JP2002291372A - トランスジェニック哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 臓器移植に好適に利用されるトランスジェニ
ック哺乳動物を提供する。 【解決手段】 本発明は、超急性拒絶の生じる局所の細
胞で機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコ
サミン転移酵素IIIの遺伝子からなる導入遺伝子、また
は当該調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転移
酵素IIIの遺伝子とヒト補体制御因子の遺伝子からなる
導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳
動物である。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、
超急性拒絶の生じる局所の細胞のα-Gal抗原を減少して
いる、またはα-Gal抗原を減少すると共にヒト補体制御
因子発現しており、Discordant異種移植において問題と
なる超急性拒絶反応を抑制する上で非常に有効である。
ック哺乳動物を提供する。 【解決手段】 本発明は、超急性拒絶の生じる局所の細
胞で機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコ
サミン転移酵素IIIの遺伝子からなる導入遺伝子、また
は当該調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転移
酵素IIIの遺伝子とヒト補体制御因子の遺伝子からなる
導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳
動物である。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、
超急性拒絶の生じる局所の細胞のα-Gal抗原を減少して
いる、またはα-Gal抗原を減少すると共にヒト補体制御
因子発現しており、Discordant異種移植において問題と
なる超急性拒絶反応を抑制する上で非常に有効である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はトランスジェニック
哺乳動物に関する。より詳細には、本発明はヒトのN-ア
セチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子を有しα-ガラ
クトース抗原を減少しているヒト以外のトランスジェニ
ック哺乳動物に関する。更に、本発明はヒトのN-アセチ
ルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子を有しα-ガラクト
ース抗原を減少すると共に、ヒトの補体制御因子の遺伝
子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関
する。
哺乳動物に関する。より詳細には、本発明はヒトのN-ア
セチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子を有しα-ガラ
クトース抗原を減少しているヒト以外のトランスジェニ
ック哺乳動物に関する。更に、本発明はヒトのN-アセチ
ルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子を有しα-ガラクト
ース抗原を減少すると共に、ヒトの補体制御因子の遺伝
子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関
する。
【０００２】
【従来の技術】臓器移植は極めて有用な根治療法であ
り、近年、臓器の機能不全を治療するために腎臓移植、
肝臓移植、心臓移植等の臓器移植が行われている。臓器
移植には、同種移植（ドナーとレシピエントが同一の種
に属する場合）と異種移植（ドナーとレシピエントが異
なる種に属する場合）があり、各々長所と短所を併有し
ている。同種移植は異種移植に比べて拒絶反応等の問題
は少ないが、ヒトがレシピエントの場合には、ドナーの
数に限りがあるという欠点がある。これに対し、近年、
動物の臓器をヒトに移植する（異種移植）ための研究が
欧米を中心に盛んに行われている。臓器を提供するドナ
ー動物としては、ヒトに最も近い点でサルが好ましい
が、サルは希少で知性の高い野生動物であることから、
サルの利用は困難な状況にある。そこで、家畜、中でも
臓器サイズ、形態がヒトに近く、繁殖や増産技術の確立
しているブタの臓器を利用するための研究が行われるよ
うになってきた。なお、異種移植のうち、近縁種間（例
えば、ヒヒ−ヒト間）の移植はConcordant異種移植と呼
ばれ、遠縁種間（例えば、ブタ−ヒト間）の移植はDisc
ordant異種移植と呼ばれている。
り、近年、臓器の機能不全を治療するために腎臓移植、
肝臓移植、心臓移植等の臓器移植が行われている。臓器
移植には、同種移植（ドナーとレシピエントが同一の種
に属する場合）と異種移植（ドナーとレシピエントが異
なる種に属する場合）があり、各々長所と短所を併有し
ている。同種移植は異種移植に比べて拒絶反応等の問題
は少ないが、ヒトがレシピエントの場合には、ドナーの
数に限りがあるという欠点がある。これに対し、近年、
動物の臓器をヒトに移植する（異種移植）ための研究が
欧米を中心に盛んに行われている。臓器を提供するドナ
ー動物としては、ヒトに最も近い点でサルが好ましい
が、サルは希少で知性の高い野生動物であることから、
サルの利用は困難な状況にある。そこで、家畜、中でも
臓器サイズ、形態がヒトに近く、繁殖や増産技術の確立
しているブタの臓器を利用するための研究が行われるよ
うになってきた。なお、異種移植のうち、近縁種間（例
えば、ヒヒ−ヒト間）の移植はConcordant異種移植と呼
ばれ、遠縁種間（例えば、ブタ−ヒト間）の移植はDisc
ordant異種移植と呼ばれている。
【０００３】ブタ−ヒト間のDiscordant異種移植の場合
には、移植片は分単位で拒絶される。このような現象は
超急性拒絶と呼ばれている。この超急性拒絶はヒト血清
中の自然抗体がブタ移植片（臓器、組織、細胞など）の
異種抗原と反応し、補体依存性細胞障害反応（補体反
応）を惹起することにより生じる。異種抗原として最も
重要視されている物は、ブタの細胞の糖鎖（糖タンパク
質、糖脂質）の非還元末端に存在するGalα1,3Gal配列
（以下、α-Gal抗原）であるとされている。α-Gal抗原
はα-1,3-ガラクトース転移酵素（以下、α-1,3GT）の
作用によりN-アセチルラクトサミン構造にガラクトース
がα1,3結合されて合成される（図1参照）。一方、ヒト
組織はα-Gal抗原を発現していない。哺乳類のうち今か
ら2000万〜3000万年前以降に系統発生した旧世界サル
（アジア、アフリカに生息する）、類人猿（チンパンジ
ー、ゴリラ、オランウータン）及びヒトの場合には、α
-Gal抗原をつくり出すα-1,3GT遺伝子は点変異により生
じたフレームシフトによって偽遺伝子（pseudogene）と
なっており（J. Biol. Chem., 265: 7055-7061 (199
0)）、逆に、この糖鎖抗原に対して強い自然抗体をもっ
ている。ヒトIgGの1％は、このα-Gal抗原に対する抗体
であると言われている（Blood, 82: 2485-2493 (199
3)）。
には、移植片は分単位で拒絶される。このような現象は
超急性拒絶と呼ばれている。この超急性拒絶はヒト血清
中の自然抗体がブタ移植片（臓器、組織、細胞など）の
異種抗原と反応し、補体依存性細胞障害反応（補体反
応）を惹起することにより生じる。異種抗原として最も
重要視されている物は、ブタの細胞の糖鎖（糖タンパク
質、糖脂質）の非還元末端に存在するGalα1,3Gal配列
（以下、α-Gal抗原）であるとされている。α-Gal抗原
はα-1,3-ガラクトース転移酵素（以下、α-1,3GT）の
作用によりN-アセチルラクトサミン構造にガラクトース
がα1,3結合されて合成される（図1参照）。一方、ヒト
組織はα-Gal抗原を発現していない。哺乳類のうち今か
ら2000万〜3000万年前以降に系統発生した旧世界サル
（アジア、アフリカに生息する）、類人猿（チンパンジ
ー、ゴリラ、オランウータン）及びヒトの場合には、α
-Gal抗原をつくり出すα-1,3GT遺伝子は点変異により生
じたフレームシフトによって偽遺伝子（pseudogene）と
なっており（J. Biol. Chem., 265: 7055-7061 (199
0)）、逆に、この糖鎖抗原に対して強い自然抗体をもっ
ている。ヒトIgGの1％は、このα-Gal抗原に対する抗体
であると言われている（Blood, 82: 2485-2493 (199
3)）。
【０００４】一方、何らかの方法で超急性拒絶を克服し
た場合でも、移植数日後から数週間後には、血管内皮細
胞の浮腫、虚血、血栓を特徴とする移植片の機能不全が
生じる。組織学的には、血小板凝集、フィブリン沈着、
血管内皮の活性化、活性化したマクロファージとＮＫの
湿潤が生じる。このような現象は、急性血管型拒絶(AV
R)または遅延型異種移植片拒絶(DXR)と呼ばれている。A
VRが生じる原因として、異種抗原、補体、マクロファー
ジ、NK細胞、好中球、血小板などが関与すると言われて
いる。
た場合でも、移植数日後から数週間後には、血管内皮細
胞の浮腫、虚血、血栓を特徴とする移植片の機能不全が
生じる。組織学的には、血小板凝集、フィブリン沈着、
血管内皮の活性化、活性化したマクロファージとＮＫの
湿潤が生じる。このような現象は、急性血管型拒絶(AV
R)または遅延型異種移植片拒絶(DXR)と呼ばれている。A
VRが生じる原因として、異種抗原、補体、マクロファー
ジ、NK細胞、好中球、血小板などが関与すると言われて
いる。
【０００５】前述の超急性拒絶を回避する方法には、大
別すれば、移植レシピエントに対する処置とドナーに対
する処置がある。前者の例としては移植レシピエント血
液中の自然抗体を免疫カラム等に吸着除去させる方法が
挙げられ、後者の例としては補体反応を抑制する補体制
御因子、特に移植レシピエントの動物種に由来する補体
制御因子をドナー動物に発現させる方法、ドナー動物の
α-Gal抗原自体を減少させる方法などが挙げられる。し
かし、移植レシピエント血液中の自然抗体を完全に除去
することは困難であるから、ドナーに対する処置が一般
的に行われている。なお、異種抗原はAVRの惹起にも関
与していると考えられているから、α−抗原の消滅はAV
Rの遅延又は回避の方策としても有効であろうと考えら
れている。
別すれば、移植レシピエントに対する処置とドナーに対
する処置がある。前者の例としては移植レシピエント血
液中の自然抗体を免疫カラム等に吸着除去させる方法が
挙げられ、後者の例としては補体反応を抑制する補体制
御因子、特に移植レシピエントの動物種に由来する補体
制御因子をドナー動物に発現させる方法、ドナー動物の
α-Gal抗原自体を減少させる方法などが挙げられる。し
かし、移植レシピエント血液中の自然抗体を完全に除去
することは困難であるから、ドナーに対する処置が一般
的に行われている。なお、異種抗原はAVRの惹起にも関
与していると考えられているから、α−抗原の消滅はAV
Rの遅延又は回避の方策としても有効であろうと考えら
れている。
【０００６】上記のドナー動物のα-Gal抗原を減少させ
るための方法としては次のようなものが知られている。（1）糖鎖末端のα-Gal抗原のα-ガラクトシド結合を切
断するα-ガラクトシダーゼを作用させて、α-Gal抗原
を減少させる方法 この方法においては、従来から知られているコーヒー豆
由来のα-ガラクトシダーゼが使用されるが、当該酵素
の至適pHは6〜6.5なので、生理的条件下でα-Gal抗原を
除去させることは不可能であった。
るための方法としては次のようなものが知られている。（1）糖鎖末端のα-Gal抗原のα-ガラクトシド結合を切
断するα-ガラクトシダーゼを作用させて、α-Gal抗原
を減少させる方法 この方法においては、従来から知られているコーヒー豆
由来のα-ガラクトシダーゼが使用されるが、当該酵素
の至適pHは6〜6.5なので、生理的条件下でα-Gal抗原を
除去させることは不可能であった。
【０００７】（2）α-Gal抗原の生成に係わるα-1,3GT
遺伝子をノックアウト(KO)する方法 α-1,3GT遺伝子KOマウスは作製されたが（Transplantat
ion, 61：13-19 (1996)）、当該マウスは白内障を発症
した。ブタの組織はマウスの組織以上に多量のα-Gal抗
原を発現しているから、ブタのα-1,3GT遺伝子をKOした
場合、ブタ生体への悪影響はマウス以上に大きいと考え
られている。また、KOブタの作製に必要とされるブタの
胚性幹（ES）細胞株が樹立されていないので、KOブタの
作製自体が不可能であった。
遺伝子をノックアウト(KO)する方法 α-1,3GT遺伝子KOマウスは作製されたが（Transplantat
ion, 61：13-19 (1996)）、当該マウスは白内障を発症
した。ブタの組織はマウスの組織以上に多量のα-Gal抗
原を発現しているから、ブタのα-1,3GT遺伝子をKOした
場合、ブタ生体への悪影響はマウス以上に大きいと考え
られている。また、KOブタの作製に必要とされるブタの
胚性幹（ES）細胞株が樹立されていないので、KOブタの
作製自体が不可能であった。
【０００８】（3）α-1,3GTと基質（N-アセチルラクト
サミン構造）が同一であるα-1,3GT以外の糖転移酵素を
遺伝子導入してα-Gal抗原の発現を競合阻害させる方法
（図1参照） α-1,3GTにより合成される糖鎖末端のα-Gal抗原（Gal
α1,3Gal配列）中のガラクトースをフコースに変換する
ために、α-1,2フコース転移酵素（α-1,2FT）遺伝子を
導入して血液型H物質とする方法（WO095/34202A1）など
が報告された。これらの方法では糖鎖非還元末端のガラ
クトースが他の糖に変換されるので、当該糖鎖のα-Gal
抗原は消失する。しかし、導入遺伝子の発現量が内在性
のα-1,3GT遺伝子の発現量を超越しない限り、細胞全体
としてのα-Gal抗原の減少量は軽度であった。また、後
述のN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIとは異なり、
糖鎖の分岐本数自体及び細胞全体の糖鎖本数には変化を
生じなかった。
サミン構造）が同一であるα-1,3GT以外の糖転移酵素を
遺伝子導入してα-Gal抗原の発現を競合阻害させる方法
（図1参照） α-1,3GTにより合成される糖鎖末端のα-Gal抗原（Gal
α1,3Gal配列）中のガラクトースをフコースに変換する
ために、α-1,2フコース転移酵素（α-1,2FT）遺伝子を
導入して血液型H物質とする方法（WO095/34202A1）など
が報告された。これらの方法では糖鎖非還元末端のガラ
クトースが他の糖に変換されるので、当該糖鎖のα-Gal
抗原は消失する。しかし、導入遺伝子の発現量が内在性
のα-1,3GT遺伝子の発現量を超越しない限り、細胞全体
としてのα-Gal抗原の減少量は軽度であった。また、後
述のN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIとは異なり、
糖鎖の分岐本数自体及び細胞全体の糖鎖本数には変化を
生じなかった。
【０００９】（4）N-結合型糖鎖の分岐の生成を阻害す
るN-アセチルグルコサミン転移酵素III（β-D-mannosid
e β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III, EC
2.4.1.144；以下、GnT-III）を強制発現させる方法 GnT-IIIを強制発現させることにより、糖鎖の分岐を抑
制し、ひいてはα-Gal抗原の減少を図る方法であり、以
下図２を参照しながら、糖鎖の分岐機構とGnT-IIIによ
る糖鎖の分岐抑制の作用点を説明する。糖鎖はN-結合型
糖鎖、O-結合型糖鎖、糖脂質糖鎖に大別される。各糖鎖
にはそれぞれコア構造が存在し、そのコア構造から末端
へ向かって糖鎖は伸長するが、α1-3ガラクトースが付
加すると糖鎖の伸長は止まる。同様に、上述のα-1,2FT
などの糖転移酵素もN-アセチルラクトサミン構造を基質
として糖鎖の伸長を止めるので、これらの糖転移酵素は
α-1,3GTと拮抗関係にある（図１参照）。一方、GnT-II
Iは他のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）転移酵素と
ともにN-結合型糖鎖のコア構造の形成に関与しており、
先の糖転移酵素のようにα-1,3GTと基質を競合しない。
N-結合型糖鎖はそのコア構造の分岐の度合いによって二
本鎖、三本鎖、四本鎖として区分される。図２に示され
るように、三本鎖、四本鎖糖鎖は前駆構造である二本鎖
にGnT-IV及びGnT-Vが作用して分岐が導入されることに
よって合成される。なお、二本鎖の糖鎖は、N-結合型糖
鎖のコアにGnT-I及びGnT-IIが作用して合成される。GnT
-IIIによってコア構造のβマンノース（βMan）に付加
されるGlcNAcからは鎖の伸長が起きないので、他のGlcN
Acとは区別され、バイセクティング（bisecting）GlcNA
cと呼ばれる。このbisecting GlcNAcが三本鎖、四本鎖
構造に分岐する前の二本鎖構造に付加されると、GnT-IV
及びGnT-Vがその構造を基質とすることができず、三本
鎖、四本鎖糖鎖の合成が阻害される。図２において、四
角の付された矢印は酵素反応が阻害されることを示す。
また、bisecting GlcNAcを持つ二本鎖糖鎖を基質にする
場合には、α-Gal抗原の合成に係わるβ-ガラクトシル
化反応及びα-ガラクトシル化反応も低下し、α-Gal抗
原自体も減少する（Glycobiol., 6: 691-694 (199
6)）。要約すれば、GnT-IIIを強制発現させることによ
って、糖鎖の分岐数及び各分岐当たりのα-Gal抗原の数
を減少させることができ、細胞全体の糖鎖本数及びα-G
al抗原を減少させることができる。
るN-アセチルグルコサミン転移酵素III（β-D-mannosid
e β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III, EC
2.4.1.144；以下、GnT-III）を強制発現させる方法 GnT-IIIを強制発現させることにより、糖鎖の分岐を抑
制し、ひいてはα-Gal抗原の減少を図る方法であり、以
下図２を参照しながら、糖鎖の分岐機構とGnT-IIIによ
る糖鎖の分岐抑制の作用点を説明する。糖鎖はN-結合型
糖鎖、O-結合型糖鎖、糖脂質糖鎖に大別される。各糖鎖
にはそれぞれコア構造が存在し、そのコア構造から末端
へ向かって糖鎖は伸長するが、α1-3ガラクトースが付
加すると糖鎖の伸長は止まる。同様に、上述のα-1,2FT
などの糖転移酵素もN-アセチルラクトサミン構造を基質
として糖鎖の伸長を止めるので、これらの糖転移酵素は
α-1,3GTと拮抗関係にある（図１参照）。一方、GnT-II
Iは他のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）転移酵素と
ともにN-結合型糖鎖のコア構造の形成に関与しており、
先の糖転移酵素のようにα-1,3GTと基質を競合しない。
N-結合型糖鎖はそのコア構造の分岐の度合いによって二
本鎖、三本鎖、四本鎖として区分される。図２に示され
るように、三本鎖、四本鎖糖鎖は前駆構造である二本鎖
にGnT-IV及びGnT-Vが作用して分岐が導入されることに
よって合成される。なお、二本鎖の糖鎖は、N-結合型糖
鎖のコアにGnT-I及びGnT-IIが作用して合成される。GnT
-IIIによってコア構造のβマンノース（βMan）に付加
されるGlcNAcからは鎖の伸長が起きないので、他のGlcN
Acとは区別され、バイセクティング（bisecting）GlcNA
cと呼ばれる。このbisecting GlcNAcが三本鎖、四本鎖
構造に分岐する前の二本鎖構造に付加されると、GnT-IV
及びGnT-Vがその構造を基質とすることができず、三本
鎖、四本鎖糖鎖の合成が阻害される。図２において、四
角の付された矢印は酵素反応が阻害されることを示す。
また、bisecting GlcNAcを持つ二本鎖糖鎖を基質にする
場合には、α-Gal抗原の合成に係わるβ-ガラクトシル
化反応及びα-ガラクトシル化反応も低下し、α-Gal抗
原自体も減少する（Glycobiol., 6: 691-694 (199
6)）。要約すれば、GnT-IIIを強制発現させることによ
って、糖鎖の分岐数及び各分岐当たりのα-Gal抗原の数
を減少させることができ、細胞全体の糖鎖本数及びα-G
al抗原を減少させることができる。
【００１０】GnT-III遺伝子を導入したトランスジェニ
ック動物としては、ラットGnT-IIIのcDNAの上流にβ-ア
クチン・プロモーターとサイトメガロウイルス・エンハ
ンサーを結合した導入用遺伝子を用いてトランスジェニ
ックマウスが作出された（Transplant. Proc., 29: 895
-896 (1997)）。当該トランスジェニックマウスの心
臓、肺と肝臓では、通常マウスの臓器に比べて、GnT-II
Iの比活性が上昇し、α-Gal抗原は減少した。しかし、
腎臓におけるGnT-IIIは、通常マウスでも高発現してお
り（3,400 p mol/h/mg protein）、当該トランスジェニ
ックマウスでは更に高発現したが（4,800 p mol/h/m
g）、α-Gal抗原は減少しなかった。このように、当該
トランスジェニックマウスはラットGnT-III遺伝子を有
するものの、必ずしも総ての臓器において、特に腎臓に
おいて、α-Gal抗原を減少することはできなかった。
ック動物としては、ラットGnT-IIIのcDNAの上流にβ-ア
クチン・プロモーターとサイトメガロウイルス・エンハ
ンサーを結合した導入用遺伝子を用いてトランスジェニ
ックマウスが作出された（Transplant. Proc., 29: 895
-896 (1997)）。当該トランスジェニックマウスの心
臓、肺と肝臓では、通常マウスの臓器に比べて、GnT-II
Iの比活性が上昇し、α-Gal抗原は減少した。しかし、
腎臓におけるGnT-IIIは、通常マウスでも高発現してお
り（3,400 p mol/h/mg protein）、当該トランスジェニ
ックマウスでは更に高発現したが（4,800 p mol/h/m
g）、α-Gal抗原は減少しなかった。このように、当該
トランスジェニックマウスはラットGnT-III遺伝子を有
するものの、必ずしも総ての臓器において、特に腎臓に
おいて、α-Gal抗原を減少することはできなかった。
【００１１】一方、GnT-III遺伝子を導入したトランス
ジェニックブタは知られていなかった。α-Gal抗原は有
袋哺乳類と霊長類を除く胎生哺乳類の細胞膜上に発現し
ているが、ブタ臓器に発現しているα-Gal抗原の量は特
に多く、例えばブタ腎臓に発現しているα-Gal抗原量は
ラット腎臓に発現しているα-Gal抗原量の500〜1000倍
であると言われており、ブタの発生及び生存上必須であ
るとも、細菌の受容体をマスクして感染を防御している
とも考えられている（細胞工学, 19: 830-834(200
0)）。また、後述するように、通常ブタの場合、腎臓を
含む多くの臓器でGnT-IIIを発現していない。従って、
ブタの臓器、組織または細胞に人為的にGnT-IIIを発現
させα-Gal抗原を減少させることがブタの発生や生存に
悪影響を生じるか否かは知られていなかった。また、導
入遺伝子を構築する際に用いられるプロモーターのう
ち、狙いとする構造遺伝子をマウスで発現させることが
できても、ブタでは発現させられないプロモーターのあ
ることが知られている（例えば、Theriogenol. 51: 422
(1999)）。このようなことから、ブタにヒトのGnT-III
遺伝子を効率よく発現させるための遺伝子プロモーター
は知られていなかった。より詳細には、（1）GnT-III遺
伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵か
ら生存トランスジェニックブタ産仔が得られるか否か、
（2）ヒトGnT-III遺伝子を導入したトランスジェニック
ブタが得られた場合でも、その臓器でGnT-IIIが発現し
α-Gal抗原量を減少させるか否か、（3）１動物個体中
にGnT-III遺伝子と共にそれ以外の1以上の導入遺伝子を
共発現させようとする場合に、生存トランスジェニック
ブタ産仔が得られるか否か、（4）当該トランスジェニ
ックブタの臓器がヒトGnT-III遺伝子を発現すると共に
α-Gal抗原を減少させ、更にGnT-III遺伝子以外の1以上
の当該導入遺伝子を発現させ得るか否か、特に、(5)糖
鎖修飾酵素をコードするGnT-III遺伝子と共に発現させ
る１以上の遺伝子が糖蛋白質（例えば、ヒトのDAF）で
ある場合、糖鎖修飾酵素GnT-IIIの発現が糖蛋白質（例
えば、ヒトのDAF）の発現に何らかの障害を生じるのか
否か、は知られていなかった。
ジェニックブタは知られていなかった。α-Gal抗原は有
袋哺乳類と霊長類を除く胎生哺乳類の細胞膜上に発現し
ているが、ブタ臓器に発現しているα-Gal抗原の量は特
に多く、例えばブタ腎臓に発現しているα-Gal抗原量は
ラット腎臓に発現しているα-Gal抗原量の500〜1000倍
であると言われており、ブタの発生及び生存上必須であ
るとも、細菌の受容体をマスクして感染を防御している
とも考えられている（細胞工学, 19: 830-834(200
0)）。また、後述するように、通常ブタの場合、腎臓を
含む多くの臓器でGnT-IIIを発現していない。従って、
ブタの臓器、組織または細胞に人為的にGnT-IIIを発現
させα-Gal抗原を減少させることがブタの発生や生存に
悪影響を生じるか否かは知られていなかった。また、導
入遺伝子を構築する際に用いられるプロモーターのう
ち、狙いとする構造遺伝子をマウスで発現させることが
できても、ブタでは発現させられないプロモーターのあ
ることが知られている（例えば、Theriogenol. 51: 422
(1999)）。このようなことから、ブタにヒトのGnT-III
遺伝子を効率よく発現させるための遺伝子プロモーター
は知られていなかった。より詳細には、（1）GnT-III遺
伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵か
ら生存トランスジェニックブタ産仔が得られるか否か、
（2）ヒトGnT-III遺伝子を導入したトランスジェニック
ブタが得られた場合でも、その臓器でGnT-IIIが発現し
α-Gal抗原量を減少させるか否か、（3）１動物個体中
にGnT-III遺伝子と共にそれ以外の1以上の導入遺伝子を
共発現させようとする場合に、生存トランスジェニック
ブタ産仔が得られるか否か、（4）当該トランスジェニ
ックブタの臓器がヒトGnT-III遺伝子を発現すると共に
α-Gal抗原を減少させ、更にGnT-III遺伝子以外の1以上
の当該導入遺伝子を発現させ得るか否か、特に、(5)糖
鎖修飾酵素をコードするGnT-III遺伝子と共に発現させ
る１以上の遺伝子が糖蛋白質（例えば、ヒトのDAF）で
ある場合、糖鎖修飾酵素GnT-IIIの発現が糖蛋白質（例
えば、ヒトのDAF）の発現に何らかの障害を生じるのか
否か、は知られていなかった。
【００１２】超急性拒絶は局所の細胞（例えば、血管内
皮細胞）で起こるから、超急性拒絶の生じる局所の細胞
のN-結合型糖鎖の分岐数が少なく、α-Gal抗原の少ない
トランスジェニック哺乳動物の作製が待ち望まれてい
た。また前述のように、超急性拒絶は補体依存性細胞障
害反応（補体反応）を惹起することにより生じるから、
当該補体反応を抑制するために、α-Gal抗原の少ないこ
とに加えて、移植レシピエント種の補体反応を抑制する
補体制御因子（レシピエントがヒトの場合にはヒト補体
制御因子）を発現しているトランスジェニック哺乳動物
が望まれていた。
皮細胞）で起こるから、超急性拒絶の生じる局所の細胞
のN-結合型糖鎖の分岐数が少なく、α-Gal抗原の少ない
トランスジェニック哺乳動物の作製が待ち望まれてい
た。また前述のように、超急性拒絶は補体依存性細胞障
害反応（補体反応）を惹起することにより生じるから、
当該補体反応を抑制するために、α-Gal抗原の少ないこ
とに加えて、移植レシピエント種の補体反応を抑制する
補体制御因子（レシピエントがヒトの場合にはヒト補体
制御因子）を発現しているトランスジェニック哺乳動物
が望まれていた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来技術に
存する上記課題を解決するためになされたものであり、
本発明の第１の目的は、超急性拒絶の生じる局所の細胞
でN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少してい
るヒト以外のトランスジェニック哺乳動物（特にトラン
スジェニックブタ）を提供することにある。また、本発
明の第２の目的は、超急性拒絶の生じる局所の細胞でN-
結合型糖鎖の分岐数及びα-ガラクトース抗原を減少す
ると同時に、ヒトの補体制御因子を発現しているヒト以
外のトランスジェニック哺乳動物（特にトランスジェニ
ックブタ）を提供することにある。
存する上記課題を解決するためになされたものであり、
本発明の第１の目的は、超急性拒絶の生じる局所の細胞
でN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少してい
るヒト以外のトランスジェニック哺乳動物（特にトラン
スジェニックブタ）を提供することにある。また、本発
明の第２の目的は、超急性拒絶の生じる局所の細胞でN-
結合型糖鎖の分岐数及びα-ガラクトース抗原を減少す
ると同時に、ヒトの補体制御因子を発現しているヒト以
外のトランスジェニック哺乳動物（特にトランスジェニ
ックブタ）を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
になされた本発明は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で
機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミ
ン転移酵素III（以下、GnT-III）の遺伝子からなる導入
遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物
である（以下、便宜上第１の発明という）。係るトラン
スジェニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細
胞でN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原が減少して
いるという特長を有する。また、本発明の他の発明は、
超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝
子とGnT-IIIの遺伝子、並びにヒトの補体制御因子の遺
伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物で
ある（以下、便宜上第２の発明という）。係るトランス
ジェニック哺乳動物は、α-Gal抗原を減少していると共
にヒトの補体制御因子を発現しているという特長を有し
ている。更に、本発明は、GnT-IIIを発現するトランス
ジェニック哺乳動物とヒトの補体制御因子を発現するト
ランスジェニック動物を個別に作製し、両者を交配する
ことによりGnT-III及びヒトの補体制御因子の両方を発
現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の作製方
法である。
になされた本発明は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で
機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミ
ン転移酵素III（以下、GnT-III）の遺伝子からなる導入
遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物
である（以下、便宜上第１の発明という）。係るトラン
スジェニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細
胞でN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原が減少して
いるという特長を有する。また、本発明の他の発明は、
超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝
子とGnT-IIIの遺伝子、並びにヒトの補体制御因子の遺
伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物で
ある（以下、便宜上第２の発明という）。係るトランス
ジェニック哺乳動物は、α-Gal抗原を減少していると共
にヒトの補体制御因子を発現しているという特長を有し
ている。更に、本発明は、GnT-IIIを発現するトランス
ジェニック哺乳動物とヒトの補体制御因子を発現するト
ランスジェニック動物を個別に作製し、両者を交配する
ことによりGnT-III及びヒトの補体制御因子の両方を発
現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の作製方
法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】上記のように、本発明の第１の発
明は、GnT-IIIの遺伝子を有し、超急性拒絶の生じる局
所の細胞におけるN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗
原を減少しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動
物である。また、本発明の第２の発明は、超急性拒絶の
生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とGnT-III
の遺伝子、並びにヒトの補体制御因子の遺伝子を有し、
N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少している
と共にヒトの補体制御因子を発現しているヒト以外のト
ランスジェニック哺乳動物及びその製造方法を提供す
る。本発明における哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であ
れば特に限定されず、各種の家畜、実験動物などが例示
され、より具体的には、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒ
ツジ、ヤギ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスターなどが挙げられ、前述のようにヒトへの
臓器移植に際してはブタが好適である。
明は、GnT-IIIの遺伝子を有し、超急性拒絶の生じる局
所の細胞におけるN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗
原を減少しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動
物である。また、本発明の第２の発明は、超急性拒絶の
生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とGnT-III
の遺伝子、並びにヒトの補体制御因子の遺伝子を有し、
N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少している
と共にヒトの補体制御因子を発現しているヒト以外のト
ランスジェニック哺乳動物及びその製造方法を提供す
る。本発明における哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であ
れば特に限定されず、各種の家畜、実験動物などが例示
され、より具体的には、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒ
ツジ、ヤギ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスターなどが挙げられ、前述のようにヒトへの
臓器移植に際してはブタが好適である。
【００１６】N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を
減少させるために、本発明はヒトのGnT-IIIの遺伝子を
用いる。該遺伝子は公知であり、ヒトのGnT-IIIを挿入
した導入用ベクター（J. Biochem. 113: 692-698 (199
3)）から適切なプライマーを用いてPCRで増幅して調製
することもできる。なお、N-結合型糖鎖とはペプチド鎖
中のアスパラギンの側鎖アミド基に糖鎖還元末端のGlcN
AcがN-グリコシド結合で結合している糖鎖のことで、ペ
プチド鎖中のセリン又はスレオニンの水酸基に糖鎖還元
末端が結合するO-型糖鎖や糖脂質糖鎖とは区別される。
なお、ブタ血管内皮細胞においては、ヒト自然抗体が反
応する主な標的はN-結合型糖鎖であるから（Transplant
ation, 50: 817-822 (1990)）、本発明の趣旨であるGnT
-IIIの発現によるN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の減少は、
超急性拒絶の軽減に有効である。
減少させるために、本発明はヒトのGnT-IIIの遺伝子を
用いる。該遺伝子は公知であり、ヒトのGnT-IIIを挿入
した導入用ベクター（J. Biochem. 113: 692-698 (199
3)）から適切なプライマーを用いてPCRで増幅して調製
することもできる。なお、N-結合型糖鎖とはペプチド鎖
中のアスパラギンの側鎖アミド基に糖鎖還元末端のGlcN
AcがN-グリコシド結合で結合している糖鎖のことで、ペ
プチド鎖中のセリン又はスレオニンの水酸基に糖鎖還元
末端が結合するO-型糖鎖や糖脂質糖鎖とは区別される。
なお、ブタ血管内皮細胞においては、ヒト自然抗体が反
応する主な標的はN-結合型糖鎖であるから（Transplant
ation, 50: 817-822 (1990)）、本発明の趣旨であるGnT
-IIIの発現によるN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の減少は、
超急性拒絶の軽減に有効である。
【００１７】本発明で用いる補体制御因子の遺伝子とし
ては、DAF（CD55）、CD59、MCP(CD46)等のヒトの補体制
御因子の遺伝子を用いることができ、係る遺伝子は既に
公知である。なお、MCPの場合には、MCP分子のうち麻疹
ウイルスの受容体としての機能を有するショートコンセ
ンサスリピート（SCR）1を欠損させた蛋白質をコードす
る遺伝子、又はMCP分子のうちSCR1を欠損させると共に
細胞膜貫通領域及び細胞内領域を欠損させ、代わりにグ
リコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）アンカ
ーを付すべくシグナルペプチドを有するように改変され
た蛋白質をコードする遺伝子（特願2000-131862）を用
いることもできる。また、補体制御因子の機能を有する
限り、DAF（CD55）、CD59、MCP(CD46)のような膜結合型
補体制御因子及びその機能を保持する改変型分子をコー
ドする遺伝子に加えて、C1-インヒビター、C4バインデ
ィングプロテイン、H因子、I因子のような血液中を循環
している可溶性補体制御因子を膜結合型に改変した改変
型補体制御因子をコードする遺伝子を用いることもでき
る。後記の実施例が示すように、超急性拒絶の生じる局
所の細胞においてN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗
原を減少させることに加えて、ヒトの補体制御因子を発
現させることによって、超急性拒絶による補体依存性細
胞障害を相乗的に軽減させることができる。
ては、DAF（CD55）、CD59、MCP(CD46)等のヒトの補体制
御因子の遺伝子を用いることができ、係る遺伝子は既に
公知である。なお、MCPの場合には、MCP分子のうち麻疹
ウイルスの受容体としての機能を有するショートコンセ
ンサスリピート（SCR）1を欠損させた蛋白質をコードす
る遺伝子、又はMCP分子のうちSCR1を欠損させると共に
細胞膜貫通領域及び細胞内領域を欠損させ、代わりにグ
リコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）アンカ
ーを付すべくシグナルペプチドを有するように改変され
た蛋白質をコードする遺伝子（特願2000-131862）を用
いることもできる。また、補体制御因子の機能を有する
限り、DAF（CD55）、CD59、MCP(CD46)のような膜結合型
補体制御因子及びその機能を保持する改変型分子をコー
ドする遺伝子に加えて、C1-インヒビター、C4バインデ
ィングプロテイン、H因子、I因子のような血液中を循環
している可溶性補体制御因子を膜結合型に改変した改変
型補体制御因子をコードする遺伝子を用いることもでき
る。後記の実施例が示すように、超急性拒絶の生じる局
所の細胞においてN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗
原を減少させることに加えて、ヒトの補体制御因子を発
現させることによって、超急性拒絶による補体依存性細
胞障害を相乗的に軽減させることができる。
【００１８】GnT-IIIの遺伝子及び／又はヒトの補体制
御因子の遺伝子を超急性拒絶の生じる局所の細胞に発現
させるために、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能し
ている調節遺伝子が使用される。当該調節遺伝子として
は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している蛋白
質をコードしている遺伝子の調節遺伝子を用いることが
好ましい。ここで「調節遺伝子」とは、遺伝子転写効率
の増減に働くDNA上の配列を意味し、プロモーター、エ
ンハンサー、上流活性化配列、サイレンサー、上流抑制
配列、及びアテニュエーター等が含まれるが、これらに
限定されない。上記のプロモーターとしては、GnT-III
及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子を超急性拒絶の
生じる局所の細胞で発現させ得るプロモーターであれば
特に限定されず、例えば、β-アクチンのプロモータ
ー、アルブミンのプロモーター、インスリンのプロモー
ター、エロンゲーションファクターのプロモーター、血
管内皮細胞が関与する蛋白質であるエンドセリンやトロ
ンボモジュリンのプロモーターなどが例示できる。な
お、移植ドナー動物に目的の蛋白質を発現させるための
プロモーターとしては、移植ドナーの動物種に由来する
プロモーターが好ましく、トランスジェニック哺乳動物
がブタの場合には、ブタ補体制御因子(pMCP)のプロモー
ター（特開平10-66584号公報）がより好適に用いられ
る。ただし、後記の実施例から、β-アクチンのプロモ
ーターはGnT-IIIをブタ血管内皮細胞に効率良く発現さ
せ得ることが明らかにされた。上述のエンハンサーとし
ては、GnT-III及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子
を超急性拒絶の生じる局所の細胞で発現させ得るエンハ
ンサーであれば特に限定されず、サイトメガロウイルス
のエンハンサー、ヒトDAF遺伝子の第一イントロンなど
を例示することができる。
御因子の遺伝子を超急性拒絶の生じる局所の細胞に発現
させるために、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能し
ている調節遺伝子が使用される。当該調節遺伝子として
は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している蛋白
質をコードしている遺伝子の調節遺伝子を用いることが
好ましい。ここで「調節遺伝子」とは、遺伝子転写効率
の増減に働くDNA上の配列を意味し、プロモーター、エ
ンハンサー、上流活性化配列、サイレンサー、上流抑制
配列、及びアテニュエーター等が含まれるが、これらに
限定されない。上記のプロモーターとしては、GnT-III
及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子を超急性拒絶の
生じる局所の細胞で発現させ得るプロモーターであれば
特に限定されず、例えば、β-アクチンのプロモータ
ー、アルブミンのプロモーター、インスリンのプロモー
ター、エロンゲーションファクターのプロモーター、血
管内皮細胞が関与する蛋白質であるエンドセリンやトロ
ンボモジュリンのプロモーターなどが例示できる。な
お、移植ドナー動物に目的の蛋白質を発現させるための
プロモーターとしては、移植ドナーの動物種に由来する
プロモーターが好ましく、トランスジェニック哺乳動物
がブタの場合には、ブタ補体制御因子(pMCP)のプロモー
ター（特開平10-66584号公報）がより好適に用いられ
る。ただし、後記の実施例から、β-アクチンのプロモ
ーターはGnT-IIIをブタ血管内皮細胞に効率良く発現さ
せ得ることが明らかにされた。上述のエンハンサーとし
ては、GnT-III及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子
を超急性拒絶の生じる局所の細胞で発現させ得るエンハ
ンサーであれば特に限定されず、サイトメガロウイルス
のエンハンサー、ヒトDAF遺伝子の第一イントロンなど
を例示することができる。
【００１９】本発明のトランスジェニック哺乳動物は、
発明の構成に適合した導入用遺伝子を構築し、当該導入
用遺伝子を用いて、慣用の方法で作製することができ
る。例えば、本発明の第１の発明においては、前述のGn
T-IIIと超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している
調節遺伝子からなる導入用遺伝子を構築して、トランス
ジェニック哺乳動物の作製に供される。上記の導入用遺
伝子は、慣用の方法により作製することができる。例え
ば、調節遺伝子としてpMCPのプロモーター及びヒトDAF
遺伝子の第一イントロンを有し、更にGnT-IIIを有する
導入用遺伝子は下記の方法により調製することもでき
る。まず、適当なベクター(例えば、pGL-3ベーシックベ
クター、pBluescript等)の一部を制限酵素で抜き取り、
そのベクター側の末端を常法に準じて平滑化しておく。
一方、ブタゲノムファージライブラリーのpMCP遺伝子
（特開平09-65887号公報）のプロモーターに相当する領
域を切り出し、次いでプロモーター領域が0.9Kbの長さ
（特願平09-142961号公報の配列番号１の塩基配列4498
〜5397番の配列を有する）になるまで短縮した後、末端
を平滑化し、上記のベクターに挿入する。また、DAF遺
伝子の第一イントロン領域を、ヒトゲノム遺伝子をテン
プレートとして適当なプライマーを用いてＰＣＲ法で増
幅させ、得られた遺伝子を上記ベクターのpMCPプロモー
ター遺伝子の下流側に挿入する。更に、GnT-IIIのcDNA
（J. Biochem. 113: 692-698 (1993)）にpolyAシグナル
配列を付し、当該遺伝子を上記ベクターのDAF第一イン
トロンの下流側に挿入する。かくして調製されたベクタ
ーから、pMCPプロモーター、DAF第一イントロン及びGnT
-IIIを含む領域を適当な制限酵素で切り出すことによ
り、導入用遺伝子を得ることができる。なお、GnT-III
遺伝子と共にヒトの補体制御因子の遺伝子を有する導入
用遺伝子は、上記の方法において、GnT-IIIの遺伝子の
上流側又は下流側にヒトの補体制御因子の遺伝子を挿入
すればよい。なお、上記の各工程における個々の手法は
当業者に知られており、常法に準じて行うことができ
る。
発明の構成に適合した導入用遺伝子を構築し、当該導入
用遺伝子を用いて、慣用の方法で作製することができ
る。例えば、本発明の第１の発明においては、前述のGn
T-IIIと超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している
調節遺伝子からなる導入用遺伝子を構築して、トランス
ジェニック哺乳動物の作製に供される。上記の導入用遺
伝子は、慣用の方法により作製することができる。例え
ば、調節遺伝子としてpMCPのプロモーター及びヒトDAF
遺伝子の第一イントロンを有し、更にGnT-IIIを有する
導入用遺伝子は下記の方法により調製することもでき
る。まず、適当なベクター(例えば、pGL-3ベーシックベ
クター、pBluescript等)の一部を制限酵素で抜き取り、
そのベクター側の末端を常法に準じて平滑化しておく。
一方、ブタゲノムファージライブラリーのpMCP遺伝子
（特開平09-65887号公報）のプロモーターに相当する領
域を切り出し、次いでプロモーター領域が0.9Kbの長さ
（特願平09-142961号公報の配列番号１の塩基配列4498
〜5397番の配列を有する）になるまで短縮した後、末端
を平滑化し、上記のベクターに挿入する。また、DAF遺
伝子の第一イントロン領域を、ヒトゲノム遺伝子をテン
プレートとして適当なプライマーを用いてＰＣＲ法で増
幅させ、得られた遺伝子を上記ベクターのpMCPプロモー
ター遺伝子の下流側に挿入する。更に、GnT-IIIのcDNA
（J. Biochem. 113: 692-698 (1993)）にpolyAシグナル
配列を付し、当該遺伝子を上記ベクターのDAF第一イン
トロンの下流側に挿入する。かくして調製されたベクタ
ーから、pMCPプロモーター、DAF第一イントロン及びGnT
-IIIを含む領域を適当な制限酵素で切り出すことによ
り、導入用遺伝子を得ることができる。なお、GnT-III
遺伝子と共にヒトの補体制御因子の遺伝子を有する導入
用遺伝子は、上記の方法において、GnT-IIIの遺伝子の
上流側又は下流側にヒトの補体制御因子の遺伝子を挿入
すればよい。なお、上記の各工程における個々の手法は
当業者に知られており、常法に準じて行うことができ
る。
【００２０】トランスジェニック哺乳動物は、上記で調
製された導入用遺伝子を哺乳動物の受精卵（前核期卵）
の前核にマイクロインジェクション法などの慣用の方法
で導入し、当該受精卵を必要に応じて培養し、又は培養
せず直ちに疑妊娠状態に同期化させておいた雌性哺乳動
物の卵管又は子宮に移植し、生存産仔を得ることにより
作製される。なお、前核にマイクロインジェクションを
行う際に、受精卵内の多量の脂肪粒の存在等により前核
の確認が困難な場合には、常法に従って予め遠心処理を
行う。作製された産仔がトランスジェニック哺乳動物で
あることの確認は、後記のドットブロッテング法、PCR
法、免疫組織化学的方法、補体反応抑制試験などにより
行うことができる。また、本発明のトランスジェニック
哺乳動物は核移植技術の適用により作製することができ
る。より具体的には、下記の方法で作製することができ
る。 (1)胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の確立していない動物種
（例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなど）の場合には
体細胞（例えば、乳腺細胞、線維芽細胞、顆粒層細胞、
卵丘細胞など）、ＥＳ細胞の確立している動物種（例え
ば、マウス）の場合にはＥＳ細胞又は体細胞を前記の導
入用遺伝子又は前記の導入用遺伝子に抗生物質耐性遺伝
子などのマーカー遺伝子を連結して構築した導入用遺伝
子を用いて、エレクトロポレーション法、リポフェクシ
ョン法などの公知の方法により形質転換する； (2)形質転換に供した細胞と同一の種の動物から卵子を
採取し、その核を取除く； (3)上記(1)の形質転換細胞と上記(2)の除核卵子を融合
し、又は上記(1)の形質転換細胞のkaryoplastを上記(2)
の除核卵子に注入し、活性化し、培養し、借り腹の雌性
動物の子宮又は卵管に移植し、懐妊させて生存産仔を得
る。更に、GnT-IIIのみを発現するトランスジェニック
哺乳動物とヒトの補体制御因子のみを発現するトランス
ジェニック動物を個別に作製し、性成熟に達した個体を
交配することによってもGnT-III及びヒトの補体制御因
子の両方を発現するトランスジェニック哺乳動物を得る
ことができる。
製された導入用遺伝子を哺乳動物の受精卵（前核期卵）
の前核にマイクロインジェクション法などの慣用の方法
で導入し、当該受精卵を必要に応じて培養し、又は培養
せず直ちに疑妊娠状態に同期化させておいた雌性哺乳動
物の卵管又は子宮に移植し、生存産仔を得ることにより
作製される。なお、前核にマイクロインジェクションを
行う際に、受精卵内の多量の脂肪粒の存在等により前核
の確認が困難な場合には、常法に従って予め遠心処理を
行う。作製された産仔がトランスジェニック哺乳動物で
あることの確認は、後記のドットブロッテング法、PCR
法、免疫組織化学的方法、補体反応抑制試験などにより
行うことができる。また、本発明のトランスジェニック
哺乳動物は核移植技術の適用により作製することができ
る。より具体的には、下記の方法で作製することができ
る。 (1)胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の確立していない動物種
（例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなど）の場合には
体細胞（例えば、乳腺細胞、線維芽細胞、顆粒層細胞、
卵丘細胞など）、ＥＳ細胞の確立している動物種（例え
ば、マウス）の場合にはＥＳ細胞又は体細胞を前記の導
入用遺伝子又は前記の導入用遺伝子に抗生物質耐性遺伝
子などのマーカー遺伝子を連結して構築した導入用遺伝
子を用いて、エレクトロポレーション法、リポフェクシ
ョン法などの公知の方法により形質転換する； (2)形質転換に供した細胞と同一の種の動物から卵子を
採取し、その核を取除く； (3)上記(1)の形質転換細胞と上記(2)の除核卵子を融合
し、又は上記(1)の形質転換細胞のkaryoplastを上記(2)
の除核卵子に注入し、活性化し、培養し、借り腹の雌性
動物の子宮又は卵管に移植し、懐妊させて生存産仔を得
る。更に、GnT-IIIのみを発現するトランスジェニック
哺乳動物とヒトの補体制御因子のみを発現するトランス
ジェニック動物を個別に作製し、性成熟に達した個体を
交配することによってもGnT-III及びヒトの補体制御因
子の両方を発現するトランスジェニック哺乳動物を得る
ことができる。
【００２１】このようにして得られたGnT-IIIの遺伝子
を有するトランスジェニック哺乳動物又はGnT-III及び
ヒトの補体制御因子の両方を発現するトランスジェニッ
ク哺乳動物は、N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原
が減少しており、特に超急性拒絶の生じる局所の細胞に
おいて当該減少が生じている。ここで、α-Gal抗原を減
少している状態とは、トランスジェニック哺乳動物の細
胞に発現しているN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の量が、遺
伝子導入操作をしていない通常動物又は野生型動物の対
応する細胞に発現しているN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の
量に比べて、少なくとも30％以上、好ましくは50%以
上、より好ましくは60%以上、最も好ましくは70%以上減
少している状態をいう。
を有するトランスジェニック哺乳動物又はGnT-III及び
ヒトの補体制御因子の両方を発現するトランスジェニッ
ク哺乳動物は、N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原
が減少しており、特に超急性拒絶の生じる局所の細胞に
おいて当該減少が生じている。ここで、α-Gal抗原を減
少している状態とは、トランスジェニック哺乳動物の細
胞に発現しているN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の量が、遺
伝子導入操作をしていない通常動物又は野生型動物の対
応する細胞に発現しているN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の
量に比べて、少なくとも30％以上、好ましくは50%以
上、より好ましくは60%以上、最も好ましくは70%以上減
少している状態をいう。
【００２２】また、本発明のGnT-IIIの遺伝子またはGnT
-III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するトランス
ジェニック哺乳動物の臓器には、肝臓、肺、腎臓、心
臓、膵臓、小腸等の消化管及び眼が含まれるが、これら
に限定されない。本発明のトランスジェニック哺乳動物
の組織には、脳組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨、
筋の組織が含まれるが、これらに限定されない。本発明
のトランスジェニック哺乳動物の細胞には、上記の臓器
又は組織に分布する血管内皮細胞の外に、肝細胞、膵細
胞、神経細胞、脳黒質線条体細胞、卵細胞、受精卵、及
び胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
-III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するトランス
ジェニック哺乳動物の臓器には、肝臓、肺、腎臓、心
臓、膵臓、小腸等の消化管及び眼が含まれるが、これら
に限定されない。本発明のトランスジェニック哺乳動物
の組織には、脳組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨、
筋の組織が含まれるが、これらに限定されない。本発明
のトランスジェニック哺乳動物の細胞には、上記の臓器
又は組織に分布する血管内皮細胞の外に、肝細胞、膵細
胞、神経細胞、脳黒質線条体細胞、卵細胞、受精卵、及
び胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
【発明の効果】本発明の第１の発明に係るトランスジェ
ニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細胞のα
-Gal抗原を減少しているので、Discordant異種移植時の
超急性拒絶反応を抑制する上で有効である。また、本発
明の第２の発明に係るトランスジェニック哺乳動物は、
α-Gal抗原を減少するとともにヒトの補体制御因子を発
現しているので、Discordant異種移植時の超急性拒絶反
応を抑制する上で更に有効である。本発明のトランスジ
ェニック哺乳動物の臓器（例えば、心臓、肺、肝臓、腎
臓、膵臓等）、臓器に付属する組織（例えば、冠状動
脈、脳硬膜等）や細胞（例えば、肝細胞、インスリンを
産生するランゲルハンス島、ドーパミンを産生する脳黒
質線条体細胞等）等をヒト患者に移植すれば既にダメー
ジを受け機能を失調させた患者臓器等の補完、あるいは
その代用とすることができる。本発明のトランスジェニ
ック哺乳動物の臓器の細胞（例えば、肝臓、腎臓などの
臓器から採取した細胞、インスリンを産生するランゲル
ハンス島、ドーパミンを産生する脳黒質線条体細胞）を
培養し、培養細胞を適宜器材装置等に組み入れ、対応す
る臓器の機能が失調しているヒト患者と体外循環系を介
して接続すれば、失調している臓器の代替や治療として
活用することができる。
ニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細胞のα
-Gal抗原を減少しているので、Discordant異種移植時の
超急性拒絶反応を抑制する上で有効である。また、本発
明の第２の発明に係るトランスジェニック哺乳動物は、
α-Gal抗原を減少するとともにヒトの補体制御因子を発
現しているので、Discordant異種移植時の超急性拒絶反
応を抑制する上で更に有効である。本発明のトランスジ
ェニック哺乳動物の臓器（例えば、心臓、肺、肝臓、腎
臓、膵臓等）、臓器に付属する組織（例えば、冠状動
脈、脳硬膜等）や細胞（例えば、肝細胞、インスリンを
産生するランゲルハンス島、ドーパミンを産生する脳黒
質線条体細胞等）等をヒト患者に移植すれば既にダメー
ジを受け機能を失調させた患者臓器等の補完、あるいは
その代用とすることができる。本発明のトランスジェニ
ック哺乳動物の臓器の細胞（例えば、肝臓、腎臓などの
臓器から採取した細胞、インスリンを産生するランゲル
ハンス島、ドーパミンを産生する脳黒質線条体細胞）を
培養し、培養細胞を適宜器材装置等に組み入れ、対応す
る臓器の機能が失調しているヒト患者と体外循環系を介
して接続すれば、失調している臓器の代替や治療として
活用することができる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。
【００２５】実施例１pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-IIIの
cDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジ
ェニックブタ （a）導入用遺伝子の作製 pMCPプロモーター、ヒトのDAF（以下、DAF）の第一イン
トロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を作製
した。その構造を図３に示す。当該導入用遺伝子は次の
手順で作製した。 （1）ブタゲノムファージライブラリーのpMCP遺伝子
（特開平09-65887号公報）のプロモーターに相当する領
域の約1.7 kbをBstEIIとBamHIの両サイトで切り出し、
末端をT4 DNA polymeraseで平滑化し、pBluescript（St
ratagene社製）のSmaIサイトに挿入した。更に、プロモ
ーター部分より更に上流にあるpBluescript由来のBstXI
とSpeIの両サイトを切断してプラスミドを直鎖状にし、
Kilo-Sequence用Deletion Kit（Takara社製）を用いて
プロモーター領域が0.9Kbの長さ（特願平09-142961号公
報の配列番号１の塩基配列4498〜5397番の配列を有す
る）になるまで短縮した。0.9 kbのプロモーター領域を
BssHIIとEcoRIの両サイトで切り出し、T4 DNA polymera
seで平滑化した後、pGL-3ベーシックベクター（Promega
社製）のSmaIサイトに挿入した。 （2）DAF遺伝子の第一イントロン領域をヒトゲノム遺伝
子をテンプレートとして5’-TCCTCGAGCTGCCCCGGCTGCTGC
TGCTGGTGCTGTTGTと5’-TCAAGCTTCTGGGGGAAGGCCACAGTCAC
Cの両プライマーで増幅し、両側に XhoIとHindIIIのサ
イトを持つ断片として得た。それを上記ベクターのXhoI
サイトとHindIIIサイトに挿入した。 （3）GnT-IIIのcDNA（J. Biochem. 113: 692-698 (199
3)）にpolyAシグナル配列を付し、上記ベクターのHindI
IIサイトとBamHIサイトに挿入した。 （4）上記ベクターからpMCPプロモーター、DAFイントロ
ン及びGnT-IIIを含む領域をMluIとSalIの両サイトで切
り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に4μg／mlの濃
度に溶解した。
cDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジ
ェニックブタ （a）導入用遺伝子の作製 pMCPプロモーター、ヒトのDAF（以下、DAF）の第一イン
トロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を作製
した。その構造を図３に示す。当該導入用遺伝子は次の
手順で作製した。 （1）ブタゲノムファージライブラリーのpMCP遺伝子
（特開平09-65887号公報）のプロモーターに相当する領
域の約1.7 kbをBstEIIとBamHIの両サイトで切り出し、
末端をT4 DNA polymeraseで平滑化し、pBluescript（St
ratagene社製）のSmaIサイトに挿入した。更に、プロモ
ーター部分より更に上流にあるpBluescript由来のBstXI
とSpeIの両サイトを切断してプラスミドを直鎖状にし、
Kilo-Sequence用Deletion Kit（Takara社製）を用いて
プロモーター領域が0.9Kbの長さ（特願平09-142961号公
報の配列番号１の塩基配列4498〜5397番の配列を有す
る）になるまで短縮した。0.9 kbのプロモーター領域を
BssHIIとEcoRIの両サイトで切り出し、T4 DNA polymera
seで平滑化した後、pGL-3ベーシックベクター（Promega
社製）のSmaIサイトに挿入した。 （2）DAF遺伝子の第一イントロン領域をヒトゲノム遺伝
子をテンプレートとして5’-TCCTCGAGCTGCCCCGGCTGCTGC
TGCTGGTGCTGTTGTと5’-TCAAGCTTCTGGGGGAAGGCCACAGTCAC
Cの両プライマーで増幅し、両側に XhoIとHindIIIのサ
イトを持つ断片として得た。それを上記ベクターのXhoI
サイトとHindIIIサイトに挿入した。 （3）GnT-IIIのcDNA（J. Biochem. 113: 692-698 (199
3)）にpolyAシグナル配列を付し、上記ベクターのHindI
IIサイトとBamHIサイトに挿入した。 （4）上記ベクターからpMCPプロモーター、DAFイントロ
ン及びGnT-IIIを含む領域をMluIとSalIの両サイトで切
り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に4μg／mlの濃
度に溶解した。
【００２６】(b)トランスジェニックブタの作製 上記の導入用遺伝子を用いて、マイクロインジェクショ
ン法によりトランスジェニックブタを作製した。作製方
法の概略は以下の通りである（特開平11-239430号公報
参照）。ランドレース種、大ヨークシャー種及びデュロ
ック種の交雑種の雌豚を採卵用豚とした。採卵用豚に過
排卵処理（PMSGあるいはFSHとhCGの投与）した後、デュ
ロック種の雄豚の精子を人工授精し、受精卵（前核期
卵）を採取した。この前核期卵を遠心分離処理（12,000
x g, 8分間)した後、前記導入用遺伝子をマイクロイン
ジェクション法により注入し、導入用遺伝子の注入され
た前核期卵を直ちにレシピエントブタの卵管に移植し
た。そして、産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特
に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生存ト
ランスジェニックブタ産仔の得られることが確認され
た。なお、レシピエントブタとして、予め前述の過排卵
処理を行いドナーブタと性周期を同期化しておいたブ
タ、あるいは受精卵を採取した後のドナーブタを供し
た。
ン法によりトランスジェニックブタを作製した。作製方
法の概略は以下の通りである（特開平11-239430号公報
参照）。ランドレース種、大ヨークシャー種及びデュロ
ック種の交雑種の雌豚を採卵用豚とした。採卵用豚に過
排卵処理（PMSGあるいはFSHとhCGの投与）した後、デュ
ロック種の雄豚の精子を人工授精し、受精卵（前核期
卵）を採取した。この前核期卵を遠心分離処理（12,000
x g, 8分間)した後、前記導入用遺伝子をマイクロイン
ジェクション法により注入し、導入用遺伝子の注入され
た前核期卵を直ちにレシピエントブタの卵管に移植し
た。そして、産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特
に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生存ト
ランスジェニックブタ産仔の得られることが確認され
た。なお、レシピエントブタとして、予め前述の過排卵
処理を行いドナーブタと性周期を同期化しておいたブ
タ、あるいは受精卵を採取した後のドナーブタを供し
た。
【００２７】(c)トランスジェニックブタの同定と選別 ブタ産仔の尾部から常法に従ってゲノムDNAを抽出し、
下記の２つの方法によりトランスジェニックブタを同定
し、トランスジェニックブタを選別した。 （1）ドットブロッティング法：供試DNA(10μg)をメン
ブレンに固定し、予めジゴキシゲニン標識（DIG核酸標
識キット、ベーリンガー・マンハイム社製）しておいた
GnT-IIIのcDNAの一部とハイブリダイゼズさせ、アルカ
リホスファターゼによる発色反応（DIG核酸検出キッ
ト、ベーリンガー・マンハイム社製）を行った。 （2）PCR法：供試DNAをテンプレートとして、GnT-IIIの
cDNA由来の5'- GGTGGACGCCTTTGTGGTGTGCをセンスプライ
マー、同5'- GCCGGTGCGGTTCTCATACTGTをアンチセンスプ
ライマーとするPCR反応を行い（条件；94℃ 30秒間、68
℃ 2分30秒間、30回）、各サンプルをミニゲル（エチジ
ウム・ブロマイド入り）で泳動し、導入遺伝子の組込み
の有無を検出した。トランスジェニックと同定されたブ
タについては、常法に従って子孫を得て、本段落に記載
の同定法によりトランスジェニックブタを選別した。
下記の２つの方法によりトランスジェニックブタを同定
し、トランスジェニックブタを選別した。 （1）ドットブロッティング法：供試DNA(10μg)をメン
ブレンに固定し、予めジゴキシゲニン標識（DIG核酸標
識キット、ベーリンガー・マンハイム社製）しておいた
GnT-IIIのcDNAの一部とハイブリダイゼズさせ、アルカ
リホスファターゼによる発色反応（DIG核酸検出キッ
ト、ベーリンガー・マンハイム社製）を行った。 （2）PCR法：供試DNAをテンプレートとして、GnT-IIIの
cDNA由来の5'- GGTGGACGCCTTTGTGGTGTGCをセンスプライ
マー、同5'- GCCGGTGCGGTTCTCATACTGTをアンチセンスプ
ライマーとするPCR反応を行い（条件；94℃ 30秒間、68
℃ 2分30秒間、30回）、各サンプルをミニゲル（エチジ
ウム・ブロマイド入り）で泳動し、導入遺伝子の組込み
の有無を検出した。トランスジェニックと同定されたブ
タについては、常法に従って子孫を得て、本段落に記載
の同定法によりトランスジェニックブタを選別した。
【００２８】実施例２pMCPプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺
伝子を用いて作製したトランスジェニックブタ pMCPプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺
伝子を作製した。その構造を図４に示す。DAFの第一イ
ントロンを欠如する以外は実施例１に準じた。そして、
トランスジェニック産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子
（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生
存トランスジェニックブタ産仔の得られることが確認さ
れた。
伝子を用いて作製したトランスジェニックブタ pMCPプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺
伝子を作製した。その構造を図４に示す。DAFの第一イ
ントロンを欠如する以外は実施例１に準じた。そして、
トランスジェニック産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子
（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生
存トランスジェニックブタ産仔の得られることが確認さ
れた。
【００２９】実施例３サイトメガロウイスのエンハンサー、鶏βアクチンのプ
ロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を
用いて作製したトランスジェニックブタ サイトメガロウイスのエンハンサーと鶏βアクチンのプ
ロモーター（pCXN2）及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用
遺伝子を作製した。その構造を図５に示す。pMCPプロモ
ーターとDAFの第一イントロン領域をpCXN2に代えた以外
は実施例１に準じた。そして、トランスジェニック産仔
を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝
子）を導入した受精卵から生存トランスジェニックブタ
産仔の得られることが確認された。
ロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を
用いて作製したトランスジェニックブタ サイトメガロウイスのエンハンサーと鶏βアクチンのプ
ロモーター（pCXN2）及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用
遺伝子を作製した。その構造を図５に示す。pMCPプロモ
ーターとDAFの第一イントロン領域をpCXN2に代えた以外
は実施例１に準じた。そして、トランスジェニック産仔
を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝
子）を導入した受精卵から生存トランスジェニックブタ
産仔の得られることが確認された。
【００３０】実施例４pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-IIIの
cDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジ
ェニックマウス 実施例１に記載の導入用遺伝子を用い、常法に従ってト
ランスジェニックマウスを作製した。
cDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジ
ェニックマウス 実施例１に記載の導入用遺伝子を用い、常法に従ってト
ランスジェニックマウスを作製した。
【００３１】比較例１pMCPプロモーター及びDAFのcDNAから成る導入用遺伝子
を用いて作製したトランスジェニックブタ pMCPのプロモータとヒトのDAFをコードするcDNAからな
る導入用遺伝子を用いてトランスジェニックブタを作製
した（特開平11-239430号公報参照）。
を用いて作製したトランスジェニックブタ pMCPのプロモータとヒトのDAFをコードするcDNAからな
る導入用遺伝子を用いてトランスジェニックブタを作製
した（特開平11-239430号公報参照）。
【００３２】比較例２pMCPプロモーター及びDAFのcDNAから成る導入用遺伝子
を用いて作製したトランスジェニックマウス 比較例１に準じて、pMCPのプロモータとヒトのDAFをコ
ードするcDNAからなる導入用遺伝子を用いてトランスジ
ェニックマウスを作製した（特開平11-239430号公報参
照）。
を用いて作製したトランスジェニックマウス 比較例１に準じて、pMCPのプロモータとヒトのDAFをコ
ードするcDNAからなる導入用遺伝子を用いてトランスジ
ェニックマウスを作製した（特開平11-239430号公報参
照）。
【００３３】実施例５GnT-IIIとDAFの両遺伝子を有するトランスジェニックブ
タ 上記実施例３に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェ
ニックブタ（ヘテロ型雄）と上記比較例１に記載のDAF
を発現するトランスジェニックブタ（ヘテロ型雌、２
頭）が性成熟に達するのを待って交配し、17匹の生存産
仔を得た（全産仔数：１８）。得られた産仔について上
記のGnT-III遺伝子の同定方法及び特開平11-239430号公
報に記載のDAF遺伝子の同定方法により導入遺伝子の有
無を調べた。得られた産仔は次の４つの遺伝子型に概ね
１：１：１：１の割合で区分された：DAF（−）／GnT-I
II（−）（n=３）、DAF（＋）／GnT-III（−）（n=
５）、DAF（−）／GnT-III（＋）（n=５）、DAF（＋）
／GnT-III（＋）（n=４）。以上の結果から、１動物個
体中にGnT-III遺伝子と共にそれ以外の１以上の導入遺
伝子（本実施例ではDAF）を共発現する生存トランスジ
ェニック産仔の得られることが確認された。
タ 上記実施例３に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェ
ニックブタ（ヘテロ型雄）と上記比較例１に記載のDAF
を発現するトランスジェニックブタ（ヘテロ型雌、２
頭）が性成熟に達するのを待って交配し、17匹の生存産
仔を得た（全産仔数：１８）。得られた産仔について上
記のGnT-III遺伝子の同定方法及び特開平11-239430号公
報に記載のDAF遺伝子の同定方法により導入遺伝子の有
無を調べた。得られた産仔は次の４つの遺伝子型に概ね
１：１：１：１の割合で区分された：DAF（−）／GnT-I
II（−）（n=３）、DAF（＋）／GnT-III（−）（n=
５）、DAF（−）／GnT-III（＋）（n=５）、DAF（＋）
／GnT-III（＋）（n=４）。以上の結果から、１動物個
体中にGnT-III遺伝子と共にそれ以外の１以上の導入遺
伝子（本実施例ではDAF）を共発現する生存トランスジ
ェニック産仔の得られることが確認された。
【００３４】実施例６GnT-IIIとDAFの両遺伝子を有するトランスジェニックマ
ウス 実施例４に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニッ
クマウス（雌）と比較例２に記載のDAFを発現するトラ
ンスジェニックマウス（雄）を交配してGnT-IIIとDAFの
両方を発現するトランスジェニックマウスを作製した。
当該トランスジェニックマウスは実施例５に準じて、両
遺伝子を保有することを確認した。
ウス 実施例４に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニッ
クマウス（雌）と比較例２に記載のDAFを発現するトラ
ンスジェニックマウス（雄）を交配してGnT-IIIとDAFの
両方を発現するトランスジェニックマウスを作製した。
当該トランスジェニックマウスは実施例５に準じて、両
遺伝子を保有することを確認した。
【００３５】試験例１トランスジェニックブタのGnT-III活性 （a）GnT-III活性の測定方法：GnT-III活性をピリジル
アミン化二分岐糖鎖（pyridylaminated biantennary-su
gar chain）を基質として測定した。概略は次の通りで
ある。供試トランスジェニックブタの各種臓器をリン酸
緩衝液（PBS）中でホモジナイズし、蛋白質含量を測定
した後、以下の反応溶液中でUDP（ウリジン２リン酸）-
GlcNAcをドナー基質として、ピリジルアミン(PA)化２分
岐糖鎖をアクセプター基質として、サンプル中のGnT-II
Iによりbisecting GlcNAcが生成される反応を行わせ、G
nT-IIIの比活性（p mol/h/mg）を測定した。すなわち、
0.77 mM 2-ピリジルアミン（PA）化糖鎖、20 mM UDP-Gl
cNAc、10 mM MnCl2、 200 mM N-アセチルグルコサミン
（GlcNAc）及び0.5% Triton X-100 を含む125 mM 2-(N-
morpholino) ethanesulphonate 緩衝液（pH 6.25）に各
サンプルを加え、37℃で2時間インキュベートした。そ
の後3分間煮沸して反応を止め、15000 gで5分間遠心分
離した。反応後のbisecting GlcNAcを HPLC（島津製作
所製HPLC装置SCL-6A）で測定した。HPLCの条件の一例を
示せば、分離用カラム；ODS-80カラム（TOSOH社製)、溶
出用緩衝液；0.25％（v/v）のbutan-1-olを含む20 mM
酢酸アンモニウム緩衝液（pH 4.0)、溶出条件；55℃で
1.2 ml/min、 検出条件；蛍光分光光度計（励起波長320
nm、蛍光波長400 nm）。399 p molのPA化二分岐糖鎖を
スタンダードとしてbisecting GlcNAcを定量した。GnT-
IIIの比活性は、個別に測定した３回の測定値を平均
し、タンパク質mg当たり、時間当たりの 転移GlcNAcのp
モルとして表した（表１）。 （b）GnT-III活性の測定結果：実施例１、２、３及び５
に記載のトランスジェニックブタ、並びに通常の非トラ
ンスジェニックブタの各種臓器についてGnT-III活性を
測定した結果を表１に示す。
アミン化二分岐糖鎖（pyridylaminated biantennary-su
gar chain）を基質として測定した。概略は次の通りで
ある。供試トランスジェニックブタの各種臓器をリン酸
緩衝液（PBS）中でホモジナイズし、蛋白質含量を測定
した後、以下の反応溶液中でUDP（ウリジン２リン酸）-
GlcNAcをドナー基質として、ピリジルアミン(PA)化２分
岐糖鎖をアクセプター基質として、サンプル中のGnT-II
Iによりbisecting GlcNAcが生成される反応を行わせ、G
nT-IIIの比活性（p mol/h/mg）を測定した。すなわち、
0.77 mM 2-ピリジルアミン（PA）化糖鎖、20 mM UDP-Gl
cNAc、10 mM MnCl2、 200 mM N-アセチルグルコサミン
（GlcNAc）及び0.5% Triton X-100 を含む125 mM 2-(N-
morpholino) ethanesulphonate 緩衝液（pH 6.25）に各
サンプルを加え、37℃で2時間インキュベートした。そ
の後3分間煮沸して反応を止め、15000 gで5分間遠心分
離した。反応後のbisecting GlcNAcを HPLC（島津製作
所製HPLC装置SCL-6A）で測定した。HPLCの条件の一例を
示せば、分離用カラム；ODS-80カラム（TOSOH社製)、溶
出用緩衝液；0.25％（v/v）のbutan-1-olを含む20 mM
酢酸アンモニウム緩衝液（pH 4.0)、溶出条件；55℃で
1.2 ml/min、 検出条件；蛍光分光光度計（励起波長320
nm、蛍光波長400 nm）。399 p molのPA化二分岐糖鎖を
スタンダードとしてbisecting GlcNAcを定量した。GnT-
IIIの比活性は、個別に測定した３回の測定値を平均
し、タンパク質mg当たり、時間当たりの 転移GlcNAcのp
モルとして表した（表１）。 （b）GnT-III活性の測定結果：実施例１、２、３及び５
に記載のトランスジェニックブタ、並びに通常の非トラ
ンスジェニックブタの各種臓器についてGnT-III活性を
測定した結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】Tanemuraらによって、通常マウスの肺及び
腎臓はそれぞれ520と3,400 p mol/h/mgのGnT-III活性を
発現していることが報告されたが（Transplant. Proc.,
29:895-896 (1997)）、通常ブタの場合には、全供試臓
器がGnT-IIIを発現していないことが今回明らかになっ
た。一方、本発明のトランスジェニックブタの場合に
は、全供試臓器がGnT-IIIを発現していた。供試臓器間
でGnT-IIIの発現量を比較すると、pMCPプロモーター、D
AFの第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用
遺伝子を用いた場合には（実施例１）、肝臓および脾臓
でGnT-IIIの発現が促進された、一方サイトメガロウイ
スのエンハンサー、鶏βアクチンのプロモーター及びGn
T-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には
（実施例３と５）、肺、心臓、腎臓および脾臓でGnT-II
Iの発現が促進された。実施例１のトランスジェニック
ブタの臓器のGnT-III活性値は、同様にpMCPプロモータ
ーを用いた実施例2のトランスジェニックブタの臓器のG
nT-III活性値に比べて明らかに高かったから、実施例1
で用いられたDAFの第一イントロンがエンハサーとして
機能することが確認された。
腎臓はそれぞれ520と3,400 p mol/h/mgのGnT-III活性を
発現していることが報告されたが（Transplant. Proc.,
29:895-896 (1997)）、通常ブタの場合には、全供試臓
器がGnT-IIIを発現していないことが今回明らかになっ
た。一方、本発明のトランスジェニックブタの場合に
は、全供試臓器がGnT-IIIを発現していた。供試臓器間
でGnT-IIIの発現量を比較すると、pMCPプロモーター、D
AFの第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用
遺伝子を用いた場合には（実施例１）、肝臓および脾臓
でGnT-IIIの発現が促進された、一方サイトメガロウイ
スのエンハンサー、鶏βアクチンのプロモーター及びGn
T-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には
（実施例３と５）、肺、心臓、腎臓および脾臓でGnT-II
Iの発現が促進された。実施例１のトランスジェニック
ブタの臓器のGnT-III活性値は、同様にpMCPプロモータ
ーを用いた実施例2のトランスジェニックブタの臓器のG
nT-III活性値に比べて明らかに高かったから、実施例1
で用いられたDAFの第一イントロンがエンハサーとして
機能することが確認された。
【００３８】試験例２トランスジェニックブタのα-Gal抗原量 （a）トランスジェニックブタの臓器のα-Gal抗原量の
測定方法（１）：供試トランスジェニックブタ臓器のα
-Gal抗原の量を、当該抗原と特異的に結合するIB4レク
チンを用いて検出した。概略は次の通りである。供試臓
器の溶解物（3μg）を還元条件下でSDS-ポリアクリルア
ミド電気泳動（12％）し、ゲルをニトロセルロース膜に
電気的に転写した。当該膜を3％のBSAを含むPBSでブロ
ッキングし、ビオチン化したIB4レクチン（10μg/ml）
を作用させ、洗浄した。その後、アビジン結合ホースラ
ディッシュ・ペルオキシダーゼ（Vector社製）を作用さ
せ、洗浄し、ECL検出キット（Amersham社製）を用いて
発色させた。発色の程度はイメージスキャナーで計測し
た。レクチンの付着率は、個別に測定した３回の測定値
を平均し、通常ブタの臓器への付着率を100として相対
値を計算した。 （b）トランスジェニックブタ血管内皮細胞のα-Gal抗
原量およびGnT-III活性の測定方法（2）：供試トランス
ジェニックブタを犠牲死させて、大動脈を取り出し、大
動脈内部を軽く擦って血管内皮細胞を採取し、Ham’s F
-12培地で数回継代した。α-Gal抗原量はFITC標識IB4レ
クチンを反応させ、FACS(ベクトンディキンソン社製FAC
Scan)により測定した。GnT-III活性は上記の方法で測定
した。 （c）供試臓器のα-Gal抗原量の測定結果（１）：実施
例１、３及び５のトランスジェニックブタ、並びに通常
の非トランスジェニックブタの各種臓器についてα-Gal
抗原量を測定した結果を表２に示す。
測定方法（１）：供試トランスジェニックブタ臓器のα
-Gal抗原の量を、当該抗原と特異的に結合するIB4レク
チンを用いて検出した。概略は次の通りである。供試臓
器の溶解物（3μg）を還元条件下でSDS-ポリアクリルア
ミド電気泳動（12％）し、ゲルをニトロセルロース膜に
電気的に転写した。当該膜を3％のBSAを含むPBSでブロ
ッキングし、ビオチン化したIB4レクチン（10μg/ml）
を作用させ、洗浄した。その後、アビジン結合ホースラ
ディッシュ・ペルオキシダーゼ（Vector社製）を作用さ
せ、洗浄し、ECL検出キット（Amersham社製）を用いて
発色させた。発色の程度はイメージスキャナーで計測し
た。レクチンの付着率は、個別に測定した３回の測定値
を平均し、通常ブタの臓器への付着率を100として相対
値を計算した。 （b）トランスジェニックブタ血管内皮細胞のα-Gal抗
原量およびGnT-III活性の測定方法（2）：供試トランス
ジェニックブタを犠牲死させて、大動脈を取り出し、大
動脈内部を軽く擦って血管内皮細胞を採取し、Ham’s F
-12培地で数回継代した。α-Gal抗原量はFITC標識IB4レ
クチンを反応させ、FACS(ベクトンディキンソン社製FAC
Scan)により測定した。GnT-III活性は上記の方法で測定
した。 （c）供試臓器のα-Gal抗原量の測定結果（１）：実施
例１、３及び５のトランスジェニックブタ、並びに通常
の非トランスジェニックブタの各種臓器についてα-Gal
抗原量を測定した結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】実施例１、３及び５のトランスジェニック
ブタの場合には、通常ブタに比べてα-Gal抗原の減少が
認められた。供試臓器間でGnT-IIIの発現量を比較する
と、pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-I
IIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には（実施
例１）、肝臓、腎臓および脾臓でα-Gal抗原の減少が促
進された、一方サイトメガロウイスのエンハンサー、鶏
βアクチンのプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る
導入用遺伝子を用いた場合には（実施例３と５）、肺お
よび心臓でα-Gal抗原の減少が促進された。
ブタの場合には、通常ブタに比べてα-Gal抗原の減少が
認められた。供試臓器間でGnT-IIIの発現量を比較する
と、pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-I
IIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には（実施
例１）、肝臓、腎臓および脾臓でα-Gal抗原の減少が促
進された、一方サイトメガロウイスのエンハンサー、鶏
βアクチンのプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る
導入用遺伝子を用いた場合には（実施例３と５）、肺お
よび心臓でα-Gal抗原の減少が促進された。
【００４１】（d）供試血管内皮細胞のα-Gal抗原量お
よびGnT-III活性の測定結果（２）：実施例３及び５の
トランスジェニックブタ、並びに通常の非トランスジェ
ニックブタの血管内皮細胞のα-Gal抗原量（FACS mean
shiftとして表す）およびGnT-III活性（p mol/h/mg）の
測定結果を表３に示す。
よびGnT-III活性の測定結果（２）：実施例３及び５の
トランスジェニックブタ、並びに通常の非トランスジェ
ニックブタの血管内皮細胞のα-Gal抗原量（FACS mean
shiftとして表す）およびGnT-III活性（p mol/h/mg）の
測定結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】実施例３及び５のトランスジェニックブタ
の血管内皮ではGnT-IIIが発現しており、その結果とし
てα-Gal抗原量の減少していることが確認された。
の血管内皮ではGnT-IIIが発現しており、その結果とし
てα-Gal抗原量の減少していることが確認された。
【００４４】試験例３ブタ心臓の体外循環試験 （1）心機能の延長時間の測定 ヒトの血清を用いてトランスジェニックブタの心臓を環
流し、GnT-IIIによる糖鎖抗原低減臓器の超急性拒絶反
応に対する効果を検討した。試験には２週齢の通常ブタ
と実施例1のトランスジェニックブタ（それぞれn=5）を
供した。鎮静剤であるストレスニル（2ｍｇ/ｋｇ）投与
後、麻酔薬であるラボナール（0.5ml/kg）により麻酔を
施した。腹部大動脈よりカテーテルを心臓に向かって挿
入し、4℃に冷やしたcardioplegic solution (glucose,
0.39M; NaHCO3, 8.3mM; KCl, 80mM; ヘパリン2000 U/l
)を200ml注入して、拍動を停止させた。摘出した心臓
はランゲンドルフ体外循環装置に結合させるまで４℃の
cardioplegic solutionに浸しておいた。心臓は大動脈
と肺静脈で装置に結合した後、35℃に保温したKrebs-He
nseleit バッファー（NaCl, 118.33mM; KCl, 4.7mM; KH
2PO4, 1.2mM; MgCl2, 0.66mM; NaHCO3, 25mM; CaCl2,
0.167mM; glucose, 11.1mM）で環流を開始した。環流開
始20分後に環流液を50％ヒト血清を含むK-H液に切り替
え、心臓が拍動を停止するまでの時間を記録した。その
際、心室の拍動の停止時を心機能の停止時とした。その
結果を表４に示す。表４に示されるように、本発明のト
ランスジェニックブタは超急性拒絶を抑制することが確
認できた。
流し、GnT-IIIによる糖鎖抗原低減臓器の超急性拒絶反
応に対する効果を検討した。試験には２週齢の通常ブタ
と実施例1のトランスジェニックブタ（それぞれn=5）を
供した。鎮静剤であるストレスニル（2ｍｇ/ｋｇ）投与
後、麻酔薬であるラボナール（0.5ml/kg）により麻酔を
施した。腹部大動脈よりカテーテルを心臓に向かって挿
入し、4℃に冷やしたcardioplegic solution (glucose,
0.39M; NaHCO3, 8.3mM; KCl, 80mM; ヘパリン2000 U/l
)を200ml注入して、拍動を停止させた。摘出した心臓
はランゲンドルフ体外循環装置に結合させるまで４℃の
cardioplegic solutionに浸しておいた。心臓は大動脈
と肺静脈で装置に結合した後、35℃に保温したKrebs-He
nseleit バッファー（NaCl, 118.33mM; KCl, 4.7mM; KH
2PO4, 1.2mM; MgCl2, 0.66mM; NaHCO3, 25mM; CaCl2,
0.167mM; glucose, 11.1mM）で環流を開始した。環流開
始20分後に環流液を50％ヒト血清を含むK-H液に切り替
え、心臓が拍動を停止するまでの時間を記録した。その
際、心室の拍動の停止時を心機能の停止時とした。その
結果を表４に示す。表４に示されるように、本発明のト
ランスジェニックブタは超急性拒絶を抑制することが確
認できた。
【００４５】
【表４】
【００４６】（2）環流後の組織学的観察 環流に使用した心臓組織の凍結切片を作製し、沈着して
いる抗体と補体量を比較した。即ち、組織の一部を環流
後直ちにOKTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、ドラ
イアイス/エタノールに接触させて凍結した。クリオス
タット切片は8μmの厚さとし、poly-L-lysinを塗布した
スライドグラスに張り付けた後、乾燥、アセトン固定を
おこなった。内因性のビオチンを「ブロッキングキッ
ト」（Vector Laboratories社製）で処理した後、抗IgG
抗体（ビオチン化抗ヒトIgGモノクローナル抗体JDC10：
サザンバイオテクノロジー社製）、 抗IgM抗体（ビオチ
ン化抗ヒトIgMモノクローナル抗体SA-DA4：サザンバイ
オテクノロジー社製）、抗C1q抗体（一次抗体；抗ヒトC
1qポリクローナルウサギ抗体：コスモ・バイオ社製、二
次抗体；ビオチン化抗ウサギIgGモノクローナル抗体D10
E6：スプリングバレーラボラトリーズ社製）、抗C3抗体
（一次抗体；抗ヒトC3ポリクローナルウサギ抗体：コス
モ・バイオ社製、二次抗体；ビオチン化抗ウサギIgGモ
ノクローナル抗体D10E6：スプリングバレーラボラトリ
ーズ社製）と反応させた。免疫染色はVector Laborator
ies社製VECTASTEIN ABC Kitを使用しておこなった。ペ
ルオキシダーゼの反応はdiaminobenzidine reagent set
(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を利用した。
そして、各成分の沈着の程度を検鏡した。その結果を表
５に示す。
いる抗体と補体量を比較した。即ち、組織の一部を環流
後直ちにOKTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、ドラ
イアイス/エタノールに接触させて凍結した。クリオス
タット切片は8μmの厚さとし、poly-L-lysinを塗布した
スライドグラスに張り付けた後、乾燥、アセトン固定を
おこなった。内因性のビオチンを「ブロッキングキッ
ト」（Vector Laboratories社製）で処理した後、抗IgG
抗体（ビオチン化抗ヒトIgGモノクローナル抗体JDC10：
サザンバイオテクノロジー社製）、 抗IgM抗体（ビオチ
ン化抗ヒトIgMモノクローナル抗体SA-DA4：サザンバイ
オテクノロジー社製）、抗C1q抗体（一次抗体；抗ヒトC
1qポリクローナルウサギ抗体：コスモ・バイオ社製、二
次抗体；ビオチン化抗ウサギIgGモノクローナル抗体D10
E6：スプリングバレーラボラトリーズ社製）、抗C3抗体
（一次抗体；抗ヒトC3ポリクローナルウサギ抗体：コス
モ・バイオ社製、二次抗体；ビオチン化抗ウサギIgGモ
ノクローナル抗体D10E6：スプリングバレーラボラトリ
ーズ社製）と反応させた。免疫染色はVector Laborator
ies社製VECTASTEIN ABC Kitを使用しておこなった。ペ
ルオキシダーゼの反応はdiaminobenzidine reagent set
(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を利用した。
そして、各成分の沈着の程度を検鏡した。その結果を表
５に示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】表５に示されるように、本発明のトランス
ジェニックブタは超急性拒絶を抑制することが確認でき
た。より詳細には、α-抗原量の減少に伴う補体反応の
初期段階の抑制（C1qの抑制）とそれに基づく補体反応
の中期段階の抑制（C3の抑制）が確認された。
ジェニックブタは超急性拒絶を抑制することが確認でき
た。より詳細には、α-抗原量の減少に伴う補体反応の
初期段階の抑制（C1qの抑制）とそれに基づく補体反応
の中期段階の抑制（C3の抑制）が確認された。
【００４９】試験例４GnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックマウスの
赤血球を用いた補体反応抑制試験 実施例４に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニッ
クマウス、比較例２に記載のDAFを発現するトランスジ
ェニックマウス、実施例６に記載のGnT-IIIとDAFを共発
現するトランスジェニックマウスのそれぞれから得られ
た子孫マウス、及び通常マウスを犠死させて血液を採取
し、赤血球画分を得た。それぞれの赤血球をPBSにて希
釈し、96穴マイクロプレートの各ウエルに30μlずつ分
注し（1x10 ７個／ウェル）、その後、補体含有量調整ヒ
ト血清70μlを上記のウェルに滴下し、赤血球と反応さ
せた（37℃、1.5時間）。その後、補体反応により生じ
た溶血の程度を405nmにおける吸光度で測定した。通常
マウスの溶血の程度を100として、各供試検体における
溶血の程度を表した。その結果を表６に示した。
赤血球を用いた補体反応抑制試験 実施例４に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニッ
クマウス、比較例２に記載のDAFを発現するトランスジ
ェニックマウス、実施例６に記載のGnT-IIIとDAFを共発
現するトランスジェニックマウスのそれぞれから得られ
た子孫マウス、及び通常マウスを犠死させて血液を採取
し、赤血球画分を得た。それぞれの赤血球をPBSにて希
釈し、96穴マイクロプレートの各ウエルに30μlずつ分
注し（1x10 ７個／ウェル）、その後、補体含有量調整ヒ
ト血清70μlを上記のウェルに滴下し、赤血球と反応さ
せた（37℃、1.5時間）。その後、補体反応により生じ
た溶血の程度を405nmにおける吸光度で測定した。通常
マウスの溶血の程度を100として、各供試検体における
溶血の程度を表した。その結果を表６に示した。
【００５０】
【表６】
【００５１】表６に示されるように、本発明のトランス
ジェニックマウスは補体依存性細胞障害（補体反応）を
抑制することが確認できた。また、GnT-IIIとDAFを同時
に発現させることによって、補体依存性細胞障害を相乗
的に抑制することが確認できた。更に、糖鎖修飾酵素で
あるGnT-IIIをマウスに発現させた場合でも、GPIアンカ
ー型糖蛋白質であるDAFの機能発現に何らの障害を生じ
ないことが確認できた。
ジェニックマウスは補体依存性細胞障害（補体反応）を
抑制することが確認できた。また、GnT-IIIとDAFを同時
に発現させることによって、補体依存性細胞障害を相乗
的に抑制することが確認できた。更に、糖鎖修飾酵素で
あるGnT-IIIをマウスに発現させた場合でも、GPIアンカ
ー型糖蛋白質であるDAFの機能発現に何らの障害を生じ
ないことが確認できた。
【００５２】試験例５GnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックブタの血
管内皮細胞を用いた補体反応抑制試験 （a）補体反応抑制試験の方法：ブタの血管内皮細胞と
ヒト血清を反応させて、補体反応による細胞傷害の程度
を調べた。実施例１、３及び５のトランスジェニックブ
タ並びに通常ブタを犠死させて大動脈を採取した。大動
脈内皮部を軽く擦って血管内皮細胞を採取し、F-12培地
にて増殖させ、更にDMEM培地で5-10回継代培養した。そ
の後、96穴マイクロプレートの播種し（5x10３細胞／ウ
エル）、一晩培養した。PBS(-)で洗浄した後、ヒト非働
化血清またはヒト補体含有量調整血清（30％と50％）10
0μlを上記のウエルに滴下し、血管内皮細胞と反応させ
た（37℃、1.5時間）。生存した細胞数を乳酸脱水素酵
素量を指標に測定した。生存率は、次式による求めた。
生存率(%)＝（ヒト補体含有量調整血清と反応させた時
の生存細胞数）／（ヒト非働化血清と反応させた時の生
存細胞数）x100。その結果を表７に示した。
管内皮細胞を用いた補体反応抑制試験 （a）補体反応抑制試験の方法：ブタの血管内皮細胞と
ヒト血清を反応させて、補体反応による細胞傷害の程度
を調べた。実施例１、３及び５のトランスジェニックブ
タ並びに通常ブタを犠死させて大動脈を採取した。大動
脈内皮部を軽く擦って血管内皮細胞を採取し、F-12培地
にて増殖させ、更にDMEM培地で5-10回継代培養した。そ
の後、96穴マイクロプレートの播種し（5x10３細胞／ウ
エル）、一晩培養した。PBS(-)で洗浄した後、ヒト非働
化血清またはヒト補体含有量調整血清（30％と50％）10
0μlを上記のウエルに滴下し、血管内皮細胞と反応させ
た（37℃、1.5時間）。生存した細胞数を乳酸脱水素酵
素量を指標に測定した。生存率は、次式による求めた。
生存率(%)＝（ヒト補体含有量調整血清と反応させた時
の生存細胞数）／（ヒト非働化血清と反応させた時の生
存細胞数）x100。その結果を表７に示した。
【００５３】
【表７】
【００５４】（b）細胞傷害抑制試験の結果：表７が示
すように、本発明のトランスジェニックブタは補体依存
性細胞傷害（補体反応）を抑制することが確認できた。
また、GnT-IIIとDAFを同時に発現させることによって、
補体依存性細胞傷害反応を相乗的に抑制することが確認
された。更に、糖鎖修飾酵素であるGnT-IIIをブタに発
現させた場合でも、GPIアンカー型糖蛋白質であるDAFの
機能発現に何らの障害を生じないことが確認できた。
すように、本発明のトランスジェニックブタは補体依存
性細胞傷害（補体反応）を抑制することが確認できた。
また、GnT-IIIとDAFを同時に発現させることによって、
補体依存性細胞傷害反応を相乗的に抑制することが確認
された。更に、糖鎖修飾酵素であるGnT-IIIをブタに発
現させた場合でも、GPIアンカー型糖蛋白質であるDAFの
機能発現に何らの障害を生じないことが確認できた。
【００５５】試験例６GnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックブタの血
管内皮細胞のNK細胞による細胞障害への抵抗性試験 試験例５と同様に実施例３及び５のトランスジェニック
ブタ並びに通常ブタから血管内皮細胞を調製し、96穴マ
イクロプレートに播種し（2x10４細胞／ウエル）、一晩
培養した。PBS(-)にて洗浄後、ヒト血液から分離したNK
細胞懸濁液（4x106細胞/ml）50μlを上記のウエルに滴
下し、血管内皮細胞と反応させた（37℃、4時間）。生
存した細胞数を乳酸脱水素酵素量を指標に測定した。生
存率は次式により求めた。生存率(%)=（NK細胞と反応さ
せた時の生存細胞数）／（NK細胞と反応させなかった時
の生存細胞数）x100。その結果を表８に示した。
管内皮細胞のNK細胞による細胞障害への抵抗性試験 試験例５と同様に実施例３及び５のトランスジェニック
ブタ並びに通常ブタから血管内皮細胞を調製し、96穴マ
イクロプレートに播種し（2x10４細胞／ウエル）、一晩
培養した。PBS(-)にて洗浄後、ヒト血液から分離したNK
細胞懸濁液（4x106細胞/ml）50μlを上記のウエルに滴
下し、血管内皮細胞と反応させた（37℃、4時間）。生
存した細胞数を乳酸脱水素酵素量を指標に測定した。生
存率は次式により求めた。生存率(%)=（NK細胞と反応さ
せた時の生存細胞数）／（NK細胞と反応させなかった時
の生存細胞数）x100。その結果を表８に示した。
【００５６】
【表８】
【００５７】表８が示すように、本発明のGnT-IIIを発
現するトランスジェニックブタはNK細胞に対する細胞障
害を抑制することが確認された。AVRの生じる原因は必
ずしも特定されていないが、異種抗原、補体、マクロフ
ァージ、NK細胞、好中球、血小板などが関与すると言わ
れている。本発明のトランスジェニックブタの血管内皮
細胞はヒトNK細胞による細胞障害に耐性を有すると共
に、試験例２から、異種抗原（α-Gal抗原）量が減少し
ているので、本発明のトランスジェニックブタは急性血
管型拒絶についても抵抗性を有すると思われる。
現するトランスジェニックブタはNK細胞に対する細胞障
害を抑制することが確認された。AVRの生じる原因は必
ずしも特定されていないが、異種抗原、補体、マクロフ
ァージ、NK細胞、好中球、血小板などが関与すると言わ
れている。本発明のトランスジェニックブタの血管内皮
細胞はヒトNK細胞による細胞障害に耐性を有すると共
に、試験例２から、異種抗原（α-Gal抗原）量が減少し
ているので、本発明のトランスジェニックブタは急性血
管型拒絶についても抵抗性を有すると思われる。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nippon Meat Packers, Inc. <120> Transgenic mammals <130> 0108NH73 <150> JP 2000-256541 <151> 2000-08-25 <160> 4 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 tcctcgagct gccccggctg ctgctgctgg tgctgttgt 39 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 tcaagcttct gggggaaggc cacagtcacc 30 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 ggtggacgcc tttgtggtgt gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 gccggtgcgg ttctcatact gt 22
【図１】α-Gal抗原の生成と同抗原の生成を回避する方
法を示す図である。
法を示す図である。
【図２】糖鎖の分岐機構とGnT-IIIによる糖鎖の分岐抑
制の作用点を示す図である。
制の作用点を示す図である。
【図３】実施例1の導入用遺伝子の構造を示す図であ
る。
る。
【図４】実施例２の導入用遺伝子の構造を示す図であ
る。
る。
【図５】実施例３の導入用遺伝子の構造を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高萩 陽一 茨城県つくば市緑ヶ原３丁目３番地 日本 ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者 豊村 浩司 茨城県つくば市緑ヶ原３丁目３番地 日本 ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者 重久 保 茨城県つくば市緑ヶ原３丁目３番地 日本 ハム株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA01 DA02 EA02 EA04 FA02 FA06 GA11 HA20
Claims (7)
- 【請求項１】 超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能
している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転
移酵素IIIの遺伝子からなる導入遺伝子を有するヒト以
外のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項２】 超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能
している調節遺伝子及びヒトのN-アセチルグルコサミン
転移酵素IIIの遺伝子、並びに、ヒトの補体活性制御因
子の遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳
動物。 - 【請求項３】 補体制御因子が、ＤＡＦ、ＣＤ５９、
ＭＣＰ、C1-インヒビター、C4バインディングプロテイ
ン、H因子、I因子またはこれらの改変型補体制御因子で
ある請求項２記載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項４】 超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能
している調節遺伝子が、β-アクチンのプロモーター、
エンドセリンのプロモーター、トロンボモジュリンのプ
ロモーター、ブタ補体制御因子(pMCP)のプロモーター、
アルブミンのプロモーター、インスリンのプロモータ
ー、エロンゲーションファクターのプロモーター、サイ
トメガロウイルスのエンハンサー及び／又はヒトDAF遺
伝子の第一イントロンである請求項１〜３の何れかに記
載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項５】 トランスジェニック哺乳動物が、家畜
又は実験動物である請求項１〜４の何れかに記載のトラ
ンスジェニック哺乳動物。 - 【請求項６】 トランスジェニック哺乳動物が、トラ
ンスジェニックブタ又はトランスジェニックマウスであ
る請求項５記載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項７】 ヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵
素IIIを発現するトランスジェニック哺乳動物とヒトの
補体制御因子を発現するトランスジェニック動物を個別
に作製し、両者を交配することによりヒトのN-アセチル
グルコサミン転移酵素III及びヒトの補体制御因子の両
方を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の
作製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001255498A JP2002291372A (ja) | 2000-08-25 | 2001-08-27 | トランスジェニック哺乳動物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-256541 | 2000-08-25 | ||
| JP2000256541 | 2000-08-25 | ||
| JP2001255498A JP2002291372A (ja) | 2000-08-25 | 2001-08-27 | トランスジェニック哺乳動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002291372A true JP2002291372A (ja) | 2002-10-08 |
Family
ID=26598538
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001255498A Pending JP2002291372A (ja) | 2000-08-25 | 2001-08-27 | トランスジェニック哺乳動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002291372A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006048954A1 (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-11 | The Animal Engineering Research Institute | 異種移植用豚細胞、その選抜方法及び異種移植用豚 |
-
2001
- 2001-08-27 JP JP2001255498A patent/JP2002291372A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006048954A1 (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-11 | The Animal Engineering Research Institute | 異種移植用豚細胞、その選抜方法及び異種移植用豚 |
| JP2006129736A (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Nippon Dobutsu Kogaku Kenkyusho:Kk | 異種移植用豚細胞、その選抜方法及び異種移植用豚 |
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