, белтък на изобретението се смесва с потенциален свързващ участник или екстракт, или фракция от клетка, в условия, които позволяват ©· свързване на потенциални свързващи участници с белтъка на изобретението. След смесване, пептиди, полипептиди, белтъци и други молекули, които са станали асоциирани с белтък на изобретението, са отделени от сместа. Свързващият участник, свързан с белтък на изобретението след това може да бъде отделен и по-нататък анализиран. За идентифициране на изолирания свързващ се белтък, целият белтък, например целият Nogo рецепторен белтък на SEQ ID NO: 2 или 4 или целият Nogo белтък на SEQ ID N0:6 може да бъде използуван. По избор може да бъде използуван фрагмент от белтъка. Един пример за приложим Nogo © рецепторен белтъчен фрагмент е разтворим Nogo рецепторен полипептид, който няма трансмембранен домен (Фигура 7).

Както тук е използувано, клетъчен екстракт се отнася за препарат или фракция, които са получени от лизирана или разрушена клетка. Предпочитан източник на клетъчни екстракти ще бъдат клетки, произхождащи от човешки мозък или гръбначен мозък, например човешка мозъчна тъкан. По избор, клетъчни екстракти могат да бъдат изготвени от всеки източник на нервна тъкан или неврални клетъчни линии, които са на разположение, по специално клетъчни линии от олигодендроцити.

Могат да бъдат използувани различни методи за получаване на екстракт от клетка. Клетки могат да бъдат разрушени с помощта на физични или химични методи за разрушаване. Примери за физични методи за разрушаване включват, но не се ограничават до, ултразвуково третиране и механично срязване. Примери за химичен лизис методи включват, но не се ограничават до детергентно лизиране и ензимен лизис. Специалистът в тази област може направо да адаптира методи за получаване на клетъчни екстракти, за да получи екстракти за приложение при наличните методи.

© След като екстрактът е получен, екстрактът се смесва с белтък на изобретението в условия, при които може да се осъществи асоцииране на белтъка със свързващия участник. Могат да бъдат използувани различни условия, най-предпочитани условия са тези, които плътно наподобяват условията в цитоплазмата на човешка клетка. Използувани особености като осмоларитет, pH, температура и концентрация на клетъчния екстракт, могат да варират за да се оптимизира свързването на белтъка със свързващия участник.

След смесване при подходящи условия, свързаният комплекс е отделян от сместа. Могат да бъдат използувани различни © техники за разделяне на сместа. Например, антитела специфични за белтъка на изобретението могат да бъдат използувани да имунопреципитират комплекса на свързващия участник. По избор, могат да бъдат използувани стандартни техники за разделяне, като хроматография и центрофугиране в плътностен градиент.

След отстраняване на не-свързаните клетъчни съставки, които се откриват в екстракта, свързващият участник може да бъде дисоцииран от комплекса, използувайки конвенционални методи. Например, дисоциация може да бъде извършена с променяне на солевата концентрация или pH на сместа.

За да се подпомогне отделянето на асоциираните чифтове свързващи участници от смесения екстракт, белтъкът на изобретението може да бъде имобилизиран върху твърда подложка. Например, белтъкът може да бъде прикачен към нитроцелулозен матрикс или акрилови зърна. Прикачването на белтъка към твърда подложка допринася при отделяне на чифтове пептид-свързващи участници от други съставки, които се намират в екстракта. Идентифицираните свързващи участници могат да бъдат единичен белтък или комплекс от два или повече белтъци. По избор, © свързващи участници могат да бъдат идентифицирани като се използува тест за фузия на алкална фосфатаза, съгласно процедурите на Flanagan & Vanderhaeghen, (1998) Annu.Rev.Neurosci. 21, 309-345 или Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69; тестът на FarWestern съгласно процедурите на Takayama et al., (1997) Methods Mol.Biol. 69, 171-184 или Dauder et al. J.Gen.Virol.(1996) 77, 991-996 или са идентифицирани c употребата на епитоп tagged белтъци или GST слети белтъци.

По избор, молекулите нуклеинова киселина на изобретението, могат да бъдат използувани при дрождена дву© хибридна система. Дрождената дву-хибридна система може да бъде използувана за идентифициране на други двойки участници, може да бъде пряко адаптирана за използуване молекулите нуклеинови киселини, описани тук (виж Stratagene Hybrizap® дву-хибридна система).

Н. Методи за идентифициране агенти, които модулират експресия

Настоящето изобретение предоставя методи за идентифициране агенти, които модулират експресията на нуклеинова киселина, кодираща Nogo рецепторен белтък. Настоящето изобретение предоставя също методи за идентифициране агенти, които модулират експресията на нуклеинова киселина кодираща Nogo белтъка. Такива тестове могат да използуват всякакви средства, които са на разположение за мониториране прояви в нивото на експресията на нуклеинова киселина на изобретението, например нуклеинова киселина кодираща белтък, притежаващ последователността на SEQ ID NO: 2, 4 или 6, ако тя е способна да регулира положително или отрицателно експресията на нуклеиновата киселина в дадена клетка.

© Във формата на един тест, могат да бъдат получени клетъчни линии, които съдържат сливания на репортерни гени между отворената рамка за четене, определена от нуклеотиди 166-1584 на SEQ ID NO: 1, или нуклеотиди 178-1596 на SEQ ID N0; 3, или нуклеотиди 135-3713 на SEQ ID N0: и може да бъде изготвен всякакъв слет участник, който може да бъде тестиран. Известни са многобройни слети участници, които могат да бъдат тестирани и те са пряко достъпни, включително луциферазен ген от светулки и генът, кодиращ хлорамфеникол ацетилтрансфераза (Alam etal., (1990) Anal.Biochem. 188, 245-254). Клетъчни линии съдържащи сливания на © репортерен ген, след това са излагани на агента, който ще бъде тестиран, в подходящи условия и време. Диференциална експресия на репортерния ген между проби изложени на агента и контролни проби, идентифицира агенти, които модулират експресията на нуклеинова киселина кодираща белтъка, притежаващ последователността на SEQ ID N0: 2, 4 или 6.

Допълнителни тест формати могат да бъдат използувани за мониториране способността на агента да модулира експресията на нуклеинова киселина, кодираща Nogo рецепторен белтък на изобретението, като белтъка притежаващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2 или 4 или Nogo белтък, притежаващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6. Например, мРНК експресия може да бъде мониторирана директно чрез хибридизация на нуклеинови киселини на изобретението. Клетъчни линии са излагани на действието на тестирания агент в подходящи условия и време и е изолирана тотална РНК и мРНК със стандартни процедури, като тези представени в Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Сонди за откриване разлики в нивата на експресия на РНК ф между клетки излагани на агента и контролни клетки, могат да бъдат получени от нуклеиновите киселини на изобретението. Предпочита се, но не е обезателно, да се планират сонди, които хибридизират само с прицелни нуклеинови киселини в условия на висока строгост. Само високо комплементарни хибриди на нуклеинови киселини се образуват в условия на висока строгост. Съответно, строгостта на условията на тестиране, определя количеството комплементарност, което би съществувало между две вериги нуклеинови киселини за да се образува хибрид. Трябва да бъде подбрана строгост за максимализиране разликата в стабилността между сонда: прицелен ф хибрид и потенциално сонда:не-прицелни хибриди.

Могат да бъдат планирани сонди от нуклеиновите киселини на изобретението с помощта на методи известни в тази област. Например, G+C съдържанието на сондата и дължината на сондата може да повлияе свързването на сондата с нейната прицелна последователност. Методи за оптимизиране специфичността на сондата обикновено са на разположение в Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing.

Условията на хибридизация са модифицирани като са използувани методи, като тези описани в Sambrook et al., (1989) и Ausubel et al., (1995) както се изисква за всяка сонда. Хибридизация на тотална клетъчна РНК или РНК обогатена на полиА-РНК може да бъде изпълнена във всякакъв формат, който е на разположение. Например, тотална клетъчна РНК или РНК обогатена на полиА-РНК, може да бъде прикрепена към твърда подложка и твърдата подложка да бъде изложена на най-малко една сонда, съдържаща най-малко една, или част от една от последователностите на изобретението, в ф условия, в които сондата специфично ще хибридизира. По избор, фрагменти от нуклеинова киселина, съдържащи най-малко една или част от една от последователностите на изобретението, може да бъдат прикрепени към твърда подложка, като силиконова пластинка или пластинка от порьозно стъкло. След това пластинката може да бъде изложена на тотална клетъчна РНК или поли А+РНК от проба, в условия, при които прикрепените последователности специфично ще хибридизират. Такива пластинки и методи за хибридизация са широко достъпни, например, такива представени от Beattie, (1995) WO9511755. Изпитвайки способността на дадена сонда специфично ф да хибридизира с РНК проба от една нетретирана клетъчна популация и от клетъчна популация излагана на агент, са идентифицирани агенти, които регулират възходящо или низходящо експресията на нуклеинова киселина, кодираща Nogo рецепторния белтък, притежаващ последователността на SEQ ID N0: 2 или 4 .

Може да бъде проведена хибридизация за качествен или количествен анализ на мРНК, като се използува тест за рибонуклеазно протестиране (RNase protection assay) (т.е. RPA, виж Ма et al., Methods (1996) 10, 273-238). Накратко, средство за експресия, съдържащо кДНК, кодираща генния продукт и фагов промотор специфичен за ДНК-зависима РНК полимераза (например,

Т7, ТЗ или SP6 РНК полимераза) е линеаризирано при 3’ края на кДНК молекулата, след фаговия промотор, където такава линеаризирана молекула, впоследствие е използувана като матрица за синтеза на белязан антисенз транскрипт на кДНК с in vitro транскрипция. След това белязаният транскрипт е хибридизиран със смес от изолирана РНК (т.е. тотална или фракционирана мРНК) чрез инкубиране на 45°С за една нощ в буфер съдържащ 80% формалдехид, 40 mM Pipes, pH 6.4, 0.4 М NaCI и 1тМ EDTA. Получените хибриди след това са хидролизирани в буфер съдържащ © 40 gg/ml рибонуклеаза А и 2pg/ml рибонукеаза. След деакгивиране и екстрахиране на белтъците, които могат да бъдат екстрахирани, пробите са нанасяни върху урея-полиакриламидни гелове за анализ.

В друг тест формат, агенти, които повлияват експресията на непосредствени генни продукти, клетки или клетъчни линии, трябва най-напред да бъдат идентифицирани, кой физиологично експресира споменатите генни продукти. Клетки и клетъчни линии така идентифицирани, може да се очаква да съдържат необходимата клетъчна машинария, така че точността на модулация на транскрипционния материал е подържана по отношение екзогенния © контакт на агента с подходящи повърхностни механизми на предаване и цитозолните каскади. По-нататък, такива клетки или клетъчни линии могат да бъдат трансдуцирани или трансфектирани с експресионно средство (например, плазмид или вирусен вектор) конструкг, включващ един опериращ не-транслиран 5’-промотор съдържащ край на структурния ген, кодиращ непосредствените генни продукти, слети с един или повече антигенни фрагменти, които са специфични за непосредствените генни продукти, където споменатите фрагменти са под транскрипционния контрол на споменатия промотор и са експресирани като полипептиди, чието молекулно тегло може да бъде различно от естествено срещащите се полипептиди, или може по-нататък да съдържа имунологично определен tag. Такъв процес е добре известен в тази област (виж, Sambrook et al., (1989) Molecular

Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Клетки или клетъчни линии, трансдуцирани или трансфекгирани както е подчертано по-горе, след това могат да бъдат поставени в контакт с агенти при подходящи условия; например, агент съдържащ фармацевтично приемлив ексципиент и е поставен в контакт с клетки във воден физиологичен буфер, като фосфатно буфериран физиологичеен разтвор (PBS) при физиологично pH, © Eagles balanced salt solution (BSS) (балансиран солеви разтвор на Eagles) при физиологично pH, PBS или BSS, съдържащи серум или кондиционирана среда съдържаща PBS или BSS и серум, инкубирани на 37°С. Споменатите условия могат да бъдат модулирани ако се счита за необходимо от специалиста в тази област. След поставянето в контакт на клетките с агента, споменатите клетки ще бъдат разрушени и полипептидите от разрушената маса са фракционирани, така че дадена полипептидна фракция е обединявана и поставяна в контакт с антитяло, за да бъде по-нататък последващо процесирана с имунологичен тест (например, ELISA, © имунопреципитация или Western blot). Пулът от белтъци, изолирани от “агент контактуваната проба се сравнява с контролна проба, където само ексципиентът е бил в контакт с клетките и повишение или отслабване на имунологично генерирания сигнал от “агент контактуваната проба, сравнено с контролата, ще бъде използувано за разграничаване ефективността на агента.

I. Методи за идентифициране агенти, които модулират активността

Настоящето изобретение предоставя методи за идентифициране агенти, които модулират поне една активност на

Nogo рецепторен белтък. Изобретението предоставя също методи за идентифициране агенти, които модулират най-малко една активност на Nogo белтък. Такива методи или тестове могат да използуват всякакви средства за мониториране или откриване на желаната активност.

В един формат, може да бъде изследвана специфичната активност на Nogo рецепторния белтък или Nogo белтък, нормализирана спрямо стандартна единица, между клетъчна популация, която е била излагана на агента, да бъде тестирана в ф сравнение с не-излагана клетъчна популация. Клетъчни линии или популации са излагани на действието на агента, за да бъдат тестирани при подходящи условия и време. Клетъчни лизати могат да бъдат изготвени от излагана клетъчна линия или популация и контрола, не-излагана клетъчна линия или популация. След това клетъчните лизати са анализирани със сондата.

Антитяло сонди могат да бъдат изготвени чрез имунизиране на подходящи бозайници гостоприемници, като се прилагат подходящи имунизационни протоколи, използуващи Nogo рецепторен белтък, Nogo белтък, Nogo рецепторни пептидни агенти ф или антиген-съдържащи фрагменти от всеки от горните. За повишение на имуногенността, тези белтъци или фрагменти могат да бъдат конюгирани с подходящи носители. Методи за получаване на имуногенни конюгати с носители, като BSA, KLH или други носители белтъци, са добре известни в тази област. В известни условия, директно конюгиране може да бъде ефективно, като се използуват, например, карбодиимидни реагенти; в други случаи свързващи реагенти, като тези доставяни от Pierce Chemical Co., могат да бъдат к желани за осигуряване достъпност до хаптена. Хаптен пептидите могат да бъдат удължени от двата амино или карбокси- краища с цистеинов остатък или да бъдат разпръснати помежду с цистеинови остатъци, например, за улесняване свързване с носител. Въвеждане на имуногените е извършвано общо с инжектиране за подходящ период от време и с помощта на подходящи адюванти, както общо е прието в тази област. По време на имунизационната схема, са определяни титрите на антителата за определяне адекватността на антитяло образуването.

Докато поликлоналните антисеруми получени по този начин могат да бъдат задоволителни за известни приложения, за фармацевтични препарати, се предпочита употребата на ф моноклонални препарати. Могат да бъдат изготвени обезсмъртени клетъчни линии, които секретират желаните моноклонални антитела, като се използуват стандартни методи, виж например, Kohler & Milstein, (1992) Biotechnology 24, 524-526 или модификации, които водят до обезсмъртяване на лимфоцити или клетки от слезка, както е общо известно. Обезсмъртените клетъчни линии секретиращи желаните антитела, могат да бъдат скринирани чрез имунотест, при който антигенът е пептиден хаптен, полипетид или белтък. Когато подходящата обезсмъртена клетъчна култура, секретираща желаното антитяло е идентифицирана, клетките могат да бъдат култивирани in ф vitro или чрез произвеждане на асцитна течност.

Желаните антитела могат да бъдат получени от надстоящата течност на културата или от асцитната надстояща течност. Интакгните анти-Nogo или анти-Nogo рецепторни антитела или техни фрагменти, които съдържат имунологично значима част, могат да бъдат използувани като например, антагонисти на свързване между Nogo (лиганд) и Nogo рецептор. Ползуването на имунологично реактивни фрагменти, като Fab, Fab’ на F(ab’)2 фрагменти често е предпочитано, по-специално в терапевтичен контекст, тъй като тези фрагменти общо са по-малко имуногенни отколкото целия имуноглобулин.

Антителата или фрагменти могат също да бъдат произведени, като се използува текуща технология, с рекомбинантни средства. Антитяло области, които специфично се свързват с желани области на белтъка, могат също да бъдат произведени в контекста на химери с произход от множество видове.

Антитяло области, които специфично се свързват с желани области на белтъка, могат също да бъдат получени в контекста на химери с произход от множество видове, например, хуманизирани антитела. Антитялото може следователно да бъде хуманизирано © антитяло или човешко антитяло, както е описаано в U.S. Patent 5,585,089 или Riechmann et al., (1988) Nature 323, 323-327.

Агенти, които са тестирани с горния метод могат произволно да бъдат подбрани или рационално селекционирани или планирани. Както тук е използувано, за един агент се казва, че е произволно подбран, когато агентът е избран произволно без да са разглеждани специфичните последователности, участвуващи в асоциацията на белтъка на изобретението самостоятелно или с неговите асоциирани субстрати, свързващи участници и т.н. Пример за произволно подбрани агенти е използуването на химична библиотека или ф пептидна комбинаторна библиотека, или хранителен бульон на даден организъм.

Както тук е използувано, един агент се казва, че е рационално подбран или планиран, когато агентът е избран на непроизволна основа, която взима предвид последователността на прицелното място или неговата конформация във връзка с действието на агента. Агенти могат рационално да бъдат подбрани или рационално планирани чрез използуване на пептидни последователности, които правят тези места. Например, рационално подбран пептиден агент може да бъде пептид, чиято аминокиселинна последователност е идентична със свързващия домен (SEQ ID N0:

20) на Nogo, който взаимодействува с Nogo рецептор. По избор, това може да бъде фрагмент от свързващия домен, например, SEQ ID N0:

8, 10, 12, 14, 16 и 18.

Агентите на настоящето изобретение могат да бъдат, например, пептиди, антитела, антитяло фрагменти, малки молекули, производни на витамини както и въглехидрати. Пептидни агенти на изобретението могат да бъдат получени като се използува стандартна твърда фаза (или фаза разтвор) петптидни методи за синтеза, каквито са известни в тази област. В допълнение, ДНК ф кодираща тези пептиди може да бъде синтезирана като се използуват търговски достъпен инструментариум за олигонуклеотидна синтеза и рекомбинантно получени, използувайки стандартни системи за рекомбинантно произвеждане. Производството използуващо твърдо фазова пептидна синтеза се налага ако ще бъдат включени не-геннокодирани аминокиселини.

Друг клас агенти на настоящето изобретение са антитела или техни фрагменти, които се свързват с Nogo белтък или Nogo рецепторен белтък. Могат да бъдат получени антитяло агенти чрез имунизация на подходящи бозайници като обекти, с пептиди, ф съдържащи антигенни области, такива части от белтъка предвидени да бъдат прицелни за антителата.

J. Тестове с висока пропускливост

Мощността на скрининг с висока пропускливост е използувана за търсене на нови съединения, които са способни да взаимодействуват с Nogo рецепторния белтък. Като обща информация за скрининг с висока пропускливост (например, Devlin, (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; U.S. Patent 5,763,263). Тестове c висока пропускливост използуват една или повече различни техники за тестиране.

Имунодиагностики и имунотестове. Това са група техники, използувани за измерване на специфични биохимични вещества, обикновено в ниски концентрации в комплексни смеси, като биологични течности, което зависи от специфичността и високия афинитет, показан с подходящо изготвени и подбрани антитела за техните комплементарни антигени. Едно вещество, което ще бъде измервано, трябва неизбежно да бъде антигенно - или една имуногенна макромолекула, или хаптенова малка молекула. Към всяка проба е добавено известно, ограничено количество специфично © антитяло и фракцията на антигена, която се комбинира с него, често експресирана като отношението свързано:свободно, е определена, използувайки като индикатор една форма от антигена, свързан с радиоизотоп (радиоимуно тест), флуоресцентна молекула (флуороимуно тест), стабилен свободен радикал (спин имуно тест), ензим (ензимен имуно тест) или друг директно различим белег.

Антитела могат да бъдат белязани по различни начини, включително: ензимно-свързан имуно сорбентен тест (ELISA); радиоимуно тест (RIA); флуоресцентен имуно тест (FIA), хемилуминисцентен тест (CLIA); и бележене на антитялото с 0 колоидални златни частици (имуноголд).

Общи формати тестове включват сандвичов тест, компетитивен или конкурентен тест, латексов аглутинационен тест, хомогенен тест, микротитрационна платка формат и тест на базата на микрочастици.

Ензимно свързан имуносорбетен тест (ELISA). ELISA е имунохимична техника, която избягва опасностите на радиохимическите съединения и скъпите флуоресцентни системи за откриване. Вместо това, тестът използува ензими като индикатори. ELISA е форма на количествен имуно тест базиран на приложението на антитела (или антигени), които са свързани с повръхност на неразтворим носител, който след това е използуван да “захване” съответния антиген (или антитяло) в тестирания разтвор. Антигенантитяло комплексът след това се открива чрез измерване активността на подходящ ензим, който предварително е ковалентно прикачен за антигена (или антитялото).

За информация върху ELISA техники, виж, например Crowther, (1999) ELISA - Theory and Practice (Methods in Molecular Biology), Humana Press; Challacombe & Kemeny, (1998) ELISA and Other Solid Phase Immunoassays - Theoretical and Practical Aspects, © John Wiley; Kemeny, (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press;

Ishikawa, (1991) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) Elsevier.

Колориметрични методи за ензими.Колориметрия е всеки метод за количествен химичен анализ, при който концентрацията или количеството на дадено съединение се определя чрез сравнение оцветяването получено от реакция на един реагент със стандартни и тестирани количества от съединението, например, използувайки колориметър или спекгрофотометьр.

Стандартни колориметрични тестове за бета-галакгозидазна 0 ензимна активност, са добре известни на специалиста в тази област (виж, например Norton et al., (1985) Mol.Cell.Biol. 5, 281-290). Един колориметричен метод може да бъде изпълнен с лизати от цели клетки, използувайки О-нитрофенил-бета-О-галакгопиранозид (ONPG, Sigma) като субстрат и стандартен колориметричен бетагалакгозидазен тест (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Автоматизирани колориметрични тестове също са на разположение за определяне на бета-галактозидазна активност (виж, например U.S. Patent 5,733,720).

Имунофлуоресцентни тестове. Имунофлуоресценция или имунофлуоресцентна микроскопия е техника, при която един антиген или антитяло е направен флуоресцентен чрез конюгиране с флуоресцентно багрило и след това е оставен да реагира с комплементарно антитяло или антиген в тъканен срез или натривка. Локализацията на антигена или антитялото може след това да бъде определена чрез наблюдение флуоресценцията с микроскоп при ултравиолетова светлина.

За обща информация върху имунофлуоресцентни техники, О виж например, Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques. Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy - A Practical Approach (The Practical Approach Series) Oxford University Press; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. За подробни обяснения на имунофлуоресцентните техники, приложими за настоящето изобретение, виж U.S. Patent 5,912,176; U.S.Patent 5,869,264; U.S.Patent 5,866,319; и U.S.Patent 5,861,259.

φ K. Употреба на агенти, които модулират активност

Както е представено в Примерите, Nogo и Nogo рецепторни белтъци и нуклеинови киселини, такива като белтъците притежаващи аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:2, 4 или 6, са експресирани в миелин, произхождащ от аксон и дендрити. Агенти, които модулират или регулират възходящо или низходящо експресията на Nogo или Nogo рецепторен белтък, или агенти като агонисти или антагонисти с най-малко една активност за Nogo или Nogo рецепторен белтък, могат да бъдат използувани за модулиране биологични и патологични процеси, свързани с функцията и активността на белтъка. Изобретението е особено полезно за лечение на хора.

Патологични процеси се отнасят към тази категория биологични процеси, които предизвикват увреждащ ефект. Например, експресия на белтък на изобретението може да бъде свързана с инхибиране на аксонална регенерация след черепна, мозъчна или гръбначно мозъчна травма, инсулт или демиелинизиращо заболяване. Такива демиелинизиращи заболявания включват, но не се ограничават до, множествена склероза, монофазна © демиелинизация, енцефаломиелит, мултифокална левкоенцефалопатия, паненцефалит, болест на Marchiafava-Bignami, понтина миелинолиза, адренолевкодистрофия, болест на PelizaeusMerzbacher, спонгиозна дегенерация, болест на Alexander, болест на Canavan, метахроматчна левкодистрофия и болест на Krabbe. Както тук е използувано, един агент се казва, че модулира патологичен процес, когато агентът редуцира степента или тежестта на процеса. Например, демиелинизиращо заболяване може да бъде предотвратено или да бъде модулирано прогресирането му, чрез въвеждане на агенти, които редуцират, стимулират или модулират 0 някакъв път на експресията, или поне активността на белтък на изобретението.

В един пример, въвеждане на Nogo пептидни агенти, представени в SEQ ID N0: 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20, може да бъде приложено за лечение на демиелинизиращо заболяване, свързано с Nogo или Nogo рецепторен белтък. В друг пример, клетки които експресират пептидните агенти на изобретението, могат да бъдат трансплантирани на място с увреждане в гръбначния мозък, за улесняване аксоналния растеж в увреденото място. Такива трансплантирани клетки биха предоставили средства за възстановяване функцията на гръбначния мозък, след увреждане или травма.

В друг пример, въвеждане на разтворим Nogo рецепторен белтък, който се свързва с Nogo, може да бъде прилаган за лечение на демиелинизиращо заболяване, свързано с Nogo или Nogo рецепторния белтък. Този агент може да бъде използуван за предотвратяване свързването на Nogo със свързания с клетъчната стена Nogo рецептор и да действува като антагонист на Nogo. Разтворими рецептори са използувани да свързват цитокини или други лиганди, за да регулират техната функция (Thomson, (1998) Cytokine Handbook, Academic Press). Разтворим рецептор са появява в разтвор или извън мембраната. Разтворими рецептори могат да се появят поради това, че сегментът от молекулата, която се разпростира или асоциира с мембраната отсъствува. Този сегмент обикновено се определя от специалистите в тази област, като трансмембранен домен на гена, или мембранен свързващ сегмент на белтъка. Така, в някои изпълнения на изобретението, един разтворим рецептор включва един фрагмент или аналог на мембранно свързан рецептор. Предпочитано, фрагментът съдържа най-малко шест, например десет, двадесет, двадесет и пет, тридесет, четиридесет, шестдесет или седемдесет аминокиселини, осигуряващи той да запази неговата желана активност.

В други изпълнения на изобретението, структурата на сегмента, която се свързва с мембраната, е модифицирана (например, полиморфизъм на ДНК последователността или мутация в гена), така че рецепторът не е вмъкнат чрез инсерция в мембраната, или рецепторът е вмъкнат, но не е задържан в рамките на мембраната. Така, един разтворим рецептор, за разлика от съответната мембранно свързана форма, се различава по един или повече сегменти на гена или рецепторния белтък, които са важни за неговото асоцииране с мембраната.

Агентите на настоящето изобретение могат да бъдат предоставени самостоятелно, или в комбинация, или в последователна комбинация с други агенти, които модулират даден патологичен процес. Например, един агент на настоящето изобретение, може да бъде въведен в комбинация с противовъзпалителни агенти, след инсулт, като средство за блокиране по нататъшно невронално увреждане и инхибиране на аксоналната регенерация. Както тук е използувано, два агента се казва, че се въвеждат в комбинация, когато двата агента са въведени едновременно или са въведени независимо, по начин, така че агентите да действуват по едно и също време.

Агентите на настоящето изобретение могат да бъдат въвеждани парентерално, подкожно, интравенозно, интрамускулно, интрапериТонеално, транодермално или букално. Например, един агент може да бъде въвеждан локално на мястото на увреждането чрез микроинфузия. Типични места включват, но не се ограничават до, увредени области на гръбначния мозък, които са резултат от нараняване или увредени места в мозъка като последствие от инсулт. По избор, или конкурентно, въвеждането може да бъде орално. Въвежданата дозировка ще зависи от възрастта, здравословното състояние и теглото на реципиента, вида на конкурентно третиране ако има такова, честота на третиране и природата на желания ефект.

Настоящето изобретение по-нататък предоставя препарати съдържащи един или повече агенти, които модулират експресията или поне една активност на белтъка на изобретението. Докато индивидуалните нужди варират, определянето на оптималните граници на ефективни количества от всеки компонент са във преценката на специалиста в тази област. Типични дозировки включват 1 pg/kg до 100 mg/kg телесно тегло. Предпочитаните дозировки за системно въвеждане включват 100 ng/kg до 100mg/kg телесно тегло. Предпочитаните дозировки за директно въвеждане на място чрез микроинфузия, включват 1 ng/kg до 1 pg/kg телесно тегло.

В допълнение към фармакологично активния агент, препаратите на настоящето изобретение, могат да съдържат подходящи фармацевтично приемливи носители, съдържащи ексципиенти или спомагателни вещества, които улесняват обработката на активните съединения в препарати, които могат да бъдат използувани фармацевтично за осигуряване на мястото на действие. Подходящи комбинации за парентерално въвеждане включват водни разтвори на активните съединения във водно разтворима форма, например, водно разтворими соли. В допълнение, могат да бъдат въвеждани суспензии на активните съединения като подходящи маслени инжекционни суспензии. Подходящи липофилни разтворители или вехикулуми включват мастни масла, например сусамово масло или синтетични мастно киселинни естери, например, етил олеат или триглицериди. Водни инжекционни суспензии могат да съдържат вещества, които повишават вискозитета на суспензията и включват, например натриева карбоксиметил целулоза, сорбитол и декстран. По избор, суспензията може да съдържа също стабилизатори. Липозоми могат също да бъдат използувани за капсулиране на агента, за предоставяне в клетката.

Фармацевтичната комбинация за системно въвеждане, съгласно изобретението, може да бъде комбинирана за ентерапно, парентерално или топично въвеждане. Наистина, всички три типове комбинации могат да бъдат прилагани едновременно за постигане системно въвеждане на активната съставка. Подходящи комбинации за орално въвеждане включват твърди или меки желатинови капсули, пилюли, таблетки, включително филм-таблетки, елексири, суспензии, сиропи или инхалации и техни форми с контролирано освобождаване.

При използуване методите на изобретението, агентите на това изобретение могат да бъдат прилагани самостоятелно или в комбинация, или в комбинация с други терапевтични или диагностични агенти. В някои предпочитани изпълнения, съединенията на това изобретение мога да бъдат прилагани заедно с други съединения, обикновено предписвани за тези състояния, съгласно общоприетата медицинска практика, такива като противовъзпалителни агенти, антикоагуланти, антитромботични, включително инхибитори на тромбоцитната агрегация, активатори на тъканния плазминоген, урокиназа, проурокиназа, стрептокиназа, аспирин и хепарин. Съединенията на това изобретение могат да бъдат използувани in vivo, обикновено при бозайници, като хора, овце, коне, говеда, прасета, кучета, котки, плъхове и мишки или in vitro.

L. Пептидни миметици

Това изобретение включва също пептидни миметици, които наподобяват три-димензионалната структура на Nogo и блок Nogo свързване при Nogo рецептора. Такива пептидни миметици могат да имат значими предимства пред естествено срещащите се пептиди, включително, например: по-икономично производство, по-голяма химична стабилност, повишени фармакологични свойства (полуживот, абсорбция, потентност, ефикасност и т.н.) променена специфичност (например, широк спектър биологични активности), намалена антигенност и други.

При една форма, миметици са пептид-съдържащи молекули, които наподобяват елементи на белтъчната вторична структура (виж, например, Johnson et al., (1993) Peptide Turn Mimetics, in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., (editors) Chapman and Hall). Основната причина за приложението на пептидни миметици е, че пептидната основна верига на белтъците съществува главно да ориентира аминокиселинните странични вериги по такъв начин, че да улесняват молекулните взаимодействия, като такива на антитяло и антиген. Един пептиден миметик се очаква да позволява молекулни взаимодействия, сходни на природната молекула.

В друга форма, пептидни аналози обичайно са използувани във фармацевтичната индустрия като не-пептидни лекарства със свойства аналогични на тези на матричния пептид. Тези типове непептидни съединения също са означени като “пептидни миметици” или “пептидомиметици” (Fauchere, (1986) Adv.Drug Res. 15, 29-69; Veber & Freidinger, (1985) Trends Neurosci. 8, 392-396; Evans et al., (1987) J.Med.Chem. 30, 1229-1239, които тук са включени чрез цитат) и обикновено са създадени с помощта на компютерно молекулно моделиране.

Пептидни миметици, които структурно са сходни с терапевтично използувани пептиди, могат да бъдат използувани за получаване на еквивалентен терапевтичен или профилактичен ефект. Общо, пептидни миметици са структурно сходни с един парадигма полипептид (т.е. полипептид, който има биохимично свойство или фармакологична активност), като извънклетъчния домен на Nogo, но има една или повече пептидни връзки по избор заменени с една връзка, подбрана от групата състояща се от: -CH₂NH-, -CH₂S-, СН₂-СН₂-, -СН=СН (цис и транс), -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -CH₂SO-, с методи известни в тази област и по-нататък описани в следните цитати; Weinstein, (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Marcel Dekker, Morley, (1980) Trends Pharmacol.Sci. 1, 463-468 (general review); Hudson et al., (1979) IntJ.Pept.Protein Res. 14, 177-185 (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al., (1986) Life Sci. 38, 1243-1249 (-CH₂-S); Hann, (1982) J.Chem.Soc. Perkin

Trans. 1, 307-314 (-CH-CH-, цис и транс); Almquist et al., (1980)

J.Med.Chem. 23, 1392-1398 (-COCH₂-); Jennings-White et al., (1982)

Tetrahedron Lett. 23, 2533 (-COCH₂-); Holladay et al., (1983) Tetrahedron

Lett. 24, 4401-4404 (-C(OH)CH₂-); и Hruby, (1982) Life Sci. 31, 189-199 (-CH₂S-); всяка, от които тук е включена чрез цитат.

Белязането на пептидни миметици обикновено включва ковалентно прикачване на един или повече белези, директно или чрез спейсер (например, една амино група), за една не-интерферираща позиция(и) върху пептидния миметик, които са предвидени от количествени данни за структура-активност и молекулно © моделиране. Такива не-интерфериращи позиции общо са позиции, които не формират директни контакти с макромолекулата(те) (например, не са контактни пунктове в Nogo-Nogo рецепторните комплекси), за които пептидният миметик се свързва за да произведе терапевтичния ефект. Дериватизация (например белязане) на пептидни миметици не трябва съществено да интерферира със желаната биологична или фармакологична активност на пептидния миметик.

Nogo пептидни миметици могат да бъдат конструирани чрез базиращ се на структура лекарствен дизайни, чрез заместване на © аминокиселини с органични части (виж, например, Hughes, (1980) Philos.Trans.R.Soc.Lond. 290, 387-394; Hodgson, (1991) Biotechnol. 9, 19-21; Suckling, (1991) Sci.Prog. 75, 323-359).

Употребата на пептидни миметици може да се повиши, чрез прилагането на комбинаториална химия за създаване на лекарствени библиотеки. Дизайнът на пептидни миметици може да бъде подпомогнат чрез идентифициране на аминокиселинни мутации, които повишават или намаляват свързването на Nogo при Nogo рецептора. Подходи, които могат да бъдат прилагани, включват дрождения дву-хибриден метод (виж, Chien et al., (1991)

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88, 9578-9582) и използуване метода на фагов дисплей. Дву-хибридният метод открива белтък-белтък взаимодействия при дрожди (Fields et al., (1989) Nature 340, 245-246). Методът фагов дисплей открива взаимодействие между един имобилизиран белтък и белтък, който е експресиран по повърхността на фаги, като ламбда и М13 (Amberg et al., (1993) Strategies 6, 2-4; Hogrefe et al., (1993) Gene 128, 119-126). Тези методи позволяват положителна или отрицателна селекция за белтък-белтък взаимодействия и идентифицирането на последователностите, които определят тези взаимодействия.

За обща информация върху пептидна синтеза и пептидни миметици, виж, например Jones, (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley; Bodansky et al., (1993) Peptide Chemistry - A Practical Textbook, Springer Verlag.

M. Трансгенни животни

Терминът “животно” както е използуван тук, включва всички гръбначни животни, с изключение на хора. Той включва също индивидуално животно във всички етапи на развитие, включително ембрионални и фетални стадии. “Трансгенно животно” е животно съдържащо една или повече клетки, носещи генетична информация получена директно или индиректно, чрез преднамерена генетична манипулация на субклетъчно ниво, като микроинжекция или инфекция с рекомбинантен вирус. Тази въведена ДНК молекула може да бъде интегрирана вътре в хромозомата, или тя може да бъде екстрахромозомна реплицираща ДНК. Терминът “зародишна клетка-линия трансгенно животно” се отнася за трансгенно животно, на което генетичната информация е въведена в една зародишна линия клетка, при което придава способността да пренася информация на потомство. Ако такова потомство фактически притежава някаква или цялата тази информация, тогава те също са трансгенни животни. В изобретението са обхванати трансгенни животни съдържащи мутантни, knock-out, модифицирани гени или генни конструкти, които да свръх-експресират или условно експресират ген, съответствуващ на кДНК последователностите на SEQ ID NO: 1 или 3 или свързани последователности.

Информацията може да бъде чужда на видовете животни, към които принадлежи реципиента, чужда само на даден индивидуален реципиент или генетична информация, която вече е притежавана от реципиента. В последния случай, въведеният ген може да бъде различно експресиран в сравнение с нативния ендогенен ген. Гените могат да бъдат получени чрез изолирането им от генетични източници, чрез получаване на кДНК от изолирани РНК матрици, чрез насочена синтеза, или чрез тяхна комбинация.

За да бъде експресиран, един ген трябва да бъде оперативно свързан с регулаторна област. Регулаторни области, като промотори, могат да бъдат използувани да повишат, да намалят, регулират или посочат известни тъкани или известни етапи от развитието експресията на един ген. Промоторът не е необходимо да бъде природно срещаща се промотор. “Трансгенните не-човешки животни” на изобретението са произведени чрез въвеждане “трансгени” в зародишната линия на животно, което не е човек. Методите, които правят възможно въвеждането на ДНК в клетки са общо достъпни и добре известни в тази област. Могат да бъдат използувани различни методи за въвеждане на трансгени. Общо, зиготата е най-добрия таргет (прицелно място) за микроинжекция. При мишката, мъжкият пронуклеус достига размер от приблизително двадесет микрона в диаметър, което позволава възпроизводимо инжектиране на един до два пиколитра ДНК разтвор. Употребата на зиготи като прицелно място за генен пренос има голямо предимство. В повечето случаи, инжектираната ДНК ще се включи в гена на гостоприемника преди първото разцепване (Bimster et al., (1985) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82, 4438-4442). Следователно, почти всички клетки на трансгенното животно, което не е човек, ще носят включения трансген. Общо, това ще има също за резултат ефективен пренос на трансген в потомство на родоначалник, тъй като 50% от зародишните клетки ще задържат трансгена. Микроинжекгиране на зиготи е предпочитан метод за включване на трансгени при практикуване на изобретението.

© Може също да бъде използувана ретровирусна инфекция, за въвеждане на трансген в животно, което не е човек. Развиващо се нечовешко ембрио може да бъде култивирано in vitro до стадия на бластоцит. През това време, бластомерите могат да бъдат прицелни места за ретровирусна инфекция. Ефективна инфекция на бластомери е получена чрез ензимно третиране, за отстраняване на zona pellucida. Вирусната векторна система използувана за въвеждане на трансгена, обикновено е репликация-дефектен ретровирус носещ трансгена (Jahner et al., (1985)

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82, 6927-6931; Van der Putten et al., (1985) φ Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82, 6148-6152). Трансфекция се постига лесно и ефективно чрез култивиране на бластомерите върху монослой от вирус-продуциращи клетки (van der Putten et al., (1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82, 6148-6152; Stewart et al., (1987) EMBO J. 6, 383-388). По избор, инфекция може да бъде извършена на по-късен стадий. Вирус или вирус-продуциращи клетки могат да бъдат инжектирани в бластоцелето (Jahner et al., (1982) Nature 298, 623628). Повечето от животните родоначалници ще бъдат мозаечни за тарнсгена, тъй като включване се появява само с една подгрупа от клетките, които формират трансгенното животно, което не е човек.

По-нататък, животното родоначалник, може да съдържа ретровирусни инсерции на трансгена на различни позиции в генома; тези общо се отделят в потомството. В допълнение, възможно е също да се въведат трансгени в зародишната линия, макар и с ниска ефективност, чрез интраутеринна ретровирусна инфекция на ембрио в среден период след гестация Jahner et al., (1982) Nature 298, 623628).

Трети тип прицелна клетка за трансгенно въвеждане е ембрионалната стволова клетка (ES). ES клетки са получении от преимплантация ембриони, култивирани in vitro (Evans et al., (1981) © Nature 292, 154-156; Bradley et al., (1984) Nature 309, 255-256; Glosser et al., (1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 9065-9069). Трансгени могат да бъдат ефективно въведени в ES клетки чрез ДНК трансфекция или ретровирус-медиирана трансдукция. Получените трансформирани ES клетки могат след това да бъдат комбинирани с бластоцити от животно, което не е човек. ES колонизират ембриото и допринасят за зародишната линия на полученото химерно животно.

Методите за оценка наличието на въведена ДНК, както и нейната експресия, са пряко достъпни и добре известни в тази област. Такива методи включват, но не се ограничават до ДНК © (Southern) хибридизация за откриване на екзогенна ДНК, полимеразна верижна реакция (PCR), електрофореза в полиакриламиден гел (PAGE) и Western blots (препечатка) за откриване на ДНК, РНК и белтък. Методите включват имунологични и хистохимични техники, за откриване експресия на Nogo рецепторен ген.

Както тук е използувано, “трансген” е ДНК последователност, въведена в зародишна линия на животно, което не е човек, чрез човешка интервенция, като по начин в Примерите, описани по-долу. Последователност на нуклеиновата киселина на трансгена, в този случай форма на SEQ ID N0: 1 или 3, може да бъде интегрирана в един локус на геном, където дадената последователност на нуклеинова киселина не се открива нормално, или в нормален локус за трансгена. Трансгенът може да се състои от последователности на нуклеинова киселина, произхождаща от геном на същите видове или на различни видове, в сравнение с видовете на прицелното животно.

Например, аксонална регенерация у мишки, които на притежават Nogo, може да бъде сравнена с такава у мишки, които не притежават MAG или и двата - MAG и Nogo. За определяне дали ефектът на анти-Nogo антитяло се дължи на Nogo блокада, антитяло ефекти могат да бъдат проучени при животни, които не притежават Nogo ф. експресия.

Както е обсъдено по-горе, нуклеинова киселина на изобретението може да бъде трансфектирана в клетка гостоприемник като се използува вектор. Предпочитани вектори са плазмиди и вирусни вектори, като ретровируси. Вирусни вектори могат да бъдат използувани за получаване на трансгенни животни, съгласно изобретението. Предпочитано, вирусните вектори са репликация дефектни, което означава, че те не са способни да реплицират автономно в прицелната клетка. Общо, геномът на репликация дефектните вирусни вектори, които са използувани в обсега на © настоящето изобретение, не притежават най-малко една област, която е необходима за репликацията на вируса в инфектираната клетка. Тези области могат или да бъдат елииминирани (изцяло или частично), или да бъдат превърнати в не-функционални с всяка техника, известна на специалиста в тази област. Тези техники включват тотално отстраняване, заместване (с други последователности, в частност с вмъкнатата чрез инсерция нуклеинова киселина), частична делеция или добавяне на една или повече бази към съществена (за репликацията) област. Такива техники могат да бъдат изпълнени in vitro (върху изолираната ДНК) или in situ, като се използуват техниките на генетична манипулация или чрез третиране с мутагенни агенти.

Предпочитано, репликация дефектният вирус задържа последователностите на неговия геном, които са необходими за залавяне на вирусните частици. Ретровирусите са интегриращи се вируси, които инфектират делящи се клетки. Ретровирусният геном включва два LTRs, една залавяща последователност и три кодиращи области (gag, pol и env). Описана е конструкцията на рекомбинантни ретровирусни вектори (виж, например Bernstein et al., (1985) GenetEng. 7, 235; McCornick, (1985) Biotechnol. 3, 689-691). B рекомбинантни ретровирусни вектори, gag, pol и env гените са общо делетирани, изцяло или частично и заменени с хетероложна последователност на нуклеинова киселина, която е от интерес. Тези вектори могат да бъдат конструирани от различни типове ретровируси, като HIV, MoMuLV (murine Moloney leukemia virus), MSV (murine Moloney sarcoma virus), HaSV (Harvey sarcoma virus); SNV (spleen necrosis virus) ( вирус на некроза на слезката); ESV (Rous sarcoma virus) и Friend вирус.

Общо, за да се конструрират рекомбинантни ретровируси, съдържащи последователност на нуклеинова киселина, е конструиран плазмид, който съдържа LTRs, залавящата последователността и кодиращата последователност. Този конструкг е използуван да трансфекгира една пакетираща клетъчна линия, която клетъчна линия е способна да достави в транс ретровирусните функции, които са липсващи в плазмида. Общо, пакетиращите клетъчни линии, са способни да експресират gag, pol и env гени. Такива пакетиращи клетъчни линии са описани в предишни изследвания, по-специално в клетъчната линия РА317 (U.S.Patent 4,861,719); PsiCRIP клетъчната линия (W09002806) и GP+envAm-12 клетъчната линия (W08907150). В допълнение, рекомбинантните ретровирусни вектори могат да съдържат модификации в рамките на LTRs за потискане на траскрипционна активност както и обширни залавящи последователности, които могат да включват част от gag гена (Bender et al., (1987) J.Virol. 61, 1639-1646). Рекомбинантни ретровирусни вектори са пречистени със стандартни техники, известни на специалистите в тази област.

В един аспект нуклеиновата киселина кодира антисенз РНК молекули. В това изпълнение, нуклеиновата киселина е оперативно свързана с подходящи регулаторни области (обсъдени по-горе), които правят възможна експресията на последователността на нуклеинова киселина и е въведена в клетка използуваща, предпочитано, рекомбинантни векторни конструкги, които ще експресират антисенз нуклеиновата киселина, след като векторът е въведен в клетката. Примери за подходящи вектори включват плазмиди, аденовируси, адено-свързани вируси (виж, например, U.S.Patent 4,797,368, U.S. Patent 5,139,941), ретровируси (виж по-горе) и херпес вируси. За предаване на терапевтичен ген, векторът предпочитано е аденосвързан вирус.

Аденовируси са еукариотни ДНК вируси, които могат да бъдат модифицирани ефективно да предават нуклеинова киселина на изобретението на различни клетъчни типове. Съществуват различни серотипове аденовирус. От тези серотипове, предимство се дава в обсега на настоящето изобретение, да се използуват два типа или тип пет човешки аденовируси (Ad2 или Ad5) или аденовируси от животински произход (виж WO9426914). Такива вируси от животински произход, които могат да бъдат използувани в обсега на настоящето изобретение, включват аденовируси от кучешки, говежди, миши, яйчев, свински, птичи и маймунски произход.

Репликационно дефектните рекомбинантни аденовируси, съгласно изобретението могат да бъдат получени с всяка техника известна на специалиста в тази област. В частност, те могат да бъдат получени чрез хомоложна рекомбинация между аденовирус и плазмид, който носи между другото, ДНК последователността, която представлява интерес. Хомоложната рекомбинация се извършва след ко-трансфекция на споменатия вирус и плазмид в подходяща клетъчна линия. Клетъчната линия, която е използувана, трябва предпочитано (i) да бъде трансформируема със споменатите елементи, и (ii) да съдържа последователностите, които са способни да допълват частта на генома на репликационно дефектния аденовирус, предпочитано в интегрирана форма, за да се избегнат рискове от рекомбинация. Рекомбинантни вируси се получават и пречистват, като се използуват стандартни биологични техники, които са добре известни на специалиста в тази област.

Произвведени са известен брой рекомбинантни или трансгенни мишки, включително такива, които експресират активирана онкогенна последователност (U.S.Patent 4,736,866); експресират Simian SV 40 Т-антиген (U.S. Patent 5,738,915); не притежават експресията на интерферон регулаторен фактор 1 (IRF-1) (U.S. Patent 5,731,490); проявяват допаминергична дисфункция (U.S.Patent 5,723,719); експресират най-малко един човешки ген, който участвува в контрола на кръвното налягане (U.S.Patent 5,731,489); проявяват по-голямо сходство с условията, съществуващи при естествено проявяваща се болест на Alzheimer (U.S.Patent 5,720,936); имат намален капацитет да медиират клетъчно прилепване (U.S.Patent 5,602,307); притежават ген на говежди растежен хормон (Cutter et al., (1996) Genetics 143, 1753-1760) или са способни да генерират напълно човешки антитяло отговор (Zou et al., (1993) Science 262, 1271-1274).

Докато мишки и плъхове остават животните на избор за повечето трансгенни експерименти, в някои случаи се предпочита или дори е необходимо да се използуват алтернативни животински видове. Трансгенни процедури успешно са използувани в различни не-миши животни, включително овце, кози, пилета, хамсгери, зайци, крави и морски свинчета (виж, Aigner et al., (1999) Biochem.Biophys. Res.Commun. 257, 843-850; Castro et al., (1999) Genet.Anal. 15, 179187; Brink et al., (2000) Theriogenology 53, 139-148; Colman, (1999) GenetAnal. 15, 167-173; Eyestone, (1999) Theriogenology 51, 509-517; Baguisi et al., (1999) NatBiotechnol. 17, 456-461; Prather et al., (1999) Theriogenology 51, 487-498; Pain et al., (1999) Cells Tissues Organs 165, 212-219; Fernandez et al., (1999) Indian J.Exp.Biol. 37, 1085-1092; U.S.Patent 5,908,969; U.S.Patent 5,792,902; U.S.Patent 5,892,070; U.S.Patent 6,025,540).

N. Диагностични методи

Един начин за диагностициране на демиелинизиращо заболяване, използувайки молекули нуклеинова киселина или белтъци на изобретението, включва получаване на тъканна проба от живи индивиди. Получаване на тъканни проби от живи източници е проблематично за тъкани, като централната нервна система. При пациенти страдащи от демиелинизиращо заболяване, тъканни проби за диагностични методи, могат да бъдат получени с по-малко инвазивни процедури. Например, проби могат да бъдат получени от цяла кръв и серум.

Употребата на молекулярно биологични средства става рутинна в съдебната технология. Например, сонди от нуклеинови киселини могат да бъдат използувани за определяне експресията на молекула нуклеинова киселина, съдържаща цялата или поне част от последователностите на SEQ ID N0: 1, при образци на съдебна патология. По-нататък, тестове с нуклеинови киселини могат да бъдат изпълнени по всякакви начини за провеждане охарактеризиращ транскрипцията анализ. В допълнение към анализа на нуклеинови киселини, съдебни методи на изобретението, могат да бъдат насочени към белтъка, кодиран от SEQ ID NO: 1, за определяне възходящата и низходяща регулация на гените (Shiverick qt al., (1975)

Biochim. Biophys. Acta 393, 124-133).

Методи на изобретението могат да включват третиране на тъкани с колагенази или други протеази, за да се направи тъканта податлива на клетъчен лизис (Semenov et al., (1987) Biull.Eksp.Biol.Med. 104, 113-116). По-нататък, възможно е да се получат биопсични проби от различни области на мозъка за анализ.

Тестове за откриване молекули нуклеинова киселина или белтък на изобретението, могат да бъдат във всякакъв формат, който е на разположение. Типични тестове за молекули нуклеинови киселини включват хибридизация или PCR. Типични тестове за откриване белтъци, полипептиди или пептиди на изобретението, включват прилагането на антитяло сонди във всякакъв разполагаем вид, като in situ свързващи тестове, и т.н. Виж, Harlow & Lane, (1988) Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. В предпочитани изпълнения, тестовете се провеждат с подходящи контроли.

Без следващо описание, счита се, че специалистът в тази област може, използувайки предходното описание и следващите илюстративни примери, да направи и използува съединенията на настоящето изобретение и да прилага претендираните методи. Следващите работни примери следователно, специфично отбелязват предпочитани изпълнения на настоящето изобретение и не се разглеждат като ограничаващи по някакъв начин на останалата част от представянето.

ПРИМЕРИ

Пример 1 - Идентифициране на Noqo като член на ретикулон семейството белтъци

Регенерацията на зрял аксон на бозайник, обикновено е успешна в периферията, но печално слаба в ЦНС. Обаче, много класове аксони на ЦНС могат да се удължат на дълги разстояния в присадки на периферен нерв (Benfy & Aguayo (1982) Nature 296, 150152). Сравнение на миелин от ЦНС и периферната нервна система (ПНС), разкрива, че бялото вещество на ЦНС е селективно инхибиторно за аксоналното нарастване (Schwab & Thoenen (1985)

J.Neurosci. 5, 2415-2423). Описани са няколко компоненти на бялото вещество на ЦНС, N135, NI250 (Nogo) и MAG, с инхибиторна активност за аксоналното нарастване (Wang et al., (1999) Transduction of inhibitory signals by the axonal growth cone, in Neurobiology of Spinal Cord Injury, Kalb & Strittmatter (editors) Humana Press; Caroni & Schwab, (1988) J.Cell Biol. 106, 1281-1288; Spillmann et al., (1998) J.Biol.Chem. 73, 19283-19293; McKerracher et al., (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay et al., (1994) Neuron 13, 757-767). Съобщено е, че IN-1 антитялото, предизвикано срещу NI35 и NI250 (Nogo), позволява умерена степен на аксонална регенерация и функционално възстановяване след увреждане на гръбначния мозък (Bregman et al., (1995) Nature 378, 498-501; Thallmair et al., (1998) Nature Neurosci. 1, 24-31). Настоящето изобретение идентифицира Nogo като член на ретикулон (Reticulon) белтъчното семейство.

Nogo се експресира от олигодендроцити, но не от Шванови клетки и се свързва първично с ендоплазматичния ретикулум. Шестдесет и шест аминокиселинния луменален-екстрацелуларен домен на Nogo (SEQ ID NO: 20) инхибира аксоналното удължаване и колабира растежните конуси на дорзалния коренчев ганглий. Други ретикулон белтъци не са експресирани в олигодендроцити, и 66 аминокиселинния луменален-екстрацелуларен домен от ретикулон белтъци не инхибира аксоналната регенерация. Тези данни осигуряват молекулна база за определяне приноса на Nogo за неуспеха на аксонална регенерация в зрялата ЦНС.

За експресия и белтъчно пречистване на рекомбинантен Nogo-A, пълноразмерната последователност (KIAA0886) е щедро предоставена от Kazusa DNS Research Institute. Пълноразмерната кодираща последователност е амплифицирана с полимеразна верижна реакция (PCR) и лигирана в pCDNA3.1-MycHis вектор (Invitrogen), за създаване плазмид, кодиращ Nogo-A, слят при карбоксилния край с Мус епитопа (Nogo-A-Myc). По избор, кодиращата последователност е амплифицирана като са използувани праймери, които кодират един във-рамката Мус епитоп, непосредствен амино край на първия остатък и един стоп кодон при карбоксилния край (Myc-Nogo-A). Nogo-C-MycHis и Rtn1C-MycHis експресионни вектори са направени производни по същия начин, с изключение на това, че е използувана кДНК библиотека от зрял мозък на плъх, като матрица за PCR реакция, с праймери базирани на Nogo-C или Rtn 1С последователностите (Van de Velde et al., (1994) J.Cell Sci. 107, 2403-2416). Тези плазмиди са трансфектирани в COS-7 или НЕК293Т с Lipofectamine (Gibco-BRL) или FuGENE 6 (Boerhinger Mannheim) метода.

Една част от Nogo-A, кодираща 66 аминокиселинния луменален-екстрацелуларен фрагмент на Nogo-A, е амплифицирана с PCR и лигирана в pGEX-2T плазмид, за добиване прокариотен експресионен вектор за GST-Nogo слет белтък. Сходни области на Rtn1, Rtn2 и Rtn3 са амплифицирани с nested PCR, като е използувана кДНК библиотека от зрял мозък на плъх като матрица и са лигирани с pGEX-2T. E.coli трансформирани с тези плазмиди са въведени с IPTG. Разтворими, нативни GST слети белтъци са пречистени с глутатион-смола и съдържат приблизително 75% GST и 25% пълноразмерен GST-Nogo или GST-Rtn белтък. Голямата част от GST-Nogo белтък не беше екстрактируема при не-денатуриращи условия, но екстракт с 8М урея, диализиран срещу PBS съдържа повече от 98% чист GST-Nogo.

Открива се Мус имунореактивност с видим размер в 225 kDa област при редуциращи условия (данните не са представени). Така кДНК насочва експресията на белтък със съответна електрофоретична подвижност и аминокиселинната последователност, която да бъде Nogo, който е наречен човешки Nogo-A (hNogo-A).

Консервираната карбоксилна опашка на Rtn семейството белтъци, съдържа два хидрофобни домена, разделени със 66 аминокиселинен остатъчен хидрофилен сегмент. Никоя от последователностите не съдържа сигнален пептид. Предсказаната топология на тези белтъци е за амино и карбокси краищата, които се намират в цитозола, и за консервираната област за асоцииране с липидния двоен слой. Има експериментални данни за Rtn 1-А, които демонстрират, че полипетидът се проявява като интегрален мембранен белтък, и че хидрофобните сегменти на консервирания домен, са отговорни за това поведение (Van de Velde et al., (1994) J.Cell Sci. 107, 2403-2416). Myc-tagged Nogo също е свързан c партикулна фракция и се екстрахира с детергент, но не при висока йонна сила (данните не са показани).

Когато е свръх експресиран в бъбречни клетки, Rtn 1 белтъкът е локализиран първично към ендоплазматичния ретикулум (ER) във финно гранулиран вид, от тук името Reticulon (Van de Velde et al., (1994) J.Cell Sci. 107, 2403-2416). Има един ди-лизин ER ретенционен мотив при карбоксилния край на Nogo най-много Rtn белтъци (Van de Velde et al., (1994) J.Cell Sci. 107, 2403-2416;Jackson et al., (1991) EMBO J. 9, 3153-3162). При неврони, Rtn 1 е експресиран навсякъде в израстъците и е концентриран в растежните конуси (Senden et al., (1996) Eur.J.Cell Biol. 69, 197-213). Неговата локализация в трансфекгирани бъбречни клетки е довела до предположението, че Rtn 1 може да регулира белтъчното разпределение и други аспекти на ER функция (Van de Velde et al., (1994) J.Cell Sci. 107, 2403-2416). И двете А и C снадени форми на Nogo проявяват едно ретикуларно разпределение, когато са експресирани в COS-7 клетки, подобно на това на Rtn1-C.

Пример 2 - Поликлонапни антитела срещу Noqo

Предсказаната интра-мембранна топология на двата хидрофобни домена на Nogo, показва, че 66 аминокиселинните остатъци между тези сегменти, са локализирани към луменалната/екстрацелуларна повърхност на мембраната. За изследване на това по-нататък, е създаден антисерум срещу 66 аминокиселинния домен.

За получаване на антитяло и имунохистология, са получени анти-Мус имуноблотове и имунохистология с 9Е10 антитялото, както е описано в Takahashi et al., (1998) Nature Neurosci., 1, 487-493 & © Takahashi et al., (1999) Cell, 99, 59-69. GST-Nogo слетият белтък е използуван като имуноген, за създаване на анти-Nogo заешки антисерум. Антитялото е афинитетно пречистено и използувано при 3 pg/ml за имунохистология и 1 pg/ml за имуноблотове. За определяне специфичността на антисерума, е правено оцветяване в присъствието на GST-Nogo белтък при 0.1 mg/ml. За оцветяване на живи клетки, клетките са инкубирани в разреждания на първично антитяло на 4°С за един час в Hanks балансиран солеви разтвор с

0.05% BSA (говежди серум албумин) и 20 mM Na-Hepes (pH 7.3). След фиксация, свързаното антитяло е открито чрез инкубация с флуоресцентно белязани вторични антитела.

Антитялото открива ниско ниво на повърхностна експресия на този епитоп, докато Мус епитопът при карбоксилния край на експресиран Nogo не е открит, ако клетките не са пермеабилизирани. Това повърхностно оцветяване се отдава на по-малкото Nogo белтък, свързан с плазмената мембрана, отколкото ER мембраната. Тези данни подкрепят един топографски модел, където амино и карбокси краищата на белтъка се намират в цитоплазмата и 66 аминокиселина на белтъка се издават напред върху луменалната-екстрацелуларна страна на ER или плазмената мембрана.

Пример 3 - Noqo експресия в централната нервна система

Ако Nogo главно допринася за инхибиторните характеристики върху аксоналното нарастване на миелина от централната нервна система, в сравнение с PNS миелин (Caroni & Schwab, (1988) J.Cell Biol. 106, 1281-1288; Spillmann et al., (1998) J.Biol.Chem. 73, 19283-19292; Bregman et al., (1995) Nature 378, 498-501), тогава Nogo трябва да бъде експресиран в зрелия ЦНС миелин, но не в PNS миелин. Проведен е Northern blot анализ на Nogo експресия, като са използувани сонди произхождащи от 5’-Нодо-А/В-сепцифична област и от 3’Nogo обща област на кДНК. Открита е единична ивица от около 4.1 килобази с 5’ сонда в проби от тотална РНК от зрял оптичен нерв на плъх, но не в проби от седалищен нерв. Резултатите показват, че Nogo-А-клонът е пълноразмерна кДНК и са в съответствие с ролята на Nogo като инхибитор на ЦНС-миелинспецифично аксонално нарастване. Northern blot анализ с 3’ сонда, разкрива, че зрителният нерв експресира високи нива на Nogo-A мРНК и доста по-ниски нива на Nogo-B и Nogo-C. Цял мозък експресира^ двата - Nogo-A и Nogo-C, но известен брой периферни тъкани (включително седалищен нерв) експресират малко или никак Nogo. Nogo-C/Rtn 4-С експресия е демонстрирана в скелетен мускул и адипоцити, както и в мозък (Morris et al., (1991) Biochim.Biophys.Acta 1450, 68-76). В рамките на Rtn семейството, експресия на зрителния нерв изглежда, че е селективна за Nogo, с не откриваема експресия на Rtn1 или Rtn 3. Rtn 2 не е изследван.

In situ хибридизация разкрива Nogo мРНК в клетки с морфология на олигодендроцити в зрял плъши зрителен нерв и пирамиден път. В рамките на мозъка, Nogo експресия също е открита в някои невронални популации. За разлика от Nogo, Rtn 1 и Rtn 3 не са експресирани в зрителен нерв, но мРНК е открита в някои невронални популации. Анализирана е локализация на Nogo белтък в култури от гръбначен мозък, третирани с PDGF и ниски концентрации серум, за индуциране диференциация на олигодендроцити, като е използувано анти-Nogo антитяло и олигодендроцит-специфично 04 моноклонално антитяло. В живи клетки, луменално-екстрацелуларната 66 аминокиселинна примка на Nogo и 04 антигенът са открити по повърхността на олигодендроцити. Приблизително половината от 04-положителните клетки в тези култури проявяват Nogo повърхностно оцветяване.

Пример 4 - Nooo-медииран колапс на растежния конус

За всички експерименти включващи клетъчна култура, са използувани следните методи. Културата от експланти на ембрионален пилешки Е10 и Е12 дорзален коренчев ганглий и дисоциирани неврони използува методите описани за култури от Е7 дорзален коренчев ганглий (Takahashi et al., (1998) Nature Neurosci. 1, 487-493; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69; Goshima et al., (1995)Nature 376, 509-514; Jin & Strittmatter, (1997) J.Neurosci. 7, 62566263). NGF-диференцирани PC12 клетки са култивирани както е описано (Strittmatter et al., (1994) J.Neurosci. 14, 2327-2338). Експланти от ембрионален гръбначен мозък (плъши Е10 или пилешки Е5) са култивирани за 7-14 дни в присъствието на PDGF-AA, за индуциране диференциация на някои клетки в зрели олигодендроцити (Vartanian et al., (1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 731-735). Процедурата за тестове c колапс на растежен конус е идентична с тази за анализ на ЗетаЗА-индуциран колапс на растежен конус (Takahashi et al., (1998) Nature Neurosci. 1, 487-493; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69; Goshima et al., (1995) Nature 376, 509-514; Jin & Strittmatter, (1997) J.Neurosci. 17, 6256-6263). Описан е също метод за анализ на тотално невритно нарастване (Goshima et al., (1995) Nature 376, 509-514; Jin & Strittmatter, (1997) J.Neurosci. 17, 6256-6263; Strittmatter et al., (1994) J.Neurosci. 14, 2327-2338). При тестове за нарастване, белтъци и пептиди са добавяни един час след посявка за минимализиране всякакъв ефект върху общия брой адхерирани клетки. За тестиране ефекта на свързания със субстрат GST или GST-Nogo, белтъчните разтвори са изсушавани върху поли-1_-лизин покрито стъкло, измивани са и след това са покрити с ламинин. За Е12 култури, невроналната идентичност на клетките е верифицирана чрез оцветяване с анти-неврофиламент антитела (2НЗ, Developmental Studies Hybridoma Bank) и неврити са трасирани чрез наблюдение на родамин-фалоидин оцветяване на F-актин в израстъци.

Експресията на рекомбинантен Nogo в НЕК293Т позволява един точен тест за това дали този белтък има инхибиторни ефекти върху нарастването на аксона. Измити мембранни фракции от векгорили hNogo-A-Myc- трансфектирани НЕК293Т клетки са добавени към култури от експланти на пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий. Морфологията на растежния конус е определяна след тридесет минути инкубация на 37°С чрез фиксация и родамин-фалоидин оцветяване.

Контролни НЕК мембрани нямат откриваем ефект върху морфологията на растежния конус. Nogo-съдържащи мембранни фракции индуцират колапс на голямата част растежни конуси от дорзален коренчев ганглий. Този колапс на растежния конус показва инхибиторна активност върху аксоналното нарастване и Nogo инхибиране на аксоналното нарастване също може да бъде демонстрирано (виж по-долу). Nogo-C формата също проявява колабираща активност, което показва, че срязаният карбоксилен край на белтъка, включващ хидрофобните сегменти и 66 аминокиселинният луменален-екстрацелуларен домен, съдържа функционално важни остатъци. От тези проучвания не се изключва допълнителна инхибиторна активност в амино терминалната област на Nogo-A. Чувствителността на по-незрели култури от експланти на Е12 пилешки ембриони или от Е15 плъши ембриони (данните не са представени) е значително по-малка. Регулацията на чувствителността по време на развитието е в съответствие с експерименти използуващи частично пречистен Nogo (Bandtlow et al., (1997) Eur.J.Neurosci. 9, 2743-2752).

В рамките на растежен конус колабиращия Nogo-C белтък, хидрофилният 66 луменален-екстрацелуларен домен изглежда повероятно да реагира с повърхността на неврони на дорзален коренчев ганглий, отколкото с мембранно-вкпючени хидрофобни домени. За тестиране на тази хипотеза, 66 амиинокиселинната област на hNogo е експресирана във и пречистена от E.coli. Голямата част от GST-Nogo слетият белтък акумулира във включващи телца, но може да бъде отделен чрез екстракция с урея. Тази ограничена област на Nogo притежава мощна (ECso = 50 пМ) растежен конус колабираща активност за неврони от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий (данните не са представени). Екстрахираният с урея белтъчен препарат изглежда, че представлява само малка фракция от Nogo последователността в една активна конформация. Следователно, 10% от GST-Nogo, който е разтворим в Е.co//, е пречистен с помощта на глутатион-Сефарозна смола. Този препарат е дори по-мощен отколкото урея-екстрахираният белтък като колабиращ фактор, остро променяйки морфологията на растежния конус при ниски концентрации като 1пМ.

Наномоларната мощност може да се сравнява с повечето известни физиологични регулатори на аксоналното насочване. Нарастване на аксон от неврони на дорзапен коренчев ганглий и NGF-диференцирани PC 12 клетки, също е блокирано с този разтворим GST-Nogo белтък в пМ концентрации (данни не са представени). Когато GST-Nogo е свързан със субстратни повърхности, аксоналното нарастване от неврони на дорзален коренчев ганглий или PC 12 клетки е редуцирано до неоткриваеми нива. Това са селективни ефекти върху аксоналното нарастване повече, отколкото клетъчно преживяване, тъй като GST-Nogo не намалява броя на неврофиламент-положителни адхерентни клетки (137 + 24% на GST-третирани култури), нито променя значимо броя на апоптични ядра, идентифицирани с DAPI оцветяване (4.0 + 1.7% в контролни култури и 5.2 + 1.1% в GST-Nogo- третирани видове).

Олигодендроцити изглежда експресират Nogo селективно измежду Rtn белтъците. За изследване селекгивността на Nogo ролята при инхибирането на аксонална регенерация, е разгледана инхибиращата активност върху аксоналното нарастване на други Rtn белтъци. Предвидените луменални-екстрацелуларни 66 аминокиселинни фрагменти на Rtn 1, Rtn 2 и Rtn 3, са експресирани като GST слети белтъци и са пречистени в нативна форма. С концентрации, при които Nogo фрагмент колабира по-голямата част от растежните конуси на Е12 дорзален коренчев ганглий, другите Rtn белтъци не променят морфологията на растежните конуси (данните не са представени). Така, инхибираща активност върху аксоналната регенерация е специфична за Nogo в Rtn семейството.

Пример 5 - Noqo рецепторни пептидни агенти

За по-нататъшно определяне активния домен на Nogo, са синтезирани 25 аминокиселинни остатъчни пептиди, съответствуващи на сегменти на 66 аминокиселинната последователност. Пептидът съответсгвуващ на остатъци 31-55 на извън клетъчния фрагмент на Nogo проявява колабиране на растежния конус (Фигура 2) и инхибиращи активности върху нарастването (данни не са представени) при концентрации 4μΜ. Докато тази последователност може да предостави сърцевината на инхибиторния домен, ясно е, че 66 аминокиселинният фрагмент е необходим за пълна мощност. Интересно е, че това е областта в 66 аминокиселинния домен, споделяща най-малко сходство с други Rtn белтъци, което е в съответствие с други членове на семейството, които са неактивни като инхибитори на аксоналната регенерация. Наистина, Rtn 1 31-55 аминокиселинния луменален-екстрацелуларен пептид, не упражнява колабираща активност върху растежния конус (данни не са представени).

Гореспоменатите експериментални данни идентифицират Nogo като олигодендроцит-специфичен член на Rtn семейството и демонстрират, че дискретен домен от Nogo може да инхибира аксоналното нарастване. Други Rtn белтъци не притежават тази активност. Експресията на Nogo в олигодендроцити, но не в Шванови клетки, следователно допринася за неуспеха на аксонална регенерация в зрялата ЦНС на бозайници, в сравнение със зрялата PNS. Относителният принос на Nogo в сравнение с други миелинови компоненти на ЦНС за не-разрешаващата природа на бялото вещество на ЦНС, може понастоящем да бъде характеризиран на молекулно ниво.

Докато текущите експериментални данни са в съответствие с ролята на Nogo при блокиране аксоналната ргенерация на зряла ЦНС след патологично увреждане, това може също да бъде свързано с физиологичната роля на Nogo при не-патологични състояния. Въз основа на локализационни проучвания, се счита, че други Rtn белтъци играят известна роля в ER функция (Van de Velde et al., (1994) J.Cell. Sci. 107, 2403-2416). Една голяма част от Nogo е разпределена в ретикуларен вид в COS-7 клетки и само малка част изглежда е достъпна на клетъчната повърхност.

П ример 6 - Инхибиране на Noqo активност

Предишните примери показаха, че една 66 аминоксиселинна област близо до карбоксилния край на Nogo инхибира аксоналното нарастване и се експресира по клетъчната повърхност. По-къси 25 аминокиселинни сегменти на този домен, са или инертни като инхибитори на нарастването или са с по-ниска потентност (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444). Областта 31-55 от този 66 аминокиселинен сегмент има слаба инхибиторна активност върху колапса на растежния конус и аксоналното нарастване. За блокиране Nogo действието in vivo, силно желан би бил един конкурентен антагонист на Nogo, който се свързва специфично със същото рецепторно място, но не упражнява биологичен ефект. Тестирани са различни фрагменти на 66 аминокиселинната област, като блокери на Nogo-медиирано инхибиране на аксонапния растеж. За тази цел са използувани два теста. Първият е тест за колапс на растежния конус и вторият е свързващ тест.

При теста за колапс на растежния конус, отговорът спрямо Nogo е измерван в присъствие на различни потенциални антагонистични пептиди. Три до двадесет и пет аминокиселинни пептиди (1-25, 11-35 и 21-45) от 66 аминокиселинната област, притежават блокираща активност в μΜ концентрации (Фигура 2). Комбинацията от всичките три пептиди не променя морфологията на растежния конус при изходни условия, но напълно предотвратява колапс при 15 пМ GST-Nogo. Същата смес от пептиди също е способна да блокира индуциран с ниска доза ЦНС миелин колапс на растежен конус. Тази блокада подкрепя хипотезата, че Nogo е първичен инхибиторен компонент на ЦНС миелин. По-нататък, блокадата има свойства, които се очакват за конкурентен антагонизъм, бидейки неефективни при високи дози миелин на ЦНС.

За да се създаде един антагонист с висока специфичност и потентност, е тестиран един по-дълъг фрагмент от Nogo. Предпочитано, такъв пептид сам по себе си няма инхибиторна активност върху аксоналното нарастване, докато конкурентно блокира Nogo действие. Фрагментът 2-41 от Nogo е ацетилиран при карбоксилния край и амидиран при амино края и е с най-високата мощност блокатор на Nogo, определена до момента. Рер2-41 отменя GST-Nogo-индуциран колапс на растежен конус и притежава видим К, от 150пМ в свързващия тест (Фигура 3). Фрагментът 2-41 също блокира способността на пречистен Nogo-66 белтък и суров миелин от ЦНС да инхибират невритно нарастване при култивирани неврони (Фигура 4).

Пример 7 - Идентифициране на Νοοο рецептор

Създаден е Nogo свързващ тест, който използува метод, широко прилаган при изследване аксоналната носочваща функция на semaphorin и ephrin (Flanagan & Vanderhaeghen, (1998) Annu.Rev. Neurosci. 21, 309-345; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69). Той включва сливане на секретирана единица алкална фосфатаза (АР) от плацента с въпросния лиганд, за предоставяне на биологично активен рецептор свързващ агент, който може да бъде откриван с изключително чувствителен колориметричен метод. За Nogo е създаден експресионен вектор, кодиращ сигнален пептид, един His6 tag за пречистване, АР и 66 аминокиселинния активен домен на Nogo. Слетият белтък може да бъде пречистен от кондиционираната среда на трансфектирани клетки в количества от милиграми (Фигура 5). Този белтък е биологично активен като растежен конус колабиращ агент, с ECso от 1пМ. AP-Nogo в действителност е малко по-потентен от GST-Nogo, вероятно поради това, че белтъкът е синтезиран в еукариотна а не в прокариотна клетка. Начални проучвания са разкрили насищащи се, високо афинитетни места по аксони. Свързване е блокирано с GST-Nogo и с антагонистичните 25 аминокиселинни пептиди, което съответствува на конкурентно свързване с невронално рецепторно място. Тъй като видимата Ка (3 пМ) за тези места е близка до ЕС50 на AP-Nogo в колабиращия тест, вероятно е местата да са физиологично съответни на Nogo рецептори.

Този тест е използуван за експресионно клониране на Nogo рецептор. Пулове от кДНК експресионна библиотека от миши зрял мозък, представляваща 250,000 независими клона, са трансфектирани в не-невронални COS-7 клетки. Не-трансфекгирани COS-7 клетки не свързват AP-Nogo, но трасфекгиране с два пула от 5,000 клона, изявява няколко клетки със силно AP-Nogo свързване. Единични кДНК клнове, кодиращи едно Nogo свързващо място, са изолирани със sib-селекция от всеки от двата положителни пула. Двата независимо изолирани клона са идентични един на друг, с изключение за едно удължение от 100 базови на 5’ нетранслираната област в един клон. Трансфекгиране на тези клонове в COS-7 клетки води до едно свързващо място с афинитет за AP-Nogo, идентично с това, наблюдавано при неврони на Е13 дорзален коренчев ганглий;

Kd за свързване е около ЗпМ (Фигура 6). АР сама не се свързва с откриваем афинитет с тези трансфекгирани клетки, което показва, че афинитетът се дължи на 66 аминокиселина произходаща от Nogo. Понататък, GST-Nogo измества AP-Nogo от тези места.

Тази кДНК кодира един нов 473 аминокиселинен белтък. Не е съобщена кДНК със значима хомология в GenBank. Предсказаният белтък съдържа един сигнален пептид, последван от осем богати на левцин повторни области, един уникален домен и едно предсказано GPI закрепващо място (Фигура 7). Идентифициран е един човешки хомолог на миша кДНК, който споделя 89% аминокиселинна идентичност. Съществуването на тази кДНК е предсказано от структурата на миша кДНК и анализ на човешка геномна последователност, депозирана в GenBank като част от Human Sequencing Project. Екзоните на човешката кДНК са разпределени върху 35 килобази и кДНК не е предварително разпозната в геномната последователност. Белтъчната структура е в съответствие с един белтък на клетъчната повърхност, способен да свързва Nogo. GPI-свързаната природа на белтъка подсказва, че трябва да има втора рецепторна субединица, която се простира върху плазмената мембрана и медиира Nogo сигнално предаване.

Пример 8 - Тъканно разпределение на Noqo рецептор

Разпределението на мРНК за този Nogo рецептор е в съответствие с известна роля на този белтък при регулиране аксонапна регенерация и пластичност в зрялата ЦНС. Northern анализ показва единична ивица от 2.3 килобази в зрелия мозък, което показва, че изолираният Nogo рецепторен клон е пълноразмерен (Фигура 8). Ниски нива от тази мРНК са наблюдавани в сърце и бъбреци, но не и в други периферни тъкани. В мозъка, експресията е широко разпространена и тези области, които са най-богати в сивото вещество, експресират най-високите нива мРНК.

Пример 9 - Биологични ефекти на различни Nogo домени

Тестове за Nogo-A функция включват колапс на растежен конус, невритно нарастване и фибробластно разпространение, със субстратно свързани и разтворими белтъчни препарати (Caroni & Schwab, (1988) J.Cell Biol. 106, 1281-1288; GrandPre et al., (2000) Nature 403,439-444; Chen et al., (2000) Nature 403, 434-439; Prinjha et al., (2000) Nature 403, 483-484). В тестове за ЗТЗ фибробластна © морфология, субстратно свързан Nogo-66 не инхибира разстилане (Фигура 1 Ь,е). Тъй като NI260 препарати и пълноразмерен Nogo-A са не-разрешаващи за ЗТЗ разстилане, необходимо е да се разгледа дали различни домени на Nogo могат да съдействуват за тази in vitro активност. За да се улесни едно сравнение на различни Nogo-A домени, киселинния амино терминален 1040 аминокиселинен фрагмент (амино-Nogo) е експресиран като Myc-his tagged белтък в НЕК293Т клетки (Фигура 1d). Nogo белтък присъствува в цитозолни фракции. Повърхности покрити с пречистен амино-Nogo белтък не допринасят за ЗТЗ фибробластно разстилане (Фигура 1 Ь,е). Сходни © резултати са наблюдавани за произхождаща от бъбрек клетъчна линия, COS-7 (Фигура 1f). Следователно, амино терминалният домен изглежда отговаря за ефектите на пълноразмерния Nogo-A върху фибробласти. Nogo-66 доменът е специфичен за неврони; той не повлиява не-невронални клетки.

Култури от дорзален коренчев ганглий също са излагани на амино-Nogo белтък (Фигура 1с,д-1). Както за ЗТЗ фибробласти, фибробласт-подобните клетки в култура на дорзален коренчев ганглий, не се разстилат върху този субстрат. По-нататък, аксонапно нарастване е редуцирано до ниски нива върху амино-Nogo покрити

повърхности. Така, докато Nogo-66 ефектите са невралноспецифични, инхибиторното действие на амино-Nogo доменът е погенерализирано. Когато е представен в разтворима форма при 100 пМ, Nogo-66 полипептидът колабира растежни конуси от пилешки Е12 дорзален коренчев ганглий и почти премахва аксоналното удължаване, както е описано по-горе (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444). Подчертано различно, разтворимият амино-Nogo белтък изглежда неактивен и не модулира значимо морфологията на растежните конуси на дорзален коренчев ганглий или аксонално удължаване на дорзален коренчев ганглий или не-невронално клетъчно разстилане (Фигура 1 c,g-i).

В експерименти на Walsh и колеги (Prinjha et al., (2000) Nature 403,483-484), са изследвани церебеларни грануларни неврони и разтворим амино-Nogo е представен като Fc слет белтък, вероятно в димерна форма. Следователно, необходимо е да се разглежда дали тези разлики могат да обяснят неакгивността на разтворимия амино-Nogo. Миши Р4 церебеларни грануларни неврони отговарят на Nogo препарати по начин неразличим от неврони от пилешки Е13 дорзален коренчев ганглий (Фигура 1i). Амино-Nogo димеризирано с анти-Мус антитяло, инхибира ЗТЗ и COS-7 разстилане (Фигура 1 e,f) и има тенденция да редуцира церебеларното аксонално нарастване (Фигура 1i). По-нататък, агрегирано чрез добавка на анти-мишо IgG антитяло, амино-Nogo значимо редуцира дорзален коренчев ганглий и церебеларно аксонално нарастване (Фигура 1h,i). Докато аминоNogo белтъкът е съвсем киселинен, електростатичният заряд самостоятелно не отговаря за инхибиторните ефекти, тъй като полиAsp не променя клетъчното разстилане или аксоналното нарастване (Фигура 1е, f, h). Така, Nogo-66 доменът е мощен и невронспецифичен инхибитор, докато вътреклетъчният амино-Nogo домен инхибира множествени клетъчни типове и изглежда функционира само в агрегирано състояние.

Пример 10 - Локализация на Nogo рецептор

За по-нататъшно характеризиране експресията на Nogo-66 рецепторен белтък е създаден антисерум срещу GST-Nogo рецепторен слет белтък. Този антисерум открива един 85 kDa белтък селективно в Nogo-66 рецептор-експресиращи НЕК293Т клетки (Фигура 9а), и специфично оцветява COS-7 клетки, експресиращи Nogo-66 рецептор (Фигура 9Ь). Имунохистологично оцветяване на култури от пилешки ембрионален гръбначен мозък, локализира белтъка в аксони, в съответствие с медииране на Nogo-66индуцирано инхибиране на аксонално нарастване. Nogo-66 рецепторна експресия не е открита в О4-положителни олигодендроцити, които експресират Nogo-66. Имунореакгивен 85 kDa белтък е експресиран в Nogo-66-отговарящи невронални препарати от пилешки E13 дорзален коренчев ганглий, но в по-малка степен в слабо реагираща тъкан от пилешки E13 дорзален коренчев ганглий и пилешка E7 ретина (Фигура 9а). Общо, картината на Nogo66 експресията е съответна с белтъка медииращ Nogo-66 аксонално инхибиране.

Това антитяло също е ефективно при локализация на Nogo66 рецепторен белтък в тъканни срези (Фигура 9с). Тъй като е ясно от проучвания с in situ хибридизация, че белтъкът е експресиран в множество класове неврони, имунохистология разкрива белтъка във високи нива в бялото вещество на ЦНС, в профили съответствуващи на аксони. Белтък е откриваем в ниски нива в невронапното тяло и невропила. Това осигурява по-нататъшна подкрепа за предлаганата функция на този белтък при медииране взаимодействия с олигодендроцити.

Пример 11 - Nogo рецептор медиира Nogo-66 отговори

Nogo-66 рецепторният белтък е необходим за Nogo-66 действие и не просто едно свързващо място с функция, която не е свързана с инхибиране на аксоналното нарастване. Първо предсказване е, че третиране с фосфоинозитол специфичнафосфолипаза С (PI-PLC) за отстраняване на гликофосфатидилинозитол (СР1)-свързани белтъци от невроналната повърхност, би направило невроните нечувствителни спрямо Nogo-66. Това предсказване е вярно за неврони от пилешки Е13 дорзален коренчев ганглий; PI-PLC третиране премахва AP-Nogo свързване и GST-Nogo66-индуциран колапс на растежни конуси (Фигура 10 а-с). Като контрола, Sema3A отговори в паралелни култури не са променени от PI-PLC третиране. Разбира се, PI-PLC третиране се очаква да отстрани известен брой белтъци от аксоналната повърхност, така този резултат остава отворена възможността, че други GPI-свързани белтъци медиират Nogo-66 отговора в нетретирани култури.

За да се демонстрира, че Nogo-66 рецепторът е способен да медиира Nogo-66 инхибиране на аксоналното нарастване, белтъкът е експресиран в неврони, у които липсва Nogo-66 отговор. Изследвани са дорзален коренчев ганглий и ретинални неврони от Е7 пилешки ембриони. Nogo отговорите при неврони на дорзален коренчев ганглий на този етап от развитието, са слаби, но слаби отговори могат да бъдат открити в някои култури (данни не са представени). Растежни конуси на Е7 ретинални ганглийни клетки са равномерно нечувствителни спрямо Nogo-66-индуциран колапс на растежни конуси (Фигура 10е), не свързват AP-Nogo (данни не са представени) и не проявяват 85kDa анти-№до-66 рецепторен имунореакгивен белтък (Фигура 9а). Експресия на NgR в тези неврони чрез инфекция с рекомбинантни HSV препарати, прави растежните конуси на ретинална ганглийна клетка чувствителни на Nogo-66-индуциран колапс. Инфектиране с контролен PlexinAI-експресиращ HSV препарат, не променя Nogo отговорите. Взети заедно, тези данни показват, че Nogo рецепторът идентифициран тук, участвува в Nogo66 инхибиране на аксонална регенерация.

Пример 12 - Структурен анализ на Noqo-66 рецептор

Nogo-66 рецепторната структура е изследвана за определяне кои области медиират Nogo-66 свързване. Белтъкът просто е разделен на левцин богат повтор и на не-левцин богата повторна област. Анализи с делеция ясно показват, че левцинбогатите повтори са необходими за Nogo-66 свързване, но останалият белтък не е необходим (Фигура 11). В рамките на левцин богатия повтор, два домена поотделно са делетирани. Това е предвидено да подържа общата структура на домена на левцин богатия повтор и подобен подход е използуван за леутропин (leutropin) рецептор. Видимо е, че Nogo-66 свързването изисква всичките осем богати на левцин повтори и насочва, за един значим сегмент на планарната повърхност, създаден от линейни бета ивици на богати на левцин повтори. Богатите на левцин повтор-амино крайни и богатите на левцин повтор-карбокси крайни консервирани, богати на цистеин области, при всеки край на богатите на левцин повтори, също са необходими за Nogo-66 свързване, вероятно те са необходими да създават съответна конформация на богат на левцин повтор.

Пример 13 - Блокада на Νοοο с разтворим Νοοο рецепторен екгодомен белтък

Един метод за блокиране каскада на сигнално предаване, инициирана от Nogo-66 свързване с Nogo рецептора, е да осигури излишък на разтворим екгодомен на рецептора. Секретиран фрагмент на Nogo рецепторния белтък е получен от НЕК293Т клетки. кДНК кодиращите аминокиселинни остатъци 1-348 на мишия Nogo рецептор са лигирани в еукариотен експресионен вектор и ДНК е трансфекгирана в НЕК293Т клетки. Кондиционирана среда от тези клетки съдържа високи нива на този Nogo рецепторен фрагмент (NgR-ecto), както е демонстрирано с имуноблотове с едно анти-NgR антитяло. Кондиционираната среда съдържа приблизително 1mg NgR-ecto белтък в литър. При AP-Nogo свързващия тест за COS-7 клетки, експресиращи пълноразмерен Nogo рецептор или за неврони © на дорзален коренчев ганглий, добавката на NgR-ecto кондиционирана среда, намалява свързването на 0.5 пМ AP-Nogo-66 с 80%. Комплексна формация между разтворим NgR-ecto и Nogo-66 предотвратява свързване с рецептори по клетъчната повърхност.

За някои рецепторни системи, такива комплекси на разтворим рецепторен лиганд, могат да блокират сигнализирането чрез създаване на неефективно взаимодействие. Например, разтворимият ектодомен на Тгк служи да блокира невротрофиновото сигнализиране и усилено е използуван за тази цел (Shelton et al., (1995) J.Neurosci. 15m 477-491). Алтернативно, Nogo-66/NgR-ecto © разтворимият комплекс може да се свързва със и да стимулира вероятна втора трансмембранна Nogo рецепторна субединица. Има предимство за този тип ефект от проучвания на GDNF семейство рецептори (Cacalano et al., (1998) Neuron 21, 53-62). Nogo-66/NgR-ecto комплексът не предизвиква колапс на растежни конуси в тези неврони (пилешки Е7 ретинапни ганглийни клетки), които нямат Nogo-66 рецептора, но съдържат други компоненти на Nogo сигналния път. Това показва, че NgR-ecto функционира като блокер на Nogo-66 сигнализирането.

В директни тестове, NgR-ecto белтъкът протектира аксони от инхибиторните ефекти на Nogo-66. NgR-ecto предотвратява Nogo-66индуциран колапс на растежни конуси и блокира Nogo-66-индуцирано инхибиране на невритно нарастване в пилешки Е13 DRG неврони (Фигура 12). По-нататък, наличието на NgR-ecto белтък, блокира способността на миелин на ЦНС да инхибира аксонално нарастване in vitro (Фигура 12). Тези данни демонстрират, че NgR-ecto белтък може да стимулира аксонална регенерация in vivo.

Въпреки че настоящето изобретение е описано в детайли с цитати към примерите по-горе, разбираемо е, че различни модификации могат да бъдат направени без да се излиза от духа на изобретението. Съответно, изобретението е ограничено само от следните претенции. Всички цитирани патенти и публикации, свързани с тази заявка са включени тук чрез цитат в тяхната цялост. Резултатите на част от експериментите представени тук, могат да бъдат публикувани (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444) след датата на представяне на U.S. Provisional Application 60/175,707, от което тази заявка претендира за приоритет, тази публикация е включена тук чрез цитат в нейната цялост.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, включващ аминокиселинни остатъци, кодиращи една богата на левцин повтор-амино крайна, консервирана богата на цистеин област (LRRNT), богати на левцин повтори и богата на левцин повтор-карбокси крайна, консервирана богата на цистеин област (LRRCT) на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0: 4; и където полипетидът не притежава един уникален домен 3’ към LRRCT областта и 5’ към GPI домена на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.
2. Нуклеинова киселина съгласно претенция 1, където кодираният полипептид съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.
3. Нуклеинова киселина съгласно претенция 1, където кодираният полипептид съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени.
4. Нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, включващ аминокиселинни остатъци с най-малко деветдесет и пет процента идентичност на амиинокиселинната последователност с тази на кодиран пептид съгласно претенция 1.
5. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид включващ аминокиселинни остатъци на SEQ ID N0:2 или SEQ ID

N0:4, не придружени от сигнален пептид на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; и където полипептидът не притежава един уникален домен 3’ към аминокиселина 348 и 5' към GPI домен на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.
6.

Нуклеинова киселина съгласно кодираният пептид съдържа претенция 5, където

1-20 консервативни аминокиселинни замени.

Нуклеинова киселина съгласно претенция 5, където кодираният полипептид съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени.
8. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, включващ аминокиселинни остатъци с най-малко деветдесет и пет процента идентичност на аминокиселинната последователност с тази на кодиран полипептид съгласно претенция 5.
9. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, включващ аминокиселинни остатъци 1-348 на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; и където полипептидът не съдържа уникален домен 3’ към аминокиселина 348 и 5’ към GPI домен на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.
10. Нуклеинова киселина съгласно претенция 9, където кодираният полипептид съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.
11. Нуклеинова киселина съгласно претенция 9, където кодираният полипептид съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени.
12. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид включващ аминокиселинни остатъци с най-малко деветдесет и пет процента идентичност на аминокиселинната последователност с тази на кодиран полипептид, съгласно претенция 9.
13. Нуклеинова киселина съгласно претенция 9, където кодираният полипептид включва аминокиселинни остатъци

1-348 на SEQ ID N0:2.
14. Нуклеинова киселина съгласно претенция 9, където кодираният полипептид включва аминокиселинни остатъци

1-348 на SEQ ID N0:4
15. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид състоящ се от аминокиселинни остатъци кодиращи една LRRNT област, богати на левцин повтори и LRRCT област на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.
16. Нуклеинова киселина съгласно претенция 15, кьдето кодираният полипептид съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.
17. Нуклеинова киселина съгласно претенция 15, където кодираният полипептид съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени.
18. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност кодираща полипептид, включващ аминокиселинни остатъци с най-малко деветдесет и пет процента идентичност на аминокиселинната последователност с тази на кодиран полипептид, съгласно претенция 15.
19. Нуклеинова киселина съгласно всяка от претенции 1 до 18, където споменатата нуклеинова киселина е оперативно свързана с един или повече контролни елементи на експресията.
20. Вектор съдържащ нуклеинова киселина, съгласно всяка от претенции 1 до 19.
21. Клетка съдържаща нуклеинова киселина, съгласно всяка от претенции 1 до 19.
22. Клетка съдържаща вектор, съгласно претенция 20.
23. Метод за получаване полипептид, характеризиращ се с това, че има етап за култивиране на клетка, съдържаща нуклеинова киселина, съгласно всяка от претенции 1 до 19, в условия, при които белтъкът кодиран от споменатата нуклеинова киселина е експресиран.
24. Полипептид получен с метода съгласно претенция 23.
25. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци, кодиращи една LRRNT област, богати на левцин повтори и LRRCT област на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; и където полипептидат не притежава уникален 3’ домен към LRRCT областта и 5’ на GPI домен на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.
26. Полипептид съгласно претенция 25, където полипептидът съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.
27. Полипептид съгласно претенция 25, където полипептидът съдържа 1-20 естествено срещащаи се аминокиселинни замени.
28. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци с наймалко деветдесет и пет процента идентичност на последователността с тази на полипептид съгласно претенция 25.
29. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци на SEQ ID N0:2 или DEQ ID N0:4, не придружен от сигнален пептид на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; и където полипептидът не притежава уникален домен 3’ при аминокиселина 348 и 5’ при GPI домен на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.
30. Полипептид съгласно претенция 29, където полипептидът съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.

31. Полипептид съгласно претенция 29, където полипептидът съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени. 32. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци с наймалко деветдесет и пет процента идентичност на последователността с полипептид съгласно претенция 29. 33. • Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 1-348 на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; където полипептидът не притежава уникален домен 3’ при аминокиселина 348 и 5’ при един GPI домен на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4. 34. Полипептид съгласно претенция 33, където полипептидът съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени. 35. Полипептид съгласно претенция 33, където полипептидът съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени. © 36. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци с наймалко деветдесет и пет процента идентичност на последователността с тази на полипептид съгласно претенция 33. 37. Полипептид съгласно претенция 33, където полипептидът съдържа аминокиселинни остатъци 1-348 на SEQ ID N0:2. 38. Полипептид съгласно претенция 33, където полипептидът съдържа аминокиселинни остатъци 1-348 на SEQ ID N0:4.

39. Полипептид състоящ се от LRRNT област, богати на левцин повтори и една LRRCT област на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4. 40. Полипептид съгласно претенция 39, където полипептидът съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени. 41. • Полипептид съгласно претенция 39, където полипептидът съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселиинни замени. 42. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци с наймалко деветдесет и пет процента идентичност на последователността с тази на полипептид, съгласно претенция 39. 43. Химерен полипептид съдържащ един полипептид, съгласно всяка една от претенции 24 до 42. ^W 44. Фармацевтичен състав съдържащ полипептид, съгласно всяка една от претенции 24 до 42. 45. Антитяло, което се свързва с полипептид, съгласно всяка една от претенции 24 до 42. 46. Трансгенно животно, което не е човек, съдържащо нуклеинова киселина съгласно всяка една от претенции 1 до 19.

47. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид включващ аминокиселинни остатъци на SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20.

48. Нуклеинова киселина съгласно претенция 47, където кодираният полипептид съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.

49. Нуклеинова киселина съгласно претенция 47, където кодираният полипептид съдържа 1-20 естествено срещащи се аминокиселинни замени.

50. Нуклеинова киселина съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид включващ аминокиселинни остатъци с най-малко деветдесет и пет процента идентичност на последователността с тази на кодиран полипептид, съгласно претенция 47; и където кодираният полипептид модулира Nogo-медиирано инхибиране на аксоналния растеж.

51. Нуклеинова киселина съгласно претенция 47, 48, 49 или 50, където споменатата нуклеинова киселина е оперативно свързана с един или повече контролни елементи на експресията.

52. Вектор съдържащ нуклеинова киселина, съгласно всяка от претенции 47 до 51.

53. Клетка съдържаща нуклеинова киселина, съгласно всяка една от претенции 47 до 51.

54. Клетка съдържаща вектор, съгласно претенция 52.

55. Метод за получаване на полипептид характеризиращ се с това, че включва етап на култивиране на клетка, съдържаща нуклеинова киселина, съгласно всяка една от претенции 47 до 51 в условия, при които белтъкът кодиран от споменатата нуклеинова киселина е експресиран.

56. Полипептид получен с метода, съгласно претенция 55.

57. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци на SEQ ID N0:8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20.

58. Полипептид съгласно претенция 57, където полипептидът съдържа 1-20 консервативни аминокиселинни замени.

59. Полипептид съгласно претенция 57, където полипептидът съдържа 1-20 естествено срещащи се замени на аминокиселинната последователност.

60. Полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци с наймалко деветдесет и пет процента идентичност на последователността с тази на полипептид, съгласно претенция 57; и където полипептидът модулира Nogoмедиирано инхибиране на аксоналния растеж.

61. Химерен полипептид съдържащ един полипептид, съгласно всяка една от претенции 56 до 60.

62. Фармацевтичен състав съдържащ полипептид, съгласно всяка една от претенции 56 до 60.

63. Антитяло, което се свързва с полипептид, съгласно всяка една от претенции 56 до 60.

64. Трансгенно животно, което не е човек, съдържащо нуклеинова киселина, съгласно всяка една от претенции 47 до 51.

65. Метод за идентифициране на агент, който модулира Nogo експресия или Nogo рецепторна експресия, характеризиращ се с това, че включва етапите на:

(a) предоставяне на клетка експресираща Nogo или Nogo рецептор;

(b) поставяне на клетката в контакт с кандидат агент; и (c) откриване повишение или намаление в нивото на Nogo експресия или Nogo рецепторна експресия в присъствието на кандидат агент, в сравнение с нивото на Nogo или Nogo рецепторна експресия в отсъствието на кандидат агента.

66. Метод за идентифициране агент, който модулира Nogoмедиирано инхибиране на аксонапния растеж, хактеризиращ се с това, че включва етапите на:

(a) предоставяне на клетка съдържаща Nogo белтък или клетка съдържаща Nogo рецепторен белтък;

(b) поставяне на клетката в контакт с кандидат агент; и (c) откриване повишение или намаление в нивото на Nogoмедиирано инхибиране на аксоналния растеж в присъствието на кандидат агента, в сравнение с нивото на Nogo-медиирано инхибиране на аксоналния растеж в отсъствието на кандидат агента.

67. Метод за модулиране Nogo-медиирано инхибиране на аксоналния растеж характеризиращ се с това, че неврон се поставя в контакт с ефективно количество полипептид съгласно всяка една от претенции 24 до 43.

68. Метод за модулиране Nogo-медиирано инхибиране на аксонален растеж, характеризиращ се с това, че неврон се поставя в контакт с ефективно количество (а) антитяло, което се свързва с полипептид, съдържащ последователността на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; или (Ь) антитяло съгласно претенция 45.

69. Метод за идентифициране на свързващ участник за Nogo рецепторен белтък, характеризиращ се с това, че включва етапите на:

(a) предоставяне на Nogo рецепторен белтък;

(b) поставяне в контакт на Nogo рецепторен белтък с кандидат за свързващ участник; и (c) откриване свързване на кандидата за свързващ участник с Nogo рецепторния белтък, където свързващият се

участник може да модулира Nogo-медиирано инхибиране на аксоналния растеж, когато се свързва с Nogo рецептор. 70. Метод за инхибиране свързане на Nogo-полипептид с Nogo рецептор, характеризиращ се с това, че Nogo рецептор се поставя в контакт с ефективно количество полипептид, съгласно всяка една от претенции 24 до 43. • ⁷¹· Метод съгласно претенция 70, където полипептидът е разтворим Nogo рецептор. 72. Метод за инхибиране свързване на Nogo полипептид с Nogo рецептор, характеризиращ се с това, че Nogo рецептор се поставя в контакт с ефективно количество от (а) антитяло, което се свързва с полипептид, съдържащ аминокиселинни остатъци на SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4; или (Ь) антитяло съгласно претенция 45. • '⁷³ Метод за инхибиране свързване на Nogo полипептид с Nogo рецептор, характеризиращ се с това, че Nogo рецептор се поставя в контакт с ефективно количество полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци на SEQ ID N0:8, 10, 12 или 18. 74. Метод за лечение нарушение на централната нервна система у бозайник, характеризиращ се с това, че се въвежда ефективно количество агент, който модулира Nogo-медиирано инхибиране на аксонален растеж.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ