EA029538B1 - Полипептид, обладающий активностью альдолазы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способы получения и применения полинуклеотида и полипептида - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как активность альдолазы HMG и/или KHG, и к полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, а также к получению и применению этих полинуклеотидов и полипептидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к биосинтетическим каскадам, которые пригодны для получения R-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (R-MP). Кроме того, полипептиды согласно данному изобретению можно применять во множестве фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных направлений, а именно в составе продукта питания, кормового продукта и напитка, добавки к продукту питания, добавки к кормовому продукту, добавки к напитку, теста, хлебного продукта и в составе фармацевтической композиции. Они также пригодны для превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала в топливо и могут входить в его состав. Причем топливо может быть этанолом, метанолом, пропанолом, бутанолом или дизелем.

Description

Изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как активность альдолазы НМО и/или КНО, и к полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, а также к получению и применению этих полинуклеотидов и полипептидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к биосинтетическим каскадам, которые пригодны для получения К-2-гидрокси-2(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (К-МР). Кроме того, полипептиды согласно данному изобретению можно применять во множестве фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных направлений, а именно в составе продукта питания, кормового продукта и напитка, добавки к продукту питания, добавки к кормовому продукту, добавки к напитку, теста, хлебного продукта и в составе фармацевтической композиции. Они также пригодны для превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала в топливо и могут входить в его состав. Причем топливо может быть этанолом, метанолом, пропанолом, бутанолом или дизелем.

Область изобретения

Изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. Более конкретно, изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов.

Предпосылки изобретения

Монатин представляет собой сильный подсластитель, имеющий химическую формулу

Монатин включает два хиральных центра, приводящих к четырем возможным стереоизомерным конфигурациям: конфигурация К_,К_ (Κ,Κ-стереоизомер или Κ,Κ,-монатин); конфигурация 8,8 (8,8стереоизомер или 8,8-монатин); конфигурация К_,8 (К_,8-стереоизомер или К_,8-монатин) и конфигурация 8,К (8,К-стереоизомер или 8,К-монатин). Как используют в настоящем документе, если нет иных указаний, термин монатин применяют для обозначения композиций, включающих все четыре стереоизомера монатина, композиций, включающих любое сочетание стереоизомеров монатина (таких как композиция, включающая только К,К- и 8,8-стереоизомеры монатина), а также единичной изомерной формы.

Для целей этого описания углеродный остов монатина будет пронумерован, как проиллюстрировано выше, при этом атом углерода, прямо ковалентно связанный с группой спирта, обозначен как атом углерода в 2 положении, и атом углерода, прямо ковалентно связанный с аминогруппой, обозначен как атом углерода в 4 положении. Таким образом, указание в настоящем документе на Κ,Κ-монатин, 8,8монатин, К,8-монатин и 8,К-монатин означает 2К,4К-монатин, 28,48-монатин, 2К,48-монатин и 28,4Кмонатин, соответственно, если нет иных указаний.

Следует отметить, что в литературе углеродный остов монатина также нумеруют с использованием альтернативного способа, при этом атом углерода, присоединенный к группе спирта, представляет собой атом углерода в 4 положении, и атом углерода, присоединенный к аминогруппе, представляет собой атом углерода в 2 положении. Таким образом, например, указание на 28,4К-монатин в этом описании может означать то же, что указание на 2К,48-монатин в литературе с использованием альтернативного способа нумерации.

Более того, вследствие различных способов номенклатуры, монатин известен под рядом альтернативных химических названий, включая 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-аминоглутаровая кислота; 4амино-2-гидрокси-2-(1Н-индол-3-илметил)пентандиовая кислота; 4-гидрокси-4-(3-индолилметил)глутаминовая кислота и 3-(1-амино-1,3-дикарбокси-3-гидрокси-бут-4-ил)индол.

Некоторые изомерные формы монатина могут быть найдены в коре корней растения 8сЫегоеййоп ϊΐΐοΐίοίΐυδ, встречающегося в области Трансвааля Южной Африки. В патентных заявках США №№ 10/422366 (заявка '366) и 10/979821 (заявка '821), которые включены в настоящий документ в качестве ссылок, описаны, помимо прочего, полипептиды, каскады и микроорганизмы для получения монатина ίπ νίίτο и ίη νίνο.

Сущность изобретения

Это изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы (в дальнейшем в настоящем документе альдолазы), включая активность пируватальдолазы, такую как, но не ограничиваясь ими, активность альдолазы НМО и/или КНО, к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, и к способам получения и применения полипептидов и полинуклеотидов.

Эти альдолазы способны катализировать реакции образования углерод-углеродной связи между акцептором в виде α-кетокислоты и донором в виде пирувата или производного пирувата (см. схему реакции ниже). Акцептор также может представлять собой кетон или альдегид. Некоторые из них обладают активностью 4-гидрокси-2-оксоглутаратальдолазы (такой как 2-кето-4-гидроксиглутаратальдолаза, 2оксо-4-гидроксиглутаратальдолаза, альдолаза КНО, ЕС 4.1.3.16) и катализируют следующую реакцию: 4гидрокси-2-оксоглутарат <=> пируват + глиоксилат. Описанные альдолазы обладают активностью альдолазы НМО (такой как 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутаратальдолаза, пируватальдолаза, гамма-метилгамма-гидрокси-альфа-кетоглутаровая альдолаза, 4-гидрокси-4-метил-2-кетоглутаратальдолаза, ЕС

4.1.3.17) и катализируют следующую реакцию: 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат <=> 2 пируват. Альдолаза НМО также действует на 4-гидрокси-4-метил-2-оксоадипат и 4-карбокси-4-гидрокси-2оксогексадиоат.

- 1 029538

К = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил,

К₂ = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил,

К₃ = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил, карбоновая кислота.

Пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, облегчают продукцию 3,4-замещенного 2кетоглутарата.

Они также способны облегчать продукцию К-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (К-МР), предшественника монатина.

Альдолазу НМО и/или КНО, можно использовать совместно с Ό-аминотрансферазой для получения 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты или ее производного. 4-Замещенную Ό-глутаминовую кислоту и/или ее производное можно применять в качестве антибиотиков, поскольку было выявлено, что эти соединения ингибируют бактериальную глутаматрацемазу (XVО 0214261 А3). Итак, первым объектом настоящего изобретения является выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:

(a) нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности 8ЕО ГО N0: 27 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более нуклеотидов, которая кодирует полипептид альдолазы полной длины или фрагмент указанного полипептида, содержащие иммуногенный эпитоп и способные индуцировать синтез специфичных к альдолазе антител;

(b) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с последовательностью, комплементарной последовательности, охарактеризованной в (а); или (c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид альдолазы полной длины, содержащий 8ЕО ГО N0: 28, или фрагмент указанного полипептида, обладающий активностью альдолазы;

(й) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь) или (с), кодирующую полипептид альдолазы или его фрагмент, обладающие по меньшей мере одной консервативной аминокислотной заменой и сохраняющие активность альдолазы;

(е) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с) или (й), кодирующую полипептид альдолазы, лишенный сигнальной последовательности;

(ί) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й) или (е), кодирующую полипептид альдолазы, дополнительно содержащий гетерологичную последовательность;

(д) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й), (е) или (ί), где активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, активность альдолазы НМО и/или активность альдолазы КНО, или (Ь) нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, раскрытой в любом из (а), (Ь), (с), (й), (е), (ί) и (д).

Вторым объектом данного изобретения является экспрессирующая кассета, вектор или носитель для клонирования, содержащие вышеуказанные нуклеиновые кислоты. Причем носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, а вирусный вектор может быть аденовирусным вектором, ретровирусным вектором или аденоассоциированным вирусным вектором. При этом искусственная хромосома может представлять собой бактериальную искусственную хромосому (ВАС), образованный из бактериофага Р1 вектор (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).

Третьим объектом данного изобретения является трансформированная клетка, содержащая указанные нуклеиновую кислоту или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования.

Предложенное изобретение также относится к трансгенному животному, которое не является человеком, содержащему заявленные последовательность или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования или трансформированную клетку.

Охватывает оно и трансгенное растение или часть растения, в частности семя, содержащие вышеуказанные последовательность или экспрессирующую кассету, вектор, или носитель для клонирования, или трансформированную клетку. Еще одним объектом предложенного изобретения является выделен- 2 029538 ный, синтетический или рекомбинантный полипептид альдолазы, содержащий:

(a) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности 5>ЕС ГО N0: 28 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков, причем указанный полипептид представляет собой полипептид альдолазы полной длины или фрагмент указанного полипептида, обладающий активностью альдолазы; или (b) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид или его фрагмент обладает иммуногенной активностью и способен индуцировать синтез антител, которые специфичны к альдолазе; или (c) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а) или (Ь), содержащую консервативную замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка, причем полипептид или его фрагмент сохраняют активность альдолазы;

(й) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь) или (с), лишенную сигнальной последовательности; или (е) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с) или (й), дополнительно содержащую гетерологичную последовательность; или (Г) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й) или (е), где активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, активность альдолазы НМО и/или активность альдолазы КНО; или (д) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й), (е) или (Г), где полипептид или его фрагмент содержат по меньшей мере один участок гликозилирования. Кроме того, еще одним из объектов настоящего изобретения является выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфично связывается с указанным полипептидом.

В изобретении раскрыт способ получения рекомбинантного полипептида альдолазы, включающий стадии:

(a) получение заявленной нуклеиновой кислоты и (b) обеспечение экспрессии нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, что приводит к получению рекомбинантного полипептида.

Изобретение также относится к способу получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид альдолазы, включающий стадии:

(a) получение матричной нуклеиновой кислоты, содержащей эту нуклеиновую кислоту; и (b) модификация, делеция или добавление одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их сочетание с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты, где вариант полипептида альдолазы является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия повышенной температуры, а также обладает повышенным гликозилированием по сравнению с альдолазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой.

В одном из вариантов осуществления этого способа стадии (Ь) осуществляют модификацию кодонов в матричной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид альдолазы, путем замены первоначального кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (а), отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещаемый кодон.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ образования углерод-углеродной связи, включающий следующие стадии:

(a) получение заявленного полипептида;

(b) получение донорного и акцепторного соединения и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид альдолаза образует углерод-углеродную связь.

В предпочтительном варианте осуществления этот способ является способом получения 4замещенной Ό-глутаминовой кислоты, включающий следующие стадии:

(a) получение заявленных полипептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой;

(b) получение акцептора а-кетокислоты и пирувата или донора пирувата и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты.

В наиболее предпочтительном варианте дополнительно применяется Ό-аминотрансфераза.

Еще в одном предпочтительном варианте этот способ является способом получения 3,4замещенного 2-кетоглутарата, включающий следующие стадии:

(a) получение заявленных полипептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой;

(b) получение донорного и акцепторного соединения и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 3,4-замещенного 2-кетоглутарата.

Одним из объектов заявленного изобретения являются композиции, содержащие вышеуказанный полипептид. Причем эта композиция может быть продуктом питания, кормовым продуктом или напитком или же фармацевтической композиций, добавкой к продукту питания, добавкой к кормовому про- 3 029538 дукту, добавкой к напитку, тестом или хлебным продуктом.

Причем эта композиция может быть приготовлена в виде таблетки, геля, пилюли, имплантата, аэрозоля, порошка, капсулы или в виде инкапсулированного состава. Данное изобретение также относится к способу превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала в топливо, включающему приведение биомассы или лигноцеллюлозного материала в контакт с указанным полипептидом или полипептидом, кодируемым заявленной нуклеиновой кислотой, или с его фрагментом, сохраняющим активность альдолазы, где при необходимости биомассу или лигноцеллюлозный материал предварительно обрабатывают перед контактом с альдолазой, и где при необходимости перед контактом с альдолазой биомассу или лигноцеллюлозный материал приводят в контакт с ферментом, вызывающим деградацию целлюлозы и/или гемицеллюлозы.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения топливо представляет собой этанол, метанол, пропанол, бутанол или дизель.

Наконец, последним объектом настоящего изобретения является топливо, содержащее заявленный полипептид, которое представляет собой этанол, метанол, пропанол, бутанол или дизель.

В настоящем документе, выражение композиция монатина означает композиции, включающие один или несколько изомеров монатина; также термин может означать только одну изомерную форму монатин и ничего более.

Как используют в настоящем документе, выражение композиция производного монатина означает композицию, включающую один или несколько изомеров производного монатина; также термин означает только одну изомерную форму производного монатина и ничего более.

Как используют в настоящем документе, выражение производное монатина соответствует следующей структуре:

где каждый из К_а, К,, Кс, Кт и Кс независимо представляет собой любой заместитель, выбранный из атома водорода, гидроксильной группы, С₁-С₃алкильной группы, группы С₁-С₃алкокси, аминогруппы или атома галогена, такого как атом йода, атом брома, атом хлора или атом фтора. Однако К_а, К_ь, Кс, Ка и Кс не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно К, и К, и/или Ка и Кс могут вместе образовывать группу С₁-С₄алкилена соответственно.

Как используют в настоящем документе, замещенный индол-3-пируват означает, что один или несколько атомов углерода в индольном кольце индол-3-пирувата независимо замещены одним или несколькими из групп заместителей К_а, К_ь, К,, К_а и К., определенных выше. Однако К_а, К_ь, К,, К_а и К. не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно К, и К, и/или Кт и Кс могут совместно образовывать группу С₁-С₄алкилена соответственно.

Как используют в настоящем документе, замещенный триптофан означает, что один или несколько атомов углерода индольного кольца триптофана независимо замещены одной или несколькими группами заместителей К_а, К_ь, К,, К_а и Кс, определенными выше. Однако К_а, К,, К,, К_а и Кс не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно К, и К, и/или Кт и К могут совместно образовывать группу С₁-С₄алкилена соответственно. В одном варианте осуществления замещенный триптофан содержит ту же группу(ы) заместителя на индольном кольце, что и конечное производное монатина.

Более того, в биосинтетических каскадах образования монатина, описанных в настоящем документе, может использоваться замещенный триптофан с образованием производных монатина, которые, вероятно, будут обладать сладким вкусом. В некоторых вариантах осуществления замещенный триптофан, подлежащий применению в биосинтетических каскадах, описанных в настоящем документе, включает хлорированный триптофан и 5-гидрокситриптофан.

Например, хлорированные ϋ-триптофаны, которые обладают структурным сходством с К,Кмонатином, были идентифицированы в качестве не обладающих пищевыми качествами подсластителей (в частности 6-хлор-О-триптофан). Аналогично было выявлено, что галогенированные и гидроксизамещенные формы монатина обладают сладким вкусом (Опубликованная патентная заявка США № 2005/0118317). Галогены и гидроксильные группы могут поддаваться замещению водородом, в частности в положениях 1-4 бензольного кольца в индоле триптофана, без препятствования последующим пре- 4 029538 вращениям в Ό- или Ь-триптофан, индол-3-пируват, МР или монатин. В литературе было показано, что замещенные индолы являются пригодными субстратами для РЬР-ферментов и приводят к замещенным триптофанам. Рикиба, Ό.8., с1 а1., Ртобисйоп о£ 5иЬыПи1с0 Ь-ТЬтур1орЬап8 Ьу Реттейайои, Арр1. Εηνίτοη. МютоЬю1., 21:841-43 (1971). Галоген, по-видимому, не является пространственным препятствием для каталитического механизма β-субъединиц триптофансинтетазы, и энантиоспецифичность также не изменялась.

Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения представлено в прилагаемых ниже чертежах и описании. Другие признаки, цели и преимущества этого изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения. Как следует понимать из представленного в настоящем документе описания, возможны модификации изобретения в различных вариантах осуществления без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, чертежи и подробное описание следует понимать по своему характеру как иллюстративные, а не ограничивающие.

Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из СеиВаик и депонированные в АТСС образцы, цитированные в настоящем документе, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для любых целей.

Краткое описание чертежей

Представленные чертежи иллюстрируют варианты осуществления этого изобретения и не предназначены для ограничения объема этого изобретения, охватываемого формулой изобретения.

На фиг. 1 представлена блок-схема, на которой показан пример ферментативного процесса получения К,К-монатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает применение Ь-аминотрансферазы (примеры которой включают Ь-триптофанаминотрансферазу, Ь-ароматическую аминотрансферазу, Ь-аспартатаминотрансферазу и Ь-аланинаминотрансферазу) в реакции с Ьтриптофаном, которая обладает большей специфичностью и/или селективностью в отношении Ьтриптофана в качестве субстрата, чем К-МР, и/или процесс включает применение оксидазы Ьаминокислот с ограниченной активностью и/или специфичностью в отношении К,К-монатина в качестве субстрата. В конкретном примере, схематически представленном на фиг. 1, Ь-аминотрансфераза или оксидаза Ь-аминокислот превращает Ь-триптофан в индол-3-пируват, индол-3-пируват подвергают реакции с К-специфичной альдолазой и пируватом с образованием К-а-кетокислоты монатина (К-МР), и К-МР превращается в К,К-монатин Ό-аминотрансферазой или дегидрогеназой Ό-аминокислот. Как показано на фиг. 1, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции проходили в обратном направлении.

На фиг. 2 представлена блок-схема, на которой показан другой пример получения К,К-монатина по этому изобретению. В этом примере процесс включает применение фермента для превращения К-МР в монатин, который является стереоселективным в отношении К-МР. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 2, показано, что триптофан превращается в индол-3-пируват в обратимой реакции. Индол-3-пируват можно подвергать реакции с нестереоспецифичной альдолазой с обратимым образованием а-кетокислоты монатина (как К-, так и δ-МР). К-МР обратимо превращают в К,К-монатин с помощью стереоселективной Ό-аминотрансферазы или дегидрогеназы Ό-аминокислот. Любой δ-МР, который образуется с помощью нестереоспецифичной альдолазы, может превращаться обратно в индол3-пируват, если используют стереоселективную Ό-аминотрансферазу или дегидрогеназу Ό-аминокислот. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении.

На фиг. 3 представлена блок-схема, на которой показан другой пример получения К,К-монатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает превращение Ь-триптофана в Όтриптофан с применением триптофанрацемазы, и применение продукта, представляющего собой Όаминокислоту, в реакции, сопряженной с реакцией образования индол-3-пирувата в качестве субстрата в реакции, сопряженной с реакцией образования К,К-монатина. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 3, Ь-триптофан превращают в Ό-триптофан с помощью триптофанрацемазы в обратимой реакции. Ό-триптофан подвергают реакции с а-кетоглутаратом (а-КС) и Ό-аминотрансферазой широкой специфичности с образованием индол-3-пирувата и Ό-глутамата. Индол-3-пируват подвергают реакции с пируватом и К-специфичной альдолазой, и он превращается в К-а-кетокислоту монатина (КМР), и К-МР подвергают реакции с Ό-аминотрансферазой широкой специфичности и Ό-глутаматом с образованием К,К-монатина и а -кетоглутарата (а-КС). Как показано на фиг. 3, каждая из реакций является обратимой, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении.

На фиг. 4 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения К,Кмонатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает превращение Ьаминокислоты, образованной в реакции, сопряженной с реакцией Ь-триптофана, в Ό-аминокислоту; эта Ό-аминокислота действует в качестве донора амино для реакции, в которой К-МР превращается в К,Кмонатин. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 4, Ь-триптофан подвергают реак- 5 029538 ции с Ь-аминотрансферазой и а-кетоглутаратом с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата. Индол3-пируват подвергают реакции с пируватом и К-специфичной альдолазой, и он превращается в К-акетокислоту монатина (К-МР), и К-МР подвергают реакции с Ό-аминотрансферазой широкой специфичности и Ό-глутаматом с образованием К,К-монатина и а-кетоглутарата. Как показано на фиг. 4, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении.

На фиг. 5 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения К,Кмонатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает ферментативное облегчение превращения К-МР в К,К-монатин с использованием стереоинвертирующего фермента, так что Ь-аминокислоту, образованную посредством реакции, сопряженной с реакцией Ь-триптофана, можно использовать в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения К-МР в К,Кмонатин. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 5, Ь-триптофан подвергают реакции с Ь-аминотрансферазой и оксалоацетатом, пируватом или а-кетоглутаратом (а-КО) с образованием индол-3-пирувата и Ь-аспартата (если используют оксалоацетат), Ь-аланина (если используют пируват) или Ь-глутамата (если используют а-КО). Индол-3-пируват подвергают реакции с пируватом и Кспецифичной альдолазой, и он превращается в К-а-кетокислоту монатина (К-МР), и К-МР подвергают реакции со стереоинвертирующей аминотрансферазой и Ь-аспартатом, Ь-аланином или Ь-глутаматом с образованием К,К-монатина и оксалоацетата (если используют Ь-аспартат), пирувата (если используют Ь-аланин) или а-кетоглутарата (а-КО, если используют Ь-глутамат). Как показано на фиг. 5, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении.

На фиг. 6 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения К,Кмонатина по этому изобретению. В этом примере процесс включает повторное использование Ьаминокислоты, образующейся в реакции образования индол-3-пирувата, с Ό-аминокислотой, используемой в качестве вещества, реагирующего с К-МР, в реакции образования К,К-монатина посредством серии реакций превращения. В конкретном примере, представленном на фиг. 6, Ь-триптофан подвергают обратимой реакции с Ь-аминотрансферазой и оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Ьаспартата. Индол-3-пируват обратимо реагирует с пируватом и К-специфичной альдолазой, и он превращается в К-а-кетокислоту монатина (К-МР), и К-МР подвергают обратимой реакции с Όаминотрансферазой и Ό-аланином с образованием К,К-монатина и пирувата. Ь-аспартат превращают в Ьаланин и СО₂ с использованием аспартат-4-декарбоксилазы. Ь-аланин превращают в Ό-аланин с помощью аланинрацемазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении.

На фиг. 7 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения К,Кмонатина в соответствии с настоящим изобретением. В этом примере процесс включает смещение в прямом направлении реакции Ь-триптофана (т.е. направление реакции на образование индол-3-пирувата) посредством превращения побочного продукта реакции, представляющего собой Ь-аминокислоту, в другой продукт. В этом примере побочный продукт, представляющий собой Ь-аминокислоту Ь-аспартат, превращают в Ь-аланин в необратимой реакции с использованием декарбоксилазы. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 7, Ь-триптофан обратимо реагирует с Ь-аминотрансферазой и с а-кетоглутаратом (а-КО) или оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата (если используют а-КО) или Ь-аспартата (если используют оксалоацетат). Индол-3-пируват обратимо реагирует с пируватом и К-специфичной альдолазой, и он превращается в К-а-кетокислоту монатин (К-МР). К-МР подвергают обратимой реакции с Ό-аминотрансферазой и Ό-аминокислотой с образованием К,Кмонатина и любого из оксалоацетата, пирувата или а-КО. Ь-глутамат или Ь-аспартат, который является продуктом реакции Ь-аминотрансферазы, превращают либо в 4-аминобутаноат и СО₂ (если субстратом является Ь-глутамат) или в β-аланин и СО₂ (если субстратом является Ь-аспартат) с использованием глутаминовой кислоты или аспартатдекарбоксилазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, показанные как обратимые, протекали в обратном направлении.

На фиг. 8 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения К,Кмонатина в соответствии с настоящим изобретением. В этом примере процесс включает повторное использование побочного продукта, представляющего собой аминокислоту, реакции Ь-триптофана с реактантом, представляющим собой аминокислоту, реакции К-МР, через серию реакций превращения. В конкретном примере, представленном на фиг. 8, Ь-триптофан подвергают обратимой реакции с Ьаминотрансферазой и с а-кетоглутаратом (а-КО) с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата. Индол-3-пируват подвергают обратимой реакции с пируватом и К-специфичной альдолазой, и он превращается в К-а-кетокислоту монатина (К-МР). К-МР подвергают обратимой реакции с Όаминотрансферазой и Ό-аланином с образованием К,К-монатина и пирувата. Ь-аланинаминотрансферазу и пируват используют для обратимого превращения Ь-глутамата, который является побочным продуктом реакции Ь-аминотрансферазы, обратно в а-КО, с Ь-аланином в качестве образующегося совместно с ним продукта. Аланинрацемаза обратимо превращает Ь-аланин в Ό-аланин, который пригоден в третьей ре- 6 029538 акции, реакции Ό-аминотрансферазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении.

На фиг. 9 представлена блок-схема компьютерной системы.

На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями из базы данных в целях определения гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных.

На фиг. 11 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса в компьютере для определения наличия гомологии двух последовательностей.

На фиг. 12 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления работы идентификатора 300 в целях детекции наличия в последовательности характерного элемента.

На фиг. 13 и 14 вместе проиллюстрированы виды активности 58 различных альдолаз (каждая из которых идентифицирована ее определенным номером δΕΟ ΙΌ) при образовании предшественника монатина (МР), как измеряют посредством ЬС/Μδ/Μδ.

На фиг. 15 проиллюстрирован эффект дитиотреитола на продукцию монатина посредством полипептида с активностью альдолазы δΕΟ ΙΌ N0: 88.

Одинаковыми указывающими символами на различных чертежах показаны одинаковые элементы.

Подробное описание

Сокращения и термины.

Следующие ниже разъяснения терминов и способов представлены для лучшего описания настоящего описания и для того, чтобы специалисты в данной области руководствовались ими при осуществлении на практике настоящего описания. Как используют в настоящем документе, включающий означает содержащий. Кроме того, формы единственного числа включают множественные упоминаемые объекты, если контекст явно не указывает на иное. Например, указание на содержащий белок включает один или множество таких белков, и указание на содержащий клетку включает указание на одну или несколько клеток и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д. Термин приблизительно включает диапазон экспериментальных ошибок, которые встречаются при любом измерении. Если нет иных указаний, все измеренные значения предполагают наличие слова приблизительно перед ними, даже если слово приблизительно прямо не используется.

Консервативная замена: замена одной аминокислоты другой аминокислотой в полипептиде, при этом замена незначительно влияет на активность полипептида или не влияет на нее. Замену считают консервативной независимо от наличия структурного или функционального сходства заменяемых аминокислот. Например, в идеальном случае полипептид триптофанаминотрансферазы, включающий одну или несколько консервативных замен, сохраняет активность триптофанаминотрансферазы. Полипептид, содержащий одну или несколько консервативных замен, можно получать манипулированием с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид, с использованием, например, стандартных способов, таких как сайт-направленный мутагенез или ПЦР, или других способов, известных в данной области.

Неограничивающие примеры аминокислот, которые могут замещать исходную аминокислоту в белке и которые можно считать консервативными заменами в случае небольшого влияния или его отсутствия, на активность полипептида, включают: А1а, замещенный посредством кег или !Н; агд, замещенный посредством д1п, Нк или 1уь; аки, замещенный посредством д1и, д1п, 1ук, Нк, акр; акр, замещенный посредством аки, д1и или д1и; сук, замещенный посредством кег или а1а; д1и, замещенный посредством акп, д1и, 1ук, Ык, акр или агд; д1и, замещенный посредством аки, д1и, 1ук или акр; д1у, замещенный посредством рго; Нк, замещенный посредством аки, 1ук, д1и, агд, !уг; Не, замещенный посредством 1еи, те!, уа1, рйе; 1еи, замещенный посредством Не, те!, уа1, рйе; 1ук, замещенный посредством аки, д1и, д1и, Нк, агд; те!, замещенный посредством Не, 1еи, уа1, рйе; рйе, замещенный посредством !гр, !уг, те!, Не или 1еи; кег, замещенный посредством !йг, а1а; !йг, замещенный посредством кег или а1а; !гр, замещенный посредством рйе, !уг; !уг, замещенный посредством Нк, рйе или !гр; и уа1, замещенный посредством те!, Не, 1еи.

Дополнительная информация в отношении консервативных замен может быть найдена, помимо прочих источников, в Веи-Вакка! е! а1. (1. Вас!етю1. 169:751-7, 1987), О'Кедаи е! а1. (Оеие 77:237-51, 1989), ЗаНи-То1й е! а1. (Рто!ет δα. 3:240-7, 1994), Носйий е! а1. (Вю/Тесйио1оду 6:1321-5, 1988), АО 00/67796 (Ситб е! а1.) и в стандартных руководствах по генетике и молекулярной биологии.

Полученный: для целей описания и формулы изобретения, вещество является полученным из организма или источника, если одно или несколько из указанных ниже утверждений является истинным: 1) вещество находится в организме/источнике; 2) вещество удалено из нативного хозяина; или 3) вещество удалено из нативного хозяина и преобразовано, например, посредством мутагенеза.

Выделенный: как используют в настоящем документе, термин выделенный относится к любому веществу, извлеченному из его нативного хозяина; вещество не должно быть очищенным. Например, выделенная нуклеиновая кислота относится к встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, которая не является непосредственно соседней с обеими последовательностями, с которыми она является непосредственно соседней (одна с 5'-конца и одна с 3'-конца) в встречающемся в природе геноме организма,

- 7 029538 из которого она получена. Например, выделенная нуклеиновая кислота может представлять собой, но не ограничиваться этим, рекомбинантную молекулу ДНК любой длины, если одна из встречающихся в норме последовательностей нуклеиновых кислот, непосредственно фланкирующих эту рекомбинантную молекулу ДНК во встречающемся в природе геноме, удалена или отсутствует. Таким образом, выделенная нуклеиновая кислота включает, но не ограничивается этим, рекомбинантную ДНК, которая существует в качестве отдельной молекулы (такой как кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный посредством ПЦР или обработки эндонуклеазой рестрикции), независимо от других последовательностей, а также рекомбинантную ДНК, которая встроена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (такой как ретровирус, аденовирус или вирус герпеса) или в геномную ДНК прокариотического или эукариотического организма. Кроме того, выделенная нуклеиновая кислота может включать рекомбинантную молекулу ДНК, которая является частью гибридной или слитой последовательности нуклеиновой кислоты.

Как используют в настоящем документе, термин выделенный означает, что материал (такой как белок или нуклеиновая кислота по этому изобретению) удален из его естественного окружения (например, из природного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, находящийся в живом животном, не является выделенным, однако тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех веществ, находящихся вместе с ним в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут являться частью вектора, и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут являться частью композиции и, тем не менее, быть выделенными, поскольку такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения.

Термин выделенный, как используют в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты, также включает любую, не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, поскольку последовательности не встречающихся в природе нуклеиновых кислот не встречаются в природе и не обладают непосредственно смежными с ними последовательностями во встречающемся в природе геноме. Например, не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, такую как сконструированная нуклеиновая кислота, считают выделенной нуклеиновой кислотой. Сконструированную нуклеиновую кислоту можно получать с использованием обычных способов молекулярного клонирования или химического синтеза нуклеиновых кислот. Выделенная не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота может быть независима от других последовательностей, или она может быть встроена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (такой как ретровирус, аденовирус или вирус герпеса) или геномную ДНК прокариотического или эукариотического организма. Кроме того, не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота может включать молекулу нуклеиновой кислоты, которая является частью гибридной или слитой последовательности нуклеиновой кислоты.

Очищенный: как используют в настоящем документе, термин очищенный не подразумевает абсолютной чистоты; скорее, он подразумевает относительное определение. Таким образом, например, очищенный препарат полипептида или нуклеиновой кислоты может представлять собой препарат, в котором представляющий интерес полипептид или нуклеиновая кислота находятся в более высокой концентрации, чем концентрация полипептида или нуклеиновой кислоты в их природном окружении в организме, или в более высокой концентрации, чем в окружении, из которого они были извлечены.

Отдельные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, обычно очищают до электрофоретической гомогенности.

Последовательности, полученные из таких клонов, не могут быть получены непосредственно либо из библиотеки, либо из тотальной ДНК человека. Очищенные нуклеиновые кислоты по этому изобретению являются очищенными от остальной геномной ДНК в организме по меньшей мере в 10⁴-10⁶ раз. В некоторых вариантах осуществления термин очищенный включает нуклеиновые кислоты, которые очищены от остальной геномной ДНК или от других последовательностей в библиотеке или других окружающих веществ по меньшей мере на один порядок величины, например в некоторых вариантах осуществления на два или три порядка или на четыре или пять порядков величины.

Аминокислота: как используют в настоящем документе, термины аминокислота или аминокислотная последовательность относятся к олигопептидной, пептидной, полипептидной или белковой последовательности или к фрагменту, участку или субъединице любой из них и к встречающимся в природе или синтетическим молекулам. Термины аминокислота или аминокислотная последовательность включают олигопептидную, пептидную, полипептидную или белковую последовательность или фрагмент, участок или субъединицу любой из них и встречающиеся в природе или синтетические молекулы. Как используют в настоящем документе, термин полипептид относится к аминокислотам, соединенным друг с другом пептидными связями или модифицированным пептидными связями, т.е. к изостерическим пептидам, и он может содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы посредством любого природного процесса, такого как посттрансляционный процессинг, или способами химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Модификации можно проводить в любом участке полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и Ν- или С-концы. Следует понимать, что указанный тип модификации может быть представлен в одинаковой или в различной степени в нескольких уча- 8 029538 стках данного полипептида. Также данный полипептид может обладать множеством типов модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ΟΡΙ-якоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в белок, такую как аргинилирование (см. СгсфШоп. Т.Е., РгоЮйъ - §1гис1иге аиЕ Мо1еси1аг РгорегИек 2иЕ ЕЕ., ν.Η. Ргеетаи аиЕ Сотрапу, Ыете Уогк (1993); Ро811гаи81а1юиа1 Соуа1еи1 МоЕШсаНои οί Рго1е1и8, В.С. 1оЬи8ои, ЕЕ., АсаЕетк Ргекк, Ыете Уогк, рр. 1-12 (1983). Пептиды и полипептиды по этому изобретению также включают все формы миметиков и пептидомиметиков, как более подробно описано ниже.

Полипептид, обладающий активностью альдолазы: под полипептидом, обладающим активностью альдолазы подразумевают полипептид, который либо самостоятельно, либо совместно с одним или нескольким дополнительными полипептидами (обладающими такой же или отличающейся последовательностью) представляет собой белок с ферментативной активностью альдолазы.

Рекомбинантный: рекомбинантные полипептиды или белки относятся к полипептидам или белкам, получаемым с помощью технологий рекомбинантных ДНК; т. е. получаемым из клеток, трансформированных конструкцией с экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид или белок. Синтетические полипептиды или белок представляют собой полипептиды и белок, полученные химическим синтезом. Также для синтеза полипептида или фрагментов по этому изобретению можно использовать твердофазные способы химического синтеза. Такой способ известен в данной области с ранних 1960-х гг. (Мегпйе1Е Р.В., 1. Ат. СЬет. 8ос, 85:2149-2154, 1963) (см. также 81е\\'аг1 1.М. аиЕ Уоиид Ι.Ό., 8оНЕ РЬаке РербЕе §уи1Ьек1к, 2иЕ ЕЕ., Р1егсе СЬетка1 Со., РоскГогЕ, Ι11., рр.11-12)) и его ранее применяли в коммерчески доступных лабораторных наборах для конструирования и синтеза пептидов (СатЪпЕде РекеагсЬ ВюсЬетка1к). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, использовались идеи Н.М. Оеукеи е! а1., Ргос. №·ιΐ1. АсаЕ. δοΐ, И8А, 81:3998 (1984), и они осуществляют синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых прикреплены к одному планшету.

По существу, идентичный: выражение по существу, идентичный, в отношении двух нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям, например по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью нуклеотидных или аминокислотных остатков (последовательностей) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как определяют с использованием одного из известных алгоритмов сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В других вариантах осуществления существенная идентичность существует на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 100 или более остатков, и наиболее часто последовательности являются, по существу, идентичными на протяжении по меньшей мере от 150 до 200 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления последовательности являются, по существу. идентичными на протяжении всей длины кодирующих областей.

Кроме того, по существу, идентичная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от эталонной последовательности на одну или несколько консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, делеций или вставок. В некоторых вариантах осуществления замена происходит в участке, который не является активным центром молекулы, или альтернативно замена происходит в участке, представляющем собой активный центр молекулы, при условии, что полипептид в основном сохраняет его функциональные (ферментативные) свойства. Консервативная аминокислотная замена, например, приводит к замене одной аминокислоты другой аминокислотой из того же класса (такой как замена одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой аминокислотой, или замена одной полярной аминокислоты другой аминокислотой, такая как замена аргинина лизином, глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой или глутамина аспарагином). Одна или несколько аминокислот могут быть удалены, например, из полипептида альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, что приводит к модификации структуры полипептида без существенного изменения его биологической активности. Например, могут быть удалены Ν- или С-концевые аминокислоты, которые не являются необходимыми для биологической активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Модифицированные полипептидные последовательности по этому изобретению можно оценивать в отношении биологической активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, множеством способов, включая контактирование модифицированной полипептидной последовательности с субстратом и определение наличия снижения посредством модифициро- 9 029538 ванного полипептида количества специфичного субстрата в анализе или повышения биологических продуктов ферментативной реакции функциональной альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как полипептид альдолаза НМО и/или КНО, с субстратом.

Фрагмент: фрагмент, как используют в настоящем документе в отношении белка или полипептида или нуклеиновой кислоты, представляет собой часть белка, полипептида или нуклеиновой кислоты соответственно. Фрагменты могут обладать такой же или. по существу, такой же последовательностью аминокислот или нуклеиновых кислот, что и более длинная последовательность белка, полипептида или нуклеиновой кислоты, из которой образован фрагмент. Также включаются фрагменты, которые обладают отличающимися трехмерными структурами по сравнению с трехмерными структурами более длинного белка, полипептида или нуклеиновой кислоты. Примером этого является молекула проформы, такая как пробелок с низкой активностью, который можно модифицировать расщеплением с образованием зрелого фермента со значительно более высокой активностью. Фрагмент белка или полипептида может представлять собой ферментативно активную часть белка или полипептида.

Стереоинвертирующая аминотрансфераза: стереоинвертирующая аминотрансфераза представляет собой полипептид, способный предпочтительно или селективно продуцировать хиральный аминокислотный продукт (такой как монатин), при применении субстрата с противоположной хиральностью в качестве донора амино. Например, стереоинвертирующая аминотрансфераза может представлять собой Ό-фенилглицинаминотрансферазу (также называемую Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазой), которая предпочтительно или селективно использует Ь-глутамат в качестве субстрата с образованием Κ,Κ-монатина. Неограничивающие примеры стереоинвертирующих аминотрансфераз включают Όметионинаминотрансферазу (ЕС 2.6.1.41) и ферменты, обладающие активностью Ό-фенилглицинаминотрансферазы или активностью Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазы.

Нуклеиновые кислоты, зонды и ингибиторные молекулы.

Термин мутагенез с насыщением, или мутагенез с насыщением сайта гена, или О88М, включает способ, в котором используются вырожденные олигонуклеотидные праймеры для внесения в полинуклеотид точечных мутаций, как подробно описано ниже. Термин оптимизированная система направленных изменений или оптимизированные направленные изменения включает способ повторной сборки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновых кислот, например, родственных генов, и подробно пояснен ниже. Термин синтетическая пересборка лигированием или §ЬК включает способ лигирования фрагментов олигонуклеотидов неслучайным образом и подробно объяснен ниже. Термин вариант относится к полинуклеотидам или полипептидам по этому изобретению, модифицированным по одной или нескольким парам оснований, кодонам, интронам, экзонам или аминокислотным остаткам (соответственно), которые, тем не менее, сохраняют биологическую активность альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению. Варианты можно получать любым количеством способов, включая способы, например, такие как ПЦР с пониженной точностью, перетасовка, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциальномножественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, пересборка гена, О88М и любое их сочетание.

Нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно получать, выделять и/или подвергать манипулированию, например, клонированием и экспрессией библиотек кДНК, амплификацией транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и т.п. Например, последовательности по этому изобретению изначально были получены из источников окружающей среды.

При применении на практике способов по этому изобретению гомологичные гены можно модифицировать посредством манипулирования с матричной нуклеиновой кислотой, как описано в настоящем документе.

Как используют в настоящем документе, выражения нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из них, к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую (комплементарную) цепь, к пептидной нуклеиновой кислоте (ΡΝΑ), или любому ДНК-подобному или РНК-подобному соединению природного или синтетического происхождения. Выражения нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты включают олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, ίΚΝΑ) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь, пептидную нуклеиновую кислоту (ΡΝΑ), или любое ДНК-подобное или РНК-подобное соединение природного или синтетического происхождения, включая, например, ίΚΝΑ, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные ίΚΝΑ, например ίΚΝΡ). Термин включает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также включает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими остовами, см., например, Ма!а (1997) Τοχίοοί. Αρρί. РЬагтасо1. 144:189-197; §1гаи88-8оикир (1997) Вюсйет181ту 36:8692-8698; §ат81ад (1996) ЛШ18еп8е №с1ею ЛсИ Эгид Эеу 6:153-156. Олигонук- 10 029538 леотид включает либо одноцепочечный полидезоксинуклеотид, либо две комплементарные полидезоксинуклеотидные цепи, которые могут быть химически синтезированными. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5'-фосфата и, таким образом, не легируются с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата в виде АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид может быть лигирован с фрагментом, который не является дефосфорилированным.

Кодирующая последовательность или нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, когда она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Термин ген означает сегмент ДНК, вовлеченный в продукцию полипептидной цепи; он включает участки, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидерная последовательность и хвост), а также, когда они существуют, встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). Промоторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если РНК-полимераза, которая инициирует транскрипцию в промоторе, будет транскрибировать кодирующую последовательность в мРНК. Как используют в настоящем документе, термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновых кислот (например, ДНК). Он может относиться к функциональной взаимосвязи регулирующей транскрипцию последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота по этому изобретению, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой экспрессирующей системе. Как правило, регулирующие транскрипцию промоторные последовательности, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т. е. они являются цис-регуляторными. Однако некоторые регулирующие транскрипцию последовательности, такие как энхансеры, не требуют физического примыкания или локализации, близкой к кодирующим последовательностям, транскрипцию которых они усиливают.

Как используется в настоящем документе, термин экспрессирующая кассета относится к нуклеотидной последовательности, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т.е. последовательности, кодирующей белок, такой как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО по этому изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью и необязательно с другими последовательностями, такими как сигналы терминации транскрипции. Также можно использовать дополнительные факторы, например энхансеры, α-факторы, необходимые для осуществления экспрессии или способствующие ей. Таким образом, экспрессирующие кассеты также включают плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любые формы вектора с рекомбинантной голой ДНК и т.п. Вектор содержит нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Следует понимать, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются ими, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), к которым фрагменты ДНК могут быть присоединены и могут становиться реплицирующимися. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см. патент США № 5217879) и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. В случае, когда рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описаны как содержащие экспрессирующий вектор, то он включает как экстрахромосомную кольцевую и линейную ДНК, так и ДНК, которая встраивается в хромосому(ы) хозяина. В случае, когда вектор поддерживается клеткой-хозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза в качестве автономной структуры, либо он является встроенным в геном хозяина.

Как используют в настоящем документе, термин рекомбинантный включает нуклеиновую кислоту, которая является смежной с остовом нуклеиновой кислоты, с которой она не является смежной в природном окружении. В некоторых вариантах осуществления для того, чтобы являться обогащенными, нуклеиновые кислоты должны быть представлены на 5% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности молекул нуклеиновых кислот остова. Молекулы остова в соответствии с этим изобретением включают нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие векторы, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, встраивающиеся нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для хранения интересующей вставки нуклеиновой кислоты или манипулирования с ней. Как правило, обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 15% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остова. Более конкретно, обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 50% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остова. Обогащенные нуклеиновые ки- 11 029538 слоты представлены на 90% или от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остовов.

Таким образом, как используют в настоящем документе, термин полинуклеотид, кодирующий полипептид относится к полинуклеотиду, который включает кодирующую полипептид последовательность, а также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.

Как используют в настоящем документе, молчащие изменения включают, например, изменения, которые не изменяют аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом.

Такие изменения могут быть желательными для повышения уровня полипептида, продуцируемого клетками-хозяевами, содержащими вектор, кодирующий полипептид, посредством внесения кодонов или кодоновых пар, которые часто встречаются в организме хозяина.

Основные способы.

Нуклеиновые кислоты, используемые для применения на практике этого изобретения, любые из РНК, κίΡΝΆ, тЖНА, антисмысловой нуклеиновой кислоты, кДНК, геномной ДНК, векторов, вирусов или их гибридов, можно выделять из множества источников, получать способами генетической инженерии, амплифицировать и/или экспрессировать/получать рекомбинантными способами. Рекомбинантные полипептиды (такие как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолазы НМО и/или КНО), полученные из этих нуклеиновых кислот, можно отдельно выделять или клонировать, и их можно исследовать в отношении требуемой активности. Можно использовать любую рекомбинантную экспрессирующую систему, включая экспрессирующие системы клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.

Альтернативно эти нуклеиновые кислоты можно синтезировать ίη νίίτο хорошо известными способами химического синтеза, как описано, например, в АПатк (1983) ί. Ат. СЬет. 8ос. 105:661; Βοϊοιικον (1997) Ыис1ею АсМк Рек. 25:3440-3444; Ргепке1 (1995) Ртее РаПю. ΒίοΙ. МеП. 19:373-380; В1оттет8 (1994) ВюсЬетЦйу 33:7886-7896; Ыагапд (1979) Ме1Ь. Εηζутο1. 68:90; Βτο^η (1979) Ме1Ь. Εηζутο1. 68:109; Веаисаде (1981) Тегга. Ьей. 22:1859; в патенте США № 4458066.

Способы манипулирования с нуклеиновыми кислотами, например, такие как субклонирование, мечение зондом (например, мечение со случайными праймерами с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п., полностью описаны в научной и патентной литературе, см. δηιη6ΐΌο1<. еП., МОЕЕСиЬАР СЬ-ΟΝΙΝΟ: А ЬАВОРАТОРУ МАЫиАЬ (2ΝΏ ΕΌ.), νοίκ. 1-3, ОДП 8рпиу НаЛют ^аЬο^аίο^у, (1989); СИРРЕЭТ РРОТОСОЬ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАР ВЮЬΟΟΥ, АикиЬе1, еП. .Ιοίιιι \1еу & 8οηκ, 1пс., Хеи ΥοΑ (1997); ЬАВОРАТОРУ ТКС11Х1ОЕК8 ΙΝ В1ОСНЕМ18ТРУ АХО МОЕЕСиЬАР ВЮЬООУ: 11УВНП)1/АТ1ОХ \1ТН ХЕСЕЕ1С АСГО РРОВЕ8, Рай I. Ή^οη- ;шП ШсШс асМ Р^еρа^айοη, Тукке^ еП. Е18е\зег Ν.Υ. (1993).

Другими пригодными способами получения нуклеиновых кислот и манипулирования с ними, используемыми для применения на практике способов по этому изобретению, является клонирование из геномных образцов и, если желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по этому изобретению, включают геномные библиотеки или библиотеки кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), см. патенты США №№ 5721118; 6025155; искусственных хромосомах человека, см. ΡοкеηЕе1П (1997) ΝηΙ. Ое^Е 15:333-335; искусственных хромосомах дрожжей (УАС); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р1, см. \οοη (1998) Оеадтюк 50:306-316; векторах на основе Р1 (РАС), см. Кет (1997) ВМесЬтциек 23:120-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах.

Полипептид может быть слитым с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Νконцевые идентификационные пептиды, которые придают требуемые свойства, такие как повышение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды также можно синтезировать и экспрессировать в качестве слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ними, например, для получения более иммуногенного пептида, для упрощения выделения рекомбинантного синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и т.п. Упрощающие определение и очистку домены включают, например, хелатирующие металлы пептиды, такие как полигистидиновые участки и молекулы гистидин-триптофана, которые позволяют очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые позволяют очистку на иммобилизованных иммуноглобулинах, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности РЬАО8 Оттитах бАгр, 8еай1е \А). Добавление расщепляемых линкерных последовательностей, таких как последовательности для фактора Ха или энтерокиназы (Ιηνύτο^η, Саг1кЬаП, СА) между доменом для очистки и пептидом или полипептидом, содержащим мотив, облегчает очистку. Например, экспрессирующий вектор может включать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина с последующим тиоредоксином и участком расщепления энтерокиназой (см., например, \\ПЬатк (1995) ВюсЬетЦйу 34:1787-1797; Όο^1ί (1998) Рго1ет Ехрг. РипЕ 12:404-414). Остатки гистидина упрощают определение и очистку, а участок расщепления энтерокиназой обеспечивает способы очистки эпитопа от остальной части слитого белка. Технология, относящаяся к

- 12 029538 векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, Кго11 (1993) ΌΝΆ Се11. ΒίοΙ., 12:441-53.

Последовательности для контроля транскрипции и трансляции.

Последовательности нуклеиновых кислот (такие как ДНК) могут быть функционально связанными с последовательностью(ями) (например, транскрипционными или трансляционными) для контроля экспрессии, такой как промоторы или энхансеры, для управления синтезом/экспрессией РНК и модулирования их. Последовательность для контроля экспрессии может находиться в экспрессирующем векторе. Иллюстративные бактериальные промоторы включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, §ρΐ, 1атЬйа Р_к, Рь и 1тр. Иллюстративные эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина I.

Как используют в настоящем документе, термин промотор включает все последовательности, способные запускать транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, такой как клетка растения. Таким образом, промоторы, используемые в конструкциях по этому изобретению, включают цисрегуляторные элементы контроля транскрипции и регуляторные последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модулирование времени начала и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-регуляторный элемент контроля транскрипции, включающий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, ориджин репликации, последовательности для встраивания в хромосому, 5'- и З'-нетранслируемые области или последовательности интронов, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти цис-регуляторные последовательности могут взаимодействовать с белками или другими биологическими молекулами для осуществления (запуск/завершение, регуляция, модулирование и т.д.) транскрипции. Конститутивные промоторы представляет собой промоторы, которые осуществляют экспрессию постоянно в большинстве условий окружающей среды и стадий развития или дифференцировки. Индуцибельные или регулируемые промоторы направляют экспрессию нуклеиновой кислоты по этому изобретению под влиянием условий окружающей среды или стадии развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию индуцибельными промоторами, включают анаэробные условия, повышенную температуру, сухость воздуха или наличие света.

Тканеспецифичные промоторы представляет собой элементы контроля транскрипции, которые активны только в конкретных клетках, или тканях, или органах, например в растениях или в животных. Тканеспецифичную регуляции могут обеспечивать определенные внутренние факторы, которые обеспечивают экспрессию генов, кодирующих белки, специфичные для данной ткани. Известно, что такие факторы существуют у млекопитающих и растений, что обеспечивает развитие конкретных тканей.

Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или ίτρ Е. сой, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор ТЗ, промотор Т7, промотор др1, промотор 1атЬйа Р_к, промотор 1атЬйа Рь, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3фосфоглицераткиназа (РСК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промоторы §У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина-Ι. Также можно использовать другие промоторы, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида или его фрагмента в бактериях, включают промоторы 1ас или ίτρ Е. сой, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др1. промотор 1атЬйа Р_к, промотор 1атЬйа Р_ь, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (РСК), и промотор кислой фосфатазы. Промоторы грибов включают промотор α-фактора. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У4 0, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металотионеина-1. Также можно использовать другие промоторы, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.

Тканеспецифичные промоторы растений.

Экспрессирующие кассеты могут экспрессироваться с тканевой специфичностью. Растения или семена способны экспрессировать фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС с тканевой специфичностью. Тканевая специфичность может представлять собой специфичность в отношении семян, специфичность в отношении стебля, специфичность в отношении листьев, специфичность в отношении корней, специфичность в отношении плодов и т. п.

Термин растение включает целые растения, части растений (например, листья, стебли, цветы, корни и т.д.), протопласты растений, семена и клетки растений, и их потомство. Класс растений, как правило, настолько широк, как и класс высших растений, пригодных для технологий трансформации, включая покрытосеменные (однодольные и двудольные растения), а также голосемянные. Они включают растения с различными уровнями плоидности, включая полиплоидное, диплоидное, гаплоидное и гемизиготное состояния. Как используют в настоящем документе, термин трансгенное растение включает растения или клетки растений, в которые встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновые кислоты и различные рекомбинантные конструкции (такие как экспрессирующие кассеты) по этому изобретению.

- 13 029538

Конститутивный промотор, такой как промотор СаМУ 358, можно использовать для экспрессии в конкретных частях растения или в семени или во всем растении. Например, для сверхэкспрессии можно использовать фрагмент промотора растения, который запускает экспрессию нуклеиновой кислоты в некоторых или всех тканях растения, например регенерирующего растения. Такие промоторы относятся в настоящем документе к конститутивным промоторам, и они являются активными в большинстве условий окружающей среды и стадий развития или дифференцировки клетки. Примеры конститутивных промоторов включают участок инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) 358, 1'- или 2'-промотор, полученный из Т-ДНК АдгоЪасЮгшт 1итсГас1СП5. и другие участки инициации транскрипции из различных генов растений, известных специалистам в данной области. Такие гены включают, например, АСТ11 из АгаЫйоркЕ (Ниапд (1996) Р1ап1 Мо1. ΒίοΙ. 33:125-139); Са(3 из АгаЫйорык (ОепВапк № И43147, ΖΗοη§ (1996) Мо1. Оеи. Оепе(. 251:196-203); ген, кодирующий стеароил-ацильный белок-носитель десатуразу из Вгаккюа парик (ОеиЪаик № Х74782, 8о1осотЪе (1994) Р1ап1 РЬукю1 104:11671176); 0Рс1 из маиса (ОепВапк № Х15596; Майте/ (1989) ί. Мо1. Вю1. 208:551-565); Орс2 из маиса (ОепВапк № И4 5855, МанщпаШ (1997) Р1ап( Мо1. Вю1. 33:97-112); промоторы растений, описанные в патентах США №№ 4962028, 5633440.

В этом изобретении используются тканеспецифичные или конститутивные промоторы, полученные из вирусов, которые могут включать, например, субгеномный промотор тобамовируса (Китада1 (1995) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сг И8А 92:1679-1683; промотор палочковидного вируса риса (К.ТВУ), который реплицируется только в клетках флоэмы инфицированных рисовых растений, при этом промотор запускает высокую экспрессию специфичного для флоэмы репортерного гена; промотор вируса мозаики жилок кассавы (СУМУ) с наиболее высокой активностью в сосудистых элементах, в клетках мезофилла листьев и на концах корней (Уегйадиег (1996) Р1ап( Мо1. Вю1. 31:1129-1139).

Промотор растений может направлять экспрессию нуклеиновой кислоты, экспрессирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, в конкретной ткани, органе, типе клеток (т.е. тканеспецифичные промоторы), или, в ином случае, экспрессия может находиться под более точным контролем окружающей среды или стадии развития или под контролем индуцибельного промотора. Примеры окружающих условий, которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, наличие света или опрыскивание химическими реагентами/гормонами. Например, это изобретение относится к промотору маиса, индуцируемому засухой (Викк (1997), выше); промотору картофеля, индуцируемому холодом, засухой и высоким содержанием соли (КисЬ (1997) Р1ап( Мо1. Вю1. 33:897-909).

Тканеспецифичные промоторы могут обеспечивать транскрипцию только в течение определенных временных рамок стадии развития этой ткани. См. ВН/сще/ (1998) Р1ап( Се11 10:791-800, где охарактеризован промотор гена ЬЕАРУ из АгаЫйорык. См. также Сагйоп (1997) Р1ап( ί 12:367-77, где описан транскрипционный фактор 8РЬ3, который распознает консервативную последовательность мотива в промоторной области А. (НаПапа гена идентичности меристемы цветка АР1; и Мапйе1 (1995) Р1ап( Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1.29, рр.995-1004, где описан промотор меристемы е1Р4. Можно использовать тканеспецифичные промоторы, которые активны в течение всего жизненного цикла конкретной ткани. Нуклеиновые кислоты функционально могут быть связаны с промотором, изначально активным только в клетках хлопковых волокон или функционально связаны с промотором, активным, главным образом, на стадиях удлинения клеток хлопковых волокон, например, как описано Втекай (1996), выше. Нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором гена ЕЪ12А для предпочтительной экспрессии в клетках хлопковых волокон (ниже). См. также 1оНп (1997) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сг И8А 89:5769-5773; 1оЬп, е( а1., патенты США №№ 5608148 и 5602321, где описаны промоторы, специфичные для хлопковых волокон, и способы создания трансгенных хлопковых растений.

Также для экспрессии нуклеиновых кислот можно использовать промоторы, специфичные для корней. Примеры промоторов, специфичных для корней, включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (ЭеЫкк (1990) 1п(. Кеу. Су1о1. 123:39-60). Другие промоторы, которые можно использовать для экспрессии нуклеиновых кислот, включают, например, промоторы, специфичные для семяпочки, специфичные для зародыша, специфичные для эндосперма, специфичные для интегумента, специфичные для оболочки семени или некоторые их сочетания; промотор, специфичный для листьев (см. Викк (1997) Р1ап( ί. 11:1285-1295, где описан промотор маиса, специфичный для листьев); промотор ΘΚΕ13 из АдгоЪасЮпит г1и/одепек (который проявляет высокую активность в корнях, см. Напкеп (1997), выше); промотор, специфичный для пыльцы маиса (см. Оиеггего (1990) Мо1. Оеп. Оепе(. 224:161-168); можно использовать промотор томатов, активный в процессе созревания плодов, при старении и опадании листвы и, в меньшей степени, в цветках (см. В1ите (1997) Р1ап( ί. 12:731-746); специфичный для пестика промотор из гена картофеля 8К2 (см. Искег (1997) Р1ап( Мо1. Вю1. 35:425-431); ген В1ес4 из гороха, который активен в эпидермальной ткани вегетативных и цветочных верхушек побегов трансгенной люцерны, что делает его ценным инструментом для направления экспрессии чужеродных генов в эпидермальный слой активно растущих побегов или волокон; ген, специфичный для семяпочки ВЕЬ1 (см. ВеЕег (1995) Се11 83:735742, ОепВапк № И39944); и/или промотор в К1ее, патент США № 5589583, где описан участок промотора растений, способный обеспечивать высокий уровень транскрипции в ткани меристемы и/или в быстро

- 14 029538 делящихся клетках.

Для экспрессии нуклеиновых кислот используют также промоторы растений, которые индуцируются под воздействием гормонов растений, таких как ауксины. Например, можно использовать отвечающие на ауксин элементы фрагмента промотора Е1 (АихКЕк) в сое (С1усше тах Ь.) (Ьш (1997) Р1аи1 РЬукю1. 115:397-407); отвечающий на ауксин промотор С8Т6 АтаЬШорк1К (также отвечающий на салициловую кислоту и пероксид водорода) (СЬеп (1996) Р1аи1 1. 10:955-966); индуцируемый ауксином промотор рагС из табака (8ака1 (1996) 37:906-913); отвечающий на биотин элемент растений (81гек (1997) Мо1. Р1аи1 ΜίетоЬе 1и1егас1. 10:933-937); и промотор, отвечающий на гормон стресса, абсцизовую кислоту (8Ьееп (1996) 8аепсе 274:1900-1902).

Также нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промоторами растений, которые индуцируются под воздействием химических реагентов, которые могут быть нанесены на растения, таких как гербициды или противомикробные средства. Например, можно использовать промотор маиса 1п2-2, активируемый антидотами гербицидов на основе бензолсульфонамида (Эе УеуШет (1997) Р1ап1 Се11 РЬ.у8ю1. 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов приводит к индукции различных систем экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатоде и в апикальной меристеме побега. Кодирующая последовательность может находиться по контролем, например, индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы из Ауепа кайуа Ь. (овес) (Макдгаи (1997) Р1ап1 1. 11:465-473); или элемент, отвечающий на салициловую кислоту (81аиде (1997) Р1ап1 1. 11:1315-1324). Используя химически индуцируемые (например, индуцируемых гормонами или пестицидами) промоторы, т.е. промоторы, отвечающие на химический реагент, который можно наносить на трансгенное растение в поле, экспрессию полипептида можно индуцировать на конкретной стадии развития растения. Итак, трансгенные растения могут содержать индуцибельный ген, кодирующий полипептиды, диапазон растений-хозяев которого ограничивается видами растений-мишеней, такими как кукуруза, рис, ячмень, соя, томат, пшеница, картофель или другие зерновые культуры, индуцируемый на любой стадии развития зерновой культуры.

Специалист в данной области поймет, что тканеспецифичный промотор растений может запускать экспрессию функционально связанной последовательности в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, тканеспецифичный промотор представляет собой промотор, который запускает экспрессию предпочтительно в ткани-мишени или типе клеток-мишеней, но, кроме того, также может приводить к некоторой экспрессии в других тканях.

Также нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промоторами растений, которые индуцируются под воздействием химических реагентов. Эти реагенты включают, например, гербициды, синтетические ауксины или противомикробные средства, которые можно наносить, например, распылять, на трансгенные растения. Индуцируемая экспрессия нуклеиновых кислот, продуцирующих фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, позволит специалисту по выращиванию растений проводить селекцию растений с оптимальной экспрессией и/или активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Таким образом, можно контролировать развитие частей растений и облегчать выращивание растений и частей растений. Например, при использовании промотора маиса 1п2-2, его активируют антидотами гербицидов на основе бензолсульфонамида (Не УеуШет (1997) Р1ап1 Се11 РЬукю1. 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатоде и в апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности могут находиться под контролем индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы из Луепа кайуа Ь. (овес) (Макдгаи (1997) Р1ап1 1. 11:465473); или отвечающего на салициловую кислоту элемента (81апде (1997) Р1ап1 1. 11:1315-1324).

Для надлежащей экспрессии полипептида может быть необходим участок полиаденилирования на 3'-конце кодирующей области. Участок полиаденилирования может быть получен из природного гена, из множества других генов растений (или животных или других генов) или из генов в Т-ДНК агробактерий.

Экспрессирующие векторы и носители для клонирования.

Экспрессирующие векторы и носители для клонирования могут содержать частицы вирусов, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, искусственные бактериальные хромосомы, вирусную ДНК (например, ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц, вируса псевдобешенства и производных 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как ВасШик, АкретдШик и дрожжи). Векторы могут включать хромосомные, нехромосомные последовательности и синтетические последовательности ДНК. Большое количество пригодных векторов известно специалистам в данной области, и они являются коммерчески доступными. Иллюстративные векторы включают бактериальные: векторы рЦЕ™ (Ц1адеп, Уа1епаа, СА), плазмиды рВЬиЕ8СК1РТ™. векторы рНН, векторы 1атЬДа-2АР (81та1адепе, Ьа 1о11а, СА); р!тс99а, рКК223-3, рИК.540, рК1Т2Т (СЕ НеаЪЬсате, РЕсаНтау, N1), векторы рЕТ (Ыоуадеп, МаШкоп, XVI); эукариотические: рХТ1, р8С5 (81та1адепе, Ьа 1о11а, СА), р8УК3, рВРУ, рМ8С, р8УЪ8У4 0 (РЬагтааа). Однако можно ис- 15 029538 пользовать любую другую плазмиду или другой вектор при условии, что они способны реплицироваться и являются устойчивыми в хозяине. Можно использовать векторы с низкой копийностью или с высокой копийностью. Плазмиды могут быть коммерчески доступными, общедоступными без ограничений или их можно конструировать на основе доступных плазмид в соответствии с опубликованными способами. Плазмиды, эквивалентные плазмидам, описанным в настоящем документе, известны в данной области, и они очевидны среднему специалисту в данной области.

Экспрессирующий вектор может содержать промотор, участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации, любые необходимые участки связывания рибосом, участок полиаденилирования, донорные и акцепторные участки сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. Для обеспечения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования ЗУ40.

Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину, для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой, и ген ТКР1 δ. ссгсуыас. Промоторные участки можно выбирать из любых других требуемых генов с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селективными маркерами.

Для повышения уровней экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках содержат энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК длиной, как правило, от приблизительно 10 до приблизительно 300 п.о. Они могут воздействовать на промотор и повышать его транскрипцию. Иллюстративные энхансеры включают энхансер ЗУ40 на поздней стороне ориджина репликации с 100 по 270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.

Последовательность нуклеиновой кислоты можно встраивать в вектор множеством способов. Как правило, последовательность лигируют в требуемом положении в векторе после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно можно лигировать тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество технологий клонирования, например, как описано в Аи8иЬе1 е! а1. Ситтеи! РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду, .Гойи \УПсу & Зоик, 1пс. 1997 и ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А йаЬогаЮгу Маииа1 2иД ЕД., Со1Д Зртшд НагЬог ЬаЬота1огу Рте88 (1989). Такие способы и другие способы находятся в пределах квалификации специалистов в данной области.

Вектор может быть представлен в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные ЗУ40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Множество векторов для клонирования и экспрессирующих векторов для применения в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, ЗатЬгоок.

Конкретные бактериальные векторы, которые можно использовать, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора для клонирования рВК322 (АТСС 37017), рКК223-3 (Рйаттааа Рте Сйетюа18, Ирр8а1а, З^еДеи), ОЕМ1 (Рготеда Вю1ес, МаД15оп, VI, иЗА) рЦЕ70, рЦЕ60, рОЕ-9 (Цхадеи, Уа1еиаа, СА), рО10, р§1Х174 рВЬИЕЗСМРТ II КЗ, р\Н8А, рХН16а, рХН18А, рКН46А (З1та1адеие, Ьа 1о11а, СА), р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, ΌΚ540, рК1Т5 (Рйаттааа), рКК232-8, рЕТ (Коуадеи, МаДЦогт XVI) и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают рЗу2САТ, рОО44, рХТ1, рЗО (З1та1адеие, Ьа 1о11а, СА) рЗУК3, рвРу, рМЗО и рЗУЪ (Рйаттааа). Однако можно использовать любой другой вектор при условии, что он способен реплицироваться и является жизнеспособным в клетке-хозяине.

Нуклеиновые кислоты могут быть экспрессированы в экспрессирующих кассетах, векторах или вирусах и могут быть временно или постоянно экспрессированы в клетках растений и семян. В одной иллюстративной временной экспрессирующей системе используются эписомальные экспрессирующие системы, например вирусная РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), которая образуется в ядре при транскрипции эписомальной мини-хромосомы, содержащей сверхскрученную ДНК, см. Соуеу (1990) Ргос. №11. АсаД. ЗсЕ ИЗА 87:1633-1637. Альтернативно кодирующие последовательности могут встраиваться в геном растительной клетки-хозяина и становиться составляющими частями хромосомной ДНК хозяина. Таким образом, могут экспрессироваться смысловые и антисмысловые транскрипты. Вектор, содержащий последовательности (например, промоторы или кодирующие участки) нуклеиновых кислот, может содержать маркерный ген, который придает селектируемый фенотип клетке растений или семени. Например, маркер может обеспечивать устойчивость к биоциду, в частности устойчивость к антибиотику, такую как устойчивость к канамицину, 0418, блеомицину, гигромицину, или устойчивость к герби- 16 029538 циду, такую как устойчивость к хлорсульфурону или ВаНа.

Экспрессирующие векторы, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты и белки в растениях, хорошо известны в данной области и могут включать, например, векторы из АдгоЬас1егшт δρρ., вируса картофеля X (см., Апде11 (1997) ЕМВО 1. 16:3675-3684), вируса табачной мозаики (см. Сакрег (1996) Оепе 173:69-73), вируса кустистой карликовости томатов (см. НШтап (1989) Уио1оду 169:42-50), вируса гравировки табака (см. Эо1)а (1997) Уио1оду 234:243-252), вируса желтой мозаики фасоли (см. Моппада (1993) М1сгоЫо1 1ттипо1. 37:471-476), вируса мозаики цветной капусты (см. СессЫт (1997) Мо1. Р1ап! МюгоЬе 1п1егас1. 10:1094-1101), перемещающегося элемента маиса Ас/Όδ (см. КиЬш (1997) Мо1. Се11. Вю1. 17:6294-6302; Кип/е (1996) Сигг. Тор. МюгоЬю1. 1ттипо1. 204:161-194) и перемещающегося элемента маиса супрессора-мутатора (8рт) (см. 8сй1арр1 (1996) Р1ап1 Мо1. Вю1. 32:717-725); и их производных. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор может иметь две системы репликации, чтобы иметь возможность поддерживаться в двух организмах, например в клетках млекопитающих или насекомых для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и размножения. Более того, в случае выстраивающихся экспрессирующих векторов, экспрессирующий вектор может содержать по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина. Он может содержать две гомологичных последовательности, которые фланкируют экспрессирующую конструкцию. Встраивающийся вектор можно направлять в конкретный локус в клетке-хозяине, посредством выбора соответствующей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкции выстраивающихся векторов хорошо известны в данной области.

Также экспрессирующие векторы по этому изобретению могут включать ген селективного маркера для обеспечения селекции бактериальных штаммов, в которых произошла трансформация, такой как гены, которые придают бактериям устойчивость к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, неомицин и тетрациклин. Селективные маркеры также могут включать гены, участвующие в биосинтезе, такие как гены, участвующие в каскадах биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе функционально связана с соответствующей последовательностью(ями) контроля экспрессии (промотором) для управления синтезом РНК. Конкретные упомянутые бактериальные промоторы включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, 1атЬйа Р_к, Рь и 1гр. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промоторы 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотеонеина-Ι. Выбор пригодного вектора и промотора находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Также экспрессирующий вектор содержит участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Промоторные участки могут быть выбраны из любого требуемого гена с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селективными маркерами. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных маркеров для придания фенотипических особенностей в целях селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой.

Экспрессирующие векторы млекопитающих также могут содержать ориджин репликации, любой необходимый участок связывания рибосом, участок полиаденилирования, донорный и акцепторный участки сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых вариантах осуществления для обеспечения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.

В целях повышения уровня экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры. Энхансеры представляют собой цисрегуляторные элементы ДНК длиной, как правило, от приблизительно 10 до приблизительно 300 п.о., которые воздействуют на промотор и повышают его транскрипцию. Их примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации с 100 по 270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.

Кроме того, экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину в Е. Сой, и ген ТКР1 8. сегеу181ае.

В нуклеиновая кислота, кодирующая один из полипептидов, может быть соединена в соответствующей рамке считывания с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента. Нуклеиновая кислота может кодировать слитый полипептид, в котором один из полипептидов является слитым с гетерологичными пептидами или полипептидами, такими как Ν-концевые идентификационные пептиды, которые придают требуемые свойства, такие как

- 17 029538 повышенная стабильность или упрощение очистки.

Соответствующая последовательность ДНК может быть встроена в вектор множеством способов. Как правило, последовательность ДНК лигируют в желательном положении в векторе после расщепления вставки и векторе соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно можно лигировать тупые концы вставки и вектора. Множество технологий клонирования описано в АизиЬе1 е! а1. Сиггеп! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду. ίοΐιη \УПеу & 8оиз. 1пс. 1997 и 8атЬгоок е! а1.. Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога1огу Маииа1 2ий Ей.. Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз (1989). Такие способы и другие способы находятся в пределах квалификации специалистов в данной области.

Вектор может быть представлен. например. в форме плазмиды. вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные. нехромосомные и синтетические последовательности ДНК. производные 8У40; бактериальные плазмиды. фаговую ДНК. бакуловирус. плазмиды дрожжей. векторы. полученные из сочетаний плазмидной и фаговой ДНК. вирусную ДНК. такую как ДНК вируса осповакцины. аденовируса. поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Множество векторов для клонирования и экспрессирующих векторов для применения в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны 8атЬгоок. е! а1.. Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога!огу Маииа1 2ий Ей.. Со1й 8ргтд НагЬог. Ν.Υ.. (1989).

Клетки-хозяева и трансформированные клетки.

Также это изобретение относится к трансформированным клеткам. содержащим последовательности нуклеиновой кислоты. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев. известных специалистам в данной области. включая прокариотические клетки. эукариотические клетки. такие как бактериальные клетки. клетки грибов. клетки дрожжей. клетки млекопитающих. клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные бактериальные клетки включают любой вид 8!гер!отусез. 8!арйу1ососсиз. Рзеийотоиаз или ВасШиз. включая Е. сой. ВасШиз зиЬ!Шз. Рзеийотоиаз Пиогезсеиз. ВасШиз сегеиз или 8а1тоие11а 1урЫтигшт. Иллюстративные клетки грибов включают любой вид АзрегдШиз. Иллюстративные клетки дрожжей включают любой вид РюЫа. 8ассйаготусез. 8сЫ/озассНаготусез или 8сЙ№аитотусез. включая РюЫа разЮпз. 8ассйаготусез сегеу1з1ае или 8сЫ/озассНаготусез ротЬе. Иллюстративные клетки насекомых включают любой вид 8ройор!ега или ИгозорЫ1а. включая ИгозорЫ1а 82 и 8ройор!ега 8£9. Иллюстративные клетки животных включают СНО. СО8 или клетки меланомы Во\\ез или любые клеточные линии мыши или человека. Выбор пригодного хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области. Технологии трансформации большого множества видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе. См. \Уе1зЫд (1988) Аии. Кеу. Оеие!. 22:421-477; патент США № 5750870.

Вектор можно вводить в клетку-хозяина с использованием любой из множества технологий. включая трансформацию. трансфекцию. трансдукцию. вирусную инфекцию. генные пушки или Τίопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция. трансфекцию. опосредуемую ИЕАЕ-декстраном. липофекцию или электропорацию (Иау1з. Ь.. ИШиег. М.. Вайеу. Ь. Вазю Ме!йойз ш Мо1еси1аг Вю1оду. (1986)).

Нуклеиновые кислоты или векторы вводят в клетки для скрининга. таким образом. нуклеиновые кислоты вводят в клетки способом. пригодным для последующей экспрессии нуклеиновой кислоты. Способ введения. главным образом. определяется типом клеток-мишеней. Иллюстративные способы включают осаждение с СаРО₄. слияние липосом. липофекцию (например. ЫРОРЕСТШ™). электропорацию. вирусную инфекцию и т. д. Нуклеиновые кислоты-кандидаты могут стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина (например. при ретровирусном введении) или могут существовать либо временно. либо постоянно в цитоплазме (т.е. при использовании традиционных плазмид. с использованием стандартных регуляторных последовательностей. селективных маркеров и т.д.). Поскольку для многих фармацевтически важных скринингов требуются клетки-мишени человека или модельные клетки-мишени млекопитающих. можно использовать ретровирусные векторы. способные трансфицировать такие мишени.

Когда это целесообразно. клетки-хозяева. полученные способами инженерии. можно культивировать на общепринятых питательных средах. модифицированных соответствующим образом для активации промоторов. селекции трансформантов или амплификации генов по этому изобретению. После трансформации пригодного штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток. выбранный промотор можно индуцировать соответствующими способами (например. смена температуры или химическое индуцирование). и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для обеспечения продукции требуемого полипептида или его фрагмента.

Клетки можно собирать центрифугированием. разрушать физическими или химическими способами. и полученный неочищенный экстракт можно сохранять для дальнейшей очистки. Микробные клетки. используемые для экспрессии белков. можно разрушать любым общепринятым способом. включая циклы замораживания и оттаивания. разрушение ультразвуком. механическое разрушение или применение средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент может быть извлечен и очищен из рекомбинантных культур клеток способами. включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом. экстракцию кислотой. анионную или катионную обменную хроматографию. хроматографию с фосфоцеллюлозой. хроматографию гидрофобного взаимодействия. аффинную хроматографию. хроматографию с гидроксилапатитом и хро- 18 029538 матографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида можно использовать стадии повторной сборки. Если необходимо, для конечных стадий очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать традиционным образом для продукции продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в способе продукции, полипептиды, продуцируемые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.

Также для продукции полипептида можно использовать бесклеточные системы трансляции. В бесклеточных системах трансляции могут использоваться мРНК, транскрибируемые с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления перед проведением реакции транскрипции ίη νίίτο конструкцию ДНК можно подвергать линеаризации. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с пригодным бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением требуемого полипептида или его фрагмента.

Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для придания фенотипических особенностей в целях селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. еой.

Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, например нуклеиновые кислоты, можно культивировать в общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой условия, ранее используемые для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и они очевидны среднему специалисту в данной области. Клоны, идентифицированные, как обладающие требуемой ферментативной активностью, затем можно секвенировать для идентификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент с повышенной активностью.

Нуклеиновые кислоты можно экспрессировать или сверхэкспрессировать в любой экспрессирующей системе ίη νίίτο или ίη νίνο. Для экспрессии или сверхэкспрессии рекомбинантного белка можно использовать любые системы клеточных культур, включая бактериальные культуры, культуры насекомых, дрожжей, грибов или млекопитающих. Сверхэкспрессию можно обеспечивать посредством целесообразного выбора промоторов, энхансеров, векторов (например, применение векторов с репликоном, бицистронных векторов (см. СигЩ (1996) Вюейет. Вюрйук. Кек. Соттип. 229:295-8), сред, культур и т.п. В некоторых вариантах осуществления для сверхэкспрессии полипептидов по этому изобретению применяют амплификацию гена с использованием в клеточных системах селективных маркеров, например глутаминсинтетазы (см. ЗапТегк (1987) ^еν. ΒίοΙ. Зίаηа. 66:55-63).

Дополнительные детали, касающиеся этого подхода, находятся в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области. В конкретном неограничивающем примере такая общедоступная литература включает ЕР 0659215 (АО 9403612 А1) (Nеνа1а^ηеη еί а1.); ΕηρίΤοΙ. А., Меейа1у, А., З1юйат, Υ., Ооегехргеккюп апТ к1пд1е-к1ер ρυΓίΓίοηΙίοη οΓ а (НетюкЩЫе ху1апаке Ггот ВаеШик кίеа^οίЬе^тορЬ^1ик Т-6, ί. Βΐοίε,1ηο1. Νον 51:259-64 (1996); ЬШЫ, Е., .Тактам Ν.Β., ВегдсццкЕ Р.Ь., Ху1апаке Ггот (Не ех1гете1у (Негп-юрИНю ЬаЦепит ί'.’;·ι1Το<χ11ιιιη каооЬа^ο1уί^оит: ονе^еxρ^екк^οη οΓ (Не депе ш Εκα1κπο1ιί;·ι οο1ί апТ оΗа^аоίе^^ζаί^οη οΓ (Не депе ρΓοΤυοΙ, Арр1. Етагоп. МюгоЪю1. Зер 56:2677-83 (1990); и Зипд, А.Ь., Ьик, С.К., 2аНаЪ, Ό.Μ., Аакагойик, А., Ооегехргеккюп οΓ (Не ВаоШик киЫШк апТ 040111111^ ху1апакек ш ЕкойепоЫа ,ο1ί, Р^οίе^η Ехрг. РипГ. ίηπ 4:200-6 (1993).

Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. В качестве репрезентативных примеров пригодных хозяев могут быть упомянуты бактериальные клетки, такие как Е. ,ο1ί, δ^ρίοιτ^^^ Βао^11ик киЪ1111к, 1ур1ититшт, и различные виды из рода Ρ^υΤοτο^^ Зί^еρίοтуоек и δίаρЬу1οоοооик, клетки грибов, такие как АкретдШик, дрожжи, такие как любые виды РюЫа, ЗаооΗа^οтуоек, ЗоΗ^ζοкаооΗа^οтуоек δой№аηη^οтуоек, включая РюЫа ракЮпк, ЗаооΗа^οтуоек ое^еν^к^ае или ЗоЫζοкаооΗа^οтуоек ροтЪе, клетки насекомых, такие как Ото^рИЛа З2 и δροаορίе^а ЗГ9, клетки животных, такие как СНО, СОЗ или клетки меланомы Βο\γек и аденовирусы. Выбор пригодного хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области.

Вектор можно вводить в клетки-хозяева с использованием любой из множества технологий, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τίопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ПЕАЕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (ОаоС, Ь., ОШпет, М., Вайеу, I., Вакю МеЛюТк ш ΜοΓ,υητ ВюЫду (1986)).

Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, можно культивировать на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для актива- 19 029538 ции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по этому изобретению. После трансформации пригодного штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток, выбранный промотор можно индуцировать соответствующими способами (такими как смена температуры или химическое индуцирование), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для обеспечения продукции требуемого полипептида или его фрагмента.

Клетки можно собирать центрифугированием, разрушать физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохранять для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушать любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или применение средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент можно извлекать и очищать из рекомбинантных культур клеток способами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида можно использовать стадии повторной сборки. Если необходимо, для конечных стадий очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Также для экспрессии рекомбинантного белка можно использовать различные системы клеточных культур млекопитающих.

Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны СО87 (описанные С1и/тап. Се11, 23:175, 1981) и другие клеточные линии, способные экспрессировать белки совместимого вектора, такие как клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК.

Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать традиционным образом. В зависимости от хозяина, используемого в способе продукции, полипептиды, продуцируемые клеткой-хозяином, содержащей вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.

Итак, для получения полипептидов можно использовать системы бесклеточной трансляции с использованием мРНК, транскрибируемых с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. Перед проведением реакции транскрипции ίη νίίΓΟ конструкцию ДНК можно подвергать линеаризации. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением требуемого полипептида или его фрагмента.

Амплификация нуклеиновых кислот.

Для применения на практике нуклеиновые кислоты можно воспроизводить посредством амплификации, такой как ПЦР. Также амплификацию можно использовать для клонирования или модификации нуклеиновых кислот. Специалист в данной области может разработать последовательности пары праймеров для амплификации для любой части или для полной длины последовательностей.

Пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например из библиотеки генов, такой как библиотека окружающей среды.

Реакции амплификации также можно использовать для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (например, количества транскрипта в клеточном образце), внесения метки в нуклеиновую кислоту (например, для нанесения ее на матрицы или блот), выявления нуклеиновой кислоты или определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. Возможна амплификация транскрипта, выделенного из клетки или библиотеки кДНК.

Специалист в данной области может выбрать и разработать пригодные олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (см. РСК РКОТОСОЬЗ, А ОИГОЕ ТО ΜΕΤΗΟΌδ ΑΝΏ АРРЬ1САТ1О№, ей. Ιηηίδ, Асайетю Рге88, Ν.Υ. (1990) и РСК 8ТКАТЕО1Е8 (1995), ей. Ιηηίδ, Асайетю Рге88, 1пс., Ν.Υ.), лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (см. Аи (1989) Оепотю8 4:560; Ьапйедгеп (1988) δαепсе 241:1077; Ватпдег (1990) Сепе 89:117); транскрипционную амплификацию (см. Κ\\ό1ι (1989) Ргос. №И. Асай. δα. И8А 86:1173) и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (см. ОиакеШ (1990) Ргос. Ν;·ι11. Асай. δα. и$А 87:1874); амплификацию с репликазой О Века (см. διηίΐΐι (1997) 1. С1ш. МюгоЪю1. 35:1477-1491), автоматизированный анализ амплификацией с репликазой О-Ьека (см. Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЪез 10:257-271) и другие технологии, опосредуемые РНК-полимеразой (например, NΑδВΑ, Сапдепе, М188188аида, Опкапо); см. также Вегдег (1987) Мейюйз Еп/уто1. 152:307-316; Аи8иЪе1 ек а1. Сиггепк РгоЮсоЕ т Мо1еси1аг Вю1оду, 1оНп Айеу & δоη8, 1пс. 1997 и δатЪ^оок ек а1., Мо1еси1аг С1оптд: А ЬаЪогакогу Мапиа1 2пй Ей., Со1й δρπι^ НагЪог ЬаЪогакогу Рге88 (1989), патенты США №№ 4683195 и 4683202; δоокηаηаη (1995) ВюкесЬпо1оду 13:563-564.

Определение степени идентичности последовательностей.

Идентичность (гомологию) последовательностей и/или нуклеиновых кислот можно оценивать с использованием любого алгоритма сравнения последовательностей и программы, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают, но не ограничиваются ими, ΤВ^ΑδΤN, В^ΑδΤР, ΡΑδ- 20 029538

ΤΑ, ТРАЗТА и (ΤΡΑΊΆΙΑν (см. Реагкоп апй Ыртап, Ргос. Иа!1. Асай. 8οΐ. ИЗА 85(8):2444-2448, 1988; А1!ксйи1 е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ. 215 (3) : 403-410, 1990; Тйотркоп е! а1., ИисЫс Ас1й Кек. 22 (2):4673-4680, 1994; ШддФк е! а1., Ме!йойк Епгуто1. 266:383-402, 1996; А1йсЬи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215 (3) :403-410, 1990; А1!ксйи1 е! а1., Иа!иге Оепейск 3:266-272, 1993).

Ее можно определять с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, Зесщепсе Апа1ук1к Зойтаге Раскаде, Оепейск Сотри!ег Отоир, Итуеткйу, ^ксопкш Вю!есйпо1оду Сеп!ег, 1710 Ишуегкйу Ауепие. Майкоп, XVI 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным делециям, заменам и другим модификациям. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают определенным процентным количеством аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые оказываются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области, как определяют с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или выравниванием вручную и визуальным исследованием. В некоторых вариантах осуществления для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают анализируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей анализируемую и эталонную последовательности вносят в компьютер, обозначают координаты подпоследовательностей, если необходимо, и указывают параметры программы алгоритма для последовательностей. Можно использовать параметры по умолчанию или можно указывать альтернативные параметры. Затем на основании параметров программы алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процентную идентичность последовательностей для анализируемой последовательности относительно эталонной последовательности.

Как используют в настоящем документе, окно сравнения относится к сегменту из любого одного из множества смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, как правило, от приблизительно 50 до приблизительно 200, более типично от приблизительно 100 до приблизительно 150, в которых последовательность может быть сравнена с эталонной последовательностью с таким же числом смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, посредством алгоритма локальной гомологии Зтйй & Vа!е^таи, Айу. Арр1. Ма!й. 2:482, 1981, посредством алгоритма выравнивания по гомологии Иеей1етап & Χνιιι^ΐτ 1. Мо1. Вю1 48:443, 1970, посредством поиска сходства способом Регкоп & Ыртап, Ргос. Иа!'1. Асай. Зсй ИЗА 85:2444, 1988, посредством компьютеризованного использования этих алгоритмов (ОАР, ВЕЗТР1Т, РАЗТА и ТРАЗТА в Χν^^ιικο! Оепейск Зойтаге Раскаде, Оепейск Сотри!ег Огоир, 575 Заепсе Ότ., Майкоп, VI) или посредством выравнивания вручную и визуального исследования. Другие алгоритмы для определения гомологии или идентичности включают, например, помимо программы ВЬАЗТ (Вакю Ьоса1 Айдптеп! Зеагсй Тоо1 в Ыайопа1 Сеп!ег йог Вю1одюа1 1пйотта!юп), АЫОК АМАЗ (Апа1ук1к ой Ми1йр1у Айдпей Зециепсе), АМРЗ (Рто!еш Ми1йр1е Зесщепсе Айдптеп!), АЗЗЕТ (Айдпей Зедтеп! З!айкйса1 Еуа1иайоп Тоо1), ВАИБЗ, ВЕЗТЗСОК, В1ОЗСАИ (В1о1одйса1 Зесщепсе Сотрагайуе Апа1ук1к Иойе), ВЫМРЗ (ВЬоскк 1МРгоуей Зеатсйет), РАЗТА, 1п!етуа1к & Рош!к, ВМВ, СЬиЗТАЬ V, СЬиЗТАЬ V, СОИЗЕИЗИЗ, ЬСОИЗЕИЗиЗ, VСОNЗЕNЗυЗ, алгоритм ЗшййVа!е^таи, ^ΑКVIN, алгоритм Ьак Vедаκ, РИАТ (Рогсей Иис1еоййе Айдптеп! Тоо1), Ртатеайдп, Ргатекеагсй, ИУИАМЮ, Р1ЬТЕК, РЗАР (Рйк!епкку Зесщепсе Апа1ук1к Раскаде), ОАР (О1ойа1 Айдптеп! Ргодгат), ОЕИАЬ, О1ВВЗ, ОепОиекР 1ЗЗС (ЗепкйКе Зесщепсе Сотрапкоп), ЬАЫОИ (Ьоса1 Зесщепсе Айдптеп!), ЬСР (Ьоса1 Соп!еп! Ргодгат), МΑСΑV (Ми1йр1е Айдптеп! Сопк!гис!юп & Апа1ук1к Vο^кЪеисй), МАР (Ми1йр1е Айдптеп! Ргодгат), МВЬКР, МВЬКИ, Р1МА (Райет-1пйисей МнЮ-кесщепсе Айдптеп!), ЗАОА (Зесщепсе Айдптеп! Ъу Оепейс А1дой!йт) и VНΑΤ-IР. Такие программы для выравнивания также можно использовать для скрининга геномных баз данных в целях идентификации полинуклеотидных последовательностей, обладающих, по существу, идентичными последовательностями. Является доступным ряд геномных баз данных, например, основная часть генома человека доступна в качестве части Проекта секвенирования генома человека (ОйЪЪк, 1995). По меньшей мере двадцать один геном других организмов уже был секвенирован, включая, например, М. деийайит (Ргакег е! а1., Заепсе 270:397-403 (1995)), М. )аппаксйи (Ви1! е! а1., Заепсе 25:1058-73 (1996)), Н. шПиеп/ае (РЫксйтапп е! а1., Заепсе 269:496-512 (1995)), Е. сой (В1а!Шег е! а1., Заепсе 277:1453-74 (1997)) и дрожжи (З. сегеуыае) (Метек е! а1., Иа!иге 387:7-65 (1997)) и Ό. те1аподак!ег (Айатк е! а1., Заепсе 257:2185-95 (2000)). Значительный прогресс также был достигнут в секвенировании геномов модельных организмов, таких как мышь, С. е1едапк и АгаЪайоркю кр. Несколько баз данных, содержащих информацию геномов, аннотированную некоторой функциональной информацией, поддерживаются различными организациями и могут быть доступными через Интернет.

При этом возможно использование алгоритмов ВЬАЗТ и ВЬАЗТ 2.0, которые описаны в А1!ксйи1 е! а1., Иис. Аайк Кек. 25:3389-3402, 1977 и А1!ксйи1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215:403-410, 1990 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов ВЬАЗТ является общедоступным через Иа1юпа1

- 21 029538

СеШег йог Вю!есЬпо1оду ΙηίοηηαΙίοη. Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (Н8Р) посредством идентификации коротких слов с длиной V в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяется как порог значений для соседних слов (А1!8сЬи1 е! а1., выше). Эти изначальные совпадения соседних слов выступают в роли предшественников для начала поиска в целях обнаружения более длинных Н8Р, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может повышаться. Суммарные значения вычисляются с использованием, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда >0). В случае аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного значения используют оценочную матрицу. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливается, если: суммарное значение для выравнивания снижается по величине X ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже, вследствие накопления одного нескольких выровненных остатков с отрицательным значением; или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма ВЬА8Т V, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ΒΕ-Λ8ΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (V) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В случае аминокислотных последовательностей программа ВЬА8ТР использует в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемые значения (Е) 10 и оценочную матрицу ВЬО8иМ62 (см. Негйкой & Немкой, Ргос. №ц1. Асай. δα. И8А 89:10915, 1989) фрагменты для выравнивания (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.

Также алгоритм В^АδΤ осуществляет статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, КагНп & АИзсЬШ, Ргос. №11. Асай. δα. ^А 90:5873, 1993). Один способ определения сходства, проводимый алгоритмом В^АδΤ, представляет собой наименьшую суммарную вероятность ^(N0), которая предполагает указание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайным образом. Например, нуклеиновая кислота рассматривается как сходная с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,2, более того, в некоторых вариантах осуществления менее приблизительно 0,01 и более всего в других вариантах осуществления менее приблизительно 0,001.

Гомология последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивается также с использованием Ва81с Ьоса1 АНдптеи! δеа^сЬ Тоо1 (В^АδΤ). В частности, для осуществления следующих задач используются пять конкретных программ В^АδΤ:

(1) В^АδΤР и В^АδΤ3 сравнивают представляющую интерес аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков;

(2) В^АδΤN сравнивает интересующую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей;

(3) В^АδΤX сравнивает концептуальные продукты трансляции с шести рамок интересующей нуклеотидной последовательности (обе нити) с базой данных белковых последовательностей;

(4) ΤВ^АδΤN сравнивает представляющую интерес белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых со всех шести рамок считывания (обе цепи); и (5) ΤВ^АδΤX сравнивает продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции с шести рамок базы данных нуклеотидных последовательностей.

Программы В^АδΤ идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных сегментов, которые называются парами сегментов с максимальным сходством между представляющей интерес последовательностью аминокислоты или нуклеиновой кислоты и анализируемой последовательностью, которую в некоторых вариантах осуществления получают из базы данных последовательностей белков или нуклеиновых кислот. Пары сегментов с максимальным сходством в некоторых вариантах осуществления идентифицируют (т.е. выравнивают) посредством оценочных матриц, многие из которых известны в данной области. Оценочная матрица представляет собой матрицу ВЬОδ^62 (Ооппе! е! а1., δ^ΐ'^ 256:1443-1445, 1992; Неткой апй Неткой, РгоЮиъ 17:49-61, 1993). Также можно использовать матрицы РАМ или РАМ250 (см. δΟμνο!/ апй ЭауЬой, ей8., 1978, МаНгсек йог Эе1ес1шд ЭШапсе Ке1а1юп8Ыр8: АИак ой Рго1еш δе^иеηсе апй δΙπιαίΓΐΌ, Vа8Ь^ηдΐοη: №Фопа1 Вюшейюа1 КекеагсЬ Роипйайоп). Программы Ρ^δΤ являются доступными посредством υ.δ. №Фопа1 ЫЬгагу ой Мей1сше.

Параметры, используемые в приведенных выше алгоритмах, можно адаптировать в зависимости от исследуемой длины последовательности и степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления параметры могут представлять собой параметры по умолчанию, используемые в алгоритмах в отсутствие инструкций от пользователя.

Компьютерные системы и компьютерные программы.

- 22 029538

Как используют в настоящем документе, слова записанный и сохраненный относятся к процессу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области может легко освоить любые известные способы записывания информации на компьютерный считываемый носитель информации с получением изделия, содержащего одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот и/или полипептидов. Как используют в настоящем документе, термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в их наиболее широких общих значениях и включают такие устройства, как подробно описано ниже. Кодирующая последовательность или последовательность, которая кодирует конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, когда она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей.

Гомологию (идентичность последовательностей) можно определять с использованием любой из компьютерных программ и параметров. Последовательность нуклеиновой кислоты или полипептида можно сохранять, записывать и обрабатывать на любом носителе информации, который может считываться компьютером и который можно подключить к компьютеру. Как используют в настоящем документе, слова записанный и сохраненный относятся к процессу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области может легко освоить любые известные в настоящее время способы записывания информации на компьютерный считываемый носитель информации с получением изделия.

Компьютерные считываемые носители информации включают магнитный считываемый носитель, оптически считываемые носители, электронные считываемые носители и магнитные/оптические носители. Например, компьютерные носители информации могут представлять собой жесткий диск, дискету, магнитную ленту, СО-КОМ, универсальный цифровой диск (ИУО), оперативное запоминающее устройство (КЛМ) или постоянное запоминающее устройство (КОМ), а также другие типы других носителей, известных специалистам в данной области.

Компьютерные системы хранят и обрабатывают информацию последовательностей. Один пример компьютерной системы 100 проиллюстрирован в форме блок-схемы на фиг. 9. Как используют в настоящем документе, термин компьютерная система относится к компонентам аппаратного оборудования, компонентам программного обеспечения и компонентам для хранения данных, используемым для анализа нуклеотидной последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидной последовательности. Компьютерная система 100 включает процессор для подготовки, доступа и обработки данных о последовательностях. Процессор 105 может представлять собой любой хорошо известный тип центрального процессорного элемента, такой как, например, Репйиш III от 1п1е1 СогрогаОоп. или сходный процессор от §ип, Мо!ото1а, Сошрац, ЛМО, или 1п1етпа1юпа1 Ви8те88 МаеЫпез.

Компьютерная система 100 представляет собой универсальную систему, которая включает процессор 105 и один или несколько внутренних устройств для хранения данных 110 и одно или несколько устройств для извлечения данных для того, чтобы извлекать данные, сохраненные на компонентах для хранения данных. Специалист в данной области может легко понять, что пригодной является любая из доступных в настоящее время компьютерных систем.

Компьютерная система 100 включает процессор 105, соединенный с общей шиной, которая соединена с основным запоминающим устройством 115 (представленная в виде КАМ) и одним или несколькими внутренними устройствами для хранения данных 110, такими как жесткий диск и/или другие компьютерные считываемые носители информации с записанными на них данными. В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 100 далее включает в одно или несколько устройств для извлечения данных 118 для считывания данных, сохраненных на внутренних устройствах для хранения данных 110.

Устройство для извлечения данных 118 может быть представлено, например, дисководом для гибких дисков, дисководом для компакт-дисков, накопителем на магнитной ленте или модемом, способным соединяться с удаленными системами хранения данных (например, через Интернет) и т.д. В некоторых вариантах осуществления внутреннее устройство для хранения данных 110 представляет собой съемный компьютерный считываемый носитель информации, такой как дискета, компакт-диск, магнитная лента и т.д., содержащий логические схемы управления и/или записанные на нем данные. Компьютерная система 100 может преимущественно включать подходящее программное обеспечение или может быть запрограммирована с помощью него для чтения логической схемы управления и/или данных с компонента для хранения данных после помещения в устройство для извлечения данных.

Компьютерная система 100 включает экран 120, который используется для выведения данных пользователю компьютера. Также следует отметить, что компьютерная система 100 может быть связана с другими компьютерным системами 125а-с в сети или в глобальной сети для получения централизованного доступа к компьютерной системе 100.

Программное обеспечение для доступа и обработки нуклеотидных последовательностей в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ей, или последовательности полипептида по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ему (такое как инструменты поиска, инструменты сравнения и инструменты моделиро- 23 029538 вания, и т.д.), в процессе выполнения программы может находиться на основном запоминающем устройстве 115.

В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 100 может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательностей для сравнения последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ей, или последовательности полипептида по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ему, сохраненных на компьютерном считываемом носителе информации, с эталонной последовательностью(ями) нуклеотидов или полипептидов, хранящейся на компьютерном считываемом носителе информации. Термин алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или нескольким программам, которые выполняются (локально или удаленно) на компьютерной системе 100 для сравнения нуклеотидной последовательности с другими нуклеотидными последовательностями и/или соединениями, хранящимися на устройствах для хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, или полипептидную последовательность по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, сохраненные на компьютерном считываемом носителе информации, с эталонными последовательностями, хранящимися на компьютерном считываемом носителе информации, для идентификации гомологии или структурных мотивов.

На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса 200 для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями из базы данных в целях определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных. Последовательности из базы данных могут представлять собой частную базу данных, сохраненную на компьютерной системе 100, или общедоступную базу данных, такую как ΟΕΝΒΑΝΚ, которая доступна через Интернет.

Процесс 200 начинается в исходном положении 201 и перемещается в положение 202, где новая последовательность, подлежащая сравнению, сохраняется на запоминающем устройстве компьютерной системы 100. Как описано выше, запоминающее устройство может представлять собой любой тип запоминающего устройства, включая КАМ или внутреннее устройство для хранения.

Затем процесс 200 перемещается в положение 204, где базу данных последовательностей открывают для анализа и сравнения. Затем процесс 200 перемещается в положение 206, где первая последовательность, сохраненная в базе данных, считывается в запоминающее устройство компьютера. Затем в положении 210 осуществляется сравнение для определения, являются ли первая последовательность и вторая последовательность одинаковыми. Важно отметить, что эта стадия не ограничивается осуществлением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью из базы данных. Специалистам в данной области известны хорошо известные способы для сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не являются идентичными. Например, в одну последовательность могут быть внесены разрывы в целях повышения уровня гомологии между двумя анализируемыми последовательностями. Параметры, контролирующие, будут ли разрывы или другие признаки внесены в последовательность в процессе сравнения, в норме вводит пользователь компьютерной системы.

После проведения сравнения двух последовательностей в положении 210, в положении для принятия решения 210 осуществляется определение того, являются ли две последовательности одинаковыми. Безусловно, термин одинаковый не ограничивается последовательностями, которые абсолютно идентичны. Последовательности, которые находятся в пределах параметров гомологии, введенных пользователем, в процессе 200 обозначатся как одинаковые.

Если определено, что две последовательности являются одинаковыми, процесс 200 перемещается в положение 214, где название последовательности из базы данных выводится на экран пользователю. В этом положении пользователь уведомляется о том, что последовательность с отображенным названием удовлетворяет введенным ограничениям. После того как название сохраненной последовательности выводится на экран пользователю, процесс 200 перемещается в положение для принятия решения 218, где определяется, существуют ли другие последовательности в базе данных. Если в базе данных больше не существует последовательностей, тогда процесс 200 завершается в конечном положении 220. Однако если в базе данных существуют другие последовательности, тогда процесс 200 перемещается в положение 224, где указатель перемещается на следующую последовательность в базе данных, так что она может быть сравнена с новой последовательностью. Таким образом, новая последовательность выравнивается и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных.

Следует отметить, что если в положении для принятия решения 212 определяется, что последовательности не гомологичны, тогда процесс 200 непосредственно перемещается в положение для принятия решения 218 в целях определения, если в базе данных есть любые другие доступные последовательности для сравнения.

Итак компьютерная система может содержать процессор, устройство для хранения данных с сохраненной на нем последовательностью нуклеиновой кислоты и последовательностями, по существу, идентичными ей, или последовательностью полипептида и последовательностями, по существу, идентичны- 24 029538 ми ей, устройство для хранения данных с сохраненными на нем извлекаемыми эталонными нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями, подлежащими сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты, и с последовательностями, по существу, идентичными ей, или полипептидной последовательностью, и с последовательностями, по существу, идентичными ей, и программой для сравнения последовательностей для проведения сравнения. Программа для сравнения последовательностей может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы в описанном выше коде нуклеиновой кислоты в последовательности нуклеиновой кислоты и в последовательностях, по существу, идентичных ей, или в последовательности полипептида и в последовательностях, по существу, идентичных ей, или она может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с этими кодами нуклеиновых кислот и кодами полипептидов. Устройство для хранения данных может обладать сохраненными на нем последовательностями по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 или более последовательностей нуклеиновых кислот и последовательностей, по существу, идентичных им, или последовательностей полипептидов и последовательностей, по существу, идентичных им.

Способ определения уровня гомологии между последовательностью нуклеиновой кислоты и последовательностями, по существу, идентичными ей, или последовательностью полипептида и последовательностями, по существу, идентичными ей, и эталонной нуклеотидной последовательностью включает считывание кода нуклеиновой кислоты или кода полипептида и эталонной нуклеотидной или полипептидной последовательности с использованием компьютерной программы, которая определяет уровни гомологии, и определение гомологии между кодом нуклеиновой кислоты или кодом полипептида и эталонной нуклеотидной или полипептидной последовательностью с помощью компьютерной программы. Компьютерная программа может представлять собой любую из множества компьютерных программ для определения уровня гомологии, включая программы, конкретно представленные в настоящем документе (например, ΒΕΆ8Τ2Ν с параметрами по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами). Способ можно осуществлять с использованием компьютерных систем, описанных выше. Также способ может быть осуществлен считыванием по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 или более описанных выше последовательностей нуклеиновых кислот и последовательностей, по существу, идентичных им, или последовательностей полипептидов и последовательностей, по существу, идентичных им, с использованием компьютерной программы, и определением гомологии между кодами нуклеиновых кислот или кодами полипептидов и эталонными нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями.

На фиг. 11 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса 250 в компьютере для определения наличия гомологии между двумя последовательностями. Процесс 250 начинается в исходном положении 252 и затем переходит в положение 254, где первая последовательность для сравнения сохраняется на запоминающем устройстве. Затем вторая последовательность для сравнения сохраняется на запоминающем устройстве в положении 256. Затем процесс 250 переходит в положение 260, где считывается первый элемент первой последовательности, а затем в положение 262, где считывается первый элемент второй последовательности. Следует понимать, что если последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, тогда элемент будет любым из А, Т, С, О или и. Если последовательность представляет собой белковую последовательность, тогда она представлена однобуквенным аминокислотным кодом, так что первая последовательность и последовательности могут легко быть сравнены.

Затем в положении для принятия решения 264 определяется, являются ли два элемента одинаковыми. Если они являются одинаковыми, тогда процесс 250 переходит в положение 268, где считываются следующие элементы первой и второй последовательностей. Затем определяется, являются ли следующие элементы одинаковыми. Если они являются одинаковыми, тогда процесс 250 продолжает этот цикл до тех пор, пока элементы не будут отличаться. Если определяется, что следующие два элемента не являются одинаковыми, тогда процесс 250 переходит в положение для принятия решения 274 для определения, существуют ли любые другие элементы или последовательности для считывания.

Если элементов для прочтения более не существует, тогда процесс 250 переходит в положение 276, где уровень гомологии между первой и второй последовательностями выводится на экран пользователю. Уровень гомологии определяется вычислением соотношения элементов в последовательностях, которые были одинаковыми из всего количества последовательностей в первой последовательности. Таким образом, если каждый элемент в первой последовательности из 100 нуклеотидов совпал с каждым элементом второй последовательности, тогда уровень гомологии составляет 100%.

Альтернативно компьютерная программа может представлять собой компьютерную программу, которая сравнивает нуклеотидные последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты, с одним или несколькими эталонными нуклеотидными последовательностями в целях определения, отличается ли код нуклеиновой кислоты от последовательностей, по существу, идентичных ей, от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты в одном или нескольких положениях. Такая программа необязательно записывает длину и название вставленных, удаленных или замещенных нуклеотидов в отношении последовательности либо эталонного полинуклеотида, либо последовательности нуклеиновой ки- 25 029538 слоты последовательностей, по существу, идентичных ей. Компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли последовательность нуклеиновой кислоты и последовательности, по существу, идентичные ей, однонуклеотидный полиморфизм (δΝΡ) относительно эталонной нуклеотидной последовательности.

Таким образом, способ определения, отличается ли последовательность нуклеиновой кислоты и последовательности, по существу, идентичные ей, по одному или нескольким нуклеотидам от эталонной нуклеотидной последовательности, включает стадии считывания кода нуклеиновой кислоты и контрольной нуклеотидной последовательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует различия между последовательностями нуклеиновых кислот, и идентификации различий между кодом нуклеиновой кислоты и контрольной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы. Компьютерная программа может представлять собой программу, которая идентифицирует однонуклеотидные полиморфизмы. Способ может быть осуществлен с помощью описанной выше компьютерной системы и способа, проиллюстрированного на фиг. 11. Также способ может быть осуществлен посредством считывания по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 или более последовательностей нуклеиновых кислот и последовательностей, по существу, идентичных им, и эталонных нуклеотидных последовательностей с использованием компьютерной программы, и идентификации различий между кодами нуклеиновых кислот и контрольными нуклеотидными последовательностями с помощью компьютерной программы.

Система на основе компьютера далее может включать идентификатор для идентификации характерных элементов в последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности полипептида. Термин идентификатор относится к одной или нескольким программам, которые идентифицируют определенные элементы в последовательности нуклеиновой кислоты, или в последовательности полипептида и последовательностях, по существу, идентичных ей. Идентификатор может включать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания в последовательности нуклеиновой кислоты и последовательностях, по существу, идентичных ей.

На фиг. 12 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления работы идентификатора 300 для определения наличия характерных элементов в последовательности. Процесс 300 начинается в исходном положении 302 и затем переходит в положение 304, где первая последовательность, которая подлежит проверке на наличие характерных элементов, сохранена на запоминающем устройстве 115 в компьютерной системе 100. Затем процесс 300 переходит в положение 306, где открывается база данных с последовательностями элементов. Такая база данных включает список признаков каждого характерного элемента вместе с названием элемента. Например, названием элемента может быть Кодон инициации, а признаком может быть АТО. Другим примером может быть название элемента ТААТАА-бокс, и признаком элемента может быть ТААТАА.. Примером такой базы данных является база данных, созданная в Итуегкйу о£ АНсоикт Оеиейск Сотри!ег Огоир. Альтернативно характерные элементы могут представлять собой структурные мотивы полипептидов, такие как альфа-спирали, бетаслои, или функциональные мотивы полипептидов, такие как ферментативные активные центры, мотивы спираль-поворот-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области.

После открытия базы данных элементов в положении 306 процесс 300 переходит в положение 308, где первый элемент считывается из базы данных. Затем проводится сравнение признака первого характерного элемента с первой последовательностью в положении 310. В положении для принятия решения 316 определяется, обнаружен ли признак характерного элемента в первой последовательности. Если признак обнаружен, тогда процесс 300 переходит в положение 318, где название обнаруженного элемента выводится на экран пользователю.

Затем процесс 300 переходит в положение для принятия решения 320, где определяется, существуют ли еще в базе данных элементы. Если элементов больше не существует, тогда процесс 300 завершается в конечном положении 324. Однако если в базе данных существуют еще характерные элементы, тогда в процессе 300 считывается следующий элемент последовательности в положении 326, и процесс возвращается в положение 310, где признак следующего элемента сравнивается с первой последовательностью. Следует отметить, что если признак элемента не обнаружен в первой последовательности в положении для принятия решения 316, тогда процесс 300 переходит непосредственно в положение для принятия решения 320 в целях определения, существуют ли еще элементы в базе данных.

Таким образом, способ идентификации элемента в последовательности нуклеиновой кислоты и в последовательностях, по существу, идентичных ей, или в последовательности полипептида и в последовательностях, по существу, идентичных ей, включает считывание кода(ов) нуклеиновой кислоты или кода(ов) полипептида с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует характерные элементы в них, и идентификацию элементов в коде(ах) нуклеиновой кислоты с помощью компьютерной программы. При этом компьютерная программа включает компьютерную программу, которая идентифицирует открытые рамки считывания. Способ может быть осуществлен посредством считывания единичной последовательности или по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, или 40 или более последовательностей нуклеиновых кислот и последовательностей, по существу, идентичных им, или последовательностей полипептидов и последовательностей, по существу, идентичных им, с использованием ком- 26 029538 пьютерной программы, и идентификации характерных элементов в кодах нуклеиновых кислот или кодах полипептидов с помощью компьютерной программы.

Последовательность нуклеиновой кислоты и последовательности, по существу, идентичные ей, или последовательность полипептида и последовательности, по существу, идентичные ей, могут храниться и обрабатываться во множестве программ для обработки данных во множестве форматов. Например, последовательность нуклеиновой кислоты и последовательности, по существу, идентичные ей, или последовательность полипептида и последовательности, по существу, идентичные ей, могут быть сохранены в качестве текста в файле для обработки слов, таком как Мюгокой ^ОКЭ™ или ^ОКЭРЕКРЕСТ™, или в качестве файла А8С11 во множестве программ с базами данных, известных специалистам в данной области, таких как ΌΒ2™, 8УВА8Е™ или ОКЛСЬЕ™. Кроме того, множество компьютерных программ и баз данных можно использовать в качестве алгоритмов сравнения последовательностей, идентификаторов или источников эталонных нуклеотидных последовательностей или полипептидных последовательностей, подлежащих сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты и последовательностями, по существу, идентичными ей, или с последовательностью полипептида и последовательностями, по существу, идентичными ей. Следующий список не предназначен для ограничения, а для предоставления рекомендаций по программам и базам данных, которые пригодны для последовательностей нуклеиновых кислот и последовательностей, по существу, идентичных им, или для последовательностей полипептидов и последовательностей, по существу, идентичных им.

Программы и базы данных, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, МАСРАТТЕКХ™ (ЕМВЬ), П18СОУЕКУВА8Е™ (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), СЕХЕМЕХЕ' ™ (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), ЬООК™ (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), МАСЬООК™ (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), ВЬА8Т и ВЬА8Т2 (ЫСВ1), ВЬАЗТЫ и ВЬА8ТХ (Айксйи1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215:403, 1990), РА8ТА (Реагкоп аиб Ыршаи, Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А, 85:2444, 1988), РА8ТОВ (ВгиЙад е! а1. Сотр. Арр. Вюкск 6:237-245, 1990), СЛТЛ^Υ8Т™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), Са!а1ук1/8НАРЕ™ (Мо1еси1аг 81ти1айои5 1пс.), Сегшк². ЭВАссекк (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), НУРООЕХ'™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), 1Ы81ОНТ II™, (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), П18СОУЕК™ (Мо1еси1аг 81ти1а1юп8 1пс.), СНАКМт™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), РЕЫХ™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ОЕЬРН1™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ОиаШеММ'™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), Ното1оду (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), МОЭЕЬЕК™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), 1818™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ОнаШа/РгоШп Оеыдп (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ХУеЬйаЬ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ХУеЬйаЬ ОАегкПу Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), Оепе Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), 8ес]Ро1б (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), базу данных МОЙ АуабаЫе Сйеш1са1к ЭйесЮгу. базу данных МОЬ Эгид Эа1а Керой, базу данных Сотргейепкйе Мебюта1 Сйеш1к1гу, базу данных Эепуетк'к \Уог1б Эгид 1пбех, базу данных ВюВу!еМак1егРйе, базу данных ОепЬапк и базу данных Оепкецп.

Множество других программ и баз данных будут очевидны специалисту в данной области, с учетом настоящего описания.

Мотивы, которые можно определять с использованием приведенных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновую молнию, мотивы спираль-поворот-спираль, участки гликозилирования, участки убиквитинилирования, альфа-спирали и бета-слои, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секрецию кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, фрагменты с кислотными свойствами, ферментативные активные центры, участки связывания субстрата и участки ферментативного расщепления.

Гибридизация нуклеиновых кислот.

Гибридизация относится к процессу, при котором цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью посредством спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными, так что конкретная представляющая интерес последовательность может быть определена даже в образцах, в которых она находится в низких концентрациях. Подходящие строгие условия могут определяться, например, концентрациями соли или формамида в растворах для предгибридизации и гибридизации или температурой гибридизации и хорошо известны в данной области. Строгость можно увеличивать снижением концентрации соли, повышением концентрации формамида или повышением температуры гибридизации.

Гибридизацию в условиях высокой строгости включает приблизительно 50% формамид при приблизительно от 37 до 42°С. Условия гибридизации включают условия сниженной строгости в приблизительно от 35 до 25% формамиде при приблизительно от 30 до 35°С. Итак, условия гибридизации включают условия высокой строгости, такие как 42°С в 50% формамиде, 5Х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося. Условия гибридизации включают также условия сниженной строгости, но в 35% формамиде при пониженной температуре 35°С. Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню строгости, может быть дополнительно сужен посредством вычисления соотношения пуринов и пиримидинов интересующей нуклеиновой кислоты и соответствующего подбора температуры. Варианты указанных выше диапазонов хорошо известны в данной об- 27 029538 ласти.

Нуклеиновые кислоты определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой строгости, включающих условия приблизительно 50% формамида при температуре от 37 до 42°С. Нуклеиновые кислоты определяют также по их способности гибридизоваться при условиях пониженной строгости, включающих условия в приблизительно от 35 до 25% формамиде при температуре приблизительно от 30 до 35°С.

Альтернативно нуклеиновые кислоты определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой строгости, включающих условия при температуре 42°С в 50% формамиде, 5Х §§РЕ, 0,3% δΌδ и с нуклеиновой кислотой, блокирующей повторяющиеся последовательности, такой как со1-1 или ДНК спермы лосося (например, 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося). Нуклеиновые кислоты также определяют по их способности гибридизоваться при условиях пониженной строгости, включающих 35 или 40% формамид при пониженной температуре 35 или 42°С.

В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня строгости, будут варьировать в зависимости от природы подлежащей гибридизации нуклеиновой кислоты. Например, при выборе условий гибридизации можно рассматривать длину, степень комплементарности, состав нуклеотидной последовательности (например, содержание СС относительно АТ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК относительно ДНК) в гибридизуемых участках нуклеиновых кислот. Дополнительно рассматривают, является ли одна из нуклеиновых кислот иммобилизованной, например, на фильтре.

Гибридизацию можно проводить в условиях низкой строгости, умеренной строгости или высокой строгости. В качестве примера гибридизации нуклеиновой кислоты сначала проводят предгибридизацию полимерной мембраны, содержащей иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты в течение 30 мин при 45°С в растворе, состоящим из 0, 9 М ЫаС1, 50 мМ ЫаН₂РО₄, рН 7,0, 5,0 мМ Νη₂ΕΌΤΑ. 0,5% δΌδ, 10Х ЭепНагб! и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем в раствор добавляют приблизительно 2х10⁷ срт (удельная активность 4-9х10⁸ срт/мкг) меченного на конце посредством ³²Р олигонуклеотидного зонда. Через 12-16 ч инкубации мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре в 1Х δΕΤ (150 мМ №С1, 20 мМ гидрохлорида Τήδ, рН 7,8, 1 мМ №₂ ЭДТА), содержащим 0,5% δΌδ, с последующим промыванием в течение 30 мин свежим 1Х δΕΤ при Т_т-10°С для олигонуклеотидного зонда. Затем мембрану проявляют на пленке для радиоавтографии в целях определения сигналов гибридизации. Все упомянутые выше способы гибридизации можно рассматривать, как проходящие в условиях высокой строгости.

После гибридизации для удаления любых неспецифично связанных детектируемых зондов фильтр можно промывать. Строгость, используемая для промывания фильтров, также может варьировать в зависимости от природы гибридизуемых нуклеиновых кислот, длины гибридизуемых нуклеиновых кислот, степени комплементарности, состава нуклеотидной последовательности (например, содержание СС относительно АТ) и типа нуклеиновой кислоты (например, РНК относительно ДНК). Примеры постепенно повышающихся условий строгости являются следующими: 2Х δδ^ 0,1% δΌδ при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая строгость); 0,1Х 88С, 0,5% δΌδ при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная строгость); 0,1Х 88С, 0,5% δΌδ в течение от 15 до 30 мин при температуре между температурой гибридизации и 68°С (высокая строгость); и 0,15 М Ν;·ιί'.Ί в течение 15 мин при 72°С (очень высокая строгость). Конечное промывание с низкой строгостью может быть проведено в 0,1Х δδС при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только иллюстрацией одного набора условий, который может использоваться для промывания фильтров. Специалист в данной области знает, что существует множество способов промывания с различной строгостью. Некоторые другие примеры приведены ниже.

Условия гибридизации включают стадию промывания, включающую промывание в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе, содержащем 1Х 150 мМ №С1, 20 мМ Тп8-гидрохлорид, рН 7,8, 1 мМ №₂ЕЭТА, 0,5% δΌδ с последующим промыванием в течение 30 мин в свежем растворе.

Нуклеиновые кислоты, гибридизованные с зондом, идентифицируют посредством радиоавтографии или других общепринятых способов.

Приведенные выше способы можно модифицировать для идентификации нуклеиновых кислот со сниженными уровнями идентичности последовательностей (гомологии) с последовательностью образца. Например, для получения нуклеиновых кислот со сниженной идентичностью последовательностей (гомологией) с поддающимся детекции зондом, можно использовать менее строгие условия. Например, температуру гибридизации можно снижать на интервал 5°С в диапазоне от 68 до 42°С в буфере для гибридизации с концентрацией Ν;·ι' приблизительно 1 М. После гибридизации фильтр можно промывать 2Х 88С, 0,5% δΌδ при температуре гибридизации. Эти условия рассматривают как умеренные условия при температуре выше 50°С и низкие условия при температуре ниже 50°С. Конкретный пример умеренных условий гибридизаций представляет собой пример, где указанную выше гибридизацию проводят при 55°С. Конкретный пример условий гибридизации низкой строгости представляет собой пример, где указанную выше гибридизацию проводят при 45°С.

Альтернативно гибридизацию можно проводить в буферах, таких как 6Х 88С, содержащих форма- 28 029538 мид при температуре 42°С. В этом случае концентрация формамида в буфере для гибридизации может быть снижена на 5% интервал в диапазоне от 50 до 0% для идентификации клонов со сниженным уровнем гомологии с зондом. После гибридизации фильтр можно промывать 6Х 88С, 0,5% δΏδ при 50°С. Эти условия рассматривают как умеренные условия при концентрации формамида более 25% и низкие условия при концентрации формамида менее 25%. Конкретный пример умеренных условий гибридизации представляет собой пример, где указанную выше гибридизацию проводят в 30% формамиде. Конкретный пример условий гибридизации низкой строгости представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят в 10% формамиде.

Однако выбор параметров гибридизации не является решающим - решающей является строгость условий промывания, которая предполагает условия, которые позволяют определить, находится ли нужная нуклеиновая кислота. Условия промывания, используемые для идентификации нуклеиновых кислот, включают, например, приблизительно 0,02-молярную концентрацию соли при рН 7 и температуру по меньшей мере приблизительно от 50°С или приблизительно от 55°С до приблизительно 60°С; или концентрацию соли приблизительно 0,15 М №С1 при 72°С в течение приблизительно 15 мин; или концентрацию соли приблизительно 0,2Х 88С при температуре по меньшей мере приблизительно от 50°С или приблизительно от 55°С до приблизительно 60°С в течение приблизительно от 15 до приблизительно 20 мин; или гибридизационный комплекс промывают дважды раствором с концентрацией соли приблизительно 2Х 88С, содержащим 0,1% δΏδ при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем промывают дважды 0,1Х §§С, содержащим 0,1% δΏδ при 68°С в течение 15 мин; или эквивалентные условия. См. 8атЪгоок ей, \1ΘΙ.ΕΠ;ΐ.ΑΚ С1.ОМХС.: Α ΕΑΒΘΚΑΤΘΚΥ ΧΙΆΜ,'ΆΙ, (2пс1 ей), νοίδ.1-3, Со1с1 8ргт§ НагЪог ЬаЪогаЮгу (1989), ΕΑΒΘΚΑΤΘΚΥ ΤΕ(Ί ΙΜΟΙ,'Εδ ΙΝ ΒΙΘί'Ι ΙΕΛΙΙδΊΚΥ’ ΑΝΏ ΧΙΘΕΕΠ,'ΕΆΚ ВЮЬΘΟΥ: I ΙΥΒΗΐυΐ/ΆΤΙΟΝ \\ΊΤΙ 1 ХЕСЕЕ1С ДСП) ΡΚΘΒΕδ, Рай I. ТЕеогу аМ Хискчс Лск1 РгерагаПоп. Τί^δδеη, ей Е18е\зег. Ν. Υ. (1993) и ΑиδиЪе1, ей Ιοίιη \УПеу & δοηδ, 1пс., №\υ ΥοιΊ< (1997) для описания буфера 88С и эквивалентных условий.

Эти способы можно использовать для выделения или идентификации нуклеиновых кислот и последовательностей, по существу, идентичных им. Например, указанные выше способы можно использовать для выделения или идентификации нуклеиновых кислот, обладающих последовательностью по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью (гомологией) последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из одной из последовательностей и последовательностей, по существу, идентичных ей, или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 их последовательно расположенных оснований и последовательностей, комплементарных им. Идентичность (гомологию) последовательностей можно определять с использованием алгоритма выравнивания. Например, гомологичные полинуклеотиды могут обладать кодирующей последовательностью, которая является природным аллельным вариантом кодирующих последовательностей. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с нуклеиновыми кислотами. Кроме того, приведенные выше способы можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды по меньшей мере приблизительно с 99, 95, по меньшей мере 90, по меньшей мере 85, по меньшей мере 80, по меньшей мере 75, по меньшей мере 70, по меньшей мере 65, по меньшей мере 60, по меньшей мере 55 или по меньшей мере 50% идентичностью (гомологией) последовательностей с полипептидом, или его фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, как определяют с использованием алгоритма выравнивания последовательностей (например, таких как алгоритм ΡΑδΤΑ версии 3.0(78 с параметрами по умолчанию).

Олигонуклеотидные зонды и способы их применения.

Зонд может представлять собой по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 или приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70 последовательно расположенных оснований последовательности, как указано, в нуклеиновой кислоте. Зонды идентифицируют нуклеиновую кислоту посредством связывания и/или гибридизации. Также зонды можно использовать в матрицах, см. обсуждение ниже, включающих, например, капиллярные матрицы. Зонды можно использовать для выделения других нуклеиновых кислот или полипептидов.

Выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, последовательности, комплементарные им, или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований одной из последовательностей, или последовательности, комплементарные им, также можно использовать в качестве зондов для определения того, содержит ли биологический образец, такой как образец почвы, организм с последовательностью нужной нуклеиновой кислоты или организм, из которого была получена нуклеиновая кислота. В таких способах получают биологический образец, потенциально содержащий организм, из которого была выделена нуклеиновая кислота, и из образца получают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты подвергают контактированию с зондом в условиях, которые обеспечивают специфичную гибридизацию

- 29 029538 зонда с любыми комплементарными последовательностями, которые находятся в них.

При необходимости условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с комплементарной последовательностью, можно определять контактированием образца с комплементарными последовательностями из образцов, о которых известно, что они содержат комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарную последовательность. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, можно варьировать для идентификации условий, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с комплементарными нуклеиновыми кислотами.

Если образец содержит организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена, то затем определяют наличие специфичной гибридизации зонда. Гибридизацию можно выявить мечением зонда детектируемым веществом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование подвергаемого детекции продукта.

Множество способов применения меченых зондов для определения наличия комплементарных нуклеиновых кислот в образце известно специалистам в данной области. Они включают анализы саузернблоты, нозерн-блоты, способы гибридизации колоний и дот-блоты. Протоколы каждого из этих способов представлены в Аи8иЬе1 еί а1. СиггеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη \УПеу 503 §ои8, 1пс. (1997) и ЗатЬгоок еί а1., Мо1еси1аг С1отид: А каЬогаЮгу Маииа1 2ий Ей., Со1й 8ргшд НагЬог каЬогаЮгу Рге88 (1989).

Альтернативно в реакции амплификации можно использовать более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфично гибридизоваться с любой комплементарной последовательностью, которая присутствует в образце нуклеиновой кислоты), для определения, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нужной нуклеиновой кислоты (например, организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена). Зонды могут включать олигонуклеотиды, реакция амплификации может включать реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны в Аи8иЬе1 и ЗатЬгоок, выше. Альтернативно амплификация может включать лигазную цепную реакцию, 3§К, или реакцию вытеснения цепей. (См. Вагаиу, Р., ТЬе Ыдаке СЬаш РеасЬоп ίη а РСК ^ог1й, РСК МеШоЙ8 апй АррПсаЬош 1:5-16, 1991; Е. РаЬу еί а1., δе1Г-8и8ίа^ηей Зесщеисе Кеρ1^саί^οи (3§К): Аи 18о1Ьегта1 ТгашспрПои-Ььей АтрНПсаЬои §у8ίет АЬетаЬуе Ю РСК, РСК МеЙюЙ8 анй АррНсаЬош! 1:25-33, 1991; и \Уа1кег С.Т. еί а1., 8Ьций Όί8р1асетеШ АтрИГ^-Шонан 18о1кегта1 ίη уйго ^NА Атρ1^Г^саί^οη ТесЬтдие, №с1ею ас1Й Ке8еагсЬ 20: 16911696, 1992). В таких способах нуклеиновые кислоты подвергают контактированию в образце с олигонуклеотидными зондами, проводят реакцию амплификации и определяют любой полученный продукт амплификации. Продукт амплификации можно определять проведением гель-электрофореза продуктов реакции и окрашиванием геля интеркалирующим красителем, таким как бромистый этидий. Альтернативно один или несколько зондов можно метить радиоактивным изотопом, и наличие радиоактивного продукта амплификации можно определять радиоавтографией после гель-электрофореза.

Зонды, полученные из последовательностей вблизи концов последовательностей, также можно использовать в способах прогулки по хромосоме для идентификации клонов, содержащих геномные последовательности, расположенные рядом с нужными последовательностями. Такие способы позволяют выделять из организма хозяина гены, которые кодируют дополнительные белки.

Выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, комплементарные им последовательности или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 или более последовательно расположенных оснований одной из последовательностей, или последовательности, комплементарные им, используют в качестве зондов для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. Сходные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномные ДНК из организмов, отличных от организма, из которого нуклеиновая кислота была выделена. Например, другие организмы могут быть родственными организмами. В таких способах образец с нуклеиновой кислотой подвергают контактированию с зондом в условиях, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с родственными последовательностями. Затем определяют наличие гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма с использованием любого из описанных выше способов.

Варьируя строгость условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномные ДНК, которые гибридизуются с поддающимся детекции зондом, можно идентифицировать и выделять нуклеиновые кислоты с различными уровнями гомологии. Строгость можно варьировать проведением гибридизации при различных температурах ниже температуры плавления зондов. Температура плавления, Тт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с абсолютно комплементарным зондом. Высоко строгие выбирают, чтобы они были равны или составляли приблизительно на 5°С ниже, чем Т_т для конкретного зонда. Температуру плавления зонда можно вычислять с использованием следующих формул:

Для образцов длиной между 14 и 70 нуклеотидами температуру плавления (Т_т) вычисляют с использованием формулы Т_т=81,5+16,6(1од|№+])+0,41(фракция С+С)-(600/№), где N представляет собой

- 30 029538 длину зонда.

Если гибридизацию проводят в растворе, содержащем формамид, температуру плавления можно вычислять с использованием формулы: Т_т=81,5+16,6(1од[№+])+0,41(фракция О+С)-(0,63% формамида)(600/Ν), где Ν представляет собой длину зонда.

Предгибридизацию можно проводить в 6Х §§С, 5Х реагенте ИеикагЕ!, 0,5% δΌδ, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или в 6Х §§С, 5Х реагенте ИеикагЕ!, 0,5% δΌδ, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы для растворов §§С и ЭеиНагЕ! приведены в ЗатЪгоок е! а1., выше.

Гибридизацию можно проводить с добавлением детектируемого зонда в растворы для предгибридизации, перечисленные выше. Когда зонд содержит двухцепочечную ДНК, перед добавлением раствора для гибридизации его денатурируют. Иногда фильтр подвергают контактированию с раствором для гибридизации на достаточный период времени для того, чтобы обеспечить гибридизацию зонда с кДНК или с геномными ДНК, содержащими последовательности, комплементарные ему или гомологичные ему. Для зондов длиной более 200 нуклеотидов гибридизацию можно проводить при температуре на 15-25°С ниже Т_т. В случае более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизацию можно проводить при температуре на 5-10°С ниже Т_т. В некоторых случаях гибридизации в 6Х §§С гибридизацию проводят при приблизительно 68°С. Как правило, для гибридизации в растворах, содержащих 50% формамид, гибридизацию проводят при приблизительно 42°С.

Ингибирование экспрессии ферментов альдолаз.

Нуклеиновые кислоты, содержащие антисмысловые последовательности, способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию генов, кодирующих фермент альдолазу. Ингибирование можно обеспечивать нацеливанием на геномную ДНК или матричную РНК. Транскрипцию или функционирование нуклеиновой кислоты-мишени можно ингибировать, например, гибридизацией и/или расщеплением. Один особенно пригодный ряд ингибиторов включает олигонуклеотиды, способные связывать либо ген, либо транскрипт фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, в любом случае предотвращая или ингибируя продукцию или функционирование фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Ассоциация может происходить посредством специфичной в отношении последовательности гибридизации. Другой пригодный класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление транскрипта фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, как в случае рибозимов. Олигонуклеотид можно химически модифицировать или конъюгировать с ферментом или композицией, способными расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Группу из множества различных подобных олигонуклеотидов можно исследовать в отношении наличия олигонуклеотидов с требуемой активностью. Ингибирование экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может обладать множеством промышленных применений. Например, ингибирование экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может замедлить или предотвратить деградацию. Композиции, которые ингибируют экспрессию и/или активность ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, таких как антитела, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, κίΚΝΛ и тгΚNА, используют для замедления или предотвращения деградации. Таким образом, нанесение на растение или растительный продукт (такой как хлебный злак, зерно, плод, семя, корни, листья и т. д.) антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, κίΚΝΛ и тгΚNΛ замедляет или предотвращает деградацию. Также эти композиции могут экспрессироваться растением (таким как трансгенное растение) или другим организмом (таким как бактерия или другой микроорганизм, трансформированный геном фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО).

Композиции для ингибирования экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО (такие как антисмысловые молекулы, ΐΚΝΛ, рибозимы, антитела), можно применять в качестве фармацевтических композиций, таких как средства против патогенов или в других лекарственных средствах, таких как противомикробные средства, например, против 8а1тоие11а.

Антисмысловые олигонуклеотиды.

Стратегии для конструирования антисмысловых олигонуклеотидов хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может разработать такие олигонуклеотиды ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, с использованием новых реагентов. Например, протоколы прогулок по гену /картирования РНК для поиска эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, см., Но (2000) МеШоЕк Еи/уток 314:168-183, где описан анализ для картирования РНК, который основан на стандартных молекулярных технологиях, для обеспечения легкого и надежного способа эффективного выбора антисмысловой последовательности. См. также διηίΐΐι (2000) Еиг. 1. РЬагт. §сг 11:191-198.

В качестве антисмысловых олигонуклеотидов используют встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты. Антисмысловые олигонуклеотиды могут иметь любую длину; например, в других аспектах длина антисмысловых олигонуклеотидов составляет между приблизительно 5 и 100, приблизительно 10

- 31 029538 и 80, приблизительно 15 и 60, приблизительно 18 и 40. Оптимальную длину можно определять общепринятыми способами скрининга. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть представлены в любой концентрации. Оптимальную концентрацию можно определять общепринятыми способами скрининга. Известно широкое множество синтетических, не встречающихся в природе аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут решить эту потенциальную проблему.

Например, можно использовать пептидные нуклеиновые кислоты (ΡΝΑ), содержащие неионные остовы, такие как элементы ^(2-аминоэтил)глицина. Также можно использовать антисмысловые олигонуклеотиды с фосфоротиоатными связями, как описано в \У0 97/03211; \У0 96/39154; Ма!а (1997) Тох1со1 Арр1. РЬагтасо1. 144:189-197; Апйкепсе ТЬегареийск, ей. Адга\уа1 (Нитапа Ргекк, То1о\\л. Ν.Ι, 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, обладающие синтетическими аналогами остова ДНК, относящиеся к этому изобретению, также могут включать нуклеиновые кислоты с фосфородитиоатом, метилфосфонатом, фосфорамидатом, алкилфосфотриэфиром, сульфаматом, 3'-тиоацеталем, метилен(метилимино), 3'Ν-карбаматом и морфолино-карбаматом, как описано выше.

Для создания большого количества олигонуклеотидов, которые можно быстро исследовать в отношении конкретных олигонуклеотидов, которые обладают соответствующей аффинностью связывания и специфичностью к любой мишени, такой как смысловые и антисмысловые последовательности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО по этому изобретению, можно использовать комбинаторную химическую методологию (см. Оо1й (1995) 1. оГ Вю1. СЬет. 270:13581-13584)).

Ингибиторные рибозимы.

Стратегии для разработки рибозимов и селекции антисмысловой последовательности, специфичной для ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, для нацеливания хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может разработать такие рибозимы с использованием новых реагентов. Рибозимы действуют посредством связывания РНК-мишени с помощью связывающего РНК-мишень участка рибозима, который находится в непосредственной близости с ферментативным участком РНК, который расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим распознает и связывает РНК-мишень посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком, действует, ферментативно расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени подобным образом нарушает ее способность направлять синтез кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После связывания и расщепления рибозимом его РНК-мишени, он может высвобождаться из этой РНК для повторного связывания и расщепления новых мишеней.

В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может быть преимущественной по сравнению с другими технологиями, такими как антисмысловые технологии (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, блокируя ее транскрипцию, трансляцию или ассоциацию с другой молекулой), поскольку эффективная концентрация рибозима, необходимая для проведения терапевтического лечения, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Это потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, единичная молекула рибозима способна расщеплять множество молекул РНК-мишеней. Итак, рибозим представляет собой высокоспецифичный ингибитор со специфичностью ингибирования, зависящей не только от связывания механизмом спаривания оснований, но также от механизма, посредством которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. Следовательно, ингибирование происходит вследствие расщепления РНК-мишени, и, таким образом, специфичность определяется как соотношение скорости расщепления РНК-мишени и скорости расщепления РНК, которая не является мишенью. Этот механизм расщепления зависит от факторов, которые являются дополнительными для факторов, вовлеченных в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть более высокой, чем специфичность антисмыслового олигонуклеотида, связывающего тот же участок РНК.

Рибозим, такой как ферментативная молекула РНК рибозима, может быть образован в форме мотива в виде головки молотка, мотива в виде шпильки, такого как мотив вируса гепатита дельта, мотив интрона группы Ι и/или РНКазе Р-подобная РНК, в ассоциации со вспомогательной последовательностью РНК. Примеры мотивов в виде головки молотка описаны, например, Кокк1 (1992) АШк КекеагсЬ апй Нитап КеКоуиикек 8:183; мотивов в виде шпильки в Натре1 (1989) ВюсЬетЕйу 28:4929, и Натре1 (1990) Шс. Аайк Кек. 18:299; мотив вируса гепатита дельта в Реггойа (1992) ВюсЬетщйу 31:16; мотив РНКазы Р в Оиетег-Такайа (1983) Се11 35:849; и интрон группы I в патенте США № 4987071, выданном СесЬ. Перечисление этих конкретных мотивов не предназначено для ограничения. Специалисты в данной области поймут, что рибозим, например, ферментативная молекула РНК, может обладать специфичным участком связывания субстрата, комплементарным одному или нескольким участкам РНК гена-мишени. Рибозим может иметь нуклеотидную последовательность в этом участке связывания субстрата или рядом с ним, который придает молекуле активность в отношении расщепления РНК.

Интерференция РНК (^А1).

Молекула КNΑ^ может содержать двухцепочечную молекулу РНК (йкКNΑ), такую как молекулы

- 32 029538 δίΚΝΑ, Ш1КЫА и/или короткошпилечной РНК (δίΚΝΑ). Молекула ΚΝΑί, такая как δίΚΝΑ (малая ингибиторная РНК) и/или ιηίΚΝΑ (микроРНК), может ингибировать экспрессию гена фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. ΚΝΑί может проникать в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (δδΚΝΑ) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. Когда клетка подвергается воздействию двухцепочечной РНК (άδΚΝΑ), мРНК гомологичного гена селективно деградируется в процессе, называемом РНК-интерференцией (ΚΝΑί). Возможный основной механизм ΚΝΑί представляет собой разрушение двухцепочечной РНК (άδΚΝΑ), совпадающей со специфичной последовательностью гена, на короткие фрагменты, называемые короткими интерферирующими РНК, которые запускают деградацию мРНК, которая совпадает с их последовательностью. ΚΝΑί используют в лекарственных средствах для подавления генов, см., 5>1шеу (2002) Эгид Όίδ^ν. Тойау 7:1040-1046. Возможна селективная деградация РНК с использованием ΚΝΑί. Процесс может быть осуществлен ίη уйто, ех У1уо или ίη угуо. ΚΝΑί можно использовать для внесения мутации с потерей функции в клетке, органе или животном.

Внутриклеточное введение ΚΝΑί проводят посредством интернализации специфичного для клеткимишени лиганда, связанного со связывающим РНК белком, содержащим адсорбированную на нем ΚΝΑί (такую как микроРНК). Лиганд является специфичным для уникального антигена клеточной поверхности клетки-мишени. Лиганд может подвергаться спонтанной интернализации после связывания с антигеном клеточной поверхности. Если уникальный антиген клеточной поверхности в естественных условиях не подвергается интернализации после связывания с его лигандом, интернализацию можно обеспечивать включением обогащенного аргинином пептида, или другого проникающего через мембрану пептида, в структуру лиганда или связывающего РНК белка или присоединения такого пептида к лиганду или связывающему РНК белку. См. публикации патентных заявок США №№ 20060030003; 20060025361; 20060019286; 20060019258. Составы на основе липидов для доставки нуклеиновых кислот в качестве частиц нуклеиновая кислота-липид содержат молекулу ΚΝΑί в клетку, см., например, публикацию патентной заявки США 20060008910.

Модификация нуклеиновых кислот.

Эти способы можно повторять или использовать в различных сочетаниях, например, для создания изменений экспрессии гена/транскрипта, трансляции транскрипта или стабильности транскрипта. Генетический набор клетки можно изменять, например, посредством модификации гомологичного гена ех У1уо с последующим повторным встраиванием в клетку.

Нуклеиновую кислоту можно изменять любыми способами, например, случайными или стохастическими способами, или нестохастическими способами или способами направленных изменений, см. патент США № 6361974. Способы внесения случайных мутаций в гены хорошо известны в данной области, см. патент США № 5830696. Например, для внесения случайной мутации в ген можно использовать мутагены. Мутагены включают, например, облучение ультрафиолетовым светом или гаммаоблучение или химический мутаген, например, митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, отдельно или в сочетании, для индукции повреждений ДНК, поддающихся репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены представляют собой аналоги предшественников нуклеотидов, например нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Эти вещества можно добавлять в реакцию ПЦР вместо нуклеотидных предшественников, вызывая посредством этого мутации в последовательности. Также можно использовать интеркалирующие вещества, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т. п.

Можно использовать любую технологию молекулярной биологии, например случайный мутагенез посредством ПЦР, см. Шее (1992) Ргос. Νηί1. Αсаά. δει. υδΑ 89:5467-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, см. Статей (1995) В^оΐесЬη^^иеδ 18:194-196. Альтернативно можно осуществлять пересборку нуклеиновых кислот, например генов, после случайной, или стохастической, фрагментации, см. патенты США №№ 6291242; 6287862; 6287861; 5955358; 5830721; 5824514; 5811238; 5605793. Модификации, вставки или делеции вносят с помощью ПЦР с пониженной точностью, перетасовки, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, ПЦР со сборкой, мутагенеза с помощью половой ПЦР, мутагенеза ίη У1уо, кассетного мутагенеза, возвратно-множественного мутагенеза, экспоненциально-множественного мутагенеза, сайт-специфического мутагенеза, пересборки гена (такой как ОеηеΚеаδδатЫу, см. патент США № 6537776), мутагенеза с насыщением сайтов гена (ОδδМ), синтетической пересборки лигированием (δΕΚ), рекомбинации, возвратной рекомбинации последовательностей, мутагенеза модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенеза с содержащей урацил матрицей, мутагенеза с содержащими разрывы дуплексами, мутагенеза с репарацией точек несоответствия, мутагенеза с дефектом репарации цепи хозяина, химического мутагенеза, мутагенеза радиогенного происхождения, мутагенеза с делецией, мутагенеза с рестрикцией и селекцией, мутагенеза с рестрикцией и исправлением ошибок, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, создания химерного мультимера нуклеиновой кислоты, хромосомного мутагенеза с насыщением и/или сочетанием этих и других способов.

В следующих публикациях описано множество способов возвратной рекомбинации процедур и/или способов, которые могут быть включены в способы по этому изобретению: δΝιηιικΓ (1999) Мо1еси1аг

- 33 029538

ЬтееЛшд οί νίπΐίχδ Гог (агдеЛпд апб о1Лег сЛтса1 ргорегйек Титог ТагдеЛпд 4:1-4; №кк (1999) БаЛче Βίο1есЬпо1о§у 17:893-896; СЛапд (1999) 'ΈγοίιΗοη оГ а суИкте икшд ΌΝΑ ГатПу кЛиГйшд №Лиге В1о1есЛпо1оду 17:793-797; ΜίηκΗυίί (1999) Рго1ет еνοίиί^οη Ьу то1еси1аг ЬгееЛтд СиггеШ Θρίηίοη ίη СЛеткН Вю1оду 3:284-290; СЛЛкЛапк (1999) О|гес1еЛ еνοίиЛοη оГ ПутНИе к Лыке Гог ΑΖΤ рЛокрЛогу1аЛоп иктд ΌΝΑ ГатЛу кЛиГйшд №Лиге Вю1есЛпо1оду 17:259-264; СгатеЛ (1998) ΌΝΑ кЛиГйшд оГ а ГатЛу оГ депек Ггот ЛКегке креаек ассе1ега1ек Лчес1еЛ еνοίиί^οη №Лиге 391:288-291; СгатеЛ (1997) Мо1еси1аг еνοίиЛοη оГ ап агкепа1е ЛеНхЛюаЛоп раНгау Ьу ΌΝΑ кЛиГЙтд, №Лиге Вю1есЛпо1оду 15:436-438; Ζ1κ·ιη§ (1997) Όίгес!еЛ еνοίиί^οη оГ ап еГГес1Ке ГисоЛЛаке Ггот а да1асЮк1Лаке Ьу ΌΝΑ кЛиГГЛпд апЛ ксгеешпд Ргос. №И. ΑсаЛ. 8с1. υ8Α 94:4504-4509; РаЛеп е1 а1. (1997) '^рЛсаЛо^ оГ ΌΝΑ 8ЛиГйтд Ю РЛагтасеиЛсак апЛ Уассшек СиггеШ Оршюп ίη Вю1есЛпо1оду 8:724-733; СгатеЛ е1 а1. (1996) СопкЛцсйоп апЛ еνοίиЛοη оГ апЛЬоЛу-рЛаде ЛЬгапек Ьу ΌΝΑ кЛиЙКпд №Лиге МеЛюше 2:100-103; Са1ек е1 а1. (1996) ΑΠΊηίΐγ кеίесЛνе 1ко1аЛоп оГ ЛдапЛк Ггот рерЛЛе ЛЬгапек НгоидЛ Л1кр1ау оп а 1ас гергекког ЛеаЛр1есе Нтет 1оита1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду 255:373-386; 81еттег (1996) 8ехиа1 РСК апЛ ΑккетЬίу РСК 1п: ТЛе Епсус1ореЛ1а оГ Мо1еси1аг Вю1оду. УСН РиЬЛкЛегк, №\υ Уогк, рр.447-457; СгатеЛ апЛ 81еттег (1995) СотЬшаНЛа1 ти1Лр1е саккейе тШадепеЛк сгеа1ек аЛ 1Ле регти!аЛопк оГ ти1ап1 апЛ \гПЛ1уре саккеЛек ВюТесЛпищек 18:194-195; 81еттег е1 а1. (1995) 81пд1е-к1ер аккетЫу оГ а депе апЛ епЛге р1акиЛЛ Гогт 1агде питЬегк оГ оЛдоЛеохупЬопис1еоЛЛек Оепе, 164:49-53; 81еттег (1995) ТЛе Ενοίπΐίοη оГ Мо1еси1аг Сотри1аЛоп 8с1епсе 270: 1510; 81еттег (1995) 8еагсЛНд 8едиепсе 8расе Вю/ТесЛпо1оду 13:549-553; 81еттег (1994) КарН еνο1иЛоп оГ а рго1еЛ1 ίη νίίτο Ьу ΌΝΑ кЛиГГЛпд №Лиге 370:389-391; апЛ 81еттег (1994) ΌΝΑ кЛиГГЛпд Ьу гапЛот ГгадтейаЛоп апЛ геаккетЫу: Ιη νίίτο гесотЬшаЛоп Гог то1еси1аг еνοίиЛοη. Ргос. ΝηΠ. ΑсаЛ. 8сг υ8Α 91:10747-10751.

Способы внесения мутаций обеспечения разнообразия включают, например, сайт-направленный мутагенез (Лтд е1 а1. (1997) ^рртоасЛек ίο ΌΝΑ тШадепеЛк: ап ογе^γ^е\γ Αηаί ВюсЛет. 254(2):157-178; Оа1е е1 а1. (1996) ОЛдопис1еоЛЛе-Л1гес1еЛ гапЛот тШадепеЛк иктд 1Ле рЛокрЛогоПиоаЮ теЛюЛ МеПоЛк Мо1. Вю1. 57:369-374; 8тЛЛ (1985) Ιη νίίτο тШадепеЛк Αηη. Κν. ОепеЛ 19:423-462; Во1к1ет & 8ЛогЛе (1985) 8йа1ед1ек апЛ аррЛсаЛопк оГ ίη νίίτο тШадепеЛк 8аепсе 229:1193-1201; СаЛет (1986) 8Ле-ЛЛес1еЛ тШадепеЛк ВюсЛет. ί. 237:1-7; апЛ Кипке1 (1987) ТЛе еГйтепсу оГ оЛдопис1еоЛЛе ЛЛес1еЛ тШадепеЛк ίη ШМею Αс^Лк & Мо1еси1аг Вю1оду (Ескк1е1п, Ε. апЛ ЬШеу, Ό. М. ί. еЛк., 8рппдег Уег1ад, ВетЛп)); мутагенез с содержащими урацил матрицами (Кипке1 (1985) КарН апЛ еГЛаеШ кйе-креайс тШадепеЛк χίΐΗοηΙ рЛепоКрю ке1есЛоп Ргос. ΝηΠ. ΑсаЛ. 8сг υ8Α 82:4 88-4 92; Кипке1 е1 а1. (1987) КарН апЛ ейгаей кЛекресгйс тШадепеЛк χίΐΗοηΙ рЛепоКрю ке1есЛоп МеНоЛк ίη Еп/уто1. 154,367-382; апЛ Вакк е1 а1. (1988) МШаШ Тгр гергеккогк χνίΐΗ пе\г ΌΝΑ-ЬНЛтд кресгйсНек 8аепсе 242:240-245); олигонуклеотиднаправленный мутагенез (МеНоЛк ίη Еп7уто1. 100:468-500 (1983); МеНоЛк ίη Еп7уто1. 154:329-350 (1987); Ζο^τ (1982) ОПдопиНеоЛЛе-ЛЛеПеЛ тНадепеык икшд М13-Ле^^νеЛ νесίο^к: ап еГЛает апЛ депега1 ргосеЛиге Гог Не ртоЛисйоп оГ роЛи тНаЛопк ίη апу ΌΝΑ ГгадтеШ ШМею Αс^Лк Кек. 10:6487-6500; ΖοΗτ & 8тЛЛ (1983) ОЛдопис1еойЛе-ЛЛес1еЛ тШадепеЛк оГ ΌΝΑ ГгадтеШк с1опеЛ ίηίο М13 νесίο^к МеНоЛк ίη Еп/уто1. 100:468-500; апЛ ΖοЛе^ (1987) ОЛдопис1еойЛе-ЛЛес1еЛ тНадепеык: а к1тр1е теЛюЛ иктд 1\υο оЛдопис1еоЛЛе рптегк апЛ а кшд1е-кЛапЛеЛ ΌΝΑ 1етр1а1е МеЛюЛк ίη Еп/уто1. 154:329-350); мутагенез с модификацией ДНК фосфоротиоатом (Тау1ог (1985) ТЛе ике оГ рЛокрЛого1Л1оа1е-тоЛгйеЛ ΌΝΑ ίη гек1г1с11оп еп/уте геасЛопк ίο ргераге шскеЛ ΌΝΑ Νικί. Αс^Лк Кек. 13:8749-8764; Тау1ог (1985) ТЛе тарН депетаЛоп оГ оПдопиМеоЛЛе-ЛЛесЮЛ тиίаЛοηк аί ЫдЛ Ггесщепсу иктд рЛокрЛогоППоаЮ-тоЛИеЛ ΌΝΑ ΝιιΝ. Αс^Лк Кек. 13:8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) ИЫЬЛюп оГ текЛтсйоп епЛопис1еаке ΝΗ I сίеаνаде Ьу рЛокрЛогоПюаЮ дгоирк апЛ Лк аррЛсаЛоп ίο оЛдопиНеойЛе-ЛЛеНеЛ тНадепекЛ ΝιιΗ. Αс^Лк Кек. 14:9679-9698; 8ауегк (1988) Υ-Т Ехопис1еакек ίη рЛокрЛогоЛиоаЮ-ЬакеЛ оЛдопиНеоДЛе-ЛЛеНеЛ тШадепекЛ ΝιιΗ. Αс^Лк Кек. 16:791-802; апЛ 8ауегк еί а1. (1988) 8йапЛ кресЛю сίеаνаде оГ рЛокрЛогоПюаЮсопЛишпд ΌΝΑ Ьу геасЛоп \γίΠ гек1г1с11оп епЛопис1еакек ίη Не ргекепсе оГ еИНшт ЬгоиЛЛе ΝιιΗ. Αс^Лк Кек. 16:803-814); мутагенез с использованием разрывов в дуплексе ДНК (Кгатег еί а1. (1984) ТЛе дарреЛ Лир1ех ΌΝΑ арргоасЛ ίο оЛдопиНеоДЛе-ЛЛеНеЛ тШайоп сопкЛисЛоп ΝιιΗ. Αс^Лк Кек. 12:9441-9456; Кгатег & ΕτίΙζ (1987) МеЛюЛк ίη Еп/уто1. ОЛдопиНеойЛе-ЛЛеПеЛ сопкЛисЛоп оГ тиίаЛοηк ν^а дарреЛ Лир1ех ΌΝΑ 154:350-367; Кгатег (1988) 1тргсл'еЛ епгутаЛс ίη νίίτο геасЛопк ίη Не дарреЛ Лир1ех ΌΝΑ арргоасЛ ίο оЛдопис1еойЛе-ЛЛес1еЛ сопкЛисЛоп оГ тШайопк ΝιιΜ. Αс^Лк Кек. 16:7207; апЛ Εηίζ (1988) ОЛдопис1еоЛЛе-ЛЛес1еЛ сопкЛисЛоп оГ тШаЛопк: а дарреЛ Лир1ех ΌΝΑ ргосеЛиге χίΐΗοηΙ еηζутаЛс геасЛопк ίη νίίτο \ис1. ΑαΗ Кек. 16:6987-6999).

Дополнительные протоколы, которые можно использовать для получения модификаций, включают репарацию ошибочно спаренных оснований (Кгатег (1984) РоЛц МЛтаИЛ КераЛ СеЛ 38:879-887), мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефектной репарацией (СаЛет еί а1. (1985) 1тргсл'еЛ оЛдопис1еоЛЛе к11е-Л1гес1еЛ тШадепекЛ икшд М13 νесίο^к ΝιιΜ. Αс^Лк Кек. 13:4431-4443; апЛ СаЛет (1987) 1тргсхеЛ оЛдопиНеоЛЛе-ЛЛеНеЛ тШадепекЛ иктд М13 νесίο^к МеНоЛк ίη Εηζутοί. 154:382-403), делеционный мутагенез (ЕдИеЛатеаЛеЛ (1986) ике оГ оЛдопис1еоЛЛек ίο депегаЮ 1агде Ле1еЛопк Ыиск Αс^Лк Кек. 14:5115), рестрикцию с селекцией, и рестрикцию с селекцией и рестрикцию с исправлением ошибок (^еЛк еί а1. (1986) 'ЛтроПапсе оГ ЛуЛгодеп-ЬопЛ ГогтаЛоп ίη ^ΠΗζ^ Не (гапкШоп к1а1е оГ киЬЛЛкт РЛЛ. Тгапк. К. 8ос. ЬопЛ. Α 317:415-423), мутагенез посредством синтеза целого гена (ЫатЫаг еί а1. (1984)

- 34 029538

То1а1 8упбю818 апб с1отпд оГ а дспе собшд Гог 1йс пЬопис1са5С δ рго!сш Зоспсс 223:1299-1301; 8акатаг (1988) То!а1 8уп!йс818 апб схргс88юп оГ а дспе Гог 1Нс а-8иЪипй оГ Ъоуше гоб ои!сг 8сдтсп! диатпс пис1сойбс-Ыпбшд рго!сш (!гаи8бисш) №с1. Лс1б8 Кс8. 14:6361-6372; Ас118 с! а1. (1985) Са88еРс ти1адспс818: ап сГйсюп! тебюб Гог дспегайоп оГ ти1йр1с ти!айоп8 а! бейпсб 8Йс8 Оспе 34:315-323; апб Огипб8!гот с! а1. (1985) ОИдопис1со!1бе-бйес!сб ти!адспс818 Ъу тюго8са1с '8Йо!-дип' дспе 8уп1йс818 №с1. Лс1б8 Кс8. 13:3305-3316), репарацию двухцепоченых разрывав (Мапбсск1 (1986); Ато1б (1993) Рго!сш спд1пссгтд Гог ипи8иа1 спуйоптспД Сштеп! Оршюп ш Вю!ссйпо1оду 4:450-455. ОИдопис1со!1бс-бйсс!сб боиЪ1с8!гапб Ъгсак герай ш р1а8пиб8 оГ Е8сйсйсЫа сой: а тебюб Гог 8Йс-8рссШс ти!адспс818 Ргос. №·ι6. Асаб. δα. ГОА, 83:7177-7181). Дополнительные детали множества из приведенных выше способов можно найти в Мс!1об8 ш Еп/уто1оду Уо1итс 154, где также описаны приемлемые способы контроля устранения проблем повреждений при различных способах мутагенеза.

Протоколы, которые можно использовать для применения на практике, описаны, например, в патенте США № 5605793, выданном δίοι-υπα (25 февраля 1997 г.), Мсбюб8 Гог 1п Уйго КесотЫпайоп; в патенте США № 5811238, выданном δίοι-υπα с! а1. (22 сентября 1998 г.) Мсбюб8 Гог Оспегабпд Ро1упис1сойбс8 Наутд Ос81гсб СЬагас!сЙ8Йс8 Ъу Иегайус δс1ссйοη апб КесотЫпайоп; в патенте США № 5830721, выданном δΙαηιικΓ с! а1. (3 ноября 1998 г.), ΌΝΑ МЫадспс818 Ъу Капбот Ргадтсйайоп апб Кса88стЪ1у; в патенте США № 5834252, выданном δ!сттс^ с! а1. (10 ноября 1998 г.) Епб-Сотр1стсп1агу Ро1утсга8с Ксасйоп; в патенте США № 5837458, выданном Мш8Йи11 с! а1. (17 ноября 1998 г.), Мсбюб8 апб Сотро81Йоп8 Гог Сс11и1аг апб Мс!аЪойс Епд1пссгшд; АО 95/22625, δ!сттс^ и Статей, Ми!адспс818 Ъу Капбот Ргадтсп!айоп апб Кса88стЪ1у; АО 96/33207, δίοι-υπα и Ыр8с1ш1/ Епб Сотр1стсп!агу Ро1утсга8с Сйат Ксасйоп; АО 97/20078, δίοι-υπα и Статей Мс!йоб8 Гог Оспегайпд Ро1упис1сойбс8 йаушд Ос81гсб СЬагас!сЙ8Йс8 Ъу Иегайус δс1ссйοη апб КесотЫпайоп; АО 97/35966, Мт8Йи11 и δίοι-υπα. МсЫоб8 апб Сотро81Йоп8 Гог Сс11и1аг апб Мс1аЪойс Епд1пссйпд; АО 99/41402 Риппопсп с! а1., Тагдейпд оГ Оспейс Уассте Усс!ог8; АО 99/41383, Риппопсп с! а1., Апйдсп ЫЪгагу Пптит/абоп; АО 99/41369, Риппопсп с! а1., Оспейс Уассте Усс!ог Епд1пссйпд; АО 99/41368, Риппопсп с! а1. Орйт1/айоп оГ 1ттипотоби1а!огу Ргорсгйс8 оГ Оспейс Уассшс8; ЕР 752008, δίοι-υπα и Статей, ΌΝΑ МЫадспс818 Ъу Капбот Ргадтсп!айоп апб Кса88стЪ1у; ЕР 0932670, δ!сттс^ ЕуоМпд Сс11и1аг ΌΝΑ ир!акс Ъу КссшЫус 8ссщепсе КесотЫпайоп; АО 99/23107, δίοι-υπα с! а1., Мобтйсайоп оГ У1ги8 Тгор18т апб Но8! Капдс Ъу Уйа1 Оспотс ВЬиййпд; АО 99/21979, Ар! с! а1., Нитап Рарб1ота\аги8 Усс!ог8; АО 98/31837 бе1 Сагбаугс с! а1., Еуо1ийоп оГ А1о1с Сс118 апб Огдаш8т8 Ъу КссшЫус δαμιοι^ КесотЫпайоп; АО 98/27230, Ра!!сп и δίοι-υπα. Мс!йоб8 апб Сотро81Йоп8 Гог Ро1урсрйбс Епд1пссйпд; АО 98/27230, δίοι-υπα с! а1., Мс!йоб8 Гог Орбпн/абоп оГ Оспе Тйсгару Ъу КссшЫус δс^исηсс δ1ηιΙΤ1ίι^ апб δс1ссйοη, АО 00/00632, Мс!йоб8 Гог Оспегайпд ШдЫу О|усг8с ЫЪгаг1с8, АО 00/09679, Мс!йоб8 Гог ОЫаиипд ш Уйго КесотЫпсб Ро1упис1сойбс δс^исηсс Вапк8 апб Кс8и1йпд δαμιαι^. АО 98/42832, Ато1б с! а1., КесотЫпайоп оГ Ро1упис1еойбс δс^исηсс8 Щшд Капбот ог ЭсПпсб Рйтсге, АО 99/29902, Ато1б с! а1., МсЫоб Гог Сгсайпд Ро1упис1еойбс апб Ро1урсрйбс δαμιαι^. АО 98/41653, Утб, Ап ш Уйго Мс!1об Гог Соп8йисйоп оГ а ΩΝΛ ЫЪгагу, АО 98/41622, Вогсйсй с! а1., Мс!1об Гог Соп8йис!шд а ЫЪгагу Щшд ΩΝΛ δΙιτιΡйшд и АО 98/42727, Рай апб 2агйпд, 'Ъесщепсе А1!сгайоп8 И8шд Ното1одои8 КесотЫпайоп.

Протоколы, которые можно использовать для применения на практике (в которых представлены детали различных способов обеспечения разнообразия), описаны, например, в патентной заявке США с серийным № (υδδΝ) 09/407800, δϊ ЮТНЫС. ОР СО1)О\ АЬТЕКЕП ОЕ№^, Ра!!сп с! а1., поданной 28 сентября 1999 г.; ЕУО^υΤIОN ОР АНОЬЕ (ΉΙ,Ι,δ А\1) ОКОΑNIδМδ ΒΥ КЕСГОМУЕ δΙ+Η,ΤΛ'ίΤ: ^СОМВ^А^^', бе1 Сагбаугс с! а1., в патенте США № 6379964; С)1.1С.О\иС1.НОТЮН МЕП1АТЕП \Ч;С1.ЫС АСГО КЕСОМΒINΑΤIОN, Статей с! а1., в патентах США №№ 6319714; 6368861; 6376246; 6423542; 6426224 и РСТ/υδ 00/01203; ГОЕ ОР СО^ОN-УΑКIЕ^ ОЫСО\иСРНОТ1ОН δΥΝΊΉΒδΙδ РОК δΥNΤНЕΤIС δНυРР^INО, Ас1с1 с! а1., в патенте США № 6436675; МЕΤНО^δ РОК МАКШО СНАКАСТЕК δΤКINОδ, РО^ΥNυС^ЕОΤI^Еδ & РО^ΥРЕРΤI^Еδ НАУШО ΟΗδΙΗΗΙ) СНАКАСТЕКIδΤIСδ, δ^^Μν с! а1., поданной 18 января 2000 г., (РСТ/ГО00/01202) и, например, МЕΤНО^δ РОК МАКШО СНАКАСТЕК БТКШОБ, РО^ΥNυС^ЕОΤI^Еδ & РО^ΥРЕРΤI^Еδ НАУШО ΟΗδΙΗΗΙ) СНΑКΑСΤЕКIδΤIСδ, δ^ί^Μν с! а1., поданной 18 июля 2000 г. (серийный номер США № 09/618579); \1НТ1 Ю1Ы ОР РОРиЬАТШО ЭАТА ВТКиСТОКЕБ РОК ГОЕ ΙΝ ЕУО^υΤЮNΑКΥ δIМυ^ΑΤЮNδ, δ^^Μν и δίαιια. поданной 18 января 2000 г. (РСТ/υδ 00/01138); и δINО^Е-δΤКΑN^Е^ М;С1.ЫС АСГО ТЕМРЬАТЕ-МЕП1АТЕП КЕСОМΒINΑΤЮN А\1) ΜΧΊ,ΗΚ' АСГО РКАОМЕЭТ IδО^ΑΤЮN, АГГйоЙсг, поданной 6 сентября 2000 г. (серийный номер США № 09/656549); в патентах США №№ 6177263; 6153410.

Нестохастические способы, или направленные изменения, включают, например, мутагенез с насыщением сайтов гена (ОδδМ), синтетическую пересборку лигированием (+ЙР) или их сочетание, используют для модификации нуклеиновых кислот с новыми или измененными свойствами (например, активность в высококислых или щелочных условиях, при высоких и низких температурах и т.п.). Полипептиды, кодируемые модифицированными нуклеиновыми кислотами, можно подвергать скринингу на активность перед тестированием в отношении образования углерод-углеродной связи или расщепления или на другую активность. Можно использовать любые приемы или протоколы, например применение

- 35 029538 платформы капиллярной матрицы. См. патенты США №№ 6361974; 6280926; 5939250.

Мутагенез с насыщением сайтов гена или ΟδδΜ.

Праймеры с кодонами, содержащие вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, используют для внесения точечных мутаций в полинуклеотид, такой как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или антитело, так, чтобы получить ряд полипептидовпотомков, в которых представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен в каждом положении аминокислоты, таком как аминокислотный остаток в активном центре фермента или участке связывания лиганда, предназначенные для модификации. Эти олигонуклеотиды могут содержать последовательно расположенные первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т и необязательно вторую гомологичную последовательность. Последующие продукты трансляции-потомки, полученные в результате применения таких олигонуклеотидов, включают все возможные замены аминокислот в любом аминокислотном положении на протяжении полипептида вследствие того, что вырожденные последовательности Ν,Ν,Ο/Т включают кодоны для всех 20 аминокислот. Один такой вырожденный олигонуклеотид (состоящий, например, из одной вырожденной кассеты Ν,Ν,Ο/Т) можно использовать для того, чтобы подвергать каждый исходный кодон исходной полинуклеотидной матрицы полному диапазону замен кодонов. Возможно также использование по меньшей мере двух вырожденных кассет - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергать по меньшей мере два исходных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Например, может быть получено более одной последовательности Ν,Ν,Ο/Т в одном олигонуклеотиде для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. В этом множестве последовательностей Ν,Ν,Ο/Т могут быть расположены непосредственно рядом, или отделены одной или несколькими дополнительной нуклеотидной последовательностью(ями). Можно также использовать олигонуклеотиды, пригодные для внесения вставок или делеций, либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ο/Т, для внесения любого сочетания или перестановки аминокислотных вставок, делеций и/или замен.

Иногда одновременный мутагенез в двух или более соседних аминокислотных положениях проводят с использованием олигонуклеотида, который содержит расположенные последовательно триплеты Ν,Ν,Ο/Т, т.е. вырожденную последовательность (Ν^Ο/Οα Используют также менее вырожденные кассеты, чем последовательности Ν,Ν,Ο/Т. Например, в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, содержащей только один Ν, где указанный Ν может находиться в первом, втором или в третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета можно использовать любые другие основания, включая любые их сочетания или перестановки. Альтернативно в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотидах) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν.

Применение вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν,Ο/Т) обеспечивает систематическое и легкое получение полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) в любом аминокислотном положении в полипептиде (способы также включают проведение не всех возможных замен в положении аминокислотного остатка или кодона). Например, в случае полипептида из 100 аминокислот можно получить 2000 различных образцов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). При применении олигонуклеотида или набора олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν,Ο/Т, все 20 возможных природных аминокислот могут кодироваться 32 отдельными последовательностями. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают мутагенезу с насыщением, при применении по меньшей мере одного такого олигонуклеотида образуются 32 различных производных полинуклеотида, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, применение невырожденного олигонуклеотида в сайт-направленном мутагенезе приводит только к одному производному полипептидному продукту в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды необязательно можно использовать в сочетании с описанными вырожденными праймерами; например невырожденные олигонуклеотиды можно использовать для получения конкретных точечных мутаций в рассматриваемом полинуклеотиде. Это обеспечивает один из способов проведения конкретных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующему изменению аминокислоты, и точечных мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов, и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.

В каждом реакционном сосуде для мутагенеза с насыщением могут находиться полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул производных полипептидов (таких как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолазы ΗΜΟ и/или КΗΟ)), чтобы все 20 природных аминокислот были представлены в одном конкретном аминокислотном положении, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде (в другом случае используют менее чем все 20 природных сочетаний). 32-Кратновырожденные производные полипептиды, полученные из каждого реакционного сосуда после мутагенеза с насыщением, можно подвергать клональной амплификации (например, их можно клонировать в пригодном хозяине, таком как хозяин Е. соН, с использованием, например, экспрессирующего вектора), и их можно подвергать анализу экспрессии. Когда посредством скринига идентифицируют, что отдельный производный полипептид проявляет благоприятные измене- 36 029538 ния свойств (по сравнению с исходным полипептидом, например, повышение активности образования углерод-углеродной связи или расщепления в щелочных или кислых условиях), его можно секвенировать в целях идентификации соответствующей благоприятной аминокислотной замены, находящейся в нем.

При внесении мутации в любое аминокислотное положение исходного полипептида с использованием мутагенеза с насыщением благоприятные изменения аминокислот можно идентифицировать более чем в одном аминокислотном положении. Можно получить одну или несколько новых производных молекул, которые содержат сочетание всех или части из этих благоприятных аминокислотных замен. Например, если в каждом из трех 3 аминокислотных положений в полипептиде идентифицировано 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой, и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, существует всего 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7 из них, которые были рассмотрены ранее - 6 единичных точечных мутаций (т. е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.

Мутагенез с насыщением сайта можно использовать совместно с перетасовкой, химеризацией, рекомбинацией и другими процессами внесения мутаций, совместно со скринингом. В иллюстративном примере многократное применение любого процесса(ов) внесения мутаций используют в сочетании со скринингом.

Итак праймеры с кодонами (содержащих вырожденные последовательности Ν,Ν,Ν) можно применять для внесения точечных мутаций в полинуклеотид, чтобы получать ряд производных полипептидов, в которых в любом положении аминокислоты представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен (мутагенез с насыщением сайтов гена (ΟδδΜ)). Используемые олигонуклеотиды состоят из расположенных последовательно первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности Ν,Ν,Ν и необязательно из второй гомологичной последовательности. Последующие производные продукты трансляции при применении таких олигонуклеотидов включают все возможные аминокислотные замены в любом аминокислотном положении на протяжении полипептида, вследствие того, что вырожденная последовательность Ν,Ν,Ν включает кодоны для всех 20 аминокислот.

Один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий одну вырожденную кассету Ν,Ν,Ν) используют для того, чтобы подвергать любой исходный кодон в родительской полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Также используют по меньшей мере две вырожденных кассеты Ν,Ν,Ν - либо в одном олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергать по меньшей мере два исходных кодона в родительской полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Таким образом, в одном олигонуклеотиде могут находиться более одной последовательности Ν,Ν,Ν для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. Это множество последовательностей Ν,Ν,Ν может быть расположено непосредственно последовательно, или они разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. Олигонуклеотиды, пригодные для внесения вставок или делеций, можно использовать либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ν, для внесения любого сочетания или перестановки аминокислотных вставок, делеций и/или замен.

Возможно также одновременное внесение мутаций в два или более соседних аминокислотных положений с использованием олигонуклеотида, который содержит последовательно расположенные триплеты Ν,Ν,Ν, т.е. вырожденную последовательность (Ν,Ν,Ν)_Π. Вырожденные кассеты, обладающие меньшей вырожденностью, чем последовательности Ν,Ν,Ν применяются также. Например, в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, содержащей только один Ν, где Ν может находиться в первом, втором или третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета можно использовать любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки. Альтернативно в некоторых случаях желательно применение (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν, триплетных последовательностей Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν,Ο/С.

Применение вырожденного триплета (такого как триплетная последовательность Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν,Ο/С) обладает преимуществом по нескольким причинам, в способах систематического и довольно простого проведения замены в любом аминокислотном положении в полипептиде полным диапазоном возможных аминокислот (всего 20 аминокислот). Таким образом, в случае полипептида из 100 аминокислот применим способ систематического и довольно простого получения 2000 различных видов (т.е. 20 возможных аминокислотных перестановок на одно положение в 100 аминокислотных положениях). Понятно, что при применении олигонуклеотида, содержащего вырожденную триплетную последовательность Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν,Ο/С, получают 32 отдельных последовательности, которые кодируют 20 возможных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают мутагенезу с насыщением, при применении одного такого олигонуклеотида образуется 32 различных производных полинуклеотида, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида при сайт-направленном мутагенезе приводит только к одному производному полипептидному продукту в реакционном сосуде.

Невырожденные олигонуклеотиды необязательно можно использовать в сочетании с описанными

- 37 029538 вырожденными праймерами. Понятно, что для внесения конкретной точечной мутации в рассматриваемый полинуклеотид в некоторых случаях предпочтительно применение невырожденных олигонуклеотидов. Это обеспечивает внесение конкретных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точечных мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов, и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.

Таким образом, каждый реакционный сосуд для мутагенеза с насыщением содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 производных полипептидных молекул, чтобы все 20 аминокислот были представлены в одном конкретном аминокислотном положении, соответствующем положению кодона, в который в исходном полинуклеотиде внесена мутация. 32-Кратновырожденные производные полипептиды, образующиеся при каждой реакции мутагенеза с насыщением, можно подвергать клональной амплификации (например, их можно клонировать в пригодном хозяине Е. соН с использованием экспрессирующего вектора) и их можно подвергать скринингу экспрессии. Когда посредством скрининга идентифицируют, что отдельный производный полипептид проявляет благоприятное изменение свойства (при сравнении с исходным полипептидом), его можно секвенировать для идентификации соответствующей благоприятной аминокислотной замены, находящейся в нем.

При внесении мутации в любое аминокислотное положение родительского полипептида с использованием мутагенеза с насыщением, благоприятные изменения аминокислот могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Можно получить одну или несколько новых производных молекул, которые содержат сочетание всех или части из этих благоприятных аминокислотных замен. Например, если в каждом из трех 3 аминокислотных положений в полипептиде идентифицировано 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой и в каждом из двух положений) и 3 положения. Таким образом, существует всего 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7 из них, которые были ранее рассмотрены - 6 единичных точечных мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.

Таким образом, в иллюстративном примере применяется мутагенез с насыщением в сочетании с дополнительным процессом внесения мутаций, таким как процесс, где два или более сходных полинуклеотида вводят в пригодную клетку-хозяина, так что при рекомбинации и редуктивной пересборке образуется гибридный полинуклеотид.

В дополнение к проведению мутагенеза на протяжении всей последовательности гена, мутагенез можно использовать для замены каждого из любого количества оснований в полинуклеотидной последовательности, где количество оснований, подлежащих внесению мутаций, представляет собой любое число от 15 до 100000. Таким образом, вместо внесения мутаций в каждое положение на протяжении молекулы, можно подвергать мутагенезу любое основание или отдельное количество оснований (в некоторых вариантах осуществления подгруппы, вмещающей от 15 до 100000). Для внесения мутации в каждое положение или в группу положений на протяжении полинуклеотидной последовательности используют отдельный нуклеотид. Группа из 3 положений, подлежащих внесению мутаций, может представлять собой кодон. Мутации можно вносить с использованием мутагенного праймера, содержащего гетерологичную кассету, который также называется мутагенной кассетой. Иллюстративные кассеты могут иметь от 1 до 500 оснований. Каждое нуклеотидное положение в таких гетерологичных кассетах представляет собой Ν, А, С, С, Т, А/С, А/С, А/Т, С/С, С/Т, С/Т, С/С/Т, А/С/Т, А/С/Т, А/С/С или Е, где Е представляет собой любое основание, которое не является А, С, С или Т (Е может быть назван олигонуклеотидом разработчика).

Мутагенез с насыщением включает внесение мутации в полный набор мутагенных кассет (где длина каждой кассеты составляет приблизительно 1-500 оснований) в определенной полинуклеотидной последовательности, подлежащей внесению мутаций (где длина последовательности, подлежащей внесению мутаций, составляет приблизительно от 15 до 100000 оснований). Таким образом, в каждую кассету для внесения мутаций вносят набор мутаций (находящихся в диапазоне от 1 до 100 мутаций). Набор мутаций, подлежащих внесению в одну кассету, может отличаться от второго набора мутаций, которые вносят во вторую кассету в процессе выполнения одного цикла мутагенеза с насыщением, или может быть одинаковым с ним. Примерами таких наборов являются наборы с делециями, вставками, наборами конкретных кодонов и наборы кассет конкретных нуклеотидов.

Определенные последовательности, подлежащие внесению мутаций, включают целый ген, каскад, кДНК, целую открытую рамку считывания (ОКЕ) и целый промотор, энхансер, репрессор/трансактиватор, точку начала репликации, интрон, оператор или любую функциональную группу полинуклеотида. Как правило, определенные последовательности для этих целей могут представлять собой любой полинуклеотид, который представляет собой полинуклеотидную последовательность из 15 оснований и полинуклеотидные последовательности длиной между 15 основаниями и 15000 оснований. Принципы выбора наборов кодонов учитывают типы аминокислот, кодируемых вырожденной мутагенной кассетой.

Синтетическая пересборка лигированием (8ЬК).

8ЬК представляет собой способ нестохастического лигирования олигонуклеотидных фрагментов

- 38 029538 друг с другом. Этот способ отличается от стохастической перетасовки олигонуклеотидов тем. что структурные блоки нуклеиновой кислоты перемещают. соединяют или химеризуют не случайным образом. а предпочтительно собирают нестохастически. См. патенты США №№ 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776. 8ЬК включает следующие стадии: (а) предоставление матричного полинуклеотида. где матричный полинуклеотид содержит последовательность. кодируемую гомологичным геном; (Ь) предоставление множества полинуклеотидных структурных блоков. где полинуклеотидные структурные блоки сконструированы для перекрестной пересборки с матричным полинуклеотидом в определенной последовательности. и полинуклеотидный структурный блок содержит последовательность. которая представляет собой вариант гомологичного гена и последовательность. гомологичную матричному полинуклеотиду. фланкирующую последовательность варианта; (с) объединение полинуклеотидного структурного блока с матричным полинуклеотидом. чтобы полинуклеотид структурного блока подвергался перекрестной пересборке с матричным полинуклеотидом. с образованием полинуклеотидов. содержащих варианты последовательностей гомологичного гена.

8ЬК не зависит от наличия высокого уровня гомологии между подлежащими реаранжировке полинуклеотидами. Таким образом. этот способ можно использовать для нестохастического создания библиотек (или наборов) производных молекул. содержащих более 10¹⁰⁰ различных химер. 8ЬК можно использовать для создания библиотек. содержащих более 10¹⁰⁰⁰ различных производных химер. Таким образом. нестохастические способы получения набора окончательных химерных молекул нуклеиновых кислот включают конечный порядок сборки. который выбран при разработке. Этот способ включает стадии проведения разработки множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот с пригодными взаимно совместимыми лигируемыми концами. и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот. чтобы полностью достигать запланированного порядка сборки.

Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот. предназначенных для сборки. рассматривают как пригодные для этого типа упорядоченной сборки. если они способны соединять структурные блоки в предопределенном порядке. Таким образом. весь порядок сборки. в котором можно соединять структурные блоки нуклеиновых кислот. определяется конструкцией лигируемых концов. Если применяют более одной стадии сборки. тогда весь порядок сборки. в котором могут соединяться структурные блоки нуклеиновых кислот. также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. Для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов соединенные структурные фрагменты обрабатывают ферментом. таким как лигаза (например. ДНК-лигаза Т4).

Конструкцию олигонуклеотидных структурных блоков получают с помощью анализа набора матриц с исходной последовательностью нуклеиновой кислоты. которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов. Эти исходные олигонуклеотидные матрицы. таким образом. служат в качестве источника информации о последовательности. которая облегчает конструирование структурных блоков нуклеиновых кислот. которые подлежат мутагенезу. например химеризации или перетасовке. Последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот выравнивают. в целях выбрать одну или несколько пограничных точек. Пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии. и они содержат один или несколько нуклеотидов. Эти пограничные точки являются общими по меньшей мере для двух исходных матриц. Таким образом. пограничные точки могут использоваться для обозначения границ в олигонуклеотидных структурных блоках. подлежащих получению для перегруппировки исходных полинуклеотидов. Пограничные точки. идентифицированные и выбранные в исходных молекулах. служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке конечных производных химерных молекул. Пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание). общую по меньшей мере для двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Альтернативно пограничная точка может представлять собой область гомологии. которая является общей по меньшей мере для половины исходных полинуклеотидных последовательностей. или она может представлять собой область гомологии. которая является общей по меньшей мере для двух третей исходных полинуклеотидных последовательностей. Более того. пригодные пограничные точки представляют собой область гомологии. которая является общей по меньшей мере для трех четвертей полинуклеотидных последовательностей. или она может быть общей почти для всех исходных полинуклеотидных последовательностей. Пограничная точка может представлять собой область гомологии. которая является общей для всех исходных полинуклеотидных последовательностей.

Иногда проводят исчерпывающий процесс пересборки лигированием в целях получения полной библиотеки производных химерных полинуклеотидов. Другими словами. все возможные упорядоченные сочетания структурных блоков нуклеиновых кислот предоставляют в наборе конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время. порядок сборки (т.е. порядок присоединения каждого структурного блока от 5'- к 3'-концу в последовательности каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании является запланированным (или нестохастическим). Вследствие нестохастического характера вероятность нежелательных побочных продуктов значительно снижается.

Способ пересборки лигированием можно проводить систематически. Например. способ проводят в целях получения систематически разделенную библиотеку производных молекул. с отделами. которые

- 39 029538 можно подвергать систематическому скринингу, например, друг за другом. Другими словами, чтобы посредством селективного и целесообразного применения структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном использовании последовательных постадийных реакций сборки, могла быть достигнута схема опыта, где в каждом из нескольких реакционных сосудов получают конкретный набор производных продуктов. Это дает возможность систематического проведения процесса исследования и скрининга. Таким образом, эти способы дают возможность систематического исследования потенциально очень большого количества производных молекул в меньших группах. Вследствие возможности осуществлять химеризацию способом, который является универсальным и в то же время также исчерпывающим и систематическим, особенно в случае низкого уровня гомологии среди исходных молекул, эти способы обеспечивают создание библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы пересборки лигированием, производные молекулы включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот, обладающих, в целом, таким порядком сборки, который выбран при разработке. Способы мутагенеза с насыщением и оптимизированного направленного изменения также можно использовать для получения различных типов производных молекул. Понятно, что это предусматривает свободу выбора и контроля в отношении пограничных точек, размера и количества структурных блоков нуклеиновых кислот и размера и конструкции соединенных элементов. Более того, понятно, что требование наличия межмолекулярной гомологии является очень нестрогим. Более того, пограничные точки можно выбирать даже в областях небольшой межмолекулярной гомологии и при ее отсутствии. Например, вследствие качания кодонов, т.е. вырожденности кодонов, в структурный блок нуклеиновой кислоты можно вносить нуклеотидные замены без изменения аминокислоты, которую изначально кодирует соответствующая исходная матрица. Альтернативно кодон может быть изменен, чтобы изменялся код исходной аминокислоты. Такие замены можно вносить в структурный блок нуклеиновой кислоты в целях повышения частоты межмолекулярных гомологичных пограничных точек и, таким образом, для возможности достижения повышения количества соединений между структурными блоками, что, в свою очередь, позволяет создать большее количество производных химерных молекул.

Синтетическая пересборка генов.

Нестохастический способ, называемый синтетической пересборкой гена, является сходным со стохастической перетасовкой, за исключением того, что перетасовка, соединение или химеризация структурных блоков нуклеиновых кислот происходит не случайным образом, а предпочтительно они собираются нестохастически. См. патент США № 6537776.

Способ синтетической пересборки гена не зависит от наличия высокого уровня гомологии между полинуклеотидами, подлежащими перетасовке. Его можно использовать для нестохастического получения библиотек (или наборов) производных молекул, содержащих свыше 10¹⁰⁰ различных химер. Предположительно синтетическую пересборку гена можно использовать даже для получения библиотек, содержащих свыше 10¹⁰⁰⁰ различных производных химер.

Таким образом, нестохастический способ получения набора конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с итоговым порядком сборки, который выбран при разработке, включает стадии получения в соответствии с разработкой множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, обладающих пригодными взаимно совместимыми лигируемыми концами, и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот, чтобы был полностью достигнут запланированный порядок сборки.

Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот, подлежащих сборке, рассматривают как пригодные для этого типа упорядоченной сборки, если они способны соединять структурные блоки в определенном порядке. Таким образом, итоговый порядок сборки, в котором могут быть соединены структурные блоки нуклеиновых кислот, определяется конструкцией лигируемых концов, и если используют более одной стадии сборки, тогда итоговый порядок сборки, в котором могут быть соединены структурные блоки нуклеиновых кислот, также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. Для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов соединенные структурные фрагменты обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНКлигаза Т4).

Конструкцию структурных блоков нуклеиновых кислот также получают с помощью анализа последовательностей набора матриц исходных нуклеиновых кислот, которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов Таким образом, эти исходные матрицы нуклеиновых кислот, служат в качестве источника информации о последовательности, которая облегчает разработку структурных блоков нуклеиновых кислот, которые подлежат внесению мутаций, например, химеризации или перетасовке.

В один из иллюстративных примеров относится к химеризации семейства родственных генов и кодируемого ими семейства сходных продуктов. В конкретном иллюстративном примере кодируемые продукты представляют собой ферменты. Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, которые можно подвергать мутагенезу способами, описанными выше.

Таким образом, последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот (например, полинуклеотидов по этому изобретению) выравнивают в целях выбора одной или нескольких погранич- 40 029538 ных точек, где пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии. Пограничные точки можно использовать для обозначения границ в подлежащих созданию структурных блоках нуклеиновых кислот. Таким образом, пограничные точки, идентифицированные и выбранные в исходных молекулах, при сборке производных молекул служат в качестве потенциальных точек химеризации.

Пригодная пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание), общую по меньшей мере для двух исходных матриц, однако пограничная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины исходных матриц, по меньшей мере для двух третей исходных матриц, по меньшей мере для трех четвертей исходных матриц и, в некоторых вариантах осуществления, почти для всех исходных матриц. Более того, пригодные пограничные точки иногда представляют собой область гомологии, которая является общей для всех исходных матриц.

Все возможные упорядоченные сочетания структурных блоков нуклеиновых кислот предоставляют в наборе конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, порядок сборки (т.е. порядок присоединения каждого структурного блока от 5'- к 3'-концу последовательности каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании является запланированным (или нестохастическим). Вследствие нестохастической природы способа, вероятность нежелательных побочных продуктов значительно снижается.

Способ может предусматривать систематическое проведение пересборки лигированием, например, для получения систематически разделенной библиотеки с отделами, которые можно подвергать систематическому скринингу, например, друг за другом. Другими словами, посредством селективного и целесообразного использования конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном использовании последовательных постадийных реакций сборки, могла быть достигнута схема опыта, где в каждом из нескольких реакционных сосудов получают конкретный набор производных продуктов. Это дает возможность проведения систематического процесса исследования и скрининга. Таким образом, это дает возможность систематического исследования потенциально очень большого количества производных молекул в меньших группах.

Вследствие возможности проведения химеризации таким способом, который является универсальным и в то же время также исчерпывающим и систематическим, особенно в случае низкого уровня гомологии среди исходных молекул, предусмотрено получение библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы пересборки лигированием, производные молекулы включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с таким порядком сборки, в целом, который выбран при разработке. Такая библиотека содержит от более 10³ до более 10¹⁰⁰⁰ различных типов производных молекул.

Набор конечных химерных молекул нуклеиновых кислот, полученных, как описано, содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид. Этот полинуклеотид может представлять собой ген, который может представлять собой искусственный ген или же этот полинуклеотид представляет собой каскад генов, который может представлять собой искусственный каскад генов. Один или несколько искусственных генов могут быть включены в искусственный каскад генов, такой как каскад, функционирующий в эукариотическом организме (включая растения).

В иллюстративном примере синтетический характер стадии, на которой образуются структурные блоки, дает возможность разработки и встраивания нуклеотидов (например, одного или нескольких нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны или интроны, или регуляторные последовательности), которые впоследствии необязательно могут быть удалены в процессе ίη νίίτο (например, посредством мутагенеза) или в процессе ίη νίνο (например, с использованием способности к сплайсингу генов в организме хозяина). Понятно, что во многих случаях встраивание этих нуклеотидов также может быть желательным по многим другим причинам, в дополнение к потенциальному преимуществу получения подходящей пограничной точки.

Таким образом, структурные блоки нуклеиновых кислот можно использовать для встраивания интрона. Таким образом, в искусственный ген можно встраивать функциональные интроны. Также функциональные интроны можно встраивать в искусственный каскад генов.

Встроенный интрон(ы) иногда является функциональным в одной или нескольких клетках-хозяевах в отношении сплайсинга гена, подобно тому, как природные интроны функционально служат для сплайсинга генов.

Искусственный ген также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. Аналогично искусственный каскад генов также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. Иногда рекомбинацию облегчают с помощью участков гомологии между искусственным содержащим интрон геном и нуклеиновой кислотой, которая служит в качестве партнера по рекомбинации, или рекомбинация происходит в них. Партнер по рекомбинации также может представлять собой нуклеиновую кислоту, включая искусственный ген или каскад генов. Рекомбинацию можно облегчать с помощью областей гомологии, которые находятся в одном (или нескольких) искусственно встроенном интроне(ах) в искусственном гене, или рекомбинация может происходить в них.

- 41 029538

В способе синтетической повторной сборки гена используют множество структурных блоков нуклеиновых кислот, каждый из которых обладает двумя лигируемыми концами. Два лигируемых конца на каждом структурном блоке нуклеиновых кислот могут представлять собой два тупых конца (т.е. на каждом выступает ноль нуклеотидов) или один тупой и один выступающий концы или более того два выступающих конца. Пригодный выступающий конец для этих целей может представлять собой 3'выступающий конец или 5'-выступающий конец. Таким образом, структурный блок нуклеиновой кислоты может обладать 3'-выступающим концом, или альтернативно 5'-выступающим концом, или альтернативно двумя 3'-выступающими концами, или альтернативно двумя 5-выступающими концами. Общий порядок, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот собираются с получением конечной химерной молекулы нуклеиновой кислоты, определяется предварительным экспериментальным планом и не является случайным.

Структурный блок нуклеиновой кислоты получают химическим синтезом двух одноцепочечных нуклеиновых кислот (также называемых одноцепочечными олигонуклеотидами) и контактированием их, чтобы дать им возможность соединиться с образованием двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты. Размер двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты может быть различным. Размеры этих структурных блоков могут быть небольшими или большими. Иллюстративные размеры структурных блоков находятся в диапазоне от 1 пары оснований (не включая какие-либо выступы) до 100000 пар оснований (не включая какие-либо выступы). Также предусмотрены другие иллюстративные диапазоны размеров, которые обладают нижними границами от 1 до 10000 п.о. (включая любое числовое значение между ними) и верхними границами от 2 до 100000 п.о. (включая любое числовое значение между ними).

Существует множество способов, которыми может быть получен двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты, и они известны в данной области, их может легко провести специалист в данной области. Двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты также получают посредством первоначального образования двух одноцепочечных нуклеиновых кислот и обеспечения их соединения с образованием двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты. Две цепи двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты могут быть комплементарными по каждому нуклеотиду, за исключением любых нуклеотидов, которые образуют выступ; таким образом, они не имеют неправильно спаренных оснований, за исключением какого-либо выступа(ов). Две цепи двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты могут быть комплементарными менее чем по каждому нуклеотиду, помимо любых нуклеотидов, которые образуют выступ. Таким образом, в соответствии с этим, двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты можно использовать для внесения вырожденности кодонов. Вырожденность кодонов вносят с использованием мутагенеза с насыщением сайта, описанного в настоящем документе, применяя одну или несколько кассет Ν,Ν,β/Τ или альтернативно применяя одну или несколько кассет Ν,Ν,Ν.

Способ рекомбинации ш νί\Ό может быть выполнен вслепую на совокупности неизвестных гибридов или аллелей конкретного полинуклеотида или последовательности. Однако не является необходимым знание истинной ДНК или РНК конкретного полинуклеотида. Подход с использованием рекомбинации в смешанной совокупности генов может быть пригоден для получения любых пригодных белков, например, альдолазы. Этот подход можно использовать для получения белков с измененной специфичностью или активностью. Также этот может быть пригодным для получения гибридных последовательностей нуклеиновых кислот, например, последовательностей промоторных участков, интронов, экзонов, энхансеров, 3'-нетранслируемых областей или 5'-нетранслируемых областей генов. Таким образом, этот подход можно использовать для получения генов с повышенным уровнем экспрессии. Также этот подход может быть пригодным для исследования повторяющихся последовательностей ДНК. В заключение, этот подход может быть пригодным для внесения мутаций в рибозимы или аптамеры.

Оптимизированная система направленных изменений.

Оптимизированные направленные изменения позволяют получить большую совокупность измененных химерных последовательностей, где полученная совокупность значительно обогащена последовательностями, которые обладают определенным количеством точек кроссинговера. Точка кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка в норме находится на стыке, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единой последовательности. Этот способ позволяет вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей, чтобы конечная химерная группа последовательностей была обогащена на выбранное количество точек кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль над выбором химерных вариантов, обладающих предопределенным количеством точек кроссинговера.

Кроме того, этот способ относится к удобным способам исследования огромного количества возможных вариантов из диапазона белков по сравнению с другими системами. Ранее, если в процессе реакции образовывалось, например, 10¹³ химерных молекул, было чрезвычайно сложно тестировать такое большое количество химерных вариантов в отношении наличия конкретной активности. Более того, значительная часть совокупности производных обладает очень большим количеством точек кроссинговера,

- 42 029538 что приводит к белкам, которые с меньшей вероятностью обладают повышенным уровнем конкретной активности. При применении этих способов в совокупности химерных молекул можно увеличить долю таких вариантов, которые обладают конкретным количеством точек кроссинговера. Таким образом, несмотря на то, что в процессе реакции по-прежнему образуется 10¹³ химерных молекул, каждая из молекул, выбранных для дальнейшего анализа, с большей вероятностью будет обладать, например, только тремя точками кроссинговера. Вследствие того, что получающаяся в результате совокупность производных может быть изменена так, чтобы она обладала определенным количеством точек кроссинговера, границы функционального разнообразия среди химерных молекул уменьшаются. Это обеспечивает более контролируемое количество переменных при вычислении того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.

Один из способов получения химерной производной полинуклеотидной последовательности представляет собой создание олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. Причем каждый олигонуклеотид включает уникальный участок перекрывания, так что смешивание вместе олигонуклеотидов приводит к новому варианту, который обладает всеми олигонуклеотидными фрагментами, собранными в правильном порядке. Дополнительную информацию также можно найти, например, в патентах США №№ 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776; 6361974.

Количество олигонуклеотидов, полученных для каждого исходного варианта, соответствует суммарному количеству произошедших кроссинговеров в химерной молекуле, которая в итоге образуется. Например, в целях поиска химерного варианта, например, с более высокой активностью при высокой температуре, для проведения реакции лигирования могут быть предоставлены три исходных варианта нуклеотидных последовательностей. В качестве одного примера можно получить набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих любым участкам каждого исходного варианта. Таким образом, в процессе пересборки лигированием в каждой химерной последовательности может быть вплоть до 50 точек кроссинговера. Вероятность того, что каждый из полученных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого исходного варианта в альтернативном порядке, очень низка. Если каждый олигонуклеотидный фрагмент представлен в реакции лигирования в одном молярном количестве, тогда вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же исходного полинуклеотида будут лигироваться друг с другом и, таким образом, не приведут к точке кроссинговера. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждой исходной молекулы остается постоянной в процессе любой стадии лигирования в этом примере, тогда существует вероятность 1/3 (в случае 3 источников), что олигонуклеотид из того же исходного варианта будет лигироваться в химерную последовательность и не приведет к кроссинговеру.

Таким образом, можно определять плотность распределения вероятностей (РОР) для предсказания совокупности точек кроссинговера, которые, вероятно, возникнут в процессе каждой стадии реакции лигирования, с учетом количества исходных вариантов в наборе, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентраций каждого варианта в процессе каждой стадии реакции лигирования. Статистические и математические способы, помимо определения РОР, описаны ниже. Используя эти способы, можно вычислять такую плотность распределения вероятностей, и, таким образом, обогащать группу химерных производных предопределенным количеством точек кроссинговера, получаемых в результате конкретной реакции лигирования. Более того, планируемое количество точек кроссинговера может быть предопределенным, и затем систему программируют для вычисления исходных количеств каждого исходного олигонуклеотида в процессе каждой стадии реакции лигирования, с получением в результате плотности распределения вероятностей, которая зависит от предопределенного количества точек кроссинговера. Эти способы направлены на применение повторяющихся циклов редуктивной пересборки, рекомбинации и селекции, которые обеспечивают направленные молекулярные изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, посредством рекомбинации. Эта система позволяет получать большую совокупность измененных химерных последовательностей, где полученная совокупность значительно обогащена последовательностями, которые обладают предопределенным количеством точек кроссинговера. Точка кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка в норме находится в точке соединения, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единичной последовательности. Способ позволяет вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей, так что конечная химерная совокупность последовательностей обогащена выбранным количеством точек кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль выбора химерных вариантов с предопределенным количеством точек кроссинговера.

Кроме того, эти способы относятся к удобным способам для исследования огромного количества возможных вариантов в диапазоне белков по сравнению с другими системами. Используя эти способы, в совокупности химерных молекул можно увеличивать долю такими вариантами, которые обладают конкретным количеством точек кроссинговера. Таким образом, несмотря на то, что в процессе реакции попрежнему может образоваться 10¹³ химерных молекул, каждая из молекул, выбранная для дальнейшего

- 43 029538 анализа, с наибольшей вероятностью, будет обладать, например, только тремя точками кроссинговера. Вследствие того, что получающуюся в результате совокупности производных можно изменять, для того чтобы обладать предопределенным количеством точек кроссинговера, границы функционального множества среди химерных молекул уменьшаются. Это обеспечивает более контролируемое количество переменных при вычислении того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.

Часто способ приводит к производной химерной полинуклеотидной последовательности посредством получения олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. Кроме того, каждый олигонуклеотид включает уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к новому варианту, в котором каждый олигонуклеотидный фрагмент присоединен в правильном порядке. См. также патенты США №№ 6773900; 6740506; 6713282;6635449;6605449;6537776;6361974.

Определение точек кроссинговера.

Система и программное обеспечение включают в качестве исходных данных требуемую плотность распределения вероятностей (РЭЕ) кроссинговера, количество исходных генов, подлежащих пересборке, и количество фрагментов при пересборке. Выходные данные этой программы представляют собой фрагментную РОЕ, которую можно использовать для определения способа получения подвергнутых пересборке генов, и оцененную РОЕ кроссинговера этих генов. Обработку проводят в МАТЬАВ™ (ТЬе МаШетогкк, №йск, МаккасЬикейк), языке программирования и средстве проектирования для технической обработки данных.

Повторяющиеся процессы.

Процессы можно многократно повторять, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую измененный или новый фенотип фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, идентифицируют, повторно выделяют (например, с использованием нуклеиновой кислоты), вновь модифицируют, повторно тестируют в отношении активности. Этот процесс можно многократно повторять до тех пор, пока не будет сконструирован требуемый фенотип. Например, в клетку способами инженерии может быть внедрен целый биохимический анаболический или катаболический путь, включая, например, активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО.

Аналогично, если определено, что конкретный олигонуклеотид совсем не влияет на требуемое свойство (такое как новый фенотип фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО), тогда его можно удалять в качестве непостоянного признака при синтезе более крупных исходных олигонуклеотидов, которые включают подлежащую удалению последовательность. Поскольку встраивание последовательности в более крупную последовательность препятствует какимлибо процессам кроссинговера, то в производных полинуклеотидах не будет существовать каких-либо вариантов этих последовательностей. Эта повторяющаяся практика определения того, какие олигонуклеотиды более всего соответствуют требуемому свойству и какие не соответствуют, дает возможность более эффективного исследования всех возможных вариантов белков, которые могут обеспечивать конкретное свойство или активность.

Перетасовка ш νί\Ό.

Перетасовку ш νί\Ό можно проводить с использованием природного свойства клеток осуществлять рекомбинацию мультимеров. Несмотря на то, что рекомбинация ш νί\Ό обеспечила главный природный путь молекулярного разнообразия, генетическая рекомбинация остается относительно сложным процессом, который включает: 1) распознавание гомологии; 2) расщепление цепи, вытеснение цепи и метаболические стадии, приводящие к продукции рекомбинантной хиазмы; и, наконец, 3) разрешение хиазмы на отдельные рекомбинированные молекулы. Для формирования хиазмы необходимо распознавание гомологичных последовательностей.

Гибридный полинуклеотид получают посредством введения, по меньшей мере, первого полинуклеотида и второго полинуклеотида (например, один или оба из них представляют собой последовательность, кодирующую фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО по этому изобретению), которые обладают по меньшей мере одним общим участком частичной гомологии последовательностей, в пригодную клетку-хозяина. Участки частичной гомологии последовательностей обеспечивают процессы, которые приводят к реорганизации последовательностей с образованием гибридного полинуклеотида. Как используют в настоящем документе, термин гибридный полинуклеотид представляет собой любую нуклеотидную последовательность, которая содержит последовательность по меньшей мере из двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут быть результатом процессов межмолекулярной рекомбинации, которые обеспечивают интеграцию последовательности между молекулами ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут образовываться вследствие процессов внутримолекулярных редуктивных пересборок, в которых используются повторяющиеся последовательности для изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК.

Пересборка ш у!уо направлена на межмолекулярные процессы, в совокупности называемые ре- 44 029538 комбинацией, которые в бактериях, как правило, рассматривают как КесА-зависимый феномен. Итак, процессы рекомбинации в клетке-хозяине осуществляют для рекомбинации и пересборки последовательностей. Это основано но способности клеток опосредовать редуктивные процессы для снижения комплексности псевдо-повторяющихся последовательностей в клетке посредством делеции. Процесс редуктивной пересборки осуществляется посредством внутримолекулярного КесА-независимого процесса.

Новые полинуклеотиды можно получать посредством процесса редуктивной пересборки. Способ включает получение конструкций, содержащих последовательно расположенные последовательности (исходные кодирующие последовательности), их встраивание в соответствующий вектор и последующее их введение в соответствующую клетку-хозяина. Пересборка отдельных молекулярных элементов происходит посредством комбинаторных процессов между последовательно расположенными последовательностями в конструкции, обладающими участками гомологии, или между псевдо-повторяющимися единицами. В процессе пересборки происходит рекомбинация и/или снижение комплексности и протяженности повторяющихся последовательностей, и она приводит к получению новых типов молекул. Для повышения скорости рекомбинации можно применять различные способы обработки. Они могут включать обработку ультрафиолетовым светом или повреждающими ДНК химическими веществами, и/или применение линий клеток-хозяев, проявляющих повышенные уровни генетической нестабильности. Таким образом, процесс пересборки может вовлекать гомологичную рекомбинацию или природное свойство псевдо-повторяющихся последовательностей направлять свои собственные изменения.

Повторяющиеся или псевдоповторяющиеся последовательности участвуют в генетической нестабильности. Псевдоповторы представляют собой повторы, которые не ограничиваются структурой их исходного элемента. Псевдоповторяющиеся элементы могут быть представлены в виде набора последовательностей в конструкции; последовательно расположенных элементов сходных последовательностей. После лигирования участки соединения между последовательно расположенными последовательностями становятся, по существу, неразличимыми, и после этого псевдоповторяющийся характер конечной конструкции становится постоянным на молекулярном уровне. Процесс делеции в клетки, который происходит в целях снижения комплексности полученной конструкции, происходит между псевдоповторяющимися последовательностями. Псевдоповторяющиеся элементы обеспечивают практически безграничный набор матриц, с помощью которых могут происходить случаи перемещения. Конструкции, содержащие псевдоповторы, таким образом, эффективно обеспечивают достаточную молекулярную гибкость, при которой процессы делеций (и, возможно, вставок) могут происходить по существу в любой области в пределах псевдоповторяющихся единиц.

Когда все псевдоповторяющиеся последовательности лигированы в одинаковой ориентации, например голова к хвосту или наоборот, клетка не может различить отдельные элементы. Следовательно, редуктивный процесс может происходить по всей последовательности. Напротив, если, например, элементы представлены в ориентации голова к голове в большей степени, чем голова к хвосту, тогда инверсия определяет конечную точку соседнего элемента, так что формирование делеций способствует потере отдельных элементов. Таким образом, предпочтительно, чтобы последовательности находились в одинаковой ориентации. Случайная ориентация псевдоповторяющихся последовательностей приведет к потере эффективности рекомбинации, в то время как постоянная ориентация последовательностей обеспечит наибольшую эффективность. Однако несмотря на то, что наличие непрерывных последовательностей в одинаковой ориентации снижает эффективность, это, тем не менее, может обеспечить достаточную гибкость для эффективного получения новых молекул. Для обеспечения более высокой эффективности конструкции можно получать с псевдоповторяющимися последовательностями в одинаковой ориентации.

Последовательности можно собирать в ориентации голова к хвосту с использованием любого из множества способов, включая следующие.

a) Можно использовать праймеры, которые включают поли-А-головной конец и поли-Т-хвост, которые, когда их получают в одноцепочечной форме, будут обеспечивать ориентацию. Это обеспечивают наличием первых нескольких оснований в праймерах, образованных из РНК, и, таким образом, они легко удаляются РНКазой Н.

b) Можно использовать праймеры, которые включают уникальные участки для расщепления рестриктазами. Могут потребоваться множество участков, ряд уникальных последовательностей и повторяющиеся стадии синтеза и лигирования.

c) Внутренние несколько оснований праймера можно тиолировать и можно использовать экзонуклеазу для получения молекул с правильными хвостами.

Выделение подвергнутых пересборке последовательностей основано на идентификации векторов для клонирования с уменьшенным индексом повторов (К1). Затем подвергнутые пересборке кодирующие последовательности можно получать посредством амплификации. Продукты повторно клонируют и экспрессируют. Выделение векторов для клонирования со сниженным К1 можно проводить посредством:

1) применения только стабильно поддерживаемых векторов, когда в конструкции снижена комплексность;

- 45 029538

2) физического выделения укороченных векторов физическими процедурами. В этом случае вектор для клонирования можно выделять с использованием стандартных способов выделения плазмид и разделения по размеру либо в агарозном геле, либо на колонке с низкомолекулярным порогом с использованием стандартных способов;

3) выделения векторов, содержащих прерванные гены, которые можно отбирать после уменьшения размера вставки;

4) применения технологий направленной селекции с экспрессирующим вектором и соответствующей селекцией.

Кодирующие последовательности (например, гены) из родственных организмов могут демонстрировать высокую степень гомологии и кодировать совершенно разные белковые продукты. Эти типы последовательностей особенно пригодны в качестве псевдоповторов. Однако несмотря на то, что примеры, проиллюстрированные ниже, демонстрируют рекомбинацию практически идентичных исходных кодирующих последовательностей (псевдоповторов), этот процесс не ограничивается такими практически идентичными повторами.

Следующий пример демонстрирует иллюстративный способ. Описаны кодирующие последовательности нуклеиновых кислот (псевдоповторы), полученные из трех (3) уникальных видов. Каждая последовательность кодирует белок с отличающимся набором свойств. Каждая из последовательностей отличается единичными или несколькими парами оснований в уникальном положении в последовательности. Псевдоповторяющиеся последовательности отдельно или совместно амплифицируют и лигируют в случайные объединенные последовательности, так что в группе лигируемых молекул возможны различные перестановки и сочетания. Количества псевдоповторяющихся единиц можно контролировать условиями сборки. Среднее количество псевдоповторяющихся единиц в конструкции определяют как индекс повторов (ΚΙ).

После формирования конструкции можно разделять или можно не разделять по размеру в агарозном геле в соответствии с опубликованными протоколами, встраивать в вектор для клонирования и трансфицировать в соответствующую клетку-хозяина. Затем клетки размножают и осуществляют редуктивную пересборку. Если желательно, скорость процесса редуктивной пересборки можно повышать посредством внесения повреждений в ДНК. Не существенным является то, опосредуется ли снижение ΚΙ образованием делеции между повторяющимися последовательностями по внутримолекулярному механизму, или оно опосредуется подобными рекомбинации процессами по межмолекулярным механизмам. Конечным результатом является пересборка молекул во всех возможных сочетаниях.

Способ необязательно включает дополнительную стадию скрининга членов библиотеки из подвергнутой пересборке группы для идентификации индивидуальных подвергнутых пересборке членов библиотеки со способностью связываться или иным образом взаимодействовать, или катализировать конкретную реакцию (например, таких как каталитические домены фермента) с предопределенной макромолекулой, например, такой как белковый рецептор, олигосахарид, вирион или другое предопределенное соединение или структура.

Полипептиды, которые идентифицируют из таких библиотек, можно применять для терапевтических, диагностических, исследовательских и сходных целей (например, в качестве катализаторов, растворимых веществ для повышения осмотического давления водного раствора и т.п.), и/или их можно подвергать одному или нескольким дополнительным циклам перетасовки и/или селекции.

До или в процессе рекомбинации или пересборки полинуклеотиды можно подвергать воздействию средств или процессам, которые обеспечивают внесение мутаций в исходные полинуклеотиды. Внесение таких мутаций может повысить разнообразие конечных гибридных полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими. Средства или процессы, которые обеспечивают мутагенез, могут включать, но не ограничиваться ими: (+)-СС-1065, или синтетический аналог, такой как (+)-СС-1065-(№-аденин) (см. δππ апй Ниг1еу, (1992)); ^ацетилированный или деацетилированный 4'-фтор-4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см. уап йе Ро11 е! а1. (1992)); или ^ацетилированный или деацетилированный 4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см. также, уап йе Ро11 е! а1. (1992), рр.751-758); трехвалентный хром, трехвалентную соль хрома, ДНК-аддукт на основе полициклических ароматических углеводородов (РАН), способный ингибировать репликацию ДНК, такой как 7бромметил-бенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3-дибромпропил)фосфат (Тп8-ВР), 1,2-дибром-3хлорпропан ('ГОВСР), 2-бромакролеин (2ВА), бензо[а]пирен-7,8-дигидродиол-9-10-эпоксид (БРЭЕ), соль платины(П) с галогеном, ^гидрокси-2-амино-3-метилимидазо[4,5-й]-хинолин (Н-гидрокси-1О) и ^гидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-й]-пиридин ('^-гидрокси-РЫР). Иллюстративные способы замедления или остановки амплификации ПЦР включают УФ-свет, (+)-СС-1065 и (+)-СС-1065(Ш-аденин). В частности, предусмотренные средства представляют собой ДНК-аддукты или полинуклеотиды, содержащие ДНК-аддукты из полинуклеотидов или совокупности полинуклеотидов, которые перед дальнейшей обработкой можно удалять посредством процесса, включающего нагревание раствора, содержащего полинуклеотиды.

Получение вариантов последователвностей.

Выделенные варианты могут быть встречающимися в природе. Также вариант можно получать ίπ

- 46 029538 νΐΐΐΌ. Варианты можно получать с использованием способов генетической инженерии, таких как сайтнаправленный мутагенез, случайный химический мутагенез, способы делеции экзонуклеазой III, и стандартными способами клонирования. Альтернативно такие варианты, фрагменты, аналоги или производные можно получать с использованием способов химического синтеза или модификации. Другие способы получения вариантов также известны специалистам в данной области. Они включают способы, в которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируют с получением нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды со свойствами, которые повышают их ценность для промышленного или лабораторного применения. В таких способах получают и охарактеризовывают большое количество последовательностей вариантов с отличиями с одним или несколькими нуклеотидами относительно последовательности, полученной из природного изолята. Эти нуклеотидные отличия могут приводить к замене аминокислот относительно полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.

Например, варианты можно получать с использованием ПЦР с пониженной точностью. В некоторых вариантах осуществления, в случае ПЦР с пониженной точностью, ПЦР проводят в условиях, в которых точность копирования ДНК-полимеразы является низкой, так что по всей длине продукта ПЦР возникает большое число точечных мутаций. ПЦР с пониженной точностью описана, например, в Ьеиид, Ό.ν. е! а1., (1989) Тесйпщие 1:11-15 и Са1Д^е11, КС. & 1оусе О.Р., (1992) РСК МеШоДк Аррйс 2:28-33. В кратком изложении, в таких способах нуклеиновые кислоты, подлежащие мутагенезу, смешивают с праймерами для ПЦР, буфером для реакции, МдС1₂, МиС1₂, Тац-полимеразой и с ДЫТР в соответствующей концентрации для достижения большого количества точечных мутаций вдоль всей длины продукта ПЦР. Например, реакцию можно проводить с использованием 20 фмоль нуклеиновой кислоты, предназначенной для внесения в нее мутаций, 30 пмоль каждого праймера для ПЦР, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 ММ Тг18 НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатин, 7 мМ МдС1₂, 0,5 мМ МдС1₂, 5 единиц Тас.]- полимеразы, 0,2 мМ Д0ТР, 0,2 мМ ДАТР, 1 мМ ДСТР и 1 мМ ДТТР. ПЦР проводят в течение 30 циклов, состоящих из 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут варьировать в соответствующих случаях. Подвергнутые мутагенезу нуклеиновые кислоты клонируют в соответствующий вектор и оценивают активность полипептидов, кодируемых подвергнутыми мутагенезу нуклеиновыми кислотами.

Варианты можно получать с использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза с образованием сайт-специфических мутаций в любой представляющей интерес клонированной ДНК. Мутагенез посредством олигонуклеотидов описан, например, в КеШйааг-Окои (1988) Заеисе 241:53-57. В кратком изложении, в таких способах множество двухцепочечных олигонуклеотидов с одной или несколькими мутациями, предназначенными для внесения в клонированную ДНК, синтезируют и встраивают в клонированную ДНК, подлежащую мутагенезу. Клоны, содержащие ДНК с внесенными в нее мутациями, выделяют и оценивают активность полипептидов, которые она кодирует.

Другим способом получения вариантов является ПЦР со сборкой. ПЦР со сборкой включает сборку продуктов ПЦР из смеси небольших фрагментов ДНК. Большое количество различных реакций ПЦР происходит параллельно в одной и той же пробирке, при этом продукты одной реакции являются затравками для продуктов другой реакции. ПЦР со сборкой описана, например, в патенте США № 5965408.

Иллюстративным примером получения вариантов является мутагенез с помощью половой ПЦР. С помощью ПЦР происходит индуцированная гомологичная рекомбинация ш νίΙΐΌ между молекулами ДНК с различными, но высокосходными последовательностями ДНК, вследствие случайной фрагментации молекулы ДНК на основе гомологии последовательностей, с последующей фиксацией продуктов кроссинговера посредством удлинения праймеров в реакции ПЦР. Мутагенез с помощью ПЦР описан, например, в З1еттег (1994) Ргос. Νηΐ1. АсаД. За. ИЗА 91:10747-10751. В кратком изложении, в таких способах множество нуклеиновых кислот, подлежащих рекомбинации, расщепляют ДНКазой с получением фрагментов со средним размером 50-200 нуклеотидов. Фрагменты с требуемым средним размером очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновых кислот. Например, ПЦР можно проводить посредством ресуспендирования очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/мкл в растворе с 0,2 мМ каждого ДКТР, 2,2 мМ МдС1₂, 50 мМ КС1, 10 мМ ТгЕ НС1, рН 9,0, и 0,1% Тгйои Х-100. Добавляют 2,5 единицы Тацполимеразы на 100 мкл реакционной смеси и проводят ПЦР с использованием следующего режима: 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако следует понимать, что эти параметры можно изменять соответствующим образом. В реакции ПЦР можно добавлять олигонуклеотиды. В первой группе реакций ПЦР можно использовать фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, и в последующей группе реакций ПЦР можно использовать Тас|полимеразу. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активность полипептидов, которые они кодируют.

Варианты получают также посредством мутагенеза ш νί\Ό. Создаются случайные мутации в интересующей последовательности, посредством воспроизведения интересующей последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е. сой, который осуществляет мутации посредством одного или нескольких путей репарации ДНК. Такие штаммы-мутаторы обладают увеличенным количеством слу- 47 029538 чайных мутаций по сравнению с родительским организмом дикого типа. Воспроизведение ДНК в одном из этих штаммов приведет со временем к образованию случайных мутаций в ДНК. Штаммы мутаторов, пригодные для применения в мутагенезе ш νίνο, описаны в публикации РСТ № АО 91/16427, опубликованной 31 октября 1991 г. под названием МеЛюТк Γογ РЬеηοίуρе Ο^Φοη Ггот Ми1Лр1е Сепе Рορи1аί^οηк.

Также варианты можно получать с использованием кассетного мутагенеза. В кассетном мутагенезе небольшой участок двухцепочечной молекулы ДНК замещают синтетической олигонуклеотидной кассетой, которая отличается от нативной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично случайную нативную последовательность.

Также для получения вариантов можно использовать возвратно-множественный мутагенез. Возвратно-множественный мутагенез представляет собой алгоритм для белковой инженерии (белкового мутагенеза), разработанный для получения различных групп фенотипически сходных мутантных форм, члены которых отличаются по аминокислотной последовательности. В этом способе используется механизм с обратной связью для контроля успешных циклов комбинаторного кассетного мутагенеза. Возвратно-множественный мутагенез описан, например в Агкш, А.Р. (1992) Рго,. №й1. А,аТ. 3,1., ИЗА, 89:7811-7815.

Варианты получают с использованием экспоненциально-множественного мутагенеза. Экспоненциально-множественный мутагенез представляет собой процесс получения комбинаторных библиотек с большим процентным содержанием уникальных и функциональных мутантов, где небольшие группы остатков случайным образом отбирают параллельно для идентификации в каждом измененном положении аминокислот, которые приводят к функциональным белкам. Экспоненциально-множественный мутагенез описан в Ое1едга\'е (1993) Β^οίеоЬηο1οду Кек., 11:1548-1552. Случайный и сайт-направленный мутагенез описаны в ΛιποΗ (1993) СиггеШ Ор1пюп ш Β^οίеоЬηο1οду, 4:450-455.

Варианты создают с использованием способов перетасовки, где участки множества нуклеиновых кислот, которые кодируют различные полипептиды, подвергают слиянию с получением химерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные полипептиды, как описано в патенте США № 5965408, выданном 9 мая 1996 г., под названием ΜеίЬοа οΓ ^NА КеаккетЪ1у Ъу 1п1еггир1шд ЗуЫйеЫк и в патенте США № 5939250, выданном 22 мая 1996 г., под названием Р^οаиоί^οη οΓ Еп/утек На\апд ЭекиеТ Аоί^ν^ί^ек Ъу МшадепекС.

Варианты полипептидов могут представлять собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептидов в последовательностях замещены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (консервативным аминокислотным остатком), и такие замещенные аминокислотные остатки могут кодироваться генетическим кодом, или могут не кодироваться им.

Консервативные замены представляют собой замены, которые приводят к замене данной аминокислоты в полипептиде на другую аминокислоту со сходными свойствами. Консервативные замены включают следующие замены: замена алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замена серина треонином или наоборот; замена кислых остатков, таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, другим кислым остатком; замена остатка, несущего амидную группу, такого как аспарагин и глутамин, другим остатком, несущим амидную группу; замена основного остатка, такого как лизин и аргинин, другим основным остатком; и замена ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин, другим ароматическим остатком.

Известны варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептида, включают заместитель. Другие варианты представляют собой варианты, в которых полипептид ассоциирован с другим соединением, таким как соединение, увеличивающее время полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль). Дополнительные варианты представляют собой варианты, в которых с полипептидом слиты дополнительные аминокислоты, такие как лидерная последовательность, секреторная последовательность, пробелковая последовательность или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида.

При этом фрагменты, производные и аналоги сохраняют ту же биологическую функцию или активность, что и у полипептидов и последовательностей, по существу, идентичных им. Фрагмент, производное или аналог включает также пробелок, так что фрагмент, производное или аналог может активироваться при отщеплении участка пробелка с образованием активного полипептида.

Оптимизация кодонов для достижения высоких уровней экспрессии белка в клетках-хозяевах.

Клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих кассет и векторов включают клетки бактерий, дрожжей, грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Таким образом, используются способы оптимизации использования кодонов во всех этих клетках, нуклеиновые кислоты с измененными кодонами и полипептиды, полученным с помощью нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Иллюстративные клетки-хозяева включают грамотрицательные бактерии, такие как ЕкоЬе^^оЫа ,ο1ί; грамположительные бактерии, такие как 31герЮту,ек кр., ^аоίοЪао^11ик даккеп, ^аоίοоοооик 1а,11к, ^аоίοоοооик о^етο^^к, Ва,Шик киИИИк, Ва,Шик ,егеик. Иллюстративные клетки-хозяева также включают эукариотические организмы, такие как различные дрожжи, такие как 3аооЬа^οтуоек кр., включая 3аооЬа^οтуоек ое^еν^к^ае, 3оЫζοкаооЬа^οтуоек ροтЪе, РюЫа ракЮпк и К1иуνе^οтуоек 1а,Ик, Напкепи1а ρο1утο^ρЬа, АкрегдШик шдеги клетки и клеточные линии млекопитающих, и клетки и клеточные

- 48 029538 линии насекомых.

Кодоны нуклеиновой кислоты модифицируют таким образом, чтобы нуклеиновая кислота оптимально экспрессировалась в бактериальной клетке, отличной от бактерий, из которых фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, был получен, в клетке дрожжей, грибов, в клетке растений, клетке насекомых или клетке млекопитающих. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области, см., патент США № 5795737; Васа (2000) Ιπί. I. РапМ1о1. 30:113118; На1е (1998) Рго1еш Ехрг. РипГ 12:185-188; Ν;·ιπιιη (2001) 1пГесГ 1ттип. 69:7250-7253. См. также Нагит (2001) 1пГес1. 1ттип. 69:7250-7253, где описаны оптимизированные кодоны в мышиных системах; ОШсНкоигоу (2002) Рго!ет Ехрг. РипГ. 24:18-24, где описаны оптимизированные кодоны в дрожжах; Репд (2000) В1ос11еи41гу 39:15399-15409, где описаны оптимизированные кодоны в Е. сой; Нитрй^еуδ (2000) Рго1ет Ехрг. РипГ. 20:252-264, где описано использование оптимизированных кодонов, которые влияют на секрецию в Е. сой.

Не относящиеся к человеку трансгенные животные.

Трансгенные не относящиеся к человеку животные могут представлять собой, например, собак, коз, кроликов, овец, лошадей, свиней (включая всех свиней, домашних свиней и родственных животных), коров, крыс и мышей, содержащих нуклеиновые кислоты по этому изобретению. Этих животных можно использовать, например, в качестве моделей для исследования ш У1уо активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, или в качестве моделей для скрининга ш У1уо веществ, которые изменяют активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Кодирующие последовательности полипептидов, подлежащих экспрессии в трансгенных не относящихся к человеку животных, можно сконструировать, чтобы они были конститутивными или находящимися под контролем тканеспецифичных, специфичных для стадий развития или индуцибельных факторов регуляции транскрипции.

Трансгенных не относящихся к человеку животных можно разрабатывать и создавать с использованием любого способа, известного в данной области; см. патенты США №№ 6211428; 6187992; 6156952; 6118044; 6111166; 6107541; 5959171; 5922854; 5892070; 5880327; 5891698; 5639940; 5573933; 5387742; 5087571, где описано получение и применение трансформированных клеток и яйцеклеток, и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней, кур, коз рыб и коров. Также см. Ро11оск (1999) Г 1ттипо1. Меΐйоάδ 231:147-157, где описана продукция рекомбинантных белков в молоке у трансгенных молочных животных; Βηβΐιίδί (1999) №Г В1о1есйпо1. 17:45 6-461, где демонстрируется получение трансгенных коз. В патенте США № 6211428 описано получение и применение трансгенных не относящихся к человеку млекопитающих, в головном мозге которых экспрессируется конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК. В патенте США № 5387742 описана инъекция клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мыши, имплантация инъецированных яйцеклеток в ложно-беременных самок и выращивание трансгенных мышей до рождения. В патенте США № 6187992 описано получение и применение трансгенной мыши.

Также для применения на практике можно использовать животных с нокаутом. Итак, трансгенные или модифицированные животные включают животное с нокаутом, такое как мышь с нокаутом, созданная способами инженерии, чтобы не происходило экспрессии эндогенного гена, который замещен геном, экспрессирующим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, или слитый белок, содержащий фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО.

Трансгенные растения и семена.

Трансгенное растение (которое включает части растений, плоды, семена и т.д.) может быть двудольным (ШсоГ) или однодольным растением (топосо!). Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующие полипептид, можно конструировать в соответствии с любым способом, известным в данной области. См., например, патент США № 6309872.

Нуклеиновые кислоты и экспрессирующие конструкции можно вводить в клетку растений любыми способами. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции можно встраивать в геном требуемого растительного хозяина, или нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут представлять собой эписомы. Встраивание в геном желательного растения может быть таким, чтобы продукция фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, регулировалась эндогенными элементами контроля транскрипции и/или трансляции хозяина.

Растения могут быть растениями с нокаутом, где вставка последовательности гена, например, посредством гомологичной рекомбинации, нарушает экспрессию эндогенного гена. Способы получения растений с нокаутом хорошо известны в данной области, см. δί^ерр (1998) Ргос ΝΕ. Αсаά. δα. υδΑ 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап! I 7:359-365. См. описание трансгенных растений ниже.

Нуклеиновые кислоты можно применять для придания требуемых свойств, по существу, любому растению, например продуцирующим крахмал растениям, таким как картофель, томат, соя, свекла, кукуруза, пшеница, рис, ячмень и т. п. Нуклеиновые кислоты можно использовать для манипулирования метаболическими каскадами растений в целях оптимизации или изменения экспрессии в хозяине фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Нуклеиновые кислоты

- 49 029538 могут изменять уровни экспрессии или активности, или они могут изменять свойства соединений или ферментов, продуцируемых в растении в природных условиях. Альтернативно фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, можно использовать для получения трансгенного растения с целью продукции соединения, которое в природных условиях растением не продуцируется. Это может привести к снижению стоимости продукции или к созданию нового продукта.

Первая стадия получения трансгенного растения включает получение экспрессирующей конструкции для экспрессии в клетке растений. Эти технологии хорошо известны в данной области. Они могут включать выбор и клонирование промотора, кодирующей последовательности для облегчения эффективного связывания рибосом с мРНК и выбор пригодной последовательности терминатора гена. Одним иллюстративным конститутивным промотором является СаМУ35§ из вируса мозаики цветной капусты, который, как правило, приводит к высокому уровню экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и отвечают на сигнал из внутренней и наружной окружающей среды растения. Иллюстративным индуцируемым светом промотором является промотор гена саЬ, кодирующего основной связывающий хлорофилл а/Ь белок.

Иногда нуклеиновую кислоту модифицируют для достижения более высокой экспрессии в клетке растений. Например, последовательность предположительно обладает более высоким процентным содержанием нуклеотидных пар А-Т по сравнению с содержанием, которое обнаруживается в растении, в некоторых из которых преобладают нуклеотидные пары О-С. Таким образом, для повышения продукции продукта гена в клетках растений нуклеотиды А-Т в кодирующей последовательности можно замещать нуклеотидами О-С без существенного изменения аминокислотной последовательности.

В целях идентификации клеток растений или тканей, в которые успешно интегрировался трансген, в конструкцию можно добавлять ген селективного маркера. Это может быть необходимым, поскольку достижение встраивания и экспрессии генов в клетках растений является редким случаем, происходящим только в нескольких процентах тканей-мишеней или клеток-мишеней. Гены селективных маркеров кодируют белки, которые придают устойчивость к средствам, которые в норме токсичны для растений, таким как противомикробные средства или гербициды. При выращивании на среде, содержащей соответствующее противомикробное средство или гербицид, выживают только те клетки растений, которые обладают встроенным геном селективного маркера. Как и в случае других встраиваемых генов, для правильного функционирования маркерных генов также необходимы промоторная и терминирующая последовательности.

Итак, получение трансгенных растений или семян включает встраивание последовательностей и, необязательно, маркерных генов в выбранную экспрессирующую конструкцию (такую как плазмида), совместно с включением промоторной и терминирующей последовательностей. Это может вовлекать перенос модифицированного гена в растение с помощью приемлемого способа. Например, конструкцию можно встраивать непосредственно в геномную ДНК клетки растений с использованием способов, таких как электропорация и микроинъекция в протопласты клетки растений, или конструкции можно вводить непосредственно в ткань растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Например, см. Сйпк!ои (1997) Р1аи! Мо1. Вю1. 35:197-203; Ра\\'1о\укк1 (1996) Мо1. Вю!есйио1. 6:17-30; К1еш (1987) №Лиге 327:70-73; Такиш1 (1997) Оеиек Оеие!. 8ук!. 72:63-69, где обсуждается использование бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшено; и АНат (1997), выше, для использования бомбардировки частицами в целях введения УАС в клетки растений. Например, Шиейай (1997), выше, использовал бомбардировку частицами в целях получения трансгенных хлопковых растений. Устройство для ускорения частиц описано в патенте США № 5015580; и коммерчески доступное устройство для ускорения частиц ВюКаН (ВюНкйск) ΡΌδ-2000; см. также 1о1т. патент США № 5608148; и БШк, патент США № 5681730, где описана опосредуемая частицами трансформация голосеменных.

При этом протопласты можно иммобилизовать и инъецировать нуклеиновыми кислотами, такими как экспрессирующая конструкция. Несмотря на то, что регенерация из протопластов не является легкой в случае зерновых, регенерация растений возможна в бобовых с использованием соматического эмбриогенеза из каллюса, полученного из протопласта. Сформированные ткани можно трансформировать депротеинизированной ДНК с использованием технологии генной пушки, где ДНК прокрывают вольфрамовыми микроснарядами, которые простреливают 1/100 размера клетки, которые переносят ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем в трансформированной ткани индуцируют регенерацию, как правило, посредством соматического эмбриогенеза. Этот способа оказался успешным для некоторых видов зерновых, включая маис и рис.

Нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие конструкции, также можно вводить в клетки растений с использованием рекомбинантных вирусов. Клетки растений можно трансформировать с использованием вирусных векторов, например, таких как векторы, полученные из вируса табачной мозаики (КоитеиНа1 (1997) Р1аи! Мо1. Вю1. 33:989-999), см. Ройа (1996) Ике о£ уиа1 герйсоик £ог !йе ехргеккюи о£ деиек ш р1аи!к, Мо1. ЕюЮсНиок 5:209-221.

Альтернативно нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие конструкции, можно комбинировать с пригодными фланкирующими участками Т-ДНК и встраивать в традиционный вектор хозяина АдгоЬас!егшт !ите£ас1еик. Вирулентные функции хозяина АдгоЬас!егшт !ите£ас1еик направляют вставку

- 50 029538 конструкции и соседнего маркера в ДНК клеток растения при инфицировании клетки бактериями. Способ трансформации, опосредуемый АдгоЬасЮгшт ЦцпеГааеш, включая нейтрализацию и применение бинарных векторов, подробно описан в научной литературе. См. Ног8сЬ (1984) Заеисе 233:4 96-4 98; Рга1еу (1983) Ргос. Ναΐ1. Асай. 8а И8А 80:4803 (1983); Сене ТгашГег (о Р1аи(8, РоРуки8, ей. (8ргшдег-Уег1ад, Вег1ш 1995). ДНК в клетке А. ТитеГааеш находится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как плазмида Т (индуцирующая опухоль). ТРплазмида содержит участок ДНК, называемый Т-ДНК (длина ~20 т.п.н.), который переносится в клетку растений в процессе инфекции и набор генов νίτ (вирулентность), которые управляют процессом инфекции. А. ШтеГааеш может инфицировать растение только через повреждения: при повреждении корня или стебля оно подает определенные химические сигналы, в ответ на которые активируются гены νίτ А. ТитеГааеш, и они направляют ряд событий по переносу Т-ДНК из ТРплазмиды в хромосому растения. Затем Т-ДНК проникает через повреждение в клетку растений. Существует предположение, что Т-ДНК ждет репликации и транскрипции ДНК растения, а затем встраивается в доступную ДНК растения. В целях применения А. (итеГааеш в качестве трансгенного вектора, необходимо удалить индуцирующий опухоль фрагмент Т-ДНК, при сохранении краевых участков Т-ДНК и генов νίτ. Затем трансген встраивают между краевыми участками Т-ДНК, где он перемещается в клетку растений и встраивается в хромосомы растений.

Трансформация однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот, включая важные злаковые растения, см. Ше1 (1997) Р1аШ Мо1. Вю1. 35:205-218. См. также, например, Ног8сЬ, Заеисе (1984) 233:496; Рга1еу (1983) Ргос. №Й. Асай. δοΐ И8А 80:4803; ТЬук)аег (1997), выше; Рагк (1996) Р1аи( Мо1. Вю1. 32:1135-1148, где описано встраивание Т-ДНК в геномную ДНК. Также см. П'На11ши, патент США № 5712135, где описан процесс стабильного встраивания ДНК, содержащей ген, который является функциональным в клетке зерновых или других однодольных растений.

Третья стадия может включать селекцию и регенерацию целых растений, способных передавать встроенный целевой ген следующему поколению. В таких способах регенерации можно использовать манипулирование посредством определенных фитогормонов в среде для выращивания культуры ткани. В способе используют биоцидный и/или гербицидный маркер, который вводят вместе с требуемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивированных протопластов описана в Еνаη8 еί а1., Рго1ор1а8(8 18о1айои анй Си11иге, НаийЬоок оГ Р1аШ Се11 Си11иге, рр.124-176, МасМПШаи РиЬН8Ыид Сотраиу, №\у Уогк, 1983; и Вшйшд, КедеиегаЬои оГ РкшК Р1аШ Рго1ор1а818, рр. 21-73, СКС Рге88, Воса Ка(ои, 1985. Регенерацию также можно проводить из каллюса растений, эксплантатов, органов или их частей. Такие способы регенерации описаны, главным образом, в К1ее (1987) Аии. Кеу. оГ Р1аШ РЬу8. 38:467-486. В целях получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, их можно выращивать под контролем окружающих условий в ряде сред, содержащих пищевые добавки и гормоны, в процессе, известном как культивирование тканей. После получения целых растений и продукции семян начинается оценка потомства.

После стабильного встраивания экспрессирующей кассеты в трансгенные растения ее можно вводить в другие растения посредством полового скрещивания. Можно использовать любой из множества стандартных способов выведения, в зависимости от вида, подлежащего скрещиванию. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот приводит к изменениям фенотипа, то можно проводить половое скрещивание растений, содержащих рекомбинантные нуклеиновые кислоты, со вторым растением с получением конечного продукта. Таким образом, семя может быть получено при скрещивании двух трансгенных растений или скрещивания растения и другого растения. Требуемые эффекты (такие как экспрессия полипептидов с получением растения, в котором изменен характер цветения) могут усиливаться, если оба родительских растения экспрессируют полипептиды. Требуемые эффекты можно передавать последующим поколениям растений стандартными способами размножения.

Нуклеиновые кислоты и полипептиды экспрессируют в любом растении или семени или встраивают в него. Трансгенные растения могут представлять собой двудольные или однодольные растения. Примерами однодольных трансгенных растений являются травы, такие как мятлик луговой (мятлик, Роа), кормовая трава, такая как овсянница, райграс, медленно растущая трава, такая как Адго8Й8, и зерновые, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примерами двудольных трансгенных растений по этому изобретению являются табак, бобовые, такие как люпины, картофель, свекла сахарная, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Вга88юасеае), такие как цветная капуста, рапс, и близко родственный модельный организм АгаЫйор818 (ЬаПаиа. Таким образом, трансгенные растения и семена по этому изобретению включают широкий диапазон растений, включая, но, не ограничиваясь ими, виды из родов Аиасагйшт, АгасЫ8, А8рагади8, А(гора, Ауеиа, Вга88юа, СЬги8, СЬги11и8, Сар8юищ, СайЬатш, Сосо8, СоГГеа, Сисит18, СисигЬЬа, Паиси8, Е1ае18, Ргадапа, С1усше, Со88уршт, НеНаи(Ьи8, Не(егосаШ8, Ногйеит, Нуо8суати8, ЬасШса, Пиит, ЬоНит, Ьирти8, Ьусорешюои, Ма1и8, МатЬор Мангат, Мейюадо ШсоНаиа, 01еа, Огу/а, Ратеищ, Раηи^8еίищ, Рег8еа, РЬа8ео1и8, Р181асЫа, Р18ищ, Руги8, Ргиии8, КарЬаии8, Кюши8, Зеса1е, Зепесю, Зшар18, Зо1аиищ, ЗогдЬищ, ТЬеоЬгощи8, Тпдоие11а, ТгШсищ, УШа, УЙ8, У1диа и 2еа.

Нуклеиновые кислоты экспрессируют также в растениях, которые содержат волокнистые клетки, включая, например, хлопок, хлопковое дерево (капок, Се1Ьа реи(аийга), иву пустынную, креозотовый

- 51 029538 куст. терескен шерстистый. бальзу. рами. кенаф. коноплю. розель. джут. сизаль. абаку и лен. Трансгенные растения могут являться членами рода Ооззуршт. включая членов любого из видов Ооззуршт. таких как О. агЬогеит; О. НегЬасеит. О. ЬагЬайеизе и О. ЫгзиШт.

Трансгенные растения подлежат применению для получения больших количеств полипептидов (таких как фермент альдолаза. такая как пируватальдолаза. альдолаза НМО и/или КНО). Например. см. Ра1т§геи (1997) Тгеийз Оеие!. 13:34 8; СНоид (1997) Тгаиздешс Кез. 6:289-296 (продукция белка молока человека бета-казеина в трансгенных растениях картофеля с использованием ауксин-индуцируемого двунаправленного промотора маннопин-синтетазы (таз1'.2') с опосредуемыми АдгоЬас1егшт ШтеГасюиз способами трансформации пластинки листа).

Используя известные процедуры. специалист в данной области может проводить скрининг растений. посредством детекции повышения или снижения количества трансгенной мРНК или белка в трансгенных растениях. Способы определения и количественной оценки мРНК или белков хорошо известны в данной области.

Полипептиды и пептиды.

Полипептиды могут быть короче. чем полноразмерные полипептиды. т.е. пептидам. фрагментам с размером. варьирующим между 5 остатками и полноразмерным полипептидом.

Обладающие активностью альдолазы. такой как активность пируватальдолазы. такой как активность альдолазы НМО и/или КНО. являются членами рода полипептидов. обладающих определенными структурными элементами. такими как аминокислотные остатки. которые коррелируют с активностью альдолазы. включая активность в отношении пирувата. такую как. но. не ограничиваясь этим. активность альдолазы НМО и/или КНО. Эти общие структурные элементы можно использовать для повседневного получения вариантов альдолазы. такой как пируватальдолаза. такая как НМО и/или КНО. Эти общие структурные элементы ферментов альдолаз. таких как пируватальдолаза. такая как альдолаза НМО и/или КНО. можно использовать в качестве основ для повседневного получения вариантов ферментов альдолаз. таких как пируватальдолаза. такая как альдолаза НМО и/или КНО.

Как используют в настоящем документе. термины альдолаза. такая как пируватальдолаза. такая как альдолаза НМО и/или КНО включают любой полипептид или ферменты. способные катализировать реакцию присоединения альдола или ретроальдольную реакцию (такой как полипептиды см. табл. 1 и примеры 4. 5 и 6. ниже). или любую модификацию содержащего углерод-углеродную связь материала. например. при получении К-2-гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (К-МР) и определенных стереоизомеров монатина. таких как К.К- и 8.К-монатин. и их солей.

Эти полипептиды катализируют образование углерод-углеродных связей в альдольной реакции и обладают способностью использовать пируват или фосфоенолпируват в качестве нуклеофильного компонента в синтезе 4-гидрокси-2-кетобутиратного остова. как представлено на общей схеме ниже.

К = Н. алкил. замещенный алкил. арил. замещенный арил. бензил. замещенный бензил;

К₂ = Н. алкил. замещенный алкил. арил. замещенный арил. бензил. замещенный бензил;

К3 = Н. алкил. замещенный алкил. арил. замещенный арил. бензил. замещенный бензил. карбоновая кислота.

Без связи с теорией. полагают. что консервативный фрагмент из четырех атомов углерода. образующийся во всех катализируемых пируватальдолазой реакциях конденсации. является как высоко. так и дифференциально функциональным. Более того. в каждом аддукте четыре соседних атома углерода находятся в четырех различных окисленных состояниях. Таким образом. каркасная область. образованная с помощью пируватальдолаз. дает возможность получения α-амино-у-гидроксикарбоновых кислот. βгидроксикарбоновых кислот. α.γ-дигидроксикарбоновых кислот и 2-дезоксиальдозных сахаров. как показано на схеме ниже.

- 52 029538

он о

ОН он _ЙЛ^А^СООН о

Таким образом, пируватальдолазы могут быть синтетически универсальными, и их можно использовать для получения широкого диапазона продуктов для применения в кормах для животных, продуктах питания для человека, промышленных процессах и в фармацевтике (см., например, Оукеп, НАМ. е( а1., Кесеп( Айуапсек т (Не СНетоеп/утайс 8уп(Нек1к оГ СагЪоНуйга(ек апй СагЪоНуйга(е МтеНск, СНет. Кеу. 1996, 96, 443-473; Непйегкоп, ΌΤ. е( а1. I. Огд. СНет., 8(егеокрес1йс Ргерагайоп оГ (Не №Тегтта1 Атто Ас1й Мо1е(у оГ №ккотустк КХ апй Ι<Ζ у1а а Ми1йр1е кп/уте 8уп(Нек1к, 1997, 62, 7910-7911; Шутег, N. & Тоопе, ЕЛ. Еп7уте-са(а1у/ей 8уп(Нек1к оГ СагЪоНуйга(ек. Сиггеп! Орт. СНет1са1 Вю1оду, 2000, 4, 110-119).

Полипептиды могут обладать более чем одним типом ферментативной активности, конкретно активностью альдолазы и дополнительной активностью, например, как указано в табл. 1 ниже. Например, полипептид может обладать активностью альдолазы, активностью пируватальдолазы, альдолазы НМО и/или КНО. Кроме того, полипептид может обладать или предположительно может обладать дополнительной ферментативной активностью, исходя из его классификации ЕС. Табл. 1 включает столбец Предсказанный номер ЕС. Номер ЕС представляет собой номер, присваиваемый типу фермента в соответствии со схемой стандартизированной номенклатуры ферментов, разработанной кп/уте СоттЕкюп оГ (Не ШтепскПиге Соттй(ее оГ (Не 1п(етайопа1 Итоп оГ ВюсНетЫгу апй Мо1еси1аг Вю1оду (ШВМВ). Результаты в столбце Предсказанный номер ЕС определены поиском посредством ВЙА8Т относительно базы данных Кедд (Куо(о Епсус1орей1а оГ Оепек апй Оепотек). Если наибольшее совпадение ВЙА8Т (также называемое хитом) обладает значением Е, равным или меньшим чем е^-6, в таблицу вносят номер ЕС, присвоенный наибольшему совпадению. Номер ЕС наибольшего хита используют в качестве ориентира в отношении того, какой у последовательности может быть номер ЕС. В случаях, где присваивается только частичный номер ЕС, может быть присвоена только широкая категория, исходя из наибольшего хита. Например, в первом ряду для 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 2, кодируемой 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 1, предсказанный номер ЕС приведен в качестве 2.... Таким образом, ориентировочно присваивается категория трансфераз. Для 8Е^ ГО ΝΟ: 26, кодируемой 8Е^ ГО ΝΟ: 25, наиболее конкретная категория, которая может быть присвоена на основе наибольшего хита, соответствует альдегидлиазе.

Таблица 1

8ЕЦГО ΝΟ:	Активность	Подкласс альдолазы	Предсказанный номер ЕС	Сигнал Р Сигнал (АА=амино кислота)	Источник
1,2	Альдолаза	НМС	2...		Бактерии
3,4	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
5, 6	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
7,8	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
9, 10	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
11, 12	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
13, 14	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
15, 16	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
17, 18	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
19, 20	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
21,22	Альдолаза	НМС			Неизвестен
23,24	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
25,26	Альдолаза	НМС	4.1.2.		Неизвестен
27, 28	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
29, 30	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
31,32	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
33,34	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
35, 36	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
37, 38	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
39, 40	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен

- 53 029538

41,42	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
43,44	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
45,46	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
47, 48	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
49, 50	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
51,52	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
53, 54	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
55, 56	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
57, 58	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
59, 60	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
61,62	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
63,64	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
65,66	Альдолаза	НМС	2...	АА1-27	Неизвестен
67, 68	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
69, 70	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
71,72	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
73,74	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
75,76	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
77, 78	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
79, 80	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
81,82	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
83,84	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
85, 86	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
87, 88	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
89, 90	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
91,92	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
93,94	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
95, 96	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
97, 98	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
99, 100	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
101, 102	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
103, 104	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
105, 106	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
107, 108	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
109, ПО	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
111, 112	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
113,114	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
115, 116	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
117, 118	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
119, 120	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
121, 122	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен

123, 124 125, 126 127, 128 129, 130 131, 132 133, 134 135, 136 137, 138 139, 140 141, 142 143, 144 145, 146 147, 148 149, 150 151, 152 153, 154 155, 156 157, 158 159, 160 161, 162 163, 164 165, 166 167, 168 169, 170 171, 172 173, 174 175, 176 177, 178 179, 180 181, 182 183, 184 185, 186 187, 188 189, 190 191, 192 193, 194 195, 196 197, 198 199, 200 201,202 203, 204

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

Альдолаза

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

НМС

2...

ΊΓ7 —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

— —

—

2...

ΊΓ7

ΊΓ7

АА1-31

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

Неизвестен

205, 206	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
207, 208	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
209,210	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
211,212	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
213,214	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
215,216	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
217,218	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
219,220	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
221,222	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
223,224	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
225, 226	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
227, 228	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
229, 230	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
231,232	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
233,234	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
235,236	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
237, 238	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
239, 240	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
241,242	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
243,244	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
245, 246	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
247, 248	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
249,250	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
251,252	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
253,254	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
255,256	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
257, 258	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
259,260	Альдолаза	НМС	2...	АА1-18	Неизвестен
261,262	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
263,264	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
265, 266	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
267, 268	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
269,270	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
271,272	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
273,274	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
275, 276	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
277, 278	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
279, 280	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
281,282	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
283,284	Альдолаза	НМС	2...		Неизвестен
285, 286	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
287, 288	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
289, 290	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
291,292	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
293,294	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
295, 296	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
297, 298	Альдолаза	НМО	2...		Неизвестен
299, 300	Альдолаза	НМО	2.1..		Неизвестен
301,302	Альдолаза	НМО	2.1..		Неизвестен
303,304	Альдолаза	НМО	2.1..		Неизвестен
305,306	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
307,308	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
309,310	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
311,312	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
313,314	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
315,316	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
317,318	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
319,320	Альдолаза	КНО	4.1.3.16		Неизвестен
321,322	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
323,324	Альдолаза	кнс	4.1.2.14		Неизвестен
325,326	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
327,328	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
329,330	Альдолаза	кнс	4.1.3.16		Неизвестен
331, 332	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен
333,334	Альдолаза	КНО	4.1.2.14		Неизвестен

Полипептиды и пептиды можно выделять из природных источников, они могут представлять собой синтетические или полученные рекомбинантными способами полипептиды или полипептиды. Пептиды и белки можно экспрессировать рекомбинантными способами ш уйго или ш У1Уо. Пептиды и полипептиды можно получать и выделять с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептид и пептиды также можно синтезировать, полностью или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. См., например, СагиШегз (1980) Чис1еР Ас1Е Рез. Зутр. Зег. 215-223; Нот (1980) Чис1еР Ас1Е Рез. Зутр. Зег. 225-232; Ваида, А.К., ТЬегареиНс РерНЕез аиЕ Рго1етз, РогтиЫюи, Ргосеззтд аиЕ БеНуегу Зуз!етз (1995) ТесНиотР РиЪНзНтд Со., Ьаисаз1ег, РА. Например, синтез пептида можно проводить с использованием различных твердофазных способов (см., например, РоЪегде (1995) ЗсРисе 269:202; Метйе1Е (1997) Ме!НоЕз Еи/уто1. 289:3-13), и можно применять автоматический синтез, например, с использованием АВ1 4 31 А РерйЕе Зуи1Нез17ег (Регкт Е1тег) в соот- 55 029538 ветствием с инструкциями, предоставляемыми изготовителем.

Пептиды и полипептиды также могут быть гликозилированными. Гликозилирование можно добавлять посттрансляционно либо химически, либо с помощью клеточных биосинтетических механизмов, где последние включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности, или их можно добавлять в виде пептида, или их можно добавлять в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может быть О-связанным или Ν-связанным.

Пептиды и полипептиды могут включать все формы миметиков и пептидомиметиков. Термины миметик и пептидомиметик относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладает по существу такими же структурными и/или функциональными характеристиками, что и полипептиды. Миметик может либо целиком состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо он представляет собой химерную молекулу частично из аминокислот природных пептидов и частично из аналогов аминокислот. Также миметик может включать любое количество консервативных замен природных аминокислот при условии, что такие замены также по существу не изменяют структуру и/или активность миметика. Как в случае полипептидов (например, которые обладают приблизительно 50% или более идентичностью последовательностей с последовательностью по этому изобретению), общепринятые способы экспериментирования позволят определить, что его структура и/или функция, по существу, не изменены.

Композиции полипептидных миметиков могут содержать любое сочетание неприродных структурных компонентов. Или же композиция миметиков включают одну или все из следующих трех структурных групп: а) группы со связью остатков, отличной от природных амидных связей (пептидной связи); Ь) неприродные остатки вместо встречающихся в природе аминокислотных остатков; или с) остатки, которые приводят к вторичной структурной мимикрии, т.е. к индуцированию или стабилизации вторичной структуры, например конформации бета-петли, гамма-петли, бета-слоя, альфа-спирали и т. п. Например, полипептид может быть охарактеризован как миметик, если все или некоторые его остатки соединены химическими способами, отличными от природных пептидных связей. Отдельные остатки пептидомиметика могут быть связаны пептидными связями, другими химическими связями или конденсирующими веществами, например, такими как глутаральдегид, сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимида, бифункциональные малеинимиды, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ЭСС) или Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (Э1С). Присоединенные группы, которые могут быть альтернативными традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(О)-СН₂- вместо -С(О)-ХН-), аминометилен (СН₂-ХН), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН₂-О), тиоэфир (СН₂-8), тетразол (СЩ-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см. 8раЮ1а (1983) в СЬетщйу анП ВюсЬетШту οΕ Атию асМк, РерйПек ааП Рго1етк, νο1. 7, рр. 267-357, РерйПе ΒаскЬοηе МοП^Е^саΐ^οηк, Магсе11 Оеккег, ХУ).

Полипептид также может быть охарактеризован как миметик в случае наличия всех или нескольких неприродных остатков вместо природных аминокислотных остатков. Неприродные остатки полностью описаны в научной и патентной литературе; некоторые иллюстративные неприродные композиции, пригодные в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и руководства описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот можно получать замещением, например, Ό- или Ь-нафтилаланином; Ό- или Ь-фенилглицином; Ό- или Ь-2-тиенилаланином; Ό- или Ь-1,-2,3- или 4-пиренилаланином; Ό- или Ь-3-тиенилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(3-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; О-(трифторметил)фенилглицином; Ό(трифторметил) фенилаланином; Ό-п-фторфенилаланином; Ό- или Ь-п-бифенилфенилаланином; Ό- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином; Ό- или Ь-2-индол(алкил)аланинами и Ό- или Ь-алкиламинами, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, вторичный изобутил, изопентил, или некислые аминокислоты. Ароматические кольца неприродных аминокислот включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.

Миметики кислых аминокислот можно получать замещением, например, некарабоксилатными аминокислотами с сохранением отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартильную или глутамильную) также можно селективно модифицировать посредством реакции с карбоимидами (Р'-Х-С-Х-Р'), такими как 1-циклогексил-3-(2морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил также можно превращать в остатки аспарагинила и глутаминила реакцией с ионами аммония. Миметики основных аминокислот можно получать замещением, например (в дополнение к лизину и аргинину), аминокислотами орнитином, цитруллином или гуанидинуксусной кислотой или гуанидиналкилуксусной кислотой, где алкил определен выше. Производным нитрила (например, содержащим СХ группу вместо СООН) можно заменять аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинила и глутаминила можно дезаминировать до соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики аргининовых остатков можно получать реакцией аргинила, например, с одним или несколькими общепринятыми реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, в

- 56 029538 некоторых вариантах осуществления в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина можно получать реакцией тирозила, например, с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Νацетилимидазол и тетранитрометан можно использовать для образования О-ацетилтирозильных продуктов и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики остатка цистеина можно получать реакцией остатков цистеинила, например, с альфа-галоацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующие амины с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Миметики цистеиновых остатков также можно получать реакцией остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Ν-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, пхлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина можно получать (и можно изменять Ν-концевые остатки) реакцией лизинила, например, с ангидридом янтарной или другой карбоновой кислоты. Лизин и другие альфа-аминосодержащие остатки также можно получать реакцией с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, Θ-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и реакциями с глиоксилатом, катализируемыми трансамидазой. Миметики метионина можно получать реакцией, например, с сульфоксидом метионина. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4метилпролин или 3,3-диметилпролин. Миметики остатков гистидина можно получать реакцией гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или пара-бромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, миметики, полученные гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп остатков серила или треонила; метилированием альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием Ν-концевого амина; метилированием остатков амида главной цепи или замещением Ν-метиламинокислотами; или амидированием С-концевых карбоксильных групп.

Аминокислоту полипептида также можно заменять аминокислотой (или остатком пептидомиметика) с противоположной хиральностью. Любую аминокислоту, встречающуюся в природе в Ьконфигурации (которая также может называться Κ или δ в зависимости от структуры химической группы), можно заменять аминокислотой такого же структурного типа или пептидомиметиком, но с противоположной хиральностью, называемой Ό-аминокислотой, но также она может называться Κ- или δформой.

Модификация полипептидов может быть осуществлена посредством природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), либо посредством способов химической модификации, и относится к полученным модифицированным полипептидам. Модификации можно проводить на любой части полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и Ν- или С-концы. Понятно, что один и тот же тип модификации может быть выражен в той же или другой степени в разных участках данного полипептида. Также данный полипептид может обладать многими типами модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, ΑΌΡрибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ΟΡΙ-якоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию, и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в белок, такую как аргинилирование. См. Сге1дЬΐοη, Т.Е., ΡΐΌΚίηδ - δΙπκΙιιΐΌ ηηύ Мо1еси1аг ΡίοροΠίοδ 2ηά Εά., \.Н. Ргеетан ;·ιηά Сотрат'. Νου ΥοιΊ< (1993); Ροδй^аηδ1аι^οηаί Сονаίеиΐ Мо01Йсайои ο£ ΡΓοΙοίηδ, В.С. ΙοΗηδοη, Εά., Αсаάет^с ΡϊΌδδ, Νου Υοάν ρρ.1-12 (1983).

Также для синтеза полипептида или фрагментов по этому изобретению можно использовать твердофазные способы химического синтеза пептидов. Такой способ известен в данной области с начала 1960-х (МетйеМ, Κ.Β., 1. Αт. СЬет. δο^ 85:2149-2154, 1963) (см. также δΐеγа^ι, ТМ. агЛ Υοικίβ, ΙΌ., δοίίά ΡΙκίδο ΡορΙίάο δ'ηΛοδίδ, 2ηά Εά., Ριοιόο СЬетюа1 Со., РоскГо1Й Ι11., ρρ.11-12)) и в последнее время его используют в коммерчески доступных лабораторных наборах для разработки и синтеза пептидов (СатЬ^де Κοδο^Λ Β^οсЪет^саίδ). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, использовались идеи Н.М. Оеуъем е! а1., Ργοο №(1. Αсаά. δά, υδΑ, 81:3998 (1984), и они обеспечивают синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых соединены с одним планшетом. При использовании такой системы планшет со стержнями или булавками переворачивают и вставляют во второй планшет с соответствующими лунками или резервуарами, которые содержат растворы для присоединения или заякоривания соответствующей аминокислоты на концах стержней или шпилек. При повторении этой стадии процесса, т.е. при переворачивании и помещении концов стержней и булавок в соответствующие растворы, из аминокислот выстраиваются требуемые пептиды. Кроме того, является доступным ряд доступных систем для синтеза пептидов ΡМΘС. Например, сборку

- 57 029538 полипептида или фрагмента можно проводить на твердой подложке с использованием устройства для автоматического синтеза пептидов АррНей Вю8у8кет8, 1пс. Мойе1 4 31А™. Такое оборудование обеспечивает легкую доступность пептидов либо непосредственным синтезом, либо синтезом ряда фрагментов, которые соединяют с использованием других известных способов.

Например, полипептиды включают пробелки перед созреванием или процессингом препропоследовательностей, например, посредством фермента процессинга пробелка, такого как конвертаза пробелка, с получением активного зрелого белка. Полипептиды включают ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, неактивные по другим причинам, например, перед активацией посредством посттрансляционного процессинга, например, воздействия эндо- и экзопептидаз или протеаз, фосфорилирования, амидирования, гликозилирования или сульфатации, димеризации и т.п. Полипептиды по этому изобретению включают все активные формы, включая активные подпоследовательности, например, каталитические домены или активные центры, фермента.

Игибирования активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, например, возможно с использованием доминантно-негативных мутантных форм или антител против альдолазы, таких как антитела против пируватальдолазы, такие как антитела против альдолазы ΗΜΟ и/или КΗΟ.

Полипептиды могут обладать активностью ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, в различных условиях, например при крайних значениях рН и/или температуры, или в присутствии окислителей и т. п. Альтернативные препараты ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, отличаются каталитической эффективностью и стабильностью, например, в отношении температуры, окислителей и изменения условий промывания. Варианты ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, можно получать с использованием способов сайт-направленного мутагенеза и/или случайного мутагенеза. Для получения большого множества вариантов ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, с альтернативной специфичностью и стабильностью, можно использовать направленные изменения.

Белки также пригодны в качестве экспериментальных реагентов для идентификации модуляторов ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, таких как активаторы или ингибиторы активности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ. В кратком изложении, анализируемые образцы (соединения, бульоны, экстракты и т.п.) добавляют к образцу для анализа ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, в целях определения их способности ингибировать расщепление субстрата. Ингибиторы, идентифицированные таким способом, можно использовать в промышленности и исследованиях для снижения или предотвращения нежелательного протеолиза. Как и в случае ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, ингибиторы можно комбинировать повышением спектра активности.

Ферменты также пригодны в качестве исследовательских реагентов для расщепления белков или секвенирования белков. Например, ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, можно использовать для разрушения полипептидов на фрагменты меньших размеров в целях секвенирования с использованием, например, автоматического секвенатора.

В способах выявления новых ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ, используют нуклеиновые кислоты, полипептиды и антитела. Для этого проводят скрининг библиотек фагмид для выявления на основании экспрессии ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ. Альтернативно проводят скрининг библиотек фага лямбда для выявления на основе экспрессии ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ. Скрининг библиотек фагов или фагмид может обеспечить определение токсичных клонов, повышение доступа к субстрату, снижение необходимости в создании способами инженерии хозяина, обход потенциальных любых ошибок, возникающих вследствие множественных удалений в библиотеке, и ускорение роста при низких плотностях клонов. Скрининг библиотек фагов или фагмид можно проводить в жидкой фазе или в твердой фазе. Это обеспечивает большую универсальность условий анализа, дополнительную универсальность субстрата, повышенную чувствительность для слабых клонов и легкость автоматизации по сравнению с твердофазным анализом.

Полипептиды или фрагменты получают способами биохимического обогащения или очистки. Последовательность потенциально гомологичных полипептидов или фрагментов можно определять посредством ферментных анализов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза ΗΜΟ и/или КΗΟ (см. примеры 3, 4 и 5, ниже), гель-электрофореза и/или микросеквенирования. Последовательность предполагаемого полипептида или фрагмента можно сравнивать с полипептидом или фрагментом, например, содержащим по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более его последовательно расположенных аминокислот, с использованием программ, описанных выше.

Анализ для идентификации фрагментов или вариантов, которые сохраняют ферментативную функцию полипептидов.

Например, фрагменты или варианты указанных полипептидов можно использовать для катализа

- 58 029538 биохимических реакций, которые указывают на то, что фрагмент или вариант сохраняет ферментативную активность полипептида. Иллюстративный способ анализа для определения сохранения фрагментами или вариантами ферментативной активности полипептидов включает стадии: контактирования полипептидного фрагмента или варианта с молекулой субстрата в условиях, которые обеспечивают функционирование полипептидного фрагмента или варианта, и детекцию либо снижения уровня субстрата, либо повышения уровня конкретного продукта реакции между полипептидом и субстратом.

В то время как применение биокатализаторов (т.е. очищенных или неочищенных ферментов, неживых или живых клеток) в химических превращениях в норме требует идентификации конкретного биокатализатора, который реагирует с конкретным исходным соединением, часто используются подобранные биокатализаторы и условия реакции, которые являются специфичными для функциональных групп, которые находятся во множестве исходных соединений, таких как низкомолекулярные соединения. Каждый биокатализатор является специфичным для одной функциональной группы или нескольких сходных функциональных групп и может реагировать с множеством исходных соединений, содержащих эту функциональную группу.

Биокаталитические реакции приводят к получению совокупности производных из единичного исходного соединения. Эти производные можно подвергать другому циклу биокаталитических реакций с получением второй группы производных соединений. При каждом повторе биокаталитического образования производных можно получать тысячи вариантов исходных низкомолекулярных молекул или соединений.

Ферменты действуют на конкретные участки исходного соединения без влияния на остальную часть молекулы, что представляет собой процесс, которого очень сложно добиться с использованием традиционных химических способов. Эта высокая степень биокаталитической специфичности обеспечивает способы идентификации единичного активного соединения из библиотеки. Библиотека характеризуется рядом биокаталитических реакций, используемых для ее получения, так называемой биосинтетической историей. Скрининг библиотеки в отношении видов биологической активности и прослеживание биосинтетической истории позволяют идентифицировать конкретную последовательность реакций образования активного соединения. Последовательность реакций повторяют и определяют структуру синтезированного соединения. Этот способ идентификации в отличие от других подходов синтеза и тестирования не требует технологий иммобилизации, и соединения можно синтезировать и анализировать в свободной форме в растворе с использованием практически любого типа скринингового анализа. Важно отметить, что высокая степень специфичности ферментативных реакций для функциональных групп позволяет проследить конкретные ферментативные реакции, которые приводят к биокаталитически полученной библиотеки.

Множество стадий способа осуществляют с использованием роботизации, способной выполнять множество тысяч биокаталитических реакций и скрининговых анализов в сутки, а также обеспечивать высокий уровень точности и воспроизводимости. Также роботизацию можно использовать для скрининга в отношении активности альдолазы. В результате за несколько недель можно получить библиотеку производных соединений, при этом ее получение с использованием традиционных химических или ферментативных способов скрининга отняло бы годы.

Способы модификации низкомолекулярных соединений включают контактирование полипептида, кодируемого полинуклеотидом, или его ферментативно активных фрагментов с низкомолекулярным соединением с получением модифицированного низкомолекулярного соединения. Библиотеку модифицированных низкомолекулярных соединений анализируют для определения того, представлено ли в библиотеке модифицированное низкомолекулярное соединение, которое проявляет требуемую активность. Конкретную биокаталитическую реакцию, которая приводит к модифицированному низкомолекулярному соединению с требуемой активностью, идентифицируют систематическим удалением каждой из биокаталитических реакций, используемых для получения части библиотеки, а затем анализом низкомолекулярных соединений, полученных в части библиотеки, на наличие или отсутствие модифицированного низкомолекулярного соединения с требуемой активностью. Конкретные биокаталитические реакции, которые приводят к модифицированному низкомолекулярному соединению с требуемой активностью, необязательно повторяют.

Биокаталитические реакции проводят с группой биокатализаторов, которые взаимодействуют с определенными структурными группами, находящимися в структуре низкомолекулярного соединения, где каждый катализатор является специфичным в отношении одной структурной группы или совокупности сходных структурных групп; и каждый биокатализатор реагирует с множеством различных низкомолекулярных соединений, которые содержат определенную структурную группу.

Сигнальные последовательности, препродомены и каталитические домены фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС.

Сигнальные последовательности ферментов (такие как сигнальные пептиды ^Р)), препродомены, связывающие домены и каталитические домены (СО) фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. δР, препродомены и/или СО могут представлять собой выделенные, синтетические или рекомбинантные пептиды, или они могут представлять собой часть слитого бел- 59 029538 ка, такую как гетерологичный домен в химерном белке.

В полипептидах с сигнальной последовательностью и/или препропоследовательностью препропоследовательность (включая последовательность, используемую в качестве гетерологичного препродомена) может быть расположена на Ν-конце или на С-конце белка. Полипептид, содержащий сигнальную последовательность, может представлять собой фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, по этому изобретению, или другой фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, или другой фермент или другой полипептид. Способы идентификации последовательностей препро-домена и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области, см. Уап йе Уеп (1993) Сгй. Кеу. Опсод. 4(2):115-136. Например, для идентификации препропоследовательности белок очищают из внеклеточного окружения и определяют Νконцевую белковую последовательность и сравнивают с непроцессированной формой.

Сигнальные последовательности (8Р) и/или препропоследовательности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, могут представлять собой выделенные, синтетические или рекомбинантные пептиды или последовательности, соединенные с другим ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, или с полипептидом не альдолазы, таким как полипептид не пируватальдолаза, такой как полипептид не альдолазы НМО и/или КОН, такие как слитый (химерный) белок. Сигнальные последовательности 8Р и/или препропоследователности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, могут содержать последовательности, гетерологичные ферменту альдолазе, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН (такие как слитый белок, содержащий 8Р и/или препропоследовательность по этому изобретению и/или последовательности из другого фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, или из белка не альдолазы, такого как белок не пируватальдолазы, такой как белок не альдолазы НМО и/или КОН). Фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, могут содержать гетерологичные 8Р и/или препропоследовательности, такие как последовательности с сигнальной последовательностью дрожжей. Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, могут содержать гетерологичную 8Р и/или препропоследовательность в векторе, таком как вектор серии рР1С (1пуйгодеп, Саг1кЬай, СА).

8Р и/или препропоследовательности идентифицируют после идентификации новых ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Пути, посредством которых белки сортируются и транспортируются в надлежащие отделы клетки, часто называют путями направления белков. Одним из наиболее важных элементов во всех из этих направляющих систем является короткая аминокислотная последовательность на Ν-конце вновь синтезированного полипептида, называемая сигнальной последовательностью. Эта сигнальная последовательность направляет белок в соответствующий отдел клетки, и она удаляется в процессе транспорта или при достижении белком пункта назначения. Большинство лизосомальных, мембранных или секретируемых белков обладают Ν-концевой сигнальной последовательностью, которая маркирует их для транспорта в просвет эндоплазматической сети. Длина сигнальных последовательностей может варьировать от 10 до 65 или более аминокислотных остатков. Различные способы выявления сигнальных последовательностей известны специалистам в данной области. Например, новые сигнальные пептиды ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, идентифицируют способом, называемым 81дпа1Р. В 81дпа1Р используется комбинированная нейронная сеть, которая распознает как сигнальные пептиды, так и участки их расщепления. (№е1кеп (1997) ИепИйсайоп оГ ргокагуойс апй еикагуойс ыдпа1 рерййек апй ргейюйоп оГ Шеи с1еауаде кйек Рго1еш Епд1пеегшд, 10:1-6.

Фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, может не обладать 8Р и/или препропоследовательностями доменами.

Выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие сигнальные последовательности (8Р), препродомен и/или каталитические домены (СО), могут включать и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, не природным образом ассоциированные (например, фермент) с 8Р, препродоменамом и/или СО. Последовательность, с которой 8Р, препродомен и/или СО могут быть не природным образом ассоциированы, может находиться на Ν-конце, С-конце 8Р, препродомена и/или СО и/или на обоих концах 8Р и/или СО, при условии, что он не ассоциирован с какой-либо последовательностью, с которой он ассоциирован в природе (такой как последовательность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН).

Гибридные (химерные) ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, и библиотеки пептидов.

Пептидные библиотеки можно использовать для выделения пептидных модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) мишеней, таких как субстраты, рецепторы, ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Пептидные библиотеки можно использовать для идентификации соответствующих партнеров для связывания мишеней, таких как лиганды, такие как цитокины, гормоны и т. п.

- 60 029538

Слитые белки (такие как пептидная группа) конформационно стабилизируют (относительно линейных пептидов), чтобы обеспечить более высокую аффинность связывания мишеней. Варианты аминокислотных последовательностей могут характеризоваться предопределенным характером изменения, что является признаком, который отделяет их от встречающихся в природе форм, таких как аллельное и межвидовое разнообразие последовательностей ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Можно отбирать варианты с модифицированными свойствами. При этом, несмотря на то, что участок или область для внесения изменения в аминокислотную последовательность предопределены, мутация, по существу, не должна быть предопределена. Например, в целях оптимизации внесения мутации в данный участок, можно проводить случайный мутагенез в кодонемишени или участке-мишени и подвергать скринингу экспрессируемые варианты ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, в отношении оптимального сочетания для требуемой активности. Способы внесения мутаций с заменами в предопределенных участках ДНК с известной последовательностью хорошо известны, как описано в настоящем документе, например, мутагенез с праймерами М13 и мутагенез посредством ПЦР. Скрининг мутантных форм можно проводить с использованием, например, анализов образования или расщепления углерод-углеродной связи. Аминокислотные замены могут представлять собой единичные остатки; размер вставок может составлять порядка от приблизительно 1 до 20 аминокислот, хотя вносят вставки значительно больших размеров. Размер делеций может варьировать от приблизительно 1 до приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70 остатков или более. Для получения конечного производного с оптимальными свойствами можно использовать замены, делеций, вставки или любое их сочетание. Как правило, эти изменения проводят в небольшом количестве аминокислот для сведения к минимуму изменений молекулы. Однако при определенных условиях могут быть допустимы большие изменения.

В ферментах альдолазах, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, структура полипептидного остова, вторичная или третичная структура, такая как структура альфа-спирали или бета-слоя, может быть модифицирована. Модифицируются заряд или гидрофобность или объем боковой цепи. Существенные изменения функции или иммунологической идентичности проводят, выбирая замены, которые являются менее консервативными. Например, можно проводить замены, которые наиболее значительно влияют: на структуру полипептидного остова в области изменения, например, на структуру альфа-спирали или бета-слоя; на заряженный или гидрофобный участок молекулы, который может находиться активном центре; или на боковую цепь. Возможны замены в полипептиде, где (а) гидрофильные остатки, например серил или треонил, замещают (или замещены им) гидрофобный остаток, например лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (Ъ) цистеин или пролин замещают (или замещены им) любой другой остаток; (с) остаток с электроположительной боковой цепью, например лизил, аргинил или гистидил, замещает (или замещен им) электроотрицательный остаток, например глутамил или аспартил; или (й) остаток с объемной боковой цепью, например фенилаланин, замещает (или замещен им) остаток, не обладающий боковой цепью, например глицин. Эти варианты могут проявлять качественно такую же биологическую активность (например, активность ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН), хотя, при необходимости, можно отбирать варианты для модификации свойств ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН.

Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, содержат эпитопы или маркеры для очистки, сигнальные последовательности или другие слитые последовательности и т.д. Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, можно подвергать слиянию со случайным пептидом с получением слитого полипептида. Под термином слитый или функционально связанный в настоящем документе подразумевают, что случайный пептид и фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, связаны друг с другом таким образом, чтобы свести к минимуму нарушения стабильности структуры фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, например, чтобы сохранялась активность к ферменту альдолазе, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Слитый полипептид (или слитый полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид) также может содержать дополнительные компоненты, включая множественные пептиды во множественных петлях.

Пептиды и кодирующие их нуклеиновые кислоты могут быть рандомизированными, либо полностью рандомизированными, либо они имеют тенденцию к рандомизации, например, в частоте нуклеотидов/остатков, в целом или в одном положении. Рандомизированный означает, что каждая нуклеиновая кислота и пептид состоят, по существу, из случайных нуклеотидов и аминокислот соответственно. Нуклеиновые кислоты, которые являются предшественниками пептидов, можно химически синтезировать, и, таким образом, они могут включать любой нуклеотид в любом положении. Таким образом, при экспрессии нуклеиновых кислот с образованием пептидов любой аминокислотный остаток может быть включен в любом положении. Процесс синтеза может быть предназначен для получения рандомизированных нуклеиновых кислот, чтобы обеспечить образование всех или большинства из возможных сочетаний на протяжении длины нуклеиновой кислоты, образуя, таким образом, библиотеку рандомизированных нуклеиновых кислот. Библиотека может обеспечить достаточно разнородную структурно группу рандомизиро- 61 029538 ванных продуктов экспрессии для того, чтобы влиять на достаточный в вероятностном смысле диапазон клеточных ответов в целях получения одной или нескольких клеток, проявляющих требуемый ответ.

Фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, может представлять собой мультидоменный фермент, который содержит сигнальный пептид, связывающий углеводы модуль, каталитический домен фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, линкер и/или другой каталитический домен.

Исходные полинуклеотиды (такие как нуклеиновая кислота), как правило, кодируют биологически активные полипептиды. Но возможно получение новых гибридных полипептидов с использованием клеточных процессов, которые объединяют последовательность исходных полинуклеотидов, так что полученный гибридный полинуклеотид кодирует полипептид, демонстрирующий активность, приобретенную от исходных биологически активных полипептидов, но отличающуюся от нее. Например, исходные полинуклеотиды могут кодировать конкретный фермент (такой как альдолаза) из различных микроорганизмов. Фермент, кодируемый первым полинуклеотидом из одного организма, или вариант может, например, эффективно функционировать в конкретных условиях окружающей среды, например при высоком процентном содержании соли. Фермент, кодируемый вторым полинуклеотидом из другого организма, или вариант может эффективно функционировать при других условиях окружающей среды, таких как крайне высокие температуры. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который проявляет свойства обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, объединенных для каждого из ферментов, кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например при высоком процентном содержании соли и предельных температурах.

Гибридный полипептид может проявлять специализированную ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редуктивной пересборки полинуклеотидов, кодирующих ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, полученный гибридный полипептид, кодируемый гибридным полинуклеотидом, можно подвергать скринингу в отношении специализированных видов активности не ферментов альдолаз, таких как виды активности не пируватальдолазы, такие как виды активности не альдолазы НМО и/или КОН, такие как виды активности гидролазы, пептидазы, фосфорилазы и т.д., полученные из каждого из исходных ферментов. Гибридный полипептид подвергают скринингу для выявления химических функциональных свойств, которые отличают гибридный фермент от исходных ферментов, таких как температура, рН или концентрация соли, при которых функционирует гибридный полипептид.

Способ получения биологически активного гибридного полипептида и скринингу такого полипептида в отношении усиленной активности включает:

1) введение в пригодную клетку-хозяин, по меньшей мере, первого полинуклеотида в функциональной связи и второго полинуклеотида в функциональной связи, где, по меньшей мере, первый полинуклеотид и второй полинуклеотид обладают по меньшей мере одним общим участком частичной гомологии последовательностей;

2) выращивание клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают реорганизацию последовательностей, приводящую к функционально связанному гибридному полинуклеотиду;

3) экспрессию гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;

4) скрининг гибридного полипептида в условиях, которые обеспечивают идентификацию усиленной биологической активности; и

5) выделение полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.

Выделение и выявление ферментов альдолаз.

Полинуклеотиды или ферменты можно выделять из отдельных организмов (изолятов), коллекций организмов, которые были выращены на определенных средах (обогащенные культуры), или некультивированных организмов (образцы из окружающей среды). Организмы можно выделять, например, биологическим пэннингом ш νί\Ό (см. описание ниже). Применение независимого от культивирования подхода для получения полинуклеотидов, кодирующих новые виды биологической активности, из образцов из окружающей среды является наиболее предпочтительным, поскольку он обеспечивает доступ к неизмененным источникам биологического разнообразия. Полинуклеотиды или ферменты также можно выделять из одного из множества организмов, таких как бактерии. В дополнение к цельным клеткам полинуклеотиды или ферменты также можно выделять из неочищенных препаратов ферментов, образованных из культур этих организмов, таких как бактерии.

Библиотеки окружающей среды получают из образцов из окружающей среды, и они представляют собой совокупные геномы природных организмов, хранящиеся в векторах для клонирования, которые можно воспроизводить в пригодных прокариотических хозяевах. Вследствие того, что клонированную ДНК исходно выделяют непосредственно из образцов из окружающей среды, библиотеки не ограничиваются небольшой фракцией прокариот, которые могут быть выращены в монокультуре. Кроме того, упорядочивание ДНК из окружающей среды, представленной в этих образцах, может обеспечить более равномерное представление ДНК из всех видов, находящихся в исходном образце. Это может привести к

- 62 029538 резкому повышению эффективности поиска интересующих генов из менее представленных компонентов образца, который на несколько порядков значимости может быть более редко встречающимся по сравнению с доминантными видами.

Библиотеки генов, полученные из одного или нескольких некультивированных микроорганизмов, подвергают скринингу в отношении представляющей интерес активности. Потенциальные каскады, кодирующие представляющие интерес биологически активные молекулы, сначала заключают в прокариотические клетки в форме библиотек для экспрессии генов. Полинуклеотиды, определяющие представляющие интерес виды активности, выделяют из библиотек и вводят в клетку-хозяин. Клетку-хозяин выращивают в условиях, которые обеспечивают рекомбинацию и/или редуктивную пересборку, с получением потенциально активных биологических молекул с новыми или усиленными видами активности.

Биологический пэннинг ш У1уо можно проводить с использованием устройств на основе ΡАСδ и неоптических (таких как магнитные) устройств. Конструируют комплексные библиотеки генов с векторами, которые содержат элементы, которые стабилизируют транскрибируемую РНК. Например, включение последовательностей, которые приводят к вторичным структурам, таким как шпильки, которые предназначены для фланкирования транскрибируемых участков РНК, может привести к усилению их стабильности, повышая, таким образом, их время полужизни в клетке. Молекулы зондов, используемые в процессе биологического пэннинга, состоят из олигонуклеотидов, меченных репортерными молекулами, которые флуоресцируют только при связывании зонда с молекулой-мишенью. Эти зонды вводят в рекомбинантные клетки из библиотеки с использованием одного из нескольких способов трансформации. Молекулы зондов связываются с транскрибируемой мРНК-мишенью, что приводит к гетеродуплексным молекулам ДНК/РНК. Связывание зонда с мишенью приведет к флуоресцентному сигналу, который детектируется и сортируется устройством ΡАСδ в процессе скрининга.

Для последующего выделения представляющих интерес последовательностей проводят субклонирование. В случае сублокнирования амплифицируют участок ДНК, расщепляют, главным образом, посредством ферментов рестрикции, чтобы вырезать требуемую последовательность, требуемую последовательность лигируют в реципиентный вектор и амплифицируют. На каждой стадии субклонирования участок исследуют в отношении представляющей интерес активности, чтобы убедиться, что ДНК, которая кодирует структурный белок, не была уничтожена. На любой стадии субклонирования вставку можно очищать, например, посредством гель-электрофореза, перед лигированием в вектор, или посредством помещения клеток, содержащих реципиентный вектор, и клеток, не содержащих реципиентный вектор, на селективные среды, содержащие, например, антибиотик, который вызывает гибель клеток, не содержащих реципиентный вектор. Конкретные способы субклонирования вставок кДНК в векторы хорошо известны в данной области (ЬатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаШгу Мапиа1, 2пй Ей., Со1й δρηΐ'ΐβ НагЬог БаЬогаЮгу Рге88 (1989)). Ферменты могут представлять собой субклоны. Такие субклоны могут отличаться от исходного родительского клона, например, длиной, мутацией, маркером или меткой.

Микроорганизмы, из которых можно выявлять, выделять или получать полинуклеотид, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕиЬас1епа и АгсЬаеЬас1епа, и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды можно выявлять, выделять и получать из образцов из окружающей среды, в случае которых нуклеиновую кислоту можно выделять без культивирования организма, или его можно выделять из одного или нескольких культивированных организмов. Такие микроорганизмы могут быть экстремофилами, такими как гипертермофилы, психрофилы, психротрофы, галофилы, барофилы и ацидофилы. Можно использовать полинуклеотиды, кодирующие ферменты, выделенные из экстремофильных микроорганизмов. Ферменты могут функционировать при температурах более 100°С, таких как температуры, встречающиеся в горячих источниках на суше и в термических кратерах на больших глубинах, или при температурах ниже 0°С, таких как температуры, встречающиеся в арктических водах, в окружающей среде, насыщенной солью, такой как среда в Мертвом море, при значениях рН приблизительно 0, таких как значения рН, встречающиеся в месторождениях угля и геотермических богатых серой источниках, или при значениях рН более 11, таких как значения рН в осадках сточных вод. Они могут обладать высокой активностью при широком диапазоне температур и рН.

Полинуклеотиды, отобранные и выделенные, как описано выше, вводят в пригодную клеткухозяина. Пригодная клетка-хозяин представляет собой любую клетку, способную обеспечивать рекомбинацию и/или редуктивную пересборку. Отобранные полинуклеотиды уже находятся в векторе, который включает соответствующие контрольные последовательности. Клетка-хозяин может представлять собой клетку высших эукариот, такую как клетка млекопитающих, или клетку низших эукариот, такую как клетка дрожжей, или клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина можно проводить трансфекцией фосфатом кальция, трансфекцией, опосредуемой ПЕАВ-декстраном, или электропорацией (Эаур е! а1., 1986).

Иллюстративные хозяева включают бактериальные клетки, такие как Е. соН, δί^еρΐοтусе8, δа1тοпе11а 1ур1итипит; клетки грибов, такие как клетки дрожжей; клетки насекомых, такие как ЭгохорННа δ2 и δροйορΐе^а δί9; клетки животных, такие как СНО, СОδ или клетки меланомы Во\уе5; аденовирусы; и клетки растений, см. описание ниже. Выбор походящего хозяина лежит в пределах квалификации спе- 63 029538 циалистов в данной области. исходя из приведенных здесь указаний.

Для экспрессии рекомбинантного белка можно использовать различные культуральные системы клеток млекопитающих; примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии СО8-7 фибробластов почки обезьяны. описанные в 8У40-1гаизГогтей зитаи се11з зиррой (Не герйсайои оГ еаг1у 8У40 ти!аи!з (С1и/таи. 1981). и другие клеточные линии. способные экспрессировать совместимый вектор. например. клеточные линии С127. 3Т3. СНО. НеЬа и ВНК. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации. пригодный промотор и энхансер. а также любые необходимые участки связывания рибосом. участок полиаденилирования. донорные и акцепторные участки сплайсинга. последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. Для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК. образованные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.

Нуклеиновые кислоты. полипептиды и способы иногда применяют в биохимических каскадах или для создания новых полинуклеотидов. кодирующих биохимические каскады из одного или нескольких оперонов или класторов генов или их фрагментов. Например. бактерии и многие эукариоты обладают координированным механизмом регуляции генов. продукты которых вовлечены в связанные процессы. Гены кластеризуются в структурах. называемых кластерами генов. на одной хромосоме и транскрибируются совместно под контролем единой регуляторной последовательности. включая единый промотор. который инициирует транскрипцию целого кластера. Таким образом. кластер генов представляет собой группу соседних генов. которые являются либо идентичными. либо родственными. как правило. в отношении их функции (примером биохимического каскада. кодируемого кластерами генов. являются поликетиды).

ДНК кластера генов выделяют из различных организмов и лигируют в векторы. в частности в векторы. содержащие регуляторные последовательности для экспрессии. которые могут контролировать и регулировать продукцию поддающегося детекции белка или связанную с белком совокупную активность в лигированном кластере генов. Применение векторов. которые обладают исключительно высокой способностью к введению экзогенной ДНК. является особенно пригодным для таких кластеров генов и описано в настоящем документе в качестве примера. включая Г-фактор (или фактор фертильности) Е. сой. Этот Г-фактор Е. сой представляет собой плазмиду. которая инициирует перенос себя с высокой частотой в процессе конъюгации и является идеальной для получения и стабильного воспроизведения крупных фрагментов ДНК. таких как кластеры генов из смешанных микробных образцов. Часто используют векторы для клонирования. называемые фосмидами. или векторы искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). Они образованы из Г-фактора Е. сой. который способен стабильно встраивать большие сегменты геномной ДНК. В случае интеграции с ДНК из смешанного некультивированного образца из окружающей среды. это обеспечивает возможность получения больших геномных фрагментов в форме ДНК-библиотеки из окружающей среды. Другим типом вектора для применения является космидный вектор. Космидные векторы изначально были предназначены для клонирования и воспроизведения крупных сегментов геномной ДНК. Клонирование в космидные векторы подробно описано в 8атЬгоок е! а1.. Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога!огу Маииа1. 2ий Ей.. Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз (1989). После лигирования в соответствующий вектор в пригодную клетку-хозяин можно вводить два или более векторов. содержащих различные гены синтетазы поликетида. Участки частичной гомологии последовательностей. общие для кластеров генов. обеспечат процессы. которые приведут к реорганизации последовательностей. приводящей к гибридному кластеру генов. Затем новый гибридный кластер генов можно подвергать скринингу в отношении усиленных видов активности. не встречающихся в исходных кластерах генов.

Способы скрининга в отношении различных видов ферментативной активности известны специалистам в данной области и рассмотрены в настоящем описании. см. примеры 1. 2 и 3 ниже. Такие способы можно использовать при выделении полипептидов и полинуклеотидов.

Методологии скрининга и устройства для мониторинга он-лайн.

В применении на практике можно использовать различные устройства и методологию совместно с полипептидами и нуклеиновыми кислотами.например. для скрининга полипептидов в отношении активности ферментов альдолаз. таких как пируватальдолаза. такая как альдолаза НМО и/или КОН. для скринига соединений в качестве потенциальных модуляторов. таких как активаторы или ингибиторы. активности ферментов альдолаз. таких как пируватальдолаза. такая как альдолаза НМО и/или КОН. антител. которые связываются с полипептидом. нуклеиновых кислот. которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой . для скрининга клеток. экспрессирующих полипептид и т.п. Эти устройства. например. включают масс-спектрометры. хроматографы. например. высокопроизводительные ВЭЖХ и другие формы жидкостной хроматографии. и форматы меньших размеров. такие как 1536-луночные планшеты. 384-луночные планшеты и т. д. Для применения на практике можно адаптировать и использовать устройства для высокопроизводительного скрининга. см. патентные заявки США №№ 20020001809; 20050272044.

Капиллярные матрицы.

Нуклеиновые кислоты или полипептиды можно иммобилизовать или наносить на матрицу. Матрицы можно использовать для скрининга или мониторинга библиотек композиций (таких как низкомолеку- 64 029538 лярные соединения, антитела, нуклеиновые кислоты и т.д.) в отношении их способности связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по этому изобретению или модулировать их активность. Капиллярные матрицы, такие как ОIОΑМΑТΚ1X'™. Эйегеа Согрогайоп, δаη О1едо, СΑ; и матрицы, описанные, например, в патентной заявке США № 20020080350 Α1; ΥΟ 0231203 А; ΥΟ 0244336 А, представляют собой альтернативные устройства для хранения и скрининга образцов. Капиллярная матрица может включать множество капилляров, составляющих матрицу из смежных капилляров, где каждый капилляр содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для нахождения в нем образца. Просвет может обладать цилиндрической, квадратной, шестиугольной или любой другой геометрической формой при условии, что стенки формируют просвет для нахождения в нем жидкости или образца. Капилляры капиллярной матрицы могут удерживаться вместе в непосредственной близости с формированием плоской структуры. Капилляры могут быть соединены друг с другом, посредством слияния (например, если капилляры изготовлены из стекла), склеивания, связывания или скрепления бок о бок. Кроме того, капиллярная матрица может включать промежуточный материал, находящийся между соседними капиллярами в матрице, образуя, таким образом, твердое плоское приспособление, содержащее множество сквозных отверстий.

Капиллярная матрица может быть образована любым количеством отдельных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Кроме того, капиллярной матрице приблизительно с 100000 или более отдельных капилляров можно придавать форму планшета МюгоШег® со стандартным размером и формой для соответствия стандартному лабораторному оборудованию. Просветы заполняют вручную или автоматически с использованием либо капиллярного действия, либо микроинъекций с использованием тонкой иглы. Представляющие интерес образцы можно впоследствии удалять из отдельных капилляров для последующего анализа или характеризации. Например, тонкий игольчатый наконечник устанавливают в подвижном соединении с выбранным капилляром либо для добавления, либо для отбора материала из просвета.

В анализе для скрининга в одной емкости перед помещением в капиллярную матрицу компоненты для анализа смешивают с получением представляющего интерес раствора. Просвет вследствие капиллярного действия заполняется, когда по меньшей мере часть матрицы погружают в интересующий раствор. Химические или биологические реакции и/или активность в каждом капилляре подвергают мониторингу в отношении поддающихся детекции событий. Поддающееся детекции событие часто называется хитом, который, как правило, отличают от полученного в капиллярах не хита способами оптического определения. Таким образом, капиллярные матрицы дают возможность множественного параллельного определения хитов.

В скрининговом анализе во множестве емкостей полипептид или нуклеиновую кислоту, такую как лиганд, можно помещать в первый компонент, который вводят по меньшей мере в часть капилляров капиллярной матрицы. Затем после первого компонента в капилляры можно вводить пузырьки воздуха. Затем в капилляры можно вводить второй компонент, где второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Затем первый и второй компоненты можно смешивать применением гидростатического давления с обеих сторон капиллярной матрицы с удалением пузырька. Затем капиллярную матрицу подвергают мониторингу в отношении наличия поддающегося детекции события, возникающего в результате наличия реакции или отсутствия реакции двух компонентов.

В скрининговом анализе связывания представляющий интерес образец можно вводить в капилляр капиллярной матрицы в качестве первой жидкости, меченной поддающимися детекции частицами, где просвет капилляра покрыт связывающим материалом для связывания поддающейся детекции частицы в просвете. Затем первую жидкость можно удалять из капиллярной трубки, при этом связанные поддающиеся частицы остаются в капилляре, и в капиллярную трубку можно вводить вторую жидкость. Затем капилляр подвергают мониторингу в отношении поддающегося детекции события, возникающего в результате наличия или отсутствия реакции частицы со второй жидкостью.

Матрицы или биочипы.

Нуклеиновые кислоты или полипептиды можно иммобилизовать или наносить на матрицу. Матрицы можно использовать для скрининга или мониторинга библиотек композиций (таких как низкомолекулярные соединения, антитела, нуклеиновые кислоты и т.д.) в отношении их способности связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом или модулировать их активность. Например, подлежащим мониторингу параметром является экспрессия транскрипта гена фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Один или несколько или все транскрипты клетки можно определять гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки, или нуклеиновые кислоты, соответствующие или комплементарные транскриптам клетки, гибридизацией с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице, или биочипе. С использованием матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе некоторые или все транскрипты клетки можно одновременно количественно определять. Альтернативно также можно использовать матрицы, содержащие геномную нуклеиновую кислоту, для определения генотипа нового сконструированного штамма. Также для одновременного количественного определения множества белков можно использовать полипептидные матрицы. На практике можно применять любую известную матрицу, так называемую микроматрицу, или матрицу нуклеиновых

- 65 029538 кислот, или полипептидную матрицу, или матрицу антител, или биочип, или их варианты. Матрицы представляют собой в общем множество пятен или элементов-мишеней, при этом каждый элемент-мишень включает определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата для специфического связывания молекулы образца, такой как транскрипты мРНК.

Как используют в настоящем документе, термины матрица, или микроматрица, или биочип, или чип представляют собой множество элементов-мишеней, при этом каждый элемент-мишень содержит определенное количество одного или нескольких полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата, как более подробно описано ниже.

При применении на практике можно использовать любую известную матрицу и/или способ получения и применения матриц, в целом или частично, или их варианты, как описано, например, в патентах США №№ 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098; 5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; также см., например, №О 99/51773; №О 99/09217; №О 97/46313; №О 96/17958; также см., например, 1оЬпкЮп (1998) Сшт. Вю1. 8:К171-К174; δΗιιιιηιικΓ (1997) ВюЮсЬпщиек 23:1087-1092; Кегп (1997) ВМесЬтдиек 23:120-124; δο1^ηак-Το1бο (1997) Сепек, СЬготокотек & Сапсег 20:399-407; Во\\1е11 (1999) №1иге Сепепск δирр. 21:25-32. Также см. опубликованные патентные заявки США №№ 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449;20010014448;20010012537;20010008765.

Антитела и способы скрининга на основе антител.

Антитела можно применять для выделения, идентификации и количественного определения ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Эти антитела можно применять для выделения других полипептидов или других сходных ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Антитела могут быть предназначены для связывания с активным центром фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН.

Термин антитело включает пептид или полипептид, полученный из, смоделированный после этого, или, по существу, кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов, или его фрагменты, способные специфично связываться с антигеном или эпитопом, см. Рипбатеп1а1 1ттипо1оду, ТЫгб ЕбШоп, ^.Е. Раи1, еб., Каνеη Ргекк, Ν.Υ. (1993); \Убкоп (1994) 1. 1ттипо1. Мебюбк 175:267-273; УагтикЬ (1992) 1. ВюсЬет. ВюрЬук. Мебюбк 25:85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие фрагменты, т.е. антигенсвязывающие участки (такие как фрагменты, подпоследовательности, определяющие комплементарность участки (СОК)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая: (ί) РаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент состоящий из доменов УЬ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')₂ фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рб-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Ρν-фрагмент, состоящий из доменов УЬ и УН на одном плече антитела, (ν) бАЬ-фрагмент (^агб е1 а1., (1989) ЫаШге 341:544546), который состоит из домена УН; и (νί) отдельный определяющий комплементарность участок (СОК). Одноцепочечные антитела также входят в понятие термина антитело.

Антитела можно использовать для иммунопреципитации, окрашивания, в иммуноаффинных колонках и т. п. Если желательно, можно получать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих конкретные антигены, посредством иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на матрице по этому изобретению. Альтернативно можно модифицировать структуры антитела, продуцируемого клеткой, подлежащей для модификации, например можно повышать или снижать аффинность антитела.

Способы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описаны в научной и патентной литературе, см., например, СоЬ§ап, СИККЕЭТ РКОΤОСО^δ ΙΝ 1ММи]\ЮЬОСУ, ^беу/Сгеепе, ΝΥ (1991); δΐΐΑΜ (ебк.) ВАδIС ЛУП СЫМСАЬ !ММП\ОПОСУ (71Ь еб. ) Ьапде Мебюа1 РиЬЬсаЬопк, Ьок АЬок, СА ('Ъб1ек); Собшд, МОЫОСЬОЫАЬ Л\Т1ВО1)П'У: РКINСIР^Εδ ЛУП РКАСТ1СЕ (2б еб.) Асабетю Ргекк, Ун Уогк, ΝΥ (1986); КоЬ1ег (1975) УаПие 256:495; Наг1ом (1988) А ЬАВОКАТОКУ МАУиАН Со1б δππιιμ

НагЬог РиЬЬсаЬопк, Νονν Уогк. В дополнение к традиционным способам ш νί\Ό с использованием животных антитела также можно получать ш М11го, например, с использованием библиотек фагового дисплея, экспрессирующих рекомбинантные участки связывания антител. См. НоодепЬоот (1997) Тгепбк Вю1есЬпо1. 15:62-70; Ка1/ (1997) Аппи. Кеу. ВюрЬук. Вюто1. δίπκΐ. 26:27-45.

Полипептиды или его фрагменты, содержащие по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, также можно применять для получения антител, которые специфично связываются с полипептидами или фрагментами. Полученные в результате антитела можно использовать в способах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для определения наличия полипептида в биологическом образце. В таких способах препарат белка, такой как экстракт, или биологический образец подвергают контактированию с антителом, способным специфично связываться с одним из полипептидов или с его фрагмента- 66 029538 ми, содержащими по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот.

При иммуноаффинных способах антитела присоединяют к твердой подложке, такой как гранулы или другая матрица колонки. Препарат белка подвергают контактированию с антителом в условиях, при которых антитело специфично связывается с одним из полипептидов по этому изобретению или его фрагментом. После промывания для удаления неспецифично связанных белков элюируют специфично связанные полипептиды.

Способность белков в биологическом образце связываться с антителом можно определять с использованием любого из множества способов, известных специалистам в данной области. Например, связывание можно определять мечением антител поддающейся детекции меткой, такой как флуоресцентное вещество, ферментативная метка или радиоизотоп. Альтернативно детекцию связывания антитела с образцом можно проводить с использованием вторичного антитела, обладающего на нем такой поддающейся детекции меткой. Конкретные способы анализа включают анализы ЕЫЗА, сэндвич-анализы, радиоиммунные анализы и вестерн-блоты.

Поликлональные антитела, образованные к полипептидам или его фрагментам, содержащим по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, можно получать посредством непосредственной инъекции полипептидов животному или введения полипептидов животному, например, не относящемуся к человеку. Полученное таким образом антитело может связывать непосредственно полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующую только фрагмент полипептида, можно использовать для получения антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Затем такие антитела можно использовать для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих этот полипептид.

Для получения моноклональных антител можно использовать любой способ, который приводит к антителам, продуцируемым непрерывными культурами клеточных линий. Их примеры включают способы гибридом (Кой1ег апй МПк!ет, Иа!иге, 256:495-497, 1975), способ триом, способ В-клеточной гибридомы (Ко/Ьог е! а1., 1штипо1о§у Тойау 4:72, 1983) и способ ЕΒV-гибридомы (Со1е, е! а1., 1985, ш Мопос1опа1 АпйЪоФек апй Сапсег Тйегару, А1ап К. Ыкк, 1пс., рр. 77-96).

Для получения одноцепочечных антител против полипептидов или его фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, можно адаптировать способы, описанные для получения одноцепочечных антител. Альтернативно для экспрессии гуманизированных антител против этих полипептидов или их фрагментов можно использовать трансгенных мышей.

Антитела, полученные против полипептидов или его фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15., 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, можно использовать для скрининга аналогичных полипептидов из других организмов и образцов. В таких способах полипептиды из организма подвергают контактированию с антителом и выявляют полипептиды, которые специфично связываются с антителами. Для детекции связывания антитела можно использовать любые из описанных выше способов. Один такой скрининговый анализ описан в Зйи1тап Н., ЕЪегйагй А., ЕЪегйагй С., Ый/иг З., Кетап Е., Вюогд Мей. Сйет. Ье!!. 2000 Ос! 16; 10 (20) :23536, Н1дй1у кепкЮуе апй гар1й йе!ес!юп ой апйЬойу са!а1уык Ъу 1иттексеп! Ъас!епа.

Инженерия цельных клеток и измерение параметров метаболизма.

Генетический набор можно модифицировать добавлением в клетку нуклеиновой кислоты, такой как кодирующая последовательность фермента. См. VО 0229032; VО 0196551.

Для выявления нового фенотипа в клетке проводят мониторинг по меньшей мере одного параметра метаболизма модифицированной клетки в режиме реального времени или в режиме он-лайн. Клеточную культуру подвергают мониторингу в реальном времени или он-лайн. Множество метаболических параметров тоже подвергают мониторингу в реальном времени или он-лайн. Метаболические параметры можно подвергать мониторингу с использованием ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, по этому изобретению.

Анализ метаболических изменений (МРА) основан на известной биохимической концепции. На основе закона сохранения масс и гипотезы квазистационарного состояния (РЗЗН) конструируют линейную независимую метаболическую матрицу внутриклеточных метаболитов. При этом устанавливают метаболические сети, включая тип всех каскадов субстратов, продуктов и промежуточных соединений, тип всех химических реакций, взаимопревращающих метаболиты каскадов, стереохимию каскадов реакций, тип всех ферментов, катализирующих реакции, кинетику ферментативных реакций, регуляторные взаимодействия между компонентами каскадов, такие как аллостерические взаимодействия, взаимодействия фермент-фермент и т.д., внутриклеточную компартментализацию ферментов или любую другую надмолекулярную организацию ферментов и наличие любого градиента концентрации метаболитов, ферментов или эффекторных молекул или

- 67 029538 диффузионных барьеров для их движения.

После построения метаболического каскада для данного штамма для оценки внутриклеточных метаболических изменений можно включать математическую презентацию по принципу матрицы, если доступны данные метаболизма он-лайн. Метаболический фенотип основан на изменениях целого метаболического каскада внутри клетки. Метаболический фенотип основан на изменении использования каскада относительно условий окружающей среды, генетического регулирования, стадии развития и генотипа и т.д. После вычисления МРА он-лайн динамическое поведение клеток, их фенотип и другие свойства анализируют с использованием каскада. Например, если в процессе ферментации дрожжей предоставление глюкозы повышать, а кислорода снижать, использование дыхательных каскадов будет снижаться и/или останавливаться, а использование ферментативных путей будет преобладать. Контроль физиологического состояния клеточной культуры становится возможным после анализа каскадов. Результаты МРА также можно сравнивать с транскриптомными и протеомными данными для разработки экспериментов и протоколов метаболической инженерии или перетасовки генов и т.д.

Клетке может быть передан и определен любой модифицированный или новый фенотип, включая новые или улучшенные свойства. Мониторингу можно подвергать любой аспект метаболизма или роста.

Мониторинг экспрессии транскрипта мРНК.

Повышенную или сниженную экспрессию можно проследить посредством тестирования в отношении наличия фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, или посредством способов анализа активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Транскрипты мРНК, или элементы информации, также можно выявлять и количественно определять любым способом, известным в данной области, включая, например, нозернблот анализ, количественные реакции амплификации, гибридизацию на матрицах и т.п. Количественные реакции амплификации включают, например, количественную ПЦР, включая, например, количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, или ОТ-ПЦР; количественную ОТ-ПЦР в режиме реального времени, или динамическую ОТ-ПЦР в реальном времени (см. Кгеи/ег (2001) Вг. 1. Наета!о1. 114:313-318; Х1а (2001) Т^аηкр1аη!а!^ои 72:907-914).

Сконструированный же фенотип получают посредством нокаута экспрессии гомологичного гена. Можно подвергать нокауту кодирующую последовательность гена или одного или нескольких элементов контроля транскрипции, таких как промоторы или энхансеры. Таким образом, экспрессию транскрипта можно полностью останавливать или только снижать.

Сконструированный фенотип может включать повышение экспрессии гомологичного гена. Этого можно добиться посредством нокаута отрицательного контрольного элемента, включая цис- или трансрегуляторный элемент регуляции транскрипции, или внесение мутации в положительный контрольный элемент. Один или несколько, или все транскрипты клетки можно определять гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, соответствующие или комплементарные транскрипту клетки, с иммобилизованными на матрице нуклеиновыми кислотами.

Анализ экспрессии полипептидов, пептидов и аминокислот.

Итак, сконструированный фенотип включает повышение или снижение экспрессии полипептида (такого как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН) или образование новых полипептидов в клетке. Эту повышенную или сниженную экспрессию можно проследить определением количества имеющегося фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, или способами анализа активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Полипептиды, пептиды и аминокислоты также можно выявлять и количественно определять любым способом, известным в данной области, включая, например, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спетрофотометрию, радиографию (внесения радиоактивной метки в белок), электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТЬС), сверхдиффузионную хроматографию, различные иммунологические способы, такие как иммунопреципитация, иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез, способы радиоиммунного анализа (К1А), способы твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫБА), иммунофлюоресцентные способы анализа, гель-электрофорез (например, δΌδ-РАОЕ), окрашивание с помощью антител, активизированную флюоресценцией сортировку клеток (РАСδ), пиролитическую масс-спектрометрию, инфракрасную спектрометрию Фурье, Раман-спектрометрию, ΟС-Μδ и способы масс-спектрометрии ЬС-электрораспыления, и кэп-ЬС-тандем-электрораспыления и т.п. Скрининг новых видов биологической активности также можно проводить с использованием способов, или их вариантов, описанных в патенте США № 6057103. Более того, как подробно описано ниже, один или несколько или все полипептиды клетки можно определять с использованием белковой матрицы.

Промышленные, фармацевтические и другие способы применения.

Полипептиды (например, имеющие альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО) могут катализировать образование или расщепление углерод-углеродных связей. Эти ферменты могут представлять собой высокоселективные катализаторы, пригодные для промышленного фармацевтического применения.

Превращение биомассы и получение чистого биологического топлива.

- 68 029538

Ферменты, таким как альдолазы, включая пируватальдолазы, такие как, но, не ограничиваясь этим, альдолазы ΗΜΟ и/или КΗΟ (включая смеси, или коктейли ферментов)могут применяться в способах превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала (например, любой композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин) в топливо (например, биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, биодизель). Таким образом, композиции и эти способы обеспечивают эффективные и надежные альтернативы или дополнения к применению нефтяных продуктов, например, в качестве смеси биоэтанола и газолина. Причем организмы, экспрессирующие ферменты для участия в химических циклах, вовлекаются в превращение природной биомассы. Эти ферменты и способы превращения применяют в виде набора ферментов для эффективной деполимеризации целлюлозных и гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых углеродных групп. Способы позволяют получить превращенный лигноцеллюлозный материал (обработанного ферментами) для превращения его в топливо (например, биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, биодизель) посредством ферментации и/или химического синтеза.

Ферменты (включая, например, организмы, такие как микроорганизмы, например, грибы, дрожжи или бактерии, производящие и секретирующие рекомбинантные ферменты) можно применять или включать/добавлять на любой стадии процесса превращения любой биомассы, например на любой стадии, нескольких стадиях или их включают во все стадии, или во все из представленных ниже способов превращения биомассы, или всех из этих альтернатив биотоплива.

Прямое сжигание: сжигание материала прямым нагреванием представляет собой наиболее простую технологию биомасс; она может быть высокоэкономичной, если источник биомассы расположен поблизости.

Пиролиз: представляет собой термическую деградацию биомассы посредством нагревания в отсутствие кислорода. В одном варианте осуществления, биомассу нагревают до температуры между приблизительно 800 и 1400° по Фаренгейту, однако кислород для поддержания горения не подают, что приводит к образованию газа, жидкого топлива и угля.

Газификация: биомассу можно использовать для образования метана посредством нагревания или анаэробного расщепления. Из биомассы может быть получен синтетический газ, смесь моноксида углерода и водорода.

Газ из органических отходов: получают посредством разложения (анаэробного расщепления) зарытого в землю мусора на свалках. Когда органические отходы разлагаются, они образуют газ, состоящий приблизительно на 50% из метана, основного компонента природного газа.

Анаэробное расщепление: превращает органическое вещество в смесь метана, основного компонента природного газа и диоксида углерода. В одном варианте осуществления биомассу, такую как водную биомассу (сточные воды), перегной или отходы пищевой промышленности, смешивают с водой и подают в емкость для расщепления без воздуха.

Ферментация.

Спиртовое брожение: спиртовое топливо получают превращением крахмала в сахар, ферментацией сахара в спирт, с последующим разделением водной смеси спирта дистилляцией. Пищевое сырье, такое как пшеница, ячмень, картофель и бумажные отходы, древесные опилки и солому, содержащие сахар, крахмал или целлюлозу, можно превращать в спирт ферментацией с помощью дрожжей.

Переэтерификация: иллюстративную реакцию превращения масла в биодизель называют переэтерификацией. В процессе переэтерификации происходит реакция спирта (такого как метанол) с триглицеридными маслами, находящимися в растительных маслах, животных жирах или утилизированных смазочных маслах, с образованием алкильных сложных эфиров жирных кислот (биодизеля) и глицерина. Для реакции требуется нагревание и сильноосновный катализатор, такой как гидроксид натрия или гидроксид калия.

Биодизель: биодизель представляет собой смесь алкильных сложных эфиров жирных кислот, изготавливаемую из растительных масел, животных жиров или утилизированных смазочных масел. Биодизель можно применять в качестве топлива для транспортных средств в его чистом виде, однако обычно его используют в качестве дизельной добавки в нефть в целях снижения уровней твердых частиц, моноксида углерода, углеводородов и токсических веществ в воздухе из дизельных транспортных средств.

Гидролиз: включает гидролиз соединения, например, биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, катализируемый с использованием фермента по настоящему изобретению.

Когенерация: представляет собой одновременное получение более чем одной формы энергии с использованием одного топлива и оборудования. В одном варианте осуществления когенерация биомассы обладает большим потенциалом развития, чем выработка энергии из биомассы отдельно, поскольку когенерация приводит как к теплу, так и к электричеству.

Полипептиды с активностью альдолазы, включая активность пируватальдолазы, такую как, но не ограничиваясь этим, активностью альдолазы ΗΜΟ и/или КΗΟ или другой ферментативной активностью, пригодны для образования биодизеля, биоэтанола, биобутанола, биопропанола или биометанола из органического материала, например из биомассы, такой как композиции, образованные из растений и животных, включая любые сельскохозяйственные культуры или другое возобновляемое сырье, сельскохозяй- 69 029538 ственные отходы или отходы животноводства, или органические компоненты муниципальных и промышленных отходов, или микроорганизмы, такие водоросли или дрожжи. Эти полипептиды применяют в процессах превращения лигноцеллюлозной биомассы в этанол, бутанол, пропанол, метанол, или, в ином случае, их применяют в процессах гидролиза или расщепления биоматериалов, чтобы их можно было использовать в качестве биотоплива (включая биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол или биодизель), или для упрощения переработки биомассы в топливо.

Их (полипептиды) также применяют в процессах переэтерификации, при которой происходит реакция спирта (такого как метанол) с триглицеридным маслом, находящимся в растительном масле, животном жире или утилизированных смазочных маслах, с образованием сложных эфиров жирных кислот (биодизеля) и глицерина. Биодизель можно получать из соевого масла или утилизированного кухонного жира. Животные жиры, другие растительные масла и другие утилизированные масла также можно использовать для получения биодизеля, в зависимости от их стоимости и доступности. Для получения биодизельного топлива можно использовать смеси жиров и масел всех типов.

Описанные в заявке ферменты также можно использовать при рафинировании глицерина. Побочный продукт глицерина содержит не вступивший в реакцию катализатор и мыла, которые нейтрализуют кислотой. Воду и спирт удаляют с получением от 50 до 80% неочищенного глицерина. Остальные примеси включают не вступившие в реакцию жиры и масла, которые можно обрабатывать с использованием полипептидов по этому изобретению. В больших биодизельных предприятиях по этому изобретению глицерин можно далее очищать, например, до 99% или более высокой чистоты для фармацевтической и косметической промышленности.

Биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель, полученные с использованием полипептидов, можно применять с оксигенатами топлива для улучшения характеристик горения. Добавление кислорода приводит к более полному сгоранию, которое снижает выделение монооксида углерода. Это представляет собой другую экологическую пользу замены нефтяного топлива биотопливом (например, топливом по этому изобретению).

Биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель можно смешивать с газолином с образованием смеси Е10 (приблизительно от 5 до 10% этанола и приблизительно от 90 до 95% газолина), однако их можно использовать в более высоких концентрациях, например Е85 или в их чистой форме. Биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель можно смешивать с нефтяным дизелем с получением смеси В20 (20% биодизель и 80% нефтяной дизель), хотя можно использовать другие уровни, вплоть до В100 (чистый биодизель).

Этанол (биоэтанол), бутанол (биобутанол), пропанол (биопропанол), метанол (биометанол) и/или дизель (биодизель) можно получать из композиций, содержащих лигноцеллюлозную биомассу. Материал лигноцеллюлозной биомассы можно получать из сельскохозяйственных культур, в качестве побочного продукта изготовления продуктов питания или кормов, или в качестве лигноцеллюлозных отходов производства, таких как растительные отходы и бумажные отходы. Примеры пригодных растительных источников или растительных отходов для обработки полипептидами включают золу бурых водорослей, водоросли, зерна, семена, стебли, листья, шелуху, скорлупу, сердцевину кукурузного початка, кукурузную солому, солому, травы (например, аиру голубую, такую как Зогдйа81гит иШаик; или просо, например, виды Рашсит, такие как Рашсит \агда1ит) и т.п., а также деревья, древесную щепу, древесную массу и древесную стружку. Примеры бумажных отходов, пригодных для обработки полипептидами по этому изобретению, включают выброшенную бумагу для фотокопирования, бумагу для компьютерного принтера, бумагу тетрадей, бумагу блокнотов, машинописную бумагу и т.п., а также газеты, журналы, картон и бумажные упаковочные материалы.

Более традиционные способы получения этанола, метанола, бутанола, пропанола и/или дизеля из биомассы это, например, такие как способы, включающие гидролиз лигноцеллюлозных материалов посредством воздействия на высушенный лигноцеллюлозный материал в реакторе катализатора, содержащего разбавленный раствор сильной кислоты и соль металла; это может снизить энергию активации или температуру гидролиза целлюлозы с обеспечением большего выхода сахаров; см., например, патенты США №№ 6660506 и 6423145.

Гидролиз лигноцеллюлозного материала, содержащего гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнин, может осуществляться посредством проведения стадии первого этапа гидролиза материала в водной среде при температуре и давлении, выбранных для достижения деполимеризации гемицеллюлозы без значительной деполимеризациии целлюлозы до глюкозы. Эта стадия приводит к густой массе, в которой жидкая фаза содержит растворенные моносахариды, образованные при деполимеризации гемицеллюлозы, и твердая фаза содержит целлюлозу и лигнин. Стадия второго этапа гидролиза может включать условия, при которых, по меньшей мере, основная часть целлюлозы деполимеризуется, такая стадия приводит к жидкой водной фазе, содержащей растворенные/растворимые продукты деполимеризации целлюлозы. См., например, патент США № 5536325. Ферменты можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного процесса.

Применение ферментов также включает обработку содержащего лигноцеллюлозу материала биомассы с помощью одной или нескольких стадий гидролиза разбавленной кислотой посредством прибли- 70 029538 зительно от 0,4 до 2% сильной кислоты, и обработку не вступившего в реакцию твердого лигноцеллюлозного компонента гидролизованного кислотой материала биомассы посредством щелочной делигнификации с образованием предшественников биологически деградируемых термопластов и производных. См., например, патент США № 6409841. Ферменты можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного процесса.

Применение ферментов включает предгидролиз лигноцеллюлозного материала в реакторе для предгидролиза; добавление кислой жидкости к твердому лигноцеллюлозному материалу с образованием смеси; нагревание смеси до температуры реакции; поддержание температуры реакции в течение периода времени, достаточного для фракционирования лигноцеллюлозного материала на растворенную часть, содержащую по меньшей мере приблизительно 20% лигнина из лигноцеллюлозного материала, и твердую фракцию, содержащую целлюлозу; отделение растворенной части от твердой фракции при температуре реакции, или при близкой температуре, где целлюлоза в твердой фракции становится более подверженной ферментативному расщеплению; и выделение растворенной части. См., например, патент США № 5705369. Ферменты можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного процесса.

Композиции моторного топлива (например, для двигателей с электорозажиганием) на основе жидких углеводородов, смешанных с топливным спиртом, тоже изготовляются с использованием фермента. Так, например, топливо, изготовленное с использованием фермента, содержит, например, смеси конденсированный угарный газ или конденсированный природный газ-этанол, метанол, бутанол, пропанол и/или дизель. При этом сорастворитель представляет собой полученный из биомассы 2метилтетрагидрофуран (МТНР). См., например, патент США № 6712866.

Ферментативная деградация лигноцеллюлозы, например, для продукции этанола из лигноцеллюлозного материала также может включать применение ультразвуковой обработки материала биомассы; см., например, патент США № 6333181.

Способы получения биоэтанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизеля из целлюлозного субстрата включают предоставление реакционной смеси в форме густой массы, содержащей целлюлозный субстрат, фермент и средство для ферментации (например, в реакционной емкости, такой как биореактор с полунепрерывной подачей твердых веществ), и реакционную смесь подвергают реакции в условиях, достаточных для инициации и поддержания реакции ферментации (как описано, например, в патентной заявке США № 20060014260). При этом можно определить оптимальную частоту подачи. Иногда в реакционную емкость подают дополнительные количества целлюлозного субстрата и фермента через промежуток(ки) времени, соответствующй(ие) оптимизированной частоте подачи.

Один иллюстративный процесс получения биотоплива (такого как биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель) описан в публикациях патентных заявок США №№ 20050069998; 20020164730; и он включает стадии измельчения лигноцеллюлозной биомассы (например, до размера 1530 мм), предварительную обработку полученного продукта паровым взрывом (например, при температуре 190-230°С) в течение между 1 и 10 мин в реакторе; сбор предварительно обработанного материала в циклоне или сходном изделии; и разделение жидкой и твердой фракций фильтрацией в фильтре под давлением, подачу твердой фракции в емкость для ферментации и добавление одного или нескольких ферментов, например фермента целлюлазы и/или бета-глюкозидазы (например, растворенных в цитратном буфере, рН 4,8).

Другой иллюстративный процесс получения биотоплива (такого как биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, и/или биодизель), предусматривающий применение ферментов, включает предварительную обработку исходного материала, содержащего лигноцеллюлозное сырье, содержащее, по меньшей мере, гемицеллюлозу и целлюлозу. Причем исходный материал включает картофель, сою (рапсовое семя), ячмень, рожь, кукурузу, овес, пшеницу, свеклу или сахарный тростник или компонент, или отходы, или побочный продукт изготовления продуктов питания или кормов. Исходный материал (сырье) подвергают реакции в условиях, при которых нарушается структура растительных волокон, для проведения. по меньшей мере частичного, гидролиза гемицеллюлозы и целлюлозы. Условия разрушения могут включать, например, воздействие на исходный материал температуры в среднем от 180 до 270°С при рН от 0,5 до 2,5 в течение приблизительно от 5 с до 60 мин; или температуры от 220 до 270°С, при рН от 0,5 до 2,5 в течение от 5 до 120 с, или эквивалентные условия. Это приводит к повышенной подверженности сырья расщеплению ферментом, например ферментом целлюлазой по этому изобретению. Патент США № 6090595.

Иллюстративные условия гидролиза лигноцеллюлозного материала включают реакции при температурах приблизительно между 30 и 48°С и/или рН приблизительно между 4,0 и 6,0. Другие иллюстративные условия включают температуру приблизительно между 30 и 60°С и рН приблизительно между 4,0 и 8,0.

Ферменты могут катализировать реакции с высокой стерео-, регио- и хемоселективностью. Фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, можно конструировать, чтобы он функционировал в различных растворителях, действовал при крайних значениях рН (например, высокие значения рН и низкие значения рН), при крайних температурах (например, высокие температуры и низкие температуры), при крайних уровнях содержания солей (например, высокий уро- 71 029538 вень содержания солей и низкий уровень содержания солей) и катализировал реакции с соединениями, которые являются структурно несходными с его природными, физиологическими субстратами.

Корма и продукты питания или добавки в корма и продукты питания.

Корма для животных, продукты питания и добавки содержат фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению и/или антитела. Животное может представлять собой любое сельскохозяйственное животное или любое животное.

Добавка в корм для животных может представлять собой гранулированный ферментный продукт, который можно легко смешивать с компонентами корма. Альтернативно добавки в корм могут составлять компонент предварительной смеси.

Гранулированный ферментный продукт может быть покрытым или непокрытым. Размер частиц ферментных гранул может быть совместимым с компонентами корма и предварительной смеси. Это обеспечивает безопасный и удобный способ включения ферменты в корма. Альтернативно добавка в корм для животных может представлять собой стабилизированную жидкую композицию. Она может представлять собой водную или масляную густую массу. См. патент США № 6245546.

Альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, в случае модификации корма или продукта питания, может воздействовать на продукт питания или корм либо ш νίΙΐΌ (посредством модификации компонентов корма или продуктов питания), либо ш νί\Ό. Полипептиды можно добавлять в композиции кормов или продуктов питания.

Фермент добавляют в сочетании с другим ферментом, таким как бета-галактозидазы, каталазы, лакказы, целлюлазы, другие альдолазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, беталакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, фитазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеазы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы. Продукты расщепления этих ферментов легче усваиваются животными. Таким образом, фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может обеспечивать доступную энергию корма или продукта питания или усвояемость продукта питания или корма посредством разрушения целлюлозы.

Фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, можно предоставлять экспрессией ферментов непосредственно в трансгенных кормовых культурах (в качестве, например, трансгенных растений, семян и т.п.), таких как зерна, злаки, кукуруза, соевые бобы, рапсовое семя, люпин и т.п.

Альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, можно выделять из любого растения или части растения. Альтернативно растение или часть растения, содержащие рекомбинантный полипептид, можно использовать непосредственно для повышения качества продукта питания или корма, например для повышения питательной ценности, вкусовых качеств и т. д.

Основа для доставки фермента находится в форме множества отдельных частиц, крупинок или гранул. Под гранулами подразумевают частицы, которые являются прессованными или сжатыми, например, посредством гранулирования, экструзии или аналогичного сжатия в целях удаления воды из основы. Такое прессование или сжатие частиц также обеспечивает сцепление внутри частиц. Например, гранулы можно получать гранулированием зернового субстрата в прессе для гранулирования. Крупинки, полученные таким образом, измельчают или дробят до размера гранул, пригодного для применения в качестве адъюванта в корме для животного. Вследствие того, что сама основа является разрешенной для применения в корме для животного, ее можно использовать в качестве разбавителя для доставки ферментов в корм для животных.

Фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, включенный в основу для доставки фермента и способы, представляет собой термостабильный фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, как описано в настоящем документе, так что фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, является устойчивым в процессе изготовления, где для получения гранулированной основы для доставки фермента могут применяться повышенные температуры и/или пар. Процесс переваривания корма, содержащего основу для доставки фермента, приведет к высвобождению активного фермента. Также в основу для доставки для высвобождения в водных условиях любого типа можно включать другие типы термостабильных ферментов и питательных добавок, которые являются термостабильными.

На частицы основы с ферментом наносят покрытие для многих различных целей, таких как добавление вкуса или питательной добавки в корм для животного, замедление высвобождения добавок в корма для животных и ферментов в желудочных условиях и т.п. Покрытие наносят для достижения функциональной цели, например, когда желательно замедление высвобождения фермента из частиц основы или контроль условий, при которых фермент будет высвобождаться. Композиция материала покрытия может быть такой, чтобы оно селективно разрушалось агентом, к которому он является чувствительным

- 72 029538 (такого как нагревание, кислота или основание, ферменты или другие химические вещества). Альтернативно на частицы основы можно последовательно наносить два или более покрытия, чувствительных к различным таким разрушающим агентам.

Процесс получения высвобождающей фермент основы включает получение множества отдельных частиц зернового субстрата с размером частиц, пригодным для применения в качестве высвобождающей фермент основы, где частицы содержат фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, кодируемый аминокислотной последовательностью. Этот процесс включает сжатие или прессование частиц высвобождающей фермент основы в гранулы, которое наиболее часто проводят гранулированием. Фунгицид и связующее вещество, когда их используют, можно добавлять в любое пригодное время, и перед гранулированием зернового субстрата их смешивают с зерновым субстратом в требуемых соотношениях. Содержание влаги в сырье пресса для гранулирования находится в диапазонах, указанных выше в отношении содержания влаги в конечном продукте, и оно может составлять приблизительно 14-15%. Для доведения содержания влаги в сырье до этого уровня, влагу добавляют в сырье в форме водного препарата фермента. Температуру в прессе для гранулирования доводят приблизительно до 82°С посредством пара. Пресс для гранулирования может работать в любых условиях, которые обеспечивают обработку сырья, достаточную для получения гранул. Непосредственно процесс гранулирования является экономичным процессом удаления воды из содержащей фермент композиции.

Эти композиции и способы можно применять на практике совместно с введением пребиотиков, которые представляют собой высокомолекулярные сахара, такие как фруктоолигосахариды (ЕО8); галактоолигосахариды (ОО8), материал ОКА8 (обычно признаваемый безопасным). Эти пребиотики могут метаболизироваться некоторыми пробиотическими молочнокислыми бактериями (ЬАВ). Для большинства кишечных микробов они являются нерасщепляемыми.

Обработка и производство продуктов питания.

Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, обладают множеством способов применения в пищевой промышленности, например гидролизом содержащих целлюлозу композиций, включая, например, клетку растений, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку животных, или любое растение или часть растения, или любой продукт питания, или корм, отходы производства и т.п.

Корма или продукт питания содержат фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, например, в корме, жидкости, такой как напиток (такой как фруктовый сок или пиво), хлебе или тесте или хлебном продукте, или напитке (таком как пиво) или в предшественнике напитка (таком как сусло).

Процесс обработки продуктов питания также может включать применение любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие альдолазы, целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, фитазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеазы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы.

Фармацевтические композиции и диетологические добавки.

Фармацевтические композиции и диетологические добавки (такие как диетологические вспомогательные вещества), тоже содержат альдолазу. Активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, альдолазы НМО и/или КНО. Фармацевтические композиции и диетологические добавки (такие как диетологические вспомогательные вещества) изготавливают для перорального приема.

Соединения для обработки периодонта могут содержать фермент, как описано в патенте США № 6776979. Композиции и способы для лечения или профилактики синдрома повышенной кислотности в желудочно-кишечном тракте могут также включать фермент, как описано в патенте США № 6468964.

Раневые повязки, имплантаты и т. п. содержат противомикробные (такие как обладающие антибиотическим действием) ферменты, включая описанные в заявке ферменты (включая, например, последовательности). Эти ферменты также можно использовать в альгинатных повязках, повязках с противомикробным барьером, повязках для ожогов, компрессионных бинтах, диагностических инструментах, гелевых повязках, гидроселективных повязках, гидропористых (пенистых) повязках, гидроколлоидных повязках, внутривенных повязках, хирургических салфетках, слабо приклеивающихся повязках, поглощающих запах повязках, приклеивающихся бинтах, послеоперационных повязках, повязках для заживления рубцов, для ухода за кожей, прозрачных повязках и/или в повязках для закрытия раны. Ферменты по этому изобретению можно использовать при промывании раны, подготовке раневого дна, для обработки пролежней, язв на ногах, ожогов, диабетических язв стоп, рубцов, внутривенной фиксации, при хирургических ранах и легких ранах. Ферменты по этому изобретению можно применять в стерильных ферментных очищающих рану композициях, таких как мази. При этом альдолазу изготавливают в форме таблетки, геля, пилюли, имплантата, жидкости, аэрозоля, пленки, мицеллы, порошка, продукта питания,

- 73 029538 кормовой гранулы или в качестве инкапсулированного состава.

Фармацевтические композиции и диетологические добавки могут включать применение любого сочетания других ферментов, таких как бета-галактозидазы, каталазы, лакказы, целлюлазы, другие альдолазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, фитазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеазы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы.

Биосинтетические каскады образования Р,Р и других стереоизомеров монатина.

Как описано, в частности, в \О 03/091396 А2 (см. фиг. 1-3 и 11-13), монатин можно получать из триптофана посредством многостадийного каскада, вовлекающего биологическое превращение (т.е. облегчение реакции субстрата с образованием продукта с помощью полипептида). Описанный каскад вовлекает биологическое превращение триптофана в индол-3-пируват, биологическое превращение индол3-пирувата в 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту (МР) и биологическое превращение МР в монатин. Полипептиды по этому изобретению можно применять для облегчения реакции индол-3-пирувата с образованием МР. Их также можно применять для облегчения образования Р-МР.

Итак, полипептиды с активностью альдолазы могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Полипептиды с активностью альдолазы НМО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Полипептиды с активностью альдолазы КНО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Один или несколько полипептидов или их фрагментов или подпоследовательностей с активностью альдолазы могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Один или несколько полипептидов с активностью альдолазы могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.

Итак, полипептиды с активностью альдолазы, описанные в настоящем документе, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода. Источник С3углерода может представлять собой, но не ограничиваться ими, оксалоацетат, пируват или производное пирувата, такое как фосфоенолпируват. В одном варианте осуществления источник С3-углерода представляет собой пируват.

Иллюстративные ферменты, пригодные для превращения продукта реакции между индол-3пируватом и источником С3-углерода в монатин, включают члены классов ферментов: триптофанаминотрансферазы (2.6.1.27), триптофандегидрогеназы (1.4.1.19), дегидрогеназы Ό-аминокислот (1.4.99.1), глутаматдегидрогеназы (1.4.1.2-4), фенилаланиндегидрогеназы (ЕС 1.4.1.20), триптофанфенилпируваттрансаминазы (2.6.1.28), или, в более общем случае, члены семейства аминотрансфераз (2.6.1.1), такие как аспартатаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), тирозин(ароматическая)аминотрансфераза (2.6.1.5), Όтриптофанаминотрансфераза или Ό-аланинаминотрансфераза (2.6.1.21) (см. фиг. 2 \О 03/091396 А2).

- 74 029538

Также эту реакцию можно проводить с использованием химических реакций. Аминирование кетокислоты (МР) проводят посредством восстановительного аминирования с использованием аммиака и цианоборгидрида натрия. На фиг. 11-13 \Θ 03/091396 А2 представлены дополнительные полипептиды, которые можно использовать для превращения МР в монатин, а также для обеспечения повышенного выхода монатина из индол-3-пирувата или триптофана. В одном варианте осуществления эти ферменты используют для катализа превращения МР, продукта реакции между индол-3-пируватом и пируватом, в монатин.

Вкусовой профиль композиции монатина можно изменять посредством контроля относительного количества различных стереоизомеров монатина в композиции. Настоящее описание относится к каскадам и веществам для получения композиций монатина с требуемым процентным количеством Κ,Κмонатина и/или δ,Κ-монатина.

На хиральность соединений монатина, образующихся посредством описанных каскадов, можно влиять посредством как рН, так и полипептидов, используемых для биологических превращений. Полипептиды с активностью альдолазы, описанные в настоящем документе, можно применять для регуляции хиральности углерода-2 монатина (см. формулу I выше) в реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР.

После образования продукта реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода, можно стереоспецифично добавлять аминогруппу. Можно получать либо Κ-, либо δ-конфигурацию углерода-4 (см. формулу I выше), в зависимости от применения аминотрансферазы Ό- или Ь-ароматической кислоты. Многие аминотрансферазы являются специфичными в отношении Ь-изомера, однако в некоторых растениях существуют Ό-триптофанаминотрансферазы (КоЫЪа ηηά Мйо, Ριτκοοάίηβδ о£ (Не 8(Н Ы(етаΙίοηη1 δутροδ^ит οη УНатЫ Β₆ аМ СагЬону1 Са(а1уδ^δ, Θδака, кфам 1990). Более того, были идентифицированы Ό-аланинаминотрансферазы (2.6.1.21), Ό-метионинпируватаминотрансферазы (2.6.1.41) и как (Κ)-3-амино-2-метилпропаноатаминотрансфераза (2.6.1.61), так и ^)-3-амино-2-метилпропаноатаминотрансфераза (2.6.1.22), и Ό-фенилглицинаминотрансфераза. Некоторые аминотрансферазы могут быть подходящими только для субстрата этой реакции с конкретной конфигурацией С2-углерода. Таким образом, даже если превращение в продукт реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода не является стереоспецифичным, стереохимию конечного продукта можно контролировать посредством соответствующего выбора аминотрансферазы. Поскольку реакции являются обратимыми, не вступивший в реакцию продукт (нежелательный изомер) можно повторно превращать обратно в его составляющие, и рацемическую смесь продукта реакции можно преобразовывать.

Пример пригодного донора амино для добавления аминогруппы к продукту реакции между индол3-пируватом и источником С3-углерода включает, но не ограничивается ими, аминокислоту, такую как аланин, аспартат, лизин, глутамат, глицин и триптофан.

При рассмотрении фигур следует отметить следующее. На блок-схеме показаны каскады образования монатина, но они не ограничиваются конкретным способом применения каскадов на практике. Например, каскады можно применять на практике ίη νίνο, ίη νίίτο или в сочетании.

Более того, применение на практике каскадов не требует, чтобы специалист предоставлял каждый из указанных компонентов (таких как участвующие в реакции вещества и ферменты), при условии предоставления достаточных компонентов или источников компонентов и условий реакции, чтобы каскад потенциально мог протекать. Иными словами, например, если на фигуре представлен процесс образования композиции монатина, который включает образование индол-3-пирувата из Ь-триптофана, образование 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (предшественника монатина или МР) из индол-3-пирувата и образование монатина из МР, где каждую реакцию облегчают посредством соответствующего фермента, подразумевается, что применение на практике этого каскада включает комбинирование Ь-триптофана с α-кетоглутаратом и ферментами, предназначенными для облегчения указанных реакций, и в условиях, пригодных для протекания каждой из реакций, также без прямого предоставления индол-3-пирувата или МР. В таком случае Ь-триптофан может реагировать с α-кетоглутаратом с образованием индол-3-пирувата. С помощью установленных условий и предоставленного фермента индол-3-пируват, образующийся в реакции Ь-триптофана, может вступать в реакцию с образованием МР, а затем с помощью установленных условий и предоставленного фермента МР, образующийся в реакции индол-3-пирувата, может вступать в реакцию с образованием монатина.

Также следует отметить, что применение на практике представленных каскадов не требует точного предоставления специалистом исходных материалов или ферментов. Иными словами, подразумевается, что применение на практике любого из каскадов, в которых Ь-триптофан указан в качестве исходного материала, будет включать предоставление соединения, которое может образовывать Ь-триптофан, в условиях, пригодных для образования Ь-триптофана, и комбинирование этого соединения с ферментами, способными облегчать серии указанных реакций в условиях, которые могут быть пригодны для протекания этих реакций. В качестве другого примера также подразумевается, что применение на практике указанного каскада будет включать предоставление микроорганизма, созданного способами генетической инженерии, чтобы он продуцировал монатин по этому изобретению в соответствии с описанным каска- 75 029538 дом, и обеспечение пригодных условий для протекания процесса ферментации. Например, микроорганизм, который естественным образом продуцирует большие количества Ь-триптофана, можно преобразовывать способами генетической инженерии для продукции или сверхпродукции одного или нескольких из ферментов, используемых для облегчения реакций в каскаде образования монатина, и можно обеспечить пригодные условия, чтобы микроорганизм посредством этого мог продуцировать монатин.

На фиг. 1 указан конкретный вариант осуществления, где Κ-специфичная альдолаза облегчает реакцию индол-3-пирувата и пирувата с образованием Κ-МР. На блок-схеме фиг. 1 схематично представлен процесс по этому изобретению для получения композиции монатина, включающей Κ,Κ-монатин. Как представлено на фиг. 1, полный каскад вовлекает реакцию триптофана с образованием индол-3-пирувата, реакцию индол-3-пирувата с образованием МР и реакцию МР с образованием монатина, включая Κ,Κмонатин.

Кроме того, на фиг. 1 представлены определенные перестановки в этом полном каскаде, предназначенные для повышения продукции Κ,Κ-формы монатина за счет δ,δ-, Κ,δ- и δ,Κ-форм монатина. В частности, на фиг. 1 представлен вариант осуществления, где фермент аминотрансфераза, используемый в реакции Ь-триптофана, обладает большей активностью и/или специфичностью в отношении этой реакции относительно реакций МР и 4δ-монатина, или оксидаза обладает большей активностью и/или специфичностью в отношении Ь-триптофана, чем в отношении 4Κ-монатина; фермент, который облегчает реакцию индол-3-пирувата, представляет собой полипептид с активностью альдолазы, описанный в настоящем документе, и, фермент, который облегчает реакцию МР, представляет собой Ό-фермент с широкой специфичностью, предпочтительно измененный для более эффективной работы с Κ-изомером МР.

Также на фиг. 1 представлены конкретные перестановки, предназначенные для обеспечения более экономичного получения Κ,Κ-монатина. Например, на фиг. 1 Ь-триптофан - в противоположность Όтриптофану или сочетаниям Ь- и Ό-триптофана - указан в качестве исходного материала. Несмотря на то, что выбор конкретной формы триптофана не влияет на хиральность конечных соединений монатина в композиции монатина (поскольку реакция триптофана приводит к индол-3-пирувату, который не обладает хиральностью), может быть предпочтительным применение Ь-триптофана в качестве исходного материала, по меньшей мере, потому, что Ь-триптофан в настоящее время является менее дорогостоящим и его легче получать, чем Ό-триптофан.

Далее, обращая внимание на первую реакцию, представленную на фиг. 1, где триптофан превращается в индол-3-пируват, любой один или несколько из α-кетоглутарата, оксалоацетата и пирувата вступают в реакцию с образованием аминокислоты (глутамата, аспартата и аланина соответственно). На фиг. 1 представлен вариант осуществления, где исходный материал триптофана представляет собой Ьтриптофан, и α-кетоглутарат, оксалоацетат и/или пируват приводят к форме Ь-изомера аминокислоты (такой как Ь-глутамат, Ь-аспартат и/или Ь-аланин соответственно).

Как показано на фиг. 1, подход для повышения образования Κ,Κ-монатина вовлекает облегчение реакции Ь-триптофана с помощью фермента, обладающего большей специфичностью, большей активностью или и тем, и другим, в отношении триптофана в противоположность МР или монатину, и облегчение реакции МР с помощью Ό-фермента. Как описано в ΥΟ 03/091396 А2, некоторые ферменты могут облегчать реакцию триптофана с образованием индол-3-пирувата, а также реакцию аминирования МР с образованием монатина. Применение Ь-аминотрансферазы на стадии аминирования приводит к созданию δ-хирального центра в положении С-4 монатина, в то время как применение Ό-фермента приводит к созданию Ό-хирального центра в положении С-4 монатина. Таким образом, в случае, когда Ьаминотрансфераза, которая облегчает реакцию триптофана, также является активной в реакции МР, может образовываться Κ,δ- и δ,δ-монатин в зависимости от формы имеющегося МР. Кроме того, некоторые другие ферменты - оксидазы Ь-аминокислот - могут не только облегчать реакцию триптофана в индол-3-пируват, однако они могут обладать побочной активностью в отношении деградации Κ,Κмонатина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эту побочную активность в отношении 4Κ минимизируют или устраняют. Побочная активность оксидазы в отношении 4δ-форм монатина может снизить или минимизировать их содержание в конечном продукте и может быть желательной, в зависимости от требуемой конечной композиции. Таким образом, чем большей является специфичность и/или активность выбранного Ь-фермента в отношении триптофана относительно МР или монатина, тем большим является количество образующегося Κ,Κ- и δ,Κ- относительно δ,δ-и Κ,δ-монатина.

Пригодные ферменты для реакции триптофана в соответствии с вариантом осуществления, представленные на фиг. 1, включают Ь-аминотрансферазы, способные облегчать реакцию Ь-триптофана с образованием индол-3-пирувата и обладающие большей специфичностью в отношении этой реакции по сравнению с реакцией Κ-МР с образованием 4δ-изомеров монатина; и оксидазы Ь-аминокислот, способные облегчать реакцию Ь-триптофана с образованием индол-3-пирувата и обладающие большей специфичностью и/или активностью в отношении этой реакции относительно реакции 4Шизомеров монатина с образованием МР, и функциональные эквиваленты любого из указанных выше. Более конкретно, неограничивающие примеры пригодных ферментов могут быть выбраны из Ь-триптофанаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.27) и тирозин(ароматической)аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.5) и оксидазы Ь-аминокислот (ЕС

- 76 029538

1.4.3.2), и мутантные формы, образованные из ферментов, обладающих активностью аспартатаминотрансферазы.

В примере 16 указан конкретный фермент, мутантный полипептид НЕХакрС, который включает замену Рго 9 на Туг и замену Агд 122 на О1у, пригодный для облегчения реакций Ь-триптофана и а-КО, оксалоацетата, пирувата или их сочетаний с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата, Ь-аспартата и Ь-аланина соответственно. Другой конкретный фермент, обладающий ограниченной активностью, представляет собой Та!А, Ь-триптофанаминотрансферазу из δ. теШой. Другие ферменты, пригодные для реакции триптофана, в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления каскада, представленного на фиг. 1, включают ферменты со следующими характеристиками: фермент, который осуществляет переаминирование МР с уровнем 1/10 или менее относительно уровня для Ь-триптофана, как в примере 16, или фермент, который при применении с рацемазой, как в примере 18, приводит более чем к 90% 4К-изомеров монатина.

Примеры ферментов, не обладающих большей специфичностью в отношении превращения Ьтриптофана в индол-3-пируват по сравнению с превращением МР в монатин, включают НЕХАкрС (пример 16), аминотрансферазу с широкой специфичностью ЬеНйташа та)ог (АО 03/091396 А2), свиную аминотрансферазу (АО 03/091396 А2) и Та!А КйоНоЬас!ег крйаегоМек (пример 18). Однако эти ферменты можно изменять, например, посредством мутагенеза, чтобы они обладали ограниченной активностью в отношении К-МР и/или К,К-монатина относительно триптофана.

Далее обращая внимание на вторую реакцию, указанную на фиг. 1, выбор фермента для облегчения реакции индол-3-пирувата в МР влияет на относительное количество образующегося К,К-монатина относительно δ,Κ-монатина. Как правило, чем большим является относительное количество образующегося К-МР относительно δ-МР, тем большим является относительное количество образующегося Κ,Κмонатина относительно δ,Κ-монатина (когда Ό-фермент облегчает реакцию МР в монатин). Когда является желательной композиция монатина, обладающая Κ,Κ-формой монатина в качестве ее единственного компонента, представляющего собой монатин, следует использовать фермент, который приводит к селективному образованию К-МР в противоположность δ-МР (К-специфичный фермент). Полипептиды с активностью альдолазы, описанные в настоящем документе, являются пригодными для селективного образования К-МР, в противоположность δ-МР. Несколько примеров высоко К-специфичных ферментов альдолаз представлены в табл. 1 выше, в примерах 4, 5 и 6 ниже и в списке последовательностей.

Далее обращая внимания на последнюю стадию каскада, указанного на фиг. 1, представлена реакция К-МР с образованием К,К-монатина, облегчаемая Ό-аминотрансферазой с широкой специфичностью, например Ό-аланинаминотрансферазой (Е.С. 2.6.1.21, также известной как аминотрансфераза Όаминокислоты или Ό-аспартатаминотрансфераза) или дегидрогеназой Ό-аминокислоты. Как рассмотрено выше, превращение МР в монатин представляет собой реакцию аминирования, которая приводит к созданию хирального центра в атоме С-4-углерода монатина. Когда желательной является К-хиральная форма в положении С-4, следует использовать ферменты, которые приводят к образованию Кхиральных центров в аминокислотах.

Ό-аминотрансфераза обладает большей специфичностью, большей активностью или и тем, и другим в отношении К-МР, чем в отношении индол-3-пирувата. Ό-аминотрансфераза обладает ограниченной активностью в отношении индол-3-пирувата. Ферменты с такими характеристиками можно изменять или подвергать мутации по сравнению с существующими ферментами, например, как показано в примере 16.

В примерах с 9 по 12 проиллюстрировано получение К,К-монатина из Ό-триптофана.

На фиг. 2 представлен способ получения К,К-монатина и δ,Κ-монатина. В то время как в варианте осуществления, представленном на фиг. 1, альдолаза, используемая в реакции индол-3-пирувата с образованием К-МР, влияет на соотношение образующихся К,КЛК, в варианте осуществления, представленном на фиг. 2, Ό-фермент, который облегчает превращение МР в монатин, влияет на соотношение образующихся К,КЛК. В соответствии с каскадом фиг. 2, если для облегчения превращения индол-3пирувата в МР используют нестереоспецифичный фермент, тогда могут образовываться как δ-МР, так и К-МР. Если для превращения индол-3-пирувата в МР используют нестереоспецифичную альдолазу, тогда необходима стереоселективная трансаминаза для превращения МР либо в К,К-монатин, либо в δ,Ρмонатин. Как показано на фиг. 2, применение Ό-аминотрансферазы или дегидрогеназы Ό-аминокислот, которые являются стереоспецифичными мониторингу в отношении К-МР, приводит к образованию К,Кмонатина.

На фиг. 3 представлен другой альтернативный каскад для направления в сторону образования К,Кмонатина. Каскад фиг. 3 представляет собой модификацию каскада фиг. 1, где индол-3-пируват получают непрямым способом, вместо прямого способа, из Ь-триптофана. Более конкретно, Ь-триптофан превращают в Ό-триптофан, а затем Ό-триптофан превращают в индол-3-пируват.

Превращение Ь-триптофана в Ό-триптофан можно облегчать посредством триптофанрацемазы или ее функционального эквивалента. В примере 15 представлены потенциальные источники триптофанрацемазы и способы скрининга в целях идентификации таких ферментов. Также подразумевается, что триптофанрацемазу можно изменять (например, посредством мутагенеза или рекомбинантной инжене- 77 029538 рии) для улучшения работы по сравнению с существующей рацемазой аминокислот.

Неограничивающие примеры триптофанрацемаз включают гомологи или мутантные формы рацемаз аминокислот (ЕС 5.1.1.1), например серинрацемазы, где гомологи или мутантные формы способны превращать Ь-триптофан в Ό-триптофан. Неограничивающие примеры источников, из которых могут быть получены рацемазы аминокислот, включают микроорганизмы, такие как δа1тоηе11а курЫтигшт, Е8сНепс1иа соН, ВасШи8 8иЪкШ8, Р8еийотопа8 аегидшо8а, МЪгю ско1егае, δсЬ^ζо8асса^оусе8 ротЪе, ВасП1и8 сегеи8, Епкегососси8 даШпагит, Рейюсосси8 репко8асеи8, ВасШи8 ритНш, ЬаскоЪасШи8 ГегтепН, ЬаскоЪасШи8 Ъге\ч8„ АсциГех ругорЫ1и8, ЬаскоЪааШ, δк^еркососси8, АпаЪаепа 8р., Р8еийотопа8 8кпака, ЬепНпи8 ейойе8, δсарΗа^са Ъгоиккопи Ое8и1Гигоососси8 8р., ТНегтососси8 8р. и Р8еийотопа8 8кпака. Дополнительные неограничивающие примеры источников, из которых может быть получена рацемаза аминокислот, включают тутовый шелкопряд, головной мозг крысы или головной мозг мыши.

Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых могут быть получены пригодные триптофанрацемазы, включают микроорганизмы, такие как Р8еийотопа8, например Р8еийотопа8 сЬ1огогарЫ8 (Р8еийотопа8 аигегеоГааеп8) (АТСС 15926) и Вигк1ю1йепа руггосша (АТСС15958). Дополнительные неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых могут быть получены триптофанрацемазы, включают растения, например растения табака, такие как №соНапа каЪасит, растения пшеницы, такие как ТгЩсит ае8кшит, сахарную свеклу, томаты и δс1е^осЬ^коη ШаГо1ш8.

Каскад, представленный на фиг. 3, обладает определенными преимуществами, включая то, что даже когда требуемым продуктом является К,К-монатин, для реакции образования индол-3-пирувата можно использовать тот же фермент, что и для реакции образования монатина. Таким образом, в каскаде, представленном на фиг. 1, Ь-аминотрансфераза (или пригодный Ь-фермент) облегчает реакцию образования индол-3-пирувата, однако Ό-аминотрансфераза облегчает реакцию образования монатина. В противоположность каскаду фиг. 3 определенная Ό-аминотрансфераза, которая облегчает реакцию образования индол-3-пирувата, также может облегчать реакцию образования монатина. Таким образом, в каскадах фиг. 3 могут быть предпочтительными Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью, где для реакции образования индол-3-пирувата является желательным применение того же фермента, что и для реакции образования монатина. В противоположность этому в каскадах фиг. 1, 2, 4, 6, 7 и 8 получение монатина можно проводить более эффективно, выбирая Ό-аминотрансферазу, которая обладает ограниченной активностью и/или специфичностью в отношении индол-3-пирувата по сравнению с К-МР.

Другим преимуществом каскада, схематично представленного на фиг. 3, является то, что представляющий собой аминокислоту продукт реакции, сопряженной с реакцией образования индол-3-пирувата, далее можно использовать в качестве исходного материала в реакции, сопряженной с реакцией образования монатина. Таким образом, в каскаде, представленном на фиг. 1, Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата, и в то же время оксалоацетат, α-кетоглутарат и/или пируват вступают в реакцию с образованием Ь-аминокислоты. Поскольку реакция К-МР с образованием монатина сопряжена с реакцией, в которой в качестве субстрата используется Ό-аминокислота, Ь-аминокислота реакции образования индол-3-пирувата в показанных условиях не используются повторно в реакции, сопряженной с реакцией К-МР. В противоположность этому в каскаде, представленном на фиг. 3, реакция Όтриптофана с образованием индол-3-пирувата сопряжена с реакцией образования продукта, представляющего собой Ό-аминокислоту, при этом Ό-аминокислоту можно повторно использовать в реакции, сопряженной с реакцией К-МР. Это позволяет применять на первой стадии нестехиометрические количества акцептора амино. Иногда Ό-аминокислота представляет собой Ό-аланин.

На фиг. 4 и 5 представлены дополнительные модификации каскада, показанного на фиг. 1, при этом модификации направлены на повторное использование продукта, представляющего собой аминокислоту, образованного посредством реакции, сопряженной с реакцией Ь-триптофана с аминокислотойучастником реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин.

Обращаясь к фиг. 4, повторное использование проводят, предоставляя фермент, который облегчает превращение Ь-аминокислоты в Ό-аминокислоту, и наоборот. Более конкретно, в случае, как показано на фиг. 4, если α-ΚΟ вступает в реакцию с образованием Ь-глутамата, когда Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата, можно предоставлять глутаматрацемазу (ЕС 5.1.1.3) или функциональный эквивалент, которые могут облегчать превращение Ь-глутамата в Ό-глутамат и наоборот. В таком случае, Ь-глутамат, образованный совместно с образованием индол-3-пирувата, удаляют посредством его превращения в Ό-глутамат, и Ό-глутамат, образованный посредством превращения Ьглутамата, затем становится доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. Аналогично, α-ΚΟ, образованный в реакции Ό-глутамата, является доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3пируват.

Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых может быть получена глутаматрацемаза, включают Рейюсосси8 репко8асеи8, ВасШи8 ритПи8, ЬаскоЪасШи8 ГегтепШ ЬаскоЪасШи8 Ъгеνΐ8, Е. соН, АсциГех ругорЫ1и8 и ВасШи8 8иЪкШ8. Более конкретно (также, не ограничиваясь этим) глутаматрацемаза может быть экспрессирована с нуклеиновой кислотой, такой как ген тиг1 рейюсосси8 реп- 78 029538 (аозасеиз (регистрационный номер ОеиЬаик № Ь22789) или ген глутаматрацемазы Ьас!оЬасй1из Ьгеу1з.

В случае. если оксалоацетат вступает в реакцию с образованием Ь-аспартата. когда Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата. можно предоставлять аспартатрацемазу (ЕС 5.1.1.13) или ее функциональный эквивалент для превращения Ь-аспартата в Ό-аспартат. В таком случае. Ь-аспартат. образованный совместно с образованием индол-3-пирувата. устраняют посредством его превращения в Ό-аспартат. и Ό-аспартат. образованный при превращении Ь-аспартата. затем становится доступным в качестве субстрата для реакции. сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. Аналогично оксалоацетат. образованный в реакции Ό-аспартата. является доступным в качестве субстрата для реакции. сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3-пируват.

Неограничивающие примеры пригодных ферментов. обладающих активностью аспартатрацемазы. включают А8РК-101 (ВюСа!а1уйсз. 1ис.. Разайеиа. СА) и гомологи или мутантные формы аминокислотарацемазы (ЕС 5.1.1.-). которые способны облегчать превращение Ь-аспартата в Ό-аспартат.

Неограничивающие примеры потенциальных источников. из которых могут быть получены аспартатрацемазы. включают ОейиНигососсиз. ТНегтососсиз. двустворчатый моллюск 8сарйагса ЬгоиНоии. Асше!оЬас!ег. АдгоЬас!егшт. Агсйаеод1оЬиз. ВасШиз. Вогйе!е11а. ВгайугЫ/оЬтт. Вгеу1Ьас!егшт. Вигкйо1йепа. Сатру1оЬас!ег. СаиФйа. Саи1оЬас!ег. С1оз1пйтт. Оезий!оЬас!егшт. Оези1Го1а1еа. Еи!егососсиз. Ег\уииа. ЕзсНепаа. Реггор1азта. НейсоЬас!ег. К1еЬз1е11а. Ьас!оЬасШиз. Ма1тНеита. Мейюадо. МезогЫ/оЬтт. МеШаиососсиз. МеШаиозагста. ОсеаиоЬасШиз. Оеиососсиз. Рейюсоссиз. Ро1айЬас!ег. Рзеийотоиаз. Ругососсиз. Ка1зота. 8Ыде11а. 8тог1и/оЬтт. 8а1тоие11а. 8рйтдотоиаз. 8!гер!ососсиз. ТйегтоаиаегоЬас!ег. УШгю. \Уо1те11а. ХаШНотоиаз. ХатНоЬасЮг. Υе^з^и^а и 2утотоиаз.

В случае. если пируват вступает в реакцию с образованием Ь-аланина. когда Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата. можно предоставить аланинрацемазу или ее функциональный эквивалент для превращения Ь-аланина в Ό-аланин. В таком случае Ь-аланин. образованный совместно с образованием индол-3-пирувата. устраняют посредством его превращения в Ό-аланин. и Όаланин. образованный при превращении Ь-аланина. затем становится доступным в качестве субстрата для реакции. сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. Аналогично пируват. образованный в реакции Ό-аланина. является доступным в качестве субстрата для реакции. сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3-пируват.

Неограничивающие примеры пригодных аланинрацемаз включают А8936 (81дта-А1йпсй. 8!. Ьошз.

МО).

Неограничивающие примеры потенциальных источников. из которых может быть получена аланинрацемаза. включают Вгисе11а аЬойиз. 8!гер!ососсиз ГаесаПз. 8а1тоие11а (урНтшгтт. ЕзсНепсЫа сой. ВасШиз зиЬййз. ВасШиз з!еагоШегторййиз. Рзеийотоиаз аегид1иоза. УШгю сйо1егае. 8с1и/озассагоусез ротЬе. ВасШиз сегеиз и Ьеийииз ейойез.

В примерах 18 и 21 показано применение указанных выше рацемаз. их влияние на повышение соотношения для требуемого продукта монатина и представлены потенциальные источники ферментов рацемаз.

Обращаясь к фиг. 5. стереоинвертирующую аминотрансферазу используют для облегчения реакции превращения К-МР в монатин. Несмотря на то. что. как правило. реакция К-МР (или 8-МР) с образованием К.К-монатина (или 8.К-монатина) сопряжена с реакцией Ό-аминокислоты. стереоинвертирующая аминотрансфераза может облегчать сопряженные реакции К-МР (или 8-МР) с образованием К.Кмонатина (или 8.К-монатина) с использованием Ь-аминокислоты. Таким образом. продукт. представляющий собой Ь-аминокислоту реакции Ь-триптофанаминотрансферазы. можно использовать в качестве субстрата для переаминирования МР с образованием монатина. и продукт (т.е. оксалоацетат. пируват. и/или α-КС) реакции. сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. можно использовать в качестве исходного материала для реакции. сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3пируват. Неограничивающие примеры стереоинвертирующих аминотрансфераз. которые можно использовать. включают Ό-фенилглицинаминотрансферазу (ЕС 2.6.1.72. также известную как Ό-4гидроксифенилглицинаминотрансфераза) и Ό-метионинаминотрансферазу (ЕС 2.6.1.41. также известную как Ό-метаминотрансфераза и Ό-метионинпируватаминотрансфераза).

Неограничивающие примеры потенциальных источников. из которых можно получать Όфенилглицинаминотрансферазу. включают Рзеийотоиаз. такие как Рзеийотоиаз риййа ИЛУ-4 и Рзеийотоиаз з1Ш/еп 8Т-201. Неограничивающие примеры потенциальных источников. из которых может быть получена Ό-метионинаминотрансфераза. включают цветную капусту и арахис.

В примерах 19 и 20 совместно представлены потенциальные источники стереоинвертирующих ферментов и способы получения таких ферментов. Также в примерах представлены способы скрининга для идентификации таких ферментов. Также подразумевается. что такие ферменты можно изменять по сравнению со стереоинвертирующими ферментами. известными или встречающимися в природе. В качестве неограничивающего примера стереоинвертирующая аминотрансфераза может представлять собой гомолог или мутантную форму аминотрансферазы Ό-аминокислот или гомолог или мутантную форму рацемазы аминокислот (ЕС 5.1.1.-).

На фиг. 6-8 также представлены модификации каскада фиг. 1. Каскады. представленные на фиг. 6-8.

- 79 029538 обеспечивают способы смещения равновесных реакций в прямом направлении посредством удаления побочного продукта в реакции триптофана и в некоторых случаях посредством предоставления субстрата для реакции МР.

Обращаясь к фиг. 6, представленный каскад удаляет продукт, представляющий собой Ьаминокислоту, реакции, сопряженной с реакцией триптофана, посредством превращения ее в другую Ьаминокислоту, а затем обеспечивает субстрат для реакции, сопряженной с реакцией МР, посредством превращения вновь образованной Ь-аминокислоты в Ό-аминокислоту. Конкретно показано, что Ьтриптофан вступает в реакцию совместно с оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Ьаспартата. Аспартат-4-декарбоксилазу (ЕС 4.1.1.12) или ее функциональный эквивалент используют для облегчения превращения Ь-аспартата в Ь-аланин и диоксид углерода, и фермент с активностью аланинрацемазы используют для облегчения превращения Ь-аланина в Ό-аланин, при этом Ό-аланин может служить в качестве донора амино для превращения К-МР в монатин.

Обращаясь к фиг. 7, представленный каскад иллюстрирует дополнительные способы удаления продукта, представляющего собой Ь-аминокислоту, реакции, сопряженной с реакцией триптофана. Варианты осуществления, как представлено на фигуре, приводят к побочному продукту(ам), который является недоступным для реакции в обратном направлении, например, вследствие улетучивания (например, диоксид углерода) или посредством спонтанного превращения во вступающий в реакцию конечный продукт. Пример такого подхода включает случай, где α-КС вступает в реакцию совместно с Ьтриптофаном с образованием Ь-глутамата, тогда можно предоставить глутаматдекарбоксилазу (ЕС 4.1.1.15) или ее функциональный эквивалент, которые могут облегчать превращение Ь-глутамата в 4аминобутаноат (с диоксидом углерода в качестве побочного продукта). Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых можно получать Ь-глутаматдекарбоксилазу, включают: С1о81пйщщ рейпидеш, С. \уе1с1ш или Е. сой.

Другой пример такого подхода для смещения реакции триптофана в прямом направлении включает случай, где оксалоацетат вступает в реакцию совместно с Ь-триптофаном, тогда можно предоставить аспартатдекарбоксилазу (ЕС 4.1.1.11) или ее функциональный эквивалент для облегчения превращения Ь-аспартата в β-аланин (с диоксидом углерода в качестве побочного продукта).

Обращаясь к фиг. 8, представленный каскад иллюстрирует дополнительные способы удаления продукта, представляющего собой Ь-аминокислоту, реакции, сопряженной с реакцией триптофана, и предоставление субстрата для реакции, сопряженной с реакцией МР. Конкретно, в случае, где α-КС вступает в реакцию совместно с Ь-триптофаном с образованием Ь-глутамата, можно предоставить фермент с активностью Ь-аланинаминотрансферазы и пируват, где фермент Ь-аланинаминотрансфераза облегчает реакцию пирувата и Ь-глутамата с образованием Ь-аланина. Также может быть предоставлена аланинрацемаза или ее функциональный эквивалент в целях облегчения превращения Ь-аланина в Ό-аланин, при этом Ό-аланин можно использовать в качестве субстрата совместно с МР с образованием монатина и пирувата. См. примеры 18 и 21.

Биосинтетические каскады для получения К,К- и других стереоизомеров производных монатина.

Полипептидов с активностью альдолазы можно использовать для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.

При этом группа заместителя в замещенном индол-3-пирувате представляет собой атом галогена, присоединенный к любому атому углерода индольного кольца или же группа заместителя представляет собой атом хлора, присоединенный к любому атому углерода индольного кольца. При этом производное монатина представляет собой 4-гидрокси-4-(6-метилиндол-3-илметил)глутаминовую кислоту.

Полипептиды, обладающие активностью альдолазы, можно применять в многостадийном каскаде, в котором одна или несколько стадий представляют собой реакцию химического синтеза. Например, один или несколько полипептидов, обладающих активностью альдолазы, могут облегчать реакцию между пируватом и индол-3-пируватом с образованием предшественника монатина. Затем предшественник монатина можно очищать. Затем можно использовать реакцию восстановительного аминирования предшественника монатина с получением монатина.

Полипептиды, обладающие активностью альдолазы а также другие ферменты, используемые в процессе получения монатина и производных монатина, можно использовать в чистой, неочищенной, выделенной форме или в форме суспензии с сульфатом аммония.

Полипептиды, обладающие активностью альдолазы, можно оптимизировать с использованием стабилизаторов, включая дитиотреитол (ОТТ) и β-меркаптоэтанол.

Монатин или производное монатина, которые получают с использованием одного или несколько полипептидов, описанных в настоящем документе, как правило, по меньшей мере приблизительно на от 50 до приблизительно до 99% представляют собой К,К-монатин или К,К-производное монатина по массе от всего полученного монатина или производного монатина. Монатин или производное монатина, полученные с использованием одного или нескольких полипептидов, описанных в настоящем документе, более чем на 60% представляют собой К,К-монатин или К,К-производное монатина по массе от всего полученного монатина; например К,К-монатин или К,К-производное монатина составляют 70, 75, 80, 85,

- 80 029538

90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% от всего полученного монатина или производного монатина. Альтернативно различные количества двух или более препаратов монатина или производного монатина можно комбинировать с получением препарата, который обладает требуемой процентной долей К,Кмонатина или К,К-производного монатина. Например, препарат монатина, который представляет собой 60% К,К-монатин, можно комбинировать с препаратом монатина, который представляет собой 90% К,Кмонатин; при комбинировании равных количеств препаратов 60 и 90% К,К-монатина полученный препарат монатина представляет собой 75% К,К-монатин.

Монатин или производное монатина, или промежуточное соединение (включая предшественник монатина), полученные с использованием одного или нескольких полипептидов, описанных в настоящем документе, можно очищать от компонентов реакции. В одном варианте осуществления монатин, производное монатина или промежуточное соединение, такое как предшественник монатина, можно очищать простым удалением вещества, которое подлежит очистке от препарата фермента, в котором его синтезировали.

Промежуточное соединение, предшественник монатина, монатин или производное монатина очищают из препарата, в котором их синтезировали, чтобы полученная очищенная композиция или препарат представляли собой по меньшей мере приблизительно 5-60% монатина по массе от всех органических соединений. В другом варианте осуществления монатин, производное монатина или промежуточное соединение, такое как предшественник монатина, можно очищать до степени чистоты по меньшей мере приблизительно 70, 80, 90, 95 или 99% от массы всех органических соединений. Монатин, производное монатина или промежуточное соединение (включая предшественник монатина), полученные с применением одного или нескольких полипептидов, описанных в настоящем документе, можно очищать от компонентов реакции любым способом, известным специалисту в данной области. В оптимальном случае очищенный монатин или промежуточное соединение можно повторно перекристаллизовывать до достижения требуемой степени чистоты.

Представленные ниже примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения заявленного изобретения.

Примеры

Пример 1. Детекция монатина, предшественника монатина, триптофана, аланина, аспартата и глутамата.

В этом примере описаны способы, используемые для детекции наличия монатина, предшественника монатина (МР), триптофана, аспартата, аланина и глутамата. Также в нем описан способ разделения и детекции четырех стереоизомеров монатина.

Анализ монатина и триптофана посредством множественного мониторинга реакции (МЕМ) ЬС/МЗ/МЗ.

Анализы смесей монатина и триптофана, образованных посредством биохимических реакций ш νί1го или 1п νίνΌ, проводили с использованием устройства для жидкостной хроматографии-тандемной массспектрометрии (ЬС/МЗ/МЗ) Vа!е^κ/М^с^οтаκκ, включающего жидкостной хроматограф Vа!е^κ 2795 с монитором поглощения νη^ΐΈ 996 Рйо!о-Эюйе Аггау (РИА), помещенным последовательно между хроматографом и тройным квадрупольным масс-спектрометром Мюготакк ОиаПго ИШта. Разделение посредством ЬС проводили с использованием обращенно-фазовой хроматографической колонки Х!егга МЗ С₈, 2, 1 мм х 250 мм при 40°С. Подвижная фаза ЬС состояла из А) воды, содержащей либо (ί) 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, либо (ίί) 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония, и В) метанола, содержащего либо (ί) 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, либо (ίί) 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония.

Если подвижная фаза ЬС состояла из А) воды, содержащей 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, и В) метанола, содержащего 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, градиентное элюирование было линейным от 5% В до 35% В, 0-4 мин, линейным от 35% В до 60% В, 4-6,5 мин, линейным от 60% В до 90% В, 6,5-7 мин, изократическим при 90% В, 7-11 мин, линейным от 90% В до 95% В, 11-12 мин, линейным от 95% В до 5% В, 12-13 мин, с периодом повторного уравновешивания в течение 2 мин между экспериментами. Скорость потока составляла 0,25 мл/мин, и мониторинг поглощения РЭЛ проводили от 200 до 400 нм. Все параметры ЕЗ1-МЗ были оптимизированы и выбраны на основе образования протонированных молекулярных ионов ([М+Н]+) представляющих интерес анализируемых веществ и продукции характерных фрагментарных ионов. Следующие инструментальные параметры использовали для анализа посредством множественного мониторинга реакции (МКМ) посредством ЬС/МЗ/МЗ монатина и триптофана: капилляр: 3,5 кВ; воронка: 40 В; шестигранник 1: 20 В; отверстие: 0 В; шестигранник 2: 0 В; температура источника: 100°С; температура десольватации: 350°С; газ для десольватации: 500 л/ч; газ воронки: 50 л/ч; разрешение для низких масс (01): 12,0; разрешение для высоких масс (01): 12,0; энергия ионов: 0,2; вход: -5 В; энергия столкновений: 8; выход: IV; разрешение для низких масс (02): 15; разрешение для высоких масс (02): 15; энергия ионов (02): 3,5; умножитель: 650. Для специфичной детекции монатина в реакциях ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό используют пять специфичных для монатина переходов МКМ от исходного вещества к продукту. Подвергаемые мониторингу переходы представляют собой от 293,1 до 158,3, от 293,1 до 168,2, от 293,1 до 211,2, от 293,1 до 230,2 и от 293,1 до 257,2. Мониторинг триптофана

- 81 029538 проводят при переходе МКМ от 204,7 до 146,4. Для количественного определения внутреннего стандарта монатина и триптофана анализируют четыре калибровочных стандарта, содержащих четыре различных соотношения каждого анализируемого вещества для й5-триптофан и й5-монатина. Эти данные подвергают линейному анализу наименьших квадратов с получением калибровочной кривой для монатина и триптофана. К каждому образцу добавляют фиксированное количество й5-триптофана и й5-монатина (й5-монатин синтезировали из й5-триптофана в соответствии со способами ν0 03/091396 А2), и соотношения ответов (монатин/й5-монатин; триптофан/й5-триптофан) используют совместно с калибровочными кривыми, описанными выше, для вычисления количества каждого анализируемого вещества в смесях.

Если подвижная фаза ЬС представляла собой А) воду, содержащую 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония, и В) метанол, содержащий 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония, градиентное элюирование было линейным от 5% В до 45% В, 0-8,5 мин, линейным от 45% В до 90% В, 8,5-9 мин, изократическим от 90% В до 90% В, 9-12,5 мин, линейным от 95% В до 5% В, 12,5-13 мин, с периодом повторного уравновешивания в течение 4 мин между экспериментами. Скорость потока составляла 0,27 мл/мин, и поглощение РОА подвергали мониторингу от 210 до 400 нм. Все параметры ЕδIМδ оптимизировали и выбирали, исходя из образования протонированных молекулярных ионов ([М+Н]+) представляющих интерес анализируемых веществ и образования характерных фрагментарных ионов. Инструментальные параметры, используемые для этой вторичной подвижной фазы, являются такими, как указано выше. Четыре специфичных для монатина перехода МКМ от исходного вещества к продукту и один специфичный для триптофана переход от исходного вещества к продукту используют для специфичной детекции монатина и триптофана в реакциях ш \йго и ш У1уо. Подвергаемые мониторингу переходы представляют собой от 293,1 до 158,0, от 293,1 до 168,0, от 293,1 до 211,5 и от 293,1 до 257,0. Триптофан подвергают мониторингу при переходе МКМ от 205,2 до 146,1. Для количественного определения внутреннего стандарта монатина и триптофана анализируют четыре калибровочных стандарта, содержащих четыре различных соотношения каждого из анализируемых веществ для й5триптофана и й5-монатина. Эти данные подвергают линейному анализу наименьших квадратов с получением калибровочной кривой для монатина и триптофана. К каждому образцу добавляют фиксированное количество й5-триптофана и й5-монатина (й5-монатин синтезировали из й5-триптофана в соответствии со способами ν003/091396 А2), и соотношения ответов (монатин/й5-монатин; триптофан/й5триптофан) совместно с калибровочными кривыми, описанными выше, используют для вычисления количества каждого анализируемого вещества в смесях. Подвергаемые мониторингу переходы масс от исходного вещества к продукту для й5-триптофана и й5-монатина представляют собой от 210,2 до 151,1 и от 298,1 до 172,0 соответственно.

Точное определение массы монатина.

Анализ Мδ с высоким разрешением проводили с использованием гибридного квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра АррНей ВюууЧепъ-Регкт Е1тег Ο-δΙηΓ. Для измерения массы протонированного монатина использовали триптофан в качестве внутреннего калибровочного стандарта массы. Вычисленная масса протонированного монатина, исходя из элементного состава С1₄Н₁₇^О₅, составляет 293,1137. Монатин, полученный с использованием биокаталитического процесса, описанного в примерах 2 и 3, показал измеренную массу 293,1144. Это представляет собой ошибку измерения массы менее 2 миллионных долей (м.д.), что представляет собой убедительное доказательство элементного состава монатина, полученного ферментативно.

Хиральное определение монатина посредством ЬС/М8/М8 (МКМ).

Определение стереоизомерного распределения монатина в реакциях ш уйго и ш У1уо проводили посредством получения производного с 1-фтор-2-4-динитрофенил-5-Ь-аланинамидом (РПАА), с последующим измерением с помощью МКМ посредством обращенно-фазовой ^^δ^δ.

Образование производного монатина с РОАА.

К 50 мкл образца или стандарта и 10 мкл внутреннего стандарта добавляли либо 100 мкл, либо 200 мкл 1% раствора РОАА в ацетоне. Добавляли двадцать или сорок мкл, соответственно, 1,0 М бикарбоната натрия и смесь инкубировали в течение 1 ч при 40°С при периодическом перемешивании. Образец извлекали и охлаждали, нейтрализовали 20 мкл 2,0 М НС1 (большее количество НС1 может быть необходимым для достижения нейтрализации забуференной биологической смеси). После завершения дегазирования образцы были готовы для анализа посредством ^С/Мδ/Мδ.

Множественный мониторинг реакции посредством ЬС/М8/М8 для определения стереоизомерного распределения монатина в реакциях ш уйго и ш У1уо.

Анализы проводили с использованием оборудования для ^С/Мδ/Мδ, описанного выше. Разделение посредством ЬС, которая может разделять все четыре стереоизомера монатина (конкретно, РОААмонатина), проводили на обращенно-фазовой хроматографической колонке РЬепотепех Ьипа 2,0x250 мм (3 мкм) С18 (2) при 40°С. Подвижная фаза ЬС состояла из А) воды, содержащей 0,05% (мас./об.) ацетата аммония, и В) ацетонитрила. Элюирование было изократическим при 13% В, 0-2 мин, линейным от 13% В до 30% В, 2-15 мин, линейным от 30% В до 80% В, 15-16 мин, изократическим при 80% В, 16-21 мин, и линейным от 80% В до 13% В, 21-22 мин, с периодом повторного уравновешивания 8 мин между экс- 82 029538 периментами. Скорость потока составляла 0,23 мл/мин, и мониторинг поглощения РЭЛ проводили при от 200 до 400 нм. Все параметры Е81-М8 оптимизировали и выбирали, исходя из образования депротонированных молекулярных ионов ([М-Н]^-) РВАА-монатина и образования характерных фрагментарных ионов.

Следующие инструментальные параметры использовали для анализа ЬС/М8 монатина в режиме Е81/М8 отрицательных ионов: капилляр: 2,0 кВ; воронка: 25 В; шестигранник 1: 10 В; отверстие: 0 В; шестигранник 2: 0 В; температура источника: 100°С; температура десольватации: 350°С; газ для десольватации: 500 л/ч; газ воронки: 50 л/ч; разрешение для низких масс (01): 12,0; разрешение для высоких масс (01): 12,0; энергия ионов: 0,2; вход: -5 В; энергия столкновений: 20; выход: 1 В; разрешение для низких масс (02): 12; разрешение для высоких масс (02): 12; энергия ионов (02): 3,0; умножитель: 650. Для специфичной детекции РОАА-монатина в реакциях ш νίΙΐΌ и ш У1уо использовали три специфичных для РОАА-монатина перехода от исходного материала к продукту. Переходы, отслеживаемые для монатина, представляют собой от 543,2 до 268,1, от 543,2 до 499,3 и от 543,2 до 525,3. Отслеживаемый переход масс внутреннего стандарта производного монатина представлял собой от 548,2 до 530,3. Идентификация стереоизомеров РОАА-монатина основана на хроматографическом времени удержания по сравнению с очищенными синтетическими стереоизомерами монатина и данных масс-спектрометрии. Внутренний стандарт используют для мониторинга хода реакции и для подтверждения времени удержания 8,8-стереоизомера.

Детекция посредством жидкостной хроматографии послеколоночной флуоресценции аминокислот, включая глутамат и аланин.

Жидкостную хроматографию с послеколоночной детекцией флуоресценции (ЬС/ОРА) для определения глутамата и аланина в реакциях ш νίΙΐΌ и ш У1уо проводили на системе Ша(егк 2690 ЬС или эквивалентной системе в сочетании со сканирующим детектором флуоресценции Ша(егк 474 и послеколоночным реакционным модулем Ша(егк. Также с использованием этого способа проводили полуколичественные анализы монатина и триптофана. Разделение ЬС проводили на реакционной ионообменной колонке, нагруженной натрием при 60°С. Подвижная фаза А представлял собой буфер Рккегшд №ι 328 (Рккеппд ЬаЪогакгкк, 1пс.; МоиШат У1е№, СА). Подвижная фаза В представляла собой буфер Рккегшд Νη 740. Градиентное элюирование было от 0% В до 100% В, 0-20 мин, изократическим при 100% В, 20-36 мин, и линейным от 100% В до 0% В, 36-37 мин, с периодом уравновешивания между экспериментами по меньшей мере 5 мин в зависимости от матрицы образцов. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин. Скорость потока для после колоночного раствора для образования производных ОРА составляла 0,5 мл/мин. Параметры детектора флуоресценции представляли собой ЕХ 338-340 нм и Ет 420-425 нм. В качестве внутреннего стандарта для анализа использовали норлейцин. Идентификация аминокислот была основана на данных хроматографического времени удержания для очищенных стандартов.

Детекция Ь- и Ό-аминокислот посредством ЬС/М8/М8.

Образцы, содержащие смесь Ь- и Ό-аминокислот, таких как лизин, аланин, метионин, тирозин, лейцин, фенилаланин, триптофан, глутамат и аспартат из экспериментов с биохимическими реакциями, сначала обрабатывали муравьиной кислотой для денатурации белка. Затем перед анализом ЬС/М8/М8 образец центрифугировали и фильтровали через 0,45-мкм нейлоновый инъекционный фильтр. Идентификация Ь- и Ό-аминокислот была основана на времени удержания и селективной детекции масс. Разделение ЬС проводили с использованием системы для жидкостной хроматографии Ша(егк 2690 и хроматографической колонки А8ТЕС 2,1 мм х 250 мм СЫгоЫойс ТАО с температурой колонки, установленной при 45°С. Подвижные фазы ЬС А и В представляли собой 0,25% уксусную кислоту и 0,25% раствор уксусной кислоты в метаноле соответственно. Изократическое элюирование использовали для всех способов разделения Ь- и Ό-изомеров. Лизин элюировали с использованием 80% подвижной фазы А и 20% В. Глутамат, аланин и метионин разделяли с элюированием 60% подвижной фазы А и 40% В и скоростью потока 0,25 мл/мин. Аспартат, триптофан, тирозин, лейцин и фенилаланин разделяли на изомеры с 30% подвижной фазой А и 70% В со скоростью потока 0,3 мл/мин для всех из них, кроме фенилаланина, который пропускали со скоростью потока 0,25 мл/мин.

Система детекции для анализа Ь- и Ό-аминокислот включала детектор Ша(егк 996 РНок-Оюйе Аггау (РОА) и тройной квадрупольный масс-спектрометр Мкготакк Оиа((го ИИта. РОА, сканирующий при от 195 до 350 нм, помещали последовательно между хроматографической системой и масс-спектрометром. Параметры тройного квадрупольного масс-спектрометра Мкготакк Оиайго ИШта, действующего в режиме положительной электрораспылительной ионизации (+Е81), были установлены следующим образом: капилляр: 3,0 кВ; воронка: 20 В; шестигранник 1: 15 В; отверстие: 1 В; шестигранник 2: 0 В; температура источника: 100°С; температура десольватации: 350°С; газ для десольватации: 530 л/ч; газ воронки: 30 л/ч; разрешение для низких масс 01: 12,5; разрешение для высоких масс 01: 12,5; энергия ионов 1: 0,2; вход: -5; столкновение: 8; выход 1: 10; разрешение для низких масс 02: 12,5; разрешение для высоких масс 02: 12,5; энергия ионов 2: 0,5; умножитель: 650 В. Эксперименты М8/М8 в режиме множественного мониторинга реакции (МКМ) были предназначены для селективного мониторинга реакционных переходов от 14 7,8 до 84,2 и от 147,8 до 102,1 для глутамата, от 134,00 до 74,30 и от 134,00 до 88,2 для аспартата, от 14 7,3 до 85,0 для лизина, от 150,3 до 104,8 для метионина, от 182,3 до 137,0 для тирозина,

- 83 029538 от 132,3 до 87,0 для лейцина и от 166,3 до 121,0 для фенилаланина. В случае, где приведены два перехода, для количественного определения использовали последний переход. Для триптофана эксперименты МЗ/МЗ с режимом множественного мониторинга реакции (МКМ) были предназначены для селективного мониторинга реакционных переходов от 205,2 до 118,2, от 205,2 до 146,1 и от 205,2 до 188,2 и перехода от 212,1 до 151,1 для Д8-ЭЬ-триптофана. Количественное определение триптофана проводили посредством определения соотношения ответа анализируемых веществ для перехода от 205,2 до 146,1 по сравнению с внутренним стандартом, Д8ГО,Ь-триптофаном. Альтернативно количественное определение триптофана, глутамата и аспарагиновой кислоты было основано на сигнальных ответах т//=146,5, т//=102,1 и 111//=88,2 соответственно.

Получение монатина и предшественника монатина (МР) для стандартов и для анализов образования монатина.

Получение монатина.

Рацемическую смесь К,К- и З,З-монатина синтетически получали, как описано в патенте США № 5128482.

К,К- и З,З-монатин разделяли посредством стадии образования производного и гидролиза. В кратком изложении, рацемическую смесь монатина этерифицировали, свободную аминогруппу блокировали посредством СЬ/, получали лактон и З,З-лактон повергали селективному гидролизу с использованием иммобилизованного фермента протеазы. Также монатин можно разделять, как описано в Ваккой, А. е! а1., Еиг. I. Огд. Сйет., 8:1652-1658, (2005).

Получение МР.

К-МР получали переаминированием К,К-монатина с использованием Ό-аминотрансферазы с широким диапазоном АТ-103 (ВюСа1а1уйск, РакаДеиа, СА) в 0,1 М фосфатно-калиевом буфере, с использованием пирувата натрия в качестве акцептора амино. З-МР получали переаминированием З,З-монатина с использованием Ь-аминотрансферазы АТ-102 (В1оСаГа1уйск, РакаДеиа, СА) в 0,1 М фосфатно-калиевом буфере, с использованием пирувата натрия в качестве акцептора амино. Обе реакции проводили при 30°С и при рН приблизительно 8,0-8,3 приблизительно в течение 20 ч. Оба соединения очищали с использованием препаративной масштабной ВЭЖХ с гидрофобной смолой Койт аиД Наак (РйИасЫрЫа, РА) (ХАЭТМ 1600) с элюированием в воде. Образцы, содержащие предшественник монатина с чистотой более 90%, собирали и высушивали сублимированием.

Пример 2. Детекция предшественника монатина.

В этом примере описаны способы, использованные для разделения и детекции двух энантиомеров предшественника монатина.

Нехиральный способ детекции предшественника монатина.

Реакционные образцы из 96-луночных планшетов инъецировали в колонку АдйеШ 2огЬах КХ-С 18, 3,5 мкм, 3,0x150 мм использованием автоматического устройства для забора образцов СТСРа1 (ЬЕАР Тесйио1од1ек, СаггЬого, Ν.Ο.). Продукты разделяли с использованием градиента Н₂О/АСК (0,1% муравьиная кислота):

Время: 0,00 мин 5% В

Время: 4,00 мин 100% В

Время: 5,00 мин 100% В

Время: 5,10 мин 5% В

Время: 6,50 мин 5% В

Градиент получали посредством насосов ^С-10А^νр (ЗЫтаД/и, КуоГо, .Гараи) при 0,8 мл/мин. Продукты подвергали детекции с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра ЛРИ000 ТигЬо1ои-Зргау (АррйеД ВюкукГетк, РокГег СИу, СА). Ионораспыление и множественный ионный мониторинг проводили для представляющих интерес анализируемых веществ в режиме отрицательных ионов, и каждый анализ продолжался 6,5 мин.

Пируват = 87,1 [М-Н+]-.

Индол-3-пируват = 202,1 [М-Н+]-.

Продукт = 290,0 [М-Н+]-.

Хиральный анализ СЕ предшественников К- и З-монатина.

Использовали устройство для капиллярного электрофореза Р/АСЕ™ МЭЦ (Весктаи СоиЙег, Ри11егГои, СА). Использовали набор для Сййа1 ^еνе1οртеиГ, он включает небольшие количества нескольких хиральных селекторов, необходимые буферы и 2 капилляра (Весктаи СоиЙег, Ри11егГои, СА). Альтернативно, для анализа только МР следующие реагенты и другие ресурсы можно получать отдельно от Весктаи СоиЙег (Ри11егГои, СА) или в другом месте:

покрытый капилляр Ν-СНО; 50 мкм ГО, общая длина 65 см или слитые капилляры из диоксида кремния;

мМ фосфатный буфер, рН 5;

мг гидроксипропил-Р-циклодекстрин;

кондиционирующий раствор для капилляров, 10 мл (альтернативно можно использовать 0,5% рас- 84 029538 твор оксида полиэтилена, М_те 600000 или 300000 Да).

Анализ посредством капиллярного электрофореза (СЕ).

Капилляры с нейтральным покрытием ГО 50 мкм, 60 см (50 см для детекции) или 30 (20) см использовали совместно с детекцией посредством ВАО (или простого УФ) при 214 нм. Капилляр для разделения термостатировали при 15°С, образцы при 4°С. Буфер для разделения представлял собой 20 мМ гидроксипропил-З-циклодекстрин, 25 мМ фосфат, рН 5. Инъекцию образца, как правило, проводили при 0,5 фунт/кв.дюйм (3432 Па), 5 с. Разделение проводили при 500 В/см, обратной полярности (15 кВ в для капилляра 30 см, 30 кВ для 60 см). Обычный ток, используемый в ходе разделения, представлял собой -28 мкА. Обычное время миграции для пиков МР составляло приблизительно 3,5 мин (эффективная длина 20 см) или 8 мин (50 см).

В необязательной стадии очистки/промывания/кондиционирования капилляров перед прогоном образцов использовали Н₂О, 4 мин, 0, 1 М НС1, 1 мин, Н₂О 1,5 мин, кондиционирующий раствор для капилляров, 4 мин, Н₂О, 1 мин, буфер для разделения, 4 мин.

Обобщенный способ анализа представляет собой промывание буфером для разделения, 1-2 мин, инъекция образца в течение 5 с при 0,5 фунт/кв.дюйм (3432 Па), разделение 5-10 мин при обратной полярности напряжения 15 или 30 кВ в зависимости от длины капилляра.

Пример 3. Основной анализ для пируватальдолаз.

В иллюстративном способе для измерения активности различных пируватальдолаз используют основной субстрат 4-карбокси-4-гидрокси-2-оксоадипат (СНА). Анализ СНА был адаптирован из литературных анализов (см., например, Е.Е. Оеккег & К.Р. Кпкт, 1. ВюН СНет. 267, 10507-10514, 1992). Типичный анализ включал 50 мМ фосфат натрия рН 7,5, 1 мМ МдС1₂, 1 мМ СНА, 10 мкг/мл Όлактатдегидрогеназы (ΓΌΗ) из ^аоίοЪао^11ик 1еюйтапи (3^дта-А1а^^ой, 3ί. Γοπί^ МО), 0,5 мМ Ν ΆΙ)Ι I. Анализ начинали добавлением фермента (как правило, между от 1 до 5 мкл). Высвобождение пирувата, сопряженное с образованием NΛ^⁺, постоянно подвергали мониторингу в спектрофотометре при 340 нм.

СНА синтезировали в соответствии со способом, описанным в Та,к, В. Г. СЕартап, Р.Г, и 3. Иад1еу. 1. Вю1. СЕет. 247 6438-6443 (1972).

Единицу активности фермента, такого как фермент пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, определяют как количество, которое высвобождает достаточное количество пирувата для снижения поглощения при 340 нм на 1 ОВ в минуту.

Пример 4. Выявление новых альдолаз кетогидроксиглутарата (КНС) и гидроксиметилкетоглутарата (НМС) из библиотек окружающей среды ОАегка.

Более 150 уникальных альдолаз НМС и 15 альдолаз КНС было обнаружено посредством скрининга библиотек ДНК ВАегка. Эти гены альдолазы секвенировали и субклонировали в пригодный экспрессирующий вектор. Затем этот вектор трансформировали в пригодного экспрессирующего хозяина для продукции достаточных количеств альдолазы в целях охарактеризации фермента. Выбранную группу альдолаз тестировали в отношении активности на СНА, а также в отношении образования предшественника монатина (МР). Все выявленные и описанные в этом патенте ферменты обладают потенциалом в отношении применения в других реакциях образования углерод-углеродной связи между акцептором акетокислоты и донором пирувата или производного пирувата, как проиллюстрировано на общей схеме реакции ниже.

К = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;

К₂ = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;

К₃ = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил, карбоновая кислота.

Пример 5. Охарактеризация отобранных альдолаз.

Отобранные альдолазы охарактеризовали в отношении их способности катализировать превращение индол-3-пирувата и пирувата в предшественник монатина (МР), как показано на следующей схеме:

- 85 029538

На фиг. 13 и 14 представлена активность 58 различных альдолаз в отношении образования МР, измеренная посредством ЬС/М8/М8.

Альдольные реакции проводили с 20 мМ индол-3-пируватом (ВР), 50 мМ пируватом, 100 мМ фосфатом натрия рН 7, 1 мМ МдС1₂, 100 мкг/мл альдолазы. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в темноте. Аликвоты (30 мкл) удаляли через различные промежутки времени и реакции останавливали, оставляя образцы на льду. Часть каждой аликвоты подвергали анализу СЕ, в то время как остальную часть разбавляли 1:1000 в 50% ацетонитриле и подвергали анализу ЕС/М8.

Таблица 2

Энантиоселективность различных альдолаз в отношении образования МР из 13Р и пирувата, определенная посредством . хиральной СЕ

Альдолаза	% К-МР (момент времени 23 часа)	СНА (Е/мг) (исходя из общего белка в лизате)	Относительная экспрессия
8ЕС ГО N0:28 (кодируемая 8Е0 ГО N0:27)	98+	31,8	###
8ЕО ГО N0:116 (кодируемая 8Е0 ГО N0:115)	95	304	##
8Е0 ГО N0:76 (кодируемая 8Е0 ГО N0:75)	50	424
8Е0 ГО N0:298 (кодируемая 8Е0 ГО N0:297)	98+	388	о
8Е0 ГО N0:44 (кодируемая 8Е0 ГО N0:43)	70	332	о
8Е0 ГО N0:54 (кодируемая 8Е0 ГО	98+	95
N0:53)
8Е0 ГО N0:148 (кодируемая 8Е0 ГО N0:147)	90	200	о
8Е0 ГО N0:46 (кодируемая 8Е0 ГО N0:45)	70	174	##
8Е0 ГО N0:134 (кодируемая 8Е0 ГО N0:133)	90	576
8Е0 ГО N0:142 (кодируемая 8Е0 ГО N0:141)	98+	55
8Е0 ГО N0:122 (кодируемая 8Е0 ГО N0:121)	98+	38	о
8Е0 ГО N0:74 (кодируемая 8Е0 ГО N0:73)	80	484
8Е0 ГО N0:64 (кодируемая 8Е0 ГО N0:63)	95	38
8Е0 ГО N0:108 (кодируемая 8Е0 ГО N0:107)	98+	40
8Е0 ГО N0:96 (кодируемая 8Е0 ГО N0:95)	98+	не выявлено
8Е0 ГО N0:126 (кодируемая 8Е0 ГО N0:125)	95	124	о
8Е0 ГО N0:80 (кодируемая 8Е0 ГО N0:79)	98+	не выявлено
8Е0 ГО N0:36 (кодируемая 8Е0 ГО N0:35)	98+	80	о
8Е0 ГО N0:62 (кодируемая 8Е0 ГО N0:61)	98+	не выявлено
8Е0 ГО N0:112 (кодируемая 8Е0 ГО N0:111)	98+	не выявлено
8Е0 ГО N0:130 (кодируемая 8Е0 ГО N0:129)	98+	38	о
8Е0 ГО N0:94 (кодируемая 8Е0 ГО N0:93)	98+	47	о
8Е0 ГО N0:102 (кодируемая 8Е0 ГО N0:101)	не выявлено	не выявлено
8Е0 ГО N0:58 (кодируемая 8Е0 ГО N0:57)	98+	59	##
8Е0 ГО N0:88 (кодируемая 8Е0 ГО N0:87)	50	510
8Е0 ГО N0:50 (кодируемая 8Е0 ГО N0:49)	98+	144	о
8Е0 ГО N0:106 (кодируемая 8Е0 ГО N0:105)	98+	не выявлено	о
8Е0 ГО N0:40 (кодируемая 8Е0 ГО	40	406	###

- 86 029538

N0:39)
8Е0 ГО N0:42 (кодируемая 8Е0 ГО N0:41)	98+	92	##
8Е0 ГО N0:278 (кодируемая 8Е0 ГО N0:277)	95	2,0
8Е0 ГО N0:162 (кодируемая 8Е0 ГО N0:161)	95	11,8
8Е0 ГО N0:276 (кодируемая 8Е0 ГО N0:275)	98+	100,4
8ЕС ГО N0:178 (кодируемая 8Е0 ГО N0:177)	95	38,8
8 ЕС ГО N0:202 (кодируемая 8Е0 ГО N0:201)	не выявлено	не выявлено
8 ЕС ГО N0:166 (кодируемая 8Е0 ГО N0:165)	98+	85,5	о
8ЕС ГО N0:218 (кодируемая 8Е0 ГО N0:217)	95	49,1	о
8Е0 ГО N0:224 (кодируемая 8Е0 ГО N0:223)	98+	23,2
8 ЕС ГО N0:226 (кодируемая 8Е0 ГО N0:225)	98+	128,3
8 ЕС ГО N0:244 (кодируемая 8Е0 ГО N0:243)	98+	40,4
8Е0 ГО N0:250 (кодируемая 8Е0 ГО N0:249)	95	6,0
8Е0 ГО N0:252 (кодируемая 8Е0 ГО N0:251)	95	20,2	о
8Е0 ГО N0:264 (кодируемая 8Е0 ГО N0:263)	95	9,9	##
8Е0 ГО N0:268 (кодируемая 8Е0 ГО N0:267)	95	2,0
8Е0 ГО N0:272 (кодируемая 8Е0 ГО N0:271)	95	6,7
8Е0 ГО N0:184 (кодируемая 8Е0 ГО N0:183)	95	не выявлено
8Е0 ГО N0:282 (кодируемая 8Е0 ГО N0:281)	95	36,7
8Е0 ГО N0:186 (кодируемая 8Е0 ГО N0:185)	95	4,2
8Е0 ГО N0:192 (кодируемая 8Е0 ГО N0:191)	95	11,9
8Е0 ГО N0:200 (кодируемая 8Е0 ГО N0:199)	95	17,9	##
8Е0 ГО N0:280 (кодируемая 8Е0 ГО	50	не выявлено
N0:279)
8Е0 ГО N0:284 (кодируемая 8Е0 ГО N0:283)	90	2,2
8Е0 ГО N0:172 (кодируемая 8Е0 ГО N0:171)	95	8,4
8Е0 ГО N0:180 (кодируемая 8Е0 ГО N0:179)	98+	61,0	###
8Е0 ГО N0:168 (кодируемая 8Е0 ГО N0:167)	98+	9,3
8Е0 ГО N0:228 (кодируемая 8Е0 ГО N0:227)	98+	38,7
8Е0 ГО N0:236 (кодируемая 8Е0 ГО N0:235)	95	13,1
8Е0 ГО N0:238 (кодируемая 8Е0 ГО N0:237)	98+	22,3	о
8Е0 ГО N0:240 (кодируемая 8Е0 ГО N0:239)	95	не выявлено
8Е0 ГО N0:270 (кодируемая 8Е0 ГО N0:269)	40	4,6
8Е0 ГО N0:156 (кодируемая 8Е0 ГО N0:155)	98+	133,0

Следует отметить, что селективность в отношении К-МР, составляющая 98+%, указывает на то, что 8-МР не выявлен. С учетом чувствительности анализа СЕ результаты указывают на то, что по меньшей мере 98% образованного МР представляет собой К-энантиомер. Таким образом, ферменты, которые приведены как 98+%, являются по меньшей мере на 98% селективными в отношении К-МР и могут быть селективными вплоть до 100%.

Также в табл. 2 показана активность ферментов в отношении основного субстрата альдолазы, СНА, а также относительная экспрессия каждого фермента, определенная посредством δΌδ-РАОЕ. Следует отметить, что несколько ферментов не показали поддающейся детекции активности в отношении СНА, однако они проявляли активность в отношении образования МР.

В общем, альдолазы показывают широкий диапазон видов активности, экспрессии и селективности. Более того, существует ряд альдолаз, которые показывают чрезвычайно высокую селективность (98% или более) в отношении К-МР.

Пример 6. Выявление растительной пируватальдолазы.

Конструировали вырожденные праймеры для ПЦР (см. ниже) и использовали для экстракции генов альдолазы из кДНК, полученной из 8с1егосЫ1оп ШсйоКик. Получали 5'- и 3'-концы генов, а затем посред- 87 029538 ством ПЦР амплифицировали полноразмерные гены.

8ЕО ГО ΝΟ:	Название праймера	Праймер
335	Р1	ААКОТВТУУУОАКОАСААТО (8ЕЦ ГО N0:335)
336	Р2	ОСОСАОАУУСААУООКТОО (8РЦ ГО N0:336)
337	К.1	ССАТСК8УАТСООСКТАОАОССА (8РЦ ГО N0:337)
338	К2	ΟΟΚΤΑΌΑΟΟΟΑΥΤΟΝΟΟΚΤΟ (8РЦ ГО N0:338)

Пример 7. Клонирование аминотрансферазы Ό-аминокислот ВасШик крЬаепсик.

Аминотрансферазу Ό-аминокислот (ЕС 2.6.1.21, также известную как Ό-аланинаминотрансфераза или Ό-аспартатаминотрансфераза) В. крЬаепсик рекомбинантно получали для применения в сопряженных анализах с различными альдолазами. Этот фермент является гомологичным Ό-аминотрансферазам, описанным ранее для получения монатина (публикация США № 20040063175 и публикация США № 20050282260).

Штаммы.

В. крЬаепсик (номер АТСС 10208) выращивали на питательном агаре при 30°С в течение ночи. Группы колоний помещали в 100 мкл стерильной воды и нагревали в течение 5 мин при 95°С для разрушения клеток. 3 мкл использовали в последующих амплификациях посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Протокол полимеразной цепной реакции.

Конструировали праймеры для клонирования в векторы рЕТ 28Ь и рЕТ 30а (Νονадеη, МаП^кοη, \Ι) с использованием участков ХстЕ и ВашНР Конструкция рЕТ 30 содержит Х-концевые маркеры Н1к и 8, в то время как конструкция рЕТ 28 не содержит маркеров.

Праймеры Па! ВасШик крЬаепсик:

Шконцевой: 5'-САТАТАССАТСССАТАСТСАТТАТССААТС-3' (8Ε^ ΙΌ ХО:383) и

С-концевой: 5'-СТТАТСССАТССТТАСССАТТААТТСАААТТС-3' (8Ε^ ΙΌ ХО:384).

Кодирующий участок амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. В 50 мкл реакционной смеси использовали 3 мкл матрицы, 1,6 мкМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого ПХТР, 3,5 Е полимеразы с высокой точностью ЕхравП Н1дЬ РМеШу Рο1уте^аке (ΡοсЬе, IηП^аηаρο1^к, ГХ), и 1Х буфер Е/хранО'™¹ с Мд. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, с последующими 8 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин. Двадцать два последующих цикла проводили с температурой отжига 58°С. После 30 циклов образец выдерживали при 72°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Получили чистые продукты ПЦР с правильным размером (приблизительно 850 п.н. для гена Па!).

Клонирование.

Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР ^^адеη ^IΑ^и^ск (^^адеη, Vа1еηс^а, СА) и расщепляли посредством ВашИ и ^οΙ в буфере ВатИ (Хеи Еп§1зпП Вю1аЬк, фкиюЬ, МА).

Расщепленный вектор и вставки очищали с использованием набора для экстракции из геля ^^адеη ^IΑ^и^ск Ое1 Εx!^ас!^οη Κι! ^аде^ Vа1еηс^а, СА). Лигирование проводили с использованием набора для лигирования ДНК ΡοсЬе РарМ ОХА ^^да!^οη Κι! (ΡοсЬе, IηП^аηаρο1^к, ГХ) и очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР ^IΑ^и^ск ^аде^ Vа1еηс^а, СА). Продукты лигирования трансформировали в ЕксЬепсЫа οο1ί БН10В с использованием 0,2-см кюветы и системы Вю-РаП Оегое Ри1кег ΙΙ, как описано в руководстве по электропорации Вю-РаП (Вю-РаП, Негси1ек, СА). Клеткам давали возможность восстановиться в 900 мкл среды 8ОС в течение 30 мин при 37°С с 225 об/мин. Клетки высевали на планшеты с ЬВ-агаром, содержащие канамицин (25 мкг/мл).

Плазмидную ДНК очищали с использованием набора для выделения в малых количествах ^^адеη ^аде^ Vа1еηс^а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством ВатШ и ^οΙ. Последовательности плазмид, для которых было выявлено, что они обладают правильной вставкой, проверяли секвенированием посредством дидезокситерминации цепи ДНК в Αдеηсοи^! В^Ые^е ^φο^Ροη (Βеνе^1у, МА). Секвенирование подтвердило кодирующую последовательность, находящуюся в ХСВЙ регистрационный номер АР081278, участок 134..985 (дй 3513754), которая приводит к белку с аминокислотной последовательностью, приведенной для регистрационного номера ААС33964 (дй 3513755).

Экспрессия гена и способы анализа.

Плазмидную ДНК субклонировали в экспрессирующего хозяина ВЙ21(БЕ3) Е. οο1ί (Νονадеη, МаШ^η, \Ι). Культуры выращивали и плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах ^^адеη ^аде^ Vа1еηс^а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава. Индукцию в основном проводили в среде ЙВ, содержащей канамицин (50 мкг/мл). Клетки выращивали до ОБ₆₀о 0,4-0,8, индуцировали посредством 0,1 мМ ГРТС (изопропил тиогалактозид) и через 4 ч после индукции проводили забор образцов. Клеточные экстракты получали в со- 88 029538 ответствии с протоколом, прилагаемым к реагенту Шуадеи ВидВи8(ег™ Щоуадеи, Май18ои, XVI) (с добавлением нуклеазы бензоназы и полного коктейля ингибиторов протеаз КосЬе (КосЬе, ШФаиаро^, ΙΝ)). Получали очень высокие уровни растворимого белка с предсказанной молекулярной массой, определенной посредством ЗОЗ-РАСЕ. Для некоторых реакций продукт гена рЕТ 30 очищали с использованием кассет Н18-Вшй в соответствии с протоколами изготовителя Щоуадеи, Май18ои, VI). Фракции элюента подвергали обессоливанию на колонках РЭ-10 (СЕ НеаЬЬсаге, Р18са(атау, Νί) и элюировали в 25-100 мМ фосфатно-калиевом буфере, рН 7,5.

Клеточные экстракты анализировали в отношении активности Ό-аминотрансферазы, прослеживая продукцию аланина из пирувата и Ό-триптофана с использованием следующего протокола. Реакции объемом 1 мл в основном проводили в 100 мМ фосфатно-калиевом буфере (рН 7,5), 50 мкМ пиридоксальфосфате, 25 мМ пирувате натрия и 50 мМ Ό-триптофане. Реакции начинали добавлением бесклеточных экстрактов или очищенного фермента и инкубировали в течение 15 мин в течение ночи при 30°С при слабом встряхивании. Для остановки реакции добавляли муравьиную кислоту до двухпроцентной конечной концентрации, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Также проводили контрольные реакции без добавления белка. Также в качестве отрицательного контроля использовали нулевые моменты времени. Алании выявляли с использованием образования производных посредством ОРА, описанного в примере 1.

Пример 8. Сравнение образования тотального монатина и распределение изомеров полипептидов с активностью альдолазы ЗЕО ГО N0:8, ЗЕО ГО N0:4, ЗЕО ГО N0:12 и ЗЕО ГО N0:28 и РгоА С. 1е8Ю81егош.

Трансаминазу АТ-103 (Ό-аминотрансфераза с широкой специфичностью) приобретали от ВюСа1а1\йс8 (Ра8айеиа, СА), и либо этот фермент, либо рекомбинантный фермент, полученный по примеру 7, использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМС с образованием монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Альдолазу РгоА из С. 1е8Ю81егош использовали в качестве эталонной альдолазы для сравнительных целей, ее получали, как описано в опубликованной заявке США № 20040063175 и ν0 03091396 А2. Тестированные альдолазы выделяли и трансформировали, как описано выше в примере 4.

Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 50-мл культуры выращивали в среде ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до 0Ό₆₀₀ приблизительно 0,5. Штаммы, содержащие конструкции ЗЕЦ ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 3 и ЗЕО ГО N0: 11, индуцировали посредством 100 мкМ 1РТС. Штамм, содержащий конструкцию ЗЕО ГО N0: 27, индуцировали посредством 200 мкг/л ангидротетрациклина. Клетки выращивали в течение 5 ч после индукции и получали клеточные экстракты в соответствии с протоколами изготовителя Щоуадеи, Май18ои, VI, ВидЬи8(ег реагент). Также добавляли бензонуклеазу и ингибитор протеазы.

Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на Вю-Кай ЬаЬога(ойе8 Ехрепои АЩотаЮй Е1ес(горЬоге818 З(айои (Вю-Кай, Негси1е8, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Ехрепои Зой^аге версии 1.1.98.0.

На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Ό-аминотрансферазы В. 8рЬаепси8, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Эксперименты проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которые не добавляли альдолазу. Образцы инкубировали 1 ч, 2 ч и в течение ночи (17-20 ч) при 30°С с осторожным встряхиванием. Небольшие количества монатина (<0,5 м.д.) образовывались в реакциях без альдолазы в течение ночи, вследствие неферментативных реакций, катализируемых магнием и фосфатом. Эти значения вычитали из чисел, представленных ниже, и показаны усредненные результаты. Единственными стереоизомерами, выявленными при получении монатина с использованием этих способов, являются К,К и З,К. Процентное количество К,К представлено ниже, его определяли по площади пика обращенно-фазовой ЬС.

- 89 029538

Таблица 3

Тотальный монатин, образованный из 1)-триптофана. и % К,К

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин, (м.д.)	% Р.Р-монатина
8Е0 ГО N0:8 (1 ч)	15,65	89,7
8Е0 ГО N0:8 (18 ч)	129,22	79,0
8Е0 ГО N0:4 (1 ч)	3,22	94,8
8Е0 ГО N0:4 (18 ч)	12,14	93,8
8Е0 ГО N0:12 (1 ч)	2,35	100
δΕΟ ГО N0:12 (18 ч)	11,89	98,65
8Е0 ГО N0:28 (1 ч)	14,70	100
8Е0 ГО N0:28 (18 ч)	95,14	97,35
С. 1е$1о$1егот РгоА (1ч) очищенный фермент	16,63	86,45
С. 1е$1о$1егот РгоА (18 ч) очищенный фермент	86,86	63,1

Образец ЗЕО ГО ИО: 28 через 18 ч также анализировали в отношении распределения стереоизомеров посредством способа образования производного с НУА.А, представленного в примере 1, который привел к результату 94,9% К,К- и 5,1% З,К-монатина.

Те же эксперименты проводили одновременно с использованием Ь-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолаз с Ь-аминотрансферазами с широкой специфичностью НехАкрС, полученными, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260, и очищенными. Эти реакции должны приводить, главным образом, к З,З-монатину и К,З-монатину. Также реакционные смеси дополняли 10 мМ альфа-кетоглутаратом в качестве акцептора амино для переаминирования Ь-триптофана. Также показаны усредненные дублированные результаты для тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы) и процентного количества З,З-монатина, исходя из площади пика обращенно-фазовой ЬС. В некоторых случаях вследствие того, что альдолазы являются высоко К-специфичными и приводят к небольшому количеству тотального монатина, обращенно-фазовая оценка распределения стереоизомеров является менее точной вследствие некоторого расширения пика триптофана, который может быть коэллюирован с пиком З,З/К,К-монатина. Тем не менее, это направление является информативным для сравнения К-специфичности альдолаз. Результаты дополнительного анализа с использованием способа образования производных НУА.А представлены в скобках для нескольких образцов и являются более точными. Показатели тотального монатина более приблизительно 400 м.д. являются более высокими, чем линейный диапазон шкалы стандартов, используемой для количественного анализа результатов, поэтому они представляют собой качественные результаты. Альдолаза РгоА С. !ек!ок!егош_г как правило, приводит к 95-100% З,З-монатина, как показано в опубликованной заявке США № 20050282260.

Таблица 4

Тотальный монатин, образованный из Ь-триптофана и % З,З

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин, (м.д.)	% δ,δ-монатина
δΕΟ ГО N0:8 (1 ч)	138,65	78,9
δΕΟ ГО N0:8 (18 ч)	600,3	78,15
δΕΟ ГО N0:4 (1 ч)	ниже отрицательного контроля	95,65
δΕΟ ГО N0:4 (18 ч)	28,5	87,6
δΕΟ ГО N0:12 (1ч)	ниже отрицательного контроля	93,55
δΕΟ ГО N0:12 (18 ч)	24,9	75 (59,35)
δΕΟ ГО N0:28 (1 ч)	17,85	55,05 (18,9)
δΕΟ ГО N0:28 (18 ч)	135,5	27,25 (19,1)
С. 1ех1оИегот РгоА (1ч) очищенный фермент	440,35	92,5
С. 1емоз1егот РгоА (18 ч) очищенный фермент	958,3	92,15

Можно видеть, что К-специфичность полипептида с активностью альдолазы ЗЕО ГО ИО: 28 является очень высокой по сравнению с эталонным ферментом Рго А, также это отражается низким % образующегося З,З-монатина, несмотря на высокую степень специфичности аминотрансферазы НехАкрС в отношении З-МР в этих реакциях. Показатели для тотального монатина при сравнении образования З,Змонатина относительно образования К,К-монатина не являются показательными для активности альдолазы. Ώ-аминотрансфераза является менее активной, чем НехАкрС, в частности, в концентрациях МР,

- 90 029538 которые представлены в этих реакциях.

Для дальнейшего сравнения полипептида с активностью альдолазы δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 28 с ферментом Р^оΑ из С. ФезФозФегоШ использовали различные соотношения Ό-аминотрансферазы и альдолазы в реакциях, начиная с Ό-триптофана (без дублирования образцов в этих экспериментах). Реакции проводили, как указано выше. Для реакций, где концентрацию альдолазы поддерживали постоянной, использовали приблизительно 50 мкг. В реакциях, где Ό-аминотрансферазу поддерживали постоянной, использовали 0,5 мг. В случае концентрации Ό-аминотрансферазы 2 и 10 мг/мл использовали лиофилизированный фермент. Для 2 наиболее высоких концентраций Ό-аминотрансферазы проводили дублирование.

Таблица 5

Эффект концентрации Ό-аминотрансферазы на образование Κ,Κ-монатина

Альдолаза	Концентрация Ό- аминотрансферазы	Время	Тотальный монатин (приблизительно м.д.)	% Κ,Κ- монатина
8ЕО ГО N0:28	0,25 мг/мл	1 ч	2	100
5Е0 ГО N0:28	0,25 мг/мл	после ночи	141	97,1
8Е0 ГО N0:28	0,5 мг/мл	1 ч	8	100
8Е0 ГО N0:28	0,5 мг/мл	после ночи	273	96,5
8Е0 ГО N0:28	1 мг/мл	1 ч	34	100
8Е0 ГО N0:28	1 мг/мл	после ночи	638	96,5
8Е0 ГО N0:28	2 мг/мл	1 ч	979	100
8Е0 ГО N0:28	2 мг/мл	после ночи	1910	97,3
8Е0 ГО N0:28	10 мг/мл	1 ч	2930	99,1
8Е0 ГО N0:28	10 мг/мл	после ночи	2950	96,5
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	0,25 мг/мл	1 ч	4	78,7
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	0,25 мг/мл	после ночи	257	61,1
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	0,5 мг/мл	1 ч	25	79,0
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	0,5 мг/мл	после ночи	480	62,5
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	1 мг/мл	1 ч	74	73,8
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	1 мг/мл	после ночи	810	68,1
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	2 мг/мл	1 ч	325	73,1
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	2 мг/мл	после ночи	2220	71,9
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	10 мг/мл	1 ч	2910	59,7
С. 1е/Ю/1егоп1 РгоА (очищенная)	10 мг/мл	после ночи	2450	67,5
8Е0 ГО N0:8	0,25 мг/мл	1 ч	4	92,3
8Е0 ГО N0:8	0,25 мг/мл	после ночи	219	69,8
8Е0 ГО N0:8	0,5 мг/мл	1 ч	14	84,9
8Е0 ГО N0:8	0,5 мг/мл	после ночи	426	67,5
8Е0 ГО N0:8	1 мг/мл	1 ч	62	84,2
8Е0 ГО N0:8	1 мг/мл	после ночи	877	68,7

Для уровней монатина выше 400 м.д. результаты находятся не в линейном диапазоне стандартной кривой и представляют собой только приблизительные значения. Максимальное количество образованного Κ,Κ-монатина при соответствующем разбавлении составляло 1100 м.д. Анализ стереоизомеров с помощью ΡΌΑΑ проводили для полипептида с активностью альдолазы δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 28 в образцах с 10 мг/мл Р-аминотрансферазы. Через 2 ч образец содержал 98,5% Κ,Κ-монатина. Через 17 ч образец содер- 91 029538 жал 95,9% Κ,Κ-монатина. Полипептид с активностью альдолазы δΡ(') ΙΌ ΝΘ: 28 приводил к высокому процентному количеству Κ,Κ-монатина даже после длительного времени инкубации и использования больших количеств аминотрансферазы. При предоставлении надлежащей Ώ-аминотрансферазы полипептид с активностью альдолазы δΡ(') ΙΌ ΝΘ: 28 приводит к такому же количеству тотального монатина, что и альдолаза ΡγοΆ С. (0δ(οδ(αΌηί, что указывает на сходную специфичную активность.

Таблица 6

Эффект концентрации альдолазы на образование Κ,Κ-монатина

Альдолаза	Концентрация альдолазы	Время	Тотальный монатин (м.д.)	монатина
8ЕО ГО N0:28	25 мг/мл	1 час	7,0	100
8ЕО ГО N0:28	25 мг/мл	после ночи	275	97,4
8Е0 ГО N0:28	50 мг/мл	1 час	9,0	97,3
8Е0 ГО N0:28	50 мг/мл	после ночи	334	95,7
8Е0 ГО N0:28	100 мг/мл	после ночи	297	93,3
С. 1е$1о$1егот РгоА (очищенная)	25 мг/мл	1 час	16	78,2
С. 1е$1о$1егот РгоА (очищенная)	25 мг/мл	после ночи	491	73,2
С. 1ея1оя1егот РгоА (очищенная)	50 мг/мл	1 час	18	64,1
С. 1е$1о$1егот РгоА (очищенная)	50 мг/мл	после ночи	437	63,0
С. 1е$1о$1егот РгоА (очищенная)	100 мг/мл	1 час	26	62,5
С. 1е$1о$1егот РгоА (очищенная)	100 мг/мл	после ночи	513	61,5
8Е0 ГО N0:8	25 мг/мл	1 час	11,0	88,1
8Е0 ГО N0:8	25 мг/мл	после ночи	337,0	74,7
8Е0 ГО N0:8	50 мг/мл	1 час	14,0	78,2
5Е0 ГО N0:8	50 мг/мл	после ночи	406,0	67,8
8Е0 ГО N0:8	100 мг/мл	1 час	24,0	70,1
8Е0 ГО N0:8	100 мг/мл	после ночи	329,0	63,9

При варьировании концентрации альдолазы отсутствует значительное повышение тотального монатина. Процентное количество Κ,Κ снижается с течением времени, а также в зависимости от концентрации альдолазы, в частности, когда Ώ-аминотрансфераза является лимитирующей.

Для дальнейшего исследования Κ-специфичности тестируемых альдолаз эксперименты проводили, начиная с Ь-триптофана и аминотрансферазы I ΙυχΛδρΡ', которую получали и очищали, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. НеxΆδρС показывает выраженную селективность в отношении переаминирования δ-\1Ρ относительно Κ-Λ1Ρ, таким образом процентное количество выше 50% для Κ,δ-монатина указывает на высокостереоспецифичную альдолазу. Альфа-кетоглутарат в концентрации 10 мМ предоставляли в качестве акцептора амино; однако при высоких концентрациях Раминотрансфераза также использует пируват. В этих реакциях, как правило, только δ,δ- и Κ,δ-монатин получают в пределах определения протокола образования производных посредством ΡΏΆΆ.

- 92 029538

Таблица 7

Эффект концентрации Ь-аминотрансферазы на образование δ,δ-монатина
Альдолаза	Концентрация ϋаминотрансферазы	Время	Тотальный монатин (приблизительно М.д.)	% δ,δмонатина
δΕΟ ГО N0:28	0,25 мг/мл	1ч	13	33,8
δΕΟ ГО N0:28	0,25 мг/мл	после ночи	127	34,2
δΕΟ ГО N0:28	0,5 мг/мл	1 ч	31	30,9
δΕΟ ГО N0:28	0,5 мг/мл	после ночи	272	26,8
δΕΟ ГО N0:28	1 мг/мл	1 ч	34	20,3
δΕΟ ГО N0:28	1 мг/мл	после ночи	385	23,5
С. !С'81О8!.С'ТО111 РгоА
(очищенная)	0,25 мг/мл	1 ч	523	94,2
С. ί€8ί08!.6Γ0ηΐ РгоА
(очищенная)	0,25 мг/мл	после ночи	1817	93,7
С. Ιί'8ΐΟ8ΐ.ίΊ~θηί РгоА
(очищенная)	0,5 мг/мл	1 ч	602	91,8
С. Ιβ8ί08ΐβΓ0ηί РгоА
(очищенная)	0,5 мг/мл	после ночи	2122	89,9
С. 1е8Ю81.егот РгоА
(очищенная)	1 мг/мл	1 ч	873	90,2
С. ίβ8ί08ίβΓ0Πί РгоА
(очищенная)	1 мг/мл	после ночи	1237	82,6
δΕΟ ГО N0:8	0,25 мг/мл	1 ч	339	86,3
δΕΟ ГО N0:8	0,25 мг/мл	после ночи	1499	88,0
δΕΟ ГО N0:8	0,5 мг/мл	1 ч	211	80,3
δΕΟ ГО N0:8	0,5 мг/мл	после ночи	1328	83,1
	δΕΟ ГО N0:8	1 мг/мл	1 ч	400	74,6
	δΕΟ ГО N0:8	1 мг/мл	после ночи	1370	79,0

Таблица 8

Эффект концентрации альдолазы на образование δ,δ-монатина

Альдолаза	Концентрация альдолазы	Время	Тотальный монатин (м.д.)	% δ,δмонатина
δΕΟ ГО N0:28	25 мг/мл	1ч	11	25,1
δΕΟ ГО N0:28	25 мг/мл	после ночи	112	20,0
δΕΟ ГО N0:28	50 мг/мл	1ч	18	31,8
δΕΟ ГО N0:28	50 мг/мл	после ночи	160	27,0
δΕΟ ГО N0:28	100 мг/мл	1ч	33	33,2
δΕΟ ГО N0:28	100 мг/мл	после ночи	238	41,4
С. 1е8Ю81егот РгоА (очищенная)	25 мг/мл	1ч	305	86,4
С. 1е8Ю81егот РгоА (очищенная)	25 мг/мл	после ночи	1094	87,5
С. 1е8Ю81егот РгоА (очищенная)	50 мг/мл	1ч	575	90,9
С. 1е8Ю81егот РгоА (очищенная)	50 мг/мл	после ночи	1449	89,5
С. 1е8Ю81егот РгоА (очищенная)	100 мг/мл	1ч	817	93,6
С. ίεζίοζίβΓοηί РгоА (очищенная)	100 мг/мл	после ночи	1360	89,7
δΕΟ ГО N0:8	25 мг/мл	1ч	134	70,7
δΕΟ ГО N0:8	25 мг/мл	после ночи	728	76,3
δΕΟ ГО N0:8	50 мг/мл	1ч	197	80,0
δΕΟ ГО N0:8	50 мг/мл	после ночи	928	81,4
δΕΟ ГО N0:8	100 мг/мл	1ч	279	86,7
δΕΟ ГО N0:8	100 мг/мл	после ночи	1383	86,8

- 93 029538

В случае альдолаз, которые являются высоко К-специфичными, таких как полипептид с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 28, образуется меньшее количество монатина, и повышение количества альдолазы не приводит к повышению тотального монатина (а также % З,З). Эти альдолазы образуют меньшее количество субстрата 3-МР, предпочтительного субстрата для используемой Ь-аминотрансферазы. В случае ферментов, которые являются менее К-специфичными, таких как РгоА, увеличение количества альдолазы значительно не повышает образование тотального монатина или % 3,3-монатина. Повышение количества добавленной Ь-аминотрансферазы снижает процентное количество образующегося 3,3монатина. Исходя из представленного выше анализа, полипептид с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 8 находится между РгоА и полипептидом с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 28 с точки зрения Кспецифичности, что согласуется с представленными выше данными, где % К-МР определяют для альдольной стадии отдельно.

Субклонирование ЗЕО ГО NО: 27.

Следующие праймеры использовали для амплификации посредством ПЦР гена альдолазы: 5'даддадоίодадίоадаодίаίίίоадίооίίίίίо-3' (ЗЕО ГО NО: 385) и 5'-адаадаоаίаίдаίίίаίоадооддддао-3' (ЗЕО ГО NО: 386). Ген альдолазы ЗЕО ГО NО: 27 кодирует полипептид с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 28. Полученный продукт ПЦР расщепляли посредством Χ1οΙ и №е1 для разрезания в участках, которые были встроены в праймеры. Фрагмент выделяли из геля (Ц1Адш,к Се1 ехИ^Юю!! Кй (Ц1адеп, Уа1еп,1а, СА)) и лигировали (с использованием ДНК-лигазы Т4) с рЕТ28Ъ, расщепленным посредством Χ1οΙ и Ше1 и очищенным из геля. Продукт лигирования трансформировали в химически компетентные клетки ТОР10Г'. Колонии, выращенные на планшетах, подвергали скринингу в отношении вставки и несколько изолятов со вставками подвергали анализу последовательности ДНК (Адеηоοи^ί, Ве\'ег1у, МА).

Очистка полипептида с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 28.

Подтвержденные клоны альдолазы трансформировали либо в ВЬ21 ЭЕ3, либо в ВЬ21 ЭЕ3 рЬукЗ. Ночные культуры, выращиваемые с соответствующим антибиотиком, разбавляли свежими средами (как правило, 1:100) и выращивали до ОЭ₆₀₀ ~0,6 с аэрацией при 37°С. Затем культуры индуцировали посредством 1 мМ 1РТС и переключали на 30°С (без аэрации), и инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием. Клеточный осадок, как правило, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания для облегчения лизиса клеток. Клеточный осадок лизировали в ВидВикЮг и бензоназе (Nονадеη, Ма^^п, ΑΙ) (в соответствии с протоколом изготовителя). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Неочищенный белковый экстракт наносили на колонку ШкВшТ (Nονадеη, МаТ^ш ΑΙ), которую подготавливали в соответствии с протоколом изготовителя. Колонку промывали и белок элюировали в соответствии с протоколом изготовителя. Очищенный белок подвергали обессоливанию с помощью колонок ΡΌ-10 (СЕ НеаЙЬ,аге, Р^коаίаνау, Νί). Буфер, используемый для обмена, представлял собой 50 мМ калий фосфат рН 7,5, 100 мМ №С1, 4 мМ МдС1₂. Очищенный белок концентрировали с помощью центробежных концентраторов Ат^оοη ^Π^οκ, ВШегюа, МА).

Пример 9. Сравнение образования тотального монатина и распределения изомеров для полипептидов с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 40, ЗЕО ГО NО: 298, ЗЕО ГО NО: 36, ЗЕО ГО NО: 62, ЗЕО ГО ^: 64, ЗЕО ГО 96, ЗЕО ГО 54, ЗЕО ГО 122, ЗЕО ГО 142, ЗЕО ГО 42, ЗЕО ГО

130, ЗЕО ГО Ш: 112, ЗЕО ГО Ш: 108, ЗЕО ГО Ш: 94, ЗЕО ГО Ш: 80 и ЗЕО ГО Ш: 28.

Трансаминазу АТ-103 (Ό-аминотрансфераза с широкой специфичностью) приобретали от Β^οСаίа1у11,к (РакаТепа, СА), и либо этот фермент, либо рекомбинантный фермент, полученный по примеру 7, использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМС для получения монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Полипептид с активностью альдолазы ЗЕО ГО NО: 28 (с Ык-маркером) использовали в качестве эталонной альдолазы для сравнительных целей, его получали и очищали, как описано в конце примера 8. Другие тестируемые альдолазы выделяли и трансформировали, как описано выше в примере 4.

Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 25-мл культуры выращивали в среде ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до ОЭ₆₀₀ приблизительно 0,4. Штаммы индуцировали посредством 100 мкМ 1РТС. Клетки выращивали в течение 4 ч после индукции, и клеточные экстракты получали в соответствии с протоколами изготовителя (Nονадеη, МаТ^ш ΑΙ, ВидЪик1ег реагент) с помощью бензонуклеазы. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на Вю-КаТ ^аЪο^аίο^^ек Ехрегюп АиίοтаίеТ Е^^р^кик Зίаί^οη (Вю-КаТ, Негси1ек, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Ехрегюп 3οΠ\ν;·^ версии 1.1.98.0.

На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС1₂, 50 мг/мл Ό-триптофана, 2 мг АТ103 (Β^οСаίа1уί^ок, РакаТепа, СА), 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Ό-Триптофан не является растворимым в этой более высокой концентрации, однако ее использовали для того, чтобы убедиться, что реакционные смеси содержали насыщающие количества Όтриптофана. Эксперименты проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которых альдолазу не добавляли. Образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи (17-20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Небольшие количества монатина образуются в течение ночи без альдолазы (~0,5 м. д.), вследствие неферментативных реакций, катализируемых магнием и фосфатом. Типичные показа- 94 029538 тели для % К,К-монатина в этих образцах составляют 50%. Показатели отрицательного контроля вычитали из чисел, представленных ниже, и представлены усредненные результаты. Единственными выявленными стереоизомерами при получении монатина с использованием этих способов являются К,К и δ,Κ Процентные количества К,К представлены ниже, их определяли с помощью площади пика обращенно-фазовой ЬС. Тот же эксперимент проводили после хранения клеточных экстрактов и очищенного полипептида с активностью альдолазы δΞΟ ГО ΝΌ: 28 в течение 2 месяцев при -20° С, на этот раз использовали 50 мМ Э-триптофан, как в примере 8. Добавляли двукратное количество альдолазы, за исключением полипептида с активностью альдолазы δΞΟ ГО ΝΌ: 28, для которого вновь использовали приблизительно 50 мкг. Эти результаты представлены в правой части табл. 9. Результаты образования производного посредством ΡϋΛΛ для распределения изомеров показаны в скобках.

Таблица 9

Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана и % К,К

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин (м.д.)	%к,к- монатина	Тотальный монатин (м.д.)	% Κ,Κмонатина
8ΕΟ ГО N0:40 (2 ч)	336	82,7	238	66,8
8Е0 ГО N0:40, (18 ч)	707,55	76,2	748,5	62,4
8Е0 ГО N0:298 (2 ч)	394,3	98,0	183	91,9(91,6)
8Е0 ГО N0:298 (18 ч)	819,5	96,1	648,5	80,0
8Е0 ГО N0:36 (2 ч)	56	98,2	52,5	94,0
8Е0 ГО N0:36 (18 ч)	123,25	96,9	296	88,5
8Е0 ГО N0:62 (2 ч)	1Д5	78,4	0	и/а
8Е0 ГО N0:62 (18 ч)	0,95	73,8	16	89,2
8Е0 ГО N0:64 (2 ч)	16,7	98,8	24	96,9
8Е0 ГО N0:64 (18 ч)	43,7	97,6	161	98,5
8Е0 ГО N0:96 (2 ч)	30,4	99,2	29	96,0
8Е0 ГО N0:96 (18 ч)	80,8	98,3	200	97,3
8Е0 ГО N0:54 (2 ч)	183,1	99,4	135,5	98,2 (98,8)
8Е0 ГО N0:54 (18 ч)	457,7	98,9	488,5	96,9
8Е0 ГО N0:122 (2 ч)	129,3	97,9	126	97,8 (99,1)
8Е(2 ГО N0:122 (18 ч)	289,85	95,8	471,5	94,4
8Е0 ГО N0:142 (2 ч)	40,4	98,3	58,5	95,9
8Е(2 ГО N0:142 (18 ч)	82,3	97,3	388	96,8
8Е0 ГО N0:42 (2 ч)	335,9	98,2	206,5	93,3
8Е0 ГО N0:42 (18 ч)	612,45	96,6	630,5	82,9
8Е0 ГО N0:130 (2 ч)	77,5	99,3	60,5	98,5 (99,6)
8Е(2 ГО N0:130 (18 ч)	177,45	99,1	368,5	98,4
8Е0 ГО N0:112 (2 ч)	20,4	99,0	27	98,6
8Е(2 ГО N0:112 (18 ч)	57,75	98,3	186,5	99,3
8Е0 ГО N0:108 (2 ч)	44,4	98,7	41	97,0
8Е(2 ГО N0:108 (18 ч)	111,7	98,0	265,5	93,3 (96,4)
8Е0 ГО N0:94 (2 ч)	69,4	98,2	56	94,4
8Е0 ГО N0:94 (18 ч)	181,95	96,9	341	84,8
δΕζ) ГО N0:80 (2 ч)	27,9	98,9	29,5	98,8
8Е0 ГО N0:80 (18 ч)	74	97,9	219	96,6
8Е0 ГО N0:28 - очищенная (2 ч)	131,3	99,5	53	96,7 (99,6)
8Е0 ГО N0:28 - очищенная (18 ч)	407,4	99,2	257	99,2

Исходя из соотношений активности, можно видеть, что определенные ферменты являются более стабильными при хранении, чем другие альдолазы. В ходе этих реакций также может образовываться вторичный продукт, наиболее вероятно, 4-гидрокси-4-метилглутамат. Указанные выше ферменты расположили по возрастанию с точки зрения их специфичности в отношении образования монатина посредством сравнения площадей его пиков относительно побочного продукта. Результаты представляли собой полипептид с активностью альдолазы δΗ() ГО 122 > δΗ() ΙΌ 42 > δΗ() ΙΌ 80 > δΗ() ΙΌ

- 95 029538

108 > δΕ() ΙΌ ^: 96 > δΕ() ΙΌ ^: 112 > δΕ() ΙΌ ^: 130 > δΕ() ΙΌ ^: 36 > δΕ() ΙΌ ^: 94 > δΕ() ΙΌ ^: 298 > δΕ() ΙΌ ^: 40 > δΕ() ΙΌ ^: 142 > δΕ() ΙΌ ^: 54 > δΕ() ΙΌ ^: 64 > δΕ() ΙΌ ^: 28 > δΕ() ΙΌ ^: 62.

Исходя из первоначальных экспериментов, полипептиды с активностью альдолазы δΞΟ ΙΌ NО: 298, δΞΟ Ш NО: 54 и δΞΟ ΙΌ NО: 42 казались наиболее перспективными с точки зрения уровня активности и % образованного К,К-монатина. Эти ферменты субклонировали в экспрессирующие векторы рЕТ с Ызмаркерами и без них.

Клонирование δΕ() ГО ^: 297, δΕ() ГО ^: 53 и δΕ() ГО ^: 41.

Праймеры, используемые для клонирования.

_Таблица 10

ЗЕО ГО ΝΟ:	5’ праймер	3'праймер
297	5 ’ -а§аа§аса1а1§§§1§1сд1с§1ссаааас-3 ’ (8ΕΌ ГО N0:387)	5'-а1аа1ад§а1ссЦадаса1а1й§а§§ссс-3 ’ (ЗЕО ГО N0:388)
53	5 ’ -а1аа1аса1а1даадссд§1дд1д§1дс-3'(ЗЕО ГО N0:389)	5 ’ -адаададда1ссйа§аса1адд1дадсссс -3 ’ (ЗЕО ГО N0:390)
41	5’ -а1аа1асса1§§д1§1сд1д§1сса§-3 ’ (ЗЕО ГО N0:391)	5 ’ -а§аа§ад§а1ссйа§аса1аВДса§дсссс -3 ’ (3Εζ) ГО N0:392)

δΕ() ΙΌ NО: 297, δΕ() ΙΌ NО: 53 и δΕ() ΙΌ NО: 41 амплифицировали посредством ПЦР и расщепляли соответствующими ферментами ЩйеТ и ВатШ для продуктов ПЦР содержащих δΕ() ΙΌ NО: 297 и δΕ() ΙΌ NО: 53, NсοI и ВатНФ для продуктов ПЦР содержащих δΕ() ΙΌ NО: 41), и очищали из геля (набор для экстракции из геля ЦГАдшск Ое1 ех1гасйоп Κίΐ (01адеп, Уа1епс1а, СА)). δΕ() ΙΌ NО: 297 и δΕ() ΙΌ NО: 53 по отдельности лигировали в рЕТ28, расщепленный посредством ν®Ι и ВатШ и очищенный из геля. δΕ() ГО NО: 41 лигировали с рЕТ30, расщепленный посредством NсοI и ВатШ и очищенный из геля. Продукт лигирования трансформировали в ТОР 10. Колонии подвергали скринингу в отношении вставок. Изоляты со вставкой подвергали анализу последовательности ДНК (Адепсоиг!, Веуег1у, МА).

Очистка альдолаз.

Проверенные клоны альдолазы трансформировали либо в В 1,21 РЕ3, либо в В 1,21 РЕ3 ρ^узδ. Культуры, выращиваемые в течение ночи с соответствующим антибиотиком, разбавляли свежими средами (как правило, 1:100) и выращивали до ОО₆₀₀ ~0,6 с аэрацией при 37°С. Затем культуры индуцировали посредством 1 мМ ГРТО и переключали на 30°С (с аэрацией), инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием. Клеточный осадок, как правило, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания для облегчения лизиса клеток. Клеточный осадок лизировали в ВидВиз1ег и бензоназу (Уоуадеп, МаЛзоп, νΙ) (в соответствии с протоколом изготовителя). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Неочищенный белковый экстракт наносили на колонку НГзВтй (Уоуадеп, МаЛзоп, νΙ), которую подготавливали в соответствии с протоколом изготовителя. Колонку промывали, белок элюировали в соответствии с протоколом изготовителя. Очищенный белок подвергали обессоливанию с помощью колонок РР-10 (ОЕ НеаДЬсаге, Р1зса1а^ау, N1). Буфер, используемый для обмена, представлял собой 50 мМ калий фосфат, рН 7,5, 100 мМ №С1, 4 мМ МдС1₂. Очищенный белок концентрировали с помощью центробежных концентраторов Атюоп (МПИроге, ВШепса, МА).

Тестирование очищенных альдолаз.

Очищенные альдолазы тестировали в отношении их способности образовывать К,К-монатин из Όтриптофана. На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг очищенной альдолазы, 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Ό-аминотрансферазы В. зрЬаепсиз, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ Р1.Р. Забор образцов проводили через 2 ч и после ночи. Результаты представлены в табл 11 ниже.

Таблица 11

Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана, и % К,К

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин (м.д.)	% К.,К.-монатина (площадь пика обращено-фазовой ЬС)	% К.,К.-монатина (образование производных посредством ΡΌΑΑ)
8Е0 ГО N0:298 (2 ч)	16,95	88,5	п/а
ЗЕО ГО N0:298 (в течение ночи)	212	77,6	71

- 96 029538

Те же эксперименты проводили с использованием Б-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолаз с Б-аминотрансферазой с широкой специфичностью НехАкрС, полученной и очищенной, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260 (0,5 мг очищенного белка). Результаты представлены ниже в табл. 12 для образования тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы), и процентное количество З,З-монатина представлено исходя из площади пика обращенно-фазовой ЬС. Числа более 400 м.д. находятся вне линейного диапазона стандартной кривой и являются приблизительными.

Таблица 12

Тотальный монатин, образованный из Б-триптофана, и % З,З

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин (м.д.)	% 3,3-монатина (площадь пика обращено-фазовой ЬС)	% 3,3-монатина (образование производных посредством ΡΌΑΑ)
ЗЕО ГО N0:298 (1 ч)	186,6	64,0	п/а
ЗЕО ГО N0:298 (в течение ночи)	197,5	64,3	67,6
ЗЕО ГО N0:54 (1ч)	70,4	36,5	п/а
ЗЕО ГО N0:54 (в течение ночи)	87,8	41,7	42,1
ЗЕО ГО N0:42 (1 ч)	401,1	80,9	п/а
ЗЕО ГО N0:42 (в течение ночи)	507,5	82,9	85,8
ЗЕО ГО N0:28 (1ч)	56,2	30,1	п/а
ЗЕО ГО N0:28 (в течение ночи)	88,8	32,2	33,8

Эти данные и представленные выше данные для К,К-монатина иллюстрируют, что с точки зрения специфичности в отношении К-МР полипептиды с активностью альдолазы обладают следующим порядком: ЗЕО ГО КО: 28 > ЗЕО ГО КО: 54 > ЗЕО ГО КО: 298 > ЗЕО ГО КО: 42.

Пример 10. Сравнение образования тотального монатина и распределение изомеров полипептидов с активностью альдолазы ЗЕО ГО КО: 116, ЗЕО ГО КО: 76, ЗЕО ГО КО: 44, ЗЕО ГО КО: 148, ЗЕО ГО КО: 46, ЗЕО ГО КО: 134, ЗЕО ГО КО: 74, ЗЕО ГО КО: 126, ЗЕО ГО КО: 102, ЗЕО ГО КО: 58, ЗЕО ГО КО: 88, ЗЕО ГО КО: 50, ЗЕО ГО КО: 106, ЗЕО ГО КО: 304, ЗЕО ГО КО: 300 и ЗЕО ГО КО: 28.

Рекомбинантный фермент по примеру 7 использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМ0 для получения монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Полипептид с активностью альдолазы ЗЕО ГО КО: 28 использовали в качестве эталона в этих анализах, и он был очищен, как описано в примере 8.

Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 25-мл культуры выращивали в среде БВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до ОО₆₀₀ приблизительно 0,5. Культуры индуцировали посредством 1 мМ ГРТО. Клетки переключали на 30°С и выращивали в течение ночи. Клеточные экстракты получали в соответствии с протоколами изготовителя (Кονаβеη, МаЛкои, VI, Ви§Ьик1ег реагент). Также добавляли бензонуклеазу. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на Вю-КаД БаЬогаЮпек Ехрепои Аи1ота1еД Е1ес1горйогек1к З1а1юи (Вю-КаД, Негси1ек, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Ехрепои ЗоЕшаге версии 1.1.98.0.

На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Ό-аминотрансферазы В. крйаепсик, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РБР. К образцам, указанным ниже, добавляли дитиотреитол (ОТТ) (конечная концентрация 2 мМ). Эксперименты проводили с дублированием. Образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Усредненные результаты представлены ниже. Единственными выявленными стереоизомерами при получении монатина с использованием этих способов являются К,К и З,К. Процентные количества К,К представлены ниже, и их определяли с помощью площади пика обращенно-фазовой БС.

- 97 029538

Таблица 13

Тотальный монатин, образованный из Ώ-триптофана и % К,К

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин (м.д.)	%К.,К- монатина
8ЕЦ ГО N0:116 (2 ч)	34,5	97
8Е0 ГО N0:116 (18 ч)	99	95
8Е0 ГО N0:76 (2 ч)	40	76
8Е0 ГО N0:76 (18 ч)	112	67
8Е0 ГО N0:44 (2 ч)	32,5	97
8Е0 ГО N0:44 (18 ч)	93,5	94
8Е0 ГО N0:148 (2 ч)	31,5	94
8Е0 ГО N0:148 (18 ч)	98	89
8Е0 ГО N0:46 (2 ч)	42,5	84
8Е0 ГО N0:46 (18 ч)	169	72
8Е0 ГО N0:134 (2 ч)	43,5	92
8Е0 ГО N0:134 (18 ч)	113	86
8Е0 ГО N0:74 (2 ч)	23,5	96
8Е0 ГО N0:74 (18 ч)	78,5	92
8Е0 ГО N0:126 (2 ч)	18	94
8Е0 ГО N0:126 (18 ч)	72	92
8Е0 ГО N0:102 (2 ч)	1	0
	/1 <	О1
и_/ ίν/, ухо чу	ТБ
8Е0 ГО N0:58 (2 ч)	23	92
8Е0 ГО N0:58 (18 ч)	122	88
8Е0 ГО N0:88 (2 ч)	57,5	74
8Е0 ГО N0:88 (18 ч)	200,5	64
8Е0 ГО N0:50 (2 ч)	32,5	99
8ЕЦ ГО N0:50 (18 ч)	131,5	97
8Е0 ГО N0:106 (2 ч)	4,5	78
8ЕЦ ГО N0:106 (18 ч)	20	95
8ЕЦ ГО N0:304 (2 ч)	0	0
8ЕЦ ГО N0:304 (18 ч)	0,45	55
8ЕЦ ГО N0:304 ЭТТ (2 ч)	0	0
8ЕЦ ГО N0:304 ЭТТ (18 ч)	0,55	53
8ЕЦ ГО N0:300 (2 ч)	0,85	34
8ЕЦ ГО N0:300 (18 ч)	5,5	36
8ЕЦ ГО N0:300 ЭТТ (2 ч)	1,5	55
8ЕЦ ГО N0:300 ЭТТ (18 ч)	9	40
8ЕЦ ГО N0:28 (2 ч)	25	99
8ЕЦ ГО N0:28 (18 ч)	69	97

Показатели образования тотального монатина находились и диапазоне от 1 до более 200 м.д. и % К,К находились в диапазоне от 0 до 99%. Поскольку аминотрансфераза была одинаковой для всех из альдолаз, изменение альдолазы может оказывать значительное влияние как на количество образованного монатина, так и на распределение стереомеров образованного монатина. Оказалось, что ОТТ (как в образцах, представленных ниже) повышает количество тотального образующегося монатина.

Те же эксперименты, что представлены выше, проводили с использованием [.-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолазы (предоставленной в качестве клеточного экстракта) с частично очищенной Ь-аминотрансферазой с широкой специфичностью НехАкрС (0,5 мг НехАкрС). Усредненные результаты (дублированные) представлены ниже в табл. 14 для образования тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы), и процентные количества 8,8-монатина представлены, исходя из площади пика обращенно-фазовой ЬС. Числа более 400 м.д. находятся вне линейного диапазона стандартной кривой и являются приблизительными. Очищенный полипептид с активностью альдолазы 8Н(3 П) ΝΟ: 28 использовали в качестве эталона. Полипептиды с активностью альдолазы 8ЕР П) ΝΟ: 304 и 8Н(3 П) ΝΟ: 300 (полученные из растений) использовали с 2 мМ ОТТ и без него. 8каиηοи

- 98 029538 аиЕ Магсиз (ТНе 1оита1 оГ Вю1одюа1 СЬет1з1гу 237:3342-3347, 1962) в качестве восстановителя использовали меркаптоэтанол при первоначальной очистке альдолазы НМО арахиса.

Таблица 14

Тотальный монатин, образованный из Ь-триптофана и % 8,8

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин (м.д.)	% δ,δ-монатина
δΕΟ ГО N0:116 (2 ч)	129	47,9
δΕΟ ГО N0:116 (21ч)	207	56,4
δΕΟ ГО N0:76 (2 ч)	949	90,6
δΕΟ ГО N0:76 (21 ч)	1181	89,0
δΕΟ ГО N0:44 (2 ч)	128	55,0
δΕΟ ГО N0:44 (21 ч)	237	61,7
δΕΟ ГО N0:148 (2 ч)	199	71,5
δΕΟ ГО N0:148 (21ч)	358	74,4
δΕΟ ГО N0:46 (2 ч)	346	79,3
δΕΟ ГО N0:46 (21 ч)	757	83,3
δΕΟ ГО N0:134 (2 ч)	215	69,2
δΕΟ ГО N0:134 (21ч)	370	74,1
δΕΟ ГО N0:74 (2 ч)	75	51,4
δΕΟ ГО N0:74 (21 ч)	137	58,8
δΕΟ ГО N0:126 (2 ч)	47	56,7
δΕΟ ГО N0:126 (21ч)	113	56,7
δΕΟ ГО N0:102 (2 ч)	как в контроле	п/а
δΕΟ ГО N0:102 (21 ч)	11,5	61,1
δΕΟ ГО N0:58 (2 ч)	113	71,9
δΕΟ ГО N0:58 (21 ч)	351	75,5
δΕΟ ГО N0:88 (2 ч)	852	90,1
δΕΟ ГО N0:88 (21 ч)	1352	88,8
δΕΟ ГО N0:50 (2 ч)	62	30,8
δΕΟ ГО N0:50 (21 ч)	145	38,6
δΕΟ ГО N0:106 (2 ч)	3,5	31,0
δΕΟ ГО N0:106 (21ч)	45	34,4
δΕΟ ГО N0:304 (2 ч)	как в контроле	п/а
δΕΟ ГО N0:304 + ϋΤΤ (2 ч)	1	п/а
δΕΟ ГО N0:304 (21 ч)	как в контроле	п/а
δΕΟ ГО N0:304 + ϋΤΤ (21 ч)	10	п/а
δΕΟ ГО N0:300 (2 ч)	73	75,2
δΕΟ ГО N0:300 + ϋΤΤ (2 ч)	121	83
δΕΟ ГО N0:300 (21 ч)	91	63,6
δΕΟ ГО N0:300 + ϋΤΤ (21 ч)	197	71,6
δΕΟ ГО N0:28 (2 ч)	55	35,1
δΕΟ ГО N0:28 (21 ч)	87	40,4

Пример 11. Эффект дитиотреитола (ЭТТ) на образование монатина.

Несколько ферментов примера 10 было выбрано для дальнейшего исследования. Полученные из растений альдолазы показали улучшение при добавлении ОТТ в качестве восстановителя. Было отмечено, что полученные из микробов альдолазы из образцов из окружающей среды также содержат высокую процентную долю остатков цистеина. Таким образом, также дальнейшие эксперименты проводили для выявления повышения посредством ОТТ образования монатина в случае нерастительных альдолаз.

На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС1₂, 50 мМ О-триптофан, 2 мг АТ-103, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. К образцам, представ- 99 029538 ленным ниже, добавляли дитиотреитол (конечная концентрация 2 мМ). Эксперименты проводили с дублированием. Образцы инкубировали в течение 2 ч при 30°С при осторожном встряхивании. Ниже представлены усредненные результаты для тотального монатина, определенного посредством ЬС/М8/М8, с вычитанием фонового образования монатина (контроль без альдолазы).

Таблица 15

Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана

Альдолаза	Тотальный монатин (м.д.)
δΕζ>ΙΟΝΟ:116	126
8Εζ) ГО N0:116 + ΌΤΤ	102
8ЕО ГО N0:44	107
8Е0 ГО N0:44 + ΌΤΤ	103
8Е0 ГО N0:46	88
8Е0 ГО N0:46 + ΌΤΤ	161
8Е0 ГО N0:58	118
8ЕЦ ГО N0:58 + ΌΤΤ	141
8Е0 ГО N0:50	243
8Е0 ГО N0:50 + ΌΤΤ	170
8Е0 ГО N0:28 очищенный белок	174
8Е0 ГО N0:28 + ΌΤΤ очищенный белок	196

Контроль без альдолазы образовывал 10 м.д. тотального монатина с ОТТ и без него, что указывает на то, что ОТТ не влияет на общую реакцию посредством восстановления побочных продуктов и не влияет на активность Ό-аминотрансферазы. Для всех полипептидов с активностью альдолазы 8КС) ΙΌ NΟ: 46, 8ЕР ΙΌ NΟ: 58 и 8ЕР ΙΌ NΟ: 28 добавление ОТТ показало наличие преимущества. Полипептид с активностью альдолазы 8КС) ΙΌ NΟ: 46 показал наиболее высокое преимущество, приблизительно в 1,8 раз повышенную активность при 2 мМ ОТТ. Оказалось, что полипептиды с активностью альдолазы ингибируются посредством ОТТ (8ЕР ΙΌ NΟ: 116 и ВЕО ΙΌ NΟ: 50), в то время как не было отмечено эффекта, в пределах экспериментальной ошибки, для полипептида с активностью альдолазы ВЕС) ΙΌ NΟ:44. Однако является возможным, что для выявления преимущества, обеспечиваемого восстановителем, для каждой используемой альдолазы существует оптимальная концентрация ОТТ.

Полипептид с активностью альдолазы ВЕС) ΙΌ NΟ:88 был выбран для исследования эффекта концентрации ОТТ на образование монатина. Сопряженные реакции проводили, как указано выше. Результаты представлены на фиг. 15. Оптимальная концентрация ОТТ в этом анализе составляла между 2,5 и 5 мМ для добавляемого количества альдолазы. Интересно, что если ОТТ не добавляли, количество образованного монатина было практически настолько же высоким, как и в случае 2,5 мМ ОТТ, однако добавление субоптимальных количеств ОТТ (0,5-1 мМ) в действительности оказывается ингибиторным, также как добавление слишком больших количеств ОТТ (20 мМ).

Пример 12. Сравнение образования тотального монатина и распределение изомеров для полипептидов с активностью альдолазы ВЕО ΙΌ Ж>:278, ВЕО ΙΌ Ш:162, ВЕО ΙΌ ^:276, ВЕО ΙΌ Ш:178, ВЕО ΙΌ ^:202, ВЕО ΙΌ ^:166, ВЕО ΙΌ Ш:218, ВЕО ΙΌ Ш:224, ВЕО ΙΌ ^:226, ВЕО ΙΌ Ш:244, ВЕО ΙΌ ^:250, ВЕО ΙΌ ^:252, ВЕО ΙΌ Ш:264, ВЕО ΙΌ Ш:268, ВЕО ΙΌ ^:272, ВЕО ΙΌ Ш:184, ВЕО ΙΌ ^:282, ВЕО ΙΌ ^:186, ВЕО ΙΌ Ш:192, ВЕО ΙΌ Ш:200, ВЕО ΙΌ ^:280, ВЕО ΙΌ Ш:284, ВЕО ΙΌ ^:172, ВЕО ΙΌ ^:180, ВЕО ΙΌ Ш:168, ВЕО ΙΌ Ш:228, ВЕО ΙΌ ^:236, ВЕО ΙΌ Ш:238, ВЕО ΙΌ ^:240, ВЕО ΙΌ ^:270, ВЕО ΙΌ Ш:156 и ВЕО ΙΌ Ж>:28.

Рекомбинантный фермент по примеру 7 использовали в сопряженных реакциях с альдолазами ΗΜΟ для получения монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Полипептид с активностью альдолазы ВЕО ΙΌ NΟ:28 использовали в качестве эталона в этих анализах, и он был очищен, как описано в примере 8.

Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 25-мл культуры выращивали в среде ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до ОС)₆₀₀ приблизительно 0,5. Культуры индуцировали посредством 1 мМ IРΤΟ. Клетки переключали на 30°С и выращивали в течение ночи. Клеточные экстракты получали с использованием реагента ВидЪи81ег в соответствии с протоколами изготовителя (Nоνадеη, Майй 8оп, \\Ί). Также добавляли бензонуклеазу. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на ВюКай ЬаЪога1ог1е8 Ехрепоп Аи1оша1ей Е1ес1горйоге818 ВкГОоп (Вю-Кай, Негси1е8, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Ехрепоп ВоПхсаге версии 1.1.98.0.

На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 200 мкг полипептидов с активностью альдолазы ВЕО ΙΌ Ж>:278, ВЕО ΙΌ Ш:162, ВЕО ΙΌ Ш:276, ВЕО ΙΌ Ш:178, ВЕО ΙΌ Ж>:202, ВЕО ΙΌ Ш:166, ВЕО ΙΌ ^:218, ВЕО ΙΌ Ш:224, ВЕО ΙΌ Ж>:226, 8Ер ΙΌ Ж>:244, ВЕО ΙΌ Ш:250, ВЕО ΙΌ Ш:252, ВЕО ΙΌ Ж>:264, ВЕО ΙΌ Ш:268, ВЕО ΙΌ Ш:272, ВЕО ΙΌ Ш:184, ВЕО ΙΌ Ш:282, ВЕО ΙΌ

- 100 029538

N0:186, ЗЕО ΙΌ N0:192 и ЗЕО ΙΌ N0:200 или 50 мкг полипептида с активностью альдолазы ЗЕО ΙΌ N0:280, ЗЕО ΙΌ N0:284, ЗЕО ΙΌ N0:172, ЗЕО ΙΌ N0:180, ЗЕО ΙΌ N0:168, ЗЕО ΙΌ N0:228, ЗЕО ΙΌ N0:236, ЗЕО ΙΌ N0:238, ЗЕО ΙΌ N0:240, ЗЕО ΙΌ N0:270 и ЗЕО ΙΌ N0:156 (предоставленного в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Όаминотрансферазы В. 8рЬаепси8, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Эксперименты проводили с дублированием. Образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Усредненные результаты представлены ниже. Единственными выявленными стереоизомерами при получении монатина с использованием этих способов являются К,К и З,К. Процентные количества К,К представлены ниже, и их определяли с помощью площади пика обращенно-фазовой ЬС.

Таблица 16

Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана, и % К,К

- 101 029538

Числа для образования тотального монатина находились в диапазоне от не подлежащих детекции до более 600 м.д. и % К,К находились в диапазоне от 61 до 100%. Вследствие того, что аминотрансфераза была одинаковой для всех альдолаз, изменение альдолазы может оказывать значительное влияние как на количество образованного монатина, так и на распределение стереоизомеров полученного монатина.

Те же эксперименты, что указаны выше, проводили с использованием Ь-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолаз (предоставленных в качестве клеточного экстракта) с Ьаминотрансферазой с широкой специфичностью НсхА8рС, полученной и очищенной, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260 (0,5 мг очищенного белка). Результаты представлены ниже в табл. 17 для образования тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы), и процентные количества δ,δ монатина представлены, исходя из площади пика обращенно-фазовой ЬС. Числа более 400 м.д. находятся вне линейного диапазона стандартной кривой и являются приблизительными. В табл. 12 представлены результаты для эталонного К-специфичного фермента, полипептида с активностью альдолазы δΗ() ΙΌ ΝΘ:28, который анализировали одновременно.

- 102 029538

Таблица 17

Тотальный монатин, образованный из I .-триптофана и % 8,8

Альдолаза (момент времени)	Тотальный монатин (м.д.)	% 8,8-монатина (площадь пика обращенофазовой ЬС)	% 8,8-монатина (образование производных посредством ΡϋΑΑ)
ЗЕО Ш N0:278 (1 ч)	14,6	21,0	п/а
8Е0 Ш N0:278 (в течение ночи)	7905	24,6	п/а
ЗЕО ГО N0:162 (1ч)	14	15,4	п/а
8Е0 Ш N0:162 (в течение ночи)	105,6	17,3	п/а
ЗЕО Ш N0:276 (1 ч)	35,8	10,2	п/а
ЗЕО Ш N0:276 (в течение ночи)	67,8	9	15,1
8ЕЦ ГО N0:218 (1ч)	11,7	20,3	п/а
8Е0 ГО N0:218 (в течение ночи)	49,9	17,7	22,0
8Е0 ГО N0:244 (1 ч)	6,2	18,0	п/а
8Е0 ГО N0:244 (в течение ночи)	24,4	14,7	19,6
8Е0 ГО N0:268 (1 ч)	6,3	24,1	п/а
8Е0 ГО N0:268 (в течение ночи)	61,2	23,3	29,2
8Е0 ГО N0:272 (1 ч)	5,7	20,5	п/а
8Е0 ГО N0:272 (в течение ночи)	43,6	19,9	22,9
8Ер ГО N0:192 (1ч)	6,8	19,0	п/а
8Е0 ГО N0:192 (в течение ночи)	56,4	20,0	24,4
8ЕЦ ГО N0:172 (1ч)	29,9	35,6	п/а
8Е0 ГО N0:172 (в течение ночи)	184,2	42,4	45,6
8Е0 ГО N0:228 (1 ч)	59,6	23,9	п/а
8Е0 ГО N0:228 (в течение ночи)	182	35,6	38,0

Пример 13. Образование монатина из индол-3-пирувата с использованием Ό-аминотрансферазы.

Трансаминаза АТ-103 представляла собой часть библиотеки трансаминаз, приобретенной от ВюСа1а1уйск (Ракабепа, СА), и фермент тестировали в отношении образования монатина в сопряженных реакциях с использованием альдолазы РгоА из С. 1ек1ок1егопт Альдолазу получали, как описано в \ΥΌ 03/091396 А2. АТ-103 представляет собой Ό-трансаминазу с широкой специфичностью (Е.С. 2.6.1.21) из видов ВасШик, для которой необходима Ό-аминокислота (такая как Ό-глутамат, Ό-аспартат или Όаланин) в качестве донора аминокислоты. Ферменты и дополнительные компоненты/субстраты добавляли непосредственно в буфер для реакции, предоставленный в наборе, который содержал 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5, 100 мМ донор амино и 0,1 мМ РЬР. К одному мл буфера для реакции добавляли 4 мг индол-3-пирувата, 20 мг пирувата, приблизительно 50 мкг РгоА, предоставленного в клеточном экстракте, 1 мкл 2М МдС1₂ и 2 мг фермента аминотрансферазы. Реакции проводили с дублированием. Реакционные смеси инкубировали в течение ночи при 30°С при осторожном встряхивании (100 об/мин). Образцы фильтровали и подвергали анализу обращенно-фазовой ЙС/М8/М8, как описано в примере 1. Результаты указывали на то, что с использованием фермента АТ-103 образовывалось приблизительно 370 мкг/мл монатина. Результаты далее анализировали для определения соотношений 8,К/К,8 относительно К,К/8,8-монатина, исходя из площадей пиков двух групп стереоизомеров, которые разделяются при хроматографическом разделении. Среди всего образованного посредством АТ-103 монатина 69% представляли собой К,К/8,8-монатин по сравнению со смешанными изомерами. Этот фермент является гомологичным ферменту 1)ЛТ ВасШик киЫШк, описанному в \\'О 03/091396 А2, о котором известно, что он обладает широкой специфичностью в отношении Ό-аминокислот. Хиральный анализ проводили с использованием способа ΕΌΆΆ, описанного в примере 1, который подтверждал, что Ό-аминотрансфераза образовывала, главным образом, К,К-монатин и небольшое количество 8,К-монатина, как и ожидалось. Дальнейшие эксперименты по переаминированию с 8,8-монатином или К,К-монатином и акетоглутаратом в качестве субстратов подтвердили, что фермент ВюСа1а1уйск был высокоселективным в отношении Ό-конфигурации углерода 4, как и ожидалось. В этих экспериментах не было выявлено глутамата в реакции с 8,8-монатином и а-кетоглутаратом в качестве субстратов.

Для снижения количества 8,8-монатина или К,8-монатина, образованных в качестве побочных продуктов в сопряженных реакциях с АТ-103 (Ό-трансаминаза с широким диапазоном) и альдолазой РгоА, альдолазу очищали с использованием кассет Юк-Вик! в соответствии с протоколами изготовителя (Νθуадеп, МаШкоп, ^1). Очищенный фермент предпочтительно не должен обладать видами активности Ваминотрансферазы дикого типа, которая может находиться в клеточных экстрактах (такими как виды активности нативных АкрС или ТугВ Е. сой). Элюент Юк-Вик! подвергали обессоливанию для удаления

- 103 029538 имидазола с использованием колонок РО-10 (О25 8ерНайех. ОЕ НеаЬНсаге. Рнсактду. N4) и элюировали в 50 мМ Тпз-С1. рН 7. Эксперименты проводили с дублированием в объеме 1 мл. и он содержал 100 мМ буфер Тпз-С1. рН 7.8. 50 мкг альдолазы РгоА. 4 мг индол-3-пирувата. 1 или 2 мг О-аминотрансферазы. 200 мМ пируват натрия. 2 мМ МдС1₂. 3 мМ фосфат калия. 0. 1 мМ РЬР и 14.7 мг ϋ-глутамата. Пробирки инкубировали при 30°С при осторожном встряхивании. Образцы через два часа отбирали и сразу замораживали при -20°С. рН доводили в течение 2 ч от 5 до 7-8 с использованием №ОН. и анализируемые образцы инкубировали в течение ночи. Образцы фильтровали и анализировали в отношении монатина. как описано в примере 1. Образцы через 2 ч не обладали поддающимися детекции количествами монатина. вероятно вследствие низких значений рН. Образцы после ночи содержали приблизительно 190 нг/мл монатина. когда использовали 1 мг Ο-аминотрансферазы. и приблизительно 84% представляли собой К.К-монатин. и 16% представляли собой 8.К-монатин. Когда использовали 2 мг О-аминотрансферазы. получали 540 нг/мл монатина. приблизительно 71% представляли собой К.К-монатин.

Сходные эксперименты проводили с использованием буфера для аминотрансферазы ВюСа1а1уйсз (ВюСа1а1уйсз. Разайеиа. СА). который содержал 100 мМ фосфат калия рН 7.5. 0.1 мМ РЬР и 100 мМ Ώглутамат. Твердый индол-3-пируват и О-аминотрансферазу добавляли. как указано выше. Альдолазу РгоА (50 мкг). МдС1₂ и 50 мМ пируват добавляли из исходных растворов. Анализируемые образцы обрабатывали. как указано выше. хотя в этом случае не требовалось доведения рН. Отрицательный контроль анализировали только с предоставленным ВюСа1а1уйсз ферментом и буфером. который не содержал монатин. Экспериментальные результаты представлены в табл. 18.

Таблица 18

Образование монатина из индол-3-пирувата в фосфатном буфере

мг ϋ- аминотрансферазы	Время (час)	Тотальный монатин (нг/мл)	% К,К
0	2	0	п/а
1	2	6780	не определено
2	2	13170	55%
0	16	0	п/а
1	16	15000	не определено
2	16	28930	51%

Образование монатина в фосфатном буфере является. очевидно. более высоким. чем его образование в Тпз-буферных системах.

Для сравнения активности клонированного ОАТ В. зиЫШз из ХО 03/091396 А2 с ферментом ВюСа1а1уйсз (АТ-103) (ВюСа1а1уйсз. Разайеиа. СА) проводили дополнительный анализ. Ген йа! В. зиЬпПз также субклонировали в рЕТ30а для удаления маркера Н|з-6. Не содержащий маркер и содержащий маркер фермент продуцировали в ВЬ21(ОЕ3). как описано в ХО 03/091396 А2. Получали клеточные экстракты и проводили общий анализ белка для оценки концентрации белка. как описано ранее. Проводили дублированные реакции объемом 1 мл. который содержал: 500 мкг О-аминотрансферазы. 50 мкг альдолазы РгоА. 100 мМ фосфат калия рН 7.5. 3 мМ МдС1₂. 4 мг индол-3-пирувата. 200 мМ пируват натрия. 7.35 мг (50 мМ) ϋ-глутамата и 0.1 мМ РЬР. Образцы инкубировали при 30°С в течение 1 ч. 2 ч и в течение ночи и фильтровали для анализа ЬС/М8/М8. Образцы содержали только 8.К- и К.К-стереоизомеры монатина. как определено с помощью протокола образования производных посредством РОАА. описанного в примере 1. Обобщенные результаты представлены в табл. 19 ниже. % КК определяли с помощью площадей пиков. которые разделяли посредством обращенно-фазовой хроматографии.

Таблица 19

Сравнение ферментов Р-аминотрансфераз

Фермент	Время (час)	Монатин м.д.	% К,К-монатина
В. аиЬ ΌΑΤ-ΗΙ8	1	512	не определено
В. 8иЬ ΌΑΤ без маркера	1	1056	не определено
ВюСа1а1уйс8 АТ-103	1	2353	не определено
В. аиЬ ΌΑΤ-ΗΙ8	2	894	-80-90%
В. 8иЬ ΌΑΤ без маркера	2	1913	-80%
ВюСа1а1уйс8 АТ-103	2	6887	92,5%
В. 8иЬ ΌΑΤ-ΗΙ8	16	3014	31
В. 8иЬ ΌΑΤ без маркера	16	5612	33
ВюСа1а1уйс8 АТ-103	16	16131	66

- 104 029538

Оказалось, что удаление маркера НЫ-6 приводит к повышенной активности Ό-аминотрансферазы В. 8иЪйЙ8; однако гомолог Ό-аминотрансферазы ВюСа!а1у!ю8 явно обладал наиболее высокой активностью. Гомолог Ό-аминотрансферазы ВюСаЫуйс8 также показал более высокую субстратную специфичность в отношении К-предшественника монатина. Оказалось, что повышенное время инкубации снижает избыток образующегося энантиомера К,К-монатина.

Поскольку ферменты Ό-аминотрансферазы Васй1и8 отдают предпочтение пирувату в качестве акцептора амино и Ό-аланину в качестве донора амино, ожидалось, что Ό-аланин можно использовать в качестве донора амино для превращения МР в монатин со сходными или улучшенными результатами. Проводили дублированные реакции объемом 1 мл, который содержал 500 мкг Ό-аминотрансферазы, 50 мкг очищенной альдолазы РгоА, 100 мМ фосфат калия рН 7,5, 3 мМ МдС1₂, 4 мг индол-3-пирувата, 100 мМ пируват натрия, 25 мМ Ό-глутамат или Ό-аланин и 0,1 мМ РЬР. Образцы инкубировали в течение 2 ч и перед анализом обрабатывали, как указано выше. Когда Ό-аланин использовали в качестве донора амино, образовывались немного более высокие уровни монатина (23 против 21 м.д.), как и ожидалось. Кроме того, ожидается, что высокие концентрации пирувата могут ингибировать стадию переаминирования, таким образом дозирование меньших количеств пирувата с течением времени может повысить общую скорость образования монатина. Из представленных выше данных можно видеть, что даже несмотря на то, что в этом случае использовали половину пирувата по сравнению с представленной выше таблицей, образовывалось значительно большее количество монатина. АТ-103 представляет собой пример фермента с ограниченной активностью в отношении δ-МР. Даже несмотря на то, что альдолаза РгоА, используемая в этом исследовании, образует более чем 90-95% δ-МР, АТ-103 образует вплоть до 92% К,К-монатина.

Пример 14. Получение К,К-монатина из Ό-триптофана.

На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 60 мкг альдолазы РгоА С. !с8!о8!сгот (предоставленной в клеточных экстрактах, как описано в АО 03/091396 А2), 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг Ό-аминотрансферазы В1оСа1а1уИс8 (АТ-103) (ВюСа!а1у!ю8, Ра8абспа, СА), 100 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 или 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 8, 0,05 мМ РЬР, 3 мМ фосфат калия (только для реакций с ацетатом) и 10 мМ а-кетоглутарат. Эксперименты проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которые не добавляли альдолазу. Образцы инкубировали в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Истинное значение рН образцов с ацетатом натрия составляло приблизительно 5, в то время как конечное значение рН для забуференных фосфатом образцов составляло приблизительно 7. Оказалось, что ни одна из альдолаз не обладает значительной активностью при рН 5, показатель образца, содержащего альдолазу РгоА, был немного выше показателя отрицательного контроля, но, вероятно, не выше экспериментальной ошибки. В фосфате калия альдолаза РгоА образовывала 73,4 м.д. монатина с соотношением К,К^,К 1,7:1 (~63% К,К из Ό-триптофана).

Вследствие того что ферменты Ό-аминотрансферазы ВасШи8 отдают предпочтение пирувату в качестве акцептора амино и Ό-аланину в качестве донора амино, ожидалось, что добавление акетоглутарата является необходимым при образовании К,К- или δ,К-монатина из Ό-триптофана. Указанный выше эксперимент повторяли (в 100 мМ фосфатно-калиевом буфере) с использованием очищенной альдолазы РгоА (50-60 мкг) и времени инкубации 2,5 ч. Дублированные эксперименты проводили с акетоглутаратом и без него. При добавлении 10 мМ а-кетоглутарата образовывалось 56,1 м.д. монатина из Ό-триптофана (79,5% К,К, 20,5% δ.Ρ). Без а-кетоглутарата образовывалось 102,5 м.д. монатина (79% К,К, 21% 8Λ).

Пример 15. Триптофанрацемаза.

К,К-монатин получали с использованием Ό-аминотрансферазы и альдолазы, когда в качестве исходного материала использовали Ό-триптофан (пример 14). Несмотря на это, Ь-триптофан может быть предпочтительным исходным материалом по нескольким причинам. Например, Ь-триптофан может быть менее дорогостоящим и более свободно доступным, чем Ό-триптофан. В этом описании описано несколько способов получения активной триптофанрацемазы. Выход К,К-монатина повышался при использовании К-специфичной альдолазы, т.е. альдолазы, которая предпочтительно или селективно образует К-МР. На фиг. 3 проиллюстрирован способ получения стереоизомерно-обогащенного К,К-монатина из Ь-триптофана с использованием триптофанрацемазы, Ό-аминотрансферазы и К-специфичной альдолазы.

Селекцию в отношении триптофанрацемазы проводят конструированием штамма, для роста которого не требуется активная рацемаза. Для ауксотрофа по триптофану требуется источник Ь-триптофана при выращивании на минимальной среде. Дополнение среды с Ό-триптофаном представляет собой один способ селекции рацемазы, которая превращает Ό-триптофан в Ь-триптофан. Ауксотрофы по триптофану тестировали в отношении роста на минимальной среде, дополненной Ό-триптофаном. Штаммы САО 18455 и САО 18579 из Сой Оспейс δ!οск Ссп!сг и NКК^12264 (также йрА^-, ХОЕ3, лизогенизированный и с удаленной его плазмидой) не росли при подпитке Ό-триптофаном, но росли при подпитке Ьтриптофаном. Е. сой можно использовать в качестве организма-хозяина, однако также можно использо- 105 029538 вать другие организмы-хозяева, такие как дрожжи, другие бактерии или другие эукариотические организмы. Ауксотроф по триптофану (конкретно 4ККЬ12264 (также йрА^-, Х4Е3, лизогенизированный и с удаленной его плазмидой)) будет расти на Ό-триптофане при его трансформации Ό-аминотрансферазой. Это подтверждает способность Е. сой транспортировать Ό-триптофан в клетку.

За1сЬег и Ьшдеи8 описали наличие триптофанрацемазы в Р8еийотоиа8 аигегеоГааеи8 (АТСС 15926). Триптофанрацемаза также описана в некоторых растениях, включая табак, свеклу, томат и пшеницу, и оказалось, что фермент индуцируется в условиях осмотического стресса или засухи. Триптофанрацемаза может участвовать в нативном каскаде образования монатина Зс1егосййои ШсйоНи8. Для выделения рацемазы с этой активностью конструируют экспрессирующую библиотеку из АТСС 15926 (или другого организма с активностью триптофанрацемазы), и библиотеку трансформируют в ауксотрофа по триптофану. Отбирают штамм, который будет расти с использованием Ό-триптофана в качестве источника триптофана. Сходный способ также использовали для скрининга многих штаммов с известными рацемазами для поиска рацемазы с активностью в отношении Ό-триптофана. Их примеры включают: аланин-, серин- и глутаматрацемазы (Т. Уо8Ыщцга аий N. Е8аИ, Анино Аай Касета8е8: Риисйои8 аий Месйат8Щ8. 1оигиа1 оГ Вю8аеисе аий Вюеид1иеегтд, Уо1. 96, № 2, 103-109, 2003). Аланинрацемаза является зависимой от РЬР, и ее клонировали из За1тоие11а (урЫщцгщщ (ген йайВ). Другими источниками являются Е8сЬейсЫа сой, Васй1и8 8иЬйЙ8, Р8еийотоиа8 аегид1ио8а, У1Ьгю сЬо1егае, Зс1п/о8ассагоусе8 ротЬе и Васй1и8 сегеи8. Базидиальные грибы, Ьеийии8 ейойе8, также содержат аланинрацемазу с широкой активностью. Серинрацемаза также является зависимой от РЬР и встречается в эукариотах (например, в кДНК тутового шелкопряда, головного мозга крысы, головного мозга мыши), а также в бактериях (Еи(егососси8 даШиагцщ). Глутаматрацемаза является независимой от РЬР, и ее клонировали из Рейюсосси8 реи(о8асеи8, Васй1и8 ритйи8, Ьас(оЬаа11и8 Гегтеий, Ьас(оЬаа11и8 Ьгеу18, Е. сой, АсцнГех ругорЫ1и8 и Васй1и8 8иЬ(1Й8. Глутаматрацемаза является высокоспецифичной, и, таким образом, даже структурно сходные аминокислоты аспартат, аспарагин и глутамин не являются субстратами для этого фермента. Также существуют аспартатрацемазы, и они являются независимыми от РЬР. Эти ферменты встречаются в штаммах Ьас(оЬаа1Н, З1гер1ососси8 и в некоторых архебактериях, таких как штаммы Ое8ийигососси8 и ТЬегтососси8. Двустворчатый моллюск ЗсарЬагса ЬгоиШопн также содержит аспартатрацемазу. Другие рацемазы, встречающиеся в литературе, включают рацемазу аминокислот (ЕС 5.1.1.10) из АиаЬаеиа 8р. и Р8еийотоиа8 8йга(а, пролинрацемазу, многофункциональную фенилаланинрацемазу. Также тестируют сходные эпимеразы или рацемазы. Потенциальные рацемазы тестируют, чтобы убедиться, что они являются не Ό-триптофанаминотрансферазами. Этот скрининг проводят посредством анализа последовательностей и/или посредством ферментного анализа.

Ферменты, которые проходят тест в качестве рацемазы, подвергают скринингу на активность в отношении монатина, как описано в примере 17. В идеальном случае получают фермент, который является высокоспецифичным в отношении триптофана и обладает небольшой активностью рацемазы в отношении монатина или не обладает ею.

Триптофанрацемазу также можно изменять и/или улучшать (посредством мутагенеза или рекомбинантной инженерии), исходя из существующей рацемазы, трансаминазы или эпимеразы. Кроме того, вследствие того, что кристаллические структуры аланинаминотрансфераз известны, их можно использовать в качестве основы для рационального мутагенеза на основе структуры. Процесс, описанный выше, используют в качестве исходной селекции в отношении активности триптофанрацемазы и в качестве скрининга улучшенной активности.

Библиотеки триптофанрацемаз.

Конструирование библиотек:

ВигкЬо1йейа руггосша (АТСС15958) и Р8еийотоиа8 СЫогогарЙ18 (АТСС15926) получали из Американской коллекции типовых культур. Их выращивали в соответствии с рекомендациями АТСС, и геномную ДНК получали в соответствии со способом Мека1аио8 Ы (ОцрНсайои аий ащрНйсайои оГ Юхт деие8 ίη У1Ьгю сЬо1егае. Се11. 1983. 35:253-63). Геномную ДНК частично расщепляли посредством фермента рестрикции Заи3Ай Фрагменты 1-3 т.п.н. очищали из геля с использованием набора для экстракции из геля О1адеи ОМсцнск Се1 Ехйасйои К11 (О1адеи, Уа1еис1а, СА). Очищенную ДНК лигировали в рТгс99а (Ащег8Ьащ, Р18са(атау, N1), расщепленный посредством ВатШ и очищенный, как описано выше. Лигирование проводили при комнатной температуре с инкубацией в течение ночи с использованием молярного соотношения вставки и вектора 3:1. Лигированную библиотеку трансформировали в химически компетентные клетки Т0Р10Р' Циуйгодеи, СагкЬай, СА) и высевали на среду ЬВ с 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации планшетов для трансформации в течение ночи колонии соскребали с планшетов, промытых жидкой средой ЬВ, и клеточный осадок соответствующего размера подвергали способу выделения в малых количествах с использованием набора О1адеи ОМсцнск ^адеи, Уа1еиаа, СА). Приблизительно 30000 колоний собирали и подвергали способу выделения в малых количествах.

Объединенные плазмиды трансформировали в САС18455 (йрС83::Ти10, грЬ-1) или САС18579 (11110::411014111 грЬ-1). Оба штамма являются ауксотрофами по триптофану, таким образом, они не растут на минимальной среде М9 (Ойео), если среда не дополнена триптофаном. Трансформанты высевали на минимальную среду М9, дополненную Ό-триптофаном. Это обеспечивает селекцию штамма, который

- 106 029538 может превращать Ό-триптофан в Ь-триптофан.

Перед трансформацией библиотеки штаммы тестировали в отношении роста на минимальной среде с Ь- или Ό-триптофаном. Штаммы тестировали в отношении роста на минимальной среде, дополненной Ό-триптофаном, и рост не был выявлен. Оба штамма росли на идентичной среде, дополненной Ьтриптофаном вместо Ό-триптофана. Кроме того, производный штамм ИККЬ12264 (из используемого штамма была удалена плазмида с триптофановым опероном, он является лизогенизированным посредством /ГОЕ3 и обладает делецией по НрА, в дополнение к другим хромосомно кодируемым мутациям (кегВ, Л!грЕО, !паА2, агоР) (этот штамм не может расти на минимальной среде, дополненной Ό-триптофаном, но растет на идентичной среде, дополненной Ь-триптофаном вместо Ό-триптофана)) трансформировали Ό-специфичной аминотрансферазой из ВасШик киЪййк (^О 03/091396). Экспрессия Όаминотрансферазы запускалась промотором Т7. Трансформированный штамм был способен расти на минимальной среде М9, дополненной Ό-триптофаном.

Колонии, которые растут на среде с Ό-триптофаном, подвергают скринингу. Плазмиду выделяют и повторно трансформируют в родительский штамм (САО18455 или САО18579) для подтверждения того, что рост на среде с Ό-триптофаном зависит от плазмиды, а не от мутаций хозяина. Анализируют нуклеотидные последовательности плазмид, которые комплементируют ауксотрофные свойства в отношении триптофана. Клоны, которые определяют как содержащие ген триптофанрацемазы, анализируют далее.

Триптофанрацемазу из других тканевых источников выделяют аналогичным образом. Существуют литературные данные об активности триптофанрацемазы как в клеточной культуре тканей табака (№сойапа !аЪасит Ь. вариант V^κсοиκ^и 38) (Мшга, О.А. апй МШк, З.Е. Тйе соп\'егкюп ой Ό-йурФрйап !о Ь(гурЮрйап ш се11 си1!игек ой !аЪассо. Р1ап! Рйукю1. 1971, 47:483-487), так и в неочищенных белковых экстрактах пшеницы (ТгШсит аекФпт) (Кекок1ауккауа, И.Ь., Уиг'ес'е, О.М, Зй^Ъаиονа, Ь.А., апй За1уаеν, К.К. Зуп!йек1к апй рйукю1одюа1 йипсйоп ой О-!гур!орйап йшгпд тйеа! дегтта!юп. Кикыап 1. Р1ап! Рйукю1. 1997. 44:196-203). Экспрессирующую библиотеку кДНК получают из ткани, как описано в литературе, и экспрессирующую библиотеку используют для трансформации ауксотрофа по триптофану, как описано выше.

Анализ триптофанрацемазы.

Клоны, которые идентифицируют как потенциально обладающие триптофанрацемазой, трансформируют в штамм Е. сой, обычно используемый для экспрессии рекомбинантных белков, таких как ВЬ21. Клетки выращивают в бульоне ЬВ до оптической плотности при 600 нм, составляющей 0,4-0,6. Промотор, запускающий экспрессию рацемазы, индуцировали посредством 1РТО (конечная концентрация 0,1 мМ). После индукции клеткам дают возможность экспрессировать белок в течение 1-3 ч при 37°С (с аэрацией). Клетки собирают и лизируют посредством пресса Ргепсй, обработки ультразвуком или химическими средствами (такими как ВидВик!ег (Nονадеи, МаФкоп, VI) ). Лизированные клетки центрифугируют для удаления клеточного дебриса. Очищенный экстракт используют непосредственно в анализах.

В раствор добавляют различные количества экстракта, так что конечная концентрация составляет 50 мМ фосфат калия (рН 7,0) и 2 мМ Ь-триптофан. Добавляют пиридоксаль-5'-фосфат до конечной концентрации 10 мкМ. Образцы инкубируют, а затем анализируют посредством ЬС/МЗ. Наличие пика Όтриптофана, когда в качестве субстрата используют только Ь-триптофан, указывает на положительный результат. Концентрация Ό-триптофана должна повышаться со времени до достижения равновесия, и скорость также должна повышаться при повышении концентрации белка, до тех пор, пока концентрация фермента не станет настолько высокой, чтобы он более не насыщался субстратом. Также Ό-триптофан можно превращать в Ь-триптофан, как описано выше.

Комплементирующий ген может кодировать Ό-аминотрансферазу (комплементирующий ген представляет собой ген, который при экспрессии устраняет следствия мутации в организме). Например, если организм обладает нуль-мутацией в одном из генов, требуемых для синтеза триптофана клеткой, комплементирующий ген может представлять собой ген, который при экспрессии позволяет штамму расти на минимальной среде (т.е. без триптофана). Эта реакция требует а-кетокислоты, такой как акетоглутарат, оксалоацетат или пируват, в качестве акцептора амино. Эти соединения, вероятно, будут представлены в клеточном экстракте (в небольших количествах). Эти соединения можно удалять с использованием колонки для обессоливания ΓΌ-10 (ОЕ Неа1!йсаге, ФксаТатау, N1), и, тем не менее, анализ можно проводить в неочищенном экстракте. Триптофанрацемазу с активностью очищают с использованием общепринятой колоночной хроматографии. В заключение, открытую рамку считывания, идентифицированную в качестве потенциальной триптофанрацемазы, клонируют в экспрессирующий вектор с аффинным маркером. Затем потенциальную триптофанрацемазу очищают аффинной хроматографией. В любом случае очищенный белок используют в ферментных анализах, по существу, как описано выше.

Обратные способы генетической инженерии триптофанрацемазы.

Триптофанрацемазу можно очищать либо из растительных, либо из микробных источников общепринятыми способами очистки белка, включая фракционирование с помощью сульфата аммония и общепринятую колоночную хроматографию. После очистки белка так, чтобы можно было выделить пятно 2-О-геля, используют способы микросеквенирования пептидов или общепринятые способы секвениро- 107 029538 вания аминокислот по принципу Эдмана (см. до1д^.йа^νа^б.еби/ш^с^осйеш/ для описаний протоколов и оборудования, используемых для этого типа работы). Однако в некоторых случаях геномную последовательность организма нельзя использовать в качестве источника белка для очистки белка, вследствие того, что такая последовательность еще не была определена. В этом случае первый набор вырожденных праймеров можно конструировать, исходя из доступной последовательности наиболее близкого известного родственника белкового источника. Затем для выделения последовательности, кодирующей триптофанрацемазу, проводят вырожденную ПЦР и прогулку по геному в соответствии с общепринятыми протоколами.

Образование монатина посредством триптофанрацемазы.

На 1 мл реакционной смеси добавляют следующее: приблизительно 60 мкг альдолазы РгоА С. !ек1ок1егош (предоставленной в клеточных экстрактах, как описано в XVО 03/091396 А2), 100 мкл/мл клеточного экстракта триптофанрацемазы или 1 мг/мл очищенной триптофанрацемазы, 4 мМ МдС12, 50 мМ Ь-триптофан, 0,5 мг Ό-аминотрансферазы ВюСа!а1уйск (АТ-103) (ВюСа!а1уйск, Ракабепа, СА), 100 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5, 0,05 мМ РЬР и 10 мМ а-кетоглутарат. Вследствие того, что пируват представляет собой доступный акцептор амино для Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью, а-кетоглутарат является необязательным. Эксперименты проводят с дублированием, с отрицательными контролями, в которых не добавляли альдолазу или не добавляли триптофанрацемазу. Образцы инкубируют ~1 ч или в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании.

Триптофанрацемазу тестируют на активность в отношении монатина. Используют анализ, сходный с анализом примера 17, с монатином в качестве субстрата и сравнивают с активностью фермента в отношении триптофана. Идеальный фермент обладает активностью в отношении триптофана, но обладает небольшой активностью или не обладает активностью в отношении других аминокислот, в частности глутамата и монатина. Если фермент обладает значительной активностью в отношении монатина, фермент можно подвергать мутагенезу для снижения активности в отношении монатина и/или глутамата, сохраняя активность в отношении триптофана неизмененной или находящейся на уровне, достаточно высоком для того, чтобы фермент был пригодным для получения монатина. Способы, которые можно использовать для мутагенеза, включают, но не ограничиваются ими, ПЦР с пониженной точностью, сайт-направленный мутагенез, моделирование в целях идентификации мишеней для сайт-направленного мутагенеза (участков, которые могут быть вовлечены связывание субстрата), пассирование через мутагенные штаммы и перетасовку ДНК.

Подвергнутые мутагенезу рацемазы можно подвергать скринингу в отношении активности триптофана с использованием анализа на планшетах, как описано выше. Затем клоны, которые сохраняют активность в отношении триптофана, подвергают скринингу в отношении потери активности в отношении монатина.

Пример 16. Сайт-направленный мутагенез НЕХАкрС.

Обзор эксперимента.

Было выявлено, что гексамутантная форма Е. сой АкрС (НЕХакрС) обладает лучшей активностью по сравнению с АкрС в отношении образования 8,8-монатина, как описано в примере 6 VО 03/091396 А2. НЕХ (регистрационный номер:/АНРА дг 127190) содержит следующие мутации из АкрС (нумерация по Е. сой): У35Ь, К37У, Т431, Ν64Ό, Т1048 и N2858. Исходя из структурного анализа и литературных данных (8. Ко!йтап апб 1. Кйксй, 1. Мо1. Вю1. (2003), 327, 593-608; 8. Ко!йтап е! а1., Рго!еш 8аепсе (2004), 13:763-772), создали еще 5 мутантных форм, которые, как ожидалось, повышают кинетическую активность в отношении субстратов, используемых в каскаде образования монатина: Ь-триптофана, 8МР или обоих из них. Две из мутантных форм повышали скорости переаминирования как триптофана, так и 8,8-монатина. Две из мутантных форм показали повышенную стереоселективность в отношении образования 8,8-монатина, в то время как одна мутантная форма была менее стереоселективной. Исходя из этого, ожидается, что Ό-аминотрансфераза с широкой специфичностью из ВасШик кр., обладающая сходными мутациями, является пригодной в качестве Ό-аминотрансферазы в каскадах К,К-монатина, представленных на фиг. 3 и описанных в примере 15. Одна из мутантных форм (НЕХакрСР9Т/К122О) обладала повышенной активностью в отношении переаминирования Ь-триптофана, однако активность в отношении образования 8,8-монатина или переаминирования 8,8-монатина значительно снижалась. Таким образом, ожидается, что этот фермент является пригодным на первой стадии каскадов образования К,К-монатина, представленных на фиг. 1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8 и описанных в примерах 18 и 19. Как правило, аминотрансфераза, которая обладает активностью, сходной с активностью АкрС в отношении Ьтриптофана и ограниченной активностью в отношении К-МР и 8-МР, является пригодной для процессов, представленных на фиг. 1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8.

Способы и материалы.

Ген НЕХ, клонированный в рИС19 был предоставлен профессором ТЕ. Кйксй Щерайтеп! ой Мо1еси1аг апб Се11 Вю1оду, Ишуегейу ой Са1йогта, Вегке1еу, Вегке1еу, СА 94720-3206), и его использовали в качестве матрицы для клонирования гена в рЕТ23а. См. 1атек 1. Опиййег апб 1аск Р. К1гксй, Кебеыдп ой !йе кийкйа!е кресйюйу ой ЕксйейсЫа сой акрайа!е аттойапкйегаке !о !йа! ой ЕксйепсЫа сой 1угокте атй

- 108 029538 ηο!^аηкΕе^аке Ьу Ьοтο1οду тοПе1^ηд аис! кйе-Ппес!еП ти!адеηек^к, Рго!ет 8с^еηсе, 4:1750-1757 (1995). Также см. регистрационный номер ΝСΒI 1АНР_А ΟΙ:1127190 (аминокислотная последовательность НЕХ). Следующие праймеры были сконструированы для клонирования гена НЕХ в вектор рЕТ23а (Νονадеη, МаП^8οη, \Ι):

Праймеры НЕХакрС:

Х-концевой: 5'-ОСООААСАТАТОТТТОАОААСАТТАССОСС-3' (8ЕО ГО ХО: 393);

С-концевой: 5'-АТААССООАТССТТАСАОСАСТОССАСААТСО-8' (8ЕО ГО ХО: 394).

Для амплификации гена использовали следующий протокол ПЦР. В реакционную смесь объемом 100 мкл добавляли 50 нг ДНК-матрицы, 1,0 мкм каждого праймера, 0,2 мМ каждого ПХТР, 1 Е полимеразы РЕи Тиг^ю (8!^а!адеηе, Ра ЫНа, СА) и 1Х буфер (Ίοικχΐ РЕи. В программе термического блока использовали горячий старт при 94°С в течение 5 мин; с последующими 25 циклами из стадии денатурации при 94°С (30 с), стадии отжига при 55°С (1 мин) и стадии удлинения при 72°С (2 мин) и в конце с заключительной стадией при 72°С (7 мин). Для клонирования продукта ПЦР рЕТ23а использовали стандартные способы молекулярной биологии с использованием участков рестрикции ΝПеI и ВатНР

Полагают, что остаток триптофана в положении 130 является важным для стэкингвзаимодействий с кольцом пиридоксила, однако также, по-видимому, он является источником стерического препятствия для субстрата 8-предшественника монатина (МР), исходя из наблюдений с моделированием белков. Таким образом, аминокислоту с гидрофобной боковой цепью меньших размеров (фенилаланин) использовали для замены триптофана. Остальные мутации были основаны на кинетических данных из литературы, хотя создавали новые сочетания требуемых мутаций. Все мутации НЕХакрС, за исключением \130Р, проводили с использованием набора 8!^а!адеηе Ми1!^-СЬаηде кН (8!^а!адеηе, Ра ЫНа, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Мутацию \ 130Р проводили с использованием набора 8Ца1адеие ОшкСНаиде кН (8!^а!адеηе, Ра 4ο11η, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя, с единственным исключением, заключающимся в том, что температура удлинения в реакции ПЦР была снижена до 66°С. Праймеры для набора для множественных изменений конструировали с использованием инструмента для конструирования праймеров ЦЫк^а^е ти1й-кй рптег Пеκ^дη !οο1 на <иии.κ!^а!адеηе.сοт>, за исключением праймеров для единичной мутации \130Р.

Последовательности праймеров приведены ниже в табл. 20.

_ Таблица 20

Праймер	Последовательность (от 5’ к 3’)
ахрСЛУ 13 0Р_Ьаск\\агс1	СССТСТТАТССТТСССТТТССТТСССТТССТСАССС (8РО Ю N0:395)
ахрСЛУ 13 ОРГо п\агс1	ОООТОАОСААСССААОСТТТССОААССАТААОАОСО (8ЕО ГО N0:396)
К122О-Г	СААААААТАССАОСОТТААОООАОТОТОООТОАОСААСС (8Е0 ГО N0:397)
Р9Т_4“	САТТАССОССОСТАСТОССОАСССОАТТС (8Е0 ГО N0:398)
168У-1“	САССАААААТТАССТСООСОТАОАСООСАТСССТОААТТ (8Е0 ГО N0:399)
Т156А“	ТОАТОСООААААТСАСОСТСТТОАСТТСОАТОСАС (8Е0 ГО N0:400)

Экспрессия мутантных генов НЕХакрС и анализ активности фермента.

Жидкие культуры (5 мл) Νονадеη Ονе^η^дЬ! Ехргекк™ Αи!ο^ηПис!^οη 8ук!ет 2 (каталожный # 713663; растворы 1-6) (Νονадеη, МаП^кοη, \Ι) инокулировали из свежих планшетов или замороженных исходных культур в глицерине следующих штаммов:

Е. οο1ΐ ВЬ21(ПЕ3) Е. οο1ΐ ВЬ21(ПЕ3) Е. οο1ΐ ВЬ21(ПЕ3) Е. οο1ΐ ВЬ21(ПЕ3) Е. οο1ΐ ВЬ21(ПЕ3) Е. οο1ΐ ВЬ21(ПЕ3) :: НЕХакрСрЕТ23а, :: НЕХакрС\130РрЕТ23а, :: НЕХакрСТ156АрЕТ23а, :: НЕХакрСР9Т/Т156АрЕТ23а, :: НЕХакрСР9Т/Р122ОрЕТ23а, :: НЕХакрСР122О/Т156АрЕТ23а.

Культуры инкубировали при 37°С при 230 об/мин в течение 6-8 ч. Определяли ОЭ₆₀₀ каждой культуры, и вычисляли объем культуры, необходимый для достижения ОЭ₆₀₀ 0,03-0,05 в 25 мл. Вычисленные объемы каждой жидкой культуры переносили во флаконы, содержащие 25 мл той же среды. Ονе^η^дЬ! Ехргекк™ Αи!ο^ηПис!^οη 8ук!ет 2 представляет собой полную среду с определенным химическим составом для экспрессии на высоком уровне с ГОТО-индуцируемыми экспрессирующими системами, которые используют лактозу в качестве индуцирующего вещества и не требуют мониторинга клеточного роста. Культуры ОхепидН Ехргекк инкубировали при 30°С при встряхивании при 230 об/мин в течение 18 ч. Клетки собирали центрифугированием и промывали один раз холодным 50 мМ МОР8, рН 7,0. Затем

- 109 029538 клетки лизировали с использованием реагента для экстракции ΒидЬиδΐе^™ (не содержащего первичные амины) ΕχΡ^^οη Κеадеηΐ (Nονадеи каталожный #70923-3) (^^адещ Маά^δοη. \Ι), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Βοηζοικίδυ (Nονадеи Са1а1од #7074 6-3) (^оуадещ Маά^δοη. \\Ί), 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Ριό(ο\18ο Ιηΐιώκοί' СоскшП δο( ΙΙ (Nονадеи Са(а1од #539132) (^оуадещ Маά^δοη. \Ι) и 0,33 мкл/10 мл ^-^уδοζуте (Nονадеи Са1а1од #71110-3) (^оуадещ Маά^δοη. \\Ί), в соответствии с рекомендованным протоколом ЭДоуадещ После инкубации при 25°С в течение 15 мин при осторожном встряхивании клеточный дебрис из каждой суспензии осаждали центрифугированием при 21000хд в течение 15 мин при 4°С. Супернатант осторожно отбирали и анализировали в качестве бесклеточного экстракта. Фракции включений выделяли суспендированием фракций клеточного дебриса в 30% реагенте для экстракции Βι%4ΐδ(οΐ'^ΊΛ' (не содержащем первичных аминов) ΕχΡ^Ιΐοη Κеадеηΐ. центрифугированием при 21000хд в течение 10 мин; суспендированием центрифугированного осадка в 10% реагенте для экстракции ΒидЬиδΐе^™ (не содержащем первичных аминов) Εχΐι^ΐίοη Κеадеηΐ. повторным центрифугированием с выделением промытого осадка. Бесклеточные экстракты и фракции включений анализировали в отношении экспрессии белка посредством δΌδ-ΡΑΟΕ на гелях с 4-15% градиентом (ΒιοΙΡιά # 161-1104, Нег^1θδ, СА). Для образцов клеточных экстрактов в каждую дорожку геля помещали двадцать микрограмм растворимого белка (предварительно смешанного с 1Х буфером для нанесения белка и нагретого при 95°С в течение 5 мин). Фракции включений растворяли в 1Х буфере для нанесения белка (0,2 мл), нагревали в течение 10 мин при 95°С и в каждую дорожку наносили 5 мкл каждого раствора. Количество каждой мутантной формы НБХ по сравнению с тотальным растворимым белком, нанесенным в каждую дорожку, вычисляли посредством анализа интенсивности полос с использованием ЬаЬшоН^ Β^οίтад^ηд ΙΌде1 (оо1 (υνΡ, Ιησ υρίаηά. СА), он описан ниже.

Таблица 21

Образец	Белок НЕХакрС/тотальный растворимый белок
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСР9Т/Т156АрЕТ23а СРЕ	0,310
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСР9Т/К.122АрЕТ23а СРЕ	0,145
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСрЕТ23а СРЕ	0,172
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСК.122А/Т156АрЕТ23а СРЕ	0,174
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рС\¥130РрЕТ23а СРЕ	0,114
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСТ156АрЕТ23а СРЕ	0,120

Анализ гелей показал, что мутантная форма НΕXаδρСΚ122Α/Τ156Α представляла собой единственный белок, который встречался в достаточных количествах во включениях. Белок НΕXаδρСΡ9Τ/Τ156Α привел к наиболее высокому уровню экспрессии, приблизительно на 90% большему, чем белок НΕXаδρС. В противоположность этому белки \130Р, Т156А и Ρ9Τ/Κ122Ο экспрессировались в меньших концентрациях, чем НΕXаδρС.

Активность мутантных белков НΕXаδρС в отношении образования δ,δ-монатина измеряли с использованием следующих условий реакции: каждая реакционная смесь объемом 1 мл содержала 50 мМ ΤΑΡδ, рН 8,2, 4 мМ МдС1₂, 3 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 200 мМ пируват натрия (рН доведен до 8), 5 мМ α-кетоглутарат (рН доведен до 8), 50 мМ триптофан, 0,05 мМ пиридоксаль-3-фосфат, 50 мкг/мл альдолазы Ριό А (добавленной в качестве бесклеточного экстракта) и различные концентрации (приблизительно 50 и 500 мкг/мл) аминотрансферазы (добавленной в качестве бесклеточного экстракта). Для получения исходных растворов и для доведения объема реакционных смесей до 1,0 мл использовали деаэрированную воду. Пиридоксальфосфат добавляли непосредственно перед добавлением ферментов. Реакционные пробирки инкубировали при 30°С при осторожном встряхивании в течение 4 ч. Образцы (0,01 мл) извлекали через 1, 2 и 4 ч после добавления ферментов, фильтровали и анализировали посредством ЬС/М8/М8, как описано в примере 1. Образование монатина нормализовали, исходя из количества аминотрансферазы, находящейся в реакционных смесях. В условиях этих анализов НΕXаδρС и НΕXаδρСΤ156Α образовывали наибольшее количество тотального монатина на 1 мг аминотрансферазы, в то время как белок Ρ9Τ/Κ122Ο образовывал наименьшее количество, за которым следует НΕXаδρС\130Ρ. Ферменты НΕXаδρС\130Ρ и Ρ9Τ/Κ122Ο показали наиболее высокую стереоселективность в отношении δ-!Ρ (более 98% δ,δ-монатина), даже в случае применения высоких концентраций фермента (более 300 мкг/мл). В ферментативных реакциях, содержащих фермент Р9Т/Т156А в высокой концентрации, процентное количество продукта в виде δ,δ-монатина снижалось менее чем до 90%. Другие мутантные формы показали стереоселективность в отношении продукта, высокосходную с исходной мутантной формой НΕXаδρС (приблизительно 95% δ,δ-монатин). Анализ продукта реакции, содержащей фермент НΕXаδρС с использованием образования производных посредством реагента ΡΌΑΑ, описанный в примере 1, показал, что второй образованный стереоизомер представляет собой Κ,δ-монатин.

Анализ активности аминотрансферазы в отношении триптофана и монатина.

Мутантные формы тестировали на активность в отношении переаминирования с использованием δ,δ-монатина и Ь-триптофана в качестве субстратов. Активность аминотрансферазы измеряли, отслежи- 110 029538 вая образование копродукта реакции, глутамата посредством ВЭЖХ с послеколоночным образованием производных посредством ОРА, как описано в примере 1. Реакционная смесь содержала, в 1,0 мл, 100 мМ буфер НЕРР8, рН 8,0, 20 мМ а-кетоглутарат, 0,08 мМ пиридоксальфосфат, 25 мМ триптофан или 8,8-монатин и фермент (предоставленный в качестве 2,5 мг белка в клеточных экстрактах). Все компоненты, за исключением фермента, смешивали, для начала реакции добавляли фермент и реакционный раствор инкубировали при 30°С (осторожно встряхивания) в течение 90 мин. Реакции проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которых фермент не добавляли. Реакцию останавливали добавлением 10% муравьиной кислоты (конечная концентрация), смесь центрифугировали при 21000 об/мин и супернатант осторожно удаляли и фильтровали. Данные корректировали по фоновым уровням глутамата и по разбавлению при добавлении кислоты для осаждения белков, затем нормализовывали по количеству добавленной мутантной аминотрансферазы. Когда в качестве субстрата использовали триптофан, НЕХакрС образовывал 13,0 мМ глутамата на 1 мг аминотрансферазы в час. Относительная активность, выраженная в процентах, мутантных форм является следующей: НЕХакрС^ 130Е (156%), НЕХакрСТ156А (151%), НЕХакрСР9Т/Т15 6А (63,7%), НЕХакрСР9Т/К122О (116%) и НЕХакрСК122О/Т156А (107%). Когда в качестве субстрата использовали 8,8-монатин, НЕХакрС образовывал 7,43 мМ глутамата на 1 мг аминотрансферазы в час. Относительная активность, выраженная в процентах, мутантных форм является следующей: НЕХакрС№130Е (113%), НЕХакрСТ156А (87,7%), НЕХакрСР9Т/Т156А (67,3%), НЕХакрСР9Т/К122О (11,2%) и НЕХакрСК122О/Т156А (114%).

Мутантная форма НЕХакрСР9Т/К122О обладала повышенной активностью в отношении превращения триптофана в индол-3-пируват, но сниженной активностью в отношении переаминирования 8,8монатина. Соотношение активности в отношении превращения триптофана в монатин составляло 18,2 по сравнению с 1,75 для НЕХакрС, что делает его желательным кандидатом для получения К,К-монатина с использованием каскадов, для которых требуется Ь-аминотрансфераза, такая как Ь-аминотрансферазы, описанные в примерах 18 и 19. Таким образом, НЕХакрСР9Т/К122О является примером аминотрансферазы с ограниченной активностью в отношении 8,8-монатина (и МР).

Большинство мутаций повышало активность Ь-триптофана, однако только две мутантные формы приводили к повышению активности в отношении как Ь-триптофана, так и 8,8-монатина (НЕХакрС^130Е и НЕХакрСК122О/Т156А). Поскольку в этих анализах использовали 25 мМ субстрат, наиболее вероятно, ферменты были насыщенными, и активность отражает кса! ферментов. Однако в условиях, в которых проводили анализы образования 8,8-монатина (выше), маловероятно, что концентрация 8-МР является достаточной для насыщения фермента, таким образом, повышение к_са! не отражается. Было описано для некоторых веществ, что некоторые из мутаций приводят к повышению к_са!, однако также снижают кажущуюся Кт в отношении субстрата, представляющего собой аминокислоту. Ожидается, что при использовании возрастающих концентраций субстратов эти две мутантные формы обеспечат преимущество в отношении скоростей образования 8,8-монатина по сравнению с НЕХакрС. Оказалось, что мутация НЕХакрСТ156А приводит к повышенным скоростям переаминирования триптофана без существенного эффекта на скорость переаминирования МР в условиях, указанных выше для образования 8,8монатина.

Посредством сравнения структур НЕХакрС и одного из ферментов Ό-аминотрансфераз ВасШик кр. (см., например, 8. 8идю, О.А. Ре!кко, !М. Маптпд, К. 8ойа апй Ό. Ктде, ВюсЬеттйу 34 (1995) рр. 96619669), мутации ^130Е, К122О, Т156А и НЕХ в АкрС можно картировать в соответствующих остатках в структуре Ό-аминотрансферазы. Ожидается, что сходные мутации в Ό-аминотрансферазе широкой специфичности повысят общее образование К,К-монатина, как описано в примере 14. Например, функциональная группа, обеспечиваемая триптофаном 130 в АкрС, заменена в Ό-аминотрансферазах ВасШик водородной связью между боковыми цепями серинов 179-181 и глутаматом 166 (схема нумерации УМ-Ι). Для уменьшения пространственных препятствий глутамат можно подвергать мутации в остаток аспартата.

Некоторые Ό-аминотрансферазы обладают остатком треонина в положении 179, который может увеличивать пространственное препятствие и который следует избегать. Фермент В. крЬеапсик обладает аланином вместо серина в положении 181, который также может уменьшать пространственное препятствие.

Дополнительную информацию из исследований аспартатаминотрансферазы также можно применять для Ό-аминотрансферазы. В то время как фермент АкрС обладает аргинином в области, которая взаимодействует с боковой цепью дикарбоксилатных субстратов, Ό-аминотрансфераза обладает петлей от 8ег240 до 8ег243. Боковые цепи 8ег240, ТЬг242 и 8ег243 повернуты в одном направлении и образуют карман с гидроксильной группой 8ег180, который обеспечивает поверхность, на которой могут взаимодействовать как неполярные, так и полярные субстраты. 8ег180 вовлечен в связывание РЬР; однако в целях повышения активности Ό-аминотрансферазы в отношении К-МР можно модифицировать остатки 8ег240, ТЬг242 или 8ег243 для акцептирования более крупных субстратов или для предпочтения отрицательно заряженных субстратов. Например, ТЬг242 можно подвергать мутации на 8ег в целях снижения длины боковой цепи. Один из остатков можно подвергать мутации на лизин или аргинин, такой как 8ег243. Остатки (нумерация УМ-1) Уа130-Уа136 расположены в бета-цепи напротив активного центра Ό- 111 029538 аминотрансферазы и также являются важными для активности. Полагают, что Туг31, Уа133, О1и32 и Ьук35 расположены в направлении активного центра. Туг31, О1и32 и Уа133 являются инвариантными во всех гомологах ВасШик. Ко еί а1. (РЕВ8 Ьей 398 (1996) рр. 141-145) проводили мутагенез Уа133 на Αίа и выявили немного повышенную каталитическую эффективность в отношении переаминирования акетоглутарата и значительно повышенную каталитическую эффективность в отношении более объемных субстратов (меньшее пространственное препятствие). В некоторых гомологах Ьук35 заменен на Αι^, однако в случае опасений в отношении пространственного препятствия остаток Ьук является предпочтительным. Остатки валина 34 и 36 также являются предпочтительными по сравнению с консервативными заменами, такими как изолейцин, также вследствие меньшего пространственного препятствия для больших молекул, таких как МР.

Пример 17. Клонирование, экспрессия и тестирование глутамат- и аспартатрацемаз.

В этом примере описаны способы, используемые для клонирования и тестирования ферментов рацемаз аминокислот, которые можно использовать для взаимопревращения между Ь-глутаматом и Όглутаматом (или Ь- и Ό-аспартатом или Ь- и Ό-аланином). Глутамат-, аспартат- или аланинрацемазы пригодны в биосинтетическом каскаде образования К,К-монатина, когда одна стадия в этом каскаде приводит к Ь-аминокислоте (такой как Ь-глутамат, Ь-аспартат или Ь-аланин), а другая стадия каскада использует Ό-аминокислоту (такую как Ό-глутамат, Ό-аспартат или Ό-аланин). На фиг. 4 проиллюстрирован биосинтетический каскад получения К,К-монатина из Ь-триптофана с использованием Ь-триптофанспецифичной аминотрансферазы, К-специфичной альдолазы, Ό-аминотрансферазы и глутамат- (или аспартат- или аланин-)рацемазы.

Гены клонировали в векторы рЕТ28 и рЕТ30 для получения как белков без маркера, так и слитых белков с поддающимися Ν-концевому расщеплению маркером Н186/маркером Т7. Полученные белки очищали с использованием аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом.

Обзор эксперимента.

Гены, кодирующие глутаматрацемазы (ЕС 5.1.1.3) из ЬасЮЬасШик Ьгесак (регистрационный номер ОепЬапк № Ό29627, последовательность нуклеиновой кислоты) и РеЛюсоссик реШокасеик (ген тиг1) (регистрационный номер ОепЬапк № Ό22789) клонировали и экспрессировали в Е. сой. Экстракты тестировали на активность в отношении превращения Ь-глутамата в Ό-глутамат и Ό-глутамата в Ь-глутамат. Фермент аспартатрацемазу ВюСаШуИск (ЕС 5.1.1.13) (ВюСа1а1уЛск, РакаЛепа, СΑ) также тестировали в отношении взаимопревращения между Ь- и Ό-аспартатом.

Выделение геномной ДНК для клонирования.

Геномную ДНК Ь. Ьгесак ^ТСС 8287Ό) получали из Американской коллекции типовых культур. Р. реШокасеик ^ТСС 25745) выращивали при 37°С в бульоне МК8 1ас1оЬасПП и 2 мл использовали для выделения геномной ДНК с использованием способа Мека1апок ίί. Оирйсайоп и атрййсайоп оГ Ιο.\ίη депек ίη УШгю сЛо1егае. Се11. 1983. 35:253-63.

Протокол полимеразной цепной реакции.

Конструировали праймеры с 5'-участками рестрикции и выступающими концами для клонирования в векторы рЕТ28 и рЕТ30 (Nονадеη, МаФкоп, XVI). Праймеры для глутаматрацемазы Ь. Ьгесак:

Ν-концевой: 5'-ОСООСОССΑΤООΑΑΑΑΤОΑΤССОΑΤΤООΤСΤΑΑΤО-3' (8ЕО ΙΌ \О: 401) и

С-концевой: 5'-ОСООСООΤСОΑСОСΑΑΤΤΑСΑΑΤΤОΤОΤΤΤОΤС-8' (8ЕО ΙΌ \О: 402).

Праймеры для глутаматрацемазы Р. реШокасеик:

Ν-концевой: 5'-ОСООСОССΑΤООΑΤОΤΑΤОΤΑΤΑΑΤΤΤΤΑΤΤΤΑО-3' (8ЕО ΙΌ ЦО: 403) и

С-концевой: 5'-ОСООСООΤСОΑСΑΑΑΤΤΤСΑΤΤΑΤΤСΑΤΤСΤΑΑΤΤΤ-3' (81 Ε) ΙΌ ЦО: 404).

Ген из Ь. Ьгесак амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. В 50 мкл реакционной смеси использовали 0,150 мкг матрицы, 1,6 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого ЛКТР, 2,8 Е высокоточной полимеразы ЕхрапЛ ШдЛ РШеШу™ Ро1утегаке (КосЛе, ФЛгапаройк, ΙΝ), 0,5 Е полимеразы РГи (81га1адепе. Ьа 1ойа, СΑ) и 1Х буфер ЕхрапЛ™ с Мд. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 96°С в течение 3 мин, 8 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин с последующими 22 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин. После 22 повторов образцы держали при 72°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту длиной ~830 п.н., исходя из сравнения с маркерами размера ДНК.

Ген из Р. реШокасеик амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. В 50 мкл реакционной смеси добавляли 0,15 мкг матрицы, 1,6 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого ЛХТР, 2,8 Е высокоточной полимеразы ЕхрапЛ ШдЛ РШеШу™ Ро1утегаке, 0,5 Е полимеразы РГи и 1Х буфер ЕхрапЛ™ с Мд. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 96°С в течение 3 мин, с последующими 8 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 37°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин, с последующими 8 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 45°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин, с последующими 14 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин. После 14 повторов образцы держали при 72°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту ~840 п.н., исходя из сравнения с

- 112 029538 маркерами размера ДНК.

Клонирование.

Продукты ПЦР очищали из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеи (01адеи, Уа1еис1а, СА). Продукты ПЦР количественно определяли с использованием спектрофотометра ЗтайЗрес 3000™. Продукты расщепляли посредством рестрикционных ферментов К^ и ЗаИ в соответствии с рекомендованными изготовителем протоколами (Кеш Еид1аиД Вю1аЬк, Ве'ег1у, МА) и очищали из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1адеи (О1адеи, Уа1еиаа, СА). Векторы рЕТ28 и рЕТ30 получали расщеплением ферментами рестрикции К^ и ЗаИ с последующей обработкой щелочной фосфатазой креветки и очисткой из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА).

Расщепленные векторы и вставки лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Карΐά™ ОКА ЫдаИои Кй (Косйе, ШДхаиароНк, ГК). Приблизительно 50 нг обработанной вставки, 100 нг обработанного вектора (с молярным соотношением вставки и вектора 3:1), 5 Е ДНК-лигазы Т4 и 1Х буфер для лигирования инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Реакционные смеси для лигирования очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР с высокой чистотой Шдй Риге РСК РгоДис! РшгйсаИои Кй (Косйе, МхитароШ, ЕК) и использовали для трансформации электрокомпетентных клеток Е. сой ЭН10В (^Шодеи, Саг1кЬаД, СА). К 40 мкл клеток ЭН10В добавляли 10 мкл каждой реакционной смеси для лигирования и трансформировали электропорацией с использованием Вю-КаД 0еие Ри1кег II (Вю-КаД, Негси1ек, СА) в следующих условиях: 2,5 кВ, 25 мкФ, 200 Ом в 0,2-см кювете. Клеткам давали возможность восстановиться в 1 мл ЗОС, находящейся при комнатной температуре, в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Клетки высевали на планшеты с ЬВ, содержащие канамицин (50 мкг/мл).

Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах посредством центрифугирования О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки посредством рестрикционного расщепления с помощью К^ и ЗаИ. Последовательности плазмид, для которых оказывалось, что они обладают правильной вставкой, проверяли посредством секвенирования с помощью дидезокситерминации цепи ДНК.

Экспрессия гена и анализы.

Плазмидную ДНК, проверенную анализом последовательности, субклонировали в экспрессирующего хозяина ВЬ21(ОЕ3) Е. соН (Кονадеи, МаДЕои, VI). Культуры выращивали. Плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава.

Индукцию в ВЬ21(ОЕ3) первоначально проводили посредством глутаматрацемаз Ь. Ьге\зк и Р. реиЮкасенк как в векторе рЕТ28 (без маркера), так и в векторе рЕТ 30 (маркированном гистидином). Проводили исследование с течением времени для культур, выращиваемых в 250 мл ЬВ, содержащей канамицин (50 мг/л) до ΘΌ₆₀₀ 0,5-0,6, индуцированных посредством 100 мМ РТ0 (изопропилтиогалактозид) и подвергаемых забору образцов в моменты 0 и 3 ч после индукции. Клетки из 600 мкл (0 ч) и 275 мкл (3 ч) суспендировали в 40 мкл буфера с додецилсульфатом натрия, содержащем 2-меркаптоэтанол, нагревали до 95°С в течение 10 мин и охлаждали. Аликвоты эти образцов тотального клеточного белка анализировали посредством ЗОЗ-РАОЕ с использованием геля с градиентом 4-15%.

Клеточные экстракты также получали из 3-часовых культур суспендированием клеточного осадка из 5 мл культуры в 0,625 мл реагента Кονадеи ВидВикГег™ (Кονадеи, МаДщои, VI), содержащего 0,625 мкл нуклеазы бензоназы и 3 мкл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1Ыосйет-Ко'аЫосйет Согр., Заи П1едо, СА) при комнатной температуре в течение 20 мин при осторожном встряхивании и центрифугированием при 16000хд для удаления клеточного дебриса. Супернатанты (клеточные экстракты) наносили на гели с 4-15% градиентом для анализа клеточных растворимых белков.

3-часовые образцы из клонированной глутаматрацемазы Ь. Ьге\ак и глутаматрацемазы Р. реиГокасеик показали как общий, так и растворимый белок, которые соответствуют правильному размеру (приблизительно 31 кДа). Продукт гена рЕТ30 (маркированный гистидином) Ь. Ьге\ак сверхэкспрессировался на более высоком уровне, и также был более растворимым (>20% растворимого белка), чем продукт гена рЕТ 28 (без маркера) Ь. Ьге'1к, а также продукты гена Р. реиГокасеик в обоих векторах. Продукт гена Р. реиГокасеик показал равную сверхэкспрессию и растворимость в векторах рЕТ28 и рЕТ30, которые были значительно меньшими, чем сверхэкспрессия и растворимость продукта гена рЕТ30 Ь. Ьге\ак.

Клетки из индуцированных культур (250 мл) центрифугировали и промывали один раз посредством 0,85% КаС1. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл/г сырой массы клеток реагента ВидВикГег™ (Ко'адеи, МаДщои, VI), содержащего 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1ЬюсйетКо'аЬюсйет Согр., Заи П1едо, СА) и 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на орбитальном устройстве для встряхивания. Нерастворимый клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16,000хд в течение 20 мин при 4°С.

Клеточные экстракты анализировали в отношении активности глутаматрацемазы с использованием следующего протокола. Реакции объемом 400 мкл проводили в 10 мМ фосфате калия (рН 8,0), 0,2 мМ

- 113 029538

ΌΤΤ и 10 мМ Ь-глутамате или Ό-глутамате. Реакции начинали добавлением 20-100 мкл бесклеточных экстрактов и инкубировали при комнатной температуре. Аликвоты образцов отбирали через 1, 5, 10, 20 мин и 1 ч (образцы в момент ноль минут служили в качестве контрольных реакций). К каждой 40-мкл аликвоте образцов добавляли 2М муравьиную кислоту (25 мкл) для остановки реакции и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до анализа посредством ЬС/М8/М8.

Результаты анализа клеточных экстрактов после индукции рЕТ30 посредством 100 мМ 1РТО (3 ч) показывают, что ферменты Ь. ЬгеУ18 (регистрационный номер ОепЬапк № ВАА06106.1 01:468450) и Р. реп1о8асеи8 (регистрационный номер ОепЬапк № ААА16761.1 01:349029) обладают значительными уровнями активности рацемазы в отношении обоих изомеров глутамата. Рацемаза Р. реп1о8асеи8 (20 мкл клеточных экстрактов) обеспечивала равновесие между Ь- и Ό-глутаматом через 10-20 мин, начиная с любого субстрата. Фермент Ь. ЬгеУ18 (20 мкл клеточных экстрактов) также обеспечивал равновесие приблизительно через 20 мин.

Частично очищенный фермент аспартатрацемаза (каталожный # ΑδРΚ-101), приобретенный от ΒίоСа1а1уйс8, 1пс. (Ра8айепа, СΑ), анализировали на активность в отношении транспорта Ь-аспартата и Όаспартата с использованием протокола, сходного с протоколом, указанным выше. Коммерческий фермент показал активность рацемазы в отношении обоих изомеров. При использовании 0,5-1 мг фермента равновесие достигалось через 20-60 мин.

Все три рацемазы (глутаматрацемаза Ь. ЬгеУ18, глутаматрацемаза Р. реп1о8асеи8 и аспартатрацемаза ВюСаЫуйсз) также анализировали на активность в отношении δ,δ-монатина с использованием следующего протокола. Реакции объемом 400-мкл проводили с 10 мМ фосфатом калия (рН 8,0), 0,2 мМ ΌΤΤ и 10 мМ δ,δ-монатином. Реакции инициировали добавлением бесклеточных экстрактов (Ь. ЬгеУ18 и Р. реп1о8асеи8) или очищенного фермента (аспартатрацемаза ВюСа1аййс8) и инкубировали при комнатной температуре. Аликвоты образцов отбирали через 1, 5, 10, 20 мин и 1 ч (образцы в момент ноль минут, а также образцы без фермента служили в качестве контрольных реакций). В каждую 40-мкл аликвоту образца добавляли 2М муравьиную кислоту (25 мкл) для остановки реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до их анализа посредством ^С/Мδ/Мδ (пример 1). Не было отмечено снижения концентрации δ,δ-монатина с течением времени, а также какого-либо повышения δ,Κ-монатина (представленного в качестве загрязняющего побочного продукта в количестве <5%, даже в контроле без фермента). Таким образом, ни одна из анализируемых рацемаз не показала активность в отношении монатина.

Пример 18. Получение Κ,Κ-монатина из Ь-триптофана с использованием глутамат- или аспартатрацемаз.

В этом примере описаны способы получения стереоизомерно-обогащенного Κ,Κ-монатина из Ьтриптофана с использованием Ь-триптофан(Ь-тирозин, или ароматической)аминотрансферазы, альдолазы ΓιόΑ, глутамат- или аспартатрацемазы и аминотрансферазы Ό-аминокислот с широкой специфичностью. На фиг. 5 представлена схема, на которой проиллюстрирован этот каскад. Этот подход для образования стереоизомерно-обогащенного Κ,Κ-монатина требует фермента на стадии 1, который обладает низкой активностью в отношении образования монатина из предшественника монатина (МР). Исходя из более ранних результатов, авторы настоящего изобретения использовали продукты гена 1;·ιίΑ δ^ηо^й^ζоЬшт теШой и Рйо0оЬас1ег 8рйаего1Йе8, описанные в примере 1 ΥΟ 03/091396 А2.

Материалы и способы.

Глутаматрацемазы из Ь. ЬгеУ18 и Р. реп1о8асеи8 продуцировали в Е. сой, как описано в примере 17. В некоторых случаях маркированный посредством Ηίδ₆ вариант этих ферментов очищали с использованием кассет Ηίδ-Βίπύ 900 в соответствии с протоколами изготовителя (ЯоУадеп, МаЙ18оп, ΥΙ) и подвергали обессоливанию для удаления имидазола с использованием колонок РЭ-10 (025 δерйаάеx, ОЕ Неаййсаге, Р18са1а№ау, ΝΤ). Ферменты элюировали в 25 мМ фосфате калия, рН 8,0. Аспартатрацемазу (ΑδРΚ-101) и Ό-аминотрансферазу (АТ-103) приобретали от ВюСа1а1уйс8, Шс. (Ра8айепа, СΑ).

Тирозин(ароматические)аминотрансферазы δ. тей1ой и Κ. 8рйаего1Йе8 получали, как описано в примере 1 ΥΟ 03/091396 А2. Альдолазу ΓιόΑ Сотатопа8 1е81о81егош получали, как описано в примере 4 ΥΟ 03/091396 А2. Анализ тотального белка проводили с использованием анализа белков Вю-Иай Рго1еш Αδδау в соответствии с протоколами изготовителя (Негси1е8, СΑ).

Снижение количества δ,δ-монатина, полученного с использованием рацемаз.

Реакционные смеси (объемом 1 мл, с дублированием) содержали 100 мМ фосфатно-калиевый буфер (рН 8), 2 мМ МдС1₂, 0,05 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР), 200 мМ пируват натрия, 5 мМ а-кетоглутарат натрия или оксалоацетат, приблизительно 280 мкг/мл Та1Л δ. теШой предоставленного в клеточном экстракте, 1 мг/мл Ό-аминотрансферазы ВюСа1а1уйс8 (АТ-103) (ВюСа1а1уйс8, Ра8айепа, СΑ), 100 мкл/мл клеточного экстракта глутаматрацемазы или 1 мг/мл аспартатрацемазы и приблизительно 100 мкг/мл альдолазы Рго, предоставленной в качестве клеточного экстракта. Твердый триптофан добавляли в концентрации 10,2 мг/мл. Отрицательные контроли ее содержали рацемазу. Образцы инкубировали при 30°С (при встряхивании 250 об/мин) в течение 1 ч, 2 ч или в течение ночи. Образцы центрифугировали для удаления осадка, фильтровали с помощью шприца и хранили при -80°С до анализа монатина с ис- 114 029538 пользованием способа ЬС/МЗ/МЗ, описанного в примере 1. Большинство образцов содержало >95% 3,3монатина, вследствие количеств нативной Ь-аминотрансферазы, находящейся в клеточных экстрактах. Однако образцы, которые содержали рацемазу, обладали сниженным количеством тотального монатина в результате того, что ферменты рацемазы приводят к меньшей доступности Ь-глутамата для переаминирования МР. Без рацемазы получали 1545-2355 м.д. монатина (главным образом, 3,3) с течением времени. При наличии рацемаз получали только 340-879 м.д. (фермент Ь. Ъ^еν^к), 444-531 м.д. (фермент Р. репЮка,еик) и 506-1460 м.д. (аспартатрацемаза) монатина. Эти данные указывают на то, что рацемазы активны в условиях реакции, необходимых для образования монатина. Для сведения к минимуму образование 3,3-монатина из ферментов клеточного экстракта, таких как аспартатаминотрансферазы, проводили дальнейшие эксперименты с очищенными ферментами и более высоким соотношением ферментов Оаминотрансферазы и Ь-аминотрансферазы.

Превращение Ь-триптофана в содержащие 4-К изомеры монатина.

Указанные выше эксперименты повторяли с использованием приблизительно 54 мкг очищенной Ьаминотрансферазы (ΤаίА либо 3. теПАй, либо К. крйаего1Тек), 1 мг аспартатаминотрансферазы (Β^οСаίа1уй,к, РакаТепа, СА), 1 мг Ώ-аминотрансферазы, оксалоацетата в качестве акцептора амино и 75 мкг очищенной альдолазы. Реакции проводили с дублированием с периодом забора образцов 2 ч и инкубацией в течение ночи. Отрицательные контрольные реакции проводили с Ь-аминотрансферазой 3. МеНАй, но без рацемазы. В дополнение к количественному определению пиков для К,К/3,3- и 3,К/К,3-монатина на основе обращенно-фазовой хроматографии, определяли процентную долю каждого стереоизомера с использованием способа образования производных посредством ГО/АА, описанного в примере 1. Результаты являются следующими.

_ Таблица 22

Ь-аминотрансфераза	Время инкубации	Тотальный монатин (м.д.)	% 3,3	%К,К	%К,3	% 8,К.
5. теШой Та(А	2ч	17,1	10,2	58,1	0,8	31,0
5. теШой Та(А	2ч	15,8	13,3	55,3	1,0	30,4
5. теШой Та(А	в течение ночи	77,7	25,8	40,0	1,3	32,9
5. теШой Та(А	в течение ночи	67,9	29,4	37,3	1,5	31,8
К. 8рНае.гок1е8 Та(А	2ч	241,2	96,3	2,3	0,8	0,6
К. 8рНае.гок1е8 Та(А	2ч	223,2	95,7	2,7	1,0	0,6
К. 8рНае.гок1е8 Та(А	в течение ночи	600,4	96,6	1,8	0,5	1,1
К. 8рНае.гок1е8 Та(А	в течение ночи	618,5	96,1	2,1	0,5	1,3
контроль без рацемазы	2ч	7,1	92,0	1,4	6,6	0,0
контроль без рацемазы	2ч	5,7	94,0	1,2	4,8	0,0
контроль без рацемазы	в течение ночи	44,6	93,5	1,3	4,7	0,5
контроль без рацемазы	в течение ночи	37,5	95,4	0,9	3,7	0,0

Очевидно, наличие рацемазы повышало количество тотального монатина, образованного при применении ΤаίА 3. теПАй в качестве фермента для переаминирования Ь-триптофана. Уровни монатина возрастали в среднем от 6,4 до 16,5 м.д. в двухчасовом анализе и от 41-73 м.д. в анализе после ночи. Кроме того, при использовании фермента рацемазы процентное количество образованного К,К возрастало приблизительно от 1 вплоть до 58%. 3,К-стереоизомер монатина, другой сильный подсластитель, представлял собой другой основной компонент, возрастая приблизительно от 0 в отрицательных контролях до 31%. Очевидно, ΤаίА К. крйаегоЫек обладал большей активностью в отношении 3-МР, чем Ьтрансаминаза 3. ηκΊί1οΐί, что показывает значение наличия фермента, который обладает высокой субстратной специфичностью в отношении Ь-триптофана по сравнению с МР, когда требуемыми продуктами являются 4-К изомеры монатина. С учетом того, что приблизительно 10% всего монатина представляет собой 43 в момент времени два часа, ΤаίА 3. теПАй можно рассматривать, как обладающую ограниченной активностью в отношении МР.

Эксперименты повторяли с очищенной ΤаίА 3. теПАй (54 мкг) и глутаматрацемазой Ь. Ъге\чк. При применении очищенной глутаматрацемазы использовали приблизительно 64 мкг на реакцию объемом 1 мл. Также тестировали клеточные экстракты, содержащие глутаматрацемазу, и использовали 1,4 мг растворимого белка. Снова использовали отрицательный контроль без рацемазы, и все образцы анализировали с дублированием. Результаты являются следующими.

- 115 029538

Таблица 23

Г лутаматрацемаза	Время инкубации	Тотальный монатин (м.д.)	% δ, δ	% К,К	%Κ,δ	% δ,К
Ь. Ьге\'!.ч (очищенная)	2ч	3,3	49,1	34,2	3,7	13,0
Ь. Ьге\'!.ч (очищенная)	2ч	3,6	47,9	35,2	3,5	13,4
/.. Ьге\'1л (очищенная)	в течение ночи	29,3	58,9	24,7	3,2	13,2
/.. Ьге\'1л (очищенная)	в течение ночи	40,2	55,1	25,0	4,7	15,3
/.. Ьге\'1л (клеточный экстракт)	2ч	10,5	45,8	35,9	1,1	17,2
/.. Ьге\'1л (клеточный экстракт)	2ч	10,5	47,4	33,9	1,1	17,6
/.. Ьге\'1л (клеточный экстракт)	в течение ночи	79,4	70,3	17,9	1,3	10,5
Ь. Ьге\'!.ч (клеточный экстракт)	в течение ночи	80,1	69,1	19,1	1,1	10,7
Отсутствует	2ч	2,7	84,1	7,1	6,3	2,4
Отсутствует	2ч	3,2	84,9	6,0	6,8	2,2
Отсутствует	в течение ночи	36,5	92,3	2,3	4,2	1,2
Отсутствует	в течение ночи	30,5	92,7	2,0	4,1	1,3

Снова, очевидно, что добавление рацемазы повышает количество тотального монатина, образованного из I .-триптофана, также повышая относительные количества содержащих 4Р-изомеров монатина по сравнению с 8,8-монатином. Применение очищенной альдолазы, рацемазы и I .-аминотрансферазы значительно повышает возможность контроля образования требуемого стереоизомера.

Соотношение Ь- и Ό-аминотрансферазы также представляет собой способ манипулирования стехиометрией конечного продукта.

При сравнении результатов, представленных в табл. 18 и 19 примера 13, с результатами для условий реакции, сходных с условиями, представленными выше, можно видеть, что из индол-3-пирувата образовывалось приблизительно 7-29 м.д. монатина, и процентные количества образованного Р,Рмонатина составляли приблизительно 51-90%. Применение аспартатрацемазы повышало общее количество образованного монатина до 16-78 м.д. монатина с % Р,Р приблизительно 40-58%. Кроме того, использовали более стабильный и менее дорогостоящий исходный материал, Ь-триптофан. В примере 14 приблизительно 73 м.д. монатина получали из Ό-триптофана с соотношением Р,Р:8,Р приблизительно 1,7:1. Общее количество 4Р-изомеров составляло >80% от общего количества монатина. Вследствие того, что Р,Р-монатин и 8,Р-монатин являются сильными подсластителями (>1000 раз слаще сахарозы), возможность обогащения этими изомерами без необходимости в дорогостоящих субстратах в виде Όаминокислот, является важной.

Как описано в примерах 13 и 14, Ό-аланин может служить в качестве донора амино для переаминирования МР в монатин. Множество Ь-аминотрансфераз обладают способностью использовать пируват в качестве акцептора амино до некоторой степени, и образовывать Ό-аланин. Вследствие того, что в упомянутых выше реакциях используются высокие концентрации пирувата, вероятно, что некоторое количество пирувата превращается в I .-аланин. Например, в процессе переаминирования I .-триптофана было выявлено, что фермент НехАзрС, описанный в примере 16, превращает 10-18% пирувата (исходные концентрации 50-200 мМ) в Ό-аланин в течение 2 ч, если отсутствует альфа-кетоглутарат. Фермент показал 10-кратное предпочтение в отношении α-кетоглутарата при наличии двух акцепторов аминов в высоких (>50 мМ) концентрациях. АзрС (описанная в νθ 03/091396 А2) также образовывала некоторое количество Ь-аланина из пирувата. Таким образом, ожидается, что можно не включать в указанные выше реакции α-кетоглутарат или оксалоацетат и использовать аланинрацемазу (ЕС 5.1.1.1) вместо глутамата или аспартатрацемазы. Ферменты аланинрацемазы сначала были идентифицированы в Вгисе11а аЪоПнз и 81гер1ососсиз ГаесаНз (Магг, А.О. аиЕ V^1зοи, Р^. АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬуз., 49 (1954) 424-433 и VοοЕ, νΆ аиЕ Оииза1из, Ь.С. I. Вю1. СЬет., 190 (1951) 403-416). Ген ЕаЕВ в 8а1тоие11а 1урЫтипит был идентифицирован в качестве источника активности аланинрацемазы, и в геномных базах данных было обнаружено несколько сотен его гомологов. Другие известные источники активности аланинрацемазы пред- 116 029538 ставляют собой Е8сйспс1йа сой, Васй1и8 8иЪйЙ8, Р8сиботопа8 асгидшо8а, У+по сйо1сгас, δсй^ζο8асса^οусс8 ротЪс и Васй1и8 ссгси8. Базидиальные грибы, Ьспйпи8 сбобс8, также содержат аланинрацемазу с широкой активностью. Термостабильный гомолог из Васй1и8 8!саго!йсгторййи8 является доступным для приобретения от δ^дта-Α1б^^сй (каталожный # А8936) (Ыдта-АИпсй δ!. Ьош8, МО) и был иммобилизован для коммерческих способов применения ДпадаИ, К., ВюсЬсш18!гу, 25: 3268 1986). Аланинрацемазу превращают в глутамат- или аспартатрацемазу случайными способами, такими как мутагенная ПЦР, пассирование через мутагенные штаммы или другие способы, известные специалистам в данной области. Более направленное изменение аланинрацемазы сосредоточено на остатках активного центра, включая Ьу8129, Мс!134, и остатки, включающие О1у283 и Тгр288 и находящиеся между ними остатки (нумерация в соответствии с Васй1и8 8!саго1йсйпорЫ1и8).

Пример 19. Ό-фенилглицинаминотрансфераза (Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансфераза).

Как показано на фиг. 3, Ό-фенилглицинаминотрансфераза является пригодной в биосинтетическом каскаде образования монатина. Например, Ό-фенилглицинаминотрансфераза образует К,К-монатин из КМР с Ь-глутаматом в качестве донора амино.

Синтез посредством ПЦР 4-О-гидроксифенилглицинаминотрансферазы Р. 81и1/сп с помощью олигонуклеотидных праймеров.

В этом примере описаны способы, которые использовали для синтеза 4-Όгидроксифенилглицинаминотрансферазы, стереоинвертирующего фермента, который можно использовать для превращения предшественника К-монатина в К,К-монатин с использованием Ь-глутамата в качестве донора амино.

Конструирование праймеров.

Опубликованную последовательность (регистрационный номер ОспЪапк № ΑΥ319935, последовательность нуклеиновой кислоты; регистрационный номер ОспЪапк № ААО8290, белковая последовательность) для 4 Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы Р8сиботопа8 81и1/сп (4 Ό-НРО АТ) использовали в качестве матрицы для конструирования праймеров для ПЦР. Альтернативно, в качестве матрицы последовательности используют 4 Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазу из Р8сиботопа8 рийба, (САО42450 (белок), АХ467211 (нуклеотид)). Конструировали всего 34 прямых праймера и 35 обратных праймеров; прямые и обратные праймеры представляли собой 40-меры, обладающие 20 перекрывающимися парами оснований. Кроме того, 2 наружных праймера конструировали с 5'-участками рестрикции и выступающими концами для клонирования в векторы рЕТ28 и рЕТ30 (Nονадсη, Маб18оп, А1).

Наружные праймеры 4 Ό-НРО АТ Р. 81и1/сп:

Ν-концевой (с участком ^Ο):

5'-ООССООСАТАТОТСОАТССТТААСОАСТАСАААСОТ-3' (δΗΟ ΙΌ ΝΘ: 405) и

С-концевой (с участком Х1о1):

5'-ООААООСТСОАОТСАТОАТТООТТТССАОАСАААТТ-3' (δΗΟ ΙΌ ΝΌ: 406).

Протокол полимеразной цепной реакции.

Последовательность гена из Р. 81и1/сп амплифицировали с использованием следующих протоколов. Первичная реакция ПЦР объемом 100 мкл включала 0,05 мкМ каждого из внутренних 69 праймеров, 0,4 мМ каждого бNΤР, 10 Е полимеразы гТ!й Ро1утсга8с ХЬ (Косйс, Iηб^аηарοЙ8, ΙΝ), 0,625 Е полимеразы РГи (8йа!адспс, Ьа 1о11а, СА), 1Х буфер ХЬ и 1 мМ Мд(ОАс)₂. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, 15 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 42°С в течение 30 с и 68°С в течение 15 с, за которыми следовали 10 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 68°С в течение 30 с, за которыми следовали 10 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин и 15 с. После конечных 10 циклов образец держали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к размытой полосе продукта размером ~0,5 т.п.н. в геле на основе 0,8% ТАЕ-агарозы.

Вторичную реакцию ПЦР проводили с использованием продукта реакции первичной ПЦР в качестве матрицы. Вторичная реакция ПЦР объемом 100 мкл включала 2,5 мкл продукта первичной реакции ПЦР, 0,5 мкМ каждого из 2 наружных праймеров (с участками рестрикции и ХйоЦ 0,4 мМ каждого б№ТР, 10 Е полимеразы гТ!й ройтсга8с ХЬ, 0,625 Е полимеразы РГи, 1Х буфер ХЬ и 1 мМ Мд(ОАс)₂. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, 10 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин 30 с, с последующими 15 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин 30 с. После 15 повторов образец держали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к отчетливой полосе продукта размером ~1,4 т.п.н. в геле на основе 0,8% ТАЕагарозы.

Продукт ПЦР выделяли из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1адсп Оадсп, Уа1спс1а, СА). Продукт клонировали с помощью ТОРО и трансформировали в клетки ТОР 10 в соответствии с протоколом изготовителя Д^йгодсп, СагкЪаб, СА). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием 01адсп (О|адсп, Уа1спс1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством и ХйоЕ Последовательности плазмиды, для

- 117 029538 которых было выявлено наличие правильной вставки, проверяли посредством секвенирования ДНК с дидезокситерминированием цепи с универсальными прямым М13 и обратным М13 праймерами. Среди 10 отсеквенированных клонов, все обладали по меньшей мере одной мутацией по сравнению с исходной последовательностью. Наилучший клон обладал мутацией в одной паре оснований, которая приводила к аминокислотной замене. Последовательность этого клона корректировали с использованием протокола мутагенеза ОшскСйаиде Ми1адеиек1к в соответствии с рекомендациями изготовителя ^!га!адеие, Ьа 1о11а, СА).

Скорректированный клон ТОРО расщепляли рестрикционными ферментами №е1 и Хйо1 в соответствии с рекомендованными изготовителем протоколами (Νρ» Еидктй Вю1аЬк, Веуег1у, МА) и очищали из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА). Векторы рЕТ 28 и рЕТ 30 получали расщеплением рестрикционными ферментами Ше1 и Хйо1 с последующей обработкой щелочной фосфатазой креветки и очисткой из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА).

Расщепленные векторы и вставку лигировали с использованием набора для лигирования №В Ошск Ыдайои Κι! (Веуег1у, МА). Приблизительно 50 нг обработанной вставки, 100 нг обработанного вектора (с молярным соотношением вставки и вектора 3:1), 5 Е ДНК-лигазы Т4 и 1Х буфер для лигирования инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь для лигирования трансформировали в химически компетентные клетки ТОР10Р' (1иу1!годеи, Саг1кЬаН, СА). Клеткам давали возможность восстановиться в 0,25 мл δ0ί'\ находящейся при комнатной температуре, в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Клетки высевали на планшеты с ЬВ, содержащие канамицин (50 мкг/мл). Плазмидную ДНК очищают из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА) и подвергают скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством №е1 и Хйо1.

Экспрессия гена и анализы.

Плазмидную ДНК трансформировали в экспрессирующего хозяина ВЬ21(ОЕ3) Е. сой Щоуадеи, МаЛкои, А1). Культуры выращивали, и плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах О1адеи (О1адеи, Уа1еис1а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава.

Индукцию в ВЬ21(ОЕ3) первоначально проводили посредством 4 Ό-НРО Р. кЦЦ/еп как в векторе рЕТ 28 (маркированном гистидином), так и в векторе рЕТ 30 (без маркера). Исследование с течением времени проводили с помощью культур, выращиваемых в 250 мл ЬВ, содержащей канамицин (50 мг/л) до ΟΌ₆₀₀ 0,5-0,6, индуцированных посредством 100 мМ 1РТО (изопропилтиогалактозид) и подвергнутых забору образцов в момент времени 0 и через 3 ч после индукции. Соответствующий объем клеток в момент времени 0 ч и через 3 ч ресуспендируют в 40 мкл буфера с додецилсульфатом натрия, содержащем 2-меркаптоэтанол, и нагревают при 95°С в течение 10 мин и охлаждают. Аликвоты этих образцов тотального клеточного белка анализируют посредством δΌδ-РАОЕ с использованием геля с градиентом 415%.

Клеточные экстракты также получают после культивирования в течение 3 ч суспендированием клеточного осадка из 5 мл культуры в 0,625 мл реагента №уадеи ВидВик!ег™ Щоуадеи, МаЛкои, А1), содержащего 0,625 мкл нуклеазы бензоназы и 3 мкл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1ЬюсйетШуаЬюсйет Согр., δаη О1едо, СА), при комнатной температуре в течение 20 мин при осторожном встряхивании, и центрифугированием при 16000хд для удаления клеточного дебриса. Супернатанты (клеточные экстракты) наносят в гели с градиентом 4-15% для анализа клеточных растворимых белков. При необходимости белок очищают с использованием кассет Шк-Вшй 900 в соответствии с протоколами изготовителя Щоуадеи, МаФкои, А1) и разбавляют для удаления имидазола с использованием колонок РО-10 (О25 δерйайеx, ОЕ Неа1!йсаге, Р1кса!атау, ΝΤ).

Организмы с Ό-фенилглицинаминотрансферазой (ОРОАТ).

Организмы рода Ркеийотоиак и сходных родов со стереоинвертирующей Όфенилглицинаминотрансферазой (также называемой Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазой) выделяют следующим образом. Образцы почвы инкубируют в чашках Петри со следующей средой: (на 1 л) 15 г агара, 3,4 г КН₂РО₄, 3,55 г №₂НРО₄, 0,2 г ΜдδΟ₄·7Н₂Ο, 8 мг СаС1₂-2Н₂О, 10 мг дрожжевого экстракта, 1 мл 1000х раствора микроэлементов, 1 г Ό-фенилглицина (Ό-4-гидроксифенилглицина).

Изоляты тестируют посредством ПЦР в отношении наличия стереоинвертирующей аминотрансферазы (праймеры сконструированы, исходя из известных Ό-фенилглицинаминотрансфераз) или далее обогащают в отношении стереоинвертирующей аминотрансферазы следующим образом: изоляты из планшетов можно выращивать в жидкой среде, как указано выше, без агара при 30°С при встряхивании до ОО₆₀₀ приблизительно 1,0. Клетки собирают центрифугированием и промывают два раза посредством 0,85% №С1. 10 мг (сырая масса) образца суспендируют в 1 мл фосфатно-калиевого буфера (рН 7,0) и 5 мМ Ό-фенилглицина (или Ό-4-гидроксифенилглицина). Нейтрализованную 15 мМ (аминоокси)уксусную кислоту добавляют в дублированные образцы, как описано выше. Потребление Ό-фенилглицина (или Ό4-гидроксиглицина) определяют посредством ВЭЖХ. Изоляты, способные вызвать деградацию Ό- 118 029538 фенилглицина (или Ό-4-гидроксифенилглицина), но осуществляющие ее с низкой скоростью в присутствии (аминоокси)уксусной кислоты, отбирают для дальнейшего анализа. Изоляты тестируют посредством ПЦР в отношении наличия стереоинвертирующей аминотрансферазы (праймеры сконструированы на основе известных Ό-фенилглицинаминотрансфераз).

Наличие стереоинвертирующей аминотрансферазы подтверждают посредством выращивания культуры в жидкой среде, как описано выше, сбора клеток и получения бесклеточного неочищенного экстракта (СРЕ) и тестирования в отношении ферментной активности Ό-фенилглицинаминотрансферазы (или Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазы). СРЕ добавляют в реакционную смесь со следующими конечными концентрациями: 0,1М САРδ (рН 9,5), 60 мМ Ь-глутамат (соль натрия), 5 мМ бензоилформиат (или 4-гидроксибензоат) и 50 мкМ РЬР. Измерение обратной реакции проводят добавлением СРЕ в реакционную смесь со следующими концентрациями: 50 мМ фосфат калия (рН 7,0), 60 мМ Όфенилглицин (или Ό-4-гидроксифенилглицин), 5 мМ а-кетоглутарат, 50 мкМ РЬР. Анализируемые образцы инкубируют при 35°С и аликвоты отбирают через определенные временные промежутки и останавливают кипячением в течение 2 мин. Продукт будут количественно определять способом ВЭЖХ ОПАу, Е., Т1зЬЬее, А., Наге, Р.Е., Кезо1иЬоп ой ипйепуаЬ/ей апипо аайз Ьу геуегзей рЬазе сНготаЮдгарНу. 1. Ат. СЬет. δοс, 102: 5115-5117 (1980), или способами, описанными в примере 1 (определение образования глутамата).

В качестве альтернативы способам на основе ПЦР стереоинвертирующую Όфенилглицинаминотрансферазу очищают из выделенных бактерий общепринятыми способами очистки белков, включая фракционирование сульфатом аммония и общепринятую колоночную хроматографию. После очистки белка до приемлемой степени используют способы микросеквенирования пептидов или общепринятые секвенирования аминокислот по типу Эдмана (см. доЦЬЬагуагй.ейи/тюгосЬет/ для описаний протоколов и оборудования, используемых для этого типа работы). Вырожденные праймеры конструируют на основе доступной последовательности из наиболее близкого родственника источника белка. Затем для выделения кодирующей последовательности стереоинвертирующей Όфенилглицинаминотрансферазы проводят вырожденную ПЦР и прогулку по геному в соответствии с общепринятыми протоколами.

Образование монатина посредством ЭРСАТ.

Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, как описано в (1) и (2), выше, используют в неочищенных бесклеточных экстрактах или очищают, как описано в (1) выше.

Тирозин(ароматические)аминотрансферазы δ. теШоЬ и К. зрНаегснйез получают, как описано в примере 1 VО 03/091396 А2. Альдолазу РгоА Сотатопаз 1ез1оз1егош получают, как описано в примере 4 VО 03/091396 А2. Общий анализ белка проводят с использованием анализа белка Вю-Кай Рго1еш Аззау в соответствии с протоколами изготовителя (Негси1ез, СА).

Реакционные смеси (объем 1 мл, анализируют с дублированием) содержат 100 мМ фосфатнокалиевый буфер (рН 8), 2 мМ МдС1₂, 0,05 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР), 200 мМ пируват натрия, 5 мМ а-кетоглутарат натрия, приблизительно 280 мкг/мл Та!А δ. теШоЬ, предоставленной в клеточном экстракте, 100 мкл/мл клеточного экстракта с Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазой или 1 мг/мл очищенной Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, и приблизительно 100 мкг/мл альдолазы РгоА, предоставленной в качестве клеточного экстракта. Твердый триптофан добавляют в концентрации 10,2 мг/мл. Отрицательные контроли анализируют без Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы. Образцы инкубируют при 30°С при осторожном встряхивании в течение ~1 ч или в течение ночи. Образцы центрифугируют для удаления осадка, фильтруют через шприц и хранят при -80°С до анализа в отношении монатина с использованием способа ^С/Мδ/Мδ, описанного в примере 1.

Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы с повышенной активностью в отношении образования монатина получают способами мутагенеза, известными специалистам в данной области, включая: мутагенную ПЦР, пассирование через мутагенные штаммы или сайт-направленный мутагенез. Улучшенные Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы отбирают посредством выращивания на минимальной среде с К,К-монатином в качестве источника азота. Исходно селекция основана на росте, однако при отборе улучшенных аминотрансфераз скрининг основан на скорости роста. Таким образом, клетки с мутантными вариантами гена выращивают, и ген экспрессируется в минимальной среде с К,К-монатином в качестве источника азота. Скорости роста клеток с мутантными вариантами гена сравнивают с немутантным вариантом. Клетки с более высокой скоростью роста отбирают и аминотрансферазу анализируют далее. Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазу подвергают мутагенезу доступными способами, такими как ПЦР с пониженной точностью и пассирование через мутагенные штаммы, или способами, для которых было получена лицензия, такими как перетасовка ДНК и другие способы направленных изменений.

Анализ ОРОАТ.

Клетки с рекомбинантной Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазой выращивали, белок экспрессировали и клетки лизировали, как описано в примере 17 или посредством стандартных протоколов. Белок экспрессируют в нативном хозяине с использованием описанных способов ^1уакгиЬа, V., МееуооЬзот, V. А зЮгеотуегПпд О-рНепу1д1усте аттоЮапзГегазе йот Рзеийотопаз зЬН/еп 8Т-201: рипйсайоп,

- 119 029538 сНагаскеп/акюп, апй аррНсаНоп Гог О-рНепу1д1усше 8упкНе818. I ВюкесНпо1., 55: 193-203 (1997)).

В реакционную смесь добавляли бесклеточный экстракт со следующими конечными концентрациями: 100 мМ фосфат калия (рН 7,0-8,5), 60 мМ Ό-фенилглицин (или Ό-4-гидроксифенилглицин), 5 мМ α-кетоглутарат, 50 мкМ РЬР. Анализируемые образцы инкубировали при комнатной температуре, и аликвоты отбирали через определенные временные интервалы и останавливали добавлением равного объема муравьиной кислоты. Продукт (Ь-глутамат) количественно определяют способами, описанными в примере 1.

Пример 20. Выявление гена Ό-метионинаминотрансферазы.

Обоснование.

Полагают, что Ό-метионинпируватаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.41) представляет собой другой пример, хотя и редкий, стереоинвертирующей трансаминазы. Этот фермент катализирует обратимое превращение Ό-метионина и пирувата в Ь-аланин и 4-метилтио-2-оксобутаноат. Оксалоацетат, фенилпируват, 2-оксобутират, 2-оксовалерат, 2-оксогептаноат, глиоксалат и оксоглутарат также могут служить в качестве акцепторов амино.

Полагают, что переаминирование Ό- или Ь-метионина является частью каскада образования этилена в высших растениях (цветная капуста, томат, яблоко, стебель гороха, банан, арахис), а также в микроорганизмах почвы (Е8сНепсЫа соН, Р8еийотопа8 р181, Р8еийотопа8 аегид1по8а, ВасН1и8 тусо1йе8, АсшекоЪаскег са1соасекюи8, Аеготопа8 НуйгорНИа В12Е, Ыи/оЬПип 1пГо1н Ν2Γ7, РешсШНнп ШдИакит, δη^Ικ-ιΐΌтусе8 сегехюкае, СогупеЪаскегшт Ό7Ρ). Э.С ВШшдкоп, В.Т. Οо1й^ηд, апй δ.Ε. Рптго8е ВюсНет I (1979) 182, 827-836. В бактериях Ь-метионин, как правило, используют в качестве субстрата в исследованиях образования этилена и полагают, что ферменты с широкой специфичностью, такие как ТугВ или А8рС из Е. СоН, являются ответственными за переаминирование. Однако δ.В. Рптго8е I Οеη. МюгоВю1. (1976), 95(1), 159-65 и δΒ. Рптго8е I Οеη. МюгоВю1. (1977), 98, 519-528 показали, что штамм δРΑ О Е. соН (ИпгуегеНу оГ Ааг\\аск си1киге соНесНоп) из Ό-метионина образует практически столько же этилена, как и из Ь-метионина в порционных культурах. Поскольку в Е. соН не было идентифицировано Όаминотрансферазы с широкой специфичностью, одним возможным объяснением этого может быть то, что дегидрогеназа Ό-аминокислот Е. соН (кодируемая геном йайА) превращает Ό-метионин в 4метилтио-2-оксобутаноат. Также возможно, что в Е. соН существует метионинрацемаза; однако в литературе такой фермент не описан.

В противоположность Е. соН в цветках цветной капусты (препараты митохондриальных экстрактов) и проросших семенах арахиса образование этилена было выше, когда к экстракту фермента добавляли Όметионин и пируват по сравнению с Ь-метионином и пируватом (Ь.А. Мар8оп, !Р. МагсН, апй О.А. Аагйа1е ВюсНет I (1969) 115, 653-661; II. ОигНат, Р.А. Могдап, !М. Рге8сокк апй СМ. Ьутап РНукосНет181гу (1973) 12, 2123-2126). Таким образом, вероятность сочетания метионинрацемазы и Ь-аминотрансферазы не подтверждается данными. Активность дегидрогеназы исключили посредством диализа клеточных экстрактов цветной капусты, в анализируемых смесях не было НАО. Активность оксидазы исключили, поскольку не было выявлено потребления кислорода и не было потребности в РАО. Όметионинаминотрансферазу из тканей арахиса очистили, показали, что она зависит от РЬР, и показали, что она не зависит от активности Ь-метионинаминотрансферазы. Существует вероятность того, что эти О-метионинпируватаминотрансферазы в действительности образуют О-аланин в качестве побочного продукта (аналогично ферментам ВасШи8, описанным в примерах 13 и 14), и что клетки содержат аланинрацемазу для обратного превращения О-аланина в Ь-аланин (или аналогичный донор амино). В любом случае выявление Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью в высших растениях является преимущественным в отношении усовершенствования процессов, которые приводят к образованию К,Кмонатина или δ,К-монатина.

Обзор эксперимента.

О-метионинаминотрансферазу частично очищают из цветков цветной капусты и зародышей проросшего арахиса с использованием стандартных протоколов хроматографии и системы РНагтааа АКТА Ехр1огег. Белковые последовательности гомологичных белков определяют способами отпечатков пальцев посредством ^С/Μδ/Μδ и поиска в базах данных, проводимых посредством оборудования Нагсагй М1сгосНет18Ну. Кодирующие участки генов растений клонируют из библиотеки кДНК с использованием стандартных протоколов ПЦР или посредством синтеза гена, как описано в примере 19.

Альтернативно конструируют экспрессирующие библиотеки кДНК ^НШадепе, Ьа 1о11а, СА) из ткани цветной капусты или из семян арахиса, выращиваемых в присутствии ϋ-метионина (и продуцирующих этилен). Библиотеки трансформируют в ауксотрофов по метионину Е. соН из Е. соН Οеηеί^с δкоск Сепкег (Уа1е), таких как штаммы КС519 или АВ 1931. Плазмиды штаммов, способных расти на минимальных средах, содержащих ϋ-метионин, содержат представляющий интерес кодирующий участок (см. пример 15, аналогичный способ скрининга).

После получения и экспрессии представляющих интерес кодирующих участков в стандартном лабораторном штамме Е. соН, полученные продукты генов можно использовать в способах анализа образования К,К-монатина, как описано в примере 19, вместо Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, за исключением того, что рН составляет 7,5 (оптимальное значение рН для аминотрансферазы). Если для Ό- 120 029538 метионинаминотрансферазы строго требуются субстраты-доноры Ό-аминокислот, фермент можно использовать для получения К,К-монатина, как описано в примерах 13 и 14. Ген можно подвергать мутагенезу и скринингу в отношении повышенной активности, как описано в примере 19.

Способы.

Выделение из цветной капусты.

Четыреста грамм свежесобранных цветков цветной капусты экстрагируют посредством 400 мл раствора сахарозы/буфера (0,4М сахароза и 0,1М натрий-фосфатный буфер рН 7,4) при 4°С посредством попеременного смачивания и смешивания с использованием устройства для смешивания. Клеточный дебрис удаляют посредством фильтрации через марлю, и полученный раствор центрифугируют при 40000хд в течение 30 мин при 4°С. Твердый материал (содержащий митохондральные органеллы) ресуспендируют в 20 мл 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, и ферменты экстрагируют посредством 200 мл холодного (-30°С) ацетона. Суспензию повторно центрифугируют и осадок сушат с использованием ЗауаШ Зреей Vас. Твердый материал растворяют в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,4, и оставшийся ацетон удаляют с использованием колонки ΓΌ-10 (ОЕ Неаййсаге, ИксаТатау, N1).

Активность аминотрансферазы анализируют посредством инкубации препарата фермента с 5 мМ Ό-метионином, 1 мМ пируватом, 0, 05 мМ РЬР и 2 мМ ЭДТА в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4. Анализы проводят при 25°С в течение 16 ч. Определение 4-метилтио-2-оксобутаноата проводят по образованию производного 2,4-динитрофенилгидразона с использованием ЬС/МЗ (т/ζ 328) и сходной технологии, описанной в примере 1. Приготавливают 0,4% (мас./об.) раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2М серной кислоте и половину объема добавляют в анализируемую смесь после инкубации. Смесь перемешивают при осторожном встряхивании при 30°С в течение 30 мин и осадок собирают центрифугированием и анализируют посредством ЬС/МЗ. Белковые фракции, разделенные стандартными хроматографическими способами, анализируют в отношении активности сходным образом, однако копродукт аланин определяют способом после колоночного образования производного ОРА, описанным в примере 1.

Выделение из арахиса (АгасЫа йуродеа Ь. су. З!агг).

Фермент Ό-метионинаминотрансферазу из проросшего гомогената зародыша арахиса (без семядоли) очищают в соответствии со способом 1.1. Оцгйат, Γ.ν. Могдап, 1.М. Ргексо!! апй СМ. Ьутап Рйу!осйет1к!гу (1973) 12, 2123-2126. В процессе получения неочищенных экстрактов используют восстановители в целях стабилизации ферментов и клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 33000хд. 35-50% фракцию сульфата аммония далее очищают посредством инкубации при низкой температуре и посредством удаления белков в осадке. Супернатант далее фракционируют с использованием ацетона. Активные пулы далее очищают гель-фильтрацией (Зерйайех 200, ОЕ Неаййсаге, Р1кса!атау, N1).

По мере того как белковые фракции обогащаются белком трансаминазой, используют 2О-гельэлектрофорез для выделения представляющего интерес фермента в целях микросеквенирования. После определения гомологичных кодирующих участков в последовательностях растений, депонированных в ИСВ1, рекомбинантными способами получают белок Ό-аминотрансферазу в ЕксйепсЫа сой с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Ожидается, что клеточные экстракты из цветков цветной капусты и семян арахиса или рекомбинантно полученные гомологичные ферменты можно использовать для получения К,К-монатина, как описано в примере 19 (в случае стереоинвертирующей трансаминазы) или в примерах 13 и 14 (в случае Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью).

Пример 21. Ь-аланинаминотрансфераза/аланинрацемаза/О-аланинаминотрансфераза.

На фиг. 4, 6 и 8 представлены биосинтетические каскады образования стереоизомерно обогащенного К,К-монатина из Ь-триптофана с использованием аминотрансферазы Ь-аминокислот (такой как Ьаланинаминотрансфераза и/или Ь-триптофанаминотрансфераза), К-специфичной альдолазы, аланинрацемазы и Ό-аланинаминотрансферазы.

Триптофан-специфичная аминотрансфераза описана в примере 16. Альтернативно тирозин(ароматические)аминотрансферазы З. тей1ой и К. крйаегслйек получают, как описано в примере 1 VО 03/091396 А2. Альдолазу РгоА Сотатопак !ек!ок!егот получают, как описано в примере 4 VО 03/091396 А2. Анализы тотального белка проводят с использованием анализа белков Вю-Кай Рго!ет Аккау в соответствии с протоколами изготовителя (Вю-Кай, Негси1ек, СА). Аланинрацемазу приобретают от З1дтаА1йпсй (З!. Ьошк, МО) (каталожный номер А8936). Ό-аланинаминотрансферазу приобретают от ВюСа!а1уйск (каталожный номер АТ-103) (ВюСа1а1у!юк, Ракайепа, СА).

Ь-аланинаминотрансферазы широко распространены в эукариотах, бактериях и архибактериях. Следующие организмы были идентифицированы (исходя из гомологии последовательностей), как содержащие Ь-аланинаминотрансферазу (Е.С. 2.6.1.2): АгаЫйорык Файапа, АкйЪуа доккурй, Αζο!οЪас!е^ утектйгс ВШйоЪас!егшт 1опдит, СаепогйаЪйШк е1едапк, СапФйа а1Ысапк, СапФйа д1аЪга!а, Сй1атуйотопак гешйагййц Сгур!ососсик пеойогтапк, ОеЪагуотусек йа^е^у Ното кар1епк, Ногйеит уи1даге, К1иууеготусек 1асйк, Мадпароййе дпкеа, Мейюадо 1гипса!и1а, Мик тикси1ик, Иеигокрога сгакка, Огуха ка!та, Рйапегосйае!е сйгукокрогшт, Ртик !аейа, Ркеийотопак риййа, Ругососсик аЬуккк Ругососсик йипокик, Ругососсик йойкокйн, Ка!!ик по1Уедюик, Зассйаготусек сегесайае, Зсй^ζοκассйа^οтусеκ ротЪе, Такйиди гиЪпрек, Тгурапокота спгск νώτώ сйо1егае, νώ™ рагайаето1уйсик, МЪйо ν^ΦΙκ^, Уагготта йро1уйса и

- 121 029538

Ζеа таук. Кроме того, многие аминотрансферазы обладают низким уровнем активности аланинаминотрансферазы и при высоких уровней Ь-глутамата и пирувата могут превращать их в Ь-аланин и акетоглутарат. Фермент с низкой активностью улучшают стандартными способами мутагенеза, такими как ПЦР с пониженной точностью и пассирование через мутагенные штаммы, или способами направленных изменений. Ген Е-аланинаминотрансферазы клонируют с использованием общедоступных способов конструирования праймеров и с применением стандартных способов амплификации, клонирования, экспрессии и очистки гена/фермента.

Реакционные смеси (объемом 1 мл, анализируют с дублированием) содержат 100 мМ фосфатнокалиевый буфер (рН 8), 2 мМ МдС1₂, 0,05 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (РРР), 200 мМ пируват натрия, 5 мМ а-кетоглутарат натрия, приблизительно 280 мкг/мл Та(А 8. шеШой, предоставленной в клеточной экстракте (или другой специфичной в отношении 1,-триптофана аминотрансферазы), 100 мкл/мл клеточного экстракта аланинрацемазы или 1 мг/мл очищенной аланинрацемазы, приблизительно 280 мкг/мл Оаланинаминотрансферазы, предоставленной в клеточном экстракте, и приблизительно 100 мкг/мл альдолазы РгоА, предоставленной в качестве клеточного экстракта. Твердый триптофан добавляют в концентрации 10,2 мг/мл. Отрицательные контроли получают без аланинрацемазы. Образцы инкубируют при 30°С при осторожном встряхивании в течение ~1 ч или в течение ночи. Образцы центрифугируют для удаления осадка, фильтруют с помощью шприца и хранят при -80°С до анализа в отношении монатина с использованием способа ЬС/М8/М8, описанного в примере 1. В этих реакционных смесях, если Ртриптофанаминотрансфераза может использовать а-кетоглутарат, но не пируват, в качестве акцептора амино можно добавлять Ь-аланинаминотрансферазу, которая превращает Ь-глутамат и пируват и в Раланин, и а-кетоглутарат, как показано на фиг. 6.

Пример 22. Субклонирование генов, кодирующих альдолазы 8РС) ΙΌ ΝΟ: 276, 244, 218, 228, 162, 50, 74, 44 и 116.

Гены, кодирующие альдолазы, обладающие аминокислотными последовательностями 8РС) ΙΟ ΝΟ: 276, 244, 218, 228, 162, 50, 74, 44 и 116, субклонировали в экспрессирующий вектор рЕТ28Ъ Бохадеп, Майкоп, \ШР) с Ν-концевыми Нщ-маркерами для обеспечения очистки. 8РС) ГО ΝΟ:275 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ΙΟ ΝΟ:276. 8РС) ГО ΝΟ:243 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:244. 8РС) ГО ΝΟ:217 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:218. 8РС) ГО ΝΟ:227 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:228. 8РС) ГО ΝΟ:161 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:162. 8РС) ГО ΝΟ:49 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:50. 8РС) ГО ΝΟ:73 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:74. 8РС) ГО ΝΟ:43 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:44. 8РС) ГО ΝΟ:115 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 8РС) ГО ΝΟ:116.

Праймеры, используемые для клонирования, представлены в табл. 24.

_Таблица 24

ДНК альдолазы ЗЕЦГО ΝΟ:	5’ праймер	3’ праймер
275	5’- АТААСАСАТАТСССТАТССТТСТТАСОАА С-3’ (БЕЦ ГО N0:339)	5’- АТААСАССАТССТТАТТССТСССССАСС СССТС-3’ (8ЕЦ ГО N0:340)
243	5’- АТААСАСАТАТСААСАСАССТСТССТТСТ	5’- АТААСАССАТССТТАСАССТАСТТСАС

- 122 029538

	С-3’_(8ЕО ГО N0:341)	АСССАС-3’ (8Е0 ГО N0:342)
217	5’- АТААСАСАТАТСАСССТССТСАТСССААА С-3’ (8Е0 ГО N0:343)	5’- АТААСАССАТССТТАСТТСССТТТСТТА ТАССС-3’ (8Е0 ГО N0:344)
227	5’- АТААСАСАТАТСААСААСССССТССТТСТ С-3’ (8Е0 ГО N0:345)	5’- АТААСАССАТССТТАСААСТАСТТСАС АСССАСС-3’ (8Е0 ГО N0:346)
161	5’- АТААСАСАТАТСАСССТССТССТСАСССС -3’ (8Е0 ГО N0:347)	5’- ТСССТС-3’ (8Е0 ГО N0:348)
49	5’- АСААСАСАТАТСАТСАССАТССТССТССА СААС-3’ (8Е0 ГО N0:349)	5’- АСААСАССАТССТСАСАСАТАТТТСАС ССССТТС-3’ (8Е0 ГО N0:350)
73	5’- АСААСАСАТАТСАТСАСССТССТСАТСАС С-3’ (8Е0 ГО N0:351)	5’- АСААСАССАТСССТАТТТСТТСТССССС СТТТС-3’ (8Е0 ГО N0:352)
43	5’- АТААТАСАТАТСАСССТССТССТТСАСАА С-3’ (8Е0 ГО N0:353)	5’- АТААТАССАТССТТАСАСАТАТТТСАСС СССТТС-3’ (8Е0 ГО N0:354)
115	5’- АСААСАСАТАТСАТСТСССТТСТССТТСА СААС-3’ (8Е0 ГО N0:355)	5’- АСААСАССАТССТСАСАТАТАСТТСАС СССС-3’ (8Е0 ГО N0:356)

Гены, кодирующие указанные выше альдолазы, амплифицировали посредством ПЦР и расщепляли соответствующими ферментами (ΝιΠΊ и ВатН1) и очищали из геля (набор для экстракции из геля ΟΙАцшск® Ое1 ехйасйоп КН (Отцеп, Уа1епс1а, СА)). Расщепленные продукты лигировали по отдельности в рЕТ28, расщепленный посредством ΝΟΙ и ВатН1. и очищенный из геля. Продукт лигирования трансформировали в клетки ТОР10 (ПтИ'одеп, Саг1кЬаб, СА). ДНК, выделенную в малых количествах из отдельных колоний, анализировали в отношении наличия вставки посредством анализа размера с использованием агарозного гель-электрофореза. Изоляты со вставкой подвергали анализу последовательности ДНК (Адепсош! Веуег1у, МА).

Очистка альдолаз.

Проверенные клоны альдолазы трансформировали либо в ВБ21(ИЕ3), либо в ВБ21(ИЕ3) рБук8. Индукцию проводили в течение ночи в бульоне Тетйс Вго1й при 30°С. Культуры, выращиваемые в течение ночи с соответствующим антибиотиком, разбавляли в свежей среде (как правило, 1:100) и выращивали до ОИ₆₀₀ ~0,6 с аэрацией при 37°С. Затем культуры индуцировали посредством 1 мМ 1РТО и переключали на 30°С (с аэрацией) и инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием. Клеточный осадок, как правило, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания для облегчения лизиса клеток. Клеточный осадок лизировали в ВидВик1ег и нуклеазе Веп/опаке (Жуадеп, МасПкоп, VI) (в соответствии с протоколом изготовителя). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Неочищенный белковый экстракт наносили на колонку емкостью 10 мг Ш8-Вшб (Жуадеп, МабБ коп, VI), которую подготавливали в соответствии с протоколом изготовителя. Колонку промывали и белок элюировали в соответствии с протоколом изготовителя. Очищенный белок подвергали обессоливанию с помощью колонок РИ-10 (ОЕ Неаййсаге, Р1кса1а^ау, N1) и элюировали в 50 мМ фосфатнокалиевом буфере, рН 7,5, содержащем 4 мМ МдС1₂, 200 мМ №С1. Очищенный белок концентрировали с помощью центробежных концентраторов .Аписон (пороговое значение Πν 5000) (Мййроге, ВШепса, МА). После концентрирования было отмечено, что альдолазы 8Е0 ГО ΝΘ:44, 8Е0 ГО ΝΘ:28 и 8Е0 ГО ΝΘ:276 показали некоторый уровень осаждения, хотя активность, тем не менее, была достаточно высокой. Белки хранили при -80°С до анализа.

Анализ белков проводили с использованием набора Р1егсе ВСА (Р1егсе, Коскйогб, ББ) и протокола титрования в микропланшетах с бычьим сывороточным альбумином (В8А) в качестве белкового стандарта. Систему для электрофореза Ехрепоп Рго260 (Вю-Каб, Негси1ек, СА) или 8И8-РАОЕ использовали для оценки процентного количества альдолазы в очищенном образце и для оценки уровней экспрессии в растворимом клеточном экстракте и в тотальном белке.

Тестирование очищенных альдолаз.

Очищенные альдолазы тестировали в отношении их способности образовывать К,К-монатин из Όтриптофана и сравнивали с альдолазами 8Е0 ГО NΘ:28 и 8Е0 ГО NΘ:54, полученными аналогичным образом. Анализы проводили в микроцентрифужных пробирках (с дублированием) с очищенным белком, с использованием той же концентрации фермента на анализируемый образец (50 мкг/мл), за исключением 8Е0 ГО NΘ:244, для которого использовали 25 мкг/мл. 8Е0 ГО NΘ:243 не экспрессировался хорошо и приводил к небольшим количествам очищенного белка. В качестве Ό-аминотрансферазы использовали 2

- 123 029538 мг/мл АТ-103 ВюСа(а1уйс8 (В1оСа(а1у(1с8, Ра8айеηа. СА). На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: альдолазу, 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ό-триптофан, Ό-аминотрансферазу, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Образцы инкубировали при 30°С. Образцы отбирали через 30 мин, 1 ч, 3 ч и после ночи (19 ч). В табл. 25 показаны усредненные результаты для тотального образованного монатина в каждый момент времени и % образованного К.К-монатина. определенные с помощью обращенно-фазовых площадей пиков. В столбце 3 табл. 25 для некоторых реакций проводили дополнительный анализ образования производных РЬАА. посредством ЬС/МЗ/МЗ, как описано в примере 1, и эти результаты указаны в скобках.

Таблица 25

Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана, и % К,К

Альдолаза (ч)	Тотальный монатин (м.д.)	% К,К-монатина
ЗЕО ГО N0:28 (0,5)	16	99,1
ЗЕО ГО N0:28 (1)	53,2	99,2 (99,0)
ЗЕО ГО N0:28 (3)	207,8	98,6 (98,1)
ЗЕО ГО N0:28 (19)	544,9	95,3 (93,2)
ЗЕО ГО N0:44 (0,5)	46,2	88,0
ЗЕО ГО N0:44 (1)	92,5	86,8
ЗЕО ГО N0:44 (3)	319,7	76,4
ЗЕО ГО N0:44 (19)	762,9	67,1
ЗЕО ГО N0:54 (0,5)	35,3	96,2
ЗЕО ГО N0:54 (1)	82,7	96,1
ЗЕО ГО N0:54 (3)	280,1	92,9
ЗЕО ГО N0:54 (19)	715,3	77,1
ЗЕО ГО N0:74 (0,5)	51,1	92,6
ЗЕО ГО N0:74 (1)	89,3	94,3
ЗЕО ГО N0:74 (3)	269,5	89,9
ЗЕО ГО N0:74(19)	701,9	76,2
ЗЕО ГО N0:50 (0,5)	55,9	96,7
ЗЕО ГО N0:50 (1)	96,5	96,2
ЗЕО ГО N0:50 (3)	272,2	95,6
ЗЕО ГО N0:50 (19)	645,8	88,5
ЗЕО ГО N0:162 (0,5)	37,3	95,7
ЗЕО ГО N0:162 (1)	75,0	97,1
ЗЕО ГО N0:162 (3)	261,0	95,9
ЗЕО ГО N0:162 (19)	633,1	87,0
ЗЕО ГО N0:276 (0,5)	37,8	98,8
ЗЕО ГО N0:276 (1)	71,2	99,3 (99,5)
ЗЕО ГО N0:276 (3)	245,2	99,0 (99,0)
ЗЕО ГО N0:276 (19)	585,4	96,7 (96,1)
ЗЕО ГО N0:244 (0,5)	30,2	97,7
ЗЕО ГО N0:244 (1)	46,4	98,3 (99,2)
ЗЕО ГО N0:244 (3)	165	98,4 (98,7)
ЗЕО ГО N0:244 (19)	572,5	95,6 (93,7)
СТ7ГЛ ТТЛ ХТГЛ ООО ί(\	<0	о< η
оыу и_/ ±ч\_/.2-2-0
ЗЕО ГО N0:228 (1)	81,7	96,5
ЗЕО ГО N0:228 (3)	251	95,9
ЗЕО ГО N0:228 (19)	723	87,1
без альдолазы (0,5)	0
без альдолазы (1)	0
без альдолазы (3)	0,6	58,3
без альдолазы (19)	6,5	61,5

Альдолаза ЗЕР ГО N0:276 сохраняла высокий уровень активности, а также наиболее высокую стереоспецифичность в отношении образования К,К-монатина. Оказалось, что хранение этого фермента в буфере без включения хлорида натрия снижает уровень осаждения, выявленный ранее. Оказалось, что

- 124 029538 концентрация магния в буфере для хранения не влияет на уровень осаждения.

Все альдолазы 8Е0 II) Ν0:276, 8Е0 ΙΏ Ν0:28 и 8Е0 ΙΏ Ν0:244 демонстрировали высокую активность и высокую стереоселективность в отношении образования К,К-монатина. Эти три фермента получали, как описано в примере 23, и анализировали в анаэробных условиях, как описано в примере 24, с использованием 10-мл флаконов для сыворотки. Анализ в объеме 7 мл проводили с использованием 0,05 мг/мл каждой альдолазы (очищенной) и 2 мг/мл очищенной Ώ-аминотрансферазы В. крЬаепсик, полученной, как описано в примере 24. Активность каждой альдолазы в отношении образования монатина из Ώтриптофана сравнивали с альдолазой НМО 8. теШоЕ, полученной, как описано в примере 27. Тотальный монатин оценивали с использованием способа БС-ОРА, описанного в примере 1. Процентное количество образованного К,К-монатина определяли с использованием способа образования производных посредством ЕОАА., описанного в примере 1. Результаты представлены ниже в табл. 26.

_ Таблица 26

Альдолаза	Время (ч)	Монатин (г/л)	% образованного К.,К.
X. теШоН	23	3,9	82,0
8ЕО ГО ΝΟ: 28	23	4,0	84,6
8Е0 ГО ΝΟ: 276	23	4,0	95,7
8Е0 ГО ΝΟ: 244	23	3,7	88,8
X. теШоН	47	4,5	76,2
8Е0 ГО ΝΟ: 28	47	4,3	84,6
8Е0 ГО ΝΟ: 276	47	4,3	93,2
8Е0 ГО ΝΟ: 244	47	4,5	85,2

Эти результаты показывают, что альдолаза 8Е0 ΙΏ Ν0:276 также приводит к высоким уровням К,К-монатина в анаэробных реакциях большего объема.

Пример 23. Экспрессия и очистка альдолазы 8Е0 ΙΏ Ν0:276.

Клонирование хозяина Е. соН ВЕ21(ОЕ3)рЕук8, обладающего геном альдолазы, приведенным в качестве 8Е0 ΙΏ Ν0:275, на плазмиде рЕТ28Ь, описано выше в примере 22.

Альдолазу 8Н(4 ΙΏ Ν0:276 с Ν-концевым маркером для очистки Ш8₆ получали с использованием НМО Вюкшепсек ОтеппдЫ Ехргекк 8ук!ет ΙΙ ^оуадеп, Майкоп, ΥΊ) (растворы 1-6), содержащей 50 мкг/мл канамицина, во встряхиваемых колбах. Эта экспрессирующая система индуцирует экспрессию индуцируемых посредством ГРТО систем без необходимости в мониторинге роста клеток. После инокуляции 200-мл аликвот среды (в 1-л флаконах) либо из жидких культур, либо из планшетов конструкцией альдолазы, культуры инкубировали при 30°С в течение ночи при встряхивании 225 об/мин. Когда ОО_600НМ достигала минимум 6, клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.

Для получения бесклеточного экстракта, содержащего альдолазу, клетки суспендировали в 3-4 об. 100 мМ фосфата калия, рН 7,8, а затем разрушали с использованием гомогенизатора М1стоГ1шй1ск (М1стоГ1шй1ск, Х'е\\1оп, МА) (3 прохождения при 18000 фунт/кв.дюйм (1235-10⁵ Па)), при поддержании температуры суспензии менее 15°С. Альтернативно бесклеточный экстракт получали с использованием реагента для экстракции Н\11) Вюксчепсек ВидВик1ет® (не содержащего первичные амины) ЕхЕ'асВоп Кеадеп! ^оуадеп, Майкоп, ΥΊ), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Веп/опаке® ^с1еаке, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго!еаке ННнЬпог Соск1а11 8е! ΙΙ и 0,033 мкл/мл гНуко/уте'™ в соответствии с инструкциями изготовителя.

Все последующие стадии очистки проводили при 4°С. Суспензию клеток центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000-20000хд для удаления клеточного дебриса. Аликвоту бесклеточного экстракта объемом 20-25 мл наносили на 45-мл колонку ОЕ НеаПЬсате СЬе1аЕпд 8ерЬагоке™ Еак! Е1о\ тект (форма никеля (ΙΙ)) (ОЕ НеаПЬсате, Р1кса1а\ау, ΝΙ), которую перед этим уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Для получения формы смолы с никелем, смолу промывали 150 мл 200 мМ гексагидратом сульфата никеля (ΙΙ), а затем 150 мл дистиллированной воды. После загрузки образца колонку промывали/элюировали посредством 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол, и 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белок с маркером Ш8₆ элюировался при последнем промывании. Смыв, полученный посредством 500 мМ имидазола, концентрировали посредством центробежных фильтров МШ1роге/Ат1соп СепЕтсоп Р1ик-70 (М^СО 10 кДа) (МПИроге, ВШепса, МА) до 15-20 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки ОЕ НеаПЬсате РО10 (ОЕ НеаИЬсате, Р1кса1а\ау, ΝΙ) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8. Очищенную альдолазу элюировали посредством 3,5 мл на колонку того же буфера.

Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1етсе ВСА (Р1етсе, КоскГогй, ГБ), применяя В8А в качестве белкового стандарта. Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии в бесклеточном экстракте определяли с использованием микрокапиллярной системы

- 125 029538 чипов Вю-Каб Ехрепоп (Вю-Каб, Негси1ек, СА) или с использованием гелей Вю-Каб с 4-15% градиентом δΌδ-полиакриламид, разделяемых в камере Мий РКОΤΕАN® 3 (Вю-Каб, Негси1ек, СА). Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием окраски Кумасси Вю-Каб Вю^аГе С-250 (ВюКаб, Негси1ек, СА), и окраску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~50 мг фермента из 400 мл ночной культуры, который является на 85-95% чистым, при определении с помощью программного обеспечения Ехрепоп. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения. Получение фермента таким образом снижало уровень осаждения фермента, выявленный ранее. Наличие магния в буфере для хранения не оказывало эффекта на уровень осаждения.

Пример 24. Образование К,К-монатина с использованием альдолазы δ6Ρ ΙΌ NО:276: оптимизация условий реакции.

Ό-аланинаминотрансферазу ВасШик крЬаепсик (штамм АТСС 10208), клонированную по примеру 7, очищали в виде маркированного НК₆ белка, как описано ниже, с использованием системы для экспрессии ЕМО Вюкаепсек О\'епйд1п Ехргекк δукΐет ΙΙ (Ноуадеп, МабЕоп, νΙ) для роста и индукции. Экспрессирующая система ЕМО Вюкаепсек Оνе^η^дЬΐ Ехргекк δукΐет ΙΙ (растворы 1-6) (Nονадеη, Мабщоп, νΙ) содержала 50 мкг/мл канамицина во встряхиваемых колбах. Эта экспрессирующая система индуцирует экспрессию индуцируемых посредством ГРТС систем без необходимости в мониторинге роста клеток. После инокуляции 200-мл аликвот среды (в 1-л флаконах) либо из жидких культур, либо из планшетов конструкцией аминотрансферазы, культуры инкубировали при 30°С в течение ночи при встряхивании 225 об/мин. Когда ОО_600НМ достигала минимум 6, клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.

Для получения бесклеточного экстракта, содержащего Ό-аланинаминотрансферазу, клетки суспендировали в 3-4 об. 100 мМ фосфата калия, рН 7,8, содержащего 50 мкМ пиридоксальфосфат (РЬР), а затем разрушали с использованием гомогенизатора МюгоЯшбюк (МюгоЯшбюк, №Щоп, МА) (3 прохождения при 18000 фунт/кв.дюйм (1235· 10⁵ Па)), при поддержании температуры суспензии менее 15°С. Альтернативно бесклеточный экстракт получали с использованием реагента для экстракции ЕМО Вюкаепсек ВидВик1ег® (не содержащего первичные амины) ЕхЯасбоп РеадеШ (Nονадеη, Мабщоп, νΙ), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Веп/опаке® Мис1еаке, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго1еаке ЕййЫ1ог СосЙаЛ δеΐ ΙΙ и 0,033 мкл/мл гБуко/уте'™ в соответствии с инструкциями изготовителя. Все последующие стадии очистки проводили при 4°С. Клеточный экстракт центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000хд для удаления клеточного дебриса. Аликвоту бесклеточного экстракта объемом 20-25 мл наносили на 45-мл колонку СЕ Неаббсаге СНебЮпд δерЬа^οке™ Рак1 Р1ом гекш (форма никеля (ΙΙ)) (СЕ НеабЬсаге, Р^ксаΐаνау, ΝΙ), которую перед этим уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Для получения формы смолы с никелем смолу промывали 150 мл 200 мМ гексагидратом сульфата никеля (ΙΙ), а затем 150 мл дистиллированной воды. После загрузки образца колонку промывали/элюировали посредством 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол, и 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белок с маркером ШБ₆ элюировался при последнем промывании. Смыв, полученный посредством 500 мМ имидазола, концентрировали посредством центробежных фильтров МПНроге/Атюоп СеШпсоп Р1ик-70 ^ν^ 10 кДа) (Мбброге, ВШепса, МА) до 15-20 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки СЕ НеабЬсаге 6Ό10 (СЕ НеабЬсаге, Р^ксаΐаνау, Ν1) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8, содержащим 0,5 мкМ РЬР. Очищенную альдолазу элюировали 3,5 мл того же буфера на колонку.

Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе ВСА (Р1егсе, КоскГогб, ΙΌ), применяя ВδА в качестве белкового стандарта. Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии в бесклеточном экстракте определяли с использованием микрокапиллярной системы чипов Вю-Каб Ехрепоп (Вю-Каб, Негси1ек, СА) или с использованием гелей Вю-Каб с 4-15% градиентом δΌδ-полиакриламид, разделяемых в камере М1П1 РКОТЕАЫ® 3 (Вю-Каб, Негси1ек, СА). Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием окраски Кумасси Вю-Каб Вю^аГе С-250 (ВюКаб, Негси1ек, СА), и окраску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~50 мг фермента из 200 мл ночной культуры, который является на 85-95% чистым, при определении с помощью программного обеспечения Ехрепоп или из анализов гелей δΌδ-РАСЕ. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения.

Альдолазу δ6Ρ ΙΌ ΝΌ:276 (клонированную по примеру 22) очищали в качестве маркированного НК₆ белка, как описано в примере 23.

Предпочтительный кофактор металла для альдолазы δ6Ρ ΙΌ ΝΌ:276 определяли посредством скрининга различных двухвалентных металлов. Реакции проводили в анаэробных 10-мл флаконах для сыворотки с конечными объемами 7 мл. Основной объем раствора, состоящий из 100 мМ фосфата калия (рН 7,8), 200 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ РЬР и 0,01% (об./об.) Тмееп 80, изготавливали с конечным объемом 48,8 мл и барботировали азотом в течение 30 мин. Ό-триптофан (143 мг; конечная концентрация 100 мМ) распределяли на семь 10-мл флаконов для сыворотки. В каждый из флаконов добавляли 0, 014 мл

- 126 029538

2М исходного раствора двухвалентного катиона металла. полученного из хлоридной соли (конечная концентрация 4 мМ). В случае отрицательного контроля добавляли 0.014 мл йН₂О. Флаконы для сыворотки закрывали резиновой мембраной и барботировали азотом через иглы калибра 16-18. В анаэробных условиях 5.625 мл основного анаэробного раствора добавляли в каждый анаэробный флакон для сыворотки. После этого Ό-аланннаминотрансферазу В. зрНаепсиз и альдолазу 8НС) ГО NО:276 добавляли в анаэробных условиях до достижения в каждом флаконе для сыворотки конечной концентрации 2 мг/мл и 0.05 мг/мл соответственно. Растворы инкубировали при комнатной температуре при осторожном встряхивании в течение 18 ч. Конечный монатин анализировали в соответствии со способами. описанными в примере 1. с использованием способа детекции аминокислот жидкостной хроматографией-после колоночной флуоресценции (табл. 27).

Таблица 27

Условия реакции для альдолазы 8НО ГО NО:276 далее исследовали посредством двухуровневого дробного факторного эксперимента. разработанного с использованием статистического программного обеспечения Оезхди Ехрег! 7.0.0 (8!а!-Еазе. 1ис.; МтиеароНз. МЩ. Схема скрининга состояла из одного блока из пяти факторов на двух уровнях с четырьмя центральными точками (всего 20 анализов). Пять факторов. подлежащих оптимизации. представляли собой концентрацию металла-кофактора. рН реакции. концентрацию Т^ееи® 80. соотношение пирувата и триптофана и концентрацию альдолазы (табл. 28).

Из конических пробирок из полипропилена (14 мл). содержащих 143 мг Ό-триптофана. удаляли кислород в анаэробном перчаточном боксе (Соу ЬаЬога!огу Ргойис!з. I ис; Огазз Ьаке. М1) в течение ночи. Исходные растворы 2М МдС1₂; 1М фосфата калия при рН 7.0. 7.75 и 8.5; 10% (об./об.) Т^ееи® 80; 2М пируват натрия и 10 мМ РЬР (пиридоксаль-5'-фосфат) получали в дегазированной воде и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы очищенной Όаланинаминотрансферазы В. зрНаепсиз и альдолазы 8НС) ГО NО:276 размораживали на льду и сразу использовали в анаэробном перчаточном боксе. Исходные растворы добавляли в 14-мл конические пробирки. содержащие Ό-триптофан. для достижения концентрации. определенной посредством статистического расчета (табл. 28). В каждую пробирку добавляли дегазированную воду для доведения конечного объема. совместно с добавлением фермента. до 7.0 мл. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в анаэробном перчаточном боксе при осторожном перемешивании в течение вплоть до 24 ч. Концентрацию монатина и изомерную чистоту анализировали в соответствии со способами. описанными в примере 1. с использованием способа детекции аминокислот жидкостной хроматографией-после колоночной флуоресценции и множественного мониторинга реакции посредством ЬС/М8/М8 для определения распределения стереоизомеров монатина в способе реакций т νΐ!ΐΌ и т νίνΌ (способ образования производных посредством РЭАА).

- 127 029538

Таблица 28

Эксперимент №	Лс1№	Блок	Мд (мМ)	рН	Тэуееп® (%)	РугТгр	Альдолаза 8ЕО Ш N0:276 (мг/мл)
20	1	Блок 1	5,00	7,75	0,01	2,00	0,05
8	2	Блок 1	9,00	8,50	0,02	1,00	0,01
3	3	Блок 1	1,00	8,50	0,00	1,00	0,01
16	4	Блок 1	9,00	8,50	0,02	3,00	0,09
7	5	Блок 1	1,00	8,50	0,02	1,00	0,09
12 6 2 15 4 5 1 13 14	6 7 8 9 10 11 12 13 14	Блок 1 Блок 1 Блок 1 Блок 1 Блок 1 Блок 1 Блок 1 Блок 1 Блок 1	9,00 9,00 9,00 1,00 9,00 1,00 1,00 1,00 9,00	8,50 7,00 7,00 8,50 8,50 7,00 7,00 7,00 7,00	0,00 0,02 0,00 0,02 0,00 0,02 0,00 0,02 0,02	3,00 1,00 1,00 3,00 1,00 1,00 1,00 3,00 3,00	0,01 0,09 0,01 0,01 0,09 0,01 0,09 0,09 0,01
17	15	Блок 1	5,00	7,75	0,01	2,00	0,05
11	16	Блок 1	1,00	8,50	0,00	3,00	0,09
18	17	Блок 1	5,00	7,75	0,01	2,00	0,05
9	18	Блок 1	1,00	7,00	0,00	3,00	0,01
19	19	Блок 1	5,00	7,75	0,01	2,00	0,05
10	20	Блок 1	9,00	7,00	0,00	3,00	0,09

Статистический анализ данных показал, что рН реакции, соотношение пирувата и триптофана и концентрация альдолазы представляли собой существенные факторы, влияющие на титр монатина, изомерную чистоту и выход углерода. Строили график целесообразности с использованием программного обеспечения Селдп ВхреП, в котором факторы варьировали в целях максимизации целей, представляющих собой наиболее высокий титр монатина и наиболее высокую изомерную чистоту в условиях избытка пирувата. Условия реакции, указанные в качестве оптимума, представляли собой 1 мМ МдС1₂, рН>8,0, 0,01% (об./об.) Т^ееп® 80 и 0,01 мг/мл альдолазу 8НС) ГО N0:276. Это представляет собой снижение в 5 раз обычного количества используемой альдолазы, а также снижение в 4 раза количества двухвалентного металла, используемого обычно.

Дополнительные эксперименты проводили для определения оптимального диапазона значений рН для протекания реакции. Исходные растворы 1М буфера ЕРР8 изготавливали с возрастанием на 0,2 единицы рН между рН 7,0 и 9,0. Эти растворы подвергали дегазированию и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Из пробирок из полипропилена (14 мл), содержащих 143 мг Отриптофана. удаляли кислород в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы 2М М§С1₂, 10% (об./об.) Т^ееп® 80, 2М пирувата натрия и 10 мМ РЬР изготавливали в дегазированной воде и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе. Препараты очищенной Ό-аланинаминотрансферазы В. крЬаепсик и альдолазы 8НС) 10 N0:276 размораживали на льду и сразу использовали в анаэробном перчаточном боксе. Исходные растворы добавляли в 14-мл конические пробирки до конечной концентрации 100 мМ ЕРР8, 200 мМ пирувата, 100 мМ триптофана, 1 мМ М§С1₂, 0,01% (об./об.) Т^ееп® 80, 0,05 мМ РЬР, 2 мг/мл Ό-аланинаминотрансферазы В. крЬаепсик и 0,01 мг/мл альдолазы 8НС) 10 N0:276 в общем объеме 7 мл на пробирку. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в анаэробном перчаточном боксе при осторожном встряхивании в течение 22 ч. Образцы удаляли и анализировали в отношении монатина, как описано в примере 1, с использованием способа множественного мониторинга реакций посредством БС/М8/М8 (табл. 29).

- 128 029538

Таблица 29

Результаты указывают на то, что образование монатина повышается при повышении рН между 7,08,0. Образование монатина достигало максимума в диапазоне рН 8,0-8,2 и снижалось при рН выше 8,4. Кроме того, изомерная чистота монатина снижалась при рН выше 8,4.

Последующую реакцию оптимизации проводили с использованием альдолазы 8ЕР ГО НО:276 (0,01 мг/мл), 2 мг/мл Т243\ 4978 1>/\Т (без маркера, по примеру 26), 1 мМ МдС1₂, 200 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ Р1.Р, 0,01% Т\ееп-80 и 100 мМ Ό-триптофана при рН 8,5. Клетки, используемые для получения альдолазы и Ό-аминотрансферазы, разрушали в 50 мМ ЕРР8, рН 8,4 с использованием гомогенизатора МюгойшШск (МюгойшШск, \е\\1оп, МΑ) (3 прохождения при 20000 фунт/кв.дюйм (1373-10⁵ Па)). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (20000хд в течение 30 мин) и очищенные клеточные экстракты использовали в ферментативных реакциях. Дополнительно буфер не использовали, однако перед добавлением фермента реакционные смеси доводили до рН 8,5 с использованием гидроксида натрия и продували азотом. Реакции объемом двести 50 мл проводили во встряхиваемых ферментерах 81хГог объемом 0,7 л (ШГогк ΑΘ, Войтшдеп, 8\\'Шег1апЛ) при 30°С с использованием азота в свободном пространстве. Фосфат калия добавляли до конечной концентрации 0, 5, 10, 20 и 50 мМ. Было выявлено, что добавление 5-10 мМ фосфата было оптимальным, обеспечивая 3,5 г/л монатина (количественно определенного посредством ЙС/М8/М8, как описано в примере 1).

Пример 25. Клонирование новой аминотрансферазы Ό-аминокислот ВасШик.

Аминотрансферазу Ό-аминокислот ВасШик (РААТ или РΑΤ) (ЕС 2.6.1.21, также известную как Ό-аланинаминотрансфераза или Ό-аспартатаминотрансфераза) получали рекомбинантными способами. Эту аминотрансферазу использовали в сопряженных анализах образования К,К-монатина с альдолазами. Этот фермент аминотрансфераза является гомологичным Ό-аминотрансферазам, описанным ранее для получения монатина (опубликованная заявка США № 20040063175 и опубликованная заявка США № 20050282260). Организм АТСС 4978 - ВасШик крйаейсик, первоначально депонированный в качестве ВасШик го!апк - получали из АТСС и использовали для получения геномной ДНК. Вырожденные праймеры конструировали в областях консервативной белковой последовательности известных Ό-аминотрансфераз ВасШик и использовали для амплификации полимеразной цепной реакцией (ПНР) внутренней последовательности гена РААТ из штамма АТСС, упомянутого выше. Прогулку по геному проводили с использованием набора ВР Оепоте Ма1кег'™ иш\'егка1 КН (С1оп1есН, МоиШаш У1е\, СΑ). Анализ последовательности (/\депсо11г1 Вю8с1епсе СогрогаПоп, Всл'еИу, МΑ) подтверждал полноразмерую кодирующую последовательность для гена РААТ из АТСС 4978. Последовательность ДНК гена РААТ из АТСС 4978 представляет собой 8ЕС) ГР \О:357 и представлена ниже. Ген 8Г.С) ГО ΝΌ:357 можно амплифицировать стандартными протоколами ПЦР и клонировать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Ген 8ЕР ГО ΝΌ:357 также можно реконструировать любым способом, известным специалисту в данной области, таким как способы ПЦР со сборкой, известные специалисту в данной области.

Последовательность ДНК АТСС 4978 ΙλΑΑΊ' представляет собой

- 129 029538

абдадббаба дсббабддаа бдассааабб	дбдаабдабд	аадаадбадб
адббдабаад	даддассдбд	дсбабсаабб	бддсдабддб	дбббабдаад
ббдбаааадб	абабаасддб	дааббаббба	садсддадда	дсабдбсдаб
сдбббббасд	сдадбдсбда	аааааббсдс	дббасдабсс	сббабасааа
адасаааббд	сабсааббаб	бдсабсадбб	адббдааабд	аабааадббс
ааасаддаса	бабббабббс	саааббасдс	дбддбдсадд	сссбсдбааб
сабаббббсс	сбддбдабда	адбдаадсса	дбаббаасад	дбаабассаа
ддаааабсса	сдбсссдбад	сааасбббда	ааааддбдбд	ааадсаасаб
ббдбадаада	саббсдббдд	ббасдсбдбд	асаббааабс	аббаааббба
сббддбдсдд	басббдсбаа	асаадаадса	сабдааааад	дабдсбабда
адсддбббба	сабсдбдабд	ааабсдбаас	адааддсбсб	бсббсаааба
бббабддааб	бааадабддс	дбаббабаса	сасабссадс	даабаасббс
абсббааабд	дбаббасасд	бсаадбаабс	аббааабдбд	сбдсбдаааб
бддсббасса	дбдааддаад	аадсаабдас	ааааасбсад	сббсббдсаа
бддабдаадб	даббдбббса	бсаасдасбб	садаадбаас	дссааббабс
дасабадабд	даасадбааб	бддбдсдддб	ааассдддбд	асбддасасд

баааббасаа дсасаабббд абасдааааб сссааааддб аббсдсдсаб аа (8Е0 ΙΌ N0:357) .

Аминокислотная последовательность гена ΌΑΑΤ из АТСС 4978, кодируемая представленной выше последовательностью ДНК, представляет собой δΙΤ) ΙΌ ΝΟ:358 и представлена ниже

Меб Зег Туг Зег Ьеи Тгр Азп Азр С1п Не Уа1 Азп Азр С1и

С1и

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Ьуз

С1и

Азр

Агд

01 у

Туг

С1п

РЬе

С1у

Азр

01 у

Уа1

Туг

О1и

Уа1

Уа1

Ьуз

Уа1

Туг

Азп

01 у

01и

Ьеи

РЬе

ТЬг

А1а

01и

С1и

Ыз

Уа1

Азр

Агд

РЬе

Туг

А1а

Зег

А1а

С1и

Ьуз

Не

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Рго

Туг

ТЬг

Ьуз

Азр

Ьуз

Ьеи

Ыз

С1п

Ьеи

Ьеи

Ыз

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Меб

Азп

Ьуз

Уа1

С1п

ТЬг

С1у

Ыз

Не

Туг

РЬе

С1п

Не

ТЬг

Агд

С1у

А1а

С1у

Рго

Агд

Азп

Ыз

Не

РЬе

Рго

01 у

Азр

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

Уа1

Ьеи

ТЬг

01 у

Азп

ТЬг

Ьуз

С1и

Азп

Рго

Агд

Рго

Уа1

А1а

Азп

РЬе

С1и

Ьуз

01 у

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

РЬе

Уа1

С1и

Азр

Не

Агд

Тгр

Ьеи

Агд

Суз

Азр

Не

Ьуз

Зег

Ьеи

Азп

Ьеи

Ьеи

С1у

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Ьуз

С1п

С1и

А1а

Ыз

С1и

Ьуз

01у

Суз

Туг

С1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ыз

Агд

Азр

С1и

Не

Уа1

ТЬг

01и

01 у

Зег

Зег

Зег

Азп

Не

Туг

С1у

Не

Ьуз

Азр

С1у

Уа1

Ьеи

Туг

ТЬг

Ыз

Рго

А1а

Азп

Азп

РЬе

Не

Ьеи

Азп

С1у

Не

ТЬг

Агд

С1 η

Уа1

Не

Не

Ьуз

Суз

А1а

А1а

С1и

Не

01 у

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

С1и

О1и

А1а

Меб

ТЬг

Ьуз

ТЬг

01п

Ьеи

Ьеи

А1а

Меб

Азр

С1и

Уа1

Не

Уа1

Зег

Зег

ТЬг

ТЬг

Зег

С1и

Уа1

ТЬг

Рго

Не

Не

Азр

Не

Азр

С1у

ТЬг

Уа1

Не

01у

А1а

01у

Ьуз

Рго

01 у

Азр

Тгр

ТЬг

Агд

Ьуз

Ьеи

С1п

А1а

С1п

РЬе

Азр

ТЬг

Ьуз

Не

Рго

Ьуз

01 у

Не

Агд

А1а

(ЗЕО Ю N0:

358)

Новая Ό-аминотрансфераза, полученная из штамма АТСС 4978, обладает белковой последовательностью, которая обладает отличающимися заменами аминокислотных остатков по сравнению с опубликованной последовательностью Ό-аминотрансферазы В. 8рйаепси8 АТСС 10208. ΌΑΑΤ из АТСС 4978 обладает только 72% идентичностью с ΌΑΑΤ из В. 8рйаепси8 (АТСС 10208). Несмотря на то, что этот штамм в настоящее время представлен в качестве В. 8рйаепси8 в АТСС, он был депонирован в качестве В. го1ап8. Исходя из выравнивания последовательностей и выявленных отличий между этой новой ΌΑΑΤ и ΌΑΑΤ из В. 8рйаепси8, идентифицировано множество остатков-кандидатов, которые можно оценивать с точки зрения их роли (отдельно или в сочетании) в повышении активности ΌΑΑΤ в отношении биосинтеза Κ,Κ-монатина, в этих, а также в других последовательностях ΌΑΑΤ.

Пример 26. Характеризация мутантных форм Ό-аминотрансферазы из АТСС 4978.

Обзор эксперимента.

Новый ген Ό-аминотрансферазы (описанный в примере 25) из штамма ВасШи8 АТСС 4978 подвер- 130 029538 гали мутагенезу с использованием сайт-направленных способов. Мутантные гены экспрессировали и анализировали на представляющую интерес активность в отношении каскадов образования монатина, особенно при сопряжении с одной или несколькими альдолазами.

В дополнение к идеям, представленным в примере 16 для мишеней сайт-направленного мутагенеза, другие идеи были разработаны посредством фактического помещения Κ-МЙ в активный центр кристаллической структуры ΥМ-1, для определения возможности наличия в белке аминотрансферазы 4978 сходных структурных свойств в этом участке использовали выравнивание первичных аминокислотных последовательностей. Ожидалось, что следующие дополнительные мутации могут быть преимущественными (с использованием нумерации аминокислот аминотрансферазы 4978). Полагали, что мутагенез аланина 153 на аргинин может стабилизировать вторую карбоксильную группу субстрата (Κ-МЙ). Эта замена может увеличить пространственное препятствие, таким образом, в целях компенсации остатки серина в положениях 181 и 182 заменяли на аланин или глицин. Также было предположено, что можно вносить аргинин в положение 180, 181 или 182 и превращать один или несколько других остатков серина в аланин или глицин для создания кармана для более объемной боковой цепи аргинина. Фенилаланин в 200 аминокислоте пространственно близко расположен с областью предсказанной фиксации Κ-МЙ в активном центре, и существует значительная вариабельность этого остатка среди Ό-аминотрансфераз, которые довольно хорошо катализируют переаминирование монатина. Полагали, что модификации аминокислот в этом положении могут быть целесообразными. Было предсказано, что мутация лейцина 151 на фенилаланин улучшает взаимодействие с индольным кольцом субстрата.

Исходя из литературы было предположено, что мутация треонина 243 на аспарагин может повысить селективность в отношении Κ-МЙ для реакций переаминирования. Аналогично полагали, что мутагенез аспарагина 100 на аланин может повысить специфичную активность фермента в реакциях переаминирования монатина (Κο, е( а1., ΡΕΒδ йе(( 398:141-145, (1996); δнд^ο, δ., е( а1., Β^οсйет^δ!^у 54:96619669, (1995); ΕΡ1580268).

Ьее е( а1. охарактеризовали мутантные формы области 141-144 (петля) и выявили, что Όаминотрансферазы с ΕΥсΥ в большей степени, чем ЬЯсН (которая является нативной для этого белка) обладают тенденцией к наличию более низких К_т в отношении субстратов в виде дикарбоновых кислот. (Ьее δ.Ο., Нοид δ.Ρ., δοид 1.1., К1т δ.Ρ, Кγак М.8., δиид М.Н. Ρнис!^οиа1 аий δΡυ^ι^ сНагас(еп/а(1оп οί Ό-атто ашй αιηιηο(π.ιηδΓαπ.ΐδαδ 1гот ОеоЬасШ^ δρρ. Αρρ1 Εηνίτοη ^^οΒ^Ι 2006 РеЬ; 72 (2):1588-94). Вследствие того, что МР представляет собой субстрат в виде дикарбоновых кислот, сходный с α-кетоглутаратом, и концентрации МР являются довольно низкими в обычной реакционной смеси для получения монатина, сниженная К_т может потенциально способствовать активности мутантной ΌΑΤ в отношении образования монатина.

Ниже описаны способы создания мутантных форм Ό-аминотрансферазы 4978, а также результаты анализа с использованием этих мутантных форм.

Мутагенез.

Праймеры для мутагенеза конструировали в соответствии с рекомендациями, приведенными в наборе 8(га1адепе Мн1!^-Сйаиде кй ^йаадеие, Ьа 1о11а, СА). Праймеры были 5'-фосфорилированными. Мутагенез проводили с использованием набора δΡα^αηα Мн1Ρ-СΡаиде кй (8(га1:адепе, Ьа 1о11а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Матрицы, используемые для мутагенеза, представляли собой конструкции ΌΑΤ 4978 либо рЕТ30 (без маркера), либо рЕТ28 (маркированная), описанные в примере 25. Праймеры приведены ниже в табл. 30.

_Таблица 30

Название мутантной формы	Аминокислотная замена	Праймер
4978-22	Τ243Ν	СТСАТТСТТТСАТСААССААТТСАСААСТААСССС (5ЕС) ГО N0:359)
10	Т243К	СТСАТТСТТТСАТСААССССТТСАСААСТААСССС (5Е() ГО N0:360)
7	Т2435	СТСАТТСТТТСАТСААССАСТТСАСААСТААСССС (5Е() ГО N0:361)
19	Т243А	СТСАТТСТТТСАТСААССССТТСАСААСТААСССС (5Е() ГО N0:362)
15	Ν100Α	СТССАСССССТССТССТСАТАТТТТСССТСС (5Е() ГО N0:363)
В	Т243ф	СААСТСАТТСТТТСАТСААСССАСТСАСААСТААССССААТТАТС (5Е() ГО N0:364)
2	Τ243Ν/Ν100	указанные выше праймеры, используемые совместно

Клетки Е. сой ХЫ0-Оо1Р ^йаддеие, Ьа 1о11а, СА) трансформировали и полученные очищенные плазмидные препараты секвенировали для подтверждения правильного внесения мутаций.

Экспрессия и анализ.

Препараты плазмидной ДНК, содержащие правильные мутантные формы или ΌΑΤ 4978 дикого типа, трансформировали в экспрессирующего хозяина ΒΡ21(ΌΕ3) Ε. сой (Nονадеи, Ма^ои, \Ι). Культуры выращивали с использованием протоколов, описанных выше, плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах 01адеи (01адеи, Уа1епс1а, СА) и анализировали посредством

- 131 029538 рестрикционного расщепления для подтверждения наличия вставки.

Индукцию гена ЭААТ, как правило, проводили в среде ЬВ, содержащей канамицин (50 мкг/л). Клетки выращивали до ОО_600НМ 0,4-0,8 при 37°С, индуцировали посредством 0, 1 мМ ГРТС (изопропилтиогалактозид) и проводили забор образцов через 3-4 ч после индукции.

Клеточные экстракты получали с помощью реагента ВидВик!ег и нуклеазы Βеηζοηаке (Νονадеη, МаП^кοη, \Ι). Анализы объемом 1 мл проводили при 30°С при осторожном встряхивании, и он содержал 10,2 мг Э-триптофана, 0,05 мМ РЬР, 4 мМ МдС1₂, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5, приблизительно 50 мкг альдолазы, 200 мМ пируват и 0,150-0,5 мг/мл Ο-аминотрансферазы, предоставленной в качестве клеточных экстрактов. Анализы тотального белка проводили с использованием набора для тотального белка Вю-РаП (Кумасси) (Вю-РаП, Негси1ек, СА) или набора Р1егсе ВСА (Рюгсе, ΡοскI'ο^П, ΙΡ), и процентную экспрессию О-аминотрансферазы оценивали посредством 8О8-РАОЕ или автоматизированной системы для электрофореза Вю-РаП Εxρе^^οη АиЮта!еП Е^^тор^те^ 8ук!ет (Вю-РаП, Негси1ек, СА). Забор образцов проводили через 3 ч и после ночи.

Р-специфичную альдолазу 8ЕР ГО ХО:28 использовали в анализах приблизительно с 0,150 мг/мл Оаминотрансферазы.

Первые анализы показали, что следующие мутантные формы (без маркера) обладали активностью в отношении переаминирования (в порядке от наибольшей к наименьшей): Т243Х, Т2438, Т243Х/Х100А, Х100А. Также было отмечено, что, как оказалось, Т243Х повышает стереомерную чистоту образованного Р,Р-монатина. Анализы повторяли с использованием очищенной альдолазы РгоА Сοтатοηак (екЮк!егош (100 мкг/мл) и 0,50 мг/мл мутантных форм О-аминотрансферазы (без маркеров, предоставленных в качестве клеточных экстрактов). Забор образцов проводили через 2 ч и после ночи. Результаты для активных белков представлены ниже, дублированные результаты усредняли. % Р,Р-монатина определяли с помощью площади пика на обращенно-фазовой ВЭЖХ, а затем измеряли с использованием способа образования производных РОАА, описанного в примере 1. В столбце 3 табл. 31, для некоторых реакций проводили дополнительный анализ образования производных посредством РОАА посредством ЬС/М8/М8, как описано в примере 1, и эти результаты показаны в скобках. Только Р,Р и 8,Р-монатин образуются из О-триптофана. Оказалось, что мутантная форма Т243Р не образует монатин в тестируемых условиях, и мутантная форма Т243 А образовывала очень низкие уровни монатина.

_ Таблица 31

Фермент без маркера (время - ч или после ночи)	Тотальный монатин (м.д.)	%Р,Р
4978 дикого типа (2 ч)	4,7	41,6
4978 дикого типа (после ночи)	43,2	35,1 (30,9)
Т2438 (2 ч)	55,0	37,4 (21,7)
Т2438 (после ночи)	97,7	35,5 (29,8)
Τ243Ν (2 ч)	73,2	86,7 (88,3)
Τ243Ν после ночи	120,9	86,3 (86,1)
Ν100Α (2 ч)	12,0	40,8
N100А (после ночи)	22,3	41
Т243А (2 ч)	0,8	-100
Т243А (после ночи)	1,3	-100

Несмотря на то, что анализы проводили, оценивая процентное количество ϋ-аминотрансферазы с использованием программного обеспечения Вю-РаП Ехрегющ понятно, что мутантные формы Т2438 и Т243Х обладали повышенной активностью по сравнению с ферментом дикого типа. Мутантная форма Т243Х также обеспечила дополнительное преимущество значительного повышения % образованного Р,Р-монатина. Этот фермент оказывает повышенное предпочтение для Р-МР по сравнению с 8-МР в реакциях переаминирования. Мутантная форма Х100А не повышала активность отдельно или в сочетании с Т243Х в противоположность тому, что предполагалось в литературе. Мутантную форму ОАТ 4978 без маркера с сайт-направленной мутацией V34Α также создавали с использованием сходных способов, как описано выше. Было выявлено, что в тестируемых условиях мутантная форма с сайт-направленной мутацией V34Α обладает значительно меньшей активностью, чем фермент дикого типа.

Другой интересной особенностью первоначальных анализов было то, что фермент дикого типа, как оказалось, обладал большей активностью, когда его получали с Х-концевым Нщ-маркером. Последующий мутагенез проводили для варианта гена с маркером. Кроме того, наиболее перспективные мутантные формы из представленных выше субклонировали в рЕТ28Ь, который обладал Х-концевым Нюмаркером. Их очищали с использованием колонок связывающих ΗΙ8 Νονадеη и протокола изготовителя с рекомендованными буферами (Νονадеη, Ма^^щ \Ι). Буфер фракции элюента заменяли с использованием колонок СЕ Неа1!Ьсаге РО10 (СЕ Неа1!Ьсаге, Р1кса!аиау, Ю) на буфер, используемый в анализах.

- 132 029538

Анализы объемом один мл с очищенной Ό-аминотрансферазой (0,5 мг/мл) и очищенной Кспецифичной альдолазой ЗЕР ГО КО:276 (50 мкг/мл) проводили при 30°С при осторожном встряхивании, и он содержал 10,2 мг Ό-триптофана, 0,05 мМ РБР, 200 мМ пирувата, 4 мМ МдС1₂ и 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5. Дублированные образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи. В качестве положительного контроля использовали БАТ ВасШик крйаепсик (клонированную по примеру 7) в тех же анализах. Результаты представлены в табл. 32.

_ Таблица 32

Фермент без маркера (время: ч или после ночи)	Тотальный монатин (м.д.)	%Е,К
4978 дикого типа (2 ч)	43	98,4
4978 дикого типа (после ночи)	96,7	98,3 (95,9)
Τ243Ν (2 ч)	197,5	100
Τ243Ν после ночи	301,2	99,9 (99,6)
В. яркаепсия ΌΑΤ (2 ч)	58,2	99,7
В. яркаепсия ΌΑΤ (после ночи)	221,7	98,7 (96,6)
Т243О (2 ч)	7,1	100
Т243С) (после ночи)	12,4	98,8

Представленные выше данные показывают, что мутантная форма Т243К, очевидно, образует наибольшее количество монатина через 2 ч. С течением времени соотношение для мутантной формы Т243К и положительного контроля БАТ В. крйаепсик снижается. Этот результат подтверждает, что мутантная форма Т243К не настолько стабильна в процессе реакции образования монатина, как ОАТ В. крйаепсик. При анализе в сходных условиях фермент Т243З (очищенный, с маркером) обладал сходными уровнями активности с мутантной формой Т243К; однако процентное количество образованного К,К-монатина было ниже (97,2% как через 2 ч, так и после ночи). Мутантная форма Т243К/К100А обладала меньшей активностью, чем мутантная форма Т243К. Однако как Т243З, так и Т243К/К100А обладали более высокой активностью, чем БАТ 4978 дикого типа.

Анализы переаминирования проводили для определения того, скорости каких реакций улучшались при использовании мутантной формы Т243К вместо БАТ В. крйаепсик. Анализы объемом половина мл проводили при 30°С 1 ч, 2 ч и 5 ч. Анализируемые образцы содержали 25 мМ монатин или Ό-триптофан, 25 мМ пируват, 100 мМ фосфат калия рН 7,5, 50 мкМ РБР и 0,1 мг Ό-аминотрансферазы (с маркером, очищенной). В случае, когда использовали менее 100 мкг БАТ, количество аланина нормализовали к 100 мкг Ό-аминотрансферазы. Образцы обрабатывали муравьиной кислотой и анализировали посредством БС-ОРА в отношении наличия копродукта, аланина. Результаты представлены в табл. 33 и 34.

Таблица 33

Активность в отношении переаминирования с К,К-монатином в качестве субстрата

Фермент	Ό-аланин (мМ)
ΌΑΤ 4978 дикого типа(2 ч)	0,54
ΌΑΤ4978 дикого типа (5 ч)	1,11
Τ243Ν/Ν100Α (2 ч)	1,32
Τ243Ν/Ν100Α (5 ч)	2,78
Т2438 (2 ч)	1,5
Т2438 (5 ч)	2,61
Τ243Ν (2 ч)	1,26
Τ243Ν (5 ч)	2,65
В. яркаепсия ΌΑΤ (2 ч)	0,97
В. яркаепсия ΌΑΤ (5 ч)	2,2

- 133 029538

Таблица 34

Активность в отношении переаминирования с 1)-триптофаном в качестве субстрата

Фермент	О-аланин (мМ)
ЭАТ 4978 дикого типа (1ч)	4,55
ϋΑΤ 4978 дикого типа (2 ч)	8,47
Τ243Ν/Ν100Α (1 ч)	8,52
Τ243Ν/Ν100Α (2 ч)	12,67
Т2438(1ч)	4,89
Т2438(2ч)	8,1
Τ243Ν (1 ч)	7,19
Τ243Ν (2 ч)	10,83
В. яркаепсиз ΌΑΤ (1ч)	8,7
В. лркаепсих ΌΑΤ (2 ч)	12,54

Для реакций с [/-триптофаном результаты показывают. что некоторые из ферментов достигали равновесия через 2 ч. Реакции с К.К-монатином. очевидно. являются скорость-лимитирующими. и повышение этой активности окажет наибольшее влияние на скорости образования из Ώ-триптофана.

Дальнейшие анализы проводили для исследования стабильности мутантной формы ОАТ 4978 Ε243Ν. Фермент дикого типа также теряет активность с течением времени. В примере 27 описаны способы повышения стабильности мутантной формы О-аминотрансферазы 'Γ243Ν. При получении свежих немаркированных и маркированных вариантов мутантной формы Τ243N и сравнении их в отношении активности. было выявлено. что немаркированный вариант обладает лучшей временной стабильностью. что приводит к тому. что в целом он является лучшим вариантом фермента для применения в реакциях образования монатина.

Дополнительные мутантные формы ОАТ 4978 получали способами. широко известными специалистам в данной области. Однако все эти мутации приводили к белку. который был нерастворим в условиях. в которых его получали. и таким образом его нельзя было анализировать в отношении активности. Мутации. которые приводили к нерастворимому белку. представляли собой

5180А/5181А/5182Н;

Ь151Е;

У34С;

5181Н;

А153Н/5181А/5182А;

А153Н/5182А;

А153Н/5182С;

518ОН/5181А/5182С;

518ОН/5181А/5182А;

518ОН/5181С/5182С;

5180С/5181Н/5182С; и 5180А/5181Н/5182А.

Дополнительный мутагенез.

Для получения мутантной формы ОАТ 4978 Е200М амплифицировали открытую рамку считывания ОАТ 4978 дикого типа по примеру 25 (с маркером) с помощью праймеров 73 и 80 (ниже) и ДНКполимеразы РГиТигЬо ΟΝΑ Ро1утегазе (8!га!адеие. Ьа ,1о11а. СА) и клонировали в рСК11-В1ии! (1^йгодеи. Саг1зЬай. СА). Ее последовательность проверяли (Адеисоиг!. Веνе^1у. МА). 5'- и 3'-участки амплифицировали с использованием праймеров 80 и 96 и 99 и 103 соответственно. Затем амплифицированную ДНК очищали из геля с использованием набора для экстракции из геля ('Тауеи СИЛсцнсТ Ое1 Ех!гас!юи Κι! (Οίадеи. Уа1еища. СА). Амплифицированную ДНК вновь подвергали ПЦР с использованием праймеров 80 и 99. Амплифицированную ДНК выделяли из геля. как описано выше. и клонировали в рСКИ В1ии!. и его последовательность проверяли. Открытую рамку считывания ОАТ субклонировали в качестве фрагмента рестрикционного расщепления М1е1/ХНо1 в рЕТ28Ь.

- 134 029538

Таблица 35

Номер праймера	Последовательность
73	САТАТОАСТТАТАССТТАТССААТСАССАААТТСТСААТС (5Еф ГО N0:365)
80	СТССАСТССССССССААССТТСТССАСССАССТС (5Еф ГО N0:366)
96	ААТАТТТАТССААТТАААСАТССССТАТТАТАСАСАСАТССАСССААТААСАТСАТСТТАААТ ССТАТТАСАССТСААСТААТСАТТАААТСТСС (5Еф ГО N0:367)
99	ССССАСТСААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССС (5Еф ГО N0:368)
103	ССССАТСТТТААТТССАТАААТАТТТСААСААСАСССТТСТС (5Еф ГО N0:369)

Следующие праймеры конструировали для дополнительного сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОшкСИапде¹'’’ МиШ δϊ^-ΌίΐΌ^ά Ми!адеиек1к Κι! ^!га!адеие, Ьа 1о11а, СА). Мутагенез проводили с использованием набора δίο-Φ^ικ' МиШ-Сйаиде кВ ^!га!адеие, Ьа 1о11а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Матрица, используемая для мутагенеза, представляла собой конструкцию ЭАТ 4978 рЕТ28 (с маркером), описанную в примере 25. Также получали двойную мутантную форму с использованием мутантной формы Ρ200Υ в качестве матрицы и проведением дополнительного цикла мутагенеза с праймером Т243N (приведенным выше).

_ Таблица 36

Мутантная форма	Олигонуклеотид
141-ЬКсО-144 ->ЕУсУ	ОСААСАТТТОТАОААОАСАТТСОТТОООААТАСТОТТАСАТТАААТСАТТА ААТТТАСТТООТОСО (δΕΟ ГО N0:370)
Ρ200Υ	ОТАТТАТАСАСАСАТССАОСОААТААСТАСАТСТТАААТООТАТТАСАСОТ СААС (δΕΟ ГО N0:371)
8244К	ОСААТООАТОААОТОАТТОТТТСАТСААСОАСТАААОААОТААСОССААТ ТАТСОАСАТАОАТО (δΕζ) ГО N0:372)
243-Т8-244 — ΝΚ	ОСААТООАТОААОТОАТТОТТТСАТСААСОААТАААОААОТААСОССААТ ТАТСОАСАТАОАТО (δΕ() ГО N0:373)
243-Т8-244 —Ж	ОСААТООАТОААОТОАТТОТТТСАТСААСОААТСОТОААОТААСОССААТ ТАТСОАСАТАОАТО (δΕ() ГО N0:374)

Кодирующие мутантную форму участки проверяли посредством секвенирования ДНК (Адеисоиг!). Плазмиды с проверенной последовательностью трансформировали в клетки ВЬ21(ПЕ3) (Жуадеи, МаШкои, А1).

Экспрессия и анализ.

Культуры, содержащие 100 мл ЬВ с 50 мкг/мл канамицина, в 500-мл флаконе с перегородками инокулировали посредством 1 мл ночной культуры и выращивали при 37°С до оптической плотности (при 600 нм) приблизительно 0,6. Продукцию белка индуцировали посредством 1РТО в конечной концентрации 1 мМ. Клетки инкубировали при 30°С в течение 4,5 ч после добавления 1РТО. Клетки центрифугировали и замораживали при -80°С. Клетки разрушали (с использованием реагента Жуадеи ВидВик!ег (Х’осадеп, МаШкои, А1), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз II и 0,033 мкл/мл гкуко/уте в соответствии с рекомендованным Х’осадеп протоколом) и анализировали посредством δΌδ-РАОЕ. Мутантные формы (141-ЬКсО-144 ΕΥсΥ) и (243-'Γδ-244 Ж) приводили к нерастворимым белкам в условиях, в которых их получали. Мутантная форма 243-'Γδ-244 -> ΝΚ не обладала поддающейся количественному определению активностью в тестируемых условиях и, вероятно, представляет собой фермент со слабой активностью по сравнению с диким типом, также как и мутантная форма δ244Κ.

Белки с НП-маркером очищали следующим образом. Колонки для связывания I ΙΙδ (Х’осадеп, МаШкои, А1) уравновешивали посредством 10 мл 100 мМ фосфата калия, рН 7,8, содержащего 200 мМ №С1 и 50 мкМ РЬР. Бесклеточные экстракты помещали в колонку. Колонки промывали 10 мл буфера для уравновешивания, 10 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, и 10 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол. Белки элюировали 5 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белки подвергали обессоливанию с использованием колонок РО10, которые уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8, содержащим 50 мкМ РЬР. Очищенные белки концентрировали и количественно определяли с использованием анализа Брэдфорд (Вю-КаН, Негси1ек, СА).

Мутантные формы Ό-аминотрансферазы анализировали с использованием для анализируемых условий 500 мкг/мл Ό-аминотрансферазы, 50 мкг/мл альдолазы δΞρ ΙΌ NΟ:276, 4 мМ МдС1₂, 50 мМ фосфата калия рН 8, 200 мМ пирувата натрия, 0, 05 мМ Р1.Р и 20,4 мг/мл Ό-триптофана. Конечный объем составлял 1,25 мл. Образцы (200 мкл) отбирали через 0,5, 1, 2 и 14 ч и замораживали до завершения эксперимента. Образцы фильтровали, разбавляли от 1 до 10 раз и анализировали посредством ^ΜδΜδ, как описано в примере 1.

Ό-аминотрансферазу 4978 дикого типа из примера 25 использовали в качестве эталона для процентной относительной активности. В табл. 37 представлена относительная активность каждой мутантной формы в каждый момент времени.

- 135 029538

Таблица 37

ϋ-аминотрансфераза	Время (ч)	% активность
4978 дикого типа	0,5	100
Τ243Ν	0,5	270
Р200М	0,5	50
Ρ200Υ	0,5	70
Ρ200Μ/Τ243Ν	0,5	183
8244К	0,5	4
4978 дикого типа	1	100
Τ243Ν	1	289
Р200М	1	55
Ρ200Υ	1	81
Ρ200Μ/Τ243Ν	1	203
8244К	1	6
4978 дикого типа	2	100
Τ243Ν	2	266
Р200М	2	51
Ρ200Υ	2	79
Ρ200Μ/Τ243Ν	2	185
8244К	2	6
4978 дикого типа	14	100
Τ243Ν	14	254
Р200М	14	56
Ρ200Υ	14	80
Ρ200Μ/Τ243Ν	14	168
8244К	14	8

Τ243N была наилучшей среди всех тестируемых мутантных форм с точки зрения активности в отношении образования К,К-монатина.

Пример 27. Стабилизация мутантной формы Τ243N Ό-аминотрансферазы из штамма АТСС 4978.

Как представлено в примере 25, первоначальная активность мутантной формы ЭАТ Τ243N значительно превышает ЭАТ В. 8рйаспси8, однако эта активность снижается более быстро. Дополнительные эксперименты с использованием анаэробного протокола, описанного ниже, показали, что первоначальная активность мутантной формы ЭАТ Τ243N вплоть до 8 раз превышала активность ЭАТ В. 8рйаспси8, однако эта активность быстро снижалась в анаэробных условиях. Следующие исследования проводили для достижения большей активности в отношении монатина в течение длительного периода времени.

Мутантную форму Ό-аминотрансферазы Τ243N из штамма 4978 (описанного в примере 25) и альдолазу НМО δ. шсШой очищали в качестве белков с НК-₆маркером, как описано ниже. Альдолазу δΞΡ ΙΌ NΘ:276 очищали, как описано в примере 23.

Очистка РАТ из АТСС 4978 (мутантная форма Τ243N).

Мутантную форму Τ243N Ό-аминотрансферазы из штамма АТСС 4978 с Ν-концевым маркером для очистки НК₆ (описанную в примере 26) получали с использованием системы для экспрессии ΞΜΌ Вю8с1спсс8 Оусгпщй! Ехргс88 δу8ΐсш ΙΙ (растворы 1-6) (Nονадсη, Маб18оп, \\Ί), содержащей 50 мкг/мл канамицина, во встряхиваемых колбах. Эта экспрессирующая система индуцирует экспрессию индуцируемых посредством ГРТО систем без необходимости в мониторинге роста клеток. После инокуляции 200мл аликвот среды (в 1-л флаконах) либо из жидких культур, либо из планшетов с хозяином ВЙ2'1(ОЕ3) Е. сой, обладающим геном мутантной формы Ό-аминотрансферазы Τ243N из штамма АТСС 4978 в плазмиде рЕТ28Ъ, культуры инкубировали при 30°С в течение ночи при встряхивании 225 об./мин. Когда ОР_600нм достигала минимум 6, клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.

Бесклеточный экстракт получали с использованием реагента для экстракции ΞΜΌ Вю8шепсс8 ВидВи81сг® (не содержащего первичные амины) Ех1гасйоп Ксадсп! (Nονадсη, Маб18оп, Ι), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Вспхопа8с® Nис1са8с, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго1са8с ГпйЛког СоскТай δΟ: ΙΙ (СаШюсйст - NονаЬ^οсйсш Согр., δаη Оюдо, СА) и 0,033 мкл/мл гЕу8охутс™ в соответствии с протоколом изготовителя. Все последующие стадии очистки проводили при 4°С. Клеточный экстракт центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000хд для удаления клеточного дебриса. Аликвоту бесклеточного экстракта объемом 20-25 мл наносили на 45-мл колонку ОЕ Нсаййсагс Сйс1айпд δсрйа^ο8с™ Ра8! Р1о^ гс81п (форма никеля (ΙΙ)) (ОЕ Нсаййсагс, Р18са1а^ау, ΝΙ), которую перед этим уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Для получения формы смолы с никелем смолу

- 136 029538 промывали 150 мл 200 мМ гексагидратом сульфата никеля(11), а затем 150 мл дистиллированной воды. После загрузки образца колонку промывали/элюировали посредством 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол, и 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белок с маркером Н18₆ элюировался при последнем промывании. Смыв, полученный посредством 500 мМ имидазола, концентрировали посредством центробежных фильтров М1Шроге/Аш1сои Сеикгсои Р1из-70 ^ν^ 10 кДа) (Мккроге, Вк1епса, МА) до 15-20 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки ОЕ Неакксаге РЭ10 (ОЕ Неакксаге, Р1зса1а№ау, ΝΤ) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8, содержащим 0,5 мкМ РЬР. Очищенную аминотрансферазу элюировали посредством 3,5 мл на колонку того же буфера. Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе ВСА (Р1егсе, РоскГогЕ, 1Ь) с ВЗА в качестве белкового стандарта.

Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии в бесклеточном экстракте определяли с использованием микрокапиллярной системы чипов Вю-РаЕ Ехрепои (Вю-РаЕ, Негси1ез, СА) или с использованием гелей Вю-РаЕ с 4-15% градиентом ЗОЗ-полиакриламид, разделяемых в камере Мш1 ΡРΟТЕАN® 3 (ВюРаЕ, Негси1ез, СА). Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием окраски Кумасси Вю-РаЕ Вю-ЗаГе О-250 (Вю-РаЕ, Негси1ез, СА), и окраску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~20 мг фермента из 200 мл ночной культуры, который является на 85-95% чистым, при определении с помощью программного обеспечения Ехрепои или посредством анализа гелей ЗЭЗ-РАОЕ. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения.

Очистку альдолазы ЗЕО ΙΌ ΝΟ:276 проводили, как описано в примере 23.

Очистка альдолазы НМО З. теШок.

Альдолазу НМО З. теШок с Ν-концевым маркером для очистки Н1З₆ (клонирование описано в опубликованной заявке США № 20040063175 и νΟ 03091396 А2) получали индукцией культур, выращенных в бульоне Луриа-Бертани, содержащем 50 мг/л канамицина с 0,2 мМ 1РТО. После инокуляции 800-мл аликвот среды либо из жидких культур, либо из планшетов с хозяином ВЬ21(ПЕ3) Е. сок, обладающим геном альдолазы НМО З. теШок в рЕТ30 (Ха/Ь1С), культуры инкубировали при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Когда оптическая плотность достигала ОЭ_600НМ 0,5-0,75, добавляли 1РТО и культуры инкубировали при 30°С при встряхивании 225 об/мин в течение 4 ч. Клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.

Для получения бесклеточного экстракта, содержащего альдолазу З. теШок, клетки суспендировали в 3-4 об. 50 мМ ЕРРЗ Щ-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(3-пропансульфоновой кислоты), рН 8,2, содержащей 100 мМ №С1, а затем разрушали с использованием гомогенизатора МюгойшЕюз (МюгойшЕюз, Nе\γЮη. МА) (3 прохождения при 18000 фунт/кв.дюйм (1235-10⁵ Па)), при поддержании температуры суспензии менее 15°С. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000-20000хд для удаления клеточного дебриса. Белок с Н1З₆-маркером очищали с использованием колонок ЕМЭ Вюзаеисез Н1З-ВтЕ® Щоуадеи, МаЕ1зои, VI) в соответствии с рекомендованным изготовителем протоколом с одним исключением, колонки промывали раствором буфера для связывания:буфер для промывания 1:1 вместо буфера для промывания отдельно. Элюированную фракцию концентрировали с помощью 15-мл центробежных фильтров МИкроте/Аткои (^νΟΟ 5 кДа) (Мккроге, ВШепса, МА) до 7-10 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки ОЕ Неакксаге РЭ10 (ОЕ Неакксаге, Р1зса1а№ау, ΝΤ) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 50 мМ ЕРРЗ, рН 8,2, содержащим 100 мМ №С1. Очищенную альдолазу элюировали тем же буфером в количестве 3,5 мл на колонку. Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе ВСА (Р1егсе, РоскГогЕ, ГО) с использованием ВЗА в качестве белкового стандарта.

Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии во фракции бесклеточного экстракта определяли с использованием ЗОЗ-полиакриламидных гелей Вю-РаЕ с градиентом 4-15% (Вю-РаЕ, Негси1ез, СА), разделяемых в устройстве с емкостью Мш1 ΡРΟТЕАN® 3. Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием краски Кумасси Вю-РаЕ Вю-ЗаГе О-250 (Вю-РаЕ, Негси1ез, СА), и краску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~15-20 мг фермента из 800 мл культуры, и он является на 85-95% чистым. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения.

Анализы образования монатина.

Из конических пробирок из полипропилена (14 мл), содержащих 143 мг Ό-триптофана, удаляли кислород в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы 1М буфера ЕРРЗ (рН 8,2), 2М МдС1₂; 2М пирувата натрия и 10 мМ РЬР получали в дегазированной воде и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы 10% (об./об.) Ттееи 80, 1% (об./об.) Ттееи 20, 1% (об./об.) Тгйои Х-100, 100% ацетона, 100% этанола и 50% (мас./об.) глицерина уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе совместно с 0,7 г каждого из трегалозы, инозитола, сорбита и эритрита в 2-мл микроцентрифужных пробирках. Препараты очищенных ферментов размораживали на льду и сразу использовали в анаэробном перчаточном боксе. Исходные растворы добавляли в 14-мл ко- 137 029538 нические пробирки для достижения конечной концентрации 100 мМ ЕРРЗ, 200 мМ пирувата, 100 мМ триптофана, 1 мМ МдС1₂, 0,05 мМ РЬР, 0,5 мг/мл Ό-аминотрансферазы и 0,01 мг/мл альдолазы 31 + ΙΌ NО:276 или альдолазы НМС 0,05 мг/мл 3. те1^1οί^. Предполагаемые стабилизирующие фермент компоненты добавляли при различных конечных концентрациях (табл. 38 и 39) для доведения конечного объема реакции до 7 мл на пробирку. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в анаэробном перчаточном боксе при осторожном перемешивании в течение вплоть до 24 ч. Периодически проводили забор образцов и анализировали их в отношении монатина, как описано в примере 1, с использованием способа множественного мониторинга реакции посредством ЬС/МЗ/МЗ. Исходные скорости вычисляли в образцах, отобранных в 0 момент времени и через 3 ч после добавления фермента.

_ Таблица 38

Добавка	Кратность повышения первоначальной скорости образования монатина	Кратность повышения конечного титра монатина (20 ч)
Отсутствует	1,0	1,0
0,01% (об./об.) Т\\ссп 80	1,3	1,4
0,1% (об./об.) Т\\ссп 80	1,3	1,5
0,01% (об./об.) Т\\ссп20	1,1	1,5
0,01% (об./об.) Ττίίοη Х-100	1,1	1,2
5% (об./об.) Ацетон	0,4	0,3
5% (об./об.) Этанол	0,7	0,5
1% (масс./об.) Глицерин	1,9	1,1
5% (масс./об.) Глицерин	1,4	1,4
10% (масс./об.) Глицерин	1,1	1,7
10% (масс./об.) Трегалоза	1,0	1,3
10% (масс./об.) Инозитол	1,3	1,5
10% (масс./об.) Сорбит	1,1	1,3
10% (масс./об.) Эритрит	0,8	1,0

Таблица 39

Альдолаза 8^О1ВПО:27^

Добавка	Кратность повышения первоначальной скорости образования монатина	Кратность повышения конечного титра монатина (22 ч)
0,01% (об./об.) Т\\ссп 80	1,0	1,0
1% (масс./об.) Глицерин	1,2	0,9
5% (масс./об.) Глицерин	1,5	1,5
10% (масс./об.) Глицерин	1,7	2,1

Добавление детергента 0,01-0,1% (об./об.), такого как ТпЩп Х-100, ТАуееп 20 или Ттееп 80, или 110% (мас./об.) полиола, такого как глицерин, трегалоза, инозитол или сорбит, повышало стабильность Όаминотрансферазы Τ243N на протяжении эксперимента.

Пример 28.

А. Клонирование рацемазы аминокислот Ркеиаοтοηак риЬТа КТ2440 (ВАК).

ВАК идентифицировали в КТ2440 Р. риЬТа с использованием информации из литературы (Кшке, Ό., Зοаа, К., Υад^, Т., Аа1к,1, С.Т., Вю,Ьет1кйу 23, 5195-5201, (1984)). Активный центр фермента ВАК из Р. кПлПа отсеквенировали и представили - ^ΤАV^КА^АΥСXСIС^ (ЗЕР ΙΌ NО:375). Эту последовательность использовали для проведения ВЬАЗТ геномной последовательности КТ2440 Р. риОТа, доступной в NСΒI. Был идентифицирован белок практически с идентичной консенсусной последовательностью. Конструировали праймеры для клонирования гена из геномной ДНК, полученной из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапаккак, УА)

5'-АСААСАСАТАТССССТТТСССССТАССС-3' (ЗЕр ΙΌ ^:376) и

5'-АСААСАССАТССТСАСТССАССАСТАТСТТСС-3' (ЗЕр ΙΌ ^:377).

ПЦР проводили в стандартных условиях, и продукт ПЦР очищали (набор для очистки продуктов ПЦР рЩдиюк, (фадеп, Уа1еп,1а, СА). Очищенный продукт ПЦР расщепляли посредством NаеI и ВатНЬ Расщепленный продукт ПЦР выделяли из геля (набор для выделения из геля Ц^ци^к Се1 Еxί^аоί^οη Кй, Р1адеп, Уа1еп,1а, СА) и лигировали в рЕТ30 и рЕТ28, расщепленные и очищенные из геля сходным образом. Клоны со вставками секвенировали (Адеηоοи^ί, Βеνе^1у, МА), и идентифицировали изоляты с пра- 138 029538 вильной последовательностью (рЕТ30 КТ2440 ВАК и рЕТ28 КТ2440 ВАК) и использовали в последующих исследованиях.

Последовательность ДНК КТ2440 ВАК представляет собой аЕдсссЕЕЕсдссдЕасссЕЕсЕддсЕдсаЕсссЕддсасЕЕсЕдаЕсассддасадд ссссссЕдЕаЕдсддсассассдЕЕдЕсдаЕддасаасддсассаасасссЕдассдЕдсааа асадсааЕдссЕдддЕсдаадЕсадсдссадсдсссЕдсадсасаасаЕссдсасдсЕдсадд ссдадсЕддссддсаадЕссаадсЕдЕдсдссдЕдсЕсааддссдаЕдссЕаЕддссасддЕа

ЕсддссЕддЕааЕдссаЕсдаЕсаЕсдсссааддсдЕдсссЕдсдЕддсддЕддссадсаасд аддаддсссдсдЕддЕссдсдссадЕддсЕЕсассдддсаасЕддЕдсдддЕасдссЕддсса дссЕсадсдадсЕддаадаЕддсЕЕдсадЕасдасаЕддаададсЕддЕдддсадсдсддааЕ

ЕЕдсссдссаддссдаЕдссаЕсдссдсдсдссаЕддсаадассЕЕдсдсаЕЕсасаЕддсдс

ЕсаасЕссадсддсаЕдадссдсаасддддЕддадаЕддссассЕддЕссддссдЕддсдаад сдсЕдсадаЕсассдассадаадсассЕсаадсЕддЕсдсдсЕдаЕдасссасЕЕсдссдЕдд аадасааддасдаЕдЕасдсаадддссЕддсддсаЕЕсаасдадсадассдасЕддЕЕдаЕса адсасдссаддсЕддассдсадсаадсЕсасссЕдсасдссдссаасЕсдЕЕсдсЕасдсЕдд аадЕдссддаадсдсдссЕддасаЕддЕасдаасдддЕддсдсдсЕдЕЕсддсдасассдЕдс сддсдсдсассдадЕасааасдЕдсдаЕдсадЕЕсаааЕсдсасдЕддсддсддЕдсасадсЕ аЕссддссддсаасассдЕдддсЕаЕдассдсассЕЕсасссЕддсссдЕдаЕЕсдсддсЕдд ссаасаЕЕасддЕсдддЕасЕссдаЕддсЕассдссдддЕаЕЕсассаасаадддссаЕдЕдс

ЕдаЕсаасддссассдЕдЕдссддЕсдЕдддсааддЕдЕсдаЕдаасасдсЕдаЕддЕсдаЕд

ЕсассдасЕЕсссЕдаЕдЕдааддддддЕаасдаадЕддЕдсЕдЕЕсддсаадсаддссдддд дсдаааЕсасссаддссдадаЕддаадаааЕсаасддсдсдЕЕдсЕсдссдаЕЕЕдЕасассд

ЕаЕддддсааЕЕссаасссдаадаЕасЕсдЕсдасЕда (ЗЕО ΙΌ N0:378).

Аминокислотная последовательность КТ2440 ВАК представляет собой

МрЕггЕ ПаазФаПК ддар1 уааррФ зтсГпдЕпЕ 1Е удпзпаш/еуз аза1 ρΗηί г Е1дае1адкзк1сау1каВаудЬдЕд1утрз11аддурсуауазпееагуугаздЕЕдд1угу г1аз1зе1е0д1дус!т.ее1удзаеЕагда0аЕааг]адкЕ1гЕЬта1пзздтзгпдуетаЕмзд гдеа1д1Ес1дк]а1к1уа1тЕ]аЕауес1кск1угкд1ааЕпедЕс1м1Ек]ааг1с1г5к1Е1]ааап5Е аЕ 1 еуреаг 1 άπινΓ Е дда1 Едс1Е ураг Е еу кг атдЕкзкуаауЬзурадпЕ удус1г Е ЕЕ 1 агс1 5г1ап1Еудузс1дуггуЕЕпкд]ау1Епд]агуруудкузтпЕ1тусД7Ес1Ерс1укддпеуу1Едк даддеФЕдаетееФпдаНасНуЕумдпзпркИус!

(ЗЕО ΙΌ N0:379).

В) Очистка КТ2440 ВАК Р. риИйа.

Плазмиду рЕТ30 КТ2440 ВАК, описанную выше, трансформировали в ВЬ21БЕ3 ρ^узδ (Iην^ί^οдеη, Саг1зЬай, СА). Полученный штамм выращивали в ЬВ или в бульоне Тетйс Вго!Ь при 37°С с аэрацией до ОБ_600нм 0,4-0,6 и индуцировали посредством 1 мМ ΙΒΓΌ. Инкубацию продолжали 3-4 ч при 37°С с аэрацией. Клетки собирали центрифугированием и клеточный осадок хранили при -80°С до применения. Клеточный осадок размораживали на льду. Клетки лизировали посредством ВидВиз!ег (Ноуадеп, МаШзоп, νΙ) и Веп/опазе (Ноуадеп, МаШзоп, νΙ). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием и бесклеточный экстракт либо сразу использовали, либо хранили при -80°С. Ген КТ2440 ВАК также клонировали в участки ШейВатШ в рЕТ28 и трансформировали в ВЙ21 БЕ3 ρ^узδ. Оказалось, что эта конструкция не экспрессирует растворимый белок с высокой эффективностью, так что в последующих исследованиях использовали немаркированный вариант (рЕТ30 КТ2440 ВАК).

Экстракт наносили на колонку ипоС) (Вю-Кай, Негси1ез, СА), уравновешенную по меньшей мере 5 об. колонки буфера А (25 мМ фосфат калия рН 8,0, 10 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР)). Колонку промывали 2 об. колонки буфера А. Белок элюировали линейным градиентом буфера В (буфер А + 1М ЖС1) из 0-100% буфера В в 20 об. колонки и с момента начала градиента собирали фракции объемом 5 мл. Фракции анализировали с использованием способа Атр1ех Кей, описанного в 7 части 4 примера. В кратком изложении, 100 мкг оксидазы Б-аминокислот (δ^дта-Λ1й^^сЬ, δί. Ьошз, МО), 0,05 мМ РАБ, 25 мМ В!гр и небольшой объем фракции, подлежащей анализу, комбинировали в 50 мкл Н₂О и добавляли к 50 мкл буфера для реакции Атр1ех Кей, полученного в соответствии с протоколом изготовителя. Фракции с активностью подвергали обессоливанию с помощью колонки РБ-10 (ОЕ Неа1!Ьсаге, Р1зса!а^ау, N1) и концентрировали с помощью центробежных концентраторов Атюоп (МПИроге, ВШегНа, МА). Очищен- 139 029538 ный белок хранили при -80°С.

С) Получение и анализ мутантной формы аланинрацемазы У354А СеоЬасШш 8(еагоШегщорШ1ш с активностью триптофанрацемазы.

Аланинрацемазу СеоЬасШш 8(еагоШегщорШ1ш дикого типа (ЗЕО ГО N0:380, представленная ниже) клонировали в рЕТ30 и использовали в качестве матрицы для сайт-направленного мутагенеза для проведения замены У354А. Ген ЗЕО ГО N0:380 можно амплифицировать посредством стандартных протоколов ПЦР и клонировать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Ген ЗЕО ГО N0:380 также можно реконструировать любым способом, известным специалисту в данной области, таким как способы ПЦР со сборкой, известные специалисту в данной области.

Последовательности ДНК и аминокислот аланинрацемазы СеоЬасШш 8(еагоШегщорЬПш дикого типа представлены ниже в качестве ЗЕО ГО N0:380 аЕддасдадЕ ЕЕсассдсда ЕасдЕдддсд даадЕддаЕЕ ЕддасдссаЕ ЕЕасдасааЕ дЕддадааЕЕ ЕдсдссдЕЕЕ дсЕдссддас дасасдсаса

ЕЕаЕддсддЕ сдЕдааддсд аасдссЕаЕд дасаЕдддда ЕдЕдсаддЕд дсааддасад сдсЕсдаадс дддддссЕсс сдссЕддсдд ЕЕдссЕЕЕЕЕ ддаЕдаддсд сЕсдсЕЕЕаа дддааааадд ааЕсдаадсд ссдаЕЕсЕад

ЕЕсЕсддддс ЕЕсссдЕсса дсЕдаЕдсдд сдсЕддссдс ссадсадсдс аЕЕдсссЕда ссдЕдЕЕссд сЕссдасЕдд ЕЕддаадаад сдЕссдсссЕ

ЕЕасадсддс ссЕЕЕЕссЕа

ЕЕсаЕЕЕсса

ЕЕЕдааааЕд дасассддса

ЕдддасддсЕ ЕддадЕдааа дасдаддаад адасдааасд ааЕсдЕадсд сЕдаЕЕдадс дссаЕссдса ЕЕЕЕдЕдсЕЕ дааддддЕдЕ асасдсаЕЕЕ ЕдсдасЕдсд даЕдаддЕда асассдаЕЕа ЕЕЕЕЕссЕаЕ садЕаЕассс дЕЕЕЕЕЕдса саЕдсЕсдаа ЕддсЕдссдЕ сдсдсссдсс дсЕсдЕссаЕ Едсдссааса дсдсадсдЕс дсЕссдЕЕЕс ссЕдассдда сдЕЕсааЕаЕ ддЕссдсЕЕс ддсаЕЕдсса ЕдЕаЕдддсЕ ЕдссссдЕсд сссддсаЕса адссдсЕдсЕ дссдЕаЕсса ЕЕаааадаад саЕЕЕЕсдсЕ ссаЕадссдс сЕсдЕасасд ЕсаааааасЕ дсаассаддс дааааддЕда дсЕаЕддЕдс дасдЕасасЕ дсдсадасдд аддадЕддаЕ сдддасдаЕЕ ссдаЕсддсЕ аЕдсддасдд сЕддсЕссдс сдссЕдсадс асЕЕЕсаЕдЕ ссЕЕдЕЕдас ддасаааадд сдссдаЕЕдЕ сддссдсаЕЕ ЕдсаЕддасс адЕдсаЕдаЕ ссдссЕдссЕ ддЕссдсЕдс сддЕсддсас дааддЕдаса сЕдаЕЕддЕс дссаадддда сдаддЕааЕЕ ЕссаЕЕдаЕд аЕдЕсдсЕсд ссаЕЕЕддаа асдаЕсаасЕ асдаадЕдсс ЕЕдсасдаЕс адЕЕаЕсдад ЕдссссдЕаЕ ЕЕЕЕЕЕссдс саЕаадсдЕа ЕааЕддаадЕ дадааасдсс дЕЕддссдсд да (ЗЕО ΙΌ N0:380).

Кодируемая аминокислотная последовательность аланинрацемазы (СеоЬасШш 8(еагоШегторШ1ш) представлена ниже в качестве ЗЕО ГО N0:381

МеЕ Азр С1и РЬе Ηίδ Агд Азр ТЬг Тгр А1а С1и Уа1 Азр Ьеи

Азр

А1а

Не

Туг

Азр

Азп

Уа1

С1и

Азп

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

Ьеи

Рго

Азр

Азр

ТЬг

ΗΪ3

11е

МеЕ

А1а

Уа1

Уа1

Ьуз

А1а

Азп

А1а

Туг

С1у

ΗΪ3

С1у

Азр

Уа1

С1п

Уа1

А1а

Агд

ТЬг

А1а

Ьеи

С1и

А1а

С1у

А1а

Зег

Агд

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

РЬе

Ьеи

Азр

С1и

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

Агд

С1и

Ьуз

С1у

11е

С1и

А1а

Рго

11е

Ьеи

Уа1

Ьеи

С1у

А1а

Зег

Агд

Рго

А1а

Азр

А1а

А1а

Ьеи

А1а

А1а

С1п

С1п

Агд

11е

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

РЬе

Агд

Зег

Азр

Тгр

Ьеи

С1и

С1и

А1а

Зег

А1а

Ьеи

Туг

Зег

С1у

Рго

РЬе

Рго

11е

ΗΪ3

РЬе

ΗΪ3

Ьеи

Ьуз

МеЕ

Азр

ТЬг

С1у

МеЕ

С1у

Агд

Ьеи

С1у

Уа1

Ьуз

Азр

С1и

С1и

С1и

ТЬг

Ьуз

Агд

11е

Уа1

А1а

Ьеи

11е

С1и

Агд

ΗΪ3

Рго

ΗΪ3

РЬе

- 140 029538

Уа1

Ьеи

С1и

С1у

Уа1

Туг

ТЬг

НТз

РЬе

А1а

ТЬг

А1а

Азр

С1и

Уа1

Азп

ТЬг

Азр

Туг

РЬе

Зег

Туг

С1п

Туг

ТЬг

Агд

РЬе

Ьеи

НТз

Мер

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Рго

Рго

Ьеи

Уа1

НТз

Суз

А1а

Азп

Зег

А1а

А1а

Зег

Ьеи

Агд

РЬе

Рго

Азр

Агд

ТЬг

РЬе

Азп

Мер

Уа1

Агд

РЬе

С1у

Не

А1а

Мер

Туг

С1у

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Рго

С1у

Не

Ьуз

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

Туг

Рго

Ьеи

Ьуз

СТи

АТа

РЬе

Зег

Ьеи

НТз

Зег

Агд

Ьеи

УаТ

НТз

УаТ

Ьуз

Ьуз

Ьеи

С1п

Рго

С1у

С1и

Ьуз

Уа1

Зег

Туг

С1у

А1а

ТЬг

Туг

ТЬг

А1а

С1п

ТЬг

С1и

С1и

Тгр

Не

С1у

ТЬг

Не

Рго

Не

С1у

Туг

А1а

Азр

С1у

Тгр

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

С1п

НТз

РЬе

НТз

Уа1

Ьеи

Уа1

Азр

С1у

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Не

Уа1

С1у

Агд

Не

Суз

Мер

Азр

С1п

Суз

Мер

Не

Агд

Ьеи

Рго

С1 у

Рго

Ьеи

Рго

УаТ

СТу

ТЬг

Ьуз

УаТ

ТЬг

Ьеи

Не

СТу

Агд

С1п

С1у

Азр

С1и

Уа1

Не

Зег

Не

Азр

Азр

Уа1

А1а

Агд

НТз

Ьеи

С1и

ТЬг

Не

Азп

Туг

С1и

Уа1

Рго

Суз

ТЬг

Не

Зег

Туг

Агд

Уа1

Рго

Агд

Не

РЬе

РЬе

Агд

НТз

Ьуз

Агд

Т1е

Мер

СТи

УаТ

Агд

Азп

АТа

УаТ

СТу

Агд

СТу

(ЗЕО ΙΌ ΝΟ:

381)

Мутагенез проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОшскСНапде'Ми1(1 ка(е-Шгес(ей тиЫуепекь И( (8(га(адепе, Ьа 1о11а, СА). Для проведения замены У354А использовали следующий мутагенный праймер, 5'-дсса(йддааасда(саасдсддаад(дсс((дсасда(сад-3' (8ЬО ΙΌ ΝΟ:382). Сайт-направленный мутагенез проводили, как описано в протоколе изготовителя. Несколько изолятов секвенировали (Адепсоиг(, Веуег1у, М.А.), и изолят с правильной последовательностью отбирали и использовали для дальнейшего анализа.

Единичную мутантную форму рЕТ30У354А трансформировали в ВЕ21(ОЕ3)рЕук8 Е. соН. Очищенный белок получали следующим образом. Штамм выращивали в ЬВ или бульоне Тегпйс Вго(й (при 37°С с аэрацией) до Οϋ₆οθΗΜ 0,4-0,6 и индуцировали посредством 1 мМ ГОТО. Инкубацию продолжали при 37°С с аэрацией в течение ~3 ч. Клетки собирали центрифугированием, и клеточный осадок хранили при -80°С.

Клеточный осадок размораживали на льду, а затем ресуспендировали в соответствующем объеме ВидВик(ег (Жуадеп, Майкоп, ШЛ.) плюс нуклеаза Веп/опаке Бохадееп Майкоп, \ΥΙ).

Клеточный дебрис удаляли центрифугированием и бесклеточный экстракт наносили на колонку I П8-Втй (Шуадеп, МаШкоп, ШТ), уравновешенную буфером для связывания. Колонку промывали буфером для связывания и буфером для промывания, и белок элюировали буфером для элюирования (как описано в протоколе изготовителя). Очищенный белок подвергали обессоливанию с использованием колонки РЭ-10 (ОЕ Неа1(йсаге, Р1кса(а^ау, ΝΙ). Белок подвергали обессоливанию в 50 мМ фосфате калия рН 8,0 и 10 мкМ пиридоксаль-5'-фосфате в соответствии с протоколом изготовителя. Белок концентрировали с использованием центробежного концентратора Аш1соп (Мййроге, ВШегша, МА). Очищенный и концентрированный белок разделяли на небольшие аликвоты и хранили при -80°С до применения.

Очищенный У354А сравнивали с аланинрацемазой дикого типа (полученной способом, описанным выше) в анализах как аланина, так и триптофана. Анализы проводили при 37°С в 50 мМ фосфатнокалиевом буфере, рН 8, и 10 мкМ РЬР с использованием 400 мкл концентрированного очищенного белка (>1 мг/мл) и 50 мМ субстрата. Детекцию Ό-аланина и Ό-триптофана проводили с использованием технологии хиральных аминокислот, описанной в примере 1.

- 141 029538

Таблица 40

Эти данные анализировали без применения внутреннего стандарта; таким образом, эти данные являются полуколичественными, и их следует применять для сравнительных целей. Тем не менее, эти результаты показывают, что единичная мутация У354А является достаточной для расширения специфичности аланинрацемазы, чтобы она могла катализировать рацемизацию аминокислот с использованием альтернативных субстратов.

Ό) Анализ фермента ВАК.

Фермент ВАК анализировали следующим образом. Анализы Атр1ех Кей проводили, как описано в этом примере. КТ2440 ВАК Р. риййа использовали в количестве 200 мкг (очищенный как описано в этом примере). Аланинрацемазу Ο. 8кеагокНегторНйи8 дикого типа и У354А очищали, как описано в этом примере, и использовали в количестве либо 200 мкг/мл, либо 1000 мкг/мл. СЕ представляет собой бесклеточный экстракт, который получали, как описано в этом примере. Результаты для момента времени 60 мин представлены в табл. 41 ниже.

Таблица 41

Фермент	Данные флуориметра (через 60 минут)
ВАК (200)	56943
Υ354Α (200)	7860
У354А(1000)	13587
\УТ аланинрацемаза (200)	3646
\УТ аланинрацемаза (1000)	3639
ВАК СЕ (5 мкл)	16228
ВАК СЕ (10 мкл 1)	26662
ВАК СЕ (50 мкл)	>58000
Без фермента	1510

Очищенный белок также анализировали в отношении активности триптофанрацемазы в 50 мМ фосфате калия рН 8, 10 мкМ РЬР, и 30 мМ Ь-триптофане, как описано выше. В анализах использовали либо 200 мкг/мл, либо 1000 мкг/мл очищенного фермента (указано в скобках). Ό-триптофан анализировали с использованием способа хиральных аминокислот, описанного в примере 1 для детекции.

- 142 029538

Таблица 42

Фермент	Время	Ό-триптофан (м.д.)
ВАК (200)	0	0
	5	172
	10	410
	20	844
	30	1318
	60	2362
	120	2594
	240	2762
	1080	2294
УЗ 54 А (200)	0	0
	5	0
	10	0
	20	0
	30	12
	60	22
	120	44
	240	56
	1080	368
Υ354Α (1000)	0	0
	5	0
	10	12
	20	18
	30	40
	60	80
	120	146
	240	218
	1080	1164

Анализы показывают, что фермент КТ2440 ВАК Р. риййа значительно более активен в отношении триптофана, чем фермент из О. к!еаго!йегторййик и его мутантная форма У354А.

Е) Образование монатина посредством КТ2440 ВАК Р. риййа.

Анализ образования монатина проводили с очищенным КТ2440 ВАК Р. риййа (очищенным, как описано выше) (100 мкг) или очищенным У354А (очищенным, как описано выше) (500 мкг), Όаминотрансферазой (ВюСа!а1уйск АТ-103 (Ракайепа, СА)) (500 мкг) и альдолазой ЗЕО ГО ИО:276 (очищенной, как в примере 23) (50 мкг). Эксперимент по образованию монатина, начиная с Ь-триптофана, проводили следующим образом. В дополнение к указанным выше ферментам, на 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: 4 мМ МдС1₂, 50 мМ Ь-триптофан, 100 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатнокалиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР.

В качестве контроля эксперимент проводили, как описано выше, без рацемазы, и начиная с Όтриптофана вместо Ь-триптофана. Обобщенные результаты представлены в табл. 43, ниже.

- 143 029538

Таблица 43

Субстрат	Рацемаза	Время	Тотальный монатин	%К,К	%δ,δ	%Κ,δ	%δ,Κ
Ь-Тгр	Υ354Α	2 часа	Не выявлен
		18 часов	Не выявлен
Ь-Цр	ВАК	2 часа	Не выявлен
		18 часов	38,6 м.д.	92,1	5		2,9
Ь-Цр	Отсутствует	2 часа	Не выявлен
		18 часов	Не выявлен
ϋ-ΐτρ	Отсутствует	2 часа	19,9 м.д.	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали
		18 часов	221,25 м.д.	97,8	0,2		2

В этом эксперименте с использованием Υ354Α монатин не был выявлен. Эту рацемазу использовали ранее (данные не представлены) для получения монатина, однако использовали значительно более высокий уровень фермента (по меньшей мере 2 мг и вплоть до 10 мг для выявления более высоких уровней монатина). КТ2440 ΒΑΚ Р. риЛЛа использовали для получения монатина из Ь-триптофана. 100 мкг, используемых в этом эксперименте, не было достаточно, чтобы выявить образование монатина через 2 ч, однако их было достаточно, чтобы выявить образование монатина через 18 ч. Распределение стереоизомеров показало, что большая часть образованного монатина представляет собой К,К-изомер. Образования К,8-изомера не происходило. Этот результат указывает на то, что КТ2440 ΒΑΚ не способен на поддающемся детекции уровне вызывать рацемизацию К,К-изомера монатина (рацемизация К,К-изомера привела бы к К,8-изомеру). В этом эксперименте образовывалось значительное количество 8,8-изомера. Это, вероятно, является следствием того факта, что АТ-103, используемая в этом эксперименте, не является высокоочищенной и может содержать Ь-аминотрансферазы из клеточного экстракта, и что существует большое количество Ь-триптофана, имеющегося в качестве донора амино для переаминирования 8МР.

Пример 29.

Клонирование и экспрессия аргининрацемазы РкеиЛотопак ίаеί^ο1епк.

Обзор эксперимента.

Аргининрацемазу РкеиЛотопак ίаеί^ο1епк (также известную как Р. дга¥ео1епк) (регистрационный номер ОепЬапк № АВ096176, последовательность нуклеиновой кислоты) и ее мутантную форму О84М клонировали, экспрессировали и тестировали на активность в отношении превращения Ь-триптофана в Ό-триптофан. Этот ген на 72% идентичен гену ΒΑΚ Р. риЛЛа из КТ2440 и на 73% идентичен гену ΒΑΚ Р. риЛЛа из ЫВКС 12996, описанного выше. Аминокислотная последовательность на 72% идентична обоим белкам Р. риЛЛа ΒΑΚ.

Протокол полимеразной цепной реакции.

РкеиЛотопак 1ае1го1епк ^ТСС 4683) выращивали в питательном бульоне при 28°С при встряхивании 225 об/мин. Полимеразную цепную реакцию проводили на цельных клетках с использованием праймеров, сконструированных с 5'-участками рестрикции и выступающими концами для клонирования в векторы рЕТ28 и рЕТ30 (Ыо¥адеп, МаЛ1коп, VI).

Последовательности праймеров представляли собой

Ν-концевой: 5'-ΑΤΑΑΤΑСΑΤΑΤОСССΤΤСΤСССОΤΑССС-3' (8Е0 ГО ЫО:408) и

С-концевой: 5'-ОСООСОООΑΤССΤΤΑСΤОΑΤСΤΤΤСΑООΑΤΤ-3' (8Е0 ГО ЫО:409).

Ген из Р. ίаеί^ο1епк амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. Двадцать пять мкл выращенных клеток лизировали при 96°С в течение 10 мин. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, и супернатант использовали в качестве матрицы для ПЦР. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержала 5 мкл матрицы (лизированный клеточный супернатант), 1,6 мкМ каждого праймера, 0,3 мМ каждого ЛЫТР, 10 Е полимеразы гТ^ь Ро1утегаке ХЬ ^ррЛеЛ ВюкуШетк, РоШег СНу, СΑ), 1Х буфер ХЬ и 1 мМ Мд(ОАс)₂. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, 8 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин, с последующими 22 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 58°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин. После 22 повторов образец поддерживали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту 1230 п.н.

Клонирование.

Продукт ПЦР выделяли из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1адеп (О1адеп, Уа1епс1а, СΑ). Продукт клонировали с помощью ТОРО и трансформировали в клетки ТОР 10 в соответствии с протоколом изготовителя (Iпν^ί^οдеп, Саг1кЬаЛ, СΑ). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с

- 144 029538 центрифугированием Р1адеп (^адеп, Уа1епс1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством Ν^Ι и ВатШ. Последовательности плазмид, для которых было выявлено наличие правильной вставки, проверяли посредством секвенирования ДНК с дидезокситерминированием цепи с универсальными прямым М13 и обратным М13 праймерами.

Скорректированный клон ТОРО расщепляли рестрикциоиными ферментами Ν^Ι и ВатШ в соответствии с рекомендованными изготовителем протоколами (№ν Епд1апб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА) и очищали из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля Р1адеп (^адеп, Уа1епс1а, СА). Векторы рЕТ28 и рЕТ30 получали расщеплением рестрикциоиными ферментами NбеI и ВатШ с последующей обработкой щелочной фосфатазой креветки (КосЬе, ИГапароНк, ΙΝ) и очисткой из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (^адеп, Уа1епс1а, СА). Расщепленные векторы и вставку лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Кар1б™ ΌΝΛ Ыдабоп Кб (КосЬе, МатроНк, ΙΝ). Приблизительно 50 нг обработанной вставки, 100 нг обработанного вектора (с молярным соотношением вставки и вектора 3 к 1), 5 Е ДНК-лигазы Т4, и 1Х буфер для лигирования инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь для лигирования подвергали обессоливанию с использованием набора для высокой очистки продуктов ПЦР ШдЬ Риге РСК Ргобис! Ригбгсабоп КН (КосЬе, ^ГагароШ, ΙΝ) и использовали для трансформации электрокомпетентных клеток ЦН10В Е. соб (^бродет Саг1кЬаб, СА). Десять мкл каждой реакционной смеси дли лигирования добавляли к 40 мкл клеток ЦН10В, которые трансформировали электропорацией с использованием ВюКаб Сепе Ри1каг ΙΙ в следующих условиях: 2,5 кВ, 25 мкФ, 200 Ом в 0,2-см кювете. Клеткам давали возможность восстановиться в 1 мл δОС, находящейся при комнатной температуре, в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Клетки размещали на планшеты ЬВ, содержащие канамицин (50 мкг/мл). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием 01адеп (^адеп, Уа1епаа, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством Ν^Ι и ВатШ.

Экспрессия гена и анализы.

Плазмидную ДНК трансформировали в экспрессирующего хозяина ВЬ21(ЛЕ3) рЬу^ Е. соб (Ыоνадеη, Мабтоп, νΙ). Культуры выращивали и плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах Р1адеп (Шадеп, Уа1епс1а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава.

Индукцию в ВЬ21(ЦЕ3) рЬу^ первоначально проводили как в векторе рЕТ 28 (маркированном гистидином), так и в векторе рЕТ 30 (без маркера). Исследование с течением времени проводили с помощью культур, выращиваемых при 37°С в 100 мл ЬВ, содержащей канамицин (50 мг/л), до ОЦ₆₀₀ 0,5 и индуцировали посредством 100 мкМ ГРТС (изопропилтиогалактозид), и проводили забор образцов в 0 момент времени и через 3 ч после индукции. Клетки, полученные в моменты времени 0 ч и 3 ч, ресуспендируют в 1Х буфере с додецилсульфатом натрия, содержащем 2-меркаптоэтанол, и нагревают при 95°С в течение 10 мин и охлаждают. Аликвоты этих образцов тотальных клеточных белков анализируют посредством δΌδ-РАСЕ с использованием геля с градиентом 4-15%.

Клеточные экстракты также получают после культивирования в течение 3 ч суспендированием клеточного осадка из 5 мл культуры в реагенте Nονадеη ВидВиИег™, содержащем нуклеазу бензоназу и коктейль ингибиторов протеаз #3 (Са1Ь^οсЬет-NονаЬ^οсЬет Согр., δаη 01едо, СА), при комнатной температуре в течение 20 мин при осторожном встряхивании и центрифугированием при 16000хд для удаления клеточного дебриса. Супернатанты (клеточные экстракты) наносят в гели с градиентом 4-15% для анализа клеточных растворимых белков.

Образец после 3 ч из клонированной аргининрацемазы Р. 1ае1го1епк показал полосу тотального белка, которая соответствует точному размеру (приблизительно 45 кДа) в векторе рЕТ 30 (без маркера). Продукт гена Р. 1ае1го1епк рЕТ 30 сверхэкспрессировался на более высоком уровне, чем продукт гена Р. 1ае1го1епк рЕТ 28 (маркированного гистидином), однако ни один из векторов не приводил к заметной полосе растворимого белка.

Клетки из индуцированных культур (100 мл) центрифугировали и промывали один раз посредством 0,85% ЦаС1. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл/г сырой массы клеток реагента ВидВик1ег™ (Nονадеη, Мабтоп, νΙ), содержащего 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1ЬюсЬетNονаЬ^οсЬет Согр., δаη 01едо, СА) и 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на орбитальном устройстве для встряхивания. Нерастворимый клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000хд в течение 20 мин при 4°С.

Клеточные экстракты анализировали в отношении активности триптофанрацемазы с использованием следующего протокола. Реакции объемом один мл проводили в 50 мМ фосфате калия (рН 8,0), 0,05 мМ РЬР и 30 мМ Ь-триптофане. Реакции инициировали добавлением бесклеточных экстрактов и инкубировали при 30°С в течение ночи. Аликвоты образцов отбирали после инкубации в течение ночи (образцы в моменты времени ноль минут служили в качестве контрольной реакции). В каждую аликвоту образцов объемом 250 мкл добавляли концентрированную муравьиную кислоту (5 мкл) для остановки

- 145 029538 реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до их анализа в отношении Ό-триптофана способом хиральных аминокислот, описанным в примере 1.

Результаты анализа клеточных экстрактов после индукции рЕТ28 и рЕТ30 посредством 100 мкМ ГРТО (3 ч) показывают, что клоны Р. 1ае1го1епк обладают активностью рацемазы в отношении Ьтриптофана. Снова оказалось, что вариант ВАК с маркером является менее активным и может осаждаться или быть менее растворимым, чем вариант без маркера (рЕТ28). В табл. 44 ниже показаны первоначальные результаты, хотя и не количественные, поскольку был получен очень слаборастворимый белок.

_ Таблица 44

Обработка	Момент времени	Субстрат	Экстракт рацемазы (200 мкг)	Концентрация Э-1гр (мкг/мл)
рЕТ28/Р. 1ае1го1епя	0	Ь-1гр	500 мкл	не выявлено
рЕТЗО/Р. 1ае1го1епя	0	Ь-1гр	500 мкл	не выявлено
рЕТ28//< 1ае1го1епя	после ночи	Ь-ΐτρ	500 мкл	140
рЕТЗО/Р. 1ае1го1епя	после ночи	Ь-ΐτρ	500 мкл	226

Индукцию конструкции рЕТ30 (без маркера) повторяли с использованием тех же условий, что упомянуты выше, и наблюдали заметную полосу растворимого белка в 808-РАСЕ. Анализ повторяли с использованием тех же условий, что описано выше, и получали результаты, представленные в табл. 45 ниже.

Таблица 45

Обработка	Момент времени	Субстрат	Экстракт рацемазы (мкл)	Концентрация Ц-1гр (мкг/мл)
Р. /яе/го/еиу-рЕТЗО	0	Ь-1гр	300	Не выявлено
Р. /де/т/елм-рЕТЗО	0	Ь-1гр	150	Не выявлено
Р. /яе/го/еих-рЕТЗО	2ч	Ь-1гр	300	319
Р. /«<Лг«Рял-рЕТ30	2ч	Ь-1гр	150	308
Р. /де/т/стм-рЕТЗО	после ночи	Ь-1гр	300	1586
Р. ГгкТгп/еш-рЕТЗО	после ночи	Ь-1гр	150	1658

Снова было отмечено, что удвоение объемов не привело к увеличению активности. Для последующей работы было решено удалить белок из ВидЬик1ег настолько быстро, насколько это возможно, после получения клеточных экстрактов и хранить белок в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8, содержащем 0,01 мМ РЬР. Детергент в ВидЬик1ег может ингибировать реакцию или может вызывать потерю активности при хранении.

Снова проводили индукцию конструкции рЕТ30 и клеточный экстракт подвергали анионообменной хроматографии (как в примере 28) для получения более чистого экстракта. Анализ повторяли с этим частично очищенным препаратом. Количества в скобках в столбце экстракт рацемазы табл. 46 ниже указывают на приблизительное количество частично очищенного фермента рацемазы, используемого в этом анализе. Результаты анализа представлены в табл. 46 ниже.

_ Таблица 46

Источник фермента	Момент времени	Субстрат	Экстракт рацемазы	Концентрация Е)-1гр (мкг/мл)
КТ2440	0	Ь-1гр	75 мкл (90 мкг	не выявлено
ΝΒΚΟ 12996	0	Ь-1гр	42 мкл (200 мкг)	не выявлено
ЫВКС 12996	0	Ь-1гр	21 мкл (100 мкг)	не выявлено
Р. 1ае1го1епя	0	Ь-1гр	108 мкл (200 мкг)	не выявлено
Р. 1ае1го1еп5	0	Ь-1гр	54 мкл (100 мкг)	не выявлено
КТ2440	2ч	Ь-1гр	75 мкл (90 мкг)	661
ΝΒΚ-С 12996	2ч	Ь-1гр	42 мкл (200 мкг)	408
ΝΒΒΓ 12996	2ч	Ь-1гр	21 мкл (100 мкг)	208
Р. 1ае1т1еп.\	2ч	Ь-1гр	108 мкл (200 мкг)	862
Р. ΙαβίΓοΙβηβ	2ч	Ь-1гр	54 мкл (100 мкг)	547
КТ2440	после ночи	Ь-1гр	75 мкл (90 мкг)	2386
ΝΒΚΟ 12996	после ночи	Ь-1гр	42 мкл (200 мкг)	2382
ΝΒΚΟ 12996	после ночи	Ь-1гр	21 мкл (100 мкг)	1706
Ρ. 1ае1го1еп$	после ночи	Ь-1гр	108 мкл (200 мкг)	2029
Ρ. 1ае1го1еп8	после ночи	Ь-1гр	54 мкл (100 мкг)	2099

Нелинейность образца после ночи в этом случае, вероятно, является следствием того факта, что ре- 146 029538 акции достигают равновесия. Очевидно, ΒΑΚ Ρ. (аей^еш обладает значительной активностью в отношении рацемизации триптофана, как и ΒΑΚ 12996 и ΒΑΚ КЬ2440. Оказалось, что ΒΑΚ КЬ2440 и ΒΑΚ Ρ. (аей^еш обладают сходной активностью, которая является немного более высокой, чем ΒΑΚ 12996.

Последовательность ДНК аргининрацемазы Ρ. (аеЦокаы представлена ниже в качестве δΗ() ΙΌ ΝΘ:410. Последовательность ПЦР привела к двум заменам по сравнению с опубликованной последовательностью NСΒI. Конкретно, последовательность ПЦР содержала аденозин вместо гуанина в положении 902 и цитозин вместо гуанина в положении 921. Эти изменения ДНК привели к одной молчащей мутации, а также к одной замене глицина на аспартат в аминокислотном положении 301.

АТССССТТСТССССТАСССТССТСССССТТТСССТТСССАТСССАТТССТССААААСС

СССССТТТССТСССССАССССТСТССАТСАСССАСССССТАССТСААСТСААТАСССАССАСА

ССААТСССТСССТССАААТСААТАААССССССТТССАССАСААСАТАСССАСТСТССАААССС

СССТСССССССААСТСССАСАТСТССССССТАСТСААСССССАТСССТАТССССАСССТАТСС

ССТТСТТСАТССССТСССТСАТССССАТСССТСТТСССТСТСТСССТСТССССАССААССААС

ААСССССССТССТСССССАСАССССТТТСААСССТСААСТСАТАССССТССССАССССТСССС

ТСАСССААС ТССААСС ТССАС ТССССТАСААСАТССААСАСС ТССТССССААСС ТССАС Т ТСС

СССТСААССССАСССТСАТТССССАССАТСАСССТСССССССТССТССТССАССТСССТСТСА

АТТССАСССССАТСАССССТААСССАСТССАСАТСАССАССССТСАССССССТССТСАТСССС

ТАССТАТСАССААССТСССАААССТССААСТСССССССАТСАТСАСССАСТТСССССТССААС

АТССТССССАССТСССТСССССССТСААССССТТСААТСАССААССССААТСССТСАТСААСС

ТСССССАСС Т ТСАТСССАССААСАТСАССС ТССАСССССССААС ТССТ ТССССАСАС ТССАСС

ТСССССААТСССАТСТССАСАТССТСССССССССССССССССТСТТСССССАСАСССТАСССТ

СССАСАСССАСТАСААСССССТСАТССАСТТСААСТСССАССТССССТСССТСААСАССТАСС

ССААССССААСАСССТСССТТАТСАССССАССТАСАСССТССССССССАСТССССССТССССА

АСАТСАСССТССССТАСТСТСАССССТАССССССССССТТТАССААТАААСССАТТСТССТСА

ТСААСССССАТССССТСССАСТССТССССАААСТСТССАТСААСАСССТСАТССТССАССТСА

СТСАССССССССАТСТСААААССССССАТСААСТССТССТСТТСССССАССАССССААССССС

АСАТТАСССАСССТСАСАТССААСАСАТСААСССТССАСТССТТССССАТСТСТАТАСССТСТ

СССССААТ ТССААССС ТААААТСС ТСАААСАТСАСТАА (ЗЕО ΙΌ N0:410).

Белок, кодируемый геном δΗ() ΙΌ ΝΘ:410, анализировали посредством программы для предсказания сигнальных пептидов δ^диаί Ρ 3.0 (γγγ.сЬδ.άΐн.άк/δе^ν^сеδ/δ^диаίΡ/), и была предсказана лидерная последовательность из 23 аминокислот.

Мутагенез В84М ΒΑΚ Ρ. (аей^еш.

Мутагенез проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОшскСНаидеМнЮ (%га(адеие, Ьа .1о11а, СА) с использованием гена ΒΑΚ Ρ. (аеЦокаы в рЕТ30, который приводит к белку без маркера. Для проведения замены В84М использовали следующий мутагенный праймер: 5'ΤΑСССΑΟΟСΤΟΑΟΑΤΟΟΑΑΟΑСΑΤСΑΑСΟ-3' (δΕρ ΙΌ ΝΘ:411).

Сайт-направленный мутагенез проводили, как описано в протоколе изготовителя. Несколько изолятов секвенировали (Лдеисоиг(, Βαναιΐχ·, МА), и изолят с правильной последовательностью отбирали и использовали для последующего анализа.

Плазмиду трансформировали в клетки ΒΌ21(ΌΕ3) (Nονадеи, Маά^δοи, \Ι). Рекомбинантный белок получали в среде С)уегшд11( Ηχρπαδδ ΙΙ (Nονадеи, МасВои, \Ι), содержащей 50 мкг/мл канамицина в соответствии с протоколами изготовителя. Бесклеточные экстракты получали с использованием Β^ΒΗδ(α· (Nονадеи, МасВои, \\Ί) в соответствии с протоколами изготовителя, подвергали обессоливанию и анализировали в отношении процентной экспрессии белка-мишени с использованием способа Εχραηοη, описанного выше.

Анализы тотального белка проводили с использованием набора Ρίαιτα ΒСΑ (Ρίαιτα, Носккогб, ΙΌ). Анализы триптофанрацемазы с мутантным ферментом проводили с использованием фермента дикого типа, полученного таким же образом, как и положительный контроль. Анализируемые образцы содержали на 1 мл: 30 мМ Ь-триптофан, 50 мМ фосфат калия рН 8, 10 мкМ ΡΌΡ и приблизительно 100 мкг белка рацемазы в бесклеточном экстракте. В случае, где 100 мкг не использовали (исходя из % экспрессии Εχραηοη и показателей тотального белка Ρίαιτα), результаты нормализовывали. Образцы в нулевой момент времени, через 30 мин, 2 ч и после ночи собирали, обрабатывали 2% муравьиной кислотой, фильтровали и разбавляли 1:10 для анализа с использованием способа хиральных аминокислот, описанного в примере 1.

Оказалось, что фермент дикого типа образует 49,1 м.д. Ό-триптофана за 30 мин, в то время как

- 147 029538

1384М мутантной формы образует 108 м.д. Показатели в момент времени 2 часа были сходными - 229,4 м.д. I)-триптофана получали посредством фермента дикого типа против 541,7 для мутантной формы 1384М. Оказалось, что мутация 1384М приводит приблизительно к удвоенной активности ВАК Р. !ае!го1епк. Результат в момент времени после ночи для мутантной формы также является более высоким, однако, поскольку реакции достигают равновесия, отличия в активности снижаются. Когда анализы проводили в отношении образования монатина, как в примере 28, оказалось, что 1384М не обеспечивает какого-либо преимущества по сравнению с ферментом дикого типа Р. !ае1го1епк.

Пример 30. Анализ экстракта А. сапае.

Аеготопак сатае' АТСС 14486 выращивали в питательном бульоне при 37°С. Клетки из культуры (200 мл) центрифугировали и промывали один раз посредством 0,85% ИаС1. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл/г сырой массы клеток реагента ВидВик!ег™ (Nονадеи, Маейкоп, VI), содержащего 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз #3 (СаШюсйет-ИотаЪюсйет Согр., Зап Отедо, СА) и 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на орбитальном устройстве для встряхивания. Нерастворимый клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000хд в течение 20 мин при 4°С. Бесклеточный экстракт подвергали обессоливанию на колонке РО-10 (ОЕ НеаЕйсаге, Рткса!атау, N1).

Бесклеточный экстракт анализировали в отношении активности триптофанрацемазы с использованием следующего протокола. Реакции объемом один мл проводили в 50 мМ фосфате калия (рН 8,0), 0,05 мМ РЬР и 30 мМ Ь-триптофане. Реакции инициировали добавлением бесклеточного экстракта (либо 100 мкл, либо 500 мкл) и инкубировали при 30°С в течение ночи. Аликвоты образцов отбирали через 2 ч и после инкубации в течение ночи (образцы в момент времени ноль минут служили в качестве контрольных реакций). К каждой аликвоте образца объемом 250 мкл добавляли концентрированную муравьиную кислоту (5 мкл) для остановки реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до их анализа в отношении Ώ-триптофана посредством способа хиральных аминокислот, описанного в примере 1.

Результаты анализа клеточных экстрактов А. сатае показали активность рацемазы в отношении йтриптофана, как показано в табл. 47.

_ Таблица 47

Обработка	Момент времени	Субстрат	Экстракт рацемазы	Концентрация ϋ-ΐτρ (мкг/мл)
А. стчае	0	Ь-Тгр	100 мкл	не выявлено
А. стчае	0	Ь-Тгр	500 мкл	не выявлено
А. стчае	2ч	Ь-Тгр	100 мкл	2
А. са\чае	2ч	Ь-Тгр	500 мкл	19
А. са\чае	после ночи	Ь-Тгр	100 мкл	45
А. са\чае	после ночи	Ь-Тгр	500 мкл	130

После выявления активности в клеточных экстрактах А. сатае конструировали вырожденные праймеры (исходя из превращенных участков известных гомологов ВАК) для получения гена ВАК из этого вида. Последовательности вырожденных праймеров представлены ниже:

Аег йед Е2: 5'-ОССАОСААСОАКОАКОСМСОСОТ-3' (ЗЕО ГО ^:412) и

Аег йед К1: 5'-ТООССЗТКОАТСАОСАСА-3' (ЗЕО ГО ^:413), где К означает О или Т, К означает А или О, З означает С или О, и М означает А или С.

Указанные выше праймеры использовали для амплификации посредством ПЦР фрагмента ДНК длиной 715 п.н. из геномной ДНК А. сатае (АТСС 14486). Использовали следующий протокол ПЦР: 50 мкл реакционной смеси содержали 0,5 мкл матрицы (~100 нг геномной ДНК А. сатае), 1,6 мкМ каждого праймера, 0,3 мМ каждого йNΤР, 10 Е полимеразы гТ^!й Ро1утегаке Хй (АррНей Вюкук!етк, Еок!ег Сйу, СА), 1Х буфер ХЬ, 1 мМ Мд(ОАс)₂ и 2,5 мкл диметилсульфоксида. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин и 30 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 53°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин. После 30 повторов, образцы держали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту длиной 715 п.н.

Клонирование.

Продукт ПЦР выделяли из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля (Й1ацеп ((йшцеп, Vа1еис^а, СА). Продукт клонировали с помощью ТОРО и трансформировали в клетки ТОР 10 в соответствии с протоколом изготовителя (ИттТтоце'п, Саг1кЪай, СА). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием (Эшце'п (Отадеп, Vа1еис^а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством ЕсоКЕ Последовательности плазмид, для которых было выявлено наличие правильной вставки, проверяли посредством секвенирования ДНК с дидезокситерминированием цепи с универсальными прямыми праймерами М13.

Последовательность ДНК продукта ПЦР А. сатае представлена ниже в качестве ЗЕО ГО NО:414 с подчеркнутыми участками последовательности вырожденного праймера:

- 148 029538

СССАССААССАКСАКСШССССТТСССССССАСТХАССССТТСС/ХАССТССССТСАТСС

СССТАССТССССССАССССССАТСААСТССАССАСССССТССССТАСААССТССАССАССТСА

ТССССАСССТССАСАСССССААССССАТСССССАСАТСССССАСССССАТСАСАССААСАТСС

СССТССАСАТСССССТСААСТССССССССАТСАСССССААССССАТССАТСТСССССАССАСС

АТСССААСССССАТССССТССССАТССТСААССТСААССССАТСАССССССТССССАТСАТСА

СССАС Т ТСССССТССАССАСАААСАССАССТСААСС ТССССС ТСССССАСТ ТСААСС ТССАС Т

АССАСТССС ТСАТССАСССССССААСС ТССАТСССАССААСС ТСАССАТССАСССССССААС Т

ССТТССССАСССТССААСТАССССААСССТАСТТТСАСАТССТСССССССССССССАТСАТСТ

АТССССАСАССАТТСССТССТАСАСССАСТАСААСААССТСАТССССТТСААСАСССАССТСС

СС ТСССТСААССАС ТАССССССССССААСАСССТСССС ТАТСАССССАСС Т ТСАССС ТСААСС

СССАСТСССТССТССССААССТССССАТССССТАСТСССАССССТАССССССССССАТСАССА

АСААССССТАТСТССТСАТСМА5ССССА ^Ер ГО NΟ:414), где К означает А или Ο, δ означает С или Ο, и М означает А или С.

Аминокислотная последовательность неполного фермента ВАК А. сахчае представлена в качестве δΙΎ/ ГО ^:415, ниже

АЗЫЕЕАКУАКЕКСЕЕСКЬМКУКААТРСЕУЕОАЪРУКЬЕЕЬ1СЗЬЕ5АКС1ΑϋΙАОКНН ΤΝΙ ΡνΗΙΟΕΝ5ΑΟΜ5ΚΝΟΙϋΕΚ0ϋΌΑΚΑΡΑΙΕ\ΜΕΚΕΚΟΙ ТРУСЛМТНЕРУЕЕКЕШКЬОЕАОЕ КЬРУСЦЫ РАСКЬРКЗКЕТIΗΑΑΝ5 ЕАТЬЕУРЕАУЕРМУКРСС11УСРТIР8 Υ ТЕ ΥΚΚΛ/ΜΑΕΚ Τ(2νΑ8νΝΗΥΡΑ0ΝΤν0ΥϋΚΤЕТЬККРЗΣΏΑΝΕΡΜΟΥδΡΟΥΚΚΑΜδΝΚΑΥνΕIХС, где X представляет собой Н, (9, Ν или К ^Ер ГО NΟ:415).

Консенсусный белковый фрагмент последовательности δΕ^ ГО NΟ:415, представленной выше, на

89% гомологичен на аминокислотном уровне опубликованной последовательности ТЮК для А. НуйгорЫ1а. Ожидалось, что вследствие того, что близкородственный белок Аеготопа8 НуйгорНИа проявляет активность рацемазы с широкой специфичностью, также как клеточные экстракты А. сахаае, полноразмерный кодирующий участок А. сахаае после получения приведет к рацемазе, которая также может обладать активностью с широкой специфичностью в отношении триптофана. Способы прогулки по геному использовали для получения полноразмерной последовательности гена ВАК А. сахаае, представленной ниже в качестве δΕ^ ГО NΟ:416.

аРдсасаада ааасасРдсР сдсдасссРд	аРсРРРддсс	РдсРддссдд
ссаддсадРс	дссдсссссР	аРсРдссдсР	сдссдасдас	сассдсаасд
дРсаддааса	дассдссдсс	аасдссРддс	РддаадРдда	РсРсддсдсс
РРсдадсаса	асаРссадас	ссРдаадааР	сдссРсддРд	асаадддссс
дсадаРсРдс	дссаРсаРда	аддсддасдс	сРасддРсас	ддсаРсдасс
РдсРддРссс	РРссдРддРс	ааддсаддса	РссссРдсаР	сддсаРсдсс

- 149 029538

адсаасдаад	аадсасдкдк	кдсссдсдад	аадддскксд	ааддксдсск
дакдсдддка	сдкдссдсса	ссссддакда	адкддадсад	дссскдссск
асаадскдда	ддадсксакс	ддсадсскдд	ададсдссаа	ддддаксдсс
дасаксдссс	адсдссакса	сассаасакс	ссддкдсаса	ксддсскдаа
скссдссддс	акдадссдса	асддсаксда	кскдсдссад	дасдакдсса
аддссдакдс	сскддссакд	сксаадскса	аддддаксас	сссддксддс
аксакдассс	аскксссддк	ддаддадааа	даддасдкса	адскддддск
ддсссадккс	аадскддаск	ассадкддск	саксдасдсс	ддсаадскдд
аксдсадсаа	дсксассакс	сасдссдсса	асксскксдс	сассскддаа
дкассддаад	сскаскккда	сакддкдсдс	ссдддсддса	ксакскакдд
сдасассакк	сссксскаса	ссдадкасаа	дааддкдакд	дсдкксаада
сссаддксдс	скссдксаас	саскасссдд	сдддсаасас	сдксддскак
дассдсасск	ксасссксаа	дсдсдасксс	скдскддсса	асскдссдак
дддскасксс	дасддскасс	дссдсдссак	дадсаасаад	дсскакдкдс
кдакссакдд	ссадааддсс	сссдксдкдд	дсаадасккс	сакдаасасс
ассакддкдд	асдксассда	саксаадддд	аксааасссд	дкдасдаддк
ддксскдккс	ддасдссадд	дкдакдссда	ддкдааасаа	кскдакскдд
аддадкасаа	сддкдссскс	ккддсддаса	кдкасассдк	скддддскак

ассаасссса адаадаксаа дсдскаа (5Е<2 ΙΌ N0:416).

Соответствующая аминокислотная последовательность для нативной ВАР А. са\аае представлена ниже в качестве 8К(0 П) ^:417:

тЬккк11ак1 ^Γд11ад^аν аару1р1ас!с1 Ьгпддедкаа 41 η3Μΐβνά1ρ3 кекп1дк1кп г1дс!кдрд1с а1ткас!ауд]а 81 ρίά11νρ3νν кад1рс1д1а зпееага/аге кдГедг1тга/

121 гаакрсЬ^ед а1рук1ееИ дз1езакд1а сИадгЫакп1

161 ρν]а^д1ηзад тзгпд1с!1гд с!с1акас1а1ат 1к1кд^кρνд

201 ^тк]акρνеек ескк1д1адк кШудтуИка дк1ПгзкШ

241 Ьаапзкак1е νρθ3ρίάπινΓ рддИудскЫ рзукеук^т

281 3ΐΑ1^ν33νη Ьурадп'Аду с!гккк1кгс1з 11ап1ртдуз

321 Цдуггатзпк ауν1^]ад^ка ρννдккзтηк кпгескксНкд

361 ^кρдс^еνν1к д^^дс^аеνк^ зс!1ееупда1 1ас1туАмду

401 кпркк1кг (ЗЕО ΙΌ N0:417).

С использованием программы 81два1 Р 3.0 (иии.сЬκ.ά!и.Пк/κе^ν^сеκ/8^дηа1Р/) предсказано, что первые 21 Х-концевых аминокислотных остатков 8К(0 П) ХО:417 представляют собой сигнальный пептид. Экспериментальные данные подтвердили, что продукт экспрессии секретировался в периплазму Е. χο1ι, и сигнальный пептид отщеплялся, как и было предсказано. Было выявлено, что полноразмерный ген, при клонировании и экспрессии с использованием способов, описанных выше, обладает активностью, сравнимой с активностью ВАР Р. но превышающей ее.

Пример 31. Получение альдолазы 8К(0 П) ХО:276 в альтернативном экспрессирующем хозяине.

Ген 8К(0 П) ХО:275 субклонировали с использованием стандартных способов молекулярной биологии в производное вектора рЕТ23П (Νονадеη, Маά^кοη, ΑΙ), содержащее ген те!Е Е. χο1ι и промотор, встроенный в участке рестрикции и втором участке рестрикции ркП, который добавляли для облегчения удаления гена бета-лактамазы (Ь1а). Конструкция этого вектора, содержащего вставку для гена миоинозитолоксигеназы описана в РСТ АО 2006066072 в примерах 2 и 20. Вставку альдолазы подтверждали секвенированием ДНК (/Αχ'ηχοιιιΊ Вюкпевсе Сο^ρο^а!^οη; Вегегк, МА), и плазмиду с правильной последовательностью вставки трансформировали в экспрессирующего хозяина Е. χο1ι ΒА30384(^Ε3)ΔοтρТΔте!Ε. Конструкция этого экспрессирующего хозяина и протокол трансформации также описаны в РСТ АО 2006066072 (примеры 21 и 22). Ген альдолазы эспрессировали с использовани- 150 029538 ем системы для экспрессии Ко'адеи ОмепнЕц Ехргекк™ АиГотДисЕои Зук!ет II (Ко'адеи, МаШкои, VI), содержащей 100 мг/л ампициллина. Эта система была описана в примере 24 для экспрессии Όаланинаминотрансферазы Васл11ик крйаепсик (штамм АТСС 10208). Бесклеточные экстракты, содержащие альдолазу, получали с использованием реагента для экстракции Ко'адеи ВицВиДег ЕхГгасЕои Кеадеи! (не содержащего первичные амины) (Ко'адеи, МаШкои, VI), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы, 0,033 мкл/мл г-куко/уте и 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго!еаке НДнЬоог СоскЦн1 Зе! II в соответствии с рекомендованным изготовителем протоколом лизиса клеток. Растворимые белки в бесклеточных экстрактах разделяли на Вю-КаД БаЬогаГопек Ехрепои АиГотаГеД Е1ес1горйоге§18 ЗиФои (Вю-КаД, Негси1е§, СА) и анализировали в отношении процентной экспрессии растворимых белков с использованием программного обеспечения Ехрепои Зойшаге версии 1.1.98.0, как описано в примере 12.

В целях повышения экспрессии альдолазы в Е. сой, со второго по седьмой кодоны кодирующей последовательности ДНК подвергали мутагенезу с заменами, предложенными, исходя из анализа последовательности дикого типа с использованием алгоритма Косйе Рго1еоЕхрег1 КТЗ Е. сой НУ. Замены проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ЦшкСйаидеВ® Ми1й З0е-[)п'ес1еД Ми1а§еие818 Ко или ЦшкСйаидеВ® II ХЬ ЗПе-[)п'ес1еД Ми1а§еие818 Ко (Зйа1а§еие, Ба До11а, СА) в соответствии с предложенным изготовителем протоколом с 0,75 мкл раствора Цшк Зо1ийои на 25 мкл реакционной смеси и трансформации в компетентные с помощью ультрафиолета клетки ХБ10-Оо1ДВ®. Мутации проводили с использованием праймеров (каждый длиной 45 нуклеотидов), сконструированных с помощью шеЬ-программы Зйа1а§еие ЦшкСйаидеВ® Рптег Όοίΰΐι Ргодгатт, доступной он-лайн на шшш.кйаГадеие.сот.дсрптегДекхди.

Таблица 48

	Кодон 1	Кодон 2	Кодон 3	Кодон 4	Кодон 5	Кодон 6	Кодон 7
Дикий тип	АТС	ССТ	АТС	СТТ	СТТ	АСС	ААС
РгсИсоЕхрсП #1	АТС	ССА	АТТ	СТТ	СТА	АСТ	ААА
Рто1еоЕхреП #2	АТС	ССА	АТТ	СТТ	СТТ	АСТ	ААА
Рго1соЕхрсП #6	АТС	ССА	АТТ	СТТ	СТА	АСС	ААА
Рго1соЕхрсП #10	АТС	ССА	АТТ	СТТ	СТТ	АСС	ААА

Последовательности гена альдолазы с указанными выше заменами кодонов трансформировали в экспрессирующего хозяина Е. сой ВV30384(^Е3)ΔοтрТΔтеίЕ, а затем экспрессировали с использованием Ко'адеи Оменнфц Ехргекк™ АШотДисйои ЗукГет II (Ко'адеи, Масйкои, VI). Ни одна из этих мутаций не привела к более высоким уровням экспрессии гена по сравнению с последовательностью дикого типа. Типичные результаты из бесклеточных экстрактов, анализированные посредством программного обеспечения Вю-КаД Ехрепои Рго260 1.1.98.0, представлены в табл. 49 ниже, в которой в столбце под названием Экспрессия белка показаны значения для % тотального растворимого белка.

Бесклеточные экстракты (0,025 мг/мл растворимого белка на анализ) анализировали в отношении их способности образовывать К,К-монатин из 200 мМ пирувата натрия и 100 мМ Ό-триптофана с использованием протокола, описанного в примере 7. Реакции (общим объемом 7 мл) проводили в 14-мл пробирках из полипропилена в анаэробном перчаточном боксе с использованием очищенной Όаминотрансферазы В. крйаепсик (АТСС 10208) в конечной концентрации 2 мг/мл. Концентрации монатина, образованного через 1, 4 и 20 ч после добавления ферментов, представлены в табл. 49 ниже. В табл. 49 показано, что бесклеточный экстракт, образованный посредством конструкции, содержащей последовательность альдолазы дикого типа, приводил к немного более высокой концентрации монатина через 20 ч, чем бесклеточные экстракты, полученные с помощью конструкций, несущих мутации Рго1еоЕхрег1. Концентрации монатина определяли способом БС/МЗ/МЗ, описанным в примере 1.

Таблица 49

	Экспрессия белка (%)	[Монатин] мМ-Ι ч	[Монатин] мМ -1 ч	[Монатин] мМ - 20 ч
Дикого типа	22	2,1	4,2	13,4
Рго1еоЕхреП #1	18	1,3	3,1	12,4
Рго1еоЕхреН #2	18	2,1	4,7	11,6
Рго1еоЕхрей #6	18	1,4	1,9	12,4
Рго1еоЕхрей #10	20	1,8	1,8	Н,7

Эти данные демонстрируют, что альдолазу ЗЕЦ ГО КО:276 можно получать в альтернативном экспрессирующем хозяине без индукции посредством ГОТО.

Ген Ь1а удаляли из вектора, и последующую ферментацию для получения альдолазы проводили без применения антибиотика, как описано в РСТ VО 2006066072 в отношении другого фермента. Уровни экспрессии при периодической ферментации с подпиткой при 30°С достигали максимума через 6-8 ч после индукции, с образованием альдолазы ЗЕЦ ГО КО:276 в количестве 25-30% от растворимого белка, в соответствии с данными Ехрепои. Исследования стабильности показали отсутствие заметного сниже- 151 029538 ния активности альдолазы, когда продукт ферментации оставляли в течение 6 часов при 15 или 30°С (как в условиях ограничения кислорода, так и в условиях аэрации) перед концентрированием и разрушением клеток. Было выявлено, что альдолаза была одинаково стабильной при хранении либо в качестве бесклеточного экстракта, либо в качестве клеточного осадка при хранении в течение 5 суток при -80°С. Промывание клеточного осадка в буфере перед хранением при -80°С не было необходимым и в действительности вызывало небольшое снижение активности. Было выявлено, что клетки, ресуспендированные в дистиллированной воде, супернатанте после ферментации или 100 мМ фосфатно-калиевом буфере (рН 7,8), не обладают сниженной активностью или концентрацией белка (исходя из 8Э8-РАСЕ) при хранении в течение 11 суток при комнатной температуре или 4°С. Бесклеточный экстракт, полученный в фосфатнокалиевом буфере, показал отсутствие снижения активности альдолазы при хранении при 4°С или комнатной температуре в течение 5 суток. Клетки можно разрушать в фосфатном буфере, вплоть до 25% культуральном супернатанте или воде с получением сравнимой активности альдолазы; однако было выявлено, что добавление 1 мМ МдС12 в воду немного повышает активность альдолазы. Эти данные показывают, что белок альдолаза является достаточно стабильным для коммерческого применения.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Вигке, Е11еп

Няскз, Раи1а М. Ьид1пЬиЫ, РеЕег К1скагДзоп, Току Иеяпег, Όανίά. ΖΕαο, Ь1зкап <120> ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ АЛЬДОЛАЗЫ, ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРУЮЩИЙ ЭТОТ ПОЛИПЕПТИД, И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДА И ПОЛИПЕПТИДА

<130> Б1710-6ИО <140> РСТ/и307/63515 <141> 2007-03-07 <150> 60/780,515 <151> 2006-03-07 <160> 417 <170> РаЕепЕ1п 3.1 <210> 1 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220> <223> Бактериальная ДНК
<400> 1 аЕдсадссдс	ЕдааддааЕЕ	сдссдадсЕс
сддсЕсдддд	аассссЕдсд	сдЕсдсдссс
сдсдЕсдссд	дссдддсссЕ	дсссдЕасдд
дсдЕЕсддсд	аддссдадсс	сддЕдасдЕс
даддссЕдса	ЕсддсдассЕ	сдссдЕссЕд
дЕсдЕдЕддд	дссЕдсассд	ддасассссс

Ессассссдс	ЕдаЕсдссда	сдссЕдсдЕд	60
дссддсаЕсс	ЕдсссдЕсдЕ	сдсдддссдд	120
сасЕасддса	дсдЕсдасдЕ	сЕЕссЕддад	180
сЕсдЕсаЕсд	асаасдсддд	ссдсдЕсдас	240
даддсддсдд	сддссддсаЕ	сдссддддЕс	300
дассЕсдЕсд	адаЕсдддсЕ	дсссдЕсЕЕс	360

- 152 029538

бссбасддас	дссасдсдсс	сддссссдбд	сдсдбсдасс	сссдддассс	ддасдсдсбд	420
асдассдсдс	ддббсддсда	дсасдаддбд	ассдссдссд	асдбсдбдбб	сддсдасдас	480
дасддсдбдд	бсббсдбсдс	сдссдсссдд	дссддсдссд	бссбддаддс	ддсссдддсс	540
сбдббссдба	сддадсдсда	дсаддсдсдд	сддабсаддд	сдддддадас	дсбдсдсдсс	600
садасссддб	бсдасдсдба	ссбддсдддс	сдддссдадд	ассссбсдба	сассббссдд	660
садсассбдс	дссддабсдд	сддсдсдабс	даддадбда			699

<210> 2 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Бактериальный белок <220>

<221> ДОМЕН <222> (8)...(165) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 2

Меб 1

О1п Рго

Ьеи

Ьуз 5

О1и

РЬе

А1а

О1и

Ьеи 10

Бег

ТЬг

Рго

Ьеи

11е 15

А1а

Азр

А1а

Суз

Уа1

Агд

Ьеи

О1у

О1и

Рго

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

Рго

А1а

О1у

20

25

30

11е

Ьеи

Рго

Уа1

Уа1

А1а

О1у

Агд

Агд

Уа1

А1а

О1у

Агд

А1а

Ьеи

Рго

35

40

45

Уа1

Агд

НФз

Туг

О1у

Бег

Уа1

Азр

Уа1

РЬе

Ьеи

О1и

А1а

РЬе

О1у

О1и

50

55

60

А1а

О1и

Рго

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

11е

Азр

Азп

А1а

О1у

Агд

Уа1

Азр

65

70

75

80

О1и

А1а

Суз

11е

О1у

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Ьеи

О1и

А1а

А1а

А1а

А1а

О1у

85

90

95

11е

А1а

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Тгр

О1у

Ьеи

НФз

Агд

Азр

ТЬг

Рго

Азр

Ьеи

100

105

110

Уа1

О1и

11е

О1у

Ьеи

Рго

Уа1

РЬе

Бег

Туг

О1у

Агд

НФз

А1а

Рго

О1у

115

120

125

Рго

Уа1

Агд

Уа1

Азр

Рго

Агд

Азр

Рго

Азр

А1а

Ьеи

ТЬг

ТЬг

А1а

Агд

130

135

140

РЬе

О1у

О1и

НФз

О1и

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

Уа1

Уа1

РЬе

О1у

Азр

Азр

145

150

155

160

Азр

О1у

Уа1

Уа1

РЬе

Уа1

А1а

А1а

А1а

Агд

А1а

О1у

А1а

Уа1

Ьеи

О1и

165

170

175

А1а

А1а

Агд

А1а

Ьеи

РЬе

Агд

ТЬг

О1и

Агд

О1и

О1п

А1а

Агд

Агд

11е

180

185

190

- 153

Агд А1а О1у

О1и ТЬг Ьеи Агд А1а О1п ТЬг 200

Агд

РЬе

Азр 205

А1а

Туг

Ьеи

195

А1а

О1у

Агд

А1а

О1и

Азр

Рго

Бег

Туг

ТЬг

РЬе

Агд

О1п

Нбз

Ьеи

Агд

210

215

220

Агд

11е

О1у

О1у

А1а

11е

О1и

О1и

225 230 <210> 3 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 3 дбдассддсс сбсдссдсдс ассдссаббс бсссадссдд абссбсдбдд асдбсдсбдс дсссадсбсс дбсааддсда сссддсдабд ссддсддбдс сбсдссддбд ддадбддадб асдбсабсдб бсддсдбсбс дассдабсса дсдасаасдб бсассассас дсдсдсасдд дддсдабдаа дсссдддсбс ссабсдбсдс бддсддссдд дсдаасбсбс асдбсдассд ссдсдадабс дасддбдсас садбддаббс сабдабссас сбсдссдбсс ддбдсддддб сббсссддбд ддбдаасаба сдасдасдас ссдддсдсдд ддбсдасабд дсддссддсд дассдсдссд даддссдасд асдабсдссд дссдссаббд ассдасддда дбсдбсассд бддасдсдсд ссддбсдбсб ддсдббдбсд дссдададсд басдддсбдс бда асдсдаасдс дссдссдсдд дббсддсддб аддбдбдссд бдабсддсда абдссддсдб ссабсадбсс дсдссддсса бсдбсссдсд аддасдасаа дсдадсбдсб ссбсдасддс сдсдсбсдсс дасддбсбсс дсссддсдас асбдсбддсд асдсдасдбс асаддддасд ддбсдбссас сдассдддбд асдсдбссдд сасссдасбс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

693 <210> 4 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (28)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 4

Меб ТЬг

О1у

Нбз

Уа1

11е

Уа1

Агд

О1и

11е

Азр

Агд

А1а

Азр

А1а

Азп

1

5

10

15

А1а Ьеи

Азр

О1у

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а

20

25

30

- 154 029538

Азр

О1у

Агд 35

Агд О1у А1а

Ьеи

А1а 40

ТЬг

А1а

11е

Агд

Рго 45

11е

ΗΪ8

Зег

О1у

РЬе

ТЬг

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

О1п

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Уа1

Меб

11е

Ηΐ3

А1а

А1а

11е

О1и

Уа1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Зег

Рго

Зег

ТЬг

Азр

О1у

Меб

11е

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Ηΐ3

О1у

Уа1

Агд

О1у

Уа1

Уа1

100

105

110

ТЬг

Азр

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

О1п

Ьеи

Агд

А1а

Меб

Азп

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

ТЬг

Агд

А1а

11е

Зег

Рго

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

Зег

130

135

140

Рго

О1у

Зег

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

О1п

Уа1

Уа1

ΗΪ8

145

150

155

160

Рго

О1у

Азр

А1а

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

165

170

175

Агд

Азр

Агд

Уа1

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

О1у

Агд

А1а

Агд

А1а

О1и

180

185

190

Зег

О1и

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Ьеи

А1а

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Зег

Уа1

195

200

205

Азр

Меб

Туг

О1у

Ьеи

Агд

О1и

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Агд

Ьеи

О1у

Уа1

О1и

Туг

210

215

220

Уа1

Азр

Агд

Агд

Рго

А1а

225 230

<210> 5 <211> 762 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 5 абддсдббда	абассддббс	сдасаббабб
ааадсбсббд	дсадбдсдас	сабсдсдддс
сасабдасдд	дсабссбдсс	асадасддсд
сбдсадбдса	бдссдсадсд	ассддассбд
асдсадсбсс	ассдссабдб	дсбсбабсас
дсдсдсддсд	абабдаадбс	дддсабсббс
сдсддсддсд	ссддсабсдб	сабсдасддс

из окружающей среды

сдсссдбсса	аддадсбсдб	бдссдддсбс	60
асдсбсддсс	асабддддбб	саадаасссд	120
ддсааддбса	бддссддссс	ддсдсбдасд	180
ббсадсдаад	дсдаабасдс	сдабссбдаа	240
дбдсаддадд	дсдасдбддб	сдбсдбсдаб	300
ддсдасабда	бдбсдассба	сббсаадддс	360
бдсабдсдсд	абсдбсссаа	бдбсдаааад	420

- 155 029538

сбсдассбдб	сдсбсбддсб	саадддсбдд	асдссдаасб	ассасдбсса	дассдасабс	480
бббсссбасд	сддбдаасдб	бссадбсдса	бдбддсддсд	ббсббдбдсб	ссссддсдас	540
абсабсдббд	ссдабдасда	сддсдсбдбс	дбсдбдссдд	бдаадабддс	дсадсасабс	600
дбсдаддасд	дсаадаадса	сдссдадбдд	даадбдббсб	сдсдсдадаа	дсбдабддсс	660
ддсдадбсдс	бссдссдбба	сбасссдсбд	сассссдабд	ссдаддасда	абассаддсс	720
бддсддаадд	сдааддддсб	дссдссдбсд	сссбсдсдсб	аа		762

<210> 6 <211> 253 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(191) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 6

Бег

Ьуз

О1и 15

Ьеи

Меб 1

А1а Ьеи Азп ТЬг О1у Бег Азр 5

11е

11е 10

Агд

Рго

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьеи

О1у

Бег

А1а

ТЬг

11е

А1а

О1у

ТЬг

Ьеи

20

25

30

О1у

НФз

Меб

О1у

РЬе

Ьуз

Азп

Рго

НФз

Меб

ТЬг

О1у

11е

Ьеи

Рго

О1п

35

40

45

ТЬг

А1а

О1у

Ьуз

Уа1

Меб

А1а

О1у

Рго

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

О1п

Суз

Меб

50

55

60

Рго

О1п

Агд

Рго

Азр

Ьеи

РЬе

Бег

О1и

О1у

О1и

Туг

А1а

Азр

Рго

О1и

65

70

75

80

ТЬг

О1п

Ьеи

НФз

Агд

НФз

Уа1

Ьеи

Туг

НФз

Уа1

О1п

О1и

О1у

Азр

Уа1

85

90

95

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

А1а

Агд

О1у

Азр

Меб

Ьуз

Бег

О1у

11е

РЬе

О1у

Азр

100

105

110

Меб

Меб

Бег

ТЬг

Туг

РЬе

Ьуз

О1у

Агд

О1у

О1у

А1а

О1у

11е

Уа1

11е

115

120

125

Азр

О1у

Суз

Меб

Агд

Азр

Агд

Рго

Азп

Уа1

О1и

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьеи

Бег

130

135

140

Ьеи

Тгр

Ьеи

Ьуз

О1у

Тгр

ТЬг

Рго

Азп

Туг

НФз

Уа1

О1п

ТЬг

Азр

11е

145

150

155

160

РЬе

Рго

Туг

А1а

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

А1а

Суз

О1у

О1у

Уа1

Ьеи

Уа1

165

170

175

Ьеи

Рго

О1у

Азр

11е

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

А1а

Уа1

Уа1

Уа1

180

185

190

- 156

Рго Уа1

Ьуз 195

Меб А1а О1п

НФз

11е 200

Уа1

О1и

Азр

О1у

Ьуз 205

Ьуз

НФз

А1а

О1и

Тгр

О1и

Уа1

РЬе

Бег

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

Меб

А1а

О1у

О1и

Бег

Ьеи

210

215

220

Агд

Агд

Туг

Туг

Рго

Ьеи

НФз

Рго

Азр

А1а

О1и

Азр

О1и

Туг

О1п

А1а

225

230

235

240

Тгр

Агд

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Рго

Рго

Бег

Рго

Бег

Агд

245 250 <210> 7 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 7 абдадбдбад	бддбдсаааа	бабсдадсдд	дсадабсадд	сааббабсаа	ддсдсббдсб	60
даабдсддбд	бадсаасбдб	дсабдаддсс	сааддссдса	сддддббдсб	ддсббсббаб	120
абдсддссаа	бббабадсдд	бдсббдсабб	ддбдсабсад	сддбаассаб	бсбддсбссд	180
ссббдсдаба	асбддабддб	ссабдбддсс	аббдадсада	бааадссддд	бдабдсбсбд	240
дббабддсаа	саасабсдбс	абсбдабдсс	ддабаббббд	дбдассбдсб	ддсдассбсд	300
абдсаддсдс	дбддсддддб	бддсабдабб	абсдабдссд	дддбдсдсда	баббааадас	360
сбдассдада	бдааабдбсс	бдбсбддбса	ааадсдабсб	дсдсбдаадд	дасддбдааа	420
дааасасббд	дсбсбдбааа	баббссддбд	дбббдсдссд	дссадббддб	саассссддс	480
дабаббдбса	бсдсбдабда	бдабддддбс	бдбдбсдббд	адсдсдааад	ддсбддсдаа	540
дббсбддааа	аадсдсаадс	ссдсабддсб	ббддаадаад	асааасдбаа	асдбббддсс	600
бссддбдаас	ббдддсбдда	бабдбабааб	абдсдсдадс	дбсбддсбда	ааааддбсбс	660
ааабабдббб	аа					672
<210> 8 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 8

Меб Бег Уа1 Уа1 Уа1 О1п Азп 11е О1и Агд А1а Азр О1п А1а 11е 11е 1 5 10 15

- 157 029538

Ьуз

А1а

Ьеи

А1а 20

О1и

Суз

С1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

ТЬг

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг 40

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг 45

Зег

О1у

А1а

Суз

11е 50

О1у

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Ьеи

А1а

Рго 60

Рго

Суз

Азр

Азп

Тгр 65

МеЕ

Уа1

Н1з

Уа1

А1а 70

11е

О1и

О1п

11е

Ьуз 75

Рго

О1у

Азр

А1а

Ьеи 80

ναι

МеЕ

А1а

ТЬг

ТЬг 85

Зег

Зег

Зег

Азр

А1а 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег 100

МеЕ

О1п

А1а

Агд

С1у 105

О1у

Уа1

О1у

МеЕ

11е 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

11е

Ьуз

Азр 120

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Ьуз 125

Суз

Рго

Уа1

Тгр

Зег 130

Ьуз

А1а

11е

Суз

А1а 135

О1и

С1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Зег 145

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

О1п 155

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

11е

Уа1

11е

А1а 165

Азр

Азр

Азр

С1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

О1и

Агд 175

О1и

Агд

А1а

О1у

О1и 180

Уа1

Ьеи

О1и

Ьуз

А1а 185

О1п

А1а

Агд

МеЕ

А1а 190

Ьеи

О1и

О1и

Азр

Ьуз 195

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а 200

Зег

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

МеЕ

Туг

Азп

МеЕ

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215

220

<210> 9 <211> 552 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 9 аЕдаасддда	ссдЕсдЕдсд	саасаЕссаЕ
дддсдсаЕсд	дсдЕсЕсдас	сдЕссасдад
ЕасаЕдсддс	ссдЕаЕддсд	дддсдсдсдс
саЕсссаасд	асаасЕддаЕ	даЕссасдЕс
сЕсдЕддЕдд	сЕЕдсЕсдад	сдадаасасд
ЕсдсЕсаЕдд	сдсдсддсдЕ	даааддсдсд
дадсЕсдадс	адаЕдаддЕЕ	ЕссдсЕсЕдд

из окружающей среды

сдсдссдадд	сдддддссаЕ	сдсддсдсЕс	60
дсдсаддддс	дсассдддсЕ	саЕдсаддсс	120
аЕсдссддса	дсдссдЕдас	сдЕссЕдЕдс	180
дсдаЕддадд	Еддсааддсс	сддсдасдЕд	240
аасддсдсда	ЕсддсдассЕ	даЕсдссасс	300
аЕссЕсдаса	ЕдддсЕдссд	сдасдЕдсЕд	360
Есдсдддсса	ЕсЕсддсдса	дддаассаЕс	420

- 158 029538

аадддсасдс	бсддсбсддб	саасббсссд	дбсассбдсд	ссддсдссса	сдбсаддссд	480
ддсдасабсд	бддбсдсдда	сдасдасддс	дбддбддбсд	бдссссдсса	ддасдсддсд	540
ааадбдабсс	аа					552

<210> 10 <211> 184 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (2)...(5) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозаФб ίά. = РБ00001 <400> 10

Меб 1

Азп О1у ТНг

Уа1 5

Уа1

Агд Азп

11е

НФз 10

Агд А1а

О1и

А1а

О1у 15

А1а

11е

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Агд

11е

О1у

Уа1

Бег

ТНг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

Агд

ТНг

О1у

Ьеи

Меб

О1п

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго

Уа1

Тгр

Агд

О1у

35

40

45

А1а

Агд

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТНг

Уа1

Ьеи

Суз

НФз

Рго

Азп

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Меб

О1и

Уа1

А1а

Агд

Рго

О1у

Азр

Уа1

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Суз

Бег

Бег

О1и

Азп

ТНг

Азп

О1у

А1а

11е

О1у

Азр

85

90

95

Ьеи

11е

А1а

ТНг

Бег

Ьеи

Меб

А1а

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

А1а

11е

Ьеи

100

105

110

Азр

Меб

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Ьеи

О1и

Ьеи

О1и

О1п

Меб

Агд

РНе

Рго

115

120

125

Ьеи

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТНг

11е

Ьуз

О1у

ТНг

Ьеи

130

135

140

О1у

Бег

Уа1

Азп

РНе

Рго

Уа1

ТНг

Суз

А1а

О1у

А1а

НФз

Уа1

Агд

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

11е

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

Агд

165

170

175

О1п

Азр

А1а

А1а

Ьуз

Уа1

11е

О1п

180

- 159

<210> 11
<211> 645 <212> ДНК <213> Неизвестно <220> <223> ДНК, полученная <400> 11	из образца	из окружающей среды
аЕддаЕссад	дддЕсаЕсад	дсдЕсЕдддд	дадсЕдддсд	ЕЕдсдассдЕ	Есасдаддсд	60
сЕсддссдсс	адддссЕЕсЕ	сдаЕсссдЕс	дЕдсдсссда	ЕсЕассссдд	сдсдсдддсд	120
дссддаассд	ссдЕаасддЕ	дЕдсЕдЕссд	дссддддаса	ассЕдаЕдаЕ	ссаЕдсддсд	180
сЕссаддЕсд	Еддсдсдсдд	сдасдЕдсЕс	дЕсдЕсасда	ссдадссдсс	дЕсдасдЕас	240
ддсаЕдЕЕсд	дсдасдЕдсЕ	ддддасдЕсд	Едссаддсдс	ЕсддддЕсдс	ддддсЕсдЕс	300
аЕсдасдссд	дсаЕссдЕда	сасддаддад	сЕсдадсдда	ЕддсдЕЕЕсс	сдссЕдддсд	360
сдсдсдасдЕ	сддсдсаддд	сасддЕдааа	дЕддсЕссдд	дсаЕсдЕсаа	сдсдссдаЕЕ	420
дЕдЕдсдсдд	дсдсддасдЕ	ЕсдЕссдддс	дасдЕЕдЕсд	ЕддсддаЕсд	сдасддсдЕс	480
дЕсаЕсдЕсс	сдсдсдадсд	ддсЕдссдаа	дсддсддадс	ЕЕддЕдадса	дсддсдсдаЕ	540
сдсдадаЕсд	ааЕассдссд	дсддсЕддса	ддЕддададс	ЕдасссЕдда	сдЕдсЕсдас	600
сЕссддсдса сссЕдсддда <210> 12 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно	даЕсдддаЕд	дасаддсЕдд	асЕда		645

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (10)...(162) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 12

МеЕ 1

Азр

Рго

О1у Уа1 5

11е Агд Агд Ьеи О1у О1и Ьеи О1у Уа1 10

А1а 15

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

Ьеи

О1у

Агд

С1п

О1у

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Уа1

Уа1

Агд

20

25

30

Рго

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

Агд

А1а

А1а

О1у

ТЬг

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Суз

35

40

45

Суз

Рго

А1а

О1у

Азр

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз

А1а

А1а

Ьеи

О1п

Уа1

Уа1

50

55

60

А1а

Агд

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

ТЬг

ТЬг

О1и

Рго

Рго

Зег

ТЬг

Туг

65

70

75

80

О1у

МеЕ

РЬе

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

О1у

ТЬг

Зег

Суз

О1п

А1а

Ьеи

О1у

Уа1

90 95

- 160 029538

А1а

О1у

Ьеи

Уа1 100

11е

Азр А1а О1у

11е 105

Агд Азр

ТЬг О1и О1и Ьеи О1и 110

Агд

Меб

А1а

РЬе

Рго

А1а

Тгр

А1а

Агд

А1а

ТЬг

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

115

120

125

Уа1

Ьуз

Уа1

А1а

Рго

О1у

11е

Уа1

Азп

А1а

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

130

135

140

А1а

Азр

Уа1

Агд

Рго

О1у

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Агд

Азр

О1у

Уа1

145

150

155

160

Уа1

11е

Уа1

Рго

Агд

О1и

Агд

А1а

А1а

О1и

А1а

А1а

О1и

Ьеи

О1у

О1и

165

170

175

О1п

Агд

Агд

Азр

Агд

О1и

11е

О1и

Туг

Агд

Агд

Агд

Ьеи

А1а

О1у

О1у

180

185

190

О1и

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Азр

Уа1

Ьеи

Азр

Ьеи

Агд

Агд

ТЬг

Ьеи

Агд

О1и

11е

195

200

205

О1у

Меб

Азр

Агд

Ьеи

Азр

210 <210> 13 <211> 498 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 13

абддсдассд	дддадбасда	сдсабдддсс	ддсбссбддб	асбсдаадсб	сбсдссддад	60
ссдббсабдд	абсбсаббсд	бсссддсасб	дсссбддбда	бсдасдабдс	дсссдсадсд	120
дабдбсддсб	ссабсдддбс	даасаасабс	сбссаабдда	адасдсдбдд	дабддбддсд	180
дбсдбдасда	асдсдасддс	дсдддасасс	дасдааабсд	ббдбсдадсд	сдбдссдсбс	240
бабббссддс	адссбддссд	сддсабссдб	ссдддссдса	абдадабсда	абсддбсаас	300
сдбсссдбдд	бсдбдддсдд	ддбдсбсдбд	абдсссддсд	асдбсабсдб	сддадасддс	360
дасддсдбдд	ббдбсдбссс	асдсдсдсад	дссдаддссд	бддсдсдаба	бдсбсасасд	420
абссбсдада	аддасасдда	аддасдбсдд	сддсбсбасс	адсадсбдаа	дсббссаасс	480
даббсдасдд	бссддбад					498

<210> 14 <211> 165 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <400> 14

- 161 029538

Меб 1

А1а ТЬг О1у О1и Туг Азр А1а Тгр А1а О1у Зег Тгр

Туг

Зег 15

Ьуз

5

10

Ьеи

Зег

Рго

О1и

Рго

РЬе

Меб

Азр

Ьеи

11е

Агд

Рго

О1у

ТЬг

А1а

Ьеи

20

25

30

Ча1

11е

Азр

Азр

А1а

Рго

А1а

А1а

Азр

Ча1

О1у

Зег

11е

О1у

Зег

Азп

35

40

45

Азп

11е

Ьеи

О1п

Тгр

Ьуз

ТЬг

Агд

О1у

Меб

Ча1

А1а

Ча1

Ча1

ТЬг

Азп

50

55

60

А1а

ТЬг

А1а

Агд

Азр

ТЬг

Азр

О1и

11е

Ча1

Ча1

О1и

Агд

Ча1

Рго

Ьеи

65

70

75

80

Туг

РЬе

Агд

О1п

Рго

О1у

Агд

О1у

11е

Агд

Рго

О1у

Агд

Азп

О1и

11е

85

90

95

О1и

Зег

Ча1

Азп

Агд

Рго

Ча1

Ча1

Ча1

О1у

О1у

Ча1

Ьеи

Ча1

Меб

Рго

100

105

110

О1у

Азр

Ча1

11е

Ча1

О1у

Азр

О1у

Азр

О1у

Ча1

Ча1

Ча1

Ча1

Рго

Агд

115

120

125

А1а

О1п

А1а

О1и

А1а

Ча1

А1а

Агд

Туг

А1а

Нчз

ТЬг

11е

Ьеи

О1и

Ьуз

130

135

140

Азр

ТЬг

О1и

О1у

Агд

Агд

Агд

Ьеи

Туг

О1п

О1п

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Рго

ТЬг

145

150

155

160

Азр

Зег

ТЬг

Ча1

Агд

165 <210> 15 <211> 723 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 15

абдасаасаа	дсасбааааа	бабдсаддба	адбсадааад	ббаббдасда	бсббсдбсдс	60
дбдбсаасад	саасбсбдса	сасбдсдсбд	ббсаааадад	дбббасдсаа	сассбасабс	120
садддбдбса	дссбсабсаа	саассааааа	сбдаадабдд	бсддссаддс	дббсасссбд	180
сдсбасабсс	сддсбсдбда	адасдббдас	ассдббдсдд	саббсаааад	сссбдадсас	240
ссбсадсдсс	бддссдббда	абссдбсссд	дааддсабдд	бдсбддбббс	адасбдбсдб	300
саддасдсаа	садсбдсббс	бдссдддадс	абссббсбба	сбсдаббдда	адббсдсаад	360
бдбдсдддбб	ббдбббссда	бдсдддсабс	ададабббса	асдабдсабс	бдааабдаас	420
абдссдаббб	бббдсдссаа	дссаадсдсб	ссаассаасс	бдассаадса	ссасдссдба	480
дасабасаад	бассдабсдд	сбдсддсддб	дбдабддбба	абссаддсда	бдбдббадбс	540
ддсдабддбд	асддсабсаб	сдббабсссб	дбддаааббд	сасаддаддб	ббсадаадаа	600

- 162 029538 дсасЕЕдсаа ЕддаасЕсЕЕ сдаадаЕЕЕЕ дЕдсЕддаЕа аадЕЕсдддс дддаадсааа дЕсаЕЕдддс ЕдЕасссЕсс Еаасдсадаа асЕсЕддадд адЕасаасаа ссааааддса

Еад <210> 16 <211> 240 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (19)...(188) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (155)...(158) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозатЕ ίά = РБ00001

660

720

723

<400> 16

Ьуз Бег

Азп МеЕ ТНг А1а

О1п ТНг 25

Уа1 10 Ьеи

Бег НФз

О1п ТНг

Ьуз А1а

Уа1 Ьеи 30

11е 15 РНе

Азр Ьуз

МеЕ 1 Азр

ТНг Ьеи

ТНг Агд

Бег Агд 20

ТНг 5 Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Агд

Азп

ТНг

Туг

11е

О1п

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

11е

Азп

Азп

35

40

45

О1п

Ьуз

Ьеи

Ьуз

МеЕ

Уа1

О1у

О1п

А1а

РНе

ТНг

Ьеи

Агд

Туг

11е

Рго

50

55

60

А1а

Агд

О1и

Азр

Уа1

Азр

ТНг

Уа1

А1а

А1а

РНе

Ьуз

Бег

Рго

О1и

НФз

65

70

75

80

Рго

О1п

Агд

Ьеи

А1а

Уа1

О1и

Бег

Уа1

Рго

О1и

О1у

МеЕ

Уа1

Ьеи

Уа1

85

90

95

Бег

Азр

Суз

Агд

О1п

Азр

А1а

ТНг

А1а

А1а

Бег

А1а

О1у

Бег

11е

Ьеи

100

105

110

Ьеи

ТНг

Агд

Ьеи

О1и

Уа1

Агд

Ьуз

Суз

А1а

О1у

РНе

Уа1

Бег

Азр

А1а

115

120

125

О1у

11е

Агд

Азр

РНе

Азп

Азр

А1а

Бег

О1и

МеЕ

Азп

МеЕ

Рго

11е

РНе

130

135

140

Суз

А1а

Ьуз

Рго

Бег

А1а

Рго

ТНг

Азп

Ьеи

ТНг

Ьуз

НФз

НФз

А1а

Уа1

145

150

155

160

Азр

11е

О1п

Уа1

Рго

11е

О1у

Суз

О1у

О1у

Уа1

МеЕ

Уа1

Азп

Рго

О1у

165

170

175

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

О1у

Азр

О1у

Азр

О1у

11е

11е

Уа1

11е

Рго

Уа1

О1и

180

185

190

11е

А1а

О1п

О1и

Уа1

Бег

О1и

О1и

А1а

Ьеи

А1а

МеЕ

О1и

Ьеи

РНе

О1и

- 163

195

200

205

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

О1у

Бег

Ьуз

Уа1

11е

О1у

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Рго

Азп

А1а

О1и

ТЬг

Ьеи

О1и

О1и

Туг

Азп

Азп

О1п

Ьуз

А1а

225

230

235

240

<210> 17 <211> 792 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 17 абдаббсддб бдассаассб даассссббб дадсддбббд асдабддссд ссссааддбд 60 сссдабдасс бдсбддадсд дабдаадсбд дбсассассд аддаддссбд дддсасдсбс 120 бабсасдссд дсбассбдсд ссадббсдаа ддсаадбддс асдадассса сссдддсдбс 180 абсасбдбсд дссдсдссдб сассдсссад ббссбдсссс абсдссссда сбассасдсс 240 дбддбдсаад ааассддсдб сддсдааддс сдсддсадсд ссддбддбса даасбсдбдд 300 абсабсдада дссбдсадсд саасдасдбс абддбддбсд асабсббсдд сааддбсааа 360 дасддсасдд бсдбсддсда саассбдддс ассдссдбдс дсасссдсас ссдсдссддд 420 дссдбсабсд асддсддсдб дсдсдасбас садддссбда сссадсбсас сдасдбсаас 480 ббсбасабсс дсддбабдда сссдассддс абсдссдасд бсасссбддс сддссбдаас 540 абссссабсс дсабсддбдд сбдсасадбс сбдсссддсд асдбддбссб сддсасдссс 600 адсддсдбсс бдббсабссс дссдсассбд дбдбсдаадд бддбсдадда дадсдаддас 660 дбссдсдбсс дсдасдадбб бддсаададс сдссбддссд ааддсабббд дассбссддс 720 садабсдасб сддссбддад сдасдадабс ааддссдасб бсдадаасбд дааддссаас 780 сдссссаадб ад 792 <210> 18 <211> 263 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (39)...(205) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 18

Меб 11е Агд Ьеи ТЬг Азп Ьеи Азп Рго РЬе О1и Агд РЬе Азр Азр О1у 1 5 10 15

- 164 029538

Агд

Рго

Ьуз

Уа1 20

Рго

Азр Азр

Ьеи

Ьеи 25

О1и Агд Меб

Ьуз

Ьеи 30

Уа1

ТЬг

ТЬг

О1и

О1и

А1а

Тгр

О1у

ТЬг

Ьеи

Туг

Нтз

А1а

О1у

Туг

Ьеи

Агд

Ο1η

35

40

45

РЬе

О1и

О1у

Ьуз

Тгр

Нтз

О1и

ТЬг

Нтз

Рго

О1у

Уа1

11е

ТЬг

Уа1

О1у

50

55

60

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Ο1η

РЬе

Ьеи

Рго

Нтз

Агд

Рго

Азр

Туг

Нтз

А1а

65

70

75

80

ναι

Уа1

Ο1η

О1и

ТЬг

О1у

Уа1

О1у

О1и

О1у

Агд

О1у

Зег

А1а

О1у

О1у

85

90

95

Οΐη

Азп

Зег

Тгр

11е

11е

О1и

Зег

Ьеи

Ο1η

Агд

Азп

Азр

Уа1

Меб

Уа1

100

105

110

Уа1

Азр

11е

РЬе

О1у

Ьуз

Уа1

Ьуз

Азр

О1у

ТЬг

Уа1

Уа1

О1у

Азр

Азп

115

120

125

Ьеи

О1у

ТЬг

А1а

Уа1

Агд

ТЬг

Агд

ТЬг

Агд

А1а

О1у

А1а

Уа1

11е

Азр

130

135

140

О1у

О1у

Уа1

Агд

Азр

Туг

Ο1η

О1у

Ьеи

ТЬг

Ο1η

Ьеи

ТЬг

Азр

Уа1

Азп

145

150

155

160

РЬе

Туг

11е

Агд

О1у

Меб

Азр

Рго

ТЬг

О1у

11е

А1а

Азр

Уа1

ТЬг

Ьеи

165

170

175

А1а

О1у

Ьеи

Азп

11е

Рго

11е

Агд

11е

О1у

О1у

Суз

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

180

185

190

О1у

Азр

Уа1

Уа1

Ьеи

О1у

ТЬг

Рго

Зег

О1у

Уа1

Ьеи

РЬе

11е

Рго

Рго

195

200

205

Нчз

Ьеи

Уа1

Зег

Ьуз

Уа1

Уа1

О1и

О1и

Зег

О1и

Азр

Уа1

Агд

Уа1

Агд

210

215

220

Азр

О1и

РЬе

О1у

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

А1а

О1и

О1у

11е

Тгр

ТЬг

Зег

О1у

225

230

235

240

Οΐη

11е

Азр

Зег

А1а

Тгр

Зег

Азр

О1и

11е

Ьуз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Азп

245

250

255

Тгр

Ьуз

А1а

Азп

Агд

Рго

Ьуз

260 <210> 19 <211> 723 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 19

абдадсдабб	абассаасда	даббассддс	даассдссад	сбдсбдаасс	бббдссддас	60
дадсаддааа	бсббддаббб	бдбасддсад	аадсбдсабд	бсдссдсддб	ббдсдабабб	120
ббддабдабб	бдддсбассд	саабсаадсс	абдсассадс	даббдсдссс	дсбссбассс	180

- 165 029538

дабаббсдда	асбдбддббб	бдбсдддсда	дсдсдбасдб	бдсдсбддаб	ддадассдаб	240
бабаббдбсд	аддаадабсс	сбабдддсбд	дадабсдасб	ббабддабад	бсбдддсдсд	300
ддбдабдбса	ббдббсаббс	сассдасссб	ддсддсасса	абдссссдбд	дддсдаасбс	360
абдассасса	бсдссаадбб	дсдсддсдса	дббддсбдсд	бсбдсдасад	ссадабасдс	420
дасасддбдс	адабсабсда	сабдддсббс	сссдбсбасб	асасдддааб	бсдбссдббд	480
даббссааад	ддсдддсдсд	сдбдабдддб	ббддабсбдс	ссдбасдсбд	бддбдабдбд	540
ббддбдсабс	сбддсдабсб	сабсббсдсс	дассабдасд	дсабсдбддб	саббссдсаа	600
дсдсаддбдс	адсаддбасб	саадсбддсс	саадаааада	бддадаадда	даассасасд	660
сдсаабдасс	бдсбсдсддд	саадасасбд	сдсдаддбсб	абдабасдба	бддддбдббд	720

бад 723 <210> 20 <211> 240 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (30)...(197) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (221)...(224) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозаФб ίά = РБ00001

<400> 20

ТЬг

О1у О1и 10

Рго

Рго

А1а

А1а 15

О1и

Меб 1

Бег Азр

Туг ТЬг 5

Азп

О1и

11е

Рго

Ьеи Рго

Азр О1и 20

О1п

О1и

11е

Ьеи 25

Азр РЬе

Уа1

Агд

О1п 30

Ьуз

Ьеи

Н1з

Уа1 А1а 35

А1а Уа1

Суз

Азр

11е 40

Ьеи

Азр Азр

Ьеи

О1у 45

Туг

Агд

Азп

О1п

А1а Меб 50

Н1з О1п

Агд

Ьеи 55

Агд

Рго

Ьеи Ьеи

Рго 60

Азр

11е

Агд

Азп

Суз 65

С1у РЬе

Уа1 О1у

Агд 70

А1а

Агд

ТЬг

Ьеи Агд 75

Тгр

Меб

О1и

ТЬг

Азр 80

Туг

11е Уа1

О1и О1и 85

Азр

Рго

Туг

О1у

Ьеи О1и 90

11е

Азр

РЬе

Меб 95

Азр

Бег

Ьеи О1у

А1а О1у 100

Азр

Уа1

11е

Уа1 105

Н1з Бег

ТЬг

Азр

Рго 110

О1у

О1у

ТЬг

Азп А1а

Рго Тгр

О1у

О1и

Ьеи

Меб

ТЬг ТЬг

11е

А1а

Ьуз

Ьеи

Агд

- 166

115 120 125

О1у А1а Уа1 130

О1у

Суз

Уа1

Суз 135

Азр

Бег О1п

11е

Агд 140

Азр

ТЬг

Уа1

О1п

11е

11е

Азр

Меб

О1у

РЬе

Рго

Уа1

Туг

Туг

ТЬг

О1у

11е

Агд

Рго

Ьеи

145

150

155

160

Азр

Бег

Ьуз

О1у

Агд

А1а

Агд

Уа1

Меб

О1у

Ьеи

Азр

Ьеи

Рго

Уа1

Агд

165

170

175

Суз

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

Нбз

Рго

О1у

Азр

Ьеи

11е

РЬе

А1а

Азр

Нбз

180

185

190

Азр

О1у

11е

Уа1

Уа1

11е

Рго

О1п

А1а

О1п

Уа1

О1п

О1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

195

200

205

Ьеи

А1а

О1п

О1и

Ьуз

Меб

О1и

Ьуз

О1и

Азп

Нбз

ТЬг

Агд

Азп

Азр

Ьеи

210

215

220

Ьеи

А1а

О1у

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Агд

О1и

Уа1

Туг

Азр

ТЬг

Туг

О1у

Уа1

Ьеи

225

230

235

240

<210> 21 <211> 444 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 21

абдассаадс	сдсбдадбда	адссдсдсдс	дссаадсбсд	ссассдбсад	бассдссасд	60
сбдасдасдс	аасбдббсаа	дсдсдддсбд	сдсаасассб	бсабссаддд	сдсасдсссд	120
сбсаабсссд	асдсдссдсс	дабддбсддс	ссддссбаса	сдсбдсдсба	бабсссддса	180
сдсдаддаса	бсдасасдсб	сдабдбдббс	аабдассдса	сссасссдса	асдсааддсс	240
дбддаддаса	бсссдссддд	садсдбдсбд	дбдабддасб	дссдсддсда	сдсдадсдбс	300
дсдбсддссд	дсадсабссб	ддбдасссдс	абдабдабдс	дсддсдсадс	сддсдбддбс	360
адсдасддсд	дссбдсдсда	ббсссссдад	абсдсдаадс	бссссббссс	сассбасбдс	420
садддсдддб	сддсдсссас	саас				444

<210> 22 <211> 148 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <400> 22

Меб ТЬг Ьуз Рго Ьеи Бег О1и А1а А1а Агд А1а Ьуз Ьеи А1а ТЬг Уа1

5 10 15

Бег ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг ТЬг О1п Ьеи РЬе Ьуз Агд О1у Ьеи Агд Азп

- 167 029538

25 30

ТЬг

РЬе

11е 35

О1п

О1у

А1а

Агд

Рго 40

Ьеи

Азп

Рго

Азр

А1а 45

Рго

Рго

МеЕ

Уа1

О1у 50

Рго

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи 55

Агд

Туг

11е

Рго

А1а 60

Агд

О1и

Азр

11е

Азр 65

ТЬг

Ьеи

Азр

Уа1

РЬе 70

Азп

Азр

Агд

ТЬг

НФз 75

Рго

О1п

Агд

Ьуз

А1а 80

Уа1

О1и

Азр

11е

Рго 85

Рго

О1у

Зег

Уа1

Ьеи 90

Уа1

МеЕ

Азр

Суз

Агд 95

О1у

Азр

А1а

Зег

Уа1 100

А1а

Зег

А1а

О1у

Зег 105

11е

Ьеи

Уа1

ТЬг

Агд 110

МеЕ

МеЕ

МеЕ

Агд

О1у 115

А1а

А1а

О1у

Уа1

Уа1 120

Зег

Азр

О1у

О1у

Ьеи 125

Агд

Азр

Зег

Рго

О1и 130

11е

А1а

Ьуз

Ьеи

Рго 135

РЬе

Рго

ТЬг

Туг

Суз 140

О1п

О1у

О1у

Зег

А1а Рго ТЬг Азп 145 <210> 23 <211> 801 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 23
аЕдаЕсааЕЕ	дссЕсдсддс	Еааассасад	сддссЕЕссс	ааЕЕаЕссаа	ЕсссЕаЕсад	60
дадссЕдсса	ЕдссадссаЕ	сЕсссЕсдаа	дЕдсЕЕдада	аасЕдсдсдс	аЕасдаЕасд	120
сссассаЕЕЕ	дсаасдЕдаЕ	сдадсЕдЕЕс	дасдЕдсддс	сдсдсассад	сддсЕасаЕд	180
даЕдсссдса	ЕссдсдссЕд	сЕЕссссдад	аЕдссдссдд	ЕддЕдддсЕЕ	ЕдссЕссасс	240
дссассЕЕсс	дсдсЕЕсЕда	адсдссдсЕс	Ессддсссдд	аЕаЕсЕасдд	сЕсдсЕдаас	300
сЕдсаадЕдд	ададсЕЕЕдд	сасдсЕсЕсс	ддсссддсса	ЕсдЕддЕсЕЕ	ЕсаадассЕд	360
дасдасссдд	сддЕддсддс	аассЕЕЕддс	даддЕдаЕдЕ	дсассассЕа	ссадасдЕас	420
ддаЕсддЕсд	ддсЕдаЕсас	сЕсЕддсдсд	дддсдсдасс	ЕддассаддЕ	асдсаадаЕЕ	480
ддЕЕасЕсдд	ЕсЕЕсассаа	сддсдсдаЕЕ	ЕдсЕсдсасд	дсЕасЕдсса	саЕЕссддаЕ	540
дЕсаасдЕдс	сддЕдсдддЕ	дддсддсЕЕа	аЕсдЕдсдсс	сддаЕдаЕсЕ	дсЕдсасаЕд	600
дасдЕдаасд	дсдЕдассаа	саЕссссаад	дадаЕсдсдд	сддаддЕддс	ддаддссЕдс	660
даддссЕасд	Еддсддсдда	даЕддсдасд	сЕдаасдддс	ЕдсаЕдсдЕа	ЕаддсаадаЕ	720
ддддаЕдссд	ддаадсЕдса	ададдсдаад	ааддададЕа	аааддсЕдаЕ	дсаддсдсЕд	780
ааддаасддд	ЕдаддаддЕа	а				801

- 168 029538 <210> 24 <211> 266 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (36)...(207) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 24

Меб 1

11е

Азп

Суз

Ьеи 5

А1а

А1а

Ьуз

Рго

О1п Агд 10

Рго

Бег

О1п

Ьеи 15

Бег

Азп

Рго

Туг

О1п

О1и

Рго

А1а

Меб

Рго

А1а

11е

Бег

Ьеи

О1и

Уа1

Ьеи

20

25

30

О1и

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

Туг

Азр

ТЬг

Рго

ТЬг

11е

Суз

Азп

Уа1

11е

О1и

35

40

45

Ьеи

РЬе

Азр

Уа1

Агд

Рго

Агд

ТЬг

Бег

О1у

Туг

Меб

Азр

А1а

Агд

11е

50

55

60

Агд

А1а

Суз

РЬе

Рго

О1и

Меб

Рго

Рго

Уа1

Уа1

О1у

РЬе

А1а

Бег

ТЬг

65

70

75

80

А1а

ТЬг

РЬе

Агд

А1а

Бег

О1и

А1а

Рго

Ьеи

Бег

О1у

Рго

Азр

11е

Туг

85

90

95

О1у

Бег

Ьеи

Азп

Ьеи

О1п

Уа1

О1и

Бег

РЬе

О1у

ТЬг

Ьеи

Бег

О1у

Рго

100

105

110

А1а

11е

Уа1

Уа1

РЬе

О1п

Азр

Ьеи

Азр

Азр

Рго

А1а

Уа1

А1а

А1а

ТЬг

115

120

125

РЬе

О1у

О1и

Уа1

Меб

Суз

ТЬг

ТЬг

Туг

О1п

ТЬг

Туг

О1у

Бег

Уа1

О1у

130

135

140

Ьеи

11е

ТЬг

Бег

О1у

А1а

О1у

Агд

Азр

Ьеи

Азр

О1п

Уа1

Агд

Ьуз

11е

145

150

155

160

О1у

Туг

Бег

Уа1

РЬе

ТЬг

Азп

О1у

А1а

11е

Суз

Бег

НФз

О1у

Туг

Суз

165

170

175

НФз

11е

Рго

Азр

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Агд

Уа1

О1у

О1у

Ьеи

11е

Уа1

180

185

190

Агд

Рго

Азр

Азр

Ьеи

Ьеи

НФз

Меб

Азр

Уа1

Азп

О1у

Уа1

ТЬг

Азп

11е

195

200

205

Рго

Ьуз

О1и

11е

А1а

А1а

О1и

Уа1

А1а

О1и

А1а

Суз

О1и

А1а

Туг

Уа1

210

215

220

А1а

А1а

О1и

Меб

А1а

ТЬг

Ьеи

Азп

О1у

Ьеи

НФз

А1а

Туг

Агд

О1п

Азр

225

230

235

240

О1у

Азр

А1а

О1у

Ьуз

Ьеи

О1п

О1и

А1а

Ьуз

Ьуз

О1и

Бег

Ьуз

Агд

Ьеи

245

250

255

- 169

Меб Ο1η А1а Ьеи Ьуз О1и Агд Уа1 Агд Агд 260 265

<210> 25
<211> 741 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 25 абддсбдада	адааасбдас	сдддсддабб	дсдсдддада	ааабсаддбб	дабддаддбд	60
ссдсддссдс	сдсааддсдб	сдбсдадсдд	ббсаадбсдс	бсддсдаббд	сассддсабс	120
абббссдаса	ссабддабда	асбдддсабс	ссдаасддсд	бдабсддсдс	дбсадбдсбд	180
сдассаасса	бссссддсас	сдбсабсдсс	дддссддсдб	бдасдсбдсд	саасаббсбс	240
садсдсабсд	абссасбсдс	сддсдсдсдс	дадсасдбса	асаадабддс	сдадббсдаа	300
бдбсасаасс	бсдсдасссс	дддсдасдбд	сбддбдабсс	адддддбдсс	даасдбсбсс	360
адбабдддад	дсабсбсддс	дсбдассддс	аадсдсдссд	дбдаадбсдд	сдссабсдбс	420
дааддсддса	бссдсдасаб	бдсасаббсд	сдбдаддббд	дсбббссасб	дбддбсдадс	480
садабсасдс	сддбсассдд	саадбддсдд	сбддаддсдд	ссдадабсаа	сддсассабс	540
дааабсддсд	дсдбдсаддб	дсассссддс	дабсбддбдд	бддссдасда	сассддсдбс	600
бдсббсабсс	сдсдсдасаа	саббсбддаа	дбдсбсдссд	адбдсдадаа	дааадсдаад	660
дссдаддасс	бдсдсбдсаа	ддсдабсдаб	ддсддсдбсс	сддбдссдда	бабсбсдааа	720
бсдасдбабд	дададасдбд	а				741

<210> 26 <211> 246 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (38)...(202) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ

<222>	(119)..,	. (122)
<223>	Участок	Ν-гликозилирования.	РгозФбе	и =	РБ00001
<220>
<221>	САЙТ
<222>	(179)...	.(182)
<223>	Участок	Ν-гликозилирования.	РгозФбе	и =	РБ00001
<400>	26

- 170 029538

Меб А1а О1и Ьуз 1

Ьуз 5

Ьеи

ТЬг

О1у

Агд

11е А1а Агд 10

О1и

Ьуз

11е 15

Агд

Ьеи

Меб

О1и

Уа1

Рго

Агд

Рго

Рго

О1п

О1у

Уа1

Уа1

О1и

Агд

РЬе

Ьуз

20

25

30

Зег

Ьеи

О1у

Азр

Суз

ТЬг

О1у

11е

11е

Зег

Азр

ТЬг

Меб

Азр

О1и

Ьеи

35

40

45

О1у

11е

Рго

Азп

О1у

Уа1

11е

О1у

А1а

Зег

Уа1

Ьеи

Агд

Рго

ТЬг

11е

50

55

60

Рго

О1у

ТЬг

Уа1

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Агд

Азп

11е

Ьеи

65

70

75

80

О1п

Агд

11е

Азр

Рго

Ьеи

А1а

О1у

А1а

Агд

О1и

Нчз

Уа1

Азп

Ьуз

Меб

85

90

95

А1а

О1и

РЬе

О1и

Суз

Нчз

Азп

Ьеи

А1а

ТЬг

Рго

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

О1п

О1у

Уа1

Рго

Азп

Уа1

Зег

Зег

Меб

О1у

О1у

11е

Зег

А1а

Ьеи

115

120

125

ТЬг

О1у

Ьуз

Агд

А1а

О1у

О1и

Уа1

О1у

А1а

11е

Уа1

О1и

О1у

О1у

11е

130

135

140

Агд

Азр

11е

А1а

Нтз

Зег

Агд

О1и

Уа1

О1у

РЬе

Рго

Ьеи

Тгр

Зег

Зег

145

150

155

160

О1п

11е

ТЬг

Рго

Уа1

ТЬг

О1у

Ьуз

Тгр

Агд

Ьеи

О1и

А1а

А1а

О1и

11е

165

170

175

Азп

О1у

ТЬг

11е

О1и

11е

О1у

О1у

Уа1

О1п

Уа1

Нчз

Рго

О1у

Азр

Ьеи

180

185

190

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

ТЬг

О1у

Уа1

Суз

РЬе

11е

Рго

Агд

Азр

Азп

11е

195

200

205

Ьеи

О1и

Уа1

Ьеи

А1а

О1и

Суз

О1и

Ьуз

Ьуз

А1а

Ьуз

А1а

О1и

Азр

Ьеи

210

215

220

Агд

Суз

Ьуз

А1а

11е

Азр

О1у

О1у

Уа1

Рго

Уа1

Рго

Азр

11е

Зег

Ьуз

225

230

235

240

Зег

ТЬг

Туг

О1у

О1и

ТЬг

245 <210> 27 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 27

абдабббабс	адссддддас аасаддсабс дбсдбдсадд абаббдсасд сдсбдабсаа	60
дссаббабсд	абддссбадс адаабдбддб дбддсдасдд бдсабдаддс асаддддсдс	120
аадддссбдб	бддсддабба бабдасдссд абббасбсдд дсдсдсдсаб сдсбддабсб	180

- 171 029538

дсддбдасса	ббсбддсасс	дссдбдбдас	ааббддабда	бссабдбддс	ддбадаасад	240
ббдсаааадд	дсдабдбдбб	дсбдсбдддс	асдабсасас	сдбссаабдс	бддсбабббс	300
ддбдасббдс	бддссасдбс	адссабддсд	сасддббдбс	дсддаббдаб	саббдабддс	360
ддбдбдсдсд	абдбдсаада	дсбдасддаб	абдддсбббс	сддбббддбс	сааддссдба	420
сабдсссаад	дсасаабсаа	адааасдсбд	ддабсддбса	асдбдссадб	бдбсбдсддс	480
саададббдд	бааассссдд	бдабаббдбд	дбддссдасд	абдасддддб	дбдсдббдбд	540
сдссдсдаад	аадсбдсбда	бдбдсбддсб	ааддсдсддд	сдсдсдадад	саабдаадсд	600
дссаадсдсд	сдсдббббда	ддссддбдад	сбддддсбдд	абабсбабда	сабдсдсдсд	660
сддсбддссд	аааааддасб	дааабасдбс	бда			693

<210> 28 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (27)...(179) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 28

Меб 1

11е

Туг О1п

Рго О1у ТЬг ТЬг О1у 5

11е 10

Уа1

Уа1

О1п

Азр

11е 15

А1а

Агд

А1а

Азр

О1п

А1а

11е

11е

Азр

О1у

Ьеи

А1а

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

20

25

30

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд

Ьуз

С1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Азр

Туг

Меб

35

40

45

ТЬг

Рго

11е

Туг

Бег

О1у

А1а

Агд

11е

А1а

С1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

50

55

60

Ьеи

А1а

Рго

Рго

Суз

Азр

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Ьуз

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Ьеи

Ьеи

С1у

ТЬг

11е

ТЬг

Рго

Бег

Азп

85

90

95

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

А1а

Меб

А1а

НФз

О1у

100

105

110

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

О1у

С1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

О1п

О1и

Ьеи

115

120

125

ТЬг

Азр

Меб

О1у

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

Уа1

НФз

А1а

О1п

О1у

130

135

140

ТЬг

11е

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

О1у

145

150

155

160

- 172

О1п

О1и

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

Азр

11е

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

165

170

175

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

О1и

А1а

А1а

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

Ьуз

А1а

180

185

190

Агд

А1а

Агд

О1и

Бег

Азп

О1и

А1а

А1а

Ьуз

Агд

А1а

Агд

РЬе

О1и

А1а

195

200

205

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1и

210

215

220

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

225 230 <210> 29 <211> 756 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 29 ббдсадсдас адсбббссас асбдсадсдд сдабддаадд сббабасдбс дддсабддаа садаадаббд сддаасддсб дбсддссббд бсддбддсдс абсбддссда бддсбдссбд сдбдссддаа сддсдабдсд ддбддбддсс аабсбасссс сдабсдбадс бддбсадсда асдбссддсс ддасасддсс ддбдсддсаб басддсадсд бсдасдбсбб ссббдаадсд сбддссдасс ссадддсддд сдабдбдсбд дбсдбсдаса абддсдассд ддасдабдаа ддсбдсабсд дсдассбдас ддсдсбддаа дбсдсбсадд ссдддсбддс сдддабсабс абсбсдддсс ддсассдсда сасддсдабс сбссдсбсса ббссаабсдс сббдббсадс сдсддбдссб дсдсдсдбдд дссддбссдд сбсдасдбсс дсдсдссдда дасаббсдбс адсдсссдса ббддсдасда ддбсдбаасс дсадсадабб дддбадсддс сдабдасдас ддсдссабсб бсабсддсда саассабабб дсддсддбдд бсдсддсддс ддадбсдабс сдсдасассд адсбссддса дассдддсбд абдааддссд ддасаадсбб дсдсдадсад сббдаддбсд сддсббабсб ддасдсдсдд дсддсддабс сддсдсбдда сббссдсдсс сабббдсдсд сдсбсаасдс ддсдабсдад даабда <210> 30 <211> 251 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

756

- 173 029538 <221> ДОМЕН <222> (28)...(184) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 30

ТЬг Ьеи О1п

Агд 10

Агд

Тгр

Ьуз

А1а

Туг 15

ТЬг

Меб 1

О1п

Агд

О1п

Ьеи 5

Бег

Бег

О1у

Меб

О1и

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1и

Агд

Ьеи

Бег

А1а

Ьеи

Бег

Уа1

20

25

30

А1а

Нчз

Ьеи

А1а

Азр

О1у

Суз

Ьеи

Агд

А1а

О1у

ТЬг

А1а

Меб

Агд

Уа1

35

40

45

Уа1

А1а

Азп

Ьеи

Рго

Рго

11е

Уа1

А1а

О1у

О1п

Агд

ТЬг

Бег

О1у

Агд

50

55

60

ТЬг

Агд

Рго

Уа1

Агд

Нчз

Туг

О1у

Бег

Уа1

Азр

Уа1

РЬе

Ьеи

О1и

А1а

65

70

75

80

Ьеи

А1а

Азр

Рго

Агд

А1а

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Азр

Азп

О1у

Азр

85

90

95

Агд

Азр

Азр

О1и

О1у

Суз

11е

О1у

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Ьеи

О1и

Уа1

А1а

100

105

110

О1п

А1а

О1у

Ьеи

А1а

О1у

11е

11е

11е

Бег

О1у

Агд

Нчз

Агд

Азр

ТЬг

115

120

125

А1а

11е

Ьеи

Агд

Бег

11е

Рго

11е

А1а

Ьеи

РЬе

Бег

Агд

О1у

А1а

Суз

130

135

140

А1а

Агд

О1у

Рго

Уа1

Агд

Ьеи

Азр

Уа1

Агд

А1а

Рго

О1и

ТЬг

РЬе

Уа1

145

150

155

160

Бег

А1а

Агд

11е

О1у

Азр

О1и

Уа1

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

Тгр

Уа1

А1а

165

170

175

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

А1а

11е

РЬе

11е

О1у

Азр

Азп

Нчз

11е

А1а

А1а

180

185

190

Уа1

Уа1

А1а

А1а

А1а

О1и

Бег

11е

Агд

Азр

ТЬг

О1и

Ьеи

Агд

О1п

ТЬг

195

200

205

О1у

Ьеи

Меб

Ьуз

А1а

О1у

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

О1и

О1п

Ьеи

О1и

Уа1

А1а

210

215

220

А1а

Туг

Ьеи

Азр

А1а

Агд

А1а

А1а

Азр

Рго

А1а

Ьеи

Азр

РЬе

Агд

А1а

225

230

235

240

Нчз

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

Азп

А1а

А1а

11е

О1и

О1и

245

250

<210> 31 <211> 327 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 31

- 174 029538

дбдадасадд	даабдсдасб	бдсбсасасд	сдбдбддсдс	ссдаасббдб	абсддссббс	60
бсддсбдббс	адассдссас	даббсасдад	дсасааддбд	дбабсддбдс	ддбсдсддсд	120
дабаббсдсс	сбсбсдассд	ддсаабдбсс	абсбдсддсс	сбдсссбдас	дабсаааасб	180
ссдсссдсдд	асаассбддс	дсббсассад	дсдсбббабс	бсдсддаасс	дддбдасдбд	240
сбддбддбсд	аббдсдсаад	ссасассдад	дссдддсааб	ддддсддсаб	бсбсабддаа	300
дсадссаадд	бдсдсддсаб	адссддд				327

<210> 32 <211> 109 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды

<400> 32

О1у

Меб 5

Агд

Ьеи А1а

НФз

ТЬг 10

Агд

Уа1

А1а

Рго

О1и 15

Ьеи

Меб 1

Агд

О1п

Уа1

Бег

А1а

РЬе

Бег

А1а

Уа1

О1п

ТЬг

А1а

ТЬг

11е

НФз

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

О1у

11е

О1у

А1а

Уа1

А1а

А1а

Азр

11е

Агд

Рго

Ьеи

Азр

Агд

А1а

35

40

45

Меб

Бег

11е

Суз

О1у

Рго

А1а

Ьеи

ТЬг

11е

Ьуз

ТЬг

Рго

Рго

А1а

Азр

50

55

60

Азп

Ьеи

А1а

Ьеи

НФз

О1п

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

А1а

О1и

Рго

О1у

Азр

Уа1

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Уа1

Азр

Суз

А1а

Бег

НФз

ТЬг

О1и

А1а

О1у

О1п

Тгр

О1у

О1у

85

90

95

11е

Ьеи

Меб

О1и

А1а

А1а

Ьуз

Уа1

Агд

О1у

11е

А1а

О1у

100

105

<210> 33 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 33
дсдсбсдада	дсдбсасдас	сдсдасдсбд	ассассдбдс	бдсбдаадса	дддссбдсдс	60
аасдбсбдда	бдсдсддсас	ссддссдсбд	дсдадсддбс	адссдсдсаа	ддбсдддсдс	120
дсдббсасдс	бссдсббсдб	дссддсдсдс	даддассбсд	сдассссддс	ббсабддддс	180
дсдссдабсб	сдасссдсдс	сдсдабсдад	дсдабдссдд	ааддсдбдаб	сдсддбсдсс	240
дабдсдабдд	дсдбдасбда	сдссддсабс	ббсддсдаса	бссбдбдсдс	ссддабдсдс	300
сддсдсаасд	бддссдсдсб	сдбдассдас	ддсдбдабсс	дсдассбддс	сддсдбдсбд	360

- 175 029538

адсассддсс	бдссддбсбд	дбдссадддб	ассдсадсдс	сббсдбсддб	сассддссбд	420
ассббсдбсд	ссбддсадса	дссддбсддс	бдсддбдддд	бддсддбдбб	сссдаасдас	480
дбддбсдбса	бсдасдссда	сддсдсддбс	дбсабсссдд	сбдсдсбдсб	сдабддсдбс	540
абсдсддадд	сдабсдадса	ддадасссад	дадддсбдда	бсабдсддда	ддбддадддс	600
ддбдсддсдс	бдссдддссб	сбабссдабд	аасдаддсда	сдааддсдсд	сбасдаадсс	660
бддаадаадд	сдадсдасбд	а				681

<210> 34 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (3)...(171) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 34

А1а

ТЬг

Ьеи ТЬг ТЬг Ча1 10

Ьеи

Ьеи 15

Ьуз

А1а 1

Ьеи

О1и

Зег

Ча1 5

ТЬг ТЬг

О1п

О1у

Ьеи

Агд

Азп

Ча1

Тгр

Меб

Агд

О1у

ТЬг

Агд

Рго

Ьеи

А1а

Зег

20

25

30

О1у

О1п

Рго

Агд

Ьуз

Ча1

О1у

Агд

А1а

РЬе

ТЬг

Ьеи

Агд

РЬе

Ча1

Рго

35

40

45

А1а

Агд

О1и

Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

Рго

А1а

Зег

Тгр

О1у

А1а

Рго

11е

Зег

50

55

60

ТЬг

Агд

А1а

А1а

11е

О1и

А1а

Меб

Рго

О1и

О1у

Ча1

11е

А1а

Ча1

А1а

65

70

75

80

Азр

А1а

Меб

О1у

Ча1

ТЬг

Азр

А1а

О1у

11е

РЬе

О1у

Азр

11е

Ьеи

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Меб

Агд

Агд

Агд

Азп

Ча1

А1а

А1а

Ьеи

Ча1

ТЬг

Азр

О1у

Ча1

100

105

110

11е

Агд

Азр

Ьеи

А1а

О1у

Ча1

Ьеи

Зег

ТЬг

О1у

Ьеи

Рго

Ча1

Тгр

Суз

115

120

125

О1п

О1у

ТЬг

А1а

А1а

Рго

Зег

Зег

Ча1

ТЬг

О1у

Ьеи

ТЬг

РЬе

Ча1

А1а

130

135

140

Тгр

О1п

О1п

Рго

Ча1

О1у

Суз

О1у

О1у

Ча1

А1а

Ча1

РЬе

Рго

Азп

Азр

145

150

155

160

Ча1

Ча1

Ча1

11е

Азр

А1а

Азр

О1у

А1а

Ча1

Ча1

11е

Рго

А1а

А1а

Ьеи

165

170

175

Ьеи

Азр

О1у

Ча1

11е

А1а

О1и

А1а

11е

О1и

О1п

О1и

ТЬг

О1п

О1и

О1у

180

185

190

- 176

Тгр

11е

Меб

Агд

О1и

Уа1

О1и

О1у

О1у

А1а

А1а

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Туг

195

200

205

Рго

Меб

Азп

О1и

А1а

ТЬг

Ьуз

А1а

Агд

Туг

О1и

А1а

Тгр

Ьуз

Ьуз

А1а

210 215 220

Бег Азр 225 <210> 35 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 35 дбдассдабс сддббдбсдб бсдасадабс дасаддссдб ссдсдаабсб ддбсдсбдаб 60 сбдсадсдсб асддсдбсбс сассдбдсас даддсдсаад ддсдбсдсдд ссбдсбсдсд 120 бсдбасабдс ддссдабсба бдссддсдсд сбсабсдссд дбсссдсдаб сасддбссбд 180 дбдссдссбд дсдасаасбб дабдабссас дбсдссдбдд аадбдбдсса дсссддсдас 240 дббсбсабсд бсдссассас сбсдссдбдс ассдасддсб абббсддсда дсбдсбддсд 300 асдбсдсбдс дддсссдсдд сдбддсдддд сбсдбдабсд абдсдддсбд ссдддабдбб 360 сдсдсдсбда садааабдсд абббсссдбс бддадссдсд сдабсадсдс дсадддаасс 420 дбсааадсда сдсбдддсбс ддбдаасдсд дсддбддбдб дсдссддддс дбсддбдада 480 дссддддабс бсабсдбддс сдасдабдас ддддбддбдд сддбдсддсд ддаддаадбс 540 дбсдссдбда сдсаддсадс сдаасадсдс дббсдсаадд аададддсас дсдсдсасдд 600 сбсдсдсадд дсдадсбсдд ссбддасабб басддсббдс дссадаадсб дбсддабсбс 660 ддсббдаадб сабсдбсдбд а 681 <210> 36 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 36

Меб ТЬг Азр Рго Уа1 Уа1 Уа1 Агд О1п 11е Азр Агд Рго Бег А1а Азп

5 10 15

Ьеи Уа1 А1а Азр Ьеи О1п Агд Туг О1у Уа1 Бег ТЬг Уа1 НФз О1и А1а

- 177 029538

20

25

30

Οϊη

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

Ьеи

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Ο1η

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

11е

Уа1

А1а

ТЬг

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

А1а

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

А1а

А1а

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Зег

Уа1

Агд

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Ьеи

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

А1а

Уа1

Агд

165

170

175

Агд

О1и

О1и

Уа1

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

Ο1η

А1а

А1а

О1и

Ο1η

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

О1у

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Ο1η

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ο1η

Ьуз

Ьеи

Зег

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Зег

210

215

220

Зег Зег 225

<210> 37 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 37 абддссддсд	бсдбддббса	асадабсдад	сдсдссддбс	бсдасасбдс	сдсбдсссбс	60
ддддаабдсд	дсдбсдссас	адбдсасдад	дсдсадддсс	ддасадддсб	дабдсдсбсс	120
басабдсддс	сдабббаббс	аддсдсссдс	дббдсдддсс	ссдсддбаас	ддбдбсбабс	180
ссдссдддсд	асаасбддаб	даббсасдбс	дсбдбддаас	адбдссддда	аддсдасдбс	240
сбсдбсдбдд	сдссдасдад	бссббдсдад	дасддсбабб	бсддсдадсб	дсбсдссбдс	300
бсдсбдсада	сссдссдадб	дадсддбсбс	абсабададд	ссддддбдсд	сдасдбссдс	360

- 178 029538

дадсбдассд	адабдсддбб	сссддбббдд	бссааддсда	ббсбсдсаса	адддасбдбд	420
ааддааасса	бсддсбсддб	даасдбсдса	абсдбсбдсд	ссддбдсддс	ддбсадбссс	480
ддсдасдбда	бсдбсдссда	бдасдасддс	дбсбдсаббд	бдссдсдсдд	асаддсддад	540
асддбдсббс	аддсдадссд	сдсссдсдад	дсдааддадд	ссдааасдсд	дсддсддсбс	600
сддбсдддсд	аасбсддссб	сдабабсбас	адсабдсдсд	аааадсбддс	ддссаддддс	660
сбдааабабд	бсбда					675

<210> 38 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 38

Уа1 5

Уа1

О1п О1п

11е

О1и Агд А1а 10

О1у

Ьеи

Азр 15

ТЬг

Меб 1

А1а О1у

Уа1

А1а

А1а

А1а

Ьеи

О1у

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Ηί8

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Меб

Агд

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

35

40

45

А1а

Агд

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

11е

Рго

Рго

О1у

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

11е

Ηί8

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

Уа1

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

Суз

Зег

Ьеи

О1п

ТЬг

Агд

Агд

Уа1

Зег

О1у

Ьеи

11е

11е

100

105

110

О1и

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

О1и

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

Ьеи

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

11е

130

135

140

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

А1а

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

Уа1

Зег

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

11е

Уа1

Рго

Агд

165

170

175

О1у

О1п

А1а

О1и

ТЬг

Уа1

Ьеи

О1п

А1а

Зег

Агд

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

180

185

190

- 179

О1и

А1а

О1и 195

ТЬг

Агд

Агд

Агд

Ьеи 200

Агд

Зег

О1у

О1и

Ьеи 205

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

Зег

МеЕ

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 39 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 39 аЕддссааад ЕЕдЕЕсаааа ЕаЕсдаасдс дсадсссааа аддЕдаЕЕда ЕдсдсЕЕддд 60 дссЕдсддЕд ЕЕдссасддЕ дсаЕдаддсд саддддсдса ааддссЕдсЕ сдсЕЕссЕаЕ 120 аЕдсддссда ЕЕЕаЕЕссдд ЕдсдсддсЕЕ дсддсаЕсдд сддЕдассаЕ аЕсддсЕдса 180 сссддЕдаЕа асЕддаЕддЕ дсаЕдЕддсд аЕЕдадсаад Едааададдд сдасаЕЕЕЕд 240 дЕдсЕЕдссс сдассЕсдсс ЕЕдЕдаадас ддсЕаЕЕЕЕд дсдаЕсЕдсЕ ддсдасаЕсд 300 аЕдсаддсдс дЕддсдддсд ЕдддсЕдаЕЕ аЕсдаЕдссд дддЕЕсдсда ЕаЕЕсдсдаЕ 360 сЕдасддааа ЕдддЕЕЕЕсс ддЕдЕддЕса ааддсдаЕЕЕ аЕдсссаадд сасддЕсаад 420 аааасдсЕдд ддЕсддЕЕаа ЕаЕЕссЕаЕс дЕсЕдсдссд дЕдсдсЕЕаЕ сааЕдсЕддс 480 дасаЕЕаЕЕд ЕЕдссдаЕда ЕдасддЕдЕд ЕдЕдЕЕдЕдд сссдадаада ддссдаадсд 540 дЕдсЕддсса аддсдсаддс дсдсдаддсс ааЕдаддаад асаадсдсаа дсддЕЕддсЕ 600 дссддЕдадЕ ЕддддсЕЕда ЕаЕдЕаЕаас аЕдсдсдсас ддсЕддсдда ааадддссЕд 660 аааЕаЕдЕЕЕ ад 672 <210> 40 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 40

МеЕ 1

А1а Ьуз

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

О1и Агд А1а 10

А1а О1п Ьуз

Уа1 15

11е

Азр

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Нтз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

А1а

- 180 029538

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

А1а

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

Уа1

Ндз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Уа1

Ьуз

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Меб

О1п

А1а

Агд

О1у

О1у

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

11е

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

О1у

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

11е

Туг

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Ьуз

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

11е

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

11е

Азп

А1а

О1у

145

150

155

160

Азр

11е

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

А1а

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Ьуз

А1а

О1п

А1а

Агд

О1и

А1а

Азп

О1и

180

185

190

О1и

Азр

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Меб

195

200

205

Туг

Азп

Меб

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 41 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 41

абдддбдбсд	бддбссадаа	саббдсссдс	дсадссбссд	абдбсабсда	бсддсбсдса	60
дссбдсддбд	бсдсаасддб	асабдаддсд	садддбсдса	сддддсбдсб	бдссадссаб	120
абдсддссда	бсбабссддд	сдсдсддсбс	дсддсаадсд	сддбдассаб	сбсбдсдссд	180
ссаддбдаса	асбддабдаб	ссабдбддсд	абсдадсадб	бдааддабдд	сдасдбдсбд	240
сбдсбсдсдс	сдасдадссс	сбдсдаддаб	ддсбабббсд	дсдассбссб	ддсдасдбсд	300
дссадддсда	ддддсбдссд	дддссбдабс	абсдабдссд	дсдбдсдсда	сдббдссдаб	360
сбдассдада	бдаадбббсс	сдбсбддбсд	ааддсдабсб	ббдсдсаддд	аассдбсаад	420
дадасбдбсд	дабсддбдаа	бдбассддбс	дбббдсдссд	дбдсбббсдб	саабссдддс	480
дабдбдабсд	бсдссдасда	бдасддсдсс	бдсдбсдбдс	сссддсаада	сдсддссдаб	540
дбддссдаса	аддсддаддс	асдбдбсдсб	дссдаддадд	ссаадсдсаа	дсддсбддса	600

- 181 029538

Есдддсдадс ЕЕдддсЕсда саЕсЕасдас аЕдсдсдддс ддсЕддсдса даддддссЕд аааЕаЕдЕсЕ да

660

672 <210> 42 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 42

МеЕ 1

О1у

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

А1а Агд А1а 10

А1а

Бег

Азр

Уа1 15

11е

Азр

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТНг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТНг

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Н1з

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТНг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

11е

Н1з

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТНг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

А1а

Агд

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТНг

О1и

МеЕ

Ьуз

РНе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

11е

РНе

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

О1и

ТНг

Уа1

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

РНе

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

А1а

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд

О1п

165

170

175

Азр

А1а

А1а

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а

А1а

О1и

180

185

190

О1и

А1а

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

Бег

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1у

Агд

Ьеи

А1а

О1п

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

- 182

<210> 43
<211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 43 абдадсдбсд	бсдббсадаа	сабсдсдсдс	дссдабсааб	ссабсдбсда	баддсбсддд	60
дссбдсддсд	бсдссассдб	дсасдаадсд	садддссдса	ааддаббдсб	сдсдадссас	120
абдсддссда	бсбаббссдд	сдсдсддсбс	дсддсдадсд	ссдбдассаб	сбсддсдссд	180
ссдддбдаса	аббддабддб	ссабдбсдсд	абсдадсааб	бдсдадссдд	сдасаббабд	240
дбдсбсдсдс	сдассадссс	дбдсдаддаб	ддсбабббсд	дбдабсбдсб	сдсдассбсд	300
дсдааадсдс	ддддсбдссд	сддбсбсабс	абсдабдссд	дсдбдсдсда	бдбсдссдаб	360
сбсассдсда	бдсадбббсс	сдбсбддбсс	ааддссдбсб	бсдсссаддд	аассдбдаад	420
дааасдсбсд	дсбсддбааа	сабссссдбд	дбсбдсдссд	дбдсдсбддб	саабссдддс	480
дабдбсабсд	бсдссдабда	сдабддбдбс	бдсдбсдбдс	дссдсдаада	ддсддаддсд	540
дбддсдсада	аддссдаддс	ссдсдбсдсс	дссдаддадд	абаадсдсаа	дсдссбсдсс	600
дссддсдаас	бсддссбсда	сабсбасаад	абдсдсдадс	ддсбсдссда	дааддддсбс	660
ааабабдбсб	да					672
<210> 44 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 44

Меб 1

Бег

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

А1а

Агд 10

А1а

Азр

О1п

Бег

11е 15

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

О1у 20

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Нбз 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

Бег

О1у

А1а

Агд

Ьеи 50

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр

Меб

Уа1

Нбз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

Агд

А1а

О1у

Азр

11е

Меб

70 75 80

- 183 029538

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТНг 85

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РНе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг

Бег 100

А1а

Ьуз

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Ьеи

ТНг

А1а

Меб

О1п 125

РНе

Рго

Уа1

Тгр

Бег 130

Ьуз

А1а

Уа1

РНе

А1а 135

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТНг

Ьеи

О1у

Бег 145

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

А1а

О1и

А1а 180

Уа1

А1а

О1п

Ьуз

А1а 185

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а 190

А1а

О1и

О1и

Азр

Ьуз 195

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг Ьуз Меб Агд О1и Агд Ьеи А1а О1и Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1

210		215		220
<210> 45 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 45 абдаасдббд	бсдбссадаа	сбббдаасдд	дсбдабссбд	сддббдббаа	ддссббдддс	60
даабдбддбд	бддссасддб	дсабдаадса	садддссдса	аддддсбббб	адссбсббаб	120
абасдсссда	бббабадсдд	аасббсбабс	ддддсббсдд	сбдббассаб	асббдсддсб	180
ссабдсдаса	асбддабдсб	дсабдбддсд	абсдаасаад	бдсаадсддд	сдабдбаббд	240
дбасбддсдд	ббасдбсасс	абсадасдса	ддббасбббд	дсдабббдбб	адсаасабсб	300
дсдсаадсдс	ддддббдсдс	аддбббдабс	асбдабдсдд	дсдбасдсда	бдбдсдсдаб	360
ббдсаддсда	бдааббббсс	ддбббддбсд	ааадсдабсб	дбдсдсаадд	сасддбдааа	420
дааасссбдд	дббсддбсаа	сдббсссдбб	дбсбдбдсад	дадсдаадаб	баабсссддб	480
дабдбдаббд	бддсддабда	бдабддддбб	бдсдсбдбда	адбдсдаада	ддсддсадад	540
дббббдаааа	аадсдсаадс	дсдбббддсс	аабдаададс	адааасдбас	дсдаббддсб	600
дабддбдадб	бадддсбдда	сабдбабдаб	абдсдсдддс	дссбадсбда	ааааддбсбд	660
ааабабдбсб	аа					672

<210> 46

- 184 029538 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 46

Уа1 5

О1п Азп

РЬе

О1и

Агд 10

А1а

Азр

Рго

А1а

Уа1 15

Уа1

МеЕ 1

Азп

Уа1

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи

О1у

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

11е

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

ТЬг

35

40

45

Зег

11е

О1у

А1а

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Ьеи

А1а

А1а

Рго

Суз

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

Ьеи

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Уа1

О1п

А1а

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

О1п

А1а

Агд

О1у

Суз

А1а

О1у

Ьеи

11е

ТЬг

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

О1п

А1а

МеЕ

Азп

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

Суз

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьуз

11е

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

А1а

Уа1

Ьуз

Суз

О1и

165

170

175

О1и

А1а

А1а

О1и

Уа1

Ьеи

Ьуз

Ьуз

А1а

О1п

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Азп

О1и

180

185

190

О1и

О1п

Ьуз

Агд

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

МеЕ

195

200

205

Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1у

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 47 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

- 185 029538 <400> 47

абдддбаббд	ббдббсадаа	сабсаадсдд	дсддассссд	ддабсабадс	аддбсббддс	60
ааабдсддсд	ббдссасбдб	дсабдаадсд	саддддбдса	аддддсбссб	ддсддссбаб	120
абдсддссса	бббаббсбдд	сдсдсдссбб	дссдссбссд	сбдбсассаб	ббссдсдссд	180
ссдддадаса	асбддабддб	дсабдбсдсс	аббдадсадд	бдаддсаадд	бдабаббсбд	240
дббсббдссс	саасабсдсс	сбдбдаадас	ддсбабббсд	дбдабббдсб	сдссассбсс	300
абдсбдсадс	дсддсддсад	ддддсбдабб	аббдасдссд	дбдбссдсда	бабссдбдаб	360
сбдасбсааа	бдааабббсс	ддбдбддбсд	аааассдббб	ббдсдсаддд	сассдббаад	420
дааасссббд	дсбсбдбдаа	сдбсссдаба	дбббдсдссд	дбдаадбддб	саабссбддс	480
дасабсабда	ббдссдабда	бдабддбдбд	бдсдбддбсс	ддсдсдасда	сдсбдааадс	540
дбдсббдааа	аадсаббддс	дсдбдаддса	ааддаадаад	абасасдсаа	асдссббдсд	600
дсаддсдадс	бдддбсббда	бабббасддс	абдсдсдсас	дбсбддссда	ааадддссба	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 48 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 48

Меб 1

О1у

11е

Уа1

Уа1 5

О1п Азп

11е

Ьуз

Агд 10

А1а

Азр

Рго

О1у

11е 15

11е

А1а

О1у

Ьеи

О1у

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Суз

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Бег

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

Уа1

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Уа1

Агд

О1п

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Меб

Ьеи

О1п

Агд

О1у

О1у

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

11е

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1п

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

- 186

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

ТЬг

Уа1

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

О1и

Уа1

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

11е

Меб

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

Азр

165

170

175

Азр

А1а

О1и

Бег

Уа1

Ьеи

О1и

Ьуз

А1а

Ьеи

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

О1и

Азр

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 49 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно

<220>
<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 49 абдадсабсд	бсдбссадаа	сабсдадсдс	дссдасаадд	абдсддббдб	ддсасбсддс	60
даабдсддсд	ббдсдасддб	дсабдаддсд	саддсссдса	аадддсбсаб	дсддссббас	120
абдсддссаа	бсбабдссдд	сдсссдсабс	дссддсссад	ссдбдасддб	сбсдабсдсд	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	ссабдбддса	дбддадсадб	дссдсдасдд	сдабабссбс	240
дбддбддсас	сдассадссс	дадбдаадас	ддсбабббсд	дсдаасбдсб	ддсдсдсбсд	300
сбсабддсдс	дсддбдбдаа	ддддсбдабс	абсдаадссд	дддбдсдсда	сдбдсдсдас	360
сбсассдада	бсаабббссс	ддбсбддбсд	ааадсдабсб	ссдсдсаадд	дасддбдаад	420
дааасдсбсд	дсбсддбдаа	бдбдссддбс	дбсбдсдссд	дсдсдсбддб	саабссдддс	480
дасдбсабса	ббдссдабда	сдасддсдбс	бдбдбсдбдд	сдсдсдсбдс	ддсаадбдас	540
дббдсдаадд	сдбсссдаас	ссдсдаадсс	ааддаадссд	ааасссдсаа	дсдссбдабд	600
дсдддбдаас	бсддасбсда	сабсбасддд	абдсдсдаса	адсббдсддс	саадддссбд	660
ааабабдбсб	да					672
<210> 50 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды

- 187 029538 <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 50

Меб 1

Зег

11е

Уа1

Уа1 5

Ο1η

Азп

11е

О1и Агд А1а Азр 10

Ьуз

Азр

А1а 15

Уа1

Уа1

А1а

Ьеи

О1у

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а

Ο1η

А1а

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Меб

Агд

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

11е

А1а

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

Нбз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Ο1η

Суз

Агд

Азр

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

Агд

Зег

Ьеи

Меб

А1а

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

11е

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

11е

Азп

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

Зег

А1а

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

А1а

Агд

А1а

165

170

175

А1а

А1а

Зег

Азр

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

Зег

Агд

ТЬг

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

О1и

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

Меб

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

Азр

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 51 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 51

абдддсдбсд	бддбссадаа	бабсдсссдд	дссдадсадб	ссдбсдбсда	саддсбддсб	60
дсдбдсддбд	ббдссасддб	дсасдаддсд	садддссдса	аддддсбдсб	сдсдадббсб	120
дбдсддссда	бсбабссддд	сдсдсдддбд	дсддссадсд	сддбсасдаб	сбсадсдссд	180

- 188 029538

ссдддЕдаса	асЕддаЕддЕ	ссаЕдЕадсд	аЕсдаасадЕ	Едааддаддд	сдасаЕссЕд	240
сЕдЕЕддсдс	сдассадЕсс	сЕдсдаддаЕ	ддсЕаЕЕЕсд	дЕдаЕсЕдсЕ	сдссасЕЕсд	300
дссаЕддсдс	ддддсЕдссд	сддасЕдаЕс	аЕадаЕдсдд	дддЕдсдсда	сдЕсдсддас	360
сЕдасддсда	ЕдсадЕЕЕсс	адЕсЕддЕсс	ааддсдаЕсЕ	Есдсссаадд	сассдЕсаад	420
дааасдсЕдд	дЕЕсддЕдаа	ЕаЕЕссЕдЕд	дЕсЕдсдссд	дсдсдсЕддЕ	сааЕсссддЕ	480
дасдЕдаЕсд	ЕддссдаЕда	сдасддсдЕс	ЕдсдЕсдЕсс	дссдсдаада	ддсддссдсс	540
дЕсдссдааа	аддсддаддс	асдддЕддсд	аЕсдаддаад	дсааасдсаа	дсддсЕсдсд	600
дсдддсдаас	ЕсдддсЕсда	ЕаЕЕЕасдас	аЕдсдсадЕс	дссЕЕдссда	дааддддсЕд	660
аааЕаЕдЕсЕ	да					672

<210> 52 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 52

МеЕ 1

О1у

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

А1а

Агд 10

А1а

О1и

О1п

Зег

Уа1 15

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

А1а 20

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Зег 40

Уа1

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

Уа1 50

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

МеЕ

Уа1

НФз

Уа1

А1а 70

11е

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз 75

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг 85

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег 100

А1а

МеЕ

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Ьеи

ТЬг

А1а

МеЕ

О1п 125

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Зег 130

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а 135

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Зег 145

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

- 189

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

А1а

А1а

А1а 180

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

А1а 185

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а 190

11е

О1и

О1и

О1у

Ьуз 195

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр 210

Меб

Агд

Бег

Агд

Ьеи 215

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи 220

Ьуз

Туг

Уа1

<210> 53 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 53 абдаадссдд бддбддбдса дасбабсдад сдддссдасс дадсдабсаб сдадддбсбд 60 дссдсдбдбд дсдббдссас сдбссабдад дсдсаддддс дссдддддсб дсббдсдбсс 120 басабдсдсс сдабсбаббс дддсдсбдсд дббдсддссб сддссдбсас сабссбсбсб 180 ссасссбдсд асаасбддаб дсбдсасдбс дссабсдадс адабссадсс дддсдасабб 240 сбсдббсбсд дсасдассбс бссдбссдаб дссддсбабб бсддбдабсб дсбддсдасб 300 бсддссаадд сдсдсддббд сдбсдддббд дбсабсдабд ссддсдбасд сдабабссдс 360 дассбдасад сдабдсадбб бссддбсбдд бссааддссд бббсддссса дддсасдабс 420 ааддадасдс бдддббсддб саасдбсссс дбсдбсбдсд ссддбдсбсб ддбсаабссс 480 ддсдасдбсд бсдбддссда бдасдасддб дбсбдсдбдд бдсдссдсда ддаадссдсд 540 дааасдсбдд ааааддсссд ддсдсддабс дссаабдадд аддаааадсд ссадсдсббб 600 дссдсбддсд аасбсдддсб сдасабсбас аадабдсдсд аасдссбсдс бдсссбдддд 660 сбсассбабд бсбда 675 <210> 54 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 54

Меб Ьуз Рго Уа1 Уа1 Уа1 О1п ТЬг 11е О1и Агд А1а Азр Агд А1а 11е 1 5 10 15

- 190 029538

11е О1и

О1у

Ьеи 20

А1а

А1а

Суз

О1у

Ча1 25

А1а

ТЬг

Ча1

НФз

О1и 30

А1а

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

35

40

45

А1а

А1а

Ча1

А1а

А1а

Зег

А1а

Ча1

ТЬг

11е

Ьеи

Зег

Рго

Рго

Суз

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

Ьеи

НФз

Ча1

А1а

11е

О1и

О1п

11е

О1п

Рго

О1у

Азр

11е

65

70

75

80

Ьеи

Ча1

Ьеи

О1у

ТЬг

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

Ьуз

А1а

Агд

О1у

Суз

Ча1

О1у

Ьеи

Ча1

11е

100

105

110

Азр

А1а

О1у

Ча1

Агд

Азр

11е

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

О1п

РЬе

Рго

115

120

125

Ча1

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

Ча1

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

11е

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

130

135

140

О1у

Зег

Ча1

Азп

Ча1

Рго

Ча1

Ча1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Ча1

Азп

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Ча1

Ча1

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Ча1

Суз

Ча1

Ча1

Агд

Агд

165

170

175

О1и

О1и

А1а

А1а

О1и

ТЬг

Ьеи

О1и

Ьуз

А1а

Агд

А1а

Агд

11е

А1а

Азп

180

185

190

О1и

О1и

О1и

Ьуз

Агд

О1п

Агд

РЬе

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

195

200

205

11е

Туг

Ьуз

Меб

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Ьеи

ТЬг

Туг

Ча1

210 215 220 <210> 55 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 55

абдаабдабс	сддбддбддб	ссддсаадбд	дадсадссдс	садссдасдс	сдббдбсдса	60
ббддадаадб	дбддбдбдас	дассдбдсаб	даадсбсадд	дасдббдбдд	бсбссббдсс	120
бссбасабдс	дбссдаббба	сбсдддадса	адсабсдссд	дббссдсбдб	дасбдбсбсб	180
сбдссбссбд	дсдасаассб	сабдабссас	дбсдссдбсд	аддбббдсдд	бссдддааас	240
абссбддбсд	бббсассаас	дбсдссббдс	ассдабддсб	асббсддада	дсбдббддсд	300
асабсбсбсс	дбдсссасдд	бдбаададдд	сбддбдабсд	асдссддсбд	ссдсдасдбс	360
сддбсдббаа	ссдадабдаа	абббссбдбс	бддадссдсд	дсабсадсбс	дсаадддаса	420

- 191 029538

дбсааадсса	сдсбсддабс	бдбдаасдбд	дсддбсасбб	дсдсдддбдс	асбддбсдаа	480
дсбддсдабд	баабсдбсдс	сдабдасдаб	ддадббдбдд	ббдбдаадсд	сдсдсаддсд	540
саададдбсд	ссдссдсддс	дсаасаасдд	дббсдсааад	аадасдбаас	бсдададсда	600
сббдсбсдбд	дадаасбсдд	асбддабабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсаасбд	660
ддссбааадб	абсбдбда					678

<210> 56 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 56

Меб 1

Азп

Азр

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

Уа1

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у 25

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

Туг

Зег

О1у

А1а 50

Зег

11е

А1а

О1у

Зег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

О1у

11е 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

А1а

Уа1

ТЬг

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

О1п

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1п

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азр 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

- 192

Азр 11е Туг Азр МеЕ Агд О1п Ьуз 11е А1а О1п Ьеи О1у Ьеи Ьуз Туг 210 215 220

Ьеи

225 <210> 57 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 57 аЕдааЕдаЕс сддЕддЕадЕ ссдададдЕд дадсадссас садсддаЕдс ддЕЕдЕсаса 60

ЕЕддадаадЕ дсддадЕдас аасЕдЕдсаЕ даддсдсадд дасдЕЕдЕдд ссЕЕсЕсдсс 120 сасЕасаЕдс дЕссдаЕЕЕа ЕссЕддадсс ассаЕсдссд дЕЕссдсЕдЕ сасЕдЕсЕсЕ 180

ЕЕдссдссЕд дсдасаассЕ саЕдаЕссас дЕЕдсддЕсд аддЕЕЕдЕсд Ессдддааас 240 аЕссЕддЕсд ЕЕЕсассдас дЕсдссЕЕдс ассдаЕддсЕ асЕЕсддада дсЕдЕЕддсд 300 асаЕсЕсЕсс дЕдсссасдд ЕдЕаададдд сЕддЕдаЕсд асдссддсЕд ссдсдасдЕс 360 сддЕсдЕЕда ссдадаЕдаа аЕЕЕссЕдЕс Еддадссдсд дсаЕсадсЕс дсаадддасд 420 дЕсааадсса сдсЕсддаЕс ЕдЕдаасдЕд дсддЕсасЕЕ дсдсдддЕдс асЕддЕсдаа 480 дсЕддсдаЕд ЕааЕсдЕсдс сдаЕдасдаЕ ддадЕЕдЕдд ЕЕдЕдаадсд сдсдсаддсд 540 саададдЕсд ссдссдсддс дсаасаасдд дЕЕсдсааад аадасдЕаас Есдададсда 600 сЕЕдсЕсдЕд дадаасЕсдд асЕсдаЕаЕЕ ЕасдасаЕдс дссаааадаЕ сдсдсаасЕд 660 ддссЕааадЕ аЕсЕдЕда 678 <210> 58 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 58

МеЕ 1

Азп

Азр

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд О1и Уа1 10

О1и О1п

Рго

Рго А1а Азр 15

А1а

Уа1

Уа1

ТЬг

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Нтз

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

40 45

- 193 029538

О1у

А1а 50

ТЬг

11е

А1а

О1у

Зег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

Н1з 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Агд

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

Н1з

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

О1у

11е 135

Зег

Зег

Ο1η

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

А1а

Уа1

ТЬг

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ο1η

А1а 180

Ο1η

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

Ο1η

Ο1η

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азр 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

Азр

Меб

Агд

Ο1η 215

Ьуз

11е

А1а

Ο1η

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225

<210> 59 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 59 абдаабдабс	сддбддбадб	ссдададдбд
ббддадаадб	дбддадбдас	аассдбдсаб
сасбасабдс	дбссдаббба	сссдддддса
ббдссдссбд	дсдасаассб	сабдабссас
абссбддбсд	бббсассдас	дбсдссббдс
асабсбсбсс	дбдсссасдд	бдбаададдд
сддбсдббда	ссдадабдаа	абббссбдбс
дбсааадсса	сдсбсдддбс	ддбдаасдбд

из окружающей среды

дадсадссас	садсддабдс	ддббдбсаса	60
даддсасадд	дасдббдбдд	ссббсбсдсд	120
ассабсдссд	дббссдсбдб	сасбдбсбсб	180
дбсдссдбсд	аддбббдсдд	бссдддааас	240
ассдабддсб	асббсддада	дсбдббддсд	300
сбддбдабсд	асдссддабд	ссдбдабдбс	360
бддадссдсд	сдабсадсбс	дсаадддаса	420
дсддбсасбб	дсдсдддбдс	асбддбсдаа	480

- 194 029538

дсбддсдабд	баабсдбсдс	сдабдасдаб	ддадббдбдд	ббдбдаадсд	сдсдсдддсд	540
саададдбсд	сддссдсддс	дсаасаасдд	дббсдсааад	аадасдбаас	бсдададсда	600
сббдсбсдбд	дадаасбсдд	асбсдабабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсаасбд	660
ддссбааадб	абсбдбда					678

<210> 60 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 60

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд О1и

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп

Азр

Рго

А1а

Уа1

Уа1

ТЬг 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз О1у 25

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Нбз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а Нбз 40

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а 50

ТЬг

11е

А1а

О1у

Бег 55

А1а Уа1

ТЬг

Уа1

Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

Нбз 70

Уа1

А1а Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег 85

Рго

ТЬг

Бег Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд А1а 105

Нбз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 Агд 120

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е 135

Бег Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

А1а

Уа1 ТЬг

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Агд

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

А1а А1а 185

А1а

А1а

О1п

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азр 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд Ьеи 200

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз 11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

- 195

210 215 220

Ьеи

225

<210> 61
<211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 61 абдадсддсд	бддббдбдсд	ддаддбсдсс	сдсссддсдс	ссдабсбсдб	ддссбсдсбс	60
даададдсдд	дбдбсбсаас	сдбссасдаа	дсасадддас	дссддддасб	дсбсдссасс	120
басабдсдбс	сдабсбасдс	сддадссасд	сбсдсдддас	сддсадбсас	сдбссбсдбс	180
ссссссддсд	асаассбдаб	даббсасдба	дссдбддадд	бдбдссдссс	дддбдасдбд	240
сбддбсдбсд	ссдбсасдбс	дссдбдсасс	дасддббасб	бсддсдадсб	дсбддсдасд	300
бсддббсдсд	сдсдсддсдб	сааддддсбс	дбсабсдабд	саддсбдссд	ддасдбдсдд	360
дсдсбсассд	адабдсддбб	бссддбдбдд	адссдддсдд	бсадсдсдса	дддсассдбс	420
ааддссасдс	бдддсбссдб	дадсдббссд	дбсдбббдсд	ссддсдсдсб	дабсдаддсс	480
ддсдасдбсд	бсдбдддсда	сдасдасдда	дбддббдбсд	бдааасддад	сдаддссдаб	540
дсддбсдбда	дбдсббсдсд	ссадсддсбс	сбсааддаад	аддддасдсд	бсадсдссбд	600
дсаадсддбд	аасбсддбсб	ддасабсбас	бсдсбдсдса	ааасдсбббс	сдассбдддд	660
сбдаадбасс	ддбаа					675
<210> 62 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 62

Меб 1

Бег

О1у

Уа1

Уа1 5

Уа1

Агд

О1и

Уа1

А1а 10

Агд

Рго

А1а

Рго

Азр 15

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

Ьеи 20

О1и

О1и

А1а

О1у

Уа1 25

Бег

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и 30

А1а

О1п

О1у

Агд

Агд 35

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг 40

Туг

Меб

Агд

Рго

11е 45

Туг

А1а

О1у

А1а

ТЬг

Ьеи

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр

- 196 029538

55 60

Азп 65

Ьеи

МеЕ

11е

Няз

Уа1 70

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз 75

Агд

Рго

О1у

Азр

Уа1 80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Уа1 85

ТНг

Бег

Рго

Суз

ТНг 90

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у 95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг 100

Бег

Уа1

Агд

А1а

Агд 105

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи 110

Уа1

11е

Азр

А1а

О1у 115

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд 120

А1а

Ьеи

ТНг

О1и

МеЕ 125

Агд

РНе

Рго

Уа1

Тгр 130

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег 135

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1 140

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

О1у 145

Бег

Уа1

Бег

Уа1

Рго 150

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у 155

А1а

Ьеи

11е

О1и

А1а 160

О1у

Азр

Уа1

Уа1

Уа1 165

О1у

Азр

Азр

Азр

О1у 170

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз 175

Агд

Бег

О1и

А1а

Азр 180

А1а

Уа1

Уа1

Бег

А1а 185

Бег

Агд

О1п

Агд

Ьеи 190

Ьеи

Ьуз

О1и

О1и

О1у 195

ТНг

Агд

О1п

Агд

Ьеи 200

А1а

Бег

О1у

О1и

Ьеи 205

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг 210

Бег

Ьеи

Агд

Ьуз

ТНг 215

Ьеи

Бег

Азр

Ьеи

О1у 220

Ьеи

Ьуз

Туг

Агд

<210> 63 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 63

аЕдассддса	ЕсдЕсдЕсса	дЕддЕЕсдад	сдсасдссдс	ЕЕдссдаЕдЕ	сдсддсдсЕЕ	60
дссдадЕЕсд	дсдЕддсЕас	саЕссасдад	дсдсааддсс	дсааддддсЕ	дсЕсдсдЕсс	120
ЕасаЕдсддс	сдаЕсЕаЕдс	дддЕдсЕдсс	дсддсдддса	аЕдссдЕсас	адЕаЕсддЕд	180
ссЕсссддЕд	асаасЕддаЕ	даЕссаЕдЕд	дсддЕсдадд	ЕдЕдссдсда	дддсдасдЕд	240
сЕддЕддЕсд	ссссдассЕс	дсссЕдсдас	аасддсЕаЕЕ	ЕсддЕдадсЕ	дсЕддссЕдс	300
ЕсдсЕсаадд	сдсдсддсдЕ	дсдсдддсЕс	дЕсаЕсдадд	ссддсЕдссд	сдасдЕдаад	360
ссасЕсЕссд	асаЕдаадЕЕ	ЕсссдЕдЕдд	Есдсдсдссд	ЕЕЕссдссса	дддсассдЕс	420
ааддададсс	ЕдддсдасдЕ	саассЕдссд	сЕсдЕдаЕсд	ссадссадас	сдЕдсаЕссЕ	480
ддсдасдЕдд	ЕддЕсдссда	ЕдасдасддЕ	дЕсдЕсаЕсд	ЕсдсЕсдсдд	сдаддЕдсдс	540
дссдЕсассд	ссаадЕсдсд	сдадсдсдад	дасааддадд	ссдсаадссд	сдадаадсЕд	600

- 197 029538 адсааддддд аддбдддссб сдасабсбас ддсабдсддд ссаадсбдаа ддадаадддс аббсдсбасд бсдсдаабсс сдасааасбс бда

660

693 <210> 64 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 64

Меб 1

ТЬг

О1у

11е

Уа1 5

Уа1

О1п

Тгр

РЬе О1и Агд 10

ТЬг

Рго

Ьеи

А1а 15

Азр

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

А1а

О1и

РЬе

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

11е

НФз

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

35

40

45

А1а

А1а

А1а

А1а

О1у

Азп

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

Уа1

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

Азр

Азп

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

Суз

Бег

Ьеи

Ьуз

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

100

105

110

О1и

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Ьуз

Рго

Ьеи

Бег

Азр

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

Бег

Ьеи

130

135

140

О1у

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

11е

А1а

Бег

О1п

ТЬг

Уа1

НФз

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

11е

Уа1

А1а

Агд

165

170

175

О1у

О1и

Уа1

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

Бег

Агд

О1и

Агд

О1и

Азр

Ьуз

180

185

190

О1и

А1а

А1а

Бег

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

Бег

Ьуз

О1у

О1и

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

195

200

205

11е

Туг

О1у

Меб

Агд

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьуз

О1и

Ьуз

О1у

11е

Агд

Туг

Уа1

210

215

220

А1а

Азп

Рго

Азр

Ьуз

Ьеи

- 198

225 230 <210> 65 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 65 абдадсабсд	бсдбсасдаа	дабсдадсдс	дссддсдсдд	сддссдбсдс	сдсдсбдсдс	60
асаадбддсд	ббдссасадб	дсасдаддсд	саадддсдса	сдддсббдаб	дсдбсссбас	120
абдсддссда	бсбасссддд	сдсдсдсабс	дссддсасдд	сдабсассдб	сбсссбдссб	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсд	дбсдадсадб	дссдсдаддд	сдабабссбс	240
дбддбддсдс	сдассадссс	дадсдасдас	ддсбабббсд	дсдассбдсб	бддсааббсд	300
сбсдбсдсас	дсддсдбсад	дддссбддбд	абсдаддссд	дбдбдсдбда	сдбдсдсдас	360
сбсасддада	бдсдсбббсс	ддбсбддбсд	аадасдаббб	сддсдсаадд	сасддбсаад	420
дадасдббдд	дсбсддбсаа	сдбдссдабс	дбсбдсдсдд	дбдсбдссдб	даассссдда	480
дасдбдабсд	бддссдасда	сдасддсдбс	бдсдбсдбдс	сдсдссадас	ддбсасадад	540
дбсдбсдадд	сддсссасдс	ссдсдаддсс	ааддаддссд	аддбссддса	дсддсбсабс	600
дсдддсдадс	ббддссбсда	сдбсбасддс	абдсдсдада	адсбддсддс	саадддссбс	660
ааабабдбсб	да					672
<210> 66 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> БТСЫАЬ <222> (1)...(27) <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 66

Меб 1

Бег

11е

Уа1

Уа1 5

ТЬг

Ьуз

11е

О1и

Агд 10

А1а

О1у

А1а

А1а

А1а 15

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

Агд 20

ТЬг

Бег

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

ТЬг

О1у 35

Ьеи

Меб

Агд

Рго

Туг 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

11е

А1а

О1у

ТЬг

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

- 199 029538

55 60

Тгр 65

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а 70

Уа1

О1и О1п Суз

Агд 75

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

Азр

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

О1у

Азп

Бег

Ьеи

Уа1

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

ТЬг

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд

О1п

165

170

175

ТЬг

Уа1

ТЬг

О1и

Уа1

Уа1

О1и

А1а

А1а

НФз

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

О1и

Уа1

Агд

О1п

Агд

Ьеи

11е

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Уа1

195

200

205

Туг О1у Меб Агд О1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1

210		215		220
<210> 67 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 67 абдадсдббд	бсдбсасдаа	дабсдадсдс	дссддсдссд	аадсбдббдб	адсдсбддсс	60
дааадбддбд	бдбсдассдб	дсасдаддсд	садддссдда	ссдддсбдаб	дсддссббаб	120
абдсддссда	бсбасдсддд	сдсдсддабс	дссдддасдд	сдабсассдб	дбсдсбдсад	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	ссабдбддсд	дбсдадсааб	дссддсаддд	сдасабссбс	240
дбсдбддсдс	сдассадссс	дадсдасдас	дддбабббсд	дсдассбдсб	сддсааббсд	300
сббдбсдсдс	ддддсдбсад	ддддсбддбд	абсдаддссд	дсдбдсдсда	сдбдсдсдаб	360
сбдассдсда	бдддббббсс	ддбабддбсд	аадасадбсб	сддсдсаадд	сассдбдаад	420
дадасдсбсд	дсбсддбдаа	сдбдсссдбс	дбсбдсдсдд	дддсдассдс	ааассссддб	480
дасдбдабсд	бддссдабда	сдасддсдбс	бдсдбддбдс	сдсдсдадас	ддссдсддса	540
дбддбсдадд	сддсссабдс	дсдддаддбд	ааддаддсад	аддбасддсд	дсддсбдабс	600
бссддсдадс	бсддссбада	сабсбасддс	абдсдсдаса	адсбсдсбдс	саадддссбс	660

- 200 029538 ааабабдбсб да <210> 68 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

672 <400> 68

Меб 1	Бег	Уа1	Уа1	Уа1 5	ТЬг	Ьуз	11е
Уа1	А1а	Ьеи	А1а 20	О1и	Бег	О1у	Уа1
Агд	ТЬг	О1у 35	Ьеи	Меб	Агд	Рго	Туг 40
Агд	11е 50	А1а	О1у	ТЬг	А1а	11е 55	ТЬг
Тгр 65	Меб	11е	НФз	Уа1	А1а 70	Уа1	О1и
Уа1	Уа1	А1а	Рго	ТЬг 85	Бег	Рго	Бег
Ьеи	О1у	Азп	Бег 100	Ьеи	Уа1	А1а	Агд
А1а	О1у	Уа1 115	Агд	Азр	Уа1	Агд	Азр 120
Тгр	Бег 130	Ьуз	ТЬг	Уа1	Бег	А1а 135	О1п
Бег 145	Уа1	Азп	Уа1	Рго	Уа1 150	Уа1	Суз
Азр	Уа1	11е	Уа1	А1а 165	Азр	Азр	Азр
ТЬг	А1а	А1а	А1а 180	Уа1	Уа1	О1и	А1а
А1а	О1и	Уа1 195	Агд	Агд	Агд	Ьеи	11е 200
Туг	О1у 210	Меб	Агд	Азр	Ьуз	Ьеи 215	А1а

О1и	Агд 10	А1а	О1у	А1а	О1и	А1а 15	Уа1
Бег 25	ТЬг	Уа1	НФз	О1и	А1а 30	О1п	О1у
Меб	Агд	Рго	11е	Туг 45	А1а	О1у	А1а
Уа1	Бег	Ьеи	О1п 60	Рго	О1у	Азр	Азп
О1п	Суз	Агд 75	О1п	О1у	Азр	11е	Ьеи 80
Азр	Азр 90	О1у	Туг	РЬе	О1у	Азр 95	Ьеи
О1у 105	Уа1	Агд	О1у	Ьеи	Уа1 110	11е	О1и
Ьеи	ТЬг	А1а	Меб	О1у 125	РЬе	Рго	Уа1
О1у	ТЬг	Уа1	Ьуз 140	О1и	ТЬг	Ьеи	О1у
А1а	О1у	А1а 155	ТЬг	А1а	Азп	Рго	О1у 160
О1у	Уа1 170	Суз	Уа1	Уа1	Рго	Агд 175	О1и
А1а 185	НФз	А1а	Агд	О1и	Уа1 190	Ьуз	О1и
Бег	О1у	О1и	Ьеи	О1у 205	Ьеи	Азр	11е
А1а	Ьуз	О1у	Ьеи	Ьуз	Туг	Уа1

<210> 69 <211> 672 <212> ДНК

220

- 201 029538 <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 69

абдддсассд	бддббсаааа	саббдсдсдс	дсбдассасб	ссдбсабсда	ссдссббдсб	60
дссбдсддбд	бсдссассдб	бсасдаддсс	садддссдса	ссддаббдсб	сдссадббас	120
абдсддссда	бсбабдсддд	сдсдсддсбд	дссдсбадсд	ссдбсассаб	сбссдсссса	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсс	абсдадсаас	бсааддсадд	сдасабсабд	240
дбдсбддссс	сдассадссс	сбдсдаддас	ддббабббсд	дсдассбдсб	сдссасббсс	300
дсссаадсдс	дадддбдсаа	дддссбаабс	абсдасдссд	дсдбдсдсда	сдббдсадас	360
сбдассдсда	бдддабббсс	сдбдбддбсс	ааддссабсб	бсдсдсаддд	басддбсаад	420
дсдадбббдд	дббсадбсаа	бдбдбсддбд	дбсбдбдсба	дбдссббдаб	саабссдддс	480
дасаббдбсд	бддссдасда	бдабддбдбд	бдбдбсдбас	ддсдсдадда	сдсддбсбсс	540
дбддсддсда	аддссдаадс	дсдддбддса	дссдаададд	асаадсдссд	дсдссбсдса	600
дддддсдаас	бдддасббда	бабббабддд	абдсдсдаса	сдсбсдсддс	сааддддсба	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 70 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (149)...(152) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά. = РЗ00001 <400> 70

Меб 1

О1у

ТЬг

Уа1

Уа1 5

Ο1η

Азп

11е

А1а

Агд 10

А1а

Азр

НФз

Зег

Уа1 15

11е

Азр

Агд

Ьеи

А1а 20

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а 30

Ο1η

О1у

Агд

ТЬг

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

А1а

О1у

А1а

Агд

Ьеи 50

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

Ο1η

Ьеи

Ьуз

А1а

О1у

Азр

11е

Меб

70 75 80

- 202 029538

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг 85

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег 100

А1а

О1п

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Ьуз

О1у

Ьеи

11е 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

О1у 125

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Бег 130

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а 135

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

А1а

Бег

Ьеи

О1у

Бег 145

Уа1

Азп

Уа1

Бег

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

Бег

А1а 155

Ьеи

11е

Азп

Рго

О1у 160

Азр

11е

Уа1

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

Азр

А1а

Уа1

Бег 180

Уа1

А1а

А1а

Ьуз

А1а 185

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а 190

А1а

О1и

О1и

Азр

Ьуз 195

Агд

Агд

Агд

Ьеи

А1а 200

О1у

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у 210

Меб

Агд

Азр

ТЬг

Ьеи 215

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи 220

Ьуз

Туг

Уа1

<210> 71
<211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 71 абдадсдбсд	бсдбссадас	сабсдсдсдс	дссдабсада	сддбсабсда	ссдссбсддс
дссбдсддсд	бсдссассдб	асабдаддсд	садддссдса	аддддсбасб	сдсдадсбас
абдсддссса	бсбаббссдд	сдсдсддсбд	дсбдсдадсд	сддбдасааб	ббсддсдссд
сссддсдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсс	абсдадсадс	бсааддссдд	сдасабсабд
дбдсбсдсбс	ссассадссс	сбдсдаадас	ддсбабббсд	дсдассбдсб	сдсдасдбсд
дсбдбддсдс	дсддсбдссд	сдддсбсдбс	абсдаддссд	дсдбдсдсда	бдбддссдаб
сбсассдсда	бдаааббссс	ддбабддбсд	ааадссабсб	ссдсбсаддд	сассдбсаад
дадасдсбдд	дсбсддбдаа	сдбдссдабс	дбабдсдссд	дсасдсбддб	сдадссдддс
дасдбсабсд	бсдссдасда	бдасддсдбс	бдсдбсдбдс	дссдсдаада	ддсддаддсс
дбддсдсада	аддссдаддс	ссдсабсдсс	ассдаададд	асаадсдсаа	асдссбддсд
ддсддсдадс	бсддбсбсда	сабсбасаад	абдсдсдадс	ддсбддссда	ааааддасбс
ааабабдбсб	ад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

672 <210> 72 <211> 223

- 203 029538 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 72

Уа1 5

О1п ТЬг

11е

А1а Агд А1а Азр О1п ТЬг Уа1

11е

МеЕ 1

Зег

Уа1

Уа1

10

15

Азр

Агд

Ьеи

О1у

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

А1а

О1у

Азр

11е

МеЕ

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

Уа1

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

О1и

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

О1и

А1а

Уа1

А1а

О1п

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

11е

А1а

ТЬг

О1и

180

185

190

О1и

Азр

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

О1у

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Ьуз

МеЕ

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 73 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

- 204 029538 <400> 73

абдадсдбдд	бсабсассаа	бабссадсдс	сссдабсссд	адсасассаа	адсдсбсдсс	60
дссббсддсд	ббдсдасбаб	бсасдаддсд	садддссдса	ссддасбдаб	дсадбссббс	120
абдсдассда	бсбабдссдд	сдсдсдсдсс	дссддсассд	ссдбсассдб	дбсдсбдссс	180
сссдссдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсд	дбддадсааб	дссаддсадд	сдасаббсбс	240
дбсдбсдсдс	сдассбсдсс	сбссдабдбс	ддабабббсд	дсдадсбссб	сдссассбсд	300
сбсдссдсас	ддддсдбддб	сддссбсабс	абсдааддсд	дсбдссдсда	сдбсдсддса	360
ббдассдада	бдддбббссс	ддбсбддбсд	сдсдссдбаб	сддсдсаддд	сассдбдаад	420
дадасдсбсд	дсбссдбдаа	сабассдабс	дбсбдсдссд	дсдсдсабаб	бсабсссддс	480
дасббсдбсд	ссдссдасда	бдасддсдбд	дбсдбсдбдс	сссдсдссса	сдбддсддаа	540
абсдссдссд	ссбсссбсдс	дсдсдаддас	ааддаддссд	ссдббсдсда	дсдссбдааа	600
бссддбдадс	бсддссбсда	бабббасддс	абдсдсссдс	дссбсаадда	даааддссбс	660
дбсбддсдсд	ааасдссдда	даадааабад				690

<210> 74 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 74

Азр НФз 11е

Рго О1и Туг 45

О1и А1а 30 А1а

НФз 15 О1п О1у

ТЬг О1у А1а

Меб 1 Ьуз Агд

Бег Уа1

Уа1 А1а 20 Ьеи

11е 5 А1а Меб

ТЬг РЬе О1п

Азп О1у Бег

11е Уа1 РЬе 40

О1п А1а 25 Меб

Агд 10 ТЬг Агд

Рго 11е Рго

А1а ТЬг

Ьеи О1у 35

Агд

А1а

А1а

О1у

ТЬг

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

А1а

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

О1п

А1а

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

Азр

Уа1

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

А1а

А1а

Агд

О1у

Уа1

Уа1

О1у

Ьеи

11е

11е

О1и

100

105

110

О1у

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

О1у

РЬе

Рго

Уа1

- 205

115

120

125

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

О1и

ТНг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

11е

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

НФз

11е

НФз

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

РНе

Уа1

А1а

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

Агд

А1а

165

170

175

НФз

Уа1

А1а

О1и

11е

А1а

А1а

А1а

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1и

Азр

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

А1а

Уа1

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Бег

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

Тгр

Агд

О1и

210 215 220

ТНг Рго О1и Ьуз Ьуз 225 <210> 75 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно

<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 75 абдддадбсд	бсдббсадаа	бабсдсдсдд	дссдадсадд	адабсабсда	ссддсбддсс	60
дссбдсддсд	ббдссассдб	бсасдаадсд	саадддсдса	аадддсбдсб	ддсаадсбаб	120
абдсддссда	бсбабсаддд	бдсдсддсбс	дссдсдадсд	ссдбсасааб	сбсддсдссд	180
ссдддсдаса	асбддабддб	бсабдбсдсс	абсдаасада	баадддссдд	сдасабссбд	240
сбдсббдсдс	ссасаадссс	дбдсдаддас	ддсбаббббд	дсдабсбссб	сдсаасдбсс	300
дсдсаддсаа	дддддбдссд	сдддсбддбс	абсдасдсбд	дбдбдсдсда	сабсдссдаб	360
сбдааддсда	бдааббббсс	ддбсбддбсд	ааддссдбдб	бсдсдсаддд	аасдабсаад	420
дадасасбсд	дабсддбсаа	бдбдсссдбд	дбсбдбдссд	дадсдсбддб	саабссддда	480
дасдбдаббд	бддсддасда	сдасддсдбс	бдсдбсдбдс	дссдддадда	ддссдаааас	540
дбадбссада	аадссдаддс	дсдддбсадс	дсддаадбдд	ссаадсдсдс	саддсбсдса	600
дссддсдаас	бсддссбсда	сабсбасадд	абдсдсдааа	ддсбддсдда	дааддддсбд	660
ааабабдбсб	да					672
<210> 76 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 206 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 76

Уа1 5

О1п Азп

11е А1а Агд А1а О1и 10

О1п

О1и

11е 15

11е

МеЕ 1

О1у Уа1

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

О1п

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

Уа1

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

11е

Агд

А1а

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

О1п

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

11е

А1а

Азр

Ьеи

Ьуз

А1а

МеЕ

Азп

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

Уа1

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

11е

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

О1и

Азп

Уа1

Уа1

О1п

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

Уа1

Зег

А1а

О1и

180

185

190

Уа1

А1а

Ьуз

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Агд

МеЕ

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 77 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 77 дЕдассдаЕс сддЕЕдЕсдс ЕсдасадаЕс дасаддссдс ссдсдааЕсЕ ддЕсдссдаЕ

- 207 029538

сбдсадсдсб	асддсдбсбс	сассдбссас	даддсдсаад	ддсдбсдсдд	ссбдсбсдсд	120
бсдбасабдс	ддссдабсба	бдссддсдсд	сбсаббдссд	дбсссдсдаб	сасддбссбд	180
дбассдссбд	дсдасаасбб	дабдабссас	дбсдссдбдд	аадбдбдсса	дссбддсдас	240
дббсбсдбсд	бсдссасдас	дбсдссдбдс	ассдасддсб	абббсддсда	дсбдсбддсд	300
асдбсдсбдс	дддсссдсдд	сдбддсдддд	сбсдбдабсд	абдсдддсбд	ссдддабдбб	360
сдсдсдсбда	сддааабдсд	абббсссдбс	бддадссдсд	сдабсадсдс	дсадддаасс	420
дбсааадсса	сдсбдддсбс	ддбдаасдсд	дсддбддбдб	дсдссдддас	дбсддбдада	480
дссддддабс	бсабсдбддс	сдасдабдас	ддддбддбдд	сддбдсддсд	ддаддаадбс	540
дбсдссдбда	сдсаддсддс	сдаасадсдс	дббсдсаадд	аададддсас	дсдсдсасдд	600
сбсдсдсадд	дсдадсбсдд	ссбддасабб	басддсббдс	дссадаадсб	дбсддабсба	660
ддсббдаадб	сабсдбсдбд	а				681

<210> 78 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 78

О1п

11е 10

Азр

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азп

Меб 1

ТЬг

Азр

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Агд

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

О1п

Агд

Туг

О1у

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

Ηίδ

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

Ьеи

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Ηί8

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

ТЬг

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

- 208

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

А1а 150

А1а

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

ТЬг

Зег

Уа1

Агд 160

А1а

О1у

Азр

Ьеи

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

А1а

Уа1 175

Агд

Агд

О1и

О1и

Уа1 180

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

О1п 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

О1у

ТЬг

Агд

А1а

Агд 200

Ьеи

А1а

О1п

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

О1п 215

Ьуз

Ьеи

Зег

Азр

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Зег

Зег Зег

225 <210> 79 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 79 аЕдадсдадс	сддЕсдЕсдЕ	ЕсддсадаЕс	дададдсссЕ	сЕЕсддссдс	даЕсдссдаЕ	60
сЕссддсддЕ	асддсдЕсЕс	дасддЕЕсас	даадсдсадд	дссдссдсдд	асЕдсЕсдсд	120
ЕссддссЕдс	ддссдаЕсЕа	Едсдассдсд	сЕсаЕддсдд	дсссЕдсдаЕ	сасддЕдсЕд	180
дЕсдсассдд	дсдасаассЕ	даЕдаЕссас	дЕсдссдЕсд	аддЕсЕдсса	дсссддддаЕ	240
дЕдсЕсдЕдд	Есасдссдас	дЕсассдЕдс	асддасддсЕ	аЕЕЕсддсда	дсЕдсЕддсс	300
асдЕсдсЕдс	дддсдсдадд	сдЕЕдсдддс	сЕсдЕсаЕсд	асдссддсЕд	ссдсдасаЕЕ	360
сдсдсдсЕда	сддадаЕдсд	дЕЕЕсссдЕа	ЕддадЕсдсд	сдаЕсадсдс	дсадддсасд	420
дЕсааадсса	сдсЕсддсЕс	сдЕдааЕдЕс	сссдЕсдЕсЕ	дсдссддсдс	дсЕЕдЕсдаа	480
дсдддсдасд	ЕсаЕсдЕсдс	сдасдаЕдас	ддддЕсдЕдд	ЕддЕдаадсд	дддсдаадЕс	540
дасдЕсдЕса	Ессаддсддс	ддадсадсдс	дЕдсдсаадд	аадаадЕсас	дсдддсссдд	600
сЕддсдсадд	дсдадсЕсдд	ЕсЕддасаЕс	ЕасддссЕдс	дсаадаадаЕ	ЕдсддассЕд	660
ддсЕЕдаадЕ	сдЕсдЕда					678
<210> 80 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
<220> <221> ДОМЕН

- 209 029538 <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 80

Меб 1

Бег

О1и

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд О1п

11е 10

О1и

Агд

Рго

Бег

Бег 15

А1а

А1а

11е

А1а

Азр

Ьеи

Агд

Агд

Туг

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

О1у

Ьеи

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

ТЬг

А1а

Ьеи

Меб

А1а

О1у

Рго

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

ТЬг

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

11е

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

О1у

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Уа1

11е

О1п

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

Уа1

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1п

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Бег

210 215 220

Бег

225 <210> 81 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 81

абдаасдадс	сдассдббдб	бсдадсдабс	дасаддссдс	сддсддабдб	ддбсдсддсд	60
сбссадсдсб	асддсдбдбс	дассдбдсаб	даадсасаад	ддадасдсдд	ссбсдбадсд	120
бссбдсабдс	ддссдабсба	сассддсдсб	ббддбсдссд	дбссбдссдб	аассдбсбсд	180

- 210 029538

сбсссдссдд	дсдасаассб	сабдаббсас	дбсдсбдбсд	аадссбдсса	ддсдддсдас	240
дбдсббдбсд	бддбдссдас	сбссссдбдс	асддасдддб	абббсддбда	дббасбддсд	300
асдбсдсбдс	асдсасдсдд	адбсдбддсб	сбсдбсабсд	абдссддсбд	ссдсдасдбд	360
сдсдсбсбдб	сддадабдсд	абббссбдбс	бддадссдсд	сдабсадсдс	бсадддсасд	420
дбсааадсса	сдббдддабс	ддбдаасдбб	сссдбддбдб	дсдсдддадс	дсссдбддад	480
сссддсдабд	бдабсдбсдс	сдасдасдаб	ддддбддбдд	ббдбдаадсд	садсдаддбд	540
дадддддбдд	сдсаддсдбс	ддадсадсда	дбссбдаадд	аддаддсдас	дсдсдадсдд	600
ббддсдсдсд	дсдадсбддд	ссбсдасабс	басдддсбдс	ддаааааддб	дбсддассбс	660
ддссбдаааб	аббсдбда					678

<210> 82 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 82

Меб 1

Азп

О1и

Рго

ТЬг 5

Уа1

Уа1

Агд А1а

11е 10

Азр

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Уа1

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

Ο1η

Агд

Туг

О1у

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а

20

25

30

Ο1η

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

Суз

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

ТЬг

35

40

45

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Нбз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

А1а

Суз

Ο1η

А1а

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Нбз

А1а

Агд

О1у

Уа1

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

Зег

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

А1а

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Рго

Уа1

О1и

145

150

155

160

- 211

Рго

О1у

Азр

Ча1

11е 165

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Ча1

Ча1

Ча1

Ча1 175

Ьуз

Агд

Зег

О1и

Ча1 180

О1и

О1у

Ча1

А1а

О1п 185

А1а

Зег

О1и

О1п

Агд 190

Ча1

Ьеи

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз 215

Ьуз

Ча1

Зег

Азр

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Зег

225 <210> 83 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 83 абдадсдадс сддбсдбсдб бсддсадабс дададдсссб сббсддссдс дабсдссдаб 60 сбссддсддб асддсдбсбс дасддббсас даадсдсадд дссдссдсдд асбдсбсдсд 120 бссддссбдс ддссдабсба бдсдадсдсд сбсабддбдд дсссбдсдаб сасддбдсбд 180 дбсдсассдд дсдасаассб дабдабссас дбсдссдбсд аддбсбдсса дсссддддаб 240 дбдсбсдбдд бсасдссдас дбсассдбдс асддасддсб абббсддсда дсбдсбддсс 300 асдбсдсбдс дддсдсдадд сдббдсдддс сбсдбсабсд асдссддсбд ссдсдасабб 360 сдсдсдсбда сддадабдсд дбббсссдба бддадбсдсд сдабсадсдс дсадддсасд 420 дбсааадсса сдсбсддсбс сдбдаабдбс сссдбсдбсб дсдссддсдс дсбсдбсдаа 480 дсдддсдасд бсабсдбсдс сдасдабдас ддддбсдбдд бддбдаадсд дддсдаадбс 540 дасдбсдбса бссаддсддс ддадсадсдс дбдсдсаадд аадаадбсас дсдддсдсдд 600 сбддсдсадд дсдадсбсдд бсбддасабс басддссбдс дсаадаадаб бдсддассбд 660 ддсббдаадб сдббдбда 678 <210> 84 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

- 212 029538 <400> 84

Меб 1

Бег

О1и

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд О1п

11е 10

О1и

Агд

Рго

Бег

Бег 15

А1а

А1а

11е

А1а

Азр

Ьеи

Агд

Агд

Туг

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

О1у

Ьеи

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

Бег

А1а

Ьеи

Меб

Уа1

О1у

Рго

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

ТЬг

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

11е

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

О1у

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Уа1

11е

О1п

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

Уа1

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1п

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Бег

210 215 220

Ьеи

225 <210> 85 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 85

абдассддса	ббдбсдбсда	дассабсдад	сдсдсдбсдс	бсдссдасаб	сдссдсдббд	60
дссдааббсд	дсдбсдссас	сабссасдад	дсдсадддсс	дсабсддссб	дсббдссбсс	120
ассабдсдсс	сдабсбасдс	аддсдсддсд	дссдссддса	абдссдбсас	сдбдбсддбд	180

- 213 029538

ссдсссддсд	асаасбддаб	дабссасдбс	дссдбсдадс	адбдссдсда	аддсдабабб	240
сбсдбсдбсд	сссссассад	сссдаасдас	аасддсбасб	ббддсдаасб	дсбддссбдс	300
бсдсбсаадб	сдсдсддсдб	дсдсддссбс	абсабсдадд	ссддсбдссд	сдасдбдааа	360
ссдсбсассд	адабдаадбб	ссссдбсбдд	бсссдсдссд	бсбссбссса	дддсасддбд	420
ааддааадсс	бсддсдасдб	даассбдссд	сбсбсдабсд	ссддссадсб	сдбсаасссс	480
ддсдабдбса	бсдбсдссда	бдасдасддс	дбддбсдбдд	бсбсссдсаа	бдаадбсадд	540
адсдбсассд	ссаадбсссд	сдадсдсдаа	дасааддадд	ссаадаассд	сдбдсадсбс	600
саадссддсс	адсбсддсаб	сдасабсбас	ддсабдсдсд	асаадсбсаа	ддссаадддс	660
сбссдсбасд	бсааабссдс	ддсддадббд	аадаадбад			699

<210> 86 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 86

Меб 1

ТЬг

О1у

11е

Уа1 5

Уа1

О1и

ТЬг

11е

О1и 10

Агд

А1а

Зег

Ьеи

А1а 15

Азр

11е

А1а

А1а

Ьеи 20

А1а

О1и

РЬе

О1у

Уа1 25

А1а

ТЬг

11е

НФз

О1и 30

А1а

Ο1η

О1у

Агд

11е 35

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег 40

ТЬг

Меб

Агд

Рго

11е 45

Туг

А1а

О1у

А1а

А1а 50

А1а

А1а

О1у

Азп

А1а 55

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Уа1 60

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп 65

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1 70

А1а

Уа1

О1и

Ο1η

Суз 75

Агд

О1и

О1у

Азр

11е 80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго 85

ТЬг

Зег

Рго

Азп

Азр 90

Азп

О1у

Туг

РЬе

О1у 95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

Суз 100

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд 105

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи 110

11е

11е

О1и

А1а

О1у 115

Суз

Агд

Азр

Уа1

Ьуз 120

Рго

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб 125

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

Тгр 130

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег 135

Зег

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1 140

Ьуз

О1и

Зег

Ьеи

О1у 145

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Рго 150

Ьеи

Зег

11е

А1а

О1у 155

Ο1η

Ьеи

Уа1

Азп

Рго 160

- 214

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Бег

Агд

165

170

175

Азп

О1и

Уа1

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

Бег

Агд

О1и

Агд

О1и

Азр

Ьуз

180

185

190

О1и

А1а

Ьуз

Азп

Агд

Уа1

О1п

Ьеи

О1п

А1а

О1у

О1п

Ьеи

О1у

11е

Азр

195

200

205

11е

Туг

О1у

Меб

Агд

Азр

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Уа1

210

215

220

Ьуз

Бег

А1а

А1а

О1и

Ьеи

Ьуз

Ьуз

225 230 <210> 87 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 87 абдддсаббд	бсдббсадаа	саббсадсдд	дсддадсадб	ссдбсабсда	бсдбсбсдсб	60
дсббдсддад	ббдсдассдб	асабдаадсд	садддссдса	аддддсбдсб	сдссадсбас	120
абдсддссда	бббабссддд	сдсдсддабс	дсддсдадбд	ссдбдасааб	ббссдсдссб	180
ссдддсдаба	асбддабдсб	дсабдбддсд	абсдадсада	бсааддсддд	сдабабссба	240
сбдсббдсдс	сдассадбсс	сбдсдаддас	ддббабббсд	дсдабсбсбб	ддсдасдбсб	300
дссабддсас	дсддсбдссд	сдддббддбд	абсдабдссд	дсдбдсдсда	бдбсдссдаб	360
сбсааддсда	бдааббббсс	сдбббддбсд	аадасдабсб	сбдсасаддд	дасддбсаад	420
дадасддбдд	дсбсддбсаа	баббсссдбс	дбсбдсдсса	дбдсдсбсдб	саабссбддс	480
дабдбдабсд	ббдссдабда	бдабддсдбс	бдсдбсдбас	ддсдддадда	адсбдссдад	540
дбсдсддаба	аддссдадса	дсдддбсдсд	дсадаададд	асаадсдссд	дсдасбддсс	600
дсдддбдаас	бсдддсбсда	бабсбасаад	абдсдсдадс	ддсбддсдда	дааддддсбд	660
ааабабдбсб	ад					672
<210> 88 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

- 215 029538 <400> 88

Меб 1

О1у

11е

Уа1

Уа1 5

Ο1η

Азп

11е

Ο1η

Агд 10

А1а

О1и

Ο1η

Зег

Уа1 15

11е

Азр

Агд

Ьеи

А1а 20

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а 30

Ο1η

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

11е 50

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

Меб

Ьеи

НФз

Уа1

А1а 70

11е

О1и

Ο1η

11е

Ьуз 75

А1а

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг 85

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег 100

А1а

Меб

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Ьеи

Ьуз

А1а

Меб

Азп 125

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Зег 130

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

А1а 135

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Уа1

О1у

Зег 145

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

Зег

А1а 155

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

А1а

А1а

О1и 180

Уа1

А1а

Азр

Ьуз

А1а 185

О1и

Ο1η

Агд

Уа1

А1а 190

А1а

О1и

О1и

Азр

Ьуз 195

Агд

Агд

Агд

Ьеи

А1а 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

Ьуз

Меб

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220

<210> 89 <211> 696 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 89 абдаадсдсд	дсдбддбддб	дасссабабс
сбдсдддадд	саддсдббдс	дассдбссас
бдсбасабдс	ддссдабсба	бссдддсдсд
дбдссдссдб	сддасаасбд	дабдсбдсаб
дбдсбддбдд	бддсдсссас	дбсбдссбдс

из окружающей среды

дсдсдддсдд	абдсддсдаа	сдбддссдбд	60
даддсдсада	дссддсббдд	бсббсбадсд	120
дссаббдссд	дассддссдб	сасддбдсбс	180
дбддсддбсд	аасадбдссд	сдсаддсдас	240
даддасдддб	абббсдддда	асбдсббдсс	300

- 216 029538

асдЕсдсЕсд	сдаадсдсдд	сдЕасадддс	сЕдаЕсаЕсд	аЕдсдддсЕд	ссдддаЕдЕд	360
ЕдсдсдсЕса	аддсааЕдда	ЕЕЕЕсссдЕд	ЕддЕсдаадд	ссдЕсЕссдс	дсадддсасд	420
дЕсааддада	сдсЕсддсЕс	ддЕсааЕдЕд	ссддЕсдЕаЕ	дсдсдсадса	даЕсдЕдсаЕ	480
ссдддадасд	ЕдаЕсдЕддс	сдаЕдасдас	ддсаЕсдЕсд	ЕддсдссдсЕ	сдссассдЕс	540
даддсддЕад	сдааддссдс	дсаддсдсдс	сЕддадаадд	аададаадас	дсдЕдсддЕд	600
сЕсдсаадсд	дсасдсЕсдд	ссЕсдасЕас	ЕасдсдаЕдс	дЕдасаддсЕ	сдсддааада	660
ддсЕЕдсдсЕ	асдЕсдаЕЕс	ддссЕсЕдаа	сЕЕЕда			696

<210> 90 <211> 231 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 90

МеЕ 1

Ьуз

Агд О1у

Уа1 5

Уа1

Уа1

ТНг

Н1з

11е А1а Агд А1а Азр А1а

А1а

10

15

Азп

Уа1

А1а

Уа1

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

А1а

ТНг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

Бег

Агд

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Суз

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТНг

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго

Бег

50

55

60

Азр

Азп

Тгр

МеЕ

Ьеи

Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд

А1а

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТНг

Бег

А1а

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

Ьеи

А1а

Ьуз

Агд

О1у

Уа1

О1п

О1у

Ьеи

11е

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Суз

А1а

Ьеи

Ьуз

А1а

МеЕ

Азр

РНе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

Уа1

Бег

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

О1и

ТНг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1п

О1п

11е

Уа1

Н1з

145

150

155

160

Рго

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

11е

Уа1

Уа1

А1а

Рго

165

170

175

- 217

Ьеи	А1а	ТЬг	Уа1 180	О1и	А1а	Уа1	А1а
Ьуз	О1и	О1и 195	Ьуз	ТЬг	Агд	А1а	Уа1 200
Азр	Туг 210	Туг	А1а	Меб	Агд	Азр 215	Агд
Уа1 225	Азр	Бег	А1а	Бег	О1и 230	Ьеи

Ьуз 185	А1а	А1а	О1п	А1а	Агд 190	Ьеи	О1и
Ьеи	А1а	Бег	О1у	ТЬг 205	Ьеи	О1у	Ьеи
Ьеи	А1а	О1и	Агд 220	О1у	Ьеи	Агд	Туг

<210> 91 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 91 абдаасааас сбддадаааб ссббасабдс сббссдсссд аббсбддбсд асббссббдс сдсбсссбса дбдаадбсса дсдддсдаса сдсдасдбдд сбддсдсддд сддбддбддб абддсдбдбс дсссдабсба дбдасаассб бсдсссссас дсдсссасдд ссдааабдаа сдсбсддабс бсдбсдбсдс ббдаадссбд дсдаасббдд ссддааддбс сасддбдсас бдссддсдсб сабдабссаб ббсассббдб сдбдааддса дбббсссдбд адбдаасдбд бдабдабдас бдаасададд дсбддасабс даасадссдс даадсдсаад бссабддссд дбсдсддбсд ассдасдддб сбсабаабсд бддадссдсд ддсдбадбдб ддадббдбсд дббсдсаадд басддаббдс сасаадабдс дссдббдсдд ддсссдссдб аадбдбдсса абббсддсда абдссддабд ссдбсадббс дбдсдддсдс бсдбдаадсд аададдсдас дсбссааддб ддбддсддсб дсбдсбсдсс сассдбсбсс дсссддааас дббдсбддсб ссдбдасдбд дсадддааса бббсабсдаа дасбббсдсд дсдддсасдд ддсддаасбс ддбсбсаадб асабабаа

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 92 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 92

Меб Азп Ьуз Рго Уа1 Уа1 Уа1 Агд Ьуз Уа1 О1и О1п Рго Рго О1п Азр 1 5 10 15

- 218 029538

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Рго

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

А1а

О1у

А1а 50

Зег

МеЕ

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1п

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

А1а 110

Ьеи

11е

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Зег

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

О1у

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

РЬе

11е

О1и 160

А1а

О1у

Азр

11е

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

ТЬг

РЬе

А1а 180

Агд

Азр

Уа1

Уа1

О1и 185

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

А1а

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Зег

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215

220

11е 225
<210> 93 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 93 аЕдааЕааас	сддЕддЕадЕ	ссддсаадЕд
сЕддадаадЕ	аЕддсдЕсас	сассдЕдсаЕ
сасЕасаЕдс	дЕссдаЕЕЕЕ	Ессдддадсд
ЕЕдссдссдд	дсдаЕаассЕ	саЕдаЕссас
аЕссЕддЕдд	ЕЕдсдссдас	сЕсдссЕЕсд
ассЕсЕсЕдс	дЕдсЕсдсдд	ЕдЕдааадда

из окружающей среды

дадсадссас	садсддасдс	ддЕЕдсддсд	60
даддсЕсадд	дасдЕЕдЕдд	ссЕдсЕсдсд	120
дссаЕсЕсдд	дЕЕсЕдсЕдЕ	сассдЕадсс	180
дЕсдсддЕсд	аддЕсЕдсдд	сссдддааас	240
асддаЕддсЕ	асЕЕсддЕда	дсЕдЕЕддсд	300
сЕЕдЕдаЕЕд	аЕдссддаЕд	ссдЕдасдЕЕ	360

- 219 029538

сдсбсссбда	ссдадабдаа	аббссссдбс	бддадссдбд	ссабсадсбс	дсадддааса	420
дбсааддсса	сссбсддабс	ддбдаабдбд	ссддбсабдб	дсдсдддсдс	дсбсдбсдаа	480
дсбддддабд	бсабсдбсдс	сдабдабдаб	ддааббдбдд	ббдбсаадсд	сдсдсабдсд	540
сасдаддбдд	ссдсддсддс	адаасааадд	дбдсдсааад	адаабабаас	ссдсдаасдд	600
сббсдасдсд	дададсбсдд	асбсдабабб	басдасабдс	дссааааааб	сдсдсаасбд	660
ддссбсаааб	ассбдбда					678

<210> 94 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 94

Меб Азп 1

Ьуз

Рго

Ча1 5

Ча1

Ча1

Агд О1п

Ча1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Ча1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Ча1

ТЬг

ТЬг

Ча1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

НФз

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

РЬе

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

Зег

О1у

Зег

А1а

Ча1

ТЬг

Ча1

А1а

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Ча1

А1а

Ча1

О1и

Ча1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Ча1

Ча1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Ча1

Ьуз

О1у

Ьеи

Ча1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Ча1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Ча1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Ча1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Ча1

Азп

Ча1

Рго

Ча1

Меб

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Ча1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Ча1

11е

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

11е

Ча1

Ча1

Ча1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

НФз

А1а

НФз

О1и

Ча1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Ча1

Агд

180

185

190

- 220

Ьуз

О1и

Азп

11е

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Агд

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225 <210> 95 <211> 639 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 95 дбдадсдабс сдабсдссда ссбдсдсддд бабддадбсб сдасддббса сдаддсссад ддссддсдсд дбсбдсбддс дссббасабд сдбссдабсб абдссддсдс ссббдбсдсс ддассадссд бдасддббсб ддбсссдссс ддсдасаасс бдабдабсса сдбсдссдбс дадсддбдсб сдссдддсда сабссбсдбс дбсдсдссда сдбсдссдбд сасддасддс бабббсддсд адсбдсбддс дасдбсдсбд сдддсасдсд дбдбсдссдс асбдабсабс дасдссддсб дсадддасдб дсдадсдсбс ассдадабдс дсббсссддб дбддадссдс дссабсадсд сссааддаас ддбдааддсд асдсбсддсб сддбдаабдб дссадбддбс бдсдссддад ссабсдбсдд бссбддсдас дбсабддббд сддасдабда сддсдбддбс дбддбдадда аддасдаадб сдссдсддбд асдсаддсдд сддсдсадсд ддбссдсааа даададддса сдсдддсдсд дсбддссдсд ддсдадсбсд дссбддасаб сбасддссбс сддсадаадс бдбсддабсб сддссбдаад бсдбсдбда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

639 <210> 96 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (9)...(161) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 96

Меб

Зег

Азр

Рго

11е

А1а

Азр

Ьеи

Агд

О1у

Туг

О1у

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

1

5

10

15

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

20

25

30

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

- 221 029538

35

40

45

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Агд

Суз

Бег

50

55

60

Рго

О1у

Азр

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТНг

Бег

Рго

Суз

ТНг

Азр

О1у

65

70

75

80

Туг

РНе

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

85

90

95

А1а

Ьеи

11е

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТНг

О1и

100

105

110

Меб

Агд

РНе

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

115

120

125

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

130

135

140

11е

Уа1

О1у

Рго

О1у

Азр

Уа1

Меб

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

145

150

155

160

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Азр

О1и

Уа1

А1а

А1а

Уа1

ТНг

О1п

А1а

А1а

А1а

О1п

165

170

175

Агд

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и

О1у

ТНг

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

180

185

190

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

О1п

Ьуз

Ьеи

Бег

Азр

Ьеи

О1у

195

200

205

Ьеи Ьуз Бег Бег 210 <210> 97 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 97

абдадсддсс	ссасддбсдб	бсдсдадабс	дассддссдд	ааддсдассб	сдбдассдса	60
сббдадсасд	сдддсдбдбс	дасддбссас	даадсасадд	дасддсдддд	асбдсбсдсс	120
ассбасабдс	ддссдаббба	сдссддадсс	дбдабсдссд	дассддсддб	сассдбссбс	180
дбдссдсссд	дсдасаассб	дабдаббсас	дбддсддбсд	аадбдбдссд	сссдддбдас	240
дбдсбддбсд	бсдссдбсас	дбсдссдбдб	ассдасддсб	асббсддбда	дсбдсбддсд	300
асдбсддббс	дсдсдсдсдд	сдбсаааддд	сбсдбсабсд	абдсадддбд	ссдддасдбд	360
сдддсдсбса	ссдадабдсд	дбббссддбд	бддадссддд	сддбсадбдс	дсадддсасс	420
дбсааддсса	сдсбсддсбс	сдбдаасдбб	ссадбсдбдб	дбдссддсдс	дсбсабсаса	480
ддбддадасд	бсдбсабсдс	сдасдасдаб	ддддбддбсд	бддбдаадсд	сдаддаадбд	540

- 222 029538

дасдсддбсд	ббсаддасбс дсдссадсдд сбдсбсаадд аадасдддас дсдададсдб	600
сбсдсдасад	дсдадсбддд дсбддасабс басбсдсбдс дсаадабдсб дбссдабсбд	660
ддасбдаадб	ассдабад	678

<210> 98 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 98

Меб 1

Бег

О1у

Рго

ТЬг 5

Уа1

Уа1

Агд О1и

11е 10

Азр Агд

Рго

О1и О1у Азр 15

Ьеи

Уа1

ТЬг

А1а

Ьеи

О1и

НФз

А1а

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

Уа1

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Уа1

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

11е

ТЬг

145

150

155

160

О1у

О1у

Азр

Уа1

Уа1

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

А1а

Уа1

Уа1

О1п

Азр

Бег

Агд

О1п

Агд

Ьеи

Ьеи

180

185

190

Ьуз

О1и

Азр

О1у

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

ТЬг

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Бег

Ьеи

Агд

Ьуз

Меб

Ьеи

Бег

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

- 223

Агд

225

<210> 99
<211> 639 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 99 дбдадсдабс	сдабсдссда	ссбдсдаддд	бабддбдбсб	ссасддббса	сдаддсдсад	60
ддссддсдсд	дссбдсбддс	дссббасабд	сдбссдабсб	абдссддсдс	дсбсдбсдсс	120
ддассадссд	бдасддбссб	ддбсссдссс	ддсдасаасс	бдабдабсса	сдбсдсбдбс	180
дадсддбдсб	сдссаддсда	сабссбсдбс	дбсдсдссда	сдбсдссдбд	сасддасддс	240
бабббсддсд	адсбдсбддс	дасдбсдсбд	сдддсасдсд	дбдбсдссдс	асбдабсабс	300
дасдсбддсб	дсадддасдб	дсдадсдсбс	ассдадабдс	дсббсссддб	дбддадссдс	360
дссабсадсд	сссааддаас	ддбдааадсд	асдсбсддсб	сддбдаабдб	дссасбддбс	420
бдсдссддад	ссабсдбсдд	бссбддсдас	дбсабддббд	сддасдабда	сддсдбддбс	480
дбддбдадда	аддасдаадб	сдссдсддбд	асдсаддсдд	сддсдсадсд	ддбссдсааа	540
даадааддса	сдсдддсдсд	дсбддссдсд	ддсдадсбсд	дссбддасаб	сбасддссбс	600
сддсадаадс	бдбсддабсб	сддссбдаад	бсдбсдбда			639
<210> 100 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (9)...(161) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 100

Меб 1

Бег

Азр

Рго

11е 5

А1а

Азр

Ьеи

Агд

О1у 10

Туг

О1у

Уа1

Бег

ТЬг 15

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п 20

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи 25

Ьеи

А1а

Рго

Туг

Меб 30

Агд

Рго

11е

Туг

А1а 35

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а 40

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг 45

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго 50

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Меб 55

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1 60

О1и

Агд

Суз

Бег

Рго

О1у

Азр

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

70 75 80

- 224 029538

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи 85

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи 90

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1 95

А1а

А1а

Ьеи

11е

11е 100

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд 105

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи 110

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе 115

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд 120

А1а

11е

Бег

А1а

О1п 125

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а 130

ТЬг

Ьеи

О1у

Бег

Уа1 135

Азп

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1 140

Суз

А1а

О1у

А1а

11е 145

Уа1

О1у

Рго

О1у

Азр 150

Уа1

Меб

Уа1

А1а

Азр 155

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1 160

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Азр 165

О1и

Уа1

А1а

А1а

Уа1 170

ТЬг

О1п

А1а

А1а

А1а 175

О1п

Агд

Уа1

Агд

Ьуз 180

О1и

О1и

О1у

ТЬг

Агд 185

А1а

Агд

Ьеи

А1а

А1а 190

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи 195

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи 200

Агд

О1п

Ьуз

Ьеи

Бег 205

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи Ьуз Бег Бег 210 <210> 101 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 101 абдаасасас сддбддбадс аадасаадбд дадсадссас садсддабдс ааббдссдса ббддадаадб дбддадбдас аассдбссаб даддсбсадд дасдббдбдд ссбссббдсд бссбасаббс дсссдаббба сссдддадса дссабсдсад дабссдсбаб сасбдбдбсб ббдссбссбд дсдасаассб сабдабссас дббдсддбдд аддбсбдсдд бссдддааас абссбддбад бббсассдас дбсдссббдб асддасддсб асббсддбда дббдббддса асабсбсбсс дбдсссасдд адбдаббддд сббдбдабсд абдссддабд ссдбдабдбд сдсбсбсбда садааабдаа аббсссддбс бддадссдсд ссабсбдббс дсдадддаса дбсааддсса сасббддабс ддбдаабдбд сссабсдбаб дсдсдддбдс аабддбсдад дсбддбдабд дсабсдбсдс сдасдабдаб ддсдббдбсд ббдбдаадсд адсдсбддсд саддадабсд сбдсддсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдбаас ссдсдаасда сбсдсасдбд дададсбсдд асббдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд ддссбсаааб абсбсбда <210> 102

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678

- 225 029538 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (28)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 102

А1а

Агд О1п

Уа1 10

О1и О1п Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп ТЬг

Рго Уа1 5

Уа1

А1а

11е

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

11е

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

11е

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Суз

Бег

Агд

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Меб

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

О1у

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

Ьеи

А1а

О1п

О1и

11е

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 103 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно

- 226 <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 103

абдаабсдас	сддбддбадб	ссддсаадбд	дадсаддсас	садсддабдс	ддбсдссдса
сбддадаадб	дсддадбдас	сассдбдсаб	даддсбсадд	дасддддбдд	ссбдсббдсс
бссбасабдс	дсссдаббба	сссдддадса	дссабсдссд	дббссдсдаб	сассдбдбсб
ббдсссссбд	дсдабаассб	сабдабссас	дбсдсадбдд	аддбсбдсдд	бссдддааас
аббсбддбдд	бббсассдаб	сбсдссббдб	асддабддбб	асббсддсда	дсбдббддса
асабсссбсс	дбдсссдсдд	бдддададдд	сббдбдабсд	абдссддабд	ссдддасдбд
сдсбсбббаа	садааабдаа	абббссадбс	бддадссдсд	ссдбсадббс	дсаддддаса
дбсааддсса	сасбдддабс	ддбдаабдбд	сссдбсдбдб	дбдсдддсдс	асбддбсдад
дсдддбдабд	бсабсдбсдс	сдабдасдаб	ддадббдбдд	бддбдаадсд	сдсдсбддсс
саддаддбсд	ссдссдсадс	ддаасааадд	дббсдсааад	адаассбдас	ссдсдаасда
сббдсдсдбд	дадаасбсдд	асбсдабабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсааабд
ддссббаааб	абсбсбаа
<210> 104 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 104

Меб Азп Агд 1

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п А1а

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег

Рго

11е

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

О1у

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

- 227 029538

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Ьеи

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п 215

Ьуз

11е

А1а

О1п

Меб 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 105 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 105

абдаабасас	сддбддбадб	ссддсаадбд	дадсадссас	сбдсддаддс	ддббдссдса	60
сбддаааадс	дбддддбдас	аассдбдсаб	даддсбсадд	дасдббдбдд	ссбссббдсс	120
бссбасабдс	дсссдаббба	сасдддадса	дсдабсдсад	дабссдсбаб	сасадбдбсс	180
ббдссдсссд	дсдасаассб	сабдабссас	дббдссдбдд	аддбабдбдд	ббсаддааас	240
абссбддбад	бббсассаас	сбсдссббдб	дсддабддсб	асббсддбда	дсбдббддса	300
асабсбсбсс	дбдсссабдд	бдбсададдд	сбддбдабсд	абдсдддабд	ссдбдабдбд	360
сдсбсссбаа	сададабдаа	абббссддбс	бддадссдсд	ссдбсадсбс	асаддддаса	420
дбсааддсса	сасббддабс	ддбдаасдбд	сссабсдббб	дсдсдддбдс	асбддбсдас	480
дсбддбдабд	бсабсдбсдс	адабдасдаб	ддсдббдбдд	бддбдаадсд	сдсдабддсд	540
саададдбсд	ссдсддсддс	ддаасааадд	дббсдсааад	адаабсбдас	ссдсдаасда	600
сббдсдсдбд	дбдаасббдд	бсбсдабабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсаасбд	660
ддасббаадб	абсбдбаа					678
<210> 106 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 228 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 106

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

О1и

МеЕ 1

Азп ТЬг

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1 А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Агд

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

ТЬг

35

40

45

О1у

А1а А1а

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Зег

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

А1а

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азр

145

150

155

160

А1а

О1у Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а МеЕ

А1а

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и Азп

Ьеи

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 107 <211> 636 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

- 229 029538 <400> 107

дбдадсдабс	сдабсдссдс	ссбдсдсдда	бабддсдббб	сдасддбдса	сдаддсдсад	60
дддсддсдсд	дссбдсбддс	дссббасабд	сдсссдабсб	абдссддбдс	дсбссбсдсс	120
дддсссдсдд	бдасддбссб	ддббссбссб	ддсдасаасс	бдабдабсса	сдбддсддбс	180
дадааабдсб	сдссбддада	сдбссбсдбс	дбсдссссдд	сдбсбссдбд	сасддасддс	240
басббсддад	ааббдсббдс	дасдбсдббд	сдддсссдсд	дсдббдссдд	сббдабсабс	300
дабдссддсб	дссдддабдб	дсдсдсдсбс	асддадабдс	ддбббссддб	дбддадссдс	360
ббсдбсбдсд	сбсадддсас	ддбдааддсс	асдсбсддсб	сдсбдаабдб	дссдсбддбс	420
бдсдссддсд	сссбсабсдс	бсссдсбдаб	дбсабсдббд	садасдабда	сддддбддбд	480
дбддбдаада	дддасдадаб	сдссабддбд	асдсаддсдд	сддадсадсд	ддббсдсааа	540
даддааддса	сдсдсдсдсд	дсбсдссдсд	ддсдадсбсд	дссбддасаб	сбасддсббд	600
сддсадаадс	бдбсддассб	сддссбсаад	бсдбда			636

<210> 108 <211> 211 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (9)...(161) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 108

11е 5

А1а

А1а Ьеи

Агд

О1у 10

Туг О1у Уа1

Зег

ТЬг 15

Уа1

Меб 1

Зег

Азр

Рго

Нбз

О1и

А1а

Ο1η 20

О1у

Агд

Агд О1у

Ьеи 25

Ьеи

А1а Рго Туг

Меб 30

Агд

Рго

11е

Туг

А1а 35

О1у

А1а

Ьеи

Ьеи А1а 40

О1у

Рго

А1а Уа1 ТЬг 45

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго 50

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Меб 11е 55

Нбз

Уа1

А1а Уа1 О1и 60

Ьуз

Суз

Зег

Рго 65

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1 70

Уа1 А1а

Рго

А1а

Зег Рго Суз 75

ТЬг

Азр

О1у 80

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи 85

Ьеи

А1а ТЬг

Зег

Ьеи 90

Агд А1а Агд

О1у

Уа1 95

А1а

О1у

Ьеи

11е

11е 100

Азр

А1а

О1у Суз

Агд 105

Азр

Уа1 Агд А1а

Ьеи 110

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе 115

Рго

Уа1

Тгр

Зег Агд 120

РЬе

Уа1

Суз А1а Ο1η 125

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

О1у

Зег

Ьеи Азп

Уа1

Рго

Ьеи Уа1 Суз

А1а

О1у

А1а

- 230

130 135 140

Ьеи 145

11е

А1а

Рго

А1а

Азр 150

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр 155

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1 160

Уа1

Уа1

Ьуз

Агд

Азр 165

О1и

11е

А1а

Меб

Уа1 170

ТЬг

О1п

А1а

А1а

О1и 175

О1п

Агд

Уа1

Агд

Ьуз 180

О1и

О1и

О1у

ТЬг

Агд 185

А1а

Агд

Ьеи

А1а

А1а 190

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

О1п

Ьуз

Ьеи

Бег

Азр

Ьеи

О1у

195 200 205

Ьеи Ьуз Бег 210 <210> 109 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 109 абдаабасас сддбддбадб аадасаадбд дадсадссас садсддабдс ааббдссдса ббааадаадб дбддадбдас аассдбссаб даддсбсадд дасдбддбдд ссбссббдсд бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дссабсдсад дабссдсбаб сасбдбдбсб ббдссбссбд дсдасаассб сабдабссас дббдсддбдд аддбсбдсдд бссдддааас абссбддбад бббсассдас дбсдссббдб асддасддсб асббсддбда дббдббддса асабсбсбсс дбдсссасдд адбдаббддд сббдбдабсд абдссддабд ссдбдабдбд сдсбсссбда садааабдаа дббсссддбс бддадссдсд ссабсбдббс дсаадддаса дбсааддсса сасббддабс ддбдаабдбд сссабсдбаб дсдсдддбдс аббддбсдад дсбддбдабд бсабсдбсдс сдасдабдаб ддсдббдбсд ббдбдаадсд адсдсбддсд саададабсд ссдсддсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдбаас ссдсдаасда сбсдсасдбд дададсбсдд асббдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд ддссбдаааб абсбсбда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 110 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174)

- 231 029538 <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 110

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп ТЬг

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

11е А1а

А1а

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

Меб

11е

Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

Бег

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Н1з

О1у

Уа1

11е

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Суз

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а Ьеи

А1а

О1п

О1и

11е

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и Азп

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 111 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 111

абдааададд	сддбддбддб	саддаабабб	дадсдсссдс	сддссдабдб	дабсдсддсд	60
сбддаааадб	ббддбдбббс	аасддбасас	даадсдсаад	дссдссдсдд	асббсбддсс	120
дсббабабда	ддссдаббба	бдддддсдсд	дссаббдссд	ддссбдсддб	дасбдбсбсд	180

- 232 029538

ббддсбссдд	дбдасаабсб	аабдаббсас	дбддссдбдд	аадбббдссд	дбсаддбдас	240
аббсбсдбдд	бсдсбссдас	дбсдссдбдс	асддабдддб	аббббддсда	дббдсбддсд	300
асббссббдс	дсдсдсасдд	ддбаааадда	сбсдбдабсд	аддсаддабд	ссдсдабдбс	360
сдддсдсбба	сддадабдаа	абббсссдбд	бддадссдсд	сддбдадббс	дсадддаасд	420
дбдааддсба	дбббдддсбс	ддбдаасдбд	ддааббдбдб	дсдсбдссдс	ддсдабсдаа	480
дссддсдасд	сдабсдббдс	сдабдабдас	ддсдббдбдд	бддбдааасд	сддсдасдсс	540
дссадбдббд	бсдссдсдбс	дсадсаасдс	дбссдсаадд	аададдсбдс	дсдаддасдс	600
сбддсдсдсд	дсдаасбддд	ссбддасабб	басддссбдс	дсдссааддб	сдсддадсбб	660
ддсббдаааб	абббдбда					678

<210> 112 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 112

Меб 1

Ьуз

О1и А1а Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

Азп

11е 10

О1и Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Уа1

11е

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

РЬе

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

О1у

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

А1а

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

Бег

О1у

Азр

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

О1и

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

Бег

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

О1у

11е

Уа1

Суз

А1а

А1а

А1а

А1а

11е

О1и

145

150

155

160

- 233

А1а

О1у

Азр

А1а

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

О1у

Азр

А1а 180

А1а

Бег

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Бег

О1п

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

А1а

Агд

О1у

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а 215

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 113 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 113 аЕдааадддд сЕддаааадЕ дсЕЕаЕаЕда

ЕЕддсЕссдд аЕЕсЕсдЕдд асЕЕссЕЕдс сдддсдсЕЕа дЕдааддсЕа дссддЕдасд дссдсЕдЕдд сЕддсдсдсд сддЕддЕддЕ

ЕЕддЕдЕЕЕс ддссдаЕЕЕа дсдасааЕЕЕ

ЕсдсЕссдас дсдсдсасдд сддадаЕдаа сЕЕЕдддсЕс

ЕдаЕсдЕЕдс

ЕсдссдсдЕс дсдаасЕддд саддааЕаЕс дасддЕдсас

Едддддсдсд ааЕдаЕЕсас дЕсдссдЕдс ддЕаааадда аЕЕЕсссдЕд ддЕдаасдЕд сдаЕдаЕдас дсадсаасдс ссЕддасаЕЕ дадсдсссдс даадсдсаад дссаЕЕдссд дЕддсддЕдд асддаЕдддЕ сЕддЕдаЕсд

Еддадссдсд даааЕЕдЕдЕ ддсдЕЕдЕдд дЕссдсааад

ЕасддссЕдс сддссдаддЕ дасдссдсдд ддссЕдсддЕ аадЕЕЕдссд аЕЕЕЕддсда аддсаддаЕд сддЕдадЕЕс дсдсЕдссдс

ЕддЕдааасд аадаадсЕас дсдссааддЕ ддЕсдсддсд асЕЕсЕддсс дасЕдЕсЕсд дЕсаддсдас дЕЕдсЕддсд ссдсдаЕдЕс дсадддаасд ддсдаЕсдаа дддсдасдсс дсдадаасдс сдсддадсЕЕ ддсЕЕдаааЕ аЕЕЕдЕда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 114 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

- 234 029538 <400> 114

МеЕ 1

Ьуз

О1у

А1а

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

Азп

11е 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

О1и

Уа1

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

РЬе

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

А1а

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

О1у

О1у

А1а 50

А1а

11е

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

А1а

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Агд

Зег

О1у

Азр 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

О1и

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

О1и

11е

Уа1

Суз

А1а 155

А1а

А1а

А1а

11е

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

О1у

Азр

А1а 180

А1а

А1а

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Зег

О1п

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225 <210> 115 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 115

аЕдЕсддЕЕд	ЕсдЕЕсадаа	саЕсдадсдЕ	дсЕдаЕсадЕ	сддЕсаЕсда	ссддсЕддсс	60
дссЕдсддсд	ЕЕдссасддЕ	дсаЕдаадсд	садддссдса	адддссЕдсЕ	сдссадсЕаЕ	120
аЕдсддссда	ЕсЕЕЕссддд	ЕдсасдссЕс	дсддсдадЕд	ссдЕсасЕаЕ	сЕссдсассЕ	180
ссдддсдаса	асЕддаЕдсЕ	дсаЕдЕддсд	аЕсдаасадЕ	Едааддссдд	сдасаЕЕсЕд	240

- 235 029538

сбдсбсдссс	сдассадссс	сбдсдаддас	ддсбабббсд	дбдабсбссб	сдссасдбсб	300
дсдсаддсдс	дсддббдсда	дддаббдабс	абсдабдсдд	дбдббсддда	бдбддсбдаб	360
сбдасддада	бдааабббсс	бдбсбддбсд	ааддсдабсб	бсдсссаддд	сасадбсаад	420
дадасссбсд	дббсбдбдаа	сдбассддбс	дбабдсдсбд	дсдссбабдб	бсдсссдддб	480
дабдбдабсд	ббдссдабда	бдабддсдбб	бдбдббдбдс	бдсдсдадда	адсбдаадбд	540
дбсдсааада	аддсддаадс	ссдбдббдсд	дссдаадабд	дбааасдсаа	дсддсбсдсд	600
дссддсдаас	бсддссбсда	бабсбасдас	абдсдсддсс	ддсбддсбда	ааадддссбд	660
аадбабабсб	да					672

<210> 116 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 116	О1и	Агд А1а Азр О1п Зег Уа1	11е
Меб 1	Зег Уа1	Уа1	Уа1 5	О1п Азп	11е
10	15
Азр	Агд Ьеи	А1а 20	А1а	Суз О1у	Уа1	А1а 25	ТЬг	Уа1 НФз О1и А1а О1п 30	О1у
Агд	Ьуз О1у 35	Ьеи	Ьеи	А1а Зег	Туг 40	Меб	Агд	Рго 11е РЬе Рго О1у 45	А1а
Агд	Ьеи А1а 50	А1а	Зег	А1а Уа1 55	ТЬг	11е	Зег	А1а Рго Рго О1у Азр 60	Азп
Тгр 65	Меб Ьеи	НФз	Уа1	А1а 11е 70	О1и	О1п	Ьеи	Ьуз А1а О1у Азр 11е 75	Ьеи 80
Ьеи	Ьеи А1а	Рго	ТЬг 85	Зег Рго	Суз	О1и	Азр 90	О1у Туг РЬе О1у Азр 95	Ьеи
Ьеи	А1а ТЬг	Зег 100	А1а	О1п А1а	Агд	О1у 105	Суз	О1и О1у Ьеи 11е 11е 110	Азр
А1а	О1у Уа1 115	Агд	Азр	Уа1 А1а	Азр 120	Ьеи	ТЬг	О1и Меб Ьуз РЬе Рго 125	Уа1
Тгр	Зег Ьуз 130	А1а	11е	РЬе А1а 135	О1п	О1у	ТЬг	Уа1 Ьуз О1и ТЬг Ьеи 140	О1у
Зег 145	Уа1 Азп	Уа1	Рго	Уа1 Уа1 150	Суз	А1а	О1у	А1а Туг Уа1 Агд Рго 155	О1у 160
Азр	Уа1 11е	Уа1	А1а	Азр Азр	Азр	О1у	Уа1	Суз Уа1 Уа1 Ьеи Агд	О1и

- 236

165 170 175

О1и А1а О1и

Уа1 180

Уа1

А1а Ьуз

Ьуз

А1а О1и А1а Агд Уа1 185

А1а 190

А1а

О1и

Азр

О1у

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Азр

Меб

Агд

О1у

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

11е

210

215

220

<210> 117 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 117 абдддбдбсд	бсдбссадаа	саббдассдс	дссдадсаад	ссдбсабсда	ссддсбсдсс	60
дссбдсддсд	бсдсдассдб	дсабдаддсд	саддддсдса	аддддсбдсб	ддсдадсбаб	120
абдсддссда	бсбабсссдд	сдсдсддабс	дсддсдадбд	сддбдасдаб	сбсддсдссд	180
ссбддбдаса	асбддабддб	дсабдбддсд	абсдадсадд	бдааддабдд	сдасабссбд	240
сбдсбддсас	сдассадссс	сбдсдаддас	ддсбабббсд	дсдабсбббб	ддсдассбсд	300
дссббддсдс	ддддсбдссд	сдддсбддбс	абсдабдссд	дсдбдсдсда	сдбсдсбдас	360
сббдсддсда	бдаадбббсс	ддбсбддбсд	ааадсдабсб	бсдсссаддд	сасддбсаад	420
дааасдсбдд	дббсддбдаа	бдбдссддбс	дбсбдсдссд	дсдсдсбддб	саассссддс	480
дасдбдабсд	бсдссдасда	бдасддсдбб	бдбдбсдббс	дссдсдаада	ддсддсддад	540
дббдсадаса	аддсбдаддс	ссасдбсдсд	дсададдадд	дсаадсдсаа	дсддсбддсд	600
дссддсдадс	ббддбсбсда	сабсбасдас	абдсдсаадс	ддсбсдссда	дааадддсбд	660
ааабабдбсб	да					672
<210> 118 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 118

Меб О1у Уа1 Уа1 Уа1 Ο1η Азп 11е Азр Агд А1а О1и Ο1η А1а Уа1 11е

5 10 15

- 237 029538

Азр

Агд

Ьеи

А1а 20

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

11е 50

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

Меб

Уа1

НФз

Уа1

А1а 70

11е

О1и

О1п

Уа1

Ьуз 75

Азр

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг 85

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег 100

А1а

Ьеи

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Ьеи

А1а

А1а

Меб

Ьуз 125

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Бег 130

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а 135

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Бег 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

А1а

А1а

О1и 180

Уа1

А1а

Азр

Ьуз

А1а 185

О1и

А1а

НФз

Уа1

А1а 190

А1а

О1и

О1и

О1у

Ьуз 195

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210		215		220
<210> 119 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 119 абдддбаббд	ббдббсадаа	сабсаадсдд	дсддассссд	ддабсабадс	аддбсббддс	60
ааабдсддсд	ббдссасбдб	дсабдаадсд	саддддбдса	аддддсбссб	ддсддссбаб	120
абдсддссса	бббаббсбдд	сдсдсдссбб	дссдссбссд	сбдбсассаб	ббссдсдссд	180
ссдддадаса	асбддабддб	дсабдбсдсс	аббдадсадд	бдаддсаадд	бдабаббсбд	240
дббсббдссс	саасабсдсс	сбдбдаадас	ддсбабббсд	дбдабббдсб	сдссассбсс	300
абдсбдсадс	дсддсддсад	ддддсбдабб	аббдасдссд	дбдбссдсда	бабссдбдаб	360
сбдасбсааа	бдааабббсс	ддбдбддбсд	аааассдббб	ббдсдсаддд	сассдббаад	420

- 238 029538

дааасссббд	дсбсбдбдаа	сдбсссдаба	дбббдсдссд	дбдаадбддб	саабссбддс	480
дасабсабда	ббдссдабда	бдабддбдбд	бдсдбддбсс	ддсдсдасда	сдсбдааадс	540
дбдсббдааа	аадсаббддс	дсдбдаддса	ааддаадаад	абасасдсаа	асдссббдсд	600
дсаддсдадс	бдддбсббда	бабббасддс	абдсдсдсас	дбсбддссда	ааадддссба	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 120 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 120

11е

Ьуз

Агд 10

А1а

Азр

Рго

О1у

11е 15

11е

Меб 1

О1у

11е

Ча1

Ча1 5

О1п

Азп

А1а

О1у

Ьеи

О1у

Ьуз

Суз

О1у

Ча1

А1а

ТЬг

Ча1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Суз

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Зег

А1а

Ча1

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

Ча1

НФз

Ча1

А1а

11е

О1и

О1п

Ча1

Агд

О1п

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Ча1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Меб

Ьеи

О1п

Агд

О1у

О1у

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Ча1

Агд

Азр

11е

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1п

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Ча1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

ТЬг

Ча1

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Ча1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Ча1

Азп

Ча1

Рго

11е

Ча1

Суз

А1а

О1у

О1и

Ча1

Ча1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

11е

Меб

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Ча1

Суз

Ча1

Ча1

Агд

Агд

Азр

165

170

175

Азр

А1а

О1и

Зег

Ча1

Ьеи

О1и

Ьуз

А1а

Ьеи

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

О1и

Азр

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

- 239

Туг О1у Меб Агд А1а Агд Ьеи А1а О1и Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1 210 215 220 <210> 121 <211> 696 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 121 абдаадсдсд дбдбсдбсдб сасссабабс дадсдсдсса асссдсдбда сдбддссдбд 60 сббсадсадд сдддсдсбдс дассдббсаб даадсдсада дссдбсбддд ссбдсбсдсд 120 бсдбасабдс ддсссабсба бдсдддсдсд бсаабсдсдд дабсддсддб дасддбдсбс 180 дбдссдссдб сддасаасбд дабдббдсас дббдссдссд аасадбдссд сдааддсдас 240 дбдсбсдбдд бсдсдссдас ббсдссдбдс даадасддсб асббсддсда асбдсбсдсд 300 асдбсдсббд ссдсдсдсдд бдбдсдсддд сбсабсабсд абдсдддсбд бсдсдабдбд 360 сдсдсдсбса аддасабдаа сббсссддбс бддбсдааад сддбсбсбдс дсааддсасд 420 дбдааддада сдсбдддсбс ддбсаабдбд ссбдббдбдб дсдсасадса дабсдбдсаб 480 дсдддсдасд бдабсдбсдс сдасдабдас ддсдбсдбдд бсдбдссдбб сдссасддбд 540 бсдсдсдбдд ссдаадсадс дсаддсдсдб сбсдсдаадд аададаадас дсдббссдбд 600 сбсдсдасдд дсдбдсбддд ссбсдасбас басадсабдс дбдасаадсб сдсддаааад 660 ддссбдсдбб асдбсдддбс дабсдаддаа дсдбда 696 <210> 122 <211> 231 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 122	Уа1	ТЬг
Меб 1	Ьуз	Агд	О1у	Уа1 5	Уа1
Азр	Уа1	А1а	Уа1 20	Ьеи	О1п	О1п	А1а
О1п	Бег	Агд 35	Ьеи	О1у	Ьеи	Ьеи	А1а 40
О1у	А1а	Бег	11е	А1а	О1у	Бег	А1а

Нбз	11е 10	О1и	Агд	А1а	Азп	Рго 15	Агд
О1у 25	А1а	А1а	ТЬг	Уа1	Нбз 30	О1и	А1а
Бег	Туг	Меб	Агд	Рго 45	11е	Туг	А1а
Уа1	ТЬг	Уа1	Ьеи	Уа1	Рго	Рго	Бег

- 240 029538

55 60

Азр Азп Тгр 65

Меб

Ьеи

НФз 70

Уа1

А1а А1а О1и Ο1η Суз 75

Агд

О1и

О1у

Азр 80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

11е

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

Меб

Азп

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

Уа1

Зег

А1а

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

Ο1η

Ο1η

11е

Уа1

НФз

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

165

170

175

РЬе

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

Агд

Уа1

А1а

О1и

А1а

А1а

Ο1η

А1а

Агд

Ьеи

А1а

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

Ьуз

ТЬг

Агд

Зег

Уа1

Ьеи

А1а

ТЬг

О1у

Уа1

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

Туг

Туг

Зег

Меб

Агд

Азр

Ьуз

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

210

215

220

Уа1

О1у

Зег

11е

О1и

О1и

А1а

225 230 <210> 123 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 123

абдаасааас	ссдбддбадб	дсддсаасбд	дадсадссас	ссдссдабдс	ддббдсддсс	60
сбддадаадб	абддсдбдас	бассдбссас	даддсбсадд	дасдббдбдд	ссбдсбддсб	120
ссббабабдс	дассдабббб	бдсдддадсс	бдсабсдссд	дббссдссдб	сассдбдбсб	180
ббдссдсссд	дсдабаасбб	сабдабссас	дббдссдбсд	аддбсбдсад	бссдддсадс	240
аббсбсдбад	бсдсссссас	сбсассббдс	асддасддбб	абббсддсда	асбсббддса	300
асббсссбсс	дсдсбсасдд	бдбсааадда	сбддбсаббд	абдссддсбд	ссдддабдбб	360
сдсбсдббаа	сддааабдаа	аббссссдбб	бддадссдбд	сддбдадббс	дсааддаасд	420
дбдааддсба	сдсбсддабс	бдбдаабдбд	ссддбсаббб	дсдсдддсдс	сдаддбддаа	480
дссддбдасд	бсабсабсдс	сдабдасдаб	ддбдбддбад	бддбдаадсд	бдсдасбдсс	540

- 241 029538

сасдаддЕад	садсддсддс	ддаасаасда	дЕЕсдсаадд	адааЕдссас	Есдсдаасда	600
сЕддсасдад	дадаасЕсдд	ссЕсдасаЕс	ЕасдасаЕдс	ддсааааааЕ	сдсдсаасЕЕ	660
ддЕсЕсаааЕ	аЕсЕдЕда					678

<210> 124 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 124

МеЕ Азп Ьуз 1

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд О1п

Ьеи 10

О1и

О1п

Рго

Рго А1а Азр 15

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

РЬе

А1а

35

40

45

О1у

А1а

Суз

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

РЬе

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Зег

Рго

О1у

Зег

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

11е

Суз

А1а

О1у

А1а

О1и

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

ТЬг

А1а

НФз

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

- 242

225 <210> 125 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 125

аЕдаасдаЕс	ссдЕсдЕсдЕ	ссдададаЕс	дададдссдЕ	сддсдасдЕс	даЕсдасдаЕ	60
сЕдсддсдЕЕ	ЕсддсдЕсЕс	дасддЕдсас	даадсдсадд	ддсдссдсдд	дсЕдсЕсдса	120
ЕсдЕасаЕдс	ддссдаЕсЕа	Едссддсдсд	сЕддЕсдссд	ддссЕдсдаЕ	ЕассдЕссЕд	180
дЕдасдссдд	дсдасаассЕ	даЕдаЕссаЕ	дЕсдсддЕсд	адаЕсЕдсса	дссаддсдаЕ	240
дЕссЕсдЕсд	Есдссссдас	дЕсдссдЕдс	ассдасддаЕ	асЕЕсддсда	дсЕдсЕддсд	300
асдЕсдЕЕдс	дадсдсаЕдд	сдЕсдсдддЕ	сЕдаЕсаЕсд	аЕдссддсЕд	ссдддаЕдЕЕ	360
сдсЕсдЕЕда	дсдадаЕдсд	аЕЕЕсссдЕд	Еддадссдсд	сдаЕсадсдс	ссаддддасс	420
дЕсааддсда	сдсЕдддЕЕс	ддЕдаасдЕд	ссдсЕддЕдЕ	дсдссддадс	дсЕддЕсдад	480
ссдддсдаЕд	сдаЕсдЕсдс	сдасдасдас	ддЕдЕсдЕсд	ЕсдЕсаддсд	ддаасаддЕс	540
дасасЕдЕдЕ	дссаддсддс	дддасадсдс	дЕдсдсаадд	аададдасас	дсдсдсдсдд	600
сЕддсдсаад	дсдадсЕЕдд	ссЕсдасаЕс	ЕасддсЕЕдс	дсааааадсЕ	дЕсддассЕс	660
дддЕЕдаадЕ	сдЕсдЕда					678

<210> 126 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 126

МеЕ 1

Азп

Азр

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1и

11е 10

О1и

Агд

Рго

Бег

А1а 15

ТНг

Бег

11е

Азр

Азр

Ьеи

Агд

Агд

РНе

О1у

Уа1

Бег

ТНг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а

11е

ТНг

Уа1

Ьеи

Уа1

ТНг

Рго

О1у

- 243 029538

Азр 65

Азп

Ьеи Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

11е 75

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр 80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

11е

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи

Бег

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

Рго

О1у

Азр

А1а

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Агд

165

170

175

Агд

О1и

О1п

Уа1

Азр

ТЬг

Уа1

Суз

О1п

А1а

А1а

О1у

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

Азр

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1п

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Бег

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Бег

210

215

220

Бег

225

<210> 127 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 127 абдаасдабс	сддбсдбсдб	бсдсдадабс
сбссддсдсб	бсддсдбдбс	дассдбссас
бсдбасабас	ддссдаббба	ббсаддсдсс
дббасдссбд	дсдасаассб	дабдабссас
дбдсбсдбсд	бсдссссдас	дбсдссдбдс
асабсдсбдс	дбдсссасдд	сдбсдбсддд
сдсдссббда	дсдадабдсд	абббссбдбд
дбсааадсса	сдсбдддсбс	ддбдаасдбд
дссддсдасд	сдабсдбддс	сдасдасдас
дабдсбдбсс	дсдаддсддс	сдаасдасдс

из окружающей среды

дасаддссдд	сдддбассдс	сабсдасдаб	60
даадсдсадд	ддсдббдсдд	сббдсбсдсб	120
сбдсбсдссд	дсссддсдаб	сассдбссад	180
дбсдсбдбсд	аадбдбдссд	дссаддадас	240
асддабддсб	абббсддсда	дсбдсбсдсд	300
сбдабсабсд	асдссддббд	ссдддасдбб	360
бддадбсдсд	сдабсадсдс	дсадддсасс	420
ссдсбдббдб	дбдссдддаб	дсбддбсдад	480
ддадбддбдд	бддбсаддсд	дадссаддбс	540
дбдсдсаадд	аададдасас	дсдддсссдд	600

- 244 029538 сбсдсссдад дсдадсббдд ссбсдасабс басддссбдс дсаддааасб дбсадасссс ддбббдаадб сдбсдбда

660

678 <210> 128 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 128

Меб Азп

А1а 11е

Ο1η О1у

О1у А1а

Азр Азп 65

Уа1 Ьеи

О1и Ьеи

11е Азр

Рго Уа1 130

Ьеи О1у 145

А1а О1у

Агд Зег

Ьуз О1и

Азр 11е

210

Азр Рго

Азр Азр 20

Агд Суз 35

Ьеи Ьеи

Ьеи Меб

Уа1 Уа1

Ьеи А1а 100

А1а О1у 115

Тгр Зег

Зег Уа1

Азр А1а

Ο1η Уа1

180

О1и Азр

195

Туг О1у

Уа1 Уа1 5

Ьеи Агд

О1у Ьеи

А1а О1у

11е Нбз

А1а Рго 85

ТЬг Зег

Суз Агд

Агд А1а

Азп Уа1 150

11е Уа1

165

Азр А1а

ТЬг Агд

Ьеи Агд

Уа1 Агд

Агд РЬе

Ьеи А1а 40

Рго А1а 55

О1и 11е

О1у Уа1

Зег Туг

11е ТЬг

Уа1 А1а

ТЬг Зег

Ьеи Агд

Азр Уа1 120

11е Зег 135

Рго Ьеи

А1а Азр

Уа1 Агд

А1а Агд 200

Агд Ьуз 215

Уа1 О1и

Рго Суз 90

А1а Нбз 105

Агд А1а

А1а Ο1η

Ьеи Суз

Азр Азр 170

О1и А1а

185

Ьеи А1а

Ьеи Зег

Азр Агд

Зег ТЬг

11е Агд

Уа1 Ο1η

Уа1 Суз 75

ТЬг Азр

О1у Уа1

Ьеи Зег

О1у ТЬг 140

А1а О1у 155

О1у Уа1

А1а О1и

Агд О1у

Азр Рго 220

Рго А1а

Уа1 Нбз 30

Рго 11е 45

Уа1 ТЬг

Агд Рго

О1у Туг

Уа1 О1у 110

О1и Меб 125

Уа1 Ьуз

Меб Ьеи

Уа1 Уа1

Агд Агд 190

О1и Ьеи

205

О1у Ьеи

О1у ТЬг 15

О1и А1а

Туг Зег

Рго О1у

О1у Азр

РЬе О1у 95

Ьеи 11е

Агд РЬе

А1а ТЬг

Уа1 О1и 160

Уа1 Агд 175

Уа1 Агд

О1у Ьеи

Ьуз Зег

Зег

225

- 245

<210> 129
<211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 129 абдаасааас	сддбддбддб	ссддааддбс	даасадссдс	сасаадабдс	ддбддсддсб	60
сбддадаааб	абддсдбсбс	сасддбдсас	даадсдсаад	дссдббдсдд	дсбдсбсдсс	120
дсббасабдс	дсссдабсба	бдссддадсб	бссабддссд	дасссдссдб	дассдбббсс	180
сббссдсссд	дбдасаассб	сабдабссас	дбсдсддбсд	аадбдбдсса	ссссддааас	240
аббсбддбсд	бсдсссссас	ббсассббдб	ассдасдддб	абббсддсда	дббдсбддсб	300
асббссббдс	дсдсссасдд	сдбдааддса	сбсабаабсд	абдссддабд	ссдбдасдбд	360
сдсбсссбса	ссдааабдаа	дбббсссдбд	бддадссдсд	ссдбсадббс	дсадддааса	420
дбдаадбсса	сдсбсддабс	адбдаасдбд	ддсдбадбдб	дбдсдддсдс	бббсабсдаа	480
дсдддсдаса	бсдбсдбсдс	бдабдабдас	ддадбсдбсд	бсдбдаадад	ддсбббсдсд	540
сдсдасдбдд	ббдаадссбд	бдаасададд	дбссдсаадд	аадаадсдас	дсдддсасдс	600
сбддсдсадд	дсдадсббдд	бсбддасабс	басддаббдс	дсдссааадб	ддсддадсбс	660
ддбсбсаадб	асабабаа					678
<210> 130 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 130

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

О1п 15

Азр

Меб 1

Азп

Ьуз

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

Ηίδ 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

Туг

А1а

О1у

А1а 50

Зег

Меб

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Ηί8

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Ηίδ

Рго

О1у

Азп

- 246 029538

70 75 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

А1а 110

Ьеи

11е

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

О1у

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

РЬе

11е

О1и 160

А1а

О1у

Азр

11е

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

РЬе

А1а 180

Агд

Азр

Уа1

Уа1

О1и 185

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

А1а

Агд 200

Ьеи

А1а

О1п

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а 215

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

11е

225 <210> 131 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 131
абдадсабсд	бсдбдсадаа	сабсдадсда	дсддассбдд	аддсддббас	дасдсббддс	60
даабдсддбд	бддсдассдб	дсасдаддса	сааддссдса	сдддссбсаб	дсбссссбаб	120
абдсддссда	бсбддссддд	сдсасддабс	дсаддсссдд	сбдбдассдб	сбсссбдссд	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	ссабдбсдсд	дбддадсааб	дссдддаддд	сдасабссбд	240
абсдбддсдс	сдассадссс	садсдаддас	ддсбабббсд	дсдадсббсб	ддсдсдсбсд	300
сбсдбддсдс	дсадсдбсаа	дддсббсдбд	абсдаддсбд	дддбдсдсда	бдбдсдсдас	360
сббассдада	басдбббссс	ддбсбддбсд	сдддсадбсб	ссдсссаддд	сасддбсаад	420
дааасдабсд	дсбсддбдаа	сдбдссдабс	дбсбдсдсад	дбдсбдсддб	даабссдддс	480
дасдбддбсд	бддсбдасда	бдасддсаба	бдбдбсдбдд	сбсдсдасаа	адсбддбдад	540
дбддссаадд	сбдсдсдадс	дсдсдаддсд	ааддаадсбд	ааасдсдссд	ссддсбдабс	600
аабддсдадс	бсдддсбсда	сабсбабдда	абдсдддада	адсббдсддс	даадддссбд	660

- 247 029538 ааабабдбсб да

672 <210> 132 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 132

Меб 1

Бег

11е

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е О1и

Агд А1а Азр 10

Ьеи

О1и

А1а 15

Уа1

ТНг

ТНг

Ьеи

О1у

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТНг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТНг

О1у

Ьеи

Меб

Ьеи

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Тгр

Рго

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТНг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

11е

Уа1

А1а

Рго

ТНг

Бег

Рго

Бег

О1и

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

Агд

Бег

Ьеи

Уа1

А1а

Агд

Бег

Уа1

Ьуз

О1у

РНе

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТНг

О1и

11е

Агд

РНе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

О1и

ТНг

11е

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

11е

Суз

Уа1

Уа1

А1а

Агд

Азр

165

170

175

Ьуз

А1а

О1у

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

А1а

Агд

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

О1и

ТНг

Агд

Агд

Агд

Ьеи

11е

Азп

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 133 <211> 672 <212> ДНК

- 248 029538 <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 133 абдаасабсд бсдбссадаа сабсдадсдс дссдабссдд сддбдабсдс сддссбсдсс 60 дадбдсддсд бсдссасадб ссасдаадсд саддддсдса бсдддсбдаб дбсабсдаад 120 абдсддссда бсбасдссдд сдсссдсабс дсддссбсдд сддбдассдб дбсдсбдссд 180 ссддссдаса асбддабдаб ссабдбсдсс дбддадсада бсааадсддд сдасдбсабд 240 дбсдбддсдс сдассбсдсс сбсддасдсд ддсбаббббд дсдассбдсб сдссааббсд 300 сбдсаддссс ддддсбдсдс сддссбсдбд абсдабдссд дддбдсдсда сдбдсдбдас 360 сббассдааа бдсддббссс сдбсбддбсд асддсдабсб сддсдсаддд аассдбсаад 420 дааасдсббд дббсддбдаа сдбсссдабс дбсбдсдссд дбдсасабдб сдаасссддс 480 дасдбдабсд бсдссдасда сдасддсдбс бдсабсдбса адсдсассда сдсддсбдсд 540 дбдсбсдааа аддсдсдддс ссддсбсдсд аасдааассд асаадсдсда дааасбсдсд 600 аасддсасдс бдддссбсда бсбсбасаад абдсдсдадд сдсбддадаа даадддссбс 660 аддбабдссб да 672 <210> 134 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (193)...(196) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά = РЗ00001 <220>

<221> САЙТ <222> (204)...(207) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргоз1бе ίά = РЗ00001 <400> 134

Меб

Азп

11е

Уа1

Уа1

Ο1η

Азп

11е

О1и

Агд

А1а

Азр

Рго

А1а

Уа1

11е

1

5

10

15

А1а

О1у

Ьеи

А1а

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

Ο1η

О1у

20

25

30

Агд

11е

О1у

Ьеи

Меб

Зег

Зег

Ьуз

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

40 45

- 249 029538

Агд

11е А1а 50

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг Уа1

Зег Ьеи

Рго 60

Рго

А1а

Азр

Азп

Тгр

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

11е

Ьуз

А1а

О1у

Азр

Уа1

МеЕ

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

Азп

Зег

Ьеи

О1п

А1а

Агд

О1у

Суз

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

ТЬг

А1а

11е

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

НФз

Уа1

О1и

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

11е

Уа1

Ьуз

Агд

ТЬг

165

170

175

Азр

А1а

А1а

А1а

Уа1

Ьеи

О1и

Ьуз

А1а

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Азп

О1и

180

185

190

ТЬг

Азр

Ьуз

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

Азп

О1у

ТЬг

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Ьеи

195

200

205

Туг Ьуз МеЕ Агд О1и А1а Ьеи О1и Ьуз Ьуз О1у Ьеи Агд Туг А1а

210		215		220
<210> 135 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 135 аЕдадсдЕсд	ЕсдЕссадаа	саЕсдсдсдс	дссдаЕсаад	сдаЕсдЕсда	ЕсддсЕсдсд	60
дссЕдсддЕд	ЕЕдссасЕдЕ	дсаЕдаадсд	садддссдса	адддасЕдсЕ	сдсдадссаЕ	120
аЕдсддссда	ЕсЕаЕсссдд	ЕасссддсЕс	дсддсдадсд	сЕдЕдассаЕ	сЕсддсдссд	180
ссдддсдаса	асЕддаЕддЕ	ссасдЕсдсд	аЕсдадсааЕ	Едсдадсддд	сдасаЕсаЕд	240
дЕдсЕсдссс	сдассадссс	сЕдсдаддаЕ	ддЕЕаЕЕЕсд	дсдаЕсЕдсЕ	ЕдссасаЕсд	300
дсдааадсас	ддддсЕдссд	сддЕсЕсаЕс	аЕсдаЕдссд	дсдЕссдсда	ЕдЕсдссдаЕ	360
сЕсасддсда	ЕдсадЕЕЕсс	ЕдЕсЕддЕсс	ааддссаЕсЕ	Есдсдсаадд	сассдЕсаад	420
дааасдсЕсд	дсЕсддЕдаа	саЕсссддЕд	дЕдЕдсдсдд	дЕдсдсЕддЕ	сааЕсссддс	480
даЕдЕсаЕсд	ЕсдссдаЕда	сдаЕддсдЕс	ЕдсдЕЕдЕдс	дссдсдаада	ддсддаддсд	540
дЕддсдсада	аддссдаадс	ссдсдЕсдсс	дссдаддасд	асаадсдсаа	дсдссЕсдсс	600

- 250 029538 дссддсдаас бсддбсбсда сабсбасаад абдсдсдадс ддсбддссда дааддддсбс ааабабдбсб да

660

672 <210> 136 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 136

Меб 1

Бег Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п Азп

11е А1а

Агд А1а 10

Азр

О1п

А1а

11е 15

Уа1

Азр

Агд

Беи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Буз

О1у

Беи

Беи

А1а

Бег

Нбз

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

О1у

ТЬг

35

40

45

Агд

Беи

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

Уа1

Нбз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Беи

Агд

А1а

О1у

Азр

11е

Меб

65

70

75

80

Уа1

Беи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Беи

85

90

95

Беи

А1а

ТЬг

Бег

А1а

Буз

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Беи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Беи

ТЬг

А1а

Меб

О1п

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Буз

А1а

11е

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Буз

О1и

ТЬг

Беи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Беи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

О1и

А1а

Уа1

А1а

О1п

Буз

А1а

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а

А1а

О1и

180

185

190

Азр

Азр

Буз

Агд

Буз

Агд

Беи

А1а

А1а

О1у

О1и

Беи

О1у

Беи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Буз

Меб

Агд

О1и

Агд

Беи

А1а

О1и

Буз

О1у

Беи

Буз

Туг

Уа1

210

215

220

- 251 <210> 137 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 137 аЕддсЕдЕсд дссЕдЕдаЕд аЕдсддссда сссддсдаса

ЕЕдсЕЕдсдс дссдЕЕдсдс сЕсасддааа дадасдсЕсд дасдЕдаЕсд дЕддсЕдсса дссддсдаас адаЕаЕдЕсЕ

ЕддЕссадаа

ЕсдссасддЕ

ЕЕЕаЕсссдд асЕддаЕддЕ сдасаадссс дсддсЕдссд

ЕдаадЕЕЕсс дсЕсддЕсаа

Еддссдасда аадссдаддс

ЕсдддсЕсда да

ЕаЕЕдсссдЕ

ЕсаЕдаддсд

ЕдсссддаЕЕ ссаЕдЕддсд сЕдсдаддас сдддсЕЕаЕс ддЕсЕддЕсс

ЕдЕдассдЕд сдаЕддсдЕс дсдЕдЕсдсЕ саЕЕЕасдас дссдассадд садддссдса дсЕдссадЕд аЕсдаасадс ддсЕаЕЕЕсд аЕсдаЕдссд ааддсддЕсЕ дЕсЕдЕдссд

ЕдсдЕддЕсс дссдаддадд аЕдсдсдддс сддЕсаЕЕда адддссЕдсЕ ссдЕаасдаЕ

Есааддсддд дсдаЕсЕЕсЕ дсдЕдсдЕда

Есдсссаддд дЕдсссЕддЕ ддсдсдадда дсаадсдсаа даЕЕддсдда ссддсЕддсс сдссддсЕас сЕсЕдсдссд сдаЕаЕссЕд сдсдасдЕсд сдЕЕдссдаЕ сасддЕсаад сааЕдссддс адсддсЕдас дсддсЕсдсд даадддасЕд

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

672 <210> 138 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (149)...(152) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозчЕе ίά = РБ00001 <400> 138

МеЕ 1

А1а

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

А1а

Агд 10

А1а

Азр

О1п

А1а

Уа1 15

11е

Азр

Агд

Ьеи

А1а 20

А1а

Суз

Азр

Уа1

А1а 25

ТНг

Уа1

Н1з

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

О1у

Туг 40

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

11е

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТНг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

55 60

- 252 029538

Тгр 65

Меб

Уа1

НФз

Уа1

А1а 70

11е О1и

О1п Ьеи Ьуз 75

А1а

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

Уа1

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

Уа1

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

ТЬг

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

А1а

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

А1а

Азр

Уа1

А1а

А1а

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а

А1а

О1и

180

185

190

О1и

О1у

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Азр

Меб

Агд

О1у

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 139 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 139

абдааббабс	адссддддас	аасаддсабс	дбсдбдсадд	абаббдсдсд	сдсбдабсаа	60
дссаббабсд	абддссбадс	адаабдбддб	дбддсдасдд	бдсабдаддс	асаадддсдс	120
ааддддсбдб	бддсддасба	бабдасдссд	аббббббсад	дсдсдддсаб	сдсбддабсб	180
дсддбдасса	ббсбддсдсс	ассббдбдас	ааббддабда	ббсабдбддс	ддбадаасад	240
ббдсаааадд	дсдабдбдбб	дсбдсбдддс	асдабсасас	сдбссаабдс	бддсбабббс	300
ддбдасббдс	бддссасдбс	адссабддсд	сасддббдбс	дсддаббдаб	саббдабддс	360
ддбдбдсдсд	абдбдсаада	дсбдасддаб	абдддсбббс	сддбббддбс	сааддссдба	420
сабдсссаад	дсасаабсаа	адааасдсбд	ддабсддбса	асдбдссадб	бдбсбдсддс	480
саададббдд	бааабсссдд	бдабаббдбд	дбддссдабд	абдасддддб	дбдсдббдбд	540
сдссдсдаад	аадсбдсбда	бдбдсбддсб	ааддсдсддд	сдсдсдадад	баабдаадсс	600
дссаадсдсд	сдсдббббда	ддасддбдад	сбддддсбдд	абабсбабда	сабдсдсдсд	660
сддсбддссд	аааадддасб	дааабасдбс	бда			693

- 253 029538 <210> 140 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (27)...(179) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 140

Меб Азп Туг О1п Рго О1у ТЬг ТЬг
1	5
Агд	А1а	Азр	О1п 20	А1а	11е	11е	Азр
ТЬг	Уа1	НФз 35	О1и	А1а	О1п	О1у	Агд 40
ТЬг	Рго 50	11е	РЬе	Бег	О1у	А1а 55	О1у
Ьеи 65	А1а	Рго	Рго	Суз	Азр 70	Азп	Тгр
Ьеи	О1п	Ьуз	О1у	Азр 85	Уа1	Ьеи	Ьеи
А1а	О1у	Туг	РЬе 100	О1у	Азр	Ьеи	Ьеи
Суз	Агд	О1у 115	Ьеи	11е	11е	Азр	О1у 120
ТЬг	Азр 130	Меб	О1у	РЬе	Рго	Уа1 135	Тгр
ТЬг 145	11е	Ьуз	О1и	ТЬг	Ьеи 150	О1у	Бег
О1п	О1и	Ьеи	Уа1	Азп 165	Рго	О1у	Азр
Уа1	Суз	Уа1	Уа1 180	Агд	Агд	О1и	О1и
Агд	А1а	Агд 195	О1и	Бег	Азп	О1и	А1а 200
О1у	О1и 210	Ьеи	О1у	Ьеи	Азр	11е 215	Туг
Ьуз 225	О1у	Ьеи	Ьуз	Туг	Уа1 230

О1у	11е 10	Уа1	Уа1	О1п	Азр	11е 15	А1а
О1у 25	Ьеи	А1а	О1и	Суз	О1у 30	Уа1	А1а
Ьуз	О1у	Ьеи	Ьеи	А1а 45	Азр	Туг	Меб
11е	А1а	О1у	Бег 60	А1а	Уа1	ТЬг	11е
Меб	11е	НФз 75	Уа1	А1а	Уа1	О1и	О1п 80
Ьеи	О1у 90	ТЬг	11е	ТЬг	Рго	Бег 95	Азп
А1а 105	ТЬг	Бег	А1а	Меб	А1а 110	НФз	О1у
О1у	Уа1	Агд	Азр	Уа1 125	О1п	О1и	Ьеи
Бег	Ьуз	А1а	Уа1 140	НФз	А1а	О1п	О1у
Уа1	Азп	Уа1 155	Рго	Уа1	Уа1	Суз	О1у 160
11е	Уа1 170	Уа1	А1а	Азр	Азр	Азр 175	О1у
А1а 185	А1а	Азр	Уа1	Ьеи	А1а 190	Ьуз	А1а
А1а	Ьуз	Агд	А1а	Агд 205	РЬе	О1и	Азр
Азр	Меб	Агд	А1а 220	Агд	Ьеи	А1а	О1и

<210> 141

- 254

<211> 672 <212> ДНК
<213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 141 абдадсдбсд	бсдбссадаа	сабсдаасдс	дссдасссдд	асбссдбсдс	сдбдсбсддс	60
дсдадсддсд	бсдссассдб	дсасдаадсд	сааддссдда	сдддасбсаб	дсддсссбаб	120
абдсддссда	бсбаббсддд	сдбдсдсабб	дссддассда	ссдбсасддб	сбссабсссд	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	бсабдбсдсд	дбсдадсадб	дссдсдаадд	сдасаббсбс	240
дббдбддсбс	сдассадссс	дадсдабдас	ддсбабббсд	дсдассбдсб	бдссдддбсд	300
сббабддсас	даддсдбсаа	ддсбсбсабс	абсдаддссд	дбдбдсдсда	сдббсдсдаб	360
сбдассдааа	бдсдсбббсс	ддбсбддбсд	аадассаббб	ссдсдсаддд	аассдбсаад	420
дааасдсббд	дсбссдбдаа	бдбдссдабс	дбсбдсдссд	дбдсддсддб	саабсссддс	480
дасдсддбсд	бддссдабда	сдасддсдба	бдсдбсдбдс	сдсдададсд	адсддссдад	540
дбддссаадд	сдбсдсаддс	ссдсдаддса	ааддаадссд	ддасдсдссд	дсддсбдабд	600
дссддбдаас	бддддсбсда	сабсбасддс	абдсдсдада	аасбсдсбдс	саадддбббд	660
ааабабдбсб	да					672
<210> 142 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 142

Меб 1

Бег

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

О1и

Агд 10

А1а

Азр

Рго

Азр

Бег 15

Уа1

А1а

Уа1

Ьеи

О1у 20

А1а

Бег

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

ТЬг

О1у 35

Ьеи

Меб

Агд

Рго

Туг 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

Бег

О1у

Уа1

Агд

11е 50

А1а

О1у

Рго

ТЬг

Уа1 55

ТЬг

Уа1

Бег

11е

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

Меб

11е

Н1з

Уа1

А1а 70

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд 75

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

Азр

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

- 255

90 95

Ьеи

А1а

О1у

Зег 100

Ьеи

Меб

А1а

Агд

О1у 105

Ча1

Ьуз

А1а

Ьеи

11е 110

11е

О1и

А1а

О1у

Ча1 115

Агд

Азр

Ча1

Агд

Азр 120

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд 125

РЬе

Рго

Ча1

Тгр

Зег 130

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

А1а 135

О1п

О1у

ТЬг

Ча1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Зег 145

Ча1

Азп

Ча1

Рго

11е 150

Ча1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

А1а

Ча1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

А1а

Ча1

Ча1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Ча1 170

Суз

Ча1

Ча1

Рго

Агд 175

О1и

Агд

А1а

А1а

О1и 180

Ча1

А1а

Ьуз

А1а

Зег 185

О1п

А1а

Агд

О1и

А1а 190

Ьуз

О1и

А1а

О1у

ТЬг 195

Агд

Агд

Агд

Ьеи

Меб 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у 210

Меб

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи 215

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи 220

Ьуз

Туг

Ча1

<210> 143 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 143 абдадсдбсд	бсдбссадаа	сабсдаасдс	дссдасссдд	асбссдбсас	сдбдсбсддс	60
дсдадсддсд	бсдссассдб	дсасдаадсд	сааддссдда	сдддасбсаб	дсддсссбас	120
абдсддссда	бсбаббсддд	сдбдсдсабб	дссддассдд	ссдбсасддб	сбссабсссд	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	бсабдбсдсд	дбсдадсадб	дссдсдаадд	сдасаббсбс	240
дббдбддсбс	сдассадссс	дадсдабдаб	ддсбабббсд	дсдассбдсб	бдссдддбсд	300
сббдбддсас	даддсдбсаа	ддсбсбсабс	абсдаддссд	дбдбдсдсда	сдббсдсдаб	360
сбдассдааа	бдсдсбббсс	ддбсбддбсд	аадассаббб	ссдсдсаддд	аассдбсаад	420
дааасдсббд	дсбссдбдаа	бдбдссдабс	дбсбдсдссд	дбдсддсддб	саабсссддс	480
дасдсддбсд	бддссдабда	сдасддсдба	бдсдбсдбдс	сдсдададсд	адсддсбдад	540
дбддссаадд	сдбсдсаддс	ссдсдаддса	ааддаддссд	ддасдсдссд	дсддсбдабд	600
дссддбдаас ааабабдбсб	бддддсбсда да	сабсбасддс	абдсдсдада	аасбсдсбдс	саадддбббд	660 672
<210> 144 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 256 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (1)...(21) <223> ТопВ-зависимые рецепторные белки, признак 1. Ргозтбе ίά =

РЗ00430

<400> 144

Ο1η

Азп

11е О1и Агд А1а Азр 10

Рго

Азр

Зег 15

Уа1

Меб 1

Зег

Уа1

Уа1

Уа1 5

ТЬг

Уа1

Ьеи

О1у

А1а

Зег

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

Ο1η

О1у

20

25

30

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Меб

Агд

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

Уа1

35

40

45

Агд

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

11е

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Ο1η

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

О1у

Зег

Ьеи

Уа1

А1а

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи

11е

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

А1а

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

А1а

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд

О1и

165

170

175

Агд

А1а

А1а

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

Зег

Ο1η

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

О1у

ТЬг

Агд

Агд

Агд

Ьеи

Меб

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210>	145
<211>	672
<212>	ДНК
<213>	Неизвестно
<220>

- 257

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 145
абдассабсд	бсдбсассдд	сабсдадсдс	дсдддадсдд	асасбдбсдс	сдсдсбдддс	60
асаадсддсд	бсдсдассдб	асасдаддсд	садддссдса	ссддссбдаб	дсдбсссбас	120
абдсддссда	бсбабасддд	адсдсдсабс	дссдддасдд	сдаббассдб	дбсдсбдссд	180
сссддсдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсс	дбсдадсадб	дссддсаадд	сдабабссбс	240
дбддбддсдс	сдассадссс	дадсдасдас	ддсбабббсд	дсдассбдсб	сдссааббсб	300
сбсдбсдссс	дсддсдбдад	дддсабддбс	абсдаддссд	дсдбдсдбда	сдббсдсдаб	360
сбсассдада	бдсдсббссс	ддбсбддбсд	аадасдабсб	сддсдсаддд	аасддбсаад	420
дадасдсбсд	дсбсддбсаа	сдбдссддбс	дбсбдсдсбд	дсббддссдб	даасссдддс	480
дасабсабсд	бддссдасда	сдасддсабс	бдсдбддбдс	сдсдссадас	сдссдсдсад	540
дбсдбсдадд	сддсбсабдс	дсдсдаддсд	ааддаддсдд	аддбссдбсд	дсддсбсабс	600
дссддсдаас	бсддссбсда	бабсбасддс	абдсдбдада	адсбддсддс	саадддссбд	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 146 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 146

ТЬг О1у

11е О1и

Агд А1а О1у А1а Азр 10

ТЬг 15

Уа1

Меб 1

ТЬг

11е

Уа1

Уа1 5

А1а

А1а

Ьеи

О1у

ТЬг

Бег

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Меб

Агд

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

ТЬг

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

О1у

ТЬг

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд

О1п

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

Азр

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

Азп

Бег

Ьеи

Уа1

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Меб

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

- 258

115 120 125

Тгр

Бег 130

Ьуз

ТЬг

11е

Бег

А1а 135

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Бег 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

Ьеи 155

А1а

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

11е

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

11е 170

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд 175

О1п

ТЬг

А1а

А1а

О1п 180

Уа1

Уа1

О1и

А1а

А1а 185

НФз

А1а

Агд

О1и

А1а 190

Ьуз

О1и

А1а

О1и

Уа1 195

Агд

Агд

Агд

Ьеи

11е 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг О1у Меб Агд О1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1

210		215		220
<210> 147 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 147 дбдадсддса	бсдбсдбсса	даасабсдад	сдсдссдасс	ссдсдабсаб	сасдддссбс	60
дссдаабдсд	дсдбсдссас	ддбдсабдад	дсдсадддсс	дсаадддбсб	дсбсдсдбсс	120
басабдсддс	сдабсбабдс	сддсдссдсб	дбсддсдсаб	сддсддбсас	сабссбсдсс	180
ссдсссбдсд	асаасбддаб	ддбдсабдбд	дсдабсдадс	аддбдсдддс	аддддасабс	240
сбсдбссбсд	сдассассбс	дсссбссдас	дссддсбабб	бсддсдабсб	дсбсдссасс	300
бсдабдаадд	сссдсддсдд	бдбсддссбс	абсабсдабд	ссддсдббсд	бдасаббсдс	360
дассбсасдд	сддбдсадбб	сссддбдбдд	бссааддссд	бсбдсдссса	дддсассабс	420
ааддааасдс	бдддсбсддб	даасдбдссд	дбддбсбдбд	ссддсдадсб	ддбсаасссд	480
ддсдабдбса	бсдбсдссда	бдасдасддс	дбсбдсдбсд	бдсддсдсда	ддаадсбдсс	540
дабдбдсбда	адааддсдса	ддсссдсдбд	дсдаасдаад	дсдасаадсд	бсадсдссбс	600
дсддссддсд	аасбсддссб	сдасабдбас	аадабдсдсд	асаадсбдаа	ддааабдддс	660
сбсааабабд	бсбда					675

<210> 148 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды

- 259 029538 <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 148

Уа1 5

Уа1

О1п Азп

11е О1и Агд 10

А1а

Азр

Рго

А1а 15

11е

Меб 1

Зег

О1у

11е

11е

ТЬг

О1у

Ьеи

А1а

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Ηΐ8

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

35

40

45

А1а

А1а

Уа1

О1у

А1а

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Ьеи

А1а

Рго

Рго

Суз

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

Уа1

Ηίδ

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Уа1

Агд

А1а

О1у

Азр

11е

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

ТЬг

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Меб

Ьуз

А1а

Агд

О1у

О1у

Уа1

О1у

Ьеи

11е

11е

100

105

110

Азр

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

11е

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Уа1

О1п

РЬе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

Уа1

Суз

А1а

О1п

О1у

ТЬг

11е

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

130

135

140

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

О1и

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

165

170

175

О1и

О1и

А1а

А1а

Азр

Уа1

Ьеи

Ьуз

Ьуз

А1а

О1п

А1а

Агд

Уа1

А1а

Азп

180

185

190

О1и

О1у

Азр

Ьуз

Агд

О1п

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

195

200

205

Меб

Туг

Ьуз

Меб

Агд

Азр

Ьуз

Ьеи

Ьуз

О1и

Меб

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210> 149 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 149 абдаабааас сддбддбадб бсдасаддбс дадсадссаб садссдабдс ддббдсддса сбадаааадб дбддсдбаас дасддбдсаб ааддсбсадд дасдсбдсдд сббдсббдса дссбасабдс дассдабббб сссаддадсб адсабсдссд дббсбдсддб сасбдбдбсс

120

180

- 260 029538

сбдссдссдд	дсдасаассб	дабдаббсас	дбсдсддбсд	аддбсбдсад	сасаддааас	240
аббсбддбдд	бсдсбссдас	сбсдссабдс	асддабддбб	асббсддбда	асбссбсдса	300
асдбсдббдс	дсдсдсасдд	бдбаададдс	сббдбдабсд	абдсбддабд	ссдбдасдбб	360
сдсбсбббда	сддааабдаа	аббсссддбс	бддадссдсд	ссабсадсбс	бсаддддаса	420
дбдааадсса	сасбсддабс	адбсаабдбд	ссдабсасаб	дсдсддддас	асбсдббдаа	480
бссддбдасд	бсабсдбсдс	сдасдабдаб	ддбдбсдбад	бсдбдаадсд	басддссдса	540
саадаадбсд	ссдсадссдс	бдаасааадд	дбдсдсааад	адаабдсдас	ссдбдаасда	600
сбсдсасддд	дсдаасбсдд	бсбсдабабс	басдадабдс	дссадааааб	сдсдсадсбс	660
ддссбсаадб	абсбдбда					678

<210> 150 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 150

Меб 1

Азп Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Бег

А1а 15

Азр

А1а

Уа1 А1а

А1а

Беи

О1и

Буз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

Буз

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

Суз

О1у

Беи

Беи

А1а

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

РЬе

Рго

35

40

45

О1у

А1а Бег

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Беи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Беи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Бег

ТЬг

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Беи Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Беи Беи

А1а

ТЬг

Бег

Беи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Беи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Беи

ТЬг

О1и

Меб

Буз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Буз

А1а

ТЬг

130

135

140

Беи

О1у Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

ТЬг

Суз

А1а

О1у

ТЬг

Беи

Уа1

О1и

145

150

155

160

Бег

О1у Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Буз

- 261

165 170 175

Агд

ТНг

А1а

А1а

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Буз

О1и

Азп

А1а

ТНг

Агд

О1и

Агд

Беи

А1а

Агд

О1у

О1и

Беи

О1у

Беи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1и

МеЕ

Агд

О1п

Буз

11е

А1а

О1п

Беи

О1у

Беи

Буз

Туг

210

215

220

Беи

225

<210> 151

<211> 675

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

<400> 151

аЕдадсддаа ЕЕдЕЕдЕсса дааЕаЕсдад сдсдссдасд сддсддЕсаЕ сдсадссЕЕд

дааадсЕдсд дсдЕсЕсаас ЕдЕдсасдад дсЕсааддсс дЕасЕддасЕ дсЕддсЕЕсЕ

ЕаЕаЕдсдЕс сааЕсЕасас аддЕдсасдд аЕадсаддаа дЕдсадЕдас ЕаЕсЕссдса

ссЕссЕддсд аЕаасЕддаЕ ддЕдсаЕдЕд дсЕаЕсдадс ааЕЕдсасдс аддсдасаЕа

ЕЕдаЕааЕсд сассаассЕс дссдЕдсдаа дасддсЕаЕЕ ЕсддсдасЕЕ дсЕадссасд

ЕсЕдсдсадд сссдЕдддЕд саадддЕсЕд аЕЕаЕсаасд ссддсдЕЕсд сдаЕдЕдсдс

даЕЕЕдасЕд аааЕдддсЕЕ ЕсссдЕсЕдд Есдааддсса ЕЕЕЕЕдссса аддсасЕаЕс

ааадсаЕсдс ЕдддЕЕсддЕ саасаЕассс дЕсдЕдЕдсд саддсдсдсс саЕсааЕссс

ддсдаЕдЕда ЕЕдЕддссда ЕдаЕдасддс дЕЕЕдЕдЕсд Едссдсдсса дааЕдсддса

даддЕсдсаа аддсддсдаа ддсасдЕдад дсдаасдадд ссдсааадсд сдассадсЕЕ

дсаассддса ЕсЕЕддддсЕ ЕдаЕаЕдЕаЕ дасаЕдсдсд даааЕсЕсдс сдадаЕдддд

сЕдаааЕаЕа ЕаЕда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

675 <210> 152 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 152

МеЕ Бег О1у 11е Уа1 Уа1 О1п Азп 11е О1и Агд А1а Азр А1а А1а Уа1

- 262 029538

5 10 15

11е

А1а

А1а Ьеи О1и 20

Зег

Суз

О1у Уа1 25

Зег ТЬг

Уа1

НФз

О1и 30

А1а

Ο1η

О1у

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

ТЬг

О1у

35

40

45

А1а

Агд

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

Уа1

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

Ο1η

Ьеи

НФз

А1а

О1у

Азр

11е

65

70

75

80

Ьеи

11е

11е

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

Ο1η

А1а

Агд

О1у

Суз

Ьуз

О1у

Ьеи

11е

11е

100

105

110

Азп

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

О1у

РЬе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а

Ο1η

О1у

ТЬг

11е

Ьуз

А1а

Зег

Ьеи

130

135

140

О1у

Зег

Уа1

Азп

11е

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Рго

11е

Азп

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд

165

170

175

Ο1η

Азп

А1а

А1а

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

А1а

Ьуз

А1а

Агд

О1и

А1а

Азп

180

185

190

О1и

А1а

А1а

Ьуз

Агд

Азр

Ο1η

Ьеи

А1а

ТЬг

О1у

11е

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

195

200

205

Меб

Туг

Азр

Меб

Агд

О1у

Азп

Ьеи

А1а

О1и

Меб

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

11е

210

215

220

<210> 153 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 153 абдбссдбсд	бсдбссадаа	сабсдсдсдс	дссдассадб	ссдбсабсда	бсддсбсддс	60
дссбдсддсд	бсдссасбдб	дсабдаадсд	садддссдса	сдддасбдсб	адссадсбас	120
абдсдсссса	бсбабсдддд	бдсдсдбсбд	дссдсдадсд	сддбдассаб	сбсддссссд	180
сссддсдаса	аббддабдсб	ссабдбсдсс	абсдадсадс	бдаддсссдд	сдасабсабд	240
дбдсббдссс	ссассадссс	сбдсдаддаб	ддсбабббсд	дсдассбдсб	бдсдасабсд	300
дсссбддсдс	дсддсбдссд	бддбсбсдбс	абсдаддсдд	дсдббсдсда	бдбсдссдас	360

- 263 029538

сЕсассдсда	ЕдаадЕЕЕсс	сдЕсЕддЕсс	ааадссаЕсЕ	Есдсссаддд	сассдЕсаад	420
ддаасдсЕдд	дЕЕсддЕдаа	сдЕдсссдЕс	дЕсЕдЕдссд	дсдсдсЕдаЕ	сааЕсссддЕ	480
дасдЕсаЕЕд	ЕддссдаЕда	сдаЕддсдЕс	ЕдсдЕддЕдс	дссдсдадда	адссдаадсд	540
дЕддсдсааа	аддссдаддс	дсдсдЕсдсс	дссдаададд	аЕаадсдсаа	дсдссЕсдсс	600
дссддсдаас	ЕсдддсЕсда	ЕаЕсЕасаад	аЕдсдсдадс	ддсЕсдссда	ааадддасЕс	660
аааЕаЕдЕсЕ	ад					672

<210>	154
<211>	223
<212>	БЕЛОК
<213>	Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 154	Азп	11е	А1а	Агд А1а Азр О1п Зег Уа1	11е
МеЕ 1	Зег	Уа1	Уа1	Уа1 5	О1п
10	15
Азр	Агд	Ьеи	О1у 20	А1а	Суз	О1у	Уа1	А1а 25	ТЬг	Уа1 НФз О1и А1а О1п 30	О1у
Агд	ТЬг	О1у 35	Ьеи	Ьеи	А1а	Зег	Туг 40	МеЕ	Агд	Рго 11е Туг Агд О1у 45	А1а
Агд	Ьеи 50	А1а	А1а	Зег	А1а	Уа1 55	ТЬг	11е	Зег	А1а Рго Рго О1у Азр 60	Азп
Тгр 65	МеЕ	Ьеи	НФз	Уа1	А1а 70	11е	О1и	О1п	Ьеи	Агд Рго О1у Азр 11е 75	МеЕ 80
Уа1	Ьеи	А1а	Рго	ТЬг 85	Зег	Рго	Суз	О1и	Азр 90	О1у Туг РЬе О1у Азр 95	Ьеи
Ьеи	А1а	ТЬг	Зег 100	А1а	Ьеи	А1а	Агд	О1у 105	Суз	Агд О1у Ьеи Уа1 11е 110	О1и
А1а	О1у	Уа1 115	Агд	Азр	Уа1	А1а	Азр 120	Ьеи	ТЬг	А1а МеЕ Ьуз РЬе Рго 125	Уа1
Тгр	Зег 130	Ьуз	А1а	11е	РЬе	А1а 135	О1п	О1у	ТЬг	Уа1 Ьуз О1у ТЬг Ьеи 140	О1у
Зег 145	Уа1	Азп	Уа1	Рго	Уа1 150	Уа1	Суз	А1а	О1у	А1а Ьеи 11е Азп Рго 155	О1у 160
Азр	Уа1	11е	Уа1	А1а 165	Азр	Азр	Азр	О1у	Уа1 170	Суз Уа1 Уа1 Агд Агд 175	О1и
О1и	А1а	О1и	А1а 180	Уа1	А1а	О1п	Ьуз	А1а 185	О1и	А1а Агд Уа1 А1а А1а 190	О1и
О1и	Азр	Ьуз	Агд	Ьуз	Агд	Ьеи	А1а	А1а	О1у	О1и Ьеи О1у Ьеи Азр	11е

- 264

195 200 205

Туг Ьуз МеЕ Агд О1и Агд Ьеи А1а О1и Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1

210		215		220
<210> 155 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 155 аЕдаасаЕсд	ЕддЕдсадаа	саЕсдадсдс	дссдаЕссдд	ссдЕдаЕсдс	сддасЕсдсд	60
даЕЕдсддсд	ЕсдссассдЕ	дсасдаддсд	саддддсдса	ЕсддасЕдаЕ	дЕсдЕссаад	120
аЕдсдассда	ЕсЕаЕссддд	сдсдсдЕдЕс	дсддсдЕсдд	сддЕдасддЕ	дЕсдсЕдссд	180
ссддссдаса	асЕддаЕдаЕ	ЕсаЕдЕддсд	дЕддадсада	Есааддссдд	сдасаЕсаЕд	240
дЕддЕсдсЕс	сдассЕсдсс	дЕсЕдаЕдсс	ддсЕасЕЕсд	дсдассЕасЕ	ддсдассЕсд	300
сЕсааддсдс	ддддсЕдсдЕ	дддасЕддЕд	аЕсдасдсдд	дддЕдсдсда	ЕдЕдсдсдас	360
сЕдассдааа	ЕдсадЕЕссс	ддЕдЕддЕсд	асддсдаЕсЕ	сддсдсаддд	дассдЕдааа	420
дааасдсЕдд	дсЕсддЕдаа	сдЕсссЕдЕс	аЕсЕдсдссд	дсдсдсаЕдЕ	ддадссдддс	480
дасдЕдаЕЕд	ЕЕдссдасда	сдасддддЕс	ЕдсаЕсдЕса	адсдЕдссаа	Едсддсддсд	540
дЕдсЕЕдада	аддсдсдадс	дсдддЕсдсс	ддсдаадссд	асаадсдсда	дадаЕЕадсд	600
аасддсасдс	ЕсдддсЕсда	ссЕсЕасаад	аЕдсдсдаад	ддсЕддадаа	даадддЕсЕа	660
аааЕаЕдЕсЕ	да					672
<210> 156 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (204)...(207) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ίά. = РЗ00001 <400> 156

МеЕ Азп 11е Уа1 Уа1 О1п Азп 11е О1и Агд А1а Азр Рго А1а Уа1 11е

5 10 15

- 265 029538

А1а

О1у

Ьеи

А1а 20

Азр

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а 30

Ο1η

О1у

Агд

11е

О1у 35

Ьеи

Меб

Зег

Зег

Ьуз 40

Меб

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

Уа1 50

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго 60

Рго

А1а

Азр

Азп

Тгр 65

Меб

11е

Нбз

Уа1

А1а 70

Уа1

О1и

Ο1η

11е

Ьуз 75

А1а

О1у

Азр

11е

Меб 80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг 85

Зег

Рго

Зег

Азр

А1а 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег 100

Ьеи

Ьуз

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Уа1 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр 120

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ο1η 125

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Зег 130

ТЬг

А1а

11е

Зег

А1а 135

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Зег 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

11е

Суз

А1а

О1у

А1а 155

Нбз

Уа1

О1и

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

11е

Уа1

Ьуз

Агд 175

А1а

Азп

А1а

А1а

А1а 180

Уа1

Ьеи

О1и

Ьуз

А1а 185

Агд

А1а

Агд

Уа1

А1а 190

О1у

О1и

А1а

Азр

Ьуз 195

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а 200

Азп

О1у

ТЬг

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

Ьеи

Туг

Ьуз

Меб

Агд

О1и

О1у

Ьеи

О1и

Ьуз

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210		215		220
<210> 157 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 157 абдадсдбдд	бсдбсассдд	сдбдсадсдд	сссдсбсссд	сддасдбсдс	ддсаббдддс	60
сдсббсддсд	бадсдасааб	ссасдаддсд	садддасдса	сбддасбааб	дсасдсббас	120
абдсддссда	бсбаббссдд	сдсдсабдбс	бдсддбссад	сддбаассдб	дбсбсбсссд	180
ссадсддаса	асбддабдаб	ссасдббдсс	абсдадсааб	дбдббдсадд	сдасабссбс	240
дбддбддсас	саассбсдсс	ббссдасдсс	ддсбабббсд	дсдадсбасб	ддсаассбсд	300
сббсаддсдс	дсддсдбдаа	ддддсббабс	абсдаддсбд	дсбдссдсда	бдбсдсддса	360
сбдасбдсса	бдсдсббссс	ддбдбддбсд	сдсбсдабсб	сбдсдсаддд	дасадбдаад	420

- 266 029538

дадасдсЕсд	дсЕсддЕааа ЕдЕдсссдЕс дЕсЕдЕассд дсдсдсЕддЕ ддсдссдддс	480
даЕдЕЕаЕсд	ЕсдсЕдасда сдаЕддадЕЕ дЕсдЕддЕсс саааддасаа ЕдЕддссдсс	540
аЕсдссЕссд	ссЕссдсддс дсдЕдаддсд ааддаддаад аддЕдсдддс даадсЕсаад	600
дссддсдЕдс	ЕдддссЕсда саЕсЕасддс дЕдсдсдадс ддсЕдаадда дааддддсЕЕ	660
сдсЕаЕсдЕд	ссдссдасда аддссасЕад	690

<210> 158 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (20)...(40) <223> Мультиоксидазы меди, признак 1. РгозчЕе ίά. = РЗ00079 <400> 158

МеЕ 1

Зег Уа1

Уа1

Уа1 5

ТЬг

О1у

Уа1

О1п

Агд 10

Рго

А1а

Рго

А1а

Азр 15

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Агд

РЬе

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

11е

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

МеЕ

НФз

А1а

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Зег

О1у

А1а

35

40

45

НФз

Уа1

Суз

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

А1а

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Суз

Уа1

А1а

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

О1п

А1а

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

11е

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

А1а

МеЕ

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Агд

Зег

11е

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

ТЬг

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Азр

165

170

175

- 267

Азп Уа1

А1а

А1а 180

11е

А1а

Бег

А1а

Бег А1а А1а Агд О1и А1а Ьуз

О1и

185

190

О1и

О1и

Уа1

Агд

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1у

Уа1

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Уа1

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Агд

А1а

210 215 220

А1а Азр О1и О1у НФз 225

<210> 159

<211> 672

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

<400> 159

абддсддбад бсдбссадаа бабсдадсдд дсддасддсд сддссабсда саадсбддса

асабдсддсд бддсдассдб дсасдаддсд саддддсдса ссддбсбдсб ддсабсддсс

абдсддссда бсбасдссдд сдсссадабб дссддабсдд сдабсассаб ббсддсссса

сссддсдаса асбддабддб дбасдбсдса абсдаасадс бсаадсаддд сдасдбдсбд

дбдаббдссс сдасдадбсс сбдбдаадас ддабасббсд дсдассбдсб бдссасббсд

дсдабддсдс дсддсбдссд сддссбдабс абсдабдсдд дсдбдсдсда сдбдсдсдаб

сбдассдсаа бдсдсббссс ддбсбддбсс ааддсдабсб бсдсдсаддд аассдбсаад

дадасдсбсд ддбсддбсаа сдбддсддбс дбдбдсдсса асдсдсбддб саассссддс

дасдбдабба бадссдасда сдасддсдбс дбсдбддбдс сасдсдсдса ддссддсдад

дбссбдаада аддсддаадс дсдсабсдса бсддаадаад ссаадсдсаа дсддсбддсд

дссддсдаас бсддссбсда бсбсбасдас абдсдсддса дасбддссда саадддссбд

аадбабдббб да

<210> 160

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

672 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 160

Меб А1а Уа1 Уа1 Уа1 О1п Азп 11е О1и Агд А1а Азр О1у А1а А1а 11е 1 5 10 15

- 268 029538

Азр

Ьуз

Ьеи А1а 20

ТЬг Суз

О1у Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

А1а

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

35

40

45

О1п

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

11е

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

Уа1

Туг

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

О1п

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

11е

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

Меб

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

А1а

Уа1

Уа1

Суз

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

Агд

А1а

165

170

175

О1п

А1а

О1у

О1и

Уа1

Ьеи

Ьуз

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

11е

А1а

Зег

О1и

180

185

190

О1и

А1а

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Ьеи

195

200

205

Туг

Азр

Меб

Агд

О1у

Агд

Ьеи

А1а

Азр

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 161 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 161

абдадсдбдд	бсдбсассдд	сабсдсдсдд	ссбдассдсд	ссдаддбдда	аддсббсдсб	60
дссабсддсд	бддсдассаб	ссасдаддсд	садддссдса	ссддссбдаб	дсадбссббс	120
абдсадссда	бсбабассдд	сдсдсасабб	ддсдддсссд	сддбдасддб	сбсдсбдссд	180
сссддсдаса	асбддабдаб	бсасдбсдсд	дбададсадб	дссаддссдд	сдасдббсбд	240
дбсдбсдссс	ссассбсасс	сбсддасдбс	ддсбабббсд	дсдадсбдсб	ддсдассбсд	300
сбсдбсдсас	дсддсабссд	сддссбсдбс	абсдаддссд	дсбдссдсда	баааасддсд	360
сбдасбдсда	бдсдсбббсс	сдбббддбсс	сдсдсддбсб	сддсдсаддд	аасддбсаад	420

- 269 029538

дадасдсбсд	дсбсддбдаа бдбсссасбс дбсбдсдссд дбдсдсбддб ааабсссддб	480
дабсбсдбдд	бсдссдабда сдасддбдбс дбсдббдбдс сдсдсдасаа ддбсдсддсд	540
дбдсдддсдд	сабсдсббдс асдсдаддсд ааддаддабд дддбдсдсдс дсддсбдсад	600
дссддсдадс дбсбабсдсд	бсддасбсда сдбсбасддс абдсдсдадс дссбдаадда аааддддсбд сддсдаасас сдасдддааа аасддсбда	660 699

<210> 162 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 162

Меб 1

Зег Ча1

Ча1

Ча1 5

ТЬг

О1у

11е А1а

Агд 10

Рго Азр Агд А1а

О1и 15

Ча1

О1и

О1у

РЬе

А1а

А1а

11е

О1у

Ча1

А1а

ТЬг

11е

Нчз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Меб

О1п

Зег

РЬе

Меб

О1п

Рго

11е

Туг

ТЬг

О1у

А1а

35

40

45

Нчз

11е

О1у

О1у

Рго

А1а

Ча1

ТЬг

Ча1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

Нчз

Ча1

А1а

Ча1

О1и

О1п

Суз

О1п

А1а

О1у

Азр

Ча1

Ьеи

65

70

75

80

Ча1

Ча1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

Азр

Ча1

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Ча1

А1а

Агд

О1у

11е

Агд

О1у

Ьеи

Ча1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Ьуз

ТЬг

А1а

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

Агд

РЬе

Рго

Ча1

115

120

125

Тгр

Зег

Агд

А1а

Ча1

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Ча1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Зег

Ча1

Азп

Ча1

Рго

Ьеи

Ча1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Ча1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Ьеи

Ча1

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Ча1

Ча1

Ча1

Ча1

Рго

Агд

Азр

165

170

175

Ьуз

Ча1

А1а

А1а

Ча1

Агд

А1а

А1а

Зег

Ьеи

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

Азр

О1у

Ча1

Агд

А1а

Агд

Ьеи

О1п

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Ча1

195

200

205

- 270

Туг О1у МеЕ Агд О1и Агд Ьеи Ьуз О1и Ьуз О1у Ьеи Уа1 Туг Агд А1а 210 215 220

А1а Азп ТНг Азр О1у Ьуз Азп О1у

225 230 <210> 163 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 163 аЕдадЕдЕсд ЕсдЕсасадд ааЕЕссдсдд дссЕсддсаЕ сЕдадаЕсда сдсдсЕЕсдс 60 сдсЕдсдддд ЕддсдасдаЕ ссасдаддсд саадддсдЕа ссддссЕЕсЕ дсдсдсдаас 120 аЕдсддссда ЕсЕасдсЕдд ЕдсссаЕдсс дЕсддаЕсдд сддЕдассдЕ дЕсдЕЕдссс 180 ссддссдаЕа асЕддаЕдаЕ ссаЕдЕддсд дЕсдадсадЕ дЕсаддсадд адасдЕссЕс 240 дЕсдЕддссс сдасЕЕсдсс ЕЕсддаЕдсс ддсЕасЕЕЕд дсдадсЕдсЕ ддсдассЕсЕ 300 сЕсдссдсдс ддддЕдЕдсд сддссЕсдЕЕ аЕсдаддсЕд ддЕдссдсда сдЕддсддсд 360

ЕЕдасддсаа ЕдсдЕЕЕЕсс ддЕсЕддЕса сдсдссдЕсЕ ссдсасаадд дасддЕдаад 420 дадасдсЕЕд дЕЕсддЕдаа ЕдЕдссдаЕс аЕсЕдсдссд дЕдсЕсЕсдЕ дааЕссддда 480 дасдЕЕдЕсд ЕЕдссдасда ЕдасддсдЕд дЕсдЕЕдЕдс сасдсаЕсдд адЕддсддаЕ 540 дЕсдсЕдссд ссЕсддссдс дсдЕдаадсд ааддаддаЕс аддЕсадддс дсдсЕЕсаад 600 дсдддсдадс ЕсдддсЕсда ЕаЕсЕаЕадд аЕдсдсдадс ддсЕдаадда аааадддсЕс 660 дЕсЕассдЕа ссдсдддЕда Еддсссаддс дддддсЕад 699 <210> 164 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 164

МеЕ 1

Бег Уа1

Уа1

Уа1 5

ТНг О1у

11е

Рго

Агд 10

А1а

Бег

А1а

Бег

О1и 15

11е

Азр

А1а

Ьеи

Агд

Агд

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТНг

11е

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТНг

О1у

Ьеи

Ьеи

Агд

А1а

Азп

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

40 45

- 271 029538

НФз

А1а 50

Уа1

О1у Бег А1а Уа1 55

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго 60

Рго

А1а

Азр

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

О1п

А1а

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

Азр

А1а

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

А1а

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

11е

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

Агд

11е

165

170

175

О1у

Уа1

А1а

Азр

Уа1

А1а

А1а

А1а

Бег

А1а

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

Азр

О1п

Уа1

Агд

А1а

Агд

РЬе

Ьуз

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Агд

Меб

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

Туг

Агд

ТЬг

210

215

220

А1а

О1у

Азр

О1у

Рго

О1у

О1у

О1у

225 230 <210> 165 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 165

абдддбдбдд	бддбссадаа	бабсдсссдс	дссдсдсааб	ссдбсабсда	ссддсбсдсд	60
дсббдсддсд	бсдсдасддб	бсабдаадса	саддддсдса	ааддссбдсб	сдссадссдб	120
абдсддссда	бсбабсссдд	сдсссддабс	дссдсдадсд	сддбдасдаб	сбсадсдссд	180
сссддбдаса	асбддабдаб	бсабдбддсд	абсдадсадс	бсаадасддд	бдасабссбд	240
сббсбддсдс	сдассадбсс	ббдсдаддас	ддсбабббсд	дсдабсбдсб	бдсдасдбсс	300
дсдабддсдс	ддддсбдбсд	дддаббдабс	абсдабдсбд	дсдбдсдсда	бдбсдссдас	360
сбддссдсда	бдаааббссс	бдбсбддбсд	ааддссабсб	бсдсдсаддд	сасддбсаад	420
дадасадбсд	дббссдбдаа	бдбдссддбс	дбсбдсдссд	дсдсдсбддб	саабсссддс	480
дабдбдабсд	бсдссдасда	бдасддсдбс	бдбдбсдбса	ддсдсдадда	бдсддсбдаб	540

- 272 029538

дбддсбдаса	аддссдаддс	дсдсдбсдсд	дссдаадада	дсаадсдсаа	дсддсбадса	600
бсаддсдадс	бсддбсбсда	сабббасдаб	абдсдссаас	ддсбсасдда	даааддссбб	660
адабабдбсб	да					672

<210> 166 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 166

Уа1 5

О1п Азп

11е

А1а Агд А1а А1а О1п Бег Уа1

11е

Меб 1

О1у

Уа1

Уа1

10

15

Азр

Агд

Беи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Беи

Беи

А1а

Бег

Агд

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Беи

Ьуз

ТЬг

О1у

Азр

11е

Беи

65

70

75

80

Беи

Беи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Беи

85

90

95

Беи

А1а

ТЬг

Бег

А1а

Меб

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Беи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Беи

А1а

А1а

Меб

Буз

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Уа1

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Беи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

Азр

А1а

А1а

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а

А1а

О1и

180

185

190

О1и

Бег

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

Беи

А1а

Бег

О1у

О1и

Беи

О1у

Беи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Агд

Беи

ТЬг

О1и

Ьуз

О1у

Беи

Агд

Туг

Уа1

210

215

220

- 273

<210> 167
<211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 167 аЕдддсдЕсд	ЕддЕссадаа	саЕсдсссдс	дссдадсдад	аЕдЕсаЕсда	ссддсЕЕдсд	60
аЕсЕдсддсд	ЕсдсдассдЕ	дсаЕдаддсд	саадддсдса	аддддсЕдсЕ	ддсдадсЕаЕ	120
аЕдсддссда	ЕсЕаЕсссдд	сдсдсддаЕЕ	дсддсдадсд	ссдЕсассаЕ	ЕЕсддсЕссс	180
сссддЕдаса	асЕддаЕддЕ	ссаЕдЕддсд	аЕсдадсадд	Едадддаддд	сдасаЕссЕд	240
сЕдсЕсдсЕс	сдасдадссс	ЕЕдсдаддас	дддЕаЕЕЕЕд	дсдассЕдсЕ	ддсдассЕсд	300
дссаЕддсдс	дсддаЕдссд	сдддсЕддЕс	аЕсдаЕдссд	дсдЕдсдЕда	ЕдЕсдссдаЕ	360
сЕсасддсда	ЕдсадЕЕссс	сдЕсЕддЕсд	ааддсдаЕсЕ	Есдсасаддд	сасддЕсаад	420
дадасдсЕдд	дсЕсЕдЕдаа	ЕдЕдссддЕс	дЕсЕдсдссд	дсдсдсЕЕаЕ	сааЕссдддс	480
даЕдЕсаЕсд	ЕддсддаЕда	ЕдасддсдЕс	ЕдсдЕсдЕса	ддсдсдадда	ддсддссдаЕ	540
дЕсдссдсса	аддссдаддс	дсдсдЕЕддс	дссдаддадд	ссаадсдсаа	дсдЕсЕсдсЕ	600
дссддсдаас	ЕсддасЕсда	саЕсЕасдаЕ	аЕдсдсаддс	дЕсЕсдссда	даадддаЕЕд	660
аааЕаЕдЕсЕ	да					672
<210> 168 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 168

МеЕ 1

О1у

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

А1а

Агд 10

А1а

О1и

Агд

Азр

Уа1 15

11е

Азр

Агд

Ьеи

А1а 20

11е

Суз

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

Уа1

Няз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг 40

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

Агд

11е 50

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1 55

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр

МеЕ

Уа1

Няз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Уа1

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи

- 274 029538

70 75 80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТНг 85

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РНе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг

Бег 100

А1а

Меб

А1а

Агд

О1у 105

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1 110

11е

Азр

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Ьеи

ТНг

А1а

Меб

О1п 125

РНе

Рго

Уа1

Тгр

Бег 130

Ьуз

А1а

11е

РНе

А1а 135

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТНг

Ьеи

О1у

Бег 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

Ьеи

11е

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

А1а

А1а

Азр 180

Уа1

А1а

А1а

Ьуз

А1а 185

О1и

А1а

Агд

Уа1

О1у 190

А1а

О1и

О1и

А1а

Ьуз 195

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр 210

Меб

Агд

Агд

Агд

Ьеи 215

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи 220

Ьуз

Туг

Уа1

<210> 169 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 169
абдадбдбдд	бсдббсадаа	бабсдадсдд	дссдабсссд	ссабсабсдс	сддссббдсс	60
даабдсддбд	бддсдассдб	ссасдаадсд	садддссдса	адддссбдсб	ддсдбссбаб	120
абдсдбссса	бсбасбсддд	сдсдсдссбд	дсадсаадбд	ссдбдассаб	ббсддсдссд	180
сссбдсдаса	асбддабдбб	дсабдбсдсс	аббдадаааб	бдсдддаддд	сдасаббсбс	240
дбссбсдссс	саасдбсдсс	дбсбдасдсб	дддбасбббд	дсдассбдсб	ддссасббсд	300
дсдсаддссс	дсддсбдсаа	дддссбдабс	аббдабдссд	дсдбасдсда	сдбддссдас	360
сбсасдсдда	бдаааббссс	сдбсбддбсс	ааддсдабаб	ббдсссаддд	сасдабсаад	420
дадасдсбдд	дсбсддбсаа	бдбдссдабб	дбсбдсдсдд	дсдадсбддб	саабдссддс	480
дасабсабсд	бддссдабда	сдабддддбб	бдсдббдбдс	дссдсдадда	ддсбдсбдсд	540
дбдсбсдаад	ссбсдсадаа	дсдсдбддсс	аабдаадада	дсасдсдсаа	дсдссбсдсб	600
дссддддаас	бдддасбсда	сабсбабдда	абдсдссадс	ддсбдассда	дааддддббд	660
аадбабдбсб	да					672

- 275 029538 <210> 170 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 170

Азп

11е

О1и Агд А1а 10

Азр

Рго

А1а

11е 15

11е

МеЕ 1

Бег

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

А1а

О1у

Ьеи

А1а

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТНг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Бег

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТНг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

Суз

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

Ьеи

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

Ьуз

Ьеи

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТНг

Бег

Рго

Бег

Азр

А1а

О1у

Туг

РНе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

А1а

О1п

А1а

Агд

О1у

Суз

Ьуз

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТНг

Агд

МеЕ

Ьуз

РНе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

11е

РНе

А1а

О1п

О1у

ТНг

11е

Ьуз

О1и

ТНг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

О1и

Ьеи

Уа1

Азп

А1а

О1у

145

150

155

160

Азр

11е

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

А1а

А1а

Уа1

Ьеи

О1и

А1а

Бег

О1п

Ьуз

Агд

Уа1

А1а

Азп

О1и

180

185

190

О1и

Бег

ТНг

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

МеЕ

Агд

О1п

Агд

Ьеи

ТНг

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210

215

220

<210>	171
<211>	672
<212>	ДНК
<213>	Неизвестно
<220>

- 276

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 171
абдассдбсд	бсдбссдсаа	сббсдадсдс	дсдбсдсссд	аадбсдбадс	сдбдсбдддс	60
даабдсддсд	бддсдасддб	дсабдаадсд	сааддссдса	дсддссбсаб	дсбсдссббс	120
абдсддссда	бсббсдсддд	сдсссдсабс	дссдддссдд	сддбдасадб	ббссдбсссд	180
ссдддсдаса	асбддабдаб	ссабдбддсд	абсдадсадб	дссдсдаадд	сдасдбдсбс	240
дбсдбддсдс	сдассадссс	сбссдаддас	ддсбабббсд	дсдассбдсб	сдсдсасбсд	300
сбдабддсдс	ддддсдбсаа	ддддсбсдбс	аббдаддссд	дсдббсдсда	бсбасдсдаб	360
сбсассдада	бдсдсбббсс	ддбсбддбсс	сддасдабсб	ссдсдсаддд	аасддбсаад	420
дадасдсбсд	дсбсддбдаа	сдбдссдабс	дбсбдсдссд	дсдсддсддб	сдабссдддс	480
дасдбадбсд	бддссдасда	сдасддсдбс	бдсабсдбда	дасдсдсссд	ддсддаадад	540
дбсдсдааад	сддсдсдсда	асдсдаддсд	ааддададдд	адасдсддсд	дсддсбддсс	600
дссддсдадс	бсддбсбсда	сабсбабддс	абдсдсдада	адсббдсддс	сааадддсбд	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 172 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 172

Уа1 5

Агд

Азп

РЬе

О1и Агд А1а 10

Бег

Рго

О1и

Уа1 15

Уа1

Меб 1

ТЬг Уа1

Уа1

А1а

Уа1 Ьеи

О1у 20

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а ТЬг Уа1 25

Нбз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Бег О1у 35

Ьеи

Меб

Ьеи

А1а

РЬе 40

Меб Агд Рго

11е

РЬе 45

А1а

О1у

А1а

Агд

11е А1а 50

О1у

Рго

А1а

Уа1 55

ТЬг

Уа1 Бег Уа1

Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

Меб 11е

Нбз

Уа1

А1а 70

11е

О1и

О1п Суз Агд 75

О1и

О1у

Азр

Уа1

Ьеи 80

Уа1

Уа1 А1а

Рго

ТЬг 85

Бег

Рго

Бег

О1и Азр О1у 90

Туг

РЬе

О1у

Азр 95

Ьеи

Ьеи

А1а Нбз

Бег 100

Ьеи

Меб

А1а

Агд

О1у Уа1 Ьуз 105

О1у

Ьеи

Уа1 110

11е

О1и

А1а

О1у Уа1

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи ТЬг О1и

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

- 277

115

120

125

Тгр

Бег

Агд

ТЬг

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

Уа1

Азр

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

11е

Уа1

Агд

Агд

А1а

165

170

175

Агд

А1а

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

А1а

Агд

О1и

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

Агд

О1и

ТЬг

Агд

Агд

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 173 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно

<220>
<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 173 абдддсдббд	бддбссадаа	бдбсддссдс	дссдаасааб	ссдбсабсда	ссддсбсдса	60
дссбдбддсд	бддсдасбдб	дсабдаддсд	садддссдсс	ддддссбссб	сдсдадсбас	120
абдсддссда	бсбаббссдд	бдсасддабс	дссдсдадбд	садбдасдаб	сбсддсдссд	180
сссадбдаса	асбддабдсб	дсабдбддсд	абсдадсааб	бдаадсаддд	сдабсбдсбб	240
сбдсбсдсдс	ссассадссс	дбдсдаадас	ддсбабббсд	дбдассбдсб	сдсдассбсб	300
дссдбддсдс	даддббдссд	сддссбдабс	абсдасдсдд	дсдбасдсда	бдбсдссдас	360
сбдасддсса	бдбсдбббсс	ддбсбддбсс	ааддсдабаб	сбдсдсаадд	сассдбсаад	420
дадасаббдд	дсбсддбдаа	бдбдссддбс	дбсбдсдссд	дбдсдсбддб	саасссаддс	480
дасдбдабсд	бддссдасда	сдабддсдбс	бдсдбсдбдс	дссдсдадда	ддсддсддад	540
абсдссдаса	аддссдаадс	дсдсдбсдсд	дссдаддааа	дсаадсдддс	дсддсбддса	600
дссддсдаас	ббдддббдда	бабсбасдас	абдсдсаадс	ддсбсдссда	дааадддсбд	660
аадбабдбсб	да					672
<210> 174 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды

- 278 029538 <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 174

Меб 1

О1у

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

Уа1

О1у Агд А1а О1и О1п Бег Уа1

11е

10

15

Азр

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Бег

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

Бег

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

Ьеи

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

О1п

О1у

Азр

Ьеи

Ьеи

65

70

75

80

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

А1а

Уа1

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

Бег

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

О1и

165

170

175

О1и

А1а

А1а

О1и

11е

А1а

Азр

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а

А1а

О1и

180

185

190

О1и

Бег

Ьуз

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

Азр

Меб

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 175 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 175

абдддбдбсд	бсдбссадаа	бабсдадсдс	дссдабссбб	сддбсабсда	асддсбддсд	60
дсабдсдддд	ббдсбасбдб	дсасдаадсд	садддасдса	адддбсбдсб	ддсдадссаб	120
абдсддссда	бсбабдссдд	бдсдсдссбб	дсадссадбд	ссдбдассаб	абсддсдссд	180

- 279 029538

ссдддсдаба	асбддабдаб	ссабдбсдсс	абсдаасадс	бсадддсддд	бдасабаабд	240
дбдсббдссс	сдасаадбсс	сбдсдаддаб	ддсбабббсд	дсдасббдсб	ддсдасдбсб	300
дсбдсддсдс	даддсбдссд	ддддсбдабс	абсдабдсдд	дсдбдсдбда	сдбддсддас	360
сбдасддсда	бдаадбббсс	ддбдбддбсд	ааддссаббб	ббдсдсаддд	сасддбсаад	420
дааасдсбдд	дсбсддбсаа	бдбдссддбд	дбсбдсдсдд	дадсдсбддб	саасссдддс	480
дасдбдабсд	бддссдабда	сдасддсдбс	бдсдбсдбдс	дасдсдадда	адсддссдсд	540
дбддссдаса	аддссдаддс	дсдсдбддсб	дсддаададд	асаадсдсад	дсдссбддсд	600
дссддддаас	бдддссбсда	сабсбасаад	абдсдсдадс	дссбддссда	даадддссбс	660
аддбабдбсб	да					672

<210> 176 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 176

Меб 1

О1у

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п Азп

11е

О1и

Агд 10

А1а Азр

Рго

Бег

Уа1 15

11е

О1и

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

НФз

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

Агд

А1а

О1у

Азр

11е

Меб

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

А1а

А1а

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

Азр

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

11е

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

- 280

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

А1а

А1а

А1а 180

Уа1

А1а

Азр

Ьуз

А1а 185

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а 190

А1а

О1и

О1и

Азр

Ьуз 195

Агд

Агд

Агд

Ьеи

А1а 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

Ьуз

Меб

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Уа1

210 <210> 177 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно	215		220
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 177 абддддддсд	бадбсдбдса	даасабсдад	сдддссдасд	сддааассаб	ссдссддсбс	60
ддсдаабдсд	дбдбддсдас	ддбдсасдад	дсдсаддддс	дсадсдддсб	дабддсдссс	120
сабабдасдс	сддбсбддсд	сддсдсабсд	дббдссддбб	сддсддбдас	дабсбссдсс	180
ссдсссддсд	асаасбддаб	дсбдсасдбд	дсдабсдадс	аддбдсабда	дддсдабабс	240
сбсдбдсбдд	сдссдассад	бссббссасд	дасддсбабб	бсддсдаббб	дсббдссасс	300
бсддсдабдд	сдсдддддбд	бсдсдддсбд	дбсабсдаад	саддсдбдсд	сдасдбддсс	360
дассбдасда	адабдсддбб	ссссдбсбдд	бсдааддсдд	бссасдсдса	дддбасддбс	420
ааададасдс	сдддсбсадб	саасдбдссд	дбсдбсбдсд	ссддбдссса	бдбдсддссд	480
ддсдасдбса	бсдбддссда	сдабдасддс	дбдбдсдбдд	бсаддсдсда	ддаддсддсд	540
дааабаббда	ддааддссда	ддсссдсабс	дссаасдаад	ссдасаадсд	сдадсдбббс	600
дссдссддсд	аасбсддссб	сдасабсбас	ддсабдсдсд	адаадсбддс	сдссааддда	660
ббдааабаба	бсбда					675

<210> 178 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 178

Меб О1у О1у Уа1 Уа1 Уа1 О1п Азп 11е О1и Агд А1а Азр А1а О1и ТЬг 1 5 10 15

- 281 029538

11е Агд Агд Ьеи О1у О1и

Суз

О1у

Уа1 25

А1а

ТЬг Уа1

НФз

О1и А1а 30

О1п

20

О1у

Агд

Бег

О1у

Ьеи

Меб

А1а

Рго

НФз

Меб

ТЬг

Рго

Уа1

Тгр

Агд

О1у

35

40

45

А1а

Бег

Уа1

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Бег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

Ьеи

НФз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Уа1

НФз

О1и

О1у

Азр

11е

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

А1а

Меб

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

100

105

110

О1и

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Меб

Агд

РЬе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

Уа1

НФз

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Рго

130

135

140

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

НФз

Уа1

Агд

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд

165

170

175

О1и

О1и

А1а

А1а

О1и

11е

Ьеи

Агд

Ьуз

А1а

О1и

А1а

Агд

11е

А1а

Азп

180

185

190

О1и

А1а

Азр

Ьуз

Агд

О1и

Агд

РЬе

А1а

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

195

200

205

11е

Туг

О1у

Меб

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

11е

210

215

220

<210> 179 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 179

абдддддбсд	бддбссадаа	сабсдаасдс	дссдабсадд	ссдбсабсаа	ссдссббдсс	60
дссбдсддсд	бддссассдб	дсасдаддсд	садддссдса	адддссбдсб	сдссдссааб	120
абдсдбссда	бсбасадсдд	адаасдбсбд	дсддссбсдд	ссдбдасдаб	ббссдсдссс	180
сссддбдаса	асбддабддб	ссабдбсдсд	абсдадсааб	бдсаддссдд	бдасабсабд	240
дббббддссс	ссассбсдсс	сбдсдаддас	ддсбабббсд	дбдабсббсб	ддссасдбсд	300
дсбабсдсас	дбддсбдсаа	дддссбдабс	абсдабдсдд	дсдбдсдсда	бдбдбсддаб	360
сбдасддсда	бдаааббссс	сдбсбддбсс	ааддсдабсб	бсдсссаадд	сасддбсаад	420

- 282 029538

дааасссббд	ддбсддбдаа	баббсссдбд	дбсбдсдссд	дсдсдсбдаб	саабсссддб	480
дабдбааббд	бддссдабда	сдасддсдбб	бдсдбддбсс	дссдсдадда	адссдаадсс	540
дббдсадсса	аадссдаадс	ссдбдбсдса	дссдаадаад	дсаадсдсдб	дсдбсбддсс	600
дсдддбдаас	бдддссббда	бабсбабаас	абдсдсдаас	дбсбддссда	даадддссбд	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 180 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 180	Азп	11е	О1и	Агд А1а Азр Ο1η А1а Уа1	11е
Меб 1	О1у	Уа1	Уа1	Уа1 5	Ο1η
10	15
Азп	Агд	Ьеи	А1а 20	А1а	Суз	О1у	Уа1	А1а 25	ТЬг	Уа1 Н1з О1и А1а Ο1η 30	О1у
Агд	Ьуз	О1у 35	Ьеи	Ьеи	А1а	А1а	Азп 40	Меб	Агд	Рго 11е Туг Зег О1у 45	О1и
Агд	Ьеи 50	А1а	А1а	Зег	А1а	Уа1 55	ТЬг	11е	Зег	А1а Рго Рго О1у Азр 60	Азп
Тгр 65	Меб	Уа1	Н1з	Уа1	А1а 70	11е	О1и	Ο1η	Ьеи	Ο1η А1а О1у Азр 11е 75	Меб 80
Уа1	Ьеи	А1а	Рго	ТЬг 85	Зег	Рго	Суз	О1и	Азр 90	О1у Туг РЬе О1у Азр 95	Ьеи
Ьеи	А1а	ТЬг	Зег 100	А1а	11е	А1а	Агд	О1у 105	Суз	Ьуз О1у Ьеи 11е 11е 110	Азр
А1а	О1у	Уа1 115	Агд	Азр	Уа1	Зег	Азр 120	Ьеи	ТЬг	А1а Меб Ьуз РЬе Рго 125	Уа1
Тгр	Зег 130	Ьуз	А1а	11е	РЬе	А1а 135	Ο1η	О1у	ТЬг	Уа1 Ьуз О1и ТЬг Ьеи 140	О1у
Зег 145	Уа1	Азп	11е	Рго	Уа1 150	Уа1	Суз	А1а	О1у	А1а Ьеи 11е Азп Рго 155	О1у 160
Азр	Уа1	11е	Уа1	А1а 165	Азр	Азр	Азр	О1у	Уа1 170	Суз Уа1 Уа1 Агд Агд 175	О1и
О1и	А1а	О1и	А1а 180	Уа1	А1а	А1а	Ьуз	А1а 185	О1и	А1а Агд Уа1 А1а А1а 190	О1и
О1и	О1у	Ьуз	Агд	Уа1	Агд	Ьеи	А1а	А1а	О1у	О1и Ьеи О1у Ьеи Азр	11е

- 283

195 200 205

Туг Азп МеЕ Агд О1и Агд Ьеи А1а О1и Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1

210	215	220
<210> 181 <211> 687 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 181 аЕдадсддЕс	аЕсдсаЕсдЕ	ссдсаасЕаЕ	ссаааадсад	асЕсдддсдЕ	сдссЕссдсЕ	60
сЕдддсдсЕс	Едддсадсдс	дассдЕдсас	даддссаЕдд	дссдсдЕддд	аЕасдссддс	120
сассдЕаЕсс	ддссдаЕсса	дсадддсдЕд	ЕсдаЕсддсд	дсассдссдЕ	аассдЕсЕсд	180
дЕсдсассдд	дЕдасаассЕ	даЕддЕЕсас	дссдсдаЕЕд	ссдаддссаа	сдааддсдас	240
дЕдсЕддЕсд	ЕсдЕЕсссдЕ	дадсдасадс	дсдЕЕсддсЕ	ЕЕаЕсддсда	ссЕдаЕддсд	300
асЕсадаЕдс	дсЕсЕсдссд	дсЕдсдсддЕ	ЕасдЕдассЕ	ссддсддсдЕ	дсдЕдаЕасс	360
дссдадЕЕдд	сссдсЕЕддд	ЕЕЕЕссддЕа	ЕддасдаааЕ	асдЕсЕсдЕс	дсаадддасд	420
дЕдааадаЕа	сссссддсЕс	ддЕсааЕдЕд	сссдЕсдЕдс	ЕсдааддсдЕ	сдЕддЕссаЕ	480
ссЕддадасд	ЕсдЕддЕадс	ддасдасдас	ддсдЕсасса	ЕсдЕдссдсд	сдадаЕсдсс	540
дссдасасдс	Ессаддссдс	Есдддсссдс	дЕддадаадд	аадссдсдас	ссдаЕсдсдд	600
ЕаЕдсддсдд	дсдадсЕЕЕс	асЕсдасдЕс	аасаассЕдс	дсссдасссЕ	сдсадсдсЕд	660
ддадЕддадЕ	аЕдЕсдаЕЕЕ	сдддЕда				687

<210> 182 <211> 228 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(31) <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 182

МеЕ

Зег

О1у

НФз

Агд

11е Уа1

Агд

Азп

Туг

Рго

Ьуз

А1а

Азр

Зег

О1у

1

5

10

15

Уа1

А1а

Зег

А1а

Ьеи

О1у А1а

Ьеи

О1у

Зег

А1а

ТЬг

Уа1

Нтз

О1и

А1а

25 30

- 284 029538

Меб

О1у

Агд 35

Уа1

О1у

Туг

А1а

О1у 40

НФз

Агд

11е

Агд

Рго 45

11е

Ο1η

Ο1η

О1у

Уа1 50

Зег

11е

О1у

О1у

ТЬг 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Уа1

А1а

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

Уа1

НФз 70

А1а

А1а

11е

А1а

О1и 75

А1а

Азп

О1и

О1у

Азр 80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Уа1 85

Рго

Уа1

Зег

Азр

Зег 90

А1а

РЬе

О1у

РЬе

11е 95

О1у

Азр

Ьеи

Меб

А1а 100

ТЬг

Ο1η

Меб

Агд

Зег 105

Агд

Агд

Ьеи

Агд

О1у 110

Туг

Уа1

ТЬг

Зег

О1у 115

О1у

Уа1

Агд

Азр

ТЬг 120

А1а

О1и

Ьеи

А1а

Агд 125

Ьеи

О1у

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

ТЬг

Ьуз

Туг

Уа1 135

Зег

Зег

Ο1η

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Азр

ТЬг

Рго 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

Уа1

Уа1

Ьеи

О1и 155

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

НФз 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

ТЬг

11е

Уа1 175

Рго

Агд

О1и

11е

А1а 180

А1а

Азр

ТЬг

Ьеи

Ο1η 185

А1а

А1а

Агд

А1а

Агд 190

Уа1

О1и

Ьуз

О1и

А1а 195

А1а

ТЬг

Агд

Зег

Агд 200

Туг

А1а

А1а

О1у

О1и 205

Ьеи

Зег

Ьеи

Азр

Уа1 210

Азп

Азп

Ьеи

Агд

Рго 215

ТЬг

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи 220

О1у

Уа1

О1и

Туг

Уа1 Азр РЬе О1у 225 <210> 183 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 183

абдсдсддсд	бсдбддбссд	даасаббсса	сдсдссдасд	сдсдсдадаб	сдсддббсбд	60
сабдаадсдд	дсдбсдссас	сдбдсасдад	дсдсададсс	дссбсддбсб	дсбсдсббсд	120
басабдсддс	ссабббасда	дддсдсабсд	аббдссддбс	сддссдбдас	сдбдсбсдбд	180
ссдссабсдд	асаасбддаб	дсбдсасдбс	дссдсбдаас	адбдссадсс	сддсдабдбс	240
сбсдбддбсд	сдссдасдбс	дссдбдсдаа	дасддсбасб	бсддсдаасб	дббддсдасд	300
бсдсбддсас	адсбсддсдб	дсдсддасбд	абсабсдабд	сдддсбдссд	сдасабссдб	360
дсдсбсаадд	сдабдааббб	ссссдбдбдд	бсдаааддда	бсбсддсдса	адддассдбс	420

- 285 029538

ааддааасдс	бсдддбсддб	даасабсссс	дбддбдбдсд	сдсадсаасб	ддбдсдассд	480
ддсдасдбда	бсдбддссда	бдасдабддс	дбсдбддбсд	бсдсдббсда	дасддбддсд	540
дссдбддсда	дсдссдсасд	сдсдсдссбс	дадааддаад	адаадасдсд	садсдбдсбб	600
дсдасаддсс	адсбсддбсб	сдасбасбас	дсдабдсдсд	адаадсббдс	ддсааадддб	660
ббдсдббасд	бсдаббссдс	бдсдддбсбб	бда			693

<210> 184 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 184	11е	Рго Агд А1а Азр А1а Агд	О1и
Меб 1	Агд О1у	Уа1	Уа1 5	Уа1	Агд	Азп
10	15
11е	А1а Уа1	Ьеи 20	Ηίδ	О1и	А1а	О1у	Уа1 25	А1а ТЬг Уа1 Шз	О1и А1а 30	О1п
Зег	Агд Ьеи 35	О1у	Ьеи	Ьеи	А1а	Зег 40	Туг	Меб Агд Рго 11е 45	Туг О1и	О1у
А1а	Зег 11е 50	А1а	О1у	Рго	А1а 55	Уа1	ТЬг	Уа1 Ьеи Уа1 Рго 60	Рго Зег	Азр
Азп 65	Тгр Меб	Ьеи	Шз	Уа1 70	А1а	А1а	О1и	О1п Суз О1п Рго 75	О1у Азр	Уа1 80
Ьеи	Уа1 Уа1	А1а	Рго 85	ТЬг	Зег	Рго	Суз	О1и Азр О1у Туг 90	РЬе О1у 95	О1и
Ьеи	Ьеи А1а	ТЬг 100	Зег	Ьеи	А1а	О1п	Ьеи 105	О1у Уа1 Агд О1у	Ьеи 11е 110	11е
Азр	А1а О1у 115	Суз	Агд	Азр	11е	Агд 120	А1а	Ьеи Ьуз А1а Меб 125	Азп РЬе	Рго
Уа1	Тгр Зег 130	Ьуз	О1у	11е	Зег 135	А1а	О1п	О1у ТЬг Уа1 Ьуз 140	О1и ТЬг	Ьеи
О1у 145	Зег Уа1	Азп	11е	Рго 150	Уа1	Уа1	Суз	А1а О1п О1п Ьеи 155	Уа1 Агд	Рго 160
О1у	Азр Уа1	11е	Уа1 165	А1а	Азр	Азр	Азр	О1у Уа1 Уа1 Уа1 170	Уа1 А1а 175	РЬе
О1и	ТЬг Уа1	А1а 180	А1а	Уа1	А1а	Зег	А1а 185	А1а Агд А1а Агд	Ьеи О1и 190	Ьуз
О1и	О1и Ьуз	ТЬг	Агд	Зег	Уа1	Ьеи	А1а	ТЬг О1у О1п Ьеи	О1у Ьеи	Азр

- 286

195	200		205
Туг Туг А1а МеЕ Агд О1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз О1у Ьеи Агд Туг Уа1 210 215 220 Азр Зег А1а А1а О1у Ьеи 225 230 <210> 185 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220> <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 185
аЕдааЕсдас сддЕддЕадЕ	ссддсаадЕЕ	даасадссас	садсддаЕдс	ддЕЕдссдса
сЕддададдЕ аЕддсдЕдас	аассдЕссаЕ	даддсЕсадд	дасссддЕдд	ссЕссЕадсс
ЕссЕасаЕдс дсссдаЕЕЕа	сссдддадса	дЕсаЕсдссд	дЕЕссдсддЕ	сасЕдЕдЕсЕ
ЕЕассЕссЕд дсдасаассЕ	саЕдаЕссас	дЕддссдЕдд	аддЕсЕдЕдд	Ессдддааас
аЕЕсЕддЕЕд ЕЕдсассдаЕ	сЕсдссдЕдЕ	асддаЕддсЕ	асЕЕсддада	дсЕдЕЕддса
ассЕсЕсЕсс дсдсссасдд	ЕдЕдсдаддд	сЕЕдЕдаЕсд	аЕдссддаЕд	ссдддасдЕд
сдсЕсЕсЕса садаааЕдаа	аЕЕЕссддсс	Еддадссдсд	ссдЕсадЕЕс	асаддддаса
дЕсааддсса сссЕдддаЕс	ддЕдааЕдЕд	ссдаЕЕдЕдЕ	дсдсдддсдс	дсдддЕсдад
дсЕддддаЕд ЕсаЕсдЕсдс	сдаЕдасдаЕ	ддадЕЕдЕдд	ЕддЕдаадсд	сдсдсЕддсс
даададдЕсд ссдссдсддс	ддаасааадд	дЕЕсдсааад	адааЕдЕдас	ссдддаасда
сЕЕдсдсдЕд дададсЕддд ддссЕЕаааЕ аЕсЕсЕда <210> 186 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно	асЕсдаЕаЕЕ	ЕасдасаЕдс	дссаааадаЕ	сдсасаасЕд

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 186

МеЕ Азп Агд Рго Уа1 Уа1 Уа1 Агд О1п Уа1 О1и О1п Рго Рго А1а Азр

5 10 15

А1а Уа1 А1а А1а Ьеи О1и Агд Туг О1у Уа1 ТЬг ТЬг Уа1 НФз О1и А1а

25 30

- 287 029538

О1п

О1у

Рго 35

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а 50

Уа1

11е

А1а

О1у

Зег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

Няз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

11е

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

Няз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

А1а 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Агд

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1и

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225

<210> 187 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 187 аЕдааЕсдас	сддЕддЕадЕ	ссддсаадЕЕ
сЕддадаадЕ	аЕддсдЕдас	аассдЕссаЕ
ЕссЕасаЕдс	дсссдаЕЕЕа	сссдддадса
ЕЕассЕссЕд	дсдасаассЕ	саЕдаЕссас
аЕЕсЕддЕЕд	ЕЕдсассдаЕ	сЕсдссдЕдЕ
ассЕсЕсЕсс	дсдсссасдд	ЕдЕдсдаддд
сдсЕсЕсЕса	садаааЕдаа	аЕЕЕссддЕс

из окружающей среды

даасадссас	садсддаЕдс	ддЕЕдссдса	60
даддсЕсадд	дасссддЕдд	ссЕссЕадсс	120
дЕсаЕсдссд	дЕЕссдсддЕ	сасЕдЕдЕсЕ	180
дЕддссдЕдд	аддЕсЕдЕдд	Ессдддааас	240
асддаЕддсЕ	асЕЕсддада	дсЕдЕЕддса	300
сЕЕдЕдаЕсд	аЕдссддаЕд	ссдддасдЕд	360
Еддадссдсд	ссдЕсадЕсс	асаддддаса	420

- 288 029538

дбсааддсса	сссбдддабс ддбдаабдбд ссдаббдбдб дсдсдддсдс дсдддбсдад	480
дсбддддабд	бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд бддбдаадсд сдсдсбддсс	540
даададдбсд	ссдссдсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдбдас ссдддаасда	600
сббдсдсдбд	дададсбддд асбсдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсасаасбд	660
ддссббаааб	абсбсбда	678

<210> 188 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 188

Меб 1

Азп

Агд

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

Ο1η

Уа1 10

О1и

Ο1η

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Нбз 30

О1и

А1а

Ο1η

О1у

Рго 35

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а 50

Уа1

11е

А1а

О1у

Зег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

Нбз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

11е

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

Нбз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Рго

Ο1η

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Агд

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1и

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

Ο1η

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

- 289

Азр 11е Туг Азр Меб Агд О1п Ьуз 11е А1а О1п Ьеи О1у Ьеи Ьуз Туг 210 215 220

Ьеи

225 <210> 189 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 189 абдаасааас сддбддбдаб ссддсаасбд дадсдддсдс сддсбдабдс ддбддсддсд 60 сбсдаааааб абддбдбдбс сассдбдсаб даадсбсадд дасдббдсдд асбасбсдсб 120 бссбасабдс дассдаббба бссдддбдсс дсбаббдссд ддбсддсддб сасддбдбса 180 сббссдсссд дсдабаассб дабдаббсас дббдссдбсд аддбббдсса дбссддсдас 240 абасбсдбдд ббдсссссас сбсдссббдс бсддасддаб асббсдддда дббдббддса 300 асабсбббдс дсдсссасдд сдбдаадддд сббдбсаббд аддсаддабд ссдбдабдбб 360 сдсбсдсбса ссдааабдаа дббсссддбс бддадссдсд ссдбсадббс дсааддсасс 420 дбдаадбсба ассбсддабс ддбдаабдбд ддсабадбсб дбдсдддбдс асасаббдас 480 дсбддсдабд бддбсдбддс адабдасдас ддбдбсдбдд сддбдаадсд сдсабссдсс 540 саадаадбад ббддддсдбд сдаасаасдд дббсдсаадд аададдсадс ссдбдадсдд 600 сбддсдсддд дададсббдд ссбсдасабс басддсббдс дсасасдааб сдсддааабд 660 ддбсбсаадб абсаабда 678 <210> 190 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 190

Меб 1

Азп

Ьуз

Рго Ча1 5

Ча1

11е Агд О1п

Ьеи О1и Агд А1а 10

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Ча1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Ча1

Зег

ТЬг

Ча1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

- 290 029538

40 45

О1у

А1а 50

А1а

11е

А1а

О1у

Зег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1п

Зег

О1у

Азр 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

Зег

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

О1и

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Зег

Азп

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

О1у

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

НФз

11е

Азр 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

А1а

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Зег

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

Уа1

О1у 185

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

А1а

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Агд

11е

А1а

О1и

МеЕ

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

О1п

225

<210> 191 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 191 аЕдаасааас	сддЕддЕдаЕ	ссддсаасЕд
сЕсдаааааЕ	аЕддЕдЕдЕс	сассдЕдсаЕ
ЕссЕасаЕдс	дассдаЕЕЕа	ЕссдддЕдсс
сЕЕссдсссд	дсдаЕаассЕ	даЕдаЕЕсас
аЕасЕсдЕдд	ЕЕдсссссас	сЕсдссЕЕдс
асаЕсЕЕЕдс	дсдсссасдд	сдЕдаадддд
сдсЕсдсЕса	ссдаааЕдаа	дЕЕсссддЕс
дЕдаадЕсЕа	ассЕсддаЕс	ддЕдааЕдЕд

из окружающей среды

дадсдддсдс	сддсЕдаЕдс	ддЕддсддсд	60
даадсЕсадд	дасдЕЕдсдд	асЕасЕсдсЕ	120
дсЕаЕЕдссд	ддЕсддсддЕ	сасддЕдЕса	180
дЕЕдссдЕсд	аддЕЕЕдсса	дЕссддсдас	240
ЕсддасддаЕ	асЕЕсдддда	дЕЕдЕЕддса	300
сЕЕдЕсаЕЕд	аддсаддаЕд	ссдЕдаЕдЕЕ	360
Еддадссдсд	ссдЕсадЕЕс	дсааддсасс	420
ддсаЕадЕсЕ	дЕдсдддЕдс	асасаЕЕдас	480

- 291 029538

дсбддсдабд	бддбсдбддс адабдасдас ддбдбсдбдд сддбдаадсд сдсабссдсс	540
саадаадбад	ббддддсдбд сдаасаасдд дббсдсаадд аададдсаас ссдбдадсдд	600
сбддсдсддд	дададсббдд ссбсдасабс басддсббдс дсасасдааб сдсддааабд	660
ддбсбсаадб	абсаабда	678

<210> 192 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 192

Уа1 5

Уа1

11е

Агд

О1п

Ьеи 10

О1и Агд

А1а

Рго

А1а 15

Азр

Меб Азп 1

Ьуз

Рго

А1а Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

Бег ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1 Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 Суз

О1п

Бег

О1у

Азр

65

70

75

80

11е Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

Бег Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е О1и

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

Бег

О1п

О1у ТЬг

Уа1

Ьуз

Бег

Азп

130

135

140

Ьеи О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

О1у

11е

Уа1

Суз

А1а О1у

А1а

НФз

11е

Азр

145

150

155

160

А1а О1у

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у Уа1

Уа1

А1а

Уа1

Буз

165

170

175

Агд А1а

Бег

А1а

О1п

О1и

Уа1

Уа1

О1у

А1а

Суз О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз О1и

О1и

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд О1у

О1и

Беи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр 11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Агд

11е

А1а

О1и Меб

О1у

Беи

Буз

Туг

- 292

210

215

220

О1п

225 <210> 193 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 193
абдаабасас	сддбддбадб	ссддсаддбд	дадсадссдс	садсаддбдс	ддббдссаса	60
сбддадаадб	дбддддбдас	аассдбдсаб	даддсбсаад	дасдббдбдд	ссбдсббдсд	120
сссбассбдс	дсссдаббба	сссдддадса	дссабсдссд	дббссдсдаб	сассдбдасб	180
ббдссбссдд	дсдасаассб	сабдабссас	дббдсддбдд	аддбсбдсдд	бссдддааас	240
аббсбсдбад	бббсассдас	сбсддсббдс	ассдабддсб	асббсддбда	дсбдббддсс	300
асабсбсбсс	дбдсссасдд	бдбдададдд	сбддбдабсд	абдссддабд	ссдбдабдбд	360
сдсбсбсбаа	садааабдаа	аббсссддбс	бддадссдсд	ссдбсадбсс	дсадддсасс	420
дбсааддсса	сдсбдддабс	ддбдаабдбд	сссабсдбдб	дсдсдддсдс	асбддбсдаа	480
дсбддбдабд	ббабсдбсдс	сдабдасдаб	ддсдбддбдд	бддбдаддсд	сдсдсбддсс	540
даададдбсд	ссдсддсддс	ддаасааадд	дббсадааад	адаабдбдас	ссдсдадсдд	600
сббдсасдсд	дададсбсдд	ссбсдабабб	басдасаббс	дссаасддаб	сдсдсаасбд	660
ддссббаааб	абсбдбаа					678

<210> 194 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 194
Меб 1	Азп	ТЬг	Рго	Уа1 5	Уа1	Уа1	Агд
А1а	Уа1	А1а	ТЬг 20	Ьеи	О1и	Ьуз	Суз
О1п	О1у	Агд 35	Суз	О1у	Ьеи	Ьеи	А1а 40
О1у	А1а	А1а	11е	А1а	О1у	Бег	А1а

О1п	Уа1 10	О1и	О1п	Рго	Рго	А1а 15	О1у
О1у 25	Уа1	ТЬг	ТЬг	Уа1	Нбз 30	О1и	А1а
Рго	Туг	Ьеи	Агд	Рго 45	11е	Туг	Рго
11е	ТЬг	Уа1	ТЬг	Ьеи	Рго	Рго	О1у

- 293 029538

55 60

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег 85

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Рго

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Агд

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1и

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

О1п

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр

11е

Агд

О1п

Агд

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225 <210> 195 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 195

абдаабасас	сддбддбадб	ссддсаддбд	дадсадссдс	садсаддбдс	ддббдссаса	60
сбддадаадб	дбддддбдас	аассдбдсаб	даддсбсаад	дасдббдбдд	ссбдсббдсд	120
сссбасабдс	дсссдаббба	сссдддадса	дссабсдссд	дббссдсдаб	сассдбдасб	180
ббдссбссдд	дсдасаассб	сабдабссас	дббдсддбдд	аддбсбдсдд	бссдддааас	240
аббббддбдд	бббсассдас	сбсддсббдс	ассдабддсб	асббсддбда	дсбдббддсс	300
ассбсбсбсс	дбдсбсасдд	бдбдададдд	сбддбдабсд	абдссддабд	ссдбдабдбд	360
сдсбсбсбаа	садааабдаа	аббсссддбс	бддадссдсд	ссдбсадббс	дсадддсасс	420
дбсааддсса	сасбдддабс	ддбдаабдбд	сссабсдбдб	дсдсдддсдс	асбддбсдаа	480
дсбддбдабд	бсабсдбсдс	сдабдасдаб	ддадбддбдд	бддбдаддсд	сдсдсбддсс	540
даададдбсд	ссдссдсддс	ддаасааадд	дсбсадааад	адаабдбдас	ссдсдадсда	600

- 294 029538 сЕддсдсдсд дададсЕсдд ссЕсдаЕаЕЕ ЕасдасаЕдс дссаааадаЕ сдсдсаасЕд ддссЕЕаааЕ аЕссдЕаа

660

678 <210> 196 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 196

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

О1у

МеЕ 1

Азп ТЬг

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1 А1а

ТЬг

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а А1а

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Агд

165

170

175

Агд

А1а Ьеи

А1а

О1и

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

А1а

О1п

180

185

190

Ьуз

О1и Азп

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Рго

- 295

225

<210> 197 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 197 аЕдааЕааас	сддЕддЕааЕ	ссддсаадЕд	дадсадссас	садсддасдс	сдЕЕдсадса	60
ЕЕддадаадЕ	аЕддсдЕсас	аассдЕдсаЕ	даддЕдсадд	дасдсЕдЕдд	ссЕссЕсдсд	120
сасЕасдЕдс	дЕссдаЕЕЕа	сдсаддадсЕ	дсааЕсдсад	дЕЕссдсЕдЕ	ЕасЕдЕдЕсд	180
ЕЕдссЕсссд	дсдасаассЕ	саЕдаЕЕсаЕ	дЕЕдсЕдЕсд	аддЕсЕдсдд	ЕссЕддаааЕ	240
аЕЕсЕддЕЕд	ЕЕЕсасссас	сЕссссЕЕдЕ	асадасддсЕ	аЕЕЕсддЕда	асЕдЕЕддса	300
асдЕсЕЕЕдс	дсдсЕсасдд	адЕдаадддд	сЕЕдЕдаЕсд	аЕдссддаЕд	ссдсдасдЕЕ	360
сдсЕсасЕда	сддадаЕдаа	аЕЕсссддЕд	Еддадссддд	ссаЕсЕдсЕс	асаддддаса	420
дЕсааддсЕа	сасЕсддаЕс	ддЕсааЕдЕд	сссаЕсаЕдЕ	дсдсдддсдс	асЕсдЕсдаа	480
дссддсдасд	ЕсаЕсдЕддс	сдасдаЕдаЕ	ддадЕддЕдд	ЕЕдЕдаадсд	адсдаЕддсд	540
аЕЕдасдЕсд	ссдсддссдс	сдадсааадд	дЕЕсасааад	адааЕасдас	ссдсдаасдд	600
сЕЕдсасдЕд	дададсЕЕдд	дсЕсдаЕаЕЕ	ЕасдадаЕдс	дЕсадааааЕ	сдЕасаасЕд	660
ддссЕЕаадЕ	аЕЕссЕда					678
<210> 198 <211> 225
<212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (197)...(200) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ίά = РБ00001 <400> 198

МеЕ Азп 1

Ьуз

Рго Уа1 5

Уа1

11е Агд О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

ТНг

ТНг

Уа1

Н1з

О1и

Уа1

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Нтз

Туг

Уа1

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

40 45

- 296 029538

О1у

А1а 50

А1а

11е

А1а

О1у

Бег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е 135

Суз

Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Меб

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Меб

А1а 180

11е

Азр

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

НФз

Ьуз

О1и

Азп 195

ТЬг

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1и

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

Уа1

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Бег

225

<210> 199 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 199 абдаасаадс	ссдбддбддб	дсдддасабс
сбсдаасддб	асддбдбдбс	сасддбдсас
ссббасабдс	дбссдабсба	бдсдддсдса
сббссдссдд	дадасаассб	дабдабссас
абссбддббд	бсасдссдас	сбсдссдбдс
асббсдсбдд	сбдсдсасдд	ддбдааадда
сдадсдббда	ссдадабдаа	абббсссдбс
дбдааддсба	сасббдддбс	ддбдаабдбд

из окружающей среды

дадсддссдс	сддсддабдс	сабсдсддсд	60
даддсдсадд	дссдббдсдд	дсбдсбддсс	120
дсдабсдсбд	дбсссдссдб	басадбббса	180
дбсдссдбсд	аадбдбдссд	бсссддадас	240
ассдасддсб	аббббддада	дббдсбсдсд	300
сбддбсаббд	абдсдддабд	ссдсдабдбб	360
бддадссдсд	ссдбдадббс	дсадддаасд	420
асдаббдсаб	дсдсдддддс	басддббдад	480

- 297 029538

сссддбдасд	баабсдбадс ддасдабдаб ддсдбсдббд бддбдааасд ддсбдаддсд	540
саадасдббд	бсдссдсабс бдадсадада дбдсдааадд аададддаас ссдбааасдд	600
сбсдсдсадд	дсдаасбсдд сббддабабб басддсббдс дсдсдаадаб сдсддассбс	660
ддссбсаадб	асббдбад	678

<210> 200 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά. = РЗ00001

<400> 200

Агд Азр

11е О1и Агд 10

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп

Ьуз

Рго

Ча1 5

Ча1

Ча1

А1а

11е

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Агд

Туг

О1у

Ча1

Зег

ТЬг

Ча1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Ча1

ТЬг

Ча1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Ча1

А1а

Ча1

О1и

Ча1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

11е

Ьеи

Ча1

Ча1

ТЬг

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

А1а

НФз

О1у

Ча1

Ьуз

О1у

Ьеи

Ча1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Ча1

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Ча1

Тгр

Зег

Агд

А1а

Ча1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Ча1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Ча1

Азп

Ча1

ТЬг

11е

А1а

Суз

А1а

О1у

А1а

ТЬг

Ча1

О1и

145

150

155

160

Рго

О1у

Азр

Ча1

11е

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Ча1

Ча1

Ча1

Ча1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

О1и

А1а

О1п

Азр

Ча1

Ча1

А1а

А1а

Зег

О1и

О1п

Агд

Ча1

Агд

180

185

190

- 298

Ьуз

О1и

О1и О1у ТЬг 195

Агд

Ьуз

Агд Ьеи А1а О1п О1у О1и Ьеи О1у Ьеи

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 201 <211> 633 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 201 абдадсаасд абббдсддсд сббсддсдбс бсдасдсбдс асдаддсдса аддасддсдс 60 дддббдсбсд сдбсабасаб дсддссдабс бабссдддсд сдсбддбсдс сддбссддсд 120 дбаассдбсс бсдбдссдсс аддсдасаас сбддбдабсс асдбсдсддб ддаадсдбдс 180 дсдссдддсд асдбссбсдб сдбсдсдссд асдбсдсссб дсасддасдд сбаббббддс 240 дадсбдсбдд сдасдбсббб асдсдсбсдд аасдбддсдд дссбддбдаб сдасдссддс 300 бдссдддабд бссдбдсдсб сассдадабд сддббсссдд бсбддсдссд сдссабсадс 360 дсдсадддда сддбсааддс дасдсбсддс бсбсбдааса сдссдабсдб сбдбдссдда 420 дсдсбсдббд сссссддсда бдбсабсдбд дссдасдабд асддадбсдб сдбддбдаад 480 сдддаддааа бсдсддсддб дасдсаддсд дсддадсадс дсдбссдсаа ддаададддб 540 асдсдадсда ддсбсдсааа сддбдаасбд ддбббддаса бсбасддсбб дсддсадаад 600 сбддсддасс бдддссбдаа дбсдбсабсд бда 633 <210> 202 <211> 210 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (6)...(158) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 202

Меб Бег Азп Азр Ьеи Агд Агд РЬе О1у Уа1 Бег ТЬг Ьеи НФз О1и А1а

5 10 15

О1п О1у Агд Агд О1у Ьеи Ьеи А1а Бег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго

25 30

- 299 029538

О1у

А1а

Ьеи 35

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а 40

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1 45

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп 50

Ьеи

Уа1

11е

Нчз

Уа1 55

А1а

Уа1

О1и

А1а

Суз 60

А1а

Рго

О1у

Азр

Уа1 65

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго 70

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг 75

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у 80

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг 85

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд 90

Азп

Уа1

А1а

О1у

Ьеи 95

Уа1

11е

Азр

А1а

О1у 100

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд 105

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб 110

Агд

РЬе

Рго

Уа1

Тгр 115

Агд

Агд

А1а

11е

Бег 120

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1 125

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

О1у 130

Бег

Ьеи

Азп

ТЬг

Рго 135

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у 140

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Рго 145

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1 150

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у 155

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз 160

Агд

О1и

О1и

11е

А1а 165

А1а

Уа1

ТЬг

О1п

А1а 170

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1 175

Агд

Ьуз

О1и

О1и

О1у 180

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Ьеи 185

А1а

Азп

О1у

О1и

Ьеи 190

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг 195

О1у

Ьеи

Агд

О1п

Ьуз 200

Ьеи

А1а

Азр

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Ьуз

Бег

Бег Бег 210 <210> 203 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 203

абдассддса	ббдбсдбсда	дассабсдад	сдсдсдбссс	бсдссдасаб	сдссдсдсбд	60
дссдадббсд	дсдбсдссас	сабссасдад	дсдсадддсс	дсабсддбсб	ссбсдссбсс	120
ассабдсдсс	сдабсбасдс	дддбдссдса	дссдссддса	абдссдбсас	сдбдбсддбб	180
ссдсссддсд	асаасбддаб	дабссасдбд	дссдбсдадс	адбдссдсда	дддсдасабс	240
сбддбддбдд	сссссассад	сссдаасдас	аасддсбасб	бсддсдаасб	дсбддссбдс	300
бсдсбсаадб	сдсдсддсдб	дсдсддссбс	абсабсдаад	ссддсбдссд	сдасдбдааа	360
ссдсбсассд	адабдаадбб	ссссдбсбдд	бсссдсдссд	бсбссбссса	аддсассдбс	420
ааддааадсс	бсддсдасдб	даабсбдссд	сбсбсдабсд	сдддссадсб	сдбсаасссс	480
ддсдабдбса	бсдбсдссда	бдасдасддс	дбддбсдбдд	бсдсссдсад	сдабдбдсдс	540

- 300 029538

бсадбсассд	ссаадбсдсд сдаасдсдаа дасааддаад ссааааассд ддбдсаасбс	600
саддссддсс	адсбсддсаб бдасабсбаб ддсабдсдсд асаадсбсаа ддссаааддс	660
сбдсдсбасд	бдаааадсдс ддсддассбд аадддсбаа	699

<210> 204 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 204

О1и ТНг

11е

О1и Агд 10

А1а

Бег

Ьеи

А1а 15

Азр

Меб 1

ТНг О1у

11е Уа1 5

Уа1

11е

А1а

А1а

Ьеи

А1а

О1и

РНе

О1у

Уа1

А1а

ТНг

11е

НФз

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

Агд

11е

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

ТНг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

35

40

45

А1а

А1а

А1а

А1а

О1у

Азп

А1а

Уа1

ТНг

Уа1

Бег

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТНг

Бег

Рго

Азп

Азр

Азп

О1у

Туг

РНе

О1у

О1и

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

Суз

Бег

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

11е

11е

100

105

110

О1и

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Ьуз

Рго

Ьеи

ТНг

О1и

Меб

Ьуз

РНе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

Бег

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

О1и

Бег

Ьеи

130

135

140

О1у

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Ьеи

Бег

11е

А1а

О1у

О1п

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Агд

165

170

175

Бег

Азр

Уа1

Агд

Бег

Уа1

ТНг

А1а

Ьуз

Бег

Агд

О1и

Агд

О1и

Азр

Ьуз

180

185

190

О1и

А1а

Ьуз

Азп

Агд

Уа1

О1п

Ьеи

О1п

А1а

О1у

О1п

Ьеи

О1у

11е

Азр

195

200

205

11е

Туг

О1у

Меб

Агд

Азр

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Уа1

210

215

220

- 301

Ьуз Бег А1а А1а Азр Ьеи Ьуз О1у

225	230
<210> 205 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 205 абдаасасас	сддбддбадс	аадасаадбд	дадсадссас	садсддабдс	ааббдссдса	60
ббддадаадб	дбддадбдас	аассдбссаб	даддсбсадд	дасдббдбдд	ссбссббдсд	120
бссбасаббс	дсссдаббба	сссдддадса	дссабсдсад	дабссдсбаб	сасбдбдбсб	180
ббдссбссбд	дсдасаассб	сабдабссас	дббдсддбдд	аддбсбдсдд	бссдддааас	240
абссбддбад	бббсассдас	дбсдссббдб	асддасддсб	асббсддбда	дббдббддса	300
асабсбсбсс	дбдсссасдд	адбдаббддд	сббдбдабсд	абдссддабд	ссдбдабдбд	360
сдсбсбсбда	садааабдаа	аббсссддбс	бддадссдсд	ссабсбдббс	дсаадддаса	420
дбсааддсса	сасббддабс	ддбдаабдбд	сссабсдбаб	дсдсдддбдс	аабддбсдад	480
дсбддбдабд	бсабсдбсдс	сдасдабдаб	ддсдббдбсд	ббдбдаадсд	адсдсбддсд	540
саддадабсд	сбдсддсддс	ддаасааадд	дббсдсааад	адаабдбаас	ссдсдаасда	600
сбсдсасдбд	дадабсбсдд	асббдабабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсаасбд	660
ддссбсаааб	абсбсбда					678

<210> 206 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (28)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 206

Меб 1

Азп

ТЬг

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

11е

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у 25

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Няз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

11е

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

55 60

- 302 029538

Азр 65

Азп Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у Рго О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

11е

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Суз

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Меб

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

Ьеи

А1а

О1п

О1и

11е

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр 11е Туг Азр Меб Агд О1п Ьуз 11е А1а О1п Ьеи О1у Ьеи Ьуз Туг

210		215		220
Ьеи 225
<210> 207 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 207 абдаасааас	сддбддбдаб	ссддсаадбд	дадсддссдс	сддсбдасдс	ддбддсддсд	60
сбсдааассс	абддсдбдбс	сассдбдсаб	даддсссадд	ддсдббдсдд	асбдсбсдсб	120
бссбасабдс	ддссдаббба	бсссддсдсс	дсдаббдссд	ддбсддсддб	сасддбдбсд	180
сббссдсссд	дсдабаабсб	сабдаббсаб	дббдссдбдд	аддбсбдсса	абссддсдас	240
аббсбсдбдд	ббдсбсссас	дбсдссббдб	бсддасддбб	асббсддбда	асбссбддса	300
ассбсссбдс	дддсдсасдд	сдбсаддддд	сбсдббабсд	абдсаддббд	ссдсдасдбб	360
сдсбсдсбба	ссдадабдаа	дббссссдбс	бддадссдсд	сбдбсадббс	дсааддсасс	420
дбдааабсса	сбсбсддабс	ддбдаабдбд	адсдбсдббб	дсдссддадс	асдсабсдаа	480
дссддсдабд	бддбсдбсдс	сдабдасдаб	ддсдбсдббд	бддбддадсд	адсасдсдсс	540
сасдаадбад	бсдсбдсдбд	сдаасаасдс	аббсдсаадд	аададдсаас	бсдсдадсдд	600

- 303 029538 сбддсдсддд дадаасбсдд асбсдабабс басддсббдс дсасаааааб сдсддадабд ддбсбсаадб абсадбда

660

678 <210> 208 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά. = РБ00001

<400> 208

Уа1

11е

Агд

О1п

Уа1 10

О1и Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп Ьуз

Рго

Уа1 5

А1а

Уа1 А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

ТЬг

НФз

О1у 25

Уа1

Бег ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

Меб Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а А1а 50

11е

А1а

О1у

Бег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1 Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 Суз 75

О1п

Бег

О1у

Азр 80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

Бег Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 Тгр 130

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

О1у ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

Ьеи 145

О1у Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Бег

Уа1

Уа1

Суз

А1а О1у 155

А1а

Агд

11е

О1и 160

А1а

О1у Азр

Уа1

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

О1и

Агд

А1а Агд

А1а 180

НФз

О1и

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Суз О1и

О1п

Агд 190

11е

Агд

Ьуз

О1и О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е Туг

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Ьуз

11е

А1а

О1и Меб

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

- 304

210 215 220

О1п

225

<210> 209
<211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 209 аЕдааЕасас	садЕддЕадЕ	ссдасаддЕд	садсадссас	садссдааас	ддЕддссдсд	60
сЕддадаадЕ	дЕддддЕдас	аасддЕдсаЕ	даддсЕсадд	дасдЕдсЕдд	ссЕдсЕЕдсд	120
ЕссЕасаЕдс	дсссдаЕсЕа	сссдддадса	дсдаЕсдсЕд	дЕЕссдсЕаЕ	сасддЕдЕсЕ	180
ЕЕдссЕсссд	дсдасаассЕ	саЕдаЕссас	дЕЕдсддЕдд	аддЕсЕдсдд	сссдддааас	240
аЕссЕддЕад	ЕЕЕсассаас	сЕсдссЕЕсЕ	асддаЕддсЕ	асЕЕсддЕда	дсЕдЕЕддса	300
асаЕсЕсЕсс	дЕдсссасдд	ЕдЕдададдд	сЕЕдЕдаЕсд	аЕдсЕддаЕд	ссдЕдаЕдЕд	360
сдсЕсЕЕЕаа	садаааЕдаа	аЕЕссссдЕс	Еддадссдсд	ссаЕсааЕЕс	дсаддддаса	420
дЕсаадасса	сасЕЕддаЕс	ддЕдааЕдЕд	сссаЕсдЕЕЕ	дсдсдддсдс	асЕддЕсдас	480
дсЕддадаЕд	ЕсаЕсдЕсдс	ддаЕдасдаЕ	ддадЕЕдЕад	ЕЕдЕЕаадса	ддсдаЕддсд	540
сдададдЕЕд	ссдсддсадс	ддаасааадд	дЕЕсдсааад	адаассЕдас	ссдсдаасда	600
сЕЕдсдсдсд	дадаасЕЕдд	ЕсЕсдасаЕЕ	ЕасдадаЕас	дасаааадаЕ	сдсдсаасЕа	660
ддасЕЕаадЕ	аЕЕЕдЕаа					678

<210> 210 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 210

МеЕ 1

Азп

ТНг

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1п

О1п

Рго

Рго

А1а 15

О1и

ТНг

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у 25

Уа1

ТНг

ТНг

Уа1

Н1з 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

А1а

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

11е

ТНг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

- 305 029538

55 60

Азр 65

Азп Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Азп

Зег

Ο1η

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

ТЬг

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азр

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Ο1η

А1а

Меб

А1а

Агд

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

Ο1η

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

Ьеи

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1и

11е

Агд

Ο1η

Ьуз

11е

А1а

Ο1η

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 211 <211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 211

дбдадсдссд	бсабсаддаа	саббссасдс	бсдссдсссд	адсбссбсда	бсдсббсаад	60
ддссбсддсд	ббдсдассдб	сбсддаадсд	садддссдса	адддссбббб	ддссссдбаб	120
абдсдсссда	бсбабссддд	ддссдсдсбд	абсддсаабд	сддбдасддс	сбсддбсдсд	180
сссддсдаса	аббддасдаб	ссабдбсдсс	дбсдаадбсб	дссаддаадд	сдасдсдсбс	240
дбсдбсдсдс	ссассбссбб	сбдсдаддас	ддсбабббсд	дсдадсбасб	сдссасдбсб	300
сбдсадсадс	дсддбдбдсд	сдддсбсабб	сбсдаадсад	дсбдссдсда	сдбдсдсдад	360
сббсааадда	бдааббббсс	ддбббддбсд	сдсдсаабсб	абдсдсаадд	аасбдбдааа	420
дадасддбдд	дсдасдбдаа	ссбдссдсбс	сдсбдсдсад	дссадабсдб	саабдссддс	480
дабсбсаббд	бсдссдасда	сдасддсдбб	бдсдбсдбдс	ссбабдссда	бдбсдадаад	540
дбсббдаасд	сддсссдсда	асдбдсддсд	ааддаадада	ддаассдбдс	сдадббсдсс	600

- 306 029538 аадддсдбдс бсддссбсда ссбсбасааа бассдсдадс дссбсдссдс саадддссбс ааабабббсд асдасабсда ддсдбабаад ааддсдаадб да

660

702 <210> 212 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 212

Рго

Агд 10

Зег

Рго

Рго

О1и

Ьеи 15

Ьеи

Меб 1

Зег А1а

Уа1

11е 5

Агд Азп

11е

Азр

Агд РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз О1у

Ьеи

Ьеи

А1а Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

35

40

45

А1а

Ьеи 11е

О1у

Азп

А1а Уа1

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

А1а

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

ТЬг 11е

Н1з

Уа1

А1а Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

О1и

О1у

Азр

А1а

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1 А1а

Рго

ТЬг

Зег РЬе

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а ТЬг

Зег

Ьеи

О1п О1п

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

11е

Ьеи

О1и

100

105

110

А1а

О1у Суз

Агд

Азр

Уа1 Агд

О1и

Ьеи

О1п

Агд

Меб

Азп

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег Агд

А1а

11е

Туг А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Уа1

О1у

130

135

140

Азр

Уа1 Азп

Ьеи

Рго

Ьеи Агд

Суз

А1а

О1у

О1п

11е

Уа1

Азп

А1а

О1у

145

150

155

160

Азр

Ьеи 11е

Уа1

А1а

Азр Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Туг

А1а

165

170

175

Азр

Уа1 О1и

Ьуз

Уа1

Ьеи Азп

А1а

А1а

Агд

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

О1и

Агд Азп

Агд

А1а

О1и РЬе

А1а

Ьуз

О1у

Уа1

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Ьеи

195

200

205

Туг

Ьуз Туг

Агд

О1и

Агд Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

РЬе

Азр

210

215

220

Азр

11е О1и

А1а

Туг

Ьуз Ьуз

А1а

Ьуз

- 307

225 230 <210> 213 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 213
абдадсдббд	бсабсасдаа	даббасдсдд	ссддасссса	аасабдбдда	дабдсбддсб	60
дсбббсддбд	бсдссассаб	бсабдаддсд	садддссдса	ссддссбдаб	дсадбссбас	120
абдсдссссд	бсбабдссдд	сдсссдбдсс	дссддсасад	ссдбсасддб	сбсдсбдссс	180
сссдссдаса	асбддабдаб	ссабдбсдсс	дбддадсадб	дссдддаадд	сдасаббсбс	240
дбсдбсдсдс	ссасббсдсс	сбссдабдбс	дддбабббсд	дсдадсбдсб	ддсдассбсд	300
сбсдбсдссс	дсддсдбссд	сддссбсдбс	аббдааддсд	дсбдссдсда	бдбсадддсд	360
сбдассдада	бдсдсббссс	ддбсбддбсд	сдсдссаббб	ссдсдсаддд	сассдбсаад	420
дааасдсбсд	дсбсддбдаа	сдбдссдабс	дбббдсдссд	дсдсдсабаб	ссабсссддс	480
дабббсаббд	ссдссдасда	сдабддсдбб	дбсдбддбдс	дссдсадссд	сдбсдссдад	540
абсдссдссд	ссдсдабддс	дсдсдаадас	ааддааасаа	ссдбссдсда	дсдссбдааа	600
дссддададс	ббддссбсда	сабббасдда	абдсдсссдс	дбсбсаадда	ааадддссбс	660
дбсбддсдсд	адасдссдда	дааддадбад				690

<210> 214 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 214

Меб 1

Зег

Уа1

Уа1

11е 5

ТЬг

Ьуз

11е

ТЬг

Агд 10

Рго

Азр

Рго

Ьуз

Ηί8 15

Уа1

О1и

Меб

Ьеи

А1а 20

А1а

РЬе

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

11е

Ηί8

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

ТЬг

О1у 35

Ьеи

Меб

О1п

Зег

Туг 40

Меб

Агд

Рго

Уа1

Туг 45

А1а

О1у

А1а

Агд

А1а 50

А1а

О1у

ТЬг

А1а

Уа1 55

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго 60

Рго

А1а

Азр

Азп

- 308 029538

Тгр Меб 65

11е

Нбз

Уа1

А1а Уа1 70

О1и

О1п

Суз

Агд О1и О1у Азр 75

11е

Ьеи 80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

Азр

Уа1

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Уа1

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

О1и

100

105

110

О1у

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Нбз

11е

Нбз

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

РЬе

11е

А1а

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Агд

Агд

Бег

165

170

175

Агд

Уа1

А1а

О1и

11е

А1а

А1а

А1а

А1а

Меб

А1а

Агд

О1и

Азр

Ьуз

О1и

180

185

190

ТЬг

ТЬг

Уа1

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

Тгр

Агд

О1и

210

215

220

ТЬг

Рго

О1и

Ьуз

О1и

225 <210> 215 <211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 215

дбдадсдссд	бсабсаддаа	саббссасдс	бсдссдсбсд	адсбссбсда	бсдсббсаад	60
ддссбсддсд	ббдсдассдб	сбсддаадсд	садддссдса	адддссбббб	ддссбсдбаб	120
абдсдсссда	бсбабссддд	ддссдсдсбд	абсддсаабд	сддбдасддс	сбсддбсдсд	180
сссддсдаса	аббддасдаб	ссабдбсдсс	дбсдаадбсб	дссаддаадд	сдасдсдсбс	240
дбсдбсдсдс	ссассбссбб	сбдсдаддас	ддсбабббсд	дсдадсбасб	сдссасдбсб	300
сбдсадсадс	дсддбдбдсд	сдддсбсабб	сбсдаадсад	дсбдссдсда	сдбдсдсдад	360
сббсааадда	бдааббббсс	ддбббддбсд	сдсдсаабсб	абдсдсаадд	аасбдбдааа	420
дадасддбдд	дсдасдбдаа	ссбдссдсбс	сдсбдсдсад	дссадабсдб	саабдссддс	480
дабсбсаббд	бсдссдасда	сдасддсдбб	бдсдбсдбдс	ссбабдссда	бдбсдадаад	540
дбсббдаасд	сддсссдсда	асдбдсддсд	ааддаадада	ддаассдбдс	сдадббсдсс	600
аадддсдбдс	бсддссбсда	ссбсбасааа	бассдсдадс	дссбсдссдс	саадддссбс	660

- 309 029538 аааЕаЕЕЕсд асдасаЕсда ддсдЕаЕаад ааддсдаадЕ да

702 <210> 216 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 216

Уа1

11е 5

Агд

Азп

11е

Рго

Агд 10

Зег

Рго

Беи

О1и

Беи 15

Беи

МеЕ 1

Зег

А1а

Азр

Агд

РЬе

Буз

О1у

Беи

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Буз

О1у

Беи

Беи

А1а

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

О1у

А1а

35

40

45

А1а

Беи

11е

О1у

Азп

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

А1а

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

ТЬг

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

О1и

О1у

Азр

А1а

Беи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

РЬе

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Беи

85

90

95

Беи

А1а

ТЬг

Зег

Беи

О1п

О1п

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Беи

11е

Беи

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

О1и

Беи

О1п

Агд

МеЕ

Азп

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Туг

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Буз

О1и

ТЬг

Уа1

О1у

130

135

140

Азр

Уа1

Азп

Беи

Рго

Беи

Агд

Суз

А1а

О1у

О1п

11е

Уа1

Азп

А1а

О1у

145

150

155

160

Азр

Беи

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Туг

А1а

165

170

175

Азр

Уа1

О1и

Буз

Уа1

Беи

Азп

А1а

А1а

Агд

О1и

Агд

А1а

А1а

Буз

О1и

180

185

190

О1и

Агд

Азп

Агд

А1а

О1и

РЬе

А1а

Буз

О1у

Уа1

Беи

О1у

Беи

Азр

Беи

195

200

205

Туг

Буз

Туг

Агд

О1и

Агд

Беи

А1а

А1а

Буз

О1у

Беи

Буз

Туг

РЬе

Азр

210

215

220

Азр

11е

О1и

А1а

Туг

Буз

Буз

А1а

Буз

225

230

- 310

<210> 217
<211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 217 дЕдадсдЕдд	ЕсаЕссдааа	саЕЕссдсдс	асдссдсЕсд	сдсЕдсЕдда	садЕЕЕсааа	60
дддЕЕсддсд	ЕЕдсдасдаЕ	сЕсддаддсд	садддссдса	адддссЕсаЕ	ддсЕЕсЕЕаЕ	120
аЕдсдЕссда	ЕЕЕаЕссддд	адсЕдадсЕЕ	дЕсддсааЕд	сддЕдасддс	сЕсддЕсдсд	180
сссддсдаса	аЕЕддасдаЕ	ссаЕдЕсдсд	аЕсдаадЕсЕ	дссаддаадд	ЕдаЕдЕдсЕс	240
дЕддЕсдсдс	сЕдссЕсдЕЕ	ЕЕдсдаддаЕ	ддсЕаЕЕЕсд	дсдадсЕЕсЕ	сдсдасЕЕсд	300
сЕЕсадсадс	дсддсдЕдсд	сдддсЕсаЕЕ	сЕсдаадссд	дсЕдссдсда	сдЕасдсдсд	360
сЕЕсадаада	ЕдааЕЕЕЕсс	ддЕЕЕддЕсд	сдсдсдаЕЕЕ	Есдсасаадд	аассдЕдааа	420
дадасддЕсд	дсдасдЕсаа	ссЕдссдсЕс	сасЕдсдсдд	дссадаЕсдЕ	дсаЕддсддс	480
даЕсЕсаЕсд	ЕсдссдаЕда	ЕдасддсдЕс	ЕдсдЕсдЕдс	сдсаЕассда	ЕдЕсдадаад	540
дЕсЕЕдадсд	сддсдсдсда	асдсдсддсд	ааддаддадс	дааассдсдс	сдадЕЕЕдсс	600
аадддсдЕдс	ЕсддссЕсда	ссЕсЕасааа	Еассдсдадс	дссЕсдсЕса	ааадддссЕс	660
аадЕаЕЕасд	асдасаЕсда	адссЕаЕаас	ааадсдаадЕ	да		702
<210> 218 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 218

МеЕ 1

Зег

Уа1

Уа1

11е 5

Агд

Азп

11е

Рго

Агд 10

ТЬг

Рго

Ьеи

А1а

Ьеи 15

Ьеи

Азр

Зег

РЬе

Ьуз 20

О1у

РЬе

О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг

11е

Зег

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

Ьуз

О1у 35

Беи

МеЕ

А1а

Зег

Туг 40

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг 45

Рго

О1у

А1а

О1и

Беи 50

Уа1

О1у

Азп

А1а

Уа1 55

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

А1а 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

ТЬг

11е

НФз

Уа1

А1а 70

11е

О1и

Уа1

Суз

О1п 75

О1и

О1у

Азр

Уа1

Ьеи 80

- 311 029538

Уа1

Уа1

А1а

Рго А1а 85

Бег

РЬе

Суз

О1и

Азр 90

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и 95

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Беи

О1п

О1п

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Беи

11е

Беи

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Беи

О1п

Буз

Меб

Азп

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

РЬе

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

Уа1

О1у

130

135

140

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Беи

Няз

Суз

А1а

О1у

О1п

11е

Уа1

Няз

О1у

О1у

145

150

155

160

Азр

Беи

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Няз

ТЬг

165

170

175

Азр

Уа1

О1и

Ьуз

Уа1

Ьеи

Бег

А1а

А1а

Агд

О1и

Агд

А1а

А1а

Буз

О1и

180

185

190

О1и

Агд

Азп

Агд

А1а

О1и

РЬе

А1а

Ьуз

О1у

Уа1

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Ьеи

195

200

205

Туг

Буз

Туг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1п

Буз

О1у

Беи

Ьуз

Туг

Туг

Азр

210

215

220

Азр

11е

О1и

А1а

Туг

Азп

Буз

А1а

Ьуз

225 230 <210> 219 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 219

абдадсдбдд	бсдбдсадаа	сабсдаасдс	дссдасдсдб	сабббдбддс	аасдсбсддс	60
дадбдсддсд	бддсдассдб	дсасдаддсд	сааддбсдаа	сбддсббдаб	дсдсссббас	120
абдсдассда	бсбасдссдд	сдсссдсабс	дссддассдд	сддбдасддб	дбсдабсссд	180
сссддсдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсд	дбсдадсадб	дссдсдаддд	сдабабссбс	240
дбсдбддссс	сдассадссс	дадсдаддас	ддсбабббсд	дсдадббдсб	ддсдсдсбсд	300
сбдсбсдсдс	дсддсдбдад	дддбсббдбс	абсдаддссд	дсдбссдсда	сдбасдсдаб	360
сбсассдада	бсаадббссс	сдбабддбсс	ааадсдабаб	сддсдсаадд	сасддбдаад	420
дадасдабсд	дсбсддбдаа	бдбдссддбс	дбабдбдссд	дсдссдссаб	саабсссддс	480
дабдбсабад	бсдсбдасда	сдасддбдбс	бдсдбсдбдб	сасдсдаасд	ддсддаадас	540
дбсдссаадд	ссдсдсдсдс	ссдсдаадсс	ааддаадсдд	ааасдсдсаа	дсддсбдаба	600
бсаддсдадс	бсддссбсда	бабсбасддс	абдсдсдада	адсбсдсддс	даааддссбс	660
ааабабдссб	да					672

- 312 029538 <210> 220 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 220

О1п

Азп

11е О1и Агд А1а Азр 10

А1а

Зег

РЬе 15

Уа1

Меб 1

Зег

Уа1

Уа1

Уа1 5

А1а

ТЬг

Беи

О1у

О1и

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТЬг

О1у

Беи

Меб

Агд

Рго

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

11е

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

Нбз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

Беи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Беи

85

90

95

Беи

А1а

Агд

Зег

Беи

Беи

А1а

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Беи

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Агд

Азр

Беи

ТЬг

О1и

11е

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

А1а

11е

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

11е

О1у

130

135

140

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

11е

Азп

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Суз

Уа1

Уа1

Зег

Агд

О1и

165

170

175

Агд

А1а

О1и

Азр

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

А1а

Агд

А1а

Агд

О1и

А1а

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

О1и

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд

Беи

11е

Зег

О1у

О1и

Беи

О1у

Беи

Азр

11е

195

200

205

Туг

О1у

Меб

Агд

О1и

Ьуз

Беи

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Беи

Ьуз

Туг

А1а

210

215

220

<210>	221
<211>	672
<212>	ДНК
<213>	Неизвестно
<220>

- 313

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 221
абдадсдбдд	бсдбдсадаа	сабсдаасдс	дссдасдсдб	сббббдбддс	аасдсбсддс	60
дадбдсддсд	бддсдассдб	дсасдаддсд	сааддбсдаа	ссддсббдаб	дсдссссбас	120
абдсдассда	бсбасдссдд	сдсссдсабс	дссдддссдд	сддбдасддб	дбсдабссса	180
сссддсдаса	асбддабдаб	ссасдбсдсд	дбсдадсааб	дссдсдасдд	бдасабссбд	240
дбсдбсдсдс	сдассадссс	дадсдаддас	ддсбабббсд	дсдадббдсб	ддсдсдсбсд	300
сббсбсдсдс	дбддсдбдад	аддссбсдбс	абсдаддссд	дсдбссдсда	сдбдсдсдас	360
сббассдааа	бсддабббсс	сдбсбддбсд	ааддсдабсб	ссдсасаадд	сассдбсаад	420
дадасдсбсд	дсббддбдаа	сдбдссддбб	дбсбдсдссд	дсдсбасддб	саасссдддс	480
дабдбсабсд	бсдсддасда	сдасддбдбд	бдсдбддбдс	сасдсддсаа	бдссдаадад	540
дбсдсдаадд	ссдсссдсдс	ссдсдаддса	ааддаддсдд	адасдадсаа	дсддббдаба	600
дсаддбдадс	бсддссбсда	сабсбасддс	абдсдсдада	адсбддсддс	саадддссбс	660
ааабабдбсб	да					672

<210> 222 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 222

Уа1 5

О1п Азп

11е

О1и

Агд А1а Азр 10

А1а

Бег

РЬе 15

Уа1

Меб 1

Бег

Уа1

Уа1

А1а

ТЬг

Ьеи

О1у 20

О1и

Суз О1у

Уа1

А1а 25

ТЬг Уа1 НФз

О1и

А1а 30

О1п

О1у

Агд

ТЬг

О1у 35

Ьеи

Меб

Агд Рго

Туг 40

Меб

Агд Рго 11е

Туг 45

А1а

О1у

А1а

Агд

11е 50

А1а

О1у

Рго

А1а Уа1 55

ТЬг

Уа1

Бег 11е Рго 60

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр 65

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а Уа1 70

О1и

О1п

Суз Агд Азр 75

О1у

Азр

11е

Ьеи 80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг 85

Бег Рго

Бег

О1и

Азр О1у Туг 90

РЬе

О1у

О1и 95

Ьеи

Ьеи

А1а

Агд

Бег 100

Ьеи

Ьеи А1а

Агд

О1у 105

Уа1 Агд О1у

Ьеи

Уа1 110

11е

О1и

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1 Агд

Азр

Ьеи

ТЬг О1и 11е

О1у

РЬе

Рго

Уа1

- 314

115

120

125

Тгр

Бег 130

Ьуз

А1а

11е

Бег

А1а 135

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз 140

О1и

ТНг

Ьеи

О1у

Ьеи 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

ТНг

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд 175

О1у

Азп

А1а

О1и

О1и 180

Уа1

А1а

Ьуз

А1а

А1а 185

Агд

А1а

Агд

О1и

А1а 190

Ьуз

О1и

А1а

О1и

ТНг 195

Бег

Ьуз

Агд

Ьеи

11е 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у 210

МеЕ

Агд

О1и

Ьуз

Ьеи 215

А1а

А1а

Ьуз

О1у

Ьеи 220

Ьуз

Туг

Уа1

<210> 223 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 223
аЕдаасдадс	сдаЕсдЕсдЕ	ЕсддасдаЕс	дсдсддссдЕ	сддссдаддс	даЕсдсддсд	60
сЕдсадсддЕ	асддсдЕдЕс	дасЕдЕдсаЕ	даадсдсаад	дасдасдсдд	асЕдсЕсддд	120
ЕсЕсдсЕЕдс	дассдаЕсЕа	садсддсдсд	дсдаЕсдссд	дЕссадсддЕ	сассдЕЕЕсд	180
сЕдссдссЕд	дЕдасаассЕ	саЕдаЕЕсас	дЕсдссдЕсд	аддЕдЕдсса	дссЕддсдас	240
дЕдсЕсдЕсд	Еддссссдас	сЕсссссЕдс	асддасддсЕ	аЕЕЕсддЕда	асЕдЕЕддсс	300
асдЕсдЕЕЕс	дсдсасдсдд	сдЕсдЕсддс	сЕдаЕсаЕсд	аЕдссддсЕд	ссдсдасдЕд	360
сдсдсдЕЕдЕ	сддадаЕдсд	сЕЕЕсссдЕс	Еддадссдсд	сдаЕсадсдс	дсадддЕасд	420
дЕдааддссЕ	сдЕЕдддЕЕс	ддЕдаасдЕЕ	дссдЕсдЕдЕ	дЕдддддадс	дЕссдЕсааЕ	480
ссаддсдаЕд	сдаЕсдЕддс	сдасдаЕдаЕ	ддддЕддЕдд	ЕсдЕддсдсд	саасдаддЕд	540
даадсддЕдд	ЕдсаддсдЕс	ддадсадсдс	аЕссддаадд	аасаддсдас	дсдсдадсдд	600
сЕддсдадсд	дЕдаасЕддд	ссЕсдаЕаЕс	ЕасддссЕса	ддаааааддЕ	дЕсддассЕс	660
дддсЕдаааЕ	аЕЕсдЕда					678

<210> 224 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды

- 315 029538 <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 224

Рго

Бег

А1а 15

О1и

Меб 1

Азп

О1и

Рго

11е Уа1 5

Уа1

Агд

ТЬг

11е 10

А1а

Агд

А1а

11е

А1а

А1а

Ьеи

О1п

Агд

Туг

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

О1у

Бег

Агд

Ьеи

Агд

Рго

11е

Туг

Бег

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

РЬе

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

Уа1

О1у

Ьеи

11е

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

Бег

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

Бег

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

А1а

Уа1

Уа1

Суз

О1у

О1у

А1а

Бег

Уа1

Азп

145

150

155

160

Рго

О1у

Азр

А1а

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

165

170

175

Агд

Азп

О1и

Уа1

О1и

А1а

Уа1

Уа1

О1п

А1а

Бег

О1и

О1п

Агд

11е

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1п

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Бег

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

Уа1

Бег

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Бег

225 <210> 225 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 225 абдаасдббд бсдбссддаа бабсдадсдд дссдсбдсдд абасдабсдс сдбдсббддс

- 316 029538

дааЕдсддсд	ЕсдсдасддЕ	дсасдаддса	садддссдса	дсддссЕсаЕ	дсдЕсссЕаЕ	120
аЕдсдассда	ЕсЕаЕасддд	сдсдсдсаЕс	дссддсЕсдд	сддЕсасЕдЕ	дЕсддЕсссд	180
ссдддсдаса	асЕддаЕдаЕ	ссаЕдЕсдсд	дЕсдаасааЕ	дссасдасдд	сдасдЕссЕс	240
дЕсдЕддсдс	сдассадссс	аЕдсдаЕдас	ддсЕаЕЕЕсд	дсдадсЕЕсЕ	ддсдсдсЕсд	300
сЕдсдддсдс	асддсдЕдад	аддссЕсдЕд	аЕсдаддсад	дсдЕдсдсда	сдЕдсдсдаЕ	360
сЕсассдада	ЕдсадЕЕссс	ддЕсЕддЕсд	аааЕсдаЕсЕ	ссдсдсаадд	дасддЕдаад	420
дадасдаЕсд	дсЕсддЕдаа	сдЕдссддЕс	дЕсЕдсдсдд	дЕдссдссдЕ	сааЕссдддс	480
дасдЕсаЕсд	Еддссдасда	сдаЕддсдЕс	ЕдсдЕЕдЕас	сдсдаддсса	ддсддсадЕс	540
дЕЕдссдадд	сддсасдсдс	дсдсдаддсд	ааддаддссд	аддЕссдсаа	дсдссЕддЕЕ	600
дссддддадс	ЕсддЕсЕсда	саЕсЕасддс	аЕдсдсдаас	ддсЕддсддс	даадддссЕд	660
аадЕаЕдЕсЕ	да					672

<210> 226 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 226

МеЕ 1

Азп

Уа1

Уа1

Уа1 5

Агд Азп

11е

О1и

Агд 10

А1а

А1а

А1а

Азр

ТЬг 15

11е

А1а

Уа1

Ьеи

О1у

О1и

Суз О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Зег

О1у

Ьеи

МеЕ

Агд Рго

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

ТЬг

О1у

А1а

35

40

45

Агд

11е

А1а

О1у

Зег

А1а Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а Уа1

О1и

О1п

Суз

НФз

Азр

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег Рго

Суз

Азр

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

Агд

Зег

Ьеи

Агд А1а

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

Уа1 Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

О1п

РЬе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Зег

Ьуз

Зег

11е

Зег А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

11е

О1у

130

135

140

- 317

Зег 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

А1а

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Рго

Агд 175

О1у

О1п

А1а

А1а

Уа1 180

Уа1

А1а

О1и

А1а

А1а 185

Агд

А1а

Агд

О1и

А1а 190

Ьуз

О1и

А1а

О1и

Уа1 195

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

Уа1 200

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Ьеи

Азр

11е

Туг О1у Меб Агд О1и Агд Ьеи А1а А1а Ьуз О1у Ьеи Ьуз Туг Уа1

210		215		220
<210> 227 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 227 абдаасаадс	ссдбддббдб	дсддаасабс	дадсдбссдс	сддсддабдс	бдбддссдсд	60
сббдадаааб	асддсдбдбс	дасддбдсас	даддсссадд	дссддаасдд	ссбасбддсс	120
бссбабабдс	дсссдабсба	бдсаддадсс	дсдабсдсбд	дассадссдб	сасадбббсс	180
сбсссдссдд	дадасаассб	дабдаббсас	дбсдссдбсд	аддбсбдбсд	дссбддддаб	240
дбссбсдббд	ббдсдссдас	абсдссабдс	ассдасддсб	аббббддада	дббдсббдса	300
асббсдсбсд	сддсдсабдд	ддбдаааддс	ббадбсаббд	аддсдддабд	бсдсдасдбс	360
сдадсбсбда	сддааабдаа	дбббссадбс	бддадссдсд	ссдбсадсбс	дсааддаасд	420
дбдааддсаа	сасббдддбс	ддбааабдба	асдаббдббб	дбдсдддбдс	бдсддббдса	480
сссддбдабд	бдабсдбддс	ддасдабдаб	ддсдбсдббд	бсдбдааасд	дасададдсд	540
саададдбсд	ббассдсабс	бдадсадада	ббдсдааадд	аададддаас	ссдсаадсдд	600
сббдсббсдд	дддаасбсдд	ссбддабабб	басддссбдс	дассдаадаб	бдсадассбс	660
ддбсбсаадб	асббдбад					678

<210> 228 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

- 318 029538 <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά = РЗ00001

<400> 228

Меб 1

Азп

Ьуз

Рго

Ча1 5

Ча1

Ча1

Агд

Азп

11е 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Ча1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Ча1

Зег

ТЬг

Ча1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Азп

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

Туг

А1а

О1у

А1а 50

А1а

11е

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Ча1

ТЬг

Ча1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Ча1

А1а

Ча1

О1и

Ча1 75

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр 80

Ча1

Ьеи

Ча1

Ча1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

А1а 105

НФз

О1у

Ча1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Ча1

11е

О1и

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Ча1 120

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Ча1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Ча1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Ча1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Ча1

Азп

Ча1 150

ТЬг

11е

Ча1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

А1а

Ча1

А1а 160

Рго

О1у

Азр

Ча1

11е 165

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Ча1

Ча1

Ча1

Ча1 175

Ьуз

Агд

ТЬг

О1и

А1а 180

О1п

О1и

Ча1

Ча1

ТЬг 185

А1а

Зег

О1и

О1п

Агд 190

Ьеи

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

О1у

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд 200

Ьеи

А1а

Зег

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Рго 215

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 229 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 229

абдаасаадс	ссдбддббдб	дсддаасабс	дадсдбссдс	сддсддабдс	бдбддссдсд	60
сббдадаааб	асддсдбдбс	дасддбдсас	даддсссадд	дссддаасдд	ссбасбддсс	120

- 319 029538

бссбабабдс	дсссдабсба	бдсаддадсс	дсдабсдсбд	дассадссдб	сасадбббсс	180
сбсссдссдд	дадасаассб	дабдаббсас	дбсдссдбсд	аддбсбдбсд	дссбддддаб	240
дбссбсдббд	ббдсдссдас	абсдссабдс	ассдасддсб	аббббддада	дббдсббдса	300
асббсдсбсд	сддсдсабдд	ддбдаааддс	ббадбсаббд	аддсдддабд	бсдсдасдбс	360
сдадсбсбда	сддааабдаа	дбббссадбс	бддадссдсд	ссдбсадсбс	дсааддаасд	420
дбдааддсаа	сасббдддбс	ддбааабдба	асдаббдббб	дбдсдддбдс	бдсддббдса	480
сссддбдабд	бдабсдбддс	ддасдабдаб	ддсдбсдббд	бсдбдааасд	дасададдсд	540
саададдссд	ббассдсабс	бдадсадада	ббдсдааадд	аададддаас	ссдсаадсдд	600
сббдсббсдд	дддаасбсдд	ссбддабабб	басддссбдс	дассдаадаб	бдсадассбс	660
ддбсбсаадб	асббдбад					678

<210> 230 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά. = РБ00001

<400> 230

Уа1

Агд

Азп

11е 10

О1и Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1 А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

Бег ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у Агд 35

Азп

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

Меб Агд

Рго 45

11е

Туг

А1а

О1у

А1а А1а 50

11е

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1 Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 Суз 75

Агд

Рго

О1у

Азр 80

Уа1

Ьеи Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

ТЬг Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

А1а

А1а 105

НФз

О1у Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

О1и А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

- 320 029538

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

ТЬг

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

А1а

Уа1

А1а

145

150

155

160

Рго

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

ТЬг

О1и

А1а

О1п

О1и

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Бег

О1и

О1п

Агд

Ьеи

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

О1у

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

Бег

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Рго

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225 <210> 231 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно

<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 231
абдаабдаас	сддбддбааб	ссддсаддбд	дадсадссас	садсадасдс	адббдссдса	60
ббддадаааб	дбддсдбдас	аассдбссаб	даадсбсаад	дасдббдбдд	ссбдсббдсд	120
сасбасабдс	дбсссабббб	сссдддадса	ассабсдсдд	дббссдссдб	сассдбдбсб	180
сбдссбсссд	дбдасаассб	сабдабссас	дббдсддбсд	аадбсбдсад	дссдддааас	240
абссбддбсд	бббсассдас	абсдссдбдс	бсддабддсб	асббсддсда	дсбаббддса	300
асббсбсбдс	дбдсбсасдд	бдбаададдд	сббдбдабсд	асдссддабд	садддасдбс	360
сдсбсдсбда	сбдадабдаа	абббсссдбс	бддадссдсд	ссабсадббс	дсадддбасс	420
дбсааадсса	сдсбсддабс	ддбдаабдбд	ссдабсасдб	дсдсдддсдс	дббадбсдас	480
дсаддбдабд	бсаббдбсдс	бдасдабдаб	ддадббдбдд	ббдбдаадсд	сдсдсаддсд	540
саададдбсд	сбдссдсддс	ддадсааадд	дббсдсааад	адаасдсдас	ссдсдаасда	600
сббдсасдбд	дададсбадд	асбсдабабб	басдасабдс	дссадаадаб	сдсдсаасбд	660
ддссббаадб	абсддбда					678

<210> 232 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 321 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 232

11е

Агд О1п

Уа1 10

О1и О1п Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп О1и

Рго Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Шз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Ηΐ8

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

РЬе

Рго

35

40

45

О1у

А1а

ТЬг

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Ηί8

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

Зег

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Шз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

ТЬг

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Азр

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

О1п

А1а

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Агд

225 <210> 233 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 233

- 322 029538

аЕдаасааас	сддЕддЕдаЕ	ссддсаадЕд	дадсддссдс	сддсЕдасдс	ддЕддсддсд	60
сЕсдааассЕ	аЕддсдЕдЕс	сассдЕдсас	даддсссадд	ддсдЕЕдсдд	дсЕдсЕсдсЕ	120
ЕссЕасаЕдс	ддссдаЕЕЕа	Еддсддсдсс	сЕдаЕЕдссд	ддЕсддсддЕ	сасддЕдЕса	180
сЕЕссдсссд	дсдаЕааЕсЕ	даЕдаЕЕсас	дЕЕдссдЕдд	аддЕсЕдсса	аЕссддсдас	240
аЕЕсЕсдЕдд	ЕЕдсЕсссас	дЕсдссЕЕдЕ	ЕсддасддЕЕ	асЕЕсддЕда	асЕЕсЕддса	300
ассЕсссЕдс	дддсасасдд	сдЕсаадддд	сЕсдЕдаЕЕд	аЕдсдддЕЕд	ссдсдасдЕЕ	360
сддЕсдсЕЕа	ссдаааЕдаа	дЕЕссссдЕс	Еддадссдсд	сЕдЕсадЕЕс	дсааддаасс	420
дЕдаааЕсда	сЕсЕсддаЕс	ддЕдааЕдЕа	адсдЕсдЕЕЕ	дсдссддадс	асдсаЕсдаа	480
дссддсдаЕд	ЕддЕсдЕсдс	ддаЕдасдаЕ	ддсдЕсдЕдд	ЕддЕддсдсд	ддсасдсдсс	540
сасдаадЕад	ЕсдсддсдЕд	сдаасаасдс	аЕЕсдсаадд	аададдсаас	ссдсдаасдд	600
сЕддсдсддд	дадаасЕсдд	асЕсдаЕаЕс	ЕасддсЕЕдс	дсасаааааЕ	сдсддадаЕд	660
ддЕсЕсдадЕ	аЕсааЕда					678

<210> 234 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозтЕе ίά. = РЗ00001

<400> 234

Уа1 5

Уа1

11е Агд

О1п

Уа1 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

МеЕ 1

Азп

Ьуз

Рго

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

ТЬг Туг

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

Нчз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи А1а 40

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

О1у

О1у

А1а 50

Ьеи

11е

А1а

О1у

Зег А1а 55

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

Нчз 70

Уа1 А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1п

Зег

О1у

Азр 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг Зег

Рго

Суз 90

Зег

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи Агд

А1а

Нтз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

- 323

100

105

110

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Бег

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Агд

11е

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

А1а

Агд

А1а

Агд

А1а 180

НФз

О1и

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд 190

11е

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг 215

Ьуз

11е

А1а

О1и

Меб 220

О1у

Ьеи

О1и

Туг

О1п

225 <210> 235 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 235
абдаабдаас	сддбддбааб	ссддсаддбд	дадсадссас	садсадасдс	адббдссдса	60
ббддадаааб	дбддсдбдас	аассдбссаб	даадсбсаад	дасдббдбдд	ссбдсббдсд	120
сасбасабдс	дбсссабббб	сссдддадса	ассабсдсдд	дббссдссдб	сассдбдбсб	180
сбдссбсссд	дбдасаассб	сабдабссас	дббдсддбсд	аадбсбдсад	дссдддааас	240
абссбддбсд	бббсассдас	абсдссдбдс	бсддабддсб	асббсддсда	дсбаббддса	300
асббсбсбдс	абдсбсасдд	бдбаададдд	сббдбдабсд	асдссддабд	садддасдбс	360
сдсбсдсбда	сбдадабдаа	абббсссдбс	бддадссдсд	ссабсадббс	дсадддбасс	420
дбсааадсса	сдсбсддабс	ддбдаабдбд	ссдабсасдб	дсдсдддсдс	дббадбсдас	480
дсаддбдаба	бсаббдбсдс	бдасдабдаб	ддадббдбдд	ббдбдаадсд	сдсдсаддсд	540
саададдбсд	сбдссдсддс	ддадсааадд	дббсдсааад	адаасдсдас	ссдсдаасда	600
сббдсасдбд	дададсбадд	асбсдабабб	басдасабдс	дссадаадаб	сдсасаасбд	660
ддссббаадб	абсддбда					678

<210> 236 <211> 225

- 324 029538 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 236

Меб Азп 1

О1и

Рго

Уа1 5

Уа1

11е

Агд

О1п Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Беи

О1и

Буз

Суз

О1у

Уа1

ТНг

ТНг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Беи

Беи

А1а

НФз

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

РНе

Рго

35

40

45

О1у

А1а

ТНг

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТНг

Уа1

Бег

Беи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Беи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Беи

Уа1

Уа1

Бег

Рго

ТНг

Бег

Рго

Суз

Бег

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у

85

90

95

О1и

Беи

Беи

А1а

ТНг

Бег

Беи

НФз

А1а

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у

Беи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Беи

ТНг

О1и

Меб

Буз

РНе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

Бег

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Буз

А1а

ТНг

130

135

140

Беи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

ТНг

Суз

А1а

О1у

А1а

Беи

Уа1

Азр

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

11е

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Буз

165

170

175

Агд

А1а

О1п

А1а

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

А1а

ТНг

Агд

О1и

Агд

Беи

А1а

Агд

О1у

О1и

Беи

О1у

Беи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Буз

11е

А1а

О1п

Беи

О1у

Беи

Буз

Туг

210 215 220

Агд 225
<210>	237
<211>	678
<212>	ДНК
<213>	Неизвестно
<220>

- 325

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 237
аЕдаасаадс	ссдЕддЕддЕ	ссддсасдЕд	дадсадссас	сЕдсЕдаЕдс	ддЕадссдсЕ	60
ЕЕддаааадЕ	аЕддсдЕдЕс	аассдЕЕсаЕ	даддсссадд	дасддЕсддд	ЕсЕЕсЕсдсс	120
адЕЕассЕдс	ддссдаЕсЕЕ	Едссддсдсс	ЕсааЕсдсад	ддссддсддЕ	ЕасддЕсЕсд	180
сЕдссассЕд	дддасааЕЕЕ	даЕдаЕссас	дЕсдссдЕсд	аддЕдЕдсас	дссЕддаадс	240
аЕссЕЕдЕсд	Есдссссаас	сЕссссЕЕдЕ	асддасддсЕ	аЕЕЕсддада	дсЕдсЕддсд	300
ассЕсдсЕЕс	дсдсасасдд	сдЕааадддд	ЕЕддЕсаЕсд	аЕдссдддЕд	ЕсдсдасдЕЕ	360
аддЕсЕЕЕаа	сддаааЕдаа	сЕЕЕсссдЕЕ	ЕддадссдсЕ	сддЕсадЕЕс	дсааддаасс	420
дЕсааадсда	сдЕЕдддаЕс	ддЕдааЕдЕа	ддсдЕсдЕсЕ	дсдссддЕдс	аЕасдЕсдад	480
ссаддсдасд	ЕдаЕсдЕсдс	ддасдаЕдас	ддадЕЕдЕад	ЕсдЕдаадсд	ддсддсЕдсд	540
сссдаддсЕд	ЕсдЕсдссЕс	сдаадсдада	дЕЕсдЕааад	аадссдсдас	дсдсдадсдЕ	600
сЕсЕсссдсд	дададсЕЕдд	ссЕЕдасаЕс	ЕасддссЕас	дЕЕсааадаЕ	ЕдсддассЕЕ	660
ддссЕсдадЕ	аЕсЕдЕда					678

<210> 238 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 238

МеЕ 1

Азп

Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

Нтз

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

Бег

ТНг

Уа1

Нтз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Бег

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

Ьеи

Агд

Рго 45

11е

РНе

А1а

О1у

А1а 50

Бег

11е

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТНг

Уа1

Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

Нтз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

ТНг

Рго

О1у

Бег 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТНг

Бег

Рго

Суз 90

ТНг

Азр

О1у

Туг

РНе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Нтз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100 105 110

- 326 029538

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Азп

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

Зег

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

О1у

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Туг

Уа1

О1и 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

А1а

А1а 180

Рго

О1и

А1а

Уа1

Уа1 185

А1а

Зег

О1и

А1а

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

А1а 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

Зег

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Зег 215

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи 220

О1у

Ьеи

О1и

Туг

Ьеи

225

<210> 239
<211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 239 абдаасааас	сддбддбдаб	ссддсаадсд	дадсддссдс	сддсбдасдс	ддбддсддсд
сбсдсаассб	абддсдбдбс	сассдбдсаб	даддсссадд	ддсдббдсдд	асбдсбсдсб
бссбасабдс	ддссдаббба	бсасддсасс	дсдаббдссд	ддбсддсддб	сасддбдбсс
сббссдсссд	дсдасаабсб	дабдаббсас	дббдссдбдд	аддбсбдсса	абссддсдас
аббсбсдбдд	бсдсбсссас	дбсдсссбдб	бссдасддбб	асббсддсда	асбссбддсс
ассбсбсбдс	дддсдсасдд	сдбсаадддд	сбсдббаббд	абдсдддббд	ссдсдасдбб
сдсбсдсбса	дсдсаабдаа	дббссссдбс	бддадссдсд	сбдбсадббс	дсааддсасс
дбдааабсба	сбсбсддабс	ддбдаабдбд	адсдбсдббб	дсдссддадс	асдсабсдаа
дссддсдасд	бддбсдбсдс	ддабдасдаб	ддсдбсдбдд	бддбддадсд	адсабссдсс
сасдаадбад	бсдбддсдбд	сдаасаасдс	сббсдсаадд	аададдсаас	бсдсдадсдс
сбддсдсддд	дадаасбсдд	асбсдасабс	басддсббдс	дсасаааадб	сдсддадабд

ддбсбсаадб абсаабда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 240 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 327 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά = РЗ00001 <400> 240

Меб Азп 1

Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

11е

Агд О1п А1а О1и Агд 10

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

А1а

ТЬг

Туг

О1у

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

НФз

35

40

45

О1у

ТЬг

А1а

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Зег

О1у

Азр

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

Зег

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Зег

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Зег

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Агд

11е

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

О1и

165

170

175

Агд

А1а

Зег

А1а

НФз

О1и

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд

Ьеи

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Меб

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

О1п

225 <210> 241 <211> 678

- 328 029538 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 241 аЕдаасааас сддЕддЕдаЕ ссддсаадЕд дадсддссдс сддсЕдасдс ддЕддсддсд сЕсдсаассЕ аЕддсдЕдЕс сассдЕдсаЕ даддсссадд ддсдЕЕдсдд асЕдсЕсдсЕ

ЕссЕасаЕдс ддссдаЕЕЕа Есссддсасс дсдаЕЕдссд ддЕсддсддЕ сасддЕдЕсс сЕЕссдсссд дсдасааЕсЕ даЕдаЕЕсас дЕЕдссдЕдд аддЕсЕдсса аЕссддсдас аЕЕсЕсдЕдд ЕсдсЕсссас дЕсдссЕЕдЕ ЕсддасддЕЕ асЕЕсддсда асЕссЕддсс ассЕсЕсЕдс дддсдсасда сдЕсаадддд сЕсдЕЕаЕЕд аЕдсдддЕЕд ссдсдасдЕЕ сдсЕсдсЕса дсдсааЕдаа дЕЕссссдЕс Еддадссдсд сЕдЕсадЕЕс дсааадсасс дЕдаааЕсЕа сЕсЕсддаЕс ддЕдааЕдЕд адсдЕсдЕЕЕ дсдссддадс асдсаЕсдаа дссддсдасд ЕддЕсдЕсдс ддаЕдасдаЕ ддсдЕсдЕдд ЕддЕддадсд адсаЕссдсс сасдаадЕад ЕсдсддсдЕд сдаасаасдс сЕЕсдсаадд аададдсаас Есдсдадсдс сЕддсдсддд дадаасЕсдд асЕсдасаЕс ЕасддсЕЕдс дсасаааадЕ сдсддадаЕд ддЕсЕсаадЕ аЕсааЕда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 242 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ίά = РЗ00001 <400> 242

МеЕ 1

Азп

Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

11е

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

А1а

ТЬг

Туг

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

ТЬг 50

А1а

11е

А1а

О1у

Зег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

- 329 029538

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

Нбз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

О1п

Бег

О1у

Азр 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

Бег

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

Нбз

Азр

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

Бег

А1а 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

Бег

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Бег

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Агд

11е

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

О1и

Агд

А1а

Бег

А1а 180

Нбз

О1и

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд 190

Ьеи

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Меб

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

О1п

225 <210> 243 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 243

абдаасадас	сбдбддббдб	ссдддаддбд	дадсддссдс	сддсадабдс	бдбдасадсд	60
сбсдадсадб	асддддбабс	дасддбдсаб	даадсбсаад	ддсдббдсдд	дббасбсдса	120
бсдбабабдс	ддссдаббба	бдссддадсд	дссабсдсбд	дбсссдссдб	дасбдбббсб	180
сбассбссдд	дадасаасбб	дабдаббсас	дбддсддбсд	аддбсбдссд	бссдддадас	240
абссбсдббд	бддсдссдас	дбсдссдбдб	асддабддсб	аббббддада	дсбдсббдса	300
асббсасбсс	дадсасабдд	сдбдааадда	сббдбдабсд	абдсдддабд	бсдсдабдбб	360
сдсбсдсбда	сбдадабдаа	дбббсссдбд	бддадбсдсд	сддбдадббс	дсадддаасд	420
дбдааддсда	сдсбсддабс	адбааабдбд	адбабсдбдб	дсдссддсдс	асбсдбсдаа	480
дссддсдабд	бсабсабсдс	ддабдасдаб	ддадссдбад	ббдбдаддад	дасадссдсд	540
ааадасдбдд	бсдсддсдбс	бдаасадада	дбдсдаааад	аададдсдас	дсдааддсдд	600

- 330 029538 сббдсдсаад дсдаасбсдд бсбддасабс басдддббдс дсдсдааааб сдсддассбс ддбсбсаадб ассбдбаа <210> 244 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозгбе ίά = РБ00001

660

678

<400> 244

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1и

Уа1 10

О1и Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

А1а 20

Беи

О1и

О1п

Туг

О1у 25

Уа1

Бег ТЬг

Уа1

Н1з 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Беи

А1а 40

Бег

Туг

Меб Агд

Рго 45

11е

Туг

А1а

О1у

А1а 50

А1а

11е

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1 Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

Н1з 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 Суз 75

Агд

Рго

О1у

Азр 80

11е

Беи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

ТЬг Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Беи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Беи

Агд

А1а 105

Н1з

О1у Уа1

Ьуз

О1у 110

Беи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Беи ТЬг

О1и 125

Меб

Буз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

О1у ТЬг 140

Уа1

Буз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Бег

11е

Уа1

Суз

А1а О1у 155

А1а

Беи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

11е

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у А1а

Уа1

Уа1

Уа1 175

Агд

Агд

ТЬг

А1а

А1а 180

Буз

Азр

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Бег О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Буз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

Агд

Агд 200

Ьеи

А1а

О1п О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

11е

А1а

Азр Беи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

- 331

210 215 220

Ьеи

225 <210> 245 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 245
абдаасаадб	ссдбддбддб	бсдсаасдбс	дадсадссбс	сбдссдабдс	сабддссдсд	60
сбсдаааааб	абддсдбббс	сассдббсас	даадсдсаад	дссдсбдсдд	сббдсбсдсс	120
бсббасабдс	дсссаабббб	сдддддбдсс	бссдбсдссд	дссссдсддб	сассдбсбсс	180
дбдссдсссд	дсдасаассб	сабдаббсас	дбсдсбдбад	аадбсбдссд	сссдддадас	240
аббсбсдбсд	бадсссссас	абсдсдсбдс	ассдасддсб	асббсддсда	асбасбадсс	300
асббсдббдс	дсдсссасдд	сдбсаааддс	сбсдбсабсд	абдссддббд	ссдсдасдбс	360
сдсбссббда	ссдааабдаа	абббсссдбс	бддадссдсд	ссабсадббс	дсааддсасс	420
дбсааабсса	сбдбдддсбс	ддбааасдбс	сссдбсдбдб	дбдсдддсдс	асбсабсдса	480
сссддсдасд	бсабддбсдс	ддабдасдаб	ддсдббдбсд	бсдбдсадсд	сдссдссдсс	540
сдсдасдбсд	бсдссдссбс	ддаасааадд	аббсдсаадд	аадаадссас	асдбдадсдб	600
сбддбдсдсд	дбдаасбсад	ссбсдабабс	басддссбдс	дсдсаааасб	сассдааббд	660
ддбсбсасдб	асббдбад					678

<210> 246 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (2)...(5) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά. = РБ00001 <400> 246

Меб Азп Ьуз Бег Уа1 Уа1 Уа1 Агд Азп Уа1 О1и О1п Рго Рго А1а Азр

5 10 15

А1а Меб А1а А1а Ьеи О1и Ьуз Туг О1у Уа1 Бег ТЬг Уа1 НФз О1и А1а

- 332 029538

25 30

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

РЬе

О1у

О1у

А1а 50

Бег

Уа1

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег 60

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Агд

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е 135

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

Уа1 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

11е

А1а 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

Меб 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

О1п

Агд

А1а

А1а

А1а 180

Агд

Азр

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Бег

О1и

О1п

Агд 190

11е

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

Уа1

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

Бег

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а 215

Ьуз

Ьеи

ТЬг

О1и

Ьеи 220

О1у

Ьеи

ТЬг

Туг

Ьеи

225

<210> 247 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 247 дбдасдддбс	сдабсдбсдб	бсдсассабс	дасадассда	бддссдабдб	сдбсдссдсд	60
сбдсадсдсс	абддсдбсбс	дасддббсас	даадсасаад	ддсдасдддд	асбдсбсдсд	120
бссбдсдбдс	ддссдабсба	бдбдддсдсс	дбдаббдсдд	дбссбдссдб	сассдбсбсд	180
сбдссассбд	дсдасаассб	дабдаббсас	дбсдсддбдд	адабдбдбса	дсссддсдаб	240
дбссбсдбсд	бсдссссдас	сбсбссдбдс	ассдасддсб	абббсддсда	асбдсбддсд	300
ассбсаббдс	асдсссдсдд	сдбсасддда	сбсабсабсд	абдссддсбд	ссдддасдбб	360

- 333 029538

сдсдссббда	сддасабдсд	абббссддбб	бддадссдсд	сдабсадсдс	дсадддсасс	420
дбсаадбсаа	сдсбсддабс	адбдаасдбд	ссддбддбдб	дсдссддадс	дббддбссас	480
дсдддсдасд	ссабсдбддс	ддабдасдаб	ддсдбддбдд	бддбдадасд	ддаададдсд	540
дддассдбдб сбсдсдсдад	сддаддсдбд дсдадсббдд	сдсддадсдд бсбсдабабс	дсдсдсаадд басддссбдс	аададдссас дааааааасб	дадддаасдд сассдассбс	600 660
ддссбдаадб	аббсдбад					678
<210> 248 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 248

Уа1

Агд

ТЬг

11е Азр 10

Агд

Рго

Меб

А1а 15

Азр

Меб 1

ТЬг

О1у Рго

11е Уа1 5

Уа1

Уа1

А1а А1а 20

Ьеи О1п

Агд

Н1з

О1у 25

Уа1 Зег

ТЬг

Уа1

Н1з 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд Агд 35

О1у Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Суз Уа1

Агд

Рго 45

11е

Туг

Уа1

О1у

А1а 50

Уа1 11е

А1а О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи Меб

11е Н1з 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и Меб 75

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр 80

Уа1

Ьеи

Уа1 Уа1

А1а Рго 85

ТЬг

Зег

Рго

Суз ТЬг 90

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи А1а 100

ТЬг Зег

Ьеи

Н1з

А1а 105

Агд О1у

Уа1

ТЬг

О1у 110

Ьеи

11е

11е

Азр

А1а О1у 115

Суз Агд

Азр

Уа1 120

Агд

А1а Ьеи

ТЬг

Азр 125

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр Зег

Агд А1а

11е 135

Зег

А1а

О1п О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Зег

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег Уа1

Азп Уа1 150

Рго

Уа1

Уа1

Суз А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

Н1з 160

А1а

О1у

Азр А1а

11е Уа1 165

А1а

Азр

Азр

Азр О1у 170

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Агд

Агд

О1и

О1и А1а 180

О1у ТЬг

Уа1

Зег

О1и 185

А1а Суз

А1а

О1и

Агд 190

А1а

Агд

Ьуз

О1и

О1и А1а

ТЬг Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

- 334

195 200 205

Азр 11е Туг О1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи ТЬг Азр Ьеи О1у Ьеи Ьуз Туг

210		215		220
Зег 225
<210> 249 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 249 аЕдаасаадЕ	ссдЕддЕддЕ	ЕсдсаасдЕс	дадсадссЕс	сЕдссдаЕдс	саЕддссдсд	60
сЕсдаааааЕ	аЕддсдЕЕЕс	сассдЕЕсас	даадсдсаад	дссдсЕдсдд	сЕЕдсЕсдсс	120
ЕсЕЕасаЕдс	дсссааЕЕЕЕ	сдддддЕдсс	ЕссдЕсдссд	дссссдсддЕ	сассдЕсЕсс	180
дЕдссдсссд	дсдасаассЕ	саЕдаЕЕсас	дЕсдсЕдЕад	аадЕсЕдссд	сссдддадас	240
аЕЕсЕсдЕсд	Еадсссссас	аЕсдсссЕдс	ассдасддсЕ	асЕЕсддсда	асЕасЕадсс	300
асЕЕсдЕЕдс	дсдсссасдд	сдЕсаааддс	сЕсдЕсаЕсд	аЕдссддЕЕд	ссдсдасдЕс	360
сдсЕссЕЕда	ссдаааЕдаа	аЕЕЕсссдЕс	Еддадссдсд	ссаЕсадЕЕс	дсааддсасс	420
дЕсаааЕсса	сЕдЕдддсЕс	ддЕааасдЕс	сссдЕсдЕдЕ	дЕдсдддсдс	асЕсаЕсдса	480
сссддсдасд	ЕсаЕддЕсдс	ддаЕдасдаЕ	ддсдЕЕдЕсд	ЕсдЕдсадсд	сдссдссдсс	540
сдсдасдЕсд	ЕсдссдссЕс	ддаасааадд	аЕЕсдсаадд	аадаадссас	асдЕдадсдЕ	600
сЕддЕдсдсд	дЕдаасЕсдд	ссЕсдаЕаЕс	ЕасддссЕдс	дсдсаааасЕ	сассдааЕЕд	660
ддЕдЕсасдЕ	асЕЕдЕад					678
<210> 250 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (2)...(5) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ίά = РЗ00001 <400> 250

МеЕ Азп Ьуз Зег Уа1 Уа1 Уа1 Агд Азп Уа1 О1и О1п Рго Рго А1а Азр

5 10 15

- 335 029538

А1а

МеЕ

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

РЬе

О1у

О1у

А1а 50

Зег

Уа1

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Зег

ТЬг

Уа1 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

11е

А1а 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

МеЕ 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

О1п

Агд

А1а

А1а

А1а 180

Агд

Азр

Уа1

Уа1

А1а 185

А1а

Зег

О1и

О1п

Агд 190

11е

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

Уа1

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

О1и

Ьеи

О1у

Уа1

ТЬг

Туг

210 215 220

Ьеи

225

<210> 251 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 251 аЕдаасаадс	сддсаЕЕсдЕ	ЕсдссссдЕа
дасдсддЕад	ссдсдсЕсда	ааааЕаЕддс
ЕдЕддсЕЕдс	ЕсдсЕЕссЕд	ЕаЕссдсссд
дЕддЕсассд	ЕЕЕссдЕдсс	дссаддддас
Едссдсссдд	дадаЕаЕссЕ	сдЕсдЕадсс
ддсдаасЕаЕ	ЕддссасЕЕс	дсЕЕсдсдсд

из окружающей среды

дЕЕдЕЕсдса	аЕдЕсдадса	ассЕЕсЕдсс	60
дЕсЕсдассд	ЕЕсаЕдаадс	дсадддссдс	120
аЕЕЕЕсдсдд	дсдссдссдЕ	сдссддЕссс	180
аассЕдаЕда	ЕЕсасдЕсдс	адЕддаадЕс	240
ссаасдЕсЕс	сЕЕдсассда	сддсЕасЕЕс	300
сасддсдЕса	адддсЕЕдаЕ	ЕаЕЕдасдсс	360

- 336 029538

ддсЕдссдЕд	асдЕссдсдс	ссЕсассдаа	аЕдаааЕЕЕс	ссдЕсЕддад	ссдсдссдЕс	420
адЕЕсдсаад	дсасЕдЕсаа	аЕссасдЕЕа	ддсЕсддЕда	аЕдЕЕЕсадЕ	сдЕсЕдЕдсс	480
ддсдсасЕдд	Есдсасссдд	сдасдЕсаЕс	дЕсдссдаЕд	асдасддадЕ	ддЕсдЕсдЕс	540
садсдсдсЕд	ссдсссдсда	ддЕадЕсдсс	дссдсадаас	аааддаЕЕсд	сааддаадаа	600
дссасЕсдсд	аасдссЕсдс	дсдсддЕдаа	сЕсддЕсЕсд	аЕаЕсЕасад	ссЕдсдсдса	660
ааасЕсассд	аасЕсддссЕ	сассЕасЕЕд	Еда			693

<210> 252 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (27)...(179) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (156)...(159) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ίά = РЗ00001 <400> 252

МеЕ 1

Азп

Ьуз

Рго

А1а 5

РЬе

Уа1

Агд

Рго

Уа1 10

Уа1

Уа1

Агд

Азп

Уа1 15

О1и

О1п

Рго

Зег

А1а 20

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а 25

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 30

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз 35

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 40

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 45

Зег

Суз

11е

Агд

Рго 50

11е

РЬе

А1а

О1у

А1а 55

А1а

Уа1

А1а

О1у

Рго 60

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 65

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр 70

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз 75

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 80

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр 85

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 90

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 95

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 100

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 105

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 110

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 115

Ьеи

11е

11е

Азр

А1а 120

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 125

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и 130

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 135

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 140

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 145

Уа1

Ьуз

Зег

ТЬг

Ьеи 150

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 155

Зег

Уа1

Уа1

Суз

А1а 160

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

- 337

165

170

175

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 180

О1п

Агд

А1а

А1а

А1а 185

Агд

О1и

Уа1

Уа1

А1а 190

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 195

11е

Агд

Ьуз

О1и

О1и 200

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 205

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 210

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 215

Туг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 220

Ьуз

Ьеи

ТЬг

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

ТЬг

Туг

Ьеи

225 230 <210> 253 <211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 253 абдадсддба	бсдбсдбсса	ддасббсдад	сдсдсабсдс	бсдссдасаб	сааддсдсбс	60
дссдадббсд	дсдбсдссас	дабссасдад	дсдсадддсс	дсдббддссб	дсбсдсдбсд	120
басабдсдсс	сдабббабдс	дддадсбдса	дссдссддса	абдссдбсас	сдбдбсддбд	180
ссдссдддсд	асаасбддаб	дабссасдбд	дсддбддадд	бдбдссдсда	дддсдасабс	240
сбсдбддбдд	сдссдассбс	дссааасдас	аасддсбасб	бсддсдадсб	дсбддсдбсб	300
бсасбдаада	дссдсддбдб	дсдбдддсбс	дбсабсдадд	ссддабдссд	сдасдбдаад	360
ссссбсассд	асабдааабб	сссддбдбдд	бсдсдсдссд	бдбссдсдса	адддасадбс	420
ааддададсс	бсддсдабдб	даассбсссд	сббдбсаббд	ссдддсадас	ддбдаасссс	480
ддсдасдбда	бсдбддсбда	сдасдасддс	дббдбсабсд	ббддссдсад	сдаддбдсдс	540
дссдбдасда	ссааабсдсд	сдадсдсдад	дадааддадд	ссаадаассд	сббдсадсбс	600
ассадсддсс	адсбсддсаб	сдасабсбаб	ддбабдсдсд	дсаадсбсаа	ддаааадддд	660
сбдсдсбасд	бдаадаасдс	дадсдадббд	ааддссаааб	аа		702
<210> 254 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ

- 338 029538 <222> (229)...(232) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозббе ίά = РЗ00001

<400> 254

11е Уа1 5

Уа1

О1п

Азр

РЬе

О1и Агд 10

А1а

Зег

Ьеи

А1а 15

Азр

Меб 1

Зег

О1у

11е

Ьуз

А1а

Ьеи

А1а

О1и

РЬе

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

11е

Нбз

О1и

А1а

О1п

20

25

30

О1у

Агд

Уа1

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

О1у

35

40

45

А1а

А1а

А1а

А1а

О1у

Азп

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр

50

55

60

Азп

Тгр

Меб

11е

Нбз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

11е

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Азп

Азр

Азп

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

85

90

95

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

О1у

Уа1

Агд

О1у

Беи

Уа1

11е

100

105

110

О1и

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Буз

Рго

Ьеи

ТЬг

Азр

Меб

Буз

РЬе

Рго

115

120

125

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Буз

О1и

Зег

Ьеи

130

135

140

О1у

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Беи

Уа1

11е

А1а

О1у

О1п

ТЬг

Уа1

Азп

Рго

145

150

155

160

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

11е

Уа1

О1у

Агд

165

170

175

Зег

О1и

Уа1

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

ТЬг

Ьуз

Зег

Агд

О1и

Агд

О1и

О1и

Ьуз

180

185

190

О1и

А1а

Ьуз

Азп

Агд

Ьеи

О1п

Беи

ТЬг

Зег

О1у

О1п

Беи

О1у

11е

Азр

195

200

205

11е

Туг

О1у

Меб

Агд

О1у

Ьуз

Ьеи

Буз

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Уа1

210

215

220

Ьуз

Азп

А1а

Зег

О1и

Ьеи

Ьуз

А1а

Буз

225

230

<210> <211> <212> <213>	255 681 ДНК Неизвестно
<220>
<223>	ДНК, полученная	из образца	из окружающей среды
<400>	255
абдаасдабс сдабсдбсдб	бсдасадабс	дасадассаб	саддсссббс	ддбсдабадб	60
сбдсдбсдсб ббддсдбсбс	дассдбдсас	даддсасадд	ддсдссдсдд	дсбдсбсдсд	120
бсдсасабдс ддссдаббба	сдссддбдсд	сбсдбсдсбд	дбссадсдаб	сасбдбссбд	180

- 339 029538

дЕдссдссдд	дсдасаассЕ	даЕдаЕЕсас	дЕсдсддЕдд	аддЕдЕдсса	дссдддЕдас	240
дЕЕсЕсдЕЕд	ЕЕдсЕссдас	дЕсдссдЕдс	ассдасддсЕ	аЕЕЕсддсда	дсЕдсЕддсд	300
ассЕсдсЕдс	дддсЕсдЕдд	сдЕддсддда	сЕсаЕсаЕсд	асдссддЕЕд	ссдддаЕдЕЕ	360
сдддсдсЕда	дсдадаЕдсд	аЕЕЕсссдЕс	ЕддадЕсдсд	сдаЕсадсдс	дсадддЕасс	420
дЕсааддсда	сдсЕдддЕЕс	ддЕдаасдЕд	ссссЕддЕдЕ	дсдссддддс	дсЕддЕсдад	480
дсдддадаса	ЕЕдЕсдЕсдс	сдасдаЕдас	ддсдЕсдЕда	ЕсдЕсаадаа	ддаЕсаддЕс	540
даЕдсддЕса	сЕсаддсадс	сдаасадсдс	дЕдсдсааад	аададдасас	асдддсдсдд	600
ЕЕддсдсдад	дсдадсЕсдд	ссЕддасаЕс	ЕасдссЕЕдс	дсаадаадсЕ	дЕсддассЕс	660
дддсЕдаадЕ	сдЕсдЕсдЕд	а				681

<210> 256 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 256

МеЕ 1

Азп

Азр

Рго

11е 5

Уа1

Уа1

Агд О1п

11е 10

Азр

Агд

Рго

Бег

О1у 15

Рго

Бег

Уа1

Азр

Бег

Ьеи

Агд

Агд

РНе

О1у

Уа1

Бег

ТНг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

НФз

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а

11е

ТНг

Уа1

Ьеи

Уа1

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТНг

Бег

Рго

Суз

ТНг

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

11е

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

Бег

О1и

МеЕ

Агд

РНе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

А1а

ТНг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

- 340

А1а

О1у

Азр

11е

Уа1 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

11е

Уа1 175

Буз

Буз

Азр

О1п

Уа1 180

Азр

А1а

Уа1

ТЬг

О1п 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Буз

О1и

О1и 195

Азр

ТЬг

Агд

А1а

Агд 200

Беи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Беи

О1у

Беи

Азр

11е

Туг

А1а

Беи

Агд

Буз

Буз

Беи

Бег

Азр

Беи

О1у

Беи

Буз

Бег

210 215 220

Бег Бег 225 <210> 257 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 257 абдаасдабс сбдсддсдаб бсдбасабдс дбддсдссдд дбссбсдбсд ассбсдббдс сдадсдббда дбсааддсда дссддадасд дабдссдбаа сбсдсдсдад ссббсдбсдб бсддсдбсбс ддссдабсба дсдасаассб бсдссссдас дддсбсдсдд дсдадабдсд сдсбдддббс бдабсдбддс сдсаддссдс дсдадсбддд бсдасаддбд дассдбдсас сассддбдсд дабдабссас дбсдссабдс сдбсдсаддд дбббсссдбс ддбдаабдбд сдабдабдас сдаасадсдс ссбсдасабс дассдассдб даддсссадд сбсдбсдссд дбсдсддбдд асддасдддб сбсабсабсд бддадбсдсд ссдсбдабдб ддсдбсдбдд дбдсдааадд басддсббдс садсбдсдбс ддсдссдсдд дбссбдссаб аддбдбдсса абббсддсда асдссддсбд сдабсадсдс дсдссддаас бсдбсаадсд аададдасас дсаадааасб дабсдасдаб дббдсбсдса сасддбссбд дссбддбдаб асбдсбддсд ссдсдабдбб дсадддсасс дсбддбсдад ддадсаддбс асдддсасдд дбсддассбс ддбббдаадб сдбсдбда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 258 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

- 341 029538

<400> 258

Агд

Рго

Бег

А1а 15

А1а

Меб 1

Азп

Азр

Рго

РЬе Уа1 5

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

Азр

Бег

11е

Азр

Азр

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

ТЬг

35

40

45

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

Рго

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Уа1

А1а

О1у

Ьеи

11е

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

Бег

О1и

Меб

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

А1а

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Ьеи

Меб

Суз

А1а

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

О1и

О1п

Уа1

Азр

А1а

Уа1

ТЬг

О1п

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

Азр

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Бег

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Бег

210

215

220

Бег

225 <210> 259 <211> 579 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 259

абдсддссса	бсбабдссдд бдсддсддсс дссддсадсд ссдбсассдб абссдбассб	60
ссдддсдаса	асбддабдаб ссасдбддсс дбсдаадбсб дссдсдаадд сдасдбдсбд	120
дбсдбсдссс	саассбсдсс абдсдабаас ддсбасббсд дсдадсбдсб сдссадсбсд	180

- 342 029538

сбсаадбссс	дбддсдбдсд	сдддсббдбс	абсдаддсад	дсбдбсдсда	сдбдададса	240
сбсбсддаба	бдаааббссс	ддбсбддбсд	сдддссдбсб	ссдсдсаадд	сасбдбдаад	300
дааадссбдд	дсдасдбдаа	ссбдссдсбс	дбдабсдссд	дасадсбсдб	саабссдддс	360
дабдбсдбдд	ббдссдасда	сдасддсдбс	дбсдбсдбдд	сдсддббада	адсдсдсдсс	420
дбдассдсса	адбсдсасда	асдддадсад	ааадаадсад	ссаассдсда	дсадсбдадс	480
аадддбдадс	бсддсабсда	бассбасддс	абдсдсаада	адсбсдссда	сааддддсбд	540
сдсбасдбсд	ссассдссда	адаасбсаад	дсдаадбда			579

<210> 260 <211> 192 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)...(132) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 260

Меб Агд 1

Рго

11е

Туг 5

А1а

О1у

А1а

А1а А1а А1а О1у Зег А1а Уа1

ТЬг

10

15

Уа1

Зег

Уа1

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

20

25

30

Уа1

Суз

Агд

О1и

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

35

40

45

Азр

Азп

О1у

Туг

РЬе

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

50

55

60

О1у

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

11е

О1и

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

65

70

75

80

Ьеи

Зег

Азр

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

А1а

О1п

85

90

95

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1и

Зег

Ьеи

О1у

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

11е

100

105

110

А1а

О1у

О1п

Ьеи

Уа1

Азп

Рго

О1у

Азр

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

115

120

125

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

130

135

140

Зег

НФз

О1и

Агд

О1и

О1п

Ьуз

О1и

А1а

А1а

Азп

Агд

О1и

О1п

Ьеи

Зег

145

150

155

160

Ьуз

О1у

О1и

Ьеи

О1у

11е

Азр

ТЬг

Туг

О1у

Меб

Агд

Ьуз

Ьуз

Ьеи

А1а

165

170

175

- 343

Азр Ьуз О1у Ьеи Агд Туг Уа1 А1а ТЬг А1а О1и О1и Ьеи Ьуз А1а Ьуз 180 185 190

<210> 261

<211> 678

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

<400> 261

абдаабсаас сддсддбадб ссдссасдбд дадсадссас ссдссдасдс ддббдсддсд

сбддадаадб абддбдбдас дассдбдсаб даадсбсадд дасдббдбдд ссбссббдсс

дсдбасабдс дбссдабббб сссдддадсд дссабсдссд дсбссдсбдб сассдбдбсд

ббдссбсссд дсдасаассб сабдабссаб дбсдсддбсд аддбсбдсад дссдддааас

абссбддбсд бббсасссас сбсдссббдб ассдасддаб асббсддбда асбдббддса

асббсбсбдс дадсбсасдд сдбдсааддб сббдбдаббд абдссддабд ссдсдасдбб

сдассдсбда сбдадабдаа аббсссддбс бддадссдда ссабсадсбс дсаддддасд

дбсааддсса сасбсддабс ддбсаабдбс ссдабсабдб дсдсдддсдс асбсдбсдаа

дсбддсдасд бсабсабсдс сдабдасдаб ддддбсдбдд ббдбсаадсд бдсадасдсд

сассаддбсд сбдсбдсбдс ддаасааадд дббсддааад адаабдбдас ссдбдадсда

сббдсдсдбд дададсбадд асбсдабабс басдасабдс дссадааааб сдсдсаасбд

ддссбсаааб ассбдбаа

<210> 262

<211> 225

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 262

Меб 1

Азп

О1п

Рго

А1а 5

Уа1

Уа1

Агд

НФз

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

РЬе

Рго

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

55 60

- 344 029538

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Агд

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

О1п

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Рго

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

ТЬг

11е 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

МеЕ

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

11е

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Азр

А1а 180

НФз

О1п

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225 <210> 263 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 263

аЕдааЕааас	сддЕддЕадЕ	ЕсдЕсаадЕд	дадсадссас	саасддаЕдс	ддЕЕасддса	60
сЕадаааадЕ	аЕддсдЕдас	дассдЕдсаЕ	даадсссадд	дасдЕЕдЕдд	ссЕссЕЕдсс	120
ЕссЕасаЕдс	дЕссдаЕЕЕЕ	Ессдддадсд	адсаЕсдсдд	дЕЕсЕдссдЕ	сасЕдЕдЕсЕ	180
ЕЕдссЕссЕд	дсдасаассЕ	даЕдаЕссас	дЕддсддЕсд	аддЕсЕдЕдд	ЕссдддаааЕ	240
аЕссЕсдЕсд	ЕЕЕсдссдас	ЕЕсдссЕЕдЕ	ассдаЕддсЕ	асЕЕсддЕда	аЕЕдЕЕддсс	300
асЕЕсссЕдс	дЕдсссдадд	ЕдЕссаадда	ЕЕадЕсаЕсд	аЕдссддаЕд	ссдЕдасдЕс	360
сдсЕсдсЕда	сддадаЕдаа	аЕЕсссддЕс	ЕддадЕсдЕд	ссаЕсадсЕс	дсадддсаса	420
дЕсааадсса	сссЕЕддаЕс	ддЕдаасдЕд	ссдаЕсаЕдЕ	дЕдсдддЕдс	дЕссдЕддаа	480
дсдддсдаЕд	ЕааЕЕдЕддс	сдаЕдаЕдаЕ	ддадЕЕдЕЕд	ЕсдЕдаадсд	Едсддссдса	540
саадасдЕсд	сЕдсддссдс	ддаасааадд	дЕЕсдсаадд	аааасдсдас	ссдсдаасдЕ	600

- 345 029538 сббдсасдсд дсдаасбсдд асбсдабабс басдасабдс дссадаадаб сдсдсадсбд ддссбсаааб абсбдбда

660

678 <210> 264 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 264

Меб 1

Азп Ьуз

Рго

Ча1 5

Ча1

Ча1

Агд

О1п

Ча1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

ТЬг 15

Азр

А1а

Ча1

ТЬг

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Ча1

ТЬг

ТЬг

Ча1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

РЬе

Рго

35

40

45

О1у

А1а

Зег

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Ча1

ТЬг

Ча1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Ча1

А1а

Ча1

О1и

Ча1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Ча1

Ча1

Зег

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

О1у

Ча1

О1п

О1у

Ьеи

Ча1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Ча1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Ча1

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Ча1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Ча1

Азп

Ча1

Рго

11е

Меб

Суз

А1а

О1у

А1а

Зег

Ча1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Ча1

11е

Ча1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Ча1

Ча1

Ча1

Ча1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

А1а

А1а

О1п

Азр

Ча1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Ча1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225

- 346

<210> 265
<211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 265 абдасдддбс	сбабсдбсдб	дсдбсасабс	даасддссас	сддсадсбдс	сдбддсасдд	60
сбдсаддадб	асддсдбддс	дасддбссас	даадсдсаад	дасдссдсдд	дббдсбддсс	120
дссбабабдс	дассдабсба	бдсдддсдса	дссаббдсдд	дсссбдсддб	сасддбдбсс	180
дббссдссдд	дсдасаассб	дабдабссас	дбсдсддбдд	аддбсбдсса	дссдддадас	240
дбдсбсдбсд ассбсдсбдс	бсдсбсссас аддсбсабдд	дбсассдбдс сдбсдбсдсд	асддасддсб сбсдбсабсд	асббсддсда асдссддабд	дсбдсбсдсд ссдадабдбд	300 360
сдбдссабда	сададабдсд	сббссссдбс	бддадссдсд	садбсадббс	дсадддсасс	420
дбдааадсда	сдсбддддбс	ддбдаасдбд	ссддбддсаб	дбдсдддсас	дсбсдбдааб	480
сссддсдабд	бсдбсабадс	ддабдабдас	ддсдббдбдд	бддбдаддсд	адасдаддбд	540
даададассд	бдадсбсдбс	ддаааадсдд	абссадааад	аддсдаббас	дсдададсдд	600
сбсдссадсд	дсдадсбсдд	дсбддабабс	басдддсбдс	ддаадааасб	сдссдассбс	660
ддасбдаадб	асбсабаа					678
<210> 266 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 266

Меб 1

ТЬг

О1у

Рго

11е 5

Уа1

Уа1

Агд НФз

11е О1и Агд 10

Рго

Рго

А1а 15

А1а

А1а

Уа1

А1а

Агд

Ьеи

О1п

О1и

Туг

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Агд

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Уа1

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

- 347 029538

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

О1п

А1а 105

Шз

О1у

Уа1

Уа1

А1а 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

А1а

Меб

ТЬг

О1и 125

Меб

Агд

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

Уа1

А1а

Суз

А1а 155

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

Азп 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

Уа1 165

11е

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Агд

Агд

Азр

О1и

Уа1 180

О1и

О1и

ТЬг

Уа1

Зег 185

Зег

Зег

О1и

Ьуз

Агд 190

11е

О1п

Ьуз

О1и

А1а 195

11е

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Зег

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

Ьеи

А1а

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Зег

225 <210> 267 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 267

абдаабасас	сдббддбадб	ссдасаадбс	дадсадссас	садсддасдс	ддббдсддса	60
ббддаааадб	дсддадбсас	аассдбдсаб	даддсбсадд	дасдбддбдд	ссбсбббдсс	120
бссбасабдс	дсссдаббба	сссдддадса	ассабсдсад	дабссдссаб	сасадбдбсб	180
дбдссбссдд	дсдасаассб	бабдабссаб	дбддсбдбдд	аадбсбдсдд	бдсдддааас	240
абссбддбдд	бббсассаас	сбссссббдб	асддабддаб	асббсддбда	дсбдббддса	300
асабсбсббс	дсдсссасдд	бдбдаддддд	сббдбдабсд	абдссддабд	бсдбдабдбд	360
сдсбсбсбда	сддабабдаа	абббссддбб	бддадбсдса	ссдбсадббс	дсаадддаса	420
дбсааддсса	сасбсддабс	ддбдаабдба	сссабсдббб	дбдсдддсдс	дабддббдад	480
дссддбдабд	бдабсдбсдс	сдасдасдаб	ддадббдбдд	бддбдаадсд	сдсдсбддсд	540
ссададдбсд	ссдсддсддс	дсаасааадд	дббсдсааад	адаабббддс	ссдсдаасда	600
сббддасдсд	дадаасбсдд	асбсдасабб	бабдасабдс	дсдаааадаб	сдсдааасбд	660
ддссббаадб	абббдбаа					678

- 348 029538 <210> 268 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 268

Меб 1	Азп	ТЬг	Рго	Ьеи 5	Уа1	Уа1	Агд
А1а	Уа1	А1а	А1а 20	Ьеи	О1и	Буз	Суз
О1п	О1у	Агд 35	О1у	О1у	Ьеи	РЬе	А1а 40
О1у	А1а 50	ТЬг	11е	А1а	О1у	Бег 55	А1а
Азр 65	Азп	Ьеи	Меб	11е	НФз 70	Уа1	А1а
11е	Ьеи	Уа1	Уа1	Бег 85	Рго	ТЬг	Бег
О1и	Ьеи	Ьеи	А1а 100	ТЬг	Бег	Ьеи	Агд
11е	Азр	А1а 115	О1у	Суз	Агд	Азр	Уа1 120
Рго	Уа1 130	Тгр	Бег	Агд	ТЬг	Уа1 135	Бег
Ьеи 145	О1у	Бег	Уа1	Азп	Уа1 150	Рго	11е
А1а	О1у	Азр	Уа1	11е 165	Уа1	А1а	Азр
Агд	А1а	Ьеи	А1а 180	Рго	О1и	Уа1	А1а
Ьуз	О1и	Азп 195	Ьеи	А1а	Агд	О1и	Агд 200
Азр	11е 210	Туг	Азр	Меб	Агд	О1и 215	Ьуз

О1п	Уа1 10	О1и	О1п	Рго	Рго	А1а 15	Азр
О1у 25	Уа1	ТЬг	ТЬг	Уа1	НФз 30	О1и	А1а
Бег	Туг	Меб	Агд	Рго 45	11е	Туг	Рго
11е	ТЬг	Уа1	Бег 60	Уа1	Рго	Рго	О1у
Уа1	О1и	Уа1 75	Суз	О1у	А1а	О1у	Азп 80
Рго	Суз 90	ТЬг	Азр	О1у	Туг	РЬе 95	О1у
А1а 105	НФз	О1у	Уа1	Агд	О1у 110	Ьеи	Уа1
Агд	Бег	Беи	ТЬг	Азр 125	Меб	Ьуз	РЬе
Бег	О1п	О1у	ТЬг 140	Уа1	Ьуз	А1а	ТЬг
Уа1	Суз	А1а 155	О1у	А1а	Меб	Уа1	О1и 160
Азр	Азр 170	О1у	Уа1	Уа1	Уа1	Уа1 175	Буз
А1а 185	А1а	А1а	О1п	О1п	Агд 190	Уа1	Агд
Ьеи	О1у	Агд	О1у	О1и 205	Беи	О1у	Ьеи
11е	А1а	Буз	Ьеи	О1у	Беи	Буз	Туг

Ьеи

225 <210> 269

220

- 349

<211> 678
<212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 269 абдаасасас	сддбсдбадб	ссддсаадбд	дадсаассаб	саабддабдб	даббдсадсс	60
сбддадааас	абддбдбдас	дассдбасаб	даддсссадд	дасдббдбдд	ссбдсбддсд	120
бдббасабдс	дбссдабббб	ссссддадсд	адсабсдсбд	дббссдсддб	сасбдбббсб	180
ббдссссссд	дсдабаабсб	бабдабссас	дббдсддбсд	аддбсбдсад	бссадддаас	240
абссббдбад	ббдссссдас	сбсдссббдс	асддабддсб	абббсддада	аббдббддса	300
асббсссбдс	дсдсбсдсдд	бдбдаааддб	сбсдбдаббд	абдссддабд	ссдбдабдбб	360
сдсбсбббда	сддааабдаа	дббсссддбс	бддадссдад	сдабсадсбс	дсадддаасд	420
дбсааабсба дссддсдаба	сасбсддсбс бсабсдссдс	сдбдаасдбд сдабдасдас	ссбабссбдб ддсдббдбсд	дсдсдддсдс ббдбсаадсд	асбсдбсдад сдсаабддсд	480 540
саддаддбсд	ссасддсддс	адаасааадд	дбдсдсааад	адаабдбдас	ссдададсдб	600
сббдсдсддд	дадабсбсдд	дсбсдабабс	басдасабдс	ддсадааасб	сдсссаасбд	660
ддссбсаааб	абсбдбда					678
<210> 270 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 270

Меб 1

Азп

ТЬг

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Бег

Меб 15

Азр

Уа1

11е

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Нбз

О1у 25

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Нбз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Суз

Туг

Меб

Агд

Рго 45

11е

РЬе

Рго

О1у

А1а 50

Бег

11е

А1а

О1у

Бег 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

Нбз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Бег

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

90 95

- 350 029538

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е 135

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Ьеи

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

11е

11е 165

А1а

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Меб

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

А1а

ТЬг 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Азр 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п 215

Ьуз

Ьеи

А1а

О1п

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 271 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 271 абдаассаад ссдбддбддб ссддаабабс дадсдсссдс ссдсддабдб адббдсбдсд ббддадааас ббддбдбббс сасддбдсас даддсдсадд дасдббдсдд бсбдббсдсб асдбабабда ддссдаббба бдсдддбдсд дсдаббдссд ддссддсддб бассдбабсд ббдссдссдд дбдасааббб дабдаббсас дбддссдбдд аадбдбдссд сдсдддддас аббббддбдд бсдсдссдас ббсдссббдс асддасдддб абббсддсда аббдсбддсд асббсдббдс дсдсасабдд сдбсаадддс сбддбдабсд абдсддддбд ссдсдасдбс сдадсдсбсд сддадабдаа абббсссдбд бддадссдсд садбаадббс дсадддаасд дбдаадбсда сссббддббс ддбааасдбс ддааббдбдб дсдсаддадс асдсдбддаа дссддадасд бдабсдббдс сдасдабдас ддсдбадбдд дддбдаадбд сддсдсадсд саддаадбдд ббдссдсддс дсадсбдсдс дббсдсаадд аададдссас дсдсдаасдс ббддддсдбд дсдадсбсдд ссбддабабс сасдддсбдс дддссааддб сдсддадсбб ддссбдаааб абббдбда <210> 272

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678

- 351 029538 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 272

Уа1

Уа1

Агд

Азп

11е О1и Агд 10

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп

О1п

А1а Уа1 5

Уа1

Уа1

А1а

А1а

Беи

О1и

Буз

Ьеи

О1у

Уа1

Бег

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

А1а

О1у

Азр

65

70

75

80

11е

Беи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Беи

А1а

ТЬг

Бег

Беи

Агд

А1а

Н1з

О1у

Уа1

Буз

О1у

Беи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

А1а

Беи

А1а

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

130

135

140

Беи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

О1у

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Агд

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

О1у

Уа1

Буз

165

170

175

Суз

О1у

А1а

А1а

О1п

О1и

Уа1

Уа1

А1а

А1а

А1а

О1п

Беи

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Буз

О1и

О1и

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Беи

О1у

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Беи

195

200

205

Азр

11е

Нгз

О1у

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

Уа1

А1а

О1и

Ьеи

О1у

Беи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 273 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно

- 352 <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 273 абдаасаадс ссдбддббдб дсддаасабс дадсдбссдс сддсддабдс бдбддссдсд сббдадаааб асддсдбдбс дасддбдсас даддсссадд дссддаасдд ссбасбддсс бссбабабдс дсссдабсба бдсаддадсс дсдабсдсбд дассадссдб сасадбббсс сбсссдссдд дадасаассб дабдаббсас дбсдссдбсд аддбсбдбсд ассбддддаб дбссбсдббд ббдсдссдас абсдссабдс ассдасддсб аббббддсда дббдсббдса асббсдсбсд сддсдсабдд ддбдаааддс ббдабсаббд аддсдддабд бсдсдасдбс сдадсбсбда сддааабдаа дбббссадбс бддадссдсд ссдбсадсбс дсааддаасд дбдааддсаа сасббдддбс ддбааабдба асдаббдббб дбдсдддбдс бдсддббдсд сссддбдабд бдабсдбддс ддасдабдаб ддсдбсдббд бсдбдааасд дасададдсд саададдбсд ббассдсабс бдадсадада ббдсдааадд аададддаас ссдсаадсдд сббдсббсдд дддаасбсдд ссбддабабб басддссбдс дадсдаадаб бдсадассбс ддбсбсаадб асббдбад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 274 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά = РЗ00001 <400> 274

Меб 1

Азп Буз

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

Азп

11е 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Беи

О1и

Буз

Туг

О1у

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Азп

О1у

Беи

Беи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Беи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Беи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

- 353 029538

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Бег

Ьеи

А1а

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

11е

11е

О1и

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

ТЬг

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

А1а

Уа1

А1а 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

ТЬг

О1и

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

Уа1

ТЬг 185

А1а

Бег

О1и

О1п

Агд 190

Ьеи

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

О1у

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд 200

Ьеи

А1а

Бег

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

11е

А1а

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

Ьеи

225 <210> 275 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 275

абдссбабсд	ббдббасдаа	дабсдассда	сссадсдсдд	сддасдбсда	ааддабсдсс	60
дссбабддбд	бсдсдассбб	дсабдаадсд	сааддасдаа	ссдддббдаб	ддсдбссааб	120
абдсдсссаа	бсбабсдссс	бдсдсасабб	дссдддсссд	сддбдассбд	ссббдбддсд	180
ссбддсдаса	аббддабдаб	ссабдбсдсс	дбсдаасадб	дссадссддд	адабдбссбд	240
дбсдбддбас	сдассадссс	сбдсдаадас	ддсбабббсд	дсдабсбдсб	ддсдассбсд	300
сбдсддбсдс	дсддддбсаа	аддбсбдабс	абсдаддссд	дсдбасдсда	бабсдсдаса	360
ббдассдада	бдаааббссс	ддбсбддбсс	ааддсддбдб	бсдсдсаадд	аасддбсаад	420
дадассабсд	ссадсдбсаа	бдбдссссбс	дбсбдсдсдд	дсдсссдсаб	сдбдссдддс	480
дабсбдабсд	ббдссдасда	сдасддддбс	дбсдбдаббс	саадасдббс	сдббссддсд	540
дбссбббсса	дсдссдаддс	ссдсдаадад	ааддаадссс	дсаассдсдс	ссдсббсдаа	600
дсбддсдадс	бдддссбсда	сдбсбасаас	абдсдссадс	дссбддссда	саадддсббд	660
сдсбабдбсд	адсддсбдсс	сдаддаабад				690

- 354 029538 <210> 276 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 276

Меб 1

Рго

11е Уа1

Уа1 5

ТНг

Ьуз

11е Азр

Агд 10

Рго

Бег

А1а

А1а

Азр 15

Уа1

О1и

Агд

11е

А1а

А1а

Туг

О1у

Уа1

А1а

ТНг

Ьеи

НФз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

ТНг

О1у

Ьеи

Меб

А1а

Бег

Азп

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Агд

Рго

А1а

35

40

45

НФз

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Уа1

ТНг

Суз

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

О1п

Суз

О1п

Рго

О1у

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Уа1

Уа1

Рго

ТНг

Бег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РНе

О1у

Азр

Беи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТНг

Бег

Ьеи

Агд

Бег

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

11е

11е

О1и

100

105

110

А1а

О1у

Уа1

Агд

Азр

11е

А1а

ТНг

Ьеи

ТНг

О1и

Меб

Ьуз

РНе

Рго

Уа1

115

120

125

Тгр

Бег

Ьуз

А1а

Уа1

РНе

А1а

О1п

О1у

ТНг

Уа1

Ьуз

О1и

ТНг

11е

А1а

130

135

140

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Агд

11е

Уа1

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Ьеи

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

11е

Рго

Агд

Агд

165

170

175

Бег

Уа1

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

Бег

Бег

А1а

О1и

А1а

Агд

О1и

О1и

Ьуз

О1и

180

185

190

А1а

Агд

Азп

Агд

А1а

Агд

РНе

О1и

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Уа1

195

200

205

Туг

Азп

Меб

Агд

О1п

Агд

Ьеи

А1а

Азр

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Туг

Уа1

О1и

210

215

220

Агд

Ьеи

Рго

О1и

О1и

<210> 277 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно

225

- 355 <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 277

аЕдааЕасас	сддЕддЕадЕ	ссдасаадЕд	дадсадссас	садсддаЕдс	ддЕЕдссдса
ЕЕддадаадЕ	дЕддадЕдас	сассдЕдсаЕ	даддсдсадд	дасдсЕдсдд	ссЕссЕЕдсд
ЕссЕасаЕдс	дсссааЕЕЕа	сссдддадса	дссаЕсдссд	дЕЕссдсЕаЕ	сасЕдЕдЕсЕ
ЕЕдссЕссЕд	дсдасаассЕ	саЕдаЕссаЕ	дЕЕдсддЕдд	аддЕсЕдсад	ЕссдддаааЕ
аЕссЕддЕад	ЕЕЕсассддс	сЕсдссЕЕдЕ	ассдаЕддсЕ	асЕЕсддЕда	дсЕдЕЕддсд
асдЕсЕсЕсс	дЕдсссасдд	сдЕдададдд	сЕЕдЕдаЕсд	аддсдддаЕд	ссдЕдасдЕд
сдсЕсЕсЕаа	садаааЕдаа	аЕЕсссддЕс	Еддадссдсд	ссаЕсадЕЕс	дсаддддаса
дЕсааддсЕа	сасЕЕддаЕс	ддЕааасдЕд	сссаЕсдЕдЕ	дсдсдддсдс	асдддЕсдад
дсЕддЕдаЕд	ЕсаЕсдЕсдс	сдаЕдасдаЕ	ддадЕддЕдд	ЕЕдЕдаадсд	ддсдсЕЕдсд
саададдЕсд	ссдсддсддс	ддаасааадд	дЕЕсдсааад	адааЕдсдас	ссдсдаасда
сЕЕдсдсдсд	дадаасЕсдд	асЕсдаЕаЕЕ	ЕасдассЕдс	дссаааадаЕ	сдсЕсаасЕд
ддссЕЕаааЕ	аЕсЕдЕда
<210> 278 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 278

МеЕ 1

Азп

ТНг

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Суз

О1у 25

Уа1

ТНг

ТНг

Уа1

Нтз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Бег

Туг

МеЕ

Агд

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

А1а 50

А1а

11е

А1а

О1у

Бег 55

А1а

11е

ТНг

Уа1

Бег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

МеЕ

11е

Нтз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Бег

Рго

О1у

Азп 80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег 85

Рго

А1а

Бег

Рго

Суз 90

ТНг

Азр

О1у

Туг

РНе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТНг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

Нтз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

- 356 029538

11е

О1и

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е 135

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Агд

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

Азр

Ьеи

Агд

О1п 215

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 279 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 279 аЕдааЕааас	сддЕддЕадЕ	дсддсаадЕс	дадсадссас	ссдссдаЕдс	ддЕЕдсддсс	60
сЕддадаадЕ	аЕддсдЕдас	сассдЕдсас	даадсЕсаад	сдсдЕЕдЕдд	ссЕдсЕддсЕ	120
сссЕаЕаЕдс	дсссдаЕЕЕЕ	Едсдддадса	ЕдсаЕсдссд	дЕЕссдссдЕ	дассдЕдЕсЕ	180
ЕЕдссдссЕд	дсдаЕааЕсЕ	саЕдаЕссас	дЕЕдссдЕсд	аддЕсЕдсас	Ессдддсадс	240
аЕЕсЕддЕад	ЕЕдсссссас	сЕсдссЕЕдс	асддасддЕЕ	аЕЕЕсдддда	асЕссЕддса	300
асЕЕсссЕдс	ЕсдсЕсасдд	ЕдЕсааадда	ЕЕддЕсаЕсд	аЕдсЕддсЕд	ЕсдддаЕдЕЕ	360
сдсЕсдЕЕаа	сддаааЕдаа	аЕЕссссдЕс	ЕддадссдЕд	сЕдЕсадЕЕс	Есааддаасд	420
дЕдааддсса	сдсЕсддаЕс	ддЕдааЕдЕд	ссддЕсаЕЕЕ	дсдсдддсдс	ддаддЕддад	480
дсЕддсдаЕа	ЕсаЕсаЕсдс	сдаЕдаЕдаЕ	ддЕдЕддЕдд	ЕддЕдаадсд	сасдсЕддсд	540
сасдаддЕдд	садсддсддс	ддаасЕасдд	дЕЕсдсаадд	адааЕдссас	ссдсдаасда	600
сЕсдсасдад	дддаЕсЕсдд	ссЕсдаЕаЕс	ЕасдасаЕдс	ддсааааааЕ	сдсдсаасЕЕ	660
ддЕсЕсаааЕ	аЕсЕдЕда					678
<210> 280 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 357 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 280

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

МеЕ 1

Азп Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1 А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

А1а Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

РЬе

А1а

35

40

45

О1у

А1а Суз

11е

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

ТЬг

Рго

О1у

Зег

65

70

75

80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьеи

А1а

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

11е

Суз

А1а

О1у

А1а

О1и

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у Азр

11е

11е

11е

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

ТЬг Ьеи

А1а

НФз

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

Ьеи

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и Азп

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Азр

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 281 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

- 358 029538 <400> 281

абдаасаадс	ссдбддбсдб	ссддсасдбд	дассаассдб	садссдасдб	бдбддсбдсд	60
сбддадаадб	асддадбсбс	дассдбдсас	даадсдсаад	дссдббдсдд	бсбасбддсс	120
бсдбасабдс	асссдаббба	бсссддсдаб	бссабсдсбд	ддссбдсддб	сасддбббсд	180
сббссдссад	дбдасааббб	дабдабссаб	дббдсддбсд	аддбсбдссс	ддсдддаадс	240
дббсбддбсд	бддсбсссас	сбсассдбдс	асадасддбб	абббсддсда	аббдсбддса	300
асббсбсбдс	дсдсбсасса	бдбдасдддд	ббддббабсд	абдссддббд	ссдсдасдбб	360
сдсбсасбса	сддааабдаа	дбббссддбд	бддадбсдсд	ссдбсадббс	асаддддасс	420
дбааадбсда	сдсббддсбс	сдбдаасдбд	ссадбадбдб	дсдссддддс	ссабдбсдаа	480
дсдддсдаба	бсабсдбсдс	сдабдасдаб	ддадбддбад	ббдбааадсд	аббддасдса	540
сссдаддбад	бсдсбдсдбд	сдаасааадд	дббсдсаадд	аасаддбдас	дсдсдаасдд	600
сбддсдсдсд	дсдаасбддд	бсбддабабб	басддссбдс	даадсааааб	сдссдаасбб	660
ддссбсаадб	асдадбад					678

<210> 282 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 282

Агд

НФз

Уа1 10

Азр

О1п

Рго

Зег

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп

Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

А1а

А1а 20

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у 25

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

НФз 30

О1и

А1а

О1п

О1у

Агд 35

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а 40

Зег

Туг

Меб

НФз

Рго 45

11е

Туг

Рго

О1у

Азр 50

Зег

11е

А1а

О1у

Рго 55

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 60

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Азр 65

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз 70

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1 75

Суз

Рго

А1а

О1у

Зег 80

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а 85

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз 90

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе 95

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

НФз

Уа1

ТЬг

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

- 359

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Бег

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

НФз

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

11е

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

Ьеи

Азр

А1а

Рго

О1и

Уа1

Уа1

А1а

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1п

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи

Агд

Бег

Ьуз

11е

А1а

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210 215 220

О1и

225 <210> 283 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно

<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 283 абдаабасас	сддбддбадб	ссддсаадбд	дадсадссас	садсддасдс	ддбддссдса	60
ббддадаасб	дбддсдбдас	сассдбдсаб	даддсбсадд	дасдбадбдд	ссбдсббдсс	120
бссбасабдс	дсссдаббба	ссадддадса	дссабсдсад	дббссдсбсб	сассдбдбсб	180
ббдссбссдд	дсдасаассб	сабдабдсаб	дббдсддбад	адббсбдсдд	сссдддаааб	240
абссбддбсд	ббдсассдас	сбсдсссбдб	асддабддсб	асббсддбда	дсбдббддса	300
асабсбсбсс	дбдсссасдд	бдддададдд	сббдбдабсд	абдссддабд	ссдбдассбд	360
сдсбсбсбаа	садааабдаа	аббсссбдбс	бддадссдсд	ссабсадббс	дсаадддасд	420
дбсааддсса	сасббддабс	сдбдаабдбд	сссабсдбаб	дсдсдддсдс	аббддбсдад	480
дссддадабд	бсабсдбсдс	сдабдасдаб	ддадббдбдд	ббдбдаадсд	сдсссбсдсд	540
саададдбса	дддсддсддс	ддадсааадд	дббсдсааад	аааабдсдас	ссдсдааада	600
сбсдсасдбд	дадаасбсдд	асбсдасабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсадсбд	660
ддссббаааб	абсбдбда					678
<210> 284 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

- 360 029538 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 284

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп ТЬг

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1 А1а

А1а

Ьеи

О1и

Азп

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

Бег

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

О1п

35

40

45

О1у

А1а А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

Меб

Меб

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

РЬе

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

НФз

О1у

О1у

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а Ьеи

А1а

О1п

О1и

Уа1

Агд

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и Азп

А1а

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 285 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

- 361 029538 <400> 285

абдаабасас	сддбддбадб	аадасаадбд	дадсадссас	садсддабдс	ааббдссдса	60
ббдаадаадб	дбддсдбдас	аассдбссас	даддсбсадд	дасдбддбдд	ссббсббдсд	120
бссбасабдс	дсссдаббба	сссдддадса	дссабсдсад	дабссдсбаб	сасбдбдбсб	180
ббдссбссбд	дсдасаассб	сабдабссас	дббдсддбдд	аддбсбдсдд	бссдддааас	240
абссбддбад	бббсассдас	сбсдссббдб	асддабддсб	асббсддбда	дббдббддса	300
асабсбсбсс	дбдсссаддд	сдбдаббддд	сббдбдабсд	абдссддабд	ссдбдасдбд	360
сдсбсбсбаа	садааабдаа	аббсссддбс	бддадссдсд	ссабсбдббс	дсаадддаса	420
дбсааддсса	сасббддабс	ддбдаабдбд	сссабсдбаб	дсдсдддбдс	аббддбсдад	480
дсбддбдабд	бсабсдбсдс	сдасдасдаб	ддсдббдбдд	ббдбааадсд	адсдсбддсд	540
саададдбсд	ссдсбдсддс	ддаасаааад	дббсдсааад	адаабдбаас	ссдсдаасда	600
сбсдсасдбд	дададсбсдд	асббдабабб	басдасабдс	дссаааадаб	сдсдсаасбд	660
ддссбсаааб	абсбдбда					678

<210> 286 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 286

Уа1

Уа1

Агд О1п Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп

ТЬг

Рго

Уа1 5

А1а

11е

А1а

А1а

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Суз

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

11е

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

Бег

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1п

О1у

Уа1

11е

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

- 362

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

11е 135

Суз

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Ьуз 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТЬг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п 215

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 287 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 287
абдаасааас	сдббддбдаб	ссддсаадбд	дадсддссдс	сддсбдасдс	бдбддсддсд	60
сбсдаааааб	абддсдбдбс	сассдбдсаб	даадсссадд	дасдббдсдд	асбдсбсдсб	120
бссбасабдс	дассдаббба	бсссддбдсб	дссдббдссд	дббсддсддб	сассдбабсс	180
сббссдсссд	дсдабаабсб	дабдаббсас	дббдсбдбсд	аддбсбдсса	дбссддсдаб	240
аббсбсдбдд	ббдсбссдас	сбсдссббдс	бсддасддаб	асббсддбда	дббдсбддсд	300
асдбссббдс	дсдсдсасдд	сдбдаадддс	сбсдбсаббд	асдсддддбд	ссдбдасдбб	360
сдсбсасбба	ссдааабдад	дббссссдбс	бддадссдса	дсдбсадсбс	дсааддбасс	420
дбдаадбсба	сбсбсддабс	бдбдаабдбд	адсаббдббб	дбдссддсдс	дсасабсдаа	480
дсбддбдабд	бдабсдбсдс	ддабдасдас	ддбдбсдбдд	бддбдаадсд	сдсабссдсс	540
сасдаадбад	бсдсддсдбд	сдаасадсдд	дббсдсаадд	аададдбсас	бсдддадсдд	600
ббддсдсдсд	дддадсббдд	дсббдасабс	басдддббдс	дсасаааааб	сдсддааабд	660
ддбсбсаадб	абсаабда					678

<210> 288 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды

- 363 029538 <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ίά = РЗ00001

<400> 288

МеЕ 1

Азп

Ьуз

Рго

Ьеи Уа1 5

11е

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

Н1з

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

Уа1

А1а О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

МеЕ

11е Н1з

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1п

Зег

О1у

Азр

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

Зег

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг Зег

Ьеи

Агд

А1а

Н1з

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Агд

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Зег

Агд Зег

Уа1

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Зег

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Зег

Уа1

Азп Уа1

Зег

11е

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а

Н1з

11е

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

Зег

А1а

Н1з О1и

Уа1

Уа1

А1а

А1а

Суз

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

О1и

Уа1

ТЬг Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

О1у

Ьеи Агд

ТЬг

Ьуз

11е

А1а

О1и

МеЕ

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

О1п

225 <210> 289 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды

- 364 029538 <400> 289

абдаасаадс	ссдбддббдб	дсддаасабс	дадсдбссдс	сддсддабдс	бдбддссдсд	60
сббдадаааб	асддсдбдбс	дасддбдсас	даддсссадд	дссддаасдд	ссбасбддсс	120
бссбабабдс	дсссдабсба	бдсаддадсс	дсдабсдсбд	дассадссдб	сасадбббсс	180
сбсссдссдд	дадасаассб	дабдаббсас	дбсдссдбсд	аддбсбдбсд	дссбддддаб	240
дбссбсдббд	ббдсдссдас	абсдссабдс	ассдасддсб	аббббддада	дббдсббдса	300
асббсдсбсд	сддсдсабдд	ддбдаааддс	ббадбсаббд	аддсдддабд	бсдсдасдбс	360
сдадсбсбда	бддааабдаа	дбббссадбс	бддадссдсд	ссдбсаасбс	дсааддаасд	420
дбдааддсаа	сасббдддбс	ддбааабдба	асдаббдббб	дбдсдддбдс	бдсддббдсд	480
сссддбдабд	бдабсдбддс	ддасдабдаб	ддсдбсдббд	бсдбдааасд	дасададдсд	540
саададдбсд	ббассдсабс	бдадсадада	ббдсдааадд	аададддаас	ссдсаадсдд	600
сббдсббсдд	дддаасбсдд	ссбддабабб	басддссбдс	дадсдаадаб	бдсадассбс	660
ддбсбсаадб	асббдбад					678

<210> 290 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>

<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά = РЗ00001

<400> 290

Ча1

Агд

Азп

11е 10

О1и

Агд

Рго

Рго

А1а 15

Азр

Меб 1

Азп Ьуз

Рго

Ча1 5

Ча1

А1а

Ча1 А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Ча1

Зег

ТЬг

Ча1

Нчз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

Азп

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

А1а

35

40

45

О1у

А1а А1а

11е

А1а

О1у

Рго

А1а

Ча1

ТЬг

Ча1

Зег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

Меб

11е

Нчз

Ча1

А1а

Ча1

О1и

Ча1

Суз

Агд

Рго

О1у

Азр

65

70

75

80

Ча1

Ьеи Ча1

Ча1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

- 365 029538

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

О1и

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

А1а

Беи

Меб

О1и 125

Меб

Ьуз

РЬе

Рго

Уа1 130

Тгр

Зег

Агд

А1а

Уа1 135

Азп

Зег

О1п

О1у

ТЬг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 145

О1у

Зег

Уа1

Азп

Уа1 150

ТЬг

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

А1а

Уа1

А1а 160

Рго

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

ТЬг

О1и

А1а 180

О1п

О1и

Уа1

Уа1

ТЬг 185

А1а

Зег

О1и

О1п

Агд 190

Беи

Агд

Ьуз

О1и

О1и 195

О1у

ТЬг

Агд

Буз

Агд 200

Ьеи

А1а

Зег

О1у

О1и 205

Беи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

О1у

Ьеи

Агд

А1а 215

Ьуз

11е

А1а

Азр

Беи 220

О1у

Беи

Буз

Туг

Ьеи

225

<210> 291
<211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 291 абдаабааас	сддбддбадб	ссддсаадбд	дадсадссас	ссдсддасдс	ддббдсддсд
сбддадаадб	абддсдббас	сассдбдсаб	даддсбсадд	дасдббдбдд	ссбдсбсдсд
сасбасабдс	дбссдабббб	бссдддадсд	дссабсбсдд	дббсбдсбдб	сассдбадсб
ббдссдссдд	дсдабаассб	сабдабссас	дбсдсддбсд	аддбсбдсдд	сссдддааас
абссбддббд	бддсассдас	сбсдссббсд	асддабддсб	асббсддбда	дсбдббддсд
ассбсбббдс	дбдсбсасдд	бдбдаааддд	сббдбдаббд	абдссддабд	ссдбдасдбб
сдсбсссбда	ссдадабдаа	аббссссдбс	бддадссдбд	ссабсадсбс	дсадддааса
дбсааддсса	сссбсддабс	ддбдаабдбд	ссддбсабдб	дсдсдддсдс	дсбсдбсдаа
дсбддддабд	бсабсдбсдс	сдабдабдаб	ддадббдбдд	ббдбдаадсд	сдсдаабдсд
сасдаддбдд	ссдсддсддс	адаасааадд	дбдсдсаадд	адаабабаас	ссдсдаасдд
сббсдасдсд	дададсбсдд	асбсдабабб	басдасабдс	дссааааааб	сдсдсаасбд

ддссбсаааб ассбдбда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678

- 366 029538 <210> 292 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 292

Меб Азп Ьуз 1

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

Нбз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Нбз

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

РЬе

Рго

35

40

45

О1у

А1а

А1а

11е

Бег

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

Нбз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Бег

Рго

Бег

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Нбз

О1у

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр

А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Бег

Ьеи

ТЬг

О1и

Меб

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1

Тгр

Бег

Агд

А1а

11е

Бег

Бег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Меб

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а

Азп

А1а

Нбз

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и

Азп

11е

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Агд

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е

Туг

Азр

Меб

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 293 <211> 678

- 367 029538 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 293 абдаабсдас сддбддбадб ссддсаадбб даасадссас садсддабдс ддббдссдса 60 сбддадаадб абддсдбдас аассдбссаб даддсбсадд дасссддбдд ссбссбадсс 120 бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дбсабсдссд дббссдсддб сасбдбдбсб 180 ббассбссбд дсдасаассб сабдабссас дбддссдбдд аддбсбдбдд бссдддааас 240 аббсбддббд ббдсассдаб сбсдссдбдб асддабддсб асббсддада дсбдббддса 300 ассбсбсбсс дсдсссасдд бдбдсдаддд сббдбдабсд абдссддабд ссдддасдбд 360 сдсбсбсбса садааабдаа абббссддбс бддадссдсд ссдбсадббс асаддддаса 420 дбсааддсса сссбдддабс ддбдаабдбд ссдаббдбдб дсдсдддсдс дсдддбсддд 480 дсбддддабд бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд бддбдаадсд сдсдсбддсс 540 даададдбсд ссдссдсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдбдас ссдддаасда 600 сббдсдсдбд дададсбддд асбсдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсасаасбд 660 ддссббаааб абсбсбда 678 <210> 294 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 294

Меб 1

Азп Агд

Рго

Уа1 5

Уа1

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у

Рго

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Бег

Туг

Меб

Агд

Рго

11е

Туг

Рго

35

40

45

О1у

А1а

Уа1

11е

А1а

О1у

Бег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Меб

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

Рго

11е

Бег

Рго

Суз

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

90 95

- 368 029538

О1и

Ьеи

Ьеи

А1а 100

ТНг

Бег

Ьеи

Агд

А1а 105

НФз

О1у

Уа1

Агд

О1у 110

Ьеи

Уа1

11е

Азр

А1а 115

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1 120

Агд

Бег

Ьеи

ТНг

О1и 125

МеЕ

Ьуз

РНе

Рго

Уа1 130

Тгр

Бег

Агд

А1а

Уа1 135

Бег

Бег

О1п

О1у

ТНг 140

Уа1

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи 145

О1у

Бег

Уа1

Азп

Уа1 150

Рго

11е

Уа1

Суз

А1а 155

О1у

А1а

Агд

Уа1

О1у 160

А1а

О1у

Азр

Уа1

11е 165

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр 170

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1 175

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

А1а 180

О1и

О1и

Уа1

А1а

А1а 185

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд 190

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

Азп 195

Уа1

ТНг

Агд

О1и

Агд 200

Ьеи

А1а

Агд

О1у

О1и 205

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

11е 210

Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п 215

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи 220

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

225 <210> 295 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 295 аЕдааЕааас сддЕддЕадЕ ссддсаадЕд дадсадссдс садсддасдс ддЕЕдсддсд сЕддадаадЕ аЕддсдЕсас сассдЕдсаЕ даддсЕсадд дасдЕЕдЕдд ссЕдсЕсддд сасЕасаЕдс дЕссдаЕЕЕЕ Ессдддадсд дссаЕсЕсдд дЕЕсЕдсадЕ сассдЕадсЕ ЕЕдссдссдд дсдаЕаассЕ саЕдаЕссас дЕсдсддЕсд аддЕсЕдсдд сссдддааас аЕссЕддЕдд ЕЕдсассдас сЕсдссЕЕсд асддаЕддсЕ асЕЕсддЕда дсЕдЕЕддсд ассЕсЕсЕдс дЕдсЕсдсда ЕдЕдаааддд сЕЕдЕдаЕЕд аЕдссддаЕд ссдЕдасдЕЕ сдсЕсссЕда ссдадаЕдаа аЕЕссссдЕс ЕддадссдЕд ссаЕсадсЕс дсадддаасд дЕсааддсса сссЕсддаЕс ддЕдааЕдЕд ссддЕсасдЕ дсдсдддсдс дсЕсдЕсдаа дссддддаЕд ЕсаЕсдЕсдс сдаЕдаЕдаЕ ддадЕЕдЕдд ЕЕдЕдаадсд сдсдсаЕдсд сасдаддЕдд сддсддсддс адаасааадд дЕдсдсааад адааЕаЕаас ссдсдаасдд сЕЕсдасдсд дададсЕсдд асЕсдаЕаЕЕ ЕасдасаЕдс дссаааадаЕ сдсдсаасЕд ддссЕсаааЕ ассЕдЕда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

678 <210> 296 <211> 225

- 369 029538 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 296

Уа1

Агд

О1п

Уа1 10

О1и

О1п

Рго

Рго

А1а 15

Азр

МеЕ 1

Азп Ьуз

Рго

Уа1 5

Уа1

А1а

Уа1 А1а

А1а

Ьеи

О1и

Ьуз

Туг

О1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Уа1

НФз

О1и

А1а

20

25

30

О1п

О1у Агд

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

О1у

НФз

Туг

МеЕ

Агд

Рго

11е

РЬе

Рго

35

40

45

О1у

А1а А1а

11е

Зег

О1у

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

Рго

Рго

О1у

50

55

60

Азр

Азп Ьеи

МеЕ

11е

НФз

Уа1

А1а

Уа1

О1и

Уа1

Суз

О1у

Рго

О1у

Азп

65

70

75

80

11е

Ьеи Уа1

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Зег

ТЬг

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

85

90

95

О1и

Ьеи Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Агд

Азр

Уа1

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

100

105

110

11е

Азр А1а

О1у

Суз

Агд

Азр

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

МеЕ

Ьуз

РЬе

115

120

125

Рго

Уа1 Тгр

Зег

Агд

А1а

11е

Зег

Зег

О1п

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

130

135

140

Ьеи

О1у Зег

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1

ТЬг

Суз

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

О1у Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Уа1

Уа1

Уа1

Ьуз

165

170

175

Агд

А1а НФз

А1а

НФз

О1и

Уа1

А1а

А1а

А1а

А1а

О1и

О1п

Агд

Уа1

Агд

180

185

190

Ьуз

О1и Азп

11е

ТЬг

Агд

О1и

Агд

Ьеи

Агд

Агд

О1у

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

195

200

205

Азр

11е Туг

Азр

МеЕ

Агд

О1п

Ьуз

11е

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Ьеи

Ьуз

Туг

210

215

220

Ьеи

225 <210> 297 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно

- 370

<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 297 абдддбдбсд	бсдбссаааа	сабсдадсдд	дсбдсдсаад	ддассабсда	ссдссбсдсс
дссбдсдддд	бддсбассдб	ссабдаадсд	саддддсдса	аддддсбдсб	ддсдадссас
абдсддссдд	бсбасадддд	сдсасддсбс	дссдсдадсд	сддбдасдаб	ббсддсдссд
сссддсдаса	асбддабдаб	ссабдбсдсс	абсдадсадс	бссаадссдд	сдасабсабд
дбдсбддсдс	сдассадссс	дбдсдаддас	ддабабббсд	дсдассбссб	ддсдассбсд
дсдсаддсдс	дсдддбдсаа	ддддсбддбд	абсдабдссд	дсдбдсдсда	сдббдссдас
сббасддсаа	бдсадббссс	ддбдбддбсд	ааддсдабсб	бсдсдсаддд	сасдсбдааа
дадасдсбдд	дббсддбдаа	сдбдссддбд	дбсбдсдссд	дсдсдсбддб	саасссдддс
дасдбсабсд	бсдссдабда	сдасддддбс	бдсдбддбас	дссдсдадда	ддбсдаддса
дбддсддааа	аддсддаадс	ссдсдбсдсб	дссдаддадд	асаадсдсаа	дсдссбсдсс
дддддадаас	бддддсбсда	сабсбасаад	абдсдсдадс	дсббддссда	даадддссбс

ааабабдбсб да

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

672 <210> 298 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

<400> 298

Агд А1а А1а 10

О1п

О1у

ТЬг 15

11е

Меб 1

О1у

Уа1

Уа1

Уа1 5

О1п

Азп

11е

О1и

Азр

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Суз

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Шз

О1и

А1а

О1п

О1у

20

25

30

Агд

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Шз

Меб

Агд

Рго

Уа1

Туг

Агд

О1у

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

11е

Зег

А1а

Рго

Рго

О1у

Азр

Азп

50

55

60

Тгр

Меб

11е

Шз

Уа1

А1а

11е

О1и

О1п

Ьеи

О1п

А1а

О1у

Азр

11е

Меб

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

Зег

Рго

Суз

О1и

Азр

О1у

Туг

РЬе

О1у

Азр

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

ТЬг

Зег

А1а

О1п

А1а

Агд

О1у

Суз

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

11е

Азр

100

105

110

- 371

А1а

О1у

Уа1 115

Агд

Азр

Уа1

А1а

Азр 120

Беи

ТЬг

А1а

Меб

О1п 125

РЬе

Рго

Уа1

Тгр

Зег 130

Буз

А1а

11е

РЬе

А1а 135

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Буз 140

О1и

ТЬг

Ьеи

О1у

Зег 145

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Уа1 150

Уа1

Суз

А1а

О1у

А1а 155

Беи

Уа1

Азп

Рго

О1у 160

Азр

Уа1

11е

Уа1

А1а 165

Азр

Азр

Азр

О1у

Уа1 170

Суз

Уа1

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

О1и

Уа1

О1и

А1а 180

Уа1

А1а

О1и

Буз

А1а 185

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а 190

А1а

О1и

О1и

Азр

Буз 195

Агд

Буз

Агд

Ьеи

А1а 200

О1у

О1у

О1и

Ьеи

О1у 205

Беи

Азр

11е

Туг

Ьуз

Меб

Агд

О1и

Агд

Ьеи

А1а

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

Буз

Туг

Уа1

210 215 220 <210> 299 <211> 501 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 299

абдддббссб	бддсаасбдс	сдаадсббдб	дасасдаабд	садсасассб	дасаадсддб	60
дасабссддд	бссбдссасс	асбсббсаад	абббасдддс	ааадбсдддс	аббсбсбддд	120
ссаабсдбда	сбдбдааддб	абббдаадас	аабдбдсбдд	басдддаасб	бсббдааасс	180
аааддсдасд	дбададббсб	ддбдабадас	ддсддаддда	дсабдаддбд	бдссббддбс	240
ддаддааасс	бддддсадбб	адсдсадаас	абддддбддд	сддддаббдб	бдбааасддд	300
бдсабаадад	асдбадабда	дабсаасддд	бдсдабдббд	дддббададс	аббддсабсс	360
сабссасада	адбсдаабаа	аааддддсаб	ддддадааас	асабдссдаб	баабабсдсд	420
ддсасдабда	бссдадасдд	ададбддббд	бабдсадаса	дбдабддсаб	бсбсабсбсс	480
адаасбдадс	бсбсбабсба	д				501

<210> 300 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (2)...(159) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза

- 372 029538 <400> 300

Меб 1

О1у Зег

Ьеи

А1а 5

ТЬг

А1а О1и А1а Суз 10

Азр

ТЬг Азп А1а

А1а 15

НФз

Ьеи

ТЬг

Зег

О1у

Азр

11е

Агд

Уа1

Ьеи

Рго

Рго

Ьеи

РЬе

Ьуз

11е

Туг

20

25

30

О1у

О1п

Зег

Агд

А1а

РЬе

Зег

О1у

Рго

11е

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьуз

Уа1

РЬе

35

40

45

О1и

Азр

Азп

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

О1и

Ьеи

Ьеи

О1и

ТЬг

Ьуз

О1у

Азр

О1у

50

55

60

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

11е

Азр

О1у

О1у

О1у

Зег

Меб

Агд

Суз

А1а

Ьеи

Уа1

65

70

75

80

О1у

О1у

Азп

Ьеи

О1у

О1п

Ьеи

А1а

О1п

Азп

Меб

О1у

Тгр

А1а

О1у

11е

85

90

95

Уа1

Уа1

Азп

О1у

Суз

11е

Агд

Азр

Уа1

Азр

О1и

11е

Азп

О1у

Суз

Азр

100

105

110

Уа1

О1у

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

А1а

Зег

НФз

Рго

О1п

Ьуз

Зег

Азп

Ьуз

Ьуз

115

120

125

О1у

НФз

О1у

О1и

Ьуз

НФз

Меб

Рго

11е

Азп

11е

А1а

О1у

ТЬг

Меб

11е

130

135

140

Агд

Азр

О1у

О1и

Тгр

Ьеи

Туг

А1а

Азр

Зег

Азр

О1у

11е

Ьеи

11е

Зег

145

150

155

160

Агд

ТЬг

О1и

Ьеи

Зег

11е

165 <210> 301 <211> 501 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 301

абдддббссб	бддсаасбдс	сдаадсббдб	дасасдаабд	садсасассб	дасаадсддб	60
дасабссддд	бссбдссасс	асбсббсаад	абббасдддс	ааадбсдддс	аббсбсбддд	120
ссаабсдбда	сбдбдааддб	абббдаадас	аабдбдсбдд	басдддаасб	бсббдааасс	180
аааддсдасд	дбададббсб	ддбдабадас	ддсддаддда	дсабдаддбд	бдссббддбс	240
ддаддааасс	бддддсадбб	адсбсадаас	абддддбддд	садддаббдб	бдбааасддд	300
бдсабаадад	асабадабда	дабсаасддд	бдсдабдббд	дддббададс	аббддсабсс	360
сабссасада	адбсдаабаа	аааддддсаб	ддддадааас	асабдссдаб	баабабсдсд	420
ддсасдабда	бссдадасдд	ададбддббд	бабдсадаса	дбдабддсаб	бсбсабсбсс	480
адаасбдадс	бсбсбабсба	д				501

- 373 029538 <210> 302 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (2)...(159) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 302

Меб 1

О1у Бег

Ьеи

А1а 5

ТЬг

А1а О1и А1а Суз 10

Азр

ТЬг Азп А1а

А1а 15

Н1з

Ьеи

ТЬг

Бег

О1у

Азр

11е

Агд

Уа1

Ьеи

Рго

Рго

Беи

РЬе

Буз

11е

Туг

20

25

30

О1у

О1п

Бег

Агд

А1а

РЬе

Бег

О1у

Рго

11е

Уа1

ТЬг

Уа1

Буз

Уа1

РЬе

35

40

45

О1и

Азр

Азп

Уа1

Беи

Уа1

Агд

О1и

Ьеи

Беи

О1и

ТЬг

Ьуз

О1у

Азр

О1у

50

55

60

Агд

Уа1

Беи

Уа1

11е

Азр

О1у

О1у

О1у

Бег

Меб

Агд

Суз

А1а

Ьеи

Уа1

65

70

75

80

О1у

О1у

Азп

Ьеи

О1у

О1п

Беи

А1а

О1п

Азп

Меб

О1у

Тгр

А1а

О1у

11е

85

90

95

Уа1

Уа1

Азп

О1у

Суз

11е

Агд

Азр

11е

Азр

О1и

11е

Азп

О1у

Суз

Азр

100

105

110

Уа1

О1у

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

А1а

Бег

Н1з

Рго

О1п

Ьуз

Бег

Азп

Буз

Буз

115

120

125

О1у

Н1з

О1у

О1и

Ьуз

Н1з

Меб

Рго

11е

Азп

11е

А1а

О1у

ТЬг

Меб

11е

130

135

140

Агд

Азр

О1у

О1и

Тгр

Беи

Туг

А1а

Азр

Бег

Азр

О1у

11е

Ьеи

11е

Бег

145

150

155

160

Агд

ТЬг

О1и

Беи

Бег

11е

165 <210> 303 <211> 501 <212> ДНК <213> Неизвестно

<220>
<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 303
абддссббад	баассасбдс	сдаадбббдб	дабдсдаасс	сасадсбсаб	бдбдадсддс	60
дадсббсдсд	сасбссабсс	ааббббссаа	абббасддба	ддсддсаадб	сббсбссддд	120
сссдббдбба	сдсбдааддб	дбббдаадаб	аабдбдббдд	бдсдсдаабб	бсббдаддад	180
аддддсаабд	дсадддббсб	бдббдбсдаб	ддбддбддса	дсббдадабд	сдсаабасбс	240

- 374 029538

ддбддсаасс	ссдббдбаса адсбсадаас аасдддбддд сбддсаббдб ддббаасддд	300
бдбабааддд	абдббдабда аабсаасддд бдсдасаббд дадбсададс бсбддссдсд	360
сасссддбда	аадссаабаа даааддсабс ддбдадаадс абдббссддб даасаббддб	420
ддаасссдба	бабдбдабдд ададбддсбс бабдсадаба ссдабддбаб бббддбдбсб	480
аааассдадб	бдбсбдбсба а	501

<210> 304 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (2)...(159) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 304

Меб 1

А1а

Ьеи Ча1

ТЬг ТЬг 5

А1а

О1и Ча1

Суз 10

Азр А1а Азп Рго

О1п 15

Ьеи

11е

Ча1

Зег

О1у

О1и

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

Нчз

Рго

11е

РЬе

О1п

11е

Туг

20

25

30

О1у

Агд

Агд

О1п

Ча1

РЬе

Зег

О1у

Рго

Ча1

Ча1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Ча1

РЬе

35

40

45

О1и

Азр

Азп

Ча1

Ьеи

Ча1

Агд

О1и

РЬе

Ьеи

О1и

О1и

Агд

О1у

Азп

О1у

50

55

60

Агд

Ча1

Ьеи

Ча1

Ча1

Азр

О1у

О1у

О1у

Зег

Ьеи

Агд

Суз

А1а

11е

Ьеи

65

70

75

80

О1у

О1у

Азп

Рго

Ча1

Ча1

О1п

А1а

О1п

Азп

Азп

О1у

Тгр

А1а

О1у

11е

85

90

95

Ча1

Ча1

Азп

О1у

Суз

11е

Агд

Азр

Ча1

Азр

О1и

11е

Азп

О1у

Суз

Азр

100

105

110

11е

О1у

Ча1

Агд

А1а

Ьеи

А1а

А1а

Нчз

Рго

Ча1

Ьуз

А1а

Азп

Ьуз

Ьуз

115

120

125

О1у

11е

О1у

О1и

Ьуз

Нчз

Ча1

Рго

Ча1

Азп

11е

О1у

О1у

ТЬг

Агд

11е

130

135

140

Суз

Азр

О1у

О1и

Тгр

Ьеи

Туг

А1а

Азр

ТЬг

Азр

О1у

11е

Ьеи

Ча1

Зег

145

150

155

160

Ьуз

ТЬг

О1и

Ьеи

Зег

Ча1

<210> 305 <211> 639 <212> ДНК

- 375 165 <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 305 ббддабсааа бссасааабс сддсаббабс сссдбсдбсд ааабсдасбс ддбадаасдс дссдбсссдс бддсбдаддс аббдсббдса ддадддсбда сддбсдбдда дабсасссбс сдсассдддд сддсдсбсда дбсдаббсда дсааббдсбс адсаддбасс ададдбсадб дбсддддсад даасадбсаб бассбдддаа саддсдсадд сддсасдбда бдсаддсдсд садббссбсд бсбсассддд дабддбддад саддббдбса бсбдддсдса ддадсассад сббссдабса бассбддсдс адсаасбссс ассдадабда бссдсддсаб саассбдддд сбсаассбсс бдаааббсбб бсссдссдаа асдабдддбд дддбаадсдс бдббааддсд ббабсбдасс сдбббссдса дббдаааббс аббсссасдд дсддсабсад дббддааааб дсадсббсдб абсбсдсдса бссбаааабс сабдсбдбдд дсддсбсдбд дабадсдааа сдададабда бсдсддабдд садабббдаб дадабссддс дбабддсаса ддаадссада дассбддбаа адсадабсад даддаааасд абсссабда <210> 306 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)...(195) <223> альдолаза КБРО и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (32)...(41) <223> Активный центр альдолаз КБРО и КНО. РгозФбе ίά. = РБ00159 <400> 306

120

180

240

300

360

420

480

540

600

639

Меб 1

Азр

О1п

11е

НФз 5

Буз

Бег

О1у

11е

11е 10

Рго

Уа1

Уа1

О1и

11е 15

Азр

Бег

Уа1

О1и

Агд 20

А1а

Уа1

Рго

Беи

А1а 25

О1и

А1а

Беи

Беи

А1а 30

О1у

О1у

Беи

ТЬг

Уа1 35

Уа1

О1и

11е

ТЬг

Беи 40

Агд

ТЬг

О1у

А1а

А1а 45

Беи

О1и

Бег

11е

Агд 50

А1а

11е

А1а

О1п

О1п 55

Уа1

Рго

О1и

Уа1

Бег 60

Уа1

О1у

А1а

О1у

ТЬг 65

Уа1

11е

ТЬг

Тгр

О1и 70

О1п

А1а

О1п

А1а

А1а 75

Агд

Азр

А1а

О1у

А1а 80

О1п

РЬе

Беи

Уа1

Бег

Рго

О1у

Меб

Уа1

О1и

О1п

Уа1

Уа1

11е

Тгр

А1а

90 95

- 376 029538

О1п

О1и

Н1з

О1п 100

Ьеи

Рго

11е

11е

Рго 105

О1у

А1а

А1а

ТЬг

Рго 110

ТЬг

О1и

Меб

11е

Агд 115

О1у

11е

Азп

Ьеи

О1у 120

Ьеи

Азп

Ьеи

Ьеи

Ьуз 125

РЬе

РЬе

Рго

А1а

О1и 130

ТЬг

Меб

О1у

О1у

Уа1 135

Зег

А1а

Уа1

Ьуз

А1а 140

Ьеи

Зег

Азр

Рго

РЬе 145

Рго

О1п

Ьеи

Ьуз

РЬе 150

11е

Рго

ТЬг

О1у

О1у 155

11е

Агд

Ьеи

О1и

Азп 160

А1а

А1а

Зег

Туг

Ьеи 165

А1а

Н1з

Рго

Ьуз

11е 170

Н1з

А1а

Уа1

О1у

О1у 175

Зег

Тгр

11е

А1а

Ьуз 180

Агд

О1и

Меб

11е

А1а 185

Азр

О1у

Агд

РЬе

Азр 190

О1и

11е

Агд

Агд

Меб 195

А1а

О1п

О1и

А1а

Агд 200

Азр

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1п 205

11е

Агд

Агд

Ьуз ТЬг 11е Рго 210 <210> 307 <211> 639 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 307

ббдасбббда	аасааддсдб	дббдссбббд	баббббааба	аддасдадда	ддбдадбабс	60
дсбдббббаа	аадсбббаба	бдаадсддда	аббсдбасад	ббдаабабас	даабсдбддб	120
даадссдсаб	бдааааасбб	баадбсдббд	сдсааддбаб	дбдабассда	аббдаабдда	180
абдбассбсд	дбаббдддас	даббаааааб	ддссадсадд	сасаадсббб	бдбддабдса	240
ддбдсадабб	абббааббад	бссдддбдба	дбддабдабд	садсаааадб	бдссдабсаа	300
аабддбббдб	бабабдбдсс	бддбдсаабд	ассссаасад	аааббабсад	ддсададсаа	360
саабббддаб	саасдсбддб	дааасббббб	ссдддбааба	ббббаддссс	бддсбббдбб	420
адбдсбабба	аадааббдбб	садсддаббд	ааабббабба	ббассддадд	адббдаассд	480
даадааааба	абббдааадд	абддббсаас	дсаддбдссд	садсбдбддд	сабдддаадб	540
аааббаабба	ссааасаддб	бббддааааб	ааадасбабд	саааааббас	ададббаасб	600
ааддаабсбб	баадасбдаб	баааббддбс	ададддбаа			639

<210> <211> <212> <213>	308 212 БЕЛОК Неизвестно
<220>

- 377 029538 <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (2)...(199) <223> альдолаза КВРО и КНО <400> 308

Меб 1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

О1п 5

О1у Уа1

Ьеи

Рго

Ьеи 10

Туг

РЬе

Азп

Ьуз

Азр 15

О1и

О1и

Уа1

Бег

11е

А1а

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьеи

Туг

О1и

А1а

О1у

11е

Агд

20

25

30

ТЬг

Уа1

О1и

Туг

ТЬг

Азп

Агд

О1у

О1и

А1а

А1а

Ьеи

Ьуз

Азп

РЬе

Ьуз

35

40

45

Бег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

Суз

Азр

ТЬг

О1и

Ьеи

Азп

О1у

Меб

Туг

Ьеи

О1у

50

55

60

11е

О1у

ТЬг

11е

Ьуз

Азп

О1у

О1п

О1п

А1а

О1п

А1а

РЬе

Уа1

Азр

А1а

65

70

75

80

О1у

А1а

Азр

Туг

Ьеи

11е

Бег

Рго

О1у

Уа1

Уа1

Азр

Азр

А1а

А1а

Ьуз

85

90

95

Уа1

А1а

Азр

О1п

Азп

О1у

Ьеи

Ьеи

Туг

Уа1

Рго

О1у

А1а

Меб

ТЬг

Рго

100

105

110

ТЬг

О1и

11е

11е

Агд

А1а

О1и

О1п

О1п

РЬе

О1у

Бег

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьуз

115

120

125

Ьеи

РЬе

Рго

О1у

Азп

11е

Ьеи

О1у

Рго

О1у

РЬе

Уа1

Бег

А1а

11е

Ьуз

130

135

140

О1и

Ьеи

РЬе

Бег

О1у

Ьеи

Ьуз

РЬе

11е

11е

ТЬг

О1у

О1у

Уа1

О1и

Рго

145

150

155

160

О1и

О1и

Азп

Азп

Ьеи

Ьуз

О1у

Тгр

РЬе

Азп

А1а

О1у

А1а

А1а

А1а

Уа1

165

170

175

О1у

Меб

О1у

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

ТЬг

Ьуз

О1п

Уа1

Ьеи

О1и

Азп

Ьуз

Азр

180

185

190

Туг

А1а

Ьуз

11е

ТЬг

О1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

О1и

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

11е

Ьуз

195

200

205

Ьеи Уа1 Агд О1у 210

<210> <211> <212> <213>	309 687 ДНК Неизвестно
<220> <223>	ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 309 абдадбаббд сбдсааабас аддбдбадас аааааааабд адабссбаса аббаасаббд
саасааддбд бдббдссббб дбаббббааб ааадабдаад аадбдадбаб бдсбдббббд

120

- 378 029538

ааадсдббаб	абдаддсадд	саббсдсаса	дббдадбаба	ссаабсдбдд	адаадссдса	180
ббаааааабб	ббааадбасб	дадааааабб	бдбдабасдд	ааббдадбдд	аббабассбд	240
ддбабсддса	ссаббааааа	бддадаасад	дсаааадсбб	ббдббдабдс	сддбдсадаб	300
бабббаабба	дбссдддбдб	ддбадабдаб	дсадсааааа	ббдсбдабса	ааабддаббд	360
ббабабдбдс	сбддбдссаб	дасдссаасб	даааббабса	дддсадааса	абббддбдса	420
асасбддбаа	аасбббббсс	сддбаабабб	ббаддсссбд	дбббсдббад	бдссдббаад	480
дааббаббса	дсддбббдаа	абббабсабс	асбддбддад	бадаассбда	адаааабааб	540
ббдаааддаб	ддбббаабдс	аддбдсбдсд	дссдбаддаа	бдддаадбаа	аббдабсаса	600
ааасааасбб	бддаааабаа	адасбасдса	ааааббасад	адсбсасдаа	ададбсббба	660
адаббдаббд	аасбддбдсд	дааабаа				687

<210> 310 <211> 228 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (16)...(215) <223> альдолаза КВРО и КНО <400> 310

Меб 1

Бег

11е

А1а

А1а 5

Азп

ТЬг

О1у Уа1

Азр 10

Буз

Буз

Азп

О1и

11е 15

Ьеи

О1п

Беи

ТЬг

Ьеи

О1п

О1п

О1у

Уа1

Беи

Рго

Беи

Туг

РЬе

Азп

Ьуз

Азр

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

Бег

11е

А1а

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьеи

Туг

О1и

А1а

О1у

11е

35

40

45

Агд

ТЬг

Уа1

О1и

Туг

ТЬг

Азп

Агд

О1у

О1и

А1а

А1а

Ьеи

Ьуз

Азп

РЬе

50

55

60

Ьуз

Уа1

Ьеи

Агд

Буз

11е

Суз

Азр

ТЬг

О1и

Ьеи

Бег

О1у

Беи

Туг

Беи

65

70

75

80

О1у

11е

О1у

ТЬг

11е

Буз

Азп

О1у

О1и

О1п

А1а

Буз

А1а

РЬе

Уа1

Азр

85

90

95

А1а

О1у

А1а

Азр

Туг

Ьеи

11е

Бег

Рго

О1у

Уа1

Уа1

Азр

Азр

А1а

А1а

100

105

110

Буз

11е

А1а

Азр

О1п

Азп

О1у

Беи

Ьеи

Туг

Уа1

Рго

О1у

А1а

Меб

ТЬг

115

120

125

Рго

ТЬг

О1и

11е

11е

Агд

А1а

О1и

О1п

РЬе

О1у

А1а

ТЬг

Беи

Уа1

Буз

130

135

140

- 379

Ьеи 145

РЬе

Рго

О1у

Азп

11е 150

Ьеи

О1у

Рго

О1у

РЬе 155

Уа1

Бег

А1а

Уа1

Ьуз 160

О1и

Ьеи

РЬе

Бег

О1у 165

Ьеи

Ьуз

РЬе

11е

11е 170

ТЬг

О1у

О1у

Уа1

О1и 175

Рго

О1и

О1и

Азп

Азп 180

Ьеи

Ьуз

О1у

Тгр

РЬе 185

Азп

А1а

О1у

А1а

А1а 190

А1а

Уа1

О1у

Меб

О1у 195

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

ТЬг 200

Ьуз

О1п

ТЬг

Ьеи

О1и 205

Азп

Ьуз

Азр

Туг

А1а

Ьуз

11е

ТЬг

О1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

О1и

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

11е

О1и

210 215 220

Ьеи Уа1 Агд Ьуз 225

<210> 311 <211> 600 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 311 абдабаббсд	ссдабдссаб	адссдаабдс	ддссбсабсд	ссабссбдсд	сддсаббдса	60
асддсбдааа	ббдаадссдб	дддасаадсс	сбсабсдаад	ссддсаббсд	сдбсдсбдаа	120
аббссдсбда	асбсдссдда	бссабббдсс	бссабсдада	ааабддссаа	ддссббсаад	180
ддсдадсбдд	ббдбсддддс	бддаассдбб	сбсадбдбдс	аддабдбсаа	бббасбдааа	240
дсссабддсд	дссадабсад	сдбббсбссс	даббдсаасд	аддсддбддб	сдсасдсасс	300
ааадаасбдд	дбсбддадсс	сдббсссддс	дбсббсасдс	ссасбдаддс	ббббдссдсд	360
абссдсдссд	дддсаассса	бабсаадббд	бббссддсдд	аадссдсаад	ссссдсаасс	420
абсадддссб	ддсдсдсбдб	бсббссааад	сабдбдаааа	бсбабссддб	дддсддсабс	480
асдссадсаа	абабдсаддд	сбдддббдаб	дссддсдссд	саддсбббдд	ааббддсбса	540
аабабсбаба	адсадддддс	сасадссдсс	аасдбддсаа	аддсддссаа	ддааббсббб	600

<210> 312 <211> 200 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (4)...(198) <223> альдолаза КЬРО и КНО <400> 312

Меб 11е РЬе А1а Азр А1а 11е А1а О1и Суз О1у Ьеи 11е А1а 11е Ьеи

- 380 029538

1

5

10

15

Агд

О1у

11е

А1а

ТЬг

А1а

О1и

11е

О1и

А1а

Уа1

О1у

О1п

А1а

Ьеи

11е

20

25

30

О1и

А1а

О1у

11е

Агд

Уа1

А1а

О1и

11е

Рго

Ьеи

Азп

Бег

Рго

Азр

Рго

35

40

45

РЬе

А1а

Бег

11е

О1и

Ьуз

Меб

А1а

Ьуз

А1а

РЬе

Ьуз

О1у

О1и

Ьеи

Уа1

50

55

60

Уа1

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

Ьеи

Бег

Уа1

О1п

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Ьуз

65

70

75

80

А1а

НФз

О1у

О1у

О1п

11е

Бег

Уа1

Бег

Рго

Азр

Суз

Азп

О1и

А1а

Уа1

85

90

95

Уа1

А1а

Агд

ТЬг

Ьуз

О1и

Ьеи

О1у

Ьеи

О1и

Рго

Уа1

Рго

О1у

Уа1

РЬе

100

105

110

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

А1а

РЬе

А1а

А1а

11е

Агд

А1а

О1у

А1а

ТЬг

НФз

11е

115

120

125

Ьуз

Ьеи

РЬе

Рго

А1а

О1и

А1а

А1а

Бег

Рго

А1а

ТЬг

11е

Агд

А1а

Тгр

130

135

140

Агд

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Ьуз

НФз

Уа1

Ьуз

11е

Туг

Рго

Уа1

О1у

О1у

11е

145

150

155

160

ТЬг

Рго

А1а

Азп

Меб

О1п

О1у

Тгр

Уа1

Азр

А1а

О1у

А1а

А1а

О1у

РЬе

165

170

175

О1у

11е

О1у

Бег

Азп

11е

Туг

Ьуз

О1п

О1у

А1а

ТЬг

А1а

А1а

Азп

Уа1

180

185

190

А1а

Ьуз

А1а

А1а

Ьуз

О1и

РЬе

РЬе

195

200

<210> 313 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 313 абдадссадс	ссдабадааа	ссбдааддад	ассдбдаббд	сдббаасбаа	ддаабдсддд	60
дббсбдсссб	дсабсаадбб	дсдсаааааа	дабдабббба	ббдссбабдс	ссаддсдабд	120
бабдасддад	дадсбсдсдб	сабсдаадбд	ассабдасаа	сбссаддсдс	ссбддаадсд	180
абсдаадсса	бббсдбсбдс	сбббааадас	ааасбсбабд	ббдсббсддд	сассасаббд	240
дасдсдбсса	сбдсдсдсда	ддбсабсасб	сасддсддаа	дсбдсаббдб	баабссббдб	300
дбсабссссд	аадбдабсда	бдбсдссаас	сдсбабддса	ббссадббба	ббссддадса	360
ббсасбдсда	ссдаддбдбб	сасддсдабд	сдсдссддад	сдбссабддб	саааабаббб	420
сссдддддбс	бдддсддсдс	саадбасабд	ассаабсбда	ааабддбабб	сссадаадбд	480

- 381 029538

аассЕдаЕЕс	сЕЕсаддддд	ааЕЕаассЕЕ	даЕааЕдсЕс	ссдааЕЕЕаЕ	Есдсдссддс	540
дссЕдсдсЕд	ЕсадЕддЕдс	асдаасЕЕЕс	аЕддаЕсасд	аааЕдаЕЕдс	саадсаЕддЕ	600
ЕЕдаааЕдда	ЕЕасЕсааса	дасдЕсаааа	ЕЕсаЕЕдаад	ЕддЕЕсЕдда	адсдаадсдд	660
аасдсЕссад	адЕЕдссЕЕд	а				681

<210> 314 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (12)...(207) <223> альдолаза КВРО и КНО <400> 314

МеЕ 1

Бег

О1п

Рго

Азр Агд Азп Ьеи 5

Ьуз

О1и 10

ТНг Уа1

11е

А1а

Ьеи 15

ТНг

Ьуз

О1и

Суз

О1у

Уа1

Ьеи

Рго

Суз

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьуз

Азр

Азр

20

25

30

РНе

11е

А1а

Туг

А1а

О1п

А1а

МеЕ

Туг

Азр

О1у

О1у

А1а

Агд

Уа1

11е

35

40

45

О1и

Уа1

ТНг

МеЕ

ТНг

ТНг

Рго

О1у

А1а

Ьеи

О1и

А1а

11е

О1и

А1а

11е

50

55

60

Бег

Бег

А1а

РНе

Ьуз

Азр

Ьуз

Ьеи

Туг

Уа1

А1а

Бег

О1у

ТНг

ТНг

Ьеи

65

70

75

80

Азр

А1а

Бег

ТНг

А1а

Агд

О1и

Уа1

11е

ТНг

Нтз

О1у

О1у

Бег

Суз

11е

85

90

95

Уа1

Азп

Рго

Суз

Уа1

11е

Рго

О1и

Уа1

11е

Азр

Уа1

А1а

Азп

Агд

Туг

100

105

110

О1у

11е

Рго

Уа1

Туг

Бег

О1у

А1а

РНе

ТНг

А1а

ТНг

О1и

Уа1

РНе

ТНг

115

120

125

А1а

МеЕ

Агд

А1а

О1у

А1а

Бег

МеЕ

Уа1

Ьуз

11е

РНе

Рго

О1у

О1у

Ьеи

130

135

140

О1у

О1у

А1а

Ьуз

Туг

МеЕ

ТНг

Азп

Ьеи

Ьуз

МеЕ

Уа1

РНе

Рго

О1и

Уа1

145

150

155

160

Азп

Ьеи

11е

Рго

Бег

О1у

О1у

11е

Азп

Ьеи

Азр

Азп

А1а

Рго

О1и

РНе

165

170

175

11е

Агд

А1а

О1у

А1а

Суз

А1а

Уа1

Бег

О1у

А1а

Агд

ТНг

РНе

МеЕ

Азр

180

185

190

Нтз

О1и

МеЕ

11е

А1а

Ьуз

Нтз

О1у

Ьеи

Ьуз

Тгр

11е

ТНг

О1п

О1п

ТНг

195

200

205

- 382

Бег Ьуз РНе 11е О1и Уа1 Уа1 Беи О1и А1а Ьуз Агд Азп А1а Рго О1и 210 215 220

Ьеи Рго

225 <210> 315 <211> 576 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 315 абддсасааб ббасаадааб адаадббдса асадсаабда аадааасбдд дабдаббссб 60 ббдбббббба асаасдаббб адааббаадб аааааадбаб баааадсббд ббасдабддб 120 ддадсасдсб баабддаабб басбдсбсдб ддадаббббд сасасдаадб ббббддбдаа 180 ббаасааааб абдсааббдс адааббасса ддаабдабба бдддбдбадд ббсбдбаасс 240 дабдсадсбд садсабсббб абасабддсб ббаддадсаа асбббаббдб аасбссадба 300 ббаададаад абабадсааб бдбббдбаас адасдбааад ббббабддбс бссбддббдб 360 ддаасбббаа сбдаааббас бааддссдаа дааббаддаб дбдаааббдб ааааббаббс 420 ссбддбдаба бббабддасс бсаабббдба аааддаабба ааддассаса ассббддасб 480 адбдбаабдс саасбддадд адбббсбсса асаааадааа абббаасадд ббддбббааб 540 дсаддбдбаа сббдбдббдд аабдддабсб саабба 576 <210> 316 <211> 192 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (9)...(192) <223> альдолаза КВРС и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (176)...(179) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФбе ίά. = РБ00001 <400> 316

Меб 1

А1а

О1п

РНе

ТНг 5

Агд

11е

О1и

Уа1

А1а 10

ТНг

А1а

Меб

Буз

О1и 15

ТНг

О1у

Меб

11е

Рго 20

Беи

РНе

РНе

Азп

Азп 25

Азр

Беи

О1и

Ьеи

Бег 30

Буз

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

Суз

Туг

Азр

О1у

О1у

А1а

Агд

Ьеи

Меб

О1и

РНе

ТНг

- 383 029538

40 45

А1а Агд О1у Азр

РЬе А1а

НФз 55

О1и Уа1

РЬе

О1у

О1и 60

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Туг

50

А1а

11е

А1а

О1и

Ьеи

Рго

О1у

Меб

11е

Меб

О1у

Уа1

О1у

Зег

Уа1

ТЬг

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

А1а

А1а

Зег

Ьеи

Туг

Меб

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Азп

РЬе

11е

85

90

95

Уа1

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Агд

О1и

Азр

11е

А1а

11е

Уа1

Суз

Азп

Агд

Агд

100

105

110

Ьуз

Уа1

Ьеи

Тгр

Зег

Рго

О1у

Суз

О1у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

О1и

11е

ТЬг

Ьуз

115

120

125

А1а

О1и

О1и

Ьеи

О1у

Суз

О1и

11е

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

Рго

О1у

Азр

11е

130

135

140

Туг

О1у

Рго

О1п

РЬе

Уа1

Ьуз

О1у

11е

Ьуз

О1у

Рго

С1п

Рго

Тгр

ТЬг

145

150

155

160

Зег

Уа1

Меб

Рго

ТЬг

О1у

О1у

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Ьуз

О1и

Азп

Ьеи

ТЬг

165

170

175

О1у

Тгр

РЬе

Азп

А1а

О1у

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

О1у

Меб

О1у

Зег

О1п

Ьеи

180

185

190

<210> 317 <211> 612 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 317
абдадсдддс	дададабсаб	бдсдабссбд	сддддсдбдс	дсссдаабда	ддбддбддсс	60
аббдддсасд	ббсбдсбдда	бдсаддбабс	дасаадабсд	аадббссдсб	дааббссссс	120
дабдссбббд	ааадсаббдс	дсббббддсд	дабдсдбббс	асдабадбдс	ддбдабаддб	180
дсбддсассд	ббсбдасдсс	асаадасдбд	дбдааддбдс	абсаасаддд	бддсдсдабд	240
дбддбабсдс	сбдаббдсаа	бссддабдбд	абсааддсаа	ссааддсдсб	дддсабдббд	300
бсббассссд	дбдббббсас	сссдассдаа	дсббббассд	сссбдсдббс	бддбдсддаб	360
дддабсааас	бдбббссбдс	ббсаддсабб	ддсссбдсад	ддсбддссдс	дабдббддсс	420
дббббдссса	саддсабдсд	садсбабдсд	дбддддддсд	бсдддссада	бадсббсдсд	480
ссббддабсд	дадббддсдб	дассддаббб	ддсаббддаа	сдддссбдбб	сааассдддд	540
бббддсасдд	сбдабдбддс	бааасдддса	дсддасаббд	бддсддссба	бдабсддддб	600
аббббдаааб	да					612

<210> 318

- 384 029538 <211> 203 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)...(192) <223> альдолаза КВРЬ и ΚΗΟ

<400> 318

11е

А1а

11е

Ьеи Агд О1у Уа1 10

Агд

Рго 15

Азп

Меб 1

Зег

О1у

Агд

О1и 5

11е

О1и

Уа1

Уа1

А1а

11е

О1у

Шз

Уа1

Ьеи

Ьеи

Азр

А1а

О1у

11е

Азр

Ьуз

20

25

30

11е

О1и

Уа1

Рго

Ьеи

Азп

Зег

Рго

Азр

А1а

РЬе

О1и

Зег

11е

А1а

Ьеи

35

40

45

Ьеи

А1а

Азр

А1а

РЬе

Шз

Азр

Зег

А1а

Уа1

11е

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

50

55

60

Ьеи

ТЬг

Рго

О1п

Азр

Уа1

Уа1

Ьуз

Уа1

Шз

О1п

О1п

О1у

О1у

А1а

Меб

65

70

75

80

Уа1

Уа1

Зег

Рго

Азр

Суз

Азп

Рго

Азр

Уа1

11е

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьуз

А1а

85

90

95

Ьеи

О1у

Меб

Ьеи

Зег

Туг

Рго

О1у

Уа1

РЬе

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

А1а

РЬе

100

105

110

ТЬг

А1а

Ьеи

Агд

Зег

О1у

А1а

Азр

О1у

11е

Ьуз

Ьеи

РЬе

Рго

А1а

Зег

115

120

125

О1у

11е

О1у

Рго

А1а

О1у

Ьеи

А1а

А1а

Меб

Ьеи

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

ТЬг

130

135

140

О1у

Меб

Агд

Зег

Туг

А1а

Уа1

О1у

О1у

Уа1

О1у

Рго

Азр

Зег

РЬе

А1а

145

150

155

160

Рго

Тгр

11е

О1у

Уа1

О1у

Уа1

ТЬг

О1у

РЬе

О1у

11е

О1у

ТЬг

О1у

Ьеи

165

170

175

РЬе

Ьуз

Рго

О1у

РЬе

О1у

ТЬг

А1а

Азр

Уа1

А1а

Ьуз

Агд

А1а

А1а

Азр

180

185

190

11е

Уа1

А1а

А1а

Туг

Азр

Агд

О1у

11е

Ьеи

Ьуз

195

200

<210> 319 <211> 600 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 319 дбдссддббс бддбсабсда адасдбсааб дабдссдбдс сдсббдссаа ддссббддбд

- 385 029538

дссддЕддЕЕ	ЕдсдсдЕдсЕ	ЕдаааЕсасс	сЕдсдсадЕд	ссдссдссда	ддааадсаЕЕ	120
ааасдЕаЕЕа	ЕсдссдаадЕ	ЕсссдаЕдса	аЕЕассддЕд	сдддсассдЕ	даЕсааЕдсс	180
ааасадаЕдд	аасдЕаЕддс	сдаааЕсддЕ	ЕдЕдсЕЕЕЕд	сддЕЕЕсдсс	дддссаЕасс	240
даЕддЕЕЕдс	ЕЕааддссдс	сааадаЕасс	ддсдЕдссдЕ	ЕдсЕдсссдд	Едссддаасд	300
ссдЕсЕдааа	ЕсаЕдсаЕсЕ	даЕЕдаЕсаЕ	ддсЕаЕдаса	ЕсЕЕдаааЕЕ	сЕЕсссддсс	360
даасаасадд	дсддЕдЕЕЕс	даЕдсЕЕааа	дсссЕдЕсЕд	дсссдсЕдсс	асаддЕдааа	420
ЕЕсЕдсссда	сдддЕддЕдЕ	дЕсдсЕддса	ааЕЕЕддддд	аЕЕаЕсЕсдс	ссЕдссаааЕ	480
аЕсаЕсассд	ЕЕддЕдддЕс	дЕдддЕсЕсд	ссааааадсд	сддЕсааддс	сддЕдасЕдд	540
дсаасдаЕса	сдсдссЕддс	асаддаадса	ассдасаадд	ЕЕдссдаасЕ	ЕсдсддЕЕаа	600

<210> 320 <211> 199 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)...(186) <223> альдолаза КЭРО и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (23)...(32) <223> Активный центр альдолаз КВРО и КНО. РгозФЕе ίά = РЗ00159 <220>

<221> САЙТ <222> (112)...(125) <223> Образующий основание Шиффа остаток альдолаз КВРО и КНО. РгозчЕе ίά = РЗ00160 <400> 320

МеЕ 1

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1 5

11е

О1и Азр

Уа1

Азп Азр 10

А1а

Уа1

Рго

Ьеи 15

А1а

Ьуз

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

О1у

Ьеи

Агд

Уа1

Ьеи

О1и

11е

ТЬг

Ьеи

Агд

20

25

30

Зег

А1а

А1а

А1а

О1и

О1и

Зег

11е

Ьуз

Агд

11е

11е

А1а

О1и

Уа1

Рго

35

40

45

Азр

А1а

11е

ТЬг

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

11е

Азп

А1а

Ьуз

О1п

МеЕ

О1и

50

55

60

Агд

МеЕ

А1а

О1и

11е

О1у

Суз

А1а

РЬе

А1а

Уа1

Зег

Рго

О1у

Нтз

ТЬг

65

70

75

80

Азр

О1у

Ьеи

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

Ьуз

Азр

ТЬг

О1у

Уа1

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

85

90

95

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Рго

Зег

О1и

11е

МеЕ

Нтз

Ьеи

11е

Азр

Нтз

О1у

Туг

- 386

100

105

110

Азр

11е

Беи

Буз

РЬе

РЬе

Рго

А1а

О1и

О1п

О1п

О1у

О1у

Уа1

Бег

Меб

115

120

125

Беи

Буз

А1а

Беи

Бег

О1у

Рго

Беи

Рго

О1п

Уа1

Буз

РЬе

Суз

Рго

ТЬг

130

135

140

О1у

О1у

Уа1

Бег

Беи

А1а

Азп

Беи

О1у

Азр

Туг

Беи

А1а

Беи

Рго

Азп

145

150

155

160

11е

11е

ТЬг

Уа1

О1у

О1у

Бег

Тгр

Уа1

Бег

Рго

Буз

Бег

А1а

Уа1

Буз

165

170

175

А1а

О1у

Азр

Тгр

А1а

ТЬг

11е

ТЬг

Агд

Беи

А1а

О1п

О1и

А1а

ТЬг

Азр

180

185

190

Буз

Уа1

А1а

О1и

Беи

Агд

О1у

195 <210> 321 <211> 654 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 321
абдассадсд	ааасдаасса	дабаббадад	дсдааабббд	ссдсбдсдсс	ддбддбдссс	60
сбдабсдаад	ссадбдассс	басддббдсд	дбадсаабсд	саааадсдсб	дсаддсдддс	120
ддссбсдабд	бдабсдаадб	сдбссбссдд	ассдасдсдд	сдсбсдаббд	сабддаадсс	180
аббабсдсдд	адасббсдда	сабсаббдбб	ддсдсдддаа	саабсббдас	сдсбдасдаб	240
дсдааддсад	сбдббасссд	сддсдсдсад	ббсаббдбдб	дсссдддасб	ддбсдасдсд	300
дбддбсаабб	бсбдсааддс	ааабдабсбб	ссддбсббсс	сдддаасааб	дассссдддс	360
даадбдсаас	аддсссабаа	бсбсддбсбс	ддаасддбда	ааббсбббсс	сдссааасбс	420
дсбддсддбд	бдссдабдсб	сааддсаббд	адсбсддбсб	ббсдсаабаб	дсдбббсабд	480
ссдасдддбд	дддбдбсадс	ададаабсбд	ддсдаабббс	бддссдбдсс	ббссдбаабб	540
дссбдсддсд	дбадсбддсб	сасдссдааа	дсддсбабсд	асдсдддсда	ббасдабдса	600
абсассаадс	бддсссдбда	адсбдбсдсб	сбсдсасдбд	ссбсбадасс	абаа	654

<210> 322 <211> 217 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (9)...(204)

- 387 029538 <223> альдолаза КЬРО и КНО <400> 322

МеЕ 1

ТЬг

Зег О1и

ТЬг 5

Азп

О1п

11е

Ьеи

О1и 10

А1а

Ьуз

РЬе

А1а

А1а 15

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Рго

Ьеи

11е

О1и

А1а

Зег

Азр

Рго

ТЬг

Уа1

А1а

Уа1

А1а

20

25

30

11е

А1а

Ьуз

А1а

Ьеи

О1п

А1а

О1у

О1у

Ьеи

Азр

Уа1

11е

О1и

Уа1

Уа1

35

40

45

Ьеи

Агд

ТЬг

Азр

А1а

А1а

Ьеи

Азр

Суз

МеЕ

О1и

А1а

11е

11е

А1а

О1и

50

55

60

ТЬг

Зег

Азр

11е

11е

Уа1

О1у

А1а

О1у

ТЬг

11е

Ьеи

ТЬг

А1а

Азр

Азр

65

70

75

80

А1а

Ьуз

А1а

А1а

Уа1

ТЬг

Агд

О1у

А1а

О1п

РЬе

11е

Уа1

Суз

Рго

О1у

85

90

95

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Уа1

Уа1

Азп

РЬе

Суз

Ьуз

А1а

Азп

Азр

Ьеи

Рго

Уа1

100

105

110

РЬе

Рго

О1у

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Рго

О1у

О1и

Уа1

О1п

О1п

А1а

Н1з

Азп

Ьеи

115

120

125

О1у

Ьеи

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

РЬе

РЬе

Рго

А1а

Ьуз

Ьеи

А1а

О1у

О1у

Уа1

130

135

140

Рго

МеЕ

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

РЬе

Агд

Азп

МеЕ

Агд

РЬе

МеЕ

145

150

155

160

Рго

ТЬг

О1у

О1у

Уа1

Зег

А1а

О1и

Азп

Ьеи

О1у

О1и

РЬе

Ьеи

А1а

Уа1

165

170

175

Рго

Зег

Уа1

11е

А1а

Суз

О1у

О1у

Зег

Тгр

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьуз

А1а

А1а

180

185

190

11е

Азр

А1а

О1у

Азр

Туг

Азр

А1а

11е

ТЬг

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

О1и

А1а

195

200

205

Уа1

А1а

Ьеи

А1а

Агд

А1а

Зег

Агд

Рго

210 215 <210> 323 <211> 603 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 323

аЕдасдЕЕсс	сссЕдадаЕс	асЕсдЕддаа	дссдсдасса	аддсассдаЕ	ЕдЕасссдЕЕ	60
сЕддЕсдЕсд	ассдсаЕЕда	адЕЕдсддсс	ссссЕЕдсдс	дддсдсЕЕдЕ	ЕдаЕддсддс	120
сЕдасааЕЕд	ссдаадЕсас	дсЕдсдааса	ссЕЕсддддс	ЕддсддЕааЕ	сдаададаЕд	180
аааЕссдссд	адсссддссЕ	дааддЕсддс	дсдддсассд	ЕдЕЕдассда	аЕссдаЕдЕс	240

- 388 029538

дадаасдсаб	бддсддссдд	сдсддабббс	сбсдбддсас	сдддсабдбс	дссаааасбд	300
ббддссддас	бдддбддсса	ссдссдссбд	абдабсссбд	дсдббдсдас	адссадсдаа	360
дссабддсса	ддсасдадда	сдддббсдас	сбдббдааас	бдбббссддс	сбсдаббдсс	420
ддсддадбса	дсдсбсбсаа	ддсдсббддс	ддбссдсбдс	сдсассбдсд	сббсабдссд	480
ассддсддса	бсассдаддс	ддабдбсддс	ааабассбсд	сссббсссаа	бдббббсдсд	540
дссддаддсб	сдбддаббдс	дасдддсдсс	дасаббдсбд	ссдаадасбс	дадссдаабб	600

сбб 603 <210> 324 <211> 201 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (9)...(201) <223> альдолаза КВРО и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (40)...(49) <223> Активный центр альдолаз КВРО и КНО. Ргозббе ίά = РЗ00159 <400> 324

Меб 1

ТЬг

РЬе

Рго

Беи 5

Агд

Зег

Беи

Уа1

О1и 10

А1а

А1а

ТЬг

Буз

А1а 15

Рго

11е

Уа1

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Азр

Агд

11е

О1и

Уа1

А1а

А1а

Рго

Ьеи

20

25

30

А1а

Агд

А1а

Беи

Уа1

Азр

О1у

О1у

Ьеи

ТЬг

11е

А1а

О1и

Уа1

ТЬг

Ьеи

35

40

45

Агд

ТЬг

Рго

Зег

О1у

Ьеи

А1а

Уа1

11е

О1и

О1и

Меб

Ьуз

Зег

А1а

О1и

50

55

60

Рго

О1у

Беи

Буз

Уа1

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

Беи

ТЬг

О1и

Зег

Азр

Уа1

65

70

75

80

О1и

Азп

А1а

Ьеи

А1а

А1а

О1у

А1а

Азр

РЬе

Беи

Уа1

А1а

Рго

О1у

Меб

85

90

95

Зег

Рго

Буз

Ьеи

Ьеи

А1а

О1у

Беи

О1у

О1у

Нбз

Агд

Агд

Беи

Меб

11е

100

105

110

Рго

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

А1а

Зег

О1и

А1а

Меб

А1а

Агд

Нбз

О1и

Азр

О1у

115

120

125

РЬе

Азр

Ьеи

Беи

Буз

Ьеи

РЬе

Рго

А1а

Зег

11е

А1а

О1у

О1у

Уа1

Зег

130

135

140

А1а

Ьеи

Ьуз

А1а

Беи

О1у

О1у

Рго

Ьеи

Рго

Нбз

Ьеи

Агд

РЬе

Меб

Рго

145

150

155

160

- 389

ТЬг О1у О1у

11е

ТЬг 165

О1и А1а Азр

Уа1

О1у 170

Ьуз

Туг

Ьеи А1а

Ьеи 175

Рго

Азп

Уа1

РЬе

А1а

А1а

О1у

О1у

Зег

Тгр

11е

А1а

ТЬг

О1у А1а

Азр

11е

180

185

190

А1а

А1а

О1и

Азр

Зег

Зег

Агд

11е

Ьеи

195 200 <210> 325 <211> 648 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 325 аЕасаадаад

ЕдЕсЕдааад сдЕддЕдааЕ аааддЕсЕаЕ даЕдссддЕд

ЕаЕЕЕдааЕа садсаадсдд дЕадаадсда дсаасадаад адсаадсЕЕа асаааадаад

ЕаааддадаЕ

ЕадсЕааЕас аЕдсасЕЕас

ЕдсЕЕдсадЕ ссдаЕЕЕЕЕЕ ааасдЕЕдЕд дЕЕдЕаадсЕ

ЕсаЕдссаЕЕ саааЕсЕддд

Еаасаааада

ЕдсЕЕЕсааЕ

ЕддЕЕЕаЕЕд

ЕЕЕдЕаЕдаЕ ааасЕЕЕааа дддсасааЕЕ даЕсадссса даЕассаддЕ

ЕаЕсаааЕЕа аЕЕсадЕдда

ЕдссЕддЕЕЕ саЕЕЕЕааад ааЕЕсдасаЕ ссЕЕЕаЕаЕЕ дссдаЕдЕаа сасЕЕадЕда аааассддда аЕаЕЕЕдаса

ЕдЕасаасдс

ЕЕсссдддаа аЕЕдаЕЕЕЕа аааЕсаддЕд ааЕддЕдаЕЕ аЕЕаааЕсад аЕсасдасда ааЕдсаЕада адсЕдадада сддаЕдсЕса дсадсдЕЕЕд саасадаааЕ аЕдЕасЕддд сдаЕсасЕдд

ЕдааддЕадЕ аЕдаЕддаЕЕ сЕаааЕад

ЕдсадсЕаЕЕ аЕЕЕасааас

ЕдаааадаЕд даааЕЕЕаЕЕ сдаЕасддсс

ЕсаЕдЕадса дссдддЕЕЕЕ

ЕддадЕадаа

ЕддааЕдддс дааадсЕааа

120

180

240

300

360

420

480

540

600

648 <210> 326 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)...(200) <223> альдолаза КВРС и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (104)...(107) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозтЕе ίά = РЗ00001 <400> 326

11е О1п О1и Уа1 Ьуз О1и 11е О1у Ьеи Ьеи Рго Ьеи Туг Туг Нтз Азр

- 390 029538

1

5

10

15

Азр

А1а

А1а

11е

Суз

Ьеи

Ьуз

Уа1

А1а

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

Азр

А1а

Азр

20

25

30

Уа1

Ьуз

Суз

11е

О1и

РЬе

ТЬг

Азп

Агд

О1у

О1и

Туг

А1а

Ьеи

ТЬг

Азп

35

40

45

РЬе

Ьуз

Нтз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

Агд

Азр

О1и

Ьуз

Меб

Ьуз

О1у

Ьеи

Ьеи

50

55

60

Ьеи

А1а

Уа1

О1у

ТЬг

11е

Ьуз

ТЬг

О1у

ТЬг

Азр

А1а

О1п

Ьуз

РЬе

11е

65

70

75

80

Азр

А1а

О1у

А1а

Азр

РЬе

Ьеи

11е

Зег

Рго

11е

РЬе

Азр

Зег

Зег

Уа1

85

90

95

Суз

Азр

ТЬг

А1а

Туг

Ьеи

Азп

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Тгр

11е

Рго

О1у

Суз

ТЬг

100

105

110

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

11е

Нтз

Уа1

А1а

О1п

О1п

А1а

О1у

Суз

Ьуз

Ьеи

11е

115

120

125

Ьуз

Ьеи

РЬе

Рго

О1у

Азп

Уа1

Ьеи

О1у

Рго

О1у

РЬе

Уа1

О1и

А1а

11е

130

135

140

Меб

Рго

Ьеи

РЬе

Зег

О1у

11е

Азр

РЬе

ТЬг

11е

ТЬг

О1у

О1у

Уа1

О1и

145

150

155

160

А1а

ТЬг

О1и

А1а

Азп

Ьеи

О1у

А1а

Тгр

РЬе

Ьуз

Зег

О1у

Уа1

Ьуз

Уа1

165

170

175

Уа1

О1у

Меб

О1у

Зег

Ьуз

Ьеи

11е

ТЬг

Ьуз

Азр

11е

Ьеи

Ьуз

Азп

О1у

180

185

190

Азр

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

О1и

Уа1

Ьеи

Зег

11е

11е

195

200

205

Агд

Нтз

11е

Ьуз

Зег

А1а

Ьуз

210 215 <210> 327 <211> 642 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 327

абддаасааб	сбабсбббда	ббасббсбас	аааабсддсд	бсаббсссдб	асбддааабс	60
дасбсддсдс	ббсабдссаа	ассдббадсс	даддсдсбдс	бддсаддадд	бсбдссбабс	120
дссдадабса	сасбдсдсас	сдаддсадсд	сбсдаддсда	ббсдсасбаб	бдсдсдсдаб	180
дбассддабд	бсабсдбсдд	ддсбддаасс	дбдабаассб	дддаасаадс	сдаадсддса	240
сдбдасдсдд	дсдсдсаабб	бсбсдбсбса	сссдддабдд	бддадсаддб	бдбсабсбдд	300
дсасаддааа	абсааабссс	бдббсбдссс	ддсдсбдбда	сссссассда	дабдабссдс	360

- 391 029538

дссабссабс	бсддбббдаа	дбббсбдааа	бббббсссаб	сддаадсбдб	аддсддасбс	420
ааадсссбса	аддсссбсбс	адассссббб	ссдддаббдс	дабббабссс	аассддбдда	480
дбдаадбббд	адаабсбддс	ддаббабсба	сааабддааа	адабссасдс	бдбсддсддс	540
бсдбддабдд	сааадсдсса	дабдабсдсс	дассдааааб	бсдасдадаб	басдсдаббд	600
дсдаабдаад	ссадсдассб	бдбдасаааа	абсаддаадб	ад		642

<210> 328 <211> 213 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (5)...(200) <223> альдолаза КБРС и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (37)...(46) <223> Активный центр альдолаз КБРС и КНО. Ргозббе ίά. = РБ00159

<400> 328

Туг

РЬе

Туг 10

Буз

11е

О1у

Уа1

11е 15

Рго

Меб 1

О1и

О1п

Бег

11е 5

РЬе

Азр

Уа1

Беи

О1и

11е

Азр

Бег

А1а

Беи

Нбз

А1а

Буз

Рго

Беи

А1а

О1и

А1а

20

25

30

Беи

Беи

А1а

О1у

О1у

Беи

Рго

11е

А1а

О1и

11е

ТЬг

Беи

Агд

ТЬг

О1и

35

40

45

А1а

А1а

Беи

О1и

А1а

11е

Агд

ТЬг

11е

А1а

Агд

Азр

Уа1

Рго

Азр

Уа1

50

55

60

11е

Уа1

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

11е

ТЬг

Тгр

О1и

О1п

А1а

О1и

А1а

А1а

65

70

75

80

Агд

Азр

А1а

О1у

А1а

О1п

РЬе

Беи

Уа1

Бег

Рго

О1у

Меб

Уа1

О1и

О1п

85

90

95

Уа1

Уа1

11е

Тгр

А1а

О1п

О1и

Азп

О1п

11е

Рго

Уа1

Беи

Рго

О1у

А1а

100

105

110

Уа1

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

Меб

11е

Агд

А1а

11е

Нбз

Беи

О1у

Беи

Буз

РЬе

115

120

125

Беи

Буз

РЬе

РЬе

Рго

Бег

О1и

А1а

Уа1

О1у

О1у

Беи

Буз

А1а

Беи

Буз

130

135

140

А1а

Беи

Бег

Азр

Рго

РЬе

Рго

О1у

Беи

Агд

РЬе

11е

Рго

ТЬг

О1у

О1у

145

150

155

160

Уа1

Буз

РЬе

О1и

Азп

Беи

А1а

Азр

Туг

Беи

О1п

Меб

О1и

Буз

11е

Нбз

165

170

175

А1а

Уа1

О1у

О1у

Бег

Тгр

Меб

А1а

Буз

Агд

О1п

Меб

11е

А1а

Азр

Агд

- 392

180

185

190

Ьуз РНе Азр 195

О1и 11е ТНг Агд Беи А1а Азп О1и А1а Бег Азр Беи Уа1 200 205

ТНг Ьуз 11е Агд Ьуз 210

<210> 329
<211> 618 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК,	полученная	из образца
<400> 329 абдасбсдсб	бббсбдаасб	бабдбсаддд
асассададс	ааддсдббаа	аабадсбсаа
даадбадбас	ббадаасбда	бдсабсдбба
ссадсдсбба	аадбаддбдс	аддсасадба
дсадсаддбд	ссдасбббаб	бдббасдсса
асаааабдса	абдбдссддб	асббссбддб
сббдадбасд	дббббдаада	асааааабба
ббсдбабсдд	сбдбсбсдбс	адбабббада
адсдадсааа	абаааабдда	ббасббабсб
бддаббдсаа	абааададбд	ддббдсасаа
аббсаадсаб	бааадбад

из окружающей среды

сааасаббас	бдссбабааб	бсаадссдас	60
дсбабддсба	абдсбддссб	басбббддбб	120
дабдсаббаа	аадсбаббаа	ададсаддбд	180
абааабасбд	асаббббада	дсаадсасбб	240
дсадбдбсбс	сдсааббабб	адссдсдсба	300
дбдбсбааса	сдддбдасаб	бббаабддсд	360
ббсссбдсаб	сдсбсдсбдд	бддбдсасса	420
дсбдсбадсб	бббдбссбас	аддбддсдба	480
ббааабаабд	бабббдсбдб	дддбддбасб	540
даааасбддс	аадсааббас	бдасбсдбдб	600
			618

<210> 330 <211> 205 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (4)...(199) <223> альдолаза КБРО и КНО <400> 330

Меб 1

ТНг

Агд

РНе

Бег 5

О1и

Беи Меб

Бег

О1у 10

О1п ТНг

Беи

Беи

Рго 15

11е

11е

О1п

А1а

Азр

ТНг

Рго

О1и

О1п

О1у

Уа1

Ьуз

11е

А1а

О1п

А1а

Меб

20

25

30

А1а

Азп

А1а

О1у

Беи

ТНг

Ьеи

Уа1

О1и

Уа1

Уа1

Ьеи

Агд

ТНг

Азр

А1а

40 45

- 393 029538

Зег Ча1 65

Ьеи Азр А1а 50

Ьеи ТЬг

Ьуз Ча1 70

А1а 55 11е

11е Азп

Ьуз ТЬг

О1и Азр

О1п 11е 75

Ча1 60 Ьеи

Рго О1и

А1а О1п

Ьеи А1а

Ьуз Ьеи 80

О1у

А1а О1у

А1а

А1а

О1у

А1а

Азр

РЬе

11е

Ча1

ТЬг

Рго

А1а

Ча1

Зег

Рго

О1п

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Суз

Азп

Ча1

Рго

Ча1

Ьеи

Рго

О1у

Ча1

Зег

100

105

110

Азп

ТЬг

О1у

Азр

11е

Ьеи

Меб

А1а

Ьеи

О1и

Туг

О1у

РЬе

О1и

О1и

О1п

115

120

125

Ьуз

Ьеи

РЬе

Рго

А1а

Зег

Ьеи

А1а

О1у

О1у

А1а

Рго

РЬе

Ча1

Зег

А1а

130

135

140

Ча1

Зег

Зег

Ча1

РЬе

Агд

А1а

А1а

Зег

РЬе

Суз

Рго

ТЬг

О1у

О1у

Ча1

145

150

155

160

Зег

О1и

О1п

Азп

Ьуз

Меб

Азр

Туг

Ьеи

Зег

Ьеи

Азп

Азп

Ча1

РЬе

А1а

165

170

175

Ча1

О1у

О1у

ТЬг

Тгр

11е

А1а

Азп

Ьуз

О1и

Тгр

Ча1

А1а

О1п

О1и

Азп

180

185

190

Тгр

О1п

А1а

11е

ТЬг

Азр

Зег

Суз

11е

О1п

А1а

Ьеи

Ьуз

195 200 205 <210> 331 <211> 663 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 331

абддсабабс	сдассдсддб	сааббсасад	аббассдаса	садсаддсаа	ддббббдсаб	60
сдсааасбда	ббдсбабббб	асдсддадбд	аадсссдабд	аадсддсабс	сабддсдсдб	120
дбдсбддбсд	абдссдддаб	сасдабдабс	даддбдссдс	бдааббсссс	ддаассдсбб	180
аааадсаббд	сдабсабдаа	ддсадаадбс	ддбдасдсдд	сссбдабсдд	ддсаддбасд	240
дбсббаасдд	бсдаддабдб	бдбдаасдбб	сдбдасдсдд	дсддбдадбб	бдббдбдбсд	300
сссааббасд	абдбсдабдб	даббаааааа	ассааддаад	бсддбабддд	аадббддссд	360
ддддбдсбда	сбссдассда	абдбббсдсс	дсдабсаадд	ссддддсдда	бдддсббааа	420
абаббсссбд	ссадсабсаб	бддсдсабсд	дддабббсдд	сдабдсдддс	ддббббдсса	480
ааадабабдс	сддбббабдс	ддббддбддб	дббдддссдд	абдаббббдс	дассбабдсс	540
ааддсддддб	дсдабддббб	сддссббдда	бсддддаббб	абааасссдд	ссбдасадсд	600
дасдаадбаб	сддддсдсдс	баббдссббс	дбаасддсдс	абдасдсддб	абббдсдддс	660
бад						663

- 394 029538 <210> 332 <211> 220 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (15)...(211) <223> альдолаза КВРО и КНО <400> 332

Меб А1а Туг 1

Рго

ТЬг 5

А1а Уа1

Азп Бег

О1п 10

11е

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а 15

О1у

Ьуз

Уа1

Ьеи

Нгз

Агд

Буз

Ьеи

11е

А1а

11е

Беи

Агд

О1у

Уа1

Ьуз

Рго

20

25

30

Азр

О1и

А1а

А1а

Бег

Меб

А1а

Агд

Уа1

Беи

Уа1

Азр

А1а

О1у

11е

ТЬг

35

40

45

Меб

11е

О1и

Уа1

Рго

Беи

Азп

Бег

Рго

О1и

Рго

Беи

Ьуз

Бег

11е

А1а

50

55

60

11е

Меб

Буз

А1а

О1и

Уа1

О1у

Азр

А1а

А1а

Ьеи

11е

О1у

А1а

О1у

ТЬг

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

О1и

Азр

Уа1

Уа1

Азп

Уа1

Агд

Азр

А1а

О1у

О1у

О1и

85

90

95

РЬе

Уа1

Уа1

Бег

Рго

Азп

Туг

Азр

Уа1

Азр

Уа1

11е

Буз

Ьуз

ТЬг

Буз

100

105

110

О1и

Уа1

О1у

Меб

О1у

Бег

Тгр

Рго

О1у

Уа1

Ьеи

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

Суз

115

120

125

РЬе

А1а

А1а

11е

Ьуз

А1а

О1у

А1а

Азр

О1у

Беи

Ьуз

11е

РЬе

Рго

А1а

130

135

140

Бег

11е

11е

О1у

А1а

Бег

О1у

11е

Бег

А1а

Меб

Агд

А1а

Уа1

Беи

Рго

145

150

155

160

Буз

Азр

Меб

Рго

Уа1

Туг

А1а

Уа1

О1у

О1у

Уа1

О1у

Рго

Азр

Азр

РЬе

165

170

175

А1а

ТЬг

Туг

А1а

Ьуз

А1а

О1у

Суз

Азр

О1у

РЬе

О1у

Беи

О1у

Бег

О1у

180

185

190

11е

Туг

Буз

Рго

О1у

Ьеи

ТЬг

А1а

Азр

О1и

Уа1

Бег

О1у

Агд

А1а

11е

195

200

205

А1а

РЬе

Уа1

ТЬг

А1а

Нгз

Азр

А1а

Уа1

РЬе

А1а

О1у

210

215

220

<210>	333
<211>	648
<212>	ДНК
<213>	Неизвестно

- 395

<220>
<223> ДНК,	полученная	из образца	из окружающей среды
<400> 333 абддсдаббд	абсссдссдс	бдссадбсдд	сдсабдсдсд	ааббддсддс	дсбддссссд	60
дбдабсссдд	бдсбддбдаб	сдаддабдсс	дсаадддсда	ддссссбддс	сдаддсдсбд	120
дбддсдддбд	дбсбдссддб	дсбддаддбд	асдсбдсдса	ссссддссдс	дссададдбс	180
аббсдсдада	бдбсссдддб	сссдддддсс	аббдбсддсд	ссддсассдб	дабсасассд	240
дссдасдбдс	ддабсдсаса	адсддсдддд	дсссдаббсд	ссдбсбсссс	сддсдсдасс	300
дабдсдббдс	бсдабдссбд	сдаадсддсд	дддсбдссдс	бссбдсссдд	сдсддссасд	360
дсдадсдадд	сдабддсдсб	бсбддсдсдс	ддсбасдаса	бдсбдаадбб	сбббсссдсс	420
даддсадбдд	дсддсдсддс	ддсдсббдса	дсдсбдддсд	сдссдсбдсс	дсадабббсс	480
ббсбдсссда	ссддаддддб	садсссддса	аасдсдсссд	асбассбсдс	сббдсссасд	540
дббсссбдсд	бсддсддсад	сбдддбддсс	ссдааассас	аддбсдссдс	сддсдасбдд	600
дасдсдабсс	дбдсссбсдс	сдаасасдсс	сдсасссбсд	сдсссбда		648
<210> 334 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно

<220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>

<221> ДОМЕН <222> (12)...(206) <223> альдолаза КБРО и КНО <220>

<221> САЙТ <222> (44)...(53) <223> Активный центр альдолаз КБРО и КНО. РгозФбе ίά = РБ00159 <220>

<221> САЙТ <222> (133)...(146) <223> Образующий основание Шиффа остаток альдолаз КБРО и КНО. РгозФбе ίά = РБ00160 <400> 334

Меб 1

А1а

11е

Азр

Рго 5

А1а

А1а

А1а

Бег

Агд 10

Агд

Меб

Агд

О1и

Беи 15

А1а

А1а

Беи

А1а

Рго 20

Уа1

11е

Рго

Уа1

Беи 25

Уа1

11е

О1и

Азр

А1а 30

А1а

Агд

А1а

Агд

Рго 35

Беи

А1а

О1и

А1а

Беи 40

Уа1

А1а

О1у

О1у

Беи 45

Рго

Уа1

Беи

О1и

Уа1

ТЬг

Беи

Агд

ТЬг

Рго

А1а

А1а

Рго

О1и

Уа1

11е

Агд

О1и

Меб

- 396

55 60

Бег 65

Агд

Уа1

Рго

О1у

А1а 70

11е

Уа1

О1у

А1а О1у ТЬг 75

Уа1

11е

ТЬг

Рго 80

А1а

Азр

Уа1

Агд

11е

А1а

О1п

А1а

А1а

О1у

А1а

Агд

РЬе

А1а

Уа1

Бег

85

90

95

Рго

О1у

А1а

ТЬг

Азр

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

А1а

Суз

О1и

А1а

А1а

О1у

Ьеи

100

105

110

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

О1у

А1а

А1а

ТЬг

А1а

Бег

О1и

А1а

Меб

А1а

Ьеи

Ьеи

115

120

125

А1а

Агд

О1у

Туг

Азр

Меб

Ьеи

Ьуз

РЬе

РЬе

Рго

А1а

О1и

А1а

Уа1

О1у

130

135

140

О1у

А1а

А1а

А1а

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Рго

Ьеи

Рго

О1п

11е

Бег

145

150

155

160

РЬе

Суз

Рго

ТЬг

О1у

О1у

Уа1

Бег

Рго

А1а

Азп

А1а

Рго

Азр

Туг

Ьеи

165

170

175

А1а

Ьеи

Рго

ТЬг

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

О1у

Бег

Тгр

Уа1

А1а

Рго

Ьуз

180

185

190

Рго

О1п

Уа1

А1а

А1а

О1у

Азр

Тгр

Азр

А1а

11е

Агд

А1а

Ьеи

А1а

О1и

195

200

205

НФз

А1а

Агд

ТЬг

Ьеи

А1а

Рго

210 215 <210> 335 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(19) <223> Ь представляет собой с, д или б <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(19) <223> у представляет собой с или б <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(19) <223> г представляет собой а или д <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(19) <223> » представляет собой а или б <400> 335 аагдбЬбмуд агдасаабд

- 397 <210> 336 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(18) <223> ά представляет собой а, д или б <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(18)

<223>	у представляет	собой	с	или	б
<220>
<221>	т1зс_£еабиге
<222>	(1)..(18)
<223>	г представляет	собой	а	или	д
<220>
<221>	т1зс_£еабиге
<222>	(1)..(18)
<223>	» представляет	собой	а	или	б

<400> 336 дсйсадамса ауддгбдд 18

<210> <211> <212> <213>	337 23 ДНК Искусственная	последовательность
<220> <223>	Праймер
<220> <221>	т1зс_£еабиге
<222>	(1)..(23)
<223>	ά представляет	собой	а,	д	или б
<220> <221>	т1зс_£еабиге
<222>	(1)..(23)
<223>	у представляет	собой	с	или	б
<220> <221>	т1зс_£еабиге
<222>	(1)..(23)
<223>	г представляет	собой	а	или	д
<220> <221>	т1зс_£еабиге
<222>	(1)..(23)
<223>	з представляет	собой	с	или	д
<400>	337
ссабсгзуаб сйдсгбайад	сса				23

- 398 029538 <210> 338 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(20) <223> ά представляет <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(20) <223> у представляет <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(20) <223> г представляет <220>

<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(20) <223> п представляет <400> 338 дс^баάадсс аубспссгбс собой а, д или б собой с или б собой а или д собой а, с, д или б <210> 339 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 339 абаадасаба бдссбабсдб бдббасдаад 30 <210> 340 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 340 абаададдаб ссббаббссб сдддсадссд сбс 33 <210> 341 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 399 029538 <220>

<223> Праймер <400> 341 аЕаадасаЕа Едаасадасс ЕдЕддЕЕдЕс 30 <210> 342 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 342 аЕаададдаЕ ссЕЕасаддЕ асЕЕдадасс дад 33 <210> 343 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 343 аЕаадасаЕа ЕдадсдЕддЕ саЕссдааас 30 <210> 344 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 344 аЕаададдаЕ ссЕЕасЕЕсд сЕЕЕдЕЕаЕа ддс 33 <210> 345 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 345 аЕаадасаЕа Едаасаадсс сдЕддЕЕдЕд 30 <210> 346 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 346 аЕаададдаЕ ссЕЕасаадЕ асЕЕдадасс дадд 34

- 400 029538 <210> 347 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 347 аЕаадасаЕа ЕдадсдЕддЕ сдЕсассдд 29 <210> 348 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 348 аЕаададдаЕ ссЕЕадссдЕ ЕЕЕЕсссдЕс ддЕд 34 <210> 349 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 349 адаадасаЕа ЕдаЕдадсаЕ сдЕсдЕссад аас 33 <210> 350 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 350 адаададдаЕ ссЕсадасаЕ аЕЕЕсаддсс сЕЕд 34 <210> 351 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 351 адаадасаЕа ЕдаЕдадсдЕ ддЕсаЕсасс 30 <210> 352 <211> 33

- 401 029538 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 352 асаасаддаЕ сссЕаЕЕЕсЕ ЕсЕссддсдЕ ЕЕс 33 <210> 353 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 353 аЕааЕасаЕа ЕдадсдЕсдЕ сдЕЕсадаас 30 <210> 354 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 354 аЕааЕаддаЕ ссЕЕадасаЕ аЕЕЕдадссс сЕЕс 34 <210> 355 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 355 адаадасаЕа ЕдаЕдЕсддЕ ЕдЕсдЕЕсад аас 33 <210> 356 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 356 адаададдаЕ ссЕсадаЕаЕ асЕЕсаддсс с 31 <210> 357 <211> 852 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 402 029538

<220> <223> АТСС 4978 ЬААТ
<400> 357
абдадббаба дсббабддаа	бдассааабб	дбдаабдабд	аадаадбадб	адббдабаад	60
даддассдбд дсбабсаабб	бддсдабддб	дбббабдаад	ббдбаааадб	абабаасддб	120
дааббаббба садсддадда	дсабдбсдаб	сдбббббасд	сдадбдсбда	аааааббсдс	180
дббасдабсс сббабасааа	адасаааббд	сабсааббаб	бдсабсадбб	адббдааабд	240
аабааадббс ааасаддаса	бабббабббс	саааббасдс	дбддбдсадд	сссбсдбааб	300
сабаббббсс сбддбдабда	адбдаадсса	дбаббаасад	дбаабассаа	ддаааабсса	360
сдбсссдбад сааасбббда	ааааддбдбд	ааадсаасаб	ббдбадаада	саббсдббдд	420
ббасдсбдбд асаббааабс	аббаааббба	сббддбдсдд	басббдсбаа	асаадаадса	480
сабдааааад дабдсбабда	адсддбббба	сабсдбдабд	ааабсдбаас	адааддсбсб	540
бсббсаааба бббабддааб	бааадабддс	дбаббабаса	сасабссадс	даабаасббс	600
абсббааабд дбаббасасд	бсаадбаабс	аббааабдбд	сбдсбдаааб	бддсббасса	660
дбдааддаад аадсаабдас	ааааасбсад	сббсббдсаа	бддабдаадб	даббдбббса	720
бсаасдасбб садаадбаас	дссааббабс	дасабадабд	даасадбааб	бддбдсдддб	780
ааассдддбд асбддасасд	баааббасаа	дсасаабббд	абасдааааб	сссааааддб	840
аббсдсдсаб аа					852

<210> 358 <211> 283 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> АТСС 4978 ЬААТ <400> 358

Меб 1	Зег	Туг	Зег	Ьеи 5	Тгр	Азп	Азр
Уа1	Уа1	Азр	Ьуз 20	О1и	Азр	Агд	О1у
О1и	Уа1	Уа1 35	Ьуз	Уа1	Туг	Азп	О1у 40
Уа1	Азр 50	Агд	РЬе	Туг	А1а	Зег 55	А1а
Туг 65	ТЬг	Ьуз	Азр	Ьуз	Ьеи 70	НФз	О1п
Азп	Ьуз	Уа1	О1п	ТЬг 85	О1у	НФз	11е

О1п	11е 10	Уа1	Азп	Азр	О1и	О1и 15	Уа1
Туг 25	О1п	РЬе	О1у	Азр	О1у 30	Уа1	Туг
О1и	Ьеи	РЬе	ТЬг	А1а 45	О1и	О1и	НФз
О1и	Ьуз	11е	Агд 60	Уа1	ТЬг	11е	Рго
Ьеи	Ьеи	НФз 75	О1п	Ьеи	Уа1	О1и	Меб 80
Туг	РЬе 90	О1п	11е	ТЬг	Агд	О1у 95	А1а

- 403

О1у Рго

Агд

Азп НФз 100

11е

РЬе

Рго

О1у 105

Азр О1и Уа1

Ьуз

Рго 110

Уа1

Ьеи

ТЬг

О1у

Азп

ТЬг

Ьуз

О1и

Азп

Рго

Агд

Рго

Уа1

А1а

Азп

РЬе

О1и

Ьуз

115

120

125

О1у

Уа1

Ьуз

А1а

ТЬг

РЬе

Уа1

О1и

Азр

11е

Агд

Тгр

Ьеи

Агд

Суз

Азр

130

135

140

11е

Ьуз

Зег

Ьеи

Азп

Ьеи

Ьеи

О1у

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Ьуз

О1п

О1и

А1а

145

150

155

160

НФз

О1и

Ьуз

О1у

Суз

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

НФз

Агд

Азр

О1и

11е

Уа1

165

170

175

ТЬг

О1и

О1у

Зег

Зег

Зег

Азп

11е

Туг

О1у

11е

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

Ьеи

180

185

190

Туг

ТЬг

НФз

Рго

А1а

Азп

Азп

РЬе

11е

Ьеи

Азп

О1у

11е

ТЬг

Агд

О1п

195

200

205

Уа1

11е

11е

Ьуз

Суз

А1а

А1а

О1и

11е

О1у

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

О1и

О1и

210

215

220

А1а

МеЕ

ТЬг

Ьуз

ТЬг

О1п

Ьеи

Ьеи

А1а

МеЕ

Азр

О1и

Уа1

11е

Уа1

Зег

225

230

235

240

Зег

ТЬг

ТЬг

Зег

О1и

Уа1

ТЬг

Рго

11е

11е

Азр

11е

Азр

О1у

ТЬг

Уа1

245

250

255

11е

О1у

А1а

О1у

Ьуз

Рго

О1у

Азр

Тгр

ТЬг

Агд

Ьуз

Ьеи

О1п

А1а

О1п

260

265

270

РЬе

Азр

ТЬг

Ьуз

11е

Рго

Ьуз

О1у

11е

Агд

А1а

275

280

<210> 359 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 359 дЕдаЕЕдЕЕЕ саЕсаасдаа ЕЕсадаадЕа асдсс 35 <210> 360 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 360 дЕдаЕЕдЕЕЕ саЕсаасдсд ЕЕсадаадЕа асдсс 35 <210> 361 <211> 35

- 404 029538 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 361 дбдаббдббб сабсаасдад ббсадаадба асдсс 35 <210> 362 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 362 дбдаббдббб сабсаасддс ббсадаадба асдсс 35 <210> 363 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 363 дбдсаддссс бсдбдсбсаб аббббсссбд д 31 <210> 364 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 364 даадбдаббд бббсабсаас дсадбсадаа дбаасдссаа ббабс 45 <210> 365 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 365 сабабдадбб абадсббабд даабдассаа аббдбдаабд 40 <210> 366 <211> 34

- 405 029538 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 366 сбсдадбдсд дссдсаадсб бдбсдасдда дсбс 34 <210> 367 <211> 95 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 367 аабабббабд дааббааада бддсдбабба басасасабс садсдаабаа сабдабсбба 60 аабддбабба сасдбсаадб аабсаббааа бдбдс 95 <210> 368 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 368 ддссадбдаа ббдбаабасд асбсасбаба дддс 34 <210> 369 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 369 сдссабсббб ааббссабаа абабббдаад аададссббс бд 42 <210> 370 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 370 дсаасабббд бадаадасаб бсдббдддаа басбдббаса ббааабсабб ааабббасбб 60 ддбдсд 66 <210> 371

- 406 029538

<211>	55
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Мутагенный праймер
<400>	371
дЕаЕЕаЕаса сасаЕссадс дааЕаасЕас аЕсЕЕаааЕд	дЕаЕЕасасд	Есаад	55
<210>	372
<211>	64
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Мутагенный праймер
<400>	372
дсааЕддаЕд аадЕдаЕЕдЕ ЕЕсаЕсаасд асЕааадаад	ЕаасдссааЕ	ЕаЕсдасаЕа	60
даЕд				64
<210>	373
<211>	64
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Мутагенный праймер
<400>	373
дсааЕддаЕд аадЕдаЕЕдЕ ЕЕсаЕсаасд ааЕааадаад	ЕаасдссааЕ	ЕаЕсдасаЕа	60
даЕд				64
<210>	374
<211>	64
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Мутагенный праймер
<400>	374
дсааЕддаЕд аадЕдаЕЕдЕ ЕЕсаЕсаасд ааЕсдЕдаад	ЕаасдссааЕ	ЕаЕсдасаЕа	60
даЕд				64
<210>	375
<211>	16
<212>	БЕЛОК
<213>	Р. зЕг1аЕа
<220>
<221>	т1зс_£еаЕиге
<222>	(12)..(12)

- 407 029538

<223>	Хаа может представлять собой	любую встречающуюся	в природе аминокис
лоту
<400>	375
Беи ТНг А1а Уа1 Беи Буз А1а Азр А1а	Туг О1у Хаа О1у 11е	О1у Беи
1	5	10	15
<210>	376
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер
<400>	376
адаадасаЕа ЕдсссЕЕЕсд ссдЕаддд		28
<210>	377
<211>	32
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер
<400>	377

адаададдаЕ ссЕсадЕсда сдадЕаЕсЕЕ сд 32 <210> 378 <211> 1230 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> КТ2440 БАК

<400> 378 аЕдсссЕЕЕс	дссдЕасссЕ	ЕсЕддсЕдса	ЕсссЕддсас	ЕЕсЕдаЕсас	сддасаддсс	60
ссссЕдЕаЕд	сддсассасс	дЕЕдЕсдаЕд	дасаасддса	ссаасасссЕ	дассдЕдсаа	120
аасадсааЕд	ссЕдддЕсда	адЕсадсдсс	адсдсссЕдс	адсасаасаЕ	ссдсасдсЕд	180
саддссдадс	Еддссддсаа	дЕссаадсЕд	ЕдсдссдЕдс	Есааддссда	ЕдссЕаЕддс	240
сасддЕаЕсд	дссЕддЕааЕ	дссаЕсдаЕс	аЕсдсссаад	дсдЕдсссЕд	сдЕддсддЕд	300
дссадсаасд	аддаддсссд	сдЕддЕссдс	дссадЕддсЕ	Есассдддса	асЕддЕдсдд	360
дЕасдссЕдд	ссадссЕсад	сдадсЕддаа	даЕддсЕЕдс	адЕасдасаЕ	ддаададсЕд	420
дЕдддсадсд	сддааЕЕЕдс	ссдссаддсс	даЕдссаЕсд	ссдсдсдсса	Еддсаадасс	480
ЕЕдсдсаЕЕс	асаЕддсдсЕ	саасЕссадс	ддсаЕдадсс	дсаасддддЕ	ддадаЕддсс	540
ассЕддЕссд	дссдЕддсда	адсдсЕдсад	аЕсассдасс	адаадсассЕ	саадсЕддЕс	600
дсдсЕдаЕда	сссасЕЕсдс	сдЕддаадас	ааддасдаЕд	Еасдсааддд	ссЕддсддса	660

- 408 029538

ббсаасдадс	адассдасбд	дббдабсаад	сасдссаддс	бддассдсад	саадсбсасс	720
сбдсасдссд	ссаасбсдбб	сдсбасдсбд	даадбдссдд	аадсдсдссб	ддасабддба	780
сдаасдддбд	дсдсдсбдбб	сддсдасасс	дбдссддсдс	дсассдадба	сааасдбдсд	840
абдсадббса	аабсдсасдб	ддсддсддбд	сасадсбабс	сддссддсаа	сассдбдддс	900
бабдассдса	ссббсасссб	ддсссдбдаб	бсдсддсбдд	ссаасаббас	ддбсдддбас	960
бссдабддсб	ассдссдддб	аббсассаас	аадддссабд	бдсбдабсаа	сддссассдб	1020
дбдссддбсд	бдддсааддб	дбсдабдаас	асдсбдабдд	бсдабдбсас	сдасббсссб	1080
дабдбдаадд	ддддбаасда	адбддбдсбд	ббсддсаадс	аддссддддд	сдааабсасс	1140
саддссдада	бддаадаааб	саасддсдсд	ббдсбсдссд	абббдбасас	сдбабддддс	1200
ааббссаасс	сдаадабасб	сдбсдасбда				1230

<210> 379 <211> 409 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность

<220>

<223> КТ2440 БАК

<400> 379

Меб

Рго

РЬе

Агд

Агд

ТЬг

Беи

Беи

А1а

А1а

Зег

Беи

А1а

Беи

Беи

11е

1

5

10

15

ТЬг

О1у

О1п

А1а

Рго

Беи

Туг

А1а

А1а

Рго

Рго

Беи

Зег

Меб

Азр

Азп

20

25

30

О1у

ТЬг

Азп

ТЬг

Беи

ТЬг

Уа1

О1п

Азп

Зег

Азп

А1а

Тгр

Уа1

О1и

Уа1

35

40

45

Зег

А1а

Зег

А1а

Беи

О1п

НФз

Азп

11е

Агд

ТЬг

Беи

О1п

А1а

О1и

Беи

50

55

60

А1а

О1у

Буз

Зег

Буз

Беи

Суз

А1а

Уа1

Беи

Буз

А1а

Азр

А1а

Туг

О1у

65

70

75

80

НФз

О1у

11е

О1у

Беи

Уа1

Меб

Рго

Зег

11е

11е

А1а

О1п

О1у

Уа1

Рго

85

90

95

Суз

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Зег

Азп

О1и

О1и

А1а

Агд

Уа1

Уа1

Агд

А1а

Зег

100

105

110

О1у

РЬе

ТЬг

О1у

О1п

Беи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Беи

А1а

Зег

Беи

Зег

О1и

115

120

125

Беи

О1и

Азр

О1у

Беи

О1п

Туг

Азр

Меб

О1и

О1и

Беи

Уа1

О1у

Зег

А1а

130

135

140

О1и

РЬе

А1а

Агд

О1п

А1а

Азр

А1а

11е

А1а

А1а

Агд

НФз

О1у

Буз

ТЬг

145

150

155

160

Беи

Агд

11е

НФз

Меб

А1а

Беи

Азп

Зег

Зег

О1у

Меб

Зег

Агд

Азп

О1у

165 170 175

- 409

Уа1

О1и Меб

А1а 180

ТЬг Тгр

Бег

О1у

Агд О1у О1и А1а Ьеи О1п

11е

ТЬг

185

190

Азр

О1п

Ьуз

НФз

Ьеи

Ьуз

Беи

Уа1

А1а

Беи

Меб

ТЬг

НФз

РЬе

А1а

Уа1

195

200

205

О1и

Азр

Буз

Азр

Азр

Уа1

Агд

Буз

О1у

Беи

А1а

А1а

РЬе

Азп

О1и

О1п

210

215

220

ТЬг

Азр

Тгр

Ьеи

11е

Ьуз

НФз

А1а

Агд

Ьеи

Азр

Агд

Бег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

225

230

235

240

Ьеи

НФз

А1а

А1а

Азп

Бег

РЬе

А1а

ТЬг

Ьеи

О1и

Уа1

Рго

О1и

А1а

Агд

245

250

255

Беи

Азр

Меб

Уа1

Агд

ТЬг

О1у

О1у

А1а

Беи

РЬе

О1у

Азр

ТЬг

Уа1

Рго

260

265

270

А1а

Агд

ТЬг

О1и

Туг

Буз

Агд

А1а

Меб

О1п

РЬе

Буз

Бег

НФз

Уа1

А1а

275

280

285

А1а

Уа1

НФз

Бег

Туг

Рго

А1а

О1у

Азп

ТЬг

Уа1

О1у

Туг

Азр

Агд

ТЬг

290

295

300

РЬе

ТЬг

Беи

А1а

Агд

Азр

Бег

Агд

Ьеи

А1а

Азп

11е

ТЬг

Уа1

О1у

Туг

305

310

315

320

Бег

Азр

О1у

Туг

Агд

Агд

Уа1

РЬе

ТЬг

Азп

Ьуз

О1у

НФз

Уа1

Беи

11е

325

330

335

Азп

О1у

НФз

Агд

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

О1у

Буз

Уа1

Бег

Меб

Азп

ТЬг

Беи

340

345

350

Меб

Уа1

Азр

Уа1

ТЬг

Азр

РЬе

Рго

Азр

Уа1

Ьуз

О1у

О1у

Азп

О1и

Уа1

355

360

365

Уа1

Ьеи

РЬе

О1у

Буз

О1п

А1а

О1у

О1у

О1и

11е

ТЬг

О1п

А1а

О1и

Меб

370

375

380

О1и

О1и

11е

Азп

О1у

А1а

Ьеи

Беи

А1а

Азр

Беи

Туг

ТЬг

Уа1

Тгр

О1у

385

390

395

400

Азп

Бег

Азп

Рго

Буз

11е

Ьеи

Уа1

Азр

405

<210> 380 <211> 1152 <212> ДНК <213> ОеоЬасШиз збеагобЬегторЫ1из <400> 380

абддасдадб	ббсассдсда	басдбдддсд	даадбддабб	бддасдссаб	ббасдасааб	60
дбддадаабб	бдсдссдббб	дсбдссддас	дасасдсаса	ббабддсддб	сдбдааддсд	120
аасдссбабд	дасабдддда	бдбдсаддбд	дсааддасад	сдсбсдаадс	дддддссбсс	180
сдссбддсдд	ббдссббббб	ддабдаддсд	сбсдсбббаа	дддааааадд	аабсдаадсд	240
ссдаббсбад	ббсбсддддс	ббсссдбсса	дсбдабдсдд	сдсбддссдс	ссадсадсдс	300

- 410 029538

аббдсссбда	ссдбдббссд	сбссдасбдд	ббддаадаад	сдбссдсссб	ббасадсддс	360
ссббббссба	ббсабббсса	бббдаааабд	дасассддса	бдддасддсб	бддадбдааа	420
дасдаддаад	адасдааасд	аабсдбадсд	сбдаббдадс	дссабссдса	ббббдбдсбб	480
дааддддбдб	асасдсаббб	бдсдасбдсд	дабдаддбда	асассдабба	бббббссбаб	540
садбабассс	дббббббдса	сабдсбсдаа	бддсбдссдб	сдсдсссдсс	дсбсдбссаб	600
бдсдссааса	дсдсадсдбс	дсбссдбббс	ссбдассдда	сдббсаабаб	ддбссдсббс	660
ддсаббдсса	бдбабдддсб	бдссссдбсд	сссддсабса	адссдсбдсб	дссдбабсса	720
ббаааадаад	саббббсдсб	ссабадссдс	сбсдбасасд	бсаааааасб	дсаассаддс	780
дааааддбда	дсбабддбдс	дасдбасасб	дсдсадасдд	аддадбддаб	сдддасдабб	840
ссдабсддсб	абдсддасдд	сбддсбссдс	сдссбдсадс	асбббсабдб	ссббдббдас	900
ддасаааадд	сдссдаббдб	сддссдсабб	бдсабддасс	адбдсабдаб	ссдссбдссб	960
ддбссдсбдс	сддбсддсас	дааддбдаса	сбдаббддбс	дссаадддда	сдаддбаабб	1020
бссаббдабд	абдбсдсбсд	ссабббддаа	асдабсаасб	асдаадбдсс	ббдсасдабс	1080
адббабсдад	бдссссдбаб	ббббббссдс	сабаадсдба	баабддаадб	дадааасдсс	1140
дббддссдсд	да					1152

<210> 381 <211> 384 <212> БЕЛОК <213> ОеоЬасШиз збеагобЬегторЫ1из

<400> 381

Меб

Азр

О1и

РЬе

Нбз

Агд

Азр

ТЬг

Тгр

А1а

О1и

Уа1

Азр

Ьеи

Азр

А1а

1

5

10

15

11е

Туг

Азр

Азп

Уа1

О1и

Азп

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

Ьеи

Рго

Азр

Азр

ТЬг

20

25

30

Нбз

11е

Меб

А1а

Уа1

Уа1

Ьуз

А1а

Азп

А1а

Туг

О1у

Нбз

О1у

Азр

Уа1

35

40

45

О1п

Уа1

А1а

Агд

ТЬг

А1а

Беи

О1и

А1а

О1у

А1а

Зег

Агд

Ьеи

А1а

Уа1

50

55

60

А1а

РЬе

Беи

Азр

О1и

А1а

Беи

А1а

Беи

Агд

О1и

Буз

О1у

11е

О1и

А1а

65

70

75

80

Рго

11е

Беи

Уа1

Беи

О1у

А1а

Зег

Агд

Рго

А1а

Азр

А1а

А1а

Беи

А1а

85

90

95

А1а

О1п

О1п

Агд

11е

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

РЬе

Агд

Зег

Азр

Тгр

Беи

О1и

100

105

110

О1и

А1а

Зег

А1а

Ьеи

Туг

Зег

О1у

Рго

РЬе

Рго

11е

Нбз

РЬе

Нбз

Ьеи

115

120

125

Ьуз

Меб

Азр

ТЬг

О1у

Меб

О1у

Агд

Беи

О1у

Уа1

Буз

Азр

О1и

О1и

О1и

- 411

130 135 140

ТЬг 145

Ьуз

Агд

11е

Уа1

А1а 150

Ьеи

11е

О1и

Агд

Нтз 155

Рго

Нтз

РЬе

Уа1

Ьеи 160

О1и

О1у

Уа1

Туг

ТЬг

Нтз

РЬе

А1а

ТЬг

А1а

Азр

О1и

Уа1

Азп

ТЬг

Азр

165

170

175

Туг

РЬе

Зег

Туг

О1п

Туг

ТЬг

Агд

РЬе

Ьеи

Нтз

Меб

Ьеи

О1и

Тгр

Ьеи

180

185

190

Рго

Зег

Агд

Рго

Рго

Ьеи

Уа1

Нтз

Суз

А1а

Азп

Зег

А1а

А1а

Зег

Ьеи

195

200

205

Агд

РЬе

Рго

Азр

Агд

ТЬг

РЬе

Азп

Меб

Уа1

Агд

РЬе

О1у

11е

А1а

Меб

210

215

220

Туг

О1у

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Рго

О1у

11е

Ьуз

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

Туг

Рго

225

230

235

240

Ьеи

Ьуз

О1и

А1а

РЬе

Зег

Ьеи

Нтз

Зег

Агд

Ьеи

Уа1

Нтз

Уа1

Ьуз

Ьуз

245

250

255

Ьеи

О1п

Рго

О1у

О1и

Ьуз

Уа1

Зег

Туг

О1у

А1а

ТЬг

Туг

ТЬг

А1а

О1п

260

265

270

ТЬг

О1и

О1и

Тгр

11е

О1у

ТЬг

11е

Рго

11е

О1у

Туг

А1а

Азр

О1у

Тгр

275

280

285

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

О1п

Нтз

РЬе

Нтз

Уа1

Ьеи

Уа1

Азр

О1у

О1п

Ьуз

А1а

290

295

300

Рго

11е

Уа1

О1у

Агд

11е

Суз

Меб

Азр

О1п

Суз

Меб

11е

Агд

Ьеи

Рго

305

310

315

320

О1у

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

11е

О1у

Агд

О1п

О1у

325

330

335

Азр

О1и

Уа1

11е

Зег

11е

Азр

Азр

Уа1

А1а

Агд

Нтз

Ьеи

О1и

ТЬг

11е

340

345

350

Азп

Туг

О1и

Уа1

Рго

Суз

ТЬг

11е

Зег

Туг

Агд

Уа1

Рго

Агд

11е

РЬе

355

360

365

РЬе

Агд

Нтз

Ьуз

Агд

11е

Меб

О1и

Уа1

Агд

Азп

А1а

Уа1

О1у

Агд

О1у

370 375 380 <210> 382 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутагенный праймер <400> 382 дссабббдда аасдабсаас дсддаадбдс сббдсасдаб сад <210> 383 <211> 30

- 412 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 383 дабабассаб ддсабасбса ббабддаабд 30 <210> 384 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 384 дббабсддаб ссббаддсаб бааббдаааб бд 32 <210> 385 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 385 даддадсбсд адбсадасдб абббсадбсс бббббс 36 <210> 386 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 386 адаадасаба бдабббабса дссддддас 29 <210> 387 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 387 адаадасаба бдддбдбсдб сдбссаааас 30 <210> 388 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 413 029538 <220>

<223> Праймер <400> 388 абаабаддаб ссббадасаб абббдаддсс с 31 <210> 389 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 389 абаабасаба бдаадссддб ддбддбдс 28 <210> 390 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 390 адаададдаб ссббадасаб аддбдадссс с 31 <210> 391 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 391 абаабассаб дддбдбсдбд дбссад 26 <210> 392 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 392 адаададдаб ссббадасаб абббсаддсс сс 32 <210> 393 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 393

- 414 029538 дсддаасаба бдбббдадаа саббассдсс 30 <210> 394 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 394 абаассддаб ссббасадса сбдссасааб сд 32 <210> 395 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 395 сдсбсббабд дббсддбббд сббдддббдс бсассс 36 <210> 396 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 396 дддбдадсаа сссаадсббб ссдаассаба ададсд 36 <210> 397 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 397 саааааабас садсдббаад ддадбдбддд бдадсаасс 39 <210> 398 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 398 саббассдсс дсбасбдссд асссдаббс 29

- 415 029538 <210> 399 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 399 сассаааааЕ ЕассЕсддсд ЕадасддсаЕ сссЕдааЕЕ 39 <210> 400 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 400

ЕдаЕдсддаа ааЕсасдсЕс ЕЕдасЕЕсда Едсас 35 <210> 401 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 401 дсддсдссаЕ ддааааЕдаЕ ссдаЕЕддЕс ЕааЕд 35 <210> 402 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 402 дсддсддЕсд асдсааЕЕас ааЕЕдЕдЕЕЕ дЕс 33 <210> 403 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 403 дсддсдссаЕ ддаЕдЕаЕдЕ аЕааЕЕЕЕаЕ ЕЕад 34

<210>	404
<211>	36
<212>	ДНК

- 416 029538 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 404 дсддсддЕсд асаааЕЕЕса ЕЕаЕЕсаЕЕс ЕааЕЕЕ 36 <210> 405 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 405 ддссддсаЕа ЕдЕсдаЕссЕ ЕаасдасЕас ааасдЕ 36 <210> 406 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 406 ддааддсЕсд адЕсаЕдаЕЕ ддЕЕЕссада саааЕЕ 36 <210> 407 <211> 27 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая сигнальная последовательность <400> 407

МеЕ Зег 11е Уа1 Уа1 ТЬг Ьуз 11е О1и Агд А1а О1у А1а А1а А1а Уа1

5 10 15

А1а А1а Беи Агд ТЬг Зег О1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 20 25 <210> 408 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 408 аЕааЕасаЕа ЕдсссЕЕсЕс ссдЕассс 28

- 417 029538 <210> 409 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 409

дсддсдддаб ссббасбдаб сбббсаддаб б <210> 410 <211> 1230 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетическая аргининрацемаза РзеиЭотопаз баебго1епз	31
<400> 410 абдсссббсб	сссдбасссб	дсбсдсссбб	бсссббддса	бддсаббдсб	дсаааасссд	60
дссбббдсбд	сдссассссб	дбсдабдасс	дасддсдбад	сбсаадбдаа	басссаддас	120
адсаабдссб	дддбсдаааб	саабааадсс	дсдббсдадс	асаасабасд	дасбсбдсаа	180
ассдсссбсд	ссддсаадбс	дсадабсбдс	дссдбасбса	аддсддабдс	сбабддссас	240
ддбабсддсб	бдббдабдсс	сбсддбдабс	дссабдддбд	ббсссбдбдб	сддбдбсдсс	300
адсаасдаад	аадсссдсдб	сдбдсдсдад	адсддбббса	адддбсаасб	дабасдсдбд	360
сдсассдсбд	сссбдадсда	асбддаадсб	дсасбдссдб	асаасабдда	ададсбддбд	420
ддсаассбдд	асббсдсддб	сааддссадс	сбдаббдссд	аддабсасдд	бсдсссдсбд	480
дбддбдсасс	бдддбсбдаа	ббссадсддс	абдадссдба	асддадбдда	сабдассасс	540
дсбсадддсс	дбсдбдабдс	ддбадсбабс	ассааддбдс	сааассбдда	адбдсдддсд	600
абсабдассс	асббсдсддб	сдаадабдсб	дссдасдбдс	дбдссдддсб	сааддссббс	660
аабсадсаад	сссаабддсб	дабдаасдбд	дсссадсббд	абсдсадсаа	дабсасссбд	720
сасдсддсса	асбсдббсдс	сасасбддад	дбдсссдааб	сдсабсбдда	сабддбссдс	780
сссддсддсд	сдсбдббсдд	сдасассдба	ссдбсссаса	ссдадбасаа	дсдддбсабд	840
садббсаадб	сссасдбддс	дбсддбсаас	адсбасссса	адддсаасас	сдбсддббаб	900
дассдсасдб	асасссбддд	ссдсдасбсд	сддсбддсса	асабсассдб	сддсбасбсб	960
дасддсбасс	дссдсдсдбб	бассаабааа	дддаббдбдс	бдабсаасдд	ссабсдсдбд	1020
ссадбддбдд	дсааадбсбс	дабдаасасс	сбдабддбдд	асдбсасбда	сдсдссддаб	1080
дбдаааадсд	дсдабдаадб	ддбдсбдббс	дддсассадд	дсааддссда	даббасссад	1140
дсбдадабсд	аадасабсаа	сддбдсасбд	сббдсддабс	бдбабассдб	дбддддсааб	1200
бссаасссба	ааабссбдаа	адабсадбаа				1230

<210> 411

- 418 029538 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 411 басссаддсб дадабддаад асабсаасд 29 <210> 412 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 412 дссадсаасд агдагдстсд сдб 23 <210> 413 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 413 бддссзбкда бсадсаса 18 <210> 414 <211> 716 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Продукт ПЦР А.сачЦае <400> 414

дссадсаасд	агдагдстсд	сдббдсссдс	дадаадддсб	бсдааддбсд	ссбдабдсдд	60
дбасдбдссд	ссассссдда	бдаадбддад	саддсссбдс	ссбасаадсб	ддаддадсбс	120
абсддсадсс	бддададсдс	сааддддабс	дссдасабсд	сссадсдсса	бсасассаас	180
абсссддбдс	асабсддссб	даасбссдсс	ддсабдадсс	дсаасддсаб	сдабсбдсдс	240
саддасдабд	ссааддссда	бдсссбддсс	абдсбсаадс	бсааддддаб	сассссддбс	300
ддсабсабда	сссасббссс	ддбддаддад	ааададдасд	бсаадсбддд	дсбддсссад	360
ббсаадсбдд	асбассадбд	дсбсабсдас	дссддсаадс	бддабсдсад	саадсбсасс	420
абссасдссд	ссаасбссбб	сдссасссбд	даадбассдд	аадссбасбб	бдасабддбд	480
сдсссдддсд	дсабсабсба	бддсдасасс	аббсссбссб	асассдадба	саадааддбд	540
абддсдббса	адасссаддб	сдссбссдбс	аассасбасс	сддсдддсаа	сассдбсддс	600

- 419 029538 бабдассдса ссббсасссб саадсдсдас бсссбдсбдд ссаассбдсс дабдддсбас бссдасддсб ассдссдсдс сабдадсаас ааддссбабд бдсбдабста зддсса

660

716 <210> 415 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Аеготопаз сачФае <220>

<221> М1БС_РЕАТиКЕ <222> (237)..(237) <223> Хаа может представлять собой РЬе, О1п, Азп или Ьуз <400> 415

А1а 1

Бег

Азп

О1и

О1и 5

А1а Агд

Уа1

А1а

Агд 10

О1и

Буз

О1у РЬе

О1и 15

О1у

Агд

Ьеи

Меб

Агд

Уа1

Агд

А1а

А1а

ТЬг

Рго

Азр

О1и

Уа1

О1и

О1п

А1а

20

25

30

Ьеи

Рго

Туг

Ьуз

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

11е

О1у

Бег

Беи

О1и

Бег

А1а

Буз

35

40

45

О1у

11е

А1а

Азр

11е

А1а

О1п

Агд

НФз

НФз

ТЬг

Азп

11е

Рго

Уа1

НФз

50

55

60

11е

О1у

Ьеи

Азп

Бег

А1а

О1у

Меб

Бег

Агд

Азп

О1у

11е

Азр

Беи

Агд

65

70

75

80

О1п

Азр

Азр

А1а

Ьуз

А1а

Азр

А1а

Ьеи

А1а

Меб

Ьеи

Ьуз

Беи

Ьуз

О1у

85

90

95

11е

ТЬг

Рго

Уа1

О1у

11е

Меб

ТЬг

НФз

РЬе

Рго

Уа1

О1и

О1и

Ьуз

О1и

100

105

110

Азр

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1у

Ьеи

А1а

О1п

РЬе

Ьуз

Беи

Азр

Туг

О1п

Тгр

Ьеи

115

120

125

11е

Азр

А1а

О1у

Ьуз

Беи

Азр

Агд

Бег

Буз

Ьеи

ТЬг

11е

НФз

А1а

А1а

130

135

140

Азп

Бег

РЬе

А1а

ТЬг

Ьеи

О1и

Уа1

Рго

О1и

А1а

Туг

РЬе

Азр

Меб

Уа1

145

150

155

160

Агд

Рго

О1у

О1у

11е

11е

Туг

О1у

Азр

ТЬг

11е

Рго

Бег

Туг

ТЬг

О1и

165

170

175

Туг

Ьуз

Ьуз

Уа1

Меб

А1а

РЬе

Буз

ТЬг

О1п

Уа1

А1а

Бег

Уа1

Азп

НФз

180

185

190

Туг

Рго

А1а

О1у

Азп

ТЬг

Уа1

О1у

Туг

Азр

Агд

ТЬг

РЬе

ТЬг

Беи

Ьуз

195

200

205

Агд

Азр

Бег

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

Беи

Рго

Меб

О1у

Туг

Бег

Азр

О1у

Туг

210

215

220

Агд

Агд

А1а

Меб

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Туг

Уа1

Ьеи

11е

Хаа

О1у

225 230 235

- 420

<210> 416 <211> 1227 <212> ДНК <213> Аеготопаз сачиае <400> 416 абдсасаада ааасасбдсб сдсдасссбд	абсбббддсс	бдсбддссдд	ссаддсадбс	60
дссдсссссб	абсбдссдсб	сдссдасдас	сассдсаасд	дбсаддааса	дассдссдсс	120
аасдссбддс	бддаадбдда	бсбсддсдсс	ббсдадсаса	асабссадас	ссбдаадааб	180
сдссбсддбд	асаадддссс	дсадабсбдс	дссабсабда	аддсддасдс	сбасддбсас	240
ддсабсдасс	бдсбддбссс	ббссдбддбс	ааддсаддса	бссссбдсаб	сддсабсдсс	300
адсаасдаад	аадсасдбдб	бдсссдсдад	аадддсббсд	ааддбсдссб	дабдсдддба	360
сдбдссдсса	ссссддабда	адбддадсад	дсссбдсссб	асаадсбдда	ддадсбсабс	420
ддсадссбдд	ададсдссаа	ддддабсдсс	дасабсдссс	адсдссабса	сассаасабс	480
ссддбдсаса	бсддссбдаа	сбссдссддс	абдадссдса	асддсабсда	бсбдсдссад	540
дасдабдсса	аддссдабдс	ссбддссабд	сбсаадсбса	аддддабсас	сссддбсддс	600
абсабдассс	асббсссддб	ддаддадааа	даддасдбса	адсбддддсб	ддсссадббс	660
аадсбддасб	ассадбддсб	сабсдасдсс	ддсаадсбдд	абсдсадсаа	дсбсассабс	720
сасдссдсса	асбссббсдс	сасссбддаа	дбассддаад	ссбасбббда	сабддбдсдс	780
ссдддсддса	бсабсбабдд	сдасассабб	сссбссбаса	ссдадбасаа	дааддбдабд	840
дсдббсаада	сссаддбсдс	сбссдбсаас	сасбасссдд	сдддсаасас	сдбсддсбаб	900
дассдсассб	бсасссбсаа	дсдсдасбсс	сбдсбддсса	ассбдссдаб	дддсбасбсс	960
дасддсбасс	дссдсдссаб	дадсаасаад	дссбабдбдс	бдабссабдд	ссадааддсс	1020
сссдбсдбдд	дсаадасббс	сабдаасасс	ассабддбдд	асдбсассда	сабсаадддд	1080
абсааасссд	дбдасдаддб	ддбссбдббс	ддасдссадд	дбдабдссда	ддбдааасаа	1140
бсбдабсбдд	аддадбасаа	сддбдсссбс	ббддсддаса	бдбасассдб	сбддддсбаб	1200
ассаасссса	адаадабсаа	дсдсбаа				1227

<210> 417 <211> 408 <212> БЕЛОК <213> Аеготопаз сачиае <400> 417

Меб 1

Н1з

Ьуз

Ьуз

ТЬг 5

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Ьеи 10

11е

РЬе

О1у

Ьеи

Ьеи 15

А1а

О1у

О1п

А1а

Уа1

А1а

А1а

Рго

Туг

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Азр

Азр

Нтз

Агд

25 30

- 421 029538

Азп О1у О1у А1а 50

О1п О1и О1п

ТЬг А1а

А1а Азп А1а Тгр 40 О1п ТЬг Ьеи Ьуз

Ьеи О1и Уа1 45 Азп Агд Ьеи

Азр О1у О1у Рго 95

Ьеи Азр Н1з 80 Суз

35 РЬе О1и Рго О1п

Н1з 11е Ьеи 85

Азп Суз 70 Уа1

11е 55 А1а Рго

60

Туг 11е

Ьуз 65 О1у

О1у 11е

11е МеЕ

Ьуз Уа1 90

А1а 75 Ьуз

Азр А1а

А1а О1у

Азр

Ьеи

Зег

Уа1

11е

О1у

11е

А1а

Зег

Азп

О1и

О1и

А1а

Агд

Уа1

А1а

Агд

О1и

Ьуз

О1у

100

105

110

РЬе

О1и

О1у

Агд

Ьеи

МеЕ

Агд

Уа1

Агд

А1а

А1а

ТЬг

Рго

Азр

О1и

Уа1

115

120

125

О1и

О1п

А1а

Ьеи

Рго

Туг

Ьуз

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

11е

О1у

Зег

Ьеи

О1и

130

135

140

Зег

А1а

Ьуз

О1у

11е

А1а

Азр

11е

А1а

О1п

Агд

Н1з

Н1з

ТЬг

Азп

11е

145

150

155

160

Рго

Уа1

Н1з

11е

О1у

Ьеи

Азп

Зег

А1а

О1у

МеЕ

Зег

Агд

Азп

О1у

11е

165

170

175

Азр

Ьеи

Агд

О1п

Азр

Азр

А1а

Ьуз

А1а

Азр

А1а

Ьеи

А1а

МеЕ

Ьеи

Ьуз

180

185

190

Ьеи

Ьуз

О1у

11е

ТЬг

Рго

Уа1

О1у

11е

МеЕ

ТЬг

Н1з

РЬе

Рго

Уа1

О1и

195

200

205

О1и

Ьуз

О1и

Азр

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1у

Ьеи

А1а

О1п

РЬе

Ьуз

Ьеи

Азр

Туг

210

215

220

О1п

Тгр

Ьеи

11е

Азр

А1а

О1у

Ьуз

Ьеи

Азр

Агд

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

11е

225

230

235

240

Н1з

А1а

А1а

Азп

Зег

РЬе

А1а

ТЬг

Ьеи

О1и

Уа1

Рго

О1и

А1а

Туг

РЬе

245

250

255

Азр

МеЕ

Уа1

Агд

Рго

О1у

О1у

11е

11е

Туг

О1у

Азр

ТЬг

11е

Рго

Зег

260

265

270

Туг

ТЬг

О1и

Туг

Ьуз

Ьуз

Уа1

МеЕ

А1а

РЬе

Ьуз

ТЬг

О1п

Уа1

А1а

Зег

275

280

285

Уа1

Азп

Н1з

Туг

Рго

А1а

О1у

Азп

ТЬг

Уа1

О1у

Туг

Азр

Агд

ТЬг

РЬе

290

295

300

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Агд

Азр

Зег

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

Ьеи

Рго

МеЕ

О1у

Туг

Зег

305

310

315

320

Азр

О1у

Туг

Агд

Агд

А1а

МеЕ

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Туг

Уа1

Ьеи

11е

Н1з

325

330

335

О1у

О1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

Уа1

О1у

Ьуз

ТЬг

Зег

МеЕ

Азп

ТЬг

ТЬг

МеЕ

340

345

350

Уа1

Азр

Уа1

ТЬг

Азр

11е

Ьуз

О1у

11е

Ьуз

Рго

О1у

Азр

О1и

Уа1

Уа1

355

360

365

- 422

Ьеи

РНе 370

О1у

Агд

О1п

О1у

Азр 375

А1а

О1и

Уа1

Ьуз

О1п 380

Бег

Азр

Беи

О1и

О1и 385

Туг

Азп

О1у

А1а

Ьеи 390

Беи

А1а

Азр

МеЕ

Туг 395

ТНг

Уа1

Тгр

О1у

Туг 400

ТНг

Азп

Рго

Ьуз

Ьуз 405

11е

Ьуз

Агд

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:

   (a) нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности ЗЕО ГО N0: 27 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более нуклеотидов, которая кодирует полипептид альдолазы полной длины или фрагмент указанного полипептида, содержащие иммуногенный эпитоп и способные индуцировать синтез специфичных к альдолазе антител;

   (b) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с последовательностью, комплементарной последовательности, охарактеризованной в (а); или (c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид альдолазы полной длины, содержащий ЗЕО ГО N0: 28, или фрагмент указанного полипептида, обладающий активностью альдолазы;

   (й) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь) или (с), кодирующую полипептид альдолазы или его фрагмент, обладающие по меньшей мере одной консервативной аминокислотной заменой и сохраняющие активность альдолазы;

   (е) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с) или (й), кодирующую полипептид альдолазы, лишенный сигнальной последовательности;

   (£) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й) или (е), кодирующую полипептид альдолазы, дополнительно содержащий гетерологичную последовательность;

   (д) нуклеотидную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й), (е) или (£), где активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, активность альдолазы НМО и/или активность альдолазы КНО; или (й) нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, раскрытой в любом из (а), (Ь), (с), (й), (е), (£) и (д).
2. 2. Экспрессирующая кассета, вектор или носитель для клонирования, содержащие нуклеиновую кислоту по п.1, где носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, причем вирусный вектор может быть аденовирусным вектором, ретровирусным вектором или аденоассоциированным вирусным вектором, а искусственная хромосома представляет собой бактериальную искусственную хромосому (ВАС), образованный из бактериофага ΡΙ вектор (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).
3. 3. Трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1 или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования по п.2.
4. 4. Трансгенное, не относящееся к человеку животное, содержащее нуклеиновую кислоту по п.1, или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования по п.2, или трансформированную клетку по п.3.
5. 5. Трансгенные растение или часть растения, в частности семя, содержащие нуклеиновую кислоту по п.1, или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования по п.2, или трансформированную клетку по п.3.
6. 6. Выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид альдолазы, содержащий:

   (a) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ЗЕО ГО N0: 28 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков, причем указанный полипептид представляет собой полипептид альдолазы полной длины или фрагмент указанного полипептида, обладающий активностью альдолазы; или (b) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид или его фрагмент обладают иммуногенной активностью и способны индуцировать синтез антител, которые специфичны к альдолазе; или (c) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а) или (Ь), содержащую консервативную замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка, причем полипептид или его фрагмент сохраняют активность альдолазы;

   - 423 029538 (й) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь) или (с), лишенную сигнальной последовательности; или (е) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с) или (й), дополнительно содержащую гетерологичную последовательность; или (ί) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й) или (е), где активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, активность альдолазы НМС и/или активность альдолазы КНС; или (д) аминокислотную последовательность, раскрытую в (а), (Ь), (с), (й), (е) или (ί), где полипептид или его фрагмент содержат по меньшей мере один участок гликозилирования.
7. 7. Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфично связывается с полипептидом по п.6.
8. 8. Способ получения рекомбинантного полипептида альдолазы по п.6, включающий стадии:

   (a) получение нуклеиновой кислоты по п.1 и (b) обеспечение экспрессии нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, что приводит к получению рекомбинантного полипептида.
9. 9. Способ получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид альдолазы, включающий стадии:

   (a) получение матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по п.1; и (b) модификация, делеция или добавление одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их сочетание с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты, где вариант полипептида альдолазы является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия повышенной температуры, а также обладает повышенным гликозилированием по сравнению с альдолазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой.
10. 10. Способ по п.9, в котором на стадии (Ь) осуществляют модификацию кодонов в матричной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид альдолазы, путем замены первоначального кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (а), отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещаемый кодон.
11. 11. Способ образования углерод-углеродной связи, включающий следующие стадии:

    (a) получение полипептида по п.6;

    (b) получение донорного и акцепторного соединения и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид альдолаза образует углерод-углеродную связь.
12. 12. Способ по п.11, который является способом получения 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты, включающий следующие стадии:

    (a) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;

    (b) получение акцептора а-кетокислоты и пирувата или донора пирувата и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты.
13. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий применение Ό-аминотрансферазы.
14. 14. Способ по п.11, который является способом получения 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, включающий следующие стадии:

    (a) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;

    (b) получение донорного и акцепторного соединения и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 3,4-замещенного 2-кетоглутарата.
15. 15. Композиция, содержащая полипептид по п.6, где композиция выбрана из группы, состоящей из продукта питания, кормового продукта и напитка.
16. 16. Способ превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала в топливо, включающий приведение биомассы или лигноцеллюлозного материала в контакт с полипептидом по п.6 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, или с его фрагментом, сохраняющим активность альдолазы, где при необходимости биомассу или лигноцеллюлозный материал предварительно обрабатывают перед контактом с альдолазой, и где при необходимости перед контактом с альдолазой биомассу или лигноцеллюлозный материал приводят в контакт с ферментом, вызывающим деградацию целлюлозы и/или гемицеллюлозы.
17. 17. Способ по п.16, где топливо представляет собой этанол, метанол, пропанол, бутанол или дизель.
18. 18. Композиция, содержащая полипептид по п.6, где композиция выбрана из группы, состоящей из фармацевтической композиции, добавки к продукту питания, добавки к кормовому продукту, добавки к напитку, теста или хлебного продукта.
19. 19. Композиция по п.18, которая приготовлена в виде таблетки, геля, пилюли, имплантата, аэрозоля, порошка, капсулы или в виде инкапсулированного состава.
20. 20. Топливо, содержащее полипептид по п.6, представляющее собой этанол, метанол, пропанол, бутанол или дизель.

    - 424 029538

    Ь-триптофан л 1_-аминотрансфераза или оксидаза [.-аминокислот ’ г индол-3-пируват пируват К-специфичная альдолаза

    К-альфа-кетокислота монатина (К-МР) β-аминотрансфераза или дегидрогеназа , _г ϋ-аминокислот

    Κ,Κ-монатин