JPH09509848A - オリゴ糖及び複合糖質を産生するトランスジェニック動物 - Google Patents
オリゴ糖及び複合糖質を産生するトランスジェニック動物Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関し、そのゲノムが、酵素及び抗体からなる群の中から選択される異種触媒実体の産生をコードする少なくとも1個の異種遺伝子を含んでおり、前記触媒実体がその哺乳動物の乳内に二次異種産物を生成することを特徴とする。ヒトグリコシルトランスフェラーゼ並びにトランスジェニックヒツジ、ヤギ及びウシが本発明を実施するのに特に有用である。異種産物にはオリゴ糖及び複合糖質が含まれる。
Description
【発明の詳細な説明】
オリゴ糖及び複合糖質を産生するトランスジェニック動物技術分野
本発明は異種グリコシルトランスフェラーゼの二次遺伝子産物のin viv
o産生に関する。これらのグリコシルトランスフェラーゼが非ヒト乳房組織で発
現されると、異種オリゴ糖や該オリゴ糖を有する様々な複合糖質がトランスジェ
ニック動物の乳内に産生される。従来技術
炭水化物は重要な生物学的化合物である。「糖」という用語は様々な炭水化物
含有化合物を包含する。それには多糖、オリゴ糖、糖タンパク質及び、非炭水化
物アグリコンを有するグリコシドが含まれる。オリゴ糖部分を含むタンパク質又
は脂質からなる生物学的高分子は総称的に複合糖質として知られている。炭水化
物部分は多数の生物学的機能をもたらす。
細胞中で炭水化物は、粘度調節及びエネルギー貯蔵の構造成分として機能する
か又は細胞表面の主要成分である。種々の複合糖質(特に糖タンパク質及び糖脂
質)の複雑なオリゴ糖鎖は様々な生物学的プロセスを媒介又は調節する。炭水化
物の生物活性の一般的な文献としては、(a)B
iology of Carbohydrates,Volume 2,Gin
sburg等,Wiley,N.Y.(1984);及び(b)P.W.Mac
her等,Annual Review of Biochemistry,V
olume 57,ページ785,(1988)を参照されたい。中でも、
(a)炭水化物の構造が糖タンパク質の安定性、活性、局在化及び分解にとって
重要であり、
(b)あるオリゴ糖構造が抗菌物質の植物分泌を活性化し、
(c)複合糖質が種々の細胞の表面上で頻繁に検出され、また例えばペプチド、
ホルモン、毒素、ウイルス、細菌の細胞表面との結合時及び細胞−細胞の相互作
用中に受容体又は調節体として機能するので、とりわけ細胞とその周辺部との相
互作用にとって重要であり、
(d)炭水化物の構造が抗原決定基(例えば血液型抗原)であり、
(e)炭水化物が正常組織発達中に細胞分化抗原として機能し、
(f)特異オリゴ糖が癌関連抗原決定基であることが判明したために炭水化物が
腫瘍発生にとって重要であり、
(g)オリゴ糖が精子/卵子の相互作用及び受精にとって重要である、
ことは公知である。
単離オリゴ糖が、尾部をもつ病原性(uropathogenic)の大腸菌
型細菌と赤血球との凝集を阻害することは公知である。他のオリゴ糖がプラスミ
ノーゲン活性化因子の量を増すことによって強力な抗トロンビン活性を示すこと
が判明している。この生物活性は、抗凝血作用を示す表面を得るために上記オリ
ゴ糖を医療機器の表面に共有結合させることによって利用されてきた。これらの
表面は血液の採取、処理、保存及び使用に有用である。グラム陽性細菌用の抗生
物質や消毒剤として有用であることが知見された他のオリゴ糖もあった。更には
、ある種の遊離オリゴ糖が特定の細菌の診断や同定に使用された。生物活性を示
す炭水化物を主体とした高付加価値の化成品については将来の市場が有望である
と考えられている。
大学や産業界では現在、生物活性を示すオリゴ糖の更なる用途を開発するため
徹底した研究が行われている。これらの開発努力には、非制限的ではあるが、
(a)新規な診断試薬や血液型判定試薬の開発、
(b)特異オリゴ糖による細菌やウイルスと細胞表面との付着防止に基づく、抗
生物質にとって代わる新しいタイプの治療薬の開発、及び
(c)植物生長を刺激し、ある種の植物病原体から防御するためのオリゴ糖の使
用
が含まれる。
多数のオリゴ糖構造が同定され、特徴付けられた。オリゴ糖の最小構成ブロッ
ク又は単位は単糖である。哺乳動物複合糖質内に見出される主な単糖はD−グル
コース(Glc)、D−ガラクトース(Gal)、D−マンノース(Man)、
L−フコース(Fuc)、N−アセチル−D−ガラクトースアミン(GalNA
c)、N−アセチル−D−グルコースアミン(GlcNAc)及びN−アセチル
−D−ノイラミン酸(NeuAc)である。括弧内の略字はInternati
onal Union of Physics,Chemistry and
Biology Council;Journal Biological C
hemistry,Volume 257,ページ3347−3354(198
2)の推奨に基づく単糖の標準的な略称である。以下ではこれらの略称を使用す
る。
アノマー配置(α−又はβ−グリコシド結合)及びO−グリコシド結合の位置は
多様であり得るので、基本的な構成ブロック数が比較的少ないにもかかわらず、
考えられる組み合わせの数は非常に多い。
従って、多種多様なオリゴ糖構造が存在し得る。オリゴ糖の生物活性が糖のコ
ンホーメーション及び組成の両方に特異的であることは公知である。個々の単糖
は一生物活性要素を提供するだけでなく、オリゴ糖のコンホーメーション全体に
寄与して、別のレベルの特異性や生物活性を付与する。ある種のオリゴ糖構造の
生物学的特異性を生じさせるのは様々な複合糖質やオリゴ糖である。しかしなが
ら、この多様性はまた、上記化合物の実用面で特定の問題を引き起こす。複合糖
質は通常強力な免疫原であり、生物特異性(biospecificity)は
上述したように、特定の単糖配列だけでなく、グリコシド結合の種類によっても
決まる。従って、ある動物種で見出されるオリゴ糖構造を他の種で使用すること
ができないことがしばしばある。個体基準でも使用に関しては同様の制限が適用
され得る。例えば、ある種の血液型抗原が特異オリゴ糖から形成されることは公
知なので、血液型オリゴ糖をタンパク質に結合
し、次いでこの糖タンパク質を治療で使用するときには特に注意を払う必要があ
る。考えられる免疫原性の問題を注意深く考慮する必要がある。
このような困難が考えられるにもかかわらず、多量のヒトオリゴ糖及び/又は
該オリゴ糖を有する複合糖質を生産する必要があることは十分に認められている
。多数の方法がこの目的を達成するのに適した手段であると考えられてきた。こ
のような方法には、慣用的な有機化学法による又は酵素のin vitro使用
によるオリゴ糖の合成が含まれる。酵素は位置及び立体選択性が高く、穏和な反
応条件下での触媒効率が高いので、現在では、固定化した酵素が大規模なin
vitroオリゴ糖生産の好ましい方法である。文献には、酵素が触媒する幾つ
かのオリゴ糖合成法が開示されている。例えば、Y.Ichikawa等「En
zyme−catalyzed Oligosaccharide Synth
esis」Analytical Biochemistry,Volume
202,ページ215−238(1992);及びK.G.I.Nillson
,「Enzymatic synthesis of Oligosaccha
rides」Tr
ends in Biotechnology,Volume 6,ページ25
6−264(1988)の科学論文を参照されたい。オリゴ糖の生産を容易にす
るためにヒドロラーゼ及びトランスフェラーゼの両方が使用されてきた。ヒドロ
ラーゼの亜種に属するグリコシダーゼ酵素が、分解サイクルの逆反応過程による
オリゴ糖の合成に特に有用である。しかしながら一般に、酵素によるオリゴ糖合
成は生合成経路に基づく。オリゴ糖合成の生合成経路は主に各グリコシルトラン
スフェラーゼの産生をコードする遺伝子によって調節されるが、実際のオリゴ糖
構造は個々のグリコシルトランスフェラーゼの基質や受容体の特異性によって決
定される。オリゴ糖は、単糖を糖ヌクレオチド供与体から受容体分子に移行させ
ることによって合成される。該受容体分子は、他の遊離のオリゴ糖、単糖、又は
タンパク質もしくは脂質に結合したオリゴ糖であり得る。
酵素、特に天然源由来のグリコシルトランスフェラーゼは単離が困難であった
ため、酵素によるオリゴ糖合成は一般に、小規模のみで実施されていた。更には
、糖ヌクレオチド供与体は天然源からの入手が非常に困難であり、有機化学合成
法で製造する場合は非常にコストがかかる。しか
しながら最近になって、多量のオリゴ糖を合成するための再循環及び再利用戦略
が開発された。参考として本明細書の一部を構成するものとする米国特許第5,
180,674号は、反応産物をマトリックス又は樹脂に結合したグリコシルト
ランスフェラーゼ上に繰り返し送り込むことからなる新規な親和性クロマトグラ
フィー法を開示している。更には、最近の遺伝子クローニング技術の進歩により
、数種のグリコシルトランスフェラーゼを、オリゴ糖の酵素的合成をより実用的
にするのに十分な品質及び量で入手することができる。
文献には異種グリコシルトランスフェラーゼの組換え又はトランスジェニック
発現に関して十分に記載されている。しかしながら、文献の議論を続ける前に、
本明細書及び請求の範囲で使用する種々の用語の意味を明確にする必要がある:
(a)宿主、宿主細胞又は宿主動物:これらの用語は生物学的材料の生合成を担
う細胞又は哺乳動物を指すために使用される。
(b)同種:この用語は、このようにして特徴付けられる実体が通常宿主に存在
するか又は宿主によって産生される
ことを意味する。
(c)異種:この用語は、このようにして特徴付けられる実体が通常宿主に存在
しないか又は宿主によって産生されないことを意味する。換言すれば、このよう
にして特徴付けられる実体は宿主に対して外来的である。
(d)触媒活性:この用語は、他の物質の化学変化を容易にするためのある種の
生物学的化合物の固有特性を指すために使用される。
(e)触媒実体:この用語は、新しい又は異なる又は改変された化合物の生成に
導く触媒活性を固有に有する生物学的化合物を指すために使用される。その例は
酵素及び抗体である。酵素は特異的な生化学的反応の生化学的触媒である。基質
材料に対する酵素の触媒活性の結果、酵素産物が生成される。
(f)ゲノム:この用語は、宿主中に見出される完全遺伝物質を指すために使用
される。この物質は染色体に配置されている。
(g)遺伝子:この用語は、特異的な生物学的実体の生合成を担うゲノムの機能
的部分を指す。
(h)挿入:この用語は、異種DNAの一部又は異種遺伝
子が宿主のゲノム内に導入されるプロセスを指すために使用される。挿入される
DNAは「インサート(又は挿入物)」と称する。
(i)トランスジーン:これは、ある動物種のゲノムから他の動物種のゲノムへ
の挿入によって移行される異種遺伝物質を指す。より簡単に言えば、トランスジ
ーンは宿主とは異種の遺伝子である。トランスジーンは特異的な生物学的物質を
コードする。
(j)トランスジェニック哺乳動物又はトランスジェニック宿主:これらの用語
は、ゲノム内に挿入されたトランスジーンを有する哺乳動物又は細胞を指すため
に使用される。この挿入の結果、トランスジェニック宿主は、通常それが合成し
ない異種生物学的物質を産生する。異種実体は、宿主細胞ゲノム内への外来遺伝
物質の挿入の結果としてトランスジェニック宿主によって生成されるか又はその
宿主に存在する。
(k)一次遺伝子産物:これは、同種又は異種遺伝子の転写及び翻訳の結果とし
て直接産生される生物学的実体を指す。その例にはタンパク質、抗体、酵素等が
含まれる。
(l)二次遺伝子産物:これは、一次遺伝子産物の生物活
性の結果として産生される産物を指す。その例は酵素の触媒活性の結果として産
生されるオリゴ糖である。
(m)生物学的産物:この用語は、哺乳動物のゲノム内へのトランスジーンの挿
入の結果としてトランスジェニック宿主によって産生又は合成される産物を指す
ために使用される。この用語は特に、二次遺伝子産物である生物学的産物を意味
する。その一つの例は後述するように、トランスジェニックウシによって産生さ
れるヒトオリゴ糖である。ヒトオリゴ糖はヒトグリコシルトランスフェラーゼの
触媒活性の結果として産生される。本明細書に開示するように、ヒトグリコシル
トランスフェラーゼをコードする遺伝子をマウスゲノム内に挿入すると、得られ
たトランスジェニックマウスは異種ヒトグリコシルトランスフェラーゼを一次遺
伝子産物として産生する。ヒトグリコシルトランスフェラーゼは同種基質材料を
用いて、オリゴ糖やグリコシル化タンパク質を産生する。一次遺伝子産物の酵素
活性の結果として産生されたオリゴ糖も二次遺伝子産物と称するのが適当である
。複合糖質は本明細書や請求の範囲で「生物学的産物」と称する化合物の他の例
である。
(n)産物:この用語は、本発明の二次遺伝子産物を指す
ために使用され、また「生物学的産物」の代わりとして使用される。
(o)人乳化乳(humanized milk):これは、宿主ゲノムの改変
によってヒト乳により近い乳を産出するようになった非ヒト哺乳動物から得られ
た乳を指す。人乳化乳の一例は、通常ウシ乳内には検出されず、ヒト乳内に検出
される産物を含んでいるウシ乳である。ヒトオリゴ糖は、ヒトグリコシルトラン
スフェラーゼをコードする遺伝子のウシゲノム内への挿入の結果としてウシ乳内
で産生される。人乳化乳は更に、ヒトオリゴ糖でグリコシル化されたタンパク質
を含んでいる。
上述したように、異種グリコシルトランスフェラーゼの組換え又はトランスジ
ェニック発現を記載する文献はかなりある。しかしながら、これらの文献には、
本発明で開示する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳内での二次遺伝子産物
の産生が開示されてもいないし、別の方法で示唆されているわけでもない。文献
例を以下に示す:
1)Paulsonの米国特許第5,032,519号は、細胞が天然の膜結
合酵素の代わりに可溶性で分泌性のGolgiプロセシング酵素を産生するよう
に細胞を遺伝
子操作する方法を教示している。
2)Paulsonの米国特許第5,047,335号は、チャイニーズハム
スター卵巣(CHO)細胞がシアリトランスフェラーゼを産生するようにCHO
のゲノムを遺伝子工学で改変させることを教示している。
3)国際特許出願第PCT/US91/08216号は、トランスジェニック
ウシ種の乳内に異種組換えタンパク質を産生し得るトランスジーンを教示してい
る。この特許出願公開は一次遺伝子産物のみの産生方法を教示している。この特
許出願公開は更に、上記トランスジェニック動物から得られる改変乳の製造及び
使用方法を開示している。
4)国際特許出願第PCT/US91/05917号は、より小さな重複DN
A断片の相同的組換えによってDNAセグメントを細胞内に作製する方法を教示
している。この特許出願公開は、一次遺伝子産物のみの産生方法を教示している
。
5)国際特許出願第PCT/GB87/00458号は、成体雌哺乳動物の乳
腺でDNA配列が発現されるように、ペプチドをコードするDNA配列を乳漿タ
ンパク質をコードする哺乳動物の遺伝子内に組み込むことからなるペプチ
ドの産生方法を教示している。この特許出願公開は、トランスジェニック哺乳動
物の乳内で一次遺伝子産物であるペプチドだけを産生する方法を教示し、更には
上記トランスジェニック動物から得られる改変乳の製造及び使用方法を開示して
いる。
6)国際特許出願第PCT/GB89/01343号は、ゲノム内に組み込ま
れた遺伝子構築物を有するトランスジェニック動物でタンパク質物質を産生する
方法を教示している。この構築物は、哺乳動物乳タンパク質遺伝子に由来する5
’−フランキング配列及び乳タンパク質以外の異種タンパク質をコードするDN
Aを含んでいる。この特許出願公開は、トランスジェニック哺乳動物の乳内に一
次遺伝子産物である異種タンパク質だけを産生する方法を教示している。
7)ヨーロッパ特許出願第88301112.4号は、特異遺伝子を乳腺にタ
ーゲッティングして、上記トランスジェニック動物の乳内に生物学的に重要な分
子を効果的に合成し分泌させる方法を教示している。この特許出願公開は更に、
上記トランスジェニック動物から得られる改変乳の製造及び使用方法、並びにト
ランスジェニック哺乳動物
の乳内に一次遺伝子産物のみを産生する方法を教示している。
8)国際特許出願第PCT/DK93/00024号は、トランスジェニック
動物の乳内にヒトκ−カゼインを産生する方法を教示している。遺伝子構築物は
、哺乳動物乳タンパク質遺伝子(例えばカゼイン又は乳漿酸性タンパク質)に由
来する5’−フランキング配列及びヒトκ−カゼインをコードするDNAを含ん
でいる。このDNA配列は少なくとも1個のイントロンを含んでいる。この特許
出願公開は、トランスジェニック哺乳動物の乳内に一次遺伝子産物である異種ヒ
トκ−カゼインだけを産生する方法を教示している。
9)国際特許出願第PCT/US87/02069号は、乳内で組み換えタン
パク質を発現し得る哺乳動物の作出方法を教示している。
上記刊行物はそれぞれ、トランスジーンの一次遺伝子産物、即ちトランスジー
ンによってコードされる活性タンパク質又は酵素、の産生手段を何らかの方法で
教示している。上記文献は、非ヒト乳内にグリコシルトランスフェラーゼを産生
するためのトランスジェニックな手段を開示してい
る。しかしながら、上記刊行物のいずれも、活性酵素による産物である所望の二
次遺伝子産物の産生手段としてのトランスジェニック動物の使用を教示も示唆も
していないし、特に、上記刊行物のいずれも、ヒトオリゴ糖又は該オリゴ糖を有
する複合糖質を産生するために非ヒト乳内においてトランスジェニックヒトグリ
コシルトランスフェラーゼを使用することを教示も示唆もしていないし、別の方
法で開示しているわけでもない。活性グリコシルトランスフェラーゼによる産物
であるこれらのオリゴ糖を以下では「二次遺伝子産物」と称する。従って、ヒト
乳内で検出される種々のオリゴ糖は、ある種の特異グリコシルトランスフェラー
ゼの遺伝学的に調節された発現の直接の結果として産生される。この点に関して
は、オリゴ糖は一次遺伝子産物である異種グリコシルトランスフェラーゼ酵素の
生化学的活性の結果として合成されるので、これを「二次遺伝子産物」とみなす
のが適当であり得る。
ヒト乳は種々のオリゴ糖やタンパク質を含んでいる。遊離の可溶性オリゴ糖は
通常、高度に分化した乳汁分泌乳腺以外の動物の細胞や組織によっては産生され
ない。オリゴ糖はヒト乳やウシ乳の炭水化物総含量の主要部分を占める。
哺乳動物乳の主要炭水化物成分は二糖ラクトースである。ラクトースは通常10
mg/ml以上の濃度で検出され、ガラクトースとグルコースとの結合によって
合成される。この反応は、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素に
よって触媒される。ウシを含む大半の哺乳動物の乳は数種の付加的なオリゴ糖を
極僅かな量しか含んでいない。対照的に、ヒト乳は、ラクトースよりも大きい数
種の付加的な可溶性オリゴ糖を多量に含んでいる。全てのヒトオリゴ糖は、単糖
を順次ラクトースに付加することによって合成される。ヒト乳内に検出される代
表的なオリゴ糖を表1に示す。
ヒト乳内のオリゴ糖は、ヒト乳房組織中に検出されるある種の特異グリコシル
トランスフェラーゼの活性の結果として存在する。例えば、構造2、5及び8中
のα−1,2結合フコース残基は独特のヒトフコシルトランスフェラーゼによっ
て生成され、免疫血液学の分野で公知の表現型を「分泌型(secretor)
」として特徴付ける。これらの個体は、オリゴ糖が種々のタンパク質に共有結合
している唾液や他の粘液分泌物中にヒト血液型物質を合成するので、上記のよう
に特徴付けられる。
構造6、8及び15中のα−1,4結合したフコース残基は、異なるフコシル
トランスフェラーゼの酵素作用の結果として生成される。これらのオリゴ糖は、
「ルイス陽性」血液型を示すとして特徴付けられた個体中に存在する表現型を示
す。このような個体は、ヒト血液型抗原に対応するオリゴ糖構造を合成するため
にこのフコシルトランスフェラーゼを使用する。このオリゴ糖は唾液や他の粘液
分泌物中にも検出されており、「ルイス陽性」個体の赤血球細胞の膜上に見出さ
れる脂質に共有結合している。構造5はABO血液型のH抗原に関し、構造6は
「ルイスa」血液型抗原である。構造8は「ルイスb」血液型抗原である。
少なくとも15種のヒト乳タンパク質が同定されている。これらのタンパク質
の中には一般にグリコシル化していると認識されたものがあり、即ちある種の特
定のオリゴ糖に共有結合している。タンパク質に共有結合した特定のオリゴ糖は
上記のオリゴ糖と同一又は同様であり、その産生はある種の特異グリコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の遺伝学的に調節された通常の発現の結果である。異種グ
リコシルトランスフェラーゼが存在すると、タンパク質の翻訳後修飾も影響を受
ける。異種グリコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化されたタンパク
質も当然「二次遺伝子産物」として知られている。同種及び異種のタンパク質は
共に、同種グリコシルトランスフェラーゼの活性によって生じるのとは異なる方
法でグリコシルトランスフェラーゼによって改変される。
これらのオリゴ糖やグリコシル化タンパク質がヒト腸管内での望ましい細菌の
増殖を促進することは長く知られている。更には、ヒト乳内のオリゴ糖は口や喉
への有害微生物の付着を阻害すると考えられている。これらのヒトオリゴ糖及び
とりわけグリコシル化タンパク質はウシ乳内には存在しないか又は存在するとし
ても量が顕著に異なる。更
には上述したように、ウシ乳は主にラクトースだけを含んでいる。ヒト乳はラク
トースだけでなく、他の多数のオリゴ糖を含んでいる。更には、ヒト乳タンパク
質のアミノ酸組成は対応するウシ乳タンパク質のアミノ酸組成とはかなり異なる
。結果として、ウシ乳を含む乳児用調合乳(infants fed infa
nt formula)の方が下痢のような腸障害を起こしやすく、又は血漿ア
ミノ酸の比率や量が母乳栄養乳児とは異なり得る。同じ理由で、免疫学的に危険
にさらされた(immunocompromised)年配の危篤状態の患者で
も、生化学的にヒト乳の組成によく似た栄養物の摂取が緊急に必要である。
ヒト乳タンパク質及びオリゴ糖の化学的性質は複雑であるため、大規模合成は
極めて困難であった。グリコシル化ヒト乳タンパク質やオリゴ糖を市販の栄養食
品に配合する以前に、これらを多量に製造する実用的な方法を考案しなければな
らない。この問題に対して考えられる解決方法は、オリゴ糖及び/又はこのヒト
オリゴ糖でグリコシル化されたタンパク質の産生を触媒する酵素をコードする遺
伝子又はcDNAを発現するトランスジェニック動物、特にトランスジェニック
ウシを使用することである。トランスジェ
ニック泌乳家畜動物(例えばウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びウシ)を本明細書
では、ヒトオリゴ糖及びヒトオリゴ糖でグリコシル化されたタンパク質を含む乳
を産出する手段として提示する。特に、1頭のウシは年間に300kgと多量の
タンパク質(主にカゼイン)を含む乳を非常に最小のコストで10,000リッ
トル以上産出し得るので、トランスジェニックウシがオリゴ糖や組換えタンパク
質の産生に非常に適している。従って、発酵設備への投資が不要であるため、ト
ランスジェニックウシは他の組換えタンパク質産生法よりもコストのかからない
産生法であるように思える。更には、乳は日に数回搾取され、実際に合成されて
搾乳されるまでの時間は数時間と短いので、ウシ乳腺はコスト的には培養細胞よ
りも効果的で、連続的に乳を出す。ウシの遺伝安定性は微生物又は細胞ベースの
産生系よりも高い。更には、ウシは人工授精、胚移植及び胚クローニング技術を
用いた生殖が比較的簡単である。更には、ヒトトランスジェニックタンパク質を
含むウシ乳の下流処理には、精製は殆ど又は全く不要であり得る。このような方
法を教示している刊行物を以下で参照する。しかしながら、これらの刊行物のい
ずれも、本発明に開示する非ヒトトラ
ンスジェニック哺乳動物の乳での二次遺伝子産物の産生を教示も開示もしていな
いし、他の方法で示唆しているわけでもない。
「Molecular Farming:Transgenic Anima
ls as Bioreactors」J.Van Brunt,Biotec
hnology,Volume 6,ページ1149−1154,1988は、
種々の異種実体を産生し得るトランスジェニック動物を作出する様々な大型の泌
乳家畜動物のゲノムの改変を記載している。この刊行物は一次遺伝子産物のみの
産生方法を示唆している。
国際特許出願第PCT/US91/08216号は、トランスジェニックウシ
種の乳内で異種組換えタンパク質を産生し得るトランスジーンを記載している。
この特許出願公開は一次遺伝子産物のみの産生方法を教示している。この特許出
願は更に、上記トランスジェニック動物から得られる改変乳の製造及び使用方法
を開示している。
国際特許出願第PCT/GB87/00458号は、成体雌哺乳動物の乳腺で
DNA配列が発現されるように、ペプチドをコードするDNA配列を乳漿タンパ
ク質をコード
する哺乳動物の遺伝子内に組み込むことからなるペプチドの産生方法を記載して
いる。この特許出願公開は、トランスジェニック哺乳動物の乳内で一次遺伝子産
物であるペプチドだけを産生する方法を教示している。この特許出願は更に、上
記トランスジェニック動物から得られる改変乳の製造及び使用方法を開示してい
る。
国際特許出願第PCT/GB89/01343号は、ゲノム内に組み込まれた
遺伝子構築物を有するトランスジェニック動物でタンパク質物質を産生する方法
を教示している。この構築物は、哺乳動物乳タンパク質遺伝子に由来する5’−
フランキング配列及び乳タンパク質以外の異種タンパク質をコードするDNAを
含んでいる。この特許出願公開は、トランスジェニック哺乳動物の乳内に一次遺
伝子産物である異種タンパク質だけを産生する方法を教示している。
ヨーロッパ特許出願第88301112.4号は、特定の遺伝子を乳腺にター
ゲッティングして、上記トランスジェニック動物の乳内に生物学的に重要な分子
を効果的に合成し分泌させる方法を記載している。この特許出願公開は更に、上
記トランスジェニック動物から得られる改変乳の
製造及び使用方法を開示し、トランスジェニック哺乳動物の乳内での一次遺伝子
産物のみの産生方法を教示している。
国際特許出願第PCT/US87/02069号は、泌乳動物の乳内に組み換
えタンパク質を発現し得る哺乳動物の作出方法を教示している。この特許出願は
、本発明で請求するような非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳での二次遺伝
子産物の産生を開示しておらず、別の方法で示唆しているわけでもない。
トランスジェニック動物は、多量のヒトタンパク質の産生のために使用するこ
とができるが、二次遺伝子産物(例えばヒトオリゴ糖、又はある種の特定のオリ
ゴ糖でグリコシル化されたタンパク質や脂質、又はある種の特定のオリゴ糖でグ
リコシル化されたヒト乳タンパク質や脂質)の産生には使用されなかった。上記
の刊行物のいずれも、非ヒト哺乳動物乳でのヒトオリゴ糖及び複合糖質の産生方
法を開示も示唆もしていない。上記刊行物は、所望のオリゴ糖でグリコシル化し
て非ヒト哺乳動物乳中に複合糖質を産生する方法も開示していないし、示唆もし
ていない。この結果に到達するには、乳房組織が所望のヒトグリコシルトランス
フェラーゼを選択的に発現し、次いである種のタンパ
ク質を所望のオリゴ糖でグリコシル化するように非ヒト泌乳哺乳動物のゲノムを
改変させる必要がある。このアプローチでは、所望のヒトグリコシルトランスフ
ェラーゼをコードするDNAをゲノム内に組み込む必要がある。文献は、所望の
オリゴ糖でグリコシル化して非ヒト哺乳動物乳中にグリコシル化ヒトタンパク質
を産生する方法も開示していないし、示唆もしていない。文献は、所望のオリゴ
糖部分でグリコシル化して非ヒト哺乳動物乳中にグリコシル化ヒト乳タンパク質
を産生する方法も開示していないし、示唆もしていない。この結果に到達するに
は、乳房組織がヒトグリコシルトランスフェラーゼ及び所望のヒトタンパク質の
両方を選択的に発現し、次いでこれらを活性ヒトグリコシルトランスフェラーゼ
により所望のオリゴ糖で適当にグリコシル化するように、非ヒト泌乳哺乳動物の
ゲノムを改変させる必要がある。このアプローチでは、所望のグリコシルトラン
スフェラーゼをコードするDNAをゲノム内に挿入するだけでなく、所望のヒト
タンパク質をコードするDNAをゲノム内に組み込む必要がある。
従って、移植された卵母細胞が所望のグリコシル化及びオリゴ糖産生を達成す
るのに必要な遺伝子構築物を含むよ
うに、受精した卵母細胞にうまく遺伝子が導入されているかどうかを移植前に検
出する方法を提供することが本発明の目的である。
哺乳動物種の乳房組織によって細胞外に分泌されるヒトグリコシルトランスフ
ェラーゼを産生し得るトランスジェニック非ヒト泌乳哺乳動物種を提供すること
が更に本発明の目的である。
更には、上記哺乳動物種によって産出される乳内に乳房組織によって細胞外分
泌されるヒトグリコシルトランスフェラーゼを産生し得るトランスジェニック非
ヒト泌乳哺乳動物種を提供することも本発明の目的である。
更には、上記哺乳動物種によって産出される乳内に乳房組織によって細胞外分
泌されるグリコシル化ヒトタンパク質及びオリゴ糖を産生し得るトランスジェニ
ック非ヒト泌乳哺乳動物種を提供することが本発明の目的である。
本発明は更に、上記トランスジェニック動物の乳内にグリコシル化ヒト乳タン
パク質及び脂質を産生し得るトランスジェニック非ヒト泌乳哺乳動物種に関する
。
上記トランスジェニック動物の乳内にヒトオリゴ糖を産生し得るトランスジェ
ニック非ヒト泌乳哺乳動物種を提供
することが更に本発明の目的である。
本発明は更に、上記トランスジェニック乳由来のグリコシル化ヒトタンパク質
、脂質及びオリゴ糖を含む食品組成物に関する。
本発明は更に、トランスジェニック動物の乳から得られたグリコシル化タンパ
ク質、脂質及びオリゴ糖を含む医薬、医学診断及び農業用組成物に関する。
本発明は、その乳腺においてグリコシル化ヒト乳タンパク質などのグリコシル
化タンパク質及び脂質を産生し得るトランスジェニックウシ種の提供も目的とす
る。
本発明は更に、その乳中にヒトオリゴ糖を産生し得るトランスジェニックウシ
種の提供も目的とする。
本発明は、上記のようなトランスジェニックウシの乳に由来するグリコシル化
タンパク質、脂質及びオリゴ糖を含有する食品組成物にも係わる。
本発明は、トランスジェニックウシの乳から得られたグリコシル化タンパク質
、脂質及びオリゴ糖を含有する医薬組成物、医学診断用組成物及び農業用組成物
にも係わる。発明の開示
本発明では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中
に二次遺伝子産物を生成させるべく、異種触媒実体をコードするトランスジーン
を用いる。本発明では特に、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に異種オ
リゴ糖及びグリコシル化複合糖質を生成させるべく、異種グリコシルトランスフ
ェラーゼをコードするトランスジーンを用いる。
本発明はトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる乳を開示し、この乳
は、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物のゲノムが有する少なくとも1種の
異種遺伝子の二次遺伝子産物として生成する異種成分を含有することを特徴とす
る。
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に産生される産物も開示
し、この産物は異種酵素及び異種抗体の中から選択された触媒実体の作用によっ
て生成し、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物はそのゲノム中に、前記触媒
実体をコードする少なくとも1種の異種遺伝子を有する。上記産物は、例えばオ
リゴ糖及び複合糖質である。
ヒトオリゴ糖、及び/または或る種のオリゴ糖でグリコシル化されたヒトタン
パク質を含有するトランスジェニック乳を製造することが望ましく、なぜならそ
れによって、ヒトの消費に備えて付加的に精製する必要がほとんど、ま
たは全く無い乳マトリックスが得られるからであり、前記トランスジェニック乳
は生化学的に人乳に類似する。
本発明は、ヒトでないトランスジェニック哺乳動物によって生産される人乳化
乳を開示し、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物のゲノムはヒト触媒実体を
コードする少なくとも1種の異種遺伝子を有する。上記触媒実体は、上記トラン
スジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に存在するオリゴ糖及び複合糖質を生成させ
る。
本発明は人乳化乳を得る方法も開示し、この方法は
(a)非ヒト哺乳動物のゲノムに、前記非ヒト哺乳動物の乳中に二次遺伝子産物
を生成させるヒト触媒実体の産生をコードする異種遺伝子を挿入するステップ、
及び
(b)前記非ヒト哺乳動物を搾乳するステップを含む。
本発明は、人乳化乳から生物学的産物を得る方法も開示し、この方法は
(a)非ヒト哺乳動物のゲノムに、前記非ヒト哺乳動物の乳中に二次遺伝子産物
を生成させる異種触媒実体の産生をコードする異種遺伝子を挿入するステップ、
(b)前記非ヒト哺乳動物を搾乳するステップ、及び
(c)前記非ヒト哺乳動物の乳から生物学的産物を単離するステップ
を含む。
本発明はトランスジェニック非ヒト哺乳動物も開示し、この哺乳動物は、その
ゲノムが酵素及び抗体の中から選択された異種触媒実体の産生をコードする少な
くとも1種の異種遺伝子を有することを特徴とし、前記触媒実体はこの哺乳動物
の乳中に第二の異種産物を生成させる。
本発明はトランスジェニックウシも開示し、このウシは、そのゲノムがフコシ
ルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランス
フェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ、グルコロニルトラ
ンスフェラーゼ、グルコロニルエピメラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マ
ンノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、β−アセチルガラク
トサミニルトランスフェラーゼ及びN−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼの中から選択された異種グリコシルトランスフェラーゼの産生をコードする
少なくとも1種の異種遺伝子を有することを特徴とし、このウシの乳は前記グリ
コシルトランスフェラーゼが生成させた異種オリゴ糖及び
複合糖質を含有する。
本発明に有用な非ヒト哺乳動物の代表例は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、
ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシである。本発明に有用な異種遺伝子の代表例は、ヒ
ト酵素及びヒト抗体をコードする遺伝子である(本明細書及び請求の範囲中では
ヒト酵素及びヒト抗体を触媒実体とも呼称する)。本発明に有用なヒト酵素は、
例えばグリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ペ
プチダーゼ及びスルホトランスフェラーゼの中から選択された酵素である。本発
明の実施に特に有用であるのはグリコシルトランスフェラーゼである。本発明の
実施に特に有用なグリコシルトランスフェラーゼの具体例には、フコシルトラン
スフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラー
ゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ、グルコロニルトランスフェ
ラーゼ、グルコロニルエピメラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシル
トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、β−アセチルガラクトサミニ
ルトランスフェラーゼ及びN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの中
から選択された酵素が有る。
本発明の望ましい異種二次遺伝子産物は、例えばオリゴ糖及び複合糖質である
(本明細書及び請求の範囲中では異種二次遺伝子産物を「生物学的産物」、また
は更に簡略化して「産物」とも呼称)。二次遺伝子産物として産生される異種オ
リゴ糖の代表例は、ラクトース、2−フコシルラクトース、ラクト−N−テトラ
オース、ラクト−N−ネオテトラオース、ラクト−N−フコペンタオースI、ラ
クト−N−フコペンタオースII、ラクト−N−フコペンタオースIII、ラクト−
N−ジフコペンタオースI、シアリルラクトース、3−シアリルラクトース、シ
アリル四糖a、シアリル四糖b、シアリル四糖c、ジシアリル四糖及びシアリル
ラクト−N−フコペンタオースである。ここに開示した二次遺伝子産物として産
生される異種複合糖質の具体例は、グリコシル化同種タンパク質、グリコシル化
異種タンパク質及びグリコシル化脂質である。本発明の実施に従い望ましいグリ
コシル化異種タンパク質の代表例は、ヒト血清タンパク質及びヒト乳タンパク質
から成るタンパク質群の中から選択されたタンパク質である。ヒト乳タンパク質
の例には、分泌型免疫グロブリン、リゾチーム、ラクトフェリン、κ−カゼイン
、α−ラクトアルブミン、β−ラクトア
ルブミン、ラクトペルオキシダーゼ及び胆汁酸塩刺激リパーゼの中から選択され
たタンパク質が有る。
本発明は、動物の栄養維持に有用である、人乳化乳を含有する経小腸(ent
eral)栄養補給品も開示する。また、動物の治療に有用である、本発明の産
物を含有する医薬品も開示する。本発明は更に、動物の診断に有用である、本発
明の産物を含有する医用診断薬も開示する。本発明は、作物の栽培に有用である
、本発明の産物を含有する農業用製品も開示する。
本発明は、その乳中に異種二次遺伝子産物を産生し得るトランスジェニック非
ヒト哺乳動物種を作出する方法も開示し、この方法は
(a)前記トランスジェニック種の乳房分泌細胞(mammary secre
tory cells)において機能する少なくとも1個の発現調節DNA配列
と、前記トランスジェニック種の乳房分泌細胞において機能する分泌DNA配列
と、組み換え異種触媒実体をコードする組み換えDNA配列とから成るトランス
ジーンを作製し、その際分泌DNA配列を組み換えDNA配列に作動可能に連結
させて分泌−組み換えDNA配列を形成し、この分泌−組み換
えDNA配列に前記少なくとも1個の発現調節配列を作動可能に連結させ、この
トランスジーンは、該トランスジーンを有する前記トランスジェニック種の乳房
分泌細胞において前記分泌−組み換えDNA配列の発現を指令し、それによって
、前記乳房分泌細胞において発現される時前記トランスジェニック種の乳中での
二次遺伝子産物の生成を触媒する組み換え異種触媒実体を生成させることを可能
にし、
(b)前記トランスジーンを胚標的細胞に導入し、それによって得られたトラン
スジェニック胚標的細胞、または該細胞から形成された胚を受容体である雌親に
移植し、
(c)その乳中に前記二次遺伝子産物を産生し得る少なくとも1匹の雌の子孫を
同定する、
ステップを含む。
本発明は、その乳中に異種二次遺伝子産物を産生し得るブタ、ヤギ、ヒツジ、
ウマ及びウシなどの大型非ヒト哺乳動物のトランスジェニック作出に有用な方法
も開示する。開示した方法は、
(a)上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞に導入されると上記表現型
を付与し得るトランスジーンを調製し、
(b)このトランスジーンをメチル化し、
(c)メチル化したトランスジーンを上記非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入
して、この細胞のゲノムDNA中への該トランスジーンの組み込みを可能にし、
(d)このようにして得られた個々の卵母細胞を培養して前移植胚とし、それに
よって各受精卵母細胞のゲノムを複製し、
(e)前記の前移植胚それぞれから少なくとも1個の細胞を採取し、これを溶解
させて細胞内のDNAを放出させ、
(f)放出されたDNAを、前記メチル化トランスジーンは切断し得るが、ゲノ
ムDNAへの組み込み及び該DNAの複製の後に生じる非メチル化形態のトラン
スジーンは切断し得ない制限エンドヌクレアーゼと接触させ、
(g)いずれの前移植胚由来細胞が前記制限エンドヌクレアーゼによる切断に耐
性のトランスジーンを含むかを、いずれの前移植胚がトランスジーンを取り込ん
だかの指標として検出する
ステップを含む。
本発明は、ステップ(d)〜(f)に従い溶解させて分析する第一の不完全胚
(hemi−embryos)を除
去する操作も含む、上述の方法に従属する方法も開示し、この方法は、
(g)少なくとも1個の上記第二の不完全胚をクローニングして、
(h)多数のトランスジェニック胚を形成する、
ステップをも含む。
本発明は、2個以上の上記トランスジェニック胚を受容体である雌親に移植し
て、同じ遺伝子型を有する少なくとも2匹のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
の集団を得ること、及びゲノムに組み込まれたトランスジーンを有する残りの前
移植胚を受容体である雌親に移植して、上記所望の表現型、即ちオリゴ糖及び複
合糖質の中から選択された異種二次遺伝子産物をその乳中に産生する能力を有す
る少なくとも1匹の子孫を同定することも開示する。
本発明に有用なトランスジーンを構成するDNA配列は少なくとも三つの機能
部分、即ち
(a)以後「組み換え部分」または「組み換え配列」と呼称する、ヒトグリコシ
ルトランスフェラーゼをコードする部分、
(b)シグナル部分、及び
(c)発現調節部分
を含む。
トランスジーンの組み換え部分は、所望のグリコシルトランスフェラーゼ酵素
をコードするDNA配列を含む。シグナル部分は天然に存在するものか、または
遺伝子操作されたものでDNA配列に組み込まれ得る。このシグナル部分は、グ
リコシルトランスフェラーゼが細胞のゴルジ装置に運搬されることを保証する分
泌配列をコードする。本発明では、シグナルDNA配列は乳房分泌細胞において
機能する。これらの配列は、作動可能に連結されて発現−シグナル−組み換えD
NA配列を形成する。発現配列は、トランスジーンが或る一定の種類の組織にお
いてのみ発現されることを保証する。本発明では、発現は乳房分泌組織において
生起するように調節される。トランスジェニック種の乳房分泌細胞において機能
する少なくとも1個の発現調節配列がシグナル−組み換えDNA配列に作動可能
に連結される。このように構築されたトランスジーンは、該トランスジーンを保
有する乳房分泌細胞においてシグナル−組み換えDNA配列を発現させ得る。こ
の発現によって、トランスジェニック種の乳房分泌細胞から乳中に分泌されるグ
リコシルトランスフェラーゼの産生が実現する。
上述の機能部分に加えて、トランスジーンは付加的な要素も含み得る。例えば
、組み換え部分は2個以上のタンパク質をコードし得る。即ち組み換え部分は、
グリコシルトランスフェラーゼをコードする以外に1種以上の他のヒトタンパク
質もコードし得る。他のグリコシルトランスフェラーゼ及び他の異種タンパク質
をコードする複数のトランスジーンを同時にトランスフェクトすることも可能で
ある。追加のトランスジーンも全て、グリコシルトランスフェラーゼトランスジ
ーンの分泌及び発現調節配列に作動可能に連結される。複数のトランスジーンの
発現によって、グリコシルトランスフェラーゼの産生のみでなく、いずれもトラ
ンスジェニック種の乳房分泌細胞から乳中に分泌される他のタンパク質の産生も
起こる。
適当な基質の存在下に、グリコシルトランスフェラーゼは個々の単糖単位を所
望のオリゴ糖に変換する。所望のオリゴ糖はトランスジェニック種の乳中に存在
する。同じグリコシルトランスフェラーゼ酵素はまた単糖をタンパク質に、利用
可能なグリコシル化部位を介して共有結合させる。所望のオリゴ糖でグリコシル
化されたこのようなタンパク
質も、トランスジェニック種の乳中に存在する。
本発明の利点は、以下の詳細な説明を添付図面と共に参照すればより良く理解
されよう。図面の簡単な説明
図1はヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼのヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列である。
図2はフコシルトランスフェラーゼcDNAの増幅及び発現を達成するプロト
コルの説明図である。
図3は乳漿酸性タンパク質(WAP)の調節配列(プロモーター)を用いるp
WAP−polyAプラスミド構築の説明図である。
図4はマウス胚へのマイクロインジェクションに用いるpWAP−フコシルト
ランスフェラーゼプラスミドの説明図である。
図5はトランスジェニックマウスの乳中にヒトα−1,2−フコシルトランス
フェラーゼが存在することを示すウェスタンブロットの写真である。
図6A〜図6Fは正常マウスもしくは非トランスジェニックマウスから得られ
た乳試料(図6A及び図6B)及びヒトα−1,2−フコシルトランスフェラー
ゼを発現する
トランスジェニックマウスから得られた乳試料(図6C、図6D、図6E及び図
6F)の高速液体クロマトグラフィープロフィールである。
図7は高速液体クロマトグラフィー分離後に貯溜したオリゴ糖物質の発蛍光団
援用(fluorophore assisted)炭水化物電気泳動のゲルの
写真である。
図8はフコース−α−1,2結合に特異的なフコシダーゼでオリゴ糖試料を消
化した後の発蛍光団援用炭水化物電気泳動ゲルの写真である。
図9は、乳から単離したオリゴ糖試料をフコシダーゼとβ−ガラクトシダーゼ
との混合物で徹底的に消化した後の単糖組成を示す発蛍光団援用炭水化物電気泳
動ゲルの写真である。放出された単糖単位を発蛍光色団(fluorochro
me)8−アミノナフタレン−2,3,6−トリスルホン酸(ANTS)で標識
して検出を容易にした。
図10は正常(非トランスジェニック)マウス、及びヒトα−1,2−フコシ
ルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスから単離した乳タン
パク質のウェスタンブロットの写真である。フィルターに移し取ったタンパク質
のグリコシル化を、α−1,2−フコース結合に
特異的なレクチンを用いて蛍光抗体法(immunofluorescence
)により検出した。この図は、トランスジェニック酵素のH抗原産物でグリコシ
ル化された乳タンパク質の存在を証明している。
図1〜図10は37 C.F.R. 1.81に従って提供する。発明の詳細な説明
本発明は、特定のグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性によって生じる二次
遺伝子産物産生を制御する触媒活性異種グリコシルトランスフェラーゼの、非ヒ
ト哺乳動物の乳房組織におけるin vivo発現に係わる。上記のようなグリ
コシルトランスフェラーゼ酵素は遊離オリゴ糖の合成、またはオリゴ糖のタンパ
ク質もしくは脂質への共有結合を制御する。上記発現は細胞において、遺伝子操
作を用いて当該細胞に特定の異種グリコシルトランスフェラーゼ(一次遺伝子産
物)を産生させ、その後当該グリコシルトランスフェラーゼに関連する特定の触
媒活性を用いて二次遺伝子産物である特定産物を産生させることにより実現する
。グリコシルトランスフェラーゼの場合、二次遺伝子産物には合成されたオリゴ
糖のみでなく、グリコシル化さ
れたタンパク質及び脂質も含まれる。オリゴ糖及びグリコシル化タンパク質/脂
質はトランスジェニック哺乳動物種の乳中に分泌され、該乳中に遊離形態で見出
される。本明細書及び請求の範囲中に用いた「グリコシル化」という語は、1個
以上の単糖単位とタンパク質または脂質との共有結合を実現する、発現されたグ
リコシルトランスフェラーゼにより容易となった酵素的方法によるタンパク質ま
たは脂質の翻訳後修飾を意味すると理解される。このようなグリコシル化は、細
胞にグリコシルトランスフェラーゼと当該タンパク質または脂質との両方の産生
を指示することによって行なわれる。当該タンパク質または脂質は同種実体であ
っても異種実体であってもよい。本明細書及び請求の範囲中に用いた「同種」と
いう語は、組成物または分子の形態が宿主細胞または宿主動物によって通常産生
されるものの形態と同じであることを意味すると理解される。本明細書及び請求
の範囲中に用いた「異種」という語は、組成物または分子の形態が宿主細胞また
は宿主動物によって通常産生されるものの形態と異なることを意味すると理解さ
れる。遺伝子操作技術を用いて、宿主動物のゲノムに外来遺伝物質、即ち別の種
から得た遺伝物質を組み込む。本明
細書及び請求の範囲中に用いた「トランスジェニック細胞」または「トランスジ
ェニック動物」という語は、上記のように形質転換されたゲノムを有する宿主細
胞系または動物を意味すると理解される。本明細書及び請求の範囲中に用いた「
トランスジェニック産物」という語は、上記のようなトランスジェニック実体に
由来する産物を意味すると理解され、例えばトランスジェニックウシに由来する
乳をトランスジェニック乳と呼称する。
本発明は、乳腺を構成する細胞が所望のグリコシルトランスフェラーゼを発現
するトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出に一部基
づく。(トランスジェニック乳房細胞ゲノムを、ヒトタンパク質をコードする遺
伝子でトランスフェクトすることも可能である)。得られるグリコシルトランス
フェラーゼは、トランスジェニック宿主乳房細胞において発現されると、上記の
ようなトランスジェニック動物によって産生される乳中への可溶性遊離オリゴ糖
の生産に有用である。発現されるグリコシルトランスフェラーゼは、トランスジ
ェニック乳房細胞が同種乳タンパク質または異種ヒトタンパク質も発現させる場
合、当該タンパク質のグリコシル化にも有用である。同
じことが脂質の修飾にも該当し得る。
本発明は、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、
グルコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトラ
ンスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、
グルコロニルトランスフェラーゼ、β−アセチルガラクトサミニルトランスフェ
ラーゼ及びN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなどの様々なグリコ
シルトランスフェラーゼによるオリゴ糖合成に広く適用できる。アセチラーゼ、
グルコロニルエピメラーゼ、グリコシダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、マ
ンノシダーゼ及びホスホトランスフェラーゼなど、他のゴルジ装置酵素類の産物
も、ここに開示した方法で合成可能である。発明の好適実施態様
フコシルトランスフェラーゼ、特にヒトα−1,2−フコシルトランスフェラ
ーゼ(以後Fuc−Tとも呼称)の産生をコードするDNAの、非ヒト乳腺を構
成する細胞のゲノムへの組み込みを次に説明する。Fuc−T産物の一例に2′
−フコシル−ラクトースが有る。この物質は人乳中のオリゴ糖の一つで、化学式
「フコース−α−1,2−
Gal−β−1,4−Glc」を有する。他のFuc−T産物に、Fuc−Tに
よってフコシル化され得るβ−結合末端ガラクトース残基を有する糖タンパク質
が含まれる。得られる炭水化物構造体「フコース−α−1,2−ガラクトース−
β−R」(前記Rはβ−1,3−GlcNAc、β−1,4−GlcNAc等の
中から選択される)は、血液型血清学の分野で「H抗原」として知られている。
他のグリコシルトランスフェラーゼ及びゴルジプロセシング酵素も本発明により
用い得ることは、当業者には十分に認識される。後述する非限定的な実施例では
トランスジェニックマウスを用いた。マウスゲノムは、Fuc−Tをコードする
DNAを有しないか、または発現しない。即ち、トランスジェニックマウスがF
uc−T、2′−フコシル−ラクトースまたはH抗原を産生すれば、Fuc−T
をコードする遺伝子のマウスゲノムへの組み込みに成功したことになる。
グリコシルトランスフェラーゼをコードするDNAをトランスジェニック宿主
細胞のゲノムに挿入し得ることは当業者に良く知られている。グリコシルトラン
スフェラーゼのトランスジェニック発現に用い得る細胞系には、チャイ
ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、マウスL細胞、マウスA9細胞、ベビー
ハムスター腎細胞、C−127細胞、PC8細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真核
細胞系などが有る。本発明の好ましい一具体例において、宿主細胞は、トランス
ジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺の組織を構成する乳腺細胞である。本発明の好
ましい具体例では、トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ
、ヤギ、ウマまたはウシを用いる。特に好ましい具体例ではトランスジェニック
ヒツジ、ヤギまたはウシを用いる。本発明の特に好ましい一具体例では、トラン
スジェニック乳牛のウシ乳房組織を用いる。
改変した遺伝物質を宿主細胞に導入するのに用いられる操作が正確にどのよう
なものであるかは重要でない。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する任意
の周知操作を用い得る。そのような操作には、プラスミドベクターの使用、ウイ
ルスベクターの使用、並びにクローン化したゲノムDNA、cDNA、合成DN
Aまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入する他の任意の周知方法が含まれる
。用いる特定の遺伝子工学的操作は、少なくとも1個のトランスジーンを宿主細
胞に好ましく導入し得、それによって宿
主細胞が所望のグリコシルトランスフェラーゼを発現させ得るようになるもので
ありさえすればよい。本発明の実施において好ましい一技術では、胚標的細胞を
トランスフェクトし、このようにして形成したトランスジェニック胚標的細胞を
受容代理母体に移植し、その乳中に(1種以上の)遊離ヒトオリゴ糖、またはグ
リコシル化ヒト組み換えタンパク質を産生し得る少なくとも1匹の雌の子孫を同
定する。本発明のきわめて好ましい一具体例は、ウシ種の胚標的細胞をトランス
フェクトし、このようにして形成したトランスジェニック胚標的細胞を受容ウシ
母体に移植し、その乳中に(1種以上の)遊離ヒトオリゴ糖、またはグリコシル
化同種もしくは異種組み換えタンパク質を産生し得る少なくとも1匹の雌のウシ
子孫を同定するステップを含む。
以下の実施例は、非ヒト哺乳動物宿主細胞のゲノムに特定のグリコシルトラン
スフェラーゼをコードする異種DNAを挿入することによる前記ゲノムの改変を
証明する。この改変によってトランスジェニック宿主は、所望の二次遺伝子産物
、特に特定のオリゴ糖の産生を容易にする特定の触媒活性グリコシルトランスフ
ェラーゼを発現させる。乳タンパク質のグリコシル化も証明される。宿主のゲノ
ムに、
オリゴ糖をコードするDNAに加えてヒト乳タンパク質をコードする異種DNA
も挿入すると、当該宿主はヒト乳タンパク質も発現させる。同じ宿主がグリコシ
ルトランスフェラーゼも発現させるので、ヒト乳タンパク質は幾種かの特定オリ
ゴ糖でグリコシル化される。宿主において発現させるヒト乳タンパク質には、分
泌型免疫グロブリン、リゾチーム、ラクトフェリン、κ−カゼイン、ラクトペル
オキシダーゼ、α−ラクトアルブミン、β−ラクトアルブミン及び胆汁酸塩刺激
リパーゼが含まれる。
オリゴ糖合成及びタンパク質/脂質グリコシル化への上記アプローチは現在使
用可能な他の方法に優る利点を幾つか有する。このアプローチは、
(a)グルコースなどの天然炭素源からの糖ヌクレオチドの合成にトランスジェ
ニック乳房細胞を用いることと、
(b)トランスジェニック哺乳動物細胞において異種組み換えグリコシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を発現させることと、
(c)トランスジェニック動物の天然の乳分泌乳腺に所望構造の異種オリゴ糖を
産生させ、この産生は発現された異種グリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素
活性によって
実現することと、
(d)異種グリコシルトランスフェラーゼ酵素を用いて同種または異種のタンパ
ク質または脂質をグリコシル化することと
の新規な組み合わせに基づく。
次に述べる実験で、以下の点を説明する。
(a) ヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をヒト表皮癌(e
pidermal carcinoma)細胞系から単離してクローン化した。
上記酵素はオリゴ糖2′−フコシル−ラクトースの合成、及び血液型特異的H抗
原でのタンパク質のグリコシル化を実現する。
(b) 上記遺伝子の機能特性を、培養非ヒト細胞系において触媒活性α−1,
2−フコシルトランスフェラーゼを発現する能力によって証明した。1,2−フ
コシルトランスフェラーゼの存在は、この酵素に特異的である酵素活性アッセイ
によって確認した。触媒活性α−1,2−フコシルトランスフェラーゼの存在は
また、該酵素を発現させた細胞の表面にH抗原が存在することを示す蛍光抗体法
を用いることに
よっても確認した。
(c) α−1,2−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物を発現させ得る非
ヒトトランスジェニック動物の作出における上記遺伝子の有用性を、触媒活性α
−1,2−フコシルトランスフェラーゼを発現し得るヒトα−1,2−フコシル
トランスフェラーゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを首尾よく発生さ
せることによって証明した。
(d) 非ヒトトランスジェニック動物の乳房組織における触媒活性ヒトα−1
,2−フコシルトランスフェラーゼの発現。この酵素の存在は直接酵素活性アッ
セイ、及び該酵素に対して結合特異性を示す抗体を用いる蛍光抗体法によって確
認した。
(e) 発現されたヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼの触媒活性が
もたらす、非ヒト乳中への二次遺伝子産物の産生。前記産物には、乳中へ放出さ
れるヒトオリゴ糖2′−フコシル−ラクトース、及び上記酵素のH抗原産物でグ
リコシル化された乳タンパク質が含まれる。二次遺伝子産物の存在は、
化合物の生化学分析、及びH抗原に対して結合特異性を示すレクチンを用いる蛍
光抗体法によって確認した。
以下の実施例は本発明の範囲の例示として示してあり、請求の範囲に記した本
発明を限定するものと看做すべきでない。
実施例1及び2では組織培養系を用いる。これらのin vitro実験は、
酵素活性を持つ異種グリコシルトランスフェラーゼの発現が可能であることを証
明するために行なった。実施例1及び2は本発明の実施(enablement
)にとって重要でなく、単に本発明の理解及び認識を確実にするべく提示してあ
る。実施例3〜6では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中への異種二次
遺伝子産物のin vivo産生が可能であることを証明する。実施例3〜6は
、本発明の教示、範囲、及び請求の範囲の内容の実施のために提示してある。上
記に照らして、本発明者は37 C.F.R. §1.802の下での生物物質
寄託は不要であると考える。実施例1
: ヒト表皮癌細胞系からのヒトα−1,2−フ
コシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離
ヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼをコードするcDNAを表皮癌
細胞系(A431)cDNAライブラリーから単離したが、なぜなら以前この供
給源からα−1,2−フコシルトランスフェラーゼがクローン化されたからであ
る(V.P.Rajan等,J.Biological Chemistry,
vol.264,pp.11158−11167,1989)。前記文献は本明
細書に参考として含まれる。タンパク質コーディング配列のポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)媒介増幅後、cDNAを細菌ベクター中にクローン化して増幅遺伝
子のcDNA配列を決定した。前記DNA配列はα−1,2−フコシルトランス
フェラーゼの、別々に単離した6個のクローンそれぞれから決定した。このヌク
レオチド配列及び対応するアミノ酸配列を図1に示す。上記cDNA配列を決定
するべく、各々31ヌクレオチド(31マー)を有する2個のα−1,2−フコ
シルトランスフェラーゼプライマーを、公表されているα−1,2−フコシルト
ランスフェラーゼcDNA配列に基づき設計した。プライマーBigNH2は、
Fuc−Tの転写が始まる27位(読み取り枠開始位置)に開始メチオニン残基
を有した。第二のプライ
マーBigCOOHは10位に終結コドンを有した。これらのプライマーを図2
に示す。PCR反応混合物は、約1μMの各プライマーと、PCR緩衝液を伴っ
た1μgの鋳型と、Taqポリメラーゼとを含有した。PCR反応はサーマルサ
イクラー(thermal cycler;Perkin and Elmer
,Model 840)において生起させ、その際94℃で1分間、60℃で3
分間及び72℃で3分間の温度サイクルを30回実施し、その後72℃での加熱
を5分間延長した。PCR反応生成物を0.8% w/v低融点アガロース上で
の電気泳動に掛けた。1.1kb断片を検出した。この断片を切り出し、PCR
IIクローニングベクター中にサブクローン化した。以後選択体(selecta
nt)と呼称する1個の形質転換体を選択し、制限分析とヌクレオチド配列分析
との両方で特性解明した。DNA配列決定は、Applied Biosyst
ems Model 373A自動DNA配列決定装置を用いて行なった。
挿入部分の制限パターンは、α−1,2−フコシルトランスフェラーゼのコー
ディング領域との類似性を示した。この候補クローンのヌクレオチド配列は公表
配列と、64
0位以外同じであった。in vitro部位特異的変異処理を用いて640位
の欠陥単独塩基を修正し、それによって野生型配列を得、この配列を後述するト
ランスフェクション実験に用いた。実施例2
: ヒトグリコシルトランスフェラーゼの宿主細
胞発現
この実施例では、特定のヒトグリコシルトランスフェラーゼであるα−1,2
−フコシルトランスフェラーゼ即ちFuc−Tを発現し得る遺伝子での培養マウ
スL細胞及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のトランスフェクショ
ンについて述べる。トランスフェクション用に上記細胞系を選択したのは、その
天然ゲノムがFuc−TをコードするDNAを持たないからである。トランスフ
ェクション後に上記細胞系がFuc−Tまたはその酵素産物(2′−フコシル−
ラクトース、または糖タンパク質に結合したH抗原)を産生することが判明すれ
ば、トランスフェクションの成功が証明されたことになる。この証明は、H抗原
に選択的に結合する特異的抗体及び/または特異的レクチンを用いる蛍光抗体法
によって行なう。
トランスフェクションに用いるFuc−T遺伝子は実施
例1に述べたようにして得た。トランスフェクションの方法及び用いた物質は下
記の通りである。
フェニル−β−D−ガラクトシドはSigma Chemical Co.か
ら入手した。比活性278mCi/mmolのヌクレオチド糖であるGDP−L
−(U−14C)フコースはAmersham Co.から購入した。A431ヒ
ト表皮癌cDNAライブラリーは、The University of Mi
ami,Oxford,OhioのDr.Nevis Frigienから贈与
を受けた。PCRIIベクターはInvitrogen Co.から購入した。発
現ベクターpQE11はQiagen Inc.から購入した。プラスミドpS
V2−neoはPharmacia Fine Chemicals Co.か
ら入手した。プラスミドpMet−FucT−bGHはOhio Univer
sity,Athens,OhioのDr.Xhou Chen及びDr.Br
uce Kelderから入手した。この構築物はFuc−TをコードするcD
NAを含む。プライマーはFischer Scientific Co.のO
peron Technologyによって合成された。H抗原に対す
るマウスモノクローナル抗体はDako Co.から購入した。フルオレセイン
イソチオシアネート標識ヤギ抗マウス抗体はSigma Chemical C
ompanyから購入した。α−1,2−フコシルトランスフェラーゼの発現を
検出する手段として、この酵素に対するウサギポリクローナル抗体を生成させた
。抗体誘導において抗原として作用する酵素を十分に生成させるべく、選択体の
挿入部分を、枠内に6XHisラベルを持つ誘導発現ベクター(pQE11)中
にサブクローン化した。6XHis標識タンパク質は、ニッケルアフィニティー
クロマトグラフィーカラムで容易に精製された。
考え得る細胞毒性を回避するために、α−1,2−フコシルトランスフェラー
ゼの疎水性領域を欠失させた。これを達成するために、新たなプライマー2個を
構築した。第1のBamHI−NH2は60位で鋳型にハイブリダイズし、第2
のプライマーSal I COOは終結コドンにまたがる。BamHI部位及びS
al Iを上流及び下流プライマー上に遺伝子操作により作製した。PCR産物
をフレーム内で6XHis標識との融合を可能にするpQE11発現ベクターの
BamHI/Sal I部位にサブクロー
ン化した。Ni−アガロースアフィニティーカラムを用い、3mgの融合タンパ
ク質(α−1,2−フコシルトランスフェラーゼ−6XHis)を精製した。該
物質をFuc−T特異的ウサギポリクローナル抗体の産生に用いた。細胞系及び培養
:
Washington,D.C.のAmerican Tissue Cult
ure Collection(ATCC)からマウスのL細胞及びCHO細胞
を得た。10%ウシ胎児血清(GIBCO)、80μg/mlのペニシリン(S
igma)、80μg/mlのストレプトマイシン(Sigma)及びL−グル
タミン(Sigma)を補充した最少必須培地α(α−MEM、GIBCO,G
rand Island,New York)(以下α−MEM/10%FCS
と称する)中で細胞を増殖させ、トランスフェクトしたL細胞は、400μg/
mlのG418を含むα−MEM(Gibco)上で増殖させた。トランスフェ
クトしたCHO細胞は、1000μg/mlのG418(GIBCO)を含むα
−MEM上で増殖させた。過渡的トランスフェクション
:
8ウエルチャンバースライド(Lab−Tek)上で集
密度75%になるようにL細胞を増殖させた。各チャンバーのpMet−Fuc
−bGH DNA(2μg)、リポフェクション(2μl)及び200μlのO
pti−MEM Medium(GIBCO)にトランスフェクションカクテル
を加えた。37℃で6時間インキュベートした後、200μlのα−MEM/1
0%FCSを加え、37℃でさらに48時間インキュベートした後、以下に記載
のように間接免疫蛍光法でスライドを処理した。
クローン化cDNA断片の、機能性α−1,2−フコシルトランスフェラーゼ
をコードする能力を、培養したマウスL細胞の細胞表面上の該酵素の触媒産物、
即ちH抗原の存在を示すことによりテストした(通常L細胞はその膜上にH抗原
を有していない)。実施例1に記載の選択体の野生型挿入物をEcoR1部位の
プラスミドpMet−bGHにサブクローン化した。該構築物におけるα−1,
2−フコシルトランスフェラーゼ活性の発現はメタロチオネインプロモーターに
より調節される。このプロモーターは亜鉛誘発性である。マウスのL細胞を過渡
的にpMet−Fuc−bGH構築物でトランスフェクトし、以下に記載の一次
抗H抗原マウスモノクローナル抗体を用いる免疫蛍光
法を用いて細胞表面上のH抗原構造体の存在を確認した。蛍光標識二次抗体はヤ
ギ抗マウス抗体であった。フコース−α−1,2−ガラクトース構造体に特異的
に結合する蛍光標識レクチンであるUlex europaeus凝集素1を用
いて、H抗原の存在をさらに確認した。間接免疫蛍光法
トランスフェクションが成功したことは、細胞表面上のH抗原の存在によって
示された。8ウエル組織培養チャンバースライドを用いて間接免疫蛍光アッセイ
を実施した。細胞を各チャンバーに適切な密度で装入し、37℃で一晩インキュ
ベートし、次いで、H抗原についてアッセイした。チャンバースライドをリン酸
緩衝塩水(PBS)で洗浄し、100μlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)中
の2%ホルマリン溶液で固定し、1%FCS中のサポニン(2mg/ml;Si
gma)で透過性とし、抗H抗体の1:1000希釈物と共に湿潤チャンバー中
室温で60分間インキュベートした。その後、スライドをPBSで3回洗浄し、
FITC標識ヤギ抗マウス抗体の1:1000希釈物と共に湿潤チャンバー中室
温でさらに60分間インキュベートした。加湿により試料の乾燥を防止した。
免疫蛍光法によれば、L細胞のトランスフェクション効率、即ちH抗原を発現
する形質転換L細胞%は約30%であった。
上記の結果は、Fuc−TをコードするDNAにより非ヒト哺乳動物細胞系が
首尾良くトランスフェクトされたことを明らかに示している。トランスフェクト
された培養細胞系は、一次遺伝子産物Fuc−Tだけでなく、修飾糖タンパク質
をも産生した。Fuc−T活性の結果として、修飾タンパク質はH抗原を有する
。これらの結果は、Fuc−Tをコードするクローン化cDNA断片が酵素的に
活性なFuc−Tを発現し得ることを証明している。従って、このcDNAを以
下に記載のトランスジェニック動物の作出に用いた。実施例3
.特定のヒトグリコシルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子を有するトランスジェニック非
ヒト哺乳動物
この実験は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、触媒的に活性な異種グリ
コシルトランスフェラーゼを産生し得ることを証明する。より具体的に言えば、
ヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼのトランスジェニック動
物の作出を証明する。トランスジェニックマウスは、マウス胚のゲノムにヒトF
uc−TcDNAを微量注入して作出した。単個細胞期にマウス受精卵を分離し
、実施例1に示されているヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子
を含むトランスジェニック構築物を雄性前核に注入した。次いで、これらの胚を
、前もって滅菌雄と交配させておいた仮性妊娠マウスに移植した。PCR増幅を
用い、挿入したヒト遺伝子に特異的なプローブを用いて尾の断片から得た染色体
DNAを分析して、生まれてから約25日後にトランスジェニック創始マウスを
同定した。当業界の標準的技術を用いて所望の形質転換を達成した。このような
詳細は、本明細書に参照として組み込むものとし且つ本明細書においてもさきに
取り上げた以下の参考文献に極めて詳細に記載されている:
(a)国際特許出願PCT/US90/06874号;
(b)国際特許出願PCT/DK93/00024号;
(c)国際特許出願PCT/GB87/00458号;及び
(d)国際特許出願PCT/GB89/01343号。
本発明の1つの態様は、非ヒト哺乳動物の乳における触
媒的に活性なヒトグリコシルトランスフェラーゼの発現及び所望の二次遺伝子産
物を形成するための該グリコシルトランスフェラーゼの使用に関する。トランス
ジェニックマウスの乳汁分泌の間にヒト遺伝子を乳腺特異的に発現させるために
、マウス由来の乳漿酸性タンパク質(WAP)の調節配列(プロモーター)を用
いて、ヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼを発現させるためのトラン
スジェニック構築物を産生した。マウスWAPプロモーターは、Nationa
l Institutes of Health、Bethesda、Maryl
andのL.Henninghauser博士から寄贈されたものであった。該
材料を用いて図3に示されているpWAP−ポリAプラスミドを構築した。該プ
ラスミドは融合遺伝子の3′末端にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配
列(ポリA)を含み、それによってメッセンジャーRNAの効果的な発現、プロ
セシング及び安定性が得られる。該プラスミドにヒトα−1,2−フコシルトラ
ンスフェラーゼ(Fuc−T)遺伝子を挿入して、図4に示されているpWAP
−ポリA−Fuc−Tプラスミドを形成した。このプラスミドを上記のマウス胚
の微量注入に用いた。2〜4μg/
ml濃度のDNA微量注入を用い、16回の注入により合計85匹の仔を得た。
2回の注入だけでは妊娠させることができなかった。一回の注入による同腹仔の
サイズは同腹仔当たり平均3〜10匹の仔が標準であった。85匹の仔マウス全
てについて尾の生検を実施した。尾の生検アッセイにより、以下F0と称する創
始集団(founder population)中9匹が、ヒトα−1,2−
フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有していることが判明した。
これは、約11%のトランスジェニックマウス作出効率に相当し、5〜25%の
予想作出効率範囲に該当する。F0後代は、8匹の雄と1匹の雌から構成されて
いた。次いで、創始マウス中6匹を正常なマウスと交配して、合計98匹の後代
を得た。尾の生検及びPCR分析により測定すると、38匹の子孫(以後F1と
称す)が、ヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を
有していた。これは、約36%のF1効率に相当する。F1世代は、19匹の雄と
19匹の雌からなる。表2は、得られた結果の要約である。
15匹のF1(第2世代)雌を成熟させ、正常なマウスと交配した。妊娠した
F1雌を出産させた。出産から10日後にこれらのF1母親中4匹から乳を採取し
た。乳の採取は、当業界において標準的な2つの方法中の1つを用いて行った:
(a)捕獲フラスコ及び吸引カップに接続された真空ラインを用いる乳房吸引;
又は
(b)動物を麻酔して殺し、次いで乳頭に穴をあけて乳腺から流体内容物を放出
させる。
乳試料は、下記の分析手順にかけるまでドライアイス上で凍結保存した。先ず
捕集した乳試料の乳タンパク質及び脂質からオリゴ多糖類を分離した。これは、
A.Kobata(Methods in Enzymology,第2
4章、第28巻,262−271ページ,1972)及びA.Kobataら(
Methods in Enzymology,第21章,211−226ページ
,1978)に記載の方法を用いて行った。乳試料を以下のように処理した。対
照(非トランスジェニック)動物及びトランスジェニック動物から得た典型的に
は90〜100μlの試料を、円錐形ポリプロピレン遠心管中、10,000相
対遠心力(RCF)で20分間遠心分離にかけた。遠心分離により、乳は、殆ど
脂質からなるクリームの上層と下層との2層に分離した。可溶性物質を含む下層
を取り出して別の遠心管に移した。2倍容量の氷冷エタノールを加え、攪拌して
混合し、10,000RCFで遠心分離した。エタノール可溶性上清を回収し、
Speed−Vac濃縮機を用いてアルコールを蒸発させて濃縮した。エタノー
ル不溶性タンパク質ペレットをその後の分析まで−70℃で凍結保存した。濃縮
後、オリゴ糖含有抽出物を初期の乳試料と等量になるように水に再懸濁した。こ
れらの再懸濁試料はその後で使用するまで冷却オートサンプラー中4℃で保存し
た。適切な場合には、該試料を実施例4〜7に記載の成分分析にかけた。
本発明の1つの態様は、非ヒト泌乳哺乳動物の乳腺における異種グリコシルト
ランスフェラーゼのトランスジェニック発現である。異種グリコシルトランスフ
ェラーゼの発現は、2つの方法:
(a)酵素(一次遺伝子産物)自体の存在を測定することにより、直接的に;及
び
(b)トランスジェニック動物の乳中の酵素産物(二次遺伝子産物:オリゴ糖又
はグリコシル化タンパク質)の存在を測定することにより、間接的に
示され得る。
先に記載のように、マウスのゲノムは、H抗原の合成に係わる特定のα−1,
2−フコシルトランスフェラーゼをコードしていない。従って、トランスジェニ
ックマウスの乳中にFuc−T又はFuc−T産物が存在すれば、ユニークな合
成手段、従って、二次遺伝子産物を得る手段を提供する遺伝子導入が成功したこ
とになる。本発明の1つの重要な態様は、非ヒト動物の乳における異種二次遺伝
子産物の産生である。先に述べたように、二次遺伝子産物は、酵素の直接産物、
即ちオリゴ糖だけでなく、該オリゴ糖との共有結合によりグリコシル化されるグ
リコシル化同種若
しくは異種タンパク質又は脂質をも含み得る。
採取した実施例3の乳を、ヒトα−1,2−フコシルトランスフェラーゼ、及
び二次遺伝子産物、特に2′−フコシルラクトース、及びH抗原でグリコシル化
されたタンパク質の存在について分析した。実施例4、5、6及び7は、非ヒト
動物の乳におけるヒトFuc−T及びFuc−T産物の産生を証明する。実施例4
:トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳におけ
る特異的グリコシルトランスフェラーゼの産生
を証明する分析
この実施例は、トランスジェニックマウスの乳におけるヒトα−1,2−フコ
シルトランスフェラーゼ産生の実現可能性を示している。上記のように、マウス
WAPプロモーターを用いて、ヒトα−1,2−グリコシルトランスフェラーゼ
の部位特異的乳腺発現を確認した。
上記実施例3のマウスから得たエタノール不溶性乳タンパク質沈降物を、ドデ
シル硫酸ナトリウム(SDS)含有ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE
)緩衝液に再懸濁した。タンパク質ペレットの再懸濁に用いたSDS−PAGE
緩衝液の量は、初期乳試料と全く同量であった。
再構成された試料をα−1,2−フコシルトランスフェラーゼの存在についてア
ッセイした。この存在は、下記のようなイムノブロット法、より具体的にはウエ
スターン法を用いて測定した。
SDS−PAGEに再懸濁したタンパク質ペレットの5μl試料を12.5%
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。電気泳動は150ボルトで実施し
た。電気泳動後、分離した蛋白質をニトロセルロース膜に移した。96mMグリ
シン、20%メタノール及び0.01%SDSを含む12.5mM Tris−
HCl緩衝液(pH7.5)を用い、100ボルトで1時間移動させた。移動後
、ニトロセルロース膜上に残った非結合反応性基を、0.5M NaCl及び2
%ゼラチンを含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)(以下TB
Sと称す)中でインキュベートしてブロックした。その後で、0.05%Twe
en−20を含むTBSで膜を3回洗浄した。
α−1,2−フコシルトランスフェラーゼ特異的ウサギポリクローナル抗体の
1:500希釈物を含む1%ゼラチン/TBS中で膜を18時間インキュベート
した。該ポリクローナル抗体は実施例2に記載のようにして得た。TB
S−Tweenでリンスした後、膜を、予め西洋ワサビペルオキシダーゼに結合
させておいたヤギ抗ウサギIgGを含む1%ゼラチン−TBS溶液と共にインキ
ュベートした。次いでTBS−Tweenで膜を洗浄した。0.018%の過酸
化水素と、30mgの4−クロロナフトールを含む10mlのメタノールとを含
む50ml容量のTBS中でニトロセルロース膜をインキュベートして、該膜上
のタンパク質の存在及び位置を視覚化した。
図5は、一匹の対照(非トランスジェニック)動物及び2匹のトランスジェニ
ック動物から得た乳試料についてのこの実験の結果を示している。図5中でトラ
ンスジェニック動物は28−89及び20−119として示されている。図5で
は、非トランスジェニック動物は対照と表記されている。図5は、2匹のトラン
スジェニック動物から得た乳試料には極めて濃いバンドが明瞭に存在するが、対
照の非トランスジェニック動物から得た乳には存在しないことを示している。濃
いバンドはα−1,2−フコシルトランスフェラーゼの予測分子量に対応する約
46キロダルトンの相対分子量の位置に明瞭に存在する。濃いバンドは、約30
〜25キロダルトンの範囲の低い相対分子量に対応する
位置にも存在する。これらのバンドは非トランスジェニック動物由来の乳試料に
は存在しない。これらの低分子量バンドは恐らくFuc−Tの断片に対応するも
のと推測されるが、この推測は本出願人を拘束するものではない。これらの結果
は、トランスジェニック動物由来の乳試料がFuc−Tを含んでいるのに対し、
非トランスジェニック動物由来の乳試料がFuc−Tを含んでいないことを証明
している。実施例5
:トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳におけ
る特異的異種二次遺伝子産物の産生を証明する
分析
この実施例は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳における異種二次遺伝
子産物産生の実現可能性を証明する。より具体的に言えば、この実施例は、非ヒ
ト動物の乳におけるFuc−Tの二次遺伝子産物産生能を示す。最も具体的には
、トランスジェニック乳における二次遺伝子産物、即ち2′−フコシルラクトー
スの存在が示された。対照の非トランスジェニックマウスの乳は、2′−フコシ
ルラクトースを含んでいない。
かつてReddy及びBush(Analytical
Biochemistry,第198巻、278−284ページ,1991)及
びTownsend及びHardy(Glycobiology,第1巻,13
9−147ページ,1991)によって記載されたDionex装置上の高速液
体及びイオン交換クロマトグラフィーの組合わせを用い、実施例3に記載のよう
にして得た蒸発器にかけたオリゴ糖抽出物を分析・分離した。これらの技術は当
業界において周知且つ標準的なものである。オリゴ糖抽出物の分離及び分析につ
いての実験設定の詳細、溶離プロフィール及び条件は以下の通りであった:Di
onex装置に、溶離緩衝液からCO2を除去するガス抜き装置、カラム溶離剤
からイオンを除去するイオンサプレッサー及びイオンサプレッサーによるイオン
の除去を確認するオンライン導電計を取り付けた。クロマトグラフィーのパラメ
ーターは以下の通りであった:
稼働時間: 45分
ピーク幅: 50秒
ピークしきい値: 0.500
ピーク面積リジェクト: 500
注入量 20L
流速 1.0ml/分。
表3に示されている溶離勾配プログラムは、以下の3種の溶離剤を含んでいた
:
溶離剤1: 100mM 水酸化ナトリウム中600mM酢酸ナトリウム
溶離剤2: ミリ−Q NanoPure水
溶離剤3: 200mM 水酸化ナトリウム。
0.5分毎に溶離された画分を分取した。
α−1,2−フコシルトランスフェラーゼを発現する4匹のトランスジェニッ
ク動物及び2匹の対照マウスから得た乳試料のクロマトグラフィープロフィール
を図6A〜図6Fに示す。2′−フコシルラクトース(トランスジーン
がコードする酵素により合成されたオリゴ糖産物である)はラクトースより後に
溶離されることが判明した。該プロフィールを検討してみると、トランスジェニ
ック動物のみが2′−フコシルラクトース標準と同時溶離される炭水化物を含む
乳を産生することが判明した。
クロマトグラフィーのピーク面積に基づき、標準法を用いてトランスジェニッ
ク動物由来の乳試料中に存在する2′−フコシルラクトースの濃度を計算するこ
とができた。データを表4に要約する。
このデータは、本発明により、二次遺伝子産物、即ち2′−フコシルラクトー
スが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中で産生され得ることを証明して
いる。オリゴ糖
のさらなる特性決定をするために、異なる炭水化物分析法を用いた。発蛍光団援
用炭水化物電気泳動(FACE)は、最初にP.JacksonによってJ.C
hromatography、第270巻、705−713ページ、1990に
記載された方法である。
FACE法を用いて、2′−フコシルラクトースと同時溶離される炭水化物が
電気泳動系において2′−フコシルラクトース標準品と同じ移動度を有すること
が明確に示された。これは、トランスジェニック乳試料中に含まれていたオリゴ
糖が2′−フコシルラクトースであることをさらに裏付けるものである。
推定2′−フコシルラクトースを用いてFACE実験を実施するために、Di
onex−HPLCクロマトグラフィーの間に分離された画分をプールした。図
6A〜図6Fにおいて矢印(横軸上に示されている)間の画分を各試料からプー
ルした。各プールの部分(1/8)を対照マウス及び2匹のトランスジェニック
マウスから得、Glyko Inc.(Novato,California)
から得た8−アミノナフタレン−2,3,6−三スルホン酸(ANTS)を用い
て45℃で3時間標識した。乾燥試料を5
μlの標識試薬及び5μlの還元試薬溶液(シアノホウ水素化ナトリウム)に再
懸濁し、45℃で3時間インキュベートした。得られた標識試料を乾燥し、6μ
lの脱イオン水に再懸濁した。該溶液からの2μlアリコートを別のマイクロ遠
心管に移した。グリセロールを含むローディング緩衝液2μlを加え、次いで、
混合物を激しく攪拌した。次いで、混合物全体(4μl)を「O−結合オリゴ糖
ゲル」(O−linked−oligosaccaride)(Glyko)中
に電気泳動させた。20ミリアンペア定常電流下に15℃で電気泳動を実施した
。このようにして得られた移動ゲルパターンのプロフィールをMillipor
eイメージ装置を用いて画像化した。
図7は、このようにして得られたゲルの画像を示している。対照マウス由来の
試料(レーン2)は、ラクトース標準マーカーの位置で移動する単一のバンドを
示している。トランスジェニックマウスから得た試料(レーン3及び4)は、高
分子量の追加バンドを含んでいた。図面中に矢印で示されているこのバンドは、
2′−フコシルラクトース標準(レーン6)の位置に移動する。
フコースのα−1,2−結合部で特異的に切断する酵素
フコシダーゼの存在下に、図6A〜図6Fに示されているプールの1/8に相当
するアリコートをインキュベートして、オリゴ糖のさらなる特性決定を行った。
用いた酵素は、Corynebacterium種由来であり、Panvera
Corp.,Madison,Wisconsinから購入した。乾燥オリゴ
糖を、20ミリ単位の酵素を含む20μlのリン酸緩衝液(pH6.0)の存在
下37℃で一晩インキュベートした。次いで消化物をANTS標識し、上記のよ
うに電気泳動にかけた。
図8のゲルはこの実験の結果を示している。Dionex−HPLCクロマト
グラフィーにおいて2′−フコシルラクトースと同時溶離され、ANTS標識し
て電気泳動させた後の該分子と共に同時移動する物質は、特異的加水分解酵素α
−1,2−フコシダーゼの作用をも受けやすいことが容易に明らかである。3′
−フコシルラクトース(2′−フコシルラクトースに最も類似した異性体である
)は該酵素の作用を受けない。この実験により、トランスジェニック乳試料中の
オリゴ糖が2′−フコシルラクトースと同一であることがさらに確認される。対
照的に、非トランスジェニック対照動物から得た乳試料(レーン6及び14)
は、加水分解後に、ガラクトース標準の位置に移動する単一のバンド(レーン7
及び15)のみを生成する。実施例6
:トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に産
生されたオリゴ糖を同定するための分析
この実験では、オリゴ糖を含む単糖単位を評価した。このために、対照マウス
及びトランスジェニックマウスから得てプールした乳試料をグリコシダーゼ混合
物で徹底的に処理した。図6A〜図6Fに示されているプールからのアリコート
(水20μl中の総量の1/8)を円錐管中で蒸発乾燥させた。乾燥内容物を、
20ミリ単位のα−1,2−フコシダーゼ(Panvera,Madison,
Wisconsin)を含む溶液20μl及び30単位のE.coli β−ガ
ラクトシダーゼ(Boehringer Mannheim,Indianap
olis,Indiana)を含む懸濁液20μlに再懸濁した。得られた懸濁
液をトルエン雰囲気下に37℃で18時間インキュベートした。このようにして
、フコシダーゼとβ−ガラクトシダーゼの連続的作用を受けやすいオリゴ糖のみ
をそれらの対応単糖単位に加水分解した。
インキュベーション後、混合物をSpeed Vac C
oncentrator中で乾燥した。この加水分解で得たオリゴ糖を上記実施
例5に記載のように標識した。標識単糖を「単糖ゲル」(Monosaccha
ride Gel)(Glyko)中で電気泳動にかけた。30ミリアンペア、
定常電圧下に1時間10分電気泳動を実施した。図9はこの実験の結果を示して
いる。トランスジェニック動物から得た乳試料(レーン2及び4)は、フコース
、ガラクトース及びグルコースに対応する3つのバンドを含んでいる。2′−フ
コシルラクトース標準から放出された単糖(レーン1)は、2匹のトランスジェ
ニック動物から得たオリゴ糖のプールから放出された単糖(レーン2及び4)と
同一であった。3′−フコシルラクトースはグリコシダーゼの酵素作用を受けな
い(レーン3)。この結果は、トランスジェニック乳中のオリゴ糖が2′−フコ
シルラクトースであることを明らかに証明している。
総合的に見れば、上記結果は、記載且つ請求されている本発明がトランスジェ
ニック動物の乳中に二次遺伝子産物を産生し得ることを証明している。より具体
的に言えば、該実験データは、一部がグリコシルトランスフェラーゼをコードす
るDNAからなるトランスジーンを含むトランス
ジェニック動物の乳中にオリゴ糖を産生することの実現可能性を証明している。
本発明をさらに裏付けるために、トランスジェニック動物の乳における糖タン
パク質のような他の複合糖質の存在を実証することを決定した。これらの糖タン
パク質は、タンパク質と、グリコシルトランスフェラーゼの産物であるオリゴ糖
との共有結合付加物である。オリゴ糖はグリコシルトランスフェラーゼの媒介に
よりタンパク質に共有結合する。実施例7
:トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳におけ
る複合糖質の産生を証明する分析
この実施例は、非ヒトトランスジェニック動物の乳における糖タンパク質産生
の実現可能性を示す。オリゴ糖部分は一次遺伝子産物であるグリコシルトランス
フェラーゼの活性の結果として産生されたものと同じオリゴ糖である。得られた
グリコシル化タンパク質は二次遺伝子産物の一例である。
実施例4に記載のようにトランスジェニック動物及び対照動物の乳タンパク質
からウエスターンブロットを作成した。しかし、移された膜をポリクローナルウ
サギ抗体と共
にインキュベートする代わりに、該膜をレクチン、Ulex europaeu
s凝集素I(UEA I)、と共にインキュベートした。このレクチンはフコー
スのα−1,2結合部に特異的に結合する。
このために、実施例3に記載のタンパク質ペレットを13,000×gで10
分間遠心し、上清(過剰なエタノール及び水)を除去し、得られたペレットを初
期乳量と等容量のSDS−PAGE試料緩衝液に再懸濁した。これらの抽出物か
ら5μlを取り、実施例3に詳細に記載されているように12.5%ポリアクリ
ルアミドSDS−PAGE上で電気泳動させた。電気泳動後、タンパク質を、1
2.5mM Tris−HCl、96mM グリシン、20% メタノール、0.
01% SDS,pH7.5中100ボルトで1時間ニトロセルロース膜に移動
させた。ニトロセルロース膜を、TBS(50mM Tris−HCl pH7.
5,0.5M NaCl)中の2%ゼラチンで1時間ブロックし、0.05% T
ween−20を含むTBSで3×5分洗浄した。次いで、膜を、ペルオキシダ
ーゼ標識UEA−1(Sigma,St.Louis Mo.)の1:500希
釈物を含む1%ゼラチン/TBS中で18時間インキ
ュベートした。次いで、得られた膜を洗浄し、タンパク質を、0.018%過酸
化水素を含むTBS 50mlと、30mgの4−クロロナフトール(Bio R
ad,Richmond,California)を含むメタノール10mlと
の混合物中でインキュベートして視覚化した。
図10は、この技術を用いて視覚化したタンパク質の写真を示している。トラ
ンスジェニック動物のみがUEA−1レクチンにより特異的に認識されたフコシ
ル化タンパク質を含む乳を産生したことは明らかである。これらのタンパク質は
35〜40キロダルトンの相対分子量で移動したが、該タンパク質はカゼインで
あると考えられる。これらの結果は、2′−フコシルラクトースオリゴ糖(H抗
原)を有する糖タンパク質が、トランスジーンがコードするα−1,2−フコシ
ルトランスフェラーゼを有するトランスジェニック動物の乳中に産生されたこと
を示している。非トランスジェニック対照動物の乳は、2′−フコシルラクトー
スを有する糖タンパク質を含んでいなかった。
実施例3〜7は、乳中で二次遺伝子産物を合成し得る非ヒトトランスジェニッ
ク哺乳動物を作出することが可能であることを証明した。より具体的に言えば、
乳房組織中で
ヒトグリコシルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動
物を作出し、これによって該動物の乳中にヒトオリゴ糖及びグリコシル化複合糖
質を存在させることが可能である。産業上の有用性
本明細書に記載且つ請求されている発明は、大量の所望オリゴ糖及び複合糖質
を得る手段を提供するという点で積年のニーズを解決するものである。所望のオ
リゴ糖及び複合糖質は、トランスジェニック哺乳動物の乳から分離して、医薬品
、診断用キット、栄養製品などに用い得る。トランスジェニック全乳は格別な利
点を提供する栄養製品の製造にも用い得る。トランスジェニック乳は特殊な経小
腸栄養製品の製造にも用い得る。記載・請求されている本発明により、医薬、研
究、診断、栄養及び農業用品の製造に用いられるこれらの極めて重要な物質の手
間のかかる有機化学及び固定化酵素化学合成が回避される。
本発明の好ましい実施態様を記載したが、当業者には、開示されている実施態
様に種々の改変が可能であり、そのような改変も本発明の範囲内に包含されるも
のであることは明らかであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
(C12N 9/10
C12R 1:91)
(C12N 9/14
C12R 1:91)
(72)発明者 カミングス,リチヤード・デール
アメリカ合衆国、オクラホマ・73003、エ
ドモンド、ノース・サンタ・フエ・5215
(72)発明者 コプチツク,ジヨン・ジヨセフ
アメリカ合衆国、オハイオ・45701、アシ
ンズ、オーチヤード・レーン・4
(72)発明者 ミユケルジ,プラデイツプ
アメリカ合衆国、オハイオ・43230、ガハ
ンナ、アルカロ・ドライブ・1069
(72)発明者 モアマン,ケリー・ウイルソン
アメリカ合衆国、ジヨージア・30605、ア
シンズ、ウインフイールド・プレイス・
115
(72)発明者 ピアース,ジエームズ・マイケル
アメリカ合衆国、ジヨージア・30605、ア
シンズ、スナツプフインガー・ドライブ・
325
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、前記哺乳動物のゲノムが、前 記哺乳動物の乳内に二次異種産物を生成させる、酵素及び抗体からなる群の中か ら選択される異種触媒実体の産生をコードする少なくとも1個の異種遺伝子を含 むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 2.マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシからなる群の 中から選択される請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 3.酵素がグリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヒドロキシラーゼ 、ペプチダーゼ及びスルホトランスフェラーゼからなる群の中から選択される請 求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 4.グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクト シルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランス フェラーゼ、アセチラーゼ、グルコロニルトランスフェラーゼ、グルコロニルエ ピメラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、ス ルホトランスフェラーゼ、 β−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ及びN−アセチルグルコサミ ニルトランスフェラーゼからなる群の中から選択される請求項3に記載のトラン スジェニック非ヒト哺乳動物。 5.前記二次遺伝子産物がオリゴ糖及び複合糖質からなる群の中から選択される 請求項4に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 6.ウシのゲノムが、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェ ラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、アセ チラーゼ、グルコロニルトランスフェラーゼ、グルコロニルエピメラーゼ、シア リルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェ ラーゼ、β−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ及びN−アセチルグ ルコサミニルトランスフェラーゼからなる群の中から選択される異種グルコシル トランスフェラーゼの産生をコードする少なくとも1個の異種遺伝子を含み、前 記ウシの乳が前記グリコシルトランスフェラーゼによって産生された異種オリゴ 糖及び複合糖質を含んでいることを特徴とするトランスジェニックウシ。 7.オリゴ糖が、ラクトース、2−フコシルラクトース、ラクト−N−テトラオ ース、ラクト−N−ネオテトラオース、ラクト−N−フコペンタオースI、ラク ト−N−フコペンタオースII、ラクト−N−フコペンタオースIII、ラクト−N −ジフコペンタオースI、シアリルラクトース、3−シアリルラクトース、シア リル四糖a、シアリル四糖b、シアリル四糖c、ジシアリル四糖及びシアリルラ クト−N−フコペンタオースからなる群の中から選択される請求項6に記載のト ランスジェニックウシ。 8.複合糖質がグリコシル化同種タンパク質、グリコシル化異種タンパク質及び グリコシル化脂質からなる群の中から選択される請求項6に記載のトランスジェ ニックウシ。 9.グリコシル化異種タンパク質がヒト血清タンパク質及びヒト乳タンパク質か らなるタンパク質群の中から選択される請求項8に記載のトランスジェニックウ シ。 10.乳内に異種二次遺伝子産物を産生し得るトランスジェニック非ヒト哺乳動 物種の作出方法であって、 (a)前記トランスジェニック種の乳房分泌細胞で機能的な少なくとも1個の発 現調節DNA配列と、前記トランスジェニック種の乳房分泌細胞で機能的な分泌 DNA配列と、 組換え異種触媒実体をコードする組換えDNA配列とからなるトランスジーンを 作製するステップ、その際、前記分泌DNA配列は前記組換えDNA配列に作動 可能に結合して分泌−組換えDNA配列を形成し、前記の少なくとも1個の発現 調節配列は前記分泌−組換えDNA配列に作動可能に結合し、前記トランスジー ンは、該トランスジーンを含む前記トランスジェニック種の乳房分泌細胞での前 記分泌−組換えDNA配列の発現を指令して組換え異種触媒実体を生成し得、該 触媒実体は、前記乳房分泌細胞によって発現されるとき、前記トランスジェニッ ク種の乳内への二次遺伝子産物の生成を触媒する、 (b)前記トランスジーンを胚標的細胞内に導入し、それによって形成されたト ランスジェニック胚標的細胞又はそれから形成された胚を受容体である雌親に移 植するステップ、 (c)乳内に前記二次遺伝子産物を産生し得る少なくとも1匹の雌子孫を同定す るステップ、 を包含する前記方法。 11.トランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤ ギ、ヒツジ、ウマ及びウシからなる 群の中から選択される請求項10に記載の方法。 12.前記異種触媒実体が、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、 ヒドロキシラーゼ、ペプチダーゼ及びスルホトランスフェラーゼからなる群の中 から選択されたヒト酵素である請求項10に記載の方法。 13.前記グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼ、ガ ラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルト ランスフェラーゼ、アセチラーゼ、グルコロニルトランスフェラーゼ、グルコロ ニルエピメラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラー ゼ、スルホトランスフェラーゼ、β−アセチルガラクトサミニルトランスフェラ ーゼ及びN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群の中から選 択される請求項12に記載の方法。 14.前記二次遺伝子産物がオリゴ糖及び複合糖質を含む群の中から選択される 請求項10に記載の方法。 15.前記オリゴ糖が、ラクトース、2−フコシルラクトース、ラクト−N−テ トラオース、ラクト−N−ネオテトラオース、ラクト−N−フコペンタオースI 、ラクト−N−フコペンタオースII、ラクト−N−フコペンタオースIII、 ラクト−N−ジフコペンタオースI、シアリルラクトース、3−シアリルラクト ース、シアリル四糖a、シアリル四糖b、シアリル四糖c、ジシアリル四糖及び シアリルラクト−N−フコペンタオースからなる群の中から選択される請求項1 4に記載の方法。 16.前記複合糖質がグリコシル化同種タンパク質、グリコシル化異種タンパク 質及びグリコシル化脂質からなる群の中から選択される請求項14に記載の方法 。 17.前記異種タンパク質がヒト血清タンパク質及びヒト乳タンパク質からなる タンパク質群の中から選択される請求項15に記載の方法。 18.前記ヒト乳タンパク質が、分泌型免疫グロブリン、リゾチーム、ラクトフ ェリン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトアルブミン、ラクト ペルオキシダーゼ及び胆汁酸塩刺激リパーゼからなる群の中から選択される請求 項16に記載の方法。 19.乳内に異種二次遺伝子産物を産生し得るトランスジェニック非ヒト哺乳動 物種の作出方法であって、 (a)前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞内に組み込んだときに前記 表現型を付与し得るトランスジーン を作製し、 (b)前記トランスジーンをメチル化し、 (c)前記メチル化トランスジーンを前記非ヒト哺乳動物の受精した卵母細胞内 に導入して、前記トランスジーンを受精した卵母細胞のゲノムDNA内に組み込 み可能にし、 (d)形成された個々の卵母細胞を培養して、受精した各卵母細胞のゲノムを複 製する前移植胚を得、 (e)前記の前移植胚の各々から少なくとも1個の細胞を取り出し、この少なく とも1個の細胞を溶解させて中に含まれるDNAを放出させ、 (f)放出されたDNAを、前記メチル化トランスジーンを開裂させることはで きるが、前記ゲノムDNA内への組み込み及びその複製の後に形成された非メチ ル化形態のトランスジーンを開裂させることはできない制限エンドヌクレアーゼ と接触させ、 (g)前記の前移植胚に由来する細胞のどれが、前記制限エンドヌクレアーゼに よる開裂に対して耐性を示すトランスジーンを含んでいるかを、いずれの前移植 胚がトランスジーンを組み込んだかの指標として検出する、 ステップを包含する前記方法。 20.前記の前移植胚の各々について第1及び第2の不完全胚から少なくとも1 個の細胞を取り出し、前記第1の不完全胚の各々を溶解し、ステップ(d)〜( f)に従って分析し、該方法が更に、 (g)前記第2の不完全胚の少なくとも1つをクローニングし、 (h)多数のトランスジェニック胚を形成する、 ことを含む請求項19に記載の方法。 21.2個以上の前記トランスジェニック胚を受容体である雌親内に移植して、 同一遺伝子型を有する少なくとも2匹のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含 む集団を作製することを更に含む請求項20に記載の方法。 22.ゲノムに組み込まれたトランスジーンを含んでいる残りの前記の前移植胚 を受容体である雌親に移植し、オリゴ糖及び複合糖質からなる群の中から選択さ れる異種二次遺伝子産物を前記種の乳内に産生する能力を所望の表現型として有 する少なくとも1匹の子孫を同定することを更に含む請求項21に記載の方法。
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