CZ2000803A3 - Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku - Google Patents

Abstract

Způsob pro přípravu transgenníchsavců s výjimkou člověka, kteří produkují různé oligosacharidy a glykokonjugaty ve svém mléku. Dále se řešení týká takto připravených savců, mléka, které tito savci produkují, prostředků obsahujících mléko, frakcí mléka a přečištěných oligosacharidů, stejně jako CO glykokonjugátů přítomných v mléku.

Description

Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobů pro přípravu transgenních savců s výjimkou člověka, kteří produkují různé oligosacharidy ve svém mléku. Dále se předkládaný vynález týká takto připravených savců, mléka, které tito savci produkují, prostředků obsahujících mléko, frakcí mléka a přečištěných oligosacharidů, stejně jako glykoproteinů, přítomných v mléku.

Dosavadní stav techniky

V minulosti dosáhlo několik jednotlivců transgenní exprese primárních genových produktů (t.j. proteinů) v mléku transgenních savců (U.S. patent č. 5322775, Wall et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1696-1700 (1991) a Krimpenfort, P. Cancer Detection and Prevention 17(2): 301-305 (1993)). Taková exprese byla provedena pro produkci velkých množství heterologních proteinů v mléku (Velander et al., Scientific American, Leden 1997, str. 70-74).

Nově bylo také prokázáno, že je možná exprese sekundárních třansgenních produktů, například oligosacharidů, glykoproteinů a glykolipidů (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 49: 29515-29519 (1995)). Pokusy provedené Prietem et al. znamenaly pokrok ve využití mléčných žláz transgenních savců jako bioreaktorů, ne pouze jako alternativního systému pro syntézu proteinů.

Většina pokusů popsaných ve výše uvedených článcích byla provedena pomocí exprese heterologních transgenů. Jedním důvodem pro takovou expresi je to, že homologní geny, které ··· ·

9999 •

9 • 9 jsou transgenně exprimovány, mohou způsobit obtíže z důvodů konfliktu s vlastní proteinovou syntézou při vývoji mléčné žlázy (Burdon et al., Mechanisms of Devolopment 36: 64-67 (1991)). Jiným důvodem pro použití heterologních transgenů je to, že většina pokusů, které byly provedeny, byla navržena pro produkci lidských biologických produktů.

Syntéza sekundárních genových produktů, jako jsou mléčné oligosacharidy, závisí primárně na expresi glykosyltransferas během laktace. Dále, existuje mnoho výhod takové produkce oligosacharidů. Například, v transgenním systému pro syntézu oligosacharidů je nutné pouze katalytické množství glykosyltransferas. Také původ transgenů nemusí být významný, takže sekundární genový produkt nebo produkty mohou být vybrány volně.

Je třeba si uvědomit, že savci jiní než lidé mají různé glykosyltransferasy, které mají své protějšky mezi enzymy u člověka (Thurin et al., The Journal of Biological Chemistry 265(12): 7055-7061 (1990)). Některé z těchto glykosyltransferas byly klonovány ze tkání savců jiných než lidí, například od myší (Larsen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)). Proto představuje transgenní exprese homologních glykosyltransferas v mléčných žlázách savců jiných než lidí prostředek pro produkci oligosacharidů, spolu s oligosacharidy produkovanými za použití heterologních glykosyltransferas. Exprese obou takových typů enzymů, stejně jako oligosacharidů, které jsou připraveny působením takových enzymů, a příbuzných glykoproteinů, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu.

Oligosacharidy popsané výše mohou být přidány, například, do kojeneckých přípravků, takže kojenec krmený takovým přípravkem může mít stejné výhody jako kojený kojenec. Například, je •fe ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · 9 9 9 9 9 ··· · · · · · · « • · · · · · *····· α · · ............

□ ·>» ·· ·· ·· ....

možné, aby oligosacharidy způsobovaly resistenci na infekci patogenními bakteriemi (Prieto et al., výše). Dále mohou být takové oligosacharidy přidány do jiných prostředků, jako jsou nutriční doplňky nebo farmaceutická činidla. Cílem předkládaného vynálezu je produkce transgenních savců s výjimkou člověka, kteří produkují takové oligosacharidy, buď za použití homologních, nebo heterologních enzymů, jako jsou například glykosyltransferasy. Takové oligosacharidy mohou být potom přidány do různých prostředků pro své výhodné vlastnosti.

Dále, přítomnost oligosacharidů a jiných glykokonjugátů v mléce transgenních savců může vést k získání ochrany před nebo resistence na virové, bakteriální nebo mykotické infekce nebo toxiny u potomstva takových zvířat.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro syntézu oligosacharidů a glykoproteinů pomocí transgenní exprese enzymů, například glykosyltransferas, během laktace. Dále vynález také obsahuje produkci oligosacharidových struktur, které nejsou v přírodě přítomné. Takové struktury mohou být vyrobeny transgenní expresí vhodných vybraných prokaryotických nebo eukaryotických enzymů, například glykosyltransferas, v savci. Proto předkládaný vynález umožňuje produkci homologních, heterologních a nových struktur v mléce transgenních zvířat.

Přesněji předkládaný vynález obsahuje způsob pro produkci non-lidských, transgenních savců, jejichž somatické a germinální buňky obsahují alespoň jeden transgen. Exprese transgenu vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savců. Způsob obsahuje kroky: (a) přípravu alespoň jednoho transgenu; (b) vložení transgenu nebo transgenů do non«« ··»· ·· ···· ·„ ,» * ; . · · · · ··*.

• · · · · e ···· • · »»· « · <ι « * « * lidského, savčího embrya a přenesení vzniklého embrya do samice; a (c) identifikaci alespoň jednoho samičího potomka. Exprese transgenu nebo transgenů vede k produkci alespoň jednoho enzymu, který potom katalyzuje produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savce. Každý transgen obsahuje, v operativní vazbě, alespoň jednu expresní regulační sekvenci funkční v sekrečních buňkách savce, DNA sekvenci kódující signální sekvenci funkční v sekrečních buňkách savce a DNA sekvenci kódující enzym. Savcem jiným než je člověk může být, například, myš, krysa, králík, prase, koza, ovce nebo kráva. Enzym může být, například, glykosyltransferasa jako je fukosyltransferasa, galaktosyltransferasa, acetylasa, glukuronyltransferasa, glukonylepimerasa, sialyltransferasa, mannosyltransferasa, sulfotransferasa, βacetylgalaktosaminyltransferasa nebo N-acetylglukosaminyltransferasa. Dále, oligosacharidem může být například, galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosa, 2'-fukosyllaktosa, 3'fukosyllaktosa, lakto-N-neo-tetraosa, lakto-N-tetraosa, laktoN-fukopentaosa, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosa II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosa III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosa IV, sialyžovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosa V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosa I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy I, lakto-N-di-fukopentaosa II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosa, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid._tv fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu z^sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.

• 9 • 9 · 9

Dále obsahuje předkládaný vynález transgenní savce s výjimkou člověka. Genom savce obsahuje alespoň jednu DNA sekvenci kódující enzym operativně navázanou na promotor specifický pro mléčnou žlázu. Exprese DNA sekvence nebo sekvencí vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savce. Savci, enzymy a oligosacharidy mohou být ty, které jsou uvedeny výše.

Dále obsahuje předkládaný vynález způsob pro produkci mléka u transgenních savců jiných než lidí. Způsob obsahuje: (a) přípravu alespoň jednoho transgenu; (b) inserci transgenu nebo transgenů do transgenního savce s výjimkou člověka; a (c) dojení transgenního savce jiného než člověka za zisku mléka. Mléko obsahuje oligosacharidy a glykoproteiny. Každý transgen obsahuje, v operativní vazbě, promotor funkční v sekrečních buňkách mléčných žláz a DNA sekvenci kódující enzym. Exprese každého transgenu vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savce. Savci, enzymy a oligosacharidy mohou být ty, které jsou uvedeny výše.

Dále obsahuje předkládaný vynález mléko produkované transgenním savcem s výjimkou člověka. Genom transgenního savce jiného než člověka obsahuje alespoň jednu DNA sekvenci kódující enzym. DNA sekvence je operativně navázaná na promotor. Exprese DNA sekvence vede nakonec k produkci oligosacharidů a glykoproteinů. Savci, enzymy a oligosacharidy mohou být ty, které jsou uvedeny výše.

Kromě toho předkládaný vynález také obsahuje frakci mléka popsaného výše. Frakce může obsahovat, například, jeden nebo více solubilních oligosacharidů a/nebo glykokonjugátů produkovaných v důsledku exprese transgenu nebo transgenů. Tak může frakce mléka obsahovat jednu nebo více uvedených složek • · 4 · · ♦ · · · · · • · » « « · * · · · · · · « * ·· ·♦ 4 ·

(t.j. oligosacharidů a glykokonjugátů) nebo jakoukoliv jejich kombinaci. Taková frakce může také obsahovat přirozené mléčné oligosacharidy transgenních zvířat v kombinaci s jedním nebo více oligosacharidy a/nebo glykokonjugaty produkovanými v důsledku přítomnosti transgenu nebo transgenů.

Dále předkládaný vynález obsahuje oligosacharid nebo glykoprotein přečištěný z mléka popsaného výše, stejně jako nutriční výrobek obsahující mléko, jeho frakci nebo oligosacharidy a/nebo glykoproteiny, které byly popsány výše. Tímto nutričním výrobkem může být kojenecký prostředek, v kapalné nebo pevné formě.

Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro dodání výživy pacientovi. Způsob obsahuje podání mléka, jeho frakce nebo oligosacharidů nebo glykoproteinů pacientovi v množství dostatečném pro výživu pacienta.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1-6 se týkají způsobu využívajícího expresi homologního enzymy , (t.j. myší UDP-Gaip-D-galaktosyltransferasy) .

Obr. 1 ilustruje přípravu konstruktu pWAP-GT.

Obr. 2 ilustruje chromatografickou analýzu galaktosa-a.1-3galaktosa- β1-4 -glukosy, nového oligosacharidů produkovaného jedním ze způsobů podle předkládaného vynálezu.

Obr. 3 znázorňuje elektroforetickou analýzu glycidů za pomoci fluoroforu (FACE) galaktosa-al-3-galaktosa-pi-4-glukosy.

Obr. 4 představuje FACE analýzu myšího mléka, do kterého byla přidána galaktosa-al-3-galaktosa-3l-4-glukosa.

Obr. 5 ilustruje příklad oligosacharidového profilu negativního transgenního, pozitivního transgenního a negativního kontrolního myšího mléka, jak byl určen za použití Dionex způsobu 2. Hlavní pík eluující ve 31-32 minutě by měl být trisacharid.

Obr. 6 znázorňuje FACE analýzu vzorků použitých v příkladu 5. Konkrétně, FACE analýza byla provedena pro potvrzení toho, že nový pík detekovaný na obr. 5 byl trisacharid. Proužek, který putuje shodně s proužkem standardu tvořeného G3 Škrobovým hydrolyzátem, je skutečně trisacharid.

Obr. 7-13 se týkají způsobu využívajícího expresi heterologního enzymu (t.j. H-a-1,2-fukosyltransferasy).

Obr. 7 znázorňuje oligosacharidové profily dvou vzorků králičího mléka získané za použití aniontové iontoměničové chromatografie při vysokém pH (HPAEC). Panel A je oligosacharidový profil vzorku získaného od kontrolního, netransgenního zvířete. Tento vzorek obsahuje laktosu a pouze stopové množství 2'-fukosyllaktosy (Fucal-2Gaipi-4Glc). Panel B je profil vzorku získaného od králíka v laktaci, jehož genom obsahoval transgen kódující lidskou Η-αΙ-2-fukosyltransferasu. Tento vzorek obsahoval měřitelné množství 2'-fukosyllaktosy a obsahoval méně než 1/10 koncentrace laktosy přítomné ve vzorku mléka od netransgenního zvířete. Panel C je profil získaný ze stejného vzorku použitého pro získání profilu na Panelu B, ale po kontaminaci vzorku 20 mg/l 2'-fukosyllaktosy.

« ·

Obr. 8 znázorňuje iontové chromatografické profily dalších vzorků mléka transgenních králíků. Panel A je kontrolní mléko, panel B je transgenní vzorek č. 2, panel C je transgenní vzorek č. 3 a panel D je transgenní vzorek č. 4. Pouze vzorek č. 4 (panel C) obsahoval významné množství 2'-fukosyllaktosy (t.j. > 50 mg/1). Vzorek č. 3 (panel B) měl značně sníženou koncentraci laktosy.

Obr. 9 znázorňuje elektroforetickou analýzu glycidů za použití fluoroforu (FACE) mléčných oligosacharidů před a po trávení al-2-fukosyllaktosou z nezpracovaného a enzymem zpracovaného králičího mléka, mléka transgenního králíka a standardu. Konkrétně, dráha 1 představuje autentický 2'fukosyllaktosový standard, dráha 2 představuje nezpracovaný transgenní vzorek č. 5, dráha 3 představuje fukosidasou zpracovaný transgenní vzorek č. 5, dráha 4 představuje nezpracovaný, netransgenní kontrolní vzorek a dráha 5 představuje fukosidasou zpracovaný kontrolní vzorek. Dráha 6 představuje sadu standardů tvořených lineárními glukosovými polymery, kde G2 znamená dvě glukosové jednotky a G3 znamená tři glukosové jednotky.

Obr. 10 představuje FACE dalších vzorků od transgenních králíků. Konkrétně, dráha 1 představuje autentický 2'fukosyllaktosový standard, dráha 2 představuje nezpracovaný transgenní vzorek č. 5, dráha 3 představuje další vzorek transgenního mléka, dráha 4 představuje transgenní vzorek č. 4, dráha 5 představuje netransgenní kontrolní vzorek, dráha 6 představuje sadu standardů tvořených lineárními glukosovými polymery a dráha 7 představuje transgenní vzorek č. 3.

Obr. 11 znázorňuje Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA-1) westernovou analýzu proteinů transgenního a kontrolního králičího mléka. Dráha 1 představuje netransgenní kontrolní vzorek, dráha 2 představuje transgenní vzorek č. 1, dráha 3 představuje transgenní vzorek č. 2a dráha 4 představuje druhou netransgenní kontrolu.

Obr. 12 znázorňuje UEA-1 westernovou analýzu proteinů dalších vzorků králičího mléka. Dráha 1 představuje netransgenní kontrolní vzorek, dráha 2 představuje transgenní vzorek č. 4, dráha 3 představuje transgenní vzorek č. 3, dráha 4 představuje netransgenní kontrolní vzorek a dráha S představuje standardy molekulové hmotnosti.

Obr. 13 znázorňuje SDS elektroforetické gely barvené Coomassie modří, ve kterých byly analyzovány proteiny králičího mléka. Dráha 1 ukazuje barvené proteiny z mléka netransgenní kontroly, dráha 2 je transgenní vzorek č. 3, dráha 3 je transgenní vzorek č. 4, dráha 4 je transgenní vzorek č. 5 a dráha S představuje barvené standardy molekulové hmotnosti.

Obr. 14-16 se týkají způsobu exprese enzymu (t.j. lidské fukosyltransferasy IV) za použití heterologní laktogenně indukované transgenní exprese.

Obr. 14 představuje chromatografické profily mléčných oligosacharidových extraktů. Panel A představuje kontrolní oligosacharidý extrakt, panel B představuje oligosacharidový extrakt z transgenního mléka a panel C představuje představuje oligosacharidový extrakt z transgenního mléka zpracovaný enzymem (t.j. 3-fukosyltransferasou).

Obr. 15 znázorňuje FACE analýzu gelové elektroforesy použité k analýze fluoroforem-značených oligosacharidů. Dráha 1 je značený škrobový hydrolyzát použitý jako standard molekulové • 0 0 00 0 hmotnosti, dráha 2 je neutrální profil získaný z mléka netransgenního kontrolního zvířete, dráha 3 je skutečná 3fukosyllaktosa, dráha 4 je neutrální profil transgenního zvířete exprimujícího FucT-IV, a dráha 5 je stejný materiál jako ve dráze 4, ale po trávení fukosidasou.

Obr. 16 ilustruje FACE vybraných frakcí z oligosacharidových extraktů z kontrolního a transgenního mléka po aniontové iontoměničové chromatografií při vysokém pH. Panel A představuje vzorek transgenního mléka a panel B představuje netransgenní kontrolu. Dráha 1 gelu představuje barvivo, dráha 2 transgenní oligosacharidový extrakt (frakce eluující v 19,5 minutě), dráha 3 je transgenní oligosacharidový extrakt (frakce eluující ve 20,0 minutě), dráha 4 představuje transgenní oligosacharidový extrakt (frakce eluující ve 20,5 minutě), dráha 5 je skutečná 3-fukosyllaktosa, dráha 6 je kontrolní f

oligosacharidWyextrakt (frakce eluující ve 20,0 minutě) a dráha 7 je kontrolní oligosacharidový extrakt (frakce eluující ve

20,5 minutě) a dráha 8 představuje oligosacharidový standard.

Obr. 17 a 18 se týkají simultání transgenní exprese glykosyltransferas u myší.

Obr. 17 je chromatogram mléčného oligosacharidového profilu od kontrolního, netransgenního zvířete.

Obr. 18 je chromatogram mléka získaného od transgenního savce exprimujícího lidskou Fuc al-2-transferasu a myší Galal3-transferasu.

Obr. 19 - 21 se týkají způsobu pro transgenní expresi bakteriální glykosyltransferasy v laktujících mléčných žlázách myši.

•fl*??

*· ··· · ·«

Obr. 19 ukazuje chromátogram získaný z testu enzymové aktivity kontrolních L-buněk.

Obr. 20 a 21 ukazují oligosacharid syntetizovaný transfektovanými L buňkami exprimujícími bakteriální Nacetylglukosaminyltransterasu.

Jak bylo uvedeno výše, předmětem vynálezu je způsob pro produkci jednoho nebo více oligosacharidů a/nebo glykokonjugátů v mléku transgenních savců s výjimkou lidí za použití transgenní technologie. Jeden oligosacharid, který může být připraven způsobem podle předkládaného vynálezu (t.j. galaktosa-ccl-3-galaktosa β1-4 glukosa) , má novou strukturu a dosud nikdy nebylo popsáno, že by existoval jako volný oligosacharid. Takové transgenně produkované oligosacharidy a/nebo glykokonjugaty produkované způsobem podle předkládaného vynálezu mohou být přidány do kojeneckých přípravků nebo lékařských nutričních prostředků podávaných ve stáří nebo imunokompromitovaným pacientům. Způsoby podle předkládaného vynálezu a jejich varianty mají tu výhodu, že umožňují navržení mléčných oligosacharidových profilů transgenních zvířat.

Stručně, pro produkci vybraného mléčného oligosacharidů nebo oligosacharidů je segment DNA kódující vybraný enzym izolován z určitého eukarotického nebo prokaryotického organismu. Tento enzym je odpovědný za produkci sekundárního genového produktu nebo mléčného oligosacharidů. Po izolaci je DNA segment vložen do vektoru obsahujícího různé genetické složky, jako je například polyadenylační signál a promotor. Část vektoru obsahující vybrané složky je potom insertována do projádra embrya stejného nebo jiného savčího druhu jako je druh, od • 9 · 9 9 · «9 9

9 9 •9 9 • 9 9 9

9 9 9

9999

9 9

9 9

9 · • · f 9

9 · C>

«9 * 9 9 *· 9

9 9 •9 9 kterého byl DNA segment izolován. Embryo je potom implantováno samici a nechá se proběhnout porod. Vzorky mléka potomstva obsahují vybraný oligosacharid nebo oligosacharidy. Další generace jsou také vyšetřovány na produkci oligosacharidů nebo oligosacharidů a tak na inkorporaci genu nebo genů kódujících vybraný enzym nebo enzymy do svých genomů. Je třeba zdůraznit, že do embrya může být vložen více než jeden transgen, což vede k produkci více než jednoho oligosacharidů. Proto je potenciál předkládaného vynálezu neomezený. Každý krok způsobu podle předkládaného vynálezu je podrobně popsán dále.

Enzym

Vybraný enzym, který má být exprimován, je vybrán podle oligosacharidů nebo oligosacharidů, které mají být produkovány v mléku transgenních savců s výjimkou člověka. Enzym může být, například, glykosyltransferasa. Mezi vhodné glykosyltransferasy patří například fukosyltransferasy, jako je a-1,2fukosyltransferasa, fukosyltransferasa IV nebo H fukosa-a1,2-transferasa, galaktosyltransferasy jako je gal a-1-3transferasa, acetylasa, glukuronyltransferasa, glukosylepimerasa, sialyltransferasa, mannosyltransferasa, sulfotransferasa, β-acetylgalaktosaminyltrahsferasa nebo Nacetylglukosaminyl-transferasa. Enzymem volby je výhodně galaktosyltransferasa, nejlépe UDP-Gal-B-D-a 1,3galaktosyltransferasa, sialyltransferasa nebo al-3/4fukosyltransferasa jako je FucT-III nebo FucT-IV.

Glykosyltransferasy kódované transgeny jsou směrovány signálními sekvencemi, buď přirozenými kódovanými cDNA nebo genomovou DNA, nebo sekvencemi přidanými pomocí standardních technik genetického inženýrství. Mohou být přítomny v ·· ·· · · • · » · · · • · 9

9 9 • 9 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9

9 9 • 9 9 9 9

9 9 9

9 9

99

9 9 9

9 9 · • 9 9 9 laktogenní buňkách transgenních zvířat a mohou být navázány na intracelulární membránové kompartmenty (například na endoplasmatické retikulum, Golgiho aparát nebo sekreční vesikuly) laktogenních buněk, nebo mohou existoval jako volné katalytické polypeptidy v lumen takových kompartměntů. Vzhledem ke vhodné intracelulární lokalizaci mají enzymy přístup k nukleotidům obsahujícím cukry nebo k jinému zdroji cukrů syntetizovanému buňkami laktující mléčné žlázy nebo získanému takovými buňkami z krve zvířete. Takovými donory cukrů jsou výhodně nukleotidy obsahující cukry.

Glykosyltransferasy mají schopnost katalyzovat přenos monosacharidových jednotek z donorového cukru na akceptor, jako je laktosa, jiné oligosacharidy, glykolipidy nebo glykoproteiny. Glykosyltransferasy mají omezenou nebo širokou specificitu jak pro donory, tak pro akceptory a mohou přenášet více než jednu monosacharidovou jednotku na vznikající nebo prodlužující se glykokonjugat. Tak mohou být opakovaným nebo neopakovaným působením glykosyltransferas syntetizovány větší oligosacharidy a/nebo polysacharidy. Glykosyltransferasy mohou být sami o sobě glykoproteiny nebo neglykosylované glykoproteiny a mohou a nemusí mít další translační a posttranslační modifikace.

Je třeba opět uvést, že oligosacharidový profil transgenního zvířete může být určen volbou jednoho nebo více vhodných enzymů, které produkují vybrané oligosacharidy a glykoproteiny.

Dále je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález umožňuje simultání expresi dvou nebo více enzymů a tím příslušných oligosacharidů a glykoproteinů. Tak může být potenciálně vytvořen transgenní savec jiný než člověk, například kráva, který je schopen produkce mnoha oligosacharidů přítomných v • ft ftftftft • ft « ftft· ft· · • ftft · • ft · · ft lidském mateřském mléku. Tyto oligosacharidy mohou být potom přidány například do kojeneckých prostředků, čímž získají kojenecké prostředky výhody spojené s oligosacharidy v mateřském mléku. Savci, jako je kráva popsaná výše, se mohou pářit (t.j. křížit) pro získání potomstva, které je schopno produkce různých oligosacharidů ve svém mléce.

Dále předkládaný vynález také zahrnuje produkci enzymů (například glykosyltransferas) z bezobratlých. Mezi takové bezobratlé patří, například, Schistosoma mansonii nebo bakterie, jako jsou bakterie rodu Neisseriae. Tyto enzymy mohou být exprimovány v aktivní formě v savčích tkáních v průběhu laktace.

Transgenní savci s výjimkou lidí

Savec, ze kterého může být izolována cDNA kódující vybraný enzym, je vybrán ze skupiny zahrnující, například, myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci, koně a krávu. Nicméně, může být použit jakýkoliv savec, pod podmínkou, že má schopnost inkorporovat DNA kódující vybraný enzym do svého genomu.

Emryo, do kterého je vložena cDNA, může a nemusí odpovídat druhu, od kterého byla DNA izolována, podle toho, zda je žádoucí heterologní exprese nebo homologní exprese enzymu. Přesněji, pokud se produkuje lidský enzym, který způsobuje produkci lidského oligosacharidů v mléce transgenního savce jiného než člověka (t.j. je použita heterologní exprese enzymu), tak je transgenním savcem jiný savec než člověk, například prase nebo koza. Pokud se produkuje například kozí enzym, který způsobuje produkci alespoň jednoho oligosacharidů v kozím mléku ((t.j. je použita homologní exprese enzymu), tak je použitým transgenním savcem koza.

♦ 0 0000

• · 0 φ · 0 • * · · • φ · 0 • φ 00 • · 0 0

Φ · Φ Φ

Φ « Φ 0 • 0 0 0

Φ · 00

Při homologní expresi umožňuje předkládaný vynález syntézu oligosacharidů, které se přirozeně nevyskytují, jako je například galaktosa al-3 galaktosa β1-4 glukosa, stejně jako všech přirozených oligosacharidů. Dále předkládaný vynález umožňuje analýzu účinnosti syntézy enzymu kočovaného vybraným genem. Dále, protože je enzym přirozený pro savce (t.j. je odvozený od stejného druhu), je redukován potenciál vlastní imunitní reakce proti enzymu nebo intolerance u kojeného potomstva. Dále, protože některé enzymy (například glykosyltransferasy) se vyskytují pouze u některých druhů, je při použití dostupných genů kódujících homologní enzymy spektrum potenciálních oligosacharidů, které mohou být transgenně syntetizovány v mléku, zvětšeno.

Také je třeba s ohledem na homologní expresi uvést, že homologní glykosyltransferasa, například, může být získána a klonována ze tkání jiných než je laktující mléčná žláza. Například, myší glykosyltransferasa, které je normálně exprimována v játrech a jiných tkáních, ale která není exprimována v laktujících mléčných žlázách myši, může být exprimována během laktace pomocí působení laktogenně reaktivního promotoru. Sekunární genové produkty (t.j. oligosacharidy a glykokonjugaty) jsou potom přítomné v mléku transgenní myši. Proto je možné, jak je popsáno v příkladu 1, syntetizovat oligosacharidy, které nejsou normálně syntetizovány laktující mléčnou žlázou daného savce, stejně jako je možné transgenně exprimovat v laktující mléčné žláze glykosyltransferasy, které jsou normálně exprimovány v jiných tkáních.

Vektor ·· 0*0 0 ··· • 000

·· 0 • 0 0 ·

Entita, do které je insertována cDNA (kódující enzym), je označována jako vektor. Vektorem může být, například, bakteriální plasmid (například pBR-322). Pokud je použit bakteriální plasmid, tak by měl obsahovat alespoň jednu rekombinantní DNA sekvenci, která řídí expresi genu a syntézu proteinů, výhodně během laktace, buď cDNA nebo genového fragmentu kódujícího alespoň jednu glykosyltransferasu, a dále by měl obsahovat DNA sekvenci kódující polyadenylační místo nutné pro správné zpracování RNA. Alternativně může být vektor konstruován za použití jiných plasmidů, kosmidů, fágové DNA, virů a jiných vektorů specifických pro kvasinky, rostliny, savce a jiné vhodné hostitele.

Promotor, který reguluje expresi cDNA, genu nebo genového fragmentu kódujícího enzym a který je operativně navázán na tuto sekvenci, může být, například, laktalbuminový promotor, kaseinový promotor, promotor syrovátkového kyselého proteinu (WAP) nebo jiný laktogenní promotor.

Polyadenylačním signálem může být, například, savčí nebo virový signál, včetně například poly-a signálu SV-40T-antigenu, ovalbuminu nebo hovězího růstového hormonu (bGHpdyA).

Oligosacharidy

Oligosacharidy, které mohou být připraveny způsobem podle předkládaného vynálezu, zahrnují, například, galaktosa a-1-3galaktosa-p-l-4-glukosa, 2'-fukosyllaktosa, 3’-fukosyllaktosa, lakto-N-neo-tetraosa, lakto-N-tetraosa, například a-lakto-Ntetraosa, lakto-N-fukopentaosa I a její sialylovaný derivát, lakto-N-fukopentaosa II a její sialylovaný derivát, lakto-Nfukopentaosa III a její sialylovaný derivát, lakto-N17 ·· ···· fukopentaosa IV a její sialyj.ováný derivát, lakto-Nfukopentaosa V a její sialyiovaný derivát, lakto-N-difukopentaosa I a její sialy. i ováný derivát, lakto-N-difukopentaosa II a její sialyiovaný derivát, lakto-N-hexaosa a její fukosylovaný derivát, sialyltetrasacharid a, bača jejich fukosylované deriváty a jiné lidské a non-lidské mléčné oligosacharidy.

Galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosa a al-2fukosyllaktosa jsou připraveny způsobem uvedeným v příkladech. První sloučenina představuje nový, nepopsaný sekundární genový produkt syntetizovaný transgenní technologií. Nikdy před publikováním předkládaného vynálezu nebylo popsáno, že by galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosa existovala.v přírodě jako volný oligosacharid. Předpokládá se, že tento oligosacharid může být použit například jako činidlo pro indukci tolerance na Galal-3 antigen u lidí před xenotransplantací orgánů, jako je srdce, játra a ledviny, od zvířat.

Je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález zahrnuje mléko produkované transgenními savci s výjimkou člověka, které obsahuje jeden nebo více výše uvedených oligosacharidů. Dále předkládaný vynález obsahuje frakcé mléka, stejně jako oligosacharidy a glykokonjugaty (například glykoproteiny) izolované a přečištěné z mléka. Takové frakce mohou zahrnovat, například, pevné složky mléka, delipidované mléko nebo mléko po sebrání smetany, mléko, ze kterého byla odstraněna smetana nebo lipidy, solubilní glycidovou frakci (t.j. specifické oligosacharidy buď samostatně, nebo v kombinaci s přirozenými uhlovodany produkovanými savcem) a/nebo specifické glykokonjugaty nebo skupiny glykokonjugátů. Takové frakce mohou • Φ Φ 1 • Φ φφ být získány způsoby známými odborníkům v oboru, jako je například odpařování, lyofilizace, krystalizace, ultrafiltrace, dialýza nebo chromatografie (například afinitní, aniontová iontoměničová chromatografie nebo gelová vylučovací chromatografie).

Dále obsahuje předkládaný vynález glykokonjugaty (například proteiny lidského mléka a proteiny lidského séra), které jsou modifikovány působením transgenně exprimovaného enzymu. Takové glykokonjugaty mohou být endogenně nebo transgenně exprimovány. Příklady proteinů lidského mléka (t.j. glykoproteinů), které mohou být takto modifikovány, zahrnují imunoglobuliny, lysozym, laktoferin, kappa-kasein, a-laktalbumin, β-laktalbumin, laktoperoxidasu a lipasu stimulovanou žlučovými solemi. Enzym může, například, přidávat vazebnou skupinu na glykoproteinů, které se přirozeně nevyskytuje (viz Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 270: 29515-29519 (1995)). Proto může být glykoprotein substrátem pro enzym.

Je třeba si uvědomit, že jak homologní, tak heterologní glykoproteiny mohou být transgenně exprimovány u savce, který již exprimuje transgeny kódující glykosyltransferasy. Proto může být přímá glykosylace důsledkem působené endogenních, stejně jako transgenně exprimovaných glykosyltransferas.

Předkládaný vynález bude dále dokreslen následujícími příklady, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

V příkladu 1 byla použita následující činidla a přístrojové vybavení:

·· ·«·· • · · φ · · φ • 9 9 9 ·· ··

Činidla :

1) 500 mM hydroxid sodný a 200 mM hydroxid sodný, RICCA Chemical Company (Arlington, TX), prostý uhličitanů, National Institute of Standards and Technology (NIST)-traceable (Baxter Inc., McGaw Park, IL);

2) Octan sodný, ACS čistota (Sigma, St. Louis, MO);

3) kit obsahující FACE činidla (Glyko Inc., Novato, CA);

4) Milli-Q voda (Millipore, Bedford, MA); a

5) kyselina sírová, Ultrex Ultrapure čistota (Baxter).

Přístrojové vybavení:

Sušení vzorků: Všechny vzorky a standardy byly sušeny za použití Speed Vac Plus SC210A vybaveného mrazícím lapačem par RVT4104 (Savant, Farmingdale, IL).

Příklad 1: Exprese myší UDP-Gaip-D-al,3-galaktosyltransferasy (homologní exprese)

A. Příprava plasmidu a vytvoření transgenních myších embryí

Genetický konstrukt byl připraven v Edison Biotechnology Institute na Ohio University (Athens, Ohio). cDNA kódující myší UDP-Gal:β-D-Galal,3-galaktosyltransferasu byla insertována do plasmidu obsahujícího polyadenylační signál hovězího růstového hormonu (bGHpolyA) a laktogenně indukovatelný promotor myšího syrovátokového kyselého proteinu (WAP) (viz obr. 1). EcoRIBamHI fragment byl injikován mikroinjekčně do pronukleu myších embryí. Přítomnost genu byla detekována přenosem na membránu se značením. Mléko od laktujících myší bylo odebíráno a skladováno při -70 °C do přesunu do Ross Labs pro analýzu glycidů.

B. Vysokoúčinná aniontová iontoměničová chromatografická analýza oligosacharidů z A.:

•0 ·0·« ··

Myší mléčné oligosacharidové standardy byly analyzovány na

Dionex Bio-LC systému s následujícím vybavením:

Pumpa: Dionex Advanced Gradient pumpa

Detektor: Dionex Pulsed Elektrochemical Detector vybavený zlatou pracovní elektrodou a pH/refereční elektrodou

Automatický dávkovač:

Spectrophysics Refrigerated AS3500

Kolony: Způsob 1: Dionex CarboPac PA1 analytická kolona (4 x 250 mm) s předkolonou (4 x 50 mm) ;

Způsob 2: Dionex CarboPac PA1 analytické kolony (4 x 250 mm každá, zapojené sériově) s předkolonou (4 x 50 mm);

Chemická úprava:

Dionex AMMS-II Anion Micromembrane Suppresion (umístěný po detektoru, ale před sběračem frakce použitý pro neutralizaci vzorků), regenerovaný 0,15% kyselinou sírovou za použití Dionex AutoRegen přístroje a Anion Regenerate Cartrige

Sběrač frakcí:

BioRad Model 2110 (BioRad lne., Hercules, CA) .

Veškeré vybavení bylo zakoupeno od Dionex, lne. (Sunnyvale,

CA), pokud není uvedeno jinak. Byla použita následující eluens:

(A) Milli-Q voda (nebo ekvivalent); (B) 500 mM hydroxid sodný;

(C) 600 mM octan sodný ve 100 mM hydroxidu sodném; a/nebo (D) 200 mM hydroxid sodný, při průtoku 1,0 ml/min. Tabulka 1 ukazuje eluční profily pro dvě použité metody. Nastříknutý objem byl 20 μΐ.

• ♦ <

» · · 4 ·· 9 9 ···· ·· 99 • 9 4

Analýza vzorků a standardů na Dionex: Všechny vzorky a/nebo standardy byly analyzovány bez dalšího ředění.

Tabulka 1: Eluční profily Způsob 1:

Čas (min)	%A	%B	%c	%D
0, 0	50	0	0	50
12, 0	50	0	0	50
12,1	46	0	7	47
20,0	46	0	7	47
20, 1	45	0	10	45
27,0	45	0	10	45
27,1	25	0	50	25
32, 0	25	0	50	25
32, 1	50	0	0	50
59, 0	50	0	0	50

Způsob 2:

Čas (min)	%A	%B	%c	%D
O o	99	1	0	0
60, 0	0	100	0	0
60, 1	99	1	0	0
75, 0	99	1	0	0

A = Milli-Q voda;

B = 500 mM NaOH;

C = 600 mM NaOHAc/lOO mM NaOH; D = 200 mM NaOH.

9499 • 4

4 • 4 4

4 4 • 4 ··»·

4 ·

4 4 • 4 4 4 • 4 4 4 • 4 44

4« 49

4 4 4 • ·4 9

4 4 4

4 4 4 »4 44

Tabulka 2: Nastavení detektoru

Integrační parametry	Způsob 1	Způsob 2
Výchozí šířka píku	50	8, 0
Práh píku	0, 5	25
pEAK AREA reject	500	1000
PED recorder range	0,100 μο	0,300 μθ

Způsob 1: Forma vlny:

Integrace:

Čas (s)	Potenciál (V)	Začátek (s)	Konec (s)
0, 00	0,40	0, 30	0, 50
0, 50	0, 40
0, 51	0, 90
0, 59	0, 90
0, 60	-0, 30
0, 65	-0,30

Způsob 2: Forma vlny

Integrace:

Čas (s)	Potenciál (V)	Začátek (s)	Konec (s)
0, 00	0, 00	0, 20	0,40
0, 40	0, 05
0,41	0, 75
0, 60	0, 75
0, 61	-0, 15
1, 00	-0, 15

C. Elektroforesa glycidů s navázaným fluoroforem (FACE)

Vzorky a standardy pro FACE byly připraveny za použití činidel (Glyko) a návodu dodaného výrobcem. Elektroforesa byla • · · · · · • · · · · · i • β ··· ·· · • ·· * · ·· · provedena za doporučených podmínek. Obrazování gelů bylo provedeno za použití FACE Imager (Glyko).

Standard syntetické Galctl-3Gaipi-4Glc, 15 mM (7,5 μg) byl resuspendován ve 37,5 μΐ vody za vzniku 200 ppm roztoku. 4 μΐ tohoto roztoku byly ředěny 36 μΐ vody a byly analyzovány HPAEC (viz obr. 2 za použití způsobu 1) (zbylý roztok standardu byl rozdělen do 5 μΐ alikvot a byl skladován zmrazený pro další použití). Frakce (0,5 ml) byly odebírány a frakce odpovídající standardovému píku (38-44) byly odebrány a sušeny přes noc na Speed Vac při teplotě okolí. Výsledný sušený materiál byl značen během 3 hodin při 45 °C podle návodu výrobce. Vzorek byl potom resuspendován ve 14 μΐ vody a 2 μΐ (105 pmol) byly ředěny ve 2 μΐ zaváděcího pufru a byly vneseny do polyakrylamidového gelu. Elektroforesa gelu byla provedeny podle návodu výrobce. Fluorografické zobrazení gelu je uvedeno na obr. 3.

Jak je uvedeno v popisu obrázků, ukazuje obr. 5 příklad oligosacharidových profilů negativního transgenního, pozitivního transgenního a negativního kontrolního myšího mléka, jak byly analyzovány HPAEC za použití způsobu 2. Předpokládá se, že velký pík eluující v 31-32 minutě je trisacharid. Při HPAEC způsobu 1 se vytváří malý arteficiální pík, který eluuje velmi blízko trisacharidovému standardu a který je přítomen také při způsobu 2, což potvrzuje, že tento nový detekovaný pík je trisacharid. Potom byly oligosacharidové extrakty z těchto vzorků značeny a testovány FACE. 8 μΐ oligosacharidových extraktů bylo sušeno a zančeno podle návodu pro kit. Značené vzorky byly resuspendovány v 10 μΐ vody a 2 μΐ byly vneseny do gelu. Do gelu byl také vnesen dříve označený vzorek trisacharidového standardu. Zobrazení • ·· ·

tohoto gelu je uvedeno na obr. 6. Proužek migrující spolu se standardem tvořeným G3 škrobovým hydrolyzátem je trisacharid.

D. Extrakce myšího mléka

Vzorky myšího mléka, které byly uskladněny při -70 °C, byly rozmraženy při teplotě okolí. 100 μΐ bylo pipetou přeneseno do 500 μΐ Eppendorfovy centrifugační zkumavky a byla provedena centrifugace po dobu 20 minut při llOOO rpm za použití Biofuge 15 (Baxter, McGaw Park, II). Pečlivě byla odstraněna lipidová vrstva a střední vrstva byla přenesena do druhé 500 μΐ zkumavky. Do zkumavky se přidal dvojnásobný objem chladného (4 °C) ethanolu a zkumavka se promísila a umístila se alespoň na 20 minut na led. Potom se provedlo centrifugování způsobem uvedeným výše. Čirý supernatant se přenesl do třetí zkumavky a tento extrakt se sušil při střední teplotě přes noc ve SpeedVac. Proteinové pelety se také sušily a uskladnily se při -70 °C do analýzy. Sušené oligosacharidové extrakty se resuspendovaly ve 100 μΐ vody a uskladnily se při -70 °C do analýzy. Z důvodů malého množství dostupného standardu nebyl celý tento postup proveden pro standard; nicméně, u jiných oligosacharidů byla provedena tato extrakční. metoda bez významné ztráty množství (data nejsou uvedena).

Tabulka III ukazuje souhrn všech testovaných WAP/GT očíslovaných transgenních mlék. Z 23 testovaných transgenních vzorků (kde transgenní znamená pozitivní na kopie transgenu v přenosu na membránu se značením) bylo 10 zvířat (neboli 44% všech zvířat v relevantních zárodečných liniích), pozitivních na syntézu trisacharidu. (Poznámka: vzorky označené jako B6SLJ byly potomky negativní kontrolní/netransgenní myši).

• · · ·

• · ·

Tabulka III

18	B6SLJ
12	B6SLJ
21	B6SLJ
25	B6SLJ
4	8	1	19	hemi	3061,187	negativní	3
5	8	1	20	hemi	3061,187	negativní
3	8	1	22	hemi	3061,187	negativní
β	8	2	13	homo	3147,19	negativní
11	8	2	23	homo	3061,242	negativní
1	64	0			3061,11	negativní	2
13	82	1	71	hemi	3147,23	negativní	1-2
7	98	8			3147,2	negativní	1
16	106	1	93	hemi	3147,199	negativní	1
29	106	2	61	hemi	3147,200	negativní
8	109	1	48	hemi	3147,21	pozitivní	1-2
15	109	1	67	hemi	3147,24	pozitivní
20	109	1	118	hemi	3147,2	negativní
22	109	2	50	hemi	3147,2	negativní
27	109	2	51	hemi	3147,2	pozitivní
17	109	2	51	hemi	3147,2	pozitivní
18	109	2	53	hemi	3147,2	pozitivní
28	109	2	54	hemi	3147,2	pozitivní
2	156	0			3061,187	pozitivní	5
9	156	0			3061,242	pozitivní
10	156	1	42	hemi	3061,242	pozitivní
23	156	1	100	hemi	3147,199	negativní
26	156	2	27	hemi	3147,2	pozitivní
14	193	0				netestováno	1
24	193	1	120	hemi		netestováno

• ft ····

♦ • · ft · · · • ftft · · ·

Povšimněte si v tabulce III, že vzorky mléka potomků stejného zvířete mohou, ale nemusí být pozitivní na syntézu trisacharidu; přítomnost kopie (nebo kopií) transgenu v DNA nezaručuje to, že myš bude schopna syntetizovat trisacharid (viz například výsledky pro mléko od různých potomků zvířete č. 109). Je možné, že tyto vzorky obsahovaly trisacharid; nicméně, jeho produkce byla pod detekčním limitem metody (přibližně 10 ppm) .

E. Přidání trisacharidového standardu do kontrolního myšího mléka

1852 pmol trisacharidového standardu bylo sušeno v 500 μΐ ependorfově centrifugační zkumavce. Do zkumavky se přidalo 100 μΐ kontrolního (netransgenního) myšího mléka a obsah zkumavek se důkladně promísil. Z tohoto mléka s přidaným standardem se odstranily tuky a proteiny, způsobem uvedeným výše. Získalo se 45 μΐ ethanolového extraktu, z nichž se 20 μΐ (teoreticky obsahujících 820 pmol) trisacharidu) sušilo a provedlo se značení během 3 hodin při 45 °C pro oligosacharidovou analýzu (Glyko). Po sušení se vzorek resuspendoval v 10 μΐ vody a 2 μΐ se vnesly do FACE gelu. Zobrazení gelu je uvedeno na obr. 4.

Pro srovnání bylo také analyzován kontrolní vzorek mléka bez přidaného standardu.

Všechny vzorky a/nebo standardy v C a D byly analyzovány HPAEC bez dalšího ředění.

Příklad 2: Exprese lidské cti, 2-fukosyltransf erasy v králících (heterologní exprese) • ·· ·

Vytvoření transgenních embryí bylo provedeno ve spolupráci s Dr. John Kopchick a jeho spolupracovníky na Edison Biotechnology Institute na Ohio University v Athens, Ohio, a ve spolupráci s Zdizislaw Smorage na Zootechnics Institute v Balíce, Polsko. 90% použitých králíků bylo odrůdy New Zealand a zbylých 10% bylo odrůdy California.

A. Příprava transgenních zygot

Zygoty byly odebírány od králičích samic věku 4-6 měsíců, u kterých byla vyvolána superovulace. Superovulace byla vyvolána standardními postupy za použití 50-100 i.u,. sérového gonadotropinu z březích klisen (PMSG) injikovaného intramuskulárně, po kterém následovala za 72 hodin intravenosní injekce 50-100 i.u. lidského choriového gonadotropinu (HCG). Ihned po injekci HCG byly superovulované samice spářeny nebo inseminovány čerstvým nebo zmrazeným semenem od 5-měsíčních samců. 20-22 hodin po inseminaci nebo páření byly samice utraceny a zygoty byly odebrány výplachem vejcovodu PBS. Do zygot byla mikroinjekčně vpravena DNA (t.j. lineární DNA fragment excidovaný z plasmidu popsaného dříve (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 49: 29515-29519 (1995)) obsahující transkripční regulační region, který obsahoval promotor myšího syrovátkového kyselého proteinu, cDNA kódující lidskou Η-αΙ-2-fukosyltransferasu a sekvenci kódující polyadenylační signál hovězího růstového hormonu) kódující 2'fukosyltransferasu v množství 2-6 ng/ml, 1-2 hodiny po výplachu, za použití invertního mikroskopu s Namarskiho optikou a mikropipet připojených na Da Venbrinovíy nebo Leitzoviy mikromanipulátory.

B. Implantace transgenních zygot a odběr mléka • · · · • · · · · ·

Jednu hodinu po mikroinjekci byly zygoty chirurgicky přeneseny do vejcovodů synchronizovaných, pseudobřezích samic věku 5-6 měsíců. Popis průběhu inseminace je uveden v tabulce

4. Mláďata byla testována na úspěšnou transkripci DNA pomocí tečkové hybridizace. Mléko od dvou takových zvířat, spolu s mlékem od netransgenních kontrol, bylo odebráno a analyzováno.

Tabulka 4: Popis průběhu inseminace

Skupina č.	Počet inseminováných samic	Počet březích samic	Počet živě narozených králíků	Počet mrtvě narozených králíků
I	8	7	26	1
II	4	4	16	8
III	20	16	67	17
IV	20	7	k k	* *
Celkem	52	34	109	26

** Informace nejsou dosud k dispozici

C. Příprava mléka získaného od potomstva

Vzorky mléka od transgenních a kontrolních králíků byly ředěny 1:3 ethanolem a byly odeslány do Ross Laboratories (Columbus, OH). Tyto vzorky byly důkladně promíseny a centrifugovány lOminut při 10000 rpm. Ethanolová vrstva byla odebrána a byla přenesena do čisté zkumavky pro oligosacharidovou analýzu a sraženiny byly zmrazený pro další analýzu proteinů.

D. Oligosacharidové profily μΐ každého ethanolového extraktu bylo ředěno 50 μΐ vody. Roztoky byly filtrovány přes předem propláchnuté 30000 MWCO ···· • ♦ · · · • · · · · • · · · · ·

filtry (Microcon, Amicon, lne., Berverly, MA) a tento materiál byl analyzován HPAEC způsobem 1 (viz příloha 1 na konci tohoto příkladu). Kontaminované vzorky kontroly a transgenních vzorků byly připraveny ředěním 50 μΐ vzorku 48 μΐ vody a 2 μΐ 1000 ppm 2'-fukosyllaktosy a filtrací, která byla provedena způsobem popsaným výše. Tyto vzorky byly také analyzovány. Druhá sada vzorků mléka byla analyzována bez dalšího ředění.

Ze zbývajících ethanolových extraktů bylo 240 μΐ sušeno ve Speed Vac (Savant, lne., Farmingdale, IL). Extrakty byly potom resuspendovány na objem pomocí 7% IPA a byly filtrovány přes Micronon 30000 MWCO filtr způsobem uvedeným výše. 20 μΐ každého vzorku ze sady jedna a 50 μΐ každého vzorku ze sady dvě bylo sušeno a značeno přes noc podle návodu výrobce (Glyko, lne., Novato, CA) . Potom byly tyto vzorky značeny přes noc podle návodu výrobce (Glyko, lne.). Značené vzorky byly resuspendovány v 10 μΐ vody. 2 μΐ každého vzorku byly vneseny na oligosacharidový gel a byla provedena elektroforesa.

F. Zpracování fukosidasou μΐ filtrovaných IPA ředění ze sady jedna bylo sušeno ve dvou zkumavkách, spolu s 2'-fukosyllaktosovými (2'-FL) alikvotami o 1000 ppm. Vzorky byly resuspendovány ve 25 μΐ lx PBS, pH 8,5. 200 mU al,2-fukosidasy z Arthrobacter oxidans (Takara-Panvera, Madison, WI) v PBS bylo přidáno do jedné zkumavky. Stejný objem převaleného /deaktivovaného) enzymu byl přidán do druhé zkumavky. Vzorky byly inkubovány při 37 °C přes noc v toluenové atmosféře. Potom byly vzorky filtrovány přes vypláchnuté Centricon 10000 MWCO filtry )Amicon) za použití 950 μΐ vody pro výplach. Filtráty byly potom zpracovány na On-Guard

9 0 00 0 •0 ····

0· ·· ·

Φ 0· ♦

0· 00 ·

0 0 9 0

00

A - kolonkách obsahujících silný aniontový iontoměnič (Dionex), které byly připraveny podle návodu výrobce. Vzorky byly vyplachovány za použití 200 μΐ vody. Získané filtráty se zmrazily, sušily a značily přes noc pro FACE analýzu (Glyko). Vzorky byly ředěny v 10 μΐ vody a 2 μΐ alikvoty tohoto materiálu se zpracovaly elektroforesou a zobrazením.

F. SDS-PAGE a westernový přenos glykoproteinů

Proteinové pelety se rozmrazily při teplotě okolí, dvakrát se promyly chladným ethanolem a sušily se. Potom se resuspendovaly ve 2x SDS denaturačním pufru. Vzorky se zahřívaly ve vroucí vodě po dobu 5 minut pro denaturaci proteinů a potom se ochladily. Za použití lx SDS pufru se připravila ředění. Vzorky a předem barvený standard o nízké molekulové hmotnosti (Sigma, St. Louis, MO) se zavedly do polyakrylamidového gelu (Novex, lne., San Diego, CA) a provedla se elektroforesa v Xcell II Mini Cell Systému (též od Novex). Takto získaný gel se přenesl na PVDF membránu a sondoval se přes noc Aglutininem I Ulex europeanus (UEA I) (značeným peroxidasou, Sigma). Po promytí TBS-Tween 20 se gel vyvíjel za použití DAB-Hydrogen Peroxide Staining roztoku (Sigma). Sušený gel se snímal a digitalizoval za použití běžného 300 dpi skeneru.

Výsledky:

Obr. 7 ukazuje chromatografické oligosacharidové profily vzorků kontrolního netransgenního, pozitivního transgenního a pozitivního transgenního králičího mléka s přidaným trisacharidem , jak byly získány z jednoho vzorku. Transgenní vzorek č. 1 obsahoval 2'-FL, což je potvrzeno profilem vzorku s přidaným trisacharidem. Povšimněte si velkého rozdílu v koncentraci laktosy mezi kontrolním a transgenním vzorkem.

·· ···· ·· ····

Druhý transgenní vzorek (č. 2), o kterém bylo zjištěno, že je negativní (neobsahuje 2'-FL), není znázorněn. V profilech uvedených na obr. 8 obsahují vzorky č. 4 (panel C) ač. 5 (panel D) 2'-FL v množství detekovatelném touto metodou. Tento vzorek vykazuje značné snížení koncentrace laktosy, zatímco vzorek č. 3 (panel B) neobsahuje žádnou detekovatelnou laktosu.

Pro další potvrzení charakteru oligosacharidů přítomných ve vzorcích mléka od transgenních zvířat byly oligosacharidy z kontrolního netransgenního a transgenního mléka podrobeny hydrolýze al-2-fukosidasou. Tento enzym výlučně hydrolyzuje 12 vazby fúkosy. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. Skutečná 2'fukosyllaktosa (2'-FL) je ukázána v dráze 1, zatímco nezpracované oligosacharidy z transgenního vzorku jsou ukázány v dráze 2. Dráha 3 ukazuje stejný materiál jako dráha 2, ale po zpracování fukosidasou. Proužek migrující se skutečnou 2'-FL je pozorovatelný v dráze 2. Tento proužek zmizí po zpracování fukosidasou, což dále potvrzuje přítomnost 2'-FL ve vzorku transgenního mléka. Oligosacharidy z kontrolního netransgenního vzorku byly v podstatě nezměněny po zpracování fukosidasou (viz dráhy 4 a 5) .

FACE oligosacharidové profily dalších vzorků mléka jsou uvedeny na obr. 10. Dráha 2 tohoto obrázku ukazuje analyzované značené oligosacharidy z mléka vzorku č. 5. Dráha 3 ukazuje oligosacharidy jiných vzorků transgenního mléka. Dráha 4 ukazuje oligosacharidy vzorku č. 4. Dráha 5 je profil od kontrolního netransgenního zvířete a dráha 7 je vzorek č.

3.Tyto výsledky potvrzují chromatografické profily obr. 8 a dále podporují teorii, že některé vzorky transgenního mléka postrádaly laktosu.

···· ·· 99··

9

Obr. 11 srovnává westernové analýzy vzorků mléčných proteinů č. 1 a č.2, které byly sondovány UEA-1. Pozitivní proužky jsou přítomny pouze ve dráze 2 odpovídající jednomu pozitivnímu transgennímu vzorku. Ani vzorek č. 2,ani netransgenní kontrola neobsahovaly proteiny, které jsou glykosylovány fukosou v a1,2-vazbě. Westernové analýzy pro další vzorky jsou uvedeny na obr. 12. Jak bylo očekáváno, vzorek č. 4 obsahoval proteiny, které jsou fukosylovány v a-1,2-pozici. Vzorek č. 3, nicméně, také obsahoval podobné proteiny. Tyto výsledky nebyly očekávány vzhledem k chybění detekovatelně 2'-FL, která v dalších dvou metodách nebyla přítomna. Všechny další dosud analyzované vzorky (včetně myších) obsahovaly fukosylované proteiny.

Barvení gelu Coomassie modří bylo identické jako barvení na obr. 12 a je uvedeno na obr. 13. Tento obr. ilustruje, že ačkoliv nebyl UEA-I u netransgenních kontrol detekován žádný protein, bylo ve vzorků přítomno mnoho proteinů. Naopak, srovnej celkové proteiny nalezené ve vzorcích č. 3 a č. 4 s proužky detekovanými UEA-I westernovým přenosem. Ačkoliv byly přítomny v téměř nedetekovatelných množstvích, byly silně detekovány lektinem.

Příloha I: Chromatografické podmínky

Oligosacharidová analýza za použití vysoko aniontové iontoměničové chromatografie.

Vzorky byly analyzovány za použití Dionex Bio-LC systému vybaveného pulsním elektrochemickým detektorem, za použití jedné analytické CarboPac PA-1 kolony s předkolonou. Podmínky byly následující:

Sensitivita: 0,200 C

Doba analýzy: 45 minut ·· ···· ···· • * · . · · <

·· ··

Šířka píku: 8,0 sekund Práh píku: 25,00 Plocha nehodnocených plků: 1000 Objem vzorku: 20 1

Gradientový program:

0-12 minut: 100 mM NaOH

12.1 - 20 minut: 42 mM NaOAc ve 100 mM NaOH

20.1 - 27 minut: 60 mM NaOAc ve 100 mM NaOH

27.1 32 minut: 300 mM NaOAc ve 100 mM NaOH

32.1 - 45 minut: 100 mM NaOH

PED program:

Forma vlny: Integrace:

Čas (s)	Potenciál (V)	Začátek (s)	Konec (s)
0, 00	0, 05	0,20	0, 40
0,40	0, 05
0, 41	0, 75
0, 60	0,75
0, 61	-0, 15
1,00	-0, 15

Příklad 3: Exprese lidské fukosyltransferasy IV v myších (heterologní exprese)

Lidská fukosyltransferasa (t.j. H fukosa al-2-transferasa) byla dříve exprimována v laktujících mléčných žlázách myší (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 270: 29515-19 (1995)) . Její exprese vedla k produkci oligosacharidů a glykoproteinů syntetizovaných enzymem. Pro dokázání potenciální širší aplikace tohoto systému pro produkci sekundárních ftft ftftftft • ft · ftftft • · · • ftft · •ft ··♦· ftft ft • ftft • · · • · · ft ftft ftft • ft ftft ft ftft · • ftft · • ftft · • ft · · • ft ft* genových produktů se vynálezci rozhodly transgenně exprimovat glykosyltransferasu jinou než lidskou H-fukosa al-2transferasu u myší. Jedním takovým enzymem je fukosyltransferasa IV (Kukosawa-Latallo et al·., Genes and Devolopment 4: 1288-1303 (1989)). Tento enzymje přítomen v některých vzorcích lidského mléka (Serenella et al., Glycoconjugate Journal 6: 101-114 (1989)) a je významný proto, že je odpovědný za syntézu některých antigenů krevních skupin (Legault et al., The Journal of Biological Chemistry 270: 20987 - 20996 a Ginsburg et al., v Immunology of Erythrocyte, Alan R. Liss, lne., New York, New York). Tyto antigeny krevních skupin jsou významné, protože jsou zvýšeny při nádorových onemocněních (Orntof et al., The Journal of Biological Chemistry 271: 3226032268 (1996)) a předpokládá se jejich účast na fenoménu buněčné adhese, například při zánětech (Lowe et al., The Journal of Biological Chemistry 266: 17467—17477)). Exprese lidského enzymu fukosyltransferasy IV a syntéza 3-fukosyllaktosy byly provedeny způsobem popsaným dále.

Byla použita následující činidla:

• 500 mM hydroxid sodný a 200 mM hydroxid sodný, RICCA Chemical Company (Arlington, TX) , bezuhličitanový;

• NIST-traceable (Baxter lne., McGaw Park, IL) ;

• Octan sodný, ACS čistota (Sigma, St. Louis, MO);

• kit obsahující FACE činidla (Glyko lne., Novato, CA);

• Milli-Q voda (Millipore, Bedford, MA); a • kyselina sírová, Ultrex Ultrapure čistota (Baxter).

Sušení vzorků: Všechny vzorky a standardy byly sušeny za použití Speed Vac Plus SC210A vybaveného mrazícím lapačem par RVT4104 (Savant, Farmingdale, IL) .

9 ··* · ♦ ··«

A. Příprava plasmidu a vytvoření transgenních myších embryí

Genetický konstrukt byl připraven v Edison Biotechnology Institute na Ohio University (Athens, Ohio). cDNA (t.j. lineární DNA fragment excidovaný z plasmidu popsaného dříve (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 270: 2951529519 (1995)) obsahující transkripční regulační region, který obsahoval promotor syrovátkového kyselého proteinu, cDNA kódující lidskou al-3/4-fukosyltransferasu (FucT-IV) a sekvenci kódující polyadenylační signál hovězího růstového hormonu (bGHpolyA)) kódující lidskou fukosyltransferasu (IV) byla insertována do plasmidu obsahujícího polyadenylační signál hovězího růstového hormonu (bGHpolyA) a laktogenně indukovatelný promotor myšího syrovátokového kyselého proteinu (WAP). EcoRI-BamHI fragment byl injikován mikroinjekčně do pronukleu myších embryí. Přítomnost genu byla detekována membránovým přenosem se značením. Mléko od laktujících myší bylo odebíráno a skladováno při -70 °C do přesunu do Ross Laboratories (Columbus, OH) pro analýzu glycidů. Mléko od dvou z těchto samic bylo odebráno a analyzováno.

B. HPAEC analýzy vzorků a standardů:

Myší mléčné oligosacharidy a oligosacharidové standardy byly analyzovány na Dionex Bio-LC systému s následujícím vybavením: Pumpa: Dionex Advanced Gradient pumpa

Detektor: Dionex Pulsed Elektrochemical Detector vybavený zlatou pracovní elektrodou a pH/refereční elektrodou

Automatický dávkovač:

Spectrophysics Refrigerated AS3500

Dionex CarboPac PA1 analytické kolony (4 x 250 mm každá, zapojené sériově) s předkolonou

Kolony:

-•.'-Λ’..’·,·:'· • · fefefefe · · · · · · ·· · · • · · ·· · · · · · • fefe fefefe fefefefe fefe fefefefe ······ (4 x 50 mm);

Chemická úprava:

Dionex AMMS-II Anion Micromembrane Suppresion (umístěný po detektoru, ale před sběračem frakce, použitý pro neutralizaci vzorků), regenerovaný 0,15% kyselinou sírovou za použití Dionex AutoRegen přístroje a Anion Regenerate Cartrige

Sběrač frakcí:

BioRad Model 2110 (BioRad lne., Hercules, CA).

Veškeré vybavení bylo zakoupeno od Dionex, lne. (Sunnyvale, CA), pokud není uvedeno jinak. Byla použita následující eluens: (A) Milli-Q voda (nebo ekvivalent); (B) 500. mM hydroxid sodný;

(C) 600 mM octan sodný ve 100 mM hydroxidu sodném; a/nebo (D) 200 mM hydroxid sodný, při průtoku 1,0 ml/min. Tabulka 5, dále, ukazuje eluční profily pro dvě použité metody. Injikovaný objem byl 20 μΐ.

Všechny vzorky a/nebo standardy byly analyzovány bez dalšího ředění. Někdy byla další charakterizace považována za nezbytnou. Frakce byly odebírány (0,5 min. na frakci) a sušeny ve zkumavkách použitých pro odběr. Tyto vzorky byly.potom použity pro FACE analýzu. Kdykoliv to bylo možné, byly provedeny chromatogramy pro transgenní a kontrolní zvířata. Pro předběžnou charakterizaci byly do alikvot přidány autentické standardy 3-fukosyllaktosy. Tímto způsobem byla prokázána současná eluce neooligosacharidu se skutečnou 3fukosyllaktosou.

·· 0000 00 ···· ·· 00 • « · 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 · · · 0 · • 0 0 0 0 · ··· ·· 0 • 0 00 «0 00 00 00

Tabulka 5: Eluční profily

A = Milli-Q voda;

B = 500 mM NaOH;

C = 600 mM NaOHAc/lOO mM NaOH; D = 200 mM NaOH

Čas (min)	%A	%B	%c	%D
0, 0	99	1	0	0
60,0	0	100	0	0
60, 1	99	1	0	0
75, 0	99	1	0	0

Tabulka 6: Nastavení detektoru

Integrační parametry	Způsob 1	Způsob 2
Výchozí šířka píku	50	8, 0
Práh píku	0, 5	25
pEAK AREA reject	500	1000
PED recorder range	0,100 μο	0,300 μθ

Způsob:

Forma vlny: Integrace:

Čas (s)	Potenciál (V)	Začátek (s)	Konec (s)
0, 00	0, 00	0,20	0,40
0, 40	0, 05
0, 41	0,75
0, 60	0, 75
0, 61	-0, 15
1, 00	-0, 15

♦ · · · • · · · · * • Φ · · · · • · · · · · · • · · · · · <

φ · ·· · ·

C. Elektroforesa glycidů s navázaným fluoroforem (FACE)

Vzorky a standardy pro FACE byly připraveny za použití činidel a návodu dodaných výrobcem (Glyko, Novalto, CA). Elektroforesa byla provedena za doporučených podmínek. Zbrazování gelů bylo provedeno za použití FACE Imager (Glyko).

Vzorky mléčných oligosacharidových extraktů (10 μΐ) byly sušeny a značeny 3 hodiny při 45 °C pro oligosacharidovou analýzu (Glyko), jak byla popsána dříve. Po sušení byly vzorky resuspendovány v 10 μΐ vody a 2 μΐ byly vneseny do polyakrylamidového gelu pro analýzu oligosacharidů. Zobrazení elektroforetogramů bylo provedeno za použití Glyko Face Imager.

D. Extrakce myšího mléka

Vzorky myšího mléka, které byly uskladněny při -70 °C, byly rozmraženy při teplotě okolí a důkladně promíseny. 50 μΐ bylo pipetou přeneseno do 500 μΐ Eppendorfovy zkumavky a přidalo se 100 μΐ chladného absolutního ethanolu. Výsledná směs se promísila a provedlo se centrifugování po dobu 15 minut při 4 °C a 11000 rpm za použití Biofuge 15 (Baxter, McGaw Park, IL). Po centrifugaci se 85 μΐ čirého supernatantu přeneslo do jiné 500 μΐ centrifugační zkumavky a přidalo se 199 μΐ destilované deionizované vody. Výsledná směs se dobře promísila a 50 μΐ se přeneslo do zkumavky automatického přístroje pro odběr vzorků, ředilo se 1:1 vodou a analyzovalo se aniontovou iontoměničovou chromatografii při vysokém pH (HPAEC). Tento konečný roztok se považoval za oligosacharidový extrakt vzorku mléka.

E. Přidání skutečné 3-fukosylaktosy do mléka φφ ·· · · · · · · · · φφφ φ · · φφφφ • · φ φ φ φ φφφ φφ φ φ · · · · ·Φ Φ φ φφ 4 φφ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

Roztok 3-fukosyllaktosy Gaipi-4[Fucal-3]Glc ο koncentraci 50 mg/1 se přidal do 50 μΐ oligosacharidového extraktu popsaného výše a provedlo se důkladné promísení. Tento vzorek mléka obsahující skutečnou 3-fukosyllaktosu se potom přímo analyzoval chromatografií a výsledky se srovnávaly s výsledky získanými pro oligosacharidový extrakt ředěný vodou.

F. Zpracování exoglykosidasami

Fukosidasy z Corynebacterium sp (al-2 specifické) a Streptomyces sp. (al-3/4 specifické) byly získány od Takara Panvera (Madison, WI). E. coli a další použitá činidla byla maximální dostupné čistoty a pokud není uvedeno jinak, tak byly získány od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

G. Separace neutrálních a nabitých oligosacharidů

Oligosacharidové extrakty (200 μΐ alikvoty) byly separovány do neutrální a nabité frakce pro usnadnění detekce a identifikace neooligosacharidů syntetizovaných v důsledku působení transgenem kódované fukosyltransferasy.

Kolona (3 ml) DE-52 (diethylaminoethylcelulosa, Whatman, Maidstone, England) byla uvedena do rovnováhy ve 0,002 M pyridinacetatovém pufru (pH 5,4) za použití přibližně 20 objemů kolony. Alikvoty oligosacharidového extraktu byly aplikovány do kolony, nechaly se proniknout do pryskyřice a potom se ponechaly v klidu po dobu 5-10 minut. Neutrální oligosacharidý byly potom eluovány 6 objemy stejného pufru. Takto získaná frakce byla sušena a byla připravena pro značení a elektroforesu glycidů s navázaným fluoroforem. Frakce • · ·· · 9 9 9 9 · 9 9 • 99 ··· 9 9 · · • 9 9 · 9 9 999999 »9 9 9 99 9 9 99 9 «9 99 99 99 99 99 obsahující náboj byla eluována z kolony potom za použití 5 objemů kolony 0,2 M pyridinacetatového pufru.

Výsledky:

Obr. 14 ukazuje chromatogramy pro oligosacharidové extrakty kontrolních a transgenních mlék (panel A a B, v příslušném pořadí). Je jasně vidět, že pík byl získán pro mléko získané od zvířete transfektovaného fukosyltransferasou FucT-IV, zatímco v mléce od netransgenního kontrolního zvířete byl přítomen pouze stopový signál. Dále, do materiálu ukázaného na panelu B byla přidána skutečná 3-fukosyllaktosa pro stanovení toho, zda neooligosacharid přítomný v mléce transgenního zvířete byl skutečně 3-fukosyllaktosa (panel C). Eluce tohoto glycidu odpovídá nezávislé eluci skutečné 3-fukosyllaktosy, jak je znázorněna šipkou v panelu B.

Dále, oligosacharidové extrakty od kontrolních a transgenních zvířat byly separovány na neutrální oligosacharidy a sialyoligosacharidy nebo negativně nabité struktury. Toto umožnilo lepší zobrazení při analýze značených oligosacharidů gelovou elektroforesou. Obr. 15 je zobrazení gelu použitého pro rozdělení neutrálních značených oligosacharidů (dráha.1 je značený škrobový hydrolyzát použitý jako standard molekulové hmotnosti, dráha 2 je neutrální profil získaný z mléka netransgenního kontrolního zvířete, dráha 3 je skutečná 3fukosyllaktosa, dráha 4 je neutrální profil transgenního zvířete exprimujícího FucT-IV a dráha 5 je stejný materiál jako ve dráze 4, ale po specifickém trávení fukosidasou).Proužek migrující současně se skutečnou 3-fukosyllaktosoubyl jasnězřetelný pouze v profilu z transgenního vzorku a tento proužek zmizel po trávení specifickou 3-fukosidasou'. Dále, materiál nebyl citlivý na hydrolýzu al-2-fukosidasou.

(* · « 9 4 4

9 4 » 9 9 «

Pro další charakterizaci neooligosacharidu byly frakce odebírány přímo z chromatografických eluátů. Oligosacharidové extrakty byly analyzovány HPAEC, jak byla popsána výše, a eluaty byly odebírány ve frakcích. Každá frakce odpovídala 0,5 minutám eluce. Odebrané frakce jsou označeny na obr. 16, panelu A pro vzorky transgenního mléka a panelu B pro vzorky netransgenní kontroly. Tyto frakce byly značeny a aplikovány na FACE, jak je uvedeno v popisu elektroforetogramu na obr. 16.

Jak HPAEC, tak FACE ukázaly, že netransgenní zvíře má pouze stopové množství oligosacharidů migrujícího současně se skutečnou 3-fukosyllaktosou (dráha 5). Nicméně, frakce z oligosacharidového extraktu vzorku mléka získaného od transgenního zvířete obsahovala zřetelný signál migrující současně s 3-fukosyllaktosou. Toto dále podporuje teorii, že 3fukosyllaktosa je syntetizována expresí transgenu.

ú>_v'č&SHC\P>

Příklad 4:iBxprese dvou transgenních fukosyltransferas pomocí křížení dvou dříve připravených myších transgenních linií

Samice stabilní genetické linie exprimující lidskou fukosyltransferasu H, řízenou laktogenním promotorem (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 49: 29515-29519 (1995)) se nechaly pářit s myšími samci ze stabilní transgenní linie exprimující myší Gal al-3-transferasu, též řízenou laktogenním promotorem (viz příklad 1).

Vzniklé potomstvo bylo testováno na přítomnost transgenů ve svém genomu, za použití biopsií z ocasu a sondování vhodnými hybridizačními sondami. Samice, které se zdály být pozitivní na oba transgeny, se dále pářily a nechaly se rodit v termínu. Od ·· ···· ·· ···· ·· ·· • * · · · · · · • · * · · · · · * « · · · · · · · · • · · · · · · · · · ·· ·· · · · · ·· těchto samic bylo získáno mléko, jehož glycidový profil byl stanoven aniontovou iontoměničovou chromatografií při vysokém pH (HPAEC), jak je popsána v příkladech 1 a 2.

Jak je vidět na obr. 17 a 18, hlavní signál byl pozorován v době eluce 2'-fukosyllaktosy, zatímco menší signál byl pozorován přesně v elučním čase syntetického trisacharidu Gal al-3 Gal pi-4Glc. Jsou uvedeny eluční pozice skutečných standardů.

Výše uvedené výsledky ukazují, že pro získání transgenních zvířat, které produkují mléko obsahující komplexní oligosacharidové a glykoproteinové profily je nutné začít de novo a injikovat myším embryím konstrukty kódující nové glykosyltransferasy. Křížení transgenních zvířat exprimujících různé glykosyltransferasy povede ke vzniku zvířat, které dědí transferasy od svých rodičů podle Mendeiových pravidel. Toto nakonec povede k syntéze příslušných sekundárních genových produktů.

Příklad 5: Transgenní exprese bakteriální glykosyltransferasy (t.j. UDP-GlcNAc:Gaipi-4) v laktujících mléčných žlázách myši

Byla použita GlcNAc-transferasa od Neisseria polysaccharea.

Pořadí kodonů genu kódujícího enzym bylo změněno tak, aby se upřednostnily kodony, které se běžně nacházejí v savčích genech. Pozměněný gen byl použit pro transfekci myších L buněk, které jsou běžně používány jako myší buněčná linie. Po ověření aktivity v těchto savčích buňkách je výsledná DNA kódující GlcNAc-transferasu použita pro přípravu konstruktu vhodného pro transgenní expresi v průběhu laktace u myší.

• · * · · · · • ·· » · ·« » »· ·· ·· ··

Aktivita GlcNAc transferasy byla testována testem syntézy v kapalné fázi. Myší L buňky (t.j. pelety z Petriho misek) byly resuspendovány ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku obsahujícím 1 mM CaCl₂, 2 0 mM laktosy a 20 mM UDP-GlcNAc. Vzniklá směs se sonikovala po dobu 5 minut a inkubovala se přes noc při 37 °C. Vzniklá inkubační směs se potom filtrovala přes microcon (Amicon, Beverly, MA) centricon (10000 AMU limit molekulové hmotnosti) filtry a filtrát se ředil pro HPAEC analýzu.

Oligosacharidové extrakty byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 1. Obr. 19-21 jasně ukazují, že bakteriální enzym je úspěšně exprimován v savčí tkáni.

Mléko, transgenních zvířat může obsahovat tetrasacharid lakto-N-neotetraosu (NnnT) v důsledku exprese N-acétylglukosaminyl-transferasy.

Claims (26)

1. Způsob produkce transgenního savce jiného než člověka, jehož somatické a germinální buňky obsahují alespoň jeden transgen, kde exprese uvedeného transgenů vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku uvedeného savce vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) přípravu alespoň jednoho transgenů, který obsahuje v operativní vazbě (1) alespoň jednu expresní regulační sekvenci funkční v savčích sekrečních buňkách, (2) DNA sekvenci kódující signální sekvenci funkční v savčích sekrečních buňkách, a (3) DNA sekvenci kódující enzym;

(b) vložení uvedeného alespoň jednoho transgenů do savčího embrya jiného než lidského a přenesení vzniklého embrya do samice;

(c) identifikaci alespoň jednoho samičího potomka, u které exprese uvedeného alespoň jednoho transgenů vede k produkci alespoň jednoho enzymu, který katalyzuje produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku uvedeného savce.

2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený transgenní savec jiný než člověk je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.

3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený enzym je glykosyltransferasa.

4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, φφ φφ ··♦· • φ φφφφ φ · φφφφ φ φφφ φ φ φ • · φ φ φ φ φ mannosyltransferasu, sulfotransferasu, βacetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.

5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa-^-l-4-glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'fukosyllaktosu, lakto-N-neo-tetraosu, lakto-N-tetraosu, laktoN-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosu, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.

6. Transgenní savec jiný než člověk vyznačující se tím, že jeho genom obsahuje alespoň jednu DNA sekvenci kódující enzym operativně navázanou na promotor specifický pro mléčnou žlázu, kde exprese uvedené alespoň jedné DNA sekvence vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléce uvedeného savce.

7. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 6

0 · 0 0 0 0

00 0 00 0 0900

000 00 0 0000 0 0 0 0 0 0 000 00 0 • 0*000000000

............

vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.

8. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 6 vyznačující se tím, že uvedeným enzymem je glykosyltransferasa.

9. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 8 vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, mannosyltransferasu, sulfotransferasu, βacetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.

10. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 6 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa^-l-4glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'-fukosyllaktosu, lakto-N-neotetraosu, lakto-N-tetraosu, lakto-N-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy II, lakto-Nfukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-di-fukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy II, lakto-Nhexaosu, fukosylovaný derivát lakto-N-hexaosy,

99 99 • ·· · ftft ·»*· • · · · · • · · · · • · · 9 9 · • 9 9 9 9 9 9

9999 99

9 ♦ · · • · · · · • · 9 ·

99 99 sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.

11. Způsob produkce mléka v transgenním savci jiném než člověku vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) přípravu alespoň jednoho transgenu, který obsahuje v v

operativní vazbě (1) promotor funkční v savčích sekrečních buňkách, (2) DNA sekvenci kódující enzym, kde exprese uvedeného transgenu vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku uvedeného savce;

(b) vložení uvedeného alespoň jednoho transgenu do transgenního savce jiného než člověka;

(c) odběr mléka od uvedeného transgenního savce, kde uvedené mléko obsahuje uvedené oligosacharidy a glykoproteiny.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že uvedený transgenní savec jiný než člověk je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.

13. Způsob podle nároku 11 vyznačuj ící se tím,

I že uvedený enzym je glykosyltransferasa.

14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, mannosyltransferasu, sulfotransferasu, β0 0 0 0 0 0

00 00··

00 0 00 t 0000

900 00 0 0099

00 0000 000 0·· 0000 0000 0009

Lf# ............

acetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.

15. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'fukosyllaktosu, lakto-N-neo-tetraosu, lakto-N-tetraosu, laktoN-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylzovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosu, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.

16. Mléko vyznačující se tím, že je produkované transgenním savcem jiným než člověkem, kde genom uvedeného transgenního savce jiného než člověka obsahuje alespoň jednu sekvenci kódující enzym, kde uvedená DNA sekvence je operativně navázána na promotor, kde exprese uvedené alespoň jedné DNA sekvence vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů.

17. Mléko podle nároku 16 vyznačující se tím, že

99 9999 99 9999 99 ·· • · 9 9 9 * 9 9 9 9 • · 9 999 9999 • 9 9 9 9 9 999 99 9

9999 9999 9999

W ............

uvedený transgenní savec jiný než člověk je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.

18. Mléko podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený enzym je glykosyltransferasa.

19. Mléko podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, mannosyltransferasu, sulfotransferasu, βacetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.

20. Mléko podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa-p~l-4-glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'fukosyllaktosu, lakto-N-neo-tetraosu, lakto-N-tetraosu, laktoN-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy I, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosu, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný • fe fefefefe •fe fefefefe • fe derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.

21. Frakce mléka podle nároku 18 vyznačuj ící se tím, že obsahuje alespoň jeden oligosacharid, alespoň jeden glykoprotein nebo jejich kombinaci.

22. Oligosacharid nebo glykoprotein přečištěný z mléka podle nároku 16.

23. Nutriční prostředek vyznačující se tím, že obsahuje mléko podle nároku 18, frakci podle nároku 21 nebo oligosacharid nebo glykoprotein podle nároku 22.

24. Nutriční prostředek podle nároku 23 vyznačuj ící se tím, že se jedná o kojeneckou výživu.

25. Nutriční prostředek podle nároku 24 vyznačuj ící se t í m, že kojenecká výživa je v kapalné nebo pevné formě.

26. Způsob výživy pacientů vyznačující se tím, že obsahuje podání mléka podle nároku 18, frakce podle nároku 21 nebo oligosacharidů nebo glykoproteinů podle nároku 22 pacientovi v množství dostatečném pro uvedenou výživu.