EA019971B1 - Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения - Google Patents

Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA019971B1
EA019971B1 EA200870329A EA200870329A EA019971B1 EA 019971 B1 EA019971 B1 EA 019971B1 EA 200870329 A EA200870329 A EA 200870329A EA 200870329 A EA200870329 A EA 200870329A EA 019971 B1 EA019971 B1 EA 019971B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aldolase
polypeptide
nucleic acid
ler
activity
Prior art date
Application number
EA200870329A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870329A1 (ru
Inventor
Эллен Берк
Паула М. Хикс
Питер Лугинбул
Тоби Ричардсон
Дэвид П. Уэйнер
Лишань Чжао
Original Assignee
Верениум Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Верениум Корпорейшн filed Critical Верениум Корпорейшн
Publication of EA200870329A1 publication Critical patent/EA200870329A1/ru
Publication of EA019971B1 publication Critical patent/EA019971B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03016—4-Hydroxy-2-oxoglutarate aldolase (4.1.3.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03017—4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase (4.1.3.17)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG, к полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и к способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG, включая термостабильную или термоустойчивую активность, к полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, и к получению и применению этих полинуклеотидов и полипептидов. Полипептиды по изобретению можно применять во множестве фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных направлений. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам и к биосинтетическим каскадам, которые пригодны для получения R-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (R-MP) и определенных стереоизомеров монатина, таких как R,R- и S,R-монатин, и их солей, а также определенных стереоизомеров производных монатина, таких как R,R- и S,R-конфигурации, и их солей.

Description

Это изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. Более конкретно, это изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов.
Предпосылки изобретения
Монатин представляет собой сильный подсластитель, имеющий химическую формулу:
Монатин включает два хиральных центра, приводящих к четырем возможным стереоизомерным конфигурациям: конфигурация КД (Κ,Κ-стереоизомер или Κ,Κ-монатин); конфигурация 8,8 (8,8стереоизомер или 8,8-монатин); конфигурация К,8 (К,8-стереоизомер или К,8-монатин) и конфигурация 8,К (8,К-стереоизомер или 8,К-монатин). Как используют в настоящем документе, если нет иных указаний, термин монатин применяют для обозначения композиций, включающих все четыре стереоизомера монатина, композиций, включающих любое сочетание стереоизомеров монатина (таких как композиция, включающая только К,К- и 8,8-стереоизомеры монатина), а также единичной изомерной формы.
Для целей этого описания углеродный остов монатина будет пронумерован, как проиллюстрировано выше, при этом атом углерода, прямо ковалентно связанный с группой спирта, обозначен как атом углерода во 2-м положении, и атом углерода, прямо ковалентно связанный с аминогруппой, обозначен как атом углерода в 4-м положении. Таким образом, указание в настоящем документе на К,К-монатин, 8,8-монатин, К,8-монатин и 8,К-монатин означает: 2К,4К-монатин, 28,48-монатин, 2К,48-монатин и 28,4К-монатин, соответственно, если нет иных указаний.
Следует отметить, что в литературе углеродный остов монатина также нумеруют с использованием альтернативного способа, при этом атом углерода, присоединенный к группе спирта, представляет собой атом углерода в 4-м положении, и атом углерода, присоединенный к аминогруппе, представляет собой атом углерода во 2-м положении. Таким образом, например, указание на 28,4К-монатин в этом описании может означать то же, что указание на 2К,48-монатин в литературе с использованием альтернативного способа нумерации.
Более того, вследствие различных способов номенклатуры, монатин известен под рядом альтернативных химических названий, включая 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-аминоглутаровая кислота; 4амино-2-гидрокси-2-(1Н-индол-3-илметил)пентандиовая кислота; 4-гидрокси-4-(3-индолилметил)глутаминовая кислота и 3-(1-амино-1,3-дикарбокси-3-гидрокси-бут-4-ил)индол.
Некоторые изомерные формы монатина могут быть найдены в коре корней растения 8сЫегосЫ1оп 111С1£о1ш8, встречающегося в области Трансвааля Южной Африки. В патентных заявках США №№ 10/422366 (заявка '366) и 10/979821 (заявка '821), которые включены в настоящий документ в качестве ссылок, описаны, помимо прочего, полипептиды, каскады и микроорганизмы для получения монатина ΐη νΐΐίο и ιη νίνο.
Сущность изобретения
Это изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы (в дальнейшем в настоящем документе альдолазы), включая активность пируватальдолазы, такую как, но не ограничиваясь ими, активность альдолазы НМС и/или КИС, к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, и к способам получения и применения полипептидов и полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к композициям (таким как фармацевтические композиции, композиции топлива и добавки к топливу, продукты питания и добавки к продуктам питания, напитки и добавки к напиткам, корма и добавки к кормам, лекарственные средства и добавки к лекарственным средствам, диетические добавки), содержащим полипептиды или полинуклеотиды по этому изобретению. Эти композиции можно изготавливать в различных формах, таких как таблетки, гели, пилюли, имплантаты, жидкости, аэрозоли, пленки, мицеллы, порошки, продукты питания, кормовые гранулы, или в виде инкапсулированной формы любого типа.
В некоторых вариантах осуществления альдолазы и/или их композиции могут быть пригодны в фармацевтической, промышленной и/или сельскохозяйственной обстановке.
В некоторых вариантах осуществления альдолазы и/или их композиции могут быть пригодны для образования или расщепления углерод-углеродных связей.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые катализируют реакции образования углерод-углеродной связи между акцептором в виде альфа-кетокислоты и донором в виде пирувата или производного пирувата (см. схему реакции, ниже). В некоторых вариантах осуществления акцептор также может представлять собой кетон или альдегид. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые обладают активностью 4-гидрокси-2-оксоглутаратальдолазы (такой
- 1 019971 как 2-кето-4-гидроксиглутаратальдолаза, 2-оксо-4-гидроксиглутаратальдолаза, альдолаза КИО, ЕС
4.1.3.16) и катализируют следующую реакцию: 4-гидрокси-2-оксоглутарат <=> пируват + глиоксилат. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые обладают активностью альдолазы НМО (такой как 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутаратальдолаза, пируватальдолаза, гамма-метилгамма-гидрокси-альфа-кетоглутаровая альдолаза, 4-гидрокси-4-метил-2-кетоглутаратальдолаза, ЕС
4.1.3.17) и катализируют следующую реакцию: 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат <=> 2 пируват. Альдолаза НМО также действует на 4-гидрокси-4-метил-2-оксоадипат и 4-карбокси-4-гидрокси-2 оксогексадиоат.
Альдолаза
акцептор в виде пируват или а-кетокислоты, производное кетона или альдегида пирувата
К = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;
К2 = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;
К3 = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил, карбоновая кислота.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как, но не ограничиваясь этим, альдолаза НМО и/или КНО, которые облегчают продукцию 3,4замещенного 2-кетоглутарата. В одном варианте осуществления это изобретение относится к способу получения 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, включающему: (а) предоставление полипептида, обладающего активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или альдолазы КМО; (Ь) предоставление донорного и акцепторного соединения; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, где необязательно донор и акцептор представляют собой пируват или донор пирувата и акцептор α-кетокислоты, кетон и/или альде гид.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые облегчают продукцию К-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (К-МР), предшественника монатина. В некоторых вариантах осуществления альдолазу пирувата, такую как альдолаза НМО и/или КНО, можно использовать совместно с Ό-аминотрансферазой для получения 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты или ее производного. 4-замещенную Ό-глутаминовую кислоту и/или ее производное можно применять в качестве антибиотиков, поскольку было выявлено, что эти соединения ингибируют бактериальную глутаматрацемазу (^О 0214261А3). В одном варианте осуществления это изобретение относится к способу получения 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты, включающему: (а) предоставление полипептида, обладающего активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или альдолазы КМО; (Ь) предоставление акцептора αкетокислоты и пирувата или донора пирувата; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты, где необязательно полипептид обладает активностью пируватальдолазы, альдолазы НМО и/или альдолазы КНО, и где необязательно способ дополнительно включает применение Ό-аминотрансферазы.
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая 8ЕО ΙΌ N0:1, 8ЕО ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:5, 8Е0 ΙΌ N0:7, 8Е0 ΙΌ N0:9, 8Е0 ΙΌ N0:11, 8Е0 ΙΌ N0:13, 8Е0 ΙΌ N0:15, 8Е0 ΙΌ N0:17, 8Е0 ΙΌ N0:19, 8Е0 ΙΌ N0:21, 8Е0 ΙΌ N0:23, 8Е0 ΙΌ N0:25, 8Е0 ΙΌ N0:27, 8Е0 ΙΌ N0:29, 8Е0 ΙΌ N0:31, 8Е0 ΙΌ N0:33, 8Е0 ΙΌ N0:35, 8Е0 ΙΌ N0:37, 8Е0 ΙΌ N0:39, 8Е0 ΙΌ N0:41, 8Е0 ΙΌ N0:43, 8Е0 ΙΌ N0:45, 8Е0 ΙΌ N0:47, 8Е0 ΙΌ N0:49, 8Е0 ΙΌ N0:51, 8Е0 ΙΌ N0:53, 8Е0 ΙΌ N0:55, 8Е0 ΙΌ N0:57, 8Е0 ΙΌ N0:59, 8Е0 ΙΌ N0:61, 8Е0 ΙΌ N0:63, 8Е0 ΙΌ N0:65, 8Е0 ΙΌ N0:67, 8Е0 ΙΌ N0:69, 8Е0 ΙΌ N0:71, 8Е0 ΙΌ N0:73, 8Е0 ΙΌ N0:75, 8Е0 ΙΌ N0:77, 8Е0 ΙΌ N0:79, 8Е0 ΙΌ N0:81, 8Е0 ΙΌ N0:83, 8Е0 ΙΌ N0:85, 8Е0 ΙΌ N0:87, 8Е0 ΙΌ N0:89, 8Е0 ΙΌ N0:91, 8Е0 ΙΌ N0:93, 8Е0 ΙΌ N0:95, 8Е0 ΙΌ N0:97, 8Е0 ΙΌ N0:99, 8Е0 ΙΌ N0:101, 8Е0 ΙΌ N0:103, 8Е0 ΙΌ N0:105, 8Е0 ΙΌ N0:107, 8Е0 ΙΌ N0:109, 8Е0 ΙΌ N0:111, 8Е0 ΙΌ N0:113, 8Е0 ΙΌ N0:115, 8Е0 ΙΌ N0:117, 8Е0 ΙΌ
N0:119, 8Е0 ΙΌ N0:121, 8Е0 ΙΌ N0:123, 8Е0 ΙΌ N0:125, 8Е0 ΙΌ N0:127, 8Е0 ΙΌ N0:129, 8Е0 ΙΌ
N0:131, 8Е0 ΙΌ N0:133, 8Е0 ΙΌ N0:135, 8Е0 ΙΌ N0:137, 8Е0 ΙΌ N0:139, 8Е0 ΙΌ N0:141, 8Е0 ΙΌ
N0:143, 8Е0 ΙΌ N0:145, 8Е0 ΙΌ N0:147, 8Е0 ΙΌ N0:149, 8Е0 ΙΌ N0:151, 8Е0 ΙΌ N0:153, 8Е0 ΙΌ
N0:155, 8Е0 ΙΌ N0:157, 8Е0 ΙΌ N0:159, 8Е0 ΙΌ N0:161, 8Е0 ΙΌ N0:163, 8Е0 ΙΌ N0:165, 8Е0 ΙΌ
N0:167, 8Е0 ΙΌ N0:169, 8Е0 ΙΌ N0:171, 8Е0 ΙΌ N0:173, 8Е0 ΙΌ N0:175, 8Е0 ΙΌ N0:177, 8Е0 ΙΌ
- 2 019971
N0:179, 8ΕΟ ΙΌ N0:181, 8Ер ΙΌ N0:183, 8Ер ΙΌ N0:185, 8ΕΟ ΙΌ N0:187, 8ΕΟ ΙΌ N0:189, 8ΕΟ ΙΌ
N0:191, 8ΕΟ ΙΌ N0:193, 8ΕΟ ΙΌ N0:195, 8ΕΟ ΙΌ N0:197, 8ΕΟ ΙΌ N0:199, 8ΕΟ ΙΌ N0:201, 8ΕΟ ΙΌ
N0:203, 8ΕΟ ΙΌ N0:205, 8ΕΟ ΙΌ N0:207, 8ΕΟ ΙΌ N0:209, 8ΕΟ ΙΌ N0:211, 8ΕΟ ΙΌ N0:213, 8ΕΟ ΙΌ
N0:215, 8ΕΟ ΙΌ N0:217, 8ΕΟ ΙΌ N0:219, 8ΕΟ ΙΌ N0:221, 8ΕΟ ΙΌ N0:223, 8ΕΟ ΙΌ N0:225, 8ΕΟ ΙΌ
N0:227, 8ΕΟ ΙΌ N0:229, 8ΕΟ ΙΌ N0:231, 8ΕΟ ΙΌ N0:233, 8ΕΟ ΙΌ N0:235, 8ΕΟ ΙΌ N0:237, 8ΕΟ ΙΌ
N0:239, 8ΕΟ ΙΌ N0:241, 8ΕΟ ΙΌ N0:243, 8ΕΟ ΙΌ N0:245, 8ΕΟ ΙΌ N0:247, 8ΕΟ ΙΌ N0:249, 8ΕΟ ΙΌ
N0:251, 8ΕΟ ΙΌ N0:253, 8ΕΟ ΙΌ N0:255, 8ΕΟ ΙΌ N0:257, 8ΕΟ ΙΌ N0:259, 8ΕΟ ΙΌ N0:261, 8ΕΟ ΙΌ
N0:263, 8ΕΟ ΙΌ N0:265, 8ΕΟ ΙΌ N0:267, 8ΕΟ ΙΌ N0:269, 8ΕΟ ΙΌ N0:271, 8ΕΟ ΙΌ N0:273, 8ΕΟ ΙΌ
N0:275, 8ΕΟ ΙΌ N0:277, 8ΕΟ ΙΌ N0:279, 8ΕΟ ΙΌ N0:281, 8ΕΟ ΙΌ N0:283, 8ΕΟ ΙΌ N0:285, 8ΕΟ ΙΌ
N0:287, 8ΕΟ ΙΌ N0:289, 8ΕΟ ΙΌ N0:291, 8ΕΟ ΙΌ N0:293, 8ΕΟ ΙΌ N0:295, 8ΕΟ ΙΌ N0:297, 8ΕΟ ΙΌ
N0:299, 8ΕΟ ΙΌ N0:301, 8ΕΟ ΙΌ N0:303, 8ΕΟ ΙΌ N0:305, 8ΕΟ ΙΌ N0:307, 8ΕΟ ΙΌ N0:309, 8ΕΟ ΙΌ
N0:311, 8ΕΟ ΙΌ N0:313, 8ΕΟ ΙΌ N0:315, 8ΕΟ ΙΌ N0:317, 8ΕΟ ΙΌ N0:319, 8ΕΟ ΙΌ N0:321, 8ΕΟ ΙΌ
N0:323, 8ΕΟ ΙΌ N0:325, 8ΕΟ ΙΌ N0:327, 8ΕΟ ΙΌ N0:329, 8ΕΟ ΙΌ N0:331, 8ΕΟ ΙΌ N0:333, 8ΕΟ ΙΌ
N0:335, 8Ε0 ΙΌ N0:336, 8Ε0 ΙΌ N0:337 и 8Ε0 ΙΌ N0:338 на протяжении участка по меньшей мере из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 остатков или более.
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием.
В альтернативных вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот кодируют по меньшей мере один полипептид, способный образовывать антитело, которое может специфично связываться с полипептидом по этому изобретению, или эти нуклеиновые кислоты можно использовать в качестве зондов для идентификации или выделения кодирующих альдолазу нуклеиновых кислот, или для ингибирования экспрессии экспрессирующих альдолазу нуклеиновых кислот.
Нуклеиновые кислоты по этому изобретению также включают выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты по этому изобретению, такие как ферменты, включающие один или несколько полипептидов, имеющих последовательность, как указано в 8Ε0 ΙΌ N0:2, 8ΕΟ ΙΌ N0:4, 8ΕΟ ΙΌ N0:6, 8ΕΟ ΙΌ N0:8, 8ΕΟ ΙΌ N0:10, 8ΕΟ ΙΌ N0:12, 8ΕΟ ΙΌ N0:14, 8ΕΟ ΙΌ N0:16, 8ΕΟ ΙΌ N0:18, 8ΕΟ ΙΌ N0:20, 8ΕΟ ΙΌ N0:22, 8ΕΟ ΙΌ N0:24, 8ΕΟ ΙΌ N0:26, 8ΕΟ ΙΌ N0:28, 8ΕΟ ΙΌ N0:30, 8ΕΟ ΙΌ N0:32, 8ΕΟ ΙΌ N0:34, 8ΕΟ ΙΌ N0:36, 8ΕΟ ΙΌ N0:38, 8ΕΟ ΙΌ N0:40, 8ΕΟ ΙΌ N0:42, 8ΕΟ ΙΌ N0:44, 8ΕΟ ΙΌ N0:46, 8ΕΟ ΙΌ N0:48, 8ΕΟ ΙΌ N0:50, 8ΕΟ ΙΌ N0:52, 8ΕΟ ΙΌ N0:54, 8ΕΟ ΙΌ N0:56, 8ΕΟ ΙΌ N0:58, 8ΕΟ ΙΌ N0:60, 8ΕΟ ΙΌ N0:62, 8ΕΟ ΙΌ N0:64, 8ΕΟ ΙΌ N0:66, 8ΕΟ ΙΌ N0:68, 8ΕΟ ΙΌ N0:70, 8ΕΟ ΙΌ N0:72, 8ΕΟ ΙΌ N0:74, 8ΕΟ ΙΌ N0:76, 8ΕΟ ΙΌ N0:78, 8ΕΟ ΙΌ N0:80, 8ΕΟ ΙΌ N0:82, 8ΕΟ ΙΌ N0:84, 8ΕΟ ΙΌ N0:86, 8ΕΟ ΙΌ N0:88, 8ΕΟ ΙΌ N0:90, 8ΕΟ ΙΌ N0:92, 8ΕΟ ΙΌ N0:94, 8ΕΟ ΙΌ N0:96, 8ΕΟ ΙΌ N0:98, 8ΕΟ ΙΌ N0:100, 8ΕΟ ΙΌ N0:102, 8ΕΟ ΙΌ N0:104, 8ΕΟ ΙΌ N0:106, 8ΕΟ ΙΌ N0:108, 8ΕΟ ΙΌ N0:110, 8ΕΟ ΙΌ N0:112, 8ΕΟ ΙΌ N0:114, 8ΕΟ ΙΌ N0:116, 8ΕΟ ΙΌ N0:118, 8ΕΟ ΙΌ
N0:120, 8ΕΟ ΙΌ N0:122, 8ΕΟ ΙΌ N0:124, 8ΕΟ ΙΌ N0:126, 8ΕΟ ΙΌ N0:128, 8ΕΟ ΙΌ N0:130, 8ΕΟ ΙΌ
N0:132, 8ΕΟ ΙΌ N0:134, 8ΕΟ ΙΌ N0:136, 8ΕΟ ΙΌ N0:138, 8ΕΟ ΙΌ N0:140, 8ΕΟ ΙΌ N0:142, 8ΕΟ ΙΌ
N0:144, 8ΕΟ ΙΌ N0:146, 8ΕΟ ΙΌ N0:148, 8ΕΟ ΙΌ N0:150, 8ΕΟ ΙΌ N0:152, 8ΕΟ ΙΌ N0:154, 8ΕΟ ΙΌ
N0:156, 8ΕΟ ΙΌ N0:158, 8ΕΟ ΙΌ N0:160, 8ΕΟ ΙΌ N0:162, 8ΕΟ ΙΌ N0:164, 8ΕΟ ΙΌ N0:166, 8ΕΟ ΙΌ
N0:168, 8ΕΟ ΙΌ N0:170, 8ΕΟ ΙΌ N0:172, 8ΕΟ ΙΌ N0:174, 8ΕΟ ΙΌ N0:176, 8ΕΟ ΙΌ N0:178, 8ΕΟ ΙΌ
N0:180, 8ΕΟ ΙΌ N0:182, 8ΕΟ ΙΌ N0:184, 8ΕΟ ΙΌ N0:186, 8ΕΟ ΙΌ N0:188, 8ΕΟ ΙΌ N0:190, 8ΕΟ ΙΌ
N0:192, 8ΕΟ ΙΌ N0:194, 8ΕΟ ΙΌ N0:196, 8ΕΟ ΙΌ N0:198, 8ΕΟ ΙΌ N0:200, 8ΕΟ ΙΌ N0:202, 8ΕΟ ΙΌ
N0:204, 8ΕΟ ΙΌ N0:206, 8ΕΟ ΙΌ N0:208, 8ΕΟ ΙΌ N0:210, 8ΕΟ ΙΌ N0:212, 8ΕΟ ΙΌ N0:214, 8ΕΟ ΙΌ
N0:216, 8ΕΟ ΙΌ N0:218, 8ΕΟ ΙΌ N0:220, 8Ερ ΙΌ N0:222, 8Ερ ΙΌ N0:224, 8Ερ ΙΌ N0:226, 8Ερ ΙΌ
N0:228, 8Ερ ΙΌ N0:230, 8Ερ ΙΌ N0:232, 8Ερ ΙΌ N0:234, 8Ερ ΙΌ N0:236, 8Ερ ΙΌ N0:238, 8Ερ ΙΌ
N0:240, 8ΕΡ ΙΌ N0:242, 8Ερ ΙΌ N0:244, 8Ερ ΙΌ N0:246, 8Ερ ΙΌ N0:248, 8Ερ ΙΌ N0:250, 8Ερ ΙΌ
N0:252, 8Ερ ΙΌ N0:254, 8Ερ ΙΌ N0:256, 8Ερ ΙΌ N0:258, 8Ερ ΙΌ N0:260, 8Ερ ΙΌ N0:262, 8Ερ ΙΌ
N0:264, 8ΕΡ ΙΌ N0:266, 8Ερ ΙΌ N0:268, 8Ερ ΙΌ N0:270, 8Ερ ΙΌ N0:272, 8Ερ ΙΌ N0:274, 8Ερ ΙΌ
N0:276, 8ΕΡ ΙΌ N0:278, 8Ερ ΙΌ N0:280, 8Ερ ΙΌ N0:282, 8Ερ ΙΌ N0:284, 8Ερ ΙΌ N0:286, 8Ερ ΙΌ
N0:288, 8Ερ ΙΌ N0:290, 8Ερ ΙΌ N0:292, 8Ερ ΙΌ N0:294, 8Ερ ΙΌ N0:296, 8Ερ ΙΌ N0:298, 8Ερ ΙΌ
N0:300, 8ΕΡ ΙΌ N0:302, 8Ερ ΙΌ N0:304, 8Ερ ΙΌ N0:306, 8Ερ ΙΌ N0:308, 8Ερ ΙΌ N0:310, 8Ερ ΙΌ
N0:312, 8ΕΡ ΙΌ N0:314, 8Ερ ΙΌ N0:316, 8Ερ ΙΌ N0:318, 8Ερ ΙΌ N0:320, 8Ερ ΙΌ N0:322, N0:324, 8ΕΡ ΙΌ N0:326, 8Ερ ΙΌ N0:328, 8Ερ ΙΌ N0:330, 8Ερ ΙΌ N0:332 и 8Ερ ΙΌ N0:334, ее подпоследовательности, их варианты и их ферментативно активные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления полипептид обладает активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к кодирующим альдолазу нук- 3 019971 леиновым кислотам, таким как нуклеиновые кислоты, кодирующие пируватальдолазу, такую как альдолаза НМС и/или КНС, предпочтительно полученным из смешанных культур. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к образованию углерод-углеродной связи или расщеплению кодирующих фермент нуклеиновых кислот, выделенных из смешанных культур, содержащих полинуклеотиды по этому изобретению, такие как последовательность, обладающая по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, такой как 81Ю ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:5, 8Е0 ГО N0:7, 8Е0 ГО 8Е0 ГО N0:9, 8Е0 ГО N0:11, 8Е0 ГО N0:13, 8Е0 ГО N0:15, 8Е0 ГО N0:17, 8Е0 ГО N0:19, 8Е0 ГО N0:21, 8Е0 ГО N0:23, 8Е0 ГО N0:25, 8Е0 ГО N0:27, 8Е0 ГО N0:29, 8Е0 ГО N0:31, 8Е0 ГО N0:33, 8Е0 ГО N0:35, 8Е0 ГО N0:37, 8Е0 ГО N0:39, 8Е0 ГО N0:41, 8Е0 ГО N0:43, 8Е0 ГО N0:45, 8Е0 ГО N0:47, 8Е0 ГО N0:49, 8Е0 ГО N0:51, 8Е0 ГО N0:53, 8Е0 ГО N0:55, 8Е0 ГО N0:57, 8Е0 ГО N0:59, 8Е0 ГО N0:61, 8Е0 ГО N0:63, 8Е0 ГО N0:65, 8Е0 ГО N0:67, 8Е0 ГО N0:69, 8Е0 ГО N0:71, 8Е0 ГО N0:73, 8Е0 ГО N0:75, 8Е0 ГО N0:77, 8Е0 ГО N0:79, 8Е0 ГО N0:81, 8Е0 ГО N0:83, 8Е0 ГО N0:85, 8Е0 ГО N0:87, 8Е0 ГО N0:89, 8Е0 ГО N0:91, 8Е0 ГО N0:93, 8Е0 ГО N0:95, 8Е0 ГО N0:97, 8Е0 ГО N0:99, 8Е0 ГО N0:101, 8Е0 ГО N0:103, 8Е0 ГО N0:105, 8Е0 ГО N0:107, 8Е0 ГО N0:109, 8Е0 ГО N0:111, 8Е0 ГО N0:113, 8Е0 ГО
N0:115, 8Е0 ГО N0:117, 8Е0 ГО N0:119, 8Е0 ГО N0:121, 8Е0 ГО N0:123, 8Е0 ГО N0:125, 8Е0 ГО
N0:127, 8Е0 ГО N0:129, 8Е0 ГО N0:131, 8Е0 ГО N0:133, 8Е0 ГО N0:135, 8Е0 ГО N0:137, 8Е0 ГО
N0:139, 8Е0 ГО N0:141, 8Е0 ГО N0:143, 8Е0 ГО N0:145, 8Е0 ГО N0:147, 8Е0 ГО N0:149, 8Е0 ГО
N0:151, 8Е0 ГО N0:153, 8Е0 ГО N0:155, 8Е0 ГО N0:157, 8Е0 ГО N0:159, 8Е0 ГО N0:161, 8Е0 ГО
N0:163, 8Е0 ГО N0:165, 8Е0 ГО N0:167, 8Е0 ГО N0:169, 8Е0 ГО N0:171, 8Е0 ГО N0:173, 8Е0 ГО
N0:175, 8Е0 ГО N0:177, 8Е0 ГО N0:179, 8Е0 ГО N0:181, 8Е0 ГО N0:183, 8Е0 ГО N0:185, 8Е0 ГО
N0:187, 8Е0 ГО N0:189, 8Е0 ГО N0:191, 8Е0 ГО N0:193, 8Е0 ГО N0:195, 8Е0 ГО N0:197, 8Е0 ГО
N0:199, 8Е0 ГО N0:201, 8Е0 ГО N0:203, 8Е0 ГО N0:205, 8Е0 ГО N0:207, 8Е0 ГО N0:209, 8Е0 ГО
N0:211, 8Е0 ГО N0:213, 8Е0 ГО N0:215, 8Е0 ГО N0:217, 8Е0 ГО N0:219, 8Е0 ГО N0:221, 8Е0 ГО
N0:223, 8Е0 ГО N0:225, 8Е0 ГО N0:227, 8Е0 ГО N0:229, 8Е0 ГО N0:231, 8Е0 ГО N0:233, 8Е0 ГО
N0:235, 8Е0 ГО N0:237, 8Е0 ГО N0:239, 8Е0 ГО N0:241, 8Е0 ГО N0:243, 8Е0 ГО N0:245, 8Е0 ГО
N0:247, 8Е0 ГО N0:249, 8Е0 ГО N0:251, 8Е0 ГО N0:253, 8Е0 ГО N0:255, 8Е0 ГО N0:257, 8Е0 ГО
N0:259, 8Е0 ГО N0:261, 8Е0 ГО N0:263, 8Е0 ГО N0:265, 8Е0 ГО N0:267, 8Е0 ГО N0:269, 8Е0 ГО
N0:271, 8Е0 ГО N0:273, 8Е0 ГО N0:275, 8Е0 ГО N0:277, 8Е0 ГО N0:279, 8Е0 ГО N0:281, 8Е0 ГО
N0:283, 8Е0 ГО N0:285, 8Е0 ГО N0:287, 8Е0 ГО N0:289, 8Е0 ГО N0:291, 8Е0 ГО N0:293, 8Е0 ГО
N0:295, 8Е0 ГО N0:297, 8Е0 ГО N0:299, 8Е0 ГО N0:301, 8Е0 ГО N0:303, 8Е0 ГО N0:305, 8Е0 ГО
N0:307, 8Е0 ГО N0:309, 8Е0 ГО N0:311, 8Е0 ГО N0:313, 8Е0 ГО N0:315, 8Е0 ГО N0:317, 8Е0 ГО
N0:319, 8Е0 ГО N0:321, 8Е0 ГО N0:323, 8Е0 ГО N0:325, 8Е0 ГО N0:327, 8Е0 ГО N0:329, 8Е0 ГО
N0:331, 8Е0 ГО N0:333, 8Е0 ГО N0:335, 8Е0 ГО N0:336, 8Е0 ГО N0:337 и 8Е0 ГО N0:338 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент альдолазу, такой как фермент пируватальдолаза, фермент НМС и/или КНС, включая полинуклеотидные последовательности по этому изобретению и к кодируемым ими полипептидам, включая ферменты по этому изобретению, такие как полипептиды по этому изобретению, такие как 8Е0 ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:8, 8Е0 ГО N0:10, 8Е0 ГО N0:12, 8Е0 ГО N0:14, 8Е0 ГО N0:16, 8Е0 ГО N0:18, 8Е0 ГО N0:20, 8Е0 ГО N0:22, 8Е0 ГО N0:24, 8Е0 ГО N0:26, 8Е0 ГО N0:28, 8Е0 ГО N0:30, 8Е0 ГО N0:32, 8Е0 ГО N0:34, 8Е0 ГО N0:36, 8Е0 ГО N0:38, 8Е0 ГО N0:40, 8Е0 ГО N0:42, 8Е0 ГО N0:44, 8Е0 ГО N0:46, 8Е0 ГО N0:48, 8Е0 ГО N0:50, 8Е0 ГО N0:52, 8Е0 ГО N0:54, 8Е0 ГО N0:56, 8Е0 ГО N0:58, 8Е0 ГО N0:60, 8Е0 ГО N0:62, 8Е0 ГО N0:64, 8Е0 ГО N0:66, 8Е0 ГО N0:68, 8Е0 ГО N0:70, 8Е0 ГО N0:72, 8Е0 ГО N0:74, 8Е0 ГО N0:76, 8Е0 ГО N0:78, 8Е0 ГО N0:80, 8Е0 ГО N0:82, 8Е0 ГО N0:84, 8Е0 ГО N0:86, 8Е0 ГО N0:88, 8Е0 ГО N0:90, 8Е0 ГО N0:92, 8Е0 ГО N0:94, 8Е0 ГО N0:96, 8Е0 ГО N0:98, 8Е0 ГО N0:100, 8Е0 ГО N0:102, 8Е0 ГО N0:104, 8Е0 ГО N0:106, 8Е0 ГО N0:108, 8Е0 ГО N0:110, 8Е0 ГО N0:112, 8Е0 ГО N0:114, 8Е0 ГО N0:116, 8Е0 ГО N0:118, 8Е0 ГО N0:120, 8Е0 ГО N0:122, 8Е0 ГО N0:124, 8Е0 ГО N0:126, 8Е0 ГО N0:128, 8Е0 ГО N0:130, 8Е0 ГО N0:132, 8Е0 ГО N0:134, 8Е0 ГО N0:136, 8Е0 ГО
N0:138, 8Е0 ГО N0:140, 8Е0 ГО N0:142, 8Е0 ГО N0:144, 8Е0 ГО N0:146, 8Е0 ГО N0:148, 8Е0 ГО
N0:150, 8Е0 ГО N0:152, 8Е0 ГО N0:154, 8Е0 ГО N0:156, 8Е0 ГО N0:158, 8Е0 ГО N0:160, 8Е0 ГО
N0:162, 8Е0 ГО N0:164, 8Е0 ГО N0:166, 8Е0 ГО N0:168, 8Е0 ГО N0:170, 8Е0 ГО N0:172, 8Е0 ГО
N0:174, 8Е0 ГО N0:176, 8Е0 ГО N0:178, 8Е0 ГО N0:180, 8Е0 ГО N0:182, 8Е0 ГО N0:184, 8Е0 ГО
N0:186, 8Е0 ГО N0:188, 8Е0 ГО N0:190, 8Е0 ГО N0:192, 8Е0 ГО N0:194, 8Е0 ГО N0:196, 8Е0 ГО
N0:198, 8Е0 ГО N0:200, 8Е0 ГО N0:202, 8Е0 ГО N0:204, 8Е0 ГО N0:206, 8Е0 ГО N0:208, 8Е0 ГО
N0:210, 8Е0 ГО N0:212, 8Е0 ГО N0:214, 8Е0 ГО N0:216, 8Е0 ГО N0:218, 8Е0 ГО N0:220, 8Е0 ГО
N0:222, 8Е0 ГО N0:224, 8Е0 ГО N0:226, 8Е0 ГО N0:228, 8Е0 ГО N0:230, 8Е0 ГО N0:232, 8Е0 ГО
N0:234, 8Е0 ГО N0:236, 8Е0 ГО N0:238, 8Е0 ГО N0:240, 8Е0 ГО N0:242, 8Е0 ГО N0:244, 8Е0 ГО
N0:246, 8Е0 ГО N0:248, 8Е0 ГО N0:250, 8Е0 ГО N0:252, 8Е0 ГО N0:254, 8Е0 ГО N0:256, 8Е0 ГО
- 4 019971
N0:258, 8Ер ΙΌ N0:260, 51 Τ) ΙΌ N0:262, 51 Τ) ΙΌ N0:264, 51 Τ) ΙΌ N0:266, 5ЕО ΙΌ N0:268, 5ЕО ΙΌ
N0:270, 5ЕО ΙΌ N0:272, 5ЕО ΙΌ N0:274, 5ЕО ΙΌ N0:276, 5ЕО ΙΌ N0:278, 5ЕО ΙΌ N0:280, 5ЕО ΙΌ
N0:282, 5ЕО ΙΌ N0:284, 5ЕО ΙΌ N0:286, 5ЕО ΙΌ N0:288, 5ЕО ΙΌ N0:290, 5ЕО ΙΌ N0:292, 5ЕО ΙΌ
N0:294, 5ЕО ΙΌ N0:296, 5ЕО ΙΌ N0:298, 5ЕО ΙΌ N0:300, 5ЕО ΙΌ N0:302, 5ЕО ΙΌ N0:304, 5ЕО ΙΌ
N0:306, 5ЕО ΙΌ N0:308, 5ЕО ΙΌ N0:310, 5ЕО ΙΌ N0:312, 5ЕО ΙΌ N0:314, 5ЕО ΙΌ N0:316, 5ЕО ΙΌ
N0:318, 5ЕО ΙΌ N0:320, 5ЕО ΙΌ N0:322, 5ЕО ΙΌ N0:324, 5ЕО ΙΌ N0:326, N0:328, 5ЕО ΙΌ N0:330, 5ЕО ΙΌ N0:332 или 5Е0 ΙΌ N0:334, и их ферментативно активные фрагменты, предпочтительно полученные из общего источника, такого как окружающая среда. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент альдолазу, такой как фермент пируватальдолаза, фермент НМ0 и/или КНО, предпочтительно полученным из естественных источников, таких как смешанные естественные источники.
В некоторых вариантах осуществления алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВЬЛ8Т, например, алгоритм ВЬЛ8Т версии 2.2.2, где установлены параметры фильтров: Ыайа11-р Ыайр-б пг ра1аа-ЕЕ. а все другие параметры установлены по умолчанию.
Другие варианты осуществления этого изобретения представляют собой выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению, по существу, идентичных ей последовательностей, и комплеметарных им последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты по этому изобретению кодируют полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, который является термостабильным. Термостабильный полипептид по этому изобретению может сохранять активность альдолазы, такую как активность альдолазы пирувата, такую как активность альдолазы НМО и/или КНО, в условиях, включающих диапазон температур от приблизительно -100°С до приблизительно -80°С, от приблизительно -80°С до приблизительно -40°С, от приблизительно -40°С до приблизительно -20°С, от приблизительно -20°С до приблизительно 0°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 37°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 5°С, от приблизительно 5°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С, от приблизительно 25°С до приблизительно 37°С, от приблизительно 37°С до приблизительно 45°С, от приблизительно 45°С до приблизительно 55°С, от приблизительно 55°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С, от приблизительно 75°С до приблизительно 85°С, от приблизительно 85°С до приблизительно 90°С, от приблизительно 90°С до приблизительно 95°С, от приблизительно 95°С до приблизительно 100°С, от приблизительно 100°С до приблизительно 105°С, от приблизительно 105°С до приблизительно 110°С, от приблизительно 110°С до приблизительно 120°С или 95°С, 96°С, 97°С, 98°С, 99°С, 100°С, 101°С, 102°С, 103°С, 104°С, 105°С, 106°С, 107°С, 108°С, 109°С, 110°С, 111°С, 112°С, 113°С, 114°С, 115°С или более. Термостабильные полипептиды по этому изобретению могут сохранять активность альдолазы, такую как активность пируватальдолазы, такую как активность альдолазы НМО и/или КНО, при температурах в диапазоне от приблизительно -100°С до приблизительно -80°С, от приблизительно -80°С до приблизительно -40°С, от приблизительно -40°С до приблизительно -20°С, от приблизительно -20°С до приблизительно 0°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 5°С, от приблизительно 5°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С, от приблизительно 25°С до приблизительно 37°С, от приблизительно 37°С до приблизительно 45°С, от приблизительно 45°С до приблизительно 55°С, от приблизительно 55°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С, от приблизительно 75°С до приблизительно 85°С, от приблизительно 85°С до приблизительно 90°С, от приблизительно 90°С до приблизительно 95°С, от приблизительно 95°С до приблизительно 100°С, от приблизительно 100°С до приблизительно 105°С, от приблизительно 105°С до приблизительно 110°С, от приблизительно 110°С до приблизительно 120°С или 95°С, 96°С, 97°С, 98°С, 99°С, 100°С, 101°С, 102°С, 103°С, 104°С, 105°С, 106°С, 107°С, 108°С, 109°С, 110°С, 111°С, 112°С, 113°С, 114°С, 115°С или более. В некоторых вариантах осуществления термостабильные полипептиды по этому изобретению сохраняют активность альдолазы при температуре в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более.
В других вариантах осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты кодируют полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, который является термоустойчивым. Термоустойчивые полипептиды по этому изобретению могут сохранять активность
- 5 019971 альдолазы, такую как активность пируватальдолазы, такую как активность альдолазы НМС и/или КНС, после воздействия условий, включающих температуру в диапазоне от приблизительно -100°С до приблизительно -80°С, от приблизительно -80°С до приблизительно -40°С, от приблизительно -40°С до приблизительно -20°С, от приблизительно -20°С до приблизительно 0°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 5°С, от приблизительно 5°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С, от приблизительно 25°С до приблизительно 37°С, от приблизительно 37°С до приблизительно 45°С, от приблизительно 45°С до приблизительно 55°С, от приблизительно 55°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С, от приблизительно 75°С до приблизительно 8 5°С, от приблизительно 85°С до приблизительно 90°С, от приблизительно 90°С до приблизительно 95°С, от приблизительно 95°С до приблизительно 100°С, от приблизительно 100°С до приблизительно 105°С, от приблизительно 105°С до приблизительно 110°С, от приблизительно 110°С до приблизительно 120°С или 95°С, 96°С, 97°С, 98°С, 99°С, 100°С, 101°С, 102°С, 103°С, 104°С, 105°С, 106°С, 107°С, 108°С, 109°С, 110°С, 111°С, 112°С, 113°С, 114°С, 115°С или более. Термоустойчивые полипептиды по этому изобретению могут сохранять активность альдолазы, такую как активность пируватальдолазы, такую как активность альдолазы НМС и/или КНС, после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно -100°С до приблизительно -80°С, от приблизительно -80°С до приблизительно -40°С, от приблизительно -40°С до приблизительно -20°С, от приблизительно -20°С до приблизительно 0°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 5°С, от приблизительно 5°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С, от приблизительно 25°С до приблизительно 37°С, от приблизительно 37°С до приблизительно 45°С, от приблизительно 45°С до приблизительно 55°С, от приблизительно 55°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С, от приблизительно 75°С до приблизительно 85°С, от приблизительно 85°С до приблизительно 90°С, от приблизительно 90°С до приблизительно 95°С, от приблизительно 95°С до приблизительно 100°С, от приблизительно 100°С до приблизительно 105°С, от приблизительно 105°С до приблизительно 110°С, от приблизительно 110°С до приблизительно 120°С или 95°С, 96°С, 97°С, 98°С, 99°С, 100°С, 101°С, 102°С, 103°С, 104°С, 105°С, 106°С, 107°С, 108°С, 109°С, 110°С, 111°С, 112°С, 113°С, 114°С, 115°С или более. В некоторых вариантах осуществления термоустойчивые полипептиды по этому изобретению сохраняют активность альдолазы после воздействия температуры в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более.
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновыми кислотами по этому изобретению, включая последовательность, указанную в 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ΙΌ N0:5, 8Ер ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:13, 8ЕО ГО N0:15, 8ЕО ГО N0:17, 8ЕО ГО N0:19, 8ЕО ГО N0:21, 8ЕО ГО N0:23, 8ЕО ГО N0:25, 8ЕО ГО N0:27, 8ЕО ГО N0:29, 8ЕО ГО N0:31, 8ЕО ГО N0:33, 8ЕО ГО N0:35, 8ЕО ГО N0:37, 8ЕО ГО N0:39, 8ЕО ГО N0:41, 8ЕО ГО N0:43, 8ЕО ГО N0:45, 8ЕО ГО N0:47, 8ЕО ГО N0:49, 8ЕО ГО N0:51, 8ЕО ГО N0:53, 8ЕО ГО N0:55, 8ЕО ГО N0:57, 8ЕО ГО N0:59, 8ЕО ГО N0:61, 8ЕО ГО N0:63, 8ЕО ГО N0:65, 8ЕО ГО N0:67, 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:73, 8ЕО ГО N0:75, 8ЕО ГО N0:77, 8ЕО ГО N0:79, 8ЕО ГО N0:81, 8ЕО ГО N0:83, 8ЕО ГО N0:85, 8ЕО ГО N0:87, 8ЕО ГО N0:89, 8ЕО ГО N0:91, 8ЕО ГО N0:93, 8ЕО ГО N0:95, 8ЕО ГО N0:97, 8ЕО ГО N0:99, 8ЕО ГО N0:101, 8ЕО ГО N0:103, 8ЕО ГО N0:105, 8ЕО ГО N0:107, 8ЕО ГО N0:109, 8ЕО ГО N0:111, 8ЕО ГО N0:113, 8ЕО ГО N0:115, 8ЕО ГО N0:117, 8ЕО ГО N0:119, 8ЕО ГО
N0:121, 8ЕО ГО N0:123, 8ЕО ГО N0:125, 8ЕО ГО N0:127, 8ЕО ГО N0:129, 8ЕО ГО N0:131, 8ЕО ГО
N0:133, 8ЕО ГО N0:135, 8ЕО ГО N0:137, 8ЕО ГО N0:139, 8ЕО ГО N0:141, 8ЕО ГО N0:143, 8ЕО ГО
N0:145, 8ЕО ГО N0:147, 8ЕО ГО N0:149, 8ЕО ГО N0:151, 8ЕО ГО N0:153, 8ЕО ГО N0:155, 8ЕО ГО
N0:157, 8ЕО ГО N0:159, 8ЕО ГО N0:161, 8ЕО ГО N0:163, 8ЕО ГО N0:165, 8ЕО ГО N0:167, 8ЕО ГО
N0:169, 8ЕО ГО N0:171, 8ЕО ГО N0:173, 8ЕО ГО N0:175, 8ЕО ГО N0:177, 8ЕО ГО N0:179, 8ЕО ГО
N0:181, 8ЕО ГО N0:183, 8ЕО ГО N0:185, 8ЕО ГО N0:187, 8ЕО ГО N0:189, 8ЕО ГО N0:191, 8ЕО ГО
N0:193, 8ЕО ГО N0:195, 8ЕО ГО N0:197, 8ЕО ГО N0:199, 8ЕО ГО N0:201, 8ЕО ГО N0:203, 8ЕО ГО
N0:205, 8ЕО ГО N0:207, 8ЕО ГО N0:209, 8ЕО ГО N0:211, 8ЕО ГО N0:213, 8ЕО ГО N0:215, 8ЕО ГО
N0:217, 8ЕО ГО N0:219, 8ЕО ГО N0:221, 8ЕО ГО N0:223, 8ЕО ГО N0:225, 8ЕО ГО N0:227, 8ЕО ГО
N0:229, 8ЕО ГО N0:231, 8ЕО ГО N0:233, 8ЕО ГО N0:235, 8ЕО ГО N0:237, 8ЕО ГО N0:239, 8ЕО ГО
N0:241, 8ЕО ГО N0:243, 8ЕО ГО N0:245, 8ЕО ГО N0:247, 8ЕО ГО N0:249, 8ЕО ГО N0:251, 8ЕО ГО
N0:253, 8ЕО ГО N0:255, 8ЕО ГО N0:257, 8ЕО ГО N0:259, 8ЕО ГО N0:261, 8ЕО ГО N0:263, 8ЕО ГО
N0:265, 8ЕО ГО N0:267, 8ЕО ГО N0:269, 8ЕО ГО N0:271, 8ЕО ГО N0:273, 8ЕО ГО N0:275, 8ЕО ГО
N0:277, 8ЕО ГО N0:279, 8ЕО ГО N0:281, 8ЕО ГО N0:283, 8ЕО ГО N0:285, 8ЕО ГО N0:287, 8ЕО ГО
N0:289, 8ЕО ГО N0:291, 8ЕО ГО N0:293, 8ЕО ГО N0:295, 8ЕО ГО N0:297, 8ЕО ГО N0:299, 8ЕО ГО
N0:301, 8ЕО ГО N0:303, 8ЕО ГО N0:305, 8ЕО ГО N0:307, 8ЕО ГО N0:309, 8ЕО ГО N0:311, 8ЕО ГО
N0:313, 8ЕО ГО N0:315, 8ЕО ГО N0:317, 8ЕО ГО N0:319, 8ЕО ГО N0:321, 8ЕО ГО N0:323, 8ЕО ГО
- 6 019971
N0:325, 8ΕΟ ΙΌ N0:327, 8ΕΟ ΙΌ N0:329, 8ΕΕ) ΙΌ N0:331, 8ΕΕ) ΙΌ N0:333, 8ΕΕ) ΙΌ N0:335, 8ΕΕ) ΙΌ N0:336, 8Ε0 ΙΌ N0:337 или 8Ε0 ΙΌ N0:338, или ее фрагменты или подпоследовательности. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты кодируют полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО. Нуклеиновые кислоты могут обладать длиной по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков или могут представлять собой полноразмерный ген или транскрипт. В некоторых вариантах осуществления строгие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65° в течение приблизительно 15 мин.
Это изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот для идентификации или выделения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, где зонды содержат приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательно расположенных оснований последовательности по этому изобретению и где зонды идентифицируют нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации. Зонды могут содержать олигонуклеотид, содержащий между приблизительно 10-100 последовательно расположенных оснований последовательности по этому изобретению, или ее фрагментов или подпоследовательностей, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 оснований или более, или они могут обладать любой промежуточной длиной.
Это изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот для идентификации и выделения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, где зонды содержат нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков нуклеиновой кислоты по этому изобретению, такой как полинуклеотид, обладающий по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В других вариантах осуществления зонды могут содержать олигонуклеотид, содержащий между по меньшей мере приблизительно 10-100 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновых кислот по этому изобретению, или ее подпоследовательности, например 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 оснований или более, или они могут обладать любой желательной длиной между ними.
Это изобретение относится к парам праймеров для амплификации (такой как амплификация посредством ПЦР) нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, где каждая пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по этому изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности (см. список последовательностей). Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности или приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более последовательно расположенных оснований последовательности. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член с последовательностью, представленной посредством приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и второй член с последовательностью, представленной посредством приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков цепи, комплементарной для первого члена.
Это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим альдолазу, таким как нуклеиновые кислоты, кодирующие пируватальдолазу, кодирующие альдолазу НМО и/или КНО, полученным посредством амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим альдолазу, таким как нуклеиновые кислоты, кодирующие пируватальдолазу, кодирующие альдолазу НМО и/или КНО, полученным посредством амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам получения фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО по
- 7 019971 средством амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, такой как библиотека генов, такая как библиотека окружающей среды.
Это изобретение относится к способам амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМС и/или КНС, включающим амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары праймеров для амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности.
Это изобретение относится к экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или ее подпоследовательность. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета может содержать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающих, грибов, дрожжей или растений. В некоторых вариантах осуществления промотор растений может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать СаМУ358. В других вариантах осуществления промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый окружающими условиями, или промотор, регулируемый в зависимости от стадии развития. Таким образом, промотор может представлять собой, например, промотор, специфичный для семян, специфичный для листьев, специфичный для корней, специфичный для стебля или индуцируемый опаданием листвы. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета далее может содержать экспрессирующий вектор растений или вирусов растений.
Это изобретение относится к носителям для клонирования, включающим экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению или нуклеиновую кислоту по этому изобретению. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или аденоассоциированный вирусный вектор. Носитель для клонирования может включать бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).
Это изобретение относится к трансформированным клеткам, содержащим нуклеиновые кислоты по этому изобретению или экспрессирующие кассеты (такие как векторы) по этому изобретению, или носители для клонирования по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающих, клетку грибов, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку растений. В некоторых вариантах осуществления клетка растений может представлять собой клетку сои, рапса, масляничных растений, томата, сахарного тростника, злаковых, картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя.
Это изобретение относится к трансгенным животным, не относящимся к человеку, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой мышь, крысу, свинью, козу или овцу.
Это изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению. Трансгенное растение может представлять собой растение злаковых, растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, масличное растение, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака.
Это изобретение относится к трансгенным семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению. Трансгенное семя может представлять собой семя злакового растения, семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличного растения, семя рапса, семя сои, ядро пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, орех или семя растения табака.
Это изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, комплементарные нуклеиновой кислоте по этому изобретению или способные гибридизоваться с ними в строгих условиях. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам ингибирования трансляции транскрипта фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по этому изобретению, или способную гибридизоваться с ней в строгих условиях. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид обладает длиной от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 20 до приблизительно 60, от приблизительно
- 8 019971 до приблизительно 70, от приблизительно 40 до приблизительно 80 или от приблизительно 60 до приблизительно 100 оснований, такой как 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более оснований.
Это изобретение относится к способам ингибирования трансляции транскрипта фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по этому изобретению или способную гибридизоваться с ней в строгих условиях.
Это изобретение относится к молекулам двухцепочечных ингибиторных РНК (ΚΝΆί или РНКинтерференция), (включая малые интерферирующие РНК, или δίΡΝΛ. для ингибирования транскрипции и микроРНК, или т^ΡNΑ. для ингибирования трансляции), содержащим подпоследовательность последовательности по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления длина δίΡΝΆ составляет от приблизительно 21 до приблизительно 24 остатков, или по меньшей мере приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более дуплексных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам ингибирования экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке двухцепочечной ингибиторной РНК (δίΡΝΆ или т^ΡNΑ), где РНК содержит подпоследовательность последовательности по этому изобретению.
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательности с полипептидом или пептидом по этому изобретению на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 или более остатков, или на протяжении полной длины полипептида. В некоторых вариантах осуществления идентичности последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием. Полипептидные или пептидные последовательности по этому изобретению включают 8ΕΟ ΙΌ N0:2, 8ЕО ΙΌ N0:4, ΞΕΟ ΙΌ N0:6, ΞΕΟ ΙΌ N0:8, ΞΕΟ ΙΌ N0:10, ΞΕΟ ΙΌ N0:12, ΞΕΟ ΙΌ N0:14, ΞΕΟ ΙΌ N0:16, ΞΕΟ ΙΌ N0:18, ΞΕΟ ΙΌ N0:20, ΞΕΟ ΙΌ N0:22, ΞΕΟ ΙΌ N0:24, ΞΕΟ ΙΌ N0:26, ΞΕΟ ΙΌ N0:28, ΞΕΟ ΙΌ N0:30, ΞΕΟ ΙΌ N0:32, ΞΕΟ ΙΌ N0:34, ΞΕΟ ΙΌ N0:36, ΞΕΟ ΙΌ N0:38, ΞΕΟ ΙΌ N0:40, ΞΕΟ ΙΌ N0:42, ΞΕΟ ΙΌ N0:44, ΞΕΟ ΙΌ N0:46, ΞΕΟ ΙΌ N0:48, ΞΕΟ ΙΌ N0:50, ΞΕΟ ΙΌ N0:52, ΞΕΟ ΙΌ N0:54, ΞΕΟ ΙΌ N0:56, ΞΕΟ ΙΌ N0:58, ΞΕΟ ΙΌ N0:60, ΞΕΟ ΙΌ N0:62, ΞΕΟ ΙΌ N0:64, ΞΕΟ ΙΌ N0:66, ΞΕΟ ΙΌ N0:68, ΞΕΟ ΙΌ N0:70, ΞΕΟ ΙΌ N0:72, ΞΕΟ ΙΌ N0:74, ΞΕΟ ΙΌ N0:76, ΞΕΟ ΙΌ N0:78, ΞΕΟ ΙΌ N0:80, ΞΕΟ ΙΌ N0:82, ΞΕΟ ΙΌ N0:84, ΞΕΟ ΙΌ N0:86, ΞΕΟ ΙΌ N0:88, ΞΕΟ ΙΌ N0:90, ΞΕΟ ΙΌ N0:92, ΞΕΟ ΙΌ N0:94, ΞΕΟ ΙΌ N0:96, ΞΕΟ ΙΌ N0:98, ΞΕΟ ΙΌ N0:100, ΞΕΟ ΙΌ N0:102, ΞΕΟ ΙΌ N0:104, ΞΕΟ ΙΌ N0:106, ΞΕΟ ΙΌ N0:108, ΞΕΟ ΙΌ N0:110, ΞΕΟ ΙΌ N0:112, ΞΕΟ ΙΌ N0:114, ΞΕΟ ΙΌ N0:116, ΞΕΟ ΙΌ N0:118, ΞΕΟ ΙΌ N0:120, ΞΕΟ ΙΌ
N0:122, ΞΕΟ ΙΌ N0:124, ΞΕΟ ΙΌ N0:126, ΞΕΟ ΙΌ N0:128, ΞΕΟ ΙΌ N0:130, ΞΕΟ ΙΌ N0:132, ΞΕΟ ΙΌ
N0:134, ΞΕΟ ΙΌ N0:136, ΞΕΟ ΙΌ N0:138, ΞΕΟ ΙΌ N0:140, ΞΕΟ ΙΌ N0:142, ΞΕΟ ΙΌ N0:144, ΞΕΟ ΙΌ
N0:146, ΞΕΟ ΙΌ N0:148, ΞΕΟ ΙΌ N0:150, ΞΕΟ ΙΌ N0:152, ΞΕΟ ΙΌ N0:154, ΞΕΟ ΙΌ N0:156, ΞΕΟ ΙΌ
N0:158, ΞΕΟ ΙΌ N0:160, ΞΕΟ ΙΌ N0:162, ΞΕΟ ΙΌ N0:164, ΞΕΟ ΙΌ N0:166, ΞΕΟ ΙΌ N0:168, ΞΕΟ ΙΌ
N0:170, ΞΕΟ ΙΌ N0:172, ΞΕΟ ΙΌ N0:174, ΞΕΟ ΙΌ N0:176, ΞΕΟ ΙΌ N0:178, ΞΕΟ ΙΌ N0:180, ΞΕΟ ΙΌ
N0:182, ΞΕΟ ΙΌ N0:184, ΞΕΟ ΙΌ N0:186, ΞΕΟ ΙΌ N0:188, ΞΕΟ ΙΌ N0:190, ΞΕΟ ΙΌ N0:192, ΞΕΟ ΙΌ
N0:194, ΞΕΟ ΙΌ N0:196, ΞΕΟ ΙΌ N0:198, ΞΕΟ ΙΌ N0:200, ΞΕΟ ΙΌ N0:202, ΞΕΟ ΙΌ N0:204, ΞΕΟ ΙΌ
N0:206, ΞΕΟ ΙΌ N0:208, ΞΕΟ ΙΌ N0:210, ΞΕΟ ΙΌ N0:212, ΞΕΟ ΙΌ N0:214, ΞΕΟ ΙΌ N0:216, ΞΕΟ ΙΌ
N0:218, ΞΕΟ ΙΌ N0:220, ΞΕΟ ΙΌ N0:222, ΞΕΟ ΙΌ N0:224, ΞΕΟ ΙΌ N0:226, ΞΕΟ ΙΌ N0:228, ΞΕΟ ΙΌ
N0:230, ΞΕΟ ΙΌ N0:232, ΞΕΟ ΙΌ N0:234, ΞΕΟ ΙΌ N0:236, ΞΕΟ ΙΌ N0:238, ΞΕΟ ΙΌ N0:240, ΞΕΟ ΙΌ
N0:242, ΞΕΟ ΙΌ N0:244, ΞΕΟ ΙΌ N0:246, ΞΕΟ ΙΌ N0:248, ΞΕΟ ΙΌ N0:250, ΞΕΟ ΙΌ N0:252, ΞΕΟ ΙΌ
N0:254, ΞΕΟ ΙΌ N0:256, ΞΕΟ ΙΌ N0:258, ΞΕΟ ΙΌ N0:260, ΞΕΟ ΙΌ N0:262, ΞΕΟ ΙΌ N0:264, ΞΕΟ ΙΌ
N0:266, ΞΕΟ ΙΌ N0:268, ΞΕΟ ΙΌ N0:270, ΞΕΟ ΙΌ N0:272, ΞΕΟ ΙΌ N0:274, ΞΕΟ ΙΌ N0:276, ΞΕΟ ΙΌ
N0:278, ΞΕΟ ΙΌ N0:280, ΞΕΟ ΙΌ N0:282, ΞΕΟ ΙΌ N0:284, ΞΕΟ ΙΌ N0:286, ΞΕΟ ΙΌ N0:288, ΞΕΟ ΙΌ
N0:290, ΞΕΟ ΙΌ N0:292, ΞΕΟ ΙΌ N0:294, 8Ερ ΙΌ N0:296, 8Ερ ΙΌ N0:298, 8Ερ ΙΌ N0:300, 8Ερ ΙΌ
N0:302, 8ΕΡ ΙΌ N0:304, 8Ερ ΙΌ N0:306, 8Ερ ΙΌ N0:308, 8Ερ ΙΌ N0:310, 8Ερ ΙΌ N0:312, 8Ερ ΙΌ
N0:314, 8ΕΡ ΙΌ N0:316, 8Ερ ΙΌ N0:318, 8Ερ ΙΌ N0:320, 8Ερ ΙΌ N0:322, 8Ερ ΙΌ N0:324, 8Ερ ΙΌ
N0:326, 8ΕΡ ΙΌ N0:328, 8Ερ ΙΌ N0:330, 8Ερ ΙΌ N0:332 и 8Ερ ΙΌ N0:334, и их подпоследовательности, их варианты и их ферментативно активные фрагменты. Также полипептиды по этому изобретению включают фрагменты длиной по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или более остатков, или полноразмерный фермент. Полипептидные или пептидные последовательности по этому изобретению включают последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по этому изобретению. Полипептидные или пептидные последовательности по этому изобретению включают полипептиды или пептиды,
- 9 019971 специфично связываемые антителом по этому изобретению (такие как эпитопы), или полипептиды или пептиды, которые могут приводить к образованию антитела по этому изобретению (такие как иммуноген).
В некоторых вариантах осуществления полипептид по этому изобретению обладает по меньшей мере одним видом ферментативной активности альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В других вариантах осуществления полинуклеотид по этому изобретению кодирует полипептид, который обладает по меньшей мере одним видом ферментной активности альдолазы, таким как ферментная активность пируватальдолазы, такой как альдолаза НМС и/или КНС.
Другой вариант осуществления этого изобретения относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам или пептидам, содержащим по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150 или более последовательно расположенных оснований полипептидных или пептидных последовательностей по этому изобретению, по существу, идентичных им последовательностей, и комплементарных им последовательностей. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (такой как участок связывания), сигнальную последовательность, препропоследовательность или активный участок.
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, и сигнальную последовательность, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по этому изобретению. Сигнальная последовательность означает секреторный сигнал или другой домен, который способствует секреции альдолазы по этому изобретению из клетки-хозяина. Сигнальная последовательность может быть получена из другого фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или из (гетерологичного) фермента, не являющегося альдолазой, такого как фермент не пируватальдолаза, такой как фермент не альдолаза НМС и/или фермент не альдолаза КНС. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где последовательность не содержит сигнальную последовательность, и нуклеиновая кислота содержит последовательность по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим полипептиды по этому изобретению, лишенные всей сигнальной последовательности или ее части. В некоторых вариантах осуществления выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид по этому изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как сигнальная последовательность гетерологичного фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или сигнальная последовательность не альдолазы, такая как сигнальная последовательность не пируватальдолазы, такая как сигнальная последовательность не альдолазы НМС и/или не альдолазы КНС.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к химерным белкам, содержащим первый домен, содержащий сигнальную последовательность по этому изобретению, и по меньшей мере второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может содержать фермент. Белок может представлять собой не фермент.
Это изобретение относится к химерным полипептидам, включающим по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), препропоследовательность и/или каталитический домен (СО) по этому изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не природным образом ассоциирован с сигнальным пептидом (8Р), препропоследовательностью и/или каталитическим доменом (СО). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид или пептид не является ферментом альдолазой, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Гетерологичный полипептид или пептид может быть Ν-концевым, С-концевым или может находиться на обоих концах сигнального пептида (8Р), препропоследовательности и/или каталитического домена (СО).
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим химерный полипептид, где химерный полипептид содержит по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СО) по этому изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не природным образом ассоциирован с сигнальным пептидом (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СО).
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям (таким как сигнальные пептиды), состоящим из последовательности, или содержащим ее, как указано в остатках с 1 по 14, с 1 по 15, с 1 по 16, с 1 по 17, с 1 по 18, с 1 по 19, с 1 по 20, с 1 по 21, с 1 по 22, с 1 по 23, с 1 по 24, с 1 по 25, с 1 по 26, с 1 по 27, с 1 по 28, с 1 по 28, с 1 по 30, с 1 по 31, с 1 по 32, с 1 по 33, с 1 по 34, с 1 по 35, с 1 по 36, с 1 по 37, с 1 по 38, с 1 по 39, с 1 по 40, с 1 по 41, с 1 по 42, с 1 по 43, с 1 по 44, с 1 по 45, с 1 по 46 или с 1 по 47, полипептида по этому изобретению, такого как 8ЕЦ ГО
- 10 019971
N0:2, 8ΕΟ ΙΌ N0:4, 8Ер ΙΌ N0:6, 8ΕΟ ΙΌ N0:8, 8ΕΟ ΙΌ N0:10, 8ΕΟ ΙΌ N0:12, 8ΕΟ ΙΌ N0:14, 8ΕΟ ΙΌ N0:16, 8ΕΟ ΙΌ N0:18, 8ΕΟ ΙΌ N0:20, 8ΕΟ ΙΌ N0:22, 8ΕΟ ΙΌ N0:24, 8ΕΟ ΙΌ N0:26, 8ΕΟ ΙΌ N0:28, 8ΕΟ ΙΌ N0:30, 8ΕΟ ΙΌ N0:32, 8ΕΟ ΙΌ N0:34, 8ΕΟ ΙΌ N0:36, 8ΕΟ ΙΌ N0:38, 8ΕΟ ΙΌ N0:40, 8ΕΟ ΙΌ N0:42, 8ΕΟ ΙΌ N0:44, 8ΕΟ ΙΌ N0:46, 8ΕΟ ΙΌ N0:48, 8ΕΟ ΙΌ N0:50, 8ΕΟ ΙΌ N0:52, 8ΕΟ ΙΌ N0:54, 8ΕΟ ΙΌ N0:56, 8ΕΟ ΙΌ N0:58, 8ΕΟ ΙΌ N0:60, 8ΕΟ ΙΌ N0:62, 8ΕΟ ΙΌ N0:64, 8ΕΟ ΙΌ N0:66, 8ΕΟ ΙΌ N0:68, 8ΕΟ ΙΌ N0:70, 8ΕΟ ΙΌ N0:72, 8ΕΟ ΙΌ N0:74, 8ΕΟ ΙΌ N0:76, 8ΕΟ ΙΌ N0:78, 8ΕΟ ΙΌ N0:80, 8ΕΟ ΙΌ N0:82, 8ΕΟ ΙΌ N0:84, 8ΕΟ ΙΌ N0:86, 8ΕΟ ΙΌ N0:88, 8ΕΟ ΙΌ N0:90, 8ΕΟ ΙΌ N0:92, 8ΕΟ ΙΌ N0:94, 8ΕΟ ΙΌ N0:96, 8ΕΟ ΙΌ N0:98, 8ΕΟ ΙΌ N0:100, 8ΕΟ ΙΌ N0:102, 8ΕΟ ΙΌ N0:104, 8ΕΟ ΙΌ N0:106, 8ΕΟ ΙΌ N0:108, 8ΕΟ ΙΌ N0:110, 8ΕΟ ΙΌ N0:112, 8ΕΟ ΙΌ N0:114, 8ΕΟ ΙΌ N0:116, 8ΕΟ ΙΌ N0:118, 8ΕΟ ΙΌ
N0:120, 8ΕΟ ΙΌ N0:122, 8ΕΟ ΙΌ N0:124, 8ΕΟ ΙΌ N0:126, 8ΕΟ ΙΌ N0:128, 8ΕΟ ΙΌ N0:130, 8ΕΟ ΙΌ
N0:132, 8ΕΟ ΙΌ N0:134, 8ΕΟ ΙΌ N0:136, 8ΕΟ ΙΌ N0:138, 8ΕΟ ΙΌ N0:140, 8ΕΟ ΙΌ N0:142, 8ΕΟ ΙΌ
N0:144, 8ΕΟ ΙΌ N0:146, 8ΕΟ ΙΌ N0:148, 8ΕΟ ΙΌ N0:150, 8ΕΟ ΙΌ N0:152, 8ΕΟ ΙΌ N0:154, 8ΕΟ ΙΌ
N0:156, 8ΕΟ ΙΌ N0:158, 8ΕΟ ΙΌ N0:160, 8ΕΟ ΙΌ N0: 162, 8ΕΟ ΙΌ N0:164, 8ΕΟ ΙΌ N0:166, 8ΕΟ ΙΌ
N0:168, 8ΕΟ ΙΌ N0:170, 8ΕΟ ΙΌ N0:172, 8ΕΟ ΙΌ N0:174, 8ΕΟ ΙΌ N0:176, 8ΕΟ ΙΌ N0:178, 8ΕΟ ΙΌ
N0:180, 8ΕΟ ΙΌ N0:182, 8ΕΟ ΙΌ N0:184, 8ΕΟ ΙΌ N0:186, 8ΕΟ ΙΌ N0:188, 8ΕΟ ΙΌ N0:190, 8ΕΟ ΙΌ
N0:192, 8ΕΟ ΙΌ N0:194, 8ΕΟ ΙΌ N0:196, 8ΕΟ ΙΌ N0:198, 8ΕΟ ΙΌ N0:200, 8ΕΟ ΙΌ N0:202, 8ΕΟ ΙΌ
N0:204, 8ΕΟ ΙΌ N0:206, 8ΕΟ ΙΌ N0:208, 8ΕΟ ΙΌ N0:210, 8ΕΟ ΙΌ N0:212, 8ΕΟ ΙΌ N0:214, 8ΕΟ ΙΌ
N0:216, 8ΕΟ ΙΌ N0:218, 8ΕΟ ΙΌ N0:220, 8ΕΟ ΙΌ N0:222, 8ΕΟ ΙΌ N0:224, 8ΕΟ ΙΌ N0:226, 8ΕΟ ΙΌ
N0:228, 8ΕΟ ΙΌ N0:230, 8ΕΟ ΙΌ N0:232, 8ΕΟ ΙΌ N0:234, 8ΕΟ ΙΌ N0:236, 8ΕΟ ΙΌ N0:238, 8ΕΟ ΙΌ
N0:240, 8ΕΟ ΙΌ N0:242, 8ΕΟ ΙΌ N0:244, 8ΕΟ ΙΌ N0:246, 8ΕΟ ΙΌ N0:248, 8ΕΟ ΙΌ N0:250, 8ΕΟ ΙΌ
N0:252, 8ΕΟ ΙΌ N0:254, 8ΕΟ ΙΌ N0:256, 8ΕΟ ΙΌ N0:258, 8ΕΟ ΙΌ N0:260, 8ΕΟ ΙΌ N0:262, 8ΕΟ ΙΌ
N0:264, 8ΕΟ ΙΌ N0:266, 8ΕΟ ΙΌ N0:268, 8ΕΟ ΙΌ N0:270, 8ΕΟ ΙΌ N0:272, 8ΕΟ ΙΌ N0:274, 8ΕΟ ΙΌ
N0:276, 8ΕΟ ΙΌ N0:278, 8ΕΟ ΙΌ N0:280, 8ΕΟ ΙΌ N0:282, 8ΕΟ ΙΌ N0:284, 8ΕΟ ΙΌ N0:286, 8ΕΟ ΙΌ
N0:288, 8ΕΟ ΙΌ N0:290, 8ΕΟ ΙΌ N0:292, 8ΕΟ ΙΌ N0:294, 8ΕΟ ΙΌ N0:296, 8ΕΟ ΙΌ N0:298, 8ΕΟ ΙΌ
N0:300, 8ΕΟ ΙΌ N0:302, 8ΕΟ ΙΌ N0:304, 8ΕΟ ΙΌ N0:306, 8ΕΟ ΙΌ N0:308, 8ΕΟ ΙΌ N0:310, 8ΕΟ ΙΌ
N0:312, 8ΕΟ ΙΌ N0:314, 8ΕΟ ΙΌ N0:316, 8ΕΟ ΙΌ N0:318, 8ΕΟ ΙΌ N0:320, 8ΕΟ ΙΌ N0:322, 8ΕΟ ΙΌ
N0:324, 8ΕΟ ΙΌ N0:326, 8ΕΟ ΙΌ N0:328, 8ΕΟ ΙΌ N0:330, 8ΕΟ ΙΌ N0:332 или 8ΕΟ ΙΌ N0:334. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к сигнальным последовательностям, содержащим первые 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или более ^концевых остатков полипептида по этому изобретению.
В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМ0 и/или КНО, включает специфичную активность от приблизительно 10 до приблизительно 12000 единиц на миллиграмм белка. В других вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМ0 и/или КНО, включает специфичную активность от приблизительно 1000 до приблизительно 10000 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 5000 до приблизительно 7500 единиц на миллиграмм белка. Альтернативно активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМ0 и/или КНО, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 7500 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 5000 до приблизительно 12000 единиц на миллиграмм белка. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 5000 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 7500 до приблизительно 10000 единиц на миллиграмм белка. В других вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 2500 единиц на миллиграмм белка. Альтернативно активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 1000 единиц на миллиграмм белка. В иллюстративном способе измерения активности различных ферментов альдолаз, таких как пируватальдолазы, такие как альдолазы НМО и/или КНО, используются основной субстрат, 4-карбокси-4-гидрокси-2-оксоадипат (СНА). Типичный анализ включает 50 мМ фосфат натрия рН 7,5, 1 мМ МдС12, 1 мМ СНА, 10 мкг/мл Ό-лактатдегидрогеназы (БОН) из ЬаСоЬасШик 1е1сЬтапл (8щта-А1бпе11. 81. Ьоик, М0), 0,5 мМ ИЛОН. Анализ начинают добавлением подлежащего измерению фермента. На спектрофотометре при 340 нм непрерывно проводят мониторинг высвобождения пирувата, сопряженного с образованием ΗΛΌ+. Единицу ферментной активности определяют как количество, которое высвобождает достаточное количество пирувата для снижения поглощения при 340 нм на 1 0Ό в минуту.
В других вариантах осуществления термоустойчивость фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, включает сохранение по меньшей мере половины специфичной активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, после нагревания до повышенной температуры, такой как температура от приблизительно 0°С до приблизительно 20°С, от приблизительно 20°С до приблизительно 37°С, от приблизительно 37°С до
- 11 019971 приблизительно 50°С, от приблизительно 50°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С, от приблизительно 75°С до приблизительно 80°С, от приблизительно 80°С до приблизительно 85°С, от приблизительно 85°С до приблизительно 90°С, от приблизительно 90°С до приблизительно 95°С, от приблизительно 95°С до приблизительно 100°С, от приблизительно 100°С до приблизительно 110°С или выше. Альтернативно термоустойчивость может включать сохранение специфичной активности от приблизительно 10 до приблизительно 12000 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 единиц на миллиграмм белка, после нагревания до повышенной температуры, как описано выше. В других вариантах осуществления термоустойчивость может включать сохранение специфичной активности в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 5000 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры, как описано выше.
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам по этому изобретению, где полипептиды содержат по меньшей мере один участок гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование может представлять собой Ν-гликозилирование. В некоторых вариантах осуществления полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в хозяине Р. ра81от18 или 8. ротЬе или в хозяйской клетке млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в условиях, включающих приблизительно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или более низкие (более кислые) рН. В других вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в условиях, включающих приблизительно рН 7, рН 7,5 рН, 8,0, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12, рН 12,5 или более высокие (более щелочные) рН. В некоторых вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, после воздействия условий, включающих приблизительно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или более низкие (более кислые) рН. В других вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, после воздействия условий, включающих приблизительно рН 7, рН 7,5 рН 8,0, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12, рН 12,5 или более высокие (более щелочные) рН.
В некоторых вариантах осуществления фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС по этому изобретению обладает активностью в щелочных условиях, таких как щелочные условия кишечника, такого как тонкий кишечник. В некоторых вариантах осуществления полипептид может сохранять активность после воздействия кислых значений рН желудка.
Это изобретение относится к белковым препаратам, содержащим полипептид (включая пептиды) по этому изобретению, где белковый препарат включает жидкость, твердое вещество или гель. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по этому изобретению, и второй компонент, такой как полипептид или другой (второй) домен. В некоторых вариантах осуществления второй компонент гетеродимера может представлять собой другой фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, другой фермент или другой белок. В некоторых вариантах осуществления второй домен может представлять собой полипептид, и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В некоторых вариантах осуществления второй домен может представлять собой эпитоп или маркер. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гомомультимерам, включая, но не ограничиваясь ими, гомодимеры, гомотримеры, гомотетрамеры, гомопентамеры и гомогексамеры, содержащие полипептид по этому изобретению.
Это изобретение относится к иммобилизованным полипептидам (включая пептиды), обладающим активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где иммобилизованный полипептид содержит полипептид по этому изобретению, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению, или полипептид, содержащий полипептид по этому изобретению, и второй домен. В некоторых вариантах осуществления полипептид может быть иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, частице графита, грануле, геле, планшете, матрице или капиллярной трубке.
Это изобретение относится к матрицам, содержащим иммобилизованную нуклеиновую кислоту по этому изобретению, включая зонды по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к матрицам, содержащим антитело по этому изобретению.
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по этому изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по этому изобретению. Эти антитела по этому изобретению могут представлять собой моноклональные или поликлональные антитела. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гибридомам, содержащим антитело по этому изобретению, такое как антитело, которое специфично связывается с полипептидом по этому изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела.
- 12 019971
Это изобретение относится к способам выделения или идентификации полипептидов, обладающих активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включающим стадии: (а) предоставления антитела по этому изобретению; (Ь) предоставления образца, содержащего полипептиды; и (с) контактирования образца стадии (Ь) с антителами стадии (а) в условиях, при которых антитело может специфично связываться с полипептидом, таким образом, выделяя или идентифицируя полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС.
Это изобретение относится к способам получения антитела против альдолазы, такого как антитело против пируватальдолазы, такое как антитело против фермента альдолазы НМС и/или КНС, включающим введение не относящемуся к человеку животному нуклеиновой кислоты по этому изобретению или полипептида по этому изобретению, или их подпоследовательностей, в количестве, достаточном для обеспечения гуморального иммунного ответа, получая посредством этого антитело против альдолазы, такое как антитело против пируватальдолазы, такое как антитело против фермента альдолазы НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам обеспечения иммунного ответа (клеточного или гуморального) против фермента альдолазы, такого как иммунный ответ против пируватальдолазы, такой как иммунный ответ против альдолазы НМС и/или КНС, включающим введение не относящемуся к человеку животному нуклеиновой кислоты по этому изобретению или полипептида по этому изобретению, или их подпоследовательностей, в количестве, достаточном для обеспечения иммунного ответа (клеточного или гуморального).
Это изобретение относится к способам получения рекомбинантного полипептида, включающим стадии: (а) предоставления нуклеиновой кислоты по этому изобретению, функционально связанной с промотором; и (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, получая посредством этого рекомбинантный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), получая посредством этого рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке.
Это изобретение относится к способам идентификации полипептида, обладающего активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включающим следующие стадии: (а) предоставление полипептида по этому изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению; (Ь) предоставление субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС; и (с) контактирование полипептида стадии (а), или его фрагмента или варианта, с субстратом стадии (Ь) и детекция уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции позволяет выявить полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой углеводород, содержащее углеводород соединение и/или миметик углеводорода.
Это изобретение относится к способам идентификации субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включающим следующие стадии: (а) предоставление полипептида по этому изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению; (Ь) предоставление анализируемого субстрата; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с анализируемым субстратом стадии (Ь) и определение уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции позволяет идентифицировать анализируемый субстрат, как субстрат фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС.
Это изобретение относится к способам определения наличия специфичного связывания анализируемого соединения с полипептидом, включающим следующие стадии: (а) экспрессия нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, обеспечивающих трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту по этому изобретению, или предоставление полипептида по этому изобретению; (Ь) предоставление анализируемого соединения; (с) контактирование полипептида с анализируемым соединением; и (ά) определение наличия специфичного связывания анализируемого соединения стадии (Ь) с полипептидом.
Это изобретение относится к способам идентификации модулятора активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включающим следующие стадии: (а) предоставление полипептида по этому изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению; (Ь) предоставление анализируемого соединения; (с) контактирование полипептида стадии (а) с анализируемым соединением стадии (Ь) и измерение активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где изменение активности, измеренной в присутствии анализируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие анализируемого соединения, позволяет определить, что анализируемое соединение модулирует активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдо- 13 019971 лаза НМС и/или КНС, можно измерять посредством предоставления субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии анализируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без анализируемого соединения позволяет идентифицировать анализируемое соединение как активатор активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии анализируемого соединения, по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без анализируемого соединения, позволяет идентифицировать анализируемое соединение как ингибитор активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС.
Это изобретение относится к компьютерным системам, включающим процессор и устройство для хранения данных, где на указанном устройстве для хранения данных сохранена последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению (например, полипептида или пептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению). В некоторых вариантах осуществления компьютерная система далее может включать алгоритм для сравнения последовательностей и устройство для хранения данных по меньшей мере с одной сохраненной на нем эталонной последовательностью. В других вариантах осуществления алгоритм сравнения последовательностей включает компьютерную программу, которая показывает полиморфизмы. В некоторых вариантах осуществления компьютерная система может далее включать идентификатор, который идентифицирует один или несколько характерных элементов в указанной последовательности. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к компьютерным считываемым носителям информации, на которых сохранена последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам идентификации характерных элементов последовательности, включающим стадии: (а) считывания последовательности с использованием компьютерной программы, которая позволяет установить один или несколько характерных элементов в последовательности, где последовательность содержит последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (Ь) идентификации одного или нескольких характерных элементов в последовательности с помощью компьютерной программы. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающим стадии: (а) считывания первой последовательности и второй последовательности с использованием компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность содержит последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (Ь) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать стадию идентификации полиморфизмов. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует один или несколько характерных элементов в последовательности. В других вариантах осуществления способ может включать считывание первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или нескольких характерных элементов в последовательности.
Это изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, из образца из окружающей среды, включающим стадии: (а) предоставления последовательностей пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту по этому изобретению; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработки образца, чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с парой праймеров для амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты стадии (Ь) с парой праймеров для амплификации стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца, выделяя или извлекая посредством этого нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, из образца. Один или каждый член пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, содержащий последовательности пары праймеров для амплификации по этому изобретению, такие как последовательности, имеющие по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности по этому изобретению. В одном варианте осуществления этого изобретения образец представляет собой образец из окружающей среды.
Это изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, из образца из окружающей среды, включающим стадии: (а) предоставления полинуклеотидного зонда, содержащего нуклеиновую кислоту по этому изобретению или ее подпосле
- 14 019971 довательность; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработки образца, чтобы нуклеиновая кислота была доступной для гибридизации с полинуклеотидным зондом стадии (а); (с) объединения выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного образца стадии (Ь) с полинуклеотидным зондом стадии (а); и (б) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидным зондом стадии (а), выделяя или извлекая посредством этого нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, из образца. Образец может включать образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В некоторых вариантах осуществления биологический образец может быть получен из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомых, клетки дрожжей, клетки растений, клетки грибов или клетки млекопитающих. В одном варианте осуществления этого изобретения образец представляет собой образец из окружающей среды.
Это изобретение относится к способам получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включающим стадии: (а) предоставления матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по этому изобретению; и (Ь) модификации, делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов в матричной последовательности, или их сочетания, с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления способ далее может включать экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с получением варианта полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Модификации, вставки и делении можно вносить способом, включающим ПЦР с пониженной точностью, перетасовку, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, ПЦР со сборкой, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, пересборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (С88М), синтетическую пересборку лигированием (8КК.), хромосомный мутагенез с насыщением (С8М) или их сочетание. В других вариантах осуществления модификации, вставки или делеции вносят способом, включающим рекомбинацию, возвратную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек ошибочно спаренных оснований, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, делеционный мутагенез, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их сочетание.
В некоторых вариантах осуществления способ можно многократно повторять до тех пор, пока не будет получен фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, с измененной или отличающейся активностью или с измененной или отличающейся стабильностью относительно активности и стабильности полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия повышенной температуры. В других вариантах осуществления вариант полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, обладает повышенным гликозилированием по сравнению ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. Альтернативно вариант полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, обладает активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, при высокой (или повышенной) температуре, где фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не является активной при высокой температуре. В некоторых вариантах осуществления способ можно многократно повторять до тех пор, пока не будет получена последовательность, кодирующая альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как фермент альдолаза НМС и/или КНС, с измененным использованием кодонов, по сравнению с использованием кодонов матричной нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления способ можно многократно повторять до тех пор, пока не будет получен ген фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, обладающий повышенным или сниженным уровнем экспрессии транскрипта или повышенной или пониженной стабильностью относительно уровня экспрессии или стабильности матричной нуклеиновой кислоты.
Это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС; и (Ь) идентификация непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет
- 15 019971 собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, таким образом модифицируя нуклеиновую кислоту для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине.
Это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС; при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (Ь) идентификация кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, таким образом модифицируя кодоны в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС.
Это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению, кодирующей полипептид фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС; и (Ь) идентификация непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительной кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, таким образом модифицируя нуклеиновую кислоту для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине.
Это изобретение относится к способам модификации кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, для снижения его экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (Ь) идентификация по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, таким образом модифицируя нуклеиновую кислоту для снижения ее экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, клетку грибов, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений или клетку млекопитающих.
Это изобретение относится к способам получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров или участков связывания субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где модифицированные активные центры или участки связывания субстрата получены из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный центр или первый участок связывания субстрата, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный центр или первый участок связывания субстрата, где последовательность первой нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, и нуклеиновая кислота кодирует активный центр фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или участок связывания субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС; (Ь) предоставление набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют варианты встречающихся в природе аминокислот во множестве кодонов-мишеней первой нуклеиновой кислоты; и (с) использование набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора вариантов кодирующих активный центр или кодирующих участок связывания субстрата нуклеиновых кислот, кодирующих ряд аминокислотных вариантов в каждом кодоне аминокислоты, который был подвергнут мутагенезу, получая, таким образом, библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или модифицированных участков связывания субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления способ включает внесение мутаций в первую нуклеиновую кислоту стадии (а) способом, включающим оптимизированную систему направленных изменений, мутагенез с насыщением сайтов гена (С88М), синтетическую пересборку лигированием (8ЬВ), ПЦР с пониженной точностью, перетасовку, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратномножественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, пересборку гена и их сочетание. В других вариантах осуществления способ включает внесение мутаций
- 16 019971 в первую нуклеиновую кислоту стадии (а) или ее варианты способом, включающим рекомбинацию, возвратную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек ошибочно спаренных оснований, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, делеционный мутагенез, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их сочетание.
Это изобретение относится к способам получения низкомолекулярного соединения, включающим следующие стадии: (а) предоставление множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать низкомолекулярное соединение, где один из ферментов содержит фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС; (Ь) предоставление субстрата по меньшей мере для одного из ферментов стадии (а); и (с) проведение реакции субстрата стадии (Ь) с ферментами в условиях, которые способствуют множеству биокаталитических реакций с получением посредством серии биокаталитических реакций низкомолекулярного соединения. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам модификации низкомолекулярного соединения, включающим следующие стадии: (а) предоставление фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где фермент содержит полипептид по этому изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению, или ее подпоследовательностями; (Ь) предоставление низкомолекулярного соединения; и (с) проведение реакции фермента стадии (а) с низкомолекулярным соединением стадии (Ь) в условиях, которые способствуют ферментативной реакции, катализируемой ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, модифицируя, таким образом, низкомолекулярное соединение посредством ферментативной реакции с ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления способ может включать множество низкомолекулярных субстратов фермента стадии (а), формируя, таким образом, библиотеку модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых по меньшей мере одной ферментативной реакцией, катализируемой ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления способ может включать множество дополнительных ферментов в условиях, которые способствуют множеству биокаталитических реакций ферментов, с формированием библиотеки модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых множеством ферментативных реакций. В других вариантах осуществления способ может дополнительно включать стадию тестирования библиотеки для определения наличия в библиотеке конкретных модифицированных низкомолекулярных соединений, которые проявляют требуемую активность. Стадия тестирования библиотеки может дополнительно включать стадии систематического удаления всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных низкомолекулярных соединений, из библиотеки, с исследованием части модифицированных низкомолекулярных соединений в отношении наличия или отсутствия конкретного модифицированного низкомолекулярного соединения с требуемой активностью, и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, в результате которой образуется модифицированное низкомолекулярное соединение с требуемой активностью.
Это изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включающим стадии: (а) предоставление фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где фермент содержит полилептид по этому изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению, или ее подпоследовательностью; и (Ь) удаление множества аминокислотных остатков из последовательности стадии (а) и тестирование оставшейся подпоследовательности в отношении активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, таким образом, определяя функциональный фрагмент фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, измеряют получением субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, и определением уменьшения количества субстрата или повышения количества продукта реакции.
Это изобретение относится к способам инженерии цельных клеток с новыми или модифицированными фенотипами с использованием анализа метаболических изменений в реальном времени, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление модифицированной клетки посредством модификации генетического набора клетки, где генетический набор модифицирован добавлением в клетку нуклеиновой кислоты по этому изобретению; (Ь) культивирование модифицированной клетки с получением множества модифицированных клеток; (с) измерение по меньшей мере одного параметра метаболизма клетки посредством мониторинга клеточной культуры стадии (Ь) в реальном времени; и (б) анализ данных стадии (с) для определения наличия отличий измеренного параметра от сравнительного показателя в немодифицированной клетке в аналогичных условиях, идентифицируя, таким образом, полученный способами инженерии фенотип клетки с использованием анализа метаболических изменений в реальном времени. В некоторых вариантах осуществления генетический набор клетки может быть моди
- 17 019971 фицирован способом, включающим удаление последовательности или модификацию последовательности в клетке, или нокаут экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать селекцию клетки, имеющей новый полученный способами инженерии фенотип. В других вариантах осуществления способ может включать культивирование отобранной клетки с получением, таким образом, нового клеточного штамма, имеющего новый полученный способами генетической инженерии фенотип.
Это изобретение относится к способам повышения термоустойчивости или термостабильности полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, при этом способ включает гликозилирование полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать последовательно расположенных аминокислот полипептида по этому изобретению, или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению, повышая, таким образом, термоустойчивость или термостабильность полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления специфичная активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне от более чем приблизительно 37°С до приблизительно 95°С.
Это изобретение относится к способам сверхэкспрессии рекомбинантного полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в клетке, включающим экспрессию вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту по этому изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению, где идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием, где сверхэкспрессии достигают с использованием промотора с высокой активностью, бицистронного вектора или амплификацией генов вектора.
Это изобретение относится к способам получения трансгенного растения, включающим следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению, получая, таким образом, трансформированную клетку растений; и (Ь) предоставление трансгенного растения из трансформированной клетки. В некоторых вариантах осуществления стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты электропорацией или микроинъекцией в протопласты клеток растений. В других вариантах осуществления стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты непосредственно в ткань растений бомбардировкой частицами ДНК. Альтернативно стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК клетки растений с использованием хозяина ЛдгоЬайегшт 1итсГас1СП5. В некоторых вариантах осуществления клетка растений может представлять собой клетку сахарного тростника, свеклы, сои, томата, картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя.
Это изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке растений, включающим следующие стадии: (а) трансформация клетки растений гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту по этому изобретению; (Ь) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетке растений. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке растений, включающим следующие стадии: (а) трансформация клетки растений гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность по этому изобретению; (Ь) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетке растений.
Это изобретение относится к кормам или продуктам питания, содержащим полипептид по этому изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к продуктам питания, кормам, жидкостям, таким как напитки (такие как фруктовые соки или пиво), хлебам или продуктам из теста или хлебным продуктам, или исходным продуктам для напитков (таким как сусло), содержащим полипептид по этому изобретению. В других вариантах осуществления это изобретение относится к продуктам питания, кормам или добавкам в напитки, содержащим полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к продуктам питания или питательным добавкам, например, для человека или животного, содержащим полипептид по этому изобретению, такой как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению.
В некоторых вариантах осуществления полипептид в продукте питания или в пищевой добавке может быть гликозилированным. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к пищевым основам для доставки ферментов, содержащим полипептид по этому изобретению, такой как по
- 18 019971 липептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления основа для доставки содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления полипептид может быть гликозилированным. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, является термоустойчивый. В других вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, является термостабильной.
Это изобретение относится к продуктам питания, кормам или питательным добавкам, содержащим полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам применения фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, в качестве питательной добавки в рацион животного, при этом способ включает: предоставление питательной добавки, содержащей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, содержащую по меньшей мере тридцать последовательно расположенных аминокислот полипептида по этому изобретению; и введение питательной добавки животному. Животное может представлять собой человека, жвачное или моногастрическое животное. Фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, можно получать экспрессией полинуклеотида, кодирующего фермент альдолазу, такого как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, в организме, выбранном из группы, состоящей из бактерии, дрожжей, растения, насекомого, гриба и животного. Организм может быть выбран из группы, состоящей из 8. ротЬе, 8. есгсуыас. йсЫа разЮйв, Ε. со11, 81гсрЮтуес5 §р., ВасШиз ер. Рзеиботоиаз ер., АзрегдШиз ер. и Ьас1оЬасШи8 ер.
Это изобретение относится к пищевым основам для доставки фермента, содержащим термостабильную рекомбинантную альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как фермент альдолаза НМО и/или КНО, такой как полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам доставки добавки в виде фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолазы НМО и/или КНО, животному, при этом способ включает: предоставление пищевой основы для доставки фермента в форме гранул, содержащих гранулированный пищевой носитель и термостабильную рекомбинантную альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как фермент альдолаза НМО и/или КНО, где гранулы легко распределяют фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, находящуюся в них, в водных средах, и введение пищевой основы для доставки фермента животному. Рекомбинантный фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может содержать полипептид по этому изобретению. Фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может быть гликозилирован для обеспечения термостабильности в условиях образования гранул. Основа для доставки может быть образована гранулированием смеси, содержащей зернистое ядро и фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО. Условия гранулирования могут включать применение пара. Условия гранулирования могут включать применение температуры более приблизительно 80°С в течение приблизительно 5 мин, и фермент сохраняет специфичную активность, составляющую по меньшей мере от 350 до приблизительно 900 единиц на миллиграмм фермента.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция действует в качестве способствующего пищеварению средства.
В некоторых вариантах осуществления содержащее углерод-углеродную связь соединение подвергают контактированию с полипептидом по этому изобретению, обладающим ферментной активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как ферментная активность альдолазы НМО и/или КНО, при рН в диапазоне от приблизительно рН 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 11,0 или более. В других вариантах осуществления содержащее углерод-углеродную связь соединение подвергают контактированию с ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, при температуре по меньшей мере приблизительно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90°С или более.
Это описание относится, помимо прочего, к полипептидам, которые пригодны для облегчения реакции в ходе получения монатина, производных монатина, и их солей, например в ходе получения N-2гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (также обозначаемой как В-альфакетокислота монатина, предшественник В-монатина, В-МР, и альфакето-форма монатина), предшественника некоторых стереоизомеров монатина, таких как В,В- и 8,В-монатин. Также описание относится к способам получения монатина, производных монатина и их солей и продуктов внутренней конденсации с использованием одного или нескольких полипептидов по этому изобретению. Способы синтеза В-МР, стереоизомеров монатина и/или стереоизомеров производных монатина включают применение одного или нескольких полипептидов с активностью альдолазы любой из 8ΕΟ ΙΌ N0:2, 8ΕΟ ΙΌ N0:4, 8Ε0 ΙΌ N0:6, 8ΕΟ ΙΌ N0:8, 8ΕΕ) ΙΌ N0:10, 8ΕΕ) ΙΌ N0:12, 8ΕΕ) ΙΌ N0:14, 8ΕΕ) ΙΌ N0:16, 8ΕΕ) ΙΌ N0:18, 8ΕΕ) ΙΌ N0:20, 8ΕΕ) ΙΌ N0:22, 8ΕΕ) ΙΌ N0:24, 8ΕΕ) ΙΌ N0:26, 8ΕΕ) ΙΌ N0:28, 8ΕΕ) ΙΌ N0:30, 8ΕΕ) ΙΌ N0:32, 8ΕΕ) ΙΌ N0:34, 8ΕΕ) ΙΌ N0:36, 8ΕΕ) ΙΌ N0:38, 8ΕΕ) ΙΌ N0:40, 8ΕΕ) ΙΌ N0:42, 8ΕΕ) ΙΌ N0:44, 8ΕΕ) ΙΌ N0:46,
- 19 019971
8ΕΟ ΙΌ N0:48, 8Ε0 ΙΌ N0:50, 8ΕΟ ΙΌ N0:52, 8ΕΟ ΙΌ N0:54, 8ΕΟ ΙΌ N0:56, 8ΕΟ ΙΌ N0:58, 8ΕΟ ΙΌ N0:60, 8ΕΟ ΙΌ N0:62, 8ΕΟ ΙΌ N0:64, 8ΕΟ ΙΌ N0:66, 8ΕΟ ΙΌ N0:68, 8ΕΟ ΙΌ N0:70, 8ΕΟ ΙΌ N0:72, 8ΕΟ ΙΌ N0:74, 8ΕΟ ΙΌ N0:76, 8ΕΟ ΙΌ N0:78, 8ΕΟ ΙΌ N0:80, 8ΕΟ ΙΌ N0:82, 8ΕΟ ΙΌ N0:84, 8ΕΟ ΙΌ N0:86, 8ΕΟ ΙΌ N0:88, 8ΕΟ ΙΌ N0:90, 8ΕΟ ΙΌ N0:92, 8ΕΟ ΙΌ N0:94, 8ΕΟ ΙΌ N0:96, 8ΕΟ ΙΌ N0:98, 8ΕΟ ΙΌ N0:100, 8ΕΟ ΙΌ N0:102, 8ΕΟ ΙΌ N0:104, 8ΕΟ ΙΌ N0:106, 8ΕΟ ΙΌ N0:108, 8ΕΟ ΙΌ N0:110, 8ΕΟ ΙΌ
N0:112, 8ΕΟ ΙΌ N0:114, 8ΕΟ ΙΌ N0:116, 8ΕΟ ΙΌ N0:118, 8ΕΟ ΙΌ N0:120, 8ΕΟ ΙΌ N0:122, 8ΕΟ ΙΌ
N0:124, 8ΕΟ ΙΌ N0:126, 8ΕΟ ΙΌ N0:128, 8ΕΟ ΙΌ N0:130, 8ΕΟ ΙΌ N0:132, 8ΕΟ ΙΌ N0:134, 8ΕΟ ΙΌ
N0:136, 8ΕΟ ΙΌ N0:138, 8ΕΟ ΙΌ N0:140, 8ΕΟ ΙΌ N0:142, 8ΕΟ ΙΌ N0:144, 8ΕΟ ΙΌ N0:146, 8ΕΟ ΙΌ
N0:148, 8ΕΟ ΙΌ N0:150, 8ΕΟ ΙΌ N0:152, 8ΕΟ ΙΌ N0:154, 8ΕΟ ΙΌ N0:156, 8ΕΟ ΙΌ N0:158, 8ΕΟ ΙΌ
N0:160, 8ΕΟ ΙΌ N0:162, 8ΕΟ ΙΌ N0:164, 8ΕΟ ΙΌ N0:166, 8ΕΟ ΙΌ N0:168, 8ΕΟ ΙΌ N0:170, 8ΕΟ ΙΌ
N0:172, 8ΕΟ ΙΌ N0:174, 8ΕΟ ΙΌ N0:176, 8ΕΟ ΙΌ N0:178, 8ΕΟ ΙΌ N0:180, 8ΕΟ ΙΌ N0:182, 8ΕΟ ΙΌ
N0:184, 8ΕΟ ΙΌ N0:186, 8ΕΟ ΙΌ N0:188, 8ΕΟ ΙΌ N0:190, 8ΕΟ ΙΌ N0:192, 8ΕΟ ΙΌ N0:194, 8ΕΟ ΙΌ
N0:196, 8ΕΟ ΙΌ N0:198, 8ΕΟ ΙΌ N0:200, 8ΕΟ ΙΌ N0:202, 8ΕΟ ΙΌ N0:204, 8ΕΟ ΙΌ N0:206, 8ΕΟ ΙΌ
N0:208, 8ΕΟ ΙΌ N0:210, 8ΕΟ ΙΌ N0:212, 8ΕΟ ΙΌ N0:214, 8ΕΟ ΙΌ N0:216, 8ΕΟ ΙΌ N0:218, 8ΕΟ ΙΌ
N0:220, 8ΕΟ ΙΌ N0:222, 8ΕΟ ΙΌ N0:224, 8ΕΟ ΙΌ N0:226, 8ΕΟ ΙΌ N0:228, 8ΕΟ ΙΌ N0:230, 8ΕΟ ΙΌ
N0:232, 8ΕΟ ΙΌ N0:234, 8ΕΟ ΙΌ N0:236, 8ΕΟ ΙΌ N0:238, 8ΕΟ ΙΌ N0:240, 8ΕΟ ΙΌ N0:242, 8ΕΟ ΙΌ
N0:244, 8ΕΟ ΙΌ N0:246, 8ΕΟ ΙΌ N0:248, 8ΕΟ ΙΌ N0:250, 8ΕΟ ΙΌ N0:252, 8ΕΟ ΙΌ N0:254, 8ΕΟ ΙΌ
N0:256, 8ΕΟ ΙΌ N0:258, 8ΕΟ ΙΌ N0:260, 8ΕΟ ΙΌ N0:262, 8ΕΟ ΙΌ N0:264, 8ΕΟ ΙΌ N0:266, 8ΕΟ ΙΌ
N0:268, 8ΕΟ ΙΌ N0:270, 8ΕΟ ΙΌ N0:272, 8ΕΟ ΙΌ N0:274, 8ΕΟ ΙΌ N0:276, 8ΕΟ ΙΌ N0:278, 8ΕΟ ΙΌ
N0:280, 8ΕΟ ΙΌ N0:282, 8ΕΟ ΙΌ N0:284, 8ΕΟ ΙΌ N0:286, 8ΕΟ ΙΌ N0:288, 8ΕΟ ΙΌ N0:290, 8ΕΟ ΙΌ
N0:292, 8ΕΟ ΙΌ N0:294, 8ΕΟ ΙΌ N0:296, 8ΕΟ ΙΌ N0:298, 8ΕΟ ΙΌ N0:300, 8ΕΟ ΙΌ N0:302, 8ΕΟ ΙΌ
N0:304, 8ΕΟ ΙΌ N0:306, 8ΕΟ ΙΌ N0:308, 8ΕΟ ΙΌ N0:310, 8ΕΟ ΙΌ N0:312, 8ΕΟ ΙΌ N0:314, 8ΕΟ ΙΌ
N0:316, 8ΕΟ ΙΌ N0:318, 8ΕΟ ΙΌ N0:320, 8ΕΟ ΙΌ N0:322, 8ΕΟ ΙΌ N0:324, 8ΕΟ ΙΌ N0:326, 8ΕΟ ΙΌ
N0:328, 8Ε0 ΙΌ N0:330, 8Ε0 ΙΌ N0:332 и 8Ε0 ΙΌ N0:334, и их ферментативно активных фрагментов.
Также способы синтеза К-МР, стереоизомеров монатина и/или стереоизомеров производных монатина могут включать применение полипептида с активностью альдолазы, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более, или полной (100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая 8Ε0 ΙΌ N0:1, 8Ε0 ΙΌ N0:3, 8Ε0 ΙΌ N0:5, 8ΕΟ ΙΌ N0:7, 8ΕΟ ΙΌ N0:9, 8ΕΟ ΙΌ N0:11, 8ΕΟ ΙΌ N0:13, 8ΕΟ ΙΌ N0:15, 8ΕΟ ΙΌ N0:17, 8ΕΟ ΙΌ N0:19, 8ΕΟ ΙΌ N0:21, 8ΕΟ ΙΌ N0:23, 8ΕΟ ΙΌ N0:25, 8ΕΟ ΙΌ N0:27, 8ΕΟ ΙΌ N0:29, 8ΕΟ ΙΌ N0:31, 8ΕΟ ΙΌ N0:33, 8ΕΟ ΙΌ N0:35, 8ΕΟ ΙΌ N0:37, 8ΕΟ ΙΌ N0:39, 8ΕΟ ΙΌ N0:41, 8ΕΟ ΙΌ N0:43, 8ΕΟ ΙΌ N0:45, 8ΕΟ ΙΌ N0:47, 8ΕΟ ΙΌ N0:49, 8ΕΟ ΙΌ N0:51, 8ΕΟ ΙΌ N0:53, 8ΕΟ ΙΌ N0:55, 8ΕΟ ΙΌ N0:57, 8ΕΟ ΙΌ N0:59, 8ΕΟ ΙΌ N0:61, 8ΕΟ ΙΌ N0:63, 8ΕΟ ΙΌ N0:65, 8ΕΟ ΙΌ N0:67, 8ΕΟ ΙΌ N0:69, 8ΕΟ ΙΌ N0:71, 8ΕΟ ΙΌ N0:73, 8ΕΟ ΙΌ N0:75, 8ΕΟ ΙΌ N0:77, 8ΕΟ ΙΌ N0:79, 8ΕΟ ΙΌ N0:81, 8ΕΟ ΙΌ N0:83, 8ΕΟ ΙΌ N0:85, 8ΕΟ ΙΌ N0:87, 8ΕΟ ΙΌ N0:89, 8ΕΟ ΙΌ N0:91, 8ΕΟ ΙΌ N0:93, 8ΕΟ ΙΌ N0:95, 8ΕΟ ΙΌ N0:97, 8ΕΟ ΙΌ N0:99, 8ΕΟ ΙΌ N0:101, 8ΕΟ ΙΌ N0:103, 8ΕΟ ΙΌ N0:105, 8ΕΟ ΙΌ N0:107, 8ΕΟ ΙΌ N0:109, 8ΕΟ ΙΌ N0:111, 8ΕΟ ΙΌ N0:113, 8ΕΟ ΙΌ N0:115, 8ΕΟ ΙΌ N0:117, 8ΕΟ ΙΌ N0:119, 8ΕΟ ΙΌ N0:121, 8ΕΟ ΙΌ
N0:123, 8ΕΟ ΙΌ N0:125, 8ΕΟ ΙΌ N0:127, 8ΕΟ ΙΌ N0:129, 8ΕΟ ΙΌ N0:131, 8ΕΟ ΙΌ N0:133, 8ΕΟ ΙΌ
N0:135, 8ΕΟ ΙΌ N0:137, 8ΕΟ ΙΌ N0:139, 8ΕΟ ΙΌ N0:141, 8ΕΟ ΙΌ N0:143, 8ΕΟ ΙΌ N0:145, 8ΕΟ ΙΌ
N0:147, 8ΕΟ ΙΌ N0:149, 8ΕΟ ΙΌ N0:151, 8ΕΟ ΙΌ N0:153, 8ΕΟ ΙΌ N0:155, 8ΕΟ ΙΌ N0:157, 8ΕΟ ΙΌ
N0:159, 8ΕΡ ΙΌ N0:161, 8Ερ ΙΌ N0:163, 8Ερ ΙΌ N0:165, 8Ερ ΙΌ N0:167, 8Ερ ΙΌ N0:169, 8Ερ ΙΌ
N0:171, 8ΕΡ ΙΌ N0:173, 8Ερ ΙΌ N0:175, 8Ερ ΙΌ N0:177, 8Ερ ΙΌ N0:179, 8Ερ ΙΌ N0:181, 8Ερ ΙΌ
N0:183, 8ΕΡ ΙΌ N0:185, 8Ερ ΙΌ N0:187, 8Ερ ΙΌ N0:189, 8Ερ ΙΌ N0:191, 8Ερ ΙΌ N0:193, 8Ερ ΙΌ
N0:195, 8ΕΡ ΙΌ N0:197, 8Ερ ΙΌ N0:199, 8Ερ ΙΌ N0:201, 8Ερ ΙΌ N0:203, 8Ερ ΙΌ N0:205, 8Ερ ΙΌ
N0:207, 8ΕΡ ΙΌ N0:209, 8Ερ ΙΌ N0:211, 8Ερ ΙΌ N0:213, 8Ερ ΙΌ N0:215, 8Ερ ΙΌ N0:217, 8Ερ ΙΌ
N0:219, 8ΕΡ ΙΌ N0:221, 8Ερ ΙΌ N0:223, 8Ερ ΙΌ N0:225, 8Ερ ΙΌ N0:227, 8Ερ ΙΌ N0:229, 8Ερ ΙΌ
N0:231, 8ΕΡ ΙΌ N0:233, 8Ερ ΙΌ N0:235, 8Ερ ΙΌ N0:237, 8Ερ ΙΌ N0:239, 8Ερ ΙΌ N0:241, 8Ερ ΙΌ
N0:243, 8ΕΡ ΙΌ N0:245, 8Ερ ΙΌ N0:247, 8Ερ ΙΌ N0:249, 8Ερ ΙΌ N0:251, 8Ερ ΙΌ N0:253, 8Ερ ΙΌ
N0:255, 8Ερ ΙΌ N0:257, 8Ερ ΙΌ N0:259, 8Ερ ΙΌ N0:261, 8Ερ ΙΌ N0:263, 8Ερ ΙΌ N0:265, 8Ερ ΙΌ
N0:267, 8ΕΡ ΙΌ N0:269, 8Ερ ΙΌ N0:271, 8Ερ ΙΌ N0:273, 8Ερ ΙΌ N0:275, 8Ερ ΙΌ N0:277, 8Ερ ΙΌ
N0:279, 8Ερ ΙΌ N0:281, 8Ερ ΙΌ N0:283, 8Ερ ΙΌ N0:285, 8Ερ ΙΌ N0:287, 8Ερ ΙΌ N0:289, 8Ερ ΙΌ
N0:291, 8ΕΡ ΙΌ N0:293, 8Ερ ΙΌ N0:295, 8Ερ ΙΌ N0:297, 8Ερ ΙΌ N0:299, 8Ερ ΙΌ N0:301, 8Ερ ΙΌ
N0:303, 8ΕΡ ΙΌ N0:305, 8Ερ ΙΌ N0:307, 8Ερ ΙΌ N0:309, 8Ερ ΙΌ N0:311, 8Ερ ΙΌ N0:313, 8Ερ ΙΌ
N0:315, 8ΕΡ ΙΌ N0:317, 8Ερ ΙΌ N0:319, 8Ερ ΙΌ N0:321, 8Ερ ΙΌ N0:323, 8Ερ ΙΌ N0:325, 8Ερ ΙΌ
N0:327, 8ΕΡ ΙΌ N0:329, 8Ερ ΙΌ N0:331, 8Ερ ΙΌ N0:333, 8Ερ ΙΌ N0:335, 8Ερ ΙΌ N0:336, 8Ερ ΙΌ
N0:337 и 8Ε0 ΙΌ N0:338 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков.
Более того, способы синтеза К-МР, стереоизомеров монатина и/или стереоизомеров производных
- 20 019971 монатина могут включать применение полипептида с активностью альдолазы, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8ЕО ΙΌ N0:1, 8ЕО ΙΌ N0:3, 8ЕО ΙΌ N0:5, 8ЕО ΙΌ N0:7, 8ЕО ΙΌ N0:9, 8ЕО ΙΌ N0:11, 8ЕО ΙΌ N0:13, 8ЕО ΙΌ N0:15, 8ЕО ΙΌ N0:17, 8ЕО ΙΌ N0:19, 8ЕО ΙΌ N0:21, 8ЕО ΙΌ N0:23, 8ЕО ΙΌ N0:25, 8ЕО ΙΌ N0:27, 8ЕО ΙΌ N0:29, 8ЕО ΙΌ N0:31, 8ЕО ΙΌ N0:33, 8ЕО ΙΌ N0:35, 8ЕО ΙΌ N0:37, 8ЕО ΙΌ N0:39, 8ЕО ΙΌ N0:41, 8ЕО ΙΌ N0:43, 8ЕО ΙΌ N0:45, 8ЕО ΙΌ N0:47, 8ЕО ГО N0:49, 8ЕО ГО N0:51, 8ЕО ГО N0:53, 8ЕО ГО N0:55, 8ЕО ГО N0:57, 8ЕО ГО N0:59, 8ЕО ГО N0:61, 8ЕО ГО N0:63, 8ЕО ГО N0:65, 8ЕО ГО N0:67, 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:73, 8ЕО ГО N0:75, 8ЕО ГО N0:77, 8ЕО ГО N0:79, 8ЕО ГО N0:81, 8ЕО ГО N0:83, 8ЕО ГО N0:85, 8ЕО ГО N0:87, 8ЕО ГО N0:89, 8ЕО ГО N0:91, 8ЕО ГО N0:93, 8ЕО ГО N0:95, 8ЕО ГО N0:97, 8ЕО ГО N0:99, 8ЕО ГО N0:101, 8ЕО ГО N0:103, 8ЕО ГО N0:105, 8ЕО ΙΟ N0:107, 8ЕО ГО N0:109, 8ЕО ГО N0:111, 8ЕО ГО N0:113, 8ЕО ГО N0:115, 8ЕО ГО N0:117, 8ЕО ΙΟ
N0:119, 8ЕО ГО N0:121, 8ЕО ГО N0:123, 8ЕО ГО N0:125, 8ЕО ГО N0:127, 8ЕО ГО N0:129, 8ЕО ΙΟ
N0:131, 8ЕО ГО N0:133, 8ЕО ГО N0:135, 8ЕО ГО N0:137, 8ЕО ГО N0:139, 8ЕО ГО N0:141, 8ЕО ΙΟ
N0:143, 8ЕО ГО N0:145, 8ЕО ГО N0:147, 8ЕО ГО N0:149, 8ЕО ГО N0:151, 8ЕО ГО N0:153, 8ЕО ΙΟ
N0:155, 8ЕО ГО N0:157, 8ЕО ГО N0:159, 8ЕО ГО N0:161, 8ЕО ГО N0:163, 8ЕО ГО N0:165, 8ЕО ΙΟ
N0:167, 8ЕО ГО N0:169, 8ЕО ГО N0:171, 8ЕО ГО N0:173, 8ЕО ГО N0:175, 8ЕО ГО N0:177, 8ЕО ΙΟ
N0:179, 8ЕО ГО N0:181, 8ЕО ГО N0:183, 8ЕО ГО N0:185, 8ЕО ГО N0:187, 8ЕО ГО N0:189, 8ЕО ΙΟ
N0:191, 8ЕО ГО N0:193, 8ЕО ГО N0:195, 8ЕО ГО N0:197, 8ЕО ГО N0:199, 8ЕО ГО N0:201, 8ЕО ΙΟ
N0:203, 8ЕО ГО N0:205, 8ЕО ГО N0:207, 8ЕО ГО N0:209, 8ЕО ГО N0:211, 8ЕО ГО N0:213, 8ЕО ΙΟ
N0:215, 8ЕО ГО N0:217, 8ЕО ГО N0:219, 8ЕО ГО N0:221, 8ЕО ГО N0:223, 8ЕО ГО N0:225, 8ЕО ΙΟ
N0:227, 8ЕО ГО N0:229, 8ЕО ГО N0:231, 8ЕО ГО N0:233, 8ЕО ГО N0:235, 8ЕО ГО N0:237, 8ЕО ΙΟ
N0:239, 8ЕО ГО N0:241, 8ЕО ГО N0:243, 8ЕО ГО N0:245, 8ЕО ГО N0:247, 8ЕО ГО N0:249, 8ЕО ΙΟ
N0:251, 8ЕО ГО N0:253, 8ЕО ГО N0:255, 8ЕО ГО N0:257, 8ЕО ГО N0:259, 8ЕО ГО N0:261, 8ЕО ΙΟ
N0:263, 8ЕО ГО N0:265, 8ЕО ГО N0:267, 8ЕО ГО N0:269, 8ЕО ГО N0:271, 8ЕО ГО N0:273, 8ЕО ΙΟ
N0:275, 8ЕО ГО N0:277, 8ЕО ГО N0:279, 8ЕО ГО N0:281, 8ЕО ГО N0:283, 8ЕО ГО N0:285, 8ЕО ΙΟ
N0:287, 8ЕО ГО N0:289, 8ЕО ГО N0:291, 8ЕО ГО N0:293, 8ЕО ГО N0:295, 8ЕО ГО N0:297, 8ЕО ΙΟ
N0:299, 8ЕО ГО N0:301, 8ЕО ГО N0:303, 8ЕО ГО N0:305, 8ЕО ГО N0:307, 8ЕО ГО N0:309, 8ЕО ΙΟ
N0:311, 8ЕО ΙΌ N0:313, 8ЕО ΙΌ N0:315, 8ЕО ГО N0:317, 8ЕО ГО N0:319, 8ЕО ГО N0:321, 8ЕО ΙΟ
N0:323, 8ЕО ГО N0:325, 8ЕО ГО N0:327, 8ЕО ГО N0:329, 8ЕО ГО N0:331, 8ЕО ГО N0:333, 8ЕО ΙΟ
N0:335, 8ЕО ΙΌ N0:336, 8ЕО ΙΌ N0:337 и 8ЕО ГО N0:338.
Это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в способе облегчают одним или несколькими полипептидами, выбранными из выделенных или рекомбинантных полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:6, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:14, 8ЕО ГО N0:16, 8ЕЦ ГО N0:18, 8ЕЦ ГО N0:20, 8ЕЦ ГО N0:22, 8ЕЦ ГО N0:24, 8ЕЦ ГО N0:26, 8ЕЦ ГО N0:28, 8ЕЦ ГО N0:30, 8ЕЦ ГО N0:32, 8ЕЦ ГО N0:34, 8ЕЦ ГО N0:36, 8ЕЦ ГО N0:38, 8ЕЦ ГО N0:40, 8ЕЦ ГО N0:42, 8ЕЦ ГО N0:44, 8ЕЦ ГО N0:46, 8ЕЦ ГО N0:48, 8ЕЦ ГО N0:50, 8ЕЦ ГО N0:52, 8ЕЦ ГО N0:54, 8ЕЦ ГО N0:56, 8ЕЦ ГО N0:58, 8ЕЦ ГО N0:60, 8ЕЦ ГО N0:64, 8ЕЦ ГО N0:66, 8ЕЦ ГО N0:68, 8ЕЦ ГО N0:70, 8ЕЦ ГО N0:72, 8ЕЦ ГО N0:74, 8ЕЦ ГО N0:76, 8ЕЦ ГО N0:78, 8ЕЦ ГО N0:80, 8ЕЦ ГО N0:82, 8ЕЦ ГО N0:84, 8ЕЦ ГО N0:86, 8ЕЦ ГО N0:88, 8ЕЦ ГО N0:90, 8ЕЦ ГО N0:92, 8ЕЦ ГО N0:94, 8ЕЦ ГО N0:96, 8ЕЦ ГО N0:98, 8ЕЦ ГО N0:100, 8ЕЦ ГО N0:102, 8ЕЦ ГО N0:106, 8ЕЦ ГО N0:108, 8ЕЦ ГО N0:110, 8ЕЦ ГО N0:112, 8ЕЦ ГО N0:114, 8ЕЦ ГО N0:116, 8ЕЦ ГО N0:118, 8ЕЦ ГО N0:120, 8ЕЦ ГО N0:122, 8ЕЦ ГО N0:124, 8ЕЦ ГО N0:126, 8ЕЦ ГО N0:128, 8ЕЦ ГО N0:130, 8ЕЦ ГО N0:132, 8ЕЦ ГО N0:134, 8ЕЦ ГО N0:136, 8ЕЦ ГО N0:138, 8ЕЦ ГО
N0:140, 8ЕЦ ГО N0:142, 8ЕЦ ГО N0:144, 8ЕЦ ГО N0:146, 8ЕЦ ГО N0:148, 8ЕЦ ГО N0:150, 8ЕЦ ГО
N0:152, 8ЕЦ ГО N0:154, 8ЕЦ ГО N0:156, 8ЕЦ ГО N0:158, 8ЕЦ ГО N0:160, 8ЕЦ ГО N0:162, 8ЕЦ ГО
N0:164, 8ЕЦ ГО N0:166, 8ЕЦ ГО N0:168, 8ЕЦ ГО N0:170, 8ЕЦ ГО N0:172, 8ЕЦ ГО N0:174, 8ЕЦ ГО
N0:176, 8ЕЦ ГО N0:178, 8ЕЦ ГО N0:180, 8ЕЦ ГО N0:182, 8ЕЦ ГО N0:184, 8ЕЦ ГО N0:186, 8ЕЦ ГО
N0:188, 8ЕЦ ГО N0:190, 8ЕЦ ГО N0:192, 8ЕЦ ГО N0:194, 8ЕЦ ГО N0:196, 8ЕЦ ГО N0:198, 8ЕЦ ГО
N0:200, 8ЕЦ ГО N0:204, 8ЕЦ ГО N0:206, 8ЕЦ ГО N0:208, 8ЕЦ ГО N0:210, 8ЕЦ ГО N0:212, 8ЕЦ ГО
N0:214, 8ЕЦ ГО N0:216, 8ЕЦ ГО N0:218, 8ЕЦ ГО N0:220, 8ЕЦ ГО N0:222, 8ЕЦ ГО N0:224, 8ЕЦ ГО
N0:226, 8ЕЦ ГО N0:228, 8ЕЦ ГО N0:230, 8ЕЦ ГО N0:232, 8ЕЦ ГО N0:234, 8ЕЦ ГО N0:236, 8ЕЦ ГО
N0:238, 8ЕЦ ГО N0:240, 8ЕЦ ГО N0:242, 8ЕЦ ГО N0:244, 8ЕЦ ГО N0:246, 8ЕЦ ГО N0:248, 8ЕЦ ГО
N0:250, 8ЕЦ ГО N0:252, 8ЕЦ ГО N0:254, 8ЕЦ ГО N0:256, 8ЕЦ ГО N0:258, 8ЕЦ ГО N0:260, 8ЕЦ ГО
N0:262, 8ЕЦ ГО N0:264, 8ЕЦ ГО N0:266, 8ЕЦ ГО N0:268, 8ЕЦ ГО N0:270, 8ЕЦ ГО N0:272, 8ЕЦ ГО
N0:274, 8ЕЦ ГО N0:276, 8ЕЦ ГО N0:278, 8ЕЦ ГО N0:282, 8ЕЦ ГО N0:284, 8ЕЦ ГО N0:286, 8ЕЦ ГО
N0:288, 8ЕЦ ГО N0:290, 8ЕЦ ГО N0:292, 8ЕЦ ГО N0:294, 8ЕЦ ГО N0:296, 8ЕЦ ГО N0:298, 8ЕЦ ГО
N0:300, 8ЕЦ ГО N0:302, 8ЕЦ ГО N0:304, 8ЕЦ ГО N0:306, 8ЕЦ ГО N0:308, 8ЕЦ ГО N0:310, 8ЕЦ ГО
N0:312, 8ЕЦ ГО N0:314, 8ЕЦ ГО N0:316, 8ЕЦ ГО N0:318, 8ЕЦ ГО N0:320, 8ЕЦ ГО N0:322, 8ЕЦ ГО
N0:324, 8ЕЦ ГО N0:326, 8ЕЦ ГО N0:328, 8ЕЦ ГО N0:330, 8ЕЦ ГО N0:332 или 8ЕЦ ГО N0:334, или их фрагментов или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы. В некоторых вариантах осуществления фрагменты или их подпоследовательности обладают активностью альдолазы, состав- 21 019971 ляющей по меньшей мере 0,2 мг МР/мг белка/ч. В других вариантах осуществления фрагменты или их подпоследовательности обладают активностью альдолазы по меньшей мере 0,1 мг МР/мг белка/ч. В некоторых вариантах осуществления реакцию, облегченную одним или несколькими полипептидами по этому изобретению, проводят в от приблизительно 1,0 до приблизительно 10,0 мМ МдС12. В других вариантах осуществления реакцию облегченную одним или несколькими полипептидами по этому изобретению, проводят при от приблизительно рН 7,0 до приблизительно рН 11,5. В других вариантах осуществления реакцию облегченную одним или несколькими полипептидами по этому изобретению, проводят в от приблизительно 0,005% до приблизительно 1% детергенте полисорбате.
В некоторых вариантах осуществления реакция представляет собой реакцию между индол-3пируватом и источником С3-углерода. В некоторых вариантах осуществления реакция предпочтительно приводит к Я-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоте относительно 3-2-гидрокси-2(индол-3 -илметил)-4-кетоглутаровой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления продукт, полученный в многостадийном каскаде, представляет собой монатин, его соли и их сочетания.
В других вариантах осуществления по меньшей мере один из Я,Я-монатина, Я-5-монатина или их сочетания в многостадийном каскаде получают в большем количестве, чем либо 3,3-монатин, либо 5,Ямонатин. В некоторых вариантах осуществления Я,Я-монатин получают в многостадийном каскаде в большем количестве, чем Я,5-монатин, 5,5-монатин и 5,Я-монатин.
Это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают по меньшей мере одним полипептидом, кодируемым последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, обладающую процентной идентичностью последовательностей по меньшей мере 50% с 5ЕО ΙΌ N0:1, 5ЕО ΙΌ N0:3, 5ЕО ΙΌ N0:5, 5ЕО ΙΌ N0:7, 5ЕО ΙΌ N0:9, 5ЕО ΙΌ N0:11, 5ЕО ΙΌ N0:13, 5ЕО ΙΌ N0:15, 5ЕО ΙΌ N0:17, 5ЕО ΙΌ N0:19, 5ЕО ΙΌ N0:21, 5ЕО ΙΌ N0:23, 5ЕО ΙΌ N0:25, 5ЕО ΙΌ N0:27, 5ЕО ΙΌ N0:29, 5ЕО ΙΌ N0:31, 5ЕО ΙΌ N0:33, 5ЕО ΙΌ N0:35, 5ЕО ΙΌ N0:37, 5ЕО ΙΌ N0:39, 5ЕО ΙΌ N0:41, 5ЕО ΙΌ N0:43, 5ЕО ΙΌ N0:45, 5ЕО ΙΌ N0:47, 5ЕО ΙΌ N0:49, 5ЕО ΙΌ N0:51, 5ЕО ΙΌ N0:61, 5ЕО ΙΌ N0:63, 5ЕО ΙΌ N0:65, 5ЕО ΙΌ N0:67, 5ЕО ΙΌ N0:69, 5ЕО ΙΌ N0:71, 5ЕО ΙΌ N0:73, 5ЕО ΙΌ N0:75, 5ЕО ΙΌ N0:77, 5ЕО ΙΌ N0:79, 5ЕО ΙΌ N0:81, 5ЕО ΙΌ N0:83, 5ЕО ΙΌ N0:85, 5ЕО ΙΌ N0:87, 5ЕО ΙΌ N0:89, 5ЕО ΙΌ N0:91, 5ЕО ΙΌ N0:93, 5ЕО ΙΌ N0:95, 5ЕО ΙΌ N0:97, 5ЕО ΙΌ N0:99, 5ЕО ΙΌ N0:103, 5ЕО ΙΌ N0:105, 5ЕО ΙΌ N0:107, 5ЕО ΙΌ N0:109, 5ЕО ΙΌ N0:111, 5ЕО ΙΌ N0:113, 5ЕО N0:125, 5ЕО N0:137, 5ЕО N0:149, 5ЕО N0:161, 5ЕО N0:173, 5ЕО N0:185, 5ЕО N0:197, 5ЕО N0:211, 5ЕО N0:223, 5ЕО N0:235, 5ЕО N0:247, 5ЕО N0:259, 5ЕО N0:271, 5ЕО N0:285, 5ЕО N0:297, 5ЕО N0:309, 5ЕО N0:321, 5ЕО
N0:333, 5ЕС) ΙΌ N0:335, 5ЕО ΙΌ N0:336, 5ЕО ΙΌ N0:337 или 5ЕО ΙΌ N0:338. В некоторых вариантах осуществления процентная идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 95%. В других вариантах осуществления процентная идентичность последовательностей составляет 100%.
Это изобретение относится к способу, включающему реакцию, которая предпочтительно приводит к Я-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоте относительно 5-2-гидрокси-2-(индол-3илметил)-4-кетоглутаровой кислоты, где по меньшей мере один полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с 5ЕО ΙΌ N0:28, 5ЕО ΙΌ N0:116, 5ЕО ΙΌ N0:298, 5ЕО ΙΌ N0:44, 5ЕО ΙΌ N0:54, 5ЕО ΙΌ N0:148, 5ЕО ΙΌ N0:46, 5ЕО ΙΌ N0:134, 5ЕО ΙΌ N0:142, 5ЕО ΙΌ N0:122, 5ЕО ΙΌ N0:74, 5ЕО ΙΌ N0:64, 5ЕО ΙΌ N0:108, 5ЕО ΙΌ N0:96, 5ЕО ΙΌ N0:126, 5ЕО ΙΌ N0:80, 5ЕО ΙΌ N0:36, 5ЕО ΙΌ N0:62, 5ЕО ΙΌ N0:112, 5ЕО ΙΌ N0:130, 5ЕО ΙΌ N0:94, 5ЕО ΙΌ N0:58, 5ЕО ΙΌ N0:50, 5ЕО ΙΌ N0:106, 5ЕО ΙΌ N0:42, 5ЕО ΙΌ
N0:278, 5ЕО ΙΌ N0:162, 5ЕО ΙΌ N0:276, 5ЕО ΙΌ N0:178, 5ЕО ΙΌ N0:166, 5ЕО ΙΌ N0:218, 5ЕО ΙΌ
N0:224, 5ЕО ΙΌ N0:226, 5ЕО ΙΌ N0:244, 5ЕО ΙΌ N0:250, 5ЕО ΙΌ N0:252, 5Ер ΙΌ N0:264, 5Ер ΙΌ
N0:268, 5ЕР ΙΌ N0:272, 5Ер ΙΌ N0:184, 5Ер ΙΌ N0:282, 5Ер ΙΌ N0:186, 5Ер ΙΌ N0:192, 5Ер ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:115, 5ЕО
N0:127, 5ЕО
N0:139, 5ЕО
N0:151, 5ЕО
N0:163, 5ЕО
N0:175, 5ЕО
N0:187, 5ЕО
N0:199, 5ЕО
N0:213, 5ЕО
N0:225, 5ЕО
N0:237, 5ЕО
N0:249, 5ЕО
N0:261, 5ЕО
N0:273, 5ЕО
N0:287, 5ЕО
N0:299, 5ЕО
N0:311, 5ЕО
N0:323, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:117, 5ЕО
N0:129, 5ЕО
N0:141, 5ЕО
N0:153, 5ЕО
N0:165, 5ЕО
N0:177, 5ЕО
N0:189, 5ЕО
N0:203, 5ЕО
N0:215, 5ЕО
N0:227, 5ЕО
N0:239, 5ЕО
N0:251, 5ЕО
N0:263, 5ЕО
N0:275, 5ЕО
N0:289, 5ЕО
N0:301, 5ЕО
N0:313, 5ЕО
N0:325, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:119, 5ЕО
N0:131, 5ЕО
N0:143, 5ЕО
N0:155, 5ЕО
N0:167, 5ЕО
N0:179, 5ЕО
N0:191, 5ЕО
N0:205, 5ЕО
N0:217, 5ЕО
N0:229, 5ЕО
N0:241, 5ЕО
N0:253, 5ЕО
N0:265, 5ЕО
N0:277, 5ЕО
N0:291, 5ЕО
N0:303, 5ЕО
N0:315, 5ЕО
N0:327, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:121, 5ЕО
N0:133, 5ЕО
N0:145, 5ЕО
N0:157, 5ЕО
N0:169, 5ЕО
N0:181, 5ЕО
N0:193, 5ЕО
N0:207, 5ЕО
N0:219, 5ЕО
N0:231, 5ЕО
N0:243, 5ЕО
N0:255, 5ЕО
N0:267, 5ЕО
N0:281, 5ЕО
N0:293, 5ЕО
N0:305, 5ЕО
N0:317, 5ЕО
N0:329, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:123, 5ЕО
N0:135, 5ЕО
N0:147, 5ЕО
N0:159, 5ЕО
N0:171, 5ЕО
N0:183, 5ЕО
N0:195, 5ЕО
N0:209, 5ЕО
N0:221, 5ЕО
N0:233, 5ЕО
N0:245, 5ЕО
N0:257, 5ЕО
N0:269, 5ЕО
N0:283, 5ЕО
N0:295, 5ЕО
N0:307, 5ЕО
N0:319, 5ЕО
N0:331, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
- 22 019971
N0:200, 8ΕΟ ΙΌ N0:284, 8ΕΟ ΙΌ N0:172, 8ΕΟ ΙΌ N0:180, 8ΕΟ ΙΌ N0:168, 8ΕΟ ΙΌ N0:228, 8ΕΟ ΙΌ N0:236, 8Ε0 ΙΌ N0:238, 8Ε0 ΙΌ N0:240 и 8Ε0 ΙΌ N0:156, используют для упрощения реакции в многостадийном каскаде.
Это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают посредством по меньшей мере одного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8ΕΟ ΙΌ N0:1, 8ΕΟ ΙΌ N0:3, 8ΕΟ ΙΌ N0:5, 8ΕΟ ΙΌ N0:7, 8ΕΟ ΙΌ N0:9, 8ΕΟ ΙΌ N0:11, 8ΕΟ ΙΌ N0:13, 8ΕΟ ΙΌ N0:15, 8ΕΟ ΙΌ N0:17, 8ΕΟ ΙΌ N0:19, 8ΕΟ ΙΌ N0:21, 8ΕΟ ΙΌ N0:23, 8ΕΟ ΙΌ N0:25, 8ΕΟ ΙΌ N0:27, 8ΕΟ ΙΌ N0:29, 8ΕΟ ΙΌ N0:31, 8ΕΟ ΙΌ N0:33, 8ΕΟ ΙΌ N0:35, 8ΕΟ ΙΌ N0:37, 8ΕΟ ΙΌ N0:39, 8ΕΟ ΙΌ N0:41, 8ΕΟ ΙΌ N0:43, 8ΕΟ ΙΌ N0:45, 8ΕΟ ΙΌ N0:47, 8ΕΟ ΙΌ N0:49, 8ΕΟ ΙΌ N0:51, 8ΕΟ ΙΌ N0:53, 8ΕΟ ΙΌ N0:55, 8ΕΟ ΙΌ N0:57, 8ΕΟ ΙΌ N0:59, 8ΕΟ ΙΌ N0:63, 8ΕΟ ΙΌ N0:65, 8ΕΟ ΙΌ N0:67, 8ΕΟ ΙΌ N0:69, 8ΕΟ ΙΌ N0:71, 8ΕΟ ΙΌ N0:73, 8ΕΟ ΙΌ N0:75, 8ΕΟ ΙΌ N0:77, 8ΕΟ ΙΌ N0:79, 8ΕΟ ΙΌ N0:81, 8ΕΟ ΙΌ N0:83, 8ΕΟ ΙΌ N0:85, 8ΕΟ ΙΌ N0:87, 8ΕΟ ΙΌ N0:89, 8ΕΟ ΙΌ N0:91, 8ΕΟ ΙΌ N0:93, 8ΕΟ ΙΌ N0:95, 8ΕΟ ΙΌ N0:97, 8ΕΟ ΙΌ N0:99, 8ΕΟ ΙΌ N0:103, 8ΕΟ ΙΌ N0:105, 8ΕΟ ΙΌ N0:107, 8ΕΟ ΙΌ N0:109, 8ΕΟ ΙΌ N0:111, 8ΕΟ ΙΌ N0:113, 8ΕΟ ΙΌ N0:115, 8ΕΟ ΙΌ N0:117, 8ΕΟ ΙΌ N0:119, 8ΕΟ ΙΌ N0:121, 8ΕΟ ΙΌ N0:123, 8ΕΟ ΙΌ N0:125, 8ΕΟ ΙΌ N0:127, 8ΕΟ ΙΌ N0:129, 8ΕΟ ΙΌ N0:131, 8ΕΟ ΙΌ N0:133, 8ΕΟ ΙΌ N0:135, 8ΕΟ ΙΌ N0:137, 8ΕΟ ΙΌ N0:139, 8ΕΟ ΙΌ N0:141, 8ΕΟ ΙΌ N0:143, 8ΕΟ ΙΌ
N0:145, 8ΕΟ ΙΌ N0:147, 8ΕΟ ΙΌ N0:149, 8ΕΟ ΙΌ N0:151, 8ΕΟ ΙΌ N0:153, 8ΕΟ ΙΌ N0:155, 8ΕΟ ΙΌ
N0:157, 8ΕΟ ΙΌ N0:159, 8ΕΟ ΙΌ N0:161, 8ΕΟ ΙΌ N0:163, 8ΕΟ ΙΌ N0:165, 8ΕΟ ΙΌ N0:167, 8ΕΟ ΙΌ
N0:169, 8ΕΟ ΙΌ N0:171, 8ΕΟ ΙΌ N0:173, 8ΕΟ ΙΌ N0:175, 8ΕΟ ΙΌ N0:177, 8ΕΟ ΙΌ N0:179, 8ΕΟ ΙΌ
N0:181, 8ΕΟ ΙΌ N0:183, 8ΕΟ ΙΌ N0:185, 8ΕΟ ΙΌ N0:187, 8ΕΟ ΙΌ N0:189, 8ΕΟ ΙΌ N0:191, 8ΕΟ ΙΌ
N0:193, 8ΕΟ ΙΌ N0:195, 8ΕΟ ΙΌ N0:197, 8ΕΟ ΙΌ N0:199, 8ΕΟ ΙΌ N0:203, 8ΕΟ ΙΌ N0:205, 8ΕΟ ΙΌ
N0:207, 8ΕΟ ΙΌ N0:209, 8ΕΟ ΙΌ N0:211, 8ΕΟ ΙΌ N0:213, 8ΕΟ ΙΌ N0:215, 8ΕΟ ΙΌ N0:217, 8ΕΟ ΙΌ
N0:219, 8ΕΟ ΙΌ N0:221, 8ΕΟ ΙΌ N0:223, 8ΕΟ ΙΌ N0:225, 8ΕΟ ΙΌ N0:227, 8ΕΟ ΙΌ N0:229, 8ΕΟ ΙΌ
N0:231, 8ΕΟ ΙΌ N0:233, 8ΕΟ ΙΌ N0:235, 8ΕΟ ΙΌ N0:237, 8ΕΟ ΙΌ N0:239, 8ΕΟ ΙΌ N0:241, 8ΕΟ ΙΌ
N0:243, 8ΕΟ ΙΌ N0:245, 8ΕΟ ΙΌ N0:247, 8ΕΟ ΙΌ N0:249, 8ΕΟ ΙΌ N0:251, 8ΕΟ ΙΌ N0:253, 8ΕΟ ΙΌ
N0:255, 8ΕΟ ΙΌ N0:257, 8ΕΟ ΙΌ N0:259, 8ΕΟ ΙΌ N0:261, 8ΕΟ ΙΌ N0:263, 8ΕΟ ΙΌ N0:265, 8ΕΟ ΙΌ
N0:267, 8ΕΟ ΙΌ N0:269, 8ΕΟ ΙΌ N0:271, 8ΕΟ ΙΌ N0:273, 8ΕΟ ΙΌ N0:275, 8ΕΟ ΙΌ N0:277, 8ΕΟ ΙΌ
N0:281, 8ΕΟ ΙΌ N0:283, 8ΕΟ ΙΌ N0:285, 8ΕΟ ΙΌ N0:287, 8ΕΟ ΙΌ N0:289, 8ΕΟ ΙΌ N0:291, 8ΕΟ ΙΌ
N0:293, 8ΕΟ ΙΌ N0:295, 8ΕΟ ΙΌ N0:297, 8ΕΟ ΙΌ N0:299, 8Ερ ΙΌ N0:301, 8Ερ ΙΌ N0:303, 8Ερ ΙΌ
N0:305, 8ΕΡ ΙΌ N0:307, 8Ερ ΙΌ N0:309, 8Ερ ΙΌ N0:311, 8Ερ ΙΌ N0:313, 8Ερ ΙΌ N0:315, 8Ερ ΙΌ
N0:317, 8ΕΡ ΙΌ N0:319, 8Ερ ΙΌ N0:321, 8Ερ ΙΌ N0:323, 8Ερ ΙΌ N0:325, 8Ερ ΙΌ N0:327, 8Ερ ΙΌ
N0:329, 8ΕΡ ΙΌ N0:331, 8Ερ ΙΌ N0:333, 8Ερ ΙΌ N0:335, 8Ερ ΙΌ N0:336, 8Ερ ΙΌ N0:337 или 8Ερ ΙΌ N0:338.
Также это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из предшественника монатина, его солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают посредством одного или нескольких полипептидов, выбранных из выделенных или рекомбинантных полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:2, 8Ε0 ΙΌ N0:4, 8ΕΡ ΙΌ N0:6, 8Ερ ΙΌ N0:8, 8Ερ ΙΌ N0:10, 8Ερ ΙΌ N0:12, 8Ερ ΙΌ N0:14, 8Ερ ΙΌ N0:16, 8Ερ ΙΌ N0:18, 8ΕΡ ΙΌ N0:20, 8Ερ ΙΌ N0:22, 8Ερ ΙΌ N0:24, 8Ερ ΙΌ N0:26, 8Ερ ΙΌ N0:28, 8Ερ ΙΌ N0:30, 8ΕΡ ΙΌ N0:32, 8Ερ ΙΌ N0:34, 8Ερ ΙΌ N0:36, 8Ερ ΙΌ N0:38, 8Ερ ΙΌ N0:40, 8Ερ ΙΌ N0:42, 8Ερ ΙΌ N0:44, 8ΕΡ ΙΌ N0:46, 8Ερ ΙΌ N0:48, 8Ερ ΙΌ N0:50, 8Ερ ΙΌ N0:52, 8Ερ ΙΌ N0:54, 8Ερ ΙΌ N0:56, 8Ερ ΙΌ N0:58, 8ΕΡ ΙΌ N0:60, 8Ερ ΙΌ N0:64, 8Ερ ΙΌ N0:66, 8Ερ ΙΌ N0:68, 8Ερ ΙΌ N0:70, 8Ερ ΙΌ N0:72, 8ΕΡ ΙΌ N0:74, 8Ερ ΙΌ N0:76, 8Ερ ΙΌ N0:78, 8Ερ ΙΌ N0:80, 8Ερ ΙΌ N0:82, 8Ερ ΙΌ N0:84, 8Ερ ΙΌ N0:86, 8ΕΡ ΙΌ N0:88, 8Ερ ΙΌ N0:90, 8Ερ ΙΌ N0:92, 8Ερ ΙΌ N0:94, 8Ερ ΙΌ N0:96, 8Ερ ΙΌ N0:98, 8Ερ ΙΌ N0:100, 8ΕΡ ΙΌ N0:104, 8Ερ ΙΌ N0:106, 8Ερ ΙΌ N0:108, 8Ερ ΙΌ N0:110, 8Ερ ΙΌ N0:112, 8Ερ ΙΌ
N0:114, 8ΕΡ ΙΌ N0:116, 8Ερ ΙΌ N0:118, 8Ερ ΙΌ N0:120, 8Ερ ΙΌ N0:122, 8Ερ ΙΌ N0:124, 8Ερ ΙΌ
N0:126, 8ΕΡ ΙΌ N0:128, 8Ερ ΙΌ N0:130, 8Ερ ΙΌ N0:132, 8Ερ ΙΌ N0:134, 8Ερ ΙΌ N0:136, 8Ερ ΙΌ
N0:138, 8ΕΡ ΙΌ N0:140, 8Ερ ΙΌ N0:142, 8Ερ ΙΌ N0:144, 8Ερ ΙΌ N0:146, 8Ερ ΙΌ N0:148, 8Ερ ΙΌ
N0:150, 8ΕΡ ΙΌ N0:152, 8Ερ ΙΌ N0:154, 8Ερ ΙΌ N0:156, 8Ερ ΙΌ N0:158, 8Ερ ΙΌ N0:160, 8Ερ ΙΌ
N0:162, 8ΕΡ ΙΌ N0:164, 8Ερ ΙΌ N0:166, 8Ερ ΙΌ N0:168, 8Ερ ΙΌ N0:170, 8Ερ ΙΌ N0:172, 8Ερ ΙΌ
N0:174, 8ΕΡ ΙΌ N0:176, 8Ερ ΙΌ N0:178, 8Ερ ΙΌ N0:180, 8Ερ ΙΌ N0:182, 8Ερ ΙΌ N0:184, 8Ερ ΙΌ
N0:186, 8ΕΡ ΙΌ N0:188, 8Ερ ΙΌ N0:190, 8Ερ ΙΌ N0:192, 8Ερ ΙΌ N0:194, 8Ερ ΙΌ N0:196, 8Ερ ΙΌ
N0:198, 8ΕΡ ΙΌ N0:200, 8Ερ ΙΌ N0:204, 8Ερ ΙΌ N0:206, 8Ερ ΙΌ N0:208, 8Ερ ΙΌ N0:210, 8Ερ ΙΌ
N0:212, 8ΕΡ ΙΌ N0:214, 8Ερ ΙΌ N0:216, 8Ερ ΙΌ N0:218, 8Ερ ΙΌ N0:220, 8Ερ ΙΌ N0:222, 8Ερ ΙΌ
N0:224, 8Ερ ΙΌ N0:226, 8Ερ ΙΌ N0:228, 8Ερ ΙΌ N0:230, 8Ερ ΙΌ N0:232, 8Ερ ΙΌ N0:234, 8Ερ ΙΌ
N0:236, 8ΕΡ ΙΌ N0:238, 8Ερ ΙΌ N0:240, 8Ερ ΙΌ N0:242, 8Ερ ΙΌ N0:244, 8Ερ ΙΌ N0:246, 8Ερ ΙΌ
N0:248, 8Ερ ΙΌ N0:250, 8Ερ ΙΌ N0:252, 8Ερ ΙΌ N0:254, 8Ερ ΙΌ N0:256, 8Ερ ΙΌ N0:258, 8Ερ ΙΌ
N0:260, 8ΕΡ ΙΌ N0:262, 8Ερ ΙΌ N0:264, 8Ερ ΙΌ N0:266, 8Ερ ΙΌ N0:268, 8Ερ ΙΌ N0:270, 8Ερ ΙΌ
N0:272, 8Ερ ΙΌ N0:274, 8Ερ ΙΌ N0:276, 8Ερ ΙΌ N0:278, 8Ερ ΙΌ N0:282, 8Ερ ΙΌ N0:284, 8Ερ ΙΌ
N0:286, 8ΕΡ ΙΌ N0:288, 8Ερ ΙΌ N0:290, 8Ερ ΙΌ N0:292, 8Ερ ΙΌ N0:294, 8Ερ ΙΌ N0:296, 8Ερ ΙΌ
- 23 019971
N0:298, 8Ер ΙΌ N0:300, ЛЕр ΙΌ N0:302, ЛЕр ΙΌ N0:304, ЛЕр ΙΌ N0:306, ЛЕр ΙΌ N0:308, ЛЕр ΙΌ N0:310, ЛЕр ΙΌ N0:312, ЛЕр ΙΌ N0:314, ЛЕр ΙΌ N0:316, ЛЕр ΙΌ N0:318, ЛЕр ΙΌ N0:320, ЛЕр ΙΌ N0:322, ЛЕр ГО N0:324, ЛЕр ГО N0:326, ЛЕр ГО N0:328, ЛЕр ГО N0:330, ЛЕр ГО N0:332 или ЛЕр ГО N0:334 или их фрагментов, или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы, где указанный предшественник монатина, его соли и их сочетания обладают сладким вкусом.
Кроме того, это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из предшественника монатина, его солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию облегчают посредством по меньшей мере одного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, обладающую процентной идентичностью последовательностей по меньшей мере 50% с ЛЕр ГО N0:1, ЛЕр ГО N0:3, ЛЕр ГО N0:5, ЛЕр ГО N0:7, ЛЕр ГО N0:9, ЛЕр ГО N0:11, ЛЕр ГО N0:13, ЛЕр ГО N0:15, ЛЕр ГО N0:17, ЛЕр ГО N0:19, ЛЕр ГО N0:21, ЛЕр ГО N0:23, ЛЕр ГО N0:25, ЛЕр ГО N0:27, ЛЕр ГО N0:29, ЛЕр ГО N0:31, ЛЕр ГО N0:33, ЛЕр ГО N0:35, ЛЕр ГО N0:37, ЛЕр ГО N0:39, ЛЕр ГО N0:41, ЛЕр ГО N0:43, ЛЕр ГО N0:45, ЛЕр ГО N0:47, ЛЕр ГО N0:49, ЛЕр ГО N0:51, ЛЕр ГО N0:53, ЛЕр ГО N0:55, ЛЕр ГО N0:57, ЛЕр ГО N0:59, ЛЕр ГО N0:63, ЛЕр ГО N0:65, ЛЕр ГО N0:67, ЛЕр ГО N0:69, ЛЕр ГО N0:71, ЛЕр ГО N0:73, ЛЕр ГО N0:75, ЛЕр ГО N0:77, ЛЕр ГО N0:79, ЛЕр ГО N0:81, ЛЕр ГО N0:83, ЛЕр ГО N0:85, ЛЕр ГО N0:87, ЛЕр ГО N0:89, ЛЕр ГО N0:91, ЛЕр ГО N0:93, ЛЕр ГО N0:95, ЛЕр ГО N0:97, ЛЕр ГО N0:99, ЛЕр ГО N0:103, ЛЕр ГО N0:105, ЛЕр ГО N0:107, ЛЕр ГО N0:109, ЛЕр ГО N0:111, ЛЕр ГО N0:113, ЛЕр ГО N0:115, ЛЕр ГО N0:117, ЛЕр ГО N0:119, ЛЕр ГО N0:121, ЛЕр ГО N0:123, ЛЕр ГО N0:125, ЛЕр ГО N0:127, ЛЕр ГО N0:129, ЛЕр ГО N0:131, ЛЕр ГО N0:133, ЛЕр ГО N0:135, ЛЕр ГО N0:137, ЛЕр ГО N0:139, ЛЕр ГО N0:141, ЛЕр ГО
N0:143, ЛЕр ГО N0:145, ЛЕр ГО N0:147, ЛЕр ГО N0:149, ЛЕр ГО N0:151, ЛЕр ГО N0:153, ЛЕр ГО
N0:155, ЛЕр ГО N0:157, ЛЕр ГО N0:159, ЛЕр ГО N0:161, ЛЕр ГО N0:163, ЛЕр ГО N0:165, ЛЕр ГО
N0:167, ЛЕр ГО N0:169, ЛЕр ГО N0:171, ЛЕр ГО N0:173, ЛЕр ГО N0:175, ЛЕр ГО N0:177, ЛЕр ГО
N0:179, ЛЕр ГО N0:181, ЛЕр ГО N0:183, ЛЕр ГО N0:185, ЛЕр ГО N0:187, ЛЕр ГО N0:189, ЛЕр ГО
N0:191, ЛЕр ГО N0:193, ЛЕр ГО N0:195, ЛЕр ГО N0:197, ЛЕр ГО N0:199, ЛЕр ГО N0:203, ЛЕр ГО
N0:205, ЛЕр ГО N0:207, ЛЕр ГО N0:209, ЛЕр ГО N0:211, ЛЕр ГО N0:213, ЛЕр ГО N0:215, ЛЕр ГО
N0:217, ЛЕр ГО N0:219, ЛЕр ГО N0:221, ЛЕр ГО N0:223, ЛЕр ГО N0:225, ЛЕр ГО N0:227, ЛЕр ГО
N0:229, ЛЕр ГО N0:231, ЛЕр ГО N0:233, ЛЕр ГО N0:235, ЛЕр ГО N0:237, ЛЕр ГО N0:239, ЛЕр ГО
N0:241, ЛЕр ГО N0:243, ЛЕр ГО N0:245, ЛЕр ГО N0:247, ЛЕр ГО N0:249, ЛЕр ГО N0:251, ЛЕр ГО
N0:253, ЛЕр ГО N0:255, ЛЕр ГО N0:257, ЛЕр ГО N0:259, ЛЕр ГО N0:261, ЛЕр ГО N0:263, ЛЕр ГО
N0:265, ЛЕр ГО N0:267, ЛЕр ГО N0:269, ЛЕр ГО N0:271, ЛЕр ГО N0:273, ЛЕр ГО N0:275, ЛЕр ГО
N0:277, ЛЕр ГО N0:281, ЛЕр ГО N0:283, ЛЕр ГО N0:285, ЛЕр ГО N0:287, ЛЕр ГО N0:289, ЛЕр ГО
N0:291, ЛЕр ГО N0:293, ЛЕр ГО N0:295, ЛЕр ГО N0:297, ЛЕр ГО N0:299, ЛЕр ГО N0:301, ЛЕр ГО
N0:303, ЛЕр ГО N0:305, ЛЕр ГО N0:307, ЛЕр ГО N0:309, ЛЕр ГО N0:311, ЛЕр ГО N0:313, ЛЕр ГО
N0:315, ЛЕр ГО N0:317, ЛЕр ГО N0:319, ЛЕр ГО N0:321, ЛЕр ГО N0:323, ЛЕр ГО N0:325, ЛЕр ГО
N0:327, ЛЕр ГО N0:329, ЛЕр ГО N0:331, ЛЕр ГО N0:333, ЛЕр ГО N0:335, ЛЕр ГО N0:336, ЛЕр ГО
N0:337 или ЛЕР ГО N0:338, где указанный предшественник монатина, его соли и их сочетания обладают сладким вкусом.
Кроме того, это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из предшественника монатина, его солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают посредством по меньшей мере одного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой ЛЕО ГО N0:1, ЛЕО ГО N0:3, ЛЕО ГО N0:5, ЛЕО ГО N0:7, ЛЕО ГО N0:9, ЛЕО ГО N0:11, ЛЕР ГО N0:13, ЛЕр ГО N0:15, ЛЕр ГО N0:17, ЛЕр ГО N0:19, ЛЕр ГО N0:21, ЛЕр ГО N0:23, ЛЕр ГО N0:25, ЛЕр ГО N0:27, ЛЕр ГО N0:29, ЛЕр ГО N0:31, ЛЕр ГО N0:33, ЛЕр ГО N0:35, ЛЕр ГО N0:37, ЛЕр ГО N0:39, ЛЕр ГО N0:41, ЛЕр ГО N0:43, ЛЕр ГО N0:45, ЛЕр ГО N0:47, ЛЕр ГО N0:49, ЛЕр ГО N0:51, ЛЕр ГО N0:53, ЛЕр ГО N0:55, ЛЕр ГО N0:57, ЛЕр ГО N0:59, ЛЕр ГО N0:63, ЛЕр ГО N0:65, ЛЕр ГО N0:67, ЛЕр ГО N0:69, ЛЕр ГО N0:71, ЛЕр ГО N0:73, ЛЕр ГО N0:75, ЛЕр ГО N0:77, ЛЕр ГО N0:79, ЛЕр ГО N0:81, ЛЕр ГО N0:83, ЛЕр ГО N0:85, ЛЕр ГО N0:87, ЛЕр ГО N0:89, ЛЕр ГО N0:91, ЛЕр ГО N0:93, ЛЕр ГО N0:95, ЛЕр ГО N0:97, ЛЕр ГО N0:99, ЛЕр ГО N0:103, ЛЕр ГО N0:105, ЛЕр ГО N0:107, ЛЕр ГО N0:109, ЛЕр ГО N0:111, ЛЕр ГО N0:113, ЛЕр ГО N0:115, ЛЕр ГО N0:117, ЛЕр ГО N0:119, ЛЕр ГО N0:121, ЛЕр ГО N0:123, ЛЕр ГО N0:125, ЛЕр ГО N0:127, ЛЕр ГО N0:129, ЛЕр ГО N0:131, ЛЕр ГО N0:133, ЛЕр ГО N0:135, ЛЕр ГО N0:137, ЛЕр ГО N0:139, ЛЕр ГО N0:141, ЛЕр ГО N0:143, ЛЕр ГО
N0:145, ЛЕр ГО N0:147, ЛЕр ГО N0:149, ЛЕр ГО N0:151, ЛЕр ГО N0:153, ЛЕр ГО N0:155, ЛЕр ГО
N0:157, ЛЕр ГО N0:159, ЛЕр ГО N0:161, ЛЕр ГО N0:163, ЛЕр ГО N0:165, ЛЕр ГО N0:167, ЛЕр ГО
N0:169, ЛЕр ГО N0:171, ЛЕр ГО N0:173, ЛЕр ГО N0:175, ЛЕр ГО N0:177, ЛЕр ГО N0:179, ЛЕр ГО
N0:181, ЛЕр ГО N0:183, ЛЕр ГО N0:185, ЛЕр ГО N0:187, ЛЕр ГО N0:189, ЛЕр ГО N0:191, ЛЕр ГО
N0:193, ЛЕр ГО N0:195, ЛЕр ГО N0:197, ЛЕр ГО N0:199, ЛЕр ГО N0:203, ЛЕр ГО N0:205, ЛЕр ГО
N0:207, ЛЕр ГО N0:209, ЛЕр ГО N0:211, ЛЕр ГО N0:213, ЛЕр ГО N0:215, ЛЕр ГО N0:217, ЛЕр ГО
N0:219, ЛЕр ГО N0:221, ЛЕр ГО N0:223, ЛЕр ГО N0:225, ЛЕр ГО N0:227, ЛЕр ГО N0:229, ЛЕр ГО
N0:231, ЛЕр ГО N0:233, ЛЕр ГО N0:235, ЛЕр ГО N0:237, ЛЕр ГО N0:239, ЛЕр ГО N0:241, ЛЕр ГО
N0:243, ЛЕр ГО N0:245, ЛЕр ГО N0:247, ЛЕр ГО N0:249, ЛЕр ГО N0:251, ЛЕр ГО N0:253, ЛЕр ГО
- 24 019971
N0:255, 8Ер ΙΌ N0:257, 8Ер ΙΌ N0:259, 8Ер ΙΌ N0:261, 8Ер ΙΌ N0:263, 8Ер ΙΌ N0:265, 8Ер ΙΌ
N0:267, 8Ер ΙΌ N0:269, 8Ер ΙΌ N0:271, 8Ер ΙΌ N0:273, 8Ер ΙΌ N0:275, 8Ер ΙΌ N0:277, 8Ер ΙΌ
N0:281, 8Ер ΙΌ N0:283, 8Ер ΙΌ N0:285, 8Ер ΙΌ N0:287, 8Ер ΙΌ N0:289, 8Ер ΙΌ N0:291, 8Ер ΙΌ
N0:293, 8Ер ΙΌ N0:295, 8Ер ΙΌ N0:297, 8Ер ΙΌ N0:299, 8Ер ΙΌ N0:301, 8Ер ΙΌ N0:303, 8Ер ΙΌ
N0:305, 8Ер ΙΌ N0:307, 8Ер ΙΌ N0:309, 8Ер ΙΌ N0:311, 8Ер ΙΌ N0:313, 8Ер ΙΌ N0:315, 8Ер ΙΌ
N0:317, 8Ер ΙΌ N0:319, 8Ер ΙΌ N0:321, 8Ер ΙΌ N0:323, 8Ер ΙΌ N0:325, 8Ер ΙΌ N0:327, 8Ер ΙΌ
N0:329, 8Ер ΙΌ N0:331, 8Ер ΙΌ N0:333, 8Ер ΙΌ N0:335, 8Ер ΙΌ N0:336, 8Ер ΙΌ N0:337 или 8Ер ΙΌ N0:338, где указанный предшественник монатина, его соли и их сочетания обладают сладким вкусом.
Для краткости, когда в описании и формуле изобретения идентифицированы в качестве образующихся какие-либо промежуточные соединения/продукты (такие как монатин, предшественник монатина или производное(ые) монатина), следует понимать, что в них включен термин и/или их соли, где это применимо. Иными словами, например, выражение индол-3-пируват превращается в МР следует понимать как индол-3-пировиноградная кислота превращается в МР и/или его соли. В действительности, специалист в данной области поймет, что в представленных условиях реакции соли промежуточных соединений/продуктов действительно присутствуют.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ приводит к композиции монатина или производного монатина, где компонент композиции, представляющий собой монатин или производное монатина, включает только К,К- и 8,К-формы монатина или производного монатина. Термин только, когда его применяют для указания на то, что образуются только определенные изомеры, означает, что каскад приведет только к указанным изомерам, в отсутствие рацемизации. Таким образом, термин только не следует воспринимать как отсутствие других изомеров, а специалист в данной области скорее поймет, что могут быть представлены другие изомерные формы в относительно небольшом количестве вследствие рацемизации, которая может произойти. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ приводит к композиции, где компонент композиции, представляющий собой монатин или производное монатина, включает только К,К-форму монатина или производного монатина (за исключением степени происходящей рацемизации, что приводит к другим изомерным формам).
Как используют в настоящем документе, выражение композиция монатина означает композиции, включающие один или несколько изомеров монатина; также термин может означать только одну изомерную форму монатин и ничего более.
Как используют в настоящем документе, выражение композиция производного монатина означает композицию, включающую один или несколько изомеров производного монатина; также термин означает только одну изомерную форму производного монатина и ничего более.
Как используют в настоящем документе, выражение производное монатина соответствует следующей структуре:
.он (П) где каждый из Ка, КЬ, Кс, Кд и Ке независимо представляют собой любой заместитель, выбранный из атома водорода, гидроксильной группы, С1-С3алкильной группы, группы С1-С3алкокси, аминогруппы или атома галогена, такого как атом йода, атом брома, атом хлора или атом фтора. Однако Ка, КЬ, Кс, Кд и Ке не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно КЬ и Кс и/или Кд и Ке могут вместе образовывать группу С1-С4алкилена, соответственно.
Как используют в настоящем документе, замещенный индол-3-пируват означает, что один или несколько атомов углерода в индольном кольце индол-3-пирувата независимо замещены одним или несколькими из групп заместителей Ка, КЬ, Кс, Кд и Ке, определенных выше. Однако Ка, КЬ, Кс, Кд и Ке не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно КЬ и Кс и/или Кд и Ке могут совместно образовывать группу С1-С4алкилена соответственно.
Как используют в настоящем документе, замещенный триптофан означает, что один или несколько атомов углерода индольного кольца триптофана независимо замещены одной или несколькими группами заместителей Ка, КЬ, Кс, Кд и Ке, определенными выше. Однако Ка, КЬ, Кс, Кд и Ке не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно КЬ и Кс и/или Кд и Ке могут совместно образовывать группу С1-С4алкилена соответственно. В одном варианте осуществления замещенный триптофан содержит ту же группу(ы) заместителя на индольном кольце, что и конечное производное монатина.
Более того, в биосинтетических каскадах образования монатина, описанных в настоящем документе, может использоваться замещенный триптофан с образованием производных монатина, которые, вероятно, будут обладать сладким вкусом. В некоторых вариантах осуществления замещенный триптофан, подлежащий применению в биосинтетических каскадах, описанных в настоящем документе, включает хлорированный триптофан и 5-гидрокситриптофан.
- 25 019971
Например, хлорированные И-триптофаны, которые обладают структурным сходством с В,Вмонатином, были идентифицированы в качестве не обладающих пищевыми качествами подсластителей (в частности 6-хлор-И-триптофан). Аналогично было выявлено, что галогенированные и гидроксизамещенные формы монатина обладают сладким вкусом. Опубликованная патентная заявка США № 2005/ 0118317. Галогены и гидроксильные группы могут поддаваться замещению водородом, в частности в положениях 1-4 бензольного кольца в индоле триптофана, без препятствования последующим превращениям в И- или Ь-триптофан, индол-3-пируват, МР или монатин. В литературе было показано, что замещенные индолы являются пригодными субстратами для РЬР-ферментов и приводят к замещенным триптофанам. Рикиба, И. 8., с1 а1., Ртобисбои οί 8иЬШ1и1еб Ь-Ткгур1орйап8 Ьу РеттеШабои, Арр1. ΕηνίΓοη. МюгоЬюк, 21:841-43 (1971). Галоген, по-видимому, не является пространственным препятствием для каталитического механизма бета-субъединиц триптофансинтетазы, и энантиоспецифичность также не изменялась.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен процесс получения композиции монатина, который включает получение индол-3-пирувата из Ь-триптофана, получение 2гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (предшественник монатина или МР) из индол-3-пирувата и получение монатина из МР. Реакцию Ь-триптофана с получением индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий большей специфичностью, большей аффинностью или обеими из них, в отношении Ь-триптофана, чем в отношении В-МР, Β,Β-монатина или обоих из них. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий Вспецифичной активностью альдолазы, и, таким образом, она приводит к В-МР. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предусмотрен фермент рацемаза, который может облегчать эпимеризацию побочного продукта в виде аминокислоты в реакции триптофана из одной изомерной формы в другую изомерную форму.
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения композиции монатина, который включает получение индол-3-пирувата из Е-триптофана, получение 2гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (предшественника монатина или МР) из индол-3-пирувата и получение монатина из МР. Реакцию Е-триптофана с получением индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий большей специфичностью, большей активностью или обеими из них, в отношении Ь-триптофана, чем в отношении В-МР, Β,Β-монатина или обоих из них, и реакцию МР с образованием монатина облегчает фермент, который является стереоселективным в отношении В-МР. Термин стереоселективный означает, что фермент обладает большей специфичностью, большей активностью или обеими из них, в отношении одного изомера - в этом случае в отношении В-МР против 8-МР - по сравнению с другим. В предпочтительных вариантах осуществления стереоселективный фермент обладает ограниченной активностью в отношении одного изомера по сравнению с другим. Ограниченная активность означает активность, которая является минимальной или неразличимой, например, при определении в соответствии с экспериментами, представленными в настоящем документе.
Следует отметить, что, когда приведены ссылки на серии реакций, такие как в предшествующих абзацах, это изобретение не требует точного исполнения каждой стадии; достаточно, чтобы стадии были проведены подразумеваемым образом. Иными словами, например, процесс получения композиции монатина, который включает получение индол-3-пирувата из Е-триптофана, получение 2-гидрокси-2-(индол3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (предшественника монатина или МР) из индол-3-пирувата и получение монатина из МР, где каждую реакцию облегчает соответствующий фермент, можно проводить, комбинируя Ь-триптофан с ферментами и условиями, чтобы могли произойти перечисленные реакции. В таком случае Е-триптофан может вступать в реакцию с образованием индол-3-пирувата, индол-3пируват, полученный реакцией Е-триптофана, может вступать в реакцию с образованием МР, и МР, полученный реакцией индол-3-пирувата, может вступать в реакцию с образованием монатина. Также процесс можно проводить, в качестве примера, предоставляя соединение, которое может приводить к Ьтриптофану, в условиях, пригодных для образования Е-триптофана, и комбинирование этого соединения с ферментами, способными облегчать указанные серии реакций, в условиях, которые могут быть пригодными для прохождения этих реакций. В качестве другого примера процесс можно проводить посредством предоставления микроорганизма, полученного способами генетической инженерии, для продукции монатина в соответствии с описанным каскадом, и обеспечением подходящих условий для прохождения процесса ферментации. Например, микроорганизм, который в природных условиях продуцирует большие количества Е-триптофана, можно преобразовывать способами генетической инженерии для продукции или сверхпродукции одного или нескольких ферментов, используемых для облегчения реакций в каскаде образования монатина, и можно обеспечить пригодные условия, чтобы микроорганизм вследствие этого продуцировал монатин.
В других вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения монатина, в котором субстрат образует Ь-аминокислоту, когда Е-триптофан превращается в индол-3-пируват, индол-3-пируват реагирует с образованием МР (который может включать как В-МР, так и 8-МР, хотя предпочтительно он включает только или в основном В-МР), и Ь-аминокислота вступает в реакцию с регенерацией (также называемой повторным циклом) субстрата, когда В-МР превращается в В,В-монатин.
- 26 019971
Реакцию В-МР с образованием Β,Β-монатина облегчает стереоинвертирующая аминотрансфераза, такая как Ό-метионинаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.41) или фермент, обладающий активностью Όфенилглицинаминотрансферазы.
В других вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения композиции монатина, который включает получение Ό-триптофана из Ь-триптофана, получение индол-3пирувата из Ό-триптофана, получение В-МР из индол-3-пирувата и получение Β,Β-монатина из В-МР. Получение Ό-триптофана из Ь-триптофана облегчает триптофанрацемаза и ее функциональные эквиваленты. В некоторых следующих вариантах осуществления реакцию Ό-триптофана с образованием индол3-пирувата и МР с образованием монатина облегчает тот же фермент. В следующих вариантах осуществления реакцию индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий В-специфичной активностью альдолазы и, таким образом, образуется В-МР, и реакции Ό-триптофана с образованием индол-3-пирувата и ВМР с образованием В,В-монатина облегчает тот же фермент.
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения производного монатина, который включает получение производного монатина из замещенного индол-3пирувата и пирувата, с использованием фермента, обладающего В-специфичной активностью альдолазы, для катализа реакции.
Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения представлено в прилагаемых ниже рисунках и описании. Другие признаки, цели и преимущества этого изобретения будут очевидны из описания и чертежей, и из формулы изобретения. Как следует понимать из представленного в настоящем документе описания, возможны модификации изобретения в различных вариантах осуществления без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, чертежи и подробное описание следует понимать по своему характеру как иллюстративные, а не ограничивающие.
Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из СепВапк и депонированные в АТСС образцы, цитированные в настоящем документе, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для любых целей.
Краткое описание чертежей
Представленные рисунки иллюстрируют варианты осуществления этого изобретения и не предназначены для ограничения объема этого изобретения, охватываемого формулой изобретения.
На фиг. 1 представлена блок-схема, на которой показан пример ферментативного процесса получения В,В-монатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает применение Ь-аминотрансферазы (примеры которой включают Ь-триптофанаминотрансферазу, Ь-ароматическую аминотрансферазу, Ь-аспартатаминотрансферазу и Ь-аланинаминотрансферазу) в реакции с Ьтриптофаном, которая обладает большей специфичностью и/или селективностью в отношении Ьтриптофана в качестве субстрата, чем В-МР, и/или процесс включает применение оксидазы Ьаминокислот с ограниченной активностью и/или специфичностью в отношении В,В-монатина в качестве субстрата. В конкретном примере схематически представленном на фиг. 1, Ь-аминотрансфераза или оксидаза Ь-аминокислот превращает Ь-триптофан в индол-3-пируват, индол-3-пируват подвергают реакции с В-специфичной альдолазой и пируватом с образованием В-альфа-кетокислоты монатина (В-МР), и ВМР превращается в В,В-монатин Ό-аминотрансферазой или дегидрогеназой Ό-аминокислот. Как показано на фиг. 1, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции проходили в обратном направлении.
На фиг. 2 представлена блок-схема, на которой показан другой пример получения В,В-монатина по этому изобретению. В этом примере процесс включает применение фермента для превращения В-МР в монатин, который является стереоселективным в отношении В-МР. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 2, показано, что триптофан превращается в индол-3-пируват в обратимой реакции. Индол-3-пируват можно подвергать реакции с нестереоспецифичной альдолазой с обратимым образованием альфа-кетокислоты монатина (как В-, так и 8-МР). В-МР обратимо превращают в В,В-монатин с помощью стереоселективной Ό-аминотрансферазы или дегидрогеназы Ό-аминокислот. Любой 8-МР, который образуется с помощью нестереоспецифичной альдолазы, может превращаться обратно в индол3-пируват, если используют стереоселективную Ό-аминотрансферазу или дегидрогеназу Ό-аминокислот. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении.
На фиг. 3 представлена блок-схема, на которой показан другой пример получения В,В-монатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает превращение Ь-триптофана в Όтриптофан с применением триптофанрацемазы, и применение продукта, представляющего собой Όаминокислоту, в реакции, сопряженной с реакцией образования индол-3-пирувата в качестве субстрата в реакции, сопряженной с реакцией образования В,В-монатина. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 3, Ь-триптофан превращают в Ό-триптофан с помощью триптофанрацемазы в обратимой реакции. Ό-триптофан подвергают реакции с альфа-кетоглутаратом (α-КС) и Όаминотрансферазой широкой специфичности с образованием индол-3-пирувата и Ό-глутамата. Индол-3пируват подвергают реакции с пируватом и В-специфичной альдолазой, и он превращается в В-альфа
- 27 019971 кетокислоту монатина (Я-МР), и Я-МР подвергают реакции с Ό-аминотрансферазой широкой специфичности и Ό-глутаматом с образованием Я,Я-монатина и альфа-кетоглутарата (α-КС). Как показано на фиг.
3, каждая из реакций является обратимой, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении.
На фиг. 4 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения Я,Ямонатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает превращение Ьаминокислоты, образованной в реакции, сопряженной с реакцией Ь-триптофана, в Ό-аминокислоту; эта Ό-аминокислота действует в качестве донора амино для реакции, в которой Я-МР превращается в Я,Ямонатин. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 4, Ь-триптофан подвергают реакции с Ь-аминотрансферазой и альфа-кетоглутаратом с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата. Индол-3-пируват подвергают реакции с пируватом и Я-специфичной альдолазой, и он превращается в Яальфа-кетокислоту монатина (Я-МР), и Я-МР подвергают реакции с Ό-аминотрансферазой широкой специфичности и Ό-глутаматом с образованием Я,Я-монатина и альфа-кетоглутарата. Как показано на фиг.
4, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении.
На фиг. 5 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения Я,Ямонатина из Ь-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает ферментативное облегчение превращения Я-МР в Я,Я-монатин с использованием стереоинвертирующего фермента, так что Ь-аминокислоту, образованную посредством реакции, сопряженной с реакцией Ь-триптофана, можно использовать в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения Я-МР в Я,Ямонатин. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 5, Ь-триптофан подвергают реакции с Ь-аминотрансферазой и оксалоацетатом, пируватом или альфа-кетоглутаратом (α-КС) с образованием индол-3-пирувата и Ь-аспартата (если используют оксалоацетат), Ь-аланина (если используют пируват) или Ь-глутамата (если используют α-КС). Индол-3-пируват подвергают реакции с пируватом и Яспецифичной альдолазой, и он превращается в Я-альфа-кетокислоту монатина (Я-МР), и Я-МР подвергают реакции со стереоинвертирующей аминотрансферазой и Ь-аспартатом, Ь-аланином или Ьглутаматом с образованием Я,Я-монатина и оксалоацетата (если используют Ь-аспартат), пирувата (если используют Ь-аланин) или альфа-кетоглутарата (α-КС, если используют Ь-глутамат). Как показано на фиг. 5, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении.
На фиг. 6 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения Я,Ямонатина по этому изобретению. В этом примере процесс включает повторное использование Ьаминокислоты, образующейся в реакции образования индол-3-пирувата, с Ό-аминокислотой, используемой в качестве вещества, реагирующего с Я-МР, в реакции образования Я,Я-монатина посредством серии реакций превращения. В конкретном примере, представленном на фиг. 6, Ь-триптофан подвергают обратимой реакции с Ь-аминотрансферазой и оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Ьаспартата. Индол-3-пируват обратимо реагирует с пируватом и Я-специфичной альдолазой, и он превращается в Я-альфа-кетокислоту монатина (Я-МР), и Я-МР подвергают обратимой реакции с Όаминотрансферазой и Ό-аланином с образованием Я,Я-монатина и пирувата. Ь-аспартат превращают в Ьаланин и СО2 с использованием аспартат-4-декарбоксилазы. Ь-аланин превращают в Ό-аланин с помощью аланинрацемазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении.
На фиг. 7 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения Я,Ямонатина в соответствии с настоящим изобретением. В этом примере процесс включает смещение в прямом направлении реакции Ь-триптофана (т.е. направление реакции на образование индол-3-пирувата) посредством превращения побочного продукта реакции, представляющего собой Ь-аминокислоту, в другой продукт. В этом примере побочный продукт, представляющий собой Ь-аминокислоту Ь-аспартат, превращают в Ь-аланин в необратимой реакции с использованием декарбоксилазы. В конкретном примере схематично представленном на фиг. 7, Ь-триптофан обратимо реагирует с Ь-аминотрансферазой и с альфа-кетоглутаратом (α-КС) или оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата (если используют α-КС) или Ь-аспартата (если используют оксалоацетат). Индол-3-пируват обратимо реагирует с пируватом и Я-специфичной альдолазой, и он превращается в Я-альфа-кетокислоту монатин (ЯМР). Я-МР подвергают обратимой реакции с Ό-аминотрансферазой и Ό-аминокислотой с образованием Я,Я-монатина и любого из оксалоацетата, пирувата или α-КС. Ь-глутамат или Ь-аспартат, который является продуктом реакции Ь-аминотрансферазы, превращают либо в 4-аминобутаноат и СО2 (если субстратом является Ь-глутамат) или в (β-аланин и СО2 (если субстратом является Ь-аспартат) с использованием глутаминовой кислоты или аспартатдекарбоксилазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, показанные как обратимые, протекали в обратном направлении.
На фиг. 8 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения Я,Ямонатина в соответствии с настоящим изобретением. В этом примере процесс включает повторное использование побочного продукта, представляющего собой аминокислоту, реакции Ь-триптофана с реак
- 28 019971 тантом, представляющим собой аминокислоту, реакции В-МР, через серию реакций превращения. В конкретном примере, представленном на фиг. 8, Ь-триптофан подвергают обратимой реакции с Ьаминотрансферазой и с альфа-кетоглутаратом (α-КС) с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата. Индол-3-пируват подвергают обратимой реакции с пируватом и В-специфичной альдолазой, и он превращается в В-альфа-кетокислоту монатина (В-МР). В-МР подвергают обратимой реакции с Όаминотрансферазой и Ό-аланином с образованием В,В-монатина и пирувата. Ь-аланинаминотрансферазу и пируват используют для обратимого превращения Ь-глутамата, который является побочным продуктом реакции Ь-аминотрансферазы, обратно в α-КС, с Ь-аланином в качестве образующегося совместно с ним продукта. Аланинрацемаза обратимо превращает Ь-аланин в Ό-аланин, который пригоден в третьей реакции, реакции Ό-аминотрансферазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении.
На фиг. 9 представлена блок-схема компьютерной системы.
На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями из базы данных в целях определения гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных.
На фиг. 11 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса в компьютере для определения наличия гомологии двух последовательностей.
На фиг. 12 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления работы идентификатора 300 в целях детекции наличия в последовательности характерного элемента.
На фиг. 13 и 14 вместе проиллюстрированы виды активности 58 различных альдолаз (каждая из которых идентифицирована ее определенным номером 8ЕЦ ΙΌ) при образовании предшественника монатина (МР), как измеряют посредством ЬС/М8/М8.
На фиг. 15 проиллюстрирован эффект дитиотреитола на продукцию монатина посредством полипептида с активностью альдолазы 8ЕЦ ΙΌ N0:88.
Одинаковыми указывающими символами на различных рисунках показаны одинаковые элементы.
Подробное описание
Множество вариантов осуществления описано выше и более подробно ниже. Варианты осуществления этого изобретения включают один или несколько из описанных аспектов.
Сокращения и термины
Следующие ниже разъяснения терминов и способов представлены для лучшего описания настоящего описания и для того, чтобы специалисты в данной области руководствовались ими при осуществлении на практике настоящего описания. Как используют в настоящем документе, включающий означает содержащий. Кроме того, формы единственного числа включают множественные упоминаемые объекты, если контекст явно не указывает на иное. Например, указание на содержащий белок включает один или множество таких белков, и указание на содержащий клетку включает указание на одну или несколько клеток и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д. Термин приблизительно включает диапазон экспериментальных ошибок, которые встречаются при любом измерении. Если нет иных указаний, все измеренные значения предполагают наличие слова приблизительно перед ними, даже если слово приблизительно прямо не используется.
Консервативная замена: замена одной аминокислоты другой аминокислотой в полипептиде, при этом замена незначительно влияет на активность полипептида или не влияет на нее. Замену считают консервативной независимо от наличия структурного или функционального сходства заменяемых аминокислот. Например, в идеальном случае полипептид триптофанаминотрансферазы, включающий одну или несколько консервативных замен, сохраняет активность триптофанаминотрансферазы. Полипептид, содержащий одну или несколько консервативных замен, можно получать манипулированием с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид, с использованием, например, стандартных способов, таких как сайт-направленный мутагенез или ПЦР, или других способов, известных в данной области.
Неограничивающие примеры аминокислот, которые могут замещать исходную аминокислоту в белке и которые можно считать консервативными заменами в случае небольшого влияния, или его отсутствия, на активность полипептида, включают: А1а, замещенный посредством кег или 1кг: агд, замещенный посредством д1и, Ык или 1ук; аки, замещенный посредством д1и, д1п, 1ук, Ык, акр; акр, замещенный посредством аки, д1и или д1и; сук, замещенный посредством кег или а1а; д1и, замещенный посредством аки, д1и, 1ук, 1пк, акр или агд; д1и, замещенный посредством аки, д1и, 1ук или акр; д1у, замещенный посредством рго; Ык, замещенный посредством аки, 1ук, д1и, агд, 1уг; 11е, замещенный посредством 1еи, те!, уа1, рке; 1еи, замещенный посредством 11е, те!, уа1, рке; 1ук, замещенный посредством аки, д1и, д1и, Ык, агд; те!, замещенный посредством 11е, 1еи, уа1, рке; рке, замещенный посредством 1гр, !уг, те!, 11е или 1еи; кег, замещенный посредством !кг, а1а; !кг, замещенный посредством кег или а1а; !гр, замещенный посредством рке, !уг; !уг, замещенный посредством Ык, рке или !гр; и уа1, замещенный посредством те!, 11е, 1еи.
Дополнительная информация в отношении консервативных замен может быть найдена, помимо
- 29 019971 прочих источников, в Веп-Вакка! е! а1., (1. Вас1еио1. 169:751-7, 1987), 0'Редап е! а1., (Оепе 77:237-51, 1989), 8а1ип-То111 е! а1., (РгоШп 8с1. 3:240-7, 1994), НосйиИ е! а1. , (В1о/Тесйпо1оду 6:1321-5, 1988), \У0 00/67796 (Сигб е! а1.) и в стандартных руководствах по генетике и молекулярной биологии.
Полученный: для целей описания и формулы изобретения, вещество является полученным из организма или источника, если одно или несколько из указанных ниже утверждений является истинным: 1) вещество находится в организме/источнике; 2) вещество удалено из нативного хозяина; или 3) вещество удалено из нативного хозяина и преобразовано, например, посредством мутагенеза.
Выделенный: как используют в настоящем документе, термин выделенный относится к любому веществу, извлеченному из его нативного хозяина; вещество не должно быть очищенным. Например выделенная нуклеиновая кислота относится к встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, которая не является непосредственно соседней с обеими последовательностями, с которыми она является непосредственно соседней (одна с 5'-конца и одна с 3'-конца) во встречающемся в природе геноме организма, из которого она получена. Например, выделенная нуклеиновая кислота может представлять собой, но не ограничиваться этим, рекомбинантную молекулу ДНК любой длины, если одна из встречающихся в норме последовательностей нуклеиновых кислот, непосредственно фланкирующих эту рекомбинантную молекулу ДНК во встречающемся в природе геноме, удалена или отсутствует. Таким образом, выделенная нуклеиновая кислота включает, но не ограничивается этим, рекомбинантную ДНК, которая существует в качестве отдельной молекулы (такой как кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный посредством ПЦР или обработки эндонуклеазой рестрикции), независимо от других последовательностей, а также рекомбинантную ДНК, которая встроена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (такой как ретровирус, аденовирус или вирус герпеса) или в геномную ДНК прокариотического или эукариотического организма. Кроме того, выделенная нуклеиновая кислота может включать рекомбинантную молекулу ДНК, которая является частью гибридной или слитой последовательности нуклеиновой кислоты.
Как используют в настоящем документе, термин выделенный означает, что материал (такой как белок или нуклеиновая кислота по этому изобретению) удален из его естественного окружения (например, из природного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, находящийся в живом животном, не является выделенным, однако тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех веществ, находящихся вместе с ним в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут являться частью вектора, и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут являться частью композиции и, тем не менее, быть выделенными, поскольку такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения.
Термин выделенный, как используют в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты, также включает любую, не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, поскольку последовательности не встречающихся в природе нуклеиновых кислот не встречаются в природе и не обладают непосредственно смежными с ними последовательностями во встречающемся в природе геноме. Например, не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, такую как сконструированная нуклеиновая кислота, считают выделенной нуклеиновой кислотой. Сконструированную нуклеиновую кислоту можно получать с использованием обычных способов молекулярного клонирования или химического синтеза нуклеиновых кислот. Выделенная не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота может быть независима от других последовательностей, или она может быть встроена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (такой как ретровирус, аденовирус или вирус герпеса) или геномную ДНК прокариотического или эукариотического организма. Кроме того, не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота может включать молекулу нуклеиновой кислоты, которая является частью гибридной или слитой последовательности нуклеиновой кислоты.
Очищенный: как используют в настоящем документе, термин очищенный не подразумевает абсолютной чистоты; скорее, он подразумевает относительное определение. Таким образом, например, очищенный препарат полипептида или нуклеиновой кислоты может представлять собой препарат, в котором представляющий интерес полипептид или нуклеиновая кислота находятся в более высокой концентрации, чем концентрация полипептида или нуклеиновой кислоты в их природном окружении в организме, или в более высокой концентрации, чем в окружении, из которого они были извлечены.
Отдельные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, обычно очищают до электрофоретической гомогенности.
Последовательности, полученные из таких клонов, не могут быть получены непосредственно либо из библиотеки, либо из тотальной ДНК человека. Очищенные нуклеиновые кислоты по этому изобретению являются очищенными от остальной геномной ДНК в организме по меньшей мере в 104-106 раз. В некоторых вариантах осуществления термин очищенный включает нуклеиновые кислоты, которые очищены от остальной геномной ДНК или от других последовательностей в библиотеке или других окружающих веществ по меньшей мере на один порядок величины, например, в некоторых вариантах осуществления на два или три порядка, или на четыре или пять порядков величины.
Аминокислота: как используют в настоящем документе, термины аминокислота или аминокислотная последовательность относятся к олигопептидной, пептидной, полипептидной или белковой по
- 30 019971 следовательности, или к фрагменту, участку или субъединице любой из них, и к встречающимся в природе или синтетическим молекулам. Термины аминокислота или аминокислотная последовательность включают олигопептидную, пептидную, полипептидную или белковую последовательность, или фрагмент, участок или субъединицу любой из них, и встречающиеся в природе или синтетические молекулы. Как используют в настоящем документе, термин полипептид относится к аминокислотам, соединенным друг с другом пептидными связями или модифицированным пептидными связями, т.е. к изостерическим пептидам, и он может содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы посредством любого природного процесса, такого как посттрансляционный процессинг, или способами химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Модификации можно проводить в любом участке полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и N или С-концы. Следует понимать, что указанный тип модификации может быть представлен в одинаковой или в различной степени в нескольких участках данного полипептида. Также данный полипептид может обладать множеством типов модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ОРКякоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в белок, такую как аргинилирование. (См., Сгс1дй1ои, Т.Е., РгсЛсиъ - 81гис1игс аиб Мо1сси1аг Рторстбсв 2пб Ε6., \У.Н. Ргсстаи апб Сотрапу, №\ν Уотк (1993); Ро8йтап81абопа1 Сота1сп1 МобШсайои оГ РгсИспъ, В.С. 1ойп5оп, Ε6., Асабстк Ргсвв, №\ν Уотк, рр.1-12 (1983). Пептиды и полипептиды по этому изобретению также включают все формы миметиков и пептидомиметиков, как более подробно описано ниже.
Полипептид, обладающий активностью альдолазы: под полипептидом, обладающим активностью альдолазы подразумевают полипептид, который либо самостоятельно, либо совместно с одним или нескольким дополнительными полипептидами (обладающими такой же или отличающейся последовательностью) представляет собой белок с ферментативной активностью альдолазы.
Рекомбинантный: рекомбинантные полипептиды или белки относятся к полипептидам или белкам, получаемым с помощью технологий рекомбинантных ДНК; т.е. получаемым из клеток, трансформированных конструкцией с экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид или белок. Синтетические полипептиды или белок представляют собой полипептиды и белок, полученные химическим синтезом. Также для синтеза полипептида или фрагментов по этому изобретению можно использовать твердофазные способы химического синтеза. Такой способ известен в данной области с ранних 1960-х годов (МстДс1б В.В., 1. Ат. С’йст. 8ос, 85:2149-2154, 1963) (см. также 81с\таг1 ЕМ. апб Уоипд Ι.Ό., 8о11б Рйавс Рсрббс 8уп(Ηс8^8. 2пб Ε6., Рюгсс Сйст1са1 Со., ВоскГогб, 111., рр.11-12)) и его ранее применяли в коммерчески доступных лабораторных наборах для конструирования и синтеза пептидов (СатЬпбдс Всвсатсй Вюсйстюак). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, использовались идеи Н.М. Осувсп с! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1, И8А, 81:3998 (1984), и они осуществляют синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых прикреплены к одному планшету.
По существу идентичный: выражение по существу идентичный, в отношении двух нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям, например, по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью нуклеотидных или аминокислотных остатков (последовательностей) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как определяют с использованием одного из известных алгоритмов сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В других вариантах осуществления существенная идентичность существует на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 100 или более остатков, и наиболее часто последовательности являются, по существу, идентичными на протяжении по меньшей мере от 150 до 200 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления последовательности являются по существу идентичными на протяжении всей длины кодирующих областей.
Кроме того, по существу идентичная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от эталонной последовательности на одну или несколько консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, делеций или вставок. В некоторых вариантах осуществления замена происходит в участке, который не является активным центром молекулы, или альтернативно замена происходит в участке, представляющем собой активный центр молекулы, при условии, что полипептид в основном сохраняет его функциональные (ферментативные) свойства. Консерва
- 31 019971 тивная аминокислотная замена, например, приводит к замене одной аминокислоты другой аминокислотой из того же класса (такой как замена одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой аминокислотой, или замена одной полярной аминокислоты другой аминокислотой, такая как замена аргинина лизином, глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой или глутамина аспарагином). Одна или несколько аминокислот могут быть удалены, например, из полипептида альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, что приводит к модификации структуры полипептида без существенного изменения его биологической активности. Например, могут быть удалены Жили С-концевые аминокислоты, которые не являются необходимыми для биологической активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Модифицированные полипептидные последовательности по этому изобретению можно оценивать в отношении биологической активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, множеством способов, включая контактирование модифицированной полипептидной последовательности с субстратом и определение наличия снижения посредством модифицированного полипептида количества специфичного субстрата в анализе или повышения биологических продуктов ферментативной реакции функциональной альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как полипептид альдолаза НМС и/или КНС, с субстратом.
Фрагмент: фрагмент, как используют в настоящем документе в отношении белка или полипептида или нуклеиновой кислоты, представляет собой часть белка, полипептида или нуклеиновой кислоты соответственно. Фрагменты могут обладать такой же или по существу такой же последовательностью аминокислот или нуклеиновых кислот, что и более длинная последовательность белка, полипептида или нуклеиновой кислоты, из которой образован фрагмент. Также включаются фрагменты, которые обладают отличающимися трехмерными структурами по сравнению с трехмерными структурами более длинного белка, полипептида или нуклеиновой кислоты. Примером этого является молекула проформы, такая как пробелок с низкой активностью, который можно модифицировать расщеплением с образованием зрелого фермента со значительно более высокой активностью. Фрагмент белка или полипептида может представлять собой ферментативно активную часть белка или полипептида.
Стереоинвертирующая аминотрансфераза: стереоинвертирующая аминотрансфераза представляет собой полипептид, способный предпочтительно или селективно продуцировать хиральный аминокислотный продукт (такой как монатин), при применении субстрата с противоположной хиральностью в качестве донора амино. Например, стереоинвертирующая аминотрансфераза может представлять собой Ό-фенилглицинаминотрансферазу (также называемую Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазой), которая предпочтительно или селективно использует Ь-глутамат в качестве субстрата с образованием В,В-монатина. Неограничивающие примеры стереоинвертирующих аминотрансфераз включают Όметионинаминотрансферазу (ЕС 2.6.1.41) и ферменты, обладающие активностью Όфенилглицинаминотрансферазы или активностью Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазы.
Это изобретение относится к полипептидам с активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМС и/или КНС, к кодирующим их полинуклеотидам, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к ферментам альдолазам, таким как пируватальдолаза, такая как ферменты альдолаза НМС и/или КНС, полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, и к способам применения таких полинуклеотидов и полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к модифицированным или измененным альдолазам, таким как пируватальдолазы, альдолазы НМС и/или КНС, с повышенной специфичной активностью по сравнению с немодифицированными или неизмененными альдолазами, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как, но не ограничиваясь этим, альдолаза НМС и/или КНС, которые облегчают образование 3,4замещенного 2-кетоглутарата. В одном варианте осуществления это изобретение относится к способу получения 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, включающему: (а) предоставление полипептида, обладающего активностью альдолазы, такой как активность альдолазы пирувата, такая как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМС и/или альдолазы КМС; (Ь) предоставление донорного и акцепторного соединения; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, где необязательно донор и акцептор представляют собой пируват или донор пирувата и акцептор α-кетокислоты, кетон и/или альдегид.
В другом варианте осуществления этого изобретения пируватальдолазу, такую как альдолаза НМС и/или КНС, можно использовать совместно с Ό-аминотрансферазой для получения 4-замещенной Όглутаминовой кислоты или ее производного. 4-Замещенную Ό-глутаминовую кислоту и/или ее производное можно использовать в качестве антибиотика, поскольку было выявлено, что эти соединения ингибируют бактериальную глутаматрацемазу. В одном варианте осуществления это изобретение относится к способу получения 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты, включающему: (а) предоставление полипептида, обладающего активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как, но
- 32 019971 не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или альдолазы КМО; (Ь) предоставление акцептора α-кетокислоты и пирувата или донора пирувата; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 4-замещенной Бглутаминовой кислоты, где полипептид необязательно обладает активностью пируватальдолазы, альдолазы НМО и/или альдолазы КНО, и где способ необязательно дополнительно включает применение Баминотрансферазы.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к композициям (таким как препараты ферментов, продукты питания и пищевые добавки, корма и кормовые добавки, напитки и добавки в напитки, лекарственные средства и добавки в лекарственные средства, и диетические добавки), содержащим ферменты, полипептиды или полинуклеотиды по этому изобретению. Эти композиции можно изготавливать во множестве форм, таких как жидкости, гели, пилюли, таблетки, аэрозоли, пленки, мицеллы, порошки, продукты питания, кормовые гранулы или инкапсулированные формы, включая наноинкапсулированные формы.
Способы анализа для измерения активности альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, например, для определения наличия у полипептида активности альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, хорошо известны в данной области и находятся в объеме этого изобретения; см. Е.Е. Беккег & К.Р. Кйзоп, 1. ΒίοΙ. Сйет. 267, 1050710514, 1992; Тайа Т.8., Бейз Т.Ь., РипДса!юп апд сйагасЮпхайоп οί 2-ке!о-3-деоху-6-рйозрйод1исопа!е а1до1азе Ггот Ахо1оЬас1ег уте1апди: еуЛепсе 1йа1 1йе епхуте 1з Ы1ипс!юпа1 !оуагдз 2-ке1о-4-йудгоху д1и!ага!е с1еауаде, Вюсйет Вюрйуз Кез Соттип. 1994 Арг 15; 200(1):459-66; Беккег Е.Е., КоЬез К.Б., Огаду 8К, 2-ке1о-4-йудгоху д1и!ага!е а1до1азе Ггот Ьоуте йуег, Ме!йодз Епхуток 1975; 42:280-5; Беккег Е.Е., МзЫйага Н., Огаду 8.К., Ме!йодз Епхуток 1975; 42:285-90, 2-ке1о-4-йудгоху д1и!ага!е а1до1азе Ггот ЕзсйепсЫа сой; МзЫйага Н., Беккег ЕЕ, Вюсйнп Вюрйуз Ас1а. 1969 1и1 8; 185 (1): 255-7, А з!егеозрес1йс 2ке!о-4-йудгоху д1и!ага!е а1до1азе Ггот ЕзсйепсЫа сой. Один пример пригодного способа анализа для определения наличия у полипептида активности альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такой как альдолаза НМО и/или КНО, описан в примере 3.
В некоторых вариантах осуществления альдолазы по этому изобретению можно эффективно применять в условиях различных значений рН, включая например, условия из диапазона от приблизительно 3,0 до приблизительно 12,0. В других вариантах осуществления альдолазы по этому изобретению можно использовать при рН приблизительно 3,0, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5 или приблизительно 12,0. Условия реакций, проводимых в кислых или щелочных условиях, также могут быть преимущественными, например, в некоторых промышленных или фармацевтических способах применения ферментов по этому изобретению.
Это изобретение относится к полипептидам альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению в различных формах и составах. В способах по этому изобретению полипептиды альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению применяют в различных формах и составах. Например, очищенные полипептиды альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, можно применять в препаратах ферментов, используемых для получения К-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4кетоглутаровой кислоты (К-МР) и определенных стереоизомеров монатина, таких как К,К- и 8.Емонатин, и их солей, а также определенных стереоизомеров производных монатина, таких как К,К- и 8,К-конфигурации производных монатина, и их солей, или в фармацевтических или диетологических способах применения. Альтернативно ферменты по этому изобретению можно применять непосредственно в процессах получения К-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (К-МР) и некоторых стереоизомеров монатина, таких как К,К- и 8,К-монатин, и их солей, а также некоторых стереоизомеров производных монатина, таких как К,К- и 8,К-конфигурации производных монатина, и их солей, для обработки продуктов питания, жидкостей или кормов и т.д.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению можно экспрессировать в микроорганизме с использованием способов, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления полипептиды альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению перед применением в способах по этому изобретению можно иммобилизовывать на твердой положке. Способы иммобилизации ферментов на твердых подложках широко известны в данной области, например 1. Мо1. Са1. В: ЕпхушаЦс 6 (1999) 29-39; Сй1уа!а е! а1. Вюса!а1уз1з: IттοЬ^1^ζеД се11з апд епхутез, 1 Мо1. Са!. 37 (1986) 1-24: 8йагта е! а1., [ттоЬШхед Вюта!епа1з Тесйшс.|иез апд Аррйсайопз, Апдеу. Сйет. ΙπΓ Ед. Епд1. 21 (1982) 837-54: Ьазкш (Ед.), Епхутез апд IттοЬ^1^ζеД Се11з т Вю!есйпо1оду.
Нуклеиновые кислоты, зонды и ингибиторные молекулы
Это изобретение относится к выделенным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, например, см. список последовательностей; нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, включая полинуклеотидные последовательности по этому изобретению, например, см. список последовательностей; включая экспрессирующие кассеты, такие как экспрессирующие векторы и различные носители для кло
- 33 019971 нирования, содержащие нуклеиновые кислоты по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к способам выявления, идентификации или выделения новых полипептидных последовательностей альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, с использованием нуклеиновых кислот по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к способам ингибирования экспрессии генов, кодирующих альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, и их транскриптов с использованием нуклеиновых кислот по этому изобретению.
Также предусмотрены способы модификации нуклеиновых кислот по этому изобретению, включая получение вариантов нуклеиновых кислот по этому изобретению, например, посредством синтетической пересборки лигированием, оптимизированной системы направленных изменений и/или мутагенеза с насыщением, такого как мутагенез с насыщением сайта гена (С88М). Термин мутагенез с насыщением или мутагенез с насыщением сайта гена, или С88М, включает способ, в котором используются вырожденные олигонуклеотидные праймеры для внесения в полинуклеотид точковых мутаций, как подробно описано ниже. Термин оптимизированная система направленных изменений или оптимизированные направленные изменения включает способ повторной сборки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновых кислот, например родственных генов, и подробно пояснен ниже. Термин синтетическая пересборка лигированием или 8ЬЯ включает способ лигирования фрагментов олигонуклеотидов неслучайным образом и подробно объяснен ниже. Термин вариант относится к полинуклеотидам или полипептидам по этому изобретению, модифицированным по одной или нескольким парам оснований, кодонам, интронам, экзонам или аминокислотным остаткам (соответственно), которые, тем не менее, сохраняют биологическую активность альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению. Варианты можно получать любым количеством способов, включая способы, например, такие как ПЦР с пониженной точностью, перетасовка, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, ПЦР со сборкой, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, пересборка гена, С88М и любое их сочетание.
Нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно получать, выделять и/или подвергать манипулированию, например, клонированием и экспрессией библиотек кДНК, амплификацией транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и т.п. Например, последовательности по этому изобретению изначально были получены из источников окружающей среды. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, и к полипептидам, кодируемым ими, предпочтительно образованным из обычного источника, такого как окружающая среда, смешанная культура или бактериальный источник.
При применении на практике способов по этому изобретению гомологичные гены можно модифицировать посредством манипулирования с матричной нуклеиновой кислотой, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления это изобретение можно применять на практике совместно с любым способом или протоколом или устройством, известным в данной области, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе.
Как используют в настоящем документе, выражения нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из них, к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую (комплементарную) цепь, к пептидной нуклеиновой кислоте ^ΝΆ), или любому ДНК-подобному или РНК-подобному соединению природного или синтетического происхождения. Выражения нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты включают олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, ίΡΝΆ) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь, пептидную нуклеиновую кислоту ^ΝΆ), или любое ДНК-подобное или РНК-подобное соединение природного или синтетического происхождения, включая, например, ίΡΝΛ. рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные ίΚΝΆ, например гЯЫР). Термин включает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также включает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими остовами, см. например, Май (1997) Тох1со1. Арр1. Рйагтасо1. 144:189-197; 81гаи88-8оикир (1997) ВюсйетМгу 36:8 692-8698; 8атз1ад (1996) Апбзепзе №.1с1сю Лаб Эгид Эсх 6:153-156. Олигонуклеотид включает либо одноцепочечный полидезоксинуклеотид, либо две комплементарные полидезоксинуклеотидные цепи, которые могут быть химически синтезированными. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5'-фосфата и, таким образом, не лигируются с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата в виде АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид может быть лигирован с фрагментом, который не является дефосфорилированным.
Кодирующая последовательность или нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая
- 34 019971 транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, когда она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Термин ген означает сегмент ДНК, вовлеченный в продукцию полипептидной цепи; он включает участки, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидерная последовательность и хвост), а также, когда они существуют, встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). Промоторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если РНК-полимераза, которая инициирует транскрипцию в промоторе, будет транскрибировать кодирующую последовательность в мРНК. Как используют в настоящем документе, термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновых кислот (например, ДНК). Он может относиться к функциональной взаимосвязи регулирующей транскрипцию последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота по этому изобретению, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой экспрессирующей системе. Как правило, регулирующие транскрипцию промоторные последовательности, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются цис-регуляторными. Однако некоторые регулирующие транскрипцию последовательности, такие как энхансеры, не требуют физического примыкания или локализации, близкой к кодирующим последовательностям, транскрипцию которых они усиливают.
Как используется в настоящем документе, термин экспрессирующая кассета относится к нуклеотидной последовательности, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т.е. последовательности, кодирующей белок, такой как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС по этому изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты включают по меньшей мере промотор, функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью и необязательно с другими последовательностями, такими как сигналы терминации транскрипции. Также можно использовать дополнительные факторы, например энхансеры, альфа-факторы, необходимые для осуществления экспрессии или способствующие ей. Таким образом, экспрессирующие кассеты также включают плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любые формы вектора с рекомбинантной голой ДНК и т.п. Вектор содержит нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Следует понимать, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются ими, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), к которым фрагменты ДНК могут быть присоединены и могут становиться реплицирующимися. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см. патент США № 5217879) и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. В случае, когда рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описаны как содержащие экспрессирующий вектор, то он включает как экстрахромосомную кольцевую и линейную ДНК, так и ДНК, которая встраивается в хромосому(ы) хозяина. В случае, когда вектор поддерживается клеткой-хозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза в качестве автономной структуры, либо он является встроенным в геном хозяина.
Как используют в настоящем документе, термин рекомбинантный включает нуклеиновую кислоту, которая является смежной с остовом нуклеиновой кислоты, с которой она не является смежной в природном окружении. В некоторых вариантах осуществления для того, чтобы являться обогащенными, нуклеиновые кислоты должны быть представлены на 5% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности молекул нуклеиновых кислот остова. Молекулы остова в соответствии с этим изобретением включают нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие векторы, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, встраивающиеся нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для хранения интересующей вставки нуклеиновой кислоты или манипулирования с ней. Как правило, обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 15% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остова. Более конкретно, обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 50% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остова. В некоторых вариантах осуществления обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 90% или от количества вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остовов.
Один вариант осуществления этого изобретения относится к выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, содержащей одну из последовательностей по этому изобретению или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 или более последовательно расположенных оснований нуклеиновой кислоты по этому изобретению. Выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты могут включать ДНК, включая
- 35 019971 кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и если она является одноцепочечной, то она может представлять собой кодирующую или некодирующую (антисмысловую) цепь. Альтернативно, выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты могут включать РНК.
Выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно использовать для получения одного из полипептидов по этому изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более последовательно расположенных аминокислот одного из полипептидов по этому изобретению. Таким образом, другой вариант осуществления этого изобретения относится к выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая кодирует один из полипептидов по этому изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 последовательно расположенных аминокислот одного из полипептидов по этому изобретению. Кодирующие последовательности этих нуклеиновых кислот могут быть идентичными одной из кодирующих последовательностей одной из нуклеиновых кислот по этому изобретению, или они могут представлять собой отличающиеся кодирующие последовательности, которые кодируют один из полипептидов по этому изобретению по меньшей мере с 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более последовательно расположенными аминокислотами одного из полипептидов по этому изобретению, как результат избыточности или вырожденности генетического кода. Генетический код хорошо известен специалистам в данной области и может быть найден, например, на стр.214 в В. ЬеМп, Сепек VI ОхГогб Ипщегкйу Ргекк, 1997.
Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует один из полипептидов по этому изобретению и, по существу, идентичные им последовательности, может включать, но не ограничиваться ими: кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению и дополнительные кодирующие последовательности, такие как лидерные последовательности или последовательности пробелков и некодирующие последовательности, такие как интроны или 5'- и/или 3'-некодирующие последовательности кодирующей последовательности. Таким образом, как используют в настоящем документе, термин полинуклеотид, кодирующий полипептид относится к полинуклеотиду, который включает кодирующую полипептид последовательность, а также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
Альтернативно последовательности нуклеиновых кислот по этому изобретению и, по существу, идентичные им последовательности можно подвергать мутагенезу с использованием общепринятых технологий, таких как сайт-направленный мутагенез, или других известных специалистам в данной области технологий для внесения молчащих изменений в полинуклеотиды по этому изобретению. Как используют в настоящем документе, молчащие изменения включают, например, изменения, которые не изменяют аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом. Такие изменения могут быть желательными для повышения уровня полипептида, продуцируемого клетками-хозяевами, содержащими вектор, кодирующий полипептид, посредством внесения кодонов или кодоновых пар, которые часто встречаются в организме хозяина.
Также это изобретение относится к полинуклеотидам, которые обладают нуклеотидными изменениями, которые приводят к аминокислотным заменам, вставкам, делециям, слияниям и укорочениям в полипептидах по этому изобретению. Такие нуклеотидные изменения можно вносить с использованием технологий, таких как сайт-направленный мутагенез, случайный химический мутагенез, делеция посредством экзонуклеазы III и другие технологии рекомбинантных ДНК. Альтернативно такие нуклеотидные изменения могут представлять собой природные аллельные варианты, которые выделяют посредством идентификации нуклеиновых кислот, которые специфично гибридизуются с зондами, содержащими по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований одной из последовательностей по этому изобретению (или комплементарной ей последовательности) в условиях высокой, умеренной и низкой строгости, как представлено в настоящем документе.
Основные способы
Нуклеиновые кислоты, используемые для применения на практике этого изобретения, любые из РНК, κίΚ,ΝΛ, ιηίΚΝΛ, антисмысловой нуклеиновой кислоты, кДНК, геномной ДНК, векторов, вирусов или их гибридов, можно выделять из множества источников, получать способами генетической инженерии, амплифицировать и/или экспрессировать/получать рекомбинантными способами. Рекомбинантные полипептиды (такие как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолазы НМС и/или КНС), полученные из этих нуклеиновых кислот, можно отдельно выделять или клонировать, и их можно исследовать в отношении требуемой активности. Можно использовать любую рекомбинантную экспрессирующую систему, включая экспрессирующие системы клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.
Альтернативно эти нуклеиновые кислоты можно синтезировать ίη νίΙΐΌ хорошо известными способами химического синтеза, как описано, например, в Абатк (1983) I. Ат. СНет. 8ос. 105:661; Βе1οикον (1997) ШсШс Ас1бк Век. 25:3440-3444; Ргепке1 (1995) Ргее Вабю. Вю1. Меб. 19:373-380; В1оттегк (1994) ВюсНетМгу 33:7886-7896; №1гапд (1979) Ме111. ЕпхутоН 68:90; Вго\уп (1979) Ме111. ЕпхутоН 68:109;
- 36 019971
Веаисаде (1981) Тегга. Ьей. 22:1859; в патенте США № 4458066.
Способы манипулирования с нуклеиновыми кислотами, например, такие как субклонирование, мечение зондом (например, мечение со случайными праймерами с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п., полностью описаны в научной и патентной литературе, см. 8атЬгоок, еб., М0ЬЕСиЬАВ Ск0МХС: А ЬАВ0ВАТ0ВУ МАНиАЬ (2ΠΏ ЕЭ.), Уок.1-3, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, (1989); СИВВЕКГ РВ0Т0С0Й8 1Ы М0ЬЕСиЬАВ ВЮЬ0СУ, АикиЬе1, еб. 1оки \\л1еу & 8оик, 1ис., Хеи Уогк (1997); ЙАВ0ВАТ0ВУ ТЕСНХ1ОЕЕ8 1Ы ΒΙ0СНЕМ18ТВУ АИО М0ЕЕСЕЕАВ ВЮЬ0СУ: Н¥ВВЮ1/АТ10Х А'ГГН ХЕСЕЕ1С АСЮ РВ0ВЕ8, Рай I. Ткеогу аиб №.1с1ею ас1б Ргерагайои, Туккеи, еб. Е1кеу1ег, КУ. (1993).
Другими пригодными способами получения нуклеиновых кислот и манипулирования с ними, используемыми для применения на практике способов по этому изобретению, является клонирование из геномных образцов и, если желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по этому изобретению, включают геномные библиотеки или библиотеки кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), см. патенты США №№ 5721118; 6025155; искусственных хромосомах человека, см. ВокеиГе1б (1997) №11. Сеие!. 15:333-335; искусственных хромосомах дрожжей (УАС); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р1, см. \¥оон (1998) Сеиотюк 50:306-316; векторах на основе Р1 (РАС), см. Кет (1997) Вюйсктциек 23:120-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по этому изобретению, соединена в соответствующей рамке считывания с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслируемого полипептида или его фрагмента.
Это изобретение относится к слитым белкам и кодирующим их нуклеиновым кислотам. Полипептид по этому изобретению может быть слитым с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как №концевые идентификационные пептиды, которые придают требуемые свойства, такие как повышение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды по этому изобретению также можно синтезировать и экспрессировать в качестве слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ними, например, для получения более иммуногенного пептида, для упрощения выделения рекомбинантного синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и т.п. Упрощающие определение и очистку домены включают, например, хелатирующие металлы пептиды, такие как полигистидиновые участки и молекулы гистидин-триптофана, которые позволяют очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые позволяют очистку на иммобилизованных иммуноглобулинах, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности РЬАС8 (1ттииех Согр, 8еа!!1е \¥А). Добавление расщепляемых линкерных последовательностей, таких как последовательности для фактора Ха или энтерокиназы (1иуйгодеи, Саг1кЬаб, СА) между доменом для очистки и пептидом или полипептидом, содержащим мотив, облегчает очистку. Например, экспрессирующий вектор может включать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина с последующим тиоредоксином и участком расщепления энтерокиназой (см. например, ^1Шатк (1995) Вюскетййу 34:1787-1797; ЭоЬек (1998) Рго!ет Ехрг. РнпГ. 12:404-414). Остатки гистидина упрощают определение и очистку, а участок расщепления энтерокиназой обеспечивает способы очистки эпитопа от остальной части слитого белка. Технология, относящаяся к векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков полностью описаны в научной и патентной литературе, см. например, Кго11 (1993) ЭНА Се11. Вю1., 12:441-53.
Последовательности для контроля транскрипции и трансляции
Это изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (таким как ДНК) по этому изобретению, функционально связанным с последовательностью(ями) (например, транскрипционными или трансляционными) для контроля экспрессии, такой как промоторы или энхансеры, для управления синтезом/экспрессией РНК и модулирования их. Последовательность для контроля экспрессии может находиться в экспрессирующем векторе. Иллюстративные бактериальные промоторы включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, 1атЬба РВ, Ръ и 1гр. Иллюстративные эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТВ ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина Ι.
Как используют в настоящем документе, термин промотор включает все последовательности, способные запускать транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, такой как клетка растения. Таким образом, промоторы, используемые в конструкциях по этому изобретению, включают цисрегуляторные элементы контроля транскрипции и регуляторные последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модулирование времени начала и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-регуляторный элемент контроля транскрипции, включающий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, ориджин репликации, последовательности для встраивания в хромосому, 5'- и 3'-нетранслируемые области или последовательности интронов, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти цис-регуляторные последовательности могут взаимодействовать с белками или другими биологическими молекулами для осуществления (запуск/завершение, регуляция, моду
- 37 019971 лирование и т.д.) транскрипции. Конститутивные промоторы представляет собой промоторы, которые осуществляют экспрессию постоянно в большинстве условий окружающей среды и стадий развития или дифференцировки. Индуцибельные или регулируемые промоторы направляют экспрессию нуклеиновой кислоты по этому изобретению под влиянием условий окружающей среды или стадии развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию индуцибельными промоторами, включают анаэробные условия, повышенную температуру, сухость воздуха или наличие света.
Тканеспецифичные промоторы представляет собой элементы контроля транскрипции, которые активны только в конкретных клетках или тканях, или органах, например, в растениях или в животных. Тканеспецифичную регуляцию могут обеспечивать определенные внутренние факторы, которые обеспечивают экспрессию генов, кодирующих белки, специфичные для данной ткани. Известно, что такие факторы существуют у млекопитающих и растений, что обеспечивает развитие конкретных тканей.
Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или !гр Ε.со1^, промотор 1асЦ промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др1, промотор 1атЬба Рр, промотор 1атЬба Рь, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3фосфоглицераткиназа (РОК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промоторы 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина-Ι. Также можно использовать другие промоторы, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида или его фрагмента в бактериях, включают промоторы 1ас или 1гр Е.со11, промотор 1асЦ промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др1, промотор 1атЬба Рр, промотор 1атЬба Рь, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (РОК), и промотор кислой фосфатазы. Промоторы грибов включают промотор α-фактора. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металотионеина-1. Также можно использовать другие промоторы, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.
Тканеспецифичные промоторы растений
Это изобретение относится к экспрессирующим кассетам, которые могут экспрессироваться с тканевой специфичностью, например, которые могут экспрессировать фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению с тканевой специфичностью. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к растениям или семенам, которые экспрессируют фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению с тканевой специфичностью. Тканевая специфичность может представлять собой специфичность в отношении семян, специфичность в отношении стебля, специфичность в отношении листьев, специфичность в отношении корней, специфичность в отношении плодов и т.п.
Термин растение включает целые растения, части растений (например, листья, стебли, цветы, корни и т.д.), протопласты растений, семена и клетки растений, и их потомство. Класс растений, которые можно использовать в способе по этому изобретению, как правило, настолько широк, как и класс высших растений, пригодных для технологий трансформации, включая покрытосеменные (однодольные и двудольные растения), а также голосемянные. Они включают растения с различными уровнями плоидности, включая полиплоидное, диплоидное, гаплоидное и гемизиготное состояния. Как используют в настоящем документе, термин трансгенное растение включает растения или клетки растений, в которые встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновые кислоты и различные рекомбинантные конструкции (такие как экспрессирующие кассеты) по этому изобретению.
В некоторых вариантах осуществления конститутивный промотор, такой как промотор СаМУ 358, можно использовать для экспрессии в конкретных частях растения или в семени, или во всем растении. Например, для сверхэкспрессии можно использовать фрагмент промотора растения, который запускает экспрессию нуклеиновой кислоты в некоторых или всех тканях растения, например регенерирующего растения. Такие промоторы относятся в настоящем документе к конститутивным промоторам, и они являются активными в большинстве условий окружающей среды и стадий развития или дифференцировки клетки. Примеры конститутивных промоторов включают участок инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) 358, 1'- или 2'-промотор, полученный из Т-ДНК АдгоЬас!епит 1нтеГааепк, и другие участки инициации транскрипции из различных генов растений, известных специалистам в данной области. Такие гены включают, например, АСТ11 из АтаЬ1борк1к (Ниапд (1996) Р1ап! Мо1. Вю1. 33:125-139); Са!3 из АтаЬ1борк1к (ОепВапк № И43147, /1юпд (1996) Мо1. Оеп. Оепе!. 251:196-203); ген, кодирующий стеароил-ацильный белок-носитель десатуразу из Втаккюа парик (ОепЬапк № Х74782, 8о1осотЬе (1994) Р1ап! Рйукю1 104:1167-1176); ОРс1 из маиса (ОепВапк № Х15596; Майте/ (1989) I. Мо1. Вю1. 208:551-565); Орс2 из маиса (ОепВапк № И45855, МащипаШ (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1. 33:97-112); промоторы растений, описанные в патентах США №№ 4962028, 5633440.
В этом изобретении используются тканеспецифичные или конститутивные промоторы, полученные из вирусов, которые могут включать, например, субгеномный промотор тобамовируса (Китадат (1995)
- 38 019971
Ргос. N311. Асаб. Лс1. ИЛЛ 92:1679-1683; промотор палочковидного вируса риса (РТВУ), который реплицируется только в клетках флоэмы инфицированных рисовых растений, при этом промотор запускает высокую экспрессию специфичного для флоэмы репортерного гена; промотор вируса мозаики жилок кассавы (СУМУ) с наиболее высокой активностью в сосудистых элементах, в клетках мезофилла листьев и на концах корней (Уегбадиег (1996) Р1ап1 Мо1. ΒίοΙ. 31:1129-1139).
В некоторых вариантах осуществления промотор растений направляет экспрессию нуклеиновой кислоты, экспрессирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в конкретной ткани, органе, типе клеток (т.е. тканеспецифичные промоторы), или, в ином случае, экспрессия может находиться под более точным контролем окружающей среды или стадии развития или под контролем индуцибельного промотора. Примеры окружающих условий, которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, наличие света или опрыскивание химическими реагентами/гормонами. Например, это изобретение относится к промотору маиса, индуцируемому засухой (Викк (1997), выше); промотору картофеля, индуцируемому холодом, засухой и высоким содержанием соли (К1гсй (1997) Р1ап1 Мо1. ΒίοΙ. 33:897-909).
В некоторых вариантах осуществления тканеспецифичные промоторы могут обеспечивать транскрипцию только в течение определенных временных рамок стадии развития этой ткани. См. В1ахс.|иех (1998) Р1ап1 Се11 10:791-800, где охарактеризован промотор гена ЬЕАЕУ из АгаЫборык. См. также Сагбоп (1997) Р1ап1 1 12:367-77, где описан транскрипционный фактор ЛРЬ3, который распознает консервативную последовательность мотива в промоторной области Α. ШаПапа гена идентичности меристемы цветка АРЕ и Мапбе1 (1995) Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1.29, рр.995-1004, где описан промотор меристемы еШ4. Можно использовать тканеспецифичные промоторы, которые активны в течение всего жизненного цикла конкретной ткани. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению функционально связаны с промотором, изначально активным только в клетках хлопковых волокон. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению функционально связаны с промотором, активным, главным образом, на стадиях удлинения клеток хлопковых волокон, например, как описано Втекай (1996), выше. Нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором гена РЬ12А для предпочтительной экспрессии в клетках хлопковых волокон (ниже). См. также, 1окп (1997) Ргос. №11. Асаб. Лск ИЛА 89:5769-5773; 1окп, е! а1., патенты США №№ 5608148 и 5602321, где описаны промоторы, специфичные для хлопковых волокон, и способы создания трансгенных хлопковых растений. Также для экспрессии нуклеиновых кислот по этому изобретению можно использовать промоторы, специфичные для корней. Примеры промоторов, специфичных для корней, включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (ПеЬ1к1е (1990) Ш1. Реу. Су!о1. 123:39-60). Другие промоторы, которые можно использовать для экспрессии нуклеиновых кислот по этому изобретению, включают, например, промоторы, специфичные для семяпочки, специфичные для зародыша, специфичные для эндосперма, специфичные для интегумента, специфичные для оболочки семени или некоторые их сочетания; промотор, специфичный для листьев (см. Викк (1997) Р1ап! 1. 11:1285-1295, где описан промотор маиса, специфичный для листьев); промотор 0ВЕ13 из АдгоЬас1егшш бпходепек (который проявляет высокую активность в корнях, см. Напкеп (1997), выше); промотор, специфичный для пыльцы маиса (см. Сиеггего (1990) Мо1. Сеп. Сепе!. 224:161-168); можно использовать промотор томатов, активный в процессе созревания плодов, при старении и опадании листвы и, в меньшей степени, в цветках (см. В1ите (1997) Р1ап! 1. 12:731-746); специфичный для пестика промотор из гена картофеля ЛК2 (см. Еюкег (1997) Р1ап! Мо1. В1о1. 35:425-431); ген В1ес4 из гороха, который активен в эпидермальной ткани вегетативных и цветочных верхушек побегов трансгенной люцерны, что делает его ценным инструментом для направления экспрессии чужеродных генов в эпидермальный слой активно растущих побегов или волокон; ген, специфичный для семяпочки ВЕЬ1 (см. Ве1кег (1995) Се11 83:735-742, СепВапк № И39944); и/или промотор в К1ее, патент США № 5589583, где описан участок промотора растений, способный обеспечивать высокий уровень транскрипции в ткани меристемы и/или в быстроделящихся клетках.
В некоторых вариантах осуществления для экспрессии нуклеиновых кислот по этому изобретению используют промоторы растений, которые индуцируются под воздействием гормонов растений, таких как ауксины. Например, в этом изобретении можно использовать отвечающие на ауксин элементы фрагмента промотора Е1 (АихВЕк) в сое (С1усте тах Ь.) (Ьт (1997) Р1ап! Ркукю1. 115:397-407); отвечающий на ауксин промотор СЛТ6 АгаЫборык (также отвечающий на салициловую кислоту и пероксид водорода) (Скеп (1996) Р1ап! 1. 10:955-966); индуцируемый ауксином промотор рагС из табака (Лака1 (1996) 37:906913); отвечающий на биотин элемент растений (Л!гек (1997) Мо1. Р1ап! МюгоЬе !п!егас!. 10:933-937); и промотор, отвечающий на гормон стресса, абсцизовую кислоту (Лкееп (1996) Лс1епсе 274:1900-1902).
Также нуклеиновые кислоты по этому изобретению могут быть функционально связаны с промоторами растений, которые индуцируются под воздействием химических реагентов, которые могут быть нанесены на растения, таких как гербициды или противомикробные средства. Например, можно использовать промотор маиса Ы2-2, активируемый антидотами гербицидов на основе бензолсульфонамида (Ое Уеу1бег (1997) Р1ап! Се11 Ркукю1. 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов приводит к индукции различных систем экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатоде и в апикальной меристеме побега. Кодирующая последовательность может находиться по контролем, например, инду
- 39 019971 цируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы из Ауспа вайуа Ь. (овес) (Мавдгаи (1997) Р1ап1 1. 11:465-473); или элемент, отвечающий на салициловую кислоту (81апдс (1997) Р1ап1 1. 11:1315-1324). Используя химически индуцируемые (например, индуцируемых гормонами или пестицидами) промоторы, т.е. промоторы, отвечающие на химический реагент, который можно наносить на трансгенное растение в поле, экспрессию полипептида по этому изобретению можно индуцировать на конкретной стадии развития растения. Таким образом, это изобретение также относится к трансгенным растениям, содержащим индуцибельный ген, кодирующий полипептиды по этому изобретению, диапазон растений-хозяев которого ограничивается видами растений-мишеней, такими как кукуруза, рис, ячмень, соя, томат, пшеница, картофель или другие зерновые культуры, индуцируемый на любой стадии развития зерновой культуры.
Специалист в данной области поймет, что тканеспецифичный промотор растений может запускать экспрессию функционально связанной последовательности в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления тканеспецифичный промотор представляет собой промотор, который запускает экспрессию предпочтительно в ткани-мишени или типе клеток-мишеней, но, кроме того, также может приводить к некоторой экспрессии в других тканях.
Также нуклеиновые кислоты по этому изобретению могут быть функционально связаны с промоторами растений, которые индуцируются под воздействием химических реагентов. Эти реагенты включают, например, гербициды, синтетические ауксины или противомикробные средства, которые можно наносить, например, распылять, на трансгенные растения. Индуцируемая экспрессия нуклеиновых кислот, продуцирующих фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению позволит специалисту по выращиванию растений проводить селекцию растений с оптимальной экспрессией и/или активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Таким образом, можно контролировать развитие частей растений. Таким образом, это изобретение относится к способам облегчения выращивания растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используют промотор маиса Ιπ2-2, активируемый антидотами гербицидов на основе бензолсульфонамида (Ис Усу1бсг (1997) Р1ап1 Сс11 Рйувю1. 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатоде и в апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности по этому изобретению также находятся под контролем индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы из Ауспа вайуа Ь. (овес) (Мавдгаи (1997) Р1ап1 1. 11:465-473); или отвечающего на салициловую кислоту элемента (81апдс (1997) Р1ап1 1. 11:1315-1324).
В некоторых вариантах осуществления для надлежащей экспрессии полипептида может быть необходим участок полиаденилирования на 3'-конце кодирующей области. Участок полиаденилирования может быть получен из природного гена, из множества других генов растений (или животных или других генов) или из генов в Т-ДНК агробактерий.
Экспрессирующие векторы и носители для клонирования
Это изобретение относится к экспрессирующим векторам и носителям для клонирования, содержащим нуклеиновые кислоты по этому изобретению, такие как последовательности, кодирующие ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению. Экспрессирующие векторы и носители для клонирования по этому изобретению могут содержать частицы вирусов, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, искусственные бактериальные хромосомы, вирусную ДНК (например, ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц, вируса псевдобешенства и производных 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как ВасШив, АврстдШив и дрожжи). Векторы по этому изобретению могут включать хромосомные, нехромосомные последовательности и синтетические последовательности ДНК. Большое количество пригодных векторов известно специалистам в данной области, и они являются коммерчески доступными. Иллюстративные векторы включают: бактериальные: векторы р^Ε™ (Οίη^α'!, Уа1спс1а, СА), плазмиды рВ^υΕ8СВIРТ™, векторы рИН, векторы 1атЬба-2АР (8ΐ^аΐадсис, Ьа 1о11а, СА); р1тс99а, рКК223-3, рЭВ540, рВГГ2Т (ΌΕ НсаИйсатс, Р1вса1а^ау, N1), векторы рЕТ (Хоуадсп, Маб1воп, \ΧΙ); эукариотические: рХТ1, р8О5 (8ΐ^аΐадсис, Ьа 1о11а, СА), р8УК3, рВРУ, рМ8О, р8УЬ8У40 (Рйаттааа). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор при условии, что они способны реплицироваться и являются устойчивыми в хозяине. В настоящем изобретением можно использовать векторы с низкой копийностью или с высокой копийностью. Плазмиды могут быть коммерчески доступными, общедоступными без ограничений, или их можно конструировать на основе доступных плазмид в соответствии с опубликованными способами. Плазмиды, эквивалентные плазмидам, описанным в настоящем документе, известны в данной области, и они очевидны среднему специалисту в данной области.
Экспрессирующий вектор может содержать промотор, участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последо
- 40 019971 вательности для усиления экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации, любые необходимые участки связывания рибосом, участок полиаденилирования, донорные и акцепторные участки сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых вариантах осуществления для обеспечения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.
В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину, для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е.ео1т и ген ТВР1 8. сегеу151ае. Промоторные участки можно выбирать из любых других требуемых генов с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селективными маркерами.
В некоторых вариантах осуществления для повышения уровней экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках содержат энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК длиной, как правило, от приблизительно 10 до приблизительно 300 п.о. Они могут воздействовать на промотор и повышать его транскрипцию. Иллюстративные энхансеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации с 100 по 270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.
Последовательность нуклеиновой кислоты можно встраивать в вектор множеством способов. Как правило, последовательность лигируют в требуемом положении в векторе после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно можно лигировать тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество технологий клонирования, например, как описано в АикиЬе1 е! а1. Сиггей Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη \УПеу & 8оик, 1пс. 1997 и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Маииа1 2ий Ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк (1989). Такие способы и другие способы находятся в пределах квалификации специалистов в данной области.
Вектор может быть представлен в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Множество векторов для клонирования и экспрессирующих векторов для применения в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, 8атЬгоок.
Конкретные бактериальные векторы, которые можно использовать, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора для клонирования рВВ322 (АТСС 37017), рКК223-3 (Рйагтата Рте СйеткаН, Иррка1а, 8\уейеп), СЕМ1 (Рготеда Вю1ес, Май1кои, VI, И8А) рРЕ70, рРЕ60, рСР-9 (Оадеи, Уа1еис1а, СА), ρΌ10, рыХ174 рВЬиЕ8СК!РТ II К8, рИН8А, рИН16а, рИН18А, р\Н46А (8ййадеие, Ьа До11а, СА), рйс99а, рКК223-3, рКК233-3, ΌΚ540, рВ1Т5 (Рйагтааа), рКК232-8, рЕТ (Жуадеи, Маййои, XVI) и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают р8У2САТ, р0С44, рХТ1, р8С (8ййадеие, Ьа йоНа, СА) р8УК3, рВРУ, рМ8С и р8УЬ (Рйагтата). Однако можно использовать любой другой вектор, при условии, что он способен реплицироваться и является жизнеспособным в клетке-хозяине.
Нуклеиновые кислоты по этому изобретению могут быть экспрессированы в экспрессирующих кассетах, векторах или вирусах и могут быть временно или постоянно экспрессированы в клетках растений и семян. В одной иллюстративной временной экспрессирующей системе используются эписомальные экспрессирующие системы, например, вирусная РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), которая образуется в ядре при транскрипции эписомальной мини-хромосомы, содержащей сверхскрученную ДНК, см. Соуеу (1990) Ргос. ИаИ. Асай. 8ск И8А 87:1633-1637. Альтернативно кодирующие последовательности, т.е. все последовательности по этому изобретению или их субфрагменты, могут встраиваться в геном растительной клетки-хозяина и становиться составляющими частями хромосомной ДНК хозяина. Таким образом могут экспрессироваться смысловые и антисмысловые транскрипты. Вектор, содержащий последовательности (например, промоторы или кодирующие участки) нуклеиновых кислот по этому изобретению, может содержать маркерный ген, который придает селектируемый фенотип клетке растений или семени. Например, маркер может обеспечивать устойчивость к биоциду, в частности, устойчивость к антибиотику, такую как устойчивость к канамицину, С418, блеомицину, гигромицину, или устойчивость к гербициду, такую как устойчивость к хлорсульфурону или Вайа.
Экспрессирующие векторы, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты и белки в растениях, хорошо известны в данной области и могут включать, например, векторы из АдгоЬайегшт крр., вируса картофеля X (см., Аиде11 (1997) ЕМВО Р 16:3675-3684), вируса табачной мозаики (см. Сакрег (1996) Сеие 173:69-73), вируса кустистой карликовости томатов (см. НШтаи (1989) У1го1оду 169:42-50), вируса гравировки табака (см. Эо1)а (1997) У1го1оду 234:243-252), вируса желтой мозаики фасоли (см. Мопиада
- 41 019971 (1993) МютоЬю1 Iттиηο1. 37:471-476), вируса мозаики цветной капусты (см. СессЫш (1997) Мо1. Р1ап1 М1сгоЬе !п(егас(. 10:1094-1101), перемещающегося элемента маиса Ас/Бк (см. РиЬт (1997) Мо1. Се11. Вю1. 17:6294-6302; Кипхе (1996) Сигг. Тор. МютоЬюй Iттиηо1. 204:161-194) и перемещающегося элемента маиса супрессора-мутатора (8рт) (см. 8сй1арр1 (1996) Р1ап! Мо1. Вю1. 32:717-725); и их производных.
В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор может иметь две системы репликации, чтобы иметь возможность поддерживаться в двух организмах, например, в клетках млекопитающих или насекомых для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и размножения. Более того, в случае встраивающихся экспрессирующих векторов, экспрессирующий вектор может содержать по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина. Он может содержать две гомологичных последовательности, которые фланкируют экспрессирующую конструкцию. Встраивающийся вектор можно направлять в конкретный локус в клетке-хозяине, посредством выбора соответствующей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкции встраивающихся векторов хорошо известны в данной области.
Также экспрессирующие векторы по этому изобретению могут включать ген селективного маркера для обеспечения селекции бактериальных штаммов, в которых произошла трансформация, такой как гены, которые придают бактериям устойчивость к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, неомицин и тетрациклин. Селективные маркеры также могут включать гены, участвующие в биосинтезе, такие как гены, участвующие в каскадах биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.
Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе функционально связана с соответствующей последовательностью(ями) контроля экспрессии (промотором) для управления синтезом РНК. Конкретные упомянутые бактериальные промоторы включают 1асЦ 1ас2, Т3, Т7, др!, 1атЬба Рр, Рь и 1гр. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промоторы 8У40, ЬТР ретровирусов и промотор мышиного металлотеонеина-Ι. Выбор пригодного вектора и промотора находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Также экспрессирующий вектор содержит участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Промоторные участки могут быть выбраны из любого требуемого гена с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селективными маркерами. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных маркеров для придания фенотипических особенностей в целях селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой.
Экспрессирующие векторы млекопитающих также могут содержать ориджин репликации, любой необходимый участок связывания рибосом, участок полиаденилирования, донорный и акцепторный участки сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых вариантах осуществления, для обеспечения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.
В целях повышения уровня экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры. Энхансеры представляют собой цисрегуляторные элементы ДНК длиной, как правило, от приблизительно 10 до приблизительно 300 п.о., которые воздействуют на промотор и повышают его транскрипцию. Их примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации с 100 по 270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.
Кроме того, экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину в Е.Со11, и ген ТРР1 8. сетеу181ае.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая один из полипептидов по этому изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более его последовательно расположенных аминокислот, соединена в соответствующей рамке считывания с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота необязательно может кодировать слитый полипептид, в котором один из полипептидов по этому изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более его последовательно расположенных аминокислот, являются слитыми с гетерологичными пептидами или полипептидами, такими как ^концевые идентификационные пептиды, которые придают требуемые свойства, такие как повышенная стабильность или упрощение очистки.
- 42 019971
Соответствующая последовательность ДНК может быть встроена в вектор множеством способов. Как правило, последовательность ДНК лигируют в желательном положении в векторе после расщепления вставки и векторе соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно можно лигировать тупые концы вставки и вектора. Множество технологий клонирования описано в АикиЬе1 е! а1. Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. ίοΐιη \Убеу & 8опк, 1пс. 1997 и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!оту Мапиа1 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (198 9). Такие способы и другие способы находятся в пределах квалификации специалистов в данной области.
Вектор может быть представлен, например, в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Множество векторов для клонирования и экспрессирующих векторов для применения в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны 8атЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С'бошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., (1989).
Клетки-хозяева и трансформированные клетки
Также это изобретение относится к трансформированным клеткам, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению, такие как последовательности, кодирующие ферменты альдолазы, такие как пируватальдолазы, такие как альдолазы НМС и/или КНС, по этому изобретению, или векторы по этому изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные бактериальные клетки включают любой вид 8!гер!отусек, 8!арйу1ососсик, Ркеиботопак или Васб1ик, включая Е.соЕ, ВасШик киЬбНк, Ркеиботопак Пиогексепк, Васб1ик сегеик или 8а1топе11а !урЫтигшт. Иллюстративные клетки грибов включают любой вид АкрегдШик. Иллюстративные клетки дрожжей включают любой вид РюЫа, 8ассНаготусек, ЗсЫ/окассйаготусек, или 8сктапЫотусек, включая РюЫа рак!опк, 8ассНаготусек сегехыае или 8сЫхокассНаготусек ротЬе. Иллюстративные клетки насекомых включают любой вид 8робор!ега или ПтокорЫ1а, включая ИгокорНба 82 и 8робор!ега 8£9. Иллюстративные клетки животных включают СНО, СО8 или клетки меланомы Вотек или любые клеточные линии мыши или человека. Выбор пригодного хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области. Технологии трансформации большого множества видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе. См. ХУеыпд (1988) Апп. Βеν. Сепе!. 22:421-477; патент США № 5750870.
Вектор можно вводить в клетку-хозяина с использованием любой из множества технологий, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τίопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ΌΕΑΕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (ИаСк, Ь, О1Ьпег, М., Ва!!еу, Ь, Вакю Ме!Нобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, (1986)).
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты или векторы по этому изобретению вводят в клетки для скрининга, таким образом, нуклеиновые кислоты вводят в клетки способом, пригодным для последующей экспрессии нуклеиновой кислоты. Способ введения, главным образом, определяется типом клеток-мишеней. Иллюстративные способы включают осаждение с СаРО4, слияние липосом, липофекцию (например, ЫРОЕЕСТШ™), электропорацию, вирусную инфекцию и т.д. Нуклеиновые кислоты-кандидаты могут стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина (например, при ретровирусном введении) или могут существовать либо временно, либо постоянно в цитоплазме (т.е. при использовании традиционных плазмид, с использованием стандартных регуляторных последовательностей, селективных маркеров и т.д.). Поскольку для многих фармацевтически важных скринингов требуются клеткимишени человека или модельные клетки-мишени млекопитающих, можно использовать ретровирусные векторы, способные трансфицировать такие мишени.
Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, можно культивировать на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по этому изобретению. После трансформации пригодного штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток, выбранный промотор можно индуцировать соответствующими способами (например, смена температуры или химическое индуцирование), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для обеспечения продукции требуемого полипептида или его фрагмента.
Клетки можно собирать центрифугированием, разрушать физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт можно сохранять для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушать любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или применение средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент может быть извлечен и очищен из рекомбинантных культур клеток способами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, ани
- 43 019971 онную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида можно использовать стадии повторной сборки. Если необходимо, для конечных стадий очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать традиционным образом для продукции продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в способе продукции, полипептиды, продуцируемые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по этому изобретению также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.
Также для продукции полипептида по этому изобретению можно использовать бесклеточные системы трансляции. В бесклеточных системах трансляции могут использоваться мРНК, транскрибируемые с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления перед проведением реакции транскрипции ίη νίίτο конструкцию ДНК можно подвергать линеаризации. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с пригодным бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением требуемого полипептида или его фрагмента.
Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для придания фенотипических особенностей в целях селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е.сой.
Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, например нуклеиновые кислоты по этому изобретению, можно культивировать в общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой условия, ранее используемые для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и они очевидны среднему специалисту в данной области. Клоны, идентифицированные, как обладающие требуемой ферментативной активностью, затем можно секвенировать для идентификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент с повышенной активностью.
Это изобретение относится к способу сверхэкспрессии рекомбинантных ферментов альдолаз, таких как пируватальдолазы, такие как альдолазы НМС и/или КНС, в клетках, содержащих экспрессирующийся вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по этому изобретению, такую как нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательностей с иллюстративной последовательностью по этому изобретению на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 100 остатков, где идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием, или нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в строгих условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению, или ее подпоследовательностью. Сверхэкспрессию можно осуществлять любыми способами, такими как применение промотора с высокой активностью, бицистронного вектора или амплификация гена в векторе.
Нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно экспрессировать, или сверхэкспрессировать, в любой экспрессирующей системе ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό. Для экспрессии, или сверхэкспрессии, рекомбинантного белка можно использовать любые системы клеточных культур, включая бактериальные культуры, культуры насекомых, дрожжей, грибов или млекопитающих. Сверхэкспрессию можно обеспечивать посредством целесообразного выбора промоторов, энхансеров, векторов (например, применение векторов с репликоном, бицистронных векторов (см. Сипи (1996) ВюсЬет. ВюрЬук. Яек. Соттип. 229:295-8), сред, культур и т.п. В некоторых вариантах осуществления для сверхэкспрессии полипептидов по этому изобретению применяют амплификацию гена с использованием в клеточных системах селективных маркеров, например, глутаминсинтетазы (см. 8аг1бегк (1987) Эех. Вю1. 81а11б. 66:55-63).
Дополнительные детали, касающиеся этого подхода, находятся в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области. В конкретном неограничивающем примере такая общедоступная литература включает ЕР 0659215 (\УО 9403612 А1) (Νανηΐηίικη е1 а1.); Ьар1бо1, А., МесЬа1у, А., 8ЬоЬат, Υ., '^сгсхргсккюп амб ктд1е-к1ер ри^^Πсаι^οη оГ а 111егток1аЬ1е хуктаке Ггот ВасШик к1еаго111егторЫ1ик Т-6, I. Вю1ссЬпо1. №ν 51:259-64 (1996); ЬйЫ, Е., 1акта1, Ν.Β., Вегддшкб Р.Ь., Хуктаке Ггот 111е ехйете1у ШегторЫйс Ьас1епит Са1босе11ит кассйаго1уйсит: ονе^еxр^екк^οη оГ 111е деме ίη ЕксЬепсЫа сой амб сйа^асΐе^^ζаΐ^οη оГ 111е деме ргобисГ, Арр1. Епуйоп. МюгоЬюк 8ер 56:2677-83 (1990); и 8ιιη§, Ьик,
С.К., 2а11аЬ, Э.М., ^акагсйик, V., '^сгсхргсккюп оГ 111е ВасШик киЬййк амб сйсиктк хуктакек ίη ЕксйепсЫа сой, Рго1ет Ехрг. РийГ. ίιιη 4:200-6 (1993), хотя в этих ссылках не описаны ферменты по этому изобретению настоящей заявки.
Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в дан
- 44 019971 ной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. В качестве репрезентативных примеров пригодных хозяев могут быть упомянуты: бактериальные клетки, такие как Е.со11, 81гер1отусек, ВасШик киЫШк, 8а1топе11а 1ур1нтипит, и различные виды из рода Ркеиботопак, 81гер1отусек и 81арНу1ососсик, клетки грибов, такие как АкрегдШик, дрожжи, такие как любые виды Р1сЫа, 8ассНаготусек, 8сЫхокассНаготусек 8сНаапп1отусек, включая РкЫа рак1ог1к, 8ассЬаготусек сеге^збае или 8сЫхокассНаготусек ротЬе, клетки насекомых, такие как ЭгокорННа 82 и 8робор!ега 8Г9, клетки животных, такие как СНО, СО8 или клетки меланомы Вотек и аденовирусы. Выбор пригодного хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области.
Вектор можно вводить в клетки-хозяева с использованием любой из множества технологий, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Т1опосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ПЕАЕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Оа\зк, Ь., О1Ьпег, М., Вабеу, I., Вак1с МеШобк ш Мо1еси1аг Вю1оду (1986)).
Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, можно культивировать на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по этому изобретению. После трансформации пригодного штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток, выбранный промотор можно индуцировать соответствующими способами (такими как смена температуры или химическое индуцирование), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для обеспечения продукции требуемого полипептида или его фрагмента.
Клетки можно собирать центрифугированием, разрушать физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохранять для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушать любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или применение средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент можно извлекать и очищать из рекомбинантных культур клеток способами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида можно использовать стадии повторной сборки. Если необходимо, для конечных стадий очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Также для экспрессии рекомбинантного белка можно использовать различные системы клеточных культур млекопитающих. Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны СО8-7 (описанные С1ихтап, Се11, 23:175, 1981) и другие клеточные линии, способные экспрессировать белки совместимого вектора, такие как клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК.
Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать традиционным образом. В зависимости от хозяина, используемого в способе продукции, полипептиды, продуцируемые клеткой-хозяином, содержащей вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по этому изобретению также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.
Альтернативно полипептиды по этому изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более их последовательно расположенных аминокислот, можно получать синтетически с помощью общепринятых устройств для синтеза пептидов, таких как рассмотрены ниже. В других вариантах осуществления фрагменты или участки полипептидов можно использовать для получения соответствующего полноразмерного полипептида с помощью пептидного синтеза; таким образом, фрагменты можно использовать в качестве промежуточных соединений для получения полноразмерных полипептидов.
Также для получения одного из полипептидов по этому изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более его последовательно расположенных аминокислот, можно использовать системы бесклеточной трансляции с использованием мРНК, транскрибируемых с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления перед проведением реакции транскрипции ш νίΙΐΌ конструкцию ДНК можно подвергать линеаризации. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением требуемого полипептида или его фрагмента.
- 45 019971
Амплификация нуклеиновых кислот
Для применения на практике этого изобретения нуклеиновые кислоты по этому изобретению и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты альдолазы, такие как пируватальдолазы, такие как альдолазы НМО и/или КНО, по этому изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно воспроизводить посредством амплификации, такой как ПЦР. Также амплификацию можно использовать для клонирования или модификации нуклеиновых кислот по этому изобретению. Таким образом, это изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновых кислот по этому изобретению. Специалист в данной области может разработать последовательности пары праймеров для амплификации для любой части или для полной длины этих последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, амплифицируемым парой праймеров по этому изобретению, например парой праймеров, как указано, с приблизительно первыми (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками нуклеиновой кислоты по этому изобретению и с приблизительно первыми (5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками комплементарной цепи. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по этому изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член последовательностей пары праймеров может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности или приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более последовательно расположенных оснований последовательности. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член с последовательностью, как указано, с приблизительно первыми (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и второй член с последовательностью, как указано, с приблизительно первыми (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками цепи, комплементарной цепи для первого члена.
Это изобретение относится к ферменту альдолазе, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, полученной амплификацией, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам получения фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, амплификацией, такой как ПЦР, с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например, из библиотеки генов, такой как библиотека окружающей среды.
Реакции амплификации также можно использовать для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (например, количества транскрипта в клеточном образце), внесения метки в нуклеиновую кислоту (например, для нанесения ее на матрицы или блот), выявления нуклеиновой кислоты или определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения амплифицируют транскрипт, выделенный из клетки или библиотеки кДНК.
Специалист в данной области может выбрать и разработать пригодные олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (см. РСК РК0Т0С0Ь8, Α ΟυΙΌΕ Т0 ΜΕΤΜ0Ό8 ЛЛЭ АРРЫСАТЮ^, ей. Ιηηίδ, .Лсайепис Рте«5, Ц.У. (1990) и РСК 8ΤΚΑΤΕΟΙΕ8 (1995), ей. Ιηηίδ, .Лсайепис Ргезз, Ιηα, КУ), лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (см. \Уи (1989) Семопла 4:560; ЬаЫедгеп (1988) 8аепсе 241:1077; Ваггшдег (1990) Оепе 89:117); транскрипционную амплификацию (см. К\\о11 (1989) Ргос. №11. Лсай. 8α. υ8Α 86:1173) и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (см. Оиа1еШ (1990) Ргос. №И. Асай. 8α. υ8Α 87:1874); амплификацию с репликазой О Ве1а (см. 8шйй (1997) 1. С1ш. М1сгоЫо1. 35:1477-1491), автоматизированный анализ амплификацией с репликазой О-Ье1а (см. Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЬез 10:257-271) и другие технологии, опосредуемые РНК-полимеразой (например, NΑ8ВΑ, Сапдепе, Мкзкзаида, 0п1апо); см. также Вегдег (1987) Ме11юйз Εηζутο1. 152:307-316; ΑιΐδΐιΜ е1 а1. Сиггеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг В1о1оду, ίοΐιη ^йеу & 8опз, Ιηα 1997 и 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1опίη§: Α ЬаЬогаФгу Маша1 2ηά Εά., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргезз (1989), патенты США №№ 4683195 и 4683202; 8οοкηаηаη (1995) В^есйш^ду 13:563-564.
Определение степени идентичности последовательностей
Это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью (гомологией) последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению (см. список последовательностей) на протяжении участка из по меньшей мере приблизительно из 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,
- 46 019971
950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательности по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью последовательностей с иллюстративным полипептидом по этому изобретению (см. список последовательностей). Степень идентичности (гомологии) последовательностей можно определять с использованием любой компьютерной программы и ассоциированных параметров, включая программы, описанные в настоящем документе, такие как ВЬЛ5Т 2.2.2. или ЕА5ТА версии 3.0178. с параметрами по умолчанию.
Последовательности нуклеиновых кислот по этому изобретению могут содержать по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 или более последовательно расположенных нуклеотидов последовательности по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ей. Гомологичные последовательности и фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению могут относиться к последовательности по меньшей мере с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью (гомологией) последовательностей с этими последовательностями. Гомологию (идентичность последовательностей) можно определять с использованием любой из компьютерных программ и параметров, описанных в настоящем документе, включая ЕА5ТА версии 3.0178 с параметрами по умолчанию. Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых остатками уридина заменены остатки тимина в последовательностях нуклеиновых кислот по этому изобретению. Гомологичные последовательности можно получать с использованием любого из способов, описанных в настоящем документе, или могут быть получены в результате коррекции ошибок секвенирования. Следует понимать, что последовательности нуклеиновых кислот по этому изобретению могут отображаться в традиционном формате отдельных символов (см. оборот задней стороны обложки 5!гуег, ЬиЬеп. Вюсйет181гу, 3гб Еб., V. Н Егеетап & Со., №\ν Уогк) или в любом другом формате, в котором записывается название нуклеотидов в последовательности.
В некоторых вариантах осуществления программы для сравнения последовательностей, указанные в настоящем документе, используют в этом аспекте изобретения, т.е. в целях определения нахождения последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида в объеме этого изобретения. Однако идентичность (гомологию) последовательностей и/или нуклеиновых кислот можно оценивать с использованием любого алгоритма сравнения последовательностей и программы, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают, но не ограничиваются ими, ТВЬА5Т^ ВЬЛ5ТР, ЕА5ТА, ТЕА5ТА и С1.и5ТА1.\\' (см. Реагкоп апб Ыртап, Ргос. №!1. Асаб. 5с1. И5А 85(8): 2444-2448, 1988; Л118с1и.11 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215(3):403-410, 1990; ТНотркоп е! а1., ШсШс Ас1б Яек. 22 (2): 4673-4680, 1994; Шддтк е! а1., МеШобк Ешуток 266:383-402, 1996; А11кс11и1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215 (3): 403-410, 1990; А11кс11и1 е! а1., №11иге Оепебск 3:266-272, 1993).
В некоторых вариантах осуществления гомологию или идентичность определяют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, 5ес.|иепсе Апа1ук18 5оП\\аге Раскаде, Оепебск Сотри!ег Огоир, ИпчуегкИу, ^ксопкт Вю!ескпо1оду Сеп!ег, 1710 Ипчуегкбу Ауепие, Мабчкоп, ΧΫΙ 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным делециям, заменам и другим модификациям. В некоторых вариантах осуществления термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают определенным процентным количеством аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые оказываются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области, как определяют с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или выравниванием вручную и визуальным исследованием. В некоторых вариантах осуществления для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают анализируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей анализируемую и эталонную последовательности вносят в компьютер, обозначают координаты подпоследовательностей, если необходимо, и указывают параметры программы алгоритма для последовательностей. Можно использовать параметры по умолчанию или можно указывать альтернативные параметры. Затем на основании параметров программы алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процентную идентичность последовательностей для анализируемой последовательности относительно эталонной последовательности.
Как используют в настоящем документе, окно сравнения относится к сегменту из любого одного из множества смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, как правило, от приблизительно 50 до приблизительно 200, более типично от приблизительно 100 до приблизительно 150, в которых последовательность может быть сравнена с эталонной последовательностью с таким же числом смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы
- 47 019971 выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, посредством алгоритма локальной гомологии 8тйй & Уа!егтап, Λάν. Арр1. Ма!й. 2:482, 1981, посредством алгоритма выравнивания по гомологии №еб1етап & Уипксй, I. Мо1. Βίο1 48:443, 1970, посредством поиска сходства способом Регкоп & Ыртаи, Ргос. №!'1. Асаб. 8с1. И8А 85:2444, 1988, посредством компьютеризованного использования этих алгоритмов (САР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, РА8ТА и ТРА8ТА в У1ксопкш Сепебск 8оП\\аге Раскаде, Сепебск Сотрйег Сгоир, 575 8с1епсе Όγ., Маббоп, У0 или посредством выравнивания вручную и визуального исследования. Другие алгоритмы для определения гомологии или идентичности включают, например, помимо программы ВБА8Т (Вабс Ьоса1 Абдитей 8еагсй Тоо1 в №бопа1 Сейег Гог Вю1одюа1 Шогтабоп), АБЮ№ аМа8 (Аиа1ук1к о£ Ми1бр1у Абдпеб 8еяиепсе), АМР8 (Рго!ет Ми1бр1е 8ес.|иепсе Абдитей), А88ΕΤ (Абдпеб 8едтей 8!абкбса1 Ενа1иабοп Тоо1), ВАНО8, ΒΕ8Τ8С0К. ВЮ8САМ (Вю1одб са1 8ес.|иепсе Сотрагййе Апа1ук1к №бе), ВЫМР8 (ВБоскк ИМРгслсб 8еагсйег), РА8ТА, б11ег\а1к & Ро1йк, ВМВ, СБИ8ТАБ V, СБИ8ТАБ У, ^^Ε^Οδ, Ρ’0\8Ε\8Ρ8, ν^^Ε^^, алгоритм 8тп11Уа!егтап, БАКУЮ, алгоритм Бак Vедак, РNАΤ (Рогсеб №с1еоббе Абдптей Тоо1), Ргатеайдп, Ргатекеагсй, □УНАМИ'.’, РI^ΤΕК. Р8АР (Рбк!епкку 8ес.|иепсе Апа1ук1к Раскаде), САР (С1оЬа1 Айдптеп! Ргодгат), ΟΕΚΑΕ, СШВ8, СепОиекР Ι88’ (8епк^бνе 8ес.|иепсе Сотрабкоп), БАБЮК (Боса1 8ес.|иепсе Айдптей), БСР (Боса1 Сойей Ргодгат), МАСАУ (Ми1бр1е Айдптеп! Сопкбисбоп & Апа1убк УогкЬепсй), МАР (Ми1бр1е Абдптей Ргодгат), МВБКР, МВБ1<№ РIМА (Райетбпбисеб МиШ-кециепсе Айдптей), 8АСА (8ес.|иепсе Айдптей Ьу Сепебс А1догййт) и УНАТ4Р. Такие программы для выравнивания также можно использовать для скрининга геномных баз данных в целях идентификации полинуклеотидных последовательностей, обладающих, по существу, идентичными последовательностями. Является доступным ряд геномных баз данных, например, основная часть генома человека доступна в качестве части Проекта секвенирования генома человека (С1ЬЬк, 1995). По меньшей мере двадцать один геном других организмов уже был отсеквенирован, включая, например, М. дейй1шт (Ргакег е! а1., 8с1епсе 270:397-403 (1995)), М. |аппаксйп (Вий е! а1., 8с1епсе 25:1058-73 (1996)), Н. бШиепхае (ЕЮксйтапп е! а1., 8с1епсе 269:496-512 (1995)), Ε.^1ί (В1айпег е! а1., 8с1епсе 277:1453-74 (1997)) и дрожжи (8. сегетыае) (Метек е! а1., №!иге 387:7-65 (1997)) и Ό. те1аподак!ег (Абатк е! а1., 8с1епсе 257:2185-95 (2000)). Значительный прогресс также был достигнут в секвенировании геномов модельных организмов, таких как мышь, С. е1едапк и АгаЬаборкй кр. Несколько баз данных, содержащих информацию геномов, аннотированную некоторой функциональной информацией, поддерживаются различными организациями и могут быть доступными через Интернет.
В некоторых вариантах осуществления используют алгоритмы ВБА8Т и ВБА8Т 2.0, которые описаны в А1!ксйи1 е! а1., Мс. Ас1бк Кек. 25:3389-3402, 1977 и А1!ксйи1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215:403-410, 1990, соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов ВБА8Т является общедоступным через №1йопа1 Сейег Гог Вю!есйпо1оду бтГогтайоп. Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (Н8Р) посредством идентификации коротких слов с длиной У в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяется как порог значений для соседних слов (А1!ксйи1 е! а1., выше). Эти изначальные совпадения соседних слов выступают в роли предшественников для начала поиска в целях обнаружения более длинных Н8Р, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может повышаться. Суммарные значения вычисляются с использованием, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда >0). В случае аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного значения используют оценочную матрицу. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливается, если: суммарное значение для выравнивания снижается по величине X ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже, вследствие накопления одного нескольких выровненных остатков с отрицательным значением; или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма ВБА8Т У, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ВБА8ТХ (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (У) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В случае аминокислотных последовательностей программа ВБА8ТР использует в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемые значения (Е) 10 и оценочную матрицу ВБ08ИМ62 (см. НешкоГГ & НейкоГГ, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 89:10915, 1989) фрагменты для выравнивания (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.
Также алгоритм ВБА8Т осуществляет статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Каг1ш & А1!ксйи1, Ргос. Иаб. Асаб. 8ск И8А 90:5873, 1993). Один способ определения сходства, проводимый алгоритмом ВБА8Т, представляет собой наименьшую суммарную вероятность (Р^)), которая предполагает указание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайным образом. Например, нуклеиновая кислота рассматривается как сходная с эталонной последовательностью, если наименьшая сум
- 48 019971 марная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,2, более того, в некоторых вариантах осуществления менее приблизительно 0,01, и, более всего, в других вариантах осуществления менее приблизительно 0,001.
В некоторых вариантах осуществления гомология последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивается с использованием Вак1с Ьоса1 АкдптегИ 8еагс11 Тоо1 (ВЬА8Т). В частности, для осуществления следующих задач используются пять конкретных программ ВЬА8Т:
(1) ВЬА8ТР и ВЬА8Т3 сравнивают представляющую интерес аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков;
(2) В^Λ8ТN сравнивает интересующую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей;
(3) ВЬА8ТХ сравнивает концептуальные продукты трансляции с шести рамок интересующей нуклеотидной последовательности (обе нити) с базой данных белковых последовательностей;
(4) ТВВЛ8ТН сравнивает представляющую интерес белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых со всех шести рамок считывания (обе цепи); и (5) ТВЬА8ТХ сравнивает продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции с шести рамок базы данных нуклеотидных последовательностей.
Программы ВЬА8Т идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных сегментов, которые в настоящем документе называются парами сегментов с максимальным сходством между представляющей интерес последовательностью аминокислоты или нуклеиновой кислоты и анализируемой последовательностью, которую в некоторых вариантах осуществления получают из базы данных последовательностей белков или нуклеиновых кислот. Пары сегментов с максимальным сходством в некоторых вариантах осуществления идентифицируют (т.е. выравнивают) посредством оценочных матриц, многие из которых известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления оценочная матрица представляет собой матрицу ВЬ08ИМ62 (Ооппе! е! а1., 8с1епсе 256:14431445, 1992; НешкоГГ апб НепкоГГ, Рго!ешк 17:49-61, 1993). В меньшей степени, в некоторых вариантах осуществления также можно использовать матрицы РАМ или РАМ250 (см. 8с11\\'аг1х апб ОаукоГГ, ебк., 1978, Мабтсек Гог Ое!есбпд О|к1апсе Ке1абопкЫрк: Абак оГ Рго!еш 8ес.|иепсе апб 81гис1иге, \Уак1ппд1оп: №1бопа1 Вютебюа1 Кекеагск Роипбабоп). Программы ВЬА8Т являются доступными посредством и.8. №бопа1 ЫЬгагу оГ Мебюше.
Параметры, используемые в приведенных выше алгоритмах, можно адаптировать в зависимости от исследуемой длины последовательности и степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления параметры могут представлять собой параметры по умолчанию, используемые в алгоритмах в отсутствие инструкций от пользователя.
Компьютерные системы и компьютерные программы
Это изобретение относится к компьютерам, компьютерным системам, компьютерным считываемым носителям информации, компьютерным программам и т.п., с записанными или сохраненными на них последовательностями нуклеиновых кислот и полипептидов по этому изобретению. Кроме того, при применении на практике способов по этому изобретению, например для определения и идентификации идентичности последовательностей, структурной гомологии, мотивов и т.п. ш кШсо, последовательность нуклеиновой кислоты или полипептида по этому изобретению можно сохранять, записывать и обрабатывать на любом носителе информации, который может считываться компьютером и который можно подключить к компьютеру.
Как используют в настоящем документе, слова записанный и сохраненный относятся к процессу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области может легко освоить любые известные способы записывания информации на компьютерный считываемый носитель информации с получением изделия, содержащего одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот и/или полипептидов по этому изобретению. Как используют в настоящем документе, термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в их наиболее широких общих значениях и включают такие устройства, как подробно описано ниже. Кодирующая последовательность или последовательность, которая кодирует конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, когда она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей.
Полипептиды по этому изобретению включают полипептидные последовательности по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные им, и подпоследовательности и ферментативно активные фрагменты любой из указанных ранее последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, по существу, идентичные или гомологичные полипептидные последовательности относятся к полипептидным последовательностям, обладающим по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью (гомологией) последовательностей с последовательностью по этому изобретению.
- 49 019971
Гомологию (идентичность последовательностей) можно определять с использованием любой из компьютерных программ и параметров, описанных в настоящем документе. Последовательность нуклеиновой кислоты или полипептида по этому изобретению можно сохранять, записывать и обрабатывать на любом носителе информации, который может считываться компьютером и который можно подключить к компьютеру. Как используют в настоящем документе, слова записанный и сохраненный относятся к процессу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области может легко освоить любые известные в настоящее время способы записывания информации на компьютерный считываемый носитель информации с получением изделия, содержащего одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению, одну или несколько последовательностей полипептидов по этому изобретению. Другим аспектом этого изобретения является компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем по меньшей мере 2, 5, 10, 15 или 20, или более последовательностями нуклеиновых кислот или полипептидов по этому изобретению.
Другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот по этому изобретению. Другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем одной или несколькими последовательностями полипептидов по этому изобретению. Другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем по меньшей мере 2, 5, 10, 15 или 20, или более последовательностями, которые указаны выше.
Компьютерные считываемые носители информации включают магнитный считываемый носитель, оптически считываемые носители, электронные считываемые носители и магнитные/оптические носители. Например, компьютерные носители информации могут представлять собой жесткий диск, дискету, магнитную ленту, СЭ-К0М, универсальный цифровой диск (БХБ), оперативное запоминающее устройство (КАМ) или постоянное запоминающее устройство (К0М), а также другие типы других носителей, известных специалистам в данной области.
Некоторые варианты осуществления этого изобретения включают системы (такие как системы на основе Интернет), такие как компьютерные системы, которые хранят и обрабатывают информацию последовательностей, описанных в настоящем документе. Один пример компьютерной системы 100 проиллюстрирован в форме блок-схемы на фиг. 9. Как используют в настоящем документе, термин компьютерная система относится к компонентам аппаратного оборудования, компонентам программного обеспечения и компонентам для хранения данных, используемым для анализа нуклеотидной последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению или полипептидной последовательности по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 100 включает процессор для подготовки, доступа и обработки данных о последовательностях. Процессор 105 может представлять собой любой хорошо известный тип центрального процессорного элемента, такой как, например, Реп!шт ΙΙΙ от !п!е1 Согрогайоп, или сходный процессор от 8ип, Мо!ого1а, Сотрац, АМБ или !п!егпа!юпа1 Визтезз МасЫпез.
В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 100 представляет собой универсальную систему, которая включает процессор 105 и один или несколько внутренних устройств для хранения данных 110 и одно или несколько устройств для извлечения данных для того, чтобы извлекать данные, сохраненные на компонентах для хранения данных. Специалист в данной области может легко понять, что пригодной является любая из доступных в настоящее время компьютерных систем.
В одном варианте осуществления компьютерная система 100 включает процессор 105, соединенный с общей шиной, которая соединена с основным запоминающим устройством 115 (в одном варианте осуществления представленном в виде КАМ) и одним или несколькими внутренними устройствами для хранения данных 110, такими как жесткий диск и/или другие компьютерные считываемые носители информации с записанными на них данными. В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 100 далее включает в одно или несколько устройств для извлечения данных 118 для считывания данных, сохраненных на внутренних устройствах для хранения данных 110.
Устройство для извлечения данных 118 может быть представлено, например, дисководом для гибких дисков, дисководом для компакт-дисков, накопителем на магнитной ленте или модемом, способным соединяться с удаленными системами хранения данных (например, через Интернет) и т.д. В некоторых вариантах осуществления внутреннее устройство для хранения данных 110 представляет собой съемный компьютерный считываемый носитель информации, такой как дискета, компакт-диск, магнитная лента и т.д., содержащий логические схемы управления и/или записанные на нем данные. Компьютерная система 100 может преимущественно включать подходящее программное обеспечение или может быть запрограммирована с помощью него для чтения логической схемы управления и/или данных с компонента для хранения данных после помещения в устройство для извлечения данных.
Компьютерная система 100 включает экран 120, который используется для выведения данных пользователю компьютера. Также следует отметить, что компьютерная система 100 может быть связана с другими компьютерным системами 125а-с в сети или в глобальной сети для получения централизованного доступа к компьютерной системе 100.
- 50 019971
Программное обеспечение для доступа и обработки нуклеотидных последовательностей в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностей, по существу идентичных ей, или последовательности полипептида по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ему (такое как инструменты поиска, инструменты сравнения и инструменты моделирования, и т.д.), в процессе выполнения программы может находиться на основном запоминающем устройстве 115.
В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 100 может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательностей для сравнения последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ей, или последовательности полипептида по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ему, сохраненных на компьютерном считываемом носителе информации, с эталонной последовательностью(ями) нуклеотидов или полипептидов, хранящейся на компьютерном считываемом носителе информации. Термин алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или нескольким программам, которые выполняются (локально или удаленно) на компьютерной системе 100 для сравнения нуклеотидной последовательности с другими нуклеотидными последовательностями и/или соединениями, хранящимися на устройствах для хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, или полипептидную последовательность по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, сохраненные на компьютерном считываемом носителе информации, с эталонными последовательностями, хранящимися на компьютерном считываемом носителе информации, для идентификации гомологии или структурных мотивов.
На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса 200 для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями из базы данных в целях определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных. Последовательности из базы данных могут представлять собой частную базу данных, сохраненную на компьютерной системе 100, или общедоступную базу данных, такую как СЕ№ ВАЫК, которая доступна через Интернет.
Процесс 200 начинается в исходном положении 201 и перемещается в положение 202, где новая последовательность, подлежащая сравнению, сохраняется на запоминающем устройстве компьютерной системы 100. Как описано выше, запоминающее устройство может представлять собой любой тип запоминающего устройства, включая ВАМ или внутреннее устройство для хранения.
Затем процесс 200 перемещается в положение 204, где базу данных последовательностей открывают для анализа и сравнения. Затем процесс 200 перемещается в положение 206, где первая последовательность, сохраненная в базе данных, считывается в запоминающее устройство компьютера. Затем в положении 210 осуществляется сравнение для определения, являются ли первая последовательность и вторая последовательность одинаковыми. Важно отметить, что эта стадия не ограничивается осуществлением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью из базы данных. Специалистам в данной области известны хорошо известные способы для сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не являются идентичными. Например, в одну последовательность могут быть внесены разрывы в целях повышения уровня гомологии между двумя анализируемыми последовательностями. Параметры, контролирующие, будут ли разрывы или другие признаки внесены в последовательность в процессе сравнения, в норме вводит пользователь компьютерной системы.
После проведения сравнения двух последовательностей в положении 210, в положении для принятия решения 210 осуществляется определение того, являются ли две последовательности одинаковыми. Безусловно, термин одинаковый не ограничивается последовательностями, которые абсолютно идентичны. Последовательности, которые находятся в пределах параметров гомологии, введенных пользователем, в процессе 200 обозначатся как одинаковые.
Если определено, что две последовательности являются одинаковыми, процесс 200 перемещается в положение 214, где название последовательности из базы данных выводится на экран пользователю. В этом положении пользователь уведомляется о том, что последовательность с отображенным названием удовлетворяет введенным ограничениям. После того как название сохраненной последовательности выводится на экран пользователю, процесс 200 перемещается в положение для принятия решения 218, где определяется, существуют ли другие последовательности в базе данных. Если в базе данных больше не существует последовательностей, тогда процесс 200 завершается в конечном положении 220. Однако если в базе данных существуют другие последовательности, тогда процесс 200 перемещается в положение 224, где указатель перемещается на следующую последовательность в базе данных, так что она может быть сравнена с новой последовательностью. Таким образом, новая последовательность выравнивается и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных.
Следует отметить, что если в положении для принятия решения 212 определяется, что последовательности не гомологичны, тогда процесс 200 непосредственно перемещается в положение для принятия решения 218 в целях определения, если в базе данных есть любые другие доступные последовательности
- 51 019971 для сравнения.
Таким образом, один вариант осуществления этого изобретения представляет собой компьютерную систему, содержащую процессор, устройство для хранения данных с сохраненной на нем последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностями, по существу, идентичными ей, или последовательностью полипептида по этому изобретению и последовательностями, по существу идентичными ей, устройство для хранения данных с сохраненными на нем извлекаемыми эталонными нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями, подлежащими сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и с последовательностями, по существу, идентичными ей, или полипептидной последовательностью по этому изобретению, и с последовательностями, по существу, идентичными ей, и программой для сравнения последовательностей для проведения сравнения. Программа для сравнения последовательностей может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы в описанном выше коде нуклеиновой кислоты в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и в последовательностях, по существу, идентичных ей, или в последовательности полипептида по этому изобретению и в последовательностях, по существу, идентичных ей, или она может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с этими кодами нуклеиновых кислот и кодами полипептидов. В некоторых вариантах осуществления устройство для хранения данных может обладать сохраненными на нем последовательностями по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 или более последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им, или последовательностей полипептидов по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им.
Другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой способ определения уровня гомологии между последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностями, по существу, идентичными ей, или последовательностью полипептида по этому изобретению и последовательностями, по существу, идентичными ей, и эталонной нуклеотидной последовательностью. Способ включает считывание кода нуклеиновой кислоты или кода полипептида и эталонной нуклеотидной или полипептидной последовательности с использованием компьютерной программы, которая определяет уровни гомологии, и определение гомологии между кодом нуклеиновой кислоты или кодом полипептида и эталонной нуклеотидной или полипептидной последовательностью с помощью компьютерной программы. Компьютерная программа может представлять собой любую из множества компьютерных программ для определения уровня гомологии, включая программы, конкретно представленные в настоящем документе (например, ВБ-А8Т2Х с параметрами по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами). Способ можно осуществлять с использованием компьютерных систем, описанных выше. Также способ может быть осуществлен считыванием по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 или более описанных выше последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им, или последовательностей полипептидов по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им, с использованием компьютерной программы, и определением гомологии между кодами нуклеиновых кислот или кодами полипептидов и эталонными нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями.
На фиг. 11 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса 250 в компьютере для определения наличия гомологии между двумя последовательностями. Процесс 250 начинается в исходном положении 252 и затем переходит в положение 254, где первая последовательность для сравнения сохраняется на запоминающем устройстве. Затем вторая последовательность для сравнения сохраняется на запоминающем устройстве в положении 256. Затем процесс 250 переходит в положение 260, где считывается первый элемент первой последовательности, а затем в положение 262, где считывается первый элемент второй последовательности. Следует понимать, что если последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, тогда элемент будет любым из А, Т, С, О или и. Если последовательность представляет собой белковую последовательность, тогда в некоторых вариантах осуществления она представлена однобуквенным аминокислотным кодом, так что первая последовательность и последовательности могут легко быть сравнены.
Затем в положении для принятия решения 264 определяется, являются ли два элемента одинаковыми. Если они являются одинаковыми, тогда процесс 250 переходит в положение 268, где считываются следующие элементы первой и второй последовательностей. Затем определяется, являются ли следующие элементы одинаковыми. Если они являются одинаковыми, тогда процесс 250 продолжает этот цикл до тех пор, пока элементы не будут отличаться. Если определяется, что следующие два элемента не являются одинаковыми, тогда процесс 250 переходит в положение для принятия решения 274 для определения, существуют ли любые другие элементы или последовательности для считывания.
Если элементов для прочтения более не существует, тогда процесс 250 переходит в положение 276, где уровень гомологии между первой и второй последовательностями выводится на экран пользователю. Уровень гомологии определяется вычислением соотношения элементов в последовательностях, которые были одинаковыми из всего количества последовательностей в первой последовательности. Таким образом, если каждый элемент в первой последовательности из 100 нуклеотидов совпал с каждым элементом
- 52 019971 второй последовательности, тогда уровень гомологии составляет 100%.
Альтернативно компьютерная программа может представлять собой компьютерную программу, которая сравнивает нуклеотидные последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в изобретении, с одним или несколькими эталонными нуклеотидными последовательностями в целях определения, отличается ли код нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ей, от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты в одном или нескольких положениях. Такая программа необязательно записывает длину и название вставленных, удаленных или замещенных нуклеотидов в отношении последовательности либо эталонного полинуклеотида, либо последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностей, по существу идентичных ей. В некоторых вариантах осуществления компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, однонуклеотидный полиморфизм (8№) относительно эталонной нуклеотидной последовательности.
Таким образом, другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой способ определения, отличается ли последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, по одному или нескольким нуклеотидам от эталонной нуклеотидной последовательности, включающий стадии считывания кода нуклеиновой кислоты и контрольной нуклеотидной последовательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует различия между последовательностями нуклеиновых кислот, и идентификации различий между кодом нуклеиновой кислоты и контрольной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы. В некоторых вариантах осуществления компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует однонуклеотидные полиморфизмы. Способ может быть осуществлен с помощью описанной выше компьютерной системы и способа, проиллюстрированного на фиг. 11. Также способ может быть осуществлен посредством считывания по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 или более последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению и последовательностей, по существу идентичных им, и эталонных нуклеотидных последовательностей с использованием компьютерной программы, и идентификации различий между кодами нуклеиновых кислот и контрольными нуклеотидными последовательностями с помощью компьютерной программы.
В других вариантах осуществления система на основе компьютера далее может включать идентификатор для идентификации характерных элементов в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению или последовательности полипептида по этому изобретению. Термин идентификатор относится к одной или нескольким программам, которые идентифицируют определенные элементы в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению, или в последовательности полипептида по этому изобретению и последовательностях, по существу идентичных ей. В некоторых вариантах осуществления идентификатор может включать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностях, по существу, идентичных ей.
На фиг. 12 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления работы идентификатора 300 для определения наличия характерных элементов в последовательности. Процесс 300 начинается в исходном положении 302 и затем переходит в положение 304, где первая последовательность, которая подлежит проверке на наличие характерных элементов, сохранена на запоминающем устройстве 115 в компьютерной системе 100. Затем процесс 300 переходит в положение 306, где открывается база данных с последовательностями элементов. Такая база данных включает список признаков каждого характерного элемента вместе с названием элемента. Например, названием элемента может быть Кодон инициации, а признаком может быть АТС. Другим примером может быть название элемента ТААТАА-бокс, и признаком элемента может быть ТААТАА. Примером такой базы данных является база данных, созданная в ишуегЩу о£ ХУБсопклп Сепейск Сотри1ег Сгоир. Альтернативно характерные элементы могут представлять собой структурные мотивы полипептидов, такие как альфа-спирали, бетаслои, или функциональные мотивы полипептидов, такие как ферментативные активные центры, мотивы спираль-поворот-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области.
После открытия базы данных элементов в положении 306 процесс 300 переходит в положение 308, где первый элемент считывается из базы данных. Затем проводится сравнение признака первого характерного элемента с первой последовательностью в положении 310. В положении для принятия решения 316 определяется, обнаружен ли признак характерного элемента в первой последовательности. Если признак обнаружен, тогда процесс 300 переходит в положение 318, где название обнаруженного элемента выводится на экран пользователю.
Затем процесс 300 переходит в положение для принятия решения 320, где определяется, существуют ли еще в базе данных элементы. Если элементов больше не существует, тогда процесс 300 завершается в конечном положении 324. Однако, если в базе данных существуют еще характерные элементы, тогда в процессе 300 считывается следующий элемент последовательности в положении 326, и процесс возвращается в положение 310, где признак следующего элемента сравнивается с первой последовательностью. Следует отметить, что если признак элемента не обнаружен в первой последовательности в поло
- 53 019971 жении для принятия решения 316, тогда процесс 300 переходит непосредственно в положение для принятия решения 320 в целях определения, существуют ли еще элементы в базе данных.
Таким образом, другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой способ идентификации элемента в последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению и в последовательностях, по существу, идентичных ей, или в последовательности полипептида по этому изобретению и в последовательностях, по существу, идентичных ей, включающий считывание кода(ов) нуклеиновой кислоты или кода(ов) полипептида с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует характерные элементы в них, и идентификацию элементов в коде(ах) нуклеиновой кислоты с помощью компьютерной программы. В некоторых вариантах осуществления компьютерная программа включает компьютерную программу, которая идентифицирует открытые рамки считывания. Способ может быть осуществлен посредством считывания единичной последовательности или по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, или 40 или более последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им, или последовательностей полипептидов по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им, с использованием компьютерной программы, и идентификации характерных элементов в кодах нуклеиновых кислот или кодах полипептидов с помощью компьютерной программы.
Последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, или последовательность полипептида по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, могут храниться и обрабатываться во множестве программ для обработки данных во множестве форматов. Например, последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательности, по существу, идентичные ей, или последовательность полипептида по этому изобретению и последовательности, по существу идентичные ей, могут быть сохранены в качестве текста в файле для обработки слов, таком как Мкгокой ^0ВЭ™ или ^0ВЭРЕВЕЕСТ™ или в качестве файла АЛСИ во множестве программ с базами данных, известных специалистам в данной области, таких как ЭВ2™, ЛУВАЛЕ или 0ВАСЬЕ. Кроме того, множество компьютерных программ и баз данных можно использовать в качестве алгоритмов сравнения последовательностей, идентификаторов или источников эталонных нуклеотидных последовательностей или полипептидных последовательностей, подлежащих сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению и последовательностями, по существу, идентичными ей, или с последовательностью полипептида по этому изобретению и последовательностями, по существу, идентичными ей. Следующий список не предназначен для ограничения этого изобретения, а для предоставления рекомендаций по программам и базам данных, которые пригодны для последовательностей нуклеиновых кислот по этому изобретению и последовательностей, по существу идентичных им, или для последовательностей полипептидов по этому изобретению и последовательностей, по существу идентичных им.
Программы и базы данных, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими: МАСРАТТЕКК'1™ (ЕМВЬ), ™ (Мо1еси1аг Аррксайопк Сгоир), СЕМЕМЕНЕ™ (Мо1еси1аг Аррксайопк Сгоир), Ь00К™ (Мо1еси1аг АррЕсайопк Сгоир), МАСЬ00К™ (Мо1еси1аг Аррксайопк Сгоир), ВЬАЛТ и ВЬАЛТ2 ^СВ^, ВЕАЛТ'Х и ВЬАЛТХ (А1!ксйи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215: 403, 1990), ЕАЛТА (Реагкоп апб Ыртап, Ргос. №!1. Асаб. ЛсЕ ИЛА, 85:2444, 1988), ЕАЛТЭВ (Вги!1ад е! а1. Сотр. Арр. В1оксЕ 6:237-245, 1990), САТАЬУЛТ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), Са!а1ук!/ЛНАРЕ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ыс.), СепикГОВАссекк (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), НΥР0СЕN™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), ГЫЛЮНТ ΙΙ™, (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ыс.), ^IЛС0УЕΕ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ыс.), СНАВМт™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), ЕЕЫХ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), ОЕБРНГ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), Риап!еММ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), Ното1оду (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ыс.), М0ЭЕЕЕЕ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ыс.), ΙδΙδ™ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), Оиап1а/Рго1ет Оеыдп (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), ^еЬЬаЬ (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), ^еЬЬаЬ Огуегкйу Ехр1огег (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), Сепе Ехр1огег (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ечс.), Лес.|Ео1б (Мо1еси1аг Л1ти1айопк Ыс.), базу данных МОЬ АуаПаЫе Сйетка1к Пиес!огу, базу данных МОЬ Эгид Эа1а Верой, базу данных СотргейепкВе Меб1с1па1 Сйет1к!гу, базу данных Эег\уеп1к'к \Уог1б Эгид Ыбех, базу данных ВюВу!еМак!егЕ11е, базу данных СепЬапк и базу данных Сепкецп. Множество других программ и баз данных будут очевидны специалисту в данной области, с учетом настоящего описания.
Мотивы, которые можно определять с использованием приведенных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновую молнию, мотивы спираль-поворот-спираль, участки гликозилирования, участки убиквитинилирования, альфа-спирали и бета-слои, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секрецию кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, фрагменты с кислотными свойствами, ферментативные активные центры, участки связывания субстрата и участки ферментативного расщепления.
- 54 019971
Гибридизация нуклеиновых кислот
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в строгих условиях с последовательностью по этому изобретению, такой как 81Г) ΙΌ N0:1, 81Г) ΙΌ N0:3, 81Г) ΙΌ N0:5, 8ΕΟ ΙΌ N0:7, 81Г) ΙΌ N0:9, 81Г) ΙΌ N0:11, 81Г) ΙΌ N0:13, 81Г) ΙΌ N0:15, 8ΕΟ ΙΌ N0:17, 81Г) ΙΌ N0:19, 8ΕΟ ΙΌ N0:21, 81Г) ΙΌ N0:23, 8ΕΟ ΙΌ N0:25, 8ΕΟ ΙΌ N0:27, 81Г) ΙΌ N0:29, 8ΕΟ ΙΌ N0:31, 8ΕΟ ΙΌ N0:33, 8ΕΟ ΙΌ N0:35, 8ΕΟ ΙΌ N0:37, 81Г) ΙΌ N0:39, 81Г) ΙΌ N0:41, 8ΕΟ ΙΌ N0:43, 81Г) ΙΌ N0:45, 8ΕΟ ΙΌ N0:47, 8ΕΟ ΙΌ N0:49, 81Г) ΙΌ N0:51, 8ΕΟ ΙΌ N0:53, 81Г) ΙΌ N0:55, 8ΕΟ ΙΌ N0:57, 81Г) ΙΌ N0:59, 8ΕΟ ΙΌ N0:61, 81Г) ΙΌ N0:63, 8ΕΟ ΙΌ N0:65, 8ΕΟ ΙΌ N0:67, 81Г) ΙΌ N0:69, 8ΕΟ ΙΌ N0:71, 8ΕΟ ΙΌ N0:73, 8ΕΟ ΙΌ N0:75, 8ΕΟ ΙΌ N0:77, 81Г) ΙΌ N0:79, 81Г) ΙΌ N0:81, 8ΕΟ ΙΌ N0:83, 81Г) ΙΌ N0:85, 8ΕΟ ΙΌ N0:87, 8ΕΟ ΙΌ N0:89, 81Г) ΙΌ N0:91, 8ΕΟ ΙΌ N0:93, 8ΕΟ ΙΌ N0:95, 8ΕΟ ΙΌ N0:97, 8ΕΟ ΙΌ N0:99, 8ΕΟ ΙΌ N0:101, 8ΕΟ ΙΌ N0:103, 8ΕΟ ΙΌ N0:105, 81Г) ΙΌ N0:107, 81Г) ΙΌ N0:109, 81Г) ΙΌ N0:111, 81Г) ΙΌ N0:113, 8ΕΟ ΙΌ N0:115, 81Г) ΙΌ N0:117, 81Г) ΙΌ N0:119, 81Г) ΙΌ N0:121, 81Г) ΙΌ N0:123, 81Г) ΙΌ N0:125, 8ΕΟ ΙΌ N0:127, 81Г) ΙΌ N0:129, 81Г) ΙΌ N0:131, 81Г) N0:143, 81Г) N0:155, 81Г) N0:167, 81Г) N0:179, 81Г) N0:191, 81Г) N0:203, 81Г) N0:215, 81Г)
N0:227, 8ΕΟ ΙΌ N0:229, 81Г) ΙΌ N0:231, 81Г) ΙΌ N0:233, 8ΕΟ ΙΌ
N0:235, 8ΕΟ ΙΌ N0:237, 8ΕΟ ΙΌ N0:239, 8ΕΟ ΙΌ N0:241, 8ΕΟ ΙΌ N0:243, 8ΕΟ ΙΌ N0:245, 8ΕΟ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:133, 8ΕΟ
N0:145, 8ΕΟ
N0:157, 8ΕΟ
N0:169, 8ΕΟ
N0:181, 8ΕΟ
N0:193, 8ΕΟ
N0:205, 8ΕΟ
N0:217, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:135, 8ΕΟ
N0:147, 8ΕΟ
N0:159, 8ΕΟ
N0:171, 8ΕΟ
N0:183, 8ΕΟ
N0:195, 8ΕΟ
N0:207, 8ΕΟ
N0:219, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:137, 8ΕΟ
N0:149, 8ΕΟ
N0:161, 8ΕΟ
N0:173, 8ΕΟ
N0:185, 8ΕΟ
N0:197, 8ΕΟ
N0:209, 8ΕΟ
N0:221, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:139, 81Γ)
N0:151, 81Γ)
N0:163, 81Γ)
N0:175, 81Γ)
N0:187, 81Γ)
N0:199, 81Γ)
N0:211, 81Γ)
N0:223, 81Γ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:141, 81Γ)
N0:153, 81Γ)
N0:165, 81Γ)
N0:177, 81Γ)
N0:189, 81Γ)
N0:201, 81Γ)
N0:213, 81Γ)
N0:225, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:249, 8Ер
N0:261, 8ΕΟ
N0:273, 8ΕΟ
N0:285, 8ΕΟ
N0:297, 8ΕΟ
N0:309, 8ΕΟ
N0:321, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:251, 8ΕΟ
N0:263, 8ΕΟ
N0:275, 8ΕΟ
N0:287, 8ΕΟ
N0:299, 8ΕΟ
N0:311, 8ΕΟ
N0:323, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:253, 8ΕΟ
N0:265, 8ΕΟ
N0:277, 8ΕΟ
N0:289, 8ΕΟ
N0:301, 8ΕΟ
N0:313, 8ΕΟ
N0:325, 8ΕΟ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:255, 8ΕΟ
N0:267, 81Γ)
N0:279, 8ΕΟ
N0:291, 81Γ)
N0:303, 81Γ)
N0:315, 81Γ)
N0:327, 81Γ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:257, 8ΕΟ
N0:269, 81Γ)
N0:281, 81Γ)
N0:293, 81Γ)
N0:305, 81Γ)
N0:317, 81Γ)
N0:329, 81Γ)
N0:247, 8ΕΟ
N0:259, 8ΕΟ N0:271, 81Γ)
N0:283, 81Γ) N0:295, 8ΕΟ
N0:307, 81Γ)
N0:319, 81Γ)
N0:331, 81Γ) ΙΌ N0:333, 8ΕΟ ΙΌ N0:335, 8ΕΟ ΙΌ N0:336, 8ΕΟ ΙΌ N0:337 или 8ΕΟ ΙΌ N0:338. Строгие условия могут представлять собой условия высокой строгости, условия средней строгости и/или условия низкой строгости, включая условия с высокой и сниженной строгостью, описанные здесь. В некоторых вариантах осуществления строгость условий промывания предусматривает условия, определяющие, находится ли нуклеиновая кислота в объеме этого изобретения, как описано ниже.
Гибридизация относится к процессу, при котором цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью посредством спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными, так что конкретная представляющая интерес последовательность может быть определена даже в образцах, в которых она находится в низких концентрациях. Подходящие строгие условия могут определяться, например, концентрациями соли или формамида в растворах для прегибридизации и гибридизации, или температурой гибридизации, и хорошо известны в данной области. В других вариантах осуществления строгость можно увеличивать снижением концентрации соли, повышением концентрации формамида или повышением температуры гибридизации. В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях различной строгости (например, высокой, умеренной и низкой), как указано в настоящем доку менте.
В некоторых вариантах осуществления гибридизация в условиях высокой строгости включает приблизительно 50% формамид при приблизительно от 37 до 42°С. В некоторых вариантах осуществления условия гибридизации включают условия сниженной строгости в приблизительно от 35 до 25% формамиде при приблизительно от 30 до 35°С. В некоторых вариантах осуществления условия гибридизации включают условия высокой строгости, такие как 42°С в 50% формамиде, 5Х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося. В некоторых вариантах осуществления условия гибридизации включают эти условия сниженной строгости, но в 35% формамиде при пониженной температуре 35°С. Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню строгости, может быть дополнительно сужен посредством вычисления соотношения пуринов и пиримидинов интересующей нуклеиновой кислоты и соответствующего подбора температуры. Варианты указанных выше диапазонов хорошо известны в данной области.
В других вариантах осуществления длина нуклеиновых кислот по этому изобретению, определенных по их способности гибридизоваться при строгих условиях, может находиться между приблизительно пятью остатками и полной длиной нуклеиновой кислоты по этому изобретению; например, их длина может составлять по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков. Нуклеи- 55 019971 новые кислоты, которые короче полной длины, также включаются. Эти нуклеиновые кислоты могут быть пригодны, например, в качестве зондов для гибридизации, зондов для мечения, олигонуклеотидных зондов для ПЦР, кЖПА или ттКПА (одноцепочечной или двухцепочечной), антисмысловой последовательности или последовательности, кодирующей пептиды, связывающиеся с антителами (эпитопами), мотивы, активные центры и т.п.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой строгости, включающих условия приблизительно 50% формамида при температуре от 37 до 42°С. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению определяют по их способности гибридизоваться при условиях пониженной строгости, включающих условия в приблизительно от 35 до 25% формамиде при температуре приблизительно от 30 до 35°С.
Альтернативно нуклеиновые кислоты по этому изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой строгости, включающих условия при температуре 42°С в 50% формамиде, 5Х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и с нуклеиновой кислотой, блокирующей повторяющиеся последовательности, такой как со1-1 или ДНК спермы лосося (например, 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению определяют по их способности гибридизоваться при условиях пониженной строгости, включающих 35% или 40% формамид при пониженной температуре 35 или 42°С.
В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня строгости, будут варьировать в зависимости от природы подлежащей гибридизации нуклеиновой кислоты. Например, при выборе условий гибридизации можно рассматривать длину, степень комплементарности, состав нуклеотидной последовательности (например, содержание СС относительно АТ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК относительно ДНК) в гибридизуемых участках нуклеиновых кислот. Дополнительно рассматривают, является ли одна из нуклеиновых кислот иммобилизованной, например, на фильтре.
Гибридизацию можно проводить в условиях низкой строгости, умеренной строгости или высокой строгости. В качестве примера гибридизации нуклеиновой кислоты сначала проводят предгибридизацию полимерной мембраны, содержащей иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты в течение 30 мин при 45°С в растворе, состоящем из 0,9 М №С1, 50 мМ NаН2Р04, рН 7,0, 5,0 мМ №ьЕОТА. 0,5% 8Ό8, 10Х ЭспйагШ и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем в раствор добавляют приблизительно 2х107 срт (удельная активность 4-9х108 срт/мкг) меченного на конце посредством 32Р олигонуклеотидного зонда. Через 12-16 ч инкубации мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре в 1Х 8ЕТ (150 мМ №С1, 20 мМ гидрохлорида ТтЦ рН 7,8, 1 мМ №2 ЭДТА), содержащим 0,5% 8Ό8, с последующим промыванием в течение 30 мин свежим 1Х 8ЕТ при Тт-10°С для олигонуклеотидного зонда. Затем мембрану проявляют на пленке для радиоавтографии в целях определения сигналов гибридизации. Все упомянутые выше способы гибридизации можно рассматривать, как проходящие в условиях высокой строгости.
После гибридизации для удаления любых неспецифично связанных детектируемых зондов фильтр можно промывать. Строгость, используемая для промывания фильтров, также может варьировать в зависимости от природы гибридизуемых нуклеиновых кислот, длины гибридизуемых нуклеиновых кислот, степени комплементарности, состава нуклеотидной последовательности (например, содержание СС относительно АТ) и типа нуклеиновой кислоты (например, РНК относительно ДНК). Примеры постепенно повышающихся условий строгости являются следующими: 2Х 88С, 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая строгость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная строгость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 в течение от 15 до 30 мин при температуре между температурой гибридизации и 68°С (высокая строгость); и 0,15 М №1С1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая строгость). Конечное промывание с низкой строгостью может быть проведено в 0,1Х 88С при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только иллюстрацией одного набора условий, который может использоваться для промывания фильтров. Специалист в данной области знает, что существует множество способов промывания с различной строгостью. Некоторые другие примеры приведены ниже.
В некоторых вариантах осуществления условия гибридизации включают стадию промывания, включающую промывание в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе, содержащем 1Х 150 мМ №С1, 20 мМ Тт18-гидрохлорид, рН 7,8, 1 мМ №ьЕОТА, 0,5% 8Ό8 с последующим промыванием в течение 30 мин в свежем растворе.
Нуклеиновые кислоты, гибридизованные с зондом, идентифицируют посредством радиоавтографии или других общепринятых способов.
Приведенные выше способы можно модифицировать для идентификации нуклеиновых кислот со сниженными уровнями идентичности последовательностей (гомологии) с последовательностью образца. Например, для получения нуклеиновых кислот со сниженной идентичностью последовательностей (гомологией) с поддающимся детекции зондом, можно использовать менее строгие условия. Например, температуру гибридизации можно снижать на интервал 5°С в диапазоне от 68 до 42°С в буфере для гиб
- 56 019971 ридизации с концентрацией №1' приблизительно 1 М. После гибридизации фильтр можно промывать 2Х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре гибридизации. Эти условия рассматривают как умеренные условия при температуре выше 50°С и низкие условия при температуре ниже 50°С. Конкретный пример умеренных условий гибридизаций представляет собой пример, где указанную выше гибридизацию проводят при 55°С. Конкретный пример условий гибридизации низкой строгости представляет собой пример, где указанную выше гибридизацию проводят при 45°С.
Альтернативно гибридизацию можно проводить в буферах, таких как 6Х 88С, содержащих формамид при температуре 42°С. В этом случае концентрация формамида в буфере для гибридизации может быть снижена на 5% интервал в диапазоне от 50 до 0% для идентификации клонов со сниженным уровнем гомологии с зондом. После гибридизации фильтр можно промывать 6Х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия рассматривают как умеренные условия при концентрации формамида более 25% и низкие условия при концентрации формамида менее 25%. Конкретный пример умеренных условий гибридизации представляет собой пример, где указанную выше гибридизацию проводят в 30% формамиде. Конкретный пример условий гибридизации низкой строгости представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят в 10% формамиде.
Однако выбор параметров гибридизации не является решающим, решающей является строгость условий промывания, которая предполагает условия, которые позволяют определить, находится ли нуклеиновая кислота в объеме этого изобретения. Условия промывания, используемые для идентификации нуклеиновых кислот в объеме этого изобретения включают, например: приблизительно 0,02 молярную концентрацию соли при рН 7 и температуру по меньшей мере приблизительно от 50°С или приблизительно от 55°С до приблизительно 60°С; или концентрацию соли приблизительно 0,15 М ШО при 72°С в течение приблизительно 15 мин; или концентрацию соли приблизительно 0,2Х 88С при температуре по меньшей мере приблизительно от 50°С или приблизительно от 55°С до приблизительно 60°С в течение приблизительно от 15 до приблизительно 20 мин; или гибридизационный комплекс промывают дважды раствором с концентрацией соли приблизительно 2Х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем промывают дважды 0,1Х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8 при 68°С в течение 15 мин; или эквивалентные условия. См. 8атЬгоок еб., МОЬЕСиЬАВ СЬОМЫС: А ЬАВОВАТОВУ МАХК/А. (2пб еб.), νο1к.1-3, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу (1989), ЬАВОВАТОВУ ТЕС11\ЮК'Е8 № Вй ОСНЕМКТВУ /\\1) МОЬЕСиЬАВ ВЮЬОСУ: НУВВГОЕАТЮМ АТГН ХЕСЕЕК' АСГО РВОВЕ8, Рай I. ТНеогу апб ЫисШс Ас1б Ргерагайоп, Туккеп, еб. Е1ке\тег, Ν. Υ. (1993) и АикиЬе1, еб. 1оНп ^йеу & 8опк, Шс., Νον Υο^к (1997) для описания буфера 88С и эквивалентных условий.
Эти способы можно использовать для выделения или идентификации нуклеиновых кислот по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им. Например, указанные выше способы можно использовать для выделения или идентификации нуклеиновых кислот, обладающих последовательностью по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более идентичностью (гомологией) последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из одной из последовательностей по этому изобретению и последовательностей, по существу идентичных ей, или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 их последовательно расположенных оснований и последовательностей, комплементарных им. Идентичность (гомологию) последовательностей можно определять с использованием алгоритма выравнивания. Например, гомологичные полинуклеотиды могут обладать кодирующей последовательностью, которая является природным аллельным вариантом одной из описанных в настоящем документе кодирующих последовательностей. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с нуклеиновыми кислотами по этому изобретению. Кроме того, приведенные выше способы можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды по меньшей мере приблизительно с 99%, 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% идентичностью (гомологией) последовательностей с полипептидом по этому изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, как определяют с использованием алгоритма выравнивания последовательностей (например, таких как алгоритм РА8ТА версии 3.0178 с параметрами по умолчанию).
Олигонуклеотидные зонды и способы их применения
Это изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот, которые можно использовать, например, для идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или его фрагменты, или для идентификации генов фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления зонд содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных оснований нуклеиновой кислоты по этому изобретению. Альтернативно зонд по этому изобретению может представлять собой по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
- 57 019971
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 или приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70 последовательно расположенных оснований последовательности, как указано, в нуклеиновой кислоте по этому изобретению. Зонды идентифицируют нуклеиновую кислоту посредством связывания и/или гибридизации. Также зонды можно использовать в матрицах по этому изобретению, см. обсуждение ниже, включающих, например, капиллярные матрицы. Зонды по этому изобретению также можно использовать для выделения других нуклеиновых кислот или полипептидов.
Выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты по этому изобретению, последовательности, комплементарные им, или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований одной из последовательностей по этому изобретению, или последовательности, комплементарные им, также можно использовать в качестве зондов для определения того, содержит ли биологический образец, такой как образец почвы, организм с последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению или организм, из которого была получена нуклеиновая кислота. В таких способах получают биологический образец, потенциально содержащий организм, из которого была выделена нуклеиновая кислота, и из образца получают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты подвергают контактированию с зондом в условиях, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с любыми комплементарными последовательностями, которые находятся в них.
При необходимости условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с комплементарной последовательностью, можно определять контактированием образца с комплементарными последовательностями из образцов, о которых известно, что они содержат комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарную последовательность. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, можно варьировать для идентификации условий, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с комплементарными нуклеиновыми кислотами.
Если образец содержит организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена, то затем определяют наличие специфичной гибридизации зонда. Гибридизацию можно выявить мечением зонда детектируемым веществом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование подвергаемого детекции продукта.
Множество способов применения меченых зондов для определения наличия комплементарных нуклеиновых кислот в образце известно специалистам в данной области. Они включают анализы саузернблоты, нозерн-блоты, способы гибридизации колоний и дот-блоты. Протоколы каждого из этих способов представлены в АикиЬе1 е! а1. Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойп \Убеу 503 8опк, 1пс. (1997) и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1опгпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (1989).
Альтернативно в реакции амплификации можно использовать более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфично гибридизоваться с любой комплементарной последовательностью, которая присутствует в образце нуклеиновой кислоты), для определения, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению (например, организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена). В некоторых вариантах осуществления зонды включают олигонуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления реакция амплификации может включать реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны в АикиЬе1 и 8атЬгоок, выше. Альтернативно амплификация может включать лигазную цепную реакцию, 38В, или реакцию вытеснения цепей. (См. Вагапу, Г., ТНе Ыдаке Скат Веасйоп т а РСВ \Уог1б, РСВ Ме!йобк апб АррНсайопк 1:5-16, 1991; Е. Еайу е! а1., 8е1£-кик!атеб 8ес.|иепсе ВерНсайоп (38В): Ап 1ко!йегта1 Тгапкспрйоп-Ьакеб АтрбПсаРоп 8ук!ет А1!етаруе !о РСВ, РСВ Ме!йобк апб АррНсайопк 1:25-33, 1991; и \Уа1кег С.Т. е! а1., 8!гапб Э|кр1асетеп1 Атр11йсайопап 1ко!йегта1 т νί!το ΌΝΛ АтрбПсабоп Тесйп1цие, №.1с1е1с ас1б Векеагсй 20: 1691-1696, 1992). В таких способах нуклеиновые кислоты подвергают контактированию в образце с олигонуклеотидными зондами, проводят реакцию амплификации и определяют любой полученный продукт амплификации. Продукт амплификации можно определять проведением гель-электрофореза продуктов реакции и окрашиванием геля интеркалирующим красителем, таким как бромистый этидий. Альтернативно один или несколько зондов можно метить радиоактивным изотопом, и наличие радиоактивного продукта амплификации можно определять радиоавтографией после гель-электрофореза.
Зонды, полученные из последовательностей вблизи концов последовательностей по этому изобретению, также можно использовать в способах прогулки по хромосоме для идентификации клонов, содержащих геномные последовательности, расположенные рядом с последовательностями по этому изобретению. Такие способы позволяют выделять из организма хозяина гены, которые кодируют дополнительные белки.
В некоторых вариантах осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты по этому изобретению, комплементарные им последовательности или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 или более последо
- 58 019971 вательно расположенных оснований одной из последовательностей по этому изобретению, или последовательности, комплементарные им, используют в качестве зондов для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах сходные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномные ДНК из организмов, отличных от организма, из которого нуклеиновая кислота была выделена. Например, другие организмы могут быть родственными организмами. В таких способах образец с нуклеиновой кислотой подвергают контактированию с зондом в условиях, которые обеспечивают специфичную гибридизацию зонда с родественными последовательностями. Затем определяют наличие гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма с использованием любого из описанных выше способов.
Варьируя строгость условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномные ДНК, которые гибридизуются с поддающимся детекции зондом, можно идентифицировать и выделять нуклеиновые кислоты с различными уровнями гомологии. Строгость можно варьировать проведением гибридизации при различных температурах ниже температуры плавления зондов. Температура плавления, Тт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с абсолютно комплементарным зондом. Высоко строгие выбирают, чтобы они были равны или составляли приблизительно на 5°С ниже, чем Тт для конкретного зонда. Температуру плавления зонда можно вычислять с использованием следующих формул:
Для образцов длиной между 14 и 70 нуклеотидами температуру плавления (Тт) вычисляют с использованием формулы:
Тт=81,5 + 16,6(1од[Ыа+])+0,41(фракция С+С)-(600^), где N представляет собой длину зонда.
Если гибридизацию проводят в растворе, содержащем формамид, температуру плавления можно вычислять с использованием формулы: Тт=81,5 + 16,6(1од |№1'|)+0,41(фракция С+С)-(0,63% формамида)-(600/Ы), где N представляет собой длину зонда.
Предгибридизацию можно проводить в 6Х 88С, 5Х реагенте Пеийагй!, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или в 6Х 88С, 5Х реагенте Пеийагй!, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы для растворов 88С и Оеийагй! приведены в 8атЬгоок е1 а1., выше.
В некоторых вариантах осуществления гибридизацию проводят добавлением детектируемого зонда в растворы для предгибридизации, перечисленные выше. Когда зонд содержит двухцепочечную ДНК, перед добавлением раствора для гибридизации его денатурируют. В некоторых вариантах осуществления фильтр подвергают контактированию с раствором для гибридизации на достаточный период времени для того, чтобы обеспечить гибридизацию зонда с кДНК или с геномными ДНК, содержащими последовательности, комплементарные ему или гомологичные ему. Для зондов длиной более 200 нуклеотидов гибридизацию можно проводить при температуре на 15-25°С ниже Тт. В случае более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизацию можно проводить при температуре на 5-10°С ниже Тт. В некоторых вариантах осуществления для гибридизации в 6Х 88С гибридизацию проводят при приблизительно 68°С. Как правило, для гибридизации в растворах, содержащих 50% формамид, гибридизацию проводят при приблизительно 42°С.
Ингибирование экспрессии ферментов альдолаз
Это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, комплементарным (например, антисмысловые последовательности) нуклеиновым кислотам по этому изобретению, таким как кодирующие фермент альдолазу нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты по этому изобретению, содержащие антисмысловые последовательности, способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию генов, кодирующих фермент альдолазу. Ингибирование можно обеспечивать нацеливанием на геномную ДНК или матричную РНК. Транскрипцию или функционирование нуклеиновой кислоты-мишени можно ингибировать, например, гибридизацией и/или расщеплением. Один особенно пригодный ряд ингибиторов, обеспечиваемый настоящим изобретением, включает олигонуклеотиды, способные связывать либо ген, либо транскрипт фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в любом случае предотвращая или ингибируя продукцию или функционирование фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Ассоциация может происходить посредством специфичной в отношении последовательности гибридизации. Другой пригодный класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление транскрипта фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, как в случае рибозимов. Олигонуклеотид можно химически модифицировать или конъюгировать с ферментом или композицией, способными расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Группу из множества различных подобных олигонуклеотидов можно исследовать в отношении наличия олигонуклеотидов с требуемой активностью. Таким образом, это изобретение относится к различным композициям для ингибирования экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, на уровне нуклеиновой кислоты и/или белка, таким как антисмысловая последовательность, кЖЫА, тЖНА. и рибозимы, содержащие последовательности фермента альдолазы, такой как пирува
- 59 019971 тальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, антитела против альдолазы, такие как антитела против пируватальдолазы, такие как антитела против альдолазы НМО и/или КНО по этому изобретению.
Ингибирование экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может обладать множеством промышленных применений. Например, ингибирование экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, может замедлить или предотвратить деградацию. В некоторых вариантах осуществления применение композиций по этому изобретению, которые ингибируют экспрессию и/или активность ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, таких как антитела, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, зГКЫА и ттКЫА, используют для замедления или предотвращения деградации. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам и композициям, включающим нанесение на растение или растительный продукт (такой как хлебный злак, зерно, плод, семя, корни, листья и т.д.) антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, зГКЫА и тгКЫА по этому изобретению для замедления или предотвращения деградации. Также эти композиции могут экспрессироваться растением (таким как трансгенное растение) или другим организмом (таким как бактерия или другой микроорганизм, трансформированный геном фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза НМО и/или КНО, по этому изобретению).
Композиции по этому изобретению для ингибирования экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО (такие как антисмысловые молекулы, 1КЫА, рибозимы, антитела), можно применять в качестве фармацевтических композиций, таких как средства против патогенов или в других лекарственных средствах, таких как противомикробные средства, например, против 8а1топе11а.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Это изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, способным связывать транскрипт ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, которые в некоторых вариантах осуществления могут ингибировать активность ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, посредством нацеливания на мРНК. Стратегии для конструирования антисмысловых олигонуклеотидов хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может разработать такие олигонуклеотиды ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, с использованием новых реагентов по этому изобретению. Например, протоколы прогулок по гену/картирования РНК для поиска эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, см., Но (2000) МеШодз Епхуток 314:168-183, где описан анализ для картирования РНК, который основан на стандартных молекулярных технологиях, для обеспечения легкого и надежного способа эффективного выбора антисмысловой последовательности. См. также 8ιπί11ι (2000) Еиг. 1. Рйагт. 8сЕ 11:191-198.
В качестве антисмысловых олигонуклеотидов используют встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты. Антисмысловые олигонуклеотиды могут иметь любую длину; например, в других аспектах длина антисмысловых олигонуклеотидов составляет между приблизительно 5 и 100, приблизительно 10 и 80, приблизительно 15 и 60, приблизительно 18 и 40. Оптимальную длину можно определять общепринятыми способами скрининга. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть представлены в любой концентрации. Оптимальную концентрацию можно определять общепринятыми способами скрининга. Известно широкое множество синтетических, не встречающихся в природе аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут решить эту потенциальную проблему. Например, можно использовать пептидные нуклеиновые кислоты (РNА), содержащие неионные остовы, такие как элементы N-(2аминоэтил)глицина. Также можно использовать антисмысловые олигонуклеотиды с фосфоротиоатными связями, как описано в \У0 97/03211; \У0 96/39154; Ма!а (1997) Тохюо1 Арр1. Рйагтасо1. 144:189-197; Апйзепсе Тйегареийсз, ед. Адгауа1 (Нитапа Ргезз, То!оуа, N.1., 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, обладающие синтетическими аналогами остова ДНК, относящиеся к этому изобретению, также могут включать нуклеиновые кислоты с фосфородитиоатом, метилфосфонатом, фосфорамидатом, алкилфосфотриэфиром, сульфаматом, 3'-тиоацеталем, метилен(метилимино), 3'-Ы-карбаматом и морфолинокарбаматом, как описано выше.
Для создания большого количества олигонуклеотидов, которые можно быстро исследовать в отношении конкретных олигонуклеотидов, которые обладают соответствующей аффинностью связывания и специфичностью к любой мишени, такой как смысловые и антисмысловые последовательности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО по этому изобретению, можно использовать комбинаторную химическую методологию (см. Оо1д (1995) 1. оГ Вю1. Сйет. 270:13581-13584)).
Ингибиторные рибозимы
Это изобретение относится к рибозимам, способным связывать транскрипт ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО. Эти рибозимы могут ингибировать активность ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, например, нацеливанием на мРНК. Стратегии для разработки рибозимов и селекции антисмысловой последовательности, специфичной для ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза
- 60 019971
НМС и/или КНС, для нацеливания хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может разработать такие рибозимы с использованием новых реагентов по этому изобретению. Рибозимы действуют посредством связывания РНК-мишени с помощью связывающего РНКмишень участка рибозима, который находится в непосредственной близости с ферментативным участком РНК, который расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим распознает и связывает РНК-мишень посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком, действует, ферментативно расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени подобным образом нарушает ее способность направлять синтез кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После связывания и расщепления рибозимом его РНКмишени, он может высвобождаться из этой РНК для повторного связывания и расщепления новых мишеней.
В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может быть преимущественной по сравнению с другими технологиями, такими как антисмысловые технологии (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, блокируя ее транскрипцию, трансляцию или ассоциацию с другой молекулой), поскольку эффективная концентрация рибозима, необходимая для проведения терапевтического лечения, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Это потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, единичная молекула рибозима способна расщеплять множество молекул РНК-мишеней. В некоторых вариантах осуществления рибозим представляет собой высокоспецифичный ингибитор со специфичностью ингибирования, зависящей не только от связывания механизмом спаривания оснований, но также от механизма, посредством которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. Следовательно, ингибирование происходит вследствие расщепления РНК-мишени, и, таким образом, специфичность определяется как соотношение скорости расщепления РНК-мишени и скорости расщепления РНК, которая не является мишенью. Этот механизм расщепления зависит от факторов, которые являются дополнительными для факторов, вовлеченных в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть более высокой, чем специфичность антисмыслового олигонуклеотида, связывающего тот же участок РНК.
Рибозим по этому изобретению, такой как ферментативная молекула РНК рибозима, может быть образован в форме мотива в виде головки молотка, мотива в виде шпильки, такого как мотив вируса гепатита дельта, мотив интрона группы Ι и/или РНКазе Р-подобная РНК, в ассоциации со вспомогательной последовательностью РНК. Примеры мотивов в виде головки молотка описаны, например, Вокк1 (1992) А1бк Векеагск аиб Нитаи Вейоуйикек 8:183; мотивов в виде шпильки в Натре1 (1989) Вюскетщйу 28:4929, и Натре1 (1990) Кис. Ас1бк Век. 18:299; мотив вируса гепатита дельта в Реггойа (1992) Вюскет1к!гу 31:16; мотив РНКазы Р в Сиетег-Такаба (1983) Се11 35:849; и интрон группы I в патенте США № 4987071, выданном Сеск. Перечисление этих конкретных мотивов не предназначено для ограничения. Специалисты в данной области поймут, что рибозим по этому изобретению, например ферментативная молекула РНК по этому изобретению, может обладать специфичным участком связывания субстрата, комплементарным одному или нескольким участкам РНК гена-мишени. Рибозим по этому изобретению может иметь нуклеотидную последовательность в этом участке связывания субстрата или рядом с ним, который придает молекуле активность в отношении расщепления РНК.
Интерференция РНК (ΚΝΑΐ)
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к ингибиторным молекулам РНК, так называемым молекулам ВNА^, содержащим последовательности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению. Молекула ВЫА1 может содержать двухцепочечную молекулу РНК (бкВNА), такую как молекулы к^ВNА, тГВЫА и/или короткошпилечной РНК (к^ПА). Молекула ВЫА1, такая как к1ВЫА (малая ингибиторная РНК) и/или тГВИА (микроРНК), может ингибировать экспрессию гена фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления длина молекулы ВNА^, такой как к1ВЫА и/или т1ВЫА, составляет приблизительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или более дуплексных нуклеотидов. Несмотря на то что это изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, ВЫА1 может проникать в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (ккВNА) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. Когда клетка подвергается воздействию двухцепочечной РНК (бкВЫА), мРНК гомологичного гена селективно деградируется в процессе, называемом РНК-интерференцией (ВNА^). Возможный основной механизм ВNА^ представляет собой разрушение двухцепочечной РНК (бкВNА), совпадающей со специфичной последовательностью гена, на короткие фрагменты, называемые короткими интерферирующими РНК, которые запускают деградацию мРНК, которая совпадает с их последовательностью. В некоторых вариантах осуществления ВИАт по этому изобретению используют в лекарственных средствах для подавления генов, см., 8киеу (2002) Эгид Эксом. Тобау 7:1040-1046. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам селективной деградации РНК с использованием ВNА^ по этому изобретению. Процесс может быть осуществлен 1и уйго, ех у1уо или ш У1уо. В некоторых вариантах осуществления молекулы ВЫА! по этому изобретению можно использовать
- 61 019971 для внесения мутации с потерей функции в клетке, органе или животном.
В одном аспекте внутриклеточное введение ΚΉΛί проводят посредством интернализации специфичного для клетки-мишени лиганда, связанного со связывающим РНК белком, содержащим адсорбированную на нем КЫА1 (такую как микроРНК). Лиганд является специфичным для уникального антигена клеточной поверхности клетки-мишени. Лиганд может подвергаться спонтанной интернализации после связывания с антигеном клеточной поверхности. Если уникальный антиген клеточной поверхности в естественных условиях не подвергается интернализации после связывания с его лигандом, интернализацию можно обеспечивать включением обогащенного аргинином пептида, или другого проникающего через мембрану пептида, в структуру лиганда или связывающего РНК белка или присоединения такого пептида к лиганду или связывающему РНК белку. См. публикации патентных заявок США №№ 20060030003; 20060025361; 20060019286; 20060019258. В одном аспекте это изобретение относится к составам на основе липидов для доставки, такой как введение, нуклеиновых кислот по этому изобретению в качестве частиц нуклеиновая кислота-липид, содержащих молекулу ВNА^, в клетку, см., например, публикацию патентной заявки США 20060008910.
Модификация нуклеиновых кислот
Это изобретение относится к способам получения вариантов нуклеиновых кислот по этому изобретению, таких как нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолазы НМО и/или КНО. Эти способы можно повторять или применять в различных сочетаниях для получения ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, с измененной или отличающейся активностью или с измененной или отличающейся стабильностью относительно активности и стабильности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. Также эти способы можно повторять или использовать в различных сочетаниях, например, для создания изменений экспрессии гена/транскрипта, трансляции транскрипта или стабильности транскрипта. В других вариантах осуществления генетический набор клетки изменяют, например, посредством модификации гомологичного гена сх νί\Ό с последующим повторным встраиванием в клетку.
Нуклеиновую кислоту по этому изобретению можно изменять любыми способами, например, случайными или стохастическими способами, или нестохастическими способами или способами направленных изменений, см., патент США № 6361974. Способы внесения случайных мутаций в гены хорошо известны в данной области, см., патент США № 5830696. Например, для внесения случайной мутации в ген можно использовать мутагены. Мутагены включают, например, облучение ультрафиолетовым светом или гамма-облучение, или химический мутаген, например митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, отдельно или в сочетании, для индукции повреждений ДНК, поддающихся репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены представляют собой аналоги предшественников нуклеотидов, например нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2аминопурин или акридин. Эти вещества можно добавлять в реакцию ПЦР вместо нуклеотидных предшественников, вызывая посредством этого мутации в последовательности. Также можно использовать интеркалирующие вещества, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т.п.
Можно использовать любую технологию молекулярной биологии, например, случайный мутагенез посредством ПЦР, см. Вюс (1992) Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А 89:54 67-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, см. Сгатсп (1995) Вю1сс11пк|исв 18:194-196. Альтернативно можно осуществлять пересборку нуклеиновых кислот, например генов, после случайной, или стохастической, фрагментации, см. патенты США №№ 6291242; 6287862; 6287861; 5955358; 5830721; 5824514; 5811238; 5605793. В других вариантах осуществления модификации вставки или делеции вносят с помощью ПЦР с пониженной точностью, перетасовки, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, ПЦР со сборкой, мутагенеза с помощью половой ПЦР, мутагенеза ίπ νί\Ό, кассетного мутагенеза, возвратно-множественного мутагенеза, экспоненциально-множественного мутагенеза, сайт-специфического мутагенеза, пересборки гена (такой как ОспсВсавватМу, см. патент США № 6537776), мутагенеза с насыщением сайтов гена (О88М), синтетической пересборки лигированием (8ЬВ), рекомбинации, возвратной рекомбинации последовательностей, мутагенеза модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенеза с содержащей урацил матрицей, мутагенеза с содержащими разрывы дуплексами, мутагенеза с репарацией точек несоответствия, мутагенеза с дефектом репарации цепи хозяина, химического мутагенеза, мутагенеза радиогенного происхождения, мутагенеза с делецией, мутагенеза с рестрикцией и селекцией, мутагенеза с рестрикцией и исправлением ошибок, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, создания химерного мультимера нуклеиновой кислоты, хромосомного мутагенеза с насыщением и/или сочетанием этих и других способов.
В следующих публикациях описано множество способов возвратной рекомбинации процедур и/или способов, которые могут быть включены в способы по этому изобретению: 81сттсг (1999) Мо1сси1аг Ьгссбтд оГ уиивсв Гог 1агдс(1пд апб о111сг с11шса1 ргорсгЦсв Титог Тагдсйпд 4:1-4; №вв (1999) №Иигс ВюВсйпо^ду 17:893-896; Сйапд (1999) Ενо1иΐ^ои оГ а суЮктс ивтд ОХА ГатПу вкиГПтд Ха1игс Вю1сс11по1оду 17:793-797; Мтвйи11 (1999) Рго1ст суокПюп Ьу то1сси1аг Ьгссбтд СиггсгИ 0ршюп ш Скстюа1
- 62 019971
Вю1оду 3:284-290; Сйпкйапк (1999) Э1гес1еб еуо1и!юп оГ Гйутчбте кчпаке Гог А2Т рйокрйогу1а!юп иктд ЭНА ГатПу кйиГйтд №!игеВю!есйпо1оду 17:259-264; Сгатеп (1998) ОНА кйиййпд оГ а ГатПу оГ депек Ггот бчуегке кресчек ассе1ега!ек бчгес!еб еуо1ийоп №1й1ге 391:288-291; Сгатеп (1997) Мо1еси1аг еуо1и!юп оГап агкепа!е бе!ох1йсайоп ра!йгау Ьу ЭКА кйиГйтд, №1Шге Вю!есйпо1оду 15:436-438; 2йапд (1997) Όίгес!еб еуо1ийоп оГ ап еГГесйуе Гисокчбаке Ггот а да1ас!окчбаке Ьу ^NА кйиГйтд апб ксгеептд Ргос. №Й. Асаб. 5сГ И5А 94:4504-4509; Райеп е! а1. (1997) Аррйсайопк оГ ^NА 5йиГГйпд !о Рйагтасеийса1к апб Уасстек Сиггеп! 0рПпоп т В1о!есйпо1оду 8:724-733; Сгатеп е! а1. (1996) Сопкйисйоп апб еуо1ийоп оГ апйЬобу-рйаде йЬгайек Ьу кйиГйтд №1Шге Мебюте 2:100-103; Оа!ек е! а1. (1996) АГйпйу ке1есйуе
1ко1айоп оГ йдапбк Ггот рерйбе йЬгапек Гйгоидй бчкр1ау оп а 1ас гергекког йеабрчесе бчтег 1оигпа1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду 255:373-386; 5!еттег (1996) 5ехиа1 РСЯ апб АккетЬ1у РСЯ Ιπ: Тйе Епсус1оребча оГ Мо1еси1аг Вю1оду. УСН РиЬйкйегк, №\ν Уогк, рр.447-457; Сгатеп апб 5!еттег (1995) СотЬта1опа1 ти1йр1е сакке!!е тиГадепекчк сгеа!ек а11 Гйе регти!айопк оГ тиГап! апб гйбГуре саккейек ВюТесйтциек 18:194-195; 5!еттег е! а1. (1995) 5шд1е-к!ер аккетЬ1у оГ а депе апб епйге р1актчб Гогт 1агде питЬегк оГ ойдобеохупЬопис1ео!1бек Оепе, 164:49-53; 5!еттег (1995) Тйе Еуо1ийоп оГ Мо1еси1аг СотриГайоп 5счепсе 270: 1510; 5!еттег (1995) 5еагсйтд 5ециепсе 5расе В1о/Тесйпо1оду 13:549-553; 5!еттег (1994) Яарчб еуо1ийоп оГ а рго!еш ш уйго Ьу ^NА кйиййпд №1й1ге 370:389-391; апб 5!еттег (1994) ^NА кйиййпд Ьу гапбот Ггадтеп!а!юп апб геаккетЬ1у: Ш уйго гесотЫпайоп Гог то1еси1аг еуо1ийоп. Ргос. №111. Асаб. 5сГ И5А 91:10747-10751.
Способы внесения мутаций обеспечения разнообразия включают, например, сайт-направленный мутагенез (Ьтд е! а1. (1997) Арргоасйек !о ^NА ти!адепек1к: ап оуегучег Апа1 Вюсйет. 254 (2):157-178; Эа1е е! а1. (1996) 0йдопис1еойбе-бйес!еб гапбот ти!адепек1к иктд !йе рйокрйого!йюа!е те!йоб МеГйобк Мо1. Вю1. 57:369-374; 5тйй (1985) ’йп уйго тиГадепекчк Апп. Яеу. Оепе!. 19:423-462; Во!к!еш & 5йой1е (1985) 5!га!ед1ек апб аррйсайопк оГ ш уйго тиГадепекчк 5счепсе 229:1193-1201; Сайег (1986) 5йе-бйес!еб тиГадепекчк Вюсйет. I. 237:1-7; апб Кипке1 (1987) Тйе еГйсчепсу оГ ойдопис1еойбе бйес!еб тиГадепекчк ш №.1с1е1с Асчбк & Мо1еси1аг Вю1оду (Ескк!ещ Е. апб ЬШеу, Ό. М. I. ебк., 5рппдег Уег1ад, Вегйп)); мутагенез с содержащими урацил матрицами (Кипке1 (1985) Яарчб апб еГйсчеп! кйе-кресчйс ти!адепек1к гййои! рйепоГурю ке1ес!юп Ргос. №!1. Асаб. 5сГ И5А 82:488-492; Кипке1 е! а1. (1987) Яарчб апб еГйсчеп! кйекресШс ти!адепек1к гййои! рйепоГурю ке1ес!юп МеГйобк ш Епхуто1. 154,367-382; апб Вакк е! а1. (1988) Ми!ап! Тгр гергеккогк \\ЙП пег ^NА-Ь^πб^πд кресШсйчек 5счепсе 242:240-245); олигонуклеотиднаправленный мутагенез (Ме!йобк чп ЕпхутоГ 100:468-500 (1983); Ме!йобк т ЕпхутоГ 154:329-350 (1987); 2о11ег (1982) 0йдопис1еойбе-б1гес!еб тиГадепекчк иктд М13-бепуеб уес!огк: ап еГйсчеп! апб депега1 ргосебиге Гог Гйе ргобисйоп оГ рот! тиГайопк т апу ^NА Ггадтеп! №.1с1ею Асчбк Яек. 10:6487-6500; 2о11ег & 5тйй (1983) 0йдопис1еойбе-б1гес!еб тиГадепекчк оГ ^NА Ггадтеп!к с1опеб т!о М13 уес!огк Ме!йобк чп ЕпхутоГ 100:468-500; апб 2о11ег (1987) 0йдопис1еойбе-бйес!еб ти!адепекчк: а кчтр1е те!йоб иктд !го ойдопис1еойбе рптегк апб а ктд1е-к!гапбеб !етр1а!е Ме!йобк т ЕпхутоГ 154:329-350);
мутагенез с модификацией ДНК фосфоротиоатом (Тау1ог (1985) Тйе ике оГ рйокрйого!Ыоа!е-тобГйеб ^NА 1п гекГпсйоп епхуте геасйопк !о ргераге шскеб ^NА N^1. Асчбк Яек. 13:8749-8764; Тау1ог (1985) Тйе гарчб депегайоп оГ ойдопис1ео!1бе-бйес!еб тиГайопк а! Ыдй Ггециепсу иктд рйокрйогоГйюа!е-тобШеб ^NА №с1. Асчбк Яек. 13:8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) ’йпйчЬйюп оГ гекйгсйоп епбопис1еаке №ί Ι с1еауаде Ьу рйокрйогоГйюа!е дгоирк апб йк аррйсайоп !о ойдопис1еойбе-бйес!еб ти!адепекчк №с1. Асчбк Яек. 14:9679-9698; 5ауегк (1988) Υ-Т Ехопис1еакек т рйокрйого!йюа!е-Ьакеб ойдопис1еойбе-бйес!еб ти!адепекчк №с1. Асчбк Яек. 16:791-802; апб 5ауегк е! а1. (1988) 5!гапб кресчйс с1еауаде оГ рйокрйогоГйюа!есопГаштд ^NА Ьу геасйоп гйй гекйгсйоп епбопис1еакек т !йе ргекепсе оГ еГйчбтт Ьготчбе №с1. Асчбк Яек. 16:803-814); мутагенез с использованием разрывов в дуплексе ДНК (Кгатег е! а1. (1984) Тйе дарреб бир1ех ^NА арргоасй !о ойдопис1еойбе-бйес!еб тиГайоп сопкйисйоп №с1. Асчбк Яек. 12:9441-9456; Кгатег & ЕгПх (1987) МеГйобк ш ЕпхутоГ 0йдопис1еойбе-б1гес!еб сопкйисйоп оГ тиГайопк уча дарреб бир1ех ^NА 154:350-367; Кгатег (1988) ’йтргоуеб епхутаПс т уйго геасйопк т !йе дарреб бир1ех ^NА арргоасй !о ойдопис1еойбе-бйес!еб сопкйисйоп оГ тиГайопк №с1. Асчбк Яек. 16:7207; апб Егйх (1988) 0йдопис1ео!1бе-бйес!еб сопкйисйоп оГ тиГайопк: а дарреб бир1ех ргосебиге гййои! епхутаПс геасйопк т уйго №с1. Асчбк Яек. 16:6987-6999).
Дополнительные протоколы, которые можно использовать для осуществления этого изобретения, включают репарацию ошибочно спаренных оснований (Кгатег (1984) Рот! М1кта!сй Яерай Се11 38:879-887), мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефектной репарацией (Сайег е! а1. (1985) 'Чшргоуеб ойдопис1еойбе кйе-бйес!еб ти!адепек1к иктд М13 уес!огк №с1. Асчбк Яек. 13:4431-4443; апб Сайег (1987) 'Чтргогеб ойдопис1ео!1бе-бйес!еб ти!адепек1к иктд М13 уес!огк Ме!йобк т ЕпхутоГ 154:382-403), делеционный мутагенез (ЕдЫебагхабеП (1986) Ике оГ ойдопис1еойбек !о депега!е 1агде бе1ейопк №с1. Асчбк Яек. 14:5115), рестрикцию с селекцией, и рестрикцию с селекцией и рестрикцию с исправлением ошибок (\Уе11к е! а1. (1986) йпройапсе оГ йубгодеп-Ьопб Гогтайоп т к1аЬП1хтд !йе !гапкйюп к!а!е оГ киЬййкчп РЫ1. Тгапк. Я. 5ос. Ьопб. А 317:415-423), мутагенез посредством синтеза целого гена (№тЫаг е! а1. (1984) ТоГа1 купГйекчк апб с1оптд оГ а депе собтд Гог !йе пЬопис1еаке 5 рго!ет 5счепсе 223:1299-1301; 5акатаг (1988) То!а1 куп!йекчк апб ехргеккюп оГ а депе Гог !йе а-киЬиш! оГ Ьоуте гоб ои!ег кедтеп! диапте пис1еойбе-Ьтбтд рго!ет (Ггапкбист) №с1. Асчбк Яек. 14:6361-6372; \Уе11к е! а1. (1985)
- 63 019971
Саккебе тЫадепекк: ап еГПаеп! те!1юб Гог депегабоп оГ ти1бр1е ти!абопк а! бейпеб кйек Оепе 34:315323; апб Огипбк!гот е! а1. (1985) 011дошс1еоббе-бйес!еб ти!адепек1к Ьу ткгокса1е 'кйо!-дип' депе купЛек1к N^1. Ас1бк Кек. 13:3305-3316), репарацию двухцепоченых разрывав (Мапбеск1 (1986); Агпо1б (1993) Рго!ет епдтеейпд Гог ипикиа1 епуйотпеп!к Ситгеп! 0р1топ ш Вю!ес1то1оду 4:450-455. 0йдопис1еоббебйес!еб боиЫе-к!гапб Ьгеак герап ш р1акт1бк оГ ΕксйейсЫа соб: а теЛоб Гог кйе-кресбас ти1адепек1к Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 83:7177-7181). Дополнительные детали множества из приведенных выше способов можно найти в Ме!1юбк ш Εηζуто1оду Уо1ите 154, где также описаны приемлемые способы контроля устранения проблем повреждений при различных способах мутагенеза.
Протоколы, которые можно использовать для применения на практике этого изобретения, описаны, например, в патенте США № 5605793, выданном 8!ештег (25 февраля 1997 года), Ме!1юбк Гог Ы Уйго КесотЬтайоп; в патенте США № 5811238, выданном 8!еттет е! а1. (22 сентября 1998 года) МеЫобк Гог Оепегайпд Ро1упис1еоббек йаутд Бекйеб Сйагас!ейкбск Ьу Йетабуе 8е1есбоп апб КесотЫпабоп; в патенте США № 5830721, выданном 8!еттег е! а1. (3 ноября 1998 года), ЭНА Ми!адепек1к Ьу Капбот Ргадтейабоп апб КеаккетЬ1у; в патенте США № 5834252, выданном 8!еттег е! а1. (10 ноября 1998 года) Εпб-Сошр1ешепΐа^у Ро1утегаке Кеасбоп; в патенте США № 5837458, выданном Мб1к1ш11 е! а1. (17 ноября 1998 года), Ме!1юбк апб СотрокШопк Гог Се11и1аг апб Ме!аЬойс Εпд^пее^^пд; \Υ0 95/22625, 8!еттег и Статей, МШадепекк Ьу Капбот РгадтеШабоп апб КеаккетЬ1у; \Υ0 96/33207, 8!еттег и Ыркс1ш!х Επ6 Сотр1етеп!агу Ро1утегаке Сйат Кеасбоп; \Υ0 97/20078, 8!еттег и Статен МеЫобк Гог Оепегабпд Ро1упис1еоббек йаутд Бекйеб Сйагас!ейкбск Ьу Йегабуе 8е1есбоп апб КесотЫпабоп; \Υ0 97/35966, Мб1к1ш11 и 8^ιηιικΓ, МеЫобк апб СотрокИзопк Гог Се11и1аг апб Ме!аЬобс Εпд^пее^^пд; \Υ0 99/41402 Риппопеп е! а1., Тагдебпд оГ Оепебс Уассте Уес!огк; \Υ0 99/41383, Риппопеп е! а1., Апбдеп ЫЬгагу Итпишхаиоп; \Υ0 99/41369, Риппопеп е! а1., Оепебс Уассте Уес!ог Εпд^пее^^пд; \Υ0 99/41368, Риппопеп е! а1. 0р!итха!юп оГ Iшшипошоби1аΐо^у Ргорегбек оГ Оепебс Уассшек; ΕР 752008, 8!еттег и Статен, ЭКА Ми!адепек1к Ьу Капбот РгадтеШабоп апб КеаккетЬ1у; ΕР 0932670, 8!еттег Ενо1ν^пд Се11и1аг ЭкА Ир!аке Ьу КеситДуе 8ес.|иепсе КесотЫпабоп; \Υ0 99/23107, 8!еттег е! а1., МобШсабоп оГ У1гик Тторкт апб Нок! Капде Ьу Упа1 Оепоте 81иГбтд; \Υ0 99/21979, Ар! е! а1., Нитап РарШотаушик Уес!огк; \Υ0 98/31837 бе1 Сагбауге е! а1., 'БуоЫбоп оГ \¥1ю1е Се11к апб 0гдатктк Ьу КесигДуе 8ес.|иепсе КесотЫпабоп; \Υ0 98/27230, Рабеп и 8!е1П1пег, МеЫобк апб СотрокШопк Гог Ро1урерббе Εпд^пее^^пд; \Υ0 98/27230, 8!еттег е! а1., Ме!1юбк Гог 0р!итха!гоп оГ Оепе Тйегару Ьу КесигДуе 8ес.|иепсе 81шГПтд апб 8е1есбоп, \Υ0 00/00632, Ме!1юбк Гог Оепегабпд Н1дЫу Б|уегке ЫЬганек, \Υ0 00/09679, МеЫобк Гог 0Ыаштд т Уйго КесотЫпеб Ро1упис1еоббе 8ес.|иепсе Вапкк апб КекиЫпд 8ециепсек, \Υ0 98/42832, Агпо1б е! а1., КесотЫпабоп оГ Ро1упис1еоббе 8ес.|иепсек Иктд Капбот ог БеПпеб Рнтегк, \Υ0 99/29902, Агпо1б е! а1., Ме!1юб Гог Сгеабпд Ро1упис1еоббе апб Ро1урерббе 8ециепсек, \Υ0 98/41653, Утб, Ап ш Уйго МеЫоб Гог Сопк!гис!юп оГ а ^NΛ ЫЬгагу, \Υ0 98/41622, Вогсйей е! а1., Ме!1юб Гог Сопкбисбпд а ЫЬтату иктд ^NΛ 8йи£Йтд и \Υ0 98/42727, Раб апб 2аг1тд, 8ес.|иепсе АЙегабопк иктд Ното1одоик КесотЫпабоп.
Протоколы, которые можно использовать для применения на практике этого изобретения (в которых представлены детали различных способов обеспечения разнообразия), описаны, например, в патентной заявке США с серийным № (и88Ц) 09/407800, ^ОТРЕШО 0Р С0В04 А^ТΕКΕ^ ОΕNΕ8, Рабеп е! а1., поданной 28 сентября 1999 года; ΕУ0^υТI0N 0Р \\Ί Ι01.Ε ΕΕΕΕ8 АЫЭ 0КОАМ8М8 ВУ ΗΕϋυ^ΓΥΕ 8ΕΟΕΕ\ΕΕ КΕС0МВINΛТI0N, бе1 Сагбауге е! а1., в патенте США № 6379964; 0ΕΙ60\ΕΕΕΕΟΓΙΟΕ \1Ε3)Ι/νΓΕ3) \ΕΕΕΕΙΕ АСИ) КΕС0МВINΛТI0N, Статей е! а1., в патентах США №№ 6319714; 6368861; 6376246; 6423542; 6426224 и РСТ/и800/01203; 'Έ8Ε 0Р СΟ^ΟN-УАКΓΕ^ 0Ы(.1041.14+:03316: 8ΥNТНΕ8I8 Р0К 8ΥNТНΕТIС 8НυРР^INО, \У'е1с11 е! а1., в патенте США № 6436675; МПАЗ Ю1)8 Р0К МАКРЫО СНАКΛСТΕК 8ТКШО8, РΟ^ΥNυС^ΕΟТI^Ε8 & РΟ^ΥРΕРТI^Ε8 НАУШО ΟΕ8ΙΡΕΌ СНАКΛСТΕКΓ8ТIС8, 8еЫопоу е! а1. , поданной 18 января 2000 года, (РСТ/и800/01202) и, например, '^^008 Р0К МАКТЫС СНАКΛСТΕК 8ТКШО8, РΟ^ΥNυС^ΕΟТI^Ε8 & Р0^ΥРΕРΠΌΕ8 НАУШО ΟΕ8ΙΡΕΌ СНАКΛСТΕК[8ТIС8, 8еЫопоу е! а1., поданной 18 июля 2000 года (серийный номер США № 09/618579); ^^008 0Р РΟРυ^ΛТINО БАТА 8ТКυСТυКΕ8 Р0К υ8Ε Ш ΕΕ0ΕΕТI0NАКΥ 8IМΕ^ΛТI0N8. 8ейГопоу и 8!еттег, поданной 18 января 2000 года (РСТ/и800/01138); и 8INО^Ε-8ТКАN^Ε^ \ΕΕΕΕΙΕ АСИ) ТΕМР^ΛТΕ-МΕ^IΛТΕ^ КΕС0МВINΛТI0N ААВ \ΕΕΕΕΙΕ АСГО РКΛОМΕNТ I80^ΛТI0N. АГГйобег, поданной 6 сентября 2000 года (серийный номер США № 09/656549); в патентах США №№ 6177263; 6153410.
Нестохастические способы, или направленные изменения, включают, например, мутагенез с насыщением сайтов гена (О88М), синтетическую пересборку лигированием (8ЬК) или их сочетание, используют для модификации нуклеиновых кислот по этому изобретению в целях получения ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, с новыми или измененными свойствами (например, активность в высоко кислых или щелочных условиях, при высоких и низких температурах и т.п.). Полипептиды, кодируемые модифицированными нуклеиновыми кислотами, можно подвергать скринингу на активность перед тестированием в отношении образования углерод-углеродной связи или расщепления, или на другую активность. Можно использовать любые приемы или протоколы, например, применение платформы капиллярной матрицы. См. патенты США №№ 6361974; 6280926;
- 64 019971
5939250.
Мутагенез с насыщением сайтов гена или С88М
Также это изобретение относится к способам получения фермента с использованием мутагенеза с насыщением сайтов гена, или С88М, как описано в настоящем документе, а также в патентах США №№ 6171820 и 6579258. В некоторых вариантах осуществления праймеры с кодонами, содержащие вырожденную последовательность Ν,Ν,ϋ/Τ, используют для внесения точковых мутаций в полинуклеотид, такой как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или антитело по этому изобретению, так, чтобы получить ряд полипептидов-потомков, в которых представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен в каждом положении аминокислоты, таком как аминокислотный остаток в активном центре фермента или участке связывания лиганда, предназначенные для модификации. Эти олигонуклеотиды могут содержать последовательно расположенные первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,ϋ/Τ и необязательно вторую гомологичную последовательность. Последующие продукты трансляции-потомки, полученные в результате применения таких олигонуклеотидов, включают все возможные замены аминокислот в любом аминокислотном положении на протяжении полипептида вследствие того, что вырожденные последовательности Ν,Ν,ϋ/Τ включают кодоны для всех 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления один такой вырожденный олигонуклеотид (состоящий например, из одной вырожденной кассеты Ν,Ν,ϋ/Τ) используют для того, чтобы подвергать каждый исходный кодон исходной полинуклеотидной матрицы полному диапазону замен кодонов. В других вариантах осуществления используют по меньшей мере две вырожденные кассеты - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергать по меньшей мере два исходных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Например, может быть получено более одной последовательности Ν,Ν,ϋ/Τ в одном олигонуклеотиде для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. В этом множестве последовательностей Ν,Ν,ϋ/Τ могут быть расположены непосредственно рядом, или отделены одной или несколькими дополнительной нуклеотидной последовательностью(ями). В других вариантах осуществления можно использовать олигонуклеотиды, пригодные для внесения вставок или делеций, либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,ϋ/Τ, для внесения любого сочетания или перестановки аминокислотных вставок, делеций и/или замен.
В некоторых вариантах осуществления одновременный мутагенез в двух или более соседних аминокислотных положениях проводят с использованием олигонуклеотида, который содержит расположенные последовательно триплеты Ν,Ν,ϋ/Τ, т.е. вырожденную последовательность (Ν,ΝΌ./Τ)η. В других вариантах осуществления используют менее вырожденные кассеты, чем последовательности Ν,Ν,ϋ/Τ. Например, в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, содержащей только один Ν, где указанный Ν может находиться в первом, втором или в третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета можно использовать любые другие основания, включая любые их сочетания или перестановки. Альтернативно в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотидах) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν.
В некоторых вариантах осуществления применение вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν,Ο/Τ) обеспечивает систематическое и легкое получение полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) в любом аминокислотном положении в полипептиде (в других вариантах осуществления способы также включают проведение менее чем всех возможных замен в положении аминокислотного остатка или кодона). Например, в случае полипептида из 100 аминокислот можно получить 2000 различных образцов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). При применении олигонуклеотида или набора олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν,ϋ/Τ, все 20 возможных природных аминокислот могут кодироваться 32 отдельными последовательностями. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают мутагенезу с насыщением, при применении по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, образуются 32 различных производных полинуклеотида, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, применение невырожденного олигонуклеотида в сайтнаправленном мутагенезе приводит только к одному производному полипептидному продукту в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды необязательно можно использовать в сочетании с описанными вырожденными праймерами; например, невырожденные олигонуклеотиды можно использовать для получения конкретных точковых мутаций в рассматриваемом полинуклеотиде. Это обеспечивает один из способов проведения конкретных молчащих точковых мутаций, точковых мутаций, приводящих к соответствующему изменению аминокислоты, и точковых мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов, и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.
В некоторых вариантах осуществления в каждом реакционном сосуде для мутагенеза с насыщением находятся полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул производных полипептидов (таких как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолазы НМС и/или КНС)), чтобы все 20 природных аминокислот были представлены в одном конкретном аминокислотном положении, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде (в других
- 65 019971 вариантах осуществления используют менее чем все 20 природных сочетаний). 32-кратно вырожденные производные полипептиды, полученные из каждого реакционного сосуда после мутагенеза с насыщением, можно подвергать клональной амплификации (например, их можно клонировать в пригодном хозяине, таком как хозяин Е. со11, с использованием, например, экспрессирующего вектора), и их можно подвергать анализу экспрессии. Когда посредством скринига идентифицируют, что отдельный производный полипептид проявляет благоприятные изменения свойств (по сравнению с исходным полипетидом, например, повышение активности образования углерод-углеродной связи или расщепления в щелочных или кислых условиях), его можно секвенировать в целях идентификации соответствующей благоприятной аминокислотной замены, находящейся в нем.
В некоторых вариантах осуществления при внесении мутации в любое аминокислотное положение исходного полипептида с использованием мутагенеза с насыщением, как описано в настоящем документе, благоприятные изменения аминокислот можно идентифицировать более чем в одном аминокислотном положении. Можно получить одну или несколько новых производных молекул, которые содержат сочетание всех или части из этих благоприятных аминокислотных замен. Например, если в каждом из трех 3 аминокислотных положений в полипептиде идентифицировано 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой, и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, существует всего 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7 из них, которые были рассмотрены ранее - 6 единичных точковых мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.
В другом варианте осуществления мутагенез с насыщением сайта можно использовать совместно с перетасовкой, химеризацией, рекомбинацией и другими процессами внесения мутаций, совместно со скринингом. Это изобретение относится к многократному применению любого процесса (ов) внесения мутаций, включая мутагенез с насыщением. В одном иллюстративном примере многократное применение любого процесса(ов) внесения мутаций используют в сочетании со скринингом.
Также это изобретение относится к применению запатентованных праймеров с кодонами (содержащих вырожденные последовательности N,N,N1 для внесения точковых мутаций в полинуклеотид, чтобы получать ряд производных полипептидов, в которых в любом положении аминокислоты представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен (мутагенез с насыщением сайтов гена (О88М)). Используемые олигонуклеотиды состоят из расположенных последовательно первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности ККК и, в некоторых вариантах осуществления, но необязательно, второй гомологичной последовательности. Последующие производные продукты трансляции при применении таких олигонуклеотидов включают все возможные аминокислотные замены в любом аминокислотном положении на протяжении полипептида, вследствие того, что вырожденная последовательность ККК включает кодоны для всех 20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий одну вырожденную кассету N,N,N1 используют для того, чтобы подвергать любой исходный кодон в родительской полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В других вариантах осуществления используют по меньшей мере две вырожденных кассеты ККК - либо в одном олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергать по меньшей мере два исходных кодона в родительской полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Таким образом, в одном олигонуклеотиде могут находиться более одной последовательности ККК для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. Это множество последовательностей ККК может быть расположено непосредственно последовательно, или они разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В других вариантах осуществления олигонуклеотиды, пригодные для внесения вставок или делений, можно использовать либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность ККК для внесения любого сочетания или перестановки аминокислотных вставок, делений и/или замен.
В некоторых вариантах осуществления возможным является одновременное внесение мутаций в два или более соседних аминокислотных положений с использованием олигонуклеотида, который содержит последовательно расположенные триплеты ККК т.е. вырожденную последовательность (КК№)п. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению вырожденных кассет, обладающих меньшей вырожденностью, чем последовательности ККК Например, в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, содержащей только один N где N может находиться в первом, втором или третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета можно использовать любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки. Альтернативно в некоторых случаях может быть желательным применение (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности ККК триплетных последовательностей ККО/Т или N,N,0/0.
В некоторых вариантах осуществления применение вырожденного триплета (такого как триплетная последовательность ККО/Т или ККО/С) является преимущественным по нескольким причинам. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам систематического и довольно
- 66 019971 простого проведения замены в любом аминокислотном положении в полипептиде полным диапазоном возможных аминокислот (всего 20 аминокислот). Таким образом, в случае полипептида из 100 аминокислот, это изобретение относится к способам систематического и довольно простого получения 2000 различных видов (т.е. 20 возможных аминокислотных перестановок на одно положение в 100 аминокислотных положениях). Понятно, что при применении олигонуклеотида, содержащего вырожденную триплетную последовательность К,И,С/Т или К,И,С/С, получают 32 отдельных последовательности, которые кодируют 20 возможных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают мутагенезу с насыщением, при применении одного такого олигонуклеотида образуется 32 различных производных полинуклеотида, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида при сайтнаправленном мутагенезе приводит только к одному производному полипептидному продукту в реакционном сосуде.
Также это изобретение относится к применению невырожденных олигонуклеотидов, которые необязательно можно использовать в сочетании с описанными вырожденными праймерами. Понятно, что для внесения конкретной точковой мутации в рассматриваемый полинуклеотид в некоторых случаях является предпочтительным применение невырожденных олигонуклеотидов. Это обеспечивает способы внесения конкретных молчащих точковых мутаций, точковых мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точковых мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов, и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления этого изобретения каждый реакционный сосуд для мутагенеза с насыщением содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 производных полипептидных молекул, чтобы все 20 аминокислот были представлены в одном конкретном аминокислотном положении, соответствующем положению кодона, в который в исходном полинуклеотиде внесена мутация. 32-кратно вырожденные производные полипептиды, образующиеся при каждой реакции мутагенеза с насыщением, можно подвергать клональной амплификации (например, их можно клонировать в пригодном хозяине Е.сой с использованием экспрессирующего вектора), и их можно подвергать скринингу экспрессии. Когда посредством скрининга идентифицируют, что отдельный производный полипептид проявляет благоприятное изменение свойства (при сравнении с исходным полипептидом), его можно секвенировать для идентификации соответствующей благоприятной аминокислотной замены, находящейся в нем.
В некоторых вариантах осуществления при внесении мутации в любое аминокислотное положение родительского полипептида с использованием мутагенеза с насыщением, как описано в настоящем документе, благоприятные изменения аминокислот могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Можно получить одну или несколько новых производных молекул, которые содержат сочетание всех или части из этих благоприятных аминокислотных замен. Например, если в каждом из трех 3 аминокислотных положений в полипептиде идентифицировано 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой, и в каждом из двух положений) и 3 положения. Таким образом, существует всего 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7 из них, которые были ранее рассмотрены - 6 единичных точковых мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.
Таким образом, в неограничивающем иллюстративном примере это изобретение относится к применению мутагенеза с насыщением в сочетании с дополнительным процессом внесения мутаций, таким как процесс, где два или более сходных полинуклеотида вводят в пригодную клетку-хозяина, так что при рекомбинации и редуктивной пересборке образуется гибридный полинуклеотид.
В дополнение к проведению мутагенеза на протяжении всей последовательности гена настоящее изобретение предусматривает, что мутагенез можно использовать для замены каждого из любого количества оснований в полинуклеотидной последовательности, где количество оснований, подлежащих внесению мутаций, в некоторых вариантах осуществления представляет собой любое число от 15 до 100000. Таким образом, вместо внесения мутаций в каждое положение на протяжении молекулы, можно подвергать мутагенезу любое основание или отдельное количество оснований (в некоторых вариантах осуществления подгруппу, вмещающую 15 до 100000). В некоторых вариантах осуществления для внесения мутации в каждое положение или в группу положений на протяжении полинуклеотидной последовательности используют отдельный нуклеотид. Группа из 3 положений, подлежащих внесению мутаций, может представлять собой кодон. Мутации можно вносить с использованием мутагенного праймера, содержащего гетерологичную кассету, который также называется мутагенной кассетой. Иллюстративные кассеты могут иметь от 1 до 500 оснований. Каждое нуклеотидное положение в таких гетерологичных кассетах представляет собой N А, С, С, Т, А/С, А/С, А/Т, С/С, С/Т, С/Т, С/С/Т, А/С/Т, А/С/Т, А/С/С или Е, где Е представляет собой любое основание, которое не является А, С, С или Т (Е может быть назван олигонуклеотидом разработчика).
В некоторых вариантах осуществления мутагенез с насыщением включает внесение мутации в полный набор мутагенных кассет (где в некоторых вариантах осуществления длина каждой кассеты состав
- 67 019971 ляет приблизительно 1-500 оснований) в определенной полинуклеотидной последовательности, подлежащей внесению мутаций (где в некоторых вариантах осуществления длина последовательности, подлежащей внесения мутаций, составляет приблизительно от 15 до 100000 оснований). Таким образом, в каждую кассету для внесения мутаций вносят набор мутаций (находящихся в диапазоне от 1 до 100 мутаций). Набор мутаций, подлежащих внесению в одну кассету, может отличаться от второго набора мутаций, которые вносят во вторую кассету в процессе выполнения одного цикла мутагенеза с насыщением, или может быть одинаковым с ним. Примерами таких наборов являются наборы с делениями, вставками, наборами конкретных кодонов и наборы кассет конкретных нуклеотидов.
В некоторых вариантах осуществления определенные последовательности, подлежащие внесению мутаций, включают целый ген, каскад, кДНК, целую открытую рамку считывания (0КБ) и целый промотор, энхансер, репрессор/трансактиватор, ориджин репликации, интрон, оператор или любую функциональную группу полинуклеотида. Как правило, определенные последовательности для этих целей могут представлять собой любой полинуклеотид, который представляет собой полинуклеотидную последовательность из 15 оснований и полинуклеотидные последовательности длиной между 15 основаниями и 15000 оснований (конкретно, это изобретение относится к любому числу, находящемуся между ними). Принципы выбора наборов кодонов учитывают типы аминокислот, кодируемых вырожденной мутагенной кассетой.
В некоторых вариантах осуществления для группирования набора мутаций, которые можно вносить в мутагенную кассету, это изобретение относится конкретно к вырожденным заменам кодонов (с использованием вырожденных олигонуклеотидов), которые кодируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 аминокислот в каждом положении, и к библиотеке полипептидов, кодируемых ими.
Синтетическая пересборка лигированием (8ЬК)
Это изобретение относится к системе нестохастической модификации генов, называемой синтетической пересборкой лигированием или просто 8ЬК, процесс направленных изменений, для получения полипептидов, таких как ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолазы НМС и/или КНС, или антитела по этому изобретению, с новыми или измененными свойствами.
8ЬК представляет собой способ нестохастического лигирования олигонуклеотидных фрагментов друг с другом. Этот способ отличается от стохастической перетасовки олигонуклеотидов тем, что структурные блоки нуклеиновой кислоты перемещают, соединяют или химеризуют не случайным образом, а предпочтительно собирают нестохастически. См. патенты США №№ 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776. В некоторых вариантах осуществления 8ЬК включает следующие стадии: (а) предоставление матричного полинуклеотида, где матричный полинуклеотид содержит последовательность, кодируемую гомологичным геном; (Ь) предоставление множества полинуклеотидных структурных блоков, где полинуклеотидные структурные блоки сконструированы для перекрестной пересборки с матричным полинуклеотидом в определенной последовательности, и полинуклеотидный структурный блок содержит последовательность, которая представляет собой вариант гомологичного гена и последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, фланкирующую последовательность варианта; (с) объединение полинуклеотидного структурного блока с матричным полинуклеотидом, чтобы полинуклеотид структурного блока подвергался перекрестной пересборке с матричным полинуклеотидом, с образованием полинуклеотидов, содержащих варианты последовательностей гомологичного гена.
8ЬК не зависит от наличия высокого уровня гомологии между подлежащими реаранжировке полинуклеотидами. Таким образом, этот способ можно использовать для нестохастического создания библиотек (или наборов) производных молекул, содержащих более 10100 различных химер. 8ЬК можно использовать для создания библиотек, содержащих более 101000 различных производных химер. Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения включают нестохастические способы получения набора окончательных химерных молекул нуклеиновых кислот, конечный порядком сборки, который выбран при разработке. Этот способ включает стадии проведения разработки множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот с пригодными взаимно совместимыми лигируемыми концами, и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот, чтобы полностью достигать запланированного порядка сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот, предназначенных для сборки, рассматривают как пригодные для этого типа упорядоченной сборки, если они способны соединять структурные блоки в предопределенном порядке. Таким образом, весь порядок сборки, в котором можно соединять структурные блоки нуклеиновых кислот, определяется конструкцией лигируемых концов. Если применяют более одной стадии сборки, тогда весь порядок сборки, в котором могут соединяться структурные блоки нуклеиновых кислот, также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. В некоторых вариантах осуществления для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов соединенные структурные фрагменты обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4).
В некоторых вариантах осуществления конструкцию олигонуклеотидных структурных блоков получают с помощью анализа набора матриц с исходной последовательностью нуклеиновой кислоты, которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов. Эти
- 68 019971 исходные олигонуклеотидные матрицы, таким образом, служат в качестве источника информации о последовательности, которая облегчает конструирование структурных блоков нуклеиновых кислот, которые подлежат мутагенезу, например, химеризации или перетасовке. В некоторых вариантах осуществления этого способа последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот выравнивают, в целях выбрать одну или несколько пограничных точек. Пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии, и они содержат один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления эти пограничные точки являются общими по меньшей мере для двух исходных матриц. Таким образом, пограничные точки могут использовать для обозначения границ в олигонуклеотидных структурных блоках, подлежащих получению для перегруппировки исходных полинуклеотидов. Пограничные точки, идентифицированные и выбранные в исходных молекулах, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке конечных производных химерных молекул. Пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание), общую по меньшей мере для двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Альтернативно пограничная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей, по меньшей мере, для половины исходных полинуклеотидных последовательностей, или она может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для двух третей исходных полинуклеотидных последовательностей. Более того, в некоторых вариантах осуществления пригодные пограничные точки представляют собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для трех четвертей полинуклеотидных последовательностей, или она может быть общей почти для всех исходных полинуклеотидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления пограничная точка представляет собой область гомологии, которая является общей для всех исходных полинуклеотидных последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления проводят исчерпывающий процесс пересборки лигированием в целях получения полной библиотеки производных химерных полинуклеотидов. Другими словами, все возможные упорядоченные сочетания структурных блоков нуклеиновых кислот предоставляют в наборе конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, в других вариантах осуществления порядок сборки (т.е. порядок присоединения каждого структурного блока от 5'- к 3'-концу в последовательности каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании является запланированным (или нестохастическим), как описано выше. Вследствие нестохастического характера этого изобретения вероятность нежелательных побочных продуктов значительно снижается.
В других вариантах осуществления способ пересборки лигированием проводят систематически. Например, способ проводят в целях получения систематически разделенную библиотеку производных молекул, с отделами, которые можно подвергать систематическому скринингу, например, друг за другом. Другими словами это изобретение предусматривает, чтобы посредством селективного и целесообразного применения структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном использовании последовательных постадийных реакций сборки, могла быть достигнута схема опыта, где в каждом из нескольких реакционных сосудов получают конкретный набор производных продуктов. Это дает возможность систематического проведения процесса исследования и скрининга. Таким образом, эти способы дают возможность систематического исследования потенциально очень большого количества производных молекул в меньших группах. Вследствие возможности осуществлять химеризацию способом, который является универсальным и в то же время также исчерпывающим и систематическим, особенно в случае низкого уровня гомологии среди исходных молекул, эти способы обеспечивают создание библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы пересборки лигированием по настоящему изобретению, производные молекулы, полученные в некоторых вариантах осуществления, включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот, обладающих, в целом, таким порядком сборки, который выбран при разработке. Способы мутагенеза с насыщением и оптимизированного направленного изменения также можно использовать для получения различных типов производных молекул. Понятно, что это изобретение предусматривает свободу выбора и контроля в отношении пограничных точек, размера и количества структурных блоков нуклеиновых кислот, и размера и конструкции соединенных элементов. Более того, понятно, что требование наличия межмолекулярной гомологии является очень нестрогим для удобства применения этого изобретению. Более того, пограничные точки можно выбирать даже в областях небольшой межмолекулярной гомологии и при ее отсутствии. Например, вследствие качания кодонов, т.е. вырожденности кодонов, в структурный блок нуклеиновой кислоты можно вносить нуклеотидные замены без изменения аминокислоты, которую изначально кодирует соответствующая исходная матрица. Альтернативно кодон может быть изменен, чтобы изменялся код исходной аминокислоты. Это изобретение предусматривает, что такие замены можно вносить в структурный блок нуклеиновой кислоты в целях повышения частоты межмолекулярных гомологичных пограничных точек и, таким образом, для возможности достижения повышения количества соединений между структурными блоками, что, в свою очередь, позволяет создать большее количество производных химерных молекул.
Синтетическая пересборка генов
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нестохастическому спо
- 69 019971 собу, называемому синтетической пересборкой гена, который в некоторой степени является сходным со стохастической перетасовкой, за исключением того, что перетасовка, соединение или химеризация структурных блоков нуклеиновых кислот происходит не случайным образом, а предпочтительно они собираются нестохастически. См. патент США № 6537776.
Способ синтетической пересборки гена не зависит от наличия высокого уровня гомологии между полинуклеотидами, подлежащими перетасовке. Это изобретение можно использовать для нестохастического получения библиотек (или наборов) производных молекул, содержащих свыше 10100 различных химер. Предположительно, синтетическую пересборку гена можно использовать даже для получения библиотек, содержащих свыше 10100 различных производных химер.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нестохастическому способу получения набора конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с итоговым порядком сборки, который выбран при разработке, где способ включает стадии получения в соответствии с разработкой множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, обладающих пригодными взаимно совместимыми лигируемыми концами, и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот, чтобы был полностью достигнут запланированный порядок сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот, подлежащих сборки, рассматривают как пригодные для этого типа упорядоченной сборки, если они способны соединять структурные блоки в определенном порядке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления итоговый порядок сборки, в котором могут быть соединены структурные блоки нуклеиновых кислот, определяется конструкцией лигируемых концов, и если используют более одной стадии сборки, тогда итоговый порядок сборки, в котором могут быть соединены структурные блоки нуклеиновых кислот, также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. В одном варианте осуществления для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов соединенные структурные фрагменты обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4).
В другом варианте осуществления конструкцию структурных блоков нуклеиновых кислот получают с помощью анализа последовательностей набора матриц исходных нуклеиновых кислот, которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов. Таким образом, эти исходные матрицы нуклеиновых кислот, служат в качестве источника информации о последовательности, которая облегчает разработку структурных блоков нуклеиновых кислот, которые подлежат внесению мутаций, например, химеризации или перетасовке.
В одном иллюстративном примере это изобретение относится к химеризации семейства родственных генов и кодируемого ими семейства сходных продуктов. В конкретном иллюстративном примере кодируемые продукты представляют собой ферменты. Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, по настоящему изобретению можно подвергать мутагенезу способами, описанными в настоящем документе.
Таким образом, с соответствии с одним вариантом этого изобретения последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот (например, полинуклеотидов по этому изобретению) выравнивают в целях выбора одной или нескольких пограничных точек, где пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии. Пограничные точки можно использовать для обозначения границ в подлежащих созданию структурных блоках нуклеиновых кислот. Таким образом, пограничные точки, идентифицированные и выбранные в исходных молекулах, при сборке производных молекул служат в качестве потенциальных точек химеризации.
В некоторых вариантах осуществления пригодная пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание), общую по меньшей мере для двух исходных матриц, однако пограничная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины исходных матриц, по меньшей мере для двух третей исходных матриц, по меньшей мере для трех четвертей исходных матриц и, в некоторых вариантах осуществления, почти для всех исходных матриц. Более того, в некоторых вариантах осуществления, пригодные пограничные точки представляют собой область гомологии, которая является общей для всех исходных матриц.
В некоторых вариантах осуществления проводят исчерпывающий процесс пересборки гена в целях получения полной библиотеки. Другими словами, все возможные упорядоченные сочетания структурных блоков нуклеиновых кислот предоставляют в наборе конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, порядок сборки (т.е. порядок присоединения каждого структурного блока от 5'- к 3'-концу последовательности каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании является запланированным (или нестохастическим). Вследствие нестохастической природы способа вероятность нежелательных побочных продуктов значительно снижается.
В других вариантах осуществления способ предусматривает систематическое проведение пересборки лигированием, например, для получения систематически разделенной библиотеки с отделами, которые можно подвергать систематическому скринингу, например, друг за другом. Другими словами, это изобретение предусматривает, чтобы посредством селективного и целесообразного использования конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном ис
- 70 019971 пользовании последовательных постадийных реакций сборки, могла быть достигнута схема опыта, где в каждом из нескольких реакционных сосудов получают конкретный набор производных продуктов. Это дает возможность проведения систематического процесса исследования и скрининга. Таким образом, это дает возможность систематического исследования потенциально очень большого количества производных молекул в меньших группах.
Вследствие возможности проведения химеризации таким способом, который является универсальным и в то же время также исчерпывающим и систематическим, особенно в случае низкого уровня гомологии среди исходных молекул, настоящее изобретение предусматривает получение библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы пересборки лигированием по настоящему изобретению, производные молекулы, полученные в некоторых вариантах осуществления, включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с таким порядком сборки, в целом, который выбран при разработке. В некоторых вариантах осуществления такая полученная библиотека содержит от более 103 до более 101000 различных типов производных молекул.
В некоторых вариантах осуществления набор конечных химерных молекул нуклеиновых кислот, полученных, как описано, содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид. В одном варианте осуществления этот полинуклеотид представляет собой ген, который может представлять собой искусственный ген. В другом варианте осуществления этот полинуклеотид представляет собой каскад генов, который может представлять собой искусственный каскад генов. Это изобретение подразумевает, что один или несколько искусственных генов, полученных по этому изобретению, могут быть включены в искусственный каскад генов, такой как каскад, функционирующий в эукариотическом организме (включая растения).
В другом иллюстративном примере синтетический характер стадии, на которой образуются структурные блоки, дает возможность разработки и встраивания нуклеотидов (например, одного или нескольких нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны или интроны, или регуляторные последовательности), которые впоследствии необязательно могут быть удалены в процессе ш νίΙΐΌ (например, посредством мутагенеза) или в процессе 1и у1уо (например, с использованием способности к сплайсингу генов в организме хозяина). Понятно, что во многих случаях встраивание этих нуклеотидов также может быть желательным по многим другим причинам, в дополнение к потенциальному преимуществу получения подходящей пограничной точки.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления это изобретение подразумевает, что структурные блоки нуклеиновых кислот можно использовать для встраивания интрона. Таким образом, это изобретение предусматривает, что в искусственный ген по этому изобретению можно встраивать функциональные интроны. Также это изобретение предусматривает, что функциональные интроны можно встраивать в искусственный каскад генов по этому изобретению. Таким образом, это изобретение относится к получению химерного полинуклеотида, который представляет собой искусственный ген, содержащий один (или несколько) искусственно встроенный интрон(ов).
Таким образом, это изобретение также относится к получению химерного полинуклеотида, который представляет собой искусственный каскад генов, содержащий один (или несколько) искусственно встроенный интрон(ы). В некоторых вариантах осуществления искусственно встроенный интрон(ы) является функциональным в одной или нескольких клетках-хозяевах в отношении сплайсинга гена, подобно тому, как природные интроны функционально служат для сплайсинга генов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к процессу получения искусственных содержащих интрон полинуклеотидов, подлежащих введению в организм хозяина для рекомбинации и/или сплайсинга.
Искусственный ген, полученный по этому изобретению, также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. Аналогично искусственный каскад генов, полученный по этому изобретению, также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления рекомбинацию облегчают с помощью участков гомологии между искусственным содержащим интрон геном и нуклеиновой кислотой, которая служит в качестве партнера по рекомбинации, или рекомбинация происходит в них. В некоторых вариантах осуществления партнер по рекомбинации также может представлять собой нуклеиновую кислоту, полученную по этому изобретению, включая искусственный ген или каскад генов. Рекомбинацию можно облегчать с помощью областей гомологии, которые находятся в одном (или нескольких) искусственно встроенном интроне(ах) в искусственном гене, или рекомбинация может происходить в них.
В некоторых вариантах осуществления в способе синтетической повторной сборки гена по этому изобретению используют множество структурных блоков нуклеиновых кислот, каждый из которых в некоторых вариантах осуществления обладает двумя лигируемыми концами. Два лигируемых конца на каждом структурном блоке нуклеиновых кислот могут представлять собой два тупых конца (т.е. на каждом выступает ноль нуклеотидов) или, в некоторых вариантах осуществления, один тупой и один выступающий концы, или, более того, в некоторых вариантах осуществления два выступающих конца. В некоторых вариантах осуществления пригодный выступающий конец для этих целей может представлять собой 3'-выступающий конец или 5'-выступающий конец. Таким образом, структурный блок нуклеино
- 71 019971 вой кислоты может обладать 3'-выступающим концом или альтернативно 5'-выступающим концом, или альтернативно двумя 3'-выступающими концами, или альтернативно двумя 5-выступающими концами. Общий порядок, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот собираются с получением конечной химерной молекулы нуклеиновой кислоты, определяется предварительным экспериментальным планом и не является случайным.
В некоторых вариантах осуществления структурный блок нуклеиновой кислоты получают химическим синтезом двух одноцепочечных нуклеиновых кислот (также называемых одноцепочечными олигонуклеотидами) и контактированием их, чтобы дать им возможность соединиться с образованием двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты. Размер двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты может быть различным. Размеры этих структурных блоков могут быть небольшими или большими. Иллюстративные размеры структурных блоков находятся в диапазоне от 1 пары оснований (не включая какие-либо выступы) до 100000 пар оснований (не включая какие-либо выступы). Также предусмотрены другие иллюстративные диапазоны размеров, которые обладают нижними границами от 1 п.о. до 10000 п.о. (включая любое числовое значение между ними) и верхними границами от 2 п.о. до 100000 п.о. (включая любое числовое значение между ними).
Существует множество способов, которыми может быть получен двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты, который является пригодным для этого изобретения; и они известны в данной области и их может легко провести специалист в данной области. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты получают посредством первоначального образования двух одноцепочечных нуклеиновых кислот и обеспечения их соединения с образованием двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты. Две цепи двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты могут быть комплементарными по каждому нуклеотиду, за исключением любых нуклеотидов, которые образуют выступ; таким образом, они не имеют неправильно спаренных оснований, за исключением какого-либо выступа(ов). В другом варианте осуществления две цепи двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты являются комплементарными менее чем по каждому нуклеотиду, помимо любых нуклеотидов, которые образуют выступ. Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления, двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты можно использовать для внесения вырожденности кодонов. В некоторых вариантах осуществления вырожденность кодонов вносят с использованием мутагенеза с насыщением сайта, описанного в настоящем документе, применяя одну или несколько кассет Ν,Ν,Ο/Т или альтернативно применяя одну или несколько кассет Ν,Ν,Ν.
Способ рекомбинации т νί\Ό по этому изобретению может быть выполнен вслепую на совокупности неизвестных гибридов или аллелей конкретного полинуклеотида или последовательности. Однако не является необходимым знание истинной ДНК или РНК конкретного полинуклеотида. Подход с использованием рекомбинации в смешанной совокупности генов может быть пригоден для получения любых пригодных белков, например, альдолазы по этому изобретению или ее вариантов. Этот подход можно использовать для получения белков с измененной специфичностью или активностью. Также этот может быть пригодным для получения гибридных последовательностей нуклеиновых кислот, например последовательностей промоторных участков, интронов, экзонов, энхансеров, 3'-нетранслируемых областей или 5'-нетранслируемых областей генов. Таким образом, этот подход можно использовать для получения генов с повышенным уровнем экспрессии. Также этот подход может быть пригодным для исследования повторяющихся последовательностей ДНК. В заключение, этот подход может быть пригодным для внесения мутаций в рибозимы или аптамеры по этому изобретению.
В некоторых вариантах осуществления изобретение, описанное в настоящем документе, относится к применению повторяющихся циклов редуктивной пересборки, рекомбинации и селекции, которые обеспечивают направленные молекулярные изменения высококомплексных линейных последовательностей, таких как ДНК, РНК или белки посредством рекомбинации.
Оптимизированная система направленных изменений
Это изобретение относится к системе нестохастической модификации генов, называемой оптимизированной системой направленных изменений, для получения полипептидов, например ферментов альдолаз, таких пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или антитела по этому изобретению с новыми или измененными свойствами. В некоторых вариантах осуществления оптимизированные направленные изменения направлены на применение повторяющихся циклов редуктивной пересборки, рекомбинации и селекции, которые обеспечивают направленные молекулярные изменения нуклеиновых кислот посредством рекомбинации.
Оптимизированные направленные изменения позволяют получить большую совокупность измененных химерных последовательностей, где полученная совокупность значительно обогащена последовательностями, которые обладают определенным количеством точек кроссинговера. Точка кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка в норме находится на стыке, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единой последовательности. Этот способ позволяет вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последова
- 72 019971 тельностей, чтобы конечная химерная группа последовательностей была обогащена на выбранное количество точек кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль над выбором химерных вариантов, обладающих предопределенным количеством точек кроссинговера.
Кроме того, этот способ относится к удобным способам исследования огромного количества возможных вариантов из диапазона белков по сравнению с другими системами. Ранее, если в процессе реакции образовывалось, например, 1013 химерных молекул, было чрезвычайно сложно тестировать такое большое количество химерных вариантов в отношении наличия конкретной активности. Более того, значительная часть совокупности производных обладает очень большим количеством точек кроссинговера, что приводит к белкам, которые с меньшей вероятностью обладают повышенным уровнем конкретной активности. При применении этих способов в совокупности химерных молекул можно увеличить долю таких вариантов, которые обладают конкретным количеством точек кроссинговера. Таким образом, несмотря на то, что в процессе реакции по-прежнему образуется 1013 химерных молекул, каждая из молекул, выбранных для дальнейшего анализа, с большей вероятностью будет обладать, например, только тремя точками кроссинговера. Вследствие того, что получающаяся в результате совокупность производных может быть изменена так, чтобы она обладала определенным количеством точек кроссинговера, границы функционального разнообразия среди химерных молекул уменьшаются. Это обеспечивает более контролируемое количество переменных при вычислении того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.
Один способ получения химерной производной полинуклеотидной последовательности представляет собой создание олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид включает уникальный участок перекрывания, так что смешивание вместе олигонуклеотидов приводит к новому варианту, который обладает всеми олигонуклеотидными фрагментами, собранными в правильном порядке. Дополнительную информацию также можно найти, например, в патентах США №№ 6773900; 6740506; 6713282;6635449;6605449;6537776;6361974.
Количество олигонуклеотидов, полученных для каждого исходного варианта, соответствует суммарному количеству произошедших кроссинговеров в химерной молекуле, которая в итоге образуется. Например, в целях поиска химерного варианта, например, с более высокой активностью при высокой температуре, для проведения реакции лигирования могут быть предоставлены три исходных варианта нуклеотидных последовательностей. В качестве одного примера можно получить набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих любым участкам каждого исходного варианта. Таким образом, в процессе пересборки лигированием в каждой химерной последовательности может быть вплоть до 50 точек кроссинговера. Вероятность того, что каждый из полученных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого исходного варианта в альтернативном порядке, очень низка. Если каждый олигонуклеотидный фрагмент представлен в реакции лигирования в одном молярном количестве, тогда вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же исходного полинуклеотида будут лигироваться друг с другом и, таким образом, не приведут к точке кроссинговера. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждой исходной молекулы остается постоянной в процессе любой стадии лигирования в этом примере, тогда существует вероятность 1/3 (в случае 3 источников), что олигонуклеотид из того же исходного варианта будет лигироваться в химерную последовательность и не приведет к кроссинговеру.
Таким образом, можно определять плотность распределения вероятностей (РЭЕ) для предсказания совокупности точек кроссинговера, которые, вероятно, возникнут в процессе каждой стадии реакции лигирования, с учетом количества исходных вариантов в наборе, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентраций каждого варианта в процессе каждой стадии реакции лигирования. Статистические и математические способы, помимо определения РЭЕ, описаны ниже. Используя эти способы, можно вычислять такую плотность распределения вероятностей, и, таким образом, обогащать группу химерных производных предопределенным количеством точек кроссинговера, получаемых в результате конкретной реакции лигирования. Более того, планируемое количество точек кроссинговера может быть предопределенным, и затем систему программируют для вычисления исходных количеств каждого исходного олигонуклеотида в процессе каждой стадии реакции лигирования, с получением в результате плотности распределения вероятностей, которая зависит от предопределенного количества точек кроссинговера. Эти способы направлены на применение повторяющихся циклов редуктивной пересборки, рекомбинации и селекции, которые обеспечивают направленные молекулярные изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, посредством рекомбинации. Эта система позволяет получать большую совокупность измененных химерных последовательностей, где полученная совокупность значительно обогащена последовательностями, которые обладают предопределенным количеством точек кроссинговера. Точка кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка в норме находится в точке соединения, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единичной последовательности. Способ позволяет вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей, так что конечная химерная со
- 73 019971 вокупность последовательностей обогащена выбранным количеством точек кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль выбора химерных вариантов с предопределенным количеством точек кроссинговера.
Кроме того, эти способы относятся к удобным способам для исследования огромного количества возможных вариантов в диапазоне белков по сравнению с другими системами. Используя эти способы, описанные в настоящем документе, в совокупности химерных молекул можно увеличивать долю такими вариантами, которые обладают конкретным количеством точек кроссинговера. Таким образом, несмотря на то, что в процессе реакции по-прежнему может образоваться 1013 химерных молекул, каждая из молекул, выбранная для дальнейшего анализа, с наибольшей вероятностью, будет обладать, например, только тремя точками кроссинговера. Вследствие того, что получающуюся в результате совокупности производных можно изменять, для того чтобы обладать предопределенным количеством точек кроссинговера, границы функционального множества среди химерных молекул уменьшаются. Это обеспечивает более контролируемое количество переменных при вычислении того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.
В некоторых вариантах осуществления способ приводит к производной химерной полинуклеотидной последовательности посредством получения олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид включает уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к новому варианту, в котором каждый олигонуклеотидный фрагмент присоединен в правильном порядке. См. также патенты США №№ 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776; 6361974.
Определение точек кроссинговера
Варианты осуществления этого изобретения включают систему и программное обеспечение, в которое включает в качестве исходных данных требуемую плотность распределения вероятностей (РЭЕ) кроссинговера, количество исходных генов, подлежащих пересборке, и количество фрагментов при пересборке. Выходные данные этой программы представляют собой фрагментную РОЕ, которую можно использовать для определения способа получения подвергнутых пересборке генов, и оцененную РОЕ кроссинговера этих генов. Обработку, описанную в настоящем документе, в некоторых вариантах проводят в МАТБАВ™ (ТНе Ма!йтегкк, №йск, Маккасйикейк), языке программирования и средстве проектирования для технической обработки данных.
Повторяющиеся процессы
При применении на практике этого изобретения эти процессы можно многократно повторять, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую измененный или новый фенотип фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению идентифицируют, повторно выделяют (например, с использованием нуклеиновой кислоты по этому изобретению), вновь модифицируют, повторно тестируют в отношении активности. Этот процесс можно многократно повторять до тех пор, пока не будет сконструирован требуемый фенотип. Например, в клетку способами инженерии может быть внедрен целый биохимический анаболический или катаболический путь, включая, например, активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС.
Аналогично, если определено, что конкретный олигонуклеотид совсем не влияет на требуемое свойство (такое как новый фенотип фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС), тогда его можно удалять в качестве непостоянного признака при синтезе более крупных исходных олигонуклеотидов, которые включают подлежащую удалению последовательность. Поскольку встраивание последовательности в более крупную последовательность препятствует какимлибо процессам кроссинговера, то в производных полинуклеотидах не будет существовать каких-либо вариантов этих последовательностей. Эта повторяющаяся практика определения того, какие олигонуклеотиды более всего соответствуют требуемому свойству и какие не соответствуют, дает возможность более эффективного исследования всех возможных вариантов белков, которые могут обеспечивать конкретное свойство или активность.
Перетасовка ΐη νίνο
В различных вариантах осуществления в способах по этому изобретению используют перетасовку молекул 1п νίνο для получения вариантов полипептидов по этому изобретению, таких как антитела по этому изобретению или ферменты альдолазы по этому изобретению, такие как пируватальдолаза, альдолазы НМС и/или КНС, и т.п. Перетасовку т νίνο можно проводить с использованием природного свойства клеток осуществлять рекомбинацию мультимеров. Несмотря на то что рекомбинация ш νίνο обеспечила главный природный путь молекулярного разнообразия, генетическая рекомбинация остается относительно сложным процессом, который включает 1) распознавание гомологии; 2) расщепление цепи, вытеснение цепи и метаболические стадии, приводящие к продукции рекомбинантной хиазмы; и, наконец, 3) разрешение хиазмы на отдельные рекомбинированные молекулы. Для формирования хиазмы необходимо распознавание гомологичных последовательностей.
В других вариантах осуществления это изобретение относится к способу получения гибридного по
- 74 019971 линуклеотида по меньшей мере из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления это изобретение можно применять для получения гибридного полинуклеотида посредством введения по меньшей мере первого полинуклеотида и второго полинуклеотида (например, один или оба из них представляют собой последовательность, кодирующую фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС по этому изобретению), которые обладают по меньшей мере одним общим участком частичной гомологии последовательностей, в пригодную клетку-хозяина. Участки частичной гомологии последовательностей обеспечивают процессы, которые приводят к реорганизации последовательностей с образованием гибридного полинуклеотида. Как используют в настоящем документе, термин гибридный полинуклеотид, представляет собой любую нуклеотидную последовательность, которая получена способом по настоящему изобретению и содержит последовательность по меньшей мере из двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут быть результатом процессов межмолекулярной рекомбинации, которые обеспечивают интеграцию последовательности между молекулами ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут образовываться вследствие процессов внутримолекулярных редуктивных пересборок, в которых используются повторяющиеся последовательности для изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК.
В некоторых вариантах осуществления пересборка ίη νί\Ό направлена на межмолекулярные процессы, в совокупности называемые рекомбинацией, которые в бактериях, как правило, рассматривают как КесА-зависимый феномен. В некоторых вариантах осуществления это изобретение может основываться на процессах рекомбинации в клетке-хозяине для рекомбинации и пересборки последовательностей, или на способности клеток опосредовать редуктивные процессы для снижения комплексности псевдо-повторяющихся последовательностей в клетке посредством делеции. Процесс редуктивной пересборки осуществляется посредством внутримолекулярного КесА-независимого процесса.
В других вариантах осуществления этого изобретения новые полинуклеотиды можно получать посредством процесса редуктивной пересборки. Способ включает получение конструкций, содержащих последовательно расположенные последовательности (исходные кодирующие последовательности), их встраивание в соответствующий вектор и последующее их введение в соответствующую клетку-хозяина. Пересборка отдельных молекулярных элементов происходит посредством комбинаторных процессов между последовательно расположенными последовательностями в конструкции, обладающими участками гомологии, или между псевдоповторяющимися единицами. В процессе пересборки происходит рекомбинация и/или снижение комплексности и протяженности повторяющихся последовательностей, и она приводит к получению новых типов молекул. Для повышения скорости рекомбинации можно применять различные способы обработки. Они могут включать обработку ультрафиолетовым светом или повреждающими ДНК химическими веществами, и/или применение линий клеток-хозяев, проявляющих повышенные уровни генетической нестабильности. Таким образом, процесс пересборки может вовлекать гомологичную рекомбинацию или природное свойство псевдо-повторяющихся последовательностей направлять свои собственные изменения.
Повторяющиеся или псевдоповторяющиеся последовательности участвуют в генетической нестабильности. В некоторых вариантах осуществления псевдоповторы представляют собой повторы, которые не ограничиваются структурой их исходного элемента. Псевдоповторяющиеся элементы могут быть представлены в виде набора последовательностей в конструкции; последовательно расположенных элементов сходных последовательностей. После лигирования участки соединения между последовательно расположенными последовательностями становятся, по существу, неразличимыми, и после этого псевдоповторяющийся характер конечной конструкции становится постоянным на молекулярном уровне. Процесс делеции в клетки, который происходит в целях снижения комплексности полученной конструкции, происходит между псевдоповторяющимися последовательностями. Псевдоповторяющиеся элементы обеспечивают практически безграничный набор матриц, с помощью которых могут происходить случаи перемещения. Конструкции, содержащие псевдо-повторы, таким образом, эффективно обеспечивают достаточную молекулярную гибкость, при которой процессы делеций (и, возможно, вставок) могут происходить по существу в любой области в пределах псевдо-повторяющихся единиц.
Когда все псевдоповторяющиеся последовательности лигированы в одинаковой ориентации, например, голова к хвосту или наоборот, клетка не может различить отдельные элементы. Следовательно, редуктивный процесс может происходить по всей последовательности. Напротив, если, например, элементы представлены в ориентации голова к голове, в большей степени, чем голова к хвосту, тогда инверсия определяет конечную точку соседнего элемента, так что формирование делеций способствует потере отдельных элементов. Таким образом, для настоящего способа предпочтительно, чтобы последовательности находились в одинаковой ориентации. Случайная ориентация псевдоповторяющихся последовательностей приведет к потере эффективности рекомбинации, в то время как постоянная ориентация последовательностей обеспечит наибольшую эффективность. Однако несмотря на то, что наличие непрерывных последовательностей в одинаковой ориентации снижает эффективность, это, тем не менее, может обеспечить достаточную гибкость для эффективного получения новых молекул. Для обеспечения более высокой эффективности конструкции можно получать с псевдоповторяющимися последовательно
- 75 019971 стями в одинаковой ориентации.
Последовательности можно собирать в ориентации голова к хвосту с использованием любого из множества способов, включая следующие:
a) можно использовать праймеры, которые включают поли-А-головной конец и поли-Т-хвост, которые, когда их получают в одноцепочечной форме, будут обеспечивать ориентацию. Это обеспечивают наличием первых нескольких оснований в праймерах, образованных из РНК, и, таким образом, они легко удаляются РНКазой Н;
b) можно использовать праймеры, которые включают уникальные участки для расщепления рестриктазами. Могут потребоваться множество участков, ряд уникальных последовательностей и повторяющиеся стадии синтеза и лигирования;
c) внутренние несколько оснований праймера можно тиолировать, и можно использовать экзонуклеазу для получения молекул с правильными хвостами.
В некоторых вариантах осуществления выделение подвергнутых пересборке последовательностей основано на идентификации векторов для клонирования с уменьшенным индексом повторов (Ш). Затем подвергнутые пересборке кодирующие последовательности можно получать посредством амплификации. Продукты повторно клонируют и экспрессируют. Выделение векторов для клонирования со сниженным ΒΙ можно проводить посредством:
1) применения только стабильно поддерживаемых векторов, когда в конструкции снижена комплексность;
2) физического выделения укороченных векторов физическими процедурами. В этом случае вектор для клонирования можно выделять с использованием стандартных способов выделения плазмид и разделения по размеру либо в агарозном геле, либо на колонке с низкомолекулярным порогом с использованием стандартных способов;
3) выделения векторов, содержащих прерванные гены, которые можно отбирать после уменьшения размера вставки;
4) применения технологий направленной селекции с экспрессирующим вектором и соответствующей селекцией.
Кодирующие последовательности (например, гены) из родственных организмов могут демонстрировать высокую степень гомологии и кодировать совершенно разные белковые продукты. Эти типы последовательностей особенно пригодны в настоящем изобретении в качестве псевдо-повторов. Однако несмотря на то, что примеры, проиллюстрированные ниже, демонстрируют рекомбинацию практически идентичных исходных кодирующих последовательностей (псевдо-повторов), этот процесс не ограничивается такими практически идентичными повторами.
Следующий пример демонстрирует иллюстративный способ по этому изобретению. Описаны кодирующие последовательности нуклеиновых кислот (псевдоповторы), полученные из трех (3) уникальных видов. Каждая последовательность кодирует белок с отличающимся набором свойств. Каждая из последовательностей отличается единичными или несколькими парами оснований в уникальном положении в последовательности. Псевдоповторяющиеся последовательности отдельно или совместно амплифицируют и лигируют в случайные объединенные последовательности, так что в группе лигируемых молекул возможны различные перестановки и сочетания. Количества псевдоповторяющихся единиц можно контролировать условиями сборки. Среднее количество псевдоповторяющихся единиц в конструкции определяют как индекс повторов (Ш).
После формирования конструкции можно разделять или можно не разделять по размеру в агарозном геле в соответствии с опубликованными протоколами, встраивать в вектор для клонирования и трансфицировать в соответствующую клетку-хозяина. Затем клетки размножают и осуществляют редуктивную пересборку. Если желательно, скорость процесса редуктивной пересборки можно повышать посредством внесения повреждений в ДНК. Несущественным является то, опосредуется ли снижение ΒΙ образованием делении между повторяющимися последовательностями по внутримолекулярному механизму, или оно опосредуется подобными рекомбинации процессами по межмолекулярным механизмам. Конечным результатом является пересборка молекул во всех возможных сочетаниях.
Способ необязательно включает дополнительную стадию скрининга членов библиотеки из подвергнутой пересборке группы для идентификации индивидуальных подвергнутых пересборке членов библиотеки со способностью связываться или иным образом взаимодействовать, или катализировать конкретную реакцию (например, таких как каталитические домены фермента) с предопределенной макромолекулой, например, такой как белковый рецептор, олигосахарид, вирион или другое предопределенное соединение или структура.
Полипептиды, которые идентифицируют из таких библиотек, можно применять для терапевтических, диагностических, исследовательских и сходных целей (например, в качестве катализаторов, растворимых веществ для повышения осмотического давления водного раствора и т.п.), и/или их можно подвергать одному или нескольким дополнительным циклам перетасовки и/или селекции.
В других вариантах осуществления предусматривают, что до или в процессе рекомбинации или пересборки полинуклеотиды, полученные способом по этому изобретению, можно подвергать воздействию
- 76 019971 средств или процессам, которые обеспечивают внесение мутаций в исходные полинуклеотиды. Внесение таких мутаций может повысить разнообразие конечных гибридных полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими. Средства или процессы, которые обеспечивают мутагенез, могут включать, но не ограничиваться ими: (+)-СС-1065, или синтетический аналог, такой как (+)-СС-1065-(№3-аденин) (см. 8ип амб Ниг1еу, (1992)); Ν-ацетилированный или деацетилированный 4'-фтор-4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см. νаη бе Ро11 е! а1. (1992)); или Ν-ацетилированный или деацетилированный 4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см. также, νаη бе Ро11 е! а1. (1992), рр.751-758); трехвалентный хром, трехвалентную соль хрома, ДНК-аддукт на основе полициклических ароматических углеводородов (РАН), способный ингибировать репликацию ДНК, такой как 7бромметил-бенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3-дибромпропил)фосфат (Тпк-ВР), 1,2-дибром-3хлорпропан (ЭВСР), 2-бромакролеин (2ВА), бензо[а]пирен-7,8-дигидродиол-9-10-эпоксид (ВРЭЕ), соль платины(11) с галогеном, №гидрокси-2-амино-3-метилимидазо[4,5-Г]-хинолин (Ν-гидрокси-ТР) и №гидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-Г]-пиридин (Ν-гидрокси-РЫР). Иллюстративные способы замедления или остановки амплификации ПЦР включают УФ-свет, (+)-СС-1065 и (+)-СС-1065(№3-аденин). В частности, предусмотренные средства представляют собой ДНК-аддукты или полинуклеотиды, содержащие ДНК-аддукты из полинуклеотидов или совокупности полинуклеотидов, которые перед дальнейшей обработкой можно удалять посредством процесса, включающего нагревание раствора, содержащего полинуклеотиды.
В других вариантах осуществления это изобретение относится к способу получения рекомбинантных белков с биологической активностью посредством обработки образца, содержащего двухцепочечные матричные полинуклеотиды, кодирующие белок дикого типа в условиях по этому изобретению, которые обеспечивают продукцию гибридных или подвергнутых пересборке полинуклеотидов.
Получение вариантов последовательностей
Также это изобретение относится к дополнительным способам получения вариантов последовательностей нуклеиновых кислот (таких как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС) по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к дополнительным способам выделения ферментов альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, с использованием нуклеиновых кислот и полипептидов по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к вариантам кодирующих последовательностей (таких как ген, кДНК или транскрипт) фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению, которые могут быть изменены любыми способами, включая, например, случайные или стохастические способы, или нестохастические способы, или способы направленных изменений, как описано выше.
Выделенные варианты могут быть встречающимися в природе. Также вариант можно получать ίη у11го. Варианты можно получать с использованием способов генетической инженерии, таких как сайтнаправленный мутагенез, случайный химический мутагенез, способы делеции экзонуклеазой III, и стандартными способами клонирования. Альтернативно такие варианты, фрагменты, аналоги или производные можно получать с использованием способов химического синтеза или модификации. Другие способы получения вариантов также известны специалистам в данной области. Они включают способы, в которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируют с получением нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды со свойствами, которые повышают их ценность для промышленного или лабораторного применения. В таких способах получают и охарактеризовывают большое количество последовательностей вариантов с отличиями с одним или несколькими нуклеотидами относительно последовательности, полученной из природного изолята. Эти нуклеотидные отличия могут приводить к замене аминокислот относительно полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.
Например, варианты можно получать с использованием ПЦР с пониженной точностью. В некоторых вариантах осуществления, в случае ПЦР с пониженной точностью, ПЦР проводят в условиях, в которых точность копирования ДНК-полимеразы является низкой, так что по всей длине продукта ПЦР возникает большое число точковых мутаций. ПЦР с пониженной точностью описана, например, в Ьеи^, ϋ.ν. е! а1., (1989) ТесЬтдие 1:11-15 и Са1б^е11, Я.С. & 1оусе С.Р., (1992) РСЯ МеШобк Аррйс 2:28-33. В кратком изложении, в таких способах нуклеиновые кислоты, подлежащие мутагенезу, смешивают с праймерами для ПЦР, буфером для реакции, МдС12, МпС12, Тад-полимеразой и с бNΤР в соответствующей концентрации для достижения большого количества точковых мутаций вдоль всей длины продукта ПЦР. Например, реакцию можно проводить с использованием 20 фмоль нуклеиновой кислоты, предназначенной для внесения в нее мутаций, 30 пмоль каждого праймера для ПЦР, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 ММ Тпк НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатин, 7 мМ МдС12, 0,5 мМ МпС12, 5 единиц Тад-полимеразы, 0,2 мМ бСТР, 0,2 мМ бАТР, 1 мМ бСТР и 1 мМ бТТР. ПЦР проводят в течение 30 циклов, состоящих из 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут варьировать в соответствующих случаях. Подвергнутые мутагенезу нуклеиновые кислоты клонируют в соответствующий вектор и оценивают активность полипептидов, кодируемых подвергнутыми мутагенезу нуклеиновыми кислотами.
- 77 019971
В некоторых вариантах осуществления варианты можно получать с использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза с образованием сайт-специфических мутаций в любой представляющей интерес клонированной ДНК. Мутагенез посредством олигонуклеотидов описан, например, в КеИйааг01зоп (1988) 8аепсе 241:53-57. В кратком изложении, в таких способах множество двухцепочечных олигонуклеотидов с одной или несколькими мутациями, предназначенными для внесения в клонированную ДНК, синтезируют и встраивают в клонированную ДНК, подлежащую мутагенезу. Клоны, содержащие ДНК с внесенными в нее мутациями, выделяют и оценивают активность полипептидов, которые она кодирует.
Другим способом получения вариантов является ПЦР со сборкой. ПЦР со сборкой включает сборку продуктов ПЦР из смеси небольших фрагментов ДНК. Большое количество различных реакций ПЦР происходит параллельно в одной и той же пробирке, при этом продукты одной реакции являются затравками для продуктов другой реакции. ПЦР со сборкой описана, например, в патенте США № 5965408.
В некоторых вариантах осуществления иллюстративным примером получения вариантов по этому изобретению является мутагенез с помощью половой ПЦР. В некоторых вариантах осуществления мутагенеза с помощью половой ПЦР происходит индуцированная гомологичная рекомбинация ίη νίίτο между молекулами ДНК с различными, но высокосходными последовательностями ДНК, вследствие случайной фрагментации молекулы ДНК на основе гомологии последовательностей, с последующей фиксацией продуктов кроссинговера посредством удлинения праймеров в реакции ПЦР. Мутагенез с помощью половой ПЦР описан, например, в 81еттег (1994) Ргос. №11. Αсаά. 8сг υ8Α 91:10747-10751. В кратком изложении, в таких способах множество нуклеиновых кислот, подлежащих рекомбинации, расщепляют ДНКазой с получением фрагментов со средним размером 50-200 нуклеотидов. Фрагменты с требуемым средним размером очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновых кислот. Например, ПЦР можно проводить посредством ресуспендирования очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/мкл в растворе с 0,2 мМ каждого ЖТР, 2,2 мМ МдС12, 50 мМ КС1, 10 мМ Ти8 НС1, рН 9,0, и 0,1% ΤτίΦη Х-100. Добавляют 2,5 единицы Тац-полимеразы на 100 мкл реакционной смеси и проводят ПЦР с использованием следующего режима: 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако следует понимать, что эти параметры можно изменять соответствующим образом. В некоторых вариантах осуществления в реакции ПЦР можно добавлять олигонуклеотиды. В других вариантах осуществления в первой группе реакций ПЦР можно использовать фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, и в последующей группе реакций ПЦР можно использовать Тац-полимеразу. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активность полипептидов, которые они кодируют.
В некоторых вариантах осуществления варианты получают посредством мутагенеза ίη νί\Ό. В некоторых вариантах осуществления создаются случайные мутации в интересующей последовательности, посредством воспроизведения интересующей последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е.соБ, который осуществляет мутации посредством одного или нескольких путей репарации ДНК. Такие штаммы-мутаторы обладают увеличенным количеством случайных мутаций по сравнению с родительским организмом дикого типа. Воспроизведение ДНК в одном из этих штаммов приведет со временем к образованию случайных мутаций в ДНК. Штаммы мутаторов, пригодные для применения в мутагенезе ίη νί\Ό, описаны в публикации РСТ № \¥0 91/16427, опубликованной 31 октября 1991 года под названием МеФойз Рог РНепо1уре Сгеа11оп Ггот Ми1йр1е Сепе Рори1айопз.
Также варианты можно получать с использованием кассетного мутагенеза. В кассетном мутагенезе небольшой участок двухцепочечной молекулы ДНК замещают синтетической олигонуклеотидной кассетой, которая отличается от нативной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично случайную нативную последовательность.
Также для получения вариантов можно использовать возвратно-множественный мутагенез. Возвратно-множественный мутагенез представляет собой алгоритм для белковой инженерии (белкового мутагенеза), разработанный для получения различных групп фенотипически сходных мутантных форм, члены которых отличаются по аминокислотной последовательности. В этом способе используется механизм с обратной связью для контроля успешных циклов комбинаторного кассетного мутагенеза. Возвратно-множественный мутагенез описан, например в ΑιΊ<ίη, ΑΤ. (1992) Ргос. №11. Αсаά. 8сг, υ8Α, 89:7811-7815.
В некоторых вариантах осуществления варианты получают с использованием экспоненциальномножественного мутагенеза. Экспоненциально-множественный мутагенез представляет собой процесс получения комбинаторных библиотек с большим процентным содержанием уникальных и функциональных мутантов, где небольшие группы остатков случайным образом отбирают параллельно для идентификации в каждом измененном положении аминокислот, которые приводят к функциональным белкам. Экспоненциально- множественный мутагенез описан в Ое1едгате (1993) В1о1есйпо1оду Кез., 11:1548-1552. Случайный и сайт-направленный мутагенез описаны в Αγ^Μ (1993) Сиггей 0ршюп ίη В1о1есйпо1оду, 4:450-455.
В некоторых вариантах осуществления варианты создают с использованием способов перетасовки,
- 78 019971 где участки множества нуклеиновых кислот, которые кодируют различные полипептиды, подвергают слиянию с получением химерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные полипептиды, как описано в патенте США № 5965408, выданном 9 мая 1996 года, под названием Мс1йоб оГ ^NА ВсаввстЬ1у Ьу 8уп1Нсв1в и в патенте США № 5939250, выданном 22 мая
1996 года, под названием Ргобисбоп оГ Εиζутсβ Наутд Освйсб АсЙУЙГсв Ьу Ми1адспсв1в.
Варианты полипептидов по этому изобретению могут представлять собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептидов в последовательностях по этому изобретению замещены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (в некоторых вариантах осуществления консервативным аминокислотным остатком), и такие замещенные аминокислотные остатки могут кодироваться генетическим кодом, или могут не кодироваться им.
В некоторых вариантах осуществления консервативные замены представляют собой замены, которые приводят к замене данной аминокислоты в полипептиде на другую аминокислоту со сходными свойствами. В некоторых вариантах осуществления консервативные замены по этому изобретению включают следующие замены: замена алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замена серина треонином или наоборот; замена кислых остатков, таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, другим кислым остатком; замена остатка, несущего амидную группу, такого как аспарагин и глутамин, другим остатком, несущим амидную группу; замена основного остатка, такого как лизин и аргинин, другим основным остатком; и замена ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин, другим ароматическим остатком.
Другие варианты представляют собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептида по этому изобретению включают заместитель. В некоторых вариантах осуществления другие варианты представляют собой варианты, в которых полипептид ассоциирован с другим соединением, таким как соединение, увеличивающее время полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль). Дополнительные варианты представляют собой варианты, в которых с полипептидом слиты дополнительные аминокислоты, такие как лидерная последовательность, секреторная последовательность, пробелковая последовательность или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида.
В некоторых вариантах осуществления фрагменты, производные и аналоги сохраняют ту же биологическую функцию или активность, что и у полипептидов по этому изобретению и последовательностей, по существу, идентичных им. В других вариантах осуществления фрагмент, производное или аналог включает пробелок, так что фрагмент, производное или аналог может активироваться при отщеплении участка пробелка с образованием активного полипептида.
Оптимизация кодонов для достижения высоких уровней экспрессии белка в клетках-хозяевах
Это изобретение относится к способам модификации нуклеиновых кислот, кодирующих фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, посредством модификации (например, оптимизации) использования кодонов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, для повышения или снижения экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, модифицированным в целях повышения их экспрессии в клетке-хозяине, к ферменту альдолазе, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, модифицированным таким образом, и к способам получения модифицированной альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как ферменты альдолазы НМО и/или КНО. Способ включает идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО, и замещение одного или нескольких из эти непредпочтительных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, так, чтобы по меньшей мере один непредпочтительный кодон или менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте был замещен предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту. Предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина.
Клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих кассет и векторов по этому изобретению включают клетки бактерий, дрожжей, грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Таким образом, это изобретение относится к способам оптимизации использования кодонов во всех этих клетках, к нуклеиновым кислотам с измененными кодонами и к полипептидам, полученным с помощью нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Иллюстративные клетки-хозяева включают грамотрицательные бактерии, такие как ΕβΟΒαχΙιίπ сой; грамположительные бактерии, такие как 81гср1отуссв вр., БасЮйасШнв даввсп, БасЮсоссив 1асбв, БасЮсоссив сгстопв, ВасШив виЬбйв, ВасШив ссгсив. Иллюстративные клетки-хозяева также включают эукариотические организмы, такие как различные дрожжи, такие как 8ассйаготуссв вр., включая 8ассйаготуссв ссгсу1в1ас, 8с1п/овассйаготуссв ротЬс,
- 79 019971
Р1сЫа райогщ и К1иууеготусе§ 1асШ, Нап§епи1а ро1утогрйа, АкрегдШик шдег, и клетки и клеточные линии млекопитающих, и клетки и клеточные линии насекомых. Таким образом, это изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и полипептидам, оптимизированным для экспрессии в этих организмах и видах.
Например, кодоны нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, выделенный из бактериальной клетки, модифицируют таким образом, чтобы нуклеиновая кислота оптимально экспрессировалась в бактериальной клетке, отличной от бактерий, из которых фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, был получен, в клетке дрожжей, грибов, в клетке растений, клетке насекомых или клетке млекопитающих. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области, см., патент США № 5795737; Васа (2000) Ιηΐ. 1. Рагакйок 30:113-118; На1е (1998) РгоШп Ехрг. РипГ. 12:185-188; Нагит (2001) Шесб Iттиη. 69:7250-7253. См. также №1гит (2001) Шесб Iттиη. 69:7250-7253, где описаны оптимизированные кодоны в мышиных системах; 0и1сйкоигоу (2002) Рго1ет Ехрг. РипГ. 24:18-24, где описаны оптимизированные кодоны в дрожжах; Бепд (2000) ВюсйешМгу 39:15399-15409, где описаны оптимизированные кодоны в Е.соН; Нитрйгеук (2000) Рго1ет Ехрг. РипГ. 20:252-264, где описано использование оптимизированных кодонов, которые влияют на секрецию в Е.соН.
Не относящиеся к человеку трансгенные животные
Это изобретение относится к трансгенным не относящимся к человеку животным, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид (такой как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС), экспрессирующую кассету или вектор или трансфицированную или трансформированную клетку по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к способам получения и применения этих трансгенных не относящихся к человеку животных.
Трансгенные не относящиеся к человеку животные могут представлять собой, например, собак, коз, кроликов, овец, лошадей, свиней (включая всех свиней, домашних свиней и родственных животных), коров, крыс и мышей, содержащих нуклеиновые кислоты по этому изобретению. Этих животных можно использовать, например, в качестве моделей для исследования ш у1уо активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, или в качестве моделей для скрининга ш у1уо веществ, которые изменяют активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Кодирующие последовательности полипептидов, подлежащих экспрессии в трансгенных не относящихся к человеку животных, можно сконструировать, чтобы они были конститутивными или находящимися под контролем тканеспецифичных, специфичных для стадий развития или индуцибельных факторов регуляции транскрипции.
Трансгенных не относящихся к человеку животных можно разрабатывать и создавать с использованием любого способа, известного в данной области; см. патенты США №№ 6211428; 6187992; 6156952; 6118044; 6111166; 6107541; 5959171; 5922854; 5892070; 5880327; 5891698; 5639940; 5573933; 5387742; 5087571, где описано получение и применение трансформированных клеток и яйцеклеток, и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней, кур, коз рыб и коров. Также см. Ро11оск (1999) 1. Iттиηо1. МеШобк 231:147-157, где описана продукция рекомбинантных белков в молоке у трансгенных молочных животных; Вадшы (1999) №11. Вю1ес11по1. 17:456-461, где демонстрируется получение трансгенных коз. В патенте США № 6211428 описано получение и применение трансгенных не относящихся к человеку млекопитающих, в головном мозге которых экспрессируется конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК. В патенте США № 5387742 описана инъекция клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мыши, имплантация инъецированных яйцеклеток в ложно-беременных самок и выращивание трансгенных мышей до рождения. В патенте США № 6187992 описано получение и применение трансгенной мыши.
Также для применения на практике способов по этому изобретению можно использовать животных с нокаутом. Например, в некоторых вариантах осуществления трансгенные или модифицированные животные по этому изобретению включают животное с нокаутом, такое как мышь с нокаутом, созданная способами инженерии, чтобы не происходило экспрессии эндогенного гена, который замещен геном, экспрессирующим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению, или слитый белок, содержащий фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению.
Трансгенные растения и семена
Это изобретение относится к трансгенным растениям и семенам, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид (такой как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС), экспрессирующую кассету или вектор, или трансфицированную или трансформированную клетку по этому изобретению. Также это изобретение относится к растительным продуктам или побочным продуктам, таким как плоды, масла, семена, листья, экстракты и т.п., включая любую часть, содержащую нуклеиновую кислоту и/или полипептид (такой как ксиланаза) по этому изобретению, например, где нуклеиновая кислота или полипептид по этому изобретению являются гетерологичными для растения, части растения, семени и т.д. Трансгенное растение (которое включает части растений, плоды, семена и т.д.) может быть двудольным (бюо1) или однодольным растением (топосо!). В некоторых вариантах осущест
- 80 019971 вления это изобретение также относится к способам получения и применения этих трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующие полипептид по этому изобретению, можно конструировать в соответствии с любым способом, известным в данной области. См., например, патент США № 6309872.
Нуклеиновые кислоты и экспрессирующие конструкции по этому изобретению можно вводить в клетку растений любыми способами. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции можно встраивать в геном требуемого растительного хозяина, или нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут представлять собой эписомы. Встраивание в геном желательного растения может быть таким, чтобы продукция фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, регулировалась эндогенными элементами контроля транскрипции и/или трансляции хозяина. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к растениям с нокаутом где вставка последовательности гена, например, посредством гомологичной рекомбинации, нарушает экспрессию эндогенного гена. Способы получения растений с нокаутом хорошо известны в данной области, см. 81герр (1998) Ргос №11. Асаб. 8с1. И8А 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап! I 7:359-365. См. описание трансгенных растений ниже.
Нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно применять для придания требуемых свойств, по существу, любому растению, например продуцирующим крахмал растениям, таким как картофель, томат, соя, свекла, кукуруза, пшеница, рис, ячмень и т.п. Нуклеиновые кислоты по этому изобретению можно использовать для манипулирования метаболическими каскадами растений в целях оптимизации или изменения экспрессии в хозяине фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Нуклеиновые кислоты по этому изобретению могут изменять уровни экспрессии или активности, или они могут изменять свойства соединений или ферментов, продуцируемых в растении в природных условиях. Альтернативно фермент альдолазу, такая как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению можно использовать для получения трансгенного растения с целью продукции соединения, которое в природных условиях растением не продуцируется. Это может привести к снижению стоимости продукции или к созданию нового продукта.
В некоторых вариантах осуществления первая стадия получения трансгенного растения включает получение экспрессирующей конструкции для экспрессии в клетке растений. Эти технологии хорошо известны в данной области. Они могут включать выбор и клонирование промотора, кодирующей последовательности для облегчения эффективного связывания рибосом с мРНК и выбор пригодной последовательности терминатора гена. Одним иллюстративным конститутивным промотором является СаМV358 из вируса мозаики цветной капусты, который, как правило, приводит к высокому уровню экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и отвечают на сигнал из внутренней и наружной окружающей среды растения. Иллюстративным индуцируемым светом промотором является промотор гена саЬ, кодирующего основной связывающий хлорофилл а/Ь белок.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту модифицируют для достижения более высокой экспрессии в клетке растений. Например, последовательность по этому изобретению предположительно обладает более высоким процентным содержанием нуклеотидных пар А-Т по сравнению с содержанием, которое обнаруживается в растении, в некоторых из которых преобладают нуклеотидные пары С-С. Таким образом, для повышения продукции продукта гена в клетках растений нуклеотиды А-Т в кодирующей последовательности можно замещать нуклеотидами С-С без существенного изменения аминокислотной последовательности.
В целях идентификации клеток растений или тканей, в которые успешно интегрировался трансген, в конструкцию можно добавлять ген селективного маркера. Это может быть необходимым, поскольку достижение встраивания и экспрессии генов в клетках растений является редким случаем, происходящим только в нескольких процентах тканей-мишеней или клеток-мишеней. Гены селективных маркеров кодируют белки, которые придают устойчивость к средствам, которые в норме токсичны для растений, таким как противомикробные средства или гербициды. При выращивании на среде, содержащей соответствующее противомикробное средство или гербицид, выживают только те клетки растений, которые обладают встроенным геном селективного маркера. Как и в случае других встраиваемых генов, для правильного функционирования маркерных генов также необходимы промоторная и терминирующая последовательности.
В некоторых вариантах осуществления получение трансгенных растений или семян включает встраивание последовательностей по этому изобретению и, необязательно, маркерных генов в выбранную экспрессирующую конструкцию (такую как плазмида), совместно с включением промоторной и терминирующей последовательностей. Это может вовлекать перенос модифицированного гена в растение с помощью приемлемого способа. Например, конструкцию можно встраивать непосредственно в геномную ДНК клетки растений с использованием способов, таких как электропорация и микроинъекция в протопласты клетки растений, или конструкции можно вводить непосредственно в ткань растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Например, см. Сйпк!ои (1997) Р1ап! Мо1. Вю1. 35:197-203; Ра\\!о\\'кк| (1996) Мо1. Вю!есйпо1. 6:17-30; К1еш (1987) №!иге 327:70-73; Такит1 (1997) Сепек Сепе!. 8ук!. 72:63-69, где обсуждается использование бомбардировки ча
- 81 019971 стицами для введения трансгенов в пшено; и Адат (1997), выше, для использования бомбардировки частицами в целях введения УАС в клетки растений. Например, КтейагГ (1997), выше, использовал бомбардировку частицами в целях получения трансгенных хлопковых растений. Устройство для ускорения частиц описано в патенте США № 5015580; и коммерчески доступное устройство для ускорения частиц ВюКад (Вюйзйсз) РБ8-2000; см. также, 1ойи, патент США № 5608148; и ЕШз, патент США № 5681730, где описана опосредуемая частицами трансформация голосеменных.
В некоторых вариантах осуществления протопласты можно иммобилизовывать и инъецировать нуклеиновыми кислотами, такими как экспрессирующая конструкция. Несмотря на то что регенерация из протопластов не является легкой в случае зерновых, регенерация растений возможна в бобовых с использованием соматического эмбриогенеза из каллюса, полученного из протопласта. Сформированные ткани можно трансформировать депротеинизированной ДНК с использованием технологии генной пушки, где ДНК прокрывают вольфрамовыми микроснарядами, которые простреливают 1/100 размера клетки, которые переносят ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем в трансформированной ткани индуцируют регенерацию, как правило, посредством соматического эмбриогенеза. Этот способа оказался успешным для некоторых видов зерновых, включая маис и рис.
Нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие конструкции, также можно вводить в клетки растений с использованием рекомбинантных вирусов. Клетки растений можно трансформировать с использованием вирусных векторов, например, таких как векторы, полученные из вируса табачной мозаики (Коиуепда1 (1997) Р1ап! Мо1. Вю1. 33:989-999), см. РогГа (1996) Изе оГ νίπι1 герйсопз Гог Фе ехргеззюп оГ депез шр1ап!з, Мо1. ВюГесЬпо! 5:209-221.
Альтернативно нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие конструкции, можно комбинировать с пригодными фланкирующими участками Т-ДНК и встраивать в традиционный вектор хозяина АдгоЪас!егшт !итеГас1епз. Вирулентные функции хозяина АдгоЪас!егшт ШтеГааепз направляют вставку конструкции и соседнего маркера в ДНК клеток растения при инфицировании клетки бактериями. Способ трансформации, опосредуемый АдгоЬас!егшт !ите£ааеп8, включая нейтрализацию и применение бинарных векторов, подробно описан в научной литературе. См. Ногзсй (1984) 8с1епсе 233:496-498; Ега1еу (1983) Ргос. №!1. Асад. 8а И8А 80:4803 (1983); Оепе ТгапзГег !о Р1ап!з, Ро!гукиз, ед. (8ргшдег-Уег1ад, Вег1ш 1995). ДНК в клетке А. ЦппеГааепз находится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как плазмида Т1 (индуцирующая опухоль). Т1-плазмида содержит участок ДНК, называемый Т-ДНК (длина ~20 т.п.н.), который переносится в клетку растений в процессе инфекции и набор генов νίΓ (вирулентность), которые управляют процессом инфекции. А. ЦппеГааепз может инфицировать растение только через повреждения: при повреждении корня или стебля оно подает определенные химические сигналы, в ответ на которые активируются гены νπ А. ТитеГааепз, и они направляют ряд событий по переносу Т-ДНК из Т1-плазмиды в хромосому растения. Затем Т-ДНК проникает через повреждение в клетку растений. Существует предположение, что Т-ДНК ждет репликации и транскрипции ДНК растения, а затем встраивается в доступную ДНК растения. В целях применения А. ЦппеГааепз в качестве трансгенного вектора, необходимо удалить индуцирующий опухоль фрагмент Т-ДНК, при сохранении краевых участков Т-ДНК и генов νίτ. Затем трансген встраивают между краевыми участками Т-ДНК, где он перемещается в клетку растений и встраивается в хромосомы растений.
Это изобретение относится к трансформации однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот по этому изобретению, включая важные злаковые растения, см. Н1е1 (1997) Р1ап! Мо1. Вю1. 35:205-218. См. также, например, Ногзсй, 8аепсе (1984) 233:496; Ега1еу (1983) Ргос. №!1. Асад. 8а И8А 80:4803; Тйук)аег (1997), выше; Рагк (1996) Р1ап! Мо1. Вю1. 32:1135-1148, где описано встраивание ТДНК в геномную ДНК. Также см. П'На11и1п, патент США № 5712135, где описан процесс стабильного встраивания ДНК, содержащей ген, который является функциональным в клетке зерновых или других однодольных растений.
В некоторых вариантах осуществления третья стадия может включать селекцию и регенерацию целых растений, способных передавать встроенный целевой ген следующему поколению. В таких способах регенерации можно использовать манипулирование посредством определенных фитогормонов в среде для выращивания культуры ткани. В некоторых вариантах осуществления в способе используют биоцидный и/или гербицидный маркер, который вводят вместе с требуемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивированных протопластов описана в Еνаηз е! а1., Рго!ор1аз!з Гзо1аГюп апд Си1!иге, НапдЬоок оГ Р1ап! Се11 Си1!иге, рр.124-176, МасМйШап РиЬНзЫпд Сотрапу, №\ν Уогк, 1983; и Втдтд, КедепегаГюп оГ Р1ап!з, Р1ап! Рго!ор1аз!з, рр.21-73, СКС Ргезз, Воса Ка!оп, 1985. Регенерацию также можно проводить из каллюса растений, эксплантатов, органов или их частей. Такие способы регенерации описаны, главным образом, в К1ее (1987) Апп. Кем. оГ Р1ап! Рйуз. 38:467-486. В целях получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, их можно выращивать под контролем окружающих условий в ряде сред, содержащих пищевые добавки и гормоны, в процессе, известном как культивирование тканей. После получения целых растений и продукции семян начинается оценка потомства.
В некоторых вариантах осуществления после стабильного встраивания экспрессирующей кассеты в трансгенные растения, ее можно вводить в другие растения посредством полового скрещивания. Можно
- 82 019971 использовать любой из множества стандартных способов выведения, в зависимости от вида, подлежащего скрещиванию. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот по этому изобретению приводит к изменениям фенотипа, то можно проводить половое скрещивание растений, содержащих рекомбинантные нуклеиновые кислоты по этому изобретению, со вторым растением с получением конечного продукта. Таким образом, семя по этому изобретению может быть получено при скрещивании двух трансгенных растений по этому изобретению или скрещивания растения по этому изобретению и другого растения. Требуемые эффекты (такие как экспрессия полипептидов по этому изобретению с получением растения, в котором изменен характер цветения) могут усиливаться, если оба родительских растения экспрессируют полипептиды по этому изобретению. Требуемые эффекты можно передавать последующим поколениям растений стандартными способами размножения.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды по этому изобретению экспрессируют в любом растении или семени или встраивают в него. Трансгенные растения по этому изобретению могут представлять собой двудольные или однодольные растения. Примерами однодольных трансгенных растений по этому изобретению являются травы, такие как мятлик луговой (мятлик, Роа), кормовая трава, такая как овсянница, райграс, медленно растущая трава, такая как Адгокйк, и зерновые, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примерами двудольных трансгенных растений по этому изобретению являются табак, бобовые, такие как люпины, картофель, свекла сахарная, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Вгаккюасеае), такие как цветная капуста, рапс, и близко родственный модельный организм АгаЫборкй [НаНапа. Таким образом, трансгенные растения и семена по этому изобретению включают широкий диапазон растений, включая, но не ограничиваясь ими, виды из родов Апасагбшш, АгасЫк, Акрагадик, Айора, Аνеηа, Вгаккюа, Сйгик, Сйгцйик, Саркюит, Саййатик, Сосок, СоГГеа, Сисит1к, СисигЬйа, Иаисик, Е1ае1к, Ргадайа, С1усше, Соккуршт, НейапНик, Не!егоса1йк, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасШса, Ьтит, Ьо1шт, Ьиртик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МашНоЕ Ма_)огапа, Мебюадо, Мсойапа, О1еа, Огуха, Рашеит, РапшкеШт, Регкеа, РНакео1ик, Р1к1асН1а, Р1кит, Ругик, Ргипик, ВарНапик, Вюшик, 8еса1е, 8епесю, 81пар1к, 8о1апит, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, Тпйсит, νίάπ, νοία νίβπη и 2еа.
В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по этому изобретению экспрессируют в растениях, которые содержат волокнистые клетки, включая, например, хлопок, хлопковое дерево (капок, Се1Ьа регИапбга), иву пустынную, креозотовый куст, терескен шерстистый, бальзу, рами, кенаф, коноплю, розель, джут, сизаль, абаку и лен. В альтернативных вариантах осуществления трансгенные растения по этому изобретению могут являться членами рода Соккуршт, включая членов любого из видов Соккуршт, таких как С. агЬогеит; С. НегЬасеит, С. ЬагЬабепке и С. НйкиШт.
Также это изобретение относится к трансгенным растениям, подлежащим применению для получения больших количеств полипептидов (таких как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС) по этому изобретению. Например, см. Ра1тдгеп (1997) Тгепбк СепеЕ 13:348; СНопд (1997) Тгапкдешс Век. 6:289-296 (продукция белка молока человека бета-казеина в трансгенных растениях картофеля с использованием ауксин-индуцируемого двунаправленного промотора маннопинсинтетазы (так1',2') с опосредуемыми АдгоЬас1егшт ШтеГааепк способами трансформации пластинки листа).
Используя известные процедуры, специалист в данной области может проводить скрининг растений по этому изобретению посредством детекции повышения или снижения количества трансгенной мРНК или белка в трансгенных растениях. Способы определения и количественной оценки мРНК или белков хорошо известны в данной области.
Полипептиды и пептиды
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, обладающим идентичностью последовательностей (например, по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей) с последовательностью по этому изобретению, такой как белки, обладающие последовательностью, как указано в 8ЕЦ ГО ЫО:2, 8ЕЦ ГО ЫО:4, 8ЕЕ) ГО ЫО:6, 8ЕЕ) ГО ЫО:8, 8ЕЕ) ГО ЫО:10, 8ЕЕ) ГО ЫО:12, 8ЕЕ) ГО ЫО:14, 8ЕЕ) ГО ЫО:16, 8ЕЕ) ГО ΝΌ:18, 8ЕЕ) ГО ЫО:20, 8ЕЕ) ГО ЫО:22, 8ЕЕ) ГО ЫО:24, 8ЕЕ) ГО ЫО:26, 8ЕЕ) ГО ЫО:28, 8ЕЕ) ГО ЫО:30, 8ЕЕ) ГО ЫО:32, 8ЕЕ) ГО ЫО:34, 8ЕЕ) ГО ЫО:36, 8ЕЕ) ГО ЫО:38, 8ЕЕ) ГО ЫО:40, 8ЕЕ) ГО ЫО:42, 8ЕЕ) ГО ЫО:44, 8ЕЕ) ГО ЫО:46, 8ЕЕ) ГО ЫО:48, 8ЕЕ) ГО ЫО:50, 8ЕЕ) ГО ЫО:52, 8ЕЕ) ГО ЫО:54, 8ЕЕ) ГО ЫО:56, 8ЕЕ) ГО ЫО:58, 8ЕЕ) ГО ЫО:60, 8ЕЕ) ГО ЫО:62, 8ЕЕ) ГО ЫО:64, 8ЕЕ) ГО ЫО:66, 8ЕЕ) ГО ЫО:68, 8ЕЕ) ГО ЫО:70, 8ЕЕ) ГО ЫО:72, 8ЕЕ) ГО ЫО:74, 8ЕЕ) ГО ЫО:76, 8ЕЕ) ГО ЫО:78, 8ЕЕ) ГО ЫО:80, 8ЕЕ) ГО ЫО:82, 8ЕЕ) ГО ЫО:84, 8ЕЕ) ГО ЫО:86, 8ЕЕ) ГО ЫО:88, 8ЕЕ) ГО ЫО:90, 8ЕЕ) ГО ЫО:92, 8ЕЕ) ГО ЫО:94, 8ЕЕ) ГО ЫО:96, 8ЕЕ) ГО ЫО:98, 8ЕЕ) ГО ЫО:100, 8ЕЕ) ГО ЫО:102, 8ЕЕ) ГО ЫО:104, 8ЕЕ) ГО ЫО:106, 8ЕЕ) ГО ЫО:108, 8ЕЕ) ГО ΝΌ:110, 8ЕЕ) ГО ЫО:112, 8ЕЕ) ГО ЫО:114, 8ЕЕ) ГО ЫО:116, 8ЕЕ) ГО ЫО:118, 8ЕЕ) ГО ЫО:120, 8ЕЕ) ГО
ЫО:122, 8ЕЕ) ГО ЫО:124, 8ЕЕ) ГО ЫО:126, 8ЕЕ) ГО ЫО:128, 8ЕЕ) ГО ЫО:130, 8ЕЕ) ГО ЫО:132, 8ЕЕ) ГО
ЫО:134, 8ЕЕ) ГО ЫО:136, 8ЕЕ) ГО ЫО:138, 8ЕЕ) ГО ЫО:140, 8ЕЕ) ГО ЫО:142, 8ЕЕ) ГО ЫО:144, 8ЕЕ) ГО
ЫО:146, 8ЕЕ) ГО ЫО:148, 8ЕЕ) ГО ЫО:150, 8ЕЕ) ГО ЫО:152, 8ЕЕ) ГО ЫО:154, 8ЕЕ) ГО ЫО:156, 8ЕЕ) ГО
ЫО:158, 8ЕЕ) ГО ЫО:160, 8ЕЕ) ГО ЫО:162, 8ЕЕ) ГО ЫО:164, 8ЕЕ) ГО ЫО:166, 8ЕЕ) ГО ЫО:168, 8ЕЕ) ГО
- 83 019971
N0:170, 8Ш ΙΌ N0:172, 8ЕР ΙΌ N0:174, 8ЕР ΙΌ N0:176, 8ЕР ΙΌ N0:178, 8ЕР ΙΌ N0:180, 8ЕР ΙΌ
N0:182, 8Ш ΙΌ N0:184, 8ЕР ΙΌ N0:186, 8ЕР ΙΌ N0:188, 8ЕР ΙΌ N0:190, 8ЕР ΙΌ N0:192, 8ЕР ΙΌ
N0:194, 8Ш ΙΌ N0:196, 81Х ΙΌ N0:198, 81Х ΙΌ N0:200, 81Х ΙΌ N0:202, 81Х ΙΌ N0:204, 81Х ΙΌ
N0:206, 8Ш ΙΌ N0:208, 81Х ΙΌ N0:210, 81Х ΙΌ N0:212, 81Х ΙΌ N0:214, 81Х ΙΌ N0:216, 81Х ΙΌ
N0:218, 81Х ΙΌ N0:220, 81Х ΙΌ N0:222, 81Х ΙΌ N0:224, 81Х ΙΌ N0:226, 81Х ΙΌ N0:228, 81Х ΙΌ
N0:230, 8Ш ΙΌ N0:232, 81Х ΙΌ N0:234, 81Х ΙΌ N0:236, 81Х ΙΌ N0:238, 81Х ΙΌ N0:240, 81Х ΙΌ
N0:242, 81Х ΙΌ N0:244, 81Х ΙΌ N0:246, 81Х ΙΌ N0:248, 81Х ΙΌ N0:250, 81Х ΙΌ N0:252, 81Х ΙΌ
N0:254, 81Х ΙΌ N0:256, 81Х ΙΌ N0:258, 81Х ΙΌ N0:260, 81Х ΙΌ N0:262, 81Х ΙΌ N0:264, 81Х ΙΌ
N0:266, 8Ш ΙΌ N0:268, 81Х ΙΌ N0:270, 81Х ΙΌ N0:272, 81Х ΙΌ N0:274, 81Х ΙΌ N0:276, 81Х ΙΌ
N0:278, 81Х ΙΌ N0:280, 81Х ΙΌ N0:282, 81Х ΙΌ N0:284, 81Х ΙΌ N0:286, 81Х ΙΌ N0:288, 81Х ΙΌ
N0:290, 8Ш ΙΌ N0:292, 81Х ΙΌ N0:294, 81Х ΙΌ N0:296, 81Х ΙΌ N0:298, 81Х ΙΌ N0:300, 81Х ΙΌ
N0:302, 8Ш ΙΌ N0:304, 81Х ΙΌ N0:306, 81Х ΙΌ N0:308, 81Х ΙΌ N0:310, 81Х ΙΌ N0:312, 81Х ΙΌ
N0:314, 8Ш ΙΌ N0:316, 81Х ΙΌ N0:318, 81Х ΙΌ N0:320, 81Х ΙΌ N0:322, 81Х ΙΌ N0:324, 81Х ΙΌ
N0:326, 8Ш ΙΌ N0:328, 81Х ΙΌ N0:330, 81Х ΙΌ N0:332 или 8ЕР ΙΌ N0:334, и их ферментативно активные фрагменты. Процентная идентичность последовательностей может быть на протяжении полной длины полипептида, или идентичность может быть на протяжении участка по меньшей мере из 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков.
Полипептиды в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения также могут быть короче, чем полноразмерные полипептиды. В других вариантах осуществления это изобретение относится к полипептидам (пептидам, фрагментам) с размером, варьирующим между 5 остатками и полноразмерным полипептидом, таким как фермент, такой как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС; иллюстративные размеры составляют приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков, таких как последовательно расположенные остатки фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению. Пептиды по этому изобретению (такие как подпоследовательность полипептида по этому изобретению) могут быть пригодны, например, в качестве зондов для мечения, антигенов (иммуногенов), толерагенов, мотивов, активных центров фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС (таких как каталитический домены), сигнальных последовательностей и/или препродоменов.
В других вариантах осуществления полипептиды по этому изобретению, обладающие активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как активность альдолазы НМС и/или КНС, являются членами рода полипептидов, обладающих определенными структурными элементами, такими как аминокислотные остатки, которые коррелируют с активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМС и/или КНС. Эти общие структурные элементы можно использовать для повседневного получения вариантов альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как НМС и/или КНС. Эти общие структурные элементы ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению можно использовать в качестве основ для повседневного получения вариантов ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в пределах объема рода полипептидов по этому изобретению.
Как используют в настоящем документе, термины альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС включают любой полипептид или ферменты, способные катализировать реакцию присоединения альдола или ретроальдольную реакцию (такой как полипептиды по этому изобретению, также см. таблицу 1 и примеры 4, 5 и 6, ниже), или любую модификацию содержащего углерод-углеродную связь материала, например, при получении В-2-гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4кетоглутаровой кислоты (В-МР) и определенных стереоизомеров монатина, таких как В, В- и 8,Вмонатин, и их солей.
Полипептиды в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения катализируют образование углерод-углеродных связей в альдольной реакции и обладают способностью использовать пируват или фосфоенолпируват в качестве нуклеофильного компонента в синтезе 4-гидрокси-2кетобутиратного остова, как представлено на общей схеме, ниже.
В = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;
В2 = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;
В3 = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил, карбоновая кислота.
Без связи с теорией, полагают, что консервативный фрагмент из четырех атомов углерода, обра- 84 019971 зующийся во всех катализируемых пируватальдолазой реакциях конденсации, является как высоко, так и дифференциально функциональным. Более того, в каждом аддукте четыре соседних атома углерода находятся в четырех различных окисленных состояниях. Таким образом, каркасная область, образованная с помощью пируватальдолаз, дает возможность получения α-амино-у-гидроксикарбоновых кислот, βгидроксикарбоновых кислот, α, γ-дигидроксикарбоновых кислот и 2-дезоксиальдозных сахаров, как показано на схеме ниже.
Таким образом, пируватальдолазы в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения могут быть синтетически универсальными и их можно использовать для получения широ кого диапазона продуктов для применения в кормах для животных, продуктах питания для человека, промышленных процессах и в фармацевтике (см., например, Сукеи, Н.1.М. е! а1., Весеи! Абуаисек 1и !ке Скетоеи/утаЕс 8уи!кек1к оГ СагЬокубга!ек аиб СагЬокубга!е М1те!1ск, Скет. Веу. 1996, 96, 443-473; Неибегкои, Б.Р. е! а1. I. 0г§. Скет., 8!егеокрес1йс Ргерагайои оГ !ке Ы-Тегтта1 Атто Ас1б Мо1е!у оГ №ккотустк КХ аиб К/ У1а а Ми1!1р1е Еп/уте 8уи!кек1к, 1997, 62, 7910-7911; Аутег, N. & Тооие, Еб. Еи/утеса!а1у/еб 8уи!кек1к оГ СагЬокубга!ек. Сиггеи! 0рт. Скет1са1 Вю1оду, 2000, 4, 110-119).
Полипептиды в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения могут обладать более чем одним типом ферментативной активности, конкретно, активностью альдолазы и дополнительной активностью, например, как указано в табл. 1 ниже. Например, полипептид по этому изобретению может обладать активностью альдолазы, активностью пируватальдолазы, альдолазы НМС и/или КНС. Кроме того, полипептид может обладать или предположительно может обладать дополнительной ферментативной активностью, исходя из его классификации ЕС. Табл. 1 включает столбец Предсказанный номер ЕС. Номер ЕС представляет собой номер, присваиваемый типу фермента в соответствии со схемой стандартизированной номенклатуры ферментов, разработанной Еп/уте Сотт1ккюи оГ !ке ^теис^ите Сотт1!!ее оГ !ке 1и!егиа!юиа1 Итои оГ Вюскет1к!гу аиб Мо1еси1аг Вю1оду (ШВМВ). Результаты в столбце Предсказанный номер ЕС определены поиском посредством ВЕА8Т относительно базы данных Кедд (Куо!о Еисус1ореб1а оГ Сеиек аиб Сеиотек). Если наибольшее совпадение ВЕА8Т (также называемое хитом) обладает значением Е, равным или меньшим чем е-6, в таблицу вносят номер ЕС, присвоенный наибольшему совпадению. Номер ЕС наибольшего хита используют в качестве ориентира в отношении того, какой у последовательности по этому изобретению может быть номер ЕС. В случаях, где присваивается только частичный номер ЕС, может быть присвоена только широкая категория, исходя из наибольшего хита. Например, в первом ряду, для 8Е^ ΙΌ N0:2, кодируемой 8Е^ ΙΌ N0:1, предсказанный номер ЕС приведен в качестве 2.... Таким образом, ориентировочно присваивается категория трансфераз. Для 8Е^ ΙΌ N0:26, кодируемой 8Е^ ΙΌ N0:25, наиболее конкретная категория, которая может быть присвоена на основе наибольшего хита, соответствует альдегидлиазе.
- 85 019971
Таблица 1
8ЕО ΙΏ ΝΟ: Активность Подкласс альдолазы Предсказанный номер ЕС Сигнал Р Сигнал (АА=аминокислота) Источник
1,2 Альдолаза НМС 2... Бактерии
3,4 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
5,6 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
7, 8 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
9, 10 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
11, 12 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
13, 14 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
15, 16 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
17, 18 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
19, 20 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
21,22 Альдолаза НМС Неизвестен
23,24 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
25,26 Альдолаза НМС 4.1.2. Неизвестен
27,28 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
29, 30 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
31,32 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
33,34 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
35, 36 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
37,38 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
39, 40 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
41,42 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
43,44 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
45,46 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
47,48 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
49, 50 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
51, 52 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
53, 54 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
55,56 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
57, 58 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
59, 60 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
- 86 019971
61,62 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
63,64 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
65,66 Альдолаза НМС 2... АА1-27 Неизвестен
67,68 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
69, 70 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
71,72 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
73,74 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
75,76 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
77, 78 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
79, 80 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
81, 82 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
83, 84 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
85, 86 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
87, 88 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
89, 90 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
91,92 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
93,94 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
95,96 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
97, 98 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
99, 100 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
101, 102 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
103,104 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
105, 106 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
107, 108 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
109, 110 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
111, 112 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
ИЗ, 114 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
115, 116 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
117, 118 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
119, 120 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
121, 122 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
123, 124 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
125,126 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
127, 128 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
129, 130 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
131, 132 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
133, 134 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
135, 136 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
137, 138 Альдолаза НМО 2... Неизвестен
139, 140 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
141, 142 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
- 87 019971
143, 144 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
145, 146 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
147, 148 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
149, 150 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
151, 152 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
153, 154 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
155, 156 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
157, 158 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
159, 160 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
161, 162 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
163, 164 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
165, 166 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
167, 168 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
169, 170 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
171, 172 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
173, 174 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
175, 176 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
177, 178 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
179, 180 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
181, 182 Альдолаза НМС 2... АА1-31 Неизвестен
183,184 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
185, 186 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
187, 188 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
189, 190 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
191, 192 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
193, 194 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
195, 196 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
197, 198 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
199, 200 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
201,202 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
203, 204 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
205,206 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
207, 208 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
209,210 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
211,212 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
213,214 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
215,216 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
217,218 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
219, 220 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
221,222 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
223, 224 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
- 88 019971
225, 226 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
227, 228 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
229, 230 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
231,232 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
233, 234 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
235,236 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
237, 238 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
239, 240 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
241,242 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
243, 244 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
245, 246 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
247, 248 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
249, 250 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
251,252 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
253,254 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
255,256 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
257, 258 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
259, 260 Альдолаза НМС 2... АА1-18 Неизвестен
261,262 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
263, 264 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
265,266 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
267, 268 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
269, 270 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
271,272 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
273, 274 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
275,276 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
277, 278 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
279, 280 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
281,282 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
283,284 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
285,286 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
287,288 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
289, 290 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
291,292 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
293, 294 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
295, 296 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
297, 298 Альдолаза НМС 2... Неизвестен
299, 300 Альдолаза НМС 2.1.. Неизвестен
301,302 Альдолаза НМС 2.1.. Неизвестен
303,304 Альдолаза НМС 2.1.. Неизвестен
305,306 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
- 89 019971
307, 308 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
309,310 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
311,312 Альдолаза КНО 4.1.2.14 Неизвестен
313,314 Альдолаза КНО 4.1.2.14 Неизвестен
315,316 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
317,318 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
319,320 Альдолаза КНС 4.1.3.16 Неизвестен
321,322 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
323,324 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
325, 326 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
327,328 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
329, 330 Альдолаза КНС 4.1.3.16 Неизвестен
331,332 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
333,334 Альдолаза КНС 4.1.2.14 Неизвестен
Полипептиды и пептиды по этому изобретению можно выделять из природных источников, они могут представлять собой синтетические или полученные рекомбинантными способами полипептиды или полипептиды. Пептиды и белки можно экспрессировать рекомбинантными способами ίη ν^ί^ο или ίη ν^νο. Пептиды и полипептиды по этому изобретению можно получать и выделять с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептид и пептиды по этому изобретению также можно синтезировать, полностью или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. См., например, СагШйегз (1980) Кис1ею Αωό Кез. 8утр. 8ег. 215-223; Нот (1980) КисЫс Αωό Кез. 8утр. 8ег. 225-232; Вапда, Α.Κ., Тйегареийс Рерййез апй Рго1етз, Рогти1айоп, Ргосеззтд апй Эе1гуегу 8уз1етз (1995) ТесЬпоппс РиЬНзЫпд Со., Ьапсаз1ег, РΑ. Например, синтез пептида можно проводить с использованием различных твердофазных способов (см., например, КоЬегде (1995) 8с1епсе 269:202; Мегпйе1й (1997) Ме1Нойз Εηζутο1. 289:3-13), и можно применять автоматический синтез, например, с использованием ΑВI 431 Α Рерййе 8уп1йез17ег (Регкш Ε1те^) в соответствием с инструкциями, предоставляемыми изготовителем.
Пептиды и полипептиды по этому изобретению также могут быть гликозилированными. Гликозилирование можно добавлять посттрансляционно либо химически, либо с помощью клеточных биосинтетических механизмов, где последние включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности, или их можно добавлять в виде пептида, или их можно добавлять в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может быть О-связанным или ^связанным.
В некоторых вариантах осуществления, где указано, пептиды и полипептиды по этому изобретению могут включать все формы миметиков и пептидомиметиков. Термины миметик и пептидомиметик относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладает, по существу, такими же структурными и/или функциональными характеристиками, что и полипептиды по этому изобретению. Миметик может либо целиком состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо он представляет собой химерную молекулу частично из аминокислот природных пептидов и частично из аналогов аминокислот. Также миметик может включать любое количество консервативных замен природных аминокислот при условии, что такие замены также, по существу, не изменяют структуру и/или активность миметика. Как в случае полипептидов по этому изобретению (например, которые обладают приблизительно 50% или более идентичностью последовательностей с последовательностью по этому изобретению), общепринятые способы экспериментирования позволят определить, находится ли миметик в объеме этого изобретения, т.е., что его структура и/или функция, по существу, не изменены. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, композиция миметика находится в объеме этого изобретения, если она обладает активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КНО.
Композиции полипептидных миметиков по этому изобретению могут содержать любое сочетание неприродных структурных компонентов. В альтернативном варианте осуществления композиции миметиков по этому изобретению включают одну или все из следующих трех структурных групп: а) группы со связью остатков, отличной от природных амидных связей (пептидной связи); Ь) неприродные остатки вместо встречающихся в природе аминокислотных остатков; или с) остатки, которые приводят к вторичной структурной мимикрии, т.е. к индуцированию или стабилизации вторичной структуры, например, конформации бета-петли, гамма-петли, бета-слоя, альфа-спирали и т.п. Например, полипептид по этому изобретению может быть охарактеризован как миметик, если все или некоторые его остатки соединены химическими способами, отличными от природных пептидных связей. Отдельные остатки пептидомиметика могут быть связаны пептидными связями, другими химическими связями или конденси
- 90 019971 рующими веществами, например, такими как глутаральдегид, сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимида, бифункциональные малеинимиды, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ОСС) или Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (Э1С). Присоединенные группы, которые могут быть альтернативными традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(О)-СН2- вместо -Ο(Ο)-ΝΉ-), аминометилен (СН2-№Н), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-О), тиоэфир (СН2-§), тетразол (ΟΝ4-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см. 8ра1о1а (1983) в СЬет1к1гу а11б ВюсНетМгу оГ Атто ас1бк, Рерббек а11б Рго1етк, Уо1.7, рр.267-357, Рерббе ВаскЬогю Мοб^Г^саι^οηк. Магсе11 Эеккег, ΝΥ).
Полипептид по этому изобретению также может быть охарактеризован как миметик в случае наличия всех или нескольких неприродных остатков вместо природных аминокислотных остатков. Неприродные остатки полностью описаны в научной и патентной литературе; некоторые иллюстративные неприродные композиции, пригодные в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и руководства описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот можно получать замещением, например, Ό- или Ь-нафтилаланином; Ό- или Ь-фенилглицином; Ό- или Ь-2-тиенилаланином; Ό- или Ь-1,-2,3- или 4-пиренилаланином; Ό- или Ь-3-тиенилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(3пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2-пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; Ό(трифторметил)фенилглицином; О-(трифторметил)фенилаланином; Ό-п-фторфенилаланином; Ό- или Ьп-бифенилфенилаланином; Ό- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином; Ό- или Ь-2-индол(алкил)аланинами и Ό- или Ь-алкиламинами, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, вторичный изобутил, изопентил, или некислые аминокислоты. Ароматические кольца неприродных аминокислот включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.
Миметики кислых аминокислот можно получать замещением, например, некарабоксилатными аминокислотами с сохранением отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартильную или глутамильную) также можно селективно модифицировать посредством реакции с карбоимидами (Я'-Ы-С-Н-Я'), такими как 1-циклогексил-3(2морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил также можно превращать в остатки аспарагинила и глутаминила реакцией с ионами аммония. Миметики основных аминокислот можно получать замещением, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислотами орнитином, цитруллином или гуанидинуксусной кислотой, или гуанидиналкилуксусной кислотой, где алкил определен выше. Производным нитрила (например, содержащим ΟΝ-группу вместо СООН) можно заменять аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинила и глутаминила можно дезаминировать до соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики аргининовых остатков можно получать реакцией аргинила, например, с одним или несколькими общепринятыми реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, в некоторых вариантах осуществления в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина можно получать реакцией тирозила, например, с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Νацетилимидазол и тетранитрометан можно использовать для образования О-ацетилтирозильных продуктов и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики остатка цистеина можно получать реакцией остатков цистеинила, например, с альфа-галоацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующие амины с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Миметики цистеиновых остатков также можно получать реакцией остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Ν-алкилмалеимидами, 3-ни1ро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, пхлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина можно получать (и можно изменять Ν-концевые остатки) реакцией лизинила, например, с ангидридом янтарной или другой карбоновой кислоты. Лизин и другие альфа-аминосодержащие остатки также можно получать реакцией с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и реакциями с глиоксилатом, катализируемыми трансамидазой. Миметики метионина можно получать реакцией, например, с сульфоксидом метионина. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4метилпролин или 3, 3-диметилпролин. Миметики остатков гистидина можно получать реакцией гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, миметики, полученные гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп остатков серила или треонила; метилированием альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием Ν-концевого амина; метилированием остатков амида главной цепи или замещением Ν-метиламинокислотами; или амидированием С-концевых карбоксильных групп.
В некоторых вариантах осуществления остаток, например, аминокислоту, полипептида по этому изобретению также можно заменять аминокислотой (или остатком пептидомиметика) с противоположной хиральностью. В некоторых вариантах осуществления любую аминокислоту, встречающуюся в при
- 91 019971 роде в Ь-конфигурации (которая также может называться В или 8 в зависимости от структуры химической группы), можно заменять аминокислотой такого же структурного типа или пептидомиметиком, но с противоположной хиральностью, называемой Ό-аминокислотой, но также она может называться В- или
8-формой.
Также это изобретение относится к способам модификации полипептидов по этому изобретению либо посредством природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), либо посредством способов химической модификации, и к полученным модифицированным полипептидам. Модификации можно проводить на любой части полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и Ν- или С-концы. Понятно, что один и тот же тип модификации может быть выражен в той же или другой степени в разных участках данного полипептида. Также данный полипептид может обладать многими типами модификаций. В некоторых вариантах осуществления модификации включают ацетилирование, ацилирование, АОР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы тема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование СР1-якоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию, и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в белок, такую как аргинилирование. См. Сге1дй!оп, Т.Е., Рго!етк 8!гис!иге апб Мо1еси1аг РгорегИек 2пб Еб., \У.Н. Егеетап апб Сотрапу, №\ν ΥογΚ (1993); Рокйгапк1а!юпа1 Сονа1еη! МобШсайоп о£ РгсИетк, В.С. .Тойпкоп, Еб., Асабетю Ргекк, №\ν ΥογΚ, рр.1-12 (1983).
Также для синтеза полипептида или фрагментов по этому изобретению можно использовать твердофазные способы химического синтеза пептидов. Такой способ известен в данной области с начала 1960-х (Метйе1б, В.В., I. Ат. Сйет. 8ос, 85:2149-2154, 1963) (см. также 8!етей, РМ. апб Υοιπίβ, ΙΌ., 8ойб Рйаке Рерббе 8уп!йек1к, 2пб Еб., Р1егсе Сйетюа1 Со., Воскйэгб, 111., рр.11-12)) и в последнее время его используют в коммерчески доступных лабораторных наборах для разработки и синтеза пептидов (СатЬпбде Векеагсй Вюсйетюа1к). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, использовались идеи Н.М. Сеукеп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сц И8А, 81:3998 (1984), и они обеспечивают синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых соединены с одним планшетом. При использовании такой системы планшет со стержнями или булавками переворачивают и вставляют во второй планшет с соответствующими лунками или резервуарами, которые содержат растворы для присоединения или заякоривания соответствующей аминокислоты на концах стержней или шпилек. При повторении этой стадии процесса, т.е. при переворачивании и помещении концов стержней и булавок в соответствующие растворы, из аминокислот выстраиваются требуемые пептиды. Кроме того, является доступным ряд доступных систем для синтеза пептидов ЕМОС. Например, сборку полипептида или фрагмента можно проводить на твердой подложке с использованием устройства для автоматического синтеза пептидов Аррйеб Вюкук!етк, 1пс. Мобе1 431А™. Такое оборудование обеспечивает легкую доступность пептидов по этому изобретению либо непосредственным синтезом, либо синтезом ряда фрагментов, которые соединяют с использованием других известных способов.
Полипептиды по этому изобретению включают ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в активной и неактивной форме. Например, полипептиды по этому изобретению включают пробелки перед созреванием или процессингом препропоследовательностей, например, посредством фермента процессинга пробелка, такого как конвертаза пробелка, с получением активного зрелого белка. Полипептиды по этому изобретению включают ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, неактивные по другим причинам, например, перед активацией посредством посттрансляционного процессинга, например, воздействия эндо- и экзопептидаз или протеаз, фосфорилирования, амидирования, гликозилирования или сульфатации, димеризации и т.п.
Полипептиды по этому изобретению включают все активные формы, включая активные подпоследовательности, например, каталитические домены или активные центры, фермента.
Это изобретение относится к иммобилизованным ферментам альдолазам, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, антителам против альдолазы, таким как антитела против пируватальдолаза, такие как антитела против альдолазы НМС и/или КНС, и к их фрагментам. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам ингибирования активности фермента альдолазы, такой пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, например, с использованием доминантно-негативных мутантных форм или антител против альдолазы, таких как антитела против пируватальдолазы, такие как антитела против альдолазы НМС и/или КНС, по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гетерокомплексам, таким как слитые белки, гетеродимеры и т.д., содержащим ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению.
- 92 019971
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по этому изобретению могут обладать активностью ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в различных условиях, например при крайних значениях рН и/или температуры, или в некоторых вариантах осуществления в присутствии окислителей и т.п. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам, приводящим к альтернативным препаратам ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, с отличающейся каталитической эффективностью и стабильностью, например, в отношении температуры, окислителей и изменения условий промывания. В некоторых вариантах осуществления варианты ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, можно получать с использованием способов сайт-направленного мутагенеза и/или случайного мутагенеза. В некоторых вариантах осуществления для получения большого множества вариантов ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, с альтернативной специфичностью и стабильностью, можно использовать направленные изменения.
Белки по этому изобретению также пригодны в качестве экспериментальных реагентов для идентификации модуляторов ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, таких как активаторы или ингибиторы активности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В кратком изложении, анализируемые образцы (соединения, бульоны, экстракты и т.п.) добавляют к образцу для анализа ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, в целях определения их способности ингибировать расщепление субстрата. Ингибиторы, идентифицированные таким способом, можно использовать в промышленности и исследованиях для снижения или предотвращения нежелательного протеолиза. Как и в случае ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, ингибиторы можно комбинировать повышением спектра активности.
Ферменты по этому изобретению также пригодны в качестве исследовательских реагентов для расщепления белков или секвенирования белков. Например, ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, можно использовать для разрушения полипептидов на фрагменты меньших размеров в целях секвенирования с использованием, например, автоматического секвенатора.
Также это изобретение относится к способам выявления новых ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления проводят скрининг библиотек фагмид для выявления на основании экспрессии ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. В других вариантах осуществления проводят скрининг библиотек фага лямбда для выявления на основе экспрессии ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. Скрининг библиотек фагов или фагмид может обеспечить определение токсичных клонов, повышение доступа к субстрату, снижение необходимости в создании способами инженерии хозяина, обход потенциальных любых ошибок, возникающих вследствие множественных удалений в библиотеке, и ускорение роста при низких плотностях клонов. Скрининг библиотек фагов или фагмид можно проводить в жидкой фазе или в твердой фазе. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к скринингу в жидкой фазе. Это обеспечивает большую универсальность условий анализа, дополнительную универсальность субстрата, повышенную чувствительность для слабых клонов и легкость автоматизации по сравнению с твердофазным анализом.
Это изобретение относится к способам скрининга с использованием белков и нуклеиновых кислот по этому изобретению и роботизации для обеспечения выполнения тысяч биокаталитических реакций и скрининговых анализов за короткий период времени, например за сутки, а также для обеспечения высокого уровня точности и воспроизводимости (см. описание матриц ниже). В результате, библиотеку производных соединений можно получить всего за несколько недель. Для других описаний модификаций молекул, включая низкомолекулярные соединения, см. РСТ/И894/09174, патент США № 6245547.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды или фрагменты по этому изобретению получают способами биохимического обогащения или очистки. Последовательность потенциально гомологичных полипептидов или фрагментов можно определять посредством ферментных анализов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС (см. примеры 3, 4 и 5, ниже), гельэлектрофореза и/или микросеквенирования. Последовательность предполагаемого полипептида или фрагмента по этому изобретению можно сравнивать с полипептидом по этому изобретением или фрагментом, например, содержащим по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более его последовательно расположенных аминокислот, с использованием программ, описанных выше.
Другой вариант осуществления этого изобретения представляет собой анализ для идентификации фрагментов или вариантов по этому изобретению, которые сохраняют ферментативную функцию полипептидов по этому изобретению. Например, фрагменты или варианты указанных полипептидов можно использовать для катализа биохимических реакций, которые указывают на то, что фрагмент или вариант сохраняет ферментативную активность полипептида по этому изобретению. Иллюстративный способ
- 93 019971 анализа для определения сохранения фрагментами или вариантами ферментативной активности полипептидов по этому изобретению включает стадии контактирования полипептидного фрагмента или варианта с молекулой субстрата в условиях, которые обеспечивают функционирование полипептидного фрагмента или варианта, и детекцию либо снижения уровня субстрата, либо повышения уровня конкретного продукта реакции между полипептидом и субстратом.
В настоящем изобретении используются определенные каталитические свойства ферментов. В то время как применение биокатализаторов (т.е. очищенных или неочищенных ферментов, неживых или живых клеток) в химических превращениях в норме требует идентификации конкретного биокатализатора, который реагирует с конкретным исходным соединением, в настоящем изобретении используются подобранные биокатализаторы и условия реакции, которые являются специфичными для функциональных групп, которые находятся во множестве исходных соединений, таких как низкомолекулярные соединения. Каждый биокатализатор является специфичным для одной функциональной группы или нескольких сходных функциональных групп и может реагировать с множеством исходных соединений, содержащих эту функциональную группу.
В некоторых вариантах осуществления биокаталитические реакции приводят к получению совокупности производных из единичного исходного соединения. Эти производные можно подвергать другому циклу биокаталитических реакций с получением второй группы производных соединений. При каждом повторе биокаталитического образования производных можно получать тысячи вариантов исходных низкомолекулярных молекул или соединений.
Ферменты действуют на конкретные участки исходного соединения без влияния на остальную часть молекулы, что представляет собой процесс, которого очень сложно добиться с использованием традиционных химических способов. Эта высокая степень биокаталитической специфичности обеспечивает способы идентификации единичного активного соединения из библиотеки. Библиотека характеризуется рядом биокаталитических реакций, используемых для ее получения, так называемой биосинтетической историей. Скрининг библиотеки в отношении видов биологической активности и прослеживание биосинтетической истории позволяют идентифицировать конкретную последовательность реакций образования активного соединения. Последовательность реакций повторяют и определяют структуру синтезированного соединения. Этот способ идентификации, в отличие от других подходов синтеза и тестирования, не требует технологий иммобилизации, и соединения можно синтезировать и анализировать в свободной форме в растворе с использованием практически любого типа скринингового анализа. Важно отметить, что высокая степень специфичности ферментативных реакций для функциональных групп позволяет проследить конкретные ферментативные реакции, которые приводят к биокаталитически полученной библиотеки.
В некоторых вариантах осуществления множество стадий способа осуществляют с использованием роботизации, способной выполнять множество тысяч биокаталитических реакций и скрининговых анализов в сутки, а также обеспечивать высокий уровень точности и воспроизводимости. Также роботизацию можно использовать для скрининга в отношении активности альдолазы в целях определения того, находится ли полипептид в объеме этого изобретения. В результате, в некоторых вариантах осуществления за несколько недель можно получить библиотеку производных соединений, при этом ее получение с использованием традиционных химических или ферментативных способов скрининга отняло бы годы.
В одном варианте осуществления это изобретение относится к способам модификации низкомолекулярных соединений, включающих контактирование полипептида, кодируемого полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, или его ферментативно активных фрагментов с низкомолекулярным соединением с получением модифицированного низкомолекулярного соединения. Библиотеку модифицированных низкомолекулярных соединений анализируют для определения того, представлено ли в библиотеке модифицированное низкомолекулярное соединение, которое проявляет требуемую активность. Конкретную биокаталитическую реакцию, которая приводит к модифицированному низкомолекулярному соединению с требуемой активностью, идентифицируют систематическим удалением каждой из биокаталитических реакций, используемых для получения части библиотеки, а затем анализом низкомолекулярных соединений, полученных в части библиотеки, на наличие или отсутствие модифицированного низкомолекулярного соединения с требуемой активностью. Конкретные биокаталитические реакции, которые приводят к модифицированному низкомолекулярному соединению с требуемой активностью, необязательно повторяют. Биокаталитические реакции проводят с группой биокатализаторов, которые взаимодействуют с определенными структурными группами, находящимися в структуре низкомолекулярного соединения, где каждый катализатор является специфичным в отношении одной структурной группы или совокупности сходных структурных групп; и каждый биокатализатор реагирует с множеством различных низкомолекулярных соединений, которые содержат определенную структурную группу.
- 94 019971
Сигнальные последовательности, препродомены и каталитические домены фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС
Это изобретение относится к сигнальным последовательностям ферментов (таким как сигнальные пептиды (8Р)), препродоменам, связывающим доменам и каталитическим доменам (СО) фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС. 8Р, препродомены и/или СО по этому изобретению могут представлять собой выделенные, синтетические или рекомбинантные пептиды, или они могут представлять собой часть слитого белка, такую как гетерологичный домен в химерном белке. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти каталитические домены (СО), препродомены и сигнальные последовательности (8Р, такие как пептид с последовательностью, содержащей/состоящей из №концевых остатков полипептида по этому изобретению).
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям (таким как сигнальные пептиды), содержащим последовательность, как указано, с остатками с 1 по 14, с 1 по 15, с 1 по 16, с 1 по 17, с 1 по 18, с 1 по 19, с 1 по 20, с 1 по 21, с 1 по 22, с 1 по 23, с 1 по 24, с 1 по 25, с 1 по 26, с 1 по 27, с 1 по 28, с 1 по 27, с 1 по 30, с 1 по 31, с 1 по 32, с 1 по 33, с 1 по 34, с 1 по 35, с 1 по 36, с 1 по 37, с 1 по 38, с 1 по 39, с 1 по 40, с 1 по 41, с 1 по 42, с 1 по 43, с 1 по 44, с 1 по 45, с 1 по 46, с 1 по 47 или более, полипептида по этому изобретению, такого как полипептиды по этому изобретению, или состоящим из них, также см. таблицу 1, примеры 4, 5 и 6, ниже, и список последовательностей. Например, в табл. 1, выше, указаны иллюстративные сигнальные (лидерные) последовательности по этому изобретению, например полипептид, обладающий последовательностью, как указано в 8ΕΟ ГО N0:66, кодируемой 8Ε0 ГО N0:65, обладает сигнальной последовательностью, содержащей (или состоящей из) 27 №концевых остатков, или М8IVVΤКIΕКАСАААVАА^КΤ8СVАΤV (8Ε0 ГО N0:407), которые соответствуют первым 27 аминокислотным остаткам 8Ε0 ГО N0:66.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к сигнальным последовательностям, содержащим первые 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или более №концевых остатков полипептида по этому изобретению.
Это изобретение относится к полипептидам с сигнальной последовательностью и/или препропоследовательностью или без них. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к полипептидам с гетерологичными сигнальными последовательностями и/или препропоследовательностями.
Препропоследовательность (включая последовательность по этому изобретению, используемую в качестве гетерологичного препродомена) может быть расположена на №конце или на С-конце белка. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям, препропоследовательностям и каталитическим доменам (таким как активные центры), содержащим последовательности по этому изобретению. Полипептид, содержащий сигнальную последовательность по этому изобретению, может представлять собой фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению, или другой фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению, или другой фермент или другой полипептид. Способы идентификации последовательностей препро-домена и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области, см. Vаи бе Vеη (1993) Сп1. Кет. 0псод. 4 (2):115-136. Например, для идентификации препропоследовательности белок очищают из внеклеточного окружения и определяют №концевую белковую последовательность и сравнивают с непроцессированной формой.
Сигнальные последовательности (8Р) и/или препропоследовательности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению могут представлять собой выделенные, синтетические или рекомбинантные пептиды или последовательности, соединенные с другим ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, или с полипептидом не альдолазы, таким как полипептид не пируватальдолаза, такой как полипептид не альдолазы НМС и/или КСН, такие как слитый (химерный) белок. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к полипептидам, содержащим сигнальные последовательности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, содержащие сигнальные последовательности 8Р и/или препропоследователности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению содержат последовательности, гетерологичные ферменту альдолазе, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН по этому изобретению (такие как слитый белок, содержащий 8Р и/или препропоследовательность по этому изобретению и/или последовательности из другого фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, или из белка не альдолазы, такого как белок не пируватальдолазы, такой как белок не альдолазы НМС и/или КСН). В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к ферментам альдолазам, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению с гетерологичными 8Р и/или препропоследовательностями, таким как последовательности с сигнальной последовательностью дрожжей. Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза
- 95 019971
НМС и/или КСН, по этому изобретению могут содержать гетерологичную 8Р и/или препропоследовательность в векторе, таком как вектор серии рРК.’ (Луйгодеи, Саг1кЬаб, СА).
В некоторых вариантах осуществления 8Р и/или препропоследовательности по этому изобретению идентифицируют после идентификации новых ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Пути, посредством которых белки сортируются и транспортируются в надлежащие отделы клетки, часто называют путями направления белков. Одним из наиболее важных элементов во всех из этих направляющих систем является короткая аминокислотная последовательность на Оконце вновь синтезированного полипептида, называемая сигнальной последовательностью. Эта сигнальная последовательность направляет белок в соответствующий отдел клетки, и она удаляется в процессе транспорта или при достижении белком пункта назначения. Большинство лизосомальных, мембранных или секретируемых белков обладают ^концевой сигнальной последовательностью, которая маркирует их для транспорта в просвет эндоплазматической сети. Длина сигнальных последовательностей может варьировать от 10 до 65 или более аминокислотных остатков. Различные способы выявления сигнальных последовательностей известны специалистам в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления новые сигнальные пептиды ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, идентифицируют способом, называемым 81дна1Р. В 81дна1Р используется комбинированная нейронная сеть, которая распознает как сигнальные пептиды, так и участки их расщепления. (№е1кег1 (1997) ”Iбеηι^Πса(^оη оГ ргокагуойс аиб еикагуойс к1диа1 рерРбек аиб рюбЬНои оГ Шей с1еауаде кйек Рго!ет Еидтеегтд, 10:1-6.
В некоторых вариантах осуществления фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению может не обладать 8Р и/или препропоследовательностями доменами. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к ферментам альдолазам, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению, лишенным всех 8Р и/или препродомена или их части. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующей сигнальную последовательность (8Р) и/или препропоследовательность из одного фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты другого фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, или, необязательно, может быть желательной сигнальная последовательность (8Р) и/или препродомен из белка не альдолазы, такого как белок не пируватальдолазы, такой как белок не альдолаза НМС и/или КСН.
Также это изобретение также относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим сигнальные последовательности (8Р), препродомен и/или каталитические домены (СЭ) по этому изобретению и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, не природным образом ассоциированные (например, фермент) с 8Р, препродоменамом и/или СЭ. Последовательность, с которой 8Р, препродомен и/или СЭ могут быть не природным образом ассоциированы, может находиться на Оконце, С-конце 8Р, препродомена и/или СЭ, и/или на обоих концах 8Р и/или СЭ. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим (или состоящему из) полипептид, содержащий сигнальную последовательность (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СЭ) по этому изобретению, при условии, что он не ассоциирован с какой-либо последовательностью, с которой он ассоциирован в природе (такой как последовательность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН). Аналогично, в некоторых вариантах осуществления, это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим эти полипептиды. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по этому изобретению содержит кодирующую последовательность для сигнальной последовательности (8Р), препродомена и/или каталитического домена (СЭ) по этому изобретению, и гетерологичную последовательность (т.е. последовательность, не природным образом ассоциированную с сигнальной последовательностью (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СЭ) по этому изобретению). Гетерологичная последовательность может находиться на 3'-конце, 5'-конце и/или на обоих концах последовательности, кодирующей 8Р, препродомен и/или СЭ.
Гибридные (химерные) ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, и библиотеки пептидов.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гибридным ферментам альдолазам, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, и к слитым белкам, включая пептидные библиотеки, содержащие последовательности по этому изобретению. Пептидные библиотеки по этому изобретению можно использовать для выделения пептидных модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) мишеней, таких как субстраты, рецепторы, ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Пептидные библиотеки по этому изобретению можно использовать для идентификации соответствующих партнеров для связывания мишеней, таких как лиганды, такие как цитокины, гормоны и т.п. В некоторых вариантах осуществления это изобретение
- 96 019971 относится к химерным белкам, содержащим сигнальную последовательность (ЛР), препродомен и/или каталитический домен (СО) по этому изобретению или их сочетание, и гетерологичную последовательность (см. выше).
В некоторых вариантах осуществления слитые белки по этому изобретению (такие как пептидная группа) конформационно стабилизируют (относительно линейных пептидов), чтобы обеспечить более высокую аффинность связывания мишеней. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к слитым молекулам ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению и других пептидов, включая известные и случайные пептиды. Их можно подвергать слиянию таким образом, чтобы структура ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, не изменялась в значительной степени, и пептид был метаболически или структурно конформационно стабилизированным. Это позволяет создавать библиотеку пептидов, которую легко подвергать мониторингу как в отношении ее наличия в клетках, так и на ее количество.
Варианты аминокислотных последовательностей по этому изобретению могут характеризоваться предопределенным характером изменения, что является признаком, который отделяет их от встречающихся в природе форм, таких как аллельное и межвидовое разнообразие последовательностей ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. В некоторых вариантах осуществления варианты по этому изобретению проявляют качественно такую же биологическую активность, что и природный аналог. Альтернативно можно отбирать варианты с модифицированными свойствами. В некоторых вариантах осуществления, несмотря на то, что участок или область для внесения изменения в аминокислотную последовательность предопределены, мутация, по существу, не должна быть предопределена. Например, в целях оптимизации внесения мутации в данный участок, можно проводить случайный мутагенез в кодоне-мишени или участке-мишени и подвергать скринингу экспрессируемые варианты ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, в отношении оптимального сочетания для требуемой активности. Способы внесения мутаций с заменами в предопределенных участках ДНК с известной последовательностью хорошо известны, как описано в настоящем документе, например, мутагенез с праймерами М13 и мутагенез посредством ПЦР. Скрининг мутантных форм можно проводить с использованием, например, анализов образования или расщепления углерод-углеродной связи. В других вариантах осуществления аминокислотные замены могут представлять собой единичные остатки; размер вставок может составлять порядка от приблизительно 1 до 20 аминокислот, хотя вносят вставки значительно больших размеров. Размер делеций может варьировать от приблизительно 1 до приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70 остатков или более. Для получения конечного производного с оптимальными свойствами можно использовать замены, делеций, вставки или любое их сочетание. Как правило, эти изменения проводят в небольшом количестве аминокислот для сведения к минимуму изменений молекулы. Однако при определенных условиях могут быть допустимы большие изменения.
Это изобретение относится к ферментам альдолазам, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, где структура полипептидного остова, вторичная или третичная структура, такая как структура альфа-спирали или бета-слоя, являются модифицированными. В некоторых вариантах осуществления модифицированы заряд или гидрофобность. В некоторых вариантах осуществления модифицирован объем боковой цепи. Существенные изменения функции или иммунологической идентичности проводят, выбирая замены, которые являются менее консервативными. Например, можно проводить замены, которые наиболее значительно влияют: на структуру полипептидного остова в области изменения, например, на структуру альфа-спирали или бета-слоя; на заряженный или гидрофобный участок молекулы, который может находиться активном центре; или на боковую цепь. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к заменам в полипептиде по этому изобретению, где (а) гидрофильные остатки, например серил или треонил, замещают (или замещены им) гидрофобный остаток, например, лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (Ь) цистеин или пролин замещают (или замещены им) любой другой остаток; (с) остаток с электроположительной боковой цепью, например, лизил, аргинил или гистидил, замещает (или замещен им) электроотрицательный остаток, например глутамил или аспартил; или (б) остаток с объемной боковой цепью, например фенилаланин, замещает (или замещен им) остаток, не обладающий боковой цепью, например глицин. Варианты могут проявлять качественно такую же биологическую активность (например, активность ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН), хотя, при необходимости, можно отбирать варианты для модификации свойств ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН.
В некоторых вариантах осуществления ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению содержат эпитопы или маркеры для очистки, сигнальные последовательности или другие слитые последовательности и т.д. В некоторых вариантах осуществления ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, можно подвергать слиянию со случайным пептидом с получением слитого полипептида. Под термином слитый или функционально связанный в настоящем документе подразумевают, что случайный пеп
- 97 019971 тид и фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, связаны друг с другом таким образом, чтобы свести к минимуму нарушения стабильности структуры фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, например, чтобы сохранялась активность к ферменту альдолазе, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Слитый полипептид (или слитый полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид) также может содержать дополнительные компоненты, включая множественные пептиды во множественных петлях.
В некоторых вариантах осуществления пептиды и кодирующие их нуклеиновые кислоты являются рандомизированными, либо полностью рандомизированными, либо они имеют тенденцию к рандомизации, например, в частоте нуклеотидов/остатков, в целом или в одном положении. Рандомизированный означает, что каждая нуклеиновая кислота и пептид состоят, по существу, из случайных нуклеотидов и аминокислот соответственно. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, которые являются предшественниками пептидов, можно химически синтезировать, и, таким образом, они могут включать любой нуклеотид в любом положении. Таким образом, при экспрессии нуклеиновых кислот с образованием пептидов, любой аминокислотный остаток может быть включен в любом положении. Процесс синтеза может быть предназначен для получения рандомизированных нуклеиновых кислот, чтобы обеспечить образование всех или большинства из возможных сочетаний на протяжении длины нуклеиновой кислоты, образуя, таким образом, библиотеку рандомизированных нуклеиновых кислот. Библиотека может обеспечить достаточно разнородную структурно группу рандомизированных продуктов экспрессии для того, чтобы влиять на достаточный в вероятностном смысле диапазон клеточных ответов в целях получения одной или нескольких клеток, проявляющих требуемый ответ. Таким образом, это изобретение относится к библиотеке взаимодействий, достаточно большой, чтобы по меньшей мере один из ее членов обладал структурой, которая придает ему аффинность в отношении некоторой молекулы, белка или другого фактора.
В некоторых вариантах осуществления фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению представляет собой мультидоменный фермент, который содержит сигнальный пептид, связывающий углеводы модуль, каталитический домен фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, линкер и/или другой каталитический домен.
Это изобретение относится к способам и последовательностям для получения химерных полипептидов, которые могут кодировать биологически активные гибридные полипептиды (такие как гибридные ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН). В некоторых вариантах осуществления исходные полинуклеотиды (такие как нуклеиновая кислота по этому изобретению) кодируют биологически активные полипептиды. В некоторых вариантах осуществления способ по этому изобретению обеспечивает новые гибридные полипептиды с использованием клеточных процессов, которые объединяют последовательность исходных полинуклеотидов, так что полученный гибридный полинуклеотид кодирует полипептид, демонстрирующий активность, приобретенную от исходных биологически активных полипептидов, но отличающуюся от нее. Например, исходные полинуклеотиды могут кодировать конкретный фермент (такой как альдолаза) из различных микроорганизмов. Фермент, кодируемый первым полинуклеотидом из одного организма, или вариант, может, например, эффективно функционировать в конкретных условиях окружающей среды, например, при высоком процентном содержании соли. Фермент, кодируемый вторым полинуклеотидом из другого организма, или вариант, может эффективно функционировать при других условиях окружающей среды, таких как крайне высокие температуры. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который проявляет свойства обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, объединенных для каждого из ферментов, кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например, при высоком процентном содержании соли и предельных температурах.
В некоторых вариантах осуществления гибридный полипептид, полученный способом по этому изобретению, может проявлять специализированную ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редуктивной пересборки полинуклеотидов, кодирующих ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, полученный гибридный полипептид, кодируемый гибридным полинуклеотидом, можно подвергать скринингу в отношении специализированных видов активности не ферментов альдолаз, таких как виды активности не пируватальдолазы, такие как виды активности не альдолазы НМС и/или КСН, такие как виды активности гидролазы, пептидазы, фосфорилазы и т.д., полученные из каждого из исходных ферментов. В некоторых вариантах осуществления гибридный полипептид подвергают скринингу для выявления химических функциональных свойств, которые отличают гибридный фермент от исходных ферментов, таких как температура, рН или концентрация соли, при которых функционирует гибридный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способу получения биологически активного гибридного полипептида и к скринингу такого полипептида в отношении усиленной ак- 98 019971 тивности посредством:
1) введения в пригодную клетку-хозяина по меньшей мере первого полинуклеотида в функциональной связи и второго полинуклеотида в функциональной связи, где по меньшей мере первый полинуклеотид и второй полинуклеотид обладают по меньшей мере одним общим участком частичной гомологии последовательностей;
2) выращивания клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают реорганизацию последовательностей, приводящую к функционально связанному гибридному полинуклеотиду;
3) экспрессии гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;
4) скрининга гибридного полипептида в условиях, которые обеспечивают идентификацию усиленной биологической активности; и
5) выделения полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.
Выделение и выявление ферментов альдолаз
Это изобретение относится к выделению и выявлению ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, и нуклеиновых кислот, которые кодируют их. Полинуклеотиды или ферменты можно выделять из отдельных организмов (изолятов), коллекций организмов, которые были выращены на определенных средах (обогащенные культуры), или некультивированных организмов (образцы из окружающей среды). Организмы можно выделять, например, биологическим пэннингом ίη у1уо (см. описание ниже). Применение независимого от культивирования подхода для получения полинуклеотидов, кодирующих новые виды биологической активности, из образцов из окружающей среды является наиболее предпочтительным, поскольку он обеспечивает доступ к неизмененным источникам биологического разнообразия. Полинуклеотиды или ферменты также можно выделять из одного из множества организмов, таких как бактерии. В дополнение к цельным клеткам полинуклеотиды или ферменты также можно выделять из неочищенных препаратов ферментов, образованных из культур этих организмов, таких как бактерии.
Библиотеки окружающей среды получают из образцов из окружающей среды, и они представляют собой совокупные геномы природных организмов, хранящиеся в векторах для клонирования, которые можно воспроизводить в пригодных прокариотических хозяевах. Вследствие того, что клонированную ДНК исходно выделяют непосредственно из образцов из окружающей среды, библиотеки не ограничиваются небольшой фракцией прокариот, которые могут быть выращены в монокультуре. Кроме того, упорядочивание ДНК из окружающей среды, представленной в этих образцах, может обеспечить более равномерное представление ДНК из всех видов, находящихся в исходном образце. Это может привести к резкому повышению эффективности поиска интересующих генов из менее представленных компонентов образца, который на несколько порядков значимости может быть более редко встречающимся по сравнению с доминантными видами.
В некоторых вариантах осуществления библиотеки генов, полученные из одного или нескольких некультивированных микроорганизмов, подвергают скринингу в отношении представляющей интерес активности. Потенциальные каскады, кодирующие представляющие интерес биологически активные молекулы, сначала заключают в прокариотические клетки в форме библиотек для экспрессии генов. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, определяющие представляющие интерес виды активности, выделяют из библиотек и вводят в клетку-хозяина. Клетку-хозяина выращивают в условиях, которые обеспечивают рекомбинацию и/или редуктивную пересборку, с получением потенциально активных биологических молекул с новыми или усиленными видами активности.
Биологический пэннинг ίη у1уо можно проводить с использованием устройств на основе ЕАС8 и неоптических (таких как магнитные) устройств. В некоторых вариантах осуществления конструируют комплексные библиотеки генов с векторами, которые содержат элементы, которые стабилизируют транскрибируемую РНК. Например, включение последовательностей, которые приводят к вторичным структурам, таким как шпильки, которые предназначены для фланкирования транскрибируемых участков РНК, может привести к усилению их стабильности, повышая, таким образом, их время полужизни в клетке. Молекулы зондов, используемые в процессе биологического пэннинга, состоят из олигонуклеотидов, меченных репортерными молекулами, которые флуоресцируют только при связывании зонда с молекулой-мишенью. Эти зонды вводят в рекомбинантные клетки из библиотеки с использованием одного из нескольких способов трансформации. Молекулы зондов связываются с транскрибируемой мРНКмишенью, что приводит к гетеродуплексным молекулам ДНК/РНК. Связывание зонда с мишенью приведет к флуоресцентному сигналу, который детектируется и сортируется устройством ЕАС8 в процессе скрининга.
В некоторых вариантах осуществления для последующего выделения представляющих интерес последовательностей проводят субклонирование. В случае сублокнирования амплифицируют участок ДНК, расщепляют, главным образом, посредством ферментов рестрикции, чтобы вырезать требуемую последовательность, требуемую последовательность лигируют в реципиентный вектор и амплифицируют. На каждой стадии субклонирования участок исследуют в отношении представляющей интерес активности, чтобы убедиться, что ДНК, которая кодирует структурный белок, не была уничтожена. На любой стадии субклонирования вставку можно очищать, например, посредством гель-электрофореза, перед лигирова
- 99 019971 нием в вектор, или посредством помещения клеток, содержащих реципиентный вектор, и клеток, не содержащих реципиентный вектор, на селективные среды, содержащие, например, антибиотик, который вызывает гибель клеток, не содержащих реципиентный вектор. Конкретные способы субклонирования вставок кДНК в векторы хорошо известны в данной области (8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пд Ед., Со1д 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз (1989)). В других вариантах осуществления ферменты по этому изобретению представляют собой субклоны. Такие субклоны могут отличаться от исходного родительского клона, например, длиной, мутацией, маркером или меткой.
Микроорганизмы, из которых можно выявлять, выделять или получать полинуклеотид, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕиЬас!ег1а и АгсйаеЬас!ег1а, и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды можно выявлять, выделять и получать из образцов из окружающей среды, в случае которых нуклеиновую кислоту можно выделять без культивирования организма, или его можно выделять из одного или нескольких культивированных организмов. В некоторых вариантах осуществления такие микроорганизмы могут быть экстремофилами, такими как гипертермофилы, психрофилы, психротрофы, галофилы, барофилы и ацидофилы. Можно использовать полинуклеотиды, кодирующие ферменты, выделенные из экстремофильных микроорганизмов. Ферменты по этому изобретению могут функционировать при температурах более 100°С, таких как температуры, встречающиеся в горячих источниках на суше и в термических кратерах на больших глубинах, или при температурах ниже 0°С, таких как температуры, встречающиеся в арктических водах, в окружающей среде, насыщенной солью, такой как среда в Мертвом море, при значениях рН приблизительно 0, таких как значения рН, встречающиеся в месторождениях угля и геотермических богатых серой источниках, или при значениях рН более 11, таких как значения рН в осадках сточных вод. В некоторых вариантах осуществления ферменты по этому изобретению обладают высокой активностью при широком диапазоне температур и рН.
Полинуклеотиды, отобранные и выделенные, как описано выше, вводят в пригодную клеткухозяина. Пригодная клетка-хозяин представляет собой любую клетку, способную обеспечивать рекомбинацию и/или редуктивную пересборку. В некоторых вариантах осуществления отобранные полинуклеотиды уже находятся в векторе, который включает соответствующие контрольные последовательности. Клетка-хозяин может представлять собой клетку высших эукариот, такую как клетка млекопитающих, или клетку низших эукариот, такую как клетка дрожжей, или, в некоторых вариантах осуществления, клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина можно проводить трансфекцией фосфатом кальция, трансфекцией, опосредуемой БЕЛЕ-декстраном, или электропорацией (Бам1з е! а1., 1986).
Иллюстративные хозяева включают бактериальные клетки, такие как Е.сой, 8!гер!отусез, 8а1топе11а 1ур1итипит; клетки грибов, такие как клетки дрожжей; клетки насекомых, такие как Бгозорййа 82 и 8родор!ега 8Г9; клетки животных, такие как СНО, С08 или клетки меланомы Воуез; аденовирусы; и клетки растений, см. описание ниже. Выбор походящего хозяина лежит в пределах квалификации специалистов в данной области, исходя из приведенных здесь указаний.
Для экспрессии рекомбинантного белка можно использовать различные культуральные системы клеток млекопитающих; примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии С08-7 фибробластов почки обезьяны, описанные в 8У40-!гапз£огтед з1т1ап се11з зиррой Не гер1юа!юп оГ еаг1у 8У40 ти!ап!з (С1ихтап, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать совместимый вектор, например, клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации, пригодный промотор и энхансер, а также любые необходимые участки связывания рибосом, участок полиаденилирования, донорные и акцепторные участки сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. Для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, образованные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.
В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, полипептиды и способы по этому изобретению применяют в биохимических каскадах, или для создания новых полинуклеотидов, кодирующих биохимические каскады из одного или нескольких оперонов или класторов генов или их фрагментов. Например, бактерии и многие эукариоты обладают координированным механизмом регуляции генов, продукты которых вовлечены в связанные процессы. Гены кластеризуются в структурах, называемых кластерами генов, на одной хромосоме и транскрибируются совместно под контролем единой регуляторной последовательности, включая единый промотор, который инициирует транскрипцию целого кластера. Таким образом, кластер генов представляет собой группу соседних генов, которые являются либо идентичными, либо родственными, как правило, в отношении их функции (примером биохимического каскада, кодируемого кластерами генов, являются поликетиды).
В некоторых вариантах осуществления ДНК кластера генов выделяют из различных организмов и лигируют в векторы, в частности в векторы, содержащие регуляторные последовательности для экспрессии, которые могут контролировать и регулировать продукцию поддающегося детекции белка или связанную с белком совокупную активность в лигированном кластере генов. Применение векторов, которые обладают исключительно высокой способностью к введению экзогенной ДНК, является особенно при
- 100 019971 годным для таких кластеров генов и описано в настоящем документе в качестве примера, включая Гфактор (или фактор фертильности) Е.со11. Этот Г-фактор Е.сой представляет собой плазмиду, которая инициирует перенос себя с высокой частотой в процессе конъюгации и является идеальной для получения и стабильного воспроизведения крупных фрагментов ДНК, таких как кластеры генов из смешанных микробных образцов. В одном варианте осуществления используют векторы для клонирования, называемые фосмидами, или векторы искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). Они образованы из Г-фактора Е.сой, который способен стабильно встраивать большие сегменты геномной ДНК. В случае интеграции с ДНК из смешанного некультивированного образца из окружающей среды, это обеспечивает возможность получения больших геномных фрагментов в форме ДНК-библиотеки из окружающей среды. Другим типом вектора для применения по настоящему изобретению является космидный вектор. Космидные векторы изначально были предназначены для клонирования и воспроизведения крупных сегментов геномной ДНК. Клонирование в космидные векторы подробно описано в 8атЬгоок с! а1., Мо1сси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Ε6., Со1б 8рппд НагЬог БаЬогаЮгу Ргсвв (1989). После лигирования в соответствующий вектор в пригодную клетку-хозяина можно вводить два или более векторов, содержащих различные гены синтетазы поликетида. Участки частичной гомологии последовательностей, общие для кластеров генов, обеспечат процессы, которые приведут к реорганизации последовательностей, приводящей к гибридному кластеру генов. Затем новый гибридный кластер генов можно подвергать скринингу в отношении усиленных видов активности, не встречающихся в исходных кластерах генов.
Способы скрининга в отношении различных видов ферментативной активности известны специалистам в данной области и рассмотрены в настоящем описании, см. примеры 1, 2 и 3, ниже. Такие способы можно использовать при выделении полипептидов и полинуклеотидов по этому изобретению.
В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам выявления и выделения альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, или соединений в целях модификации активности этих ферментов с использованием подхода на основе цельных клеток (см. описание ниже). Предполагаемые клоны, кодирующие альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, из библиотеки геномной ДНК, можно подвергать скринингу.
Методологии скрининга и устройства для мониторинга он-лайн
В применении на практике способов по этому изобретению можно использовать различные устройства и методологию, совместно с полипептидами и нуклеиновыми кислотами по этому изобретению, например, для скрининга полипептидов в отношении активности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, для скринига соединений в качестве потенциальных модуляторов, таких как активаторы или ингибиторы, активности ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН, антител, которые связываются с полипептидом по этому изобретению, нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, для скрининга клеток, экспрессирующих полипептид по этому изобретению и т.п. В дополнение к формату матриц, подробно описанному ниже для скрининга образцов, для применения на практике способов по этому изобретению также можно использовать альтернативные форматы. Такие форматы включают, например, масс-спектрометры, хроматографы, например высокопроизводительные ВЭЖХ и другие формы жидкостной хроматографии, и форматы меньших размеров, такие как 1536луночные планшеты, 384-луночные планшеты и т.д. Для применения на практике способов по этому изобретению можно адаптировать и использовать устройства для высокопроизводительного скрининга, см. патентные заявки США №№ 20020001809; 20050272044.
Капиллярные матрицы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по этому изобретению можно иммобилизовывать или наносить на матрицу. Матрицы можно использовать для скрининга или мониторинга библиотек композиций (таких как низкомолекулярные соединения, антитела, нуклеиновые кислоты, и т.д.) в отношении их способности связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по этому изобретению или модулировать их активность. Капиллярные матрицы, такие как ОIОΛМАТВIX™, Ойсгва Согрогайоп, 8ап Эш^о, СА; и матрицы, описанные в, например, патентной заявке США № 20020080350 А1; \У0 0231203 А; \У0 0244336 А, представляют собой альтернативные устройства для хранения и скрининга образцов. В некоторых вариантах осуществления капиллярная матрица включает множество капилляров, составляющих матрицу из смежных капилляров, где каждый капилляр содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для нахождения в нем образца. Просвет может обладать цилиндрической, квадратной, шестиугольной или любой другой геометрической формой, при условии, что стенки формируют просвет для нахождения в нем жидкости или образца. Капилляры капиллярной матрицы могут удерживаться вместе в непосредственной близости с формированием плоской структуры. Капилляры могут быть соединены друг с другом, посредством слияния (например, если капилляры изготовлены из стекла), склеивания, связывания или скрепления бок о бок. Кроме того, капиллярная матрица может включать промежуточный материал, находящийся между соседними капиллярами в матрице, образуя, таким образом, твердое плоское приспособление, содержащее множество сквозных отверстий.
Капиллярная матрица может быть образована любым количеством отдельных капилляров, напри
- 101 019971 мер, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Кроме того, капиллярной матрице приблизительно с 100000 или более отдельных капилляров можно придавать форму планшета МюгоШег® со стандартным размером и формой, для соответствия стандартному лабораторному оборудованию. Просветы заполняют вручную или автоматически с использованием либо капиллярного действия, либо микроинъекций с использованием тонкой иглы. Представляющие интерес образцы можно впоследствии удалять из отдельных капилляров для последующего анализа или охарактеризации. Например, тонкий игольчатый наконечник устанавливают в подвижном соединении с выбранным капилляром либо для добавления, либо для отбора материала из просвета.
В анализе для скрининга в одной емкости перед помещением в капиллярную матрицу компоненты для анализа смешивают с получением представляющего интерес раствора. Просвет вследствие капиллярного действия заполняется, когда по меньшей мере часть матрицы погружают в интересующий раствор. Химические или биологические реакции и/или активность в каждом капилляре подвергают мониторингу в отношении поддающихся детекции событий. Поддающееся детекции событие часто называется хитом, который, как правило, отличают от полученного в капиллярах не хита способами оптического определения. Таким образом, капиллярные матрицы дают возможность множественного параллельного определения хитов.
В скрининговом анализе во множестве емкостей полипептид или нуклеиновую кислоту, такую как лиганд, можно помещать в первый компонент, который вводят по меньшей мере в часть капилляров капиллярной матрицы. Затем после первого компонента в капилляры можно вводить пузырьки воздуха. Затем в капилляры можно вводить второй компонент, где второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Затем первый и второй компоненты можно смешивать применением гидростатического давления с обеих сторон капиллярной матрицы с удалением пузырька. Затем капиллярную матрицу подвергают мониторингу в отношении наличия поддающегося детекции события, возникающего в результате наличия реакции или отсутствия реакции двух компонентов.
В скрининговом анализе связывания представляющий интерес образец можно вводить в капилляр капиллярной матрицы в качестве первой жидкости, меченной поддающимися детекции частицами, где просвет капилляра покрыт связывающим материалом для связывания поддающейся детекции частицы в просвете. Затем первую жидкость можно удалять из капиллярной трубки, при этом связанные поддающиеся частицы остаются в капилляре, и в капиллярную трубку можно вводить вторую жидкость. Затем капилляр подвергают мониторингу в отношении поддающегося детекции события, возникающего в результате наличия или отсутствия реакции частицы со второй жидкостью.
Матрицы или биочипы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по этому изобретению можно иммобилизовывать или наносить на матрицу. Матрицы можно использовать для скрининга или мониторинга библиотек композиций (таких как низкомолекулярные соединения, антитела, нуклеиновые кислоты и т.д.) в отношении их способности связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по этому изобретению или модулировать их активность. Например, в некоторых вариантах осуществления этого изобретения, подлежащим мониторингу параметром является экспрессия транскрипта гена фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМО и/или КОН. Один или несколько или все транскрипты клетки можно определять гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки, или нуклеиновые кислоты, соответствующие или комплементарные транскриптам клетки, гибридизацией с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице, или биочипе. С использованием матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе некоторые или все транскрипты клетки можно одновременно количественно определять. Альтернативно также можно использовать матрицы, содержащие геномную нуклеиновую кислоту, для определения генотипа нового сконструированного штамма, полученного способами по этому изобретению. Также для одновременного количественного определения множества белков можно использовать полипептидные матрицы. Настоящее изобретение можно применять на практике с любой известной матрицей, также называемой микроматрицей или матрицей нуклеиновых кислот, или полипептидной матрицей, или матрицей антител, или биочипом, или с их вариантами. Матрицы представляют собой в общем множество пятен или элементов-мишеней, при этом каждый элемент-мишень включает определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата для специфического связывания молекулы образца, такой как транскрипты мРНК.
Как используют в настоящем документе, термины матрица или микроматрица, или биочип, или чип представляют собой множество элементов-мишеней, при этом каждый элемент-мишень содержит определенное количество одного или нескольких полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата, как более подробно описано ниже.
При применении на практике способов по этому изобретению можно использовать любую известную матрицу и/или способ получения и применения матриц, в целом или частично, или их варианты, как описано, например, в патентах США №№ 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098; 5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854;
- 102 019971
5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; также см., например, №0 99/51773; №0 99/09217; №0 97/46313; №0 96/17958; также см., например, бойпкЮп (1998) Сигг. Бю1. 8:К171-К174; 8сйиттег (1997) Вю1есйпк|иек 23:1087-1092; Кет (1997) Вю1есйпк|иек 23:120-124; 8ойпак-То1бо (1997) Сепек, Сйготокотек & Сапсег 20:399-407; Во\\1е11 (1999) №11иге Сепебск 8ирр. 21:25-32. Также см. опубликованные патентные заявки США №№ 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537;20010008765.
Антитела и способы скрининга на основе антител
Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению. Эти антитела можно применять для выделения, идентификации и количественного определения ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению или сходных полипептидов. Эти антитела можно применять для выделения других полипептидов в пределах объема этого изобретения или других сходных ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Антитела могут быть предназначены для связывания с активным центром фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Таким образом, это изобретение относится к способам ингибирования ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, с использованием антител по этому изобретению (см. описание выше, в отношении применения для композиций против фермента альдолазы, таких как композиции против пируватальдолазы, такие как композиции против альдолазы НМС и/или КСН, по этому изобретению).
Термин антитело включает пептид или полипептид, полученный из, смоделированный после этого, или по существу кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов, или его фрагменты, способные специфично связываться с антигеном или эпитопом, см. Рипбатеп1а1 [ттипо1оду. Тй1гб Ε^ώη, №.Ε. Раи1, еб., Кауеп Ргекк, КУ. (1993); №11коп (1994) I. Iттиηο1. Ме1йобк 175:267-273; Уагтикй (1992) ί. Вюсйет. Вюрйук. Ме1йобк 25:85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие фрагменты, т.е. антигенсвязывающие участки (такие как фрагменты, подпоследовательности, определяющие комплементарность участки (СЭК)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (ί) Рай-фрагмент, одновалентный фрагмент состоящий из доменов УБ, УН, СБ и СН1; (ίί) Р(аЬ')2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рб-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Ρν-фрагмент, состоящий из доменов УБ и УН на одном плече антитела, (ν) бАЬ-фрагмент (№агб е1 а1., (1989) №11иге 341:544546), который состоит из домена УН; и (νί) отдельный определяющий комплементарность участок (СЭК). Одноцепочечные антитела также входят в понятие термина антитело.
Это изобретение относится к фрагментам ферментов по этому изобретению (таким как пептиды), включая иммуногенные фрагменты (такие как подпоследовательности) полипептида по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к композициям, содержащим полипептид или пептид по этому изобретению и адъюванты или носители и т.п.
Антитела можно использовать для иммунопреципитации, окрашивания, в иммуноаффинных колонках и т.п. Если желательно, можно получать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих конкретные антигены, посредством иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на матрице по этому изобретению. Альтернативно способы по этому изобретению можно применять для модификации структуры антитела, продуцируемого клеткой, подлежащей для модификации, например, можно повышать или снижать аффинность антитела. Более того, способность получать или модифицировать антитела может представлять собой полученный способами инженерии фенотип в клетке посредством способов по этому изобретению.
Способы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описаны в научной и патентной литературе, см., например, Сойдап, συΗΗΕΧΊ' РК0Т0С0Б8 Ш IММυNΟ^ΟСΥ, №11еу/Сгеепе, ΧΥ (1991); 8шек (ебк.) ВА8ГС АКБ СБЮТСАБ IММυNΟ^ΟСΥ (7(Н еб.) Бапде Меб1са1 РиЬ11са11опк, Бок АНок, СА (8111ек); Собтд, М0N0СБ0ХЛЕ .-^401101)6:8: РКАСбРЕЮ АПБ РКАСТ^ (2б еб.) Асабетс Ргекк, Хем Υο^к, ΧΥ (1986); Кой1ег (1975) ХаИие 256:495; Наг1ом (1988) ЛNТIВ0^IΕ8, А БАВ0КАТ0ОТ МАШАВ, Со1б 8рппд НагЬог РиЫюайопк, кем Υο^к. В дополнение к традиционным способам ίη νί\Ό с использованием животных антитела также можно получать ίη νίΙΐΌ, например, с использованием библиотек фагового дисплея, экспрессирующих рекомбинантные участки связывания антител. См. НоодепЬоот (1997) Тгепбк Вю1есйпо1. 15:62-70; Ка1х (1997) Аипи. Кем. Вюрйук. Вюто1. 81гисР 26:27-45.
Полипептиды по этому изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, также можно применять для получения антител, которые специфично связываются с полипептидами или фрагментами. Полученные в результате антитела можно использовать в способах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для определения наличия полипептида в биологическом образце. В таких способах препарат белка, такой как экстракт, или биологический образец
- 103 019971 подвергают контактированию с антителом, способным специфично связываться с одним из полипептидов по этому изобретению, или с фрагментами, содержащими по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот.
При иммуноаффинных способах антитела присоединяют к твердой подложке, такой как гранулы или другая матрица колонки. Препарат белка подвергают контактированию с антителом в условиях, при которых антитело специфично связывается с одним из полипептидов по этому изобретению или его фрагментом. После промывания для удаления неспецифично связанных белков элюируют специфично связанные полипептиды.
Способность белков в биологическом образце связываться с антителом можно определять с использованием любого из множества способов, известных специалистам в данной области. Например, связывание можно определять мечением антител поддающейся детекции меткой, такой как флуоресцентное вещество, ферментативная метка или радиоизотоп. Альтернативно детекцию связывания антитела с образцом можно проводить с использованием вторичного антитела, обладающего на нем такой поддающейся детекции меткой. Конкретные способы анализа включают анализы ЕЫЛА, сэндвич-анализы, радиоиммунные анализы и вестерн-блоты.
Поликлональные антитела, образованные против полипептидов по этому изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, можно получать посредством непосредственной инъекции полипептидов животному или введения полипептидов животному, например, не относящемуся к человеку. Полученное таким образом антитело может связывать непосредственно полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующую только фрагмент полипептида, можно использовать для получения антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Затем такие антитела можно использовать для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих этот полипептид.
Для получения моноклональных антител можно использовать любой способ, который приводит к антителам, продуцируемым непрерывными культурами клеточных линий. Их примеры включают способы гибридом (КоЫег апб М11к!е1п, №11иге, 256:495-497, 1975), способ триом, способ В-клеточной гибридомы (КохЬог е! а1., Iттиηο1οду Тобау 4:72, 1983) и способ ЕВУ-гибридомы (Со1е, е! а1., 1985, ш Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек апб Сапсег Тйегару, А1ап В. Ыкк, Ечс., рр.77-96).
Для получения одноцепочечных антител против полипептидов по этому изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, можно адаптировать способы, описанные для получения одноцепочечных антител. Альтернативно для экспрессии гуманизированных антител против этих полипептидов или их фрагментов можно использовать трансгенных мышей.
Антитела, полученные против полипептидов по этому изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот, можно использовать для скрининга аналогичных полипептидов из других организмов и образцов. В таких способах полипептиды из организма подвергают контактированию с антителом и выявляют полипептиды, которые специфично связываются с антителами. Для детекции связывания антитела можно использовать любые из описанных выше способов. Один такой скрининговый анализ описан в Лйи1тап Н., ЕЬегйагб А., ЕЬегйагб С., иШхиг Л., Кетап Е., Вюогд Меб. Сйет. Ье!!. 2000 0с! 16; 10 (20):2353-6, Н1дй1у кепкШте апб гар1б бе!ес!юп о£ апйЬобу са!а1ук1к Ьу 1иттексеп! Ьас!епа.
Наборы
Это изобретение относится к наборам, содержащим композиции, такие как нуклеиновые кислоты, экспрессирующие кассеты, векторы, клетки, трансгенные семена или растения или части растений, полипептиды (такие как фермент альдолаза) и/или антитела по этому изобретению. Также наборы могут содержать инструктивный материал, с указанием методологии и промышленного, медицинского и диетологического применения по этому изобретению, как описано в настоящем документе.
Инженерия цельных клеток и измерение параметров метаболизма
Способы по этому изобретению относятся к изменению цельных клеток, или инженерии цельных клеток, для разработки нового штамма клеток с новым фенотипом, таким как новая модифицированная активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, посредством модификации генетического набора клетки. См. патентную заявку США № 20040033975.
Генетический набор можно модифицировать добавлением в клетку нуклеиновой кислоты по этому изобретению, такой как кодирующая последовательность фермента по этому изобретению. См. \У0 0229032; \\'0 0196551.
Для выявления нового фенотипа в клетке проводят мониторинг по меньшей мере одного параметра метаболизма модифицированной клетки в режиме реального времени или в режиме он-лайн. В некоторых вариантах осуществления множество клеток, таких как клеточная культура, подвергают мониторингу в реальном времени или он-лайн. В некоторых вариантах осуществления множество метаболических параметров подвергают мониторингу в реальном времени или он-лайн. Метаболические параметры можно подвергать мониторингу с использованием ферментов альдолаз, таких как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, по этому изобретению.
- 104 019971
Анализ метаболических изменений (МЕА) основан на известной биохимической концепции. На основе закона сохранения масс и гипотезы квазистационарного состояния (Р88Н) конструируют линейную независимую метаболическую матрицу внутриклеточных метаболитов. При применении способов по этому изобретению устанавливают метаболические сети, включая:
тип всех каскадов субстратов, продуктов и промежуточных соединений, тип всех химических реакций, взаимопревращающих метаболиты каскадов, стереохимию каскадов реакций, тип всех ферментов, катализирующих реакции, кинетику ферментативных реакций, регуляторные взаимодействия между компонентами каскадов, такие как аллостерические взаимодействия, взаимодействия фермент-фермент и т.д., внутриклеточную компартментализацию ферментов или любую другую надмолекулярную организацию ферментов и наличие любого градиента концентрации метаболитов, ферментов или эффекторных молекул, или диффузионных барьеров для их движения.
После построения метаболического каскада для данного штамма, для оценки внутриклеточных метаболических изменений можно включать математическую презентацию по принципу матрицы, если доступны данные метаболома он-лайн. Метаболический фенотип основан на изменениях целого метаболического каскада внутри клетки. Метаболический фенотип основан на изменении использования каскада относительно условий окружающей среды, генетического регулирования, стадии развития и генотипа и т.д. В некоторых вариантах осуществления способов по этому изобретению, после вычисления МЕА он-лайн, динамическое поведение клеток, их фенотип и другие свойства анализируют исследованием использования каскада. Например, если в процессе ферментации дрожжей предоставление глюкозы повышать, а кислорода снижать, использование дыхательных каскадов будет снижаться и/или останавливаться, а использование ферментативных путей будет преобладать. Контроль физиологического состояния клеточной культуры становится возможным после анализа каскадов. Способы по этому изобретению могут помочь определить, каким образом манипулировать ферментацией, посредством определения того, как изменять предоставление субстрата, температуру, применение индукторов и т.д. для контроля физиологического состояния клеток, в целях продвижения в желательном направлении. В применении на практике способов по этому изобретению, результаты МЕА также можно сравнивать с транскриптомными и протеомными данными для разработки экспериментов и протоколов метаболической инженерии или перетасовки генов и т.д.
При применении на практике способов по этому изобретению клетке может быть передан и определен любой модифицированный или новый фенотип, включая новые или улучшенные свойства. Мониторингу можно подвергать любой аспект метаболизма или роста.
Мониторинг экспрессии транскрипта мРНК
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения полученный способами инженерии фенотип включает повышение или снижение экспрессии транскрипта мРНК (такого как транскрипт фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН) или образование новых транскриптов (например, фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН) в клетке. Эту повышенную или сниженную экспрессию можно проследить посредством тестирования в отношении наличия фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, или посредством способов анализа активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Транскрипты мРНК, или элементы информации, также можно выявлять и количественно определять любым способом, известным в данной области, включая, например, нозерн-блот анализ, количественные реакции амплификации, гибридизацию на матрицах и т.п. Количественные реакции амплификации включают, например, количественную ПЦР, включая, например, количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, или ОТ-ПЦР; количественную ОТ-ПЦР в режиме реального времени, или динамическую ОТ-ПЦР в реальном времени (см. Кгеихег (2001) Вг. I. Наета!о1. 114:313-318; Х1а (2001) Тгапкр1ап1абоп 72:907-914).
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения сконструированный фенотип получают посредством нокаута экспрессии гомологичного гена. Можно подвергать нокауту кодирующую последовательность гена или одного или нескольких элементов контроля транскрипции, таких как промоторы или энхансеры. Таким образом, экспрессию транскрипта можно полностью останавливать или только снижать.
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения сконструированный фенотип включает повышение экспрессии гомологичного гена. Этого можно добиться посредством нокаута отрицательного контрольного элемента, включая цис- или транс-регуляторный элемент регуляции транскрипции, или внесение мутации в положительный контрольный элемент. Один или несколько, или все транскрипты клетки можно определять гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, соответствующие или комплементарные транскрипту клетки, с иммобилизованными на матрице нуклеиновыми кислотами.
Анализ экспрессии полипептидов, пептидов и аминокислот
- 105 019971
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения сконструированный фенотип включает повышение или снижение экспрессии полипептида (такого как фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН) или образование новых полипептидов в клетке. Эту повышенную или сниженную экспрессию можно проследить определением количества имеющегося фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН, или способами анализа активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КСН. Полипептиды, пептиды и аминокислоты также можно выявлять и количественно определять любым способом, известным в данной области, включая, например, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спетрофотометрию, радиографию (внесения радиоактивной метки в белок), электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТЬС), сверхдиффузионную хроматографию, различные иммунологические способы, такие как иммунопреципитация, иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез, способы радиоиммунного анализа (ША), способы твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А), иммунофлюоресцентные способы анализа, гельэлектрофорез (например, 8Э8-РАСЕ), окрашивание с помощью антител, активизированную флюоресценцией сортировку клеток (РАС8), пиролитическую масс-спектрометрию, инфракрасную спектрометрию Фурье, Раман-спектрометрию, СС-М8 и способы масс-спектрометрии ЬС-электрораспыления, и кэп-ЬС-тандем-электрораспыления и т.п. Скрининг новых видов биологической активности также можно проводить с использованием способов, или их вариантов, описанных в патенте США № 6057103. Более того, как подробно описано ниже, один или несколько, или все полипептиды клетки можно определять с использованием белковой матрицы.
Промышленные, фармацевтические и другие способы применения
Полипептиды по этому изобретению (например, имеющие альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС) могут катализировать образование или расщепление углеродуглеродных связей. Ферменты по этому изобретению могут представлять собой высокоселективные катализаторы. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к промышленным процессам, использующим ферменты по этому изобретению, например, в фармацевтической промышленности или в промышленности пищевых (диетологических) добавок, в промышленности продуктов питания и кормов, например, в способах изготовления продуктов питания и кормов и добавок в продукты питания и корма. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к процессам, использующим ферменты по этому изобретению в медицинской промышленности, например для изготовления фармацевтических средств или диетологических средств или добавок, или добавок и вспомогательных веществ для продуктов питания.
Превращение биомассы и получение чистого биологического топлива
Это изобретение относится к ферментам, таким как альдолазы, включая пируватальдолазы, такие как, но не ограничиваясь этим, альдолазы НМС и/или КНС (включая смеси, или коктейли ферментов), и к способам превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала (например, любой композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин) в топливо (например, биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, биодизель) с использованием ферментов по этому изобретению, в дополнение к кормам, продуктам питания и химическим веществам. Таким образом, композиции и способы обеспечивают эффективные и надежные альтернативы или дополнения к применению нефтяных продуктов, например, в качестве смеси биоэтанола и газолина. Это изобретение относится к организмам, экспрессирующим ферменты по этому изобретению для участия в химических циклах, вовлекающих превращение природной биомассы. В одном варианте осуществления ферменты и способы превращения применяют в виде набора ферментов для эффективной деполимеризации целлюлозных и гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых углеродных групп. Это изобретение относится к способам выявления и внедрения наиболее эффективных ферментов для обеспечения этого важного нового превращения биомассы и промышленных процессов с альтернативным источником энергии.
Способы по этому изобретению также включают получение превращенного лигноцеллюлозного материала (обработанного ферментами по этому изобретению) и превращение его в топливо (например, биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, биодизель) посредством ферментации и/или химического синтеза. В одном варианте осуществления полученные сахара подвергают ферментации и/или не поддающиеся ферментации продукты газифицируют.
Ферменты по этому изобретению (включая, например, организмы, такие как микроорганизмы, например грибы, дрожжи или бактерии, производящие и в некоторых вариантах осуществления секретирующие рекомбинантные ферменты по этому изобретению) можно применять или включать/добавлять на любой стадии процесса превращения любой биомассы, например, на любой стадии, нескольких стадиях, или их включают во все стадии, или во все из представленных ниже способов превращения биомассы, или всех из этих альтернатив биотоплива.
Прямое сжигание: сжигание материала прямым нагреванием представляет собой наиболее простую технологию биомасс; она может быть высокоэкономичной, если источник биомассы расположен поблизости.
Пиролиз: представляет собой термическую деградацию биомассы посредством нагревания в отсут
- 106 019971 ствие кислорода. В одном варианте осуществления биомассу нагревают до температуры между приблизительно 800 и 1400 градусами по Фаренгейту, однако кислород для поддержания горения не подают, что приводит к образованию газа, жидкого топлива и угля.
Газификация: биомассу можно использовать для образования метана посредством нагревания или анаэробного расщепления. Из биомассы может быть получен синтетический газ, смесь моноксида углерода и водорода.
Газ из органических отходов: получают посредством разложения (анаэробного расщепления) зарытого в землю мусора на свалках. Когда органические отходы разлагаются, они образуют газ, состоящий приблизительно на 50% из метана, основного компонента природного газа.
Анаэробное расщепление: превращает органическое вещество в смесь метана, основного компонента природного газа, и диоксида углерода. В одном варианте осуществления биомассу, такую как водную биомассу (сточные воды), перегной или отходы пищевой промышленности, смешивают с водой и подают в емкость для расщепления без воздуха.
Ферментация.
Спиртовое брожение: спиртовое топливо получают превращением крахмала в сахар, ферментацией сахара в спирт, с последующим разделением водной смеси спирта дистилляцией. Пищевое сырье, такое как пшеница, ячмень, картофель, и бумажные отходы, древесные опилки и солому, содержащие сахар, крахмал или целлюлозу, можно превращать в спирт ферментацией с помощью дрожжей.
Переэтерификация: иллюстративную реакцию превращения масла в биодизель называют переэтерификацией. В процессе переэтерификации происходит реакция спирта (такого как метанол) с триглицеридными маслами, находящимися в растительных маслах, животных жирах или утилизированных смазочных маслах, с образованием алкильных сложных эфиров жирных кислот (биодизеля) и глицерина. Для реакции требуется нагревание и сильноосновный катализатор, такой как гидроксид натрия или гидроксид калия.
Биодизель: биодизель представляет собой смесь алькильных сложных эфиров жирных кислот, изготавливаемую из растительных масел, животных жиров или утилизированных смазочных масел. Биодизель можно применять в качестве топлива для транспортных средств в его чистом виде, однако обычно его используют в качестве дизельной добавки в нефть в целях снижения уровней твердых частиц, моноксида углерода, углеводородов и токсических веществ в воздухе из дизельных транспортных средств.
Гидролиз: включает гидролиз соединения, например, биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, катализируемый с использованием фермента по настоящему изобретению.
Когенерация: представляет собой одновременное получение более чем одной формы энергии с использованием одного топлива и оборудования. В одном варианте осуществления когенерация биомассы обладает большим потенциалом развития, чем выработка энергии из биомассы отдельно, поскольку когенерация приводит как к теплу, так и к электричеству.
В одном варианте осуществления полипептиды по этому изобретению обладают активностью альдолазы, включая активность пируватальдолазы, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы НМО и/или КНО, или другой ферментативной активностью в отношении образования биодизеля, биоэтанола, биобутанола, биопропанола или биометанола из органического материала, например, из биомассы, такой как композиции, образованные из растений и животных, включая любые сельскохозяйственные культуры или другое возобновляемое сырье, сельскохозяйственные отходы или отходы животноводства, или органические компоненты муниципальных и промышленных отходов, или микроорганизмы, такие водоросли или дрожжи. В одном варианте осуществления полипептиды по этому изобретению применяют в процессах превращения лигноцеллюлозной биомассы в этанол, бутанол, пропанол, метанол, или, в ином случае, их применяют в процессах гидролиза или расщепления биоматериалов, чтобы их можно было использовать в качестве биотоплива (включая биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол или биодизель), или для упрощения переработки биомассы в топливо. В альтернативном варианте осуществления полипелтиды по этому изобретению применяют в процессах переэтерификации, при которой происходит реакция спирта (такого как метанол) с триглицеридным маслом, находящимся в растительном масле, животном жире или утилизированных смазочных маслах, с образованием сложных эфиров жирных кислот (биодизеля) и глицерина. В одном варианте осуществления биодизель получают из соевого масла или утилизированного кухонного жира. Животные жиры, другие растительные масла и другие утилизированные масла также можно использовать для получения биодизеля, в зависимости от их стоимости и доступности. В другом варианте осуществления для получения биодизельного топлива по этому изобретению используют смеси жиров и масел всех типов.
Ферменты по этому изобретению также можно использовать при рафинировании глицерина. Побочный продукт глицерина содержит не вступивший в реакцию катализатор и мыла, которые нейтрализуют кислотой. Воду и спирт удаляют с получением от 50 до 80% неочищенного глицерина. Остальные примеси включают не вступившие в реакцию жиры и масла, которые можно обрабатывать с использованием полипептидов по этому изобретению. В больших биодизельных предприятиях по этому изобретению глицерин можно далее очищать, например, до 99% или более высокой чистоты для фармацевтической и косметической промышленности.
- 107 019971
Биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель, полученные с использованием полипептидов по этому изобретению, можно применять с оксигенатами топлива для улучшения характеристик горения. Добавление кислорода приводит к более полному сгоранию, которое снижает выделение монооксида углерода. Это представляет собой другую экологическую пользу замены нефтяного топлива биотопливом (например, топливом по этому изобретению). Биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, и/или биодизель, полученные с использованием композиций и/или способов по этому изобретению, можно смешивать с газолином с образованием смеси Е10 (приблизительно от 5 до 10% этанола и приблизительно от 90 до 95% газолина), однако их можно использовать в более высоких концентрациях, например Е85 или в их чистой форме. Биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель, полученные с использованием композиций и/или способов по этому изобретению, можно смешивать с нефтяным дизелем с получением смеси В20 (20% биодизель и 80% нефтяной дизель), хотя можно использовать другие уровни, вплоть до В100 (чистый биодизель).
Это изобретение также относится к процессам получения этанола (биоэтанола), бутанола (биобутанола), пропанола (биопропанола), метанола (биометанола) и/или дизеля (биодизеля) из композиций, содержащих лигноцеллюлозную биомассу. Материал лигноцеллюлозной биомассы можно получать из сельскохозяйственных культур, в качестве побочного продукта изготовления продуктов питания или кормов, или в качестве лигноцеллюлозных отходов производства, таких как растительные отходы и бумажные отходы. Примеры пригодных растительных источников или растительных отходов для обработки полипептидами по этому изобретению включают золу бурых водорослей, водоросли, зерна, семена, стебли, листья, шелуху, скорлупу, сердцевину кукурузного початка, кукурузную солому, солому, травы (например, аиру голубую, такую как 8огдйабгит пи!апк; или просо, например, виды Ратсит, такие как Ратсит т1гда!ит) и т.п., а также деревья, древесную щепу, древесную массу и древесную стружку. Примеры бумажных отходов, пригодных для обработки полипептидами по этому изобретению, включают выброшенную бумагу для фотокопирования, бумагу для компьютерного принтера, бумагу тетрадей, бумагу блокнотов, машинописную бумагу и т.п., а также газеты, журналы, картон и бумажные упаковочные материалы.
В одном варианте осуществления ферменты и способы по этому изобретению можно применять совместно с более традиционными способами получения этанола, метанола, бутанола, пропанола и/или дизеля из биомассы, например, такими как способы, включающие гидролиз лигноцеллюлозных материалов посредством воздействия на высушенный лигноцеллюлозный материал в реакторе катализатора, содержащего разбавленный раствор сильной кислоты и соль металла; это может снизить энергию активации, или температуру, гидролиза целлюлозы с обеспечением большего выхода сахаров; см., например, патенты США №№ 6660506 и 6423145.
Другой вариант осуществления, который охватывает применение ферментов по этому изобретению, включает гидролиз лигноцеллюлозного материала, содержащего гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнин, посредством проведения стадии первого этапа гидролиза материала в водной среде при температуре и давлении, выбранных для достижения деполимеризации гемицеллюлозы без значительной деполимеризациии целлюлозы до глюкозы. Эта стадия приводит к густой массе, в которой жидкая фаза содержит растворенные моносахариды, образованные при деполимеризации гемицеллюлозы, и твердая фаза содержит целлюлозу и лигнин. Стадия второго этапа гидролиза может включать условия, при которых по меньшей мере основная часть целлюлозы деполимеризуется, такая стадия приводит к жидкой водной фазе, содержащей растворенные/растворимые продукты деполимеризации целлюлозы. См., например, патент США № 5536325. Ферменты по этому изобретению можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного процесса.
Другой вариант осуществления, который охватывает применение ферментов по этому изобретению, включает обработку содержащего лигноцеллюлозу материала биомассы с помощью одной или нескольких стадий гидролиза разбавленной кислотой посредством приблизительно от 0,4 до 2% сильной кислоты, и обработку не вступившего в реакцию твердого лигноцеллюлозного компонента гидролизованного кислотой материала биомассы посредством щелочной делигнификации с образованием предшественников биологически деградируемых термопластов и производных. См., например, патент США № 6409841. Ферменты по этому изобретению можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного процесса.
Другой вариант осуществления, который охватывает применение ферментов по этому изобретению, включает предгидролиз лигноцеллюлозного материала в реакторе для предгидролиза; добавление кислой жидкости к твердому лигноцеллюлозному материалу с образованием смеси; нагревание смеси до температуры реакции; поддержание температуры реакции в течение периода времени, достаточного для фракционирования лигноцеллюлозного материала на растворенную часть, содержащую по меньшей мере приблизительно 20% лигнина из лигноцеллюлозного материала, и твердую фракцию, содержащую целлюлозу; отделение растворенной части от твердой фракции при температуре реакции, или при близкой температуре, где целлюлоза в твердой фракции становится более подверженной ферментативному расщеплению; и выделение растворенной части. См., например, патент США № 5705369. Ферменты по этому изобретению можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного процесса.
Это изобретение относится к способам получения композиций моторного топлива (например, для
- 108 019971 двигателей с электорозажиганием) на основе жидких углеводородов, смешанных с топливным спиртом, изготовленным с использованием фермента или способа по этому изобретению. В одном варианте осуществления топливо, изготовленное с использованием фермента по этому изобретению, содержит, например, смеси конденсированный угарный газ или конденсированный природный газ-этанол, метанол, бутанол, пропанол и/или дизель. В одном варианте осуществления корастворитель представляет собой полученный из биомассы 2-метилтетрагидрофуран (МТНР). См. , например, патент США № 6712866.
В одном варианте осуществления способы по этому изобретению для ферментативной деградации лигноцеллюлозы, например, для продукции этанола из лигноцеллюлозного материала, также могут включать применение ультразвуковой обработки материала биомассы; см., например, патент США № 6333181.
В другом варианте осуществления способы по этому изобретению для получения биоэтанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизеля из целлюлозного субстрата включают предоставление реакционной смеси в форме густой массы, содержащей целлюлозный субстрат, фермент по этому изобретению и средство для ферментации (например, в реакционной емкости, такой как биореактор с полунепрерывной подачей твердых веществ), и реакционную смесь подвергают реакции в условиях, достаточных для инициации и поддержания реакции ферментации (как описано, например, в патентной заявке США № 20060014260). В одном варианте осуществления, с помощью эксперимента или теоретических вычислений, можно определить оптимальную частоту подачи. В одном варианте осуществления в реакционную емкость подают дополнительные количества целлюлозного субстрата и фермента через промежуток(ки) времени, соответствующй(ие) оптимизированной частоте подачи.
Один иллюстративный процесс получения биотоплива (такого как биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол и/или биодизель) по этому изобретению описан в публикациях патентных заявок США №№ 20050069998; 20020164730; и в одном варианте осуществления он включает стадии измельчения лигноцеллюлозной биомассы (например, до размера 15-30 мм), предварительную обработку полученного продукта паровым взрывом (например, при температуре 190-230°С) в течение между 1 и 10 мин в реакторе; сбор предварительно обработанного материала в циклоне или сходном изделии; и разделение жидкой и твердой фракций фильтрацией в фильтре под давлением, подачу твердой фракции в емкость для ферментации и добавление одного или нескольких ферментов по этому изобретению, например, фермента целлюлазы и/или бета-глюкозидазы (например, растворенных в цитратном буфере, рН 4,8).
Другой иллюстративный процесс получения биотоплива (такого как биоэтанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, и/или биодизель) по этому изобретению, включающий применение ферментов по этому изобретению, включает предварительную обработку исходного материала, содержащего лигноцеллюлозное сырье, содержащее по меньшей мере гемицеллюлозу и целлюлозу. В одном варианте осуществления исходный материал включает картофель, сою (рапсовое семя), ячмень, рожь, кукурузу, овес, пшеницу, свеклу или сахарный тростник или компонент, или отходы, или побочный продукт изготовления продуктов питания или кормов. Исходный материал (сырье) подвергают реакции в условиях, при которых нарушается структура растительных волокон, для проведения по меньшей мере частичного гидролиза гемицеллюлозы и целлюлозы. Условия разрушения могут включать, например, воздействие на исходный материал температуры в среднем от 180 до 270°С при рН от 0,5 до 2,5 в течение приблизительно от 5 с до 60 мин; или температуры от 220 до 270°С, при рН от 0,5 до 2,5 в течение от 5 до 120 с, или эквивалентные условия. Это приводит к повышенной подверженности сырья расщеплению ферментом, например, ферментом целлюлазой по этому изобретению. Патент США № 6090595.
Иллюстративные условия гидролиза лигноцеллюлозного материала включают реакции при температурах приблизительно между 30 и 48°С и/или рН приблизительно между 4,0 и 6,0. Другие иллюстративные условия включают температуру приблизительно между 30 и 60°С и рН приблизительно между 4,0 и 8,0.
Ферменты по этому изобретению могут катализировать реакции с высокой стерео-, регио- и хемоселективностью. Фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению можно конструировать, чтобы он функционировал в различных растворителях, действовал при крайних значениях рН (например, высокие значения рН и низкие значения рН), при крайних температурах (например, высокие температуры и низкие температуры), при крайних уровнях содержания солей (например, высокий уровень содержания солей и низкий уровень содержания солей) и катализировал реакции с соединениями, которые являются структурно несходными с его природными, физиологическими субстратами.
Корма и продукты питания или добавки в корма и продукты питания
В дополнение к предоставлению диетологических добавок или вспомогательных веществ, или вспомогательных веществ и добавок в продукты питания, это изобретение также относится к композициям и способам обработки кормов и продуктов питания и добавок в продукты питания и корма человека и животного с использованием полипептида по этому изобретению, такого как белок, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению и/или антитела по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к кормам для животных, продуктам питания и добавкам, содержащим фермент альдола
- 109 019971 зу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению и/или антитела по этому изобретению. Животное может представлять собой любое сельскохозяйственное животное или любое животное.
Добавка в корм для животных по этому изобретению может представлять собой гранулированный ферментный продукт, который можно легко смешивать с компонентами корма. Альтернативно добавки в корм по этому изобретению могут составлять компонент предварительной смеси. Гранулированный ферментный продукт по этому изобретению может быть покрытым или непокрытым. Размер частиц ферментных гранул может быть совместимым с компонентами корма и предварительной смеси. Это обеспечивает безопасный и удобный способ включения ферменты в корма. Альтернативно добавка в корм для животных по этому изобретению может представлять собой стабилизированную жидкую композицию. Она может представлять собой водную или масляную густую массу. См. патент США № 6245546.
Альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по настоящему изобретению, в случае модификации корма или продукта питания, может воздействовать на продукт питания или корм либо ίη νίΙΐΌ (посредством модификации компонентов корма или продуктов питания), либо ίη νί\Ό. Полипептиды по этому изобретению можно добавлять в композиции кормов или продуктов питания.
В некоторых вариантах осуществления фермент по этому изобретению добавляют в сочетании с другим ферментом, таким как бета-галактозидазы, каталазы, лакказы, целлюлазы, другие альдолазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, фитазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеазы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы. Продукты расщепления этих ферментов легче усваиваются животными. Таким образом, фермент альдолаза, такая пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению может обеспечивать доступную энергию корма или продукта питания, или усвояемость продукта питания или корма посредством разрушения целлюлозы.
В других вариантах осуществления фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению можно предоставлять экспрессией ферментов непосредственно в трансгенных кормовых культурах (в качестве, например, трансгенных растений, семян и т.п.), таких как зерна, злаки, кукуруза, соевые бобы, рапсовое семя, люпин и т.п. Как рассмотрено выше, это изобретение относится к трансгенным растениям и клеткам растений, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту экспрессируют, чтобы фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению продуцировался в поддающихся выделению количествах. Фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, можно выделять из любого растения или части растения. Альтернативно растение или часть растения, содержащие рекомбинантный полипептид, можно использовать непосредственно для повышения качества продукта питания или корма, например для повышения питательной ценности, вкусовых качеств и т.д.
В некоторых вариантах осуществления основа для доставки фермента по этому изобретению находится в форме множества отдельных частиц, крупинок или гранул. Под гранулами подразумевают частицы, которые являются прессованными или сжатыми, например, посредством гранулирования, экструзии или аналогичного сжатия в целях удаления воды из основы. Такое прессование или сжатие частиц также обеспечивает сцепление внутри частиц. Например, гранулы можно получать гранулированием зернового субстрата в прессе для гранулирования. Крупинки, полученные таким образом, измельчают или дробят до размера гранул, пригодного для применения в качестве адъюванта в корме для животного. Вследствие того, что сама основа является разрешенной для применения в корме для животного, ее можно использовать в качестве разбавителя для доставки ферментов в корм для животных.
В некоторых вариантах осуществления фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, включенный в основу для доставки фермента по этому изобретению и способы, представляет собой термостабильный фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, как описано в настоящем документе, так что фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС и/или КНС, является устойчивым в процессе изготовления, где для получения гранулированной основы для доставки фермента могут применяться повышенные температуры и/или пар. В процессе переваривания корма, содержащего основу для доставки фермента по этому изобретению, водные пищеварительные соки приведут к высвобождению активного фермента. Также в основу для доставки для высвобождения в водных условиях любого типа можно включать другие типы термостабильных ферментов и питательных добавок, которые являются термостабильными.
В некоторых вариантах осуществления на частицы основы с ферментом наносят покрытие для многих различных целей, таких как добавление вкуса или питательной добавки в корм для животного, за
- 110 019971 медление высвобождения добавок в корма для животных и ферментов в желудочных условиях и т.п. В некоторых вариантах осуществления покрытие наносят для достижения функциональной цели, например, когда является желательным замедление высвобождения фермента из частиц основы или контроль условий, при которых фермент будет высвобождаться. Композиция материала покрытия может быть такой, чтобы оно селективно разрушалось агентом, к которому он является чувствительным (такого как нагревание, кислота или основание, ферменты или другие химические вещества). Альтернативно на частицы основы можно последовательно наносить два или более покрытия, чувствительных к различным таким разрушающим агентам.
Также это изобретение относится к процессу получения высвобождающей фермент основы. В соответствии с этим изобретением процесс включает получение множества отдельных частиц зернового субстрата с размером частиц, пригодным для применения в качестве высвобождающей фермент основы, где частицы содержат фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, кодируемый аминокислотной последовательностью по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления процесс включает сжатие или прессование частиц высвобождающей фермент основы в гранулы, которое, в некоторых вариантах осуществления, наиболее часто проводят гранулированием. Фунгицид и связующее вещество, когда их используют, можно добавлять в любое пригодное время, и в некоторых вариантах осуществления перед гранулированием зернового субстрата их смешивают с зерновым субстратом в требуемых соотношениях. Содержание влаги в сырье пресса для гранулирования в некоторых вариантах осуществления находится в диапазонах, указанных выше в отношении содержания влаги в конечном продукте, и в некоторых вариантах осуществления оно составляет приблизительно 14-15%. В некоторых вариантах осуществления для доведения содержания влаги в сырье до этого уровня влагу добавляют в сырье в форме водного препарата фермента. Температуру в прессе для гранулирования в некоторых вариантах осуществления доводят приблизительно до 82°С посредством пара. Пресс для гранулирования может работать в любых условиях, которые обеспечивают обработку сырья, достаточную для получения гранул. Непосредственно процесс гранулирования является экономичным процессом удаления воды из содержащей фермент композиции.
Композиции и способы по этому изобретению можно применять на практике совместно с введением пребиотиков, которые представляют собой высокомолекулярные сахара, такие как фруктоолигосахариды (Е08); галактоолигосахариды (С08), материал СВА8 (обычно признаваемый безопасным). Эти пребиотики могут метаболизироваться некоторыми пробиотическими молочнокислыми бактериями (ЬАВ). Для большинства кишечных микробов они являются нерасщепляемыми.
Обработка и производство продуктов питания
Это изобретение относится к продуктам питания и кормам, содержащим ферменты по этому изобретению, и способам применения ферментов по этому изобретению для обработки продуктов питания и кормов. Ферменты альдолазы, такие как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению обладают множеством способов применения в пищевой промышленности. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам гидролиза содержащих целлюлозу композиций, включая, например, клетку растений, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку животных, или любое растение или часть растения, или любой продукт питания или корм, отходы производства и т.п.
Например, это изобретение относится к кормам или продуктам питания, содержащим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза НМС и/или КНС, по этому изобретению, например, в корме, жидкости, такой как напиток (такой как фруктовый сок или пиво), хлебе или тесте или хлебном продукте, или напитке (таком как пиво) или в предшественнике напитка (таком как сусло).
Процесс обработки продуктов питания по этому изобретению также может включать применение любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие альдолазы, целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, глюкозидазы, глюзозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, фитазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеазы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы.
Фармацевтические композиции и диетологические добавки
Также это изобретение относится к фармацевтическим композициям и диетологическим добавкам (таким как диетологические вспомогательные вещества), содержащим альдолазу по этому изобретению. Активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, альдолазы НМС и/или КНС. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции и диетологические добавки (такие как диетологические вспомогательные вещества) изготавливают для перорального приема.
Соединения для обработки периодонта могут содержать фермент по этому изобретению, как описано в патенте США № 6776979. Композиции и способы для лечения или профилактики синдрома повышенной кислотности в желудочно-кишечном тракте могут включать фермент по этому изобретению, как
- 111 019971 описано в патенте США № 6468964.
В других вариантах осуществления раневые повязки, имплантаты и т.п. содержат противомикробные (такие как обладающие антибиотическим действием) ферменты, включая фермент по этому изобретению (включая, например, последовательности по этому изобретению). Ферменты по этому изобретению также можно использовать в альгинатных повязках, повязках с противомикробным барьером, повязках для ожогов, компрессионных бинтах, диагностических инструментах, гелевых повязках, гидроселективных повязках, гидропористых (пенистых) повязках, гидроколлоидных повязках, внутривенных повязках, хирургических салфетках, слабо приклеивающихся повязках, поглощающих запах повязках, приклеивающихся бинтах, послеоперационных повязках, повязках для заживления рубцов, для ухода за кожей, прозрачных повязках и/или в повязках для закрытия раны. Ферменты по этому изобретению можно использовать при промывании раны, подготовке раневого дна, для обработки пролежней, язв на ногах, ожогов, диабетических язв стоп, рубцов, внутривенной фиксации, при хирургических ранах и легких ранах. Ферменты по этому изобретению можно применять в стерильных ферментных очищающих рану композициях, таких как мази. В различных вариантах осуществления альдолазу изготавливают в форме таблетки, геля, пилюли, имплантата, жидкости, аэрозоля, пленки, мицеллы, порошка, продукта питания, кормовой гранулы или в качестве инкапсулированного состава.
Фармацевтические композиции и диетологические добавки по этому изобретению также могут включать применение любого сочетания других ферментов, таких как бета-галактозидазы, каталазы, лакказы, целлюлазы, другие альдолазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, беталакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, фитазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеазы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы.
Биосинтетические каскады образования К,К и других стереоизомеров монатина
Как описано, в частности, в \У0 03/091396 А2 (см. фиг. 1-3 и 11-13), монатин можно получать из триптофана посредством многостадийного каскада, вовлекающего биологическое превращение (т.е. облегчение реакции субстрата с образованием продукта с помощью полипептида). Описанный каскад вовлекает биологическое превращение триптофана в индол-3-пируват, биологическое превращение индол3-пирувата в 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту (МР) и биологическое превращение МР в монатин. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по этому изобретению можно применять для облегчения реакции индол-3-пирувата с образованием МР. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по этому изобретению можно применять для предпочтительного облегчения образования Р-МР.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько полипептидов, выбранных из выделенных или рекомбинантных полипептидов 8ΕΟ ΙΌ N0:2, 8Ε0 ΙΌ N0:4, 8Ε0 ΙΌ N0:6, 8Ε0 ΙΌ N0:8, 8Ε0 ΙΌ N0:10, ΞΕΟ ΙΌ N0:12, ΞΕΟ ΙΌ N0:14, ΞΕΟ ΙΌ N0:16, ΞΕΟ ΙΌ N0:18, ΞΕΟ ΙΌ N0:20, ΞΕΟ ΙΌ N0:22, ΞΕΟ ΙΌ N0:24, ΞΕΟ ΙΌ N0:26, ΞΕΟ ΙΌ N0:28, ΞΕΟ ΙΌ N0:30, ΞΕΟ ΙΌ N0:32, ΞΕΟ ΙΌ N0:34, ΞΕΟ ΙΌ N0:36, ΞΕΟ ΙΌ N0:38, ΞΕΟ ΙΌ N0:40, ΞΕΟ ΙΌ N0:42, ΞΕΟ ΙΌ N0:44, ΞΕΟ ΙΌ N0:46, ΞΕΟ ΙΌ N0:48, ΞΕΟ ΙΌ N0:50, ΞΕΟ ΙΌ N0:52, ΞΕΟ ΙΌ N0:54, ΞΕΟ ΙΌ N0:56, ΞΕΟ ΙΌ N0:58, ΞΕΟ ΙΌ N0:60, ΞΕΟ ΙΌ N0:62, ΞΕΟ ΙΌ N0:64, ΞΕΟ ΙΌ N0:66, ΞΕΟ ΙΌ N0:68, ΞΕΟ ΙΌ N0:70, ΞΕΟ ΙΌ N0:72, ΞΕΟ ΙΌ N0:74, ΞΕΟ ΙΌ N0:76, ΞΕΟ ΙΌ N0:78, ΞΕΟ ΙΌ N0:80, ΞΕΟ ΙΌ N0:82, ΞΕΟ ΙΌ N0:84, ΞΕΟ ΙΌ N0:86, ΞΕΟ ΙΌ N0:88, ΞΕΟ ΙΌ N0:90, ΞΕΟ ΙΌ N0:92, ΞΕΟ ΙΌ N0:94, ΞΕΟ ΙΌ N0:96, ΞΕΟ ΙΌ N0:98, ΞΕΟ ΙΌ N0:100, ΞΕΟ ΙΌ N0:102, ΞΕΟ ΙΌ N0:104, ΞΕΟ ΙΌ N0:106, ΞΕΟ ΙΌ N0:108, ΞΕΟ ΙΌ N0:110, ΞΕΟ ΙΌ N0:112, ΞΕΟ ΙΌ N0:114, ΞΕΟ ΙΌ N0:116, ΞΕΟ ΙΌ N0:118, ΞΕΟ ΙΌ N0:120, ΞΕΟ ΙΌ N0:122, ΞΕΟ ΙΌ N0:124, ΞΕΟ ΙΌ N0:126, ΞΕΟ ΙΌ N0:128, ΞΕΟ ΙΌ N0:130, ΞΕΟ ΙΌ N0:132, ΞΕΟ ΙΌ N0:134, ΞΕΟ ΙΌ N0:136, ΞΕΟ ΙΌ N0:138, ΞΕΟ ΙΌ
N0:140, ΞΕΟ ΙΌ N0:142, ΞΕΟ ΙΌ N0:144, ΞΕΟ ΙΌ N0:146, ΞΕΟ ΙΌ N0:148, ΞΕΟ ΙΌ N0:150, ΞΕΟ ΙΌ
N0:152, ΞΕΟ ΙΌ N0:154, ΞΕΟ ΙΌ N0:156, ΞΕΟ ΙΌ N0:158, ΞΕΟ ΙΌ N0:160, ΞΕΟ ΙΌ N0:162, ΞΕΟ ΙΌ
N0:164, ΞΕΟ ΙΌ N0:166, ΞΕΟ ΙΌ N0:168, ΞΕΟ ΙΌ N0:170, ΞΕΟ ΙΌ N0:172, ΞΕΟ ΙΌ N0:174, ΞΕΟ ΙΌ
N0:176, ΞΕΟ ΙΌ N0:178, ΞΕΟ ΙΌ N0:180, ΞΕΟ ΙΌ N0:182, ΞΕΟ ΙΌ N0:184, ΞΕΟ ΙΌ N0:186, ΞΕΟ ΙΌ
N0:188, ΞΕΟ ΙΌ N0:190, ΞΕΟ ΙΌ N0:192, ΞΕΟ ΙΌ N0:194, ΞΕΟ ΙΌ N0:196, ΞΕΟ ΙΌ N0:198, ΞΕΟ ΙΌ
N0:200, ΞΕΟ ΙΌ N0:202, ΞΕΟ ΙΌ N0:204, ΞΕΟ ΙΌ N0:206, ΞΕΟ ΙΌ N0:208, ΞΕΟ ΙΌ N0:210, ΞΕΟ ΙΌ
N0:212, ΞΕΟ ΙΌ N0:214, ΞΕΟ ΙΌ N0:216, ΞΕΟ ΙΌ N0:218, ΞΕΟ ΙΌ N0:220, ΞΕΟ ΙΌ N0:222, ΞΕΟ ΙΌ
N0:224, ΞΕΟ ΙΌ N0:226, ΞΕΟ ΙΌ N0:228, ΞΕΟ ΙΌ N0:230, ΞΕΟ ΙΌ N0:232, ΞΕΟ ΙΌ N0:234, ΞΕΟ ΙΌ
N0:236, ΞΕΟ ΙΌ N0:238, ΞΕΟ ΙΌ N0:240, ΞΕΟ ΙΌ N0:242, ΞΕΟ ΙΌ N0:244, ΞΕΟ ΙΌ N0:246, ΞΕΟ ΙΌ
N0:248, ΞΕΟ ΙΌ N0:250, ΞΕΟ ΙΌ N0:252, ΞΕΟ ΙΌ N0:254, ΞΕΟ ΙΌ N0:256, ΞΕΟ ΙΌ N0:258, ΞΕΟ ΙΌ
N0:260, ΞΕΟ ΙΌ N0:262, ΞΕΟ ΙΌ N0:264, ΞΕΟ ΙΌ N0:266, ΞΕΟ ΙΌ N0:268, ΞΕΟ ΙΌ N0:270, ΞΕΟ ΙΌ
N0:272, ΞΕΟ ΙΌ N0:274, ΞΕΟ ΙΌ N0:276, ΞΕΟ ΙΌ N0:278, ΞΕΟ ΙΌ N0:280, ΞΕΟ ΙΌ N0:282, ΞΕΟ ΙΌ
N0:284, ΞΕΟ ΙΌ N0:286, ΞΕΟ ΙΌ N0:288, ΞΕΟ ΙΌ N0:290, ΞΕΟ ΙΌ N0:292, ΞΕΟ ΙΌ N0:294, ΞΕΟ ΙΌ
N0:296, ΞΕΟ ΙΌ N0:298, ΞΕΟ ΙΌ N0:300, 8Ερ ΙΌ N0:302, 8Ερ ΙΌ N0:304, 8Ερ ΙΌ N0:306, 8Ερ ΙΌ
N0:308, 8ΕΡ ΙΌ N0:310, 8Ερ ΙΌ N0:312, 8Ερ ΙΌ N0:314, 8Ερ ΙΌ N0:316, 8Ερ ΙΌ N0:318, 8Ερ ΙΌ
- 112 019971
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
N0:112, 5ЕР
N0:124, 5ЕР
N0:136, 5ЕР
N0:148, 5ЕР
N0:160, 5ЕР
N0:172, 5ЕР
N0:184, 5ЕР
N0:196, 5ЕР
N0:208, 5ЕР
N0:220, 5ЕР
N0:232, 5ЕР
N0:244, 5Ер
N0:256, 5ЕР
N0:268, 5ЕР
N0:280, 5ЕР
N0:292, 5Ер
N0:304 или их фрагментов, или подпоследовательностей, обладающих активностью
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:114, 5ЕО
N0:126, 5ЕО
N0:138, 5ЕО
N0:150, 5ЕО
N0:162, 5ЕО
N0:174, 5ЕО
N0:186, 5ЕО
N0:198, 5ЕО
N0:210, 5ЕО
N0:222, 5ЕО
N0:234, 5ЕО
N0:246, 5ЕО
N0:258, 5ЕО
N0:270, 5ЕО
N0:282, 5ЕО
N0:294, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:116, 5ЕО
N0:128, 5ЕО
N0:140, 5ЕО
N0:152, 5ЕО
N0:164, 5ЕО
N0:176, 5ЕО
N0:188, 5ЕО
N0:200, 5ЕО
N0:212, 5ЕО
N0:224, 5ЕО
N0:236, 5ЕО
N0:248, 5ЕО
N0:260, 5ЕО
N0:272, 5ЕО
N0:284, 5ЕО
N0:296, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:106, 5ЕО
N0:118, 5ЕО
N0:130, 5ЕО
N0:142, 5ЕО
N0:154, 5ЕО
N0:166, 5ЕО
N0:178, 5ЕО
N0:190, 5ЕО
N0:202, 5ЕО
N0:214, 5ЕО
N0:226, 5ЕО
N0:238, 5ЕО
N0:250, 5ЕО
N0:262, 5ЕО
N0:274, 5ЕО
N0:286, 5ЕО
N0:298, 5ЕО
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:108, 5ЕО
N0:120, 5ЕО
N0:132, 5ЕО
N0:144, 5ЕО
N0:156, 5ЕО
N0:168, 5ЕО
N0:180, 5ЕО
N0:192, 5ЕО
N0:204, 5ЕО
N0:216, 5ЕО
N0:228, 5ЕО
N0:240, 5ЕО
N0:252, 5ЕО
N0:264, 5ЕО
N0:276, 5ЕО
N0:288, 5ЕО
N0:300, 5ЕО
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
N0:320, 5ЕО ΙΌ N0:322, 5ЕО ΙΌ N0:324, 5ЕО ΙΌ N0:326, 5ЕО ΙΌ N0:328, 5ЕО ΙΌ N0:330, 5ЕО ΙΌ N0:332 или 5Е0 ΙΌ N0:334, или их фрагментов или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы, могут быть пригодны для облегчения реакции в многостадийном каскаде образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления полипептиды с активностью альдолазы могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
В другом варианте осуществления один или несколько полипептидов, выбранных из выделенных или рекомбинантных полипептидов с активностью альдолазы НМО по любой из 5Е0 ΙΌ N0:2, 5Е0 ΙΌ N0:4, 5ЕО ΙΌ N0:6, 5ЕО ΙΌ N0:8, 5ЕО ΙΌ N0:10, 5ЕО ΙΌ N0:12, 5ЕО ΙΌ N0:14, 5ЕО ΙΌ N0:16, 5ЕО ΙΌ N0:18, 5ЕО ΙΌ N0:20, 5ЕО ΙΌ N0:22, 5ЕО ΙΌ N0:24, 5ЕО ΙΌ N0:26, 5ЕО ΙΌ N0:28, 5ЕО ΙΌ N0:30, 5ЕО ΙΌ N0:32, 5ЕО ΙΌ N0:34, 5ЕО ΙΌ N0:36, 5ЕО ΙΌ N0:38, 5ЕО ΙΌ N0:40, 5ЕО ΙΌ N0:42, 5ЕО ΙΌ N0:44, 5ЕО ΙΌ N0:46, 5ЕО ΙΌ N0:48, 5ЕО ΙΌ N0:50, 5ЕО ΙΌ N0:52, 5ЕО ΙΌ N0:54, 5ЕО ΙΌ N0:56, 5ЕО ΙΌ N0:58, 5ЕО ΙΌ N0:60, 5ЕО ΙΌ N0:62, 5ЕО ΙΌ N0:64, 5ЕО ΙΌ N0:66, 5ЕО ΙΌ N0:68, 5ЕО ΙΌ N0:70, 5ЕО ΙΌ N0:72, 5ЕО ΙΌ N0:74, 5ЕО ΙΌ N0:76, 5ЕО ΙΌ N0:78, 5ЕО ΙΌ N0:80, 5ЕО ΙΌ N0:82, 5ЕО ΙΌ N0:84, 5ЕО ΙΌ N0:86, 5ЕО ΙΌ N0:88, 5ЕО ΙΌ N0:90, 5ЕО ΙΌ N0:92, 5ЕО ΙΌ N0:94, 5ЕО ΙΌ N0:96, 5ЕО ΙΌ N0:98, 5ЕО ΙΌ N0:100, 5ЕО ΙΌ N0:102, 5ЕО ΙΌ N0:104, 5ЕО N0:110, 5ЕО N0:122, 5ЕО N0:134, 5ЕО N0:146, 5ЕО N0:158, 5ЕО N0:170, 5ЕО N0:182, 5ЕО N0:194, 5ЕО N0:206, 5ЕО N0:218, 5ЕО N0:230, 5ЕО N0:242, 5ЕО N0:254, 5ЕО N0:266, 5ЕО N0:278, 5ЕО N0:290, 5ЕО N0:302, 5ЕО альдолазы, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления полипептиды с активностью альдолазы НМО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
В другом варианте осуществления один или несколько полипептидов, выбранных из выделенных или рекомбинантных полипептидов с активностью альдолазы КНО по любой из 5Е0 ΙΌ N0:306, 5Е0 ΙΌ N0:308, 5ЕО ΙΌ N0:310, 5ЕО ΙΌ N0:312, 5ЕО ΙΌ N0:314, 5ЕО ΙΌ N0:316, 5ЕО ΙΌ N0:318, 5ЕО ΙΌ N0:320, 5ЕО ΙΌ N0:322, 5ЕО ΙΌ N0:324, 5ЕО ΙΌ N0:326, 5ЕО ΙΌ N0:328, 5ЕО ΙΌ N0:330, 5ЕО ΙΌ N0:332 или 5Е0 ΙΌ N0:334, или их фрагментов, или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления полипептиды активностью альдолазы КНО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
Кроме того, один или несколько полипептидов, кодируемых одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, обладающими по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая 5Е0 ΙΌ N0:1, 5Е0 ΙΌ N0:3, 5Е0 ΙΌ N0:5, 5ЕО ΙΌ N0:7, 5ЕО ΙΌ N0:9, 5ЕО ΙΌ N0:11, 5ЕО ΙΌ N0:13, 5ЕО ΙΌ N0:15, 5ЕО ΙΌ N0:17, 5ЕО ΙΌ N0:19, 5ЕО ΙΌ N0:21, 5ЕО ΙΌ N0:23, 5ЕО ΙΌ N0:25, 5ЕО ΙΌ N0:27, 5ЕО ΙΌ N0:29, 5ЕО ΙΌ N0:31, 5ЕО ΙΌ N0:33, 5ЕО ΙΌ N0:35, 5ЕО ΙΌ N0:37, 5ЕО ΙΌ N0:39, 5ЕО ΙΌ N0:41, 5ЕО ΙΌ N0:43, 5ЕО ΙΌ N0:45, 5ЕО ΙΌ N0:47, 5ЕО ΙΌ N0:49, 5ЕО ΙΌ N0:51, 5ЕО ΙΌ N0:53, 5ЕО ΙΌ N0:55, 5ЕО ΙΌ N0:57, 5ЕО ΙΌ N0:59, 5ЕО ΙΌ N0:61, 5ЕО ΙΌ N0:63, 5ЕО ΙΌ N0:65, 5ЕО ΙΌ N0:67, 5ЕО ΙΌ N0:69, 5ЕО ΙΌ N0:71, 5ЕО ΙΌ N0:73, 5ЕО ΙΌ N0:75, 5ЕО ΙΌ N0:77, 5ЕО ΙΌ N0:79, 5ЕО ΙΌ N0:81, 5ЕО ΙΌ N0:83, 5Ер ΙΌ
- 113 019971
N0:85, 8ΕΟ ΙΌ N0:87, 8ΕΟ ΙΌ N0:89, 8ΕΟ ΙΌ N0:91, 8ΕΟ ΙΌ N0:93, 8ΕΟ ΙΌ N0:95, 8ΕΟ ΙΌ N0:97, 8ΕΟ ΙΌ N0:99, 8ΕΟ ΙΌ N0:101, 8ΕΟ ΙΌ N0:103, 8ΕΟ ΙΌ N0:105, 8ΕΟ ΙΌ N0:107, 8ΕΟ ΙΌ N0:109, 8ΕΟ ΙΌ N0:111, 8ΕΟ ΙΌ N0:113, 8ΕΟ ΙΌ N0:115, 8ΕΟ ΙΌ N0:117, 8ΕΟ ΙΌ N0:119, 8ΕΟ ΙΌ N0:121, 8ΕΟ ΙΌ
N0:123, 8ΕΟ ΙΌ N0:125, 8ΕΟ ΙΌ N0:127, 8ΕΟ ΙΌ N0:129, 8ΕΟ ΙΌ N0:131, 8ΕΟ ΙΌ N0:133, 8ΕΟ ΙΌ
N0:135, 8ΕΟ ΙΌ N0:137, 8ΕΟ ΙΌ N0:139, 8ΕΟ ΙΌ N0:141, 8ΕΟ ΙΌ N0:143, 8ΕΟ ΙΌ N0:145, 8ΕΟ ΙΌ
N0:147, 8ΕΟ ΙΌ N0:149, 8ΕΟ ΙΌ N0:151, 8ΕΟ ΙΌ N0:153, 8ΕΟ ΙΌ N0:155, 8ΕΟ ΙΌ N0:157, 8ΕΟ ΙΌ
N0:159, 8ΕΟ ΙΌ N0:161, 8ΕΟ ΙΌ N0:163, 8ΕΟ ΙΌ N0:165, 8ΕΟ ΙΌ N0:167, 8ΕΟ ΙΌ N0:169, 8ΕΟ ΙΌ
N0:171, 8ΕΟ ΙΌ N0:173, 8ΕΟ ΙΌ N0:175, 8ΕΟ ΙΌ N0:177, 8ΕΟ ΙΌ N0:179, 8ΕΟ ΙΌ N0:181, 8ΕΟ ΙΌ
N0:183, 8ΕΟ ΙΌ N0:185, 8ΕΟ ΙΌ N0:187, 8ΕΟ ΙΌ N0:189, 8ΕΟ ΙΌ N0:191, 8ΕΟ ΙΌ N0:193, 8ΕΟ ΙΌ
N0:195, 8ΕΟ ΙΌ N0:197, 8ΕΟ ΙΌ N0:199, 8ΕΟ ΙΌ N0:201, 8ΕΟ ΙΌ N0:203, 8ΕΟ ΙΌ N0:205, 8ΕΟ ΙΌ
N0:207, 8ΕΟ ΙΌ N0:209, 8ΕΟ ΙΌ N0:211, 8ΕΟ ΙΌ N0:213, 8ΕΟ ΙΌ N0:215, 8ΕΟ ΙΌ N0:217, 8ΕΟ ΙΌ
N0:219, 8ΕΟ ΙΌ N0:221, 8ΕΟ ΙΌ N0:223, 8ΕΟ ΙΌ N0:225, 8ΕΟ ΙΌ N0:227, 8ΕΟ ΙΌ N0:229, 8ΕΟ ΙΌ
N0:231, 8ΕΟ ΙΌ N0:233, 8ΕΟ ΙΌ N0:235, 8ΕΟ ΙΌ N0:237, 8ΕΟ ΙΌ N0:239, 8ΕΟ ΙΌ N0:241, 8ΕΟ ΙΌ
N0:243, 8ΕΟ ΙΌ N0:245, 8ΕΟ ΙΌ N0:247, 8ΕΟ ΙΌ N0:249, 8ΕΟ ΙΌ N0:251, 8ΕΟ ΙΌ N0:253, 8ΕΟ ΙΌ
N0:255, 8ΕΟ ΙΌ N0:257, 8ΕΟ ΙΌ N0:259, 8ΕΟ ΙΌ N0:261, 8ΕΟ ΙΌ N0:263, 8ΕΟ ΙΌ N0:265, 8ΕΟ ΙΌ
N0:267, 8ΕΟ ΙΌ N0:269, 8ΕΟ ΙΌ N0:271, 8ΕΟ ΙΌ N0:273, 8ΕΟ ΙΌ N0:275, 8ΕΟ ΙΌ N0:277, 8ΕΟ ΙΌ
N0:279, 8ΕΟ ΙΌ N0:281, 8ΕΟ ΙΌ N0:283, 8ΕΟ ΙΌ N0:285, 8ΕΟ ΙΌ N0:287, 8ΕΟ ΙΌ N0:289, 8ΕΟ ΙΌ
N0:291, 8ΕΟ ΙΌ N0:293, 8ΕΟ ΙΌ N0:295, 8ΕΟ ΙΌ N0:297, 8ΕΟ ΙΌ N0:299, 8ΕΟ ΙΌ N0:301, 8ΕΟ ΙΌ
N0:303, 8ΕΟ ΙΌ N0:305, 8ΕΟ ΙΌ N0:307, 8ΕΟ ΙΌ N0:309, 8ΕΟ ΙΌ N0:311, 8ΕΟ ΙΌ N0:313, 8ΕΟ ΙΌ
N0:315, 8ΕΟ ΙΌ N0:317, 8ΕΟ ΙΌ N0:319, 8ΕΟ ΙΌ N0:321, 8ΕΟ ΙΌ N0:323, 8ΕΟ ΙΌ N0:325, 8ΕΟ ΙΌ
N0:327, 8ΕΟ ΙΌ N0:329, 8ΕΟ ΙΌ N0:331, 8ΕΟ ΙΌ N0:333, 8ΕΟ ΙΌ N0:335, 8ΕΟ ΙΌ N0:336, 8ΕΟ ΙΌ
N0:337 и 8Ε0 ΙΌ N0:338 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов, или их фрагментов или подпоследовательностей, с активностью альдолазы могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
В другом варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМО, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая 8ΕΟ ΙΌ N0:1, 8ΕΟ ΙΌ N0:3, 8ΕΟ ΙΌ N0:5, 8ΕΟ ΙΌ N0:7, 8ΕΟ ΙΌ N0:9, 8ΕΟ ΙΌ N0:11, 8ΕΟ ΙΌ N0:13, 8ΕΟ ΙΌ N0:15, 8ΕΟ ΙΌ N0:17, 8ΕΟ ΙΌ N0:19, 8ΕΟ ΙΌ N0:21, 8ΕΟ ΙΌ N0:23, 8ΕΟ ΙΌ N0:25, 8ΕΟ ΙΌ N0:27, 8ΕΟ ΙΌ N0:29, 8ΕΟ ΙΌ N0:31, 8ΕΟ ΙΌ N0:33, 8ΕΟ ΙΌ N0:35, 8ΕΟ ΙΌ N0:37, 8ΕΟ ΙΌ N0:39, 8ΕΟ ΙΌ N0:41, 8ΕΟ ΙΌ N0:43, 8ΕΟ ΙΌ N0:45, 8ΕΟ ΙΌ N0:47, 8ΕΟ ΙΌ N0:49, 8ΕΟ ΙΌ N0:51, 8ΕΟ ΙΌ N0:53, 8ΕΟ ΙΌ N0:55, 8ΕΟ ΙΌ N0:57, 8ΕΟ ΙΌ N0:59, 8ΕΟ ΙΌ N0:61, 8ΕΟ ΙΌ N0:63, 8ΕΟ ΙΌ N0:65, 8ΕΟ ΙΌ N0:67, 8ΕΟ ΙΌ N0:69, 8ΕΟ ΙΌ N0:71, 8ΕΟ ΙΌ N0:73, 8ΕΟ ΙΌ N0:75, 8ΕΟ ΙΌ N0:77, 8ΕΟ ΙΌ N0:79, 8ΕΟ ΙΌ N0:81, 8ΕΟ ΙΌ N0:83, 8ΕΟ ΙΌ N0:85, 8ΕΟ ΙΌ N0:87, 8ΕΟ ΙΌ N0:89, 8ΕΟ ΙΌ N0:91, 8ΕΟ ΙΌ N0:93, 8ΕΟ ΙΌ N0:95, 8ΕΟ ΙΌ N0:97, 8ΕΟ ΙΌ N0:99, 8ΕΟ ΙΌ N0:101, 8ΕΟ ΙΌ N0:103, 8ΕΟ ΙΌ N0:105, 8ΕΟ ΙΌ N0:107, 8ΕΟ ΙΌ N0:109, 8ΕΟ ΙΌ N0:111, 8ΕΟ ΙΌ N0:113, 8ΕΟ ΙΌ N0:115, 8ΕΟ ΙΌ N0:117, 8ΕΟ ΙΌ N0:119, 8ΕΟ ΙΌ N0:121, 8ΕΟ ΙΌ N0:123, 8ΕΟ ΙΌ N0:125, 8ΕΟ ΙΌ N0:127, 8ΕΟ ΙΌ N0:129, 8ΕΟ ΙΌ N0:131, 8ΕΟ ΙΌ N0:133, 8ΕΟ ΙΌ N0:135, 8ΕΟ ΙΌ N0:137, 8ΕΟ ΙΌ N0:139, 8ΕΟ ΙΌ
N0:141, 8ΕΟ ΙΌ N0:143, 8ΕΟ ΙΌ N0:145, 8ΕΟ ΙΌ N0:147, 8ΕΟ ΙΌ N0:149, 8ΕΟ ΙΌ N0:151, 8ΕΟ ΙΌ
N0:153, 8ΕΟ ΙΌ N0:155, 8ΕΟ ΙΌ N0:157, 8ΕΟ ΙΌ N0:159, 8ΕΟ ΙΌ N0:161, 8ΕΟ ΙΌ N0:163, 8ΕΟ ΙΌ
N0:165, 8ΕΟ ΙΌ N0:167, 8ΕΟ ΙΌ N0:169, 8ΕΟ ΙΌ N0:171, 8Ε0 ΙΌ N0:173, 8Ε0 ΙΌ N0:175, 8Ε0 ΙΌ
N0:177, 8Ε0 ΙΌ N0:179, 8Ε0 ΙΌ N0:181, 8Ε0 ΙΌ N0:183, 8Ε0 ΙΌ N0:185, 8Ε0 ΙΌ N0:187, 8Ε0 ΙΌ
N0:189, 8Ε0 ΙΌ N0:191, 8Ε0 ΙΌ N0:193, 8Ε0 ΙΌ N0:195, 8Ε0 ΙΌ N0:197, 8Ε0 ΙΌ N0:199, 8Ε0 ΙΌ
N0:201, 8Ε0 ΙΌ N0:203, 8Ε0 ΙΌ N0:205, 8Ε0 ΙΌ N0:207, 8Ε0 ΙΌ N0:209, 8Ε0 ΙΌ N0:211, 8Ε0 ΙΌ
N0:213, 8Ε0 ΙΌ N0:215, 8Ε0 ΙΌ N0:217, 8Ε0 ΙΌ N0:219, 8Ε0 ΙΌ N0:221, 8Ε0 ΙΌ N0:223, 8Ε0 ΙΌ
N0:225, 8Ε0 ΙΌ N0:227, 8Ε0 ΙΌ N0:229, 8Ε0 ΙΌ N0:231, 8Ε0 ΙΌ N0:233, 8Ε0 ΙΌ N0:235, 8Ε0 ΙΌ
N0:237, 8Ε0 ΙΌ N0:239, 8Ε0 ΙΌ N0:241, 8Ε0 ΙΌ N0:243, 8Ε0 ΙΌ N0:245, 8Ε0 ΙΌ N0:247, 8Ε0 ΙΌ
N0:249, 8Ε0 ΙΌ N0:251, 8Ε0 ΙΌ N0:253, 8Ε0 ΙΌ N0:255, 8Ε0 ΙΌ N0:257, 8Ε0 ΙΌ N0:259, 8Ε0 ΙΌ
N0:261, 8Ε0 ΙΌ N0:263, 8Ε0 ΙΌ N0:265, 8Ε0 ΙΌ N0:267, 8Ε0 ΙΌ N0:269, 8Ε0 ΙΌ N0:271, 8Ε0 ΙΌ
N0:273, 8Ε0 ΙΌ N0:275, 8Ε0 ΙΌ N0:277, 8Ε0 ΙΌ N0:279, 8Ε0 ΙΌ N0:281, 8Ε0 ΙΌ N0:283, 8Ε0 ΙΌ
N0:285, 8Ε0 ΙΌ N0:287, 8Ε0 ΙΌ N0:289, 8Ε0 ΙΌ N0:291, 8Ε0 ΙΌ N0:293, 8Ε0 ΙΌ N0:295, 8Ε0 ΙΌ
N0:297, 8Ε0 ΙΌ N0:299, 8Ε0 ΙΌ N0:301, 8Ε0 ΙΌ N0:303, 8Ε0 ΙΌ N0:305 на протяжении участка по
- 114 019971 меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3пируватом и источником С3-углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
В другом варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНО, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая 8ЕО ΙΌ N0:307, 8ЕО ΙΌ N0:309, 8ЕО ΙΌ N0:311, 8ЕО ΙΌ N0:313, 8ЕО ΙΌ N0:315, 8ЕО ΙΌ N0:317, 8ЕО ΙΌ N0:319, 8ЕО ΙΌ N0:321, 8ЕО ΙΌ N0:323, 8ЕО ΙΌ N0:325, 8ЕО ΙΌ N0:327, 8ЕО ΙΌ N0:329, 8ЕО ΙΌ N0:331, 8ЕО ΙΌ N0:333, 8ЕО ΙΌ N0:335, 8ЕО ΙΌ N0:336, 8ЕО ΙΌ N0:337 и 8ЕО ΙΌ N0:338 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
Более того, один или несколько полипептидов с активностью альдолазы, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8ЕО ΙΌ N0:1, 8ЕО ΙΌ N0:3, 8ЕО ΙΌ N0:5, 8ЕО ΙΌ N0:7, 8ЕО ΙΌ N0:9, 8ЕО ΙΌ N0:11, 8ЕО ΙΌ N0:13, 8ЕО ΙΌ N0:15, 8ЕО ΙΌ N0:17, 8ЕО ΙΌ N0:19, 8ЕО ΙΌ N0:21, 8ЕО ΙΌ N0:23, 8ЕО ΙΌ N0:25, 8ЕО ΙΌ N0:27, 8ЕО ΙΌ N0:29, 8ЕО ΙΌ N0:31, 8ЕО ΙΌ N0:33, 8ЕО ΙΌ N0:35, 8ЕО ΙΌ N0:37, 8ЕО ΙΌ N0:39, 8ЕО ΙΌ N0:41, 8ЕО ΙΌ N0:43, 8ЕО ΙΌ N0:45, 8ЕО ΙΌ N0:47, 8ЕО ΙΌ N0:49, 8ЕО ΙΌ N0:51, 8ЕО ΙΌ N0:53, 8ЕО ΙΌ N0:55, 8ЕО ΙΌ N0:57, 8ЕО ΙΌ N0:59, 8ЕО ΙΌ N0:61, 8ЕО ΙΌ N0:63, 8ЕО ΙΌ N0:65, 8ЕО ΙΌ N0:67, 8ЕО ΙΌ N0:69, 8ЕО ΙΌ N0:71, 8ЕО ΙΌ N0:73, 8ЕО ΙΌ N0:75, 8ЕО ΙΌ N0:77, 8ЕО ΙΌ N0:79, 8ЕО ΙΌ N0:81, 8ЕО ΙΌ N0:83, 8ЕО ΙΌ N0:85, 8ЕО ΙΌ N0:87, 8ЕО ΙΌ N0:89, 8ЕО ΙΌ N0:91, 8ЕО ΙΌ N0:93, 8ЕО ΙΌ N0:95, 8ЕО ΙΌ N0:97, 8ЕО ΙΌ N0:99, 8ЕО ΙΌ N0:101, 8ЕО ΙΌ N0:103, 8ЕО ΙΌ N0:105, 8ЕО ΙΌ N0:107, 8ЕО ΙΌ N0:109, 8ЕО ΙΌ N0:111, 8ЕО ΙΌ N0:113, 8ЕО ΙΌ N0:115, 8ЕО ΙΌ N0:117, 8ЕО ΙΌ
N0:119, 8ЕО ΙΌ N0:121, 8ЕО ΙΌ N0:123, 8ЕО ΙΌ N0:125, 8ЕО ΙΌ N0:127, 8ЕО ΙΌ N0:129, 8ЕО ΙΌ
N0:131, 8ЕО ΙΌ N0:133, 8ЕО ΙΌ N0:135, 8ЕО ΙΌ N0:137, 8ЕО ΙΌ N0:139, 8ЕО ΙΌ N0:141, 8ЕО ΙΌ
N0:143, 8ЕО ΙΌ N0:145, 8ЕО ΙΌ N0:147, 8ЕО ΙΌ N0:149, 8ЕО ΙΌ N0:151, 8ЕО ΙΌ N0:153, 8ЕО ΙΌ
N0:155, 8ЕО ΙΌ N0:157, 8ЕО ΙΌ N0:159, 8ЕО ΙΌ N0:161, 8ЕО ΙΌ N0:163, 8ЕО ΙΌ N0:165, 8ЕО ΙΌ
N0:167, 8ЕО ΙΌ N0:169, 8ЕО ΙΌ N0:171, 8ЕО ΙΌ N0:173, 8ЕО ΙΌ N0:175, 8ЕО ΙΌ N0:177, 8ЕО ΙΌ
N0:179, 8ЕО ΙΌ N0:181, 8ЕО ΙΌ N0:183, 8ЕО ΙΌ N0:185, 8ЕО ΙΌ N0:187, 8ЕО ΙΌ N0:189, 8ЕО ΙΌ
N0:191, 8ЕО ΙΌ N0:193, 8ЕО ΙΌ N0:195, 8ЕО ΙΌ N0:197, 8ЕО ΙΌ N0:199, 8ЕО ΙΌ N0:201, 8ЕО ΙΌ
N0:203, 8ЕО ΙΌ N0:205, 8ЕО ΙΌ N0:207, 8ЕО ΙΌ N0:209, 8ЕО ΙΌ N0:211, 8ЕО ΙΌ N0:213, 8ЕО ΙΌ
N0:215, 8ЕО ΙΌ N0:217, 8ЕО ΙΌ N0:219, 8ЕО ΙΌ N0:221, 8ЕО ΙΌ N0:223, 8ЕО ΙΌ N0:225, 8ЕО ΙΌ
N0:227, 8ЕО ΙΌ N0:229, 8ЕО ΙΌ N0:231, 8ЕО ΙΌ N0:233, 8ЕО ΙΌ N0:235, 8ЕО ΙΌ N0:237, 8ЕО ΙΌ
N0:239, 8ЕО ΙΌ N0:241, 8ЕО ΙΌ N0:243, 8ЕО ΙΌ N0:245, 8ЕО ΙΌ N0:247, 8ЕО ΙΌ N0:249, 8ЕО ΙΌ
N0:251, 8ЕО ΙΌ N0:253, 8ЕО ΙΌ N0:255, 8ЕО ΙΌ N0:257, 8ЕО ΙΌ N0:259, 8ЕО ΙΌ N0:261, 8ЕО ΙΌ
N0:263, 8ЕО ΙΌ N0:265, 8ЕЦ ΙΌ N0:267, 8ЕЦ ΙΌ N0:269, 8ЕЦ ΙΌ N0:271, 8ЕЦ ΙΌ N0:273, 8ЕЦ ΙΌ
N0:275, 8ЕЦ ΙΌ N0:277, 8ЕЦ ΙΌ N0:279, 8ЕЦ ΙΌ N0:281, 8ЕЦ ΙΌ N0:283, 8ЕЦ ΙΌ N0:285, 8ЕЦ ΙΌ
N0:287, 8ЕЦ ΙΌ N0:289, 8ЕЦ ΙΌ N0:291, 8ЕЦ ΙΌ N0:293, 8ЕЦ ΙΌ N0:295, 8ЕЦ ΙΌ N0:297, 8ЕЦ ΙΌ
N0:299, 8ЕЦ ΙΌ N0:301, 8ЕЦ ΙΌ N0:303, 8ЕЦ ΙΌ N0:305, 8ЕЦ ΙΌ N0:307, 8ЕЦ ΙΌ N0:309, 8ЕЦ ΙΌ
N0:311, 8ЕЦ ΙΌ N0:313, 8ЕЦ ΙΌ N0:315, 8ЕЦ ΙΌ N0:317, 8ЕЦ ΙΌ N0:319, 8ЕЦ ΙΌ N0:321, 8ЕЦ ΙΌ
N0:323, 8ЕЦ ΙΌ N0:325, 8ЕЦ ΙΌ N0:327, 8ЕЦ ΙΌ N0:329, 8ЕЦ ΙΌ N0:331, 8ЕЦ ΙΌ N0:333, 8ЕЦ ΙΌ
N0:335, 8Е0 ΙΌ N0:336, 8ЕЦ ΙΌ N0:337 и 8ЕЦ ΙΌ N0:338, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной ста- 115 019971 дии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:129, 8ΕΟ
N0:141, 8ΕΕ)
N0:153, 8ΕΕ)
N0:165, 8ΕΕ)
N0:177, 8ΕΕ)
N0:189, 8ΕΕ)
N0:201, 8ΕΕ)
N0:213, 8ΕΕ)
N0:225, 8ΕΕ)
N0:237, 8ΕΕ)
N0:249, 8ΕΕ)
N0:261, 8ΕΕ)
N0:273, 8ΕΕ)
N0:285, 8ΕΕ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:131, 8ΕΕ)
N0:143, 8ΕΕ)
N0:155, 8ΕΕ)
N0:167, 8ΕΕ)
N0:179, 8ΕΕ)
N0:191, 8ΕΕ)
N0:203, 8ΕΕ)
N0:215, 8ΕΕ)
N0:227, 8ΕΕ)
N0:239, 8ΕΕ)
N0:251, 8ΕΕ)
N0:263, 8ΕΕ)
N0:275, 8ΕΕ)
N0:287, 8ΕΕ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:133, 8ΕΕ)
N0:145, 8ΕΕ)
N0:157, 8ΕΕ)
N0:169, 8ΕΕ)
N0:181, 8ΕΕ)
N0:193, 8ΕΕ)
N0:205, 8ΕΕ)
N0:217, 8ΕΕ)
N0:229, 8ΕΕ)
N0:241, 8ΕΕ)
N0:253, 8ΕΕ)
N0:265, 8ΕΕ)
N0:277, 8ΕΕ)
N0:289, 8ΕΕ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:135, 8ΕΕ)
N0:147, 8ΕΕ)
N0:159, 8ΕΕ)
N0:171, 8ΕΕ)
N0:183, 8ΕΕ)
N0:195, 8ΕΕ)
N0:207, 8ΕΕ)
N0:219, 8ΕΕ)
N0:231, 8ΕΕ)
N0:243, 8ΕΕ)
N0:255, 8ΕΕ)
N0:267, 8ΕΕ)
N0:279, 8ΕΕ)
N0:291, 8ΕΕ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:137, 8ΕΕ)
N0:149, 8ΕΕ)
N0:161, 8ΕΕ)
N0:173, 8ΕΕ)
N0:185, 8ΕΕ)
N0:197, 8ΕΕ)
N0:209, 8ΕΕ)
N0:221, 8ΕΕ)
N0:233, 8ΕΕ)
N0:245, 8ΕΕ)
N0:257, 8ΕΕ)
N0:269, 8ΕΕ)
N0:281, 8ΕΕ)
N0:293, 8ΕΕ)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
В другом варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМО, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8Ε0 ΙΌ N0:1, 8Ε0 ΙΌ N0:3, 8Ε0 ΙΌ N0:5, 8Ε0 ΙΌ N0:7, 8Ε0 ΙΌ N0:9, 8ΕΕ) ΙΌ N0:11, 8ΕΕ) ΙΌ N0:13, 8ΕΕ) ΙΌ N0:15, 8ΕΕ) ΙΌ N0:17, 8ΕΕ) ΙΌ N0:19, 8ΕΕ) ΙΌ N0:21, 8ΕΕ) ΙΌ N0:23, 8ΕΕ) ΙΌ N0:25, 8ΕΕ) ΙΌ N0:27, 8ΕΕ) ΙΌ N0:29, 8ΕΕ) ΙΌ N0:31, 8ΕΕ) ΙΌ N0:33, 8ΕΕ) ΙΌ N0:35, 8ΕΕ) ΙΌ N0:37, 8ΕΕ) ΙΌ N0:39, 8ΕΕ) ΙΌ N0:41, 8ΕΕ) ΙΌ N0:43, 8ΕΕ) ΙΌ N0:45, 8ΕΕ) ΙΌ N0:47, 8ΕΕ) ΙΌ N0:49, 8ΕΕ) ΙΌ N0:51, 8ΕΕ) ΙΌ N0:53, 8ΕΕ) ΙΌ N0:55, 8ΕΕ) ΙΌ N0:57, 8ΕΕ) ΙΌ N0:59, 8ΕΕ) ΙΌ N0:61, 8ΕΕ) ΙΌ N0:63, 8ΕΕ) ΙΌ N0:65, 8ΕΕ) ΙΌ N0:67, 8ΕΕ) ΙΌ N0:69, 8ΕΕ) ΙΌ N0:71, 8ΕΕ) ΙΌ N0:73, 8ΕΕ) ΙΌ N0:75, 8ΕΕ) ΙΌ N0:77, 8ΕΕ) ΙΌ N0:79, 8ΕΕ) ΙΌ N0:81, 8ΕΕ) ΙΌ N0:83, 8ΕΕ) ΙΌ N0:85, 8ΕΕ) ΙΌ N0:87, 8ΕΕ) ΙΌ N0:89, 8ΕΕ) ΙΌ N0:91, 8ΕΕ) ΙΌ N0:93, 8ΕΕ) ΙΌ N0:95, 8ΕΕ) ΙΌ N0:97, 8ΕΕ) ΙΌ N0:99, 8ΕΕ) ΙΌ N0:101, 8ΕΕ) ΙΌ N0:103, 8ΕΕ) ΙΌ N0:105, 8ΕΕ) ΙΌ N0:107, 8ΕΕ) ΙΌ N0:109, 8ΕΕ) ΙΌ N0:111, 8ΕΕ) ΙΌ N0:113, 8ΕΕ) ΙΌ N0:115, 8ΕΕ) ΙΌ N0:117, 8ΕΕ) ΙΌ N0:119, 8ΕΕ) ΙΌ N0:121, 8ΕΕ) ΙΌ N0:123, 8ΕΕ) ΙΌ N0:125, 8ΕΕ) ΙΌ N0:127, 8ΕΕ) N0:139, 8ΕΕ) N0:151, 8ΕΕ) N0:163, 8ΕΕ) N0:175, 8ΕΕ) N0:187, 8ΕΕ) N0:199, 8ΕΕ) N0:211, 8ΕΕ) N0:223, 8ΕΕ) N0:235, 8ΕΕ) N0:247, 8ΕΕ) N0:259, 8ΕΕ) N0:271, 8ΕΕ) N0:283, 8ΕΕ)
N0:295, 8ΕΕ) ΙΌ N0:297, 8ΕΕ) ΙΌ N0:299, 8ΕΕ) ΙΌ N0:301, 8ΕΕ) ΙΌ N0:303, 8ΕΕ) ΙΌ N0:305, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
В другом варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНО, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8Ε0 ΙΌ N0:307, 8Ε0 ΙΌ N0:309, 8Ε0 ΙΌ N0:311, 8Ε0 ΙΌ
N0:313, 8ΕΕ) ΙΌ N0:315, 8ΕΕ) ΙΌ N0:317, 8ΕΕ) ΙΌ N0:319, 8ΕΕ) ΙΌ N0:321, 8ΕΕ) ΙΌ N0:323, 8ΕΕ) ΙΌ
N0:325, 8ΕΕ) ΙΌ N0:327, 8ΕΕ) ΙΌ N0:329, 8ΕΕ) ΙΌ N0:331, 8ΕΕ) ΙΌ N0:333, 8ΕΕ) ΙΌ N0:335, 8ΕΕ) ΙΌ
N0:336, 8Ε0 ΙΌ N0:337 и 8Ε0 ΙΌ N0:338, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол3-пируватом и источником С3-углерода в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний. В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНО могут быть пригодны для облегчения реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР в качестве одной стадии многостадийного каскада образования продукта, выбранного из монатина, производных монатина, их солей и их сочетаний.
Полипептиды с активностью альдолазы, описанные в настоящем документе, могут быть пригодны для облегчения реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода. Источник С3-углерода может представлять собой, но не ограничиваться ими, оксалоацетат, пируват или производное пирувата, такое как фосфоенолпируват. В одном варианте осуществления источник С3-углерода представляет собой пируват.
Иллюстративные ферменты, пригодные для превращения продукта реакции между индол-3пируватом и источником С3-углерода в монатин, включают члены классов ферментов: триптофанаминотрансферазы (2.6.1.27), триптофандегидрогеназы (1.4.1.19), дегидрогеназы Ό-аминокислот (1.4.99.1), глутаматдегидрогеназы (1.4.1.2-4), фенилаланиндегидрогеназы (ЕС 1.4.1.20), триптофанфенилпируваттрансаминазы (2.6.1.28), или, в более общем случае, члены семейства аминотрансфераз (2.6.1.-), такие как аспартатаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), тирозин(ароматическая)аминотрансфераза (2.6.1.5), Όтриптофанаминотрансфераза или Ό-аланинаминотрансфераза (2.6.1.21) (см. фиг. 2 \У0 03/091396 А2). Также эту реакцию можно проводить с использованием химических реакций. Аминирование кетокислоты (МР) проводят посредством восстановительного аминирования с использованием аммиака и цианоборгидрида натрия. На фиг. 11-13 \У0 03/091396 А2 представлены дополнительные полипептиды, кото
- 116 019971 рые можно использовать для превращения МР в монатин, а также для обеспечения повышенного выхода монатина из индол-3-пирувата или триптофана. В одном варианте осуществления эти ферменты используют для катализа превращения МР, продукта реакции между индол-3-пируватом и пируватом, в монатин.
Вкусовой профиль композиции монатина можно изменять посредством контроля относительного количества различных стереоизомеров монатина в композиции. Настоящее описание относится к каскадам и веществам для получения композиций монатина с требуемым процентным количеством В,Вмонатина и/или 8,В-монатина.
На хиральность соединений монатина, образующихся посредством описанных каскадов, можно влиять посредством как рН, так и полипептидов, используемых для биологических превращений. Полипептиды с активностью альдолазы, описанные в настоящем документе, можно применять для регуляции хиральности углерода-2 монатина (см. формулу I, выше) в реакции, в которой индол-3-пируват превращается в МР.
После образования продукта реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода, можно стереоспецифично добавлять аминогруппу. Можно получать либо В-, либо 8-конфигурацию углерода-4 (см. формулу I, выше), в зависимости от применения аминотрансферазы Ό- или Ь-ароматической кислоты. Многие аминотрансферазы являются специфичными в отношении Ь-изомера, однако в некоторых растениях существуют Ό-триптофанаминотрансферазы (КоЫЬа апб Мйо, Ртосеебтдк о£ !йе 8!й 1п!егпа!1опа1 8утрокшт оп Уйатт В6 апб СагЬопу1 Са!а1ук1к, Окака, 1арап 1990). Более того, были идентифицированы Ό-аланинаминотрансферазы (2.6.1.21), Ό-метионинпируватаминотрансферазы (2.6.1.41) и как (В)-3-амино-2-метилпропаноатаминотрансфераза (2.6.1.61), так и (8)-3-амино-2-метилпропаноатаминотрансфераза (2.6.1.22), и Ό-фенилглицинаминотрансфераза. Некоторые аминотрансферазы могут быть подходящими только для субстрата этой реакции с конкретной конфигурацией С2-углерода. Таким образом, даже если превращение в продукт реакции между индол-3-пируватом и источником С3-углерода не является стереоспецифичным, стереохимию конечного продукта можно контролировать посредством соответствующего выбора аминотрансферазы. Поскольку реакции являются обратимыми, не вступивший в реакцию продукт (нежелательный изомер) можно повторно превращать обратно в его составляющие, и рацемическую смесь продукта реакции можно преобразовывать.
Пример пригодного донора амино для добавления аминогруппы к продукту реакции между индол3-пируватом и источником С3-углерода включает, но не ограничивается ими, аминокислоту, такую как аланин, аспартат, лизин, глутамат, глицин и триптофан.
При рассмотрении фигур следует отметить следующее. На блок-схеме показаны каскады образования монатина, но они не ограничиваются конкретным способом применения каскадов на практике. Например, каскады можно применять на практике ш νίνο, ш νί!το или в сочетании.
Более того, применение на практике каскадов не требует, чтобы специалист предоставлял каждый из указанных компонентов (таких как участвующие в реакции вещества и ферменты), при условии предоставления достаточных компонентов или источников компонентов и условий реакции, чтобы каскад потенциально мог протекать. Иными словами, например, если на фигуре представлен процесс образования композиции монатина, который включает образование индол-3-пирувата из Ь-триптофана, образование 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (предшественника монатина или МР) из индол-3-пирувата и образование монатина из МР, где каждую реакцию облегчают посредством соответствующего фермента, подразумевается, что применение на практике этого каскада включает комбинирование Ь-триптофана с α-кетоглутаратом и ферментами, предназначенными для облегчения указанных реакций, и в условиях, пригодных для протекания каждой из реакций, также без прямого предоставления индол-3-пирувата или МР. В таком случае Ь-триптофан может реагировать с α-кетоглутаратом с образованием индол-3-пирувата. С помощью установленных условий и предоставленного фермента индол-3-пируват, образующийся в реакции Ь-триптофана, может вступать в реакцию с образованием МР, а затем, с помощью установленных условий и предоставленного фермента, МР, образующийся в реакции индол-3-пирувата, может вступать в реакцию с образованием монатина.
Также следует отметить, что применение на практике представленных каскадов не требует точного предоставления специалистом исходных материалов или ферментов. Иными словами, подразумевается, что применение на практике любого из каскадов, в которых Ь-триптофан указан в качестве исходного материала, будет включать предоставление соединения, которое может образовывать Ь-триптофан, в условиях, пригодных для образования Ь-триптофана, и комбинирование этого соединения с ферментами, способными облегчать серии указанных реакций в условиях, которые могут быть пригодны для протекания этих реакций. В качестве другого примера также подразумевается, что применение на практике указанного каскада будет включать предоставление микроорганизма, созданного способами генетической инженерии, чтобы он продуцировал монатин по этому изобретению в соответствии с описанным каскадом, и обеспечение пригодных условий для протекания процесса ферментации. Например, микроорганизм, который естественным образом продуцирует большие количества Ь-триптофана, можно преобразовывать способами генетической инженерии для продукции или сверхпродукции одного или несколь
- 117 019971 ких из ферментов, используемых для облегчения реакций в каскаде образования монатина, и можно обеспечить пригодные условия, чтобы микроорганизм посредством этого мог продуцировать монатин.
На фиг. 1 указан конкретный вариант осуществления, где К-специфичная альдолаза облегчает реакцию индол-3-пирувата и пирувата с образованием К-МР. На блок-схеме фиг. 1 схематично представлен процесс по этому изобретению для получения композиции монатина, включающей К,К-монатин. Как представлено на фиг. 1, полный каскад вовлекает реакцию триптофана с образованием индол-3-пирувата, реакцию индол-3-пирувата с образованием МР и реакцию МР с образованием монатина, включая К,Кмонатин.
Кроме того, на фиг. 1 представлены определенные перестановки в этом полном каскаде, предназначенные для повышения продукции К,К-формы монатина за счет 8,8-, К,8- и 8,К-форм монатина. В частности, на фиг. 1 представлен вариант осуществления, где: фермент аминотрансфераза, используемый в реакции Ь-триптофана, обладает большей активностью и/или специфичностью в отношении этой реакции относительно реакций МР и 48-монатина, или оксидаза обладает большей активностью и/или специфичностью в отношении Ь-триптофана, чем в отношении 4К-монатина; фермент, который облегчает реакцию индол-3-пирувата, представляет собой полипептид с активностью альдолазы, описанный в настоящем документе, и, фермент, который облегчает реакцию МР, представляет собой Б-фермент с широкой специфичностью, предпочтительно измененный для более эффективной работы с К-изомером МР.
Также на фиг. 1 представлены конкретные перестановки, предназначенные для обеспечения более экономичного получения К,К-монатина. Например, на фиг. 1, Ь-триптофан - в противоположность Бтриптофану или сочетаниям Ь- и Б-триптофана - указан в качестве исходного материала. Несмотря на то что выбор конкретной формы триптофана не влияет на хиральность конечных соединений монатина в композиции монатина (поскольку реакция триптофана приводит к индол-3-пирувату, который не обладает хиральностью), может быть предпочтительным применение Ь-триптофана в качестве исходного материала по меньшей мере по тому, что Ь-триптофан в настоящее время является менее дорогостоящим и его легче получать, чем Б-триптофан.
Далее, обращая внимание на первую реакцию, представленную на фиг. 1, где триптофан превращается в индол-3-пируват, любой один или несколько из альфа-кетоглутарата, оксалоацетата и пирувата вступают в реакцию с образованием аминокислоты (глутамата, аспартата и аланина, соответственно). На фиг. 1 представлен вариант осуществления, где исходный материал триптофана представляет собой Ьтриптофан, и альфа-кетоглутарат, оксалоацетат и/или пируват приводят к форме Ь-изомера аминокислоты (такой как Ь-глутамат, Ь-аспартат и/или Ь-аланин, соответственно).
Как показано на фиг. 1, подход для повышения образования К,К-монатина вовлекает облегчение реакции Ь-триптофана с помощью фермента, обладающего большей специфичностью, большей активностью, или и тем и другим, в отношении триптофана в противоположность МР или монатину, и облегчение реакции МР с помощью Б-фермента. Как описано в \У0 03/091396 А2, некоторые ферменты могут облегчать реакцию триптофана с образованием индол-3-пирувата, а также реакцию аминирования МР с образованием монатина. Применение Ь-аминотрансферазы на стадии аминирования приводит к созданию 8-хирального центра в положении С-4 монатина, в то время как применение Б-фермента приводит к созданию Б-хирального центра в положении С-4 монатина. Таким образом, в случае, когда Ьаминотрансфераза, которая облегчает реакцию триптофана, также является активной в реакции МР, может образовываться К,8- и 8,8-монатин, В зависимости от формы имеющегося МР. Кроме того, некоторые другие ферменты - оксидазы Ь-аминокислот - могут не только облегчать реакцию триптофана в индол-3-пируват, однако они могут обладать побочной активностью в отношении деградации К,Кмонатина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эту побочную активность в отношении 4К минимизируют или устраняют. Побочная активность оксидазы в отношении 48-форм монатина может снизить или мизимизировать их содержание в конечном продукте и может быть желательной, в зависимости от требуемой конечной композиции. Таким образом, чем большей является специфичность и/или активность выбранного Ь-фермента в отношении триптофана относительно МР или монатина, тем большим является количество образующегося К,К- и 8,К- относительно 8,8- и К,8-монатина.
Пригодные ферменты для реакции триптофана, в соответствии с вариантом осуществления, представленные на фиг. 1, включают: Ь-аминотрансферазы, способные облегчать реакцию Ь-триптофана с образованием индол-3-пирувата и обладающие большей специфичностью в отношении этой реакции по сравнению с реакцией К-МР с образованием 4К-изомеров монатина; и оксидазы Ь-аминокислот, способные облегчать реакцию Ь-триптофана с образованием индол-3-пирувата и обладающие большей специфичностью и/или активностью в отношении этой реакции относительно реакции 4К-изомеров монатина с образованием МР, и функциональные эквиваленты любого из указанных выше. Более конкретно, неограничивающие примеры пригодных ферментов могут быть выбраны из Ь-триптофанаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.27) и тирозин(ароматической)аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.5) и оксидазы Ь-аминокислот (ЕС 1.4.3.2), и мутантные формы, образованные из ферментов, обладающих активностью аспартатаминотрансферазы.
В примере 16 указан конкретный фермент, мутантный полипептид НΕXакрС, который включает замену Рго 9 на Туг и замену Агд 122 на О1у, пригодный для облегчения реакций Ь-триптофана и α-КО,
- 118 019971 оксалоацетата, пирувата или их сочетаний с образованием индол-3-пирувата и Ь-глутамата, Ь-аспартата и Ь-аланина соответственно. Другой конкретный фермент, обладающий ограниченной активностью, представляет собой Та1А, Ь-триптофанаминотрансферазу из 8. теШоб. Другие ферменты, пригодные для реакции триптофана, в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления каскада, представленного на фиг. 1, включают ферменты со следующими характеристиками: фермент, который осуществляет переаминирование МР с уровнем 1/10 или менее относительно уровня для Ь-триптофана, как в примере 16, или фермент, который при применении с рацемазой, как в примере 18, приводит более чем к 90% 4К-изомеров монатина.
Примеры ферментов, не обладающих большей специфичностью в отношении превращения Ьтриптофана в индол-3-пируват по сравнению с превращением МР в монатин, включают: НЕХАкрС (пример 16), аминотрансферазу с широкой специфичностью Ьещбташа та)ог (\У0 03/091396 А2), свиную аминотрансферазу (\У0 03/091396 А2) и Та1А КбобоЬас1ет крйаегойек (пример 18). Однако эти ферменты можно изменять, например, посредством мутагенеза, чтобы они обладали ограниченной активностью в отношении К-МР и/или К,К-монатина относительно триптофана.
Далее, обращая внимание на вторую реакцию, указанную на фиг. 1, выбор фермента для облегчения реакции индол-3-пирувата в МР влияет на относительное количество образующегося К,К-монатина относительно 8,К-монатина. Как правило, чем большим является относительное количество образующегося К-МР относительно 8-МР, тем большим является относительное количество образующегося К,Кмонатина относительно 8,К-монатина (когда Ό-фермент облегчает реакцию МР в монатин). Когда является желательной композиция монатина, обладающая К,К-формой монатина в качестве ее единственного компонента, представляющего собой монатин, следует использовать фермент, который приводит к селективному образованию К-МР в противоположность 8-МР (К-специфичный фермент). Полипептиды с активностью альдолазы, описанные в настоящем документе, являются пригодными для селективного образования К-МР, в противоположность 8-МР. Несколько примеров высоко К-специфичных ферментов альдолаз представлены в таблице 1, выше, в примерах 4, 5 и 6, ниже, и в списке последовательностей.
Далее, обращая внимания на последнюю стадию каскада, указанного на фиг. 1, представлена реакция К-МР с образованием К,К-монатина, облегчаемая Ό-аминотрансферазой с широкой специфичностью, например, Ό-аланинаминотрансферазой (Е.С. 2.6.1.21, также известной как аминотрансфераза Όаминокислоты или Ό-аспартатаминотрансфераза) или дегидрогеназой Ό-аминокислоты. Как рассмотрено выше, превращение МР в монатин представляет собой реакцию аминирования, которая приводит к созданию хирального центра в атоме С-4-углерода монатина. Когда желательной является К-хиральная форма в положении С-4, следует использовать ферменты, которые приводят к образованию Кхиральных центров в аминокислотах.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, Ό-аминотрансфераза обладает большей специфичностью, большей активностью, или и тем и другим, в отношении К-МР, чем в отношении индол-3-пирувата. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, Ό-аминотрансфераза обладает ограниченной активностью в отношении индол-3-пирувата. Ферменты с такими характеристиками можно изменять или подвергать мутации по сравнению с существующими ферментами, например, как показано в примере 16.
В примерах с 9 по 12 проиллюстрировано получение К,К-монатина из Ό-триптофана.
На фиг. 2 представлен способ получения К,К-монатина и 8,К-монатина. В то время как в варианте осуществления, представленном на фиг. 1, альдолаза, используемая в реакции индол-3-пирувата с образованием К-МР, влияет на соотношение образующихся К,К:8,К, в варианте осуществления, представленном на фиг. 2, О-фермент, который облегчает превращение МР в монатин, влияет на соотношение образующихся К,К:8,К. В соответствии с каскадом фиг. 2, если для облегчения превращения индол-3пирувата в МР используют нестереоспецифичный фермент, тогда могут образовываться как 8-МР, так и К-МР. Если для превращения индол-3-пирувата в МР используют нестереоспецифичную альдолазу, тогда необходима стереоселективная трансаминаза для превращения МР либо в К,К-монатин, либо в 8,Кмонатин. Как показано на фиг. 2, применение Ό-аминотрансферазы или дегидрогеназы О-аминокислот, которые являются стереоспецифичными мониторингу в отношении К-МР, приводит к образованию К,Кмонатина.
На фиг. 3 представлен другой альтернативный каскад для направления в сторону образования К,Кмонатина. Каскад фиг. 3 представляет собой модификацию каскада фиг. 1, где индол-3-пируват получают непрямым способом, вместо прямого способа, из Ь-триптофана. Более конкретно, Ь-триптофан превращают в О-триптофан, а затем О-триптофан превращают в индол-3-пируват.
Превращение Ь-триптофана в О-триптофан можно облегчать посредством триптофанрацемазы или ее функционального эквивалента. В примере 15 представлены потенциальные источники триптофанрацемазы и способы скрининга в целях идентификации таких ферментов. Также подразумевается, что триптофанрацемазу можно изменять (например, посредством мутагенеза или рекомбинантной инженерии) для улучшения работы по сравнению с существующей рацемазой аминокислот.
Неограничивающие примеры триптофанрацемаз включают гомологи или мутантные формы раце
- 119 019971 маз аминокислот (ЕС 5.1.1.-), например серинрацемазы, где гомологи или мутантные формы способны превращать Ь-триптофан в Ό-триптофан. Неограничивающие примеры источников, из которых могут быть получены рацемазы аминокислот, включают: микроорганизмы, такие как 8а1тоие11а 1урЫтштит, ЕксйепсЫа сой, ВасШик киЬййк, Ркеийотоиак аегидтока, У1Ьпо сйо1егае, 8сЫ/окассагоусек ротЬе, Васй1ик сегеик, Ейегососснк цаШиагнт, Рейюсоссик рейокасеик, ВасШик ритйик, ЙасЮЬасШик Гегтеий, йасЮЬасШик Ьгеу1к, Ацийех ругорШик, ЬайоЬасШц 81гер1ососснк, АиаЬаеиа кр., Ркеийотоиак к1па1а, Ьеийиик ейойек, 8сарйагса ЬгопНЮий Оекн1Гнгоососснк кр., Тйегтососсик кр. и Ркеийотоиак к1па1а. Дополнительные неограничивающие примеры источников, из которых может быть получена рацемаза аминокислот, включают тутовый шелкопряд, головной мозг крысы или головной мозг мыши.
Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых могут быть получены пригодные триптофанрацемазы, включают: микроорганизмы, такие как Ркеийотоиак, например Ркеийотоиак сЫогогарйк (Ркеийотоиак аигегеоГааеик) (АТСС 15926) и Вигк1ю1йепа руггоаиа (АТСС15958). Дополнительные неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых могут быть получены триптофанрацемазы, включают растения, например растения табака, такие как Жсойаиа 1аЬасит, растения пшеницы, такие как Тпйсит аекйуит, сахарную свеклу, томаты и 8с1егосЫ1ои Шсйо1шк.
Каскад, представленный на фиг. 3, обладает определенными преимуществами, включая то, что даже когда требуемым продуктом является В,В-монатин, для реакции образования индол-3-пирувата можно использовать тот же фермент, что и для реакции образования монатина. Таким образом, в каскаде, представленном на фиг. 1, Ь-аминотрансфераза (или пригодный Ь-фермент) облегчает реакцию образования индол-3-пирувата, однако Ό-аминотрансфераза облегчает реакцию образования монатина. В противоположность каскаду фиг. 3, определенная Ό-аминотрансфераза, которая облегчает реакцию образования индол-3-пирувата, также может облегчать реакцию образования монатина. Таким образом, в каскадах фиг. 3 могут быть предпочтительными Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью, где для реакции образования индол-3-пирувата является желательным применение того же фермента, что и для реакции образования монатина. В противоположность этому в каскадах фиг. 1, 2, 4, 6, 7 и 8 получение монатина можно проводить более эффективно, выбирая Ό-аминотрансферазу, которая обладает ограниченной активностью и/или специфичностью в отношении индол-3-пирувата по сравнению с В-МР.
Другим преимуществом каскада, схематично представленного на фиг. 3, является то, что представляющий собой аминокислоту продукт реакции, сопряженной с реакцией образования индол-3-пирувата, далее можно использовать в качестве исходного материала в реакции, сопряженной с реакцией образования монатина. Таким образом, в каскаде, представленном на фиг. 1, Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата, и в то же время оксалоацетат, альфа-кетоглутарат и/или пируват вступают в реакцию с образованием Ь-аминокислоты. Поскольку реакция В-МР с образованием монатина сопряжена с реакцией, в которой в качестве субстрата используется Ό-аминокислота, Ь-аминокислота реакции образования индол-3-пирувата в показанных условиях не используются повторно в реакции, сопряженной с реакцией В-МР. В противоположность этому, в каскаде, представленном на фиг. 3, реакция Ό-триптофана с образованием индол-3-пирувата сопряжена с реакцией образования продукта, представляющего собой Ό-аминокислоту, при этом Ό-аминокислоту можно повторно использовать в реакции, сопряженной с реакцией В-МР. Это позволяет применять на первой стадии нестехиометрические количества акцептора амино. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения Ό-аминокислота представляет собой Ό-аланин.
На фиг. 4 и 5 представлены дополнительные модификации каскада, показанного на фиг. 1, при этом модификации направлены на повторное использование продукта, представляющего собой аминокислоту, образованного посредством реакции, сопряженной с реакцией Ь-триптофана с аминокислотой - участником реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин.
Обращаясь к фиг. 4, повторное использование проводят, предоставляя фермент, который облегчает превращение Ь-аминокислоты в Ό-аминокислоту, и наоборот. Более конкретно, в случае, как показано на фиг. 4, если α-КС вступает в реакцию с образованием Ь-глутамата, когда Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата, можно предоставлять глутаматрацемазу (ЕС 5.1.1.3) или функциональный эквивалент, которые могут облегчать превращение Ь-глутамата в Ό-глутамат, и наоборот. В таком случае, Ь-глутамат, образованный совместно с образованием индол-3-пирувата, удаляют посредством его превращения в Ό-глутамат, и Ό-глутамат, образованный посредством превращения Ьглутамата, затем становится доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. Аналогично, α-КС, образованный в реакции Ό-глутамата, является доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3пируват.
Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых может быть получена глутаматрацемаза, включают Рейюсоссик рейокасеик, ВасШик ритйик, ЬайоЬасШик Геттеий, ЬайоЬасШик ЬгеУ1к, Е.сой, Ас.|шГе.х руторййик и ВасШик киЫШк. Более конкретно (также не ограничиваясь этим) глутаматрацемаза может быть экспрессирована с нуклеиновой кислотой, такой как ген ншй рейюсоссик реи(аокасенк (регистрационный номер СеиЬаик № Й22789) или ген глутаматрацемазы ЬайоЬасШик Ьтеугк.
- 120 019971
В случае, если оксалоацетат вступает в реакцию с образованием Ь-аспартата, когда Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата, можно предоставлять аспартатрацемазу (ЕС 5.1.1.13) или ее функциональный эквивалент, для превращения Ь-аспартата в Ό-аспартат. В таком случае, Ь-аспартат, образованный совместно с образованием индол-3-пирувата, устраняют посредством его превращения в Ό-аспартат, и Ό-аспартат, образованный при превращении Ь-аспартата, затем становится доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. Аналогично оксалоацетат, образованный в реакции О-аспартата, является доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3-пируват.
Неограничивающие примеры пригодных ферментов, обладающих активностью аспартатрацемазы, включают А8РК-101 (ВюСа1а1у!юк, Шс., Ракабепа, СА) и гомологи или мутантные формы аминокислотарацемазы (ЕС 5.1.1.-), которые способны облегчать превращение Ь-аспартата в О-аспартат.
Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых могут быть получены аспартатрацемазы, включают: ОебиИигососсик, Тйегтососсик, двустворчатый моллюск 8сарйагса ЬгоийЮпб, Асте!оЬас!ег, АдгоЬас!егшт, Агсйаеод1оЬик, ВасШик, Вогбе!е11а, ВгабугШ/оЬшт, Вгет|Ьас1ег1нт, Вигкйо1бейа, Сатру1оЬас!ег, Сапб1ба, Саи1оЬас!ег, С1ок!йбшт, Оекий!оЬас!егшт, Оекн1Го1а1еа, ΕπΗιό^^ сик, ΕΓ^ίηίη, Εксйе^^сй^а, Реггор1акта, НейсоЬас!ег, К1еЬк1е11а, Ьас!оЬасШик, Маппйе1т1а, Мебюадо, Мекогй|/оЫит, Ме!йапососсик, Ме!йапокагсша, 0сеапоЬасШик, 0епососсик, Ребюсоссик, Ро1апЬас!ег, Ркеиботопак, Ругососсик, Ка1кота, 8Ыде11а, 8|погй|/оЫит, 8а1топе11а, 8рй1пдотопак, 8!гер!ососсик, ТйегтоаиаегоЬас!ег, ^Ьйо, Уо1ше11а, Хаи!йотопак, Хаи!йоЬас!ег, Уегкйиа и 2утотопак.
В случае, если пируват вступает в реакцию с образованием Ь-аланина, когда Ь-триптофан вступает в реакцию с образованием индол-3-пирувата, можно предоставить аланинрацемазу или ее функциональный эквивалент для превращения Ь-аланина в ϋ-аланин. В таком случае Ь-аланин, образованный совместно с образованием индол-3-пирувата, устраняют посредством его превращения в ϋ-аланин, и Όаланин, образованный при превращении Ь-аланина, затем становится доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин. Аналогично пируват, образованный в реакции О-аланина, является доступным в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3-пируват.
Неограничивающие примеры пригодных аланинрацемаз включают А8936 (81дта-А1бпсй, 8!. Ьошк, МО).
Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых может быть получена аланинрацемаза, включают: Вгисейа аЬойик, 8йер!ососсик Гаесайк, 8а1топе11а (урЫтигшт, Εксйе^^сй^а сой, ВасШик киЬййк, ВасШик к!еагоШегторЫ1ик, Ркеиботопак аегидтока, ^Ьйо сйо1егае, 8с1пхокассагоусек ротЬе, ВасШик сегеик и Ьепйпик ебобек.
В примерах 18 и 21 показано применение указанных выше рацемаз, их влияние на повышение соотношения для требуемого продукта монатина, и представлены потенциальные источники ферментов рацемаз.
Обращаясь к фиг. 5, стереоинвертирующую аминотрансферазу используют для облегчения реакции превращения К-МР в монатин. Несмотря на то что, как правило, реакция К-МР (или 8-МР) с образованием К,К-монатина (или 8,К-монатина) сопряжена с реакцией О-аминокислоты, стереоинвертирующая аминотрансфераза может облегчать сопряженные реакции К-МР (или 8-МР) с образованием К,Кмонатина (или 8,К-монатина) с использованием Ь-аминокислоты. Таким образом, продукт, представляющий собой Ь-аминокислоту реакции Ь-триптофанаминотрансферазы, можно использовать в качестве субстрата для переаминирования МР с образованием монатина, и продукт (т.е. оксалоацетат, пируват, и/или α-КС) реакции, сопряженной с реакцией превращения МР в монатин, можно использовать в качестве исходного материала для реакции, сопряженной с реакцией превращения Ь-триптофана в индол-3пируват. Неограничивающие примеры стереоинвертирующих аминотрансфераз, которые можно использовать, включают ϋ-фенилглицинаминотрансферазу (ЕС 2.6.1.72, также известную как Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансфераза) и О-метионинаминотрансферазу (ЕС 2.6.1.41, также известную как Όметаминотрансфераза и О-метионинпируватаминотрансфераза). Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых можно получать Ώ-фенилглицинаминотрансферазу, включают Ркеиботопак, такие как Ркеиботопак рийба ЬУ-4 и Ркеиботопак кЦЦхеп 8Т-201. Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых может быть получена Ό-метионинаминотрансфераза, включают цветную капусту и арахис.
В примерах 19 и 20 совместно представлены потенциальные источники стереоинвертирующих ферментов и способы получения таких ферментов. Также в примерах представлены способы скрининга для идентификации таких ферментов. Также подразумевается, что такие ферменты можно изменять по сравнению со стереоинвертирующими ферментами, известными или встречающимися в природе. В качестве неограничивающего примера стереоинвертирующая аминотрансфераза может представлять собой гомолог или мутантную форму аминотрансферазы О-аминокислот или гомолог или мутантную форму рацемазы аминокислот (ЕС 5.1.1.-).
На фиг. 6-8 также представлены модификации каскада фиг. 1. Каскады, представленные на фиг. 6-8, обеспечивают способы смещения равновесных реакций в прямом направлении посредством удаления
- 121 019971 побочного продукта в реакции триптофана и в некоторых случаях посредством предоставления субстрата для реакции МР.
Обращаясь к фиг. 6, представленный каскад удаляет продукт, представляющий собой Ьаминокислоту, реакции, сопряженной с реакцией триптофана, посредством превращения ее в другую Ьаминокислоту, а затем обеспечивает субстрат для реакции, сопряженной с реакцией МР, посредством превращения вновь образованной Ь-аминокислоты в Ό-аминокислоту. Конкретно показано, что Ьтриптофан вступает в реакцию совместно с оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Ьаспартата. Аспартат-4-декарбоксилазу (ЕС 4.1.1.12) или ее функциональный эквивалент используют для облегчения превращения Ь-аспартата в Ь-аланин и диоксид углерода, и фермент с активностью аланинрацемазы используют для облегчения превращения Ь-аланина в Ό-аланин, при этом Ό-аланин может служить в качестве донора амино для превращения В-МР в монатин.
Обращаясь к фиг. 7, представленный каскад иллюстрирует дополнительные способы удаления продукта, представляющего собой Ь-аминокислоту, реакции, сопряженной с реакцией триптофана. Варианты осуществления, как представлено на фигуре, приводят к побочному продукту(ам), который является недоступным для реакции в обратном направлении, например, вследствие улетучивания (например, диоксид углерода) или посредством спонтанного превращения во вступающий в реакцию конечный продукт. Пример такого подхода включает случай, где α-КС вступает в реакцию совместно с Ьтриптофаном с образованием Ь-глутамата, тогда можно предоставить глутаматдекарбоксилазу (ЕС 4.1.1.15) или ее функциональный эквивалент, которые могут облегчать превращение Ь-глутамата в 4аминобутаноат (с диоксидом углерода в качестве побочного продукта). Неограничивающие примеры потенциальных источников, из которых можно получать Ь-глутаматдекарбоксилазу, включают: С1ок1г1б1ит регГгшдеик, СлмеЫш или Е.сой
Другой пример такого подхода для смещения реакции триптофана в прямом направлении включает случай, где оксалоацетат вступает в реакцию совместно с Ь-триптофаном, тогда можно предоставить аспартатдекарбоксилазу (ЕС 4.1.1.11) или ее функциональный эквивалент для облегчения превращения Ь-аспартата в β-аланин (с диоксидом углерода в качестве побочного продукта).
Обращаясь к фиг. 8, представленный каскад иллюстрирует дополнительные способы удаления продукта, представляющего собой Ь-аминокислоту, реакции, сопряженной с реакцией триптофана, и предоставление субстрата для реакции, сопряженной с реакцией МР. Конкретно, в случае, где α-КС вступает в реакцию совместно с Ь-триптофаном с образованием Ь-глутамата, можно предоставить фермент с активностью Ь-аланинаминотрансферазы и пируват, где фермент Ь-аланинаминотрансфераза облегчает реакцию пирувата и Ь-глутамата с образованием Ь-аланина. Также может быть предоставлена аланинрацемаза или ее функциональный эквивалент в целях облегчения превращения Ь-аланина в Ό-аланин, при этом Ό-аланин можно использовать в качестве субстрата совместно с МР с образованием монатина и пирувата. См. примеры 18 и 21.
Биосинтетические каскады для получения К,К- и других стереоизомеров производных монатина
Способы по описанному изобретению включают применение полипептидов с активностью альдолазы, описанных в настоящем документе, которые можно использовать для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
Ферменты, пригодные для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода, включают один или несколько полипептидов с активностью альдолазы по любой из 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:6, 8Е0 ΙΌ N0:8, 8Е0 ΙΌ N0:10, 8Е0 ΙΌ N0:12, 8Е0 ΙΌ N0:14, 8Е0 ΙΌ N0:16, 8Е0 ΙΌ N0:18, 8Е0 ΙΌ N0:20, 8Е0 ΙΌ N0:22, 8Е0 ΙΌ N0:24, 8Е0 ΙΌ N0:26, 8Е0 ΙΌ N0:28, 8Е0 ΙΌ N0:30, 8Е0 ΙΌ N0:32, 8Е0 ΙΌ N0:34, 8Е0 ΙΌ N0:36, 8Е0 ΙΌ N0:38, 8Е0 ΙΌ N0:40, 8Е0 ΙΌ N0:42, 8Е0 ΙΌ N0:44, 8Е0 ΙΌ N0:46, 8Е0 ΙΌ N0:48, 8Е0 ΙΌ N0:50, 8Е0 ΙΌ N0:52, 8Е0 ΙΌ N0:54, 8Е0 ΙΌ N0:56, 8Е0 ΙΌ N0:58, 8Е0 ΙΌ N0:60, 8Е0 ΙΌ N0:62, 8Е0 ΙΌ N0:64, 8Е0 ΙΌ N0:66, 8Е0 ΙΌ N0:68, 8Е0 ΙΌ N0:70, 8Е0 ΙΌ N0:72, 8Е0 ΙΌ N0:74, 8Е0 ΙΌ N0:76, 8Е0 ΙΌ N0:78, 8Е0 ΙΌ N0:80, 8Е0 ΙΌ N0:82, 8Е0 ΙΌ N0:84, 8Е0 ΙΌ N0:86, 8Е0 ΙΌ N0:88, 8Е0 ΙΌ N0:90, 8Е0 ΙΌ N0:92, 8Е0 ΙΌ N0:94, 8Е0 ΙΌ N0:96, 8Е0 ΙΌ N0:98, 8Е0 ΙΌ N0:100, 8Е0 ΙΌ N0:102, 8Е0 ΙΌ N0:104, 8Е0 ΙΌ N0:106, 8Е0 ΙΌ N0:108, 8Е0 N0:120, 8Е0 N0:132, 8Е0 N0:144, 8Е0 N0:156, 8Е0 N0:168, 8Е0 N0:180, 8Е0 N0:192, 8Е0 N0:204, 8Е0 N0:216, 8Е0 N0:228, 8Е0 N0:240, 8Е0
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:110, 8Е0
N0:122, 8Е0
N0:134, 8Е0
N0:146, 8Е0
N0:158, 8Е0
N0:170, 8Е0
N0:182, 8Е0
N0:194, 8Е0
N0:206, 8Е0
N0:218, 8Е0
N0:230, 8Е0
N0:242, 8Е0
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:112, 8Е0
N0:124, 8Е0
N0:136, 8Е0
N0:148, 8Е0
N0:160, 8Е0
N0:172, 8Е0
N0:184, 8Е0
N0:196, 8Е0
N0:208, 8Е0
N0:220, 8Е0
N0:232, 8Е0
N0:244, 8Е0
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:118, 8Е0
N0:130, 8Е0
N0:142, 8Е0
N0:154, 8Е0
N0:166, 8Е0
N0:178, 8Е0
N0:190, 8Е0
N0:202, 8Е0
N0:214, 8Е0
N0:226, 8Е0
N0:238, 8Е0
N0:250, 8Е0
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
N0:114, 8Е0
N0:126, 8Е0
N0:138, 8Е0
N0:150, 8Е0
N0:162, 8Е0
N0:174, 8Е0
N0:186, 8Е0
N0:198, 8Е0
N0:210, 8Е0
N0:222, 8Е0
N0:234, 8Е0
N0:246, 8Е0
N0:116, 8Е0
N0:128, 8Е0
N0:140, 8Е0
N0:152, 8Е0
N0:164, 8Е0
N0:176, 8Е0
N0:188, 8Е0
N0:200, 8Е0
N0:212, 8Е0
N0:224, 8Е0
N0:236, 8Е0
N0:248, 8Е0
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
- 122 019971 \О:252, 8Е6) ГО ЫО:254, 8ЕО ГО ЫО:256, 8ЕО ГО ЫО:258, 8ЕЕ) ГО ЫО:260, 8ЕЕ) ГО 4():262, 8ЕЕ) ГО \О:264, 8ЕЕ) ГО \О:266, 8ЕЕ) ГО \О:268, 8ЕЕ) ГО ЫО:270, 8ЕЕ) ГО ЫО:272, 8ЕЕ) ГО ЫО:274, 8ЕЕ) ГО \О:276, 8ЕЕ) ГО ЫО:278, 8ЕЕ) ГО ЫО:280, 8ЕЕ) ГО \О:282, 8ЕЕ) ГО \О:284, 8ЕЕ) ГО \О:286, 8ЕЕ) ГО \О:288, 8ЕЕ) ГО ЫО:290, 8ЕЕ) ГО \О:292, 8ЕЕ) ГО \О:294, 8ЕЕ) ГО \О:296, 8ЕЕ) ГО \О:298, 8ЕЕ) ГО
ЫО:300, 8ЕЕ) ГО ЫО:302, 8ЕЕ) ГО ЫО:304, 8ЕЕ) ГО ЫО:306, 8Е6) ГО ЫО:308, 8Е6) ГО ЫО:310, 8ЕГ) ГО
ЫО:312, 8ЕГ) ГО ЫО:314, 8ЕГ) ГО ЫО:316, 8ЕГ) ГО ЫО:318, 8ЕГ) ГО ЫО:320, 8ЕГ) ГО ЫО:322, 8ЕГ) ГО
ЫО:324, 8ЕГ) ГО ЫО:326, 8ЕГ) ГО ЫО:328, 8ЕГ) ГО ЫО:330, 8ЕГ) ГО ЫО:332 или 8ЕГ) ГО ЫО:334, или их фрагментов или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы.
В одном варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМС по любой из 8ЕГ) ГО ЫО:2, 8ЕГ) ГО ЫО:4, 8ЕГ) ГО ЫО:6, 8ЕГ) ГО ЫО:8, 8ЕГ) ГО ЫО:10, 8ЕГ) ГО ΝΌ:12, 8ЕГ) ГО ЫО:14, 8ЕГ) ГО ЫО:16, 8ЕГ) ГО ЫО:18, 8ЕГ) ГО ЫО:20, 8ЕГ) ГО ЫО:22, 8ЕГ) ГО ЫО:24, 8ЕГ) ГО ЫО:26, 8ЕГ) ГО ЫО:28, 8ЕГ) ГО ЫО:30, 8ЕГ) ГО ЫО:32, 8ЕГ) ГО ЫО:34, 8ЕГ) ГО ЫО:36, 8ЕГ) ГО ЫО:38, 8ЕГ) ГО ЫО:40, 8ЕГ) ГО ЫО:42, 8ЕГ) ГО ЫО:44, 8ЕГ) ГО ЫО:46, 8ЕГ) ГО ЫО:48, 8ЕГ) ГО ЫО:50, 8ЕГ) ГО ЫО:52, 8ЕГ) ГО ЫО:54, 8ЕГ) ГО ЫО:56, 8ЕГ) ГО ЫО:58, 8ЕГ) ГО ЫО:60, 8ЕГ) ГО ЫО:62, 8ЕГ) ГО ЫО:64, 8ЕГ) ГО ЫО:66, 8ЕГ) ГО ЫО:68, 8ЕГ) ГО ЫО:70, 8ЕГ) ГО ЫО:72, 8ЕГ) ГО ЫО:74, 8ЕГ) ГО ЫО:76, 8ЕГ) ГО ЫО:78, 8ЕГ) ГО ЫО:80, 8ЕГ) ГО ЫО:82, 8ЕГ) ГО ЫО:84, 8ЕГ) ГО ЫО:86, 8ЕГ) ГО ЫО:88, 8ЕГ) ГО ЫО:90, 8ЕГ) ГО ЫО:92, 8ЕГ) ГО ЫО:94, 8ЕГ) ГО ЫО:96, 8ЕГ) ГО ЫО:98, 8ЕГ) ГО ЫО:100, 8ЕГ) ГО ЫО:102, 8ЕГ) ГО ЫО:104, 8ЕГ) ГО ЫО:106, 8ЕГ) ГО ЫО:108, 8ЕГ) ГО ЫО:110, 8ЕГ) ГО ЫО:112, 8ЕГ) ГО ЫО:114, 8ЕГ) ГО ЫО:116, 8ЕГ) ГО ΝΌ:118, 8ЕГ) ГО ЫО:120, 8ЕГ) ГО ЫО:122, 8ЕГ) ГО ЫО:124, 8ЕГ) ГО ЫО:126, 8ЕГ) ГО ЫО:128, 8ЕГ) ГО ЫО:130, 8ЕГ) ГО ЫО:132, 8ЕГ) ГО ЫО:134, 8ЕГ) ГО ЫО:136, 8ЕГ) ГО ЫО:138, 8ЕГ) ГО ЫО:140, 8ЕГ) ГО
ЫО:142, 8ЕГ) ГО ЫО:144, 8ЕГ) ГО ЫО:146, 8ЕГ) ГО ЫО:148, 8ЕГ) ГО ЫО:150, 8ЕГ) ГО ЫО:152, 8ЕГ) ГО
ЫО:154, 8ЕГ) ГО ЫО:156, 8ЕГ) ГО ЫО:158, 8ЕГ) ГО ЫО:160, 8ЕГ) ГО ЫО:162, 8ЕГ) ГО ЫО:164, 8ЕГ) ГО
ЫО:166, 8ЕГ) ГО ЫО:168, 8ЕГ) ГО ЫО:170, 8ЕГ) ГО ЫО:172, 8ЕГ) ГО ЫО:174, 8ЕГ) ГО ЫО:176, 8ЕГ) ГО
ЫО:178, 8ЕГ) ГО ЫО:180, 8ЕГ) ГО ЫО:182, 8ЕГ) ГО ЫО:184, 8ЕГ) ГО ЫО:186, 8ЕГ) ГО ЫО:188, 8ЕГ) ГО
ЫО:190, 8ЕГ) ГО ЫО:192, 8ЕГ) ГО ЫО:194, 8ЕГ) ГО ЫО:196, 8ЕГ) ГО ЫО:198, 8ЕГ) ГО ЫО:200, 8ЕГ) ГО
ЫО:202, 8ЕГ) ГО ЫО:204, 8ЕГ) ГО ЫО:206, 8ЕГ) ГО ЫО:208, 8ЕГ) ГО ЫО:210, 8ЕГ) ГО ЫО:212, 8ЕГ) ГО
ЫО:214, 8ЕГ) ГО ЫО:216, 8ЕГ) ГО ЫО:218, 8ЕГ) ГО ЫО:220, 8ЕЦ ГО ЫО:222, 8ЕЦ ГО ЫО:224, 8ЕЦ ГО
ЫО:226, 8ЕЦ ГО ЫО:228, 8ЕЦ ГО ЫО:230, 8ЕЦ ГО ЫО:232, 8ЕЦ ГО ЫО:234, 8ЕЦ ГО ЫО:236, 8ЕЦ ГО
ЫО:238, 8ЕЦ ГО ЫО:240, 8ЕЦ ГО ЫО:242, 8ЕЦ ГО ЫО:244, 8ЕЦ ГО ЫО:246, 8ЕЦ ГО ЫО:248, 8ЕЦ ГО
ЫО:250, 8ЕЦ ГО ЫО:252, 8ЕЦ ГО ЫО:254, 8ЕЦ ГО ЫО:256, 8ЕЦ ГО ЫО:258, 8ЕЦ ГО ЫО:260, 8ЕЦ ГО
ЫО:262, 8ЕЦ ГО ЫО:264, 8ЕЦ ГО ЫО:266, 8ЕЦ ГО ЫО:268, 8ЕЦ ГО ЫО:270, 8ЕЦ ГО ЫО:272, 8ЕЦ ГО
ЫО:274, 8ЕЦ ГО ЫО:276, 8ЕЦ ГО ЫО:278, 8ЕЦ ГО ЫО:280, 8ЕЦ ГО ЫО:282, 8ЕЦ ГО ЫО:284, 8ЕЦ ГО
ЫО:286, 8ЕЦ ГО ЫО:288, 8ЕЦ ГО ЫО:290, 8ЕЦ ГО ЫО:292, 8ЕЦ ГО ЫО:294, 8ЕЦ ГО ЫО:296, 8ЕЦ ГО
ЫО:298, 8Е0 ГО ЫО:300, 8ЕЦ ГО ЫО:302, 8ЕЦ ГО ЫО:304 или их фрагментов, или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
В другом варианте осуществления один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНС по любой из 8ЕЦ ГО ЫО:306, 8ЕЦ ГО ЫО:308, 8ЕЦ ГО ЫО:310, 8ЕЦ ГО ЫО:312, 8ЕЦ ГО ЫО:314, 8ЕЦ ГО ЫО:316, 8ЕЦ ГО ЫО:318, 8ЕЦ ГО ЫО:320, 8ЕЦ ГО ЫО:322, 8ЕЦ ГО ЫО:324, 8ЕЦ ГО ЫО:326, 8ЕЦ ГО ЫО:328, 8Е0 ГО ЫО:330, 8ЕЦ ГО ЫО:332 или 8ЕЦ ГО ЫО:334, или их фрагментов, или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
Альтернативно один или несколько полипептидов с активностью альдолазы, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая 8ЕЦ ГО ЫО:1, 8ЕЦ ГО ЫО:3, 8ЕЦ ГО ЫО:5, 8ЕЦ ГО ЫО:7, 8ЕЦ ГО ЫО:9, 8ЕЦ ГО ЫО:11, 8ЕЦ ГО ЫО:13, 8ЕЦ ГО ЫО:15, 8ЕЦ ГО ЫО:17, 8ЕЦ ГО ЫО:19, 8ЕЦ ГО ЫО:21, 8ЕЦ ГО ЫО:23, 8ЕЦ ГО ЫО:25, 8ЕЦ ГО ЫО:27, 8ЕЦ ГО ЫО:29, 8ЕЦ ГО ЫО:31, 8ЕЦ ГО ЫО:33, 8ЕЦ ГО ЫО:35, 8ЕЦ ГО ЫО:37, 8ЕЦ ГО ЫО:39, 8ЕЦ ГО ЫО:41, 8ЕЦ ГО ЫО:43, 8ЕЦ ГО ЫО:45, 8ЕЦ ГО ЫО:47, 8ЕЦ ГО ЫО:49, 8ЕЦ ГО ЫО:51, 8ЕЦ ГО ЫО:53, 8ЕЦ ГО ЫО:55, 8ЕЦ ГО ЫО:57, 8ЕЦ ГО ЫО:59, 8ЕЦ ГО ЫО:61, 8ЕЦ ГО ЫО:63, 8ЕЦ ГО ЫО:65, 8ЕЦ ГО ЫО:67, 8ЕЦ ГО ЫО:69, 8ЕЦ ГО ЫО:71, 8ЕЦ ГО ЫО:73, 8ЕЦ ГО ЫО:75, 8ЕЦ ГО ЫО:77, 8ЕЦ ГО ЫО:79, 8ЕЦ ГО ЫО:81, 8ЕЦ ГО ЫО:83, 8ЕЦ ГО ЫО:85, 8ЕЦ ГО ЫО:87, 8ЕЦ ГО ЫО:89, 8ЕЦ ГО ЫО:91, 8ЕЦ ГО ЫО:93, 8ЕЦ ГО ЫО:95, 8ЕЦ ГО ЫО:97, 8ЕЦ ГО ЫО:99, 8ЕЦ ГО ЫО:101, 8ЕЦ ГО ЫО:103, 8ЕЦ ГО ЫО:105, 8ЕЦ ГО ЫО:107, 8ЕЦ ГО ЫО:109, 8ЕЦ ГО ЫО:111, 8ЕЦ ГО ЫО:113, 8ЕЦ ГО ЫО:115, 8ЕЦ ГО ЫО:117, 8ЕЦ ГО ЫО:119, 8ЕЦ ГО ЫО:121, 8ЕЦ ГО ЫО:123, 8ЕЦ ГО ЫО:125, 8ЕЦ ГО ЫО:127, 8ЕЦ ГО ЫО:129, 8ЕЦ ГО ЫО:131, 8ЕЦ ГО ЫО:133, 8ЕЦ ГО
ЫО:135, 8ЕЦ ГО ЫО:137, 8ЕЦ ГО ЫО:139, 8ЕЦ ГО ЫО:141, 8ЕЦ ГО ЫО:143, 8ЕЦ ГО ЫО:145, 8ЕЦ ГО
ЫО:147, 8ЕЦ ГО ЫО:149, 8ЕЦ ГО ЫО:151, 8ЕЦ ГО ЫО:153, 8ЕЦ ГО ЫО:155, 8ЕЦ ГО ЫО:157, 8ЕЦ ГО
ЫО:159, 8ЕЦ ГО ЫО:161, 8ЕЦ ГО ЫО:163, 8ЕЦ ГО ЫО:165, 8ЕЦ ГО ЫО:167, 8ЕЦ ГО ЫО:169, 8ЕЦ ГО
ЫО:171, 8ЕЦ ГО ЫО:173, 8ЕЦ ГО ЫО:175, 8ЕЦ ГО ЫО:177, 8ЕЦ ГО ЫО:179, 8ЕЦ ГО ЫО:181, 8ЕЦ ГО
ЫО:183, 8ЕЦ ГО ЫО:185, 8ЕЦ ГО ЫО:187, 8ЕЦ ГО ЫО:189, 8ЕЦ ГО ЫО:191, 8ЕЦ ГО ЫО:193, 8ЕЦ ГО
- 123 019971
N0:195, ЛЕО ΙΌ N0:197, ЛЕО ΙΌ N0:199, ЛЕО ΙΌ N0:201, ЛЕО ΙΌ N0:203, ЛЕО ΙΌ N0:205, ЛЕО ΙΌ
N0:207, ЛЕО ΙΌ N0:209, ЛЕО ΙΌ N0:211, ЛЕО ΙΌ N0:213, ЛЕО ΙΌ N0:215, ЛЕО ΙΌ N0:217, ЛЕО ΙΌ
N0:219, ЛЕО ΙΌ N0:221, ЛЕО ΙΌ N0:223, ЛЕО ΙΌ N0:225, ЛЕО ΙΌ N0:227, ЛЕО ΙΌ N0:229, ЛЕО ΙΌ
N0:231, ЛЕО ΙΌ N0:233, ЛЕО ΙΌ N0:235, ЛЕО ΙΌ N0:237, ЛЕО ΙΌ N0:239, ЛЕО ΙΌ N0:241, ЛЕО ΙΌ
N0:243, ЛЕО ΙΌ N0:245, ЛЕО ΙΌ N0:247, ЛЕО ΙΌ N0:249, ЛЕО ΙΌ N0:251, ЛЕО ΙΌ N0:253, ЛЕО ΙΌ
N0:255, ЛЕО ΙΌ N0:257, ЛЕО ΙΌ N0:259, ЛЕО ΙΌ N0:261, ЛЕО ΙΌ N0:263, ЛЕО ΙΌ N0:265, ЛЕО ΙΌ
N0:267, ЛЕО ΙΌ N0:269, ЛЕО ΙΌ N0:271, ЛЕО ΙΌ N0:273, ЛЕО ΙΌ N0:275, ЛЕО ΙΌ N0:277, ЛЕО ΙΌ
N0:279, ЛЕО ΙΌ N0:281, ЛЕО ΙΌ N0:283, ЛЕО ΙΌ N0:285, ЛЕО ΙΌ N0:287, ЛЕО ΙΌ N0:289, ЛЕО ΙΌ
N0:291, ЛЕО ΙΌ N0:293, ЛЕО ΙΌ N0:295, ЛЕО ΙΌ N0:297, ЛЕО ΙΌ N0:299, ЛЕО ΙΌ N0:301, ЛЕО ΙΌ
N0:303, ЛЕО ΙΌ N0:305, ЛЕО ΙΌ N0:307, ЛЕО ΙΌ N0:309, ЛЕО ΙΌ N0:311, ЛЕО ΙΌ N0:313, ЛЕО ΙΌ
N0:315, ЛЕО ΙΌ N0:317, ЛЕО ΙΌ N0:319, ЛЕО ΙΌ N0:321, ЛЕО ΙΌ N0:323, ЛЕО ΙΌ N0:325, ЛЕО ΙΌ
N0:327, ЛЕО ΙΌ N0:329, ЛЕО ΙΌ N0:331, ЛЕО ΙΌ N0:333, ЛЕО ΙΌ N0:335, ЛЕО ΙΌ N0:336, ЛЕО ΙΌ
N0:337 и ЛЕО ΙΌ N0:338 на протяжении участка, по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
В одном варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМС, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая ЛЕО ΙΌ N0:1, ЛЕО ΙΌ N0:3, ЛЕО ΙΌ N0:5, ЛЕО ΙΌ N0:7, ЛЕО ΙΌ N0:9, ЛЕО ΙΌ N0:11, ЛЕО ΙΌ N0:13, ЛЕО ΙΌ N0:15, ЛЕО ΙΌ N0:17, ЛЕО ΙΌ N0:19, ЛЕО ΙΌ N0:21, ЛЕО ΙΌ N0:23, ЛЕО ΙΌ N0:25, ЛЕО ΙΌ N0:27, ЛЕО ΙΌ N0:29, ЛЕО ΙΌ N0:31, ЛЕО ΙΌ N0:33, ЛЕО ΙΌ N0:35, ЛЕО ΙΌ N0:37, ЛЕО ΙΌ N0:39, ЛЕО ΙΌ N0:41, ЛЕО ΙΌ N0:43, ЛЕО ΙΌ N0:45, ЛЕО ΙΌ N0:47, ЛЕО ΙΌ N0:49, ЛЕО ΙΌ N0:51, ЛЕО ΙΌ N0:53, ЛЕО ΙΌ N0:55, ЛЕО ΙΌ N0:57, ЛЕО ΙΌ N0:59, ЛЕО ΙΌ N0:61, ЛЕО ΙΌ N0:63, ЛЕО ΙΌ N0:65, ЛЕО ΙΌ N0:67, ЛЕО ΙΌ N0:69, ЛЕО ΙΌ N0:71, ЛЕО ΙΌ N0:73, ЛЕО ΙΌ N0:75, ЛЕО ΙΌ N0:77, ЛЕО ΙΌ N0:79, ЛЕО ΙΌ N0:81, ЛЕО ΙΌ N0:83, ЛЕО ΙΌ N0:85, ЛЕО ΙΌ N0:87, ЛЕО ΙΌ N0:89, ЛЕО ΙΌ N0:91, ЛЕО ΙΌ N0:93, ЛЕО ΙΌ N0:95, ЛЕО ΙΌ N0:97, ЛЕО ΙΌ N0:99, ЛЕО ΙΌ N0:101, ЛЕО ΙΌ N0:103, ЛЕО ΙΌ N0:105, ЛЕО ΙΌ N0:107, ЛЕО ΙΌ N0:109, ЛЕО ΙΌ N0:111, ЛЕО ΙΌ N0:113, ЛЕО ΙΌ N0:115, ЛЕО ΙΌ N0:117, ЛЕО ΙΌ N0:119, ЛЕО ΙΌ N0:121, ЛЕО ΙΌ N0:123, ЛЕО ΙΌ N0:125, ЛЕО ΙΌ N0:127, ЛЕО ΙΌ N0:129, ЛЕО ΙΌ N0:131, ЛЕО ΙΌ N0:133, ЛЕО ΙΌ N0:135, ЛЕО ΙΌ N0:137, ЛЕО ΙΌ N0:139, ЛЕО ΙΌ
N0:141, ЛЕО ΙΌ N0:143, ЛЕО ΙΌ N0:145, ЛЕО ΙΌ N0:147, ЛЕО ΙΌ N0:149, ЛЕО ΙΌ N0:151, ЛЕО ΙΌ
N0:153, ЛЕО ΙΌ N0:155, ЛЕО ΙΌ N0:157, ЛЕО ΙΌ N0:159, ЛЕО ΙΌ N0:161, ЛЕО ΙΌ N0:163, ЛЕО ΙΌ
N0:165, ЛЕО ΙΌ N0:167, ЛЕО ΙΌ N0:169, ЛЕО ΙΌ N0:171, ЛЕО ΙΌ N0:173, ЛЕО ΙΌ N0:175, ЛЕО ΙΌ
N0:177, ЛЕО ΙΌ N0:179, ЛЕО ΙΌ N0:181, ЛЕО ΙΌ N0:183, ЛЕО ΙΌ N0:185, ЛЕО ΙΌ N0:187, ЛЕО ΙΌ
N0:189, ЛЕО ΙΌ N0:191, ЛЕО ΙΌ N0:193, ЛЕО ΙΌ N0:195, ЛЕО ΙΌ N0:197, ЛЕО ΙΌ N0:199, ЛЕО ΙΌ
N0:201, ЛЕО ΙΌ N0:203, ЛЕО ΙΌ N0:205, ЛЕО ΙΌ N0:207, ЛЕО ΙΌ N0:209, ЛЕО ΙΌ N0:211, ЛЕО ΙΌ
N0:213, ЛЕО ΙΌ N0:215, ЛЕО ΙΌ N0:217, ЛЕО ΙΌ N0:219, ЛЕО ΙΌ N0:221, ЛЕО ΙΌ N0:223, ЛЕО ΙΌ
N0:225, ЛЕО ΙΌ N0:227, ЛЕО ΙΌ N0:229, ЛЕО ΙΌ N0:231, ЛЕО ΙΌ N0:233, ЛЕО ΙΌ N0:235, ЛЕЦ ΙΌ
N0:237, ЛЕЦ ΙΌ N0:239, ЛЕЦ ΙΌ N0:241, ЛЕЦ ΙΌ N0:243, ЛЕЦ ΙΌ N0:245, ЛЕЦ ΙΌ N0:247, ЛЕЦ ΙΌ
N0:249, ЛЕЦ ΙΌ N0:251, ЛЕЦ ΙΌ N0:253, ЛЕЦ ΙΌ N0:255, ЛЕЦ ΙΌ N0:257, ЛЕЦ ΙΌ N0:259, ЛЕЦ ΙΌ
N0:261, ЛЕЦ ΙΌ N0:263, ЛЕЦ ΙΌ N0:265, ЛЕЦ ΙΌ N0:267, ЛЕЦ ΙΌ N0:269, ЛЕЦ ΙΌ N0:271, ЛЕЦ ΙΌ
N0:273, ЛЕЦ ΙΌ N0:275, ЛЕЦ ΙΌ N0:277, ЛЕЦ ΙΌ N0:279, ЛЕЦ ΙΌ N0:281, ЛЕЦ ΙΌ N0:283, ЛЕЦ ΙΌ
N0:285, ЛЕЦ ΙΌ N0:287, ЛЕЦ ΙΌ N0:289, ЛЕЦ ΙΌ N0:291, ЛЕЦ ΙΌ N0:293, ЛЕЦ ΙΌ N0:295, ЛЕЦ ΙΌ
N0:297, ЛЕЦ ΙΌ N0:299, ЛЕЦ ΙΌ N0:301, ЛЕЦ ΙΌ N0:303, ЛЕЦ ΙΌ N0:305 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
В другом варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНС, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая ЛЕЦ ΙΌ N0:307, ЛЕЦ ΙΌ N0:309, ЛЕЦ ΙΌ N0:311, ЛЕЦ ΙΌ N0:313, ЛЕЦ ΙΌ N0:315, ЛЕЦ ΙΌ N0:317, ЛЕЦ ΙΌ N0:319, ЛЕЦ ΙΌ N0:321, ЛЕЦ ΙΌ N0:323, ЛЕЦ ΙΌ N0:325, ЛЕЦ ΙΌ N0:327, ЛЕЦ ΙΌ N0:329, ЛЕЦ ΙΌ N0:331, ЛЕЦ ΙΌ N0:333, ЛЕЦ ΙΌ N0:335, ЛЕЦ ΙΌ N0:336, ЛЕЦ ΙΌ N0:337 и ЛЕЦ ΙΌ N0:338 на протяжении участка, по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100,
- 124 019971
1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
Один или несколько полипептидов с активностью альдолазы, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8ЕЦ ГО NΟ:1, 8ЕО ГО ΝΌ:3, 8ЕО ГО ЦО:5, 8ЕО ГО ЦО:7, 8ЕО ГО ЦО:9, 8ЕО ГО ЦО:11, 8ЕО ГО ЦО:13, 8ЕО ГО ЦО:15, 8ЕО ГО ΝΌ:17, 8ЕО ГО ЦО:19, 8ЕО ГО ЦО:21, 8ЕО ГО ЦО:23, 8ЕО ГО ЦО:25, 8ЕО ГО ЦО:27, 8ЕО ГО ΝΌ:29, 8ЕО ГО ЦО:31, 8ЕО ГО ЦО:33, 8ЕО ГО ЦО:35, 8ЕО ГО ЦО:37, 8ЕО ГО ЦО:39, 8ЕО ГО ЦО:41, 8ЕО ГО ΝΌ:43, 8ЕО ГО ЦО:45, 8ЕО ГО ЦО:47, 8ЕО ГО ЦО:49, 8ЕО ГО ЦО:51, 8ЕО ГО ЦО:53, 8ЕО ГО ЦО:55, 8ЕО ГО ΝΌ:57, 8ЕО ГО ЦО:59, 8ЕО ГО ЦО:61, 8ЕО ГО КО:63, 8ЕО ГО КО:65, 8ЕО ГО КО:67, 8ЕО ГО ΝΌ:69, 8ЕО ГО ЦО:71, 8ЕО ГО ЦО:73, 8ЕО ГО ЦО:75, 8ЕО ГО ЦО:77, 8ЕО ГО ЦО:79, 8ЕО ГО ЦО:81, 8ЕО ГО ΝΌ:83, 8ЕО ГО ЦО:85, 8ЕО ГО ЦО:87, 8ЕО ГО ЦО:89, 8ЕО ГО ЦО:91, 8ЕО ГО ЦО:93, 8ЕО ГО ЦО:95, 8ЕО ГО ΝΌ:97, 8ЕО ГО ЦО:99, 8ЕО ГО МО:101, 8ЕО ГО МО:103, 8ЕО ГО МО:105, 8ЕО ГО МО:107, 8ЕО ГО МО:109, 8ЕО ГО МО:111, 8ЕО ГО ЦО:113, 8ЕО ГО ЦО:115, 8ЕО ГО ЦО:117, 8ЕО ГО ЦО:119, 8ЕО ГО
ΝΌ:121, 8ЕО ГО МО:123, 8ЕО ГО МО:125, 8ЕО ГО ЦО:127, 8ЕО ГО МО:129, 8ЕО ГО ЦО:131, 8ЕО ГО
ΝΌ:133, 8ЕО ГО МО:135, 8ЕО ГО МО:137, 8ЕО ГО МО:139, 8ЕО ГО ЦО:141, 8ЕО ГО МО:143, 8ЕО ГО
ΝΌ:145, 8ЕО ГО ЦО:147, 8ЕО ГО МО:149, 8ЕО ГО ЦО:151, 8ЕО ГО МО:153, 8ЕО ГО МО:155, 8ЕО ГО
ΝΌ:157, 8ЕО ГО МО:159, 8ЕО ГО ЦО:161, 8ЕО ГО МО:163, 8ЕО ГО МО:165, 8ЕО ГО КО:167, 8ЕО ГО
МО:169, 8ЕО ГО ЦО:171, 8ЕО ГО МО:173, 8ЕО ГО МО:175, 8ЕО ГО ЦО:177, 8ЕО ГО МО:179, 8ЕО ГО
ΝΌ:181, 8ЕО ГО МО:183, 8ЕО ГО МО:185, 8ЕО ГО МО:187, 8ЕО ГО МО:189, 8ЕО ГО ЦО:191, 8ЕО ГО
ΝΌ:193, 8ЕО ГО МО:195, 8ЕО ГО МО:197, 8ЕО ГО МО:199, 8ЕО ГО МО:201, 8ЕО ГО КО:203, 8ЕО ГО
ΝΌ:205, 8ЕО ГО КО:207, 8ЕО ГО КО:209, 8ЕО ГО ЦО:211, 8ЕО ГО МО:213, 8ЕО ГО МО:215, 8ЕО ГО
ΝΌ:217, 8ЕО ГО МО:219, 8ЕО ГО ЦО:221, 8ЕО ГО ЦО:223, 8ЕО ГО ЦО:225, 8ЕО ГО ЦО:227, 8ЕО ГО
ΝΌ:229, 8ЕО ГО ЦО:231, 8ЕО ГО ЦО:233, 8ЕО ГО ЦО:235, 8ЕО ГО ЦО:237, 8ЕО ГО ЦО:239, 8ЕО ГО
ΝΌ:241, 8ЕО ГО ЦО:243, 8ЕО ГО ЦО:245, 8ЕО ГО ЦО:247, 8ЕО ГО ЦО:249, 8ЕО ГО ЦО:251, 8ЕО ГО
ΝΌ:253, 8ЕО ГО ЦО:255, 8ЕО ГО ЦО:257, 8ЕО ГО ЦО:259, 8ЕО ГО ЦО:261, 8ЕО ГО КО:263, 8ЕО ГО
ΝΌ:265, 8ЕО ГО КО:267, 8ЕО ГО КО:269, 8ЕО ГО ЦО:271, 8ЕО ГО ЦО:273, 8ЕО ГО ЦО:275, 8ЕО ГО
ΝΌ:277, 8ЕО ГО ЦО:279, 8ЕО ГО ЦО:281, 8ЕО ГО ЦО:283, 8ЕО ГО ЦО:285, 8ЕО ГО ЦО:287, 8ЕО ГО
ΝΌ:289, 8ЕО ГО ЦО:291, 8ЕО ГО ЦО:293, 8ЕО ГО ЦО:295, 8ЕО ГО ЦО:297, 8ЕО ГО ЦО:299, 8ЕО ГО
ΝΌ:301, 8ЕО ГО МО:303, 8ЕО ГО КО:305, 8ЕО ГО КО:307, 8ЕО ГО КО:309, 8ЕО ГО ЦО:311, 8ЕО ГО
ΝΌ:313, 8ЕО ГО МО:315, 8ЕО ГО МО:317, 8ЕО ГО МО:319, 8ЕО ГО ЦО:321, 8ЕО ГО ЦО:323, 8ЕО ГО
ΝΌ:325, 8ЕО ГО ЦО:327, 8ЕО ГО ЦО:329, 8ЕО ГО ЦО:331, 8ЕО ГО МО:333, 8ЕО ГО МО:335, 8Ер ГО
NΟ:336, 8ЕЦ ГО NΟ:337 и 8ЕЦ ГО NΟ:338, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
В одном варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы НМС, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8ЕЦ ГО NΟ:1, 8ЕЦ ГО NΟ:3, 8ЕЦ ГО NΟ:5, 8ЕЦ ГО NΟ:7, 8ЕЦ ГО NΟ:9, 8Ер ГО ЦО:11, 8Ер ГО ЦО:13, 8Ер ГО ЦО:15, 8Ер ГО ЦО:17, 8Ер ГО ЦО:19, 8Ер ГО ЦО:21, 8ЕР ГО NΟ:23, 8Ер ГО ЦО:25, 8Ер ГО ЦО:27, 8Ер ГО ЦО:29, 8Ер ГО ЦО:31, 8Ер ГО ЦО:33, 8Ер ГО NΟ:35, 8ЕР ГО ЦО:37, 8Ер ГО ЦО:39, 8Ер ГО ЦО:41, 8Ер ГО ЦО:43, 8Ер ГО ЦО:45, 8Ер ГО ЦО:47, 8Ер ГО NΟ:49, 8ЕР ГО ЦО:51, 8Ер ГО ЦО:53, 8Ер ГО ЦО:55, 8Ер ГО ЦО:57, 8Ер ГО ЦО:59, 8Ер ГО ЦО:61, 8Ер ГО NΟ:63, 8Ер ГО КО:65, 8Ер ГО КО:67, 8Ер ГО КО:69, 8Ер ГО ЦО:71, 8Ер ГО ЦО:73, 8Ер ГО NΟ:75, 8ЕР ГО ЦО:77, 8Ер ГО ЦО:79, 8Ер ГО ЦО:81, 8Ер ГО ЦО:83, 8Ер ГО ЦО:85, 8Ер ГО ЦО:87, 8Ер ГО NΟ:89, 8ЕР ГО ЦО:91, 8Ер ГО ЦО:93, 8Ер ГО ЦО:95, 8Ер ГО ЦО:97, 8Ер ГО ЦО:99, 8Ер ГО КО:101, 8ЕР ГО NΟ:103, 8Ер ГО МО:105, 8Ер ГО МО:107, 8Ер ГО МО:109, 8Ер ГО КО:111, 8Ер ГО ЦО:113, 8Ер ГО ЦО:115, 8Ер ГО ЦО:117, 8Ер ГО ЦО:119, 8Ер ГО ЦО:121, 8Ер ГО МО:123, 8Ер ГО МО:125, 8Ер ГО NΟ:127, 8ЕР ГО МО:129, 8Ер ГО ЦО:131, 8Ер ГО МО:133, 8Ер ГО МО:135, 8Ер ГО МО:137, 8Ер ГО
NΟ:139, 8ЕР ГО ЦО:141, 8Ер ГО МО:143, 8Ер ГО МО:145, 8Ер ГО ЦО:147, 8Ер ГО МО:149, 8Ер ГО
ЦО:151, 8Ер ГО МО:153, 8Ер ГО МО:155, 8Ер ГО МО:157, 8Ер ГО МО:159, 8Ер ГО ЦО:161, 8Ер ГО
NΟ:163, 8Ер ГО МО:165, 8Ер ГО КО:167, 8Ер ГО МО:169, 8Ер ГО ЦО:171, 8Ер ГО МО:173, 8Ер ГО
NΟ:175, 8ЕР ГО ЦО:177, 8Ер ГО МО:179, 8Ер ГО ЦО:181, 8Ер ГО МО:183, 8Ер ГО МО:185, 8Ер ГО
NΟ:187, 8ЕР ГО МО:189, 8Ер ГО ЦО:191, 8Ер ГО МО:193, 8Ер ГО МО:195, 8Ер ГО МО:197, 8Ер ГО
NΟ:199, 8ЕР ГО КО:201, 8Ер ГО КО:203, 8Ер ГО КО:205, 8Ер ГО КО:207, 8Ер ГО КО:209, 8Ер ГО
ЦО:211, 8Ер ГО МО:213, 8Ер ГО МО:215, 8Ер ГО ЦО:217, 8Ер ГО МО:219, 8Ер ГО ЦО:221, 8Ер ГО
NΟ:223, 8ЕР ГО ЦО:225, 8Ер ГО ЦО:227, 8Ер ГО ЦО:229, 8Ер ГО ЦО:231, 8Ер ГО ЦО:233, 8Ер ГО
NΟ:235, 8ЕР ГО ЦО:237, 8Ер ГО ЦО:239, 8Ер ГО ЦО:241, 8Ер ГО ЦО:243, 8Ер ГО ЦО:245, 8Ер ГО
NΟ:247, 8Ер ГО ЦО:249, 8Ер ГО ЦО:251, 8Ер ГО ЦО:253, 8Ер ГО ЦО:255, 8Ер ГО ЦО:257, 8Ер ГО
NΟ:259, 8Ер ГО ЦО:261, 8Ер ГО КО:263, 8Ер ГО КО:265, 8Ер ГО КО:267, 8Ер ГО КО:269, 8Ер ГО
ЦО:271, 8ЕР ГО ЦО:273, 8Ер ГО ЦО:275, 8Ер ГО ЦО:277, 8Ер ГО ЦО:279, 8Ер ГО ЦО:281, 8Ер ГО
NΟ:283, 8ЕР ГО ЦО:285, 8Ер ГО ЦО:287, 8Ер ГО ЦО:289, 8Ер ГО ЦО:291, 8Ер ГО ЦО:293, 8Ер ГО
NΟ:295, 8Ер ГО ЦО:297, 8Ер ГО ЦО:299, 8Ер ГО КО:301, 8Ер ГО МО:303, 8Ер ГО КО:305, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
- 125 019971
В другом варианте осуществления этого изобретения один или несколько полипептидов с активностью альдолазы КНС, кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой 8ΕΟ ΙΌ N0:307, 8Ε0 ΙΌ N0:309, 8Ε0 ΙΌ N0:311, 8Ε0 ΙΌ
N0:313, 8ΕΟ ΙΌ N0:315, 8ΕΟ ΙΌ N0:317, 8ΕΟ ΙΌ N0:319, 8ΕΟ ΙΌ N0:321, 8ΕΟ ΙΌ N0:323, 8ΕΟ ΙΌ
N0:325, 8ΕΟ ΙΌ N0:327, 8ΕΟ ΙΌ N0:329, 8ΕΟ ΙΌ N0:331, 8ΕΟ ΙΌ N0:333, 8ΕΟ ΙΌ N0:335, 8ΕΟ ΙΌ
N0:336, 8Ε0 ΙΌ N0:337 и 8Ε0 ΙΌ N0:338, могут быть пригодны для облегчения реакции между замещенным индол-3-пируватом и источником С3-углерода.
В одном варианте осуществления группа заместителя в замещенном индол-3-пирувате представляет собой атом галогена, присоединенный к любому атому углерода индольного кольца. В другом варианте осуществления группа заместителя представляет собой атом хлора, присоединенный к любому атому углерода индольного кольца. В другом варианте осуществления производное монатина представляет собой 4-гидрокси-4-(6-метилиндол-3-илметил)глутаминовую кислоту.
Полипептиды, обладающие активностью альдолазы и в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения, можно применять в многостадийном каскаде, в котором одна или несколько стадий представляют собой реакцию химического синтеза. Например, в некоторых вариантах осуществления один или несколько полипептидов, обладающих активностью альдолазы, могут облегчать реакцию между пируватом и индол-3-пируватом с образованием предшественника монатина. Затем предшественник монатина можно очищать. Затем можно использовать реакцию восстановительного аминирования предшественника монатина с получением монатина.
Полипептиды, обладающие активностью альдолазы и в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения, а также другие ферменты, используемые в процессе получения монатина и производных монатина, можно использовать в чистой, неочищенной, выделенной форме или в форме суспензии с сульфатом аммония.
Полипептиды, обладающие активностью альдолазы и в соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого изобретения, можно оптимизировать с использованием стабилизаторов, включая дитиотреитол (БТТ) и β-меркаптоэтанол.
Монатин или производное монатина, которые получают с использованием одного или несколько полипептидов, описанных в настоящем документе, как правило, по меньшей мере приблизительно на от 50 до приблизительно до 99% представляют собой К,К-монатин или К,К-производное монатина по массе от всего полученного монатина или производного монатина. В других вариантах осуществления монатин или производное монатина, полученные с использованием одного или нескольких полипептидов, описанных в настоящем документе, более чем на 60% представляют собой К,К-монатин или К,Кпроизводное монатина по массе от всего полученного монатина; например, К,К-монатин ИЛИ К,Кпроизводное монатина составляют 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% от всего полученного монатина или производного монатина. Альтернативно различные количества двух или более препаратов монатина или производного монатина можно комбинировать с получением препарата, который обладает требуемой процентной долей К,К-монатина или К,К-производного монатина. Например, препарат монатина, который представляет собой 60% К,К-монатин, можно комбинировать с препаратом монатина, который представляет собой 90% К,К-монатин; при комбинировании равных количеств препаратов 60% и 90% К,К-монатина полученный препарат монатина представляет собой 75% К,К-монатин.
Монатин или производное монатина, или промежуточное соединение (включая предшественник монатина), полученные с использованием одного или нескольких полипептидов, описанных в настоящем документе, можно очищать от компонентов реакции. В одном варианте осуществления монатин, производное монатина или промежуточное соединение, такое как предшественник монатина, можно очищать простым удалением вещества, которое подлежит очистке от препарата фермента, в котором его синтезировали.
В других вариантах осуществления промежуточное соединение, предшественник монатина, монатин или производное монатина очищают из препарата, в котором их синтезировали, чтобы полученная очищенная композиция или препарат представляли собой по меньшей мере приблизительно 5-60% монатин по массе от всех органических соединений. В другом варианте осуществления монатин, производное монатина или промежуточное соединение, такое как предшественник монатина, можно очищать до степени чистоты по меньшей мере приблизительно 70, 80, 90, 95 или 99% от массы всех органических соединений. Монатин, производное монатина или промежуточное соединение (включая предшественник монатина), полученные с применением одного или нескольких полипептидов, описанных в настоящем документе, можно очищать от компонентов реакции любым способом, известным специалисту в данной области. В оптимальном случае очищенный монатин или промежуточное соединение можно повторно перекристаллизовывать до достижения требуемой степени чистоты.
Представленные ниже примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения заявленного изобретения.
Примеры
Пример 1. Детекция монатина, предшественника монатина, триптофана, аланина, аспартата и глу
- 126 019971 тамата.
В этом примере описаны способы, используемые для детекции наличия монатина, предшественника монатина (МР), триптофана, аспартата, аланина и глутамата. Также в нем описан способ разделения и детекции четырех стереоизомеров монатина.
Анализ монатина и триптофана посредством множественного мониторинга реакции (МВМ) БС/М8/М8.
Анализы смесей монатина и триптофана, образованных посредством биохимических реакций ш νί!го или 1п νίνο проводили с использованием устройства для жидкостной хроматографии-тандемной массспектрометрии (ЬС/М8/М8) ^а!егк/М1сготакк, включающего жидкостной хроматограф ^а!егк 2795 с монитором поглощения ^а!егк 996 Рйо!о-Июбе Аггау (РОА), помещенным последовательно между хроматографом и тройным квадрупольным масс-спектрометром Мюготакк ОиаИго ИШта. Разделение посредством ЬС проводили с использованием обращенно-фазовой хроматографической колонки Х!егга М8 С8, 2,1 мм х 250 мм при 40°С. Подвижная фаза ЬС состояла из А) воды, содержащей либо (ί) 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, либо (ίί) 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония, и В) метанола, содержащего либо (ί) 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, либо (ίί) 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония.
Если подвижная фаза ЬС состояла из А) воды, содержащей 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, и В) метанола, содержащего 0,05% (об./об.) трифторуксусную кислоту, градиентное элюирование было линейным от 5% В до 35% В, 0-4 мин, линейным от 35% В до 60% В, 4-6,5 мин, линейным от 60% В до 90% В, 6,5-7 мин, изократическим при 90% В, 7-11 мин, линейным от 90% В до 95% В, 11-12 мин, линейным от 95% В до 5% В, 12-13 мин, с периодом повторного уравновешивания в течение 2 мин между экспериментами. Скорость потока составляла 0,25 мл/мин, и мониторинг поглощения РОА проводили от 200 нм до 400 нм. Все параметры Е81-М8 были оптимизированы и выбраны на основе образования протонированных молекулярных ионов ([М+Н]+) представляющих интерес анализируемых веществ и продукции характерных фрагментарных ионов. Следующие инструментальные параметры использовали для анализа посредством множественного мониторинга реакции (МВМ) посредством ЬС/М8/М8 монатина и триптофана: капилляр: 3,5 кВ; воронка: 40 В; шестигранник 1: 20 В; отверстие: 0 В; шестигранник 2: 0 В; температура источника: 100°С; температура десольватации: 350°С; газ для десольватации: 500 л/ч; газ воронки: 50 л/ч; разрешение для низких масс (01) : 12,0; разрешение для высоких масс (01) : 12,0; энергия ионов: 0,2; вход: -5 В; энергия столкновений: 8; выход: IV; разрешение для низких масс (02): 15; разрешение для высоких масс (02) : 15; энергия ионов (02) : 3,5; умножитель: 650. Для специфичной детекции монатина в реакциях ш νίίτο и ш νίνο используют пять специфичных для монатина переходов МВМ от исходного вещества к продукту. Подвергаемые мониторингу переходы представляют собой от 293,1 до 158,3, от 293,1 до 168,2, от 293,1 до 211,2, от 293,1 до 230,2 и от 293,1 до 257,2. Мониторинг триптофана проводят при переходе МВМ от 204,7 до 146,4. Для количественного определения внутреннего стандарта монатина и триптофана анализируют четыре калибровочных стандарта, содержащих четыре различных соотношения каждого анализируемого вещества для б5-триптофан и б5-монатина. Эти данные подвергают линейному анализу наименьших квадратов с получением калибровочной кривой для монатина и триптофана. К каждому образцу добавляют фиксированное количество б5-триптофана и б5монатина (б5-монатин синтезировали из б5-триптофана в соответствии со способами \УО 03/091396 А2), и соотношения ответов (монатин/б5-монатин; триптофан/б5-триптофан) используют совместно с калибровочными кривыми, описанными выше, для вычисления количества каждого анализируемого вещества в смесях.
Если подвижная фаза ЬС представляла собой А) воду, содержащую 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония, и В) метанол, содержащий 0,3% муравьиную кислоту и 10 мМ формиат аммония, градиентное элюирование было линейным от 5% В до 45% В, 0-8,5 мин, линейным от 45% В до 90% В,
8,5-9 мин, изократическим от 90% В до 90% В, 9-12,5 мин, линейным от 95% В до 5% В, 12,5-13 мин, с периодом повторного уравновешивания в течение 4 мин между экспериментами. Скорость потока составляла 0,27 мл/мин, и поглощение РОА подвергали мониторингу от 210 нм до 400 нм. Все параметры Е81-М8 оптимизировали и выбирали, исходя из образования протонированных молекулярных ионов ([М+Н]+) представляющих интерес анализируемых веществ и образования характерных фрагментарных ионов. Инструментальные параметры, используемые для этой вторичной подвижной фазы, являются такими, как указано выше. Четыре специфичных для монатина перехода МВМ от исходного вещества к продукту и один специфичный для триптофана переход от исходного вещества к продукту используют для специфичной детекции монатина и триптофана в реакциях т νίίτο и т νίνο. Подвергаемые мониторингу переходы представляют собой от 293,1 до 158,0, от 293,1 до 168,0, от 293,1 до 211,5 и от 293,1 до 257,0. Триптофан подвергают мониторингу при переходе МВМ от 205,2 до 146,1. Для количественного определения внутреннего стандарта монатина и триптофана анализируют четыре калибровочных стандарта, содержащих четыре различных соотношения каждого из анализируемых веществ для б5триптофана и б5-монатина. Эти данные подвергают линейному анализу наименьших квадратов с получением калибровочной кривой для монатина и триптофана. К каждому образцу добавляют фиксированное количество б5-триптофана и б5-монатина (б5-монатин синтезировали из б5-триптофана в соответст
- 127 019971 вии со способами 4003/091396 А2), и соотношения ответов (монатин/б5-монатин; триптофан/б5триптофан) совместно с калибровочными кривыми, описанными выше, используют для вычисления количества каждого анализируемого вещества в смесях. Подвергаемые мониторингу переходы масс от исходного вещества к продукту для б5-триптофана и б5-монатина представляют собой от 210,2 до 151,1 и от 298,1 до 172,0 соответственно.
Точное определение массы монатина
Анализ М8 с высоким разрешением проводили с использованием гибридного квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра АррИеб В1окук!етк-Регк1п Ε1ιικγ 0-8!аг. Для измерения массы протонированного монатина использовали триптофан в качестве внутреннего калибровочного стандарта массы. Вычисленная масса протонированного монатина, исходя из элементного состава ^4^7^05, составляет 293,1137. Монатин, полученный с использованием биокаталитического процесса, описанного в примерах 2 и 3, показал измеренную массу 293,1144. Это представляет собой ошибку измерения массы менее 2 миллионных долей (м.д.), что представляет собой убедительное доказательство элементного состава монатина, полученного ферментативно.
Хиральное определение монатина посредством ЬС/М8/М5 (МКМ)
Определение стереоизомерного распределения монатина в реакциях т νίίΐΌ и т νί\Ό проводили посредством получения производного с 1-фтор-2-4-динитрофенил-5-Ь-аланинамидом (РВАА), с последующим измерением с помощью МКМ посредством обращенно-фазовой ЬС/М8/М8.
Образование производного монатина с РБАА
К 50 мкл образца или стандарта и 10 мкл внутреннего стандарта добавляли либо 100 мкл, либо 200 мкл 1% раствора РБАА в ацетоне. Добавляли двадцать или сорок мкл, соответственно, 1,0 М бикарбоната натрия, и смесь инкубировали в течение 1 ч при 40°С при периодическом перемешивании. Образец извлекали и охлаждали, и нейтрализовывали 20 мкл 2,0 М НС1 (большее количество НС1 может быть необходимым для достижения нейтрализации забуференной биологической смеси). После завершения дегазирования образцы были готовы для анализа посредством ЬС/М8/М8.
Множественный мониторинг реакции посредством ЬС/М8/М8 для определения стереоизомерного распределения монатина в реакциях т νί!ΐΌ и т νί\Ό
Анализы проводили с использованием оборудования для ЬС/М8/М8, описанного выше. Разделение посредством ЬС, которая может разделять все четыре стереоизомера монатина (конкретно, РВААмонатина), проводили на обращенно-фазовой хроматографической колонке РНепотепех Ьипа 2,0x250 мм (3 мкм) С18 (2) при 40°С. Подвижная фаза ЬС состояла из А) воды, содержащей 0,05% (мас./об.) ацетата аммония, и В) ацетонитрила. Элюирование было изократическим при 13% В, 0-2 мин, линейным от 13% В до 30% В, 2-15 мин, линейным от 30% В до 80% В, 15-16 мин, изократическим при 80% В, 16-21 мин, и линейным от 80% В до 13% В, 21-22 мин, с периодом повторного уравновешивания 8 мин между экспериментами. Скорость потока составляла 0,23 мл/мин, и мониторинг поглощения РБА проводили при от 200 нм до 400 нм. Все параметры Ε8I-М8 оптимизировали и выбирали, исходя из образования депротонированных молекулярных ионов ([М-Н]-) РБАА-монатина и образования характерных фрагментарных ионов.
Следующие инструментальные параметры использовали для анализа ЬС/М8 монатина в режиме Ε8Ι^8 отрицательных ионов: капилляр: 2,0 кВ; воронка: 25 В; шестигранник 1: 10 В; отверстие: 0 В; шестигранник 2: 0 В; температура источника: 100°С; температура десольватации: 350°С; газ для десольватации: 500 л/ч; газ воронки: 50 л/ч; разрешение для низких масс (01): 12,0; разрешение для высоких масс (01): 12,0; энергия ионов: 0,2; вход: -5 В; энергия столкновений: 20; выход: 1 В; разрешение для низких масс (02): 12; разрешение для высоких масс (02): 12; энергия ионов (02): 3,0; умножитель: 650. Для специфичной детекции РВАА-монагана в реакциях ш νί!ΐΌ и т νί\Ό использовали три специфичных для РБАА-монатина перехода от исходного материала к продукту. Переходы, отслеживаемые для монатина, представляют собой от 543,2 до 268,1, от 543,2 до 499,3 и от 543,2 до 525,3. Отслеживаемый переход масс внутреннего стандарта производного монатина представлял собой от 548,2 до 530,3. Идентификация стереоизомеров РВАА-монатина основана на хроматографическом времени удержания по сравнению с очищенными синтетическими стереоизомерами монатина и данных масс-спектрометрии. Внутренний стандарт используют для мониторинга хода реакции и для подтверждения времени удержания 8,8-стереоизомера.
Детекция посредством жидкостной хроматографии-послеколоночной флуоресценции аминокислот, включая глутамат и аланин
Жидкостную хроматографию с послеколоночной детекцией флуоресценции (ЬС/0РА) для определения глутамата и аланина в реакциях т νίίΐΌ и т νί\Ό проводили на системе 4а!егк 2690 ЬС или эквивалентной системе в сочетании со сканирующим детектором флуоресценции 4а!егк 474 и послеколоночным реакционным модулем 4а!егк. Также с использованием этого способа проводили полуколичественные анализы монатина и триптофана. Разделение ЬС проводили на реакционной ионообменной колонке, нагруженной натрием при 60°С. Подвижная фаза А представлял собой буфер Рккегшд № 328 (Рккегшд ЬаЬога!опек, Ичс.; Моип!ат У1е\\', СА). Подвижная фаза В представляла собой буфер Рккегшд № 740. Градиентное элюирование было от 0% В до 100% В, 0-20 мин, изократическим при 100% В, 20-36 мин, и
- 128 019971 линейным от 100% В до 0% В, 36-37 мин, с периодом уравновешивания между экспериментами по меньшей мере 5 мин, в зависимости от матрицы образцов. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин. Скорость потока для послеколоночного раствора для образования производных ОРА составляла 0,5 мл/мин. Параметры детектора флуоресценции представляли собой ЕХ 338-340 нм и Ет 420-425 нм. В качестве внутреннего стандарта для анализа использовали норлейцин. Идентификация аминокислот была основана на данных хроматографического времени удержания для очищенных стандартов.
Детекция Ь- и ϋ-аминокислот посредством БС/М8/М8
Образцы, содержащие смесь Ь- и Ό-аминокислот, таких как лизин, аланин, метионин, тирозин, лейцин, фенилаланин, триптофан, глутамат и аспартат из экспериментов с биохимическими реакциями, сначала обрабатывали муравьиной кислотой для денатурации белка. Затем перед анализом ЙС/М8/М8 образец центрифугировали и фильтровали через 0,45-мкм нейлоновый инъекционный фильтр. Идентификация Ь- и Ό-аминокислот была основана на времени удержания и селективной детекции масс. Разделение ЬС проводили с использованием системы для жидкостной хроматографии \Уа1егк 2690 и хроматографической колонки А8ТЕС 2,1 мм х 250 мм СЫгоЫобс ТАС с температурой колонки, установленной при 45°С. Подвижные фазы ЬС А и В представляли собой 0,25% уксусную кислоту и 0,25% раствор уксусной кислоты в метаноле соответственно. Изократическое элюирование использовали для всех способов разделения Ь- и Ό-изомеров. Лизин элюировали с использованием 80% подвижной фазы А и 20% В. Глутамат, аланин и метионин разделяли с элюированием 60% подвижной фазы А и 40% В и скоростью потока 0,25 мл/мин. Аспартат, триптофан, тирозин, лейцин, и фенилаланин разделяли на изомеры с 30% подвижной фазой А и 70% В со скоростью потока 0,3 мл/мин для всех из них, кроме фенилаланина, который пропускали со скоростью потока 0,25 мл/мин.
Система детекции для анализа Ь- и ϋ-аминокислот включала детектор \Уа1егк 996 Рйо1о-Оюйе Аггау (РОА) и тройной квадрупольный масс-спектрометр Мюготакк Циайто ИШта. РОА, сканирующий при от 195 до 350 нм, помещали последовательно между хроматографической системой и масс-спектрометром. Параметры тройного квадрупольного масс-спектрометра Мютотакк Циайто ИШта, действующего в режиме положительной электрораспылительной ионизации (+Е8Ц были установлены следующим образом: капилляр: 3,0 кВ; воронка: 2 0 В; шестигранник 1: 15 В; отверстие: 1 В; шестигранник 2: 0 В; температура источника: 100°С; температура десольватации: 350°С; газ для десольватации: 530 л/ч; газ воронки: 30 л/ч; разрешение для низких масс Ц1: 12,5; разрешение для высоких масс Ц1: 12,5; энергия ионов 1: 0,2; вход: -5; столкновение: 8; выход 1: 10; разрешение для низких масс 02: 12,5; разрешение для высоких масс 02: 12,5; энергия ионов 2: 0,5; умножитель: 650 В. Эксперименты М8/М8 в режиме множественного мониторинга реакции (МКМ) были предназначены для селективного мониторинга реакционных переходов от 147,8 до 84,2 и от 147,8 до 102,1 для глутамата, от 134,00 до 74,30, и от 134,00 до 88,2 для аспартата, от 147,3 до 85,0 для лизина, от 150,3 до 104,8 для метионина, от 182,3 до 137,0 для тирозина, от 132,3 до 87,0 для лейцина и от 166,3 до 121,0 для фенилаланина. В случае, где приведены два перехода, для количественного определения использовали последний переход. Для триптофана эксперименты М8/М8 с режимом множественного мониторинга реакции (МКМ) были предназначены для селективного мониторинга реакционных переходов от 205,2 до 118,2, от 205,2 до 146,1 и от 205,2 до 188,2, и перехода от 212,1 до 151,1 для й8-ОЬ-триптофана. Количественное определение триптофана проводили посредством определения соотношения ответа анализируемых веществ для перехода от 205,2 до 146,1 по сравнению с внутренним стандартом, й8-О,Ь-триптофаном. Альтернативно количественное определение триптофана, глутамата и аспарагиновой кислоты было основано на сигнальных ответах 111//=146,5, т//=102,1 и т//=88,2 соответственно.
Получение монатина и предшественника монатина (МР) для стандартов и для анализов образования монатина
Получение монатина
Рацемическую смесь К,К- и 3,3-монатина синтетически получали, как описано в патенте США № 5128482.
К,К- и 8,8-монатин разделяли посредством стадии образования производного и гидролиза. В кратком изложении, рацемическую смесь монатина этерифицировали, свободную аминогруппу блокировали посредством СЬ/, получали лактон, и 3,3-лактон повергали селективному гидролизу с использованием иммобилизованного фермента протеазы. Также монатин можно разделять, как описано в Ваккой, А. е! а1., Еиг. 1. 0гд. Сйет., 8:1652-1658, (2005).
Получение МР
К-МР получали переаминированием К,К-монатин с использованием Ό-аминотрансферазы с широким диапазоном АТ-103 (В1оСа1а1уйск, Ракайепа, СА) в 0,1 М фосфатно-калиевом буфере, с использованием пирувата натрия в качестве акцептора амино. 8-МР получали переаминированием 3,3-монатина с использованием Ь-аминотрансферазы АТ-102 (В1оСа1а1уйск, Ракайепа, СА) в 0,1 М фосфатно-калиевом буфере, с использованием пирувата натрия в качестве акцептора амино. Обе реакции проводили при 30°С и при рН приблизительно 8,0-8,3 приблизительно в течение 20 ч. Оба соединения очищали с использованием препаративной масштабной ВЭЖХ с гидрофобной смолой Койт апй Наак (Рййайе1рй1а, РА) (ХАОТМ 1600) с элюированием в воде. Образцы, содержащие предшественник монатина с чистотой
- 129 019971 более 90%, собирали и высушивали сублимированием.
Пример 2. Детекция предшественника монатина.
В этом примере описаны способы, использованные для разделения и детекции двух энантиомеров предшественника монатина.
Нехиральный способ детекции предшественника монатина
Реакционные образцы из 96-луночных планшетов инъецировали в колонку Адйеп! 2огЬах КХ-С 18, 3,5 мкм, 3,0x150 мм использованием автоматического устройства для забора образцов СТСРа1 (^ΕЛР Тес11по1од1ек, СаггЬого, N.0.). Продукты разделяли с использованием градиента Н2О/АСN (0,1% муравьиная кислота):
время: 0,00 мин 5% В;
время: 4,00 мин 100% В;
время: 5,00 мин 100% В;
время: 5,10 мин 5% В;
время: 6,50 мин 5% В.
Градиент получали посредством насосов БС-ШАБур (Ыптабхи, КуоЮ, 1арап) при 0,8 мл/мин. Продукты подвергали детекции с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра АРМ000 ТигЬо1оп-8ргау (Аррйеб В1окук1етк, Рок1ег Сйу, СА). Ионораспыление и множественный ионный мониторинг проводили для представляющих интерес анализируемых веществ в режиме отрицательных ионов, и каждый анализ продолжался 6,5 мин.
Пируват = 87,1 [М-Н+]-.
Индол-3-пируват = 202,1 [М-Н+]-.
Продукт = 290,0 [М-Н+]-.
Хиральный анализ СЕ предшественников К- и 8-монатина
Использовали устройство для капиллярного электрофореза Р/АСЕ™ МБР (Весктап СоиИег, Ри11ег1оп, СА). Использовали набор для С1пга1 ^еνе1οртеηΐ, и он включает небольшие количества нескольких хиральных селекторов, необходимые буферы и 2 капилляра (Весктап СоиЙег, РиНейоп, СА). Альтернативно, для анализа только МР, следующие реагенты и другие ресурсы можно получать отдельно от Весктап СоиИег (РиНейоп, СА) или в другом месте:
покрытый капилляр N-СН0;
мкм ГБ, общая длина 65 см или слитые капилляры из диоксида кремния;
5 мМ фосфатный буфер, рН 5;
мг гидроксипропил-в-циклодекстрин;
кондиционирующий раствор для капилляров, 10 мл (альтернативно можно использовать 0,5% раствор оксида полиэтилена, Мм 600000 или 300000 Да).
Анализ посредством капиллярного электрофореза (СЕ)
Капилляры с нейтральным покрытием, ГО 50 мкм, 60 см (50 см для детекции) или 30 (20) см, использовали совместно с детекцией посредством БАБ (или простого УФ) при 214 нм. Капилляр для разделения термостатировали при 15°С, образцы при 4°С. Буфер для разделения представлял собой 20 мМ гидроксипропил-в-циклодекстрин, 25 мМ фосфат, рН 5. Инъекцию образца, как правило, проводили при 0,5 фунт/кв.дюйм (3432 Па), 5 с. Разделение проводили при 500 В/см, обратной полярности (15 кВ в для капилляра 30 см, 30 кВ для 60 см). Обычный ток, используемый в ходе разделения, представлял собой 28 мкА. Обычное время миграции для пиков МР составляло приблизительно 3,5 мин (эффективная длина 20 см) или 8 мин (50 см).
В необязательной стадии очистки/промывания/кондиционирования капилляров, перед прогоном образцов, использовали Н2О, 4 мин, 0,1 М НС1, 1 мин, Н20 1,5 мин, кондиционирующий раствор для капилляров, 4 мин, Н20, 1 мин, буфер для разделения, 4 мин.
Обобщенный способ анализа представляет собой: промывание буфером для разделения, 1-2 мин, инъекция образца в течение 5 с при 0,5 фунт/кв.дюйм (3432 Па), разделение 5-10 мин при обратной полярности напряжения 15 или 30 кВ, в зависимости от длины капилляра.
Пример 3. Основной анализ для пируватальдо лаз.
В иллюстративном способе для измерения активности различных пируватальдолаз используют основной субстрат 4-карбокси-4-гидрокси-2-оксоадипат (СНА). Анализ СНА был адаптирован из литературных анализов (см., например, Е.Е. Беккег & К.Р. Кйкоп, Б Вю1. Сйет. 267, 10507-10514, 1992). Типичный анализ включал 50 мМ фосфат натрия рН 7,5, 1 мМ МдС12, 1 мМ СНА, 10 мкг/мл Блактатдегидрогеназы (ББН) из БасЮЬасШик 1еюйтапп ^дта-АШНсй, 8ΐ. Бошк, М0), 0,5 мМ НАБН. Анализ начинали добавлением фермента (как правило, между от 1 до 5 мкл). Высвобождение пирувата, сопряженное с образованием ОАБ', постоянно подвергали мониторингу в спектрофотометре при 340 нм.
СНА синтезировали в соответствии со способом, описанным в Таск, В. Р. Сйартап, Р. Б, и 8. Бад1еу. Б Вю1. СНет. 247 6438-6443 (1972).
Единицу активности фермента, такого как фермент пируватальдолаза, такая как альдолаза НМС
- 130 019971 и/или КНС, определяют как количество, которое высвобождает достаточное количество пирувата для снижения поглощения при 340 нм на 1 ΘΌ в минуту.
Пример 4. Выявление новых альдолаз кетогидроксиглутарата (КНС) и гидроксиметилкетоглутарата (НМС) из библиотек окружающей среды О1уегка.
Более 150 уникальных альдолаз НМС и 15 альдолаз КНС было обнаружено посредством скрининга библиотек ДНК Эхуегка. Эти гены альдолазы секвенировали и субклонировали в пригодный экспрессирующий вектор. Затем этот вектор трансформировали в пригодного экспрессирующего хозяина для продукции достаточных количеств альдолазы в целях охарактеризации фермента. Выбранную группу альдолаз тестировали в отношении активности на СНА, а также в отношении образования предшественника монатина (МР). Все выявленные и описанные в этом патенте ферменты обладают потенциалом в отношении применения в других реакциях образования углерод-углеродной связи между акцептором альфакетокислоты и донором пирувата или производного пирувата, как проиллюстрировано на общей схеме реакции, ниже.
В = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;
В2= Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил;
В3 = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил, карбоновая кислота.
Пример 5. Охарактеризация отобранных альдолаз.
Отобранные альдолазы охарактеризовывали в отношении их способности катализировать превращение индол-3-пирувата и пирувата в предшественник монатина (МР), как показано на следующей схеме:
На фиг. 13 и 14 представлена активность 58 различных альдолаз в отношении образования МР, измеренная посредством ЬС/М8/М8.
Альдольные реакции проводили с 20 мМ индол-3-пируватом (ВР), 50 мМ пируватом, 100 мМ фосфатом натрия рН 7, 1 мМ МдС12, 100 мкг/мл альдолазы. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в темноте. Аликвоты (30 мкл) удаляли через различные промежутки времени, и реакции останавливали, оставляя образцы на льду. Часть каждой аликвоты подвергали анализу СЕ, в то время как остальную часть разбавляли 1:1000 в 50% ацетонитриле и подвергали анализу ЕС/М8.
- 131 019971
Таблица 2. Энантиоселективность различных альдолаз в отношении образования МР из ВР и пирувата, определенная посредством хиральной СЕ
Альдолаза % К-МР (момент времени 23 часа) СНА (Е/мг) (исходя из общего белка в лизате) Относительная экспрессия
8ЕО ГО N0:28 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:27) 98+ 31,8 ###
8Εζ) ГО N0:116 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:115) 95 304 ##
8Εζ) ГО N0:76 (кодируемая 8Εζ> ГО N0:75) 50 424 ###
8Е0 ГО N0:298 (кодируемая 8Е0 ГО N0:297) 98+ 388 ##
8Εζ> ГО N0:44 (кодируемая 8Εζ> ГО N0:43) 70 332 ##
8Εζ) ГО N0:54 (кодируемая 8Еф ГО N0:53) 98+ 95 #
8Е0 ГО N0:148 (кодируемая 8Еф ГО N0:147) 90 200 ##
8Е0 ГО N0:46 (кодируемая 8Еф ГО N0:45) 70 174 ##
8Еф ГО N0:134 (кодируемая 8Еф ГО N0:133) 90 576 ###
8Е0 ГО N0:142 (кодируемая 8Е0 ГО N0:141) 98+ 55 #
8Е0 ГО N0:122 (кодируемая 8Εζ> ГО N0:121) 98+ 38 ##
8Е0 ГО N0:74 (кодируемая 8Еф ГО N0:73) 80 484 ###
8Е0 ГО N0:64 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:63) 95 38 #
8Е0 ГО N0:108 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:107) 98+ 40 #
8Εζ) ГО N0:96 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:95) 98+ не выявлено #
8Е0 ГО N0:126 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:125) 95 124 ##
8Е0 ГО N0:80 (кодируемая 8Е0 ГО N0:79) 98+ не выявлено #
8Е0 ГО N0:36 (кодируемая 8Еф ГО N0:35) 98+ 80 ##
8Е0 ГО N0:62 (кодируемая 8Еф ГО N0:61) 98+ не выявлено #
- 132 019971
ЗЕО ГО N0:112 (кодируемая ЗЕО ГО N0:111) 98+ не выявлено #
ЗЕО ГО N0:130 (кодируемая ЗЕО ГО N0:129) 98+ 38 ##
ЗЕО ГО N0:94 (кодируемая ЗЕО ГО N0:93) 98+ 47 ##
БЕЦ ГО N0:102 (кодируемая 8Е0 ГО N0:101) не выявлено не выявлено #
ЗЕО ГО N0:58 (кодируемая 8Е0 ГО N0:57) 98+ 59 ##
8Е0 ГО N0:88 (кодируемая ЗЕО ГО N0:87) 50 510 ###
8Е0 ГО N0:50 (кодируемая ЗЕО ГО N0:49) 98+ 144 ##
ЗЕО ГО N0:106 (кодируемая 8Е0 ГО N0:105) 98+ не выявлено ##
ЗЕО ГО N0:40 (кодируемая ЗЕО ГО N0:39) 40 406 ###
ЗЕО ГО N0:42 (кодируемая 8Е0 ГО N0:41) 98+ 92 ##
8Е0 ГО N0:278 (кодируемая 8Е0 ГО N0:277) 95 2,0 #
8Е0 ГО N0:162 (кодируемая ЗЕО ГО N0:161) 95 11,8 #
ЗЕО ГО N0:276 (кодируемая ЗЕО ГО N0:275) 98+ 100,4 ####
ЗЕО ГО N0:178 (кодируемая ЗЕО ГО N0:177) 95 38,8 #
ЗЕО Ю N0:202 (кодируемая ЗЕО ГО N0:201) не выявлено не выявлено #
ЗЕО ГО ΝΟ: 166 (кодируемая ЗЕО ГО N0:165) 98+ 85,5 ##
ЗЕО ГО N0:218 (кодируемая ЗЕО ГО N0:217) 95 49,1 ##
ЗЕО ГО N0:224 (кодируемая ЗЕО ГО N0:223) 98+ 23,2 #
ЗЕО ГО N0:226 (кодируемая ЗЕО ГО N0:225) 98+ 128,3 #
ЗЕО ГО N0:244 (кодируемая ЗЕО ГО N0:243) 98+ 40,4
ЗЕО ГО N0:250 (кодируемая ЗЕО ГО N0:249) 95 6,0 #
ЗЕО ГО N0:252 (кодируемая ЗЕО ГО N0:251) 95 20,2 ##
- 133 019971
8Е<3 ГО N0:264 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:263) 95 9,9 ##
8Е0 ГО N0:268 (кодируемая ЗЕГ) ГО N0:267) 95 2,0 #
8Εζ) ГО N0:272 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:271) 95 6,7 #
8Е0 ГО N0:184 (кодируемая 8Е0 ГО N0:183) 95 не выявлено #
8Е0 ГО N0:282 (кодируемая 8ЕС? ГО N0:281) 95 36,7 ш
8Е0 ГО N0:186 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:185) 95 4,2 #
8Е0 ГО N0:192 (кодируемая 8Е<2 ГО N0:191) 95 11,9 #
8Е0 ГО N0:200 (кодируемая 8Е0 ГО N0:199) 95 17,9 ##
8Е0 ГО N0:280 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:279) 50 не выявлено
8Е0 ГО N0:284 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:283) 90 2,2
8Е0 ГО N0:172 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:171) 95 8,4
8Еф ГО N0:180 (кодируемая 8Еф ГО N0:179) 98+ 61,0 ###
8Е0 ГО N0:168 (кодируемая ЗЕр ГО N0:167) 98+ 9,3 #
8Е0 ГО N0:228 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:227) 98+ 38,7 ###
8Е<2 ГО N0:236 (кодируемая 8Еф ГО N0:235) 95 13,1 #
8Е0 ГО N0:238 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:237) 98+ 22,3 ##
8Е0 ГО N0:240 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:239) 95 не выявлено #
8Е0 ГО N0:270 (кодируемая 8Εζ) ГО N0:269) 40 4,6 #
8Е0 ГО N0:156 (кодируемая 8Е0 ГО N0:155) 98+ 133,0 ш
Следует отметить, что селективность в отношении Я-МР, составляющая 98+%, указывает на то, что
5-МР не выявлен. С учетом чувствительности анализа СЕ, результаты указывают на то, что по меньшей мере 98% образованного МР представляет собой Я-энантиомер. Таким образом, ферменты, которые приведены как 98+%, являются по меньшей мере на 98% селективными в отношении Я-МР и могут быть селективными вплоть до 100%.
Также в табл. 2 показана активность ферментов в отношении основного субстрата альдолазы, СНА, а также относительная экспрессия каждого фермента, определенная посредством 5Э5-РАОЕ. Следует отметить, что несколько ферментов не показали поддающейся детекции активности в отношении СНА, однако они проявляли активность в отношении образования МР.
В общем, альдолазы показывают широкий диапазон видов активности, экспрессии и селективности. Более того, существует ряд альдолаз, которые показывают чрезвычайно высокую селективность (98% или более) в отношении Я-МР.
Пример 6. Выявление растительной пируватальдолазы.
Конструировали вырожденные праймеры для ПИР (см. ниже) и использовали для экстракции генов альдолазы из кДНК, полученной из 5с1егосЫ!оп Шс1Го1шк. Получали 5'- и 3'-концы генов, а затем посредством ПТЦР амплифицировали полноразмерные гены.
- 134 019971
8Е<2 ГО ΝΟ: Название праймера Праймер
335 Р1 ΑΑΚΟΤΒΤνΥΟΑΚΟΑΟΑΑΤΟ (8Еф ГО N0:335)
336 Е2 ΟΟϋΟΑΟΑΨΟΑΑΥΟΟΚΤΟΟ (8Еф ГО N0:336)
337 К.1 ΟΟΑΤΟΚδΥΑΤΟϋΟΟΚΤΑϋΑΟΟΟΑ (8Е0 ГО N0:337)
338 К2 ΟΟΚΤΑΌΑΟΟΟΑΥΤΟΝΟΟΚΤΟ (8Еф ГО N0:338)
Пример 7. Клонирование аминотрансферазы Ό-аминокислот ВасШик крйаепсик Аминотрансферазу Ό-аминокислот (ЕС 2.6.1.21, также известную как Ό-аланинаминотрансфераза или Ό-аспартатаминотрансфераза) В. крйаепсик рекомбинантно получали для применения в сопряженных анализах с различными альдолазами. Этот фермент является гомологичным Ό-аминотрансферазам, описанным ранее для получения монатина (публикация США № 20040063175 и публикация США № 20050282260).
Штаммы
В. крйаепсик (номер АТСС 10208) выращивали на питательном агаре при 30°С в течение ночи. Группы колоний помещали в 100 мкл стерильной воды и нагревали в течение 5 минут при 95°С для разрушения клеток. 3 мкл использовали в последующих амплификациях посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Протокол полимеразной цепной реакции
Конструировали праймеры для клонирования в векторы рЕТ 28Ь и рЕТ 30а (\о\'адеп, МаШкоп, XVI) с использованием участков №о1 и ВатН1. Конструкция рЕТ 30 содержит Ν-концевые маркеры Н1к и 8, в то время как конструкция рЕТ 28 не содержит маркеров.
Праймеры ба! ВасШик крйаепсик:
Ν-концевой: 5'-ОАТАТАССАТООСАТАСТСАТТАТООААТО-3' (8ЕЦ ΙΌ ^:383) и С-концевой: 5'-ОΤΤАΤСООАΤССΤΤАООСАΤΤАΛΤΤОАААΤΤО-3' (8ЕС) ΙΌ ^:384).
Кодирующий участок амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. В 50 мкл реакционной смеси использовали 3 мкл матрицы, 1,6 мкМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого бNΤР, 3,5 Е полимеразы с высокой точностью Ехрапб Н1дй ЕШеШу Ро1утегаке (Восйе, 1пШапаройк, ΙΝ), и 1Х буфер Ехрапб™ с Мд. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, с последующими 8 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин. Двадцать два последующих цикла проводили с температурой отжига 58°С. После 30 циклов образец выдерживали при 72°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Получили чистые продукты ПЦР с правильным размером (приблизительно 850 п.н. для гена ба!).
Клонирование
Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР Ц1адеп Ц^дшск (Ц1адеп, \'а1епс1а, СА) и расщепляли посредством ВатН1 и ΝοοΙ в буфере ВатН1 (\е\\- Епд1апб Вю1аЬк, 1рк^1сй, МА).
Расщепленный вектор и вставки очищали с использованием набора для экстракции из геля Ц1адеп Ц^дшск Се1 Ех!гас!юп К1! ((фадеп, \'а1епсаа, СА). Цитирование проводили с использованием набора для лигирования ДНК Восйе Вар1б ΟΝΆ Б1да!юп К1! (Восйе, 1пб1апаро11к, ΙΝ) и очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР Ц1Адшск (Ц1адеп, Vа1еηс^а, СА). Продукты лигирования трансформировали в ЕксйепсЫа сой ЦН10В с использованием 0,2-см кюветы и системы Вю-Ваб Оепе Ри1кег II, как описано в руководстве по электропорации Вю-Ваб (Вю-Ваб, Негси1ек, СА). Клеткам давали возможность восстановиться в 900 мкл среды 8ОС в течение 30 мин при 37°С с 225 об./мин. Клетки высевали на планшеты с БВ-агаром, содержащие канамицин (25 мкг/мл).
Плазмидную ДНК очищали с использованием набора для выделения в малых количествах Ц1адеп (Ц1адеп, Vа1еηс^а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством ВашШ и Жок Последовательности плазмид, для которых было выявлено, что они обладают правильной вставкой, проверяли секвенированием посредством дидезокси-терминации цепи ДНК в Адепсоиг! Вю8с1епсе Согрогайоп (Ве¥ег1у, МА). Секвенирование подтвердило кодирующую последовательность, находящуюся в NСВI, регистрационный номер АЕ081278, участок: 134..985 (дц 3513754), которая приводит к белку с аминокислотной последовательностью, приведенной для регистрационного номера ААС33964 (§}: 3513755).
Экспрессия гена и способы анализа
Плазмидную ДНК субклонировали в экспрессирующего хозяина ВБ21(ЦЕ3) Е.сой (\о\'адеп, Маб1коп, ^Ί). Культуры выращивали и плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах Ц1адеп (Ц1адеп, Vа1еηс^а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава. Индукцию в основном проводили в среде БВ, содержащей канамицин (50 мкг/мл). Клетки выращивали до ОП60о 0,4-0,8, индуцировали посредством 0,1 мМ ГРТС (изопропил тиогалактозид), и через 4 ч после индукции проводили забор образцов. Клеточные экстракты получали в
- 135 019971 соответствии с протоколом, прилагаемым к реагенту Nоνадси Ви§Вив1сг™ (Nоνадси, Маб1воп, \\Ί) (с добавлением нуклеазы бензоназы и полного коктейля ингибиторов протеаз Восйс (Восйс, ИкПапароНв, Ш)). Получали очень высокие уровни растворимого белка с предсказанной молекулярной массой, определенной посредством 81)8-1^61:. Для некоторых реакций продукт гена рЕТ 30 очищали с использованием кассет 1 Пв-Впк! в соответствии с протоколами изготовителя (Nоνадси, Маб1воп, \\Ί). Фракции элюента подвергали обессоливанию на колонках РО-10 (С! Нса11йсагс, Р1вса1а^ау, N1) и элюировали в 25-100 мМ фосфатно-калиевом буфере, рН 7,5.
Клеточные экстракты анализировали в отношении активности Ό-аминотрансферазы, прослеживая продукцию аланина из пирувата и Ό-триптофана с использованием следующего протокола. Реакции объемом один мл в основном проводили в 100 мМ фосфатно-калиевом буфере (рН 7,5), 50 мкМ пиридоксальфосфате, 25 мМ пирувате натрия и 50 мМ Ό-триптофане. Реакции начинали добавлением бесклеточных экстрактов или очищенного фермента и инкубировали в течение 15 мин в течение ночи при 30°С при слабом встряхивании. Для остановки реакции добавляли муравьиную кислоту до двухпроцентной конечной концентрации, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Также проводили контрольные реакции без добавления белка. Также в качестве отрицательного контроля использовали нулевые моменты времени. Аланин выявляли с использованием образования производных посредством ОРА, описанного в примере 1.
Пример 8. Сравнение образования тотального монатина и распределение изомеров полипептидов с активностью альдолазы 8Εφ) ГО N0:8, 8ΕΗ ГО N0:4, 8ΕΗ ГО N0:12 и 8ΕΗ ГО N0:28 и РгоА С. 1св1ов1сгот.
Трансаминазу АТ-103 (Ό-аминотрансфераза с широкой специфичностью) приобретали от ВюСа1а1уНсв (Равабспа, СА), и либо этот фермент, либо рекомбинантный фермент, полученный по примеру 7, использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМО с образованием монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Альдолазу РгоА из С. гёвФв^ош использовали в качестве эталонной альдолазы для сравнительных целей, и ее получали, как описано в опубликованной заявке США № 20040063175 и \\'0 03091396 А2. Тестированные альдолазы выделяли и трансформировали, как описано выше в примере 4.
Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 50-мл культуры выращивали в среде ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до 0Ό600 приблизительно 0,5. Штаммы, содержащие конструкции 8ΕΕ) ГО N0:7, 8ΕΕ) ГО N0:3 и 8ΕΕ) ГО N0:11, индуцировали посредством 100 мкМ ГОТО. Штамм, содержащий конструкцию 8ΕΕ) ГО N0:27, индуцировали посредством 200 мкг/л ангидротетрациклина. Клетки выращивали в течение 5 ч после индукции, и получали клеточные экстракты в соответствии с протоколами изготовителя (Nоνадси, МасПвоп, \\'Е ВидЬив1сг реагент). Также добавляли бензонуклеазу и ингибитор протеазы. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на Вю-Ваб ЬаЬога1ог1св Εxрс^^ои Аи1оша1сб ИссГгорйогсвхв 81а11оп (Вю-Ваб, Нсгси1св, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Εxрс^^ои 8ой^агс версии 1.1.98.0.
На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС12, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Ό-аминотрансферазы В. врйаспсив, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Эксперименты проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которые не добавляли альдолазу. Образцы инкубировали 1 ч, 2 ч и в течение ночи (17-20 ч) при 30°С с осторожным встряхиванием. Небольшие количества монатина (<0,5 м.д.) образовывались в реакциях без альдолазы в течение ночи, вследствие неферментативных реакций, катализируемых магнием и фосфатом. Эти значения вычитали из чисел, представленных ниже, и показаны усредненные результаты. Единственными стереоизомерами, выявленными при получении монатина с использованием этих способов, являются В,В и 8,В.
Процентное количество В,В представлено ниже, и его определяли по площади пика обращеннофазовой ЬС.
Таблица 3. Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана и % В,В
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин, (м.д.) % К,В-монатина
8ЕЦ ГО N0:8 (1 ч) 15,65 89,7
8ЕЦ ГО N0:8(18 4) 129,22 79,0
8Е0 ГО N0:4(1 ч) 3,22 94,8
8ЕЦ ГО N0:4(18 4) 12,14 93,8
8ЕЦ ГО N0:12(1 ч) 2,35 100
8ЕЦ ГО N0:12(18 4) 11,89 98,65
8ЕЦ ГО N0:28 (1 ч) 14,70 100
8ЕЦ ГО N0:28 (18 ч) 95,14 97,35
С. 1ез1оз1егот РгоА (1 ч) очищенный фермент 16,63 86,45
С. 1ез1оз1егот РгоА (18 ч) очищенный фермент 86,86 63,1
- 136 019971
Образец 8ЕР И) N0:28 через 18 ч также анализировали в отношении распределения стереоизомеров посредством способа образования производного с ЕПАА, представленного в примере 1, который привел к результату 94,9% В,В- и 5,1% 8,В-монатина.
Те же эксперименты проводили одновременно с использованием Ь-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолаз с Ь-аминотрансферазами с широкой специфичностью НехАкрС, полученными, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260, и очищенными. Эти реакции должны приводить, главным образом, к 8,8-монатину и В,8-монатину. Также реакционные смеси дополняли 10 мМ альфа-кетоглутаратом в качестве акцептора амино для переаминирования Ь-триптофана. Также показаны усредненные дублированные результаты для тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы) и процентного количества 8,8-монатина, исходя из площади пика обращенно-фазовой ЕС. В некоторых случаях, вследствие того, что альдолазы являются высоко В-специфичными и приводят к небольшому количеству тотального монатина, обращенно-фазовая оценка распределения стереоизомеров является менее точной вследствие некоторого расширения пика триптофана, который может быть коэллюирован с пиком 8,8/В,В-монатина. Тем не менее, это направление является информативным для сравнения ^-специфичности альдолаз. Результаты дополнительного анализа с использованием способа образования производных Е[)АА представлены в скобках для нескольких образцов и являются более точными. Показатели тотального монатина более приблизительно 400 м.д. являются более высокими, чем линейный диапазон шкалы стандартов, используемой для количественного анализа результатов, поэтому они представляют собой качественные результаты. Альдолаза РгоА С. !е8!о§!егош, как правило, приводит к 95-100% 8,8-монатина, как показано в опубликованной заявке США № 20050282260.
Таблица 4. Тотальный монатин, образованный из Ь-триптофана и % 8,8
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин, (м.д.) % 8,8-монатина
8Еф ГО N0:8(1 ч) 138,65 78,9
8Еф ГО N0:8(18 4) 600,3 78,15
8ЕЦ ГО N0:4(1 ч) ниже отрицательного контроля 95,65
8Еф ГО N0:4(18 ч) 28,5 87,6
ЗЕф ГО N0:12(1 ч) ниже отрицательного контроля 93,55
8Е0 ГО N0:12(18 4) 24,9 75 (59,35)
8Еф ГО N0:28 (1 4) 17,85 55,05 (18,9)
8Еф ГО N0:28 (18 4) 135,5 27,25 (19,1)
С. 1ез1оз1егот РгоА (14) 04ищенный фермент 440,35 92,5
С. 1ех1ох1егот РгоА (18 4) 04ищенный фермент 958,3 92,15
Можно видеть, что ^-специфичность полипептида с активностью альдолазы 8ЕЕ) И) N0:28 является очень высокой по сравнению с эталонным ферментом Рго А, также это отражается низким % образующегося 8,8-монатина, несмотря на высокую степень специфичности аминотрансферазы НехАкрС в отношении 8-МР в этих реакциях. Показатели для тотального монатина, при сравнении образования 8,8монатина относительно образования В,В-монатина, не являются показательными для активности альдолазы. Ώ-аминотрансфераза является менее активной, чем НехАкрС, в частности, в концентрациях МР, которые представлены в этих реакциях.
Для дальнейшего сравнения полипептида с активностью альдолазы 8ЕЕ) И) N0:28 с ферментом РгоА из С. !е8!о§!егош использовали различные соотношения Ώ-аминотрансферазы и альдолазы в реакциях, начиная с Ώ-триптофана (без дублирования образцов в этих экспериментах). Реакции проводили, как указано выше. Для реакций, где концентрацию альдолазы поддерживали постоянной, использовали приблизительно 50 мкг. В реакциях, где Ώ-аминотрансферазу поддерживали постоянной, использовали 0,5 мг. В случае концентрации Ώ-аминотрансферазы 2 и 10 мг/мл использовали лиофилизированный фермент. Для 2 наиболее высоких концентраций Ώ-аминотрансферазы проводили дублирование.
- 137 019971
Таблица 5. Эффект концентрации Ό-аминотрансферазы на образование В,В-монатина
Альдолаза Концентрация Ώаминотрансферазы Время Тотальный монатин (приблизительно м.д.) % к,кмонатина
ЗЕф ГО N0:28 0,25 мг/мл 1 ч 2 100
ЗЕО ГО N0:28 0,25 мг/мл после ночи 141 97,1
ЗЕО ГО N0:28 0,5 мг/мл 1 ч 8 100
ЗЕО Ю N0:28 0,5 мг/мл после ночи 273 96,5
ЗЕО ГО N0:28 1 мг/мл 1 ч 34 100
ЗЕО ГО N0:28 1 мг/мл после ночи 638 96,5
ЗЕО ГО N0:28 2 мг/мл 1 ч 979 100
ЗЕО ГО N0:28 2 мг/мл после ночи 1910 97,3
ЗЕО ГО N0:28 10 мг/мл 1 ч 2930 99,1
ЗЕО ГО N0:28 10 мг/мл после ночи 2950 96,5
С. 1е81о81егот РгоА
(очищенная) 0,25 мг/мл 1 ч 4 78,7
С. 1в81о81егот РгоА
(очищенная) 0,25 мг/мл после ночи 257 61,1
С. 1е81о81егот РгоА
(очищенная) 0,5 мг/мл 1 ч 25 79,0
С. 1е81о81егот РгоА
(очищенная) 0,5 мг/мл после ночи 480 62,5
С. 1е81о81егот РгоА
(очищенная) 1 мг/мл 1 ч 74 73,8
С. 1ех1ох1егок11 РгоА
(очищенная) 1 мг/мл после ночи 810 68,1
С. 1в81о81егот РгоА
(очищенная) 2 мг/мл 1 ч 325 73,1
С. 1е81о81егот РгоА
(очищенная) 2 мг/мл после ночи 2220 71,9
С. 1е81о81егот РгоА
(очищенная) 10 мг/мл 1 ч 2910 59,7
С. 1е8Ю81егот РгоА
(очищенная) 10 мг/мл после ночи 2450 67,5
ЗЕО ГО N0:8 0,25 мг/мл 1 ч 4 92,3
ЗЕО ГО N0:8 0,25 мг/мл после ночи 219 69,8
ЗЕО ГО N0:8 0,5 мг/мл 1 ч 14 84,9
ЗЕО ГО N0:8 0,5 мг/мл после ночи 426 67,5
ЗЕО ГО N0:8 1 мг/мл 1 ч 62 84,2
ЗЕО ГО N0:8 1 мг/мл после ночи 877 68,7
Для уровней монатина выше 400 м.д. результаты находятся не в линейном диапазоне стандартной кривой и представляют собой только приблизительные значения. Максимальное количество образованного В,В-монатина, при соответствующем разбавлении, составляло 1100 м.д. Анализ стереоизомеров с помощью ΕΌΆΆ проводили для полипептида с активностью альдолазы 8Е0 Ш N0:28 в образцах с 10 мг/мл Ό-аминотрансферазы. Через два часа образец содержал 98,5% В,В-монатина. Через 17 ч в образец содержал 95,9% В,В-монатина. Полипептид с активностью альдолазы 8Е0 Ш N0:28 приводил к высокому процентному количеству В,В-монатина, даже после длительного времени инкубации и использованием больших количеств аминотрансферазы. При предоставлении надлежащей Ό-аминотрансферазы полипептид с активностью альдолазы 8Е0 Ш N0:28 приводит к такому же количеству тотального монатина, что и альдолаза РгоА С. 1ек1ок1егош, что указывает на сходную специфичную активность.
- 138 019971
Альдолаза Концентрация альдолазы Время Тотальный монатин (м.д.) % кд- монатина
8ЕЦ ГО N0:28 25 мг/мл 1 час 7,0 100
8ЕЦ ГО N0:28 25 мг/мл после ночи 275 97,4
8ЕЦ ГО N0:28 50 мг/мл 1 час 9,0 97,3
8Е0 ГО N0:28 50 мг/мл после ночи 334 95,7
8ЕЦ ГО N0:28 100 мг/мл после ночи 297 93,3
С. 1ех1о.ч1екоп1 РгоА (очищенная) 25 мг/мл 1 час 16 78,2
С. 1ех1оз1егот РгоА (очищенная) 25 мг/мл после ночи 491 73,2
С. 1ез1о.ч1егоп1 РгоА (очищенная) 50 мг/мл 1 час 18 64,1
С. 1ез1оз1егот РгоА (очищенная) 50 мг/мл после ночи 437 63,0
С. 1ез1оз1егот РгоА (очищенная) 100 мг/мл 1 час 26 62,5
С. ΙβαΙούβκοηί РгоА (очищенная) 100 мг/мл после ночи 513 61,5
8Е0 ГО N0:8 25 мг/мл 1 час 11,0 88,1
8Е0 ГО N0:8 25 мг/мл после ночи 337,0 74,7
8Е0 ГО N0:8 50 мг/мл 1 час 14,0 78,2
8Е0 ГО N0:8 50 мг/мл после ночи 406,0 67,8
8Е0 ГО N0:8 100 мг/мл 1 час 24,0 70,1
8ЕЦ ГО N0:8 100 мг/мл после ночи 329,0 63,9
При варьировании концентрации альдолазы отсутствует значительное повышение тотального монатина. Процентное количество К,К снижается с течением времени, а также в зависимости от концентрации альдолазы, в частности, когда Ό-аминотрансфераза является лимитирующей.
Для дальнейшего исследования К-специфичности тестируемых альдолаз эксперименты проводили, начиная с Ь-триптофана и аминотрансферазы НехАкрС, которую получали и очищали, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. НехАкрС показывает выраженную селективность в отношении переаминирования 8-МР относительно К-МР, таким образом процентное количество выше 50% для К,8-монатина указывает на высокостереоспецифичную альдолазу. Альфа-кетоглутарат в концентрации десять мМ предоставляли в качестве акцептора амино; однако при высоких концентрациях I.аминотрансфераза также использует пируват. В этих реакциях, как правило, только 8,8- и К,8-монатин получают в пределах определения протокола образования производных посредством РВАА.
Таблица 7. Эффект концентрации Ь-аминотрансферазы на образование 8,8-монатина
- 139 019971
Таблица 8. Эффект концентрации альдолазы на образование 8,8-монатина
Альдолаза мг/мл мг/мл после ночи мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл после ночи
С. 1ез1оз1егоп1 РгоА (очищенная) мг/мл
С. ίβζίοζίβΓοηι РгоА (очищенная) мг/мл после ночи
С. 1е$1о81егоп1 РгоА (очищенная) мг/мл
С. 1ез1о81егот РгоА (очищенная мг/мл после ночи
С. 1ез1о81егот РгоА (очищенная) мг/мл
С. 1ез1о81егот РгоА (очищенная
100 мг/мл после ночи мг/мл мг/мл
Тотальный монатин
Концентрация альдолазы после ночи
В случае альдолаз, которые являются высоко К-специфичными, таких как полипептид с активностью альдолазы 8ЕО ΙΌ N0:28, образуется меньшее количество монатина, и повышение количества альдолазы не приводит к повышению тотального монатина (а также % 8,8). Эти альдолазы образуют меньшее количество субстрата 8-МР, предпочтительного субстрата для используемой Ь-аминотрансферазы. В случае ферментов, которые являются менее К-специфичными, таких как РгоА, увеличение количества альдолазы значительно не повышает образование тотального монатина или % 8,8-монатина. Повышение количества добавленной Ь-аминотрансферазы снижает процентное количество образующегося 8,8монатина. Исходя из представленного выше анализа, полипептид с активностью альдолазы 8ЕО ΙΌ N0:8 находится между РгоА и полипептидом с активностью альдолазы 8ЕО ΙΌ N0:28 с точки зрения Кспецифичности, что согласуется с представленными выше данными, где % К-МР определяют для альдольной стадии отдельно.
Субклонирование 8ЕО ΙΌ N0:27
Следующие праймеры использовали для амплификации посредством ПЦР гена альдолазы: 5'цаццацс!сцац!сацасц!а!!!сац!сс!!!!!с-3' (8Ер ΙΌ N0:385) и 5'-ацаацаса!а!ца!!!а!сацссццццас-3' (8Ер ΙΌ N0:386). Ген альдолазы 8ЕО ΙΌ N0:27 кодирует полипептид с активностью альдолазы 8ЕО ΙΌ N0:28. Полученный продукт ПЦР расщепляли посредством ХДЯ и NάеI для разрезания в участках, которые были встроены в праймеры. Фрагмент выделяли из геля (рТАдшск Ое1 ех!гас!юп К1! (Р1ацеп, Уа1епс1а, СА)) и лигировали (с использованием ДНК-лигазы Т4) с рЕТ28Ь, расщепленным посредством Χ^Ι и NάеI и очищенным из геля. Продукт лигирования трансформировали в химически компетентные клетки Т0Р10Р'. Колонии, выращенные на планшетах, подвергали скринингу в отношении вставки, и несколько изолятов со вставками подвергали анализу последовательности ДНК (Ацепсоиг!, Веуег1у, МА).
Очистка полипептида с активностью альдолазы 81Д) ΙΌ N0:28
Подтвержденные клоны альдолазы трансформировали либо в ВЬ21 ОЕ3, либо в ВЬ21 ОЕ3 рЬуз8. Ночные культуры, выращиваемые с соответствующим антибиотиком, разбавляли свежими средами (как правило, 1:100) и выращивали до 0Ό600 ~0,6 с аэрацией при 37°С. Затем культуры индуцировали посредством 1 мМ !РТО и переключали на 30°С (без аэрации), и инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием. Клеточный осадок, как правило, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания для облегчения лизиса клеток. Клеточный осадок лизировали в ВицВиз!ег и бензоназе (Хоуацеп, МаШзоп, ^1) (в соответствии с протоколом изготовителя). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Неочищенный белковый экстракт наносили на колонку Н1зВт4 ^оуадеп, МаШзоп, ^1), которую подготавливали в соответствии с протоколом изготовителя. Колонку промывали и белок элюировали в соответствии с протоколом изготовителя. Очищенный белок подвергали обессоливанию с помощью колонок РВ-10 (ОЕ Неа1!йсаге, Р1зса!а^ау, N1). Буфер, используемый для обмена, представлял собой 50 мМ калий фосфат рН 7,5, 100 мМ НаС1, 4 мМ МцС12. Очищенный белок концентрировали с помощью центробежных концентраторов Ат1соп (М1Шроге, ВШепса, МА).
Пример 9. Сравнение образования тотального монатина и распределения изомеров для полипептидов с активностью альдолазы 8ЕО ΙΌ N0:40, 8ЕО ΙΌ N0:298, 8ЕО ΙΌ N0:36, 8ЕР ΙΌ N0:62, 8ЕО ΙΌ N0:64, 8Е(,) ΙΌ N0:96, 8Е(,) ΙΌ N0:54, 8Е(,) ΙΌ N0:122, 8Е(,) ΙΌ N0:142, 8Е(,) ΙΌ N0:42, 8Е(,) ΙΌ N0:130, 8Е(,) ΙΌ N0:112, 8Е(,) ΙΌ N0:108, 8Е(,) ΙΌ N0:94, 8Е(,) ΙΌ N0:80 и 8Е(,) ΙΌ N0:28.
- 140 019971
Трансаминазу АТ-103 (Ό-аминотрансфераза с широкой специфичностью) приобретали от ВюСа!а1у!1ск (Ракабепа, СА), и либо этот фермент, либо рекомбинантный фермент, полученный по примеру 7, использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМС для получения монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Полипептид с активностью альдолазы ЛЕр ГО N0:28 (с Ык-маркером) использовали в качестве эталонной альдолазы для сравнительных целей, и его получали и очищали, как описано в конце примера 8. Другие тестируемые альдолазы выделяли и трансформировали, как описано выше в примере 4.
Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 25-мл культуры выращивали в среде ГВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до 0Ό600 приблизительно 0,4. Штаммы индуцировали посредством 100 мкМ ГОТС. Клетки выращивали в течение 4 ч после индукции, и клеточные экстракты получали в соответствии с протоколами изготовителя (Хоеадеп, Мабйоп, \\Ί, ВидЬик!ег реагент) с помощью бензонуклеазы. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на Вю-Ваб ЬаЬога!ог1ек Ехрепоп Аи!ота!еб Е1ес!горйогек1к Л!а!юп (Вю-Ваб, Негси1ек, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Ехрепоп Лой^аге версии 1.1.98.0.
На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС12, 50 мг/мл Ό-триптофана, 2 мг АТ103 (ВюСа!а1уйск, Ракабепа, СА), 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЕР. Ό-Триптофан не является растворимым в этой более высокой концентрации, однако ее использовали для того, чтобы убедиться, что реакционные смеси содержали насыщающие количества Όтриптофана. Эксперименты проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которых альдолазу не добавляли. Образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи (17-20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Небольшие количества монатина образуются в течение ночи без альдолазы (~0,5 м.д.), вследствие неферментативных реакций, катализируемых магнием и фосфатом. Типичные показатели для % В,В-монатина в этих образцах составляют 50%. Показатели отрицательного контроля вычитали из чисел, представленных ниже, и представлены усредненные результаты. Единственными выявленными стереоизомерами при получении монатина с использованием этих способов являются В, В и Л,В. Процентные количества В,В представлены ниже, и их определяли с помощью площади пика обращенно-фазовой ЕС. Тот же эксперимент проводили после хранения клеточных экстрактов и очищенного полипептида с активностью альдолазы ЛЕС) ГО N0:28 в течение 2 месяцев при -20°С, на этот раз использовали 50 мМ Ό-триптофан, как в примере 8. Добавляли двукратное количество альдолазы, за исключением полипептида с активностью альдолазы ЛЕС) ГО N0:28, для которого вновь использовали приблизительно 50 мкг. Эти результаты представлены в правой части табл. 9. Результаты образования производного посредством Г1)АА для распределения изомеров показаны в скобках.
Таблица 9. Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана и % В,В
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) % к,к- монатина Тотальный монатин (м.д.) % К.,Вмонатина
8ЕЦ ГО N0:40 (2 ч) 336 82,7 238 66,8
8ЕЦ ГО N0:40,(18 ч) 707,55 76,2 748,5 62,4
8ЕЦ ГО N0:298 (2 ч) 394,3 98,0 183 91,9 (91,6)
8ЕЦ ГО N0:298(18 4) 819,5 96,1 648,5 80,0
8ЕЦ ГО N0:36 (2 ч) 56 98,2 52,5 94,0
8ЕЦ ГО N0:36 (18 4) 123,25 96,9 296 88,5
8ЕЦ ГО N0:62 (2 ч) 1,15 78,4 0 п/а
8ЕЦ ГО N0:62 (18 ч) 0,95 73,8 16 89,2
8ЕЦ ГО N0:64 (2 ч) 16,7 98,8 24 96,9
8ЕЦ ГО N0:64(18 4) 43,7 97,6 161 98,5
8ЕЦ ГО N0:96 (2 ч) 30,4 99,2 29 96,0
8Εζ) ГО N0:96(18 4) 80,8 98,3 200 97,3
8ЕЦ ГО N0:54 (2 ч) 183,1 99,4 135,5 98,2 (98,8)
8ЕЦ ГО N0:54(18 4) 457,7 98,9 488,5 96,9
8ЕЦ ГО N0:122 (2 ч) 129,3 97,9 126 97,8(99,1)
8ЕЦ ГО N0:122(18 4) 289,85 95,8 471,5 94,4
8ЕЦ ГО N0:142 (2 ч) 40,4 98,3 58,5 95,9
8ЕЦ ГО N0:142(18 4) 82,3 97,3 388 96,8
8ЕЦ ГО N0:42 (2 ч) 335,9 98,2 206,5 93,3
8ЕЦ ГО N0:42(18 ч) 612,45 96,6 630,5 82,9
8ЕЦ ГО N0:130(2 ч) 77,5 99,3 60,5 98,5 (99,6)
8ЕЦ ГО N0:130(18 4) 177,45 99,1 368,5 98,4
- 141 019971
8Е0 ГО N0:112(2 ч) 20,4 99,0 27 98,6
ЗЕф ГО N0:112(18 4) 57,75 98,3 186,5 99,3
8Е0 ГО N0:108 (2 ч) 44,4 98,7 41 97,0
8Е0 ГО N0:108 (18 ч) 111,7 98,0 265,5 93,3 (96,4)
8Е0 ГО N0:94 (2 ч) 69,4 98,2 56 94,4
8Е<2 ГО N0:94(18 ч) 181,95 96,9 341 84,8
8Е0 ГО N0:80 (2 ч) 27,9 98,9 29,5 98,8
8Е0 ГО N0:80(18 4) 74 97,9 219 96,6
8Е0 ГО N0:28 - очищенная (2 4) 131,3 99,5 53 96,7 (99,6)
8Е<2 ГО N0:28 - очищенная (18 ч) 407,4 99,2 257 99,2
Исходя из соотношений активности, можно видеть, что определенные ферменты являются более стабильными при хранении, чем другие альдолазы. В ходе этих реакций также может образовываться вторичный продукт, наиболее вероятно, 4-гидрокси-4-метилглутамат. Указанные выше ферменты расположили по возрастанию с точки зрения их специфичности в отношении образования монатина посредством сравнения площадей его пиков относительно побочного продукта. Результаты представляли собой полипептид с активностью альдолазы 8ΕΕ) ΙΌ N0:122 > 8ΕΕ) ΙΌ N0:42 > 8ΕΕ) ΙΌ N0:80 > 8ΕΕ) ΙΌ N0:108 > 8ΕΟ ΙΌ N0:96 > 8ΕΟ ΙΌ N0:112 > 8ΕΟ ΙΌ N0:130 > 8ΕΟ ΙΌ N0:36 > 8ΕΟ ΙΌ N0:94 > 8ΕΟ ΙΌ N0:298 > 8ΕΟ ΙΌ N0:40 > 8ΕΟ ΙΌ N0:142 > 8ΕΟ ΙΌ N0:54 > 8ΕΟ ΙΌ N0:64 > 8ΕΟ ΙΌ N0:28 > 8ΕΟ ΙΌ N0:62.
Исходя из первоначальных экспериментов, полипептиды с активностью альдолазы 8ΕΕ) ΙΌ N0:298, 8ΕΕ) ΙΌ N0:54 и 8ΕΕ) ΙΌ N0:42 казались наиболее перспективными с точки зрения уровня активности и % образованного К,К-монатина. Эти ферменты субклонировали в экспрессирующие векторы рЕТ с й1кмаркерами и без них.
Клонирование 8ΕΟ ΙΌ N0:297, 8ΕΟ ΙΌ N0:53 и 8ΕΟ ΙΌ N0:41.
Праймеры, используемые для клонирования:
Таблица 10
8Ер ГО N0.
297
5’ праймер ’’аёаадаса1а1дд§хд1сд1сд1ссаааас'3 ’ (8Е(? ГО N0:387)
З’праймер ’-а1аа1а§да1ссИа§аса1аШ§аё§ссс-3 ’ (8Е9
ГО N0:388)
’-а1аа1аса1а1даадссдд£д§1дд1дс
(8Е(2 ГО N0:390) ’-а§аададда1ссПадаса1аШсаддсссс-3 ’ (8Е0 ГО N0:392)
ГО N0:389)
5’-а1аа1асса1ддд1д1сд1дд1ссад-3’ (8Е0 ГО
N0:391)
8ΕΕ) ΙΌ N0:297, 8ΕΕ) ΙΌ N0:53 и 8ΕΕ) ΙΌ N0:41 амплифицировали посредством ПЦР и расщепляли соответствующими ферментами (NάеI и ВатН для продуктов ПЦР, содержащих 8ΕΕ) ΙΌ N0:297 и 8ΕΕ) ΙΌ N0:53, NсοI и ВатН для продуктов ПЦР, содержащих 8ΕΕ) ΙΌ N0:41), и очищали из геля (набор для экстракции из геля Р^цшск Се1 ех!гас!юи К1! (Р1адеи, Уа1еис1а, СА) ). 8ΕΕ) ΙΌ N0:297 и 8ΕΕ) ΙΌ N0:53 по-отдельности лигировали в рЕТ28, расщепленный посредством NάеI и ВатН и очищенный из геля. 8ΕΕ) ΙΌ N0:41 лигировали с рЕТ30, расщепленный посредством NсοI и ВатЮ и очищенный из геля. Продукт лигирования трансформировали в ТОР10. Колонии подвергали скринингу в отношении вставок. Изоляты со вставкой подвергали анализу последовательности ДНК (Адепсоиг!, Ветег1у, МА).
Очистка альдолаз
Проверенные клоны альдолазы трансформировали либо в ВБ21 ΌΕ3, либо в ВБ21 ΌΕ3 рЬук8. Культуры, выращиваемые в течение ночи с соответствующим антибиотиком, разбавляли свежими средами (как правило, 1:100) и выращивали до 0Ό600 ~0,6 с аэрацией при 37°С. Затем культуры индуцировали посредством 1 мМ №ТС и переключали на 30°С (с аэрацией), и инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием. Клеточный осадок, как правило, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания для облегчения лизиса клеток. Клеточный осадок лизировали в ВидВик!ег и бензоназу (Хотаце'п, Майкоп, УЦ (в соответствии с протоколом изготовителя). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Неочищенный белковый экстракт наносили на колонку Н1кВ1иб (Хотаде'п, Майкоп, УЦ, которую подготавливали в соответствии с протоколом изготовителя. Колонку промывали, и белок элюировали в соответствии с протоколом изготовителя. Очищенный белок подвергали обессоливанию с помощью колонок ₽Ό-10 (СИ Неа1!йсаге, Р1кса!а^ау, XI). Буфер, используемый для обмена, представлял собой 50 мМ калий фосфат, рН 7,5, 100 мМ №’!, 4 мМ МдСЕ. Очищенный белок концентрировали с помощью центробежных концентраторов Ат1сои (М1Шроге, ВШепса, МА).
Тестирование очищенных альдолаз
Очищенные альдолазы тестировали в отношении их способности образовывать К,К-монатин из Όтриптофана. На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг очищенной альдолазы, 4 мМ МдСЕ, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Ό-аминотрансферазы В. крйаепсик, 200 мМ
- 142 019971 пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Забор образцов проводили через 2 ч и после ночи. Результаты представлены в табл. 11, ниже.
Таблица 11. Тотальный монатин, образованный из Ώ-триптофана, и % К,К
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) % К,К-монатина (площадь пика обращенно-фазовой ЬС) % К,К-монатина (образование производных посредством РЭАА)
8Еф ГО N0:298 (2 ч) 16,95 88,5 п/а
8Еф ГО N0:298 (в течение ночи) 212 77,6 71
8Е0 ГО N0:54 (2 ч) 12,05 96,7 п/а
8ЕЦ ГО N0:54 (в течение ночи) 161,85 93,0 91,1
8Еф ГО N0:42 (2 ч) 20,95 80,3 п/а
8Еф ГО N0:42 (в течение ночи) 223,2 69,1 62,1
8Еф ГО N0:28 (2 ч) 14,25 95,8 п/а
ЗЕф ГО N0:28 (в течение ночи) 176,6 93,4 92,3
Те же эксперименты проводили с использованием Ь-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолаз с Ь-аминотрансферазой с широкой специфичностью НехАкрС, полученной и очищенной, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260 (0,5 мг очищенного белка). Результаты представлены ниже в таблице 12 для образования тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы), и процентное количество 3,5-монатина представлено, исходя из площади пика обращенно-фазовой ЬС. Числа более 400 м.д. находятся вне линейного диапазона стандартной кривой и являются приблизительными.
Таблица 12. Тотальный монатин, образованный из Ь-триптофана, и % 8,8
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) % 8,8-монатина (площадь пика обращенно-фазовой ЬС) % 8,8-монатина (образование производных посредством ΓϋΑΑ)
8Еф ГО N0:298 (1 ч) 186,6 64,0 п/а
8Еф ГО N0:298 (в течение ночи) 197,5 64,3 67,6
8Еф ГО N0:54 (1 ч) 70,4 36,5 п/а
8Еф ГО N0:54 (в течение ночи) 87,8 41,7 42,1
8Еф ГО N0:42(1 ч) 401,1 80,9 п/а
8Еф Ιϋ N0:42 (в течение ночи) 507,5 82,9 85,8
8ΕφΙϋΝΟ:28 (1 ч) 56,2 30,1 п/а
8Еф ГО N0:28 (в течение ночи) 88,8 32,2 33,8
Эти данные и представленные выше данные для К,К-монатина иллюстрируют, что с точки зрения специфичности в отношении К-МР полипептиды с активностью альдолазы обладают следующим порядком: 8Ер ))) N0:28 > 8Ер ))) N0:54 > 8Ер ))) N0:298 > 8Ер ))) N0:42.
Пример 10. Сравнение образования тотального монатина и распределение изомеров полипептидов с активностью альдолазы 8Ер ))) N0:116, 8Ер ))) N0:76, 8Ер ))) N0:44, 8Ер ))) N0:148, 8Ер ))) N0:46, 8Ер ))) N0:134, 8Ер ))) N0:74, 8Ер ))) N0:126, 8Ер ΙΏ N0:102, 8Ер ))) N0:58, 8Ер ))) N0:88, 8Ер ))) N0:50, 8Е() ))) N0:106, 8Ер ))) N0:304, 8Ер ))) N0:300 и 8Ер ))) N0:28.
Рекомбинантный фермент по примеру 7 использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМС для получения монатина из Ώ-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Полипептид с активностью альдолазы 8ЕР ΙΏ N0:28 использовали в качестве эталона в этих анализах, и он был очищен, как описано в примере 8.
Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 25-мл культуры выращивали в среде ЕВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до 01)600 приблизительно 0,5. Культуры индуцировали посредством 1 мМ )РТ(.1. Клетки переключали на 30°С и выращивали в течение ночи. Клеточные экстракты получали в соответствии с протоколами изготовителя (Комадеп, Майкоп, ^Ι, ВпдЬпк1ег реагент). Также добавляли бензонуклеазу. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на Вю-Кай ВаЬога1опек Ехрегюп Аи!ота!ей Е1ес1горйогек1к 8Шюп (Вю-Кай, Негси1ек, СА) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Ехрегюп 8оП\\аге версии 1.1.98.0.
На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС12, 50 мМ О-триптофан, 0,5 мг очищенной Ώ-аминотрансферазы В. крйаейсик, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЕР. К образцам, указанным ниже, добавляли дитиотреитол (ОТТ) (конечная концентрация 2 мМ). Эксперименты проводили с дублированием. Образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Усредненные результаты представлены ниже. Единственными выявленными стереоизомерами при получении монатина с использованием этих спосо- 143 019971 бов являются К,К и 8,К. Процентные количества К,К представлены ниже, и их определяли с помощью площади пика обращенно-фазовой БС.
Таблица 13. Тотальный монатин, образованный из Э-триптофана и % К,К
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) %к,к- монатина
8Еф ГО N0:116(2 ч) 34,5 97
8Е0 ГО N0:116 (18 ч) 99 95
8Еф ГО N0:76 (2 ч) 40 76
5Е0 ГО N0:76 (18 ч) 112 67
8ЕБ ГО N0:44 (2 ч) 32,5 97
8Εζ) ГО N0:44(18 4) 93,5 94
8Εζ) ГО N0:148(2 ч) 31,5 94
8Еф ГО N0:148(18 4) 98 89
8Е0 ГО N0:46 (2 ч) 42,5 84
8Еф ГО N0:46(18 4) 169 72
8Е0 ГО N0:134(2 ч) 43,5 92
8Еф ГО N0:134(18 ч) 113 86
8Εζ) ГО N0:74 (2 ч) 23,5 96
8Еф ГО N0:74(18 4) 78,5 92
8Еф ГО N0:126 (2 ч) 18 94
8Е<2 ГО N0:126(18 4) 72 92
8Е0 ГО N0:102 (2 ч) 1 0
8Еф ГО N0:102(18 4) 4,5 91
8Еф ГО N0:58(2 4) 23 92
8Е<2 ГО N0:58 (18 ч) 122 88
8Еф ГО N0:88 (2 4) 57,5 74
8Е<2 ГО N0:88 (18 4) 200,5 64
8Εζ) ГО N0:50 (2 ч) 32,5 99
8Е<? ГО N0:50 (18 4) 131,5 97
8Еф ГО N0:106 (2 ч) 4,5 78
8Еф ГО N0:106(18 4) 20 95
8Е0 ГО N0:304 (2 ч) 0 0
8Е0 ГО N0:304 (18 ч) 0,45 55
8Е0 ГО N0:304 БТТ (2 ч) 0 0
8Еф ГО N0:304 ОТТ (18 ч) 0,55 53
8Е0 ГО N0:300 (2 ч) 0,85 34
8Εζί ГО N0:300(18 ч) 5,5 36
8Еф ГО N0:300 ОТТ (2 ч) 1,5 55
8Е() ГО N0:300 ОТТ (18 ч) 9 40
8Εζ) ГО N0:28 (2 ч) 25 99
8Еф ГО N0:28 (18 ч) 69 97
Показатели образования тотального монатина находились и диапазоне от 1 м.д. до более 200 м.д. и % К,К находились в диапазоне от 0% до 99%. Поскольку аминотрансфераза была одинаковой для всех из альдолаз, изменение альдолазы может оказывать значительное влияние как на количество образованного монатина, так и на распределение стереомеров образованного монатина. Оказалось, что ЭТТ (как в образцах, представленных ниже) повышает количество тотального образующегося монатина.
Те же эксперименты, что представлены выше, проводили с использованием Ь-триптофана в качестве исходного субстрата и с сопряжением альдолазы (предоставленной в качестве клеточного экстракта) с частично очищенной Ь-аминотрансферазой с широкой специфичностью НехАкрС (0,5 мг НехАкрС). Усредненные результаты (дублированные) представлены ниже в таблице 14 для образования тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы), и процентные количества 8,8-монатина представлены, исходя из площади пика обращенно-фазовой БС. Числа более 400 м.д. находятся вне линейно- 144 019971 го диапазона стандартной кривой и являются приблизительными. Очищенный полипептид с активностью альдолазы 5Е0 Ш N0:28 использовали в качестве эталона. Полипептиды с активностью альдолазы 5Е() ΙΌ N0:304 и 5Е() Ш N0:300 (полученные из растений) использовали с 2 мМ ЭТТ и без него. 5йаппоп апб Магсик (Тйе боигпа1 оГ Вю1од1са1 Сйет1к)гу 237:3342-3347, 1962) в качестве восстановителя использовали меркаптоэтанол при первоначальной очистке альдолазы НМО арахиса.
Таблица 14. Тотальный монатин, образованный из Ь-триптофана и % 5,5
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) % 8,8-монатина
8Е9 Ю ΝΟ: 116 (2 ч) 129 47,9
8Еф ГО N0:116 (21 ч) 207 56,4
8Еф ГО N0:76 (2 ч) 949 90,6
8Еф ГО N0:76 (21 ч) 1181 89,0
8Еф ГО N0:44 (2 ч) 128 55,0
8Еф ГО N0:44 (21 ч) 237 61,7
8Еф ГО N0:148 (2 ч) 199 71,5
8ΕφΙΟΝΟ:148 (21 ч) 358 74,4
8Еф ГО N0:46 (2 ч) 346 79,3
8Еф ГО N0:46 (21 ч) 757 83,3
8Е<3 ГО N0:134(2 ч) 215 69,2
8Е(? ГО N0:134 (21 ч) 370 74,1
8Εζ) ГО N0:74 (2 ч) 75 51,4
8Еф ГО N0:74 (21 ч) 137 58,8
8Е0 ГО N0:126 (2 ч) 47 56,7
8Еф ГО N0:126 (21 ч) 113 56,7
8Еф ГО N0:102 (2 ч) как в контроле п/а
8Еф ГО N0:102 (21 ч) 11,5 61,1
8Еф ГО N0:58(2 ч) ИЗ 71,9
8Еф ГО N0:58 (21 ч) 351 75,5
ЗЕф ГО N0:88(2 ч) 852 90,1
8Еф ГО N0:88 (21 ч) 1352 88,8
8Еф ГО N0:50 (2 ч) 62 30,8
8Еф ГО N0:50 (21 ч) 145 38,6
8Εζ) ГО N0:106 (2 ч) 3,5 31,0
8Еф ГО N0:106 (21 ч) 45 34,4
8Εζ> ГО N0:304 (2 ч) как в контроле п/а
8Е(2 ГО N0:304 + ЭТТ (2 ч) 1 п/а
8Еф ГО N0:304 (21 ч) как в контроле п/а
8Еф ГО N0:304 + ЭТТ (21 ч) 10 п/а
8Еф ГО N0:300 (2 ч) 73 75,2
8Εζ) ГО N0:300+ ΌΤΤ (2 ч) 121 83
8Е<2 ГО N0:300 (21 ч) 91 63,6
8Е<2 ГО N0:300 + ϋΤΤ (21 ч) 197 71,6
8Е() ГО N0:28 (2 ч) 55 35,1
8Е<2 ГО N0:28 (21 ч) 87 40,4
Пример 11. Эффект дитиотреитола (ЭТТ) на образование монатина.
Несколько ферментов примера 10 было выбрано для дальнейшего исследования. Полученные из растений альдолазы показали улучшение при добавлении ОТТ в качестве восстановителя. Было отмечено, что полученные из микробов альдолазы из образцов из окружающей среды также содержат высокую процентную долю остатков цистеина. Таким образом, также дальнейшие эксперименты проводили для выявления повышения посредством ОТТ образования монатина в случае нерастительных альдолаз.
На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 50 мкг альдолазы (предоставленной в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС12, 50 мМ Ό-триптофан, 2 мг АТ-103, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. К образцам, представленным ниже, добавляли дитиотреитол (конечная концентрация 2 мМ). Эксперименты проводили с дуб
- 145 019971 лированием. Образцы инкубировали в течение 2 ч при 30°С при осторожном встряхивании. Ниже представлены усредненные результаты для тотального монатина, определенного посредством ЙС/М8/М8, с вычитанием фонового образования монатина (контроль без альдолазы).
Таблица 15 Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана
Альдолаза Тотальный монатин (м.д.)
8ЕЦ ГО N0:116 126
8Е0 ΙΌΝΟ:116 + ΟΤΤ 102
8Е0 ГО N0:44 107
8Е0 ГО N0:44 + ΏΤΤ 103
8Е0 ГО N0:46 88
8ЕЦ ГО N0:46 + ΌΤΤ 161
8Е0 ГО N0:58 118
8ЕЦ ГО N0:58 + ΌΤΤ 141
8ЕЦ ГО N0:50 243
8Е0 ГО N0:50 + ЭТТ 170
8Е0 ГО N0:28 очищенный белок 174
8Εζ> ГО N0:28 + ΏΤΤ очищенный белок 196
Контроль без альдолазы образовывал 10 м.д. тотального монатина с ОТТ и без него, что указывает на то, что ОТТ не влияет на общую реакцию посредством восстановления побочных продуктов и не влияет на активность Ό-аминотрансферазы. Для всех полипептидов с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:46, 8ΕΡ ΙΌ N0:58 и 8ΕΡ ΙΌ N0:28 добавление ЭТТ показало наличие преимущества. Полипептид с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:46 показал наиболее высокое преимущество, приблизительно в 1,8 раз повышенную активность при 2 мМ ЭТТ. Оказалось, что полипептиды с активностью альдолазы ингибируются посредством ЭТТ (8ΕΡ ΙΌ N0:116 и 81Т,) ΙΌ N0:50), в то время как не было отмечено эффекта, в пределах экспериментальной ошибки, для полипептида с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:44. Однако является возможным, что для выявления преимущества, обеспечиваемого восстановителем, для каждой используемой альдолазы существует оптимальная концентрация ЭТТ.
Полипептид с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:88 был выбран для исследования эффекта концентрации ЭТТ на образование монатина. Сопряженные реакции проводили, как указано выше. Результаты представлены на фиг. 15. Оптимальная концентрация ЭТТ в этом анализе составляла между 2,5 и 5 мМ для добавляемого количества альдолазы. Интересно, что если ЭТТ не добавляли, количество образованного монатина было практически настолько же высоким, как и в случае 2,5 мМ ЭТТ, однако добавление субоптимальных количеств ЭТТ (0,5-1 мМ) в действительности оказывается ингибиторным, также как добавление слишком больших количеств ЭТТ (20 мМ).
Пример 12. Сравнение образования тотального монатина и распределение изомеров для полипептидов с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:278, 8Ε0 ΙΌ N0:162, 8Ε0 ΙΌ N0:276, 8Ε0 ΙΌ N0:178, 8Ε0 ΙΌ N0:202, 8Ε0 ΙΌ N0:166, 8Ε0 ΙΌ N0:218, 8Ε0 ΙΌ N0:224, 8Ε0 ΙΌ N0:226, 8Ε0 ΙΌ N0:244, 8Ε0 ΙΌ
N0:250, 8Ε0 ΙΌ N0:252, 8Ε0 ΙΌ N0:264, 8Ε0 ΙΌ N0:268, 8Ε0 ΙΌ N0:272, 8Ε0 ΙΌ N0:184, 8Ε0 ΙΌ
N0:282, 8Ε0 ΙΌ N0:186, 8Ε0 ΙΌ N0:192, 8Ε0 ΙΌ N0:200, 8Ε0 ΙΌ N0:280, 8Ε0 ΙΌ N0:284, 8Ε0 ΙΌ
N0:172, 8Ε0 ΙΌ N0:180, 8Ε0 ΙΌ N0:168, 8Ε0 ΙΌ N0:228, 8Ε0 ΙΌ N0:236, 8Ε0 ΙΌ N0:238, 8Ε0 ΙΌ
N0:240, 8Ε0 ΙΌ N0:270, 8Ε0 ΙΌ N0:156 и 8Ε0 ΙΌ N0:28.
Рекомбинантный фермент по примеру 7 использовали в сопряженных реакциях с альдолазами НМО для получения монатина из Ό-триптофана и пирувата, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260. Полипептид с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:28 использовали в качестве эталона в этих анализах, и он был очищен, как описано в примере 8.
Для получения тестируемых количеств каждой альдолазы 25-мл культуры выращивали в среде ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), до 0Ό600 приблизительно 0,5. Культуры индуцировали посредством 1 мМ ГРТО. Клетки переключали на 30°С и выращивали в течение ночи. Клеточные экстракты получали с использованием реагента ВидЬиз1ег в соответствии с протоколами изготовителя (Nονадеη, Май1зоп, ШЦ. Также добавляли бензонуклеазу. Растворимые белки в клеточных экстрактах разделяли на В1оКай ЬаЬога1ог1ез Εxре^^οη Αиίοтаίей Ε1есί^οрйο^ез^з 81аИоп (Вю-Кай, Негси1ез, СΑ) и анализировали в отношении концентрации и процентной экспрессии с использованием программного обеспечения Εxрепоп 8оГ1\\аге версии 1.1.98.0.
На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 200 мкг полипептидов с активностью альдолазы 8Ε0 ΙΌ N0:278, 8Ε0 ΙΌ N0:162, 8Ε0 ΙΌ N0:276, 8Ε0 ΙΌ N0:178, 8Ε0 ΙΌ N0:202, 8Ε0 ΙΌ N0:166, 8Ε0 ΙΌ N0:218, 8Ε0 ΙΌ N0:224, 8Ε0 Ш N0:226, 8Ε0 ΙΌ N0:244, 8Ε0 ΙΌ N0:250, 8Ε0 ΙΌ N0:252, 8Ε0 ΙΌ N0:264, 8Ε0 ΙΌ N0:268, 8Ε0 ΙΌ N0:272, 8Ε0 ΙΌ N0:184, 8Ε0 ΙΌ N0:282, 8Ε0 ΙΌ N0:186, 8ΕΡ ΙΌ N0:192 и 8ΕΡ ΙΌ N0:200 или 50 мкг полипептида с активностью альдолазы 8ΕΡ ΙΌ N0:280, 8Ε0 ΙΌ N0:284, 8Ε0 ΙΌ N0:172, 8Ε0 ΙΌ N0:180, 8Ε0 ΙΌ N0:168, 8Ε0 ΙΌ N0:228, 8Ε0 ΙΌ
- 146 019971
N0:236, 8ΕΟ ΙΌ N0:238, 8ΕΟ ΙΌ N0:240, 8ΕΟ ΙΌ N0:270 и 8ΕΟ ΙΌ N0:156 (предоставленного в клеточных экстрактах, если нет иных указаний), 4 мМ МдС12, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг очищенной Όаминотрансферазы В. зрйаепсиз, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Эксперименты проводили с дублированием. Образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Усредненные результаты представлены ниже. Единственными выявленными стереоизомерами при получении монатина с использованием этих способов являются К,К и 8,Р. Процентные количества К,К представлены ниже, и их определяли с помощью площади пика обращенно-фазовой ЬС.
Таблица 16. Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана, и % К,К
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) % Κ,,Κ,-монатина
8ЕЦ ГО N0:278 (1 ч) 11,35 100
8ЕЦ ГО N0:278 (18 ч) 282,15 96
8Е0 ГО N0:162(1 ч) 19,35 100
8ЕЦ ГО N0:162 (18 ч) 277,9 98
8Е0 ГО N0:276(1 ч) 27,2 100
8Е0 ГО N0:276(18 4) 421 98
8ЕЦ ГО N0:178 (1 ч) 24,8 98
8ЕЦ ГО N0:178 (18 ч) 394,25 94
8Е0 ГО N0:202(1 ч) 0 0
8ЕЦ ГО N0:202(18 ч) 19,2 91
БЕЦ ГО N0:166(1 ч) 42,8 89
8ЕЦ ГО N0:166(18 4) 601,25 71
8Е0 ГО N0:218(1 ч) 15,6 99
8ЕЦ ГО N0:218 (18 ч) 456,05 96
8ЕЦ ГО N0:224(1 ч) 19,7 98
8ЕЦ ГО N0:224(18 4) 406,55 93
8ЕЦ ГО N0:226(1 ч) 41,3 95
8Е0 ГО N0:226(18 4) 460,15 84
8ЕЦ ГО N0:244(1 ч) 11,6 99
- 147 019971
Числа для образования тотального монатина находились в диапазоне от не подлежащих детекции до более 600 м.д. и % К,К находились в диапазоне от 61 до 100%. Вследствие того, что аминотрансфераза была одинаковой для всех альдолаз, изменение альдолазы может оказывать значительное влияние как на количество образованного монатина, так и на распределение стереоизомеров полученного монатина.
Те же эксперименты, что указаны выше, проводили с использованием Ь-триптофана в качестве ис
- 148 019971 ходного субстрата и с сопряжением альдолаз (предоставленных в качестве клеточного экстракта) с Ьаминотрансферазой с широкой специфичностью НехАкрС, полученной и очищенной, как описано в опубликованной заявке США № 20050282260 (0,5 мг очищенного белка). Результаты представлены ниже в таблице 17 для образования тотального монатина (с вычитанием фоновых уровней без альдолазы), и процентные количества 8,8 монатина представлены, исходя из площади пика обращенно-фазовой ЬС. Числа более 400 м.д. находятся вне линейного диапазона стандартной кривой и являются приблизительными. В таблице 12 представлены результаты для эталонного В-специфичного фермента, полипептида с активностью альдолазы 8ЕС) П) N0:28, который анализировали одновременно.
Таблица 17. Тотальный монатин, образованный из Ь-триптофана и % 8,8
Альдолаза (момент времени) Тотальный монатин (м.д.) % 8,8-монатина (площадь пика обращеннофазовой ЬС) % 8,8-монатина (образование производных посредством ΕΌΑΑ)
ЗЕф ГО N0:278 (1 ч) 14,6 21,0 п/а
ЗЕф ГО N0:278 (в течение ночи) 7905 24,6 п/а
ЗЕф ГО N0:162(1 ч) 14 15,4 п/а
ЗЕф ГО N0:162 (в течение ночи) 105,6 17,3 п/а
ЗЕф ГО N0:276(1 ч) 35,8 10,2 п/а
ЗЕф ГО N0:276 (в течение ночи) 67,8 9 15,1
ЗЕф ГО N0:218(1 ч) 11,7 20,3 п/а
ЗЕф ГО N0:218 (в течение ночи) 49,9 17,7 22,0
ЗЕф ГО N0:244(1 ч) 6,2 18,0 п/а
ЗЕф ГО N0:244 (в течение ночи) 24,4 14,7 19,6
ЗЕф ГО N0:268(1 ч) 6,3 24,1 п/а
ЗЕф ГО N0:268 (в течение ночи) 61,2 23,3 29,2
ЗЕф ГО N0:272 (1 ч) 5,7 20,5 п/а
ЗЕф ГО N0:272 (в течение ночи) 43,6 19,9 22,9
ЗЕф ГО N0:192(1 ч) 6,8 19,0 п/а
ЗЕф ГО N0:192 (в течение ночи) 56,4 20,0 24,4
ЗЕф ГО N0:172(1 ч) 29,9 35,6 п/а
ЗЕф ГО ΝΟ: 172 (в течение ночи) 184,2 42,4 45,6
ЗЕф ГО N0:228 (1 ч) 59,6 23,9 п/а
ЗЕф ГО N0:228 (в течение ночи) 182 35,6 38,0
Пример 13. Образование монатина из индол-3-пирувата с использованием Ώ-аминотрансферазы Трансаминаза АТ-103 представляла собой часть библиотеки трансаминаз, приобретенной от ВюСа!а1у!1ск (Ракабеиа, СА), и фермент тестировали в отношении образования монатина в сопряженных реакциях с использованием альдолазы РгоА из С. !ек!ок!егош. Альдолазу получали, как описано в \\'(.) 03/091396 А2. АТ-103 представляет собой Ώ-трансаминазу с широкой специфичностью (Е.С. 2.6.1.21) из видов ВасШик, для которой необходима Ώ-аминокислота (такая как Ώ-глутамат, Ώ-аспартат или Ώ-аланин) в качестве донора аминокислоты. Ферменты и дополнительные компоненты/субстраты добавляли непосредственно в буфер для реакции, предоставленный в наборе, который содержал 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5, 100 мМ донор амино и 0,1 мМ РЕР. К одному мл буфера для реакции добавляли: 4 мг индол-3пирувата, 20 мг пирувата, приблизительно 50 мкг РгоА, предоставленного в клеточном экстракте, 1 мкл 2М МдС12 и 2 мг фермента аминотрансферазы. Реакции проводили с дублированием. Реакционные смеси инкубировали в течение ночи при 30°С при осторожном встряхивании (100 об/мин). Образцы фильтровали и подвергали анализу обращенно-фазовой ЕС/М8/М8, как описано в примере 1. Результаты указывали на то, что с использованием фермента АТ-103 образовывалось приблизительно 370 мкг/мл монатина. Результаты далее анализировали для определения соотношений 8,В/В,8 относительно В,К/8,8монатина, исходя из площадей пиков двух групп стереоизомеров, которые разделяются при хроматографическом разделении. Среди всего образованного посредством АТ-103 монатина, 69% представляли собой В,К/8,8-монатин по сравнению со смешанными изомерами. Этот фермент является гомологичным ферменту ВАТ ВасШик киЫШк, описанному в \\'(.) 03/091396 А2, о котором известно, что он обладает широкой специфичностью в отношении Ώ-аминокислот. Хиральный анализ проводили с использованием способа Ι'ΌΛΛ, описанного в примере 1, который подтверждал, что Ώ-аминотрансфераза образовывала, главным образом, К,В-монатин и небольшое количество 8,В-монатина, как и ожидалось. Дальнейшие эксперименты по переаминированию с 8,8-монатином или В,В-монатином и α-кетоглутаратом в качестве субстратов подтвердили, что фермент ВюСа!а1у!1ск был высокоселективным в отношении I)конфигурации углерода 4, как и ожидалось. В этих экспериментах не было выявлено глутамата в реакции с 8,8-монатином и α-кетоглутаратом в качестве субстратов.
- 149 019971
Для снижения количества 8,8-монатина или В,8-монатина, образованных в качестве побочных продуктов в сопряженных реакциях с АТ-103 (Ό-трансаминаза с широким диапазоном) и альдолазой РгоА, альдолазу очищали с использованием кассет Н1к-Втб, в соответствии с протоколами изготовителя (№оуадеи, МаШкои, \\'Ι). Очищенный фермент предпочтительно не должен обладать видами активности Ьаминотрансферазы дикого типа, которая может находиться в клеточных экстрактах (такими как виды активности нативных АкрС или ТугВ Е.со11). Элюент Н1к-Втб подвергали обессоливанию для удаления имидазола с использованием колонок РЭ-10 (С25 8ерЬабех, СЕ НеаЙГсаге, Р1кса1а^ау, N1) и элюировали в 50 мМ Тпк-С1, рН 7. Эксперименты проводили с дублированием в объеме 1 мл, и он содержал 100 мМ буфер Тпк-С1, рН 7,8, 50 мкг альдолазы РгоА, 4 мг индол-3-пирувата, 1 или 2 мг Ό-аминотрансферазы, 200 мМ пируват натрия, 2 мМ МдС12, 3 мМ фосфат калия, 0,1 мМ РЬР и 14,7 мг Ό-глутамата. Пробирки инкубировали при 30°С при осторожном встряхивании. Образцы через два часа отбирали и сразу замораживали при -20°С. рН доводили в течение двух часов от 5 до между 7-8 с использованием №0Н, и анализируемые образцы инкубировали в течение ночи. Образцы фильтровали и анализировали в отношении монатина, как описано в примере 1. Образцы через два часа не обладали поддающимися детекции количествами монатина, вероятно вследствие низких значений рН. Образцы после ночи содержали приблизительно 190 нг/мл монатина, когда использовали 1 мг Ό-аминотрансферазы, и приблизительно 84% представляли собой В,В-монатин, и 16% представляли собой 8,В-монатин. Когда использовали 2 мг Όаминотрансферазы, получали 540 нг/мл монатина, приблизительно 71% представляли собой В,В монатин.
Сходные эксперименты проводили с использованием буфера для аминотрансферазы ВюСа1а1у11ск (ВюСа1а1у11ск, Ракайеиа, СА), который содержал 100 мМ фосфат калия рН 7,5, 0,1 мМ РЬР и 100 мМ Όглутамат. Твердый индол-3-пируват и Ό-аминотрансферазу добавляли, как указано выше. Альдолазу РгоА (50 мкг), МдС12 и 50 мМ пируват добавляли из исходных растворов. Анализируемые образцы обрабатывали, как указано выше, хотя в этом случае не требовалось доведения рН. Отрицательный контроль анализировали только с предоставленным ВюСа1а1у1тск ферментом и буфером, который не содержал монатин. Экспериментальные результаты представлены в таблице 18.
Таблица 18. Образование монатина из индол-3-пирувата в фосфатном буфере
мг Ό- аминотрансферазы Время (час)
0 2
1 2
2 2
0 16
1 16
2 16
Тотальный монатин (нг/мл) % В.,К
0 п/а
6780 не определено
13170 55%
0 п/а
15000 не определено
28930 51%
Образование монатина в фосфатном буфере является, очевидно, более высоким, чем его образование в Тпк-буферных системах.
Для сравнения активности клонированного ЭАТ В. киЫШк из \\Ό 03/091396 А2 с ферментом ВюСа1а1у11ск (АТ-103). (ВюСа1а1уйск, Ракайеиа, СА) проводили дополнительный анализ. Ген йа1 В. киЫШк также субклонировали в рЕТ30а для удаления маркера Н1к-6. Не содержащий маркер и содержащий маркер фермент продуцировали в ВГ21(ОЕ3), как описано в 03/091396 А2. Получали клеточные экстракты, и проводили общий анализ белка для оценки концентрации белка, как описано ранее. Проводили дублированные реакции объемом один мл, который содержал: 500 мкг Ό-аминотрансферазы, 50 мкг альдолазы РгоА, 100 мМ фосфат калия рН 7,5, 3 мМ МдС12, 4 мг индол-3-пирувата, 200 мМ пируват натрия, 7,35 мг (50 мМ) Ό-глутамата и 0,1 мМ РЬР. Образцы инкубировали при 30°С в течение 1 ч, 2 ч и в течение ночи и фильтровали для анализа ЬС/М8/М8. Образцы содержали только 8,В-и В,В-стереоизомеры монатина, как определено с помощью протокола образования производных посредством 1;1)АЛ, описанного в примере 1. Обобщенные результаты представлены в таблице 19, ниже. % ВВ определяли с помощью площадей пиков, которые разделяли посредством обращенно-фазовой хроматографии.
Таблица 19. Сравнение ферментов Ό-аминотрансфераз
Фермент Время (час) Монатин м.д. % К.,В-монатина
В. .чиЬ ΌΑΤ-Η18 1 512 не определено
В. чиЬ ΌΑΤ без маркера 1 1056 не определено
В1оСа1а1уйс5 АТ-103 1 2353 не определено
В. .чиЬ ΌΑΤ-ΗΙ8 2 894 -80-90%
В. чиЬ ΌΑΤ без маркера 2 1913 -80%
В1оСа1а1уйс8 АТ-103 2 6887 92,5%
В. хиЬ ΌΑΤ-ΗΙδ 16 3014 31
В. хиЬ ΌΑΤ без маркера 16 5612 33
ВюСаШ1уйс8 АТ-103 16 16131 66
- 150 019971
Оказалось, что удаление маркера Ш8-6 приводит к повышенной активности Ό-аминотрансферазы В. киЬббк; однако гомолог Ό-аминотрансферазы В1оСа!а1убск явно обладал наиболее высокой активностью. Гомолог Ό-аминотрансферазы ВюСа!а1убск также показал более высокую субстратную специфичность в отношении К-предшественника монатина. Оказалось, что повышенное время инкубации снижает избыток образующегося энантиомера К, К-монатина.
Поскольку ферменты Ό-аминотрансферазы ВасШик отдают предпочтение пирувату в качестве акцептора амино и Ό-аланину в качестве донора амино, ожидалось, что Ό-аланин можно использовать в качестве донора амино для превращения МР в монатин со сходными или улучшенными результатами. Проводили дублированные реакции объемом один мл, который содержал: 500 мкг Ό-аминотрансферазы, 50 мкг очищенной альдолазы РгоА, 100 мМ фосфат калия рН 7,5, 3 мМ МдС12, 4 мг индол-3-пирувата, 100 мМ пируват натрия, 25 мМ Ό-глутамат или Ό-аланин и 0,1 мМ РЬР. Образцы инкубировали в течение 2 ч и перед анализом обрабатывали, как указано выше. Когда Ό-аланин использовали в качестве донора амино, образовывались немного более высокие уровни монатина (23 против 21 м.д.), как и ожидалось. Кроме того, ожидается, что высокие концентрации пирувата могут ингибировать стадию переаминирования, таким образом дозирование меньших количеств пирувата с течением времени может повысить общую скорость образования монатина. Из представленных выше данных можно видеть, что даже несмотря на то, что в этом случае использовали половину пирувата по сравнению с представленной выше таблицей, образовывалось значительно большее количество монатина. АТ-103 представляет собой пример фермента с ограниченной активностью в отношении 8-МР. Даже несмотря на то, что альдолаза РгоА, используемая в этом исследовании, образует более чем 90-95% 8-МР, АТ-103 образует вплоть до 92% К, К-монатина.
Пример 14. Получение К,К-монатина из Ό-триптофана.
На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: приблизительно 60 мкг альдолазы РгоА С. !ек!ок!егош (предоставленной в клеточных экстрактах, как описано в 40 03/091396 А2), 4 мМ МдС12, 50 мМ Ό-триптофан, 0,5 мг Ό-аминотрансферазы ВюСа!а1убск (АТ-103) (ВюСа!а1убск, Ракабепа, СА), 100 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 или 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 8, 0,05 мМ РЬР, 3 мМ фосфат калия (только для реакций с ацетатом) и 10 мМ α-кетоглутарат. Эксперименты проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которые не добавляли альдолазу. Образцы инкубировали в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании. Истинное значение рН образцов с ацетатом натрия составляло приблизительно 5, в то время как конечное значение рН для забуференных фосфатом образцов составляло приблизительно 7. Оказалось, что ни одна из альдолаз не обладает значительной активностью при рН 5, показатель образца, содержащего альдолазу РгоА, был немного выше показателя отрицательного контроля, но, вероятно, не выше экспериментальной ошибки. В фосфате калия альдолаза РгоА образовывала 73,4 м.д. монатина с соотношением К,К:8,К 1,7:1 (~63% К,К из Ό-триптофана).
Вследствие того, что ферменты Ό-аминотрансферазы ВасШик отдают предпочтение пирувату в качестве акцептора амино и Ό-аланину в качестве донора амино, ожидалось, что добавление альфакетоглутарата является необходимым при образовании К,К-или 8,К-монатина из Ό-триптофана. Указанный выше эксперимент повторяли (в 100 мМ фосфатно-калиевом буфере) с использованием очищенной альдолазы РгоА (50-60 мкг) и времени инкубации 2,5 ч. Дублированные эксперименты проводили с альфа-кетоглутаратом и без него. При добавлении 10 мМ альфа-кетоглутарата образовывалось 56,1 м.д. монатина из Ό-триптофана (79,5% К,К, 20,5% 8,К). Без альфа-кетоглутарата образовывалось 102,5 м.д. монатина (79% К,К, 21% 8,К).
Пример 15. Триптофанрацемаза.
К,К-монатин получали с использованием Ό-аминотрансферазы и альдолазы, когда в качестве исходного материала использовали Ό-триптофан (пример 14). Несмотря на это, Ь-триптофан может быть предпочтительным исходным материалом по нескольким причинам. Например, Ь-триптофан может быть менее дорогостоящим и более свободно доступным, чем Ό-триптофан. В этом описании описано несколько способов получения активной триптофанрацемазы. Выход К,К-монатина повышался при использовании К-специфичной альдолазы, т.е. альдолазы, которая предпочтительно или селективно образует К-МР. На фиг. 3 проиллюстрирован способ получения стереоизомерно-обогащенного К,К-монатина из Ь-триптофана с использованием триптофанрацемазы, Ό-аминотрансферазы и К-специфичной альдолазы.
Селекцию в отношении триптофанрацемазы проводят конструированием штамма, для роста которого не требуется активная рацемаза. Для ауксотрофа по триптофану требуется источник Ь-триптофана при выращивании на минимальной среде. Дополнение среды с Ό-триптофаном представляет собой один способ селекции рацемазы, которая превращает Ό-триптофан в Ь-триптофан. Ауксотрофы по триптофану тестировали в отношении роста на минимальной среде, дополненной Ό-триптофаном. Штаммы САО 18455 и САО 18579 из Сой Оепебс 8!оск Сеп!ег и N66612264 (также йрА-, λΌΕ3, лизогенизированный и с удаленной его плазмидой) не росли при подпитке Ό-триптофаном, но росли при подпитке Ьтриптофаном. Е.сой можно использовать в качестве организма-хозяина, однако также можно использо
- 151 019971 вать другие организмы-хозяева, такие как дрожжи, другие бактерии или другие эукариотические организмы. Ауксотроф по триптофану (конкретно ИККБ12264 (также 11рА-, λΌΕ3, лизогенизированный и с удаленной его плазмидой)) будет расти на Б-триптофане при его трансформации Б-аминотрансферазой. Это подтверждает способность Е.сой транспортировать Б-триптофан в клетку.
8а1сйег и Ыпдепк описали наличие триптофанрацемазы в Ркеиботопак аигегеойааепк (АТСС 15926). Триптофанрацемаза также описана в некоторых растениях, включая табак, свеклу, томат и пшеницу, и оказалось, что фермент индуцируется в условиях осмотического стресса или засухи. Триптофанрацемаза может участвовать в нативном каскаде образования монатина 8с1егосййоп Шсйойик. Для выделения рацемазы с этой активностью конструируют экспрессирующую библиотеку из АТСС 15926 (или другого организма с активностью триптофанрацемазы), и библиотеку трансформируют в ауксотрофа по триптофану. Отбирают штамм, который будет расти с использованием Б-триптофана в качестве источника триптофана. Сходный способ также использовали для скрининга многих штаммов с известными рацемазами для поиска рацемазы с активностью в отношении Б-триптофана. Их примеры включают: аланин-, серин- и глутаматрацемазы (Т. Υοкй^ти^а апб N. Ε^ιΚί, Атто Ас1б Касетакек: Рипсйопк апб Месйашктк. 1оигпа1 ой Вюкаепсе апб Вюепдтеегтд, Уо1.96, № 2, 103-109, 2003). Аланинрацемаза является зависимой от РЬР, и ее клонировали из 8а1топе11а 1ур1птипит (ген бабВ). Другими источниками являются Εксйе^^сй^а сой, ВасШик киЫШк, Ркеиботопак аегидшока, У1Ьпо сйо1егае, 8с1пхокассагоусек ротЬе и ВасШик сегеик. Базидиальные грибы, Ьепйпик ебобек, также содержат аланинрацемазу с широкой активностью. Серинрацемаза также является зависимой от РЬР и встречается в эукариотах (например, в кДНК тутового шелкопряда, головного мозга крысы, головного мозга мыши), а также в бактериях (Ъгиегососсик даШпагит). Глутаматрацемаза является независимой от РЬР, и ее клонировали из Ребюсоссик репЮкасеик, ВасШик ритйик, ЙасЮЬасШик йегтепй, ЙасЮЬасШик ЬютА Ε^Η, Ацшйех ругорййик и ВасШик киЫШк. Глутаматрацемаза является высокоспецифичной, и, таким образом, даже структурно сходные аминокислоты аспартат, аспарагин и глутамин не являются субстратами для этого фермента. Также существуют аспартатрацемазы, и они являются независимыми от РЬР. Эти ферменты встречаются в штаммах Ьас1оЬасШ1, 8йер1ососсик и в некоторых архебактериях, таких как штаммы БекШ&гососсик и Тйегтососсик. Двустворчатый моллюск 8сарйагса ЬгонйЮпй также содержит аспартатрацемазу. Другие рацемазы, встречающиеся в литературе, включают рацемазу аминокислот (ЕС 5.1.1.10) из ЛηаЬаеηа кр. и Ркеиботопак к1па1а, пролинрацемазу, многофункциональную фенилаланинрацемазу. Также тестируют сходные эпимеразы или рацемазы. Потенциальные рацемазы тестируют, чтобы убедиться, что они являются не Б-триптофанаминотрансферазами. Этот скрининг проводят посредством анализа последовательностей и/или посредством ферментного анализа.
Ферменты, которые проходят тест в качестве рацемазы, подвергают скринингу на активность в отношении монатина, как описано в примере 17. В идеальном случае получают фермент, который является высокоспецифичным в отношении триптофана и обладает небольшой активностью рацемазы в отношении монатина или не обладает ею.
Триптофанрацемазу также можно изменять и/или улучшать (посредством мутагенеза или рекомбинантной инженерии), исходя из существующей рацемазы, трансаминазы или эпимеразы. Кроме того, вследствие того, что кристаллические структуры аланинаминотрансфераз известны, их можно использовать в качестве основы для рационального мутагенеза на основе структуры. Процесс, описанный выше, используют в качестве исходной селекции в отношении активности триптофанрацемазы и в качестве скрининга улучшенной активности.
Библиотеки триптофанрацемаз
Конструирование библиотек: Вигкйо1бепа руггосша (АТСС15958) и Ркеиботопак СШогогарЫк (АТСС15926) получали из Американской коллекции типовых культур. Их выращивали в соответствии с рекомендациями АТСС, и геномную ДНК получали в соответствии со способом Мека1апок П. (Бирйсабоп апб атрШтсайоп ой 1охт депек ίη У1Ьпо сйо1егае. Се11. 1983. 35:253-63). Геномную ДНК частично расщепляли посредством фермента рестрикции 8аи3Ак Фрагменты 1-3 т.п.н. очищали из геля с использованием набора для экстракции из геля О1адеп р^ц^ск Се1 Εχί^ί^ КН (О1адеп, Уа1епс1а, СА). Очищенную ДНК лигировали в рТгс99а (Атегкйат, Р|кса1а\\ау, N1), расщепленный посредством ВатШ и очищенный, как описано выше. Лигирование проводили при комнатной температуре с инкубацией в течение ночи с использованием молярного соотношения вставки и вектора 3:1. Лигированную библиотеку трансформировали в химически компетентные клетки Т0Р10Р' (Iην^ΐ^οдеη, Саг1кЬаб, СА) и высевали на среду ЬВ с 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации планшетов для трансформации в течение ночи колонии соскребали с планшетов, промытых жидкой средой ЬВ, и клеточный осадок соответствующего размера подвергали способу выделения в малых количествах с использованием набора 01адеп р^ци^к (О|адеп, Уа1епс1а, СА). Приблизительно 30000 колоний собирали и подвергали способу выделения в малых количествах.
Объединенные плазмиды трансформировали в САС18455 (йрС83::Тп10, грй-1) или САС18579 (йрС::Тп10кап, грй-1). Оба штамма являются ауксотрофами по триптофану, таким образом, они не растут на минимальной среде М9 (БШсо), если среда не дополнена триптофаном. Трансформанты высевали на минимальную среду М9, дополненную Б-триптофаном. Это обеспечивает селекцию штамма, который
- 152 019971 может превращать Ό-триптофан в Ь-триптофан.
Перед трансформацией библиотеки штаммы тестировали в отношении роста на минимальной среде с Ь- или Ό-триптофаном. Штаммы тестировали в отношении роста на минимальной среде, дополненной Ό-триптофаном, и рост не был выявлен. Оба штамма росли на идентичной среде, дополненной Ьтриптофаном вместо Ό-триптофана. Кроме того, производный штамм N^№2264 (из используемого штамма была удалена плазмида с триптофановым опероном, он является лизогенизированным посредством Λ^Ε3 и обладает делецией по НрА, в дополнение к другим хромосомно кодируемым мутациям (всгВ, Δ1^рΕ^. ίиаΛ2, агоР) (этот штамм не может расти на минимальной среде, дополненной Όтриптофаном, но растет на идентичной среде, дополненной Ь-триптофаном вместо Ό-триптофана)) трансформировали Ό-специфичной аминотрансферазой из ВасШив виЫШв (\0 03/091396). Экспрессия Ό-аминотрансферазы запускалась промотором Т7. Трансформированный штамм был способен расти на минимальной среде М9, дополненной Ό-триптофаном.
Колонии, которые растут на среде с Ό-триптофаном, подвергают скринингу. Плазмиду выделяют и повторно трансформируют в родительский штамм (САО18455 или САО18579) для подтверждения того, что рост на среде с Ό-триптофаном зависит от плазмиды, а не от мутаций хозяина. Анализируют нуклеотидные последовательности плазмид, которые комплементируют ауксотрофные свойства в отношении триптофана. Клоны, которые определяют как содержащие ген триптофанрацемазы, анализируют далее.
Триптофанрацемазу из других тканевых источников выделяют аналогичным образом. Существуют литературные данные об активности триптофанрацемазы как в клеточной культуре тканей табака (№соЦапа 1аЬасшп Ь. вариант \1всопвт 38) (Мшга, О.А. апб М111в, 8.Ε. Тйс сопусгвюп оГ О-1тур1орйап 1о Ь1гур1орйап щ сс11 сийигсв оГ 1аЬассо. Р1ап1 Рйувю1. 1971, 47:483-487), так и в неочищенных белковых экстрактах пшеницы (ТгШсиш асвйушп) (Всков1аувкауа, КЬ, Уит'сус, 0.ν., 8й1Ьапоуа, Ь.А., апб 8а1уасу, В.К. 8упШсв1в апб рйувю1ощса1 Гипсйоп оГ 0-1гур1орйап билпд \\йса1 дсттШайоп. Вивв1ап к Р1ап1 Рйувю1. 1997. 44:196-203). Экспрессирующую библиотеку кДНК получают из ткани, как описано в литературе, и экспрессирующую библиотеку используют для трансформации ауксотрофа по триптофану, как описано выше.
Анализ триптофанрацемазы
Клоны, которые идентифицируют как потенциально обладающие триптофанрацемазой, трансформируют в штамм Е.сой, обычно используемый для экспрессии рекомбинантных белков, таких как ВЬ21. Клетки выращивают в бульоне ЬВ до оптической плотности при 600 нм, составляющей 0,4-0,6. Промотор, запускающий экспрессию рацемазы, индуцировали посредством РРТО (конечная концентрация 0,1 мМ). После индукции клеткам дают возможность экспрессировать белок в течение 1-3 ч при 37°С (с аэрацией). Клетки собирают и лизируют посредством пресса Ргспсй, обработки ультразвуком или химическими средствами (такими как ВидВив1сг (Nоνадсп, Маб1воп, \Ι)). Лизированные клетки центрифугируют для удаления клеточного дебриса. Очищенный экстракт используют непосредственно в анализах.
В раствор добавляют различные количества экстракта, так что конечная концентрация составляет 50 мМ фосфат калия (рН 7,0) и 2 мМ Ь-триптофан. Добавляют пиридоксаль-5'-фосфат до конечной концентрации 10 мкМ. Образцы инкубируют, а затем анализируют посредством ЬС/М8. Наличие пика Όтриптофана, когда в качестве субстрата используют только Ь-триптофан, указывает на положительный результат. Концентрация Ό-триптофана должна повышаться со времени до достижения равновесия, и скорость также должна повышаться при повышении концентрации белка, до тех пор, пока концентрация фермента не станет настолько высокой, чтобы он более не насыщался субстратом. Также Ό-триптофан можно превращать в Ь-триптофан, как описано выше.
Комплементирующий ген может кодировать Ό-аминотрансферазу (комплементирующий ген представляет собой ген, который при экспрессии устраняет следствия мутации в организме). Например, если организм обладает нуль-мутацией в одном из генов, требуемых для синтеза триптофана клеткой, комплементирующий ген может представлять собой ген, который при экспрессии позволяет штамму расти на минимальной среде (т.е. без триптофана). Эта реакция требует альфа-кетокислоты, такой как αкетоглутарат, оксалоацетат или пируват, в качестве акцептора амино. Эти соединения, вероятно, будут представлены в клеточном экстракте (в небольших количествах). Эти соединения можно удалять с использованием колонки для обессоливания ΓΌ-10 (ΌΕ Нса11йсагс, Р|вса1а\уау, N1), и, тем не менее, анализ можно проводить в неочищенном экстракте. Триптофанрацемазу с активностью очищают с использованием общепринятой колоночной хроматографии. В заключение, открытую рамку считывания, идентифицированную в качестве потенциальной триптофанрацемазы, клонируют в экспрессирующий вектор с аффинным маркером. Затем потенциальную триптофанрацемазу очищают аффинной хроматографией. В любом случае очищенный белок используют в ферментных анализах, по существу как описано выше.
Обратные способы генетической инженерии триптофанрацемазы
Триптофанрацемазу можно очищать либо из растительных, либо из микробных источников общепринятыми способами очистки белка, включая фракционирование с помощью сульфата аммония и общепринятую колоночную хроматографию. После очистки белка так, чтобы можно было выделить пятно 2-О-геля, используют способы микросеквенирования пептидов или общепринятые способы секвениро
- 153 019971 вания аминокислот по принципу Эдмана (см. дο1д^.йа^νа^б.еби/ш^с^οсйеш/ для описаний протоколов и оборудования, используемых для этого типа работы). Однако в некоторых случаях геномную последовательность организма нельзя использовать в качестве источника белка для очистки белка, вследствие того, что такая последовательность еще не была определена. В этом случае первый набор вырожденных праймеров можно конструировать, исходя из доступной последовательности наиболее близкого известного родственника белкового источника. Затем для выделения последовательности, кодирующей триптофанрацемазу, проводят вырожденную ПЦР и прогулку по геному в соответствии с общепринятыми протоколами.
Образование монатина посредством триптофанрацемазы
На 1 мл реакционной смеси добавляют следующее: приблизительно 60 мкг альдолазы РгоА С. !ек!ок!етош (предоставленной в клеточных экстрактах, как описано в \УО 03/091396 А2), 100 мкл/мл клеточного экстракта триптофанрацемазы или 1 мг/мл очищенной триптофанрацемазы, 4 мМ МдС12, 50 мМ Ь-триптофан, 0,5 мг Ό-аминотрансферазы ВюСа!а1уйск (АТ-103) (ВюСа!а1уйск, Ракабепа, СА), 100 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5, 0,05 мМ РЬР и 10 мМ α-кетоглутарат. Вследствие того, что пируват представляет собой доступный акцептор амино для Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью, α-кетоглутарат является необязательным. Эксперименты проводят с дублированием, с отрицательными контролями, в которых не добавляли альдолазу или не добавляли триптофанрацемазу. Образцы инкубируют ~1 ч или в течение ночи (20 ч) при 30°С при осторожном встряхивании.
Триптофанрацемазу тестируют на активность в отношении монатина. Используют анализ, сходный с анализом примера 17, с монатином в качестве субстрата и сравнивают с активностью фермента в отношении триптофана. Идеальный фермент обладает активностью в отношении триптофана, но обладает небольшой активностью или не обладает активностью в отношении других аминокислот, в частности, глутамата и монатина. Если фермент обладает значительной активностью в отношении монатина, фермент можно подвергать мутагенезу для снижения активности в отношении монатина и/или глутамата, сохраняя активность в отношении триптофана неизмененной или находящейся на уровне, достаточно высоком для того, чтобы фермент был пригодным для получения монатина. Способы, которые можно использовать для мутагенеза, включают, но не ограничиваются ими, ПЦР с пониженной точностью, сайт-направленный мутагенез, моделирование в целях идентификации мишеней для сайт-направленного мутагенеза (участков, которые могут быть вовлечены связывание субстрата), пассирование через мутагенные штаммы и перетасовку ДНК.
Подвергнутые мутагенезу рацемазы можно подвергать скринингу в отношении активности триптофана с использованием анализа на планшетах, как описано выше. Затем клоны, которые сохраняют активность в отношении триптофана, подвергают скринингу в отношении потери активности в отношении монатина.
Пример 16. Сайт-направленный мутагенез НЕХАкрС.
Обзор эксперимента
Было выявлено, что гексамутантная форма Е.сой АкрС (НЕХакрС) обладает лучшей активностью по сравнению с АкрС в отношении образования 8,8-монатина, как описано в примере 6 \УО 03/091396 А2. НЕХ (регистрационный номерУАНЕА дЬ 127190) содержит следующие мутации из АкрС (нумерация по Е.сой): ν35Ό, К37У, Т43к Ν64Ό, Т1048 и N2858. Исходя из структурного анализа и литературных данных (8. Во!йтап апб I. Кнксй, I. Мо1. Вю1. (2003), 327, 593-608; 8. Во!йтап е! а1., Рто!ет 8с1епсе (2004), 13:763-772), создали еще 5 мутантных форм, которые, как ожидалось, повышают кинетическую активность в отношении субстратов, используемых в каскаде образования монатина: Ь-триптофана, 8-МР или обоих из них. Две из мутантных форм повышали скорости переаминирования как триптофана, так и 8,8монатина. Две из мутантных форм показали повышенную стереоселективность в отношении образования 8,8-монатина, в то время как одна мутантная форма была менее стереоселективной. Исходя из этого, ожидается, что Ό-аминотрансфераза с широкой специфичностью из ВасШик кр., обладающая сходными мутациями, является пригодной в качестве Ό-аминотрансферазы в каскадах В,В-монатина, представленных на фиг. 3 и описанных в примере 15. Одна из мутантных форм (НЕХакрСР9Т/В122С) обладала повышенной активностью в отношении переаминирования Ь-триптофана, однако активность в отношении образования 8,8-монатина или переаминирования 8,8-монатина значительно снижалась. Таким образом, ожидается, что этот фермент является пригодным на первой стадии каскадов образования В, В-монатина, представленных на фиг. 1, 2, 4-8 и описанных в примерах 18 и 19. Как правило, аминотрансфераза, которая обладает активностью, сходной с активностью АкрС в отношении Ь-триптофана и ограниченной активностью в отношении В-МР и 8-МР, является пригодной для процессов, представленных на фиг. 1, 2, 4-8.
Способы и материалы
Ген НЕХ, клонированный в рИС19 был предоставлен профессором 1. Е. Кнксй (Оерайтеп! оГ Мо1еси1аг апб Се11 Вю1оду, υη^νе^к^ΐу оГ СаШогша, Вегке1еу, Вегке1еу, СА 94720-3206), и его использовали в качестве матрицы для клонирования гена в рЕТ23а. См. 1атек 1. ОпиГГег апб 1аск Е. Кнксй, Вебеыдп оГ Ше киЬк!га!е кресгйсйу оГ ЕксйепсЫа сой акрайа!е аш^ηο!^аηкГе^аке !о !йа! оГ Ексйепсйга сой 1угокте атг
- 154 019971 по1гапк£егаке Ьу Ьото1оду тойеНпд апй кйе-й1гес1ей ти1адепек1к, РгоГет 8с1епсе, 4:1750-1757 (1995). Также см. регистрационный номер NСВI 1АНГ_А СГ1127190 (аминокислотная последовательность НЕХ). Следующие праймеры были сконструированы для клонирования гена НЕХ в вектор рЕТ23а ^оуадеп, Майкоп, \Ы).
Праймеры НЕХакрС:
Х-конце'вой: 5'-ССССААСАТАТСТТТСАСААСАТТАССССС-3' (8Ер ΙΌ N0:393);
С-концевой: 5'-АТААССССАТССТТАСАССАСТСССАСААТСС-8' (8Ер ΙΌ N0:394).
Для амплификации гена использовали следующий протокол ПЦР: В реакционную смесь объемом 100 мкл добавляли 50 нг ДНК-матрицы, 1,0 мкм каждого праймера, 0,2 мМ каждого ЙХТР, 1 Е полимеразы Р£л ТигЬо (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА), и 1Х буфер С1опей Р£л. В программе термического блока использовали горячий старт при 94°С в течение 5 мин; с последующими 25 циклами из стадии денатурации при 94°С (30 с), стадии отжига при 55°С (1 мин) и стадии удлинения при 72°С (2 мин), и, в конце, с заключительной стадией при 72°С (7 мин). Для клонирования продукта ПЦР рЕТ23а использовали стандартные способы молекулярной биологии с использованием участков рестрикции Хс.1еЧ и ВатШ.
Полагают, что остаток триптофана в положении 130 является важным для стэкингвзаимодействий с кольцом пиридоксила, однако также, по-видимому, он является источником стерического препятствия для субстрата 8-предшественника монатина (МР), исходя из наблюдений с моделированием белков. Таким образом, аминокислоту с гидрофобной боковой цепью меньших размеров (фенилаланин) использовали для замены триптофана. Остальные мутации были основаны на кинетических данных из литературы, хотя создавали новые сочетания требуемых мутаций. Все мутации НЕХакрС, за исключением ^130Г, проводили с использованием набора 81га1адепе МиЖ-СЬапде кй (81га1адепе, Ьа ,1о11а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Мутацию ^130Г проводили с использованием набора 81гаПшене ОшкСйшше' кй (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя, с единственным исключением, заключающимся в том, что температура удлинения в реакции ПЦР была снижена до 66°С. Праймеры для набора для множественных изменений конструировали с использованием инструмента для конструирования праймеров ОшкСйшше' тиЙ1-кй рптег йек1дп !оо1 на <шшш.к1га1адепе.сот>, за исключением праймеров для единичной мутации ^130Г.
Последовательности праймеров приведены ниже в табл. 20.
Таблица 20
Праймер Последовательность (от 5’ к 3’)
Экспрессия мутантных генов НЕХакрС и анализ активности фермента
Жидкие культуры (5 мл) Хохадеч! 0уегшдЫ Ехргекк™ Аи1отйис1юп 8ук!ет 2 (каталожный # 713663; растворы 1-6) (Хохадечп Майкоп, \Ы) инокулировали из свежих планшетов или замороженных исходных культур в глицерине следующих штаммов:
Е.сой ВЕ21(ОЕ3)::НЕХакрСрЕТ23а;
Е.сой ВЬ21 (бЕ3):: НЕХакрС^ 130ГрЕТ23а;
Е.сой ВЬ21 рЕ3): :НЕХакрСТ 156АрЕТ23а;
Е.сой ВЬ21 (0Е3)::НЕХакрСР9Т/Т156АрЕТ23а;
Е.сой ВЬ21 (0Е3)::НЕХакрСР9Т/К122СрЕТ23а;
Е.сой ВЬ21 (0Е3)::НЕХакрСК122С/Т156АрЕТ23а.
Культуры инкубировали при 37°С при 230 об/мин в течение 6-8 ч. Определяли 0Ό600 каждой культуры, и вычисляли объем культуры, необходимый для достижения 0Ό600 0,03-0,05 в 25 мл. Вычисленные объемы каждой жидкой культуры переносили во флаконы, содержащие 25 мл той же среды. 0уегшдЫ Ехргекк™ Аи1ошйис1юп 8ук!ет 2 представляет собой полную среду с определенным химическим составом для экспрессии на высоком уровне с ШТС-индуцируемыми экспрессирующими системами, которые используют лактозу в качестве индуцирующего вещества и не требуют мониторинга клеточного роста. Культуры 0уегшдЫ Ехргекк инкубировали при 30°С при встряхивании при 230 об/мин в течение 18 ч. Клетки собирали центрифугированием и промывали один раз холодным 50 мМ М0Р8, рН 7,0. Затем
- 155 019971 клетки лизировали с использованием реагента для экстракции ВидЬик!ег™ (не содержащего первичные амины) ЕхИ’асИоп Кеадеп! (Хоуадеп каталожный #70923-3) ^оуадеп, Майкоп, \\Ί), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Веп/опаке ^оуадеп Са!а1од #70746-3) ^оуадеп, Майкоп, \\Ί), 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго!еаке ШпВпо!’ Соск!а11 Ле! П ^оуадеп Са!а1од #539132) ^оуадеп, Майкоп, \\Ί) и 0,33 мкл/10 мл г-1 .хко/хте ^оуадеп Са!а1од #71110-3) ^оуадеп, Майкоп, ^Ι), в соответствии с рекомендованным протоколом Nονадеη. После инкубации при 25°С в течение 15 мин при осторожном встряхивании, клеточный дебрис из каждой суспензии осаждали центрифугированием при 21000хд в течение 15 мин при 4°С. Супернатант осторожно отбирали и анализировали в качестве бесклеточного экстракта. Фракции включений, выделяли суспендированием фракций клеточного дебриса в 30% реагенте для экстракции ВидЬик!ег™ (не содержащем первичных аминов) Ех!гас!юп Кеадеп!, центрифугированием при 21000хд в течение 10 мин; суспендированием центрифугированного осадка в 10% реагенте для экстракции ВидЬик!ег™ (не содержащем первичных аминов) Ех!гас!юп Кеадеп!, повторным центрифугированием с выделением промытого осадка. Бесклеточные экстракты и фракции включений анализировали в отношении экспрессии белка посредством ЛЭЛ-РАСЕ на гелях с 4-15% градиентом (ВюКаб # 161-1104, Негси1ек, СА). Для образцов клеточных экстрактов, в каждую дорожку геля помещали двадцать микрограмм растворимого белка (предварительно смешанного с 1Х буфером для нанесения белка и нагретого при 95°С в течение 5 мин). Фракции включений растворяли в 1Х буфере для нанесения белка (0,2 мл), нагревали в течение 10 мин при 95°С, и в каждую дорожку наносили 5 мкл каждого раствора. Количество каждой мутантной формы НЕХ по сравнению с тотальным растворимым белком, нанесенным в каждую дорожку, вычисляли посредством анализа интенсивности полос с использованием БаЬшэгкк Вю1тадт§ ГО-де1 !оо1 (ЦУР, Ис. ир1апб, СА), и он описан ниже:
Таблица 21
Образец
Белок НЕХазрС/тотальный растворимый белок
Е. соП ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа5рСР9Т/Т156АрЕТ23а СЕЕ 0,310
Е. соП ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСР9Т/К122АрЕТ23а СЕЕ 0,145
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСрЕТ23а СЕЕ 0,172
Е. соИ ВЬ21 (ΏΕ3): :НЕХазрСК. 122 А/Т156 АрЕТ23 а СЕЕ 0,174
Е. соН ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рС№130ЕрЕТ23а СЕЕ 0,114
Е. соП ВЬ21(ОЕЗ)::НЕХа8рСТ156АрЕТ23а СЕЕ 0,120
Анализ гелей показал, что мутантная форма НЕХакрСК122А/Т156А представляла собой единственный белок, который встречался в достаточных количествах во включениях. Белок НЕХакрСР9Т/Т156А привел к наиболее высокому уровню экспрессии, приблизительно на 90% большему, чем белок НЕХакрС. В противоположность этому, белки А130Г, Т156А и Р9Т/К122С экспрессировались в меньших концентрациях, чем НЕХакрС.
Активность мутантных белков НЕХакрС в отношении образования Л,Л-монатина измеряли с использованием следующих условий реакции: каждая реакционная смесь объемом 1 мл содержала 50 мМ ТАРЛ, рН 8,2, 4 мМ МдС12, 3 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 200 мМ пируват натрия (рН доведен до 8), 5 мМ α-кетоглутарат (рН доведен до 8), 50 мМ триптофан, 0,05 мМ пиридоксаль-3-фосфат, 50 мкг/мл альдолазы Рго А (добавленной в качестве бесклеточного экстракта) и различные концентрации (приблизительно 50 и 500 мкг/мл) аминотрансферазы (добавленной в качестве бесклеточного экстракта). Для получения исходных растворов и для доведения объема реакционных смесей до 1,0 мл использовали деаэрированную воду. Пиридоксальфосфат добавляли непосредственно перед добавлением ферментов. Реакционные пробирки инкубировали при 30°С при осторожном встряхивании в течение 4 ч. Образцы (0,01 мл) извлекали через 1, 2 и 4 ч после добавления ферментов, фильтровали и анализировали посредством БС/МЛ/МЛ, как описано в примере 1. Образование монатина нормализовали, исходя из количества аминотрансферазы, находящейся в реакционных смесях. В условиях этих анализов НЕХакрС и НЕХакр СТ156А образовывали наибольшее количество тотального монатина на мг аминотрансферазы, в то время как белок Р9Т/К122С образовывал наименьшее количество, за которым следует НЕХакрСА130Г. Ферменты НЕХакрСА130Г и Р9Т/К122С показали наиболее высокую стереоселективность в отношении ЛМР (более 98% Л,Л-монатина), даже в случае применения высоких концентраций фермента (более 300 мкг/мл). В ферментативных реакциях, содержащих фермент Р9Т/Т156А в высокой концентрации, процентное количество продукта в виде Л,Л-монатина снижалось менее чем до 90%. Другие мутантные формы показали стереоселективность в отношении продукта, высокосходную с исходной мутантной формой НЕХакрС (приблизительно 95% Л,Л-монатин). Анализ продукта реакции, содержащей фермент НЕХакрС с использованием образования производных посредством реагента ГОАА, описанный в примере 1, показал, что второй образованный стереоизомер представляет собой К,Л-монатин.
Анализ активности аминотрансферазы в отношении триптофана и монатина
Мутантные формы тестировали на активность в отношении переаминирования с использованием
- 156 019971
5,5-монатина и Ь-триптофана в качестве субстратов. Активность аминотрансферазы измеряли, отслеживая образование копродукта реакции, глутамата, посредством ВЭЖХ с послеколоночным образованием производных посредством ОРА, как описано в примере 1. Реакционная смесь содержала, в 1,0 мл, 100 мМ буфер НЕРР5, рН 8,0, 20 мМ альфа-кетоглутарат, 0,08 мМ пиридоксальфосфат, 25 мМ триптофан или 5,5-монатин, и фермент (предоставленный в качестве 2,5 мг белка в клеточных экстрактах). Все компоненты, за исключением фермента, смешивали, для начала реакции добавляли фермент, и реакционный раствор инкубировали при 30°С (осторожно встряхивания) в течение 90 мин. Реакции проводили с дублированием, с отрицательными контролями, в которых фермент не добавляли. Реакцию останавливали добавлением 10% муравьиной кислоты (конечная концентрация), смесь центрифугировали при 21000 об/мин, и супернатант осторожно удаляли и фильтровали. Данные корректировали по фоновым уровням глутамата и по разбавлению при добавлении кислоты для осаждения белков, затем нормализовывали по количеству добавленной мутантной аминотрансферазы. Когда в качестве субстрата использовали триптофан, НЕХакрС образовывал 13,0 мМ глутамата на мг аминотрансферазы в час. Относительная активность, выраженная в процентах, мутантных форм является следующей: НЕХакрС^130Е (156%), НЕХакрСТ156А (151%), НЕХакрСР9Т/Т156А (63,7%), НЕХакрСР9Т/Я122О (116%) и НЕХакр СЯ122О/Т156А (107%). Когда в качестве субстрата использовали 5,5-монатин, НЕХакрС образовывал 7,43 мМ глутамата на мг аминотрансферазы в час. Относительная активность, выраженная в процентах, мутантных форм является следующей: НЕХакрС^130Е (113%), НЕХакрСТ156А (87,7%), НЕХакр СР9Т/Т156А (67,3%), НЕХакрСР9Т/Я122О (11,2%) и НЕХакрСЯ122О/Т156А (114%).
Мутантная форма НЕХакрСР9Т/Я122О обладала повышенной активностью в отношении превращения триптофана в индол-3-пируват, но сниженной активностью в отношении переаминирования 5,5монатина. Соотношение активности в отношении превращения триптофана в монатин составляло 18,2 по сравнению с 1,75 для НЕХакрС, что делает его желательным кандидатом для получения Я,Я-монатина с использованием каскадов, для которых требуется Ь-аминотрансфераза, такая как Ь-аминотрансферазы, описанные в примерах 18 и 19. Таким образом, НЕХакрСР9Т/Я122О является примером аминотрансферазы с ограниченной активностью в отношении 5,5-монатина (и МР).
Большинство мутаций повышало активность Ь-триптофана, однако только две мутантные формы приводили к повышению активности в отношении как Ь-триптофана, так и 5,5-монатина (НЕХакрС^130Е и НЕХакрСЯ122О/Т156А). Поскольку в этих анализах использовали 25 мМ субстрат, наиболее вероятно, ферменты были насыщенными, и активность отражает кса1 ферментов. Однако в условиях, в которых проводили анализы образования 5,5-монатина (выше), маловероятно, что концентрация 5-МР является достаточной для насыщения фермента, таким образом, повышение кса1 не отражается. Было описано для некоторых веществ, что некоторые из мутаций приводят к повышению кса!, однако также снижают кажущуюся кт в отношении субстрата, представляющего собой аминокислоту. Ожидается, что при использовании возрастающих концентраций субстратов, эти две мутантные формы обеспечат преимущество в отношении скоростей образования 5,5-монатина по сравнению с НЕХакрС. Оказалось, что мутация НЕХакрСТ156А приводит к повышенным скоростям переаминирования триптофана без существенного эффекта на скорость переаминирования МР в условиях, указанных выше для образования 5,5монатина.
Посредством сравнения структур НЕХакрС и одного из ферментов Ό-аминотрансфераз ВасШик кр. (см., например, 5. 5идю, О.А. Ре!кко, ЬМ. Мапшпд, К. 5оба апб Ό. Яшде, ВюсйетЫгу 34 (1995) рр.96619669), мутации ^130Е, Я122О, Т156А и НЕХ в АкрС можно картировать в соответствующих остатках в структуре Ό-аминотрансферазы. Ожидается, что сходные мутации в Ό-аминотрансферазе широкой специфичности повысят общее образование Я,Я-монатина, как описано в примере 14. Например, функциональная группа, обеспечиваемая триптофаном 130 в АкрС, заменена в Ό-аминотрансферазах ВасШик водородной связью между боковыми цепями серинов 179-181 и глутаматом 166 (схема нумерации УМ-Ι). Для уменьшения пространственных препятствий глутамат можно подвергать мутации в остаток аспартата. Некоторые Ό-аминотрансферазы обладают остатком треонина в положении 179, который может увеличивать пространственное препятствие и который следует избегать. Фермент В.крйеапсик обладает аланином вместо серина в положении 181, который также может уменьшать пространственное препятствие.
Дополнительную информацию из исследований аспартатаминотрансферазы также можно применять для Ό-аминотрансферазы. В то время как фермент АкрС обладает аргинином в области, которая взаимодействует с боковой цепью дикарбоксилатных субстратов, Ό-аминотрансфераза обладает петлей от 5ег240 до 5ег243. Боковые цепи 5ег240, Тйг242 и 5ег243 повернуты в одном направлении и образуют карман с гидроксильной группой 5ег180, который обеспечивает поверхность, на которой могут взаимодействовать как неполярные, так и полярные субстраты. 5ег180 вовлечен в связывание РЬР; однако в целях повышения активности Ό-аминотрансферазы в отношении Я-МР можно модифицировать остатки 5ег240, Тйг242 или 5ег243 для акцептирования более крупных субстратов или для предпочтения отрицательно заряженных субстратов. Например, Тйг242 можно подвергать мутации на 5ег в целях снижения длины боковой цепи. Один из остатков можно подвергать мутации на лизин или аргинин, такой как 5ег243. Остатки (нумерация УМ-1) Уа130-Уа136 расположены в бета-цепи напротив активного центра Όаминотрансферазы и также являются важными для активности. Полагают, что Туг31, Уа133, О1и32 и
- 157 019971
Ьук35 расположены в направлении активного центра. Туг31, С1и32 и Уа133 являются инвариантными во всех гомологах ВасШик. Ко е! а1. (РЕВ8 Еей 398 (1996) рр. 141-145) проводили мутагенез Уа133 на А1а и выявили немного повышенную каталитическую эффективность в отношении переаминирования альфакетоглутарата и значительно повышенную каталитическую эффективность в отношении более объемных субстратов (меньшее пространственное препятствие). В некоторых гомологах Ьук35 заменен на Агд, однако в случае опасений в отношении пространственного препятствия остаток Еук является предпочтительным. Остатки валина 34 и 36 также являются предпочтительными по сравнению с консервативными заменами, такими как изолейцин, также вследствие меньшего пространственного препятствия для больших молекул, таких как МР.
Пример 17. Клонирование, экспрессия и тестирование глутамат- и аспартатрацемаз.
В этом примере описаны способы, используемые для клонирования и тестирования ферментов рацемаз аминокислот, которые можно использовать для взаимопревращения между Ь-глутаматом и Όглутаматом (или Е- и Ό-аспартатом или Е- и Ό-аланином). Глутамат-, аспартат- или аланинрацемазы пригодны в биосинтетическом каскаде образования К,К-монатина, когда одна стадия в этом каскаде приводит к Ь-аминокислоте (такой как Ь-глутамат, Ь-аспартат или Ь-аланин), а другая стадия каскада использует Ό-аминокислоту (такую как Ό-глутамат, Ό-аспартат или Ό-аланин). На фиг. 4 проиллюстрирован биосинтетический каскад получения К,К-монатина из Ь-триптофана с использованием Ь-триптофанспецифичной аминотрансферазы, К-специфичной альдолазы, Ό-аминотрансферазы и глутамат- (или аспартат- или аланин-) рацемазы.
Гены клонировали в векторы рЕТ28 и рЕТ30 для получения как белков без маркера, так и слитых белков с поддающимися Ы-концевому расщеплению маркером Н!86/маркером Т7. Полученные белки очищали с использованием аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом.
Обзор эксперимента
Гены, кодирующие глутаматрацемазы (ЕС 5.1.1.3) из Ьас1оЬасШик Ьгеу1к (регистрационный номер СепЬапк № Ό29627, последовательность нуклеиновой кислоты) и Рейюсоссик реп1окасеик (ген шиг1) (регистрационный номер СепЬапк № Ь22789) клонировали и экспрессировали в Е.соИ. Экстракты тестировали на активность в отношении превращения Ь-глутамата в Ό-глутамат и Ό-глутамата в Ь-глутамат. Фермент аспартатрацемазу ВюСа1а1уйск (ЕС 5.1.1.13) (ВюСа1а1уйск, Ракайепа, СА) также тестировали в отношении взаимопревращения между Ь- и Ό-аспартатом.
Выделение геномной ДНК для клонирования
Геномную ДНК Ь. Ьгеу1к (АТСС 8287Ό) получали из Американской коллекции типовых культур. Р. реп!окасеик (АТСС 25745) выращивали при 37°С в бульоне МК8 1ас1оЬасШ1, и 2 мл использовали для выделения геномной ДНК с использованием способа Мека1апок Л. ОирИсайоп и атрИйсайоп оГ 1охш депек ш У1Ьпо сйо1егае. Се11. 1983. 35:253-63.
Протокол полимеразной цепной реакции
Конструировали праймеры с 5'-участками рестрикции и выступающими концами для клонирования в векторы рЕТ28 и рЕТ30 (Лоуадеп, Майкоп, ^Ι). Праймеры для глутаматрацемазы Ь. Ьгеу1к:
Ν-концевой: 5 '-ССОСССССАТОСААААТСАТСССАТТОСТСТААТС-3 ' (5Е<2
Ю N0:401), и
С-концевой: 5'-СССССССТССАСССААТТАСААТТСТСТТТСТС-3 ' (ЗЕф
Ю N0:402).
Праймеры для глутаматрацемазы Р. реп!окасеик:
Ν-концевой: 5'-ССССССССАТССАТСТАТСТАТААТТТТАТТТАС-3' (ЗЕф
Ю N0:403), и
С-концевой: 5 ' -СССССССТСОАСАААТТТСАТТАТТСАТТСТААТТТ-З ' (ЗЕ<2 Ю N0:404) .
Ген из Ь. Ьгеу1к амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. В 50 мкл реакционной смеси использовали 0,150 мкг матрицы, 1,6 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого йКГР, 2,8 Е высокоточной полимеразы Ехрапй Н1дй Р1йе1йу™ Ро1утегаке (Косйе, ^ШапароНк, Ш), 0,5 Е полимеразы РГи (81га1адепе, Еа 1о11а, СА) и 1Х буфер Ехрапй™ с Мд. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 96°С в течение 3 мин, 8 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин, с последующими 22 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин. После 22 повторов образцы держали при 72°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту длиной ~830 п.н., исходя из сравнения с маркерами размера ДНК.
Ген из Р. реп!окасеик амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. В 50 мкл реакционной смеси добавляли 0,15 мкг матрицы, 1,6 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого йКГР, 2,8 Е высокоточной полимеразы Ехрапй Н1дй Р1йе1йу™ Ро1утегаке, 0,5 Е полимеразы РГи и 1Х буфер Ехрапй™ с Мд. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 96°С в течение
- 158 019971 мин, с последующими 8 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 37°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин, с последующими 8 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 45°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин, с последующими 14 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 45 с и 72°С в течение 2 мин. После 14 повторов образцы держали при 72°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту ~840 п.н., исходя из сравнения с маркерами размера ДНК.
Клонирование
Продукты ПЦР очищали из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (фа^еи, Уа1епс1а, СА). Продукты ПЦР количественно определяли с использованием спектрофотометра 8тай8рес 3000™. Продукты расщепляли посредством рестрикционных ферментов NсοI и 8аП в соответствии с рекомендованными изготовителем протоколами (№№ Εηд1аиб Вю1аЬк, Ветег1у, МА) и очищали из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (О|адеп, Уа1епаа, СА). Векторы рЕТ28 и рЕТ30 получали расщеплением ферментами рестрикции NсοI и 8ай с последующей обработкой щелочной фосфатазой креветки и очисткой из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (О|адеп, Уа1епаа, СА).
Расщепленные векторы и вставки лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Кар1б™ ^NА Ыдайоп Кй (Косйе, Iηб^аηарο1^к. Щ). Приблизительно 50 нг обработанной вставки, 100 нг обработанного вектора (с молярным соотношением вставки и вектора 3:1), 5 Е ДНК-лигазы Т4 и 1Х буфер для лигирования инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Реакционные смеси для лигирования очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР с высокой чистотой Н1дй Риге РСК Ргобис! Рипйсайоп Кй (Косйе, Н-Югц-тройк, Ш) и использовали для трансформации электрокомпетентных клеток Е.сой ЭН10В (Чптйгодеп, Саг1кЬаб, СА). К 40 мкл клеток ЭН10В добавляли десять мкл каждой реакционной смеси для лигирования и трансформировали электропорацией с использованием Вю-Каб Сепе Ри1кег ΙΙ (Вю-Каб, Негси1ек, СА) в следующих условиях: 2,5 кВ, 25 мкФ, 200 Ом в 0,2-см кювете. Клеткам давали возможность восстановиться в 1 мл 80С, находящейся при комнатной температуре, в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Клетки высевали на планшеты с ЬВ, содержащие канамицин (50 мкг/мл).
Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах посредством центрифугирования 01адеп (фа^еи, Уа1епс1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки посредством рестрикционного расщепления с помощью NсοI и 8ай. Последовательности плазмид, для которых оказывалось, что они обладают правильной вставкой, проверяли посредством секвенирования с помощью дидезокси-терминации цепи ДНК.
Экспрессия гена и анализы
Плазмидную ДНК, проверенную анализом последовательности, субклонировали в экспрессирующего хозяина Β^21(^Ε3) Е.сой ^отадеп, Маб1коп, УЦ Культуры выращивали. Плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах 01адеп (фа^еи, Уа1епс1а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава.
Индукцию в Β^21(^Ε3) первоначально проводили посредством глутаматрацемаз Ь. Ьгетак и Р. реп!окасеик как в векторе рЕТ28 (без маркера), так и в векторе рЕТ 30 (маркированном гистидином). Проводили исследование с течением времени для культур, выращиваемых в 250 мл ЬВ, содержащей канамицин (50 мг/л) до 0Ό600 0,5-0,6, индуцированных посредством 100 мМ ШТС (изопропилтиогалактозид) и подвергаемых забору образцов в моменты 0 и 3 ч после индукции. Клетки из 600 мкл (0 ч) и 275 мкл (3 ч) суспендировали в 40 мкл буфера с додецилсульфатом натрия, содержащем 2-меркаптоэтанол, нагревали до 95°С в течение 10 мин и охлаждали. Аликвоты эти образцов тотального клеточного белка анализировали посредством 8Ό8-ΓΑΟΕ с использованием геля с градиентом 4-15%.
Клеточные экстракты также получали из 3-часовых культур суспендированием клеточного осадка из 5 мл культуры в 0,625 мл реагента №тадеп ВидВик!ег™ ^отадеп, Маб1кои, УЦ содержащего 0, 625 мкл нуклеазы бензоназы и 3 мкл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1Ь^οсйет-NονаЬ^οсйет Согр., 8аи П1едо, СА) при комнатной температуре в течение 20 мин при осторожном встряхивании и центрифугированием при 16000хд для удаления клеточного дебриса. Супернатанты (клеточные экстракты) наносили на гели с 4-15% градиентом для анализа клеточных растворимых белков.
3-часовые образцы из клонированной глутаматрацемазы Ь. Ьгет1к и глутаматрацемазы Р. реп!окасеик показали как общий, так и растворимый белок, которые соответствуют правильному размеру (приблизительно 31 кДа). Продукт гена рЕТ30 (маркированный гистидином) Ь. Ьгет1к сверхэкспрессировался на более высоком уровне, и также был более растворимым (>20% растворимого белка), чем продукт гена рЕТ 28 (без маркера) Ь. Ьгет1к, а также продукты гена Р. реп!окасеик в обоих векторах. Продукт гена Р. реп!окасеик показал равную сверхэкспрессию и растворимость в векторах рЕТ28 и рЕТ30, которые были значительно меньшими, чем сверхэкспрессия и растворимость продукта гена рЕТ30 Ь. Ьгет1к.
Клетки из индуцированных культур (250 мл) центрифугировали и промывали один раз посредством 0,85% №’1. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл/г сырой массы клеток реагента ВидВик!ег™ (Xονадеη, Мабгкои, УЦ содержащего 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1Ъюсйеш
- 159 019971
НоуаЫосйет Согр., 8ап О|едо, СА) и 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на орбитальном устройстве для встряхивания. Нерастворимый клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16,000хд в течение 20 мин при 4°С.
Клеточные экстракты анализировали в отношении активности глутаматрацемазы с использованием следующего протокола. Реакции объемом 400 мкл проводили в 10 мМ фосфате калия (рН 8,0), 0,2 мМ ЭТТ и 10 мМ Ь-глутамате или Ό-глутамате. Реакции начинали добавлением 20-100 мкл бесклеточных экстрактов и инкубировали при комнатной температуре. Аликвоты образцов отбирали через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин и 1 ч (образцы в момент ноль минут служили в качестве контрольных реакций). К каждой 40-мкл аликвоте образцов добавляли 2 М муравьиную кислоту (25 мкл) для остановки реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до анализа посредством ЙС/М8/М8.
Результаты анализа клеточных экстрактов после индукции рЕТ30 посредством 100 мМ ГРТО (3 ч) показывают, что ферменты Ь. Ьгеу1з (регистрационный номер ОепЬапк № ВАА06106.1 6Ι: 468450) и Р. реп!озасеиз (регистрационный номер ОепЬапк № ААА167 61.1 ОЕ34 902 9) обладают значительными уровнями активности рацемазы в отношении обоих изомеров глутамата. Рацемаза Р. реп!озасеиз (20 мкл клеточных экстрактов) обеспечивала равновесие между Ь- и Ό-глутаматом через 10-20 мин, начиная с любого субстрата. Фермент Ь. Ьгеу1з (20 мкл клеточных экстрактов) также обеспечивал равновесие приблизительно через 20 мин.
Частично очищенный фермент аспартатрацемаза (каталожный # А8РК-101), приобретенный от Вю Са!а1уйсз, Шс. (Разадепа, СА), анализировали на активность в отношении транспорта Ь-аспартата и Όаспартата с использованием протокола, сходного с протоколом, указанным выше. Коммерческий фермент показал активность рацемазы в отношении обоих изомеров. При использовании 0,5-1 мг фермента равновесие достигалось через 20-60 мин.
Все три рацемазы (глутаматрацемаза Ь. Ьгеу1з, глутаматрацемаза Р. реп!озасеиз и аспартатрацемаза ВюСа!а1у!1сз) также анализировали на активность в отношении 8,8-монатина с использованием следующего протокола. Реакции объемом 400-мкл проводили с 10 мМ фосфатом калия (рН 8,0), 0,2 мМ ЭТТ и 10 мМ 8,8-монатином. Реакции инициировали добавлением бесклеточных экстрактов (Ь. Ьгеу1з и Р. реп!озасеиз) или очищенного фермента (аспартатрацемаза ВюСа!а1уйсз) и инкубировали при комнатной температуре.
Аликвоты образцов отбирали через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин и 1 ч (образцы в момент ноль минут, а также образцы без фермента служили в качестве контрольных реакций). В каждую 40-мкл аликвоту образца добавляли 2 М муравьиную кислоту (25 мкл) для остановки реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до их анализа посредством ЬС/М8/М8 (пример 1). Не было отмечено снижения концентрации 8,8-монатина с течением времени, а также какого-либо повышения 8,К-монатина (представленного в качестве загрязняющего побочного продукта в количестве <5%, даже в контроле без фермента). Таким образом, ни одна из анализируемых рацемаз не показала активность в отношении монатина.
Пример 18. Получение К,К-монатина из Ь-триптофана с использованием глутамат- или аспартатрацемаз.
В этом примере описаны способы получения стереоизомерно-обогащенного К,К-монатина из Ьтриптофана с использованием Ь-триптофанЩтирозин, или ароматической)аминотрансферазы, альдолазы РгоА, глутамат- или аспартатрацемазы и аминотрансферазы Ό-аминокислот с широкой специфичностью. На фиг. 5 представлена схема, на которой проиллюстрирован этот каскад. Этот подход для образования стереоизомерно-обогащенного К,К-монатина требует фермента на стадии 1, который обладает низкой активностью в отношении образования монатина из предшественника монатина (МР). Исходя из более ранних результатов, авторы настоящего изобретения использовали продукты гена !а!А 8|погй|/оЬшт теШой и КйодоЬас!ег зрйаего1дез, описанные в примере 1 \У0 03/091396 А2.
Материалы и способы
Глутаматрацемазы из Ь. Ьгеу1з и Р. реп!озасеиз продуцировали в Е.сой, как описано в примере 17. В некоторых случаях маркированный посредством Н1з6 вариант этих ферментов очищали с использованием кассет Н1з-ВШд 900 в соответствии с протоколами изготовителя Щоуадеп, Мад1зоп, νΙ) и подвергали обессоливанию для удаления имидазола с использованием колонок РБ-10 (О25 8ерйадех, ОЕ Неа1!йсаге, Р1зса!ауау, N1). Ферменты элюировали в 25 мМ фосфате калия, рН 8,0. Аспартатрацемазу (А8РК-101) и Ό-аминотрансферазу (АТ-103) приобретали от ВюСа!а1уйсз, Шс. (Разадепа, СА). Тирозин(ароматические)аминотрансферазы 8. теШой и К. зрйаего1дез получали, как описано в примере 1 ν0 03/091396 А2 . Альдолазу РгоА Сотатопаз !ез!оз!егоп1 получали, как описано в примере 4 ν0 03/091396 А2. Анализ тотального белка проводили с использованием анализа белков Вю-Кад Рго!ет Аззау в соответствии с протоколами изготовителя (Негси1ез, СА).
Снижение количества 8,8-монатина, полученного с использованием рацемаз
Реакционные смеси (объемом 1 мл, с дублированием) содержали 100 мМ фосфатно-калиевый буфер (рН 8), 2 мМ МдС12, 0,05 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР), 200 мМ пируват натрия, 5 мМ α-кетоглутарат натрия или оксалоацетат, приблизительно 280 мкг/мл Та!А 8. теШой, предоставленного в клеточном
- 160 019971 экстракте, 1 мг/мл Ώ-аминотрансферазы ВюСа!а1уйск (АТ-103) (ВюСа!а1уйск, Ракабеиа, СА), 100 мкл/мл клеточного экстракта глутаматрацемазы или 1 мг/мл аспартатрацемазы и приблизительно 100 мкг/мл альдолазы Рго, предоставленной в качестве клеточного экстракта. Твердый триптофан добавляли в концентрации 10,2 мг/мл. Отрицательные контроли ее содержали рацемазу. Образцы инкубировали при 30°С (при встряхивании 250 об/мин) в течение 1, 2 ч или в течение ночи. Образцы центрифугировали для удаления осадка, фильтровали с помощью шприца и хранили при -80°С до анализа монатина с использованием способа ЙС/М8/М8, описанного в примере 1. Большинство образцов содержало >95% 8,8монатина, вследствие количеств нативной Ь-аминотрансферазы, находящейся в клеточных экстрактах. Однако образцы, которые содержали рацемазу, обладали сниженным количеством тотального монатина в результате того, что ферменты рацемазы приводят к меньшей доступности Ь-глутамата для переаминирования МР. Без рацемазы получали 1545-2355 м.д. монатина (главным образом, 8,8) с течением времени. При наличии рацемаз получали только 340-879 м.д. (фермент Е. Ьгеу1к), 444-531 м.д. (фермент Р. реи!окасеик) и 506-1460 м.д. (аспартатрацемаза) монатина. Эти данные указывают на то, что рацемазы активны в условиях реакции, необходимых для образования монатина. Для сведения к минимуму образование 8,8-монатина из ферментов клеточного экстракта, таких как аспартатаминотрансферазы, проводили дальнейшие эксперименты с очищенными ферментами и более высоким соотношением ферментов Оаминотрансферазы и Ь-аминотрансферазы.
Превращение Е-триптофана в содержащие 4-В изомеры монатина
Указанные выше эксперименты повторяли с использованием приблизительно 54 мкг очищенной Еаминотрансферазы (Та!А либо 8. теШой, либо К. крйаего1бек), 1 мг аспартатаминотрансферазы (ВюСа!а1у!1ск, Ракабеиа, СА), 1 мг Ώ-аминотрансферазы, оксалоацетата в качестве акцептора амино и 75 мкг очищенной альдолазы. Реакции проводили с дублированием с периодом забора образцов 2 ч и инкубацией в течение ночи. Отрицательные контрольные реакции проводили с Ь-аминотрансферазой 8. МеШой, но без рацемазы. В дополнение к количественному определению пиков для В,В/8,8- и 8,В/В,8-монатнна на основе обращенно-фазовой хроматографии, определяли процентную долю каждого стереоизомера с использованием способа образования производных посредством ЕОАЛ, описанного в примере 1. Результаты являются следующими.
Таблица 22
Ь-аминотрансфераза Время инкубации Тотальный монатин (м.д.) % 8,8 % К,К % К, 8 % 8,В
5. теШоН Та! А 2ч 17,1 10,2 58,1 0,8 31,0
8. теШоН Та!А 2ч 15,8 13,3 55,3 1,0 30,4
5. теШоН Та!А 5. теШоН Та!А К. зрИаегоШез Та!А К. зркаего '^ез Та!А К. зркаегоШез Та!А Л зркаегоШез ТгЛА в течение ночи в течение ночи 2 ч 2ч в течение ночи в течение ночи 77,7 67,9 241.2 223.2 600.4 618.5 25,8 29,4 96,3 95,7 96,6 96,1 40,0 37.3 2.3 2.7 1.8 2,1 1,3 1,5 0,8 1,0 0,5 0,5 32,9 31,8 0,6 0,6 1,1 1,3
контроль без рацемазы 2ч 7,1 92,0 1,4 6,6 0,0
контроль без рацемазы 2 ч 5,7 94,0 1,2 4,8 0,0
контроль без рацемазы в течение ночи 44,6 93,5 1,3 4,7 0,5
контроль без рацемазы в течение ночи 37,5 95,4 0,9 3,7 0,0
Очевидно, наличие рацемазы повышало количество тотального монатина, образованного при применении Та!А 8. шеШой в качестве фермента для переаминирования Ь-триптофана. Уровни монатина возрастали в среднем от 6,4 до 16,5 м.д. в двухчасовом анализе и от 41-73 м.д. в анализе после ночи. Кроме того, при использовании фермента рацемазы процентное количество образованного В,В возрастало приблизительно от 1% вплоть до 58%. 8,В-стереоизомер монатина, другой сильный подсластитель, представлял собой другой основной компонент, возрастая приблизительно от 0 в отрицательных контролях до 31%. Очевидно, Та!А В. крйаего1бек обладал большей активностью в отношении 8-МР, чем Етрансаминаза 8. теШой, что показывает значение наличия фермента, который обладает высокой субстратной специфичностью в отношении Ь-триптофана по сравнению с МР, когда требуемыми продуктами являются 4-В изомеры монатина. С учетом того, что приблизительно 10% всего монатина представляет собой 48 в момент времени два часа, Та!А 8. теШой можно рассматривать, как обладающую ограниченной активностью в отношении МР.
Эксперименты повторяли с очищенной Та!А 8. теШой (54 мкг) и глутаматрацемазой Е. Ьгеутк. При
- 161 019971 применении очищенной глутаматрацемазы использовали приблизительно 64 мкг на реакцию объемом 1 мл. Также тестировали клеточные экстракты, содержащие глутаматрацемазу, и использовали 1,4 мг растворимого белка. Снова использовали отрицательный контроль без рацемазы, и все образцы анализировали с дублированием. Результаты являются следующими:
Таблица 23
Г лутаматрацемаза Время инкубации Тотальный монатин (м.д.) % 8,8 % Κ,Η. %К,8 % 8,К.
К Ьгехчх (очищенная) 2ч 3,3 49,1 34,2 3,7 13,0
Ь. ЬгечЕ (очищенная) 2 ч 3,6 47,9 35,2 3,5 13,4
£. ЬгеУ18 (очищенная) в течение ночи 29,3 58,9 24,7 3,2 13,2
Ь. ЬгехЕ (очищенная) в течение ночи 40,2 55,1 25,0 4,7 15,3
Ь. Ьгехча (клеточный экстракт) 2ч 10,5 45,8 35,9 1,1 17,2
1. ЬгеуШ (клеточный экстракт) 2ч 10,5 47,4 33,9 1,1 17,6
Ь. Ъге\18 (клеточный экстракт) в течение ночи 79,4 70,3 17,9 1,3 10,5
£. ЪгехШ (клеточный экстракт) в течение ночи 80,1 69,1 19,1 1,1 10,7
Отсутствует 2ч 2,7 84,1 7,1 6,3 2,4
Отсутствует 2ч 3,2 84,9 6,0 6,8 2,2
Отсутствует в течение ночи 36,5 92,3 2,3 4,2 1,2
Отсутствует в течение ночи 30,5 92,7 2,0 4,1 1,3
Снова, очевидно, что добавление рацемазы повышает количество тотального монатина, образованного из Ь-триптофана, также повышая относительные количества содержащих 4В-изомеров монатина по сравнению с 8,8-монатином. Применение очищенной альдолазы, рацемазы и Ь-аминотрансферазы значительно повышает возможность контроля образования требуемого стереоизомера. Соотношение Ь- и Όаминотрансферазы также представляет собой способ манипулирования стехиометрией конечного продукта.
При сравнении результатов, представленных в таблицах 18 и 19 примера 13, с результатами для условий реакции, сходных с условиями, представленными выше, можно видеть, что из индол-3-пирувата образовывалось приблизительно 7-29 м.д. монатина, и процентные количества образованного В,Вмонатина составляли приблизительно 51-90%. Применение аспартатрацемазы повышало общее количество образованного монатина до 16-78 м.д. монатина с % В,В приблизительно 40-58%. Кроме того, использовали более стабильный и менее дорогостоящий исходный материал, Ь-триптофан. В примере 14 приблизительно 73 м.д. монатина получали из Ό-триптофана с соотношением В,В:8,В приблизительно 1,7:1. Общее количество 4В-изомеров составляло >80% от общего количества монатина. Вследствие того, что В,В-монатин и 8,В-монатин являются сильными подсластителями (>1000 раз слаще сахарозы), возможность обогащения этими изомерами без необходимости в дорогостоящих субстратах в виде Όаминокислот, является важной.
Как описано в примерах 13 и 14, Ό-аланин может служить в качестве донора амино для переаминирования МР в монатин. Множество Ь-аминотрансфераз обладают способностью использовать пируват в качестве акцептора амино до некоторой степени, и образовывать Ь-аланин. Вследствие того, что в упомянутых выше реакциях используются высокие концентрации пирувата, вероятно, что некоторое количество пирувата превращается в Ь-аланин. Например, в процессе переаминирования Ь-триптофана было выявлено, что фермент НехАкрС, описанный в примере 16, превращает 10-18% пирувата (исходные концентрации 50-200 мМ) в Ь-аланин в течение 2 ч, если отсутствует альфа-кетоглутарат. Фермент показал 10-кратное предпочтение в отношении альфа-кетоглутарата при наличии двух акцепторов амино в высоких (>50 мМ) концентрациях. АкрС (описанная в \\Ό 03/091396 А2) также образовывала некоторое количество Ь-аланина из пирувата. Таким образом, ожидается, что можно не включать в указанные выше
- 162 019971 реакции альфа-кетоглутарат или оксалоацетат, и использовать аланинрацемазу (ЕС 5.1.1.1) вместо глутамата или аспартатрацемазы. Ферменты аланинрацемазы сначала были идентифицированы в Вгисе11а аЬойик и 8!гер!ососсик Гаесайк (Магг, А. О. апб 411коп, Р.4. Агск. Вюскет. Вюркук., 49 (1954) 424-433 и 4ооб, 4.А. апб Оипка1ик, Ь.С. 1. Вю1. Скет., 190 (1951) 403-416). Ген бабВ в 8а1топе11а !ур1птипит был идентифицирован в качестве источника активности аланинрацемазы, и в геномных базах данных было обнаружено несколько сотен его гомологов. Другие известные источники активности аланинрацемазы представляют собой Εкске^^ск^а сой, ВасШик киЬййк, Ркеиботопак аегидтока, У1Ьпо ско1егае, 8с1ихокассагоусек ротЬе и ВасШик сегеик. Базидиальные грибы, Ьепйпик ебобек, также содержат аланинрацемазу с широкой активностью. Термостабильный гомолог из ВасШик йеатоШетторкПик является доступным для приобретения от 8^дта-Λ1б^^ск (каталожный # А8936) (8^дта-Λ1б^^ск, 8ΐ. Ьошк, МО) и был иммобилизован для коммерческих способов применения ^падай, К., Вюскеткйу, 25: 3268 1986). Аланинрацемазу превращают в глутамат- или аспартатрацемазу случайными способами, такими как мутагенная ПЦР, пассирование через мутагенные штаммы или другие способы, известные специалистам в данной области. Более направленное изменение аланинрацемазы сосредоточено на остатках активного центра, включая Ьук129, Ме!134, и остатки, включающие О1у283 и Тгр288 и находящиеся между ними остатки (нумерация в соответствии с ВасШик к!еаго!кег!порЫ1ик).
Пример 19. Ό-фенилглицинаминотрансфераза (Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансфераза).
Как показано на фиг. 3, Ό-фенилглицинаминотрансфераза является пригодной в биосинтетическом каскаде образования монатина. Например, Ό-фенилглицинаминотрансфераза образует К,К-монатин из КМР с Ь-глутаматом в качестве донора амино.
Синтез посредством ПЦР 4 Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы Р. к!и!хеп с помощью олигонуклеотидных праймеров
В этом примере описаны способы, которые использовали для синтеза 4 Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, стереоинвертирующего фермента, который можно использовать для превращения предшественника К-монатина в К,К-монатин с использованием Ь-глутамата в качестве донора амино.
Конструирование праймеров
Опубликованную последовательность (регистрационный номер ОепЬапк № АУ319935, последовательность нуклеиновой кислоты; регистрационный номер ОепЬапк № ААЦ8290, белковая последовательность) для 4 Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы Ркеиботопак к!и!хеп (4 Ό-НРО АТ) использовали в качестве матрицы для конструирования праймеров для ПЦР. Альтернативно в качестве матрицы последовательности используют 4-О-гидроксифенилглицинаминотрансферазу из Ркеиботопак рийба, (САО42450 (белок), АХ467211 (нуклеотид)). Конструировали всего 34 прямых праймера и 35 обратных праймеров; прямые и обратные праймеры представляли собой 40-меры, обладающие 20 перекрывающимися парами оснований. Кроме того, 2 наружных праймера конструировали с 5'-участками рестрикции и выступающими концами для клонирования в векторы рЕТ 28 и рЕТ30 (Nоνадеη, Мабкоп, 4Ι).
Наружные праймеры 4 Ό-НРО АТ Р. к!и!хеп: ^концевой (с участком ШеЦ 5'-ООССООСΛТΛТОТСОΛТССТТΛАСОΛСТΛСΛΛΛСОТ-3' (81 Τ) ΙΌ N0:405), и С-концевой (с участком ХкоЦ 5'ООΛΛООСТСОΛОТСΛТОΛТТООТТТССΛОΛСΛΛΛТТ-3' (8ΕΤ) ΙΌ N0:406).
Протокол полимеразной цепной реакции
Последовательность гена из Р. к!и!хеп амплифицировали с использованием следующих протоколов. Первичная реакция ПЦР объемом 100 мкл включала 0,05 мкМ каждого из внутренних 69 праймеров, 0,4 мМ каждого б№ТР, 10 Е полимеразы тТШ Ро1утегаке ХЬ (Коске, !пб1апаро11к, ЕЙ), 0,625 Ε полимеразы РГи (8йа!адепе, Ьа бо11а_ СА), 1Х буфер ХЬ и 1 мМ Мд(0Ас)2. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, 15 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 42°С в течение 30 с и 68°С в течение 15 с, за которыми следовали 10 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 68°С в течение 30 с, за которыми следовали 10 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин и 15 с. После конечных 10 циклов образец держали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к размытой полосе продукта размером ~0,5 т.п.н. в геле на основе 0,8% ТАЕ-агарозы.
Вторичную реакцию ПЦР проводили с использованием продукта реакции первичной ПЦР в качестве матрицы. Вторичная реакция ПЦР объемом 100 мкл включала 2,5 мкл продукта первичной реакции ПЦР, 0,5 мкМ каждого из 2 наружных праймеров (с участками рестрикции NбеI и ХНок 0,4 мМ каждого бЭТР, 10 Е полимеразы тТШ роктетаке ХЬ, 0,625 Ε полимеразы РГи, кХ буфер ХЬ и 1 мМ Мд(0Ас)2. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, 10 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин 30 с, с последующими 15 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин 30 с. После 15 повторов образец держали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к отчетливой полосе продукта размером ~1,4 т.п.н. в геле на основе 0,8% ТАЕагарозы.
Продукт ПЦР выделяли из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстрак
- 163 019971 ции из геля ф1адеи (ф1адеи, Уа1еиаа, СА). Продукт клонировали с помощью ТОРО и трансформировали в клетки ТОР 10 в соответствии с протоколом изготовителя Циуйгодеи, Саг1кЬай, СА). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием ф1адеи (ф1адеи, Уа1еис1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством NйеI и ХНок Последовательности плазмиды, для которых было выявлено наличие правильной вставки, проверяли посредством секвенирования ДНК с дидезокси-терминированием цепи с универсальными прямым М13 и обратным М13 праймерами. Среди 10 отсеквенироавнных клонов, все обладали по меньшей мере одной мутацией по сравнению с исходной последовательностью. Наилучший клон обладал мутацией в одной паре оснований, которая приводила к аминокислотной замене. Последовательность этого клона корректировали с использованием протокола мутагенеза фшскСЬаиде Мйадеиекщ в соответствии с рекомендациями изготовителя (81га1адеие, Ьа 1о11а, СА).
Скорректированный клон ТОРО расщепляли рестрикционными ферментами NйеI и Χ1μΙ в соответствии с рекомендованными изготовителем протоколами (№ν Еид1аий Вю1аЬк, Веуег1у, МА) и очищали из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля ф1адеи (ф1адеи, Уа1еис1а, СА).
Векторы рЕТ 28 и рЕТ 30 получали расщеплением рестрикционными ферментами NйеI и ХМ с последующей обработкой щелочной фосфатазой креветки и очисткой из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля ф1адеи (ф1адеи, Уа1еис1а, СА).
Расщепленные векторы и вставку лигировали с использованием набора для лигирования ХЕВ фшск Ыдайои К11 (Веуег1у, МА). Приблизительно 50 нг обработанной вставки, 100 нг обработанного вектора (с молярным соотношением вставки и вектора 3:1), 5 Е ДНК-лигазы Т4 и 1Х буфер для лигирования инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь для лигирования трансформировали в химически компетентные клетки Т0Р10Е' (Iην^1^οдеη. Саг1кЬай, СА). Клеткам давали возможность восстановиться в 0,25 мл 80С, находящейся при комнатной температуре, в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 225 об./мин. Клетки высевали на планшеты с ЬВ, содержащие канамицин (50 мкг/мл). Плазмидную ДНК очищают из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием ф1адеи (ф1адеи, Уа1еис1а, СА) и подвергают скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством NйеI и ХМ.
Экспрессия гена и анализы
Плазмидную ДНК трансформировали в экспрессирующего хозяина ВЬ21(ОЕ3) Е.сой Щоуадеи, Май1кои, νΙ). Культуры выращивали, и плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах ф1адеи (ф1адеи, Уа1еиаа, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава.
Индукцию в ВЬ21(ОЕ3) первоначально проводили посредством 4 Ό-НРС Р. к1и1хеп как в векторе рЕТ 28 (маркированном гистидином), так и в векторе рЕТ 30 (без маркера). Исследование с течением времени проводили с помощью культур, выращиваемых в 250 мл ЬВ, содержащей канамицин (50 мг/л) до 0Ό600 0,5-0,6, индуцированных посредством 100 мМ ГРТС (изопропилтиогалактозид) и подвергнутых забору образцов в момент времени 0 и через 3 ч после индукции. Соответствующий объем клеток в момент времени 0 ч и через 3 ч ресуспендируют в 40 мкл буфера с додецилсульфатом натрия, содержащем 2-меркаптоэтанол, и нагревают при 95°С в течение 10 мин, и охлаждают. Аликвоты этих образцов тотального клеточного белка анализируют посредством 8П8-РАСЕ с использованием геля с градиентом 415%.
Клеточные экстракты также получают после культивирования в течение 3 ч суспендированием клеточного осадка из 5 мл культуры в 0,625 мл реагента Штадеи ВидВийег™ Щоуадеи, Май1кои, νΙ), содержащего 0,625 мкл нуклеазы бензоназы и 3 мкл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1Ьюсйет^уаИоЛет Согр., 8аи О1едо, СА), при комнатной температуре в течение 20 мин при осторожном встряхивании, и центрифугированием при 16000хд для удаления клеточного дебриса. Супернатанты (клеточные экстракты) наносят в гели с градиентом 4-15% для анализа клеточных растворимых белков. При необходимости белок очищают с использованием кассет Н1к-Втй 900 в соответствии с протоколами изготовителя Щоуадеи, Май1кои, νΙ) и разбавляют для удаления имидазола с использованием колонок РО-10 (С25 8ерНайех, СЕ НеаННсаге, Р|кса1а\уау, N1).
Организмы с Ό-фенилглицинаминотрансферазой (ОРСАТ)
Организмы рода Ркеийотоиак и сходных родов, со стереоинвертирующей Ό-фенилглицинаминотрансферазой (также называемой Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазой), выделяют следующим образом. Образцы почвы инкубируют в чашках Петри со следующей средой: (на литр) 15 г агара, 3,4 г КН2РО4, 3,55 г №2НР04, 0,2 г Мд804х7Н20, 8 мг СаС12-2Н20, 10 мг дрожжевого экстракта, 1 мл 1000х раствора микроэлементов, 1 г Ό-фенилглицина (Ό-4-гидроксифенилглицина).
Изоляты тестируют посредством ПЦР в отношении наличия стереоинвертирующей аминотрансферазы (праймеры сконструированы, исходя из известных Ό-фенилглицинаминотрансфераз) или далее обогащают в отношении стереоинвертирующей аминотрансферазы следующим образом: изоляты из план
- 164 019971 шетов можно выращивать в жидкой среде, как указано выше, без агара при 30°С при встряхивании до ОЭ600 приблизительно 1,0. Клетки собирают центрифугированием и промывают два раза посредством 0,85% №С1. 10 мг (сырая масса) образца суспендируют в 1 мл фосфатно-калиевого буфера (рН 7,0) и 5 мМ Ό-фенилглицина (или Ό-4-гидроксифенилглицина). Нейтрализованную 15 мМ (аминоокси)уксусную кислоту добавляют в дублированные образцы, как описано выше. Потребление Ό-фенилглицина (или Ό4-гидроксиглицина) определяют посредством ВЭЖХ. Изоляты, способные вызвать деградацию Όфенилглицина (или Ό-4-гидроксифенилглицина), но осуществляющие ее с низкой скоростью в присутствии (аминоокси)уксусной кислоты, отбирают для дальнейшего анализа. Изоляты тестируют посредством ПЦР в отношении наличия стереоинвертирующей аминотрансферазы (праймеры сконструированы на основе известных Ό-фенилглицинаминотрансфераз).
Наличие стереоинвертирующей аминотрансферазы подтверждают посредством выращивания культуры в жидкой среде, как описано выше, сбора клеток и получения бесклеточного неочищенного экстракта (СЕЕ) и тестирования в отношении ферментной активности Ό-фенилглицинаминотрансферазы (или Ό-4-гидроксифенилглицинаминотрансферазы). СЕЕ добавляют в реакционную смесь со следующими конечными концентрациями: 0,1 М САР8 (рН 9,5), 60 мМ Ь-глутамат (соль натрия), 5 мМ бензоилформиат (или 4-гидроксибензоат) и 50 мкМ РЬР. Измерение обратной реакции проводят добавлением СЕЕ в реакционную смесь со следующими концентрациями: 50 мМ фосфат калия (рН 7,0), 60 мМ Όфенилглицин (или Ό-4-гидроксифенилглицин), 5 мМ α-кетоглутарат, 50 мкМ РЬР. Анализируемые образцы инкубируют при 35°С, и аликвоты отбирают через определенные временные промежутки и останавливают кипячением в течение 2 мин. Продукт будут количественно определять способом ВЭЖХ С11Ау, Е., Т1кйЬее, А., Наге, Р. Е., Веко1ийоп оГ ипбегй'аб/еб атто ас1бк Ьу гегегкеб рйаке сйгота!одгарйу. 1. Аш. Сйет. 8ос, 102: 5115-5117 (1980), или способами, описанными в примере 1 (определение образования глутамата).
В качестве альтернативы способам на основе ПЦР, стереоинвертирующую Ό-фенилглицинаминотрансферазу очищают из выделенных бактерий общепринятыми способами очистки белков, включая фракционирование сульфатом аммония и общепринятую колоночную хроматографию. После очистки белка до приемлемой степени используют способы микросеквенирования пептидов или общепринятые секвенирования аминокислот по типу Эдмана (см. дο1д^.йа^νа^б.еби/т^с^οсйеш/ для описаний протоколов и оборудования, используемых для этого типа работы). Вырожденные праймеры конструируют на основе доступной последовательности из наиболее близкого родственника источника белка. Затем для выделения кодирующей последовательности стереоинвертирующей Ό-фенилглицинаминотрансферазы проводят вырожденную ПЦР и прогулку по геному в соответствии с общепринятыми протоколами.
Образование монатина посредством ОРСАТ
Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, как описано в (1) и (2), выше, используют в неочищенных бесклеточных экстрактах или очищают, как описано в (1), выше.
Тирозин(ароматические)аминотрансферазы 8. теШой и В. крйаего1бек получают, как описано в примере 1 \¥О 03/091396 А2. Альдолазу РгоА Сотатопак !ек!ок!егош получают, как описано в примере 4 \УО 03/091396 А2. Общий анализ белка проводят с использованием анализа белка Вю-Ваб Рго!ет Аккау в соответствии с протоколами изготовителя (Негси1ек, СА).
Реакционные смеси (объем 1 мл, анализируют с дублированием) содержат 100 мМ фосфатнокалиевый буфер (рН 8), 2 мМ МдС12, 0,05 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР), 200 мМ пируват натрия, 5 мМ α-кетоглутарат натрия, приблизительно 280 мкг/мл Та!А 8. теШой, предоставленной в клеточном экстракте, 100 мкл/мл клеточного экстракта с Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазой или 1 мг/мл очищенной Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, и приблизительно 100 мкг/мл альдолазы РгоА, предоставленной в качестве клеточного экстракта. Твердый триптофан добавляют в концентрации 10,2 мг/мл. Отрицательные контроли анализируют без Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы. Образцы инкубируют при 30°С при осторожном встряхивании в течение ~1 ч или в течение ночи. Образцы центрифугируют для удаления осадка, фильтруют через шприц и хранят при -80°С до анализа в отношении монатина с использованием способа ЙС/М8/М8, описанного в примере 1.
Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы с повышенной активностью в отношении образования монатина получают способами мутагенеза, известными специалистам в данной области, включая: мутагенную ПЦР, пассирование через мутагенные штаммы или сайт-направленный мутагенез. Улучшенные Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы отбирают посредством выращивания на минимальной среде с В,В-монатином в качестве источника азота. Исходно селекция основана на росте, однако при отборе улучшенных аминотрансфераз скрининг основан на скорости роста. Таким образом, клетки с мутантными вариантами гена выращивают, и ген экспрессируется в минимальной среде с В,В-монатином в качестве источника азота. Скорости роста клеток с мутантными вариантами гена сравнивают с немутантным вариантом. Клетки с более высокой скоростью роста отбирают, и аминотрансферазу анализируют далее. Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазу подвергают мутагенезу доступными способами, такими как ПЦР с пониженной точностью и пассирование через мутагенные штаммы, или способами, для которых было получена лицензия, такими как перетасовка ДНК и другие способы направленных изменений.
- 165 019971
Анализ ЭРСАТ
Клетки с рекомбинантной Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазой выращивали, белок экспрессировали, и клетки лизировали, как описано в примере 17 или посредством стандартных протоколов. Белок экспрессируют в нативном хозяине с использованием описанных способов (^уакгийа, V., МееуооНкот, V. А кЫеотуегЦпд О-рЬепу1д1усше ат1по1гапкГегаке Ггот Ркеибοтοηак кинхеп 8Т-201: рипПсабоп, сЬагасЮп/аиоп, апб иррИспНоп Гог О-рЬепу1д1усте купШеык. I. В|о1есЬпо1., 55: 193-203 (1997)).
В реакционную смесь добавляли бесклеточный экстракт со следующими конечными концентрациями: 100 мМ фосфат калия (рН 7,0-8,5), 60 мМ Ό-фенилглицин (или Ό-4-гидроксифенилглицин), 5 мМ α-кетоглутарат, 50 мкМ РЬР. Анализируемые образцы инкубировали при комнатной температуре, и аликвоты отбирали через определенные временные интервалы и останавливали добавлением равного объема муравьиной кислоты. Продукт (Ь-глутамат) количественно определяют способами, описанными в примере 1.
Пример 20. Выявление гена Р-метионинаминотрансферазы.
Обоснование
Полагают, что Ό-метионинпируватаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.41) представляет собой другой пример, хотя и редкий, стереоинвертирующей трансаминазы. Этот фермент катализирует обратимое превращение Ό-метионина и пирувата в Ь-аланин и 4-метилтио-2-оксобутаноат. Оксалоацетат, фенилпируват, 2-оксобутират, 2-оксовалерат, 2-оксогептаноат, глиоксалат и оксоглутарат также могут служить в качестве акцепторов амино.
Полагают, что переаминирование Ό- или Ь-метионина является частью каскада образования этилена в высших растениях (цветная капуста, томат, яблоко, стебель гороха, банан, арахис), а также в микроорганизмах почвы (ЕксЬепсЫа соЬ, Ркеибοтοηак ры, Ркеибοтοηак аегидтока, ВасШик тусо1бек, Асте1оЬас!ег сакоассЬсик, Аеготопак ЬубгорЬЬа В12Е, ЯЬ|/оЫпт Ιπίο1ίί №Р7, РешсШшт б1дЬа1ит, 8ассЬаготусек се^еν^к^ае. СогупеЬас1епит Ό7Ρ). Ό. С В1Шпд1оп, В. Т. Со1бшд, апб 8. В. Рптгоке ВюсЬет I. (1979) 182, 827-836. В бактериях Ь-метионин, как правило, используют в качестве субстрата в исследованиях образования этилена, и полагают, что ферменты с широкой специфичностью, такие как ТугВ или АкрС из Е.СоЬ, являются ответственными за переаминирование. Однако 8. В. Рптгоке I. Сеп. МюгоВюЬ (1976), 95(1), 159-65 и 8. В. Рптгоке I. Сеп. МюгоВюЬ (1977), 98, 519-528 показали, что штамм 8РА О Е. сой (ЬшуегкПу оГ \Уаг\уюк сиЬиге со11есйоп) из Ό-метионина образует практически столько же этилена, как и из Ь-метионина в порционных культурах. Поскольку в Е.соЬ не было идентифицировано Όаминотрансферазы с широкой специфичностью, одним возможным объяснением этого может быть то, что дегидрогеназа Ό-аминокислот Е.соЬ (кодируемая геном бабА) превращает Ό-метионин в 4-метилтио2-оксобутаноат. Также возможно, что в Е.соЬ существует метионинрацемаза; однако в литературе такой фермент не описан.
В противоположность Е. соЬ в цветках цветной капусты (препараты митохондриальных экстрактов) и проросших семенах арахиса образование этилена было выше, когда к экстракту фермента добавляли Όметионин и пируват по сравнению с Ь-метионином и пируватом (ЬАУ. Маркоп, ЬР. МагсЬ, апб О.А. \Уагба1е ВюсЬет I. (1969) 115, 653-661; Ы. ОпгЬат, Р^. Могдап, ЬМ. РгексоЬ апб С.М. Ьутап РЬуЮсЬеппкЬгу (1973) 12, 2123-2126). Таким образом, вероятность сочетания метионинрацемазы и Ьаминотрансферазы не подтверждается данными. Активность дегидрогеназы исключили посредством диализа клеточных экстрактов цветной капусты, в анализируемых смесях не было ХАО. Активность оксидазы исключили, поскольку не было выявлено потребления кислорода и не было потребности в РАО. Ό-метионинаминотрансферазу из тканей арахиса очистили, показали, что она зависит от РЬР, и показали, что она не зависит от активности Ь-метионинаминотрансферазы. Существует вероятность того, что эти Ό-метионинпируватаминотрансферазы в действительности образуют Ό-аланин в качестве побочного продукта (аналогично ферментам ВасШик, описанным в примерах 13 и 14), и что клетки содержат аланинрацемазу для обратного превращения Ό-аланина в Ь-аланин (или аналогичный донор амино). В любом случае выявление Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью в высших растениях является преимущественным в отношении усовершенствования процессов, которые приводят к образованию Я,Ямонатина или 8, Я-монатина.
Обзор эксперимента
Ό-метионинаминотрансферазу частично очищают из цветков цветной капусты и зародышей проросшего арахиса с использованием стандартных протоколов хроматографии и системы РЬагтата АКТА Ехр1огег. Белковые последовательности гомологичных белков определяют способами отпечатков пальцев посредством ЬС/М8/М8 и поиска в базах данных, проводимых посредством оборудования Нагуагб М1сгосЬет1кЬгу. Кодирующие участки генов растений клонируют из библиотеки кДНК с использованием стандартных протоколов ПЦР или посредством синтеза гена, как описано в примере 19.
Альтернативно конструируют экспрессирующие библиотеки кДНК (8йа1адепе, Ьа 1о11а, СА) из ткани цветной капусты или из семян арахиса, выращиваемых в присутствии Ό-метионина (и продуцирующих этилен). Библиотеки трансформируют в ауксотрофов по метионину Е.соЬ из Е.соЬ Сепсис 8!оск Сейег (Υ;·1Κ), таких как штаммы ЯС519 или АВ 1931. Плазмиды штаммов, способных расти на минимальных средах, содержащих Ό-метионин, содержат представляющий интерес кодирующий участок (см.
- 166 019971 пример 15, аналогичный способ скрининга).
После получения и экспрессии представляющих интерес кодирующих участков в стандартном лабораторном штамме Е.сой полученные продукты генов можно использовать в способах анализа образования В,В-монатина, как описано в примере 19, вместо Ό-гидроксифенилглицинаминотрансферазы, за исключением того, что рН составляет 7,5 (оптимальное значение рН для аминотрансферазы). Если для Όметионинаминотрансферазы строго требуются субстраты-доноры Ό-аминокислот, фермент можно использовать для получения В,В-монатина, как описано в примерах 13 и 14. Ген можно подвергать мутагенезу и скринингу в отношении повышенной активности, как описано в примере 19.
Способы
Выделение из цветной капусты
Четыреста грамм свежесобранных цветков цветной капусты экстрагируют посредством 400 мл раствора сахарозы/буфера (0,4 М сахароза и 0,1 М натрий-фосфатный буфер рН 7,4) при 4°С посредством попеременного смачивания и смешивания с использованием устройства для смешивания. Клеточный дебрис удаляют посредством фильтрации через марлю, и полученный раствор центрифугируют при 40000/д в течение 30 мин при 4°С. Твердый материал (содержащий митохондральные органеллы) ресуспендируют в 20 мл 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, и ферменты экстрагируют посредством 200 мл холодного (-30°С) ацетона. Суспензию повторно центрифугируют и осадок сушат с использованием 8ауап1 8рссб Vас. Твердый материал растворяют в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,4, и оставшийся ацетон удаляют с использованием колонки ΓΌ-10 (ΌΕ Нсаййсагс, Р|вса1а\\'ау, N1).
Активность аминотрансферазы анализируют посредством инкубации препарата фермента с 5 мМ Ό-метионином, 1 мМ пируватом, 0,05 мМ РЬР и 2 мМ ЭДТА в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4. Анализы проводят при 25°С в течение 16 ч. Определение 4-метилтио-2-оксобутаноата проводят по образованию производного 2,4-динитрофенилгидразона, с использованием БС/М8 (т/ζ 328) и сходной технологии, описанной в примере 1. Приготавливают 0,4% (мас./об.) раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2М серной кислоте, и половину объема добавляют в анализируемую смесь после инкубации. Смесь перемешивают при осторожном встряхивании при 30°С в течение 30 мин и осадок собирают центрифугированием и анализируют посредством БС/М8. Белковые фракции, разделенные стандартными хроматографическими способами, анализируют в отношении активности сходным образом, однако копродукт аланин определяют способом послеколоночного образования производного ОРА, описанным в примере 1.
Выделение из арахиса (АгасШа йуродса Б. су. 81агг)
Фермент Ό-метионинаминотрансферазу из проросшего гомогената зародыша арахиса (без семядоли) очищают в соответствии со способом Н. Откат, Р.\. Могдап, !М. Ргсвсо11 апб СМ. Бутан Рйу1осйсттвйу (1973) 12, 2123-2126. В процессе получения неочищенных экстрактов используют восстановители в целях стабилизации ферментов, и клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 33000/д. 35-50% фракцию сульфата аммония далее очищают посредством инкубации при низкой температуре и посредством удаления белков в осадке. Супернатант далее фракционируют с использованием ацетона. Активные пулы далее очищают гель-фильтрацией (8срйабсх 200, ОΕ Нсаййсагс, Р|вса1а\\ау, N1).
По мере того как белковые фракции обогащаются белком трансаминазой, используют 2О-гельэлектрофорез для выделения представляющего интерес фермента в целях микросеквенирования. После определения гомологичных кодирующих участков в последовательностях растений, депонированных в NСВI, рекомбинантными способами получают белок Ό-аминотрансферазу в Ε3Λ№^ι сой с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Ожидается, что клеточные экстракты из цветков цветной капусты и семян арахиса или рекомбинантно полученные гомологичный ферменты можно использовать для получения В,В-монатина, как описано в примере 19 (в случае стереоинвертирующей трансаминазы) или в примерах 13 и 14 (в случае Ό-аминотрансферазы с широкой специфичностью).
Пример 21. Б-Аланинаминотрансфераза/аланинрацемаза/О-аланинаминотрансфераза.
На фиг. 4, 6 и 8 представлены биосинтетические каскады образования стереоизомерно обогащенного В,В-монатина из Б-триптофана с использованием аминотрансферазы Б-аминокислот (такой как Баланинаминотрансфераза и/или Б-триптофанаминотрансфераза), В-специфичной альдолазы, аланинрацемазы и Ό-аланинаминотрансферазы.
Триптофанспецифичная аминотрансфераза описана в примере 16. Альтернативно тирозин (ароматические)аминотрансферазы 8. шсй1ой и В. врйасго1бсв получают, как описано в примере 1 \0 03/ 091396 А2. Альдолазу РгоА Сотатопав 1св1ов1сгош получают, как описано в примере 4 \0 03/091396 А2 . Анализы тотального белка проводят с использованием анализа белков Вю-Ваб Рго1ст Аввау в соответствии с протоколами изготовителя (Вю-Ваб, Нсгси1св, СА). Аланинрацемазу приобретают от 81дтаА1бг1сй (81. Бошв, МО) (каталожный номер А8936). Ό-аланинаминотрансферазу приобретают от ВюСа1а1уйсв (каталожный номер АТ-103) (ВюСа1а1уйсв, Равабспа, СА).
Б-аланинаминотрансферазы широко распространены в эукариотах, бактериях и архибактериях. Следующие организмы были идентифицированы (исходя из гомологии последовательностей), как содержащие Б-аланинаминотрансферазу (Е.С. 2.6.1.2): АгаЬ1борв1в 1йайапа, АвйЬуа доввурп, Λζо1оЬас1с^ утс1апбн, В|ПбоЬас1спшп 1опдшп, СаспогйаЬбйгв с1сдапв, Сапбтба а1Ысапв, Сапбтба д1аЬга1а, Сйкнпубото
- 167 019971 пак ге1пЬагбШ, Сгур!ососсик пеоГогтапк, ОеЬагуотусек йапкепл, Ното кар1епк, Ногбеит уи1даге, К1иууеготусек 1асйк, Мадпароййе дпкеа, Мебкадо 1гипса!и1а, Мик тикси1ик, №игокрога сгакка, 0гуха кайуа, Рйапегосйае!е сйгукокрогшт, Ршик !аеба, Ркеиботопак рийба, Ругососсик аЬуккк Ругососсик Гипокик, Ругососсик йопкоккл, Яа!!ик погуедкик, 5ассйаготусек сегеу1к1ае, 5сЫхокассйаготусек ротЬе, ТакГиди гиЬпрек, Тгурапокота сги/Г У1Ьгк сйо1егае, У1Ьпо рагайаето1у!кик, У1Ьпо уи1шйсик, Уагго\\та йро1уйса и 2еа таук. Кроме того, многие аминотрансферазы обладают низким уровнем активности аланинаминотрансферазы и при высоких уровней Ь-глутамата и пирувата могут превращать их в Ь-аланин и αкетоглутарат. Фермент с низкой активностью улучшают стандартными способами мутагенеза, такими как ПИР с пониженной точностью и пассирование через мутагенные штаммы, или способами направленных изменений. Ген Ь-аланинаминотрансферазы клонируют с использованием общедоступных способов конструирования праймеров и с применением стандартных способов амплификации, клонирования, экспрессии и очистки гена/фермента.
Реакционные смеси (объемом 1 мл, анализируют с дублированием) содержат 100 мМ фосфатнокалиевый буфер (рН 8), 2 мМ МдС12, 0,05 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР), 200 мМ пируват натрия, 5 мМ α-кетоглутарат натрия, приблизительно 280 мкг/мл Та!А 5. теШой, предоставленной в клеточной экстракте (или другой специфичной в отношении Ь-триптофана аминотрансферазы), 100 мкл/мл клеточного экстракта аланинрацемазы или 1 мг/мл очищенной аланинрацемазы, приблизительно 280 мкг/мл Όаланинаминотрансферазы, предоставленной в клеточном экстракте, и приблизительно 100 мкг/мл альдолазы РгоА, предоставленной в качестве клеточного экстракта. Твердый триптофан добавляют в концентрации 10,2 мг/мл. Отрицательные контроли получают без аланинрацемазы. Образцы инкубируют при 30°С при осторожном встряхивании в течение ~1 ч или в течение ночи. Образцы центрифугируют для удаления осадка, фильтруют с помощью шприца и хранят при -80°С до анализа в отношении монатина с использованием способа ЬС/М5/М5, описанного в примере 1. В этих реакционных смесях, если Ьтриптофанаминотрансфераза может использовать α-кетоглутарат, но не пируват, в качестве акцептора амино, можно добавлять Ь-аланинаминотрансферазу, которая превращает Ь-глутамат и пируват и в Ьаланин и α-кетоглутарат, как показано на фиг. 6.
Пример 22. Субклонирование генов, кодирующих альдолазы 5ЕО ΙΌ N0:276, 244, 218, 228, 162, 50, 74, 44 и 116.
Гены, кодирующие альдолазы, обладающие аминокислотными последовательностями 5ЕО ΙΌ N0:276, 244, 218, 228, 162, 50, 74, 44 и 116, субклонировали в экспрессирующий вектор рЕТ28Ь (№уадеп, Мабкоп, νΙ) с №концевыми Н1к-маркерами для обеспечения очистки. 5Е0 ΙΌ N0:275 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:276. 5Е0 ΙΌ N0:243 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:244. 5Е0 ΙΌ N0:217 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:218. 5Е0 ΙΌ N0:227 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:228. 5Е0 ΙΌ N0:161 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:162. 5Е0 ΙΌ N0:49 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:50. 5Е0 ΙΌ N0:73 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:74. 5Е0 ΙΌ N0:43 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:44. 5Е0 ΙΌ N0:115 представляет собой последовательность гена, который кодирует альдолазу, обладающую аминокислотной последовательностью 5Е0 ΙΌ N0:116.
Праймеры, используемые для клонирования, представлены в табл. 24.
- 168 019971
Таблица 24
ДНК альдолазы 8Е0 ГО ΝΟ: 5’ праймер 3’праймер
275 5’- АТААОАСАТАТОССТАТССТТОТТАСОАА О-З’ (8Е0 ГО N0:339) 5’- АТААОАООАТССТТАТТССТССООСАОС СОСТС-3’ (8ЕЦ ГО N0:340)
243 5’- 5’-
АТААСАСАТАТСААСАОАССТОТСОТТОТ АТАА0А0САТССТТАСА0СТАСТТ6АС
С-З’-СБЕЦ ГО N0:341) АСС6АС-3' (8ЕЦ ГО N0:342)
217 5’- 5’-
АТААОАСАТАТОАОСОТООТСАТССОААА АТАА6АОСАТССТТАСТТСССТТТОТТА
С-3’ (8ЕЦ ГО N0:343) ТАООС-З’ (8ЕЦ ГО N0:344)
227 5’- 5’-
АТААСАСАТАТОААСААОСССОТООТТСТ АТААСАООАТССТТАСААОТАСТТОАО
0-3’ (8ЕЦ ГО N0:345) АССОАОО-З’ (8ЕЦ ГО N0:346)
161 5’- 5’-
АТААОАСАТАТОАОСОТООТСОТСАССОО АТААСАООАТССТТАОССОТТТТТСССС
-3’ (8Е0 ГО N0:347) ТСООТО-3’ (8Еф ГО N0:348)
49 5’- 5’-
А0ААСАСАТАТ6АТ0АССАТС0ТС0ТССА А0АА0А0САТССТСА6АСАТАТТТСАС
ОААС-3’(8Е0 ГО N0:349) ОСССТТ6-3’ (8Е0 ГО N0:350)
73 5’- 5‘-
АОААОАСАТАТОАТОАОСОТООТСАТСАС АСААСАООАТСССТАТТТСТТСТССООС
С-3’ (8ЕЦ ГО N0:351) ОТТТС-3’ (8ЕЦ ГО N0:352)
43 5’- 5’-
АТААТАСАТАТ0А0С6ТС0ТС0ТТСАСАА АТААТАООАТССТТАОАСАТАТТТОАОС
С-3’ (8ЕЦ ГО N0:353) СССТТС-3’ (8ЕЦ ГО N0:354)
115 5’- 5‘-
АСАА0АСАТАТ0АТ0ТС00ТТ6ТС6ТТСА АОААОАООАТССТСАОАТАТАСТТСАО
ОААС-3’(8Е0 ГО N0:355) ОССС-3’ (8ЕЦ ГО N0:356)
Г ены, кодирующие указанные выше альдолазы, амплифицировали посредством ПЦР и расщепляли соответствующими ферментами (ЫМ и ВатШ), и очищали из геля (набор для экстракции из геля ^IАцшск® Се1 ех1гас1юп Κΐΐ ^1адеп, Уа1епс1а, СА)). Расщепленные продукты лигировали по отдельности в рЕТ28, расщепленный посредством NйеI и ВашНЕ и очищенный из геля. Продукт лигирования трансформировали в клетки ТОР10 ЦпуИгодеп, Саг1кЬай, СА). ДНК, выделенную в малых количествах из отдельных колоний, анализировали в отношении наличия вставки посредством анализа размера с использованием агарозного гель-электрофореза. Изоляты со вставкой подвергали анализу последовательности ДНК (АдепсоигЦ Веуег1у, МА).
Очистка альдолаз
Проверенные клоны альдолазы трансформировали либо в ВЬ21(ОЕ3), либо в ВЬ21(БЕ3) рЬук8. Индукцию проводили в течение ночи в бульоне Тетйс ВгоШ при 30°С. Культуры, выращиваемые в течение ночи с соответствующим антибиотиком, разбавляли в свежей среде (как правило, 1:100) и выращивали до ΘΌ600 ~0,6 с аэрацией при 37°С. Затем культуры индуцировали посредством 1 мМ ГРТС и переключали на 30°С (с аэрацией), и инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием. Клеточный осадок, как правило, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания для облегчения лизиса клеток. Клеточный осадок лизировали в ВидВик£ег и нуклеазе Веп/опаке (Шуадеп, Майкоп, ΑΙ) (в соответствии с протоколом изготовителя). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Неочищенный белковый экстракт наносили на колонку емкостью 10 мг Ш8-Втй (Шуадеп, Майкоп, ΑΙ), которую подготавливали в соответствии с протоколом изготовителя. Колонку промывали, и белок элюировали в соответствии с протоколом изготовителя. Очищенный белок подвергали обессоливанию с помощью колонок РБ-10 (СЕ НеаЙИсаге, Р1кса1а\уау, N1) и элюировали в 50 мМ фосфатнокалиевом буфере, рН 7,5, содержащем 4 мМ МдС12, 200 мМ №С1. Очищенный белок концентрировали с помощью центробежных концентраторов Атюоп (пороговое значение МА 5000) (Мййроге, ВШепса, МА). После концентрирования было отмечено, что альдолазы 8Ε^ ΙΌ N0:44, 8Ε^ ΙΌ N0:28 и 8Ε^ ΙΌ N0:276 показали некоторый уровень осаждения, хотя активность, тем не менее, была достаточно высокой. Белки хранили при -80°С до анализа.
Анализ белков проводили с использованием набора Р1егсе ВСА (Р1егсе, КоскГогй, Ш) и протокола титрования в микропланшетах с бычьим сывороточным альбумином (В8А) в качестве белкового стандарта. Систему для электрофореза Ехрепоп Рго260 (Вю-Кай, Негси1ек, СА) или 8Б8-РАСЕ использовали для оценки процентного количества альдолазы в очищенном образце и для оценки уровней экспрессии в растворимом клеточном экстракте и в тотальном белке.
- 169 019971
Тестирование очищенных альдолаз
Очищенные альдолазы тестировали в отношении их способности образовывать К,К-монатин из Όтриптофана и сравнивали с альдолазами 8ΕΡ ΙΌ N0:28 и 8ΕΡ ΙΌ N0:54, полученными аналогичным образом. Анализы проводили в микроцентрифужных пробирках (с дублированием) с очищенным белком, с использованием той же концентрации фермента на анализируемый образец (50 мкг/мл), за исключением 8ΕΡ ΙΌ N0:244, для которого использовали 25 мкг/мл. 8ΕΡ ΙΌ N0:243 не экспрессировался хорошо и приводил к небольшим количествам очищенного белка. В качестве Ό-аминотрансферазы использовали два мг/мл АТ-103 ВюСа1а1уйсз (ВюСа1а1уйсз, Разайепа, СΑ). На 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: альдолазу, 4 мМ МдС12, 50 мМ Ό-триптофан, Ό-аминотрансферазу, 200 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР. Образцы инкубировали при 30°С. Образцы отбирали через 30 мин, 1 ч, 3 ч и после ночи (19 ч). В табл. 25 показаны усредненные результаты для тотального образованного монатина в каждый момент времени и % образованного К,К-монатина, определенные с помощью обращенно-фазовых площадей пиков. В столбце 3 табл. 25 для некоторых реакций проводили дополнительный анализ образования производных ΡΌΑΑ посредством ЬС/М8/М8, как описано в примере 1, и эти результаты указаны в скобках.
Таблица 25. Тотальный монатин, образованный из Ό-триптофана, и % К,К
Альдолаза (ч) Тотальный монатин (м.д.) % К.,К-монатина
ЗЕЦ ГО N0:28 (0,5) 16 99,1
ЗЕО ГО N0:28(1) 53,2 99,2 (99,0)
8ЕЦ ГО N0:28(3) 207,8 98,6 (98,1)
8ЕЦ ГО N0:28 (19) 544,9 95,3 (93,2)
8Е0 ГО N0:44 (0,5) 46,2 88,0
8ЕЦ ГО N0:44(1) 92,5 86,8
8ЕЦ ГО N0:44 (3) 319,7 76,4
8Εζ) ГО N0:44 (19) 762,9 67,1
8ЕЦ ГО N0:54 (0,5) 35,3 96,2
БЕЦ ГО N0:54(1) 82,7 96,1
8ЕЦ ГО N0:54(3) 280,1 92,9
8Е0 ГО N0:54(19) 715,3 77,1
8Е0 ГО N0:74 (0,5) 51,1 92,6
8Е0 ГО N0:74(1) 89,3 94,3
8Е0 ГО N0:74 (3) 269,5 89,9
8Е0 ГО N0:74(19) 701,9 76,2
8Е0 ГО N0:50 (0,5) 55,9 96,7
8ЕЦ ГО N0:50(1) 96,5 96,2
8ЕЦ ГО N0:50(3) 272,2 95,6
8Εζ) ГО N0:50(19) 645,8 88,5
8Е0 ГО N0:162 (0,5) 37,3 95,7
8ЕЦ ГО N0:162(1) 75,0 97,1
8ΕΟΙΟΝΟ:162 (3) 261,0 95,9
8ЕЦ ГО N0:162(19) 633,1 87,0
8Е0 ГО N0:276 (0,5) 37,8 98,8
8ЕЦ ГО N0:276(1) 71,2 99,3 (99,5)
8ЕЦ ГО N0:276 (3) 245,2 99,0 (99,0)
8ЕЦ ГО N0:276(19) 585,4 96,7 (96,1)
8ЕЦ ГО N0:244 (0,5) 30,2 97,7
8Е0 ГО N0:244(1) 46,4 98,3 (99,2)
8Εζ) ГО N0:244 (3) 165 98,4 (98,7)
8Е0 ГО N0:244(19) 572,5 95,6 (93,7)
8ЕЦ ГО N0:228 (0,5) 52 95,0
8Е0 ГО N0:228(1) 81,7 96,5
8ЕЦ ГО N0:228 (3) 251 95,9
БЕЦ ГО N0:228 (19) 723 87,1
без альдолазы (0,5) 0
без альдолазы (1) 0
без альдолазы (3) 0,6 58,3
без альдолазы (19) 6,5 61,5
- 170 019971
Альдолаза 8Е0 ГО ЫО:276 сохраняла высокий уровень активности, а также наиболее высокую стереоспецифичность в отношении образования В,В-монатина. Оказалось, что хранение этого фермента в буфере без включения хлорида натрия снижает уровень осаждения, выявленный ранее. Оказалось, что концентрация магния в буфере для хранения не влияет на уровень осаждения.
Все альдолазы 8Е0 ГО КО:276, 8Е0 ГО ЫО:28 и 8Е0 ГО ЫО:244 демонстрировали высокую активность и высокую стереоселективность в отношении образования В,В-монатина. Эти три фермента получали, как описано в примере 23, и анализировали в анаэробных условиях, как описано в примере 24, с использованием 10-мл флаконов для сыворотки. Анализ в объеме семь мл проводили с использованием 0,05 мг/мл каждой альдолазы (очищенной) и 2 мг/мл очищенной ϋ-аминотрансферазы В. крНаепсик, полученной, как описано в примере 24. Активность каждой альдолазы в отношении образования монатина из Ό-трнптофана сравнивали с альдолазой НМС 8. теЫой, полученной, как описано в примере 27. Тотальный монатин оценивали с использованием способа ЬС-ОРА, описанного в примере 1. Процентное количество образованного В,В-монатииа определяли с использованием способа образования производных посредством ГПАА, описанного в примере 1. Результаты представлены ниже в табл. 26.
Таблица 26
Альдолаза Время (ч) Монатин (г/л) % образованного К.,К
5, теШоИ 23 3,9 82,0
8Εζ) ГО ΝΟ: 28 23 4,0 84,6
8ЕЦ ГО N0: 276 23 4,0 95,7
8ЕЦ ГО ΝΟ: 244 23 3,7 88,8
5, теШоИ 47 4,5 76,2
8ЕЦ ГО ΝΟ: 28 47 4,3 84,6
8Εζ) ГО ΝΟ: 276 47 4,3 93,2
8ЕЦ ГО ΝΟ: 244 47 4,5 85,2
Эти результаты показывают, что альдолаза 8Е0 ГО ЫО:276 также приводит к высоким уровням В^-монагана в анаэробных реакциях большего объема.
Пример 23. Экспрессия и очистка альдолазы 8Е0 ГО ЫО:276.
Клонирование хозяина Е.со11 ВЬ21(ПЕ3)рЬук8, обладающего геном альдолазы, приведенным в качестве 8Е0 ГО КО:275, на плазмиде рЕТ28Ь, описано выше в примере 22.
Альдолазу 8Е0 ГО ЫО:276 с Ν-концевым маркером для очистки Ш86 получали с использованием ЕМО Вюкаепсек ОуегшдН! Ехргекк 8ук!ет II (Х'осадеп, МаФкоп, \\4) (растворы 1-6), содержащей 50 мкг/мл канамицина, во встряхиваемых колбах. Эта экспрессирующая система индуцирует экспрессию индуцируемых посредством ГРТС систем без необходимости в мониторинге роста клеток. После инокуляции 200-мл аликвот среды (в 1-л флаконах) либо из жидких культур, либо из планшетов конструкцией альдолазы, культуры инкубировали при 30°С в течение ночи при встряхивании 225 об. /мин. Когда ОЭбоонм достигала минимум 6, клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.
Для получения бесклеточного экстракта, содержащего альдолазу, клетки суспендировали в 3-4 объемах 100 мМ фосфата калия, рН 7,8, а затем разрушали с использованием гомогенизатора МюгоЙшФск (МюгоДшФск, Ке\4оп, МА) (3 прохождения при 18000 фунт/кв.дюйм (1235х105 Па)), при поддержании температуры суспензии менее 15°С. Альтернативно бесклеточный экстракт получали с использованием реагента для экстракции ЕМЭ Вюкаепсек ВидВик1е® (не содержащего первичные амины) Ех!гас!юп Веадеп! (Х'осадеп, МаФкоп, \\4), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Веп/опаке'® \пс1еаке, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго1еаке ШИБкот Соск1ай 8е1 II и 0,033 мкл/мл гйукохуте™ в соответствии с инструкциями изготовителя. Все последующие стадии очистки проводили при 4°С. Суспензию клеток центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000-20000хд для удаления клеточного дебриса. Аликвоту бесклеточного экстракта объемом 20-25 мл наносили на 45-мл колонку СЕ НеаЙНсаге СНе1айпд 8ерНагоке™ Гак! Е1оа гекш (форма никеля (II)) (СЕ Неа1!Нсаге, Р1кса1а\\ах, ΝΓ), которую перед этим уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Для получения формы смолы с никелем, смолу промывали 150 мл 200 мМ гексагидратом сульфата никеля (II), а затем 150 мл дистиллированной воды. После загрузки образца колонку промывали/элюировали посредством 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол, и 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белок с маркером Ш86 элюировался при последнем промывании. Смыв, полученный посредством 500 мМ имидазола, концентрировали посредством центробежных фильтров М1Шроге/Ат1соп Сеп!псоп Р1ик-70 (М^СО 10 кДа) (М1Шроге, ВШепса, МА) до 15-20 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки СЕ Неа1!Нсаге РЭ10 (СЕ Неа1!Нсаге, Р1кса!а^ау, ΝΙ) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8. Очищенную альдолазу элюировали посредством 3,5 мл на колонку того же буфера.
Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе
- 171 019971
ВСА (Р1егсе, КоскГогб, ГО), применяя В8А в качестве белкового стандарта. Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии в бесклеточном экстракте определяли с использованием микрокапиллярной системы чипов В1о-Каб Εxре^^οη (Вю-Каб, Негси1ек, СА) или с использованием гелей Вю-Каб с 4-15% градиентом 8Б8-полиакриламид, разделяемых в камере М1ш РК0ТΕЛN® 3 (Вю-Каб, Негси1ек, СА). Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием окраски Кумасси Вю-Каб Вю-8аГе С-250 (ВюКаб, Негси1ек, СА), и окраску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~50 мг фермента из 400 мл ночной культуры, который является на 85-95% чистым, при определении с помощью программного обеспечения Εxре^^οη. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения. Получение фермента таким образом снижало уровень осаждения фермента, выявленный ранее. Наличие магния в буфере для хранения не оказывало эффекта на уровень осаждения.
Пример 24. Образование К,К-монатина с использованием альдолазы 8ΕΟ ГО N0:276: Оптимизация условий реакции Б-аланинаминотрансферазу ВасШик крйаепсик (штамм АТСС 10208), клонированную по примеру 7, очищали в виде маркированного Ш86 белка, как описано ниже, с использованием системы для экспрессии ΕΙΠΒ Вюкаепсек 0νе^тдйΐ Εxр^екк 8ук1ет ΙΙ (Nονадеη, Маб1коп, №Ι) для роста и индукции. Экспрессирующая система ΕΙΠΒ Вюкаепсек 0νе^шдйΐ Εxр^екк 8ук1ет ΙΙ (растворы 1-6) (Nονадеη, Маб1коп, №Ι) содержала 50 мкг/мл канамицина во встряхиваемых колбах. Эта экспрессирующая система индуцирует экспрессию индуцируемых посредством ЙРТС систем без необходимости в мониторинге роста клеток. После инокуляции 200-мл аликвот среды (в 1-л флаконах) либо из жидких культур, либо из планшетов конструкцией аминотрансферазы, культуры инкубировали при 30°С в течение ночи при встряхивании 225 об /мин. Когда 0Б600НМ достигала минимум 6, клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.
Для получения бесклеточного экстракта, содержащего Б-аланинаминотрансферазу, клетки суспендировали в 3-4 объемах 100 мМ фосфата калия, рН 7,8, содержащего 50 мкМ пиридоксальфосфат (РЬР), а затем разрушали с использованием гомогенизатора М1сгоГ1шб1ск (М1сгоГ1шб1ск, №м!оп, МА) (3 прохождения при 18000 фунт/кв.дюйм (1235х105 Па)), при поддержании температуры суспензии менее 15°С. Альтернативно бесклеточный экстракт получали с использованием реагента для экстракции ΕΙΠΒ Вюкаепсек ВидВик!е® (не содержащего первичные амины) ΕχΙ^-ια^η Кеадеп! (Nονадеη, Маб1коп, №Ι), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Вепхопаке® Мюкаке, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго!еаке ΙηΗίΜ1ог СоскйаП 8е1 ΙΙ и 0,033 мкл/мл гЬукохуте™ в соответствии с инструкциями изготовителя. Все последующие стадии очистки проводили при 4°С. Клеточный экстракт центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000хд для удаления клеточного дебриса. Аликвоту бесклеточного экстракта объемом 20-25 мл наносили на 45-мл колонку СΕ Неаййсаге Сйе1абпд 8ерйагоке™ Рак! Р1ом гект (форма никеля (ΙΙ)) (ΌΕ Неаййсаге, Р1кса!амау, N1), которую перед этим уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Для получения формы смолы с никелем смолу промывали 150 мл 200 мМ гексагидратом сульфата никеля (ΙΙ), а затем 150 мл дистиллированной воды. После загрузки образца колонку промывали/элюировали посредством 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол, и 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белок с маркером Ш86 элюировался при последнем промывании. Смыв, полученный посредством 500 мМ имидазола, концентрировали посредством центробежных фильтров М1Шроге/Ат1соп Сеп!псоп Р1ик-70 (М№С0 10 кДа) (М1Шроге, ВШепса, МА) до 15-20 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки СΕ Неа1Шсаге РБ10 (ΌΕ НеаИйсаге, Р1кса!амау, N1) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8, содержащим 0,5 мкМ РЬР. Очищенную альдолазу элюировали 3,5 мл того же буфера на колонку.
Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе ВСА (Р1егсе, КоскГогб, ГО), применяя В8А в качестве белкового стандарта. Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии в бесклеточном экстракте определяли с использованием микрокапиллярной системы чипов Вю-Каб Εxре^^οη (Вю-Каб, Негси1ек, СА) или с использованием гелей Вю-Каб с 4-15% градиентом 8Б8-полиакриламид, разделяемых в камере М1ш РК0ТΕЛN® 3 (Вю-Каб, Негси1ек, СА). Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием окраски Кумасси Вю-Каб Вю-8аГе С-250 (ВюКаб, Негси1ек, СА), и окраску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~50 мг фермента из 200 мл ночной культуры, который является на 85-95% чистым, при определении с помощью программного обеспечения Εxре^^οη или из анализов гелей 8^8-РАСΕ. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения.
Альдолазу 8ΕΟ ГО N0:276 (клонированную по примеру 22) очищали в качестве маркированного Ш86 белка, как описано в примере 23.
Предпочтительный кофактор металла для альдолазы 8ΕΟ ГО N0:276 определяли посредством скрининга различных двухвалентных металлов. Реакции проводили в анаэробных 10-мл флаконах для сыворотки с конечными объемами 7 мл. Основной объем раствора, состоящий из 100 мМ фосфата калия (рН 7,8), 200 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ РЬР и 0,01% (об./об.) Тмееп 80, изготавливали с конечным объемом 48,8 мл и барботировали азотом в течение 30 мин. Б-триптофан (143 мг; конечная концентрация 100
- 172 019971 мМ) распределяли на семь 10-мл флаконов для сыворотки. В каждый из флаконов добавляли 0,014 мл 2 М исходного раствора двухвалентного катиона металла, полученного из хлоридной соли (конечная концентрация 4 мМ). В случае отрицательного контроля добавляли 0,014 мл ОН20. Флаконы для сыворотки закрывали резиновой мембраной и барботировали азотом через иглы калибра 16-18. В анаэробных условиях 5,625 мл основного анаэробного раствора добавляли в каждый анаэробный флакон для сыворотки. После этого ϋ-аланинаминотрансферазу В. зрйаспсиз и альдолазу 8ЕЦ ΙΩ N0:276 добавляли в анаэробных условиях до достижения в каждом флаконе для сыворотки конечной концентрации 2 и 0,05 мг/мл соответственно. Растворы инкубировали при комнатной температуре при осторожном встряхивании в течение 18 ч. Конечный монатин анализировали в соответствии со способами, описанными в примере 1, с использованием способа детекции аминокислот жидкостной хроматографией-послеколоночной флуоресценции (табл. 27).
Таблица 27
Металл-кофактор Конечный монатин (мМ) через 18 часов
Отсутствует (отрицательный контроль) 1,7
Магний 10,6
Марганец 10,0
Кобальт 6,7
Цинк 4,9
Никель 1,5
Кальций 0,7
Условия реакции для альдолазы 8ЕЦ ГО N0:276 далее исследовали посредством двухуровневого дробного факторного эксперимента, разработанного с использованием статистического программного обеспечения Иез1дп Ехрей 7.0.0 (8!а!-Еазе, Шс.; МтпеароНз, МЩ. Схема скрининга состояла из одного блока из пяти факторов на двух уровнях с четырьмя центральными точками (всего 20 анализов). Пять факторов, подлежащих оптимизации, представляли собой концентрацию металла-кофактора, рН реакции, концентрацию Туссп® 80, соотношение пирувата и триптофана и концентрацию альдолазы (табл. 28).
Из конических пробирок из полипропилена (14 мл), содержащих 143 мг Э-триптофана, удаляли кислород в анаэробном перчаточном боксе (Соу ЕаЬога!огу РгоОиШз, Шс; Огазз Еаке, МЦ в течение ночи. Исходные растворы 2 М МдС12; 1 М фосфата калия при рН 7,0, 7,75 и 8,5; 10% (об./об.) Туссп® 80; 2 М пируват натрия и 10 мМ РЕР (пиридоксаль-5'-фосфат) получали в дегазированной воде и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы очищенной И-аланинаминотрансферазы В. зрйаепсиз и альдолазы 8ЕЦ ГО N0:276 размораживали на льду и сразу использовали в анаэробном перчаточном боксе. Исходные растворы добавляли в 14-мл конические пробирки, содержащие Э-триптофан, для достижения концентрации, определенной посредством статистического расчета (табл. 28). В каждую пробирку добавляли дегазированную воду для доведения конечного объема, совместно с добавлением фермента, до 7,0 мл. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в анаэробном перчаточном боксе при осторожном перемешивании в течение вплоть до 24 ч. Концентрацию монатина и изомерную чистоту анализировали в соответствии со способами, описанными в примере 1, с использованием способа детекции аминокислот жидкостной хроматографей-послеколоночной флуоресценции и множественного мониторинга реакции посредством ЕС/М8/М8 для определения распределения стереоизомеров монатина в способе реакций ш уйго и ш у1уо (способ образования производных посредством ЕИАА).
- 173 019971
Таблица 28
Статистический анализ данных показал, что рН реакции, соотношение пирувата и триптофана и концентрация альдолазы представляли собой существенные факторы, влияющие на титр монатина, изомерную чистоту и выход углерода. Строили график целесообразности с использованием программного обеспечения Оеыдп Ехрег!, в котором факторы варьировали в целях максимизации целей, представляющих собой наиболее высокий титр монатина и наиболее высокую изомерную чистоту в условиях избытка пирувата. Условия реакции, указанные в качестве оптимума, представляли собой 1 мМ МдС12, рН>8,0, 0,01% (об./об.) Тхееп® 80 и 0,01 мг/мл альдолазу ЛЕР ΙΌ N0:276. Это представляет собой снижение в 5 раз обычного количества используемой альдолазы, а также снижение в 4 раза количества двухвалентного металла, используемого обычно.
Дополнительные эксперименты проводили для определения оптимального диапазона значений рН для протекания реакции. Исходные растворы 1 М буфера ЕРРЛ изготавливали с возрастанием на 0,2 единицы рН между рН 7,0 и 9,0. Эти растворы подвергали дегазированию и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Из пробирок из полипропилена (14 мл), содержащих 143 мг Όтриптофана. удаляли кислород в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы 2 М МдС12, 10% (об./об.) Тхееп® 80, 2 М пирувата натрия и 10 мМ РЕР изготавливали в дегазированной воде и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе. Препараты очищенной Ό-аланинаминотрансферазы В. крйаепсик и альдолазы ЛЕР ΙΌ N0:276 размораживали на льду и сразу использовали в анаэробном перчаточном боксе. Исходные растворы добавляли в 14-мл конические пробирки до конечной концентрации 100 мМ ЕРРЛ, 200 мМ пирувата, 100 мМ триптофана, 1 мМ МдС12, 0,01% (об./об.) Тхееп® 80, 0,05 мМ РЕР, 2 мг/мл Ό-аланинаминотрансферазы В. крйаепсик и 0,01 мг/мл альдолазы ЛЕР ΙΌ N0:276 в общем объеме 7 мл на пробирку. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в анаэробном перчаточном боксе при осторожном встряхивании в течение 22 ч. Образцы удаляли и анализировали в отношении монатина, как описано в примере 1, с использованием способа множественного мониторинга реакций посредством ЕС/МЛ/МЛ (табл. 29).
Таблица 29
- 174 019971
Результаты указывают на то, что образование монатина повышается при повышении рН между 7,08,0. Образование монатина достигало максимума в диапазоне рН 8,0-8,2, и снижалось при рН выше 8,4. Кроме того, изомерная чистота монатина снижалась при рН выше 8,4.
Последующую реакцию оптимизации проводили с использованием альдолазы 8Ε-Ρ ГО N0:276 (0,01 мг/мл), 2 мг/мл Τ243N 4978 ЭАТ (без маркера, по примеру 26), 1 мМ МдС12, 200 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ РЬР, 0,01% Ттеееи-80 и 100 мМ Э-триптофана при рН 8,5. Клетки, используемые для получения альдолазы и Ώ-аминотрансферазы, разрушали в 50 мМ Ε₽₽8, рН 8,4 с использованием гомогенизатора М1сгоГ1шШск (М1сгоГ1шШск, N0^^^ МА) (3 прохождения при 20000 фунт/кв.дюйм (1373х105 Па)). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (20000хд в течение 30 мин), и очищенные клеточные экстракты использовали в ферментативных реакциях. Дополнительно буфер не использовали, однако перед добавлением фермента реакционные смеси доводили до рН 8,5 с использованием гидроксида натрия и продували азотом. Реакции объемом двести пятьдесят мл проводили во встряхиваемых ферментерах 81хГог объемом 0,7 л (ШГогк АО, Войштдеи, 8те1!/ег1аиб) при 30°С с использованием азота в свободном пространстве. Фосфат калия добавляли до конечной концентрации 0, 5, 10, 20 и 50 мМ. Было выявлено, что добавление 5-10 мМ фосфата было оптимальным, обеспечивая 3,5 г/л монатина (количественно определенного посредством БС/М8/М8, как описано в примере 1).
Пример 25. Клонирование новой аминотрансферазы ϋ-аминокислот ВасШик.
Аминотрансферазу ϋ-аминокислот ВасШик (ОААТ или ЭАТ) (ЕС 2.6.1.21, также известную как ϋ-аланинаминотрансфераза или ϋ-аспартатаминотрансфераза) получали рекомбинантными способами. Эту аминотрансферазу использовали в сопряженных анализах образования К,К-монатина с альдолазами. Этот фермент аминотрансфераза является гомологичным ϋ-аминотрансферазам, описанным ранее для получения монатина (опубликованная заявка США № 20040063175 и опубликованная заявка США № 20050282260). Организм АТСС 4978 - ВасШик крйаепсик, первоначально депонированный в качестве ВасШик го!аик - получали из АТСС и использовали для получения геномной ДНК. Вырожденные праймеры конструировали в областях консервативной белковой последовательности известных ϋ-аминотрансфераз ВасШик и использовали для амплификации полимеразной цепной реакцией (ПЦР) внутренней последовательности гена ОААТ из штамма АТСС, упомянутого выше. Прогулку по геному проводили с использованием набора ВО Сеноте Уа1кег™ Иттегка1 К1! (С1ои!есй, Моии!ат У1ете, СА). Анализ последовательности (Адеисоиг! Вю8сюисе Согрогайои, Ветег1у, МА) подтверждал полноразмерую кодирующую последовательность для гена ОААТ из АТСС 4978. Последовательность ДНК гена ОААТ из АТСС 4978 представляет собой 8Ε·Ρ ГО N0:357 и представлена ниже. Ген 8Ε-Ρ ГО N0:357 можно амплифицировать стандартными протоколами ПЦР и клонировать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Ген 8Ε-Ρ ГО N0:357 также можно реконструировать любым способом, известным специалисту в данной области, таким как способы ПЦР со сборкой, известные специалисту в данной области.
Последовательность ДНК АТСС 4978 ОААТ представляет собой:
аЬдадЬЬаЬа дсГЬаЬддаа ГдассаааЬЬ дЬдааЬдаЬд аадаадйадГ
адГГдаЬаад даддассдЬд дсГаГсааГЬ ЬддсдаГддЬ дЬ-ЬЬаЬдаад
ЕЬдЬаааад'Ь аЬаЬаасддЕ дааЕЕаГЫза садсддадда дсаЬдЬсдаЬ
сдЬЬЬЬ'Ьасд сдадЬдсЬда аааааЬЬсдс дЬЬасдаГсс сГЬаГасааа
адасааэБ-Ьд саГсааЕЬаЬ ГдсаГсадкГ адЬЬдаааГд ааЬааадГГс
ааасаддаса Еа-ЬЕЬаЬ-к-кс саааЬЬасдс дЬддЬдсадд сссГсдЬааЬ
саГаГГГГсс сЬддЬдаГда адГдаадсса дГаГГаасад дЬааЬассаа
ддааааЬсса сдЬсссдЬад сааасЬГГда ааааддЬдЬд ааадсаасаЬ
ЬБдЬадаада са-ЕЬсдГЬдд ЬГасдсГдЕд асаГЬаааГс аЬЬааа-ЬГ.Ьа
сГГддЬдсдд ЬасГЬдсЬаа асаадаадса саГдааааад даГдсГаГда
адсддГГЬЬа саЕсдЕдаЬд аааГсдГаас адааддсЬсЬ ЬсЬЕсаааЬа
ЕЬ-ЬаЬддааЬ ЕааадаЬддс дЬаЬЬаГаса сасайссадс давГаасГЬс
а!с!!ааа!д д!а!!асасд !саад!аа!с айааа!д!§ с!дс!дааа! !§§с!1асса д!дааддаад аадсаа!дас аас!сад с!!с!!дсаа !дда!даад! дайдШса !саасдас!! садаад!аас дссаа!!а!с даса!ада!д даасад!аа! !дд!дсддд! ааассддд!д ас!ддасасд !ааа!!асаа дсасааШд а!асдаааа! сссаааадд! а!!сдсдса!аа (8Ε-Ρ ГО N0:357).
Аминокислотная последовательность гена ОААТ из АТСС 4978, кодируемая представленной выше последовательностью ДНК, представляет собой 8Ε-Ρ ГО N0:358 и представлена ниже:
- 175 019971
МеЬ . Зе: с Ту г Зе ;Г Ьеи Тгр А зп А .зр ОЬп 11е УаЬ Азп Азр СЬи
<31и Уа1 Уа1 Уа1 Азр Ьуз С1и Азр Агд С1у Туг С1п РЬе СЬу Азр СЬу
Уа1 Туг С1и Уа1 Уа1 Ьуз Уа1 Туг Азп СЬу С1и Ьеи РЬе ТЬг А1а СЬи
С1и ΗΪ3 Уа1 Азр Агд РЬе Туг А1а Зег А1а С1и Ьуз Не Агд Уа1 ТЬг
Не Рго Туг ТЬг Ьуз Азр Ьуз Ьеи НЬз О1п Ьеи Ьеи НЬз С1п Ьеи Уа1
С1и МеТ Азп Ьуз Уа1 С1п ТЬг СЬу НЬз 11е Туг РЬе С1п 11е ТЬг Агд
С1у А1а С1у Рго Агд Азп НЬз 11е РЬе Рго СЬу Азр С1и Уа1 Ьуз Рго
Уа1 Ьеи ТЬг С1у Азп ТЬг Ьуз С1и Азп Рго Агд Рго УаЬ А1а Азп РЬе
С1и Ьуз С1у Уа1 Ьуз А1а ТЬг РЬе Уа1 С1и Азр 11е Агд Тгр Ьеи Агд
Суз Азр 11е Ьуз Зег Ьеи Азп Ьеи Ьеи СЬу А1а УаЬ Ьеи А1а Ьуз С1п
С1и А1а Н15 С1и Ьуз С1у Суз Туг С1и А1а Уа1 Ьеи НЬз Агд Азр СЬи
11е Уа1 ТЬг С1и С1у Зег Зег Зег Азп 11е Туг СЬу Не Ьуз Азр СЬу
Уа1 Ьеи Туг ТЬг НЬз Рго А1а Азп Азп РЬе 11е Ьеи Азп СЬу 11е ТЬг
Агд С1п Уа1 Не Не Ьуз Суз А1а А1а С1и 11е СЬу Ьеи Рго УаЬ Ьуз
С1и С1и А1а МеЬ ТЬг Ьуз ТЬг ОЬп Ьеи Ьеи А1а МеЬ Азр СЬи УаЬ Не
\7а1 Зег Зег ТЬг ТЬг Зег С1и Уа1 ТЬг Рго 11е 11е Азр 11е Азр СЬу
ТЬг Уа1 11е С1у А1а С1у Ьуз Рго СЬу Азр Тгр ТЬг Агд Ьуз Ьеи С1п
А1а С1п РЬе Азр ТЬг Ьуз 11е Рго Ьуз СЬу 11е Агд А1а
(ЗЕ<2 Ю N0:358) .
Новая Ώ-амннотрансфераза, полученная из штамма АТСС 4978, обладает белковой последовательностью, которая обладает отличающимися заменами аминокислотных остатков по сравнению с опубликованной последовательностью Ώ-аминотрансферазы В. крйаепсик АТСС 10208. 1)ААТ из АТСС 4978 обладает только 72% идентичностью с 1)ААТ из В. крйаепсик (АТСС 10208). Несмотря на то что этот штамм в настоящее время представлен в качестве В. крйаепсик в АТСС, он был депонирован в качестве В. го!апк.
Исходя из выравнивания последовательностей и выявленных отличий между этой новой 1)ААТ и 1)ААТ из В. крйаепсик, идентифицировано множество остатков-кандидатов, которые можно оценивать с точки зрения их роли (отдельно или в сочетании) в повышении активности 1)ААТ в отношении биосинтеза К,К-монатина, в этих, а также в других последовательностях 1)ААТ.
Пример 26. Охарактеризация мутантных форм Ώ-аминотрансферазы из АТСС 4978.
Обзор эксперимента
Новый ген Ώ-аминотрансферазы (описанный в примере 25) из штамма ВасШик АТСС 4978 подвергали мутагенезу с использованием сайт-направленных способов. Мутантные гены экспрессировали и анализировали на представляющую интерес активность в отношении каскадов образования монатина, особенно при сопряжении с одной или несколькими альдолазами.
В дополнение к идеям, представленным в примере 16 для мишеней сайт-направленного мутагенеза, другие идеи были разработаны посредством фактического помещения К-МР в активный центр кристаллической структуры УМ-1, для определения возможности наличия в белке аминотрансферазы 4978 сходных структурных свойств в этом участке использовали выравнивание первичных аминокислотных последовательностей. Ожидалось, что следующие дополнительные мутации могут быть преимущественными (с использованием нумерации аминокислот аминотрансферазы 4978). Полагали, что мутагенез аланина 153 на аргинин может стабилизировать вторую карбоксильную группу субстрата (К-МР). Эта замена может увеличить пространственное препятствие, таким образом, в целях компенсации остатки серина в положениях 181 и 182 заменяли на аланин или глицин. Также было предположено, что можно вносить аргинин в положение 180, 181 или 182 и превращать один или несколько других остатков серина в аланин или глицин для создания кармана для более объемной боковой цепи аргинина. Фенилаланин в 200 аминокислоте пространственно близко расположен с областью предсказанной фиксации К-МР в активном центре, и существует значительная вариабельность этого остатка среди Ώ-амннотрансфераз, которые довольно хорошо катализируют переаминирование монатина. Полагали, что модификации аминокислот в этом положении могут быть целесообразными. Было предсказано, что мутация лейцина 151 на фенилаланин улучшает взаимодействие с индольным кольцом субстрата.
Исходя из литературы, было предположено, что мутация треонина 243 на аспарагин может повысить селективность в отношении К-МР для реакций переаминирования. Аналогично полагали, что мутагенез аспарагина 100 на аланин может повысить специфичную активность фермента в реакциях переаминирования монатина (Ко, е! а1., ЕЕВ8 ЬеИ 398:141-145, (1996); 8идю, 8, е! а1., ВШсйетЬЕгу 54:96619669, (1995); ЕР1580268).
- 176 019971
Ьее е! а1. охарактеризовали мутантные формы области 141-144 (петля) и выявили, что Ώаминотрансферазы с ЕУсУ в большей степени, чем ЬВсО (которая является нативной для этого белка) обладают тенденцией к наличию более низких Кш в отношении субстратов в виде дикарбоновых кислот. (1.ее 8.С, Ноид 8.Р, 8оид .Ι..Ι, К1ш 8.1, К\\ак М.8, 8иид М.Н. аиб к!гис!ига1 сйа^ас!е^^ζа!^оη оГ
111еппок1аЬ1е И-атшо ас1б атшоЛаикГегакек Ггош СеоЬасШик крр. Арр1 Еиу1гои М1сгоВю1. 2006 РеЬ; 72(2):1588-94). Вследствие того, что МР представляет собой субстрат в виде дикарбоновых кислот, сходный с альфа-кетоглутаратом, и концентрации МР являются довольно низкими в обычной реакционной смеси для получения монатина, сниженная Кш может потенциально способствовать активности мутантной И АТ в отношении образования монатина.
Ниже описаны способы создания мутантных форм И-аминотрансферазы 4978, а также результаты анализа с использованием этих мутантных форм.
Мутагенез
Праймеры для мутагенеза конструировали в соответствии с рекомендациями, приведенными в наборе 8!га!адеие МиШ-СИаиде к1! (8!га!адеие, Ьа Ло11а, СА). Праймеры были б'-фосфорилированными. Мутагенез проводили с использованием набора 8!га!адеие МиШ-СИаиде к1! (8!га!адеие, Ьа боба, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Матрицы, используемые для мутагенеза, представляли собой конструкции ИАТ 4978 либо рЕТ30 (без маркера), либо рЕТ28 (маркированная), описанные в примере 25. Праймеры приведены ниже в табл. 30.
Таблица 30
Название мутантной формы 4978-22
Аминокислотная замена
Праймер
Τ243Ν
Т243К
Т2438
Т243А
N100 А
ОТОАТТОТТТСАТСААССААТТСАОААОТААСОСС (8Еф ГО N0:359)
ОТОАТТОТТТСАТСААСОСОТТСАОААСТААСОСС (ЗЕф ГО N0:360)
ОТОАТТОТТТСАТСААССАОТТСАСААСТААСОСС (8Еф ГО N0:361)
ОТОАТТОТТТСАТСААСООСТТСАОААОТААСССС (ЗЕф ГО N0:362)
ОТОСАООСССТСОТОСТСАТАТТТТСССТОО (8Еф ГО N0:363)
Т243О
Τ243Ν/Ν100
ОААОТОАТТСТТТСАТСААСОСАСТСАСААОТААСОССААТТАТС (8Еф
ГО N0:364) указанные выше праймеры, используемые совместно
Клетки Е.со11 ХЬ10-Со1б (8!га!адеие, Ьа бо11а, СА) трансформировали, и полученные очищенные плазмидные препараты секвенировали для подтверждения правильного внесения мутаций.
Экспрессия и анализ
Препараты плазмидной ДНК, содержащие правильные мутантные формы или ОЛТ 4978 дикого типа, трансформировали в экспрессирующего хозяина ВЬ21(ПЕ3) Е. сой (Nоνадеη, Маб1кои, \·¥Ι). Культуры выращивали с использованием протоколов, описанных выше, плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах Р1адеи (Р1адеи, Уа1еис1а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения наличия вставки.
Индукцию гена ИААТ, как правило, проводили в среде ЬВ, содержащей канамицин (50 мкг/л). Клетки выращивали до 0Ибоонм 0,4-0,8 при 37°С, индуцировали посредством 0,1 мМ ГРТС (изопропилтиогалактозид) и проводили забор образцов через 3-4 ч после индукции.
Клеточные экстракты получали с помощью реагента ВидВик!ег и нуклеазы Ве^опаке (Nоνадеη, Маб1кои, ^Ι). Анализы объемом один мл проводили при 30°С при осторожном встряхивании, и он содержал 10,2 мг И-триптофана, 0,05 мМ РЬР, 4 мМ МдС12, 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5, приблизительно 50 мкг альдолазы, 200 мМ пируват и 0,150-0,5 мг/мл И-аминотрансферазы, предоставленной в качестве клеточных экстрактов. Анализы тотального белка проводили с использованием набора для тотального белка Вю-Ваб (Кумасси) (Вю-Ваб, Негси1ек, СА) или набора Р1егсе ВСА (Р1егсе, ВоскГогб, ГЬ), и процентную экспрессию И-аминотрансферазы оценивали посредством 8И8-РАСЕ или автоматизированной системы для электрофореза Вю-Ваб Ехрепои Аи!ота!еб Е1ес!горИогек1к 8ук!ет (Вю-Ваб, Негси1ек, СА). Забор образцов проводили через 3 ч и после ночи.
В-специфичную альдолазу 8Еф ΙΏ N0:28 использовали в анализах приблизительно с 0,150 мг/мл Ώаминотрансферазы.
Первые анализы показали, что следующие мутантные формы (без маркера) обладали активностью в отношении переаминирования (в порядке от наибольшей к наименьшей): 7243^ Т2438, Т243N/N100А, N100А. Также было отмечено, что, как оказалось, Т243N повышает стереомерную чистоту образованного В,В-монатина. Анализы повторяли с использованием очищенной альдолазы РгоА Сотатоиак !ек!ок!егош (100 мкг/мл) и 0,50 мг/мл мутантных форм ϋ-аминотрансферазы (без маркеров, предоставленных в качестве клеточных экстрактов). Забор образцов проводили через 2 ч и после ночи. Результаты для активных белков представлены ниже, дублированные результаты усредняли. % В,В-монатина определяли с помощью площади пика на обращенно-фазовой ВЭЖХ, а затем измеряли с использованием способа образования производных РИАА, описанного в примере 1. В столбце 3 табл. 31, для некоторых реакций
- 177 019971 проводили дополнительный анализ образования производных посредством ГЭАА посредством ЬС/МЛ/МЛ, как описано в примере 1, и эти результаты показаны в скобках. Только К,К и Л,К-монатин образуются из Ό-триптофана. Оказалось, что мутантная форма Т243К не образует монатин в тестируемых условиях, и мутантная форма Т243А образовывала очень низкие уровни монатина.
Таблица 31
Фермент без маркера (время - ч или после ночи) Тотальный монатин (м.д.) % К,К
4978 дикого типа (2 ч) 4,7 41,6
4978 дикого типа (после ночи) 43,2 35,1 (30,9)
Т2438 (2 ч) 55,0 37,4 (21,7)
Т2438 (после ночи) 97,7 35,5 (29,8)
Τ243Ν (2 ч) 73,2 86,7 (88,3)
Τ243Ν после ночи 120,9 86,3 (86,1)
Ν100Α (2 ч) 12,0 40,8
N100А (после ночи) 22,3 41
Т243А (2 ч) 0,8 -100
Т243А (после ночи) 1,3 -100
Несмотря на то что анализы проводили, оценивая процентное количество Ό-аминотрансферазы с использованием программного обеспечения Вю-Каб Ехрепоп, понятно, что мутантные формы Т243Л и Т243N обладали повышенной активностью по сравнению с ферментом дикого типа. Мутантная форма Т243N также обеспечила дополнительное преимущество значительного повышения % образованного К,К-монатина. Этот фермент оказывает повышенное предпочтение для К-МР по сравнению с Л-МР в реакциях переаминирования. Мутантная форма N100Α не повышала активность отдельно или в сочетании с Т243N в противоположность тому, что предполагалось в литературе. Мутантную форму ЭАТ 4978 без маркера с сайт-направленной мутацией У34А также создавали с использованием сходных способов, как описано выше. Было выявлено, что в тестируемых условиях мутантная форма с сайт-направленной мутацией У34А обладает значительно меньшей активностью, чем фермент дикого типа.
Другой интересной особенностью первоначальных анализов было то, что фермент дикого типа, как оказалось, обладал большей активностью, когда его получали с N-концевым Н1к-маркером. Последующий мутагенез проводили для варианта гена с маркером. Кроме того, наиболее перспективные мутантные формы из представленных выше субклонировали в рЕТ28Ь, который обладал N-концевым Н1кмаркером. Их очищали с использованием колонок связывающих НК Nονадеη и протокола изготовителя с рекомендованными буферами ^оуадеп, Майкоп, \·\Ί). Буфер фракции элюента заменяли с использованием колонок СЕ Неа1!йсаге ΓΌ10 (ОЕ Неа1!йсаге, Р1кса!ахау, N1) на буфер, используемый в анализах.
Анализы объемом один мл с очищенной Ό-аминотрансферазой (0,5 мг/мл) и очищенной Кспецифичной альдолазой ЛЕР ΙΌ N0:276 (50 мкг/мл) проводили при 30°С при осторожном встряхивании, и он содержал 10,2 мг Ό-триптофана, 0,05 мМ РБР, 200 мМ пирувата, 4 мМ МдС12 и 100 мМ фосфатно-калиевый буфер рН 7,5. Дублированные образцы инкубировали в течение 2 ч и в течение ночи. В качестве положительного контроля использовали ОАТ ВасШик крйаепсик (клонированную по примеру 7) в тех же анализах. Результаты представлены в таблице 32.
Таблица 32
Фермент без маркера (время: ч или после ночи) Тотальный монатин (м.д.) % К.,Е
4978 дикого типа (2 ч) 43 98,4
4978 дикого типа (после ночи) 96,7 98,3 (95,9)
Τ243Ν (2 ч) 197,5 100
Τ243Ν после ночи 301,2 99,9 (99,6)
В. зркаепсиз ΌΑΤ (2 ч) 58,2 99,7
В. зркаегкиз ΌΑΤ (после ночи) 221,7 98,7 (96,6)
Т243() (2 ч) 7,1 100
Τ243ζ> (после ночи) 12,4 98,8
Представленные выше данные показывают, что мутантная форма Т243И очевидно, образует наибольшее количество монатина через 2 ч. С течением времени соотношение для мутантной формы Т243N и положительного контроля ОАТ В. крйаепсик снижается. Этот результат подтверждает, что мутантная форма Т243N не настолько стабильна в процессе реакции образования монатина, как ОАТ В. крйаепсик. При анализе в сходных условиях фермент Т243Л (очищенный, с маркером) обладал сходными уровнями активности с мутантной формой Т243^ однако процентное количество образованного К,К-монатина
- 178 019971 было ниже (97,2% как через 2 ч, так и после ночи). Мутантная форма Т243N/N100А обладала меньшей активностью, чем мутантная форма Т243N. Однако как Т2438, так и Т243N/N100А обладали более высокой активностью, чем О.АТ 4978 дикого типа.
Анализы переаминирования проводили для определения того, скорости каких реакций улучшались при использовании мутантной формы Т243N вместо О.АТ В. крНаепсик. Анализы объемом половина мл проводили при 30°С 1, 2 и 5 ч. Анализируемые образцы содержали 25 мМ монатин или Ό-триптофан, 25 мМ пируват, 100 мМ фосфат калия рН 7,5, 50 мкМ РЬР и 0,1 мг Ό-аминотрансферазы (с маркером, очищенной). В случае, когда использовали менее 100 мкг ОАТ, количество аланина нормализовали к 100 мкг Ό-аминотрансферазы. Образцы обрабатывали муравьиной кислотой и анализировали посредством ЬС-0РА в отношении наличия копродукта, аланина. Результаты представлены в таблицах 33 и 34.
Таблица 33. Активность в отношении переаминирования с К,К-монатином в качестве субстрата
Фермент Ο-аланин (мМ)
ΌΑΤ 4978 дикого типа(2 ч) 0,54
ΌΑΤ4978 дикого типа (5 ч) 1,11
Τ243Ν/Ν100Α (2 ч) 1,32
Τ243Ν/Ν100Α (5 ч) 2,78
Т2438 (2 ч) 1,5
Т2438 (5 ч) 2,61
Τ243Ν (2 ч) 1,26
Τ243Ν (5 ч) 2,65
В. хркаенсих ПАТ (2 ч) 0,97
В. хр’паенсих ПАТ (5 ч) 2,2
Таблица 34. Активность в отношении переаминирования с Ό-триптофаном в качестве субстрата
Фермент ΰ-аланин (мМ)
ΏΑΤ 4978 дикого типа (1 ч) 4,55
ϋΑΤ 4978 дикого типа (2 ч) 8,47
Τ243Ν/Ν100Α (1 ч) 8,52
Τ243Ν/Ν100Α (2 ч) 12,67
Т2438 (1 ч) 4,89
Т2438 (2 ч) 8,1
Τ243Ν (1 ч) 7,19
Τ243Ν (2 ч) 10,83
В. зрИаегкиз ϋΑΤ (1ч) 8,7
В. зрИаепсиз ϋΑΤ (2 ч) 12,54
Для реакций с Ό-триптофаном результаты показывают, что некоторые из ферментов достигали равновесия через 2 ч. Реакции с К,К-монатином, очевидно, являются скорость-лимитирующими, и повышение этой активности окажет наибольшее влияние на скорости образования из Ό-триптофана.
Дальнейшие анализы проводили для исследования стабильности мутантной формы О.АТ 4978 Т243N. Фермент дикого типа также теряет активность с течением времени. В примере 27 описаны способы повышения стабильности мутантной формы Ό-аминотрансферазы Т2 43^ При получении свежих немаркированных и маркированных вариантов мутантной формы Т243N и сравнении их в отношении активности, было выявлено, что немаркированный вариант обладает лучшей временной стабильностью, что приводит к тому, что в целом он является лучшим вариантом фермента для применения в реакциях образования монатина.
Дополнительные мутантные формы О.АТ 4978 получали способами, широко известными специалистам в данной области. Однако все эти мутации приводили к белку, который был нерастворим в условиях, в которых его получали, и таким образом его нельзя было анализировать в отношении активности. Мутации, которые приводили к нерастворимому белку, представляли собой:
8180А/8181А/8182К;
Ь151Р;
У34О;
8181К;
А153К/8181А/8182А;
А153К/8182А;
А153К/8182О;
8180К/8181А/8182О;
8180К/8181А/8182А;
8180К/8181О/8182О;
8180О/8181К/8182О; и
8180А/8181К/8182А.
- 179 019971
Дополнительный мутагенез
Для получения мутантной формы [).АТ 4978 Е200М амплифицировали открытую рамку считывания [).АТ 4978 дикого типа по примеру 25 (с маркером) с помощью праймеров 73 и 80 (ниже) и ДНКполимеразы РГиТигЬо 1)\.А Ро1утегазе (8!га!адспс, ка 1о11а, СА) и клонировали в рСКП-В1ип! Дпуйгодеп, Саг1зЬа4, СА). Ее последовательность проверяли (Адспсоиг!, Всусг1у, МА). 5'- и 3'-участки амплифицировали с использованием праймеров 80 и 96 и 99 и 103 соответственно. Затем амплифицированную ДНК очищали из геля с использованием набора для экстракции из геля (Дадего ОкАлцнск Ое1 Ех!гас!юп К1! ((Дадеп, Уа1спс1а, СА). Амплифицированную ДНК вновь подвергали ПЦР с использованием праймеров 80 и 99. Амплифицированную ДНК выделяли из геля, как описано выше, и клонировали в рСКП В1ип!, и его последовательность проверяли. Открытую рамку считывания [).АТ субклонировали в качестве фрагмента рестрикционного расщепления NάсI/XЬοI в рЕТ28Ь.
Таблица 35
Номер праймера Последовательность
73 САТАТ0А6ТТАТАССТТАТС0ААТСАССАААТТСТ0ААТС (8ЕЦ ГО N0:365)
80 СТСОАСТОСООССОСААОСТТОТСОАСОСАССТС (8Еф ГО N0:366)
96 ААТАТТТАТСОААТТАААСАТОСССТАТТАТАСАСАСАТССАОССААТААСАТОАТСТТАААТ С0ТАТТАСАССТСАА0ТААТСАТТАААТ6Т6С (8Еф ГО N0:367)
99 00ССА0ТСААТТ6ТААТАС0АСТСАСТАТА000С (8Еф ГО N0:368)
103 СОССАТСТТТААТТССАТАААТАТТТСААОААОАОССТТСТС (ЗЕЦ ГО N0:369)
Следующие праймеры конструировали для дополнительного сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза РшкСйапдсВ Ми1!1 811с-[)исс1еч1 Ми!адспсз1з К1! (81га1адспс, ка .1о11а, СА). Мутагенез проводили с использованием набора 8!га!адспс Ми1!1-Сйапдс к1! (81га1адспс, ка .1о11а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Матрица, используемая для мутагенеза, представляла собой конструкцию 1).АТ 4978 рЕТ28 (с маркером), описанную в примере 25. Также получали двойную мутантную форму с использованием мутантной формы Ε200Υ в качестве матрицы и проведением дополнительного цикла мутагенеза с праймером Т243N (приведенным выше).
Таблица 36
Мутантная форма Олигонуклеотид
141-ЬКсО-144 -> ЕУсУ 0СААСАТТТСТА0АА6АСАТТС0ТТ000ААТАСТ6ТТАСАТТАААТСАТТА ААТТТАСТТОСТОСО (8Еф ГО N0:370)
Ρ200Υ СТАТТАТАСАСАСАТССАСССААТААСТАСАТСТТАААТССТАТТАСАССТ СААО (8Еф ГО N0:371)
8244К 0СААТ00АТ0АА0Т0АТТ0ТТТСАТСААС0АСТААА6АА0ТААС0ССААТ ТАТССАСАТАОАТО (8Е0 ГО N0:372)
243-Т8-244 -> ΝΚ 6СААТС6АТСААСТ6АТТСТТТСАТСААССААТАААСАА6ТААС6ССААТ ТАТССАСАТАОАТО (8Е0 ГО N0:373)
243-Т8-244 -> ΝΚ ССААТССАТСААСТСАТТСТТТСАТСААСОААТССТСААСТААСОССААТ
I____________________[ТАТССАСАТАОАТО (8Е() ΙΡ N0:374)_________________________________|
Кодирующие мутантную форму участки проверяли посредством секвенирования ДНК (Адспсоиг!). Плазмиды с проверенной последовательностью трансформировали в клетки ВЕ21(ОЕ3) (^ма^сп, МаШзоп, νΙ).
Экспрессия и анализ
Культуры, содержащие 100 мл ЕВ с 50 мкг/мл канамицина, в 500-мл флаконе с перегородками инокулировали посредством одного мл ночной культуры и выращивали при 37°С до оптической плотности (при 600 нм) приблизительно 0,6. Продукцию белка индуцировали посредством ЩТО в конечной концентрации 1 мМ. Клетки инкубировали при 30°С в течение 4,5 ч после добавления !РТО. Клетки центрифугировали и замораживали при -80°С. Клетки разрушали (с использованием реагента Аомадсп ВидВиз!сг (^уад^, Май1зоп, νΙ), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз ΙΙ и 0,033 мкл/мл гкузохутс в соответствии с рекомендованным Аомаде'п протоколом) и анализировали посредством 8О8-РАОЕ. Мутантные формы (141-ЕКсО-144 -> ЕΥсΥ) и (243-Т8-244 -> NК) приводили к нерастворимым белкам в условиях, в которых их получали. Мутантная форма 243-Т8-244 -> NК не обладала поддающейся количественному определению активностью в тестируемых условиях и, вероятно, представляет собой фермент со слабой активностью по сравнению с диким типом, также как и мутантная форма 8244К.
Белки с Н1з-маркером очищали следующим образом. Колонки для связывания Ш8 (Аомаде'!], МаШзоп, νΙ) уравновешивали посредством 10 мл 100 мМ фосфата калия, рН 7,8, содержащего 200 мМ АаС1 и 50 мкМ РЕР. Бесклеточные экстракты помещали в колонку. Колонки промывали 10 мл буфера для уравновешивания, 10 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, и 10 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол. Белки элюировали 5 мл буфера для уравновешивания,
- 180 019971 содержащего 500 мМ имидазол. Белки подвергали обессоливанию с использованием колонок РО10, которые уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8, содержащим 50 мкМ РЬР. Очищенные белки концентрировали и количественно определяли с использованием анализа Брэдфорд (Вю-Ваб, Негси1ек, СА).
Мутантные формы Ό-аминотрансферазы анализировали с использованием для анализируемых условий 500 мкг/мл Ό-аминотрансферазы, 50 мкг/мл альдолазы 8ЕЕ) ГО NО:276, 4 мМ МдС12, 50 мМ фосфата калия рН 8, 200 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ РЬР и 20,4 мг/мл Ό-триптофана. Конечный объем составлял 1,25 мл. Образцы (200 мкл) отбирали через 0,5, 1, 2 и 14 ч и замораживали до завершения эксперимента. Образцы фильтровали, разбавляли от 1 до 10 раз, и анализировали посредством БС/М8/М8, как описано в примере 1.
Ό-аминотрансферазу 4978 дикого типа из примера 25 использовали в качестве эталона для процентной относительной активности. В табл. 37 представлена относительная активность каждой мутантной формы в каждый момент времени.
Таблица 37
ϋ-аминотрансфераза Время (ч) % активность
4978 дикого типа 0,5 100
Τ243Ν 0,5 270
Р200М 0,5 50
Ρ200Υ 0,5 70
Ρ200Μ/Τ243Ν 0,5 183
8244К 0,5 4
4978 дикого типа 1 100
Τ243Ν 1 289
Р200М 1 55
Ρ200Υ 1 81
Ρ200Μ/Τ243Ν 1 203
8244К 1 6
4978 дикого типа 2 100
Τ243Ν 2 266
Р200М 2 51
Ρ200Υ 2 79
Ρ200Μ/Τ243Ν 2 185
8244К 2 6
4978 дикого типа 14 100
Τ243Ν 14 254
Р200М 14 56
Ρ200Υ 14 80
Ρ200Μ/Τ243Ν 14 168
8244К_______________________ 14 [_________8 |
Τ243N была наилучшей среди всех тестируемых мутантных форм с точки зрения активности в отношении образования В,В-монатина.
Пример 27. Стабилизация мутантной формы Τ243N Ό-аминотрансферазы из штамма АТСС 4978.
Как представлено в примере 25, первоначальная активность мутантной формы ОАТ Τ243N значительно превышает Ό.ΑΓ В. крйаепсик, однако эта активность снижается более быстро. Дополнительные эксперименты с использованием анаэробного протокола, описанного ниже, показали, что первоначальная активность мутантной формы Ό.ΑΓ Τ243N вплоть до 8 раз превышала активность Ό.ΑΓ В. крйаепсик, однако эта активность быстро снижалась в анаэробных условиях. Следующие исследования проводили для достижения большей активности в отношении монатина в течение длительного периода времени.
Мутантную форму Ό-аминотрансферазы Τ243N из штамма 4978 (описанного в примере 25) и альдолазу НМС 8. теШой очищали в качестве белков с Ш8-маркером, как описано ниже. Альдолазу 8ЕО ГО NО:276 очищали, как описано в примере 23.
Очистка О.АТ из АТСС 4978 (мутантная форма Т243^
Мутантную форму Τ243N Ό-аминотрансферазы из штамма АТСС 4978 с Ν-концевым маркером для очистки Н!86 (описанную в примере 26) получали с использованием системы для экспрессии Е\1П ВюкШепсек О\'елшд111 Ехргекк 8ук!ет II (растворы 1-6) (Nονадеη, Маб1коп, \\'Е), содержащей 50 мкг/мл канамицина, во встряхиваемых колбах. Эта экспрессирующая система индуцирует экспрессию индуцируемых посредством П’ТС систем без необходимости в мониторинге роста клеток. После инокуляции 200мл аликвот среды (в 1-л флаконах) либо из жидких культур, либо из планшетов с хозяином ВЕ21(ОЕ3) Е. сой, обладающим геном мутантной формы Ό-аминотрансферазы Τ243N из штамма АТСС 4978 в плазми
- 181 019971 де рЕТ28Ь, культуры инкубировали при 30°С в течение ночи при встряхивании 225 об/мин. Когда 0Ό600[Ι,, достигала минимум 6, клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.
Бесклеточный экстракт получали с использованием реагента для экстракции ЕМО Вюкиеисек ВидВик1е® (не содержащего первичные амины) Ех1гас11ои ВеадеиГ (Штадеи, Май1кои, νΙ), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы Веихоиаке® МсКаке, 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго1еаке ИНнЬНог СоскГаП 8е1 ΙΙ (Са1ЫосНет - NονаЬ^οсНет Согр., 8аи О|едо, СА) и 0,033 мкл/мл гБукохуте™ в соответствии с протоколом изготовителя. Все последующие стадии очистки проводили при 4°С. Клеточный экстракт центрифугировали в течение 20-30 мин при 15000хд для удаления клеточного дебриса. Аликвоту бесклеточного экстракта объемом 20-25 мл наносили на 45-мл колонку СЕ НеаННсаге СНе1аГшд 8ерНагоке™ Еак1 Е1о\г гекш (форма никеля (ΙΙ)) (СЕ НеаННсаге, Р|кса1а\\'ау, N1), которую перед этим уравновешивали 100 мМ фосфатом калия, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Для получения формы смолы с никелем смолу промывали 150 мл 200 мМ гексагидратом сульфата никеля (ΙΙ), а затем 150 мл дистиллированной воды. После загрузки образца колонку промывали/элюировали посредством 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 25 мМ имидазол, 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 50 мМ имидазол, и 150 мл буфера для уравновешивания, содержащего 500 мМ имидазол. Белок с маркером Ш86 элюировался при последнем промывании. Смыв, полученный посредством 500 мМ имидазола, концентрировали посредством центробежных фильтров М1Шроге/Ат1сои СеиНгсои Р1ик-70 ^ν№ 10 кДа) (М1Шроге, В111ег1са, МА) до 15-20 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки СЕ НеаННсаге РЭ10 (СЕ НеаННсаге, Р|кса1а\\'ау, N1) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 100 мМ фосфатом калия, рН 7,8, содержащим 0,5 мкМ РЬР. Очищенную аминотрансферазу элюировали посредством 3,5 мл на колонку того же буфера. Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе ВСА (Р1егсе, ВоскГогй, ГО) с В8А в качестве белкового стандарта.
Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии в бесклеточном экстракте определяли с использованием микрокапиллярной системы чипов Вю-Вай Ехрепои (В1о-Вай, Негси1ек, СА) или с использованием гелей В1о-Вай с 4-15% градиентом 8П8-полиакриламид, разделяемых в камере М1ш РВ0ТЕАК® 3 (ВюВай, Негси1ек, СА). Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием окраски Кумасси Вю-Вай Вю-8аГе С-250 (Вю-Вай, Негси1ек, СА), и окраску удаляли водой. Как правило, этот способ приводит к ~20 мг фермента из 200 мл ночной культуры, который является на 85-95% чистым, при определении с помощью программного обеспечения Ехрепои или посредством анализа гелей 8О8-РАСЕ. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения.
Очистку альдолазы 8Еф ΙΌ N0:276 проводили, как описано в примере 23.
Очистка альдолазы НМС 8. теШоН
Альдолазу НМС 8. теШоН с Жконцевым маркером для очистки Ш86 (клонирование описано в опубликованной заявке США № 20040063175 и ν0 03091396 А2) получали индукцией культур, выращенных в бульоне Луриа-Бертани, содержащем 50 мг/л канамицина с 0,2 мМ ГРТС. После инокуляции 800-мл аликвот среды либо из жидких культур, либо из планшетов с хозяином ВЬ21(ОЕ3) Е. соН, обладающим геном альдолазы НМС 8. теШоН в рЕТ30 (Ха/ЫС), культуры инкубировали при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Когда оптическая плотность достигала 0Э600НМ 0,5-0,75, добавляли ГРТС, и культуры инкубировали при 30°С при встряхивании 225 об/мин в течение 4 ч. Клетки собирали центрифугированием и промывали один раз буфером.
Для получения бесклеточного экстракта, содержащего альдолазу 8. теШоН, клетки суспендировали в 3-4 объемах 50 мМ ЕРР8 (Ж(2-гидроксиэтил)пиперазин-Ы'-(3-пропансульфоновой кислоты), рН 8,2, содержащей 100 мМ №С1, а затем разрушали с использованием гомогенизатора МкгоГГшйкк (МкгоГГи1й1ск, Nеν1οη. МА) (3 прохождения при 18000 фунт/кв.дюйм (1235х105 Па)), при поддержании температуры суспензии менее 15°С. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 20-30 мин при 1500020000хд для удаления клеточного дебриса. Белок с Ш86-маркером очищали с использованием колонок ЕМО Вюкаеисек НК-Вшй® (Штадеи, Май1кои, νΙ) в соответствии с рекомендованным изготовителем протоколом с одним исключением, колонки промывали раствором буфер для связывания:буфер для промывания 1:1 вместо буфера для промывания отдельно. Элюированную фракцию концентрировали с помощью 15-мл центробежных фильтров М1Шроге/Ат1сои (^νΟΌ 5 кДа) (М1Шроге, ВШепса, МА) до 7-10 мл в соответствии с инструкциями изготовителя. Имидазол и хлорид натрия удаляли пропусканием через одноразовые колонки СЕ НеаННсаге РЭ10 (СЕ НеаННсаге, Р|кса1а\\'ау, N1) (2,5-мл образец на колонку), предварительно уравновешенные 50 мМ ЕРР8, рН 8,2, содержащим 100 мМ №С1. Очищенную альдолазу элюировали тем же буфером в количестве 3,5 мл на колонку. Концентрацию белка в каждой фракции определяли с использованием набора для анализа Р1егсе ВСА (Р1егсе, ВоскГогй, ГО) с использованием В8А в качестве белкового стандарта.
Чистоту каждой фракции и уровень экспрессии во фракции бесклеточного экстракта определяли с использованием 8О8-полиакриламидных гелей Вю-Вай с градиентом 4-15% (Вю-Вай, Негси1ек, СА), разделяемых в устройстве с емкостью М1ш РВ0ТЕАN® 3. Белок визуализировали в полиакриламидных гелях с использованием краски Кумасси Вю-Вай Вю-8аГе С-250 (Вю-Вай, Негси1ек, СА), и краску удаля
- 182 019971 ли водой. Как правило, этот способ приводит к ~15-20 мг фермента из 800 мл культуры, и он является на 85-95% чистым. Аликвоты (1-5 мл) очищенного фермента хранили при -80°С до применения.
Анализы образования монатина
Из конических пробирок из полипропилена (14 мл), содержащих 143 мг Ό-триптофана, удаляли кислород в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы 1 М буфера Ε₽₽8 (рН 8,2), 2 М МдС12; 2 М пирувата натрия и 10 мМ РЬР получали в дегазированной воде и уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе в течение ночи. Исходные растворы 10% (об./об.) Т\ееп 80, 1% (об./об.) Т\ееп 20, 1% (об./об.) Тп1оп Х-100, 100% ацетона, 100% этанола и 50% (мас./об.) глицерина уравновешивали в анаэробном перчаточном боксе совместно с 0,7 г каждого из трегалозы, инозитола, сорбита и эритрита в 2-мл микроцентрифужных пробирках. Препараты очищенных ферментов размораживали на льду и сразу использовали в анаэробном перчаточном боксе. Исходные растворы добавляли в 14-мл конические пробирки для достижения конечной концентрации 100 мМ ΕРР8, 200 мМ пирувата, 100 мМ триптофана, 1 мМ МдС12, 0,05 мМ РЬР, 0,5 мг/мл Ό-аминотрансферазы и 0,01 мг/мл альдолазы 8ΕΡ ΙΌ N0:276 или альдолазы НМО 0,05 мг/мл 8. теШой. Предполагаемые стабилизирующие фермент компоненты добавляли при различных конечных концентрациях (табл. 38 и 39) для доведения конечного объема реакции до 7 мл на пробирку. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в анаэробном перчаточном боксе при осторожном перемешивании в течение вплоть до 24 ч. Периодически проводили забор образцов и анализировали их в отношении монатина, как описано в примере 1, с использованием способа множественного мониторинга реакции посредством ЙС/М8/М8. Исходные скорости вычисляли в образцах, отобранных в 0 момент времени и через 3 ч после добавления фермента.
Таблица 38
Добавка Кратность повышения первоначальной скорости образования монатина Кратность повышения конечного титра монатина (20 ч)
Отсутствует 1,0 1,0
0,01% (об./об.) Ттаеп 80 1,3 1,4
0,1% (об./об.) Τχνεεη 80 1,3 1,5
0,01% (об./об.) Тм/ееп 20 1,1 1,5
0,01% (об./об.) ТпЮп Х-100 1,1 1,2
5% (об./об.) Ацетон 0,4 0,3
5% (об./об.) Этанол 0,7 0,5
1% (масс./об.) Глицерин 1,9 1,1
5% (масс./об.) Глицерин 1,4 1,4
10% (масс./об.) Глицерин 1,1 1,7
10% (масс./об.) Трегалоза 1,0 1,3
10% (масс./об.) Инозитол 1,3 1,5
10% (масс./об.) Сорбит 1,1 1,3
10% (масс./об.) Эритрит 0,8 1,0
Таблица 39 (Альдолаза 8ΕΡ ΙΌ N0:276)
Добавка Кратность повышения первоначальной скорости образования монатина Кратность повышения конечного титра монатина (22 ч)
0,01% (об./об.) Ттаеп 80 1,0 1,0
1% (масс./об.) Глицерин 1,2 0,9
5% (масс./об.) Глицерин 1,5 1,5
10% (масс./об.) Глицерин 1,7 2,1
Добавление детергента 0,01%-0,1% (об./об.), такого как Тп1оп Х-100, Т\ееп 20 или Т\ееп 80, или 110% (мас./об.) полиола, такого как глицерин, трегалоза, инозитол или сорбит, повышало стабильность Όаминотрансферазы Τ243N на протяжении эксперимента.
Пример 28 А. Клонирование рацемазы аминокислот Рзеийотопаз риййа КТ2440 φΑΗ).
ВΑК идентифицировали в КТ2440 Р. риййа с использованием информации из литературы (Ко1зе, Ό., 8ойа, К., Уад1, Т., Ша1зсй, СТ., Вюсйет1з1гу 23, 5195-5201, (1984)). Активный центр фермента ВΑК из Р. з1па1а отсеквенировали и представили - ^ΤΑV^ΚΑ^ΑΥОXОIО^ (8ΕΡ ΙΌ N0:375). Эту последовательность использовали для проведения В^Α8Τ геномной последовательности КТ2440 Р. риййа, доступной в NСВI. Был идентифицирован белок практически с идентичной консенсусной последовательностью. Конструировали праймеры для клонирования гена из геномной ДНК, полученной из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапаззаз, νΑ) (5'-ΑОΑΑОΑСΑΤΑΤОСССΤΤΤСОССОΤΑООО-3' (8ΕΡ ΙΌ N0:376 и 5'-ΑОΑΑОΑООΑΤССΤСΑОΤСОΑСОΑОΤΑΤСΤΤСО-3') (8Ερ ΙΌ N0:377)).
ПЦР проводили в стандартных условиях, и продукт ПЦР очищали (набор для очистки продуктов ПЦР Р^дшск, Р1адеп, Vа1еηс^а, СΑ). Очищенный продукт ПЦР расщепляли посредством NйеI и ВатНТ Расщепленный продукт ПЦР выделяли из геля (набор для выделения из геля р^дшск Ое1 Εxί^асί^οη К|1,
- 183 019971
01адеп, Уа1епс1а, СА) и лигировали в рЕТ30 и рЕТ28, расщепленные и очищенные из геля сходным образом. Клоны со вставками секвенировали (Адепсоиг!, Веуег1у, МА), и идентифицировали изоляты с правильной последовательностью (рЕТ30 КТ2440 ВАЯ и рЕТ28 КТ2440 ВАЯ) и использовали в последующих исследованиях. Последовательность ДНК КТ2440 ВАЯ представляет собой:
а’ЬдсссЬЬРсдссд'ЬасссЬЬсЬддс'Ьдса’Ьссс'ЬддсасЬ’ЬсЬдаЬсассддасадд ссссссЬдЬаЬдсддсассассдЕЬдЬсдаЬддасаасддсассаасасссЬдассдЬдсааа асадсаайдссЬдддЬсдаадЬсадсдссадсдсссЬдсадсасааса'ЬссдсасдсЬдсадд ссдадсЬддссддсаад’кссаадсЬд'ЬдсдссдЬдс’ЕсааддссдаЬдссЕа’ЕддссасддЕа ЬсддссЬддЬааЬдссаРсдаЬсаЬсдсссааддсдЬдсссйдсдЬддсддЬддссадсаасд аддаддсссдсд'ЬддЬссдсдссадЬддс'ЬЬсассдддсаасЬдд'ЬдсдддЬасдссЬддсса дссАсадсдадсЬддаадаЬддскЬдсадЬасдасаЬддаададсГддЪдддсадсдсддааЪ ЬЬдсссдссаддссдаЬдссаЬсдссдсдсдсса'Ьддсаадасс'ЬЬдсдсаЬ'Ьсаса'Ьддсдс ЬсаасЬссадсддсаЬдадссдсаасддддЬддадакддссассЬддЬссддссдЬддсдаад сдсЬдсада'ЬсассдассадаадсассЬсаадсЬдд'ЬсдсдсЬдаЬдасссасЕ'ЬсдссдЬдд аадасааддасдакдЬасдсаадддссЬддсддсак ЬсаасдадсадассдасЬддк-ЬдаРса адсасдссаддс'ЬддассдсадсаадсЬсасссЬдсасдссдссаасЬсдЬЬсдсЬасдсЬдд аад'кдссддаадсдсдссЬддасаЬддЬасдаасдддЬддсдсдсЬд'кк.сддсдасассдЬдс сддсдсдсассдадкасааасдЬдсдакдсадкίсаааЬсдсасдЬддсддсддйдсасадск аЬссддссддсаасассд’ЬдддсЬаЬдассдсассЬЬсасссЬддсссд'Ьда'ЬЬсдсддсЬдд ссаасаЬ'ЬасддЬсддд'ЬасЬссдаЬддсЬассдссддд'ЬаЬЬсассаасаадддссаЬд’Ьдс кдаксаасддссассдЬдкдссддЬсдЬдддсааддЬдксдакдаасасдсЬда'ЬддЬсдаЬд ЬсассдасЬЬсссЬдакдЬдааддддддЬаасдаадЬддЬдсЬдЬЬсддсаадсаддссдддд дсдааайсасссаддссдадакддаадаааЬсаасддсдсдкίдсксдссдакЬЕдкасассд 'Ьа'ЬддддсааЬ'ЬссаасссдаадаЬасЬсдЬсдасЬда (5Е0 Ш N0:378).
Аминокислотная последовательность КТ2440 ВАЯ представляет собой:
Мр£ггк.11ааз1а111Ьддар1уаарр1зтбпдкпЫЬудпзпамуеузаза1дйп1г
ЫдаеЬадкзкбсауЬкабаудйдбдЕутрзЫаддурсуауазпееагуугаздЕкддХугу г1аз1зе1ебд1дубтее1удзае£агдаба1аагйдкЫг1йта1пзздтзгпдуетакизд гдеа1д1'кс1дкН1к1уа1т'кП£ауебкббугкд1аа£пед1:с1м1±кйаг1бгзк1-Ыйаапз£ аЫеуреаг1с1туг1:дда1£дсЙ:урагкеукгатд£кзЙуаауНзурадп1:удус1гк£1:1агс1 зг1ап1кудузс!дуггу£кпкд?1У11пдйгуруудкузтпЫтус1уЬ0£рдукддпеуу11:дк дадде1Ьдаетее1пда11ас11уЬуидпзпрк11Ус1 (5Е0 Ш N0:379).
В) Очистка КТ2440 ВАЯ Р. Рийба.
Плазмиду рЕТ30 КТ2440 ВАЯ, описанную выше, трансформировали в В1.21ОЕ3 рЬук5 (Тпуйгодеп Саг1кЬаб, СА). Полученный штамм выращивали в 1.В или в бульоне Тетйс ВгоГй при 37°С с аэрацией до 006оонм 0,4-0,6 и индуцировали посредством 1 мМ ГРТО. Инкубацию продолжали 3-4 ч при 37°С с аэрацией. Клетки собирали центрифугированием и клеточный осадок хранили при -80°С до применения. Клеточный осадок размораживали на льду. Клетки лизировали посредством ВидВикГег (Хоуазеш Маб1коп, νΙ) и Веп7опаке (Nоνадеπ, Маб1коп, νΙ). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, и бесклеточный экстракт либо сразу использовали, либо хранили при -80°С. Ген КТ2440 ВАЯ также клонировали в участки ШеТ-ВатЫ в рЕТ28 и трансформировали в В1.21 1)Е3 рЬук5. Оказалось, что эта конструкция не экспрессирует растворимый белок с высокой эффективностью, так что в последующих исследованиях использовали немаркированный вариант (рЕТ30 КТ2440 ВАЯ).
Экстракт наносили на колонку ЦпоО (Вю-Яаб, Негси1ек, СА), уравновешенную по меньшей мере 5 объемами колонки буфера А (25 мМ фосфат калия рН 8,0, 10 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР)). Колонку промывали 2 объемами колонки буфера А. Белок элюировали линейным градиентом буфера В (буфер А + 1 М №С1) из 0-100% буфера В в 20 объемах колонки, и с момента начала градиента собирали фракции объемом 5 мл. Фракции анализировали с использованием способа Атр1ех Яеб, описанного в 7 части 4 примера. В кратком изложении, 100 мкг оксидазы Ό-аминокислот (51дта-А1бпсй, 51. Ьошк, МО), 0,05
- 184 019971 мМ ГАО, 25 мМ Е-1гр и небольшой объем фракции, подлежащей анализу, комбинировали в 50 мкл Н20 и добавляли к 50 мкл буфера для реакции Атр1сх Всб, полученного в соответствии с протоколом изготовителя. Фракции с активностью подвергали обессоливанию с помощью колонки РО-10 (6Ε Нса11йсагс, Р1вса1а^ау, N1) и концентрировали с помощью центробежных концентраторов Аш1соп (МШ1рогс, ВШсгс1а, МА). Очищенный белок хранили при -80°С.
С) Получение и анализ мутантной формы аланинрацемазы У354А ОсоЬасШив вΐса^оΐйс^шорй^1ив с активностью триптофанрацемазы.
Аланинрацемазу ОсоЬасШив вΐса^оΐйс^шорй^1ив дикого типа (8Ε(4 ΙΌ N0:380, представленная ниже) клонировали в рЕТЗО и использовали в качестве матрицы для сайт-направленного мутагенеза для проведения замены У354А. Ген 8ΕΡ ΙΌ N0:380 можно амплифицировать посредством стандартных протоколов ПЦР и клонировать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Ген 8Ε(4 ΙΌ N0:380 также можно реконструировать любым способом, известным специалисту в данной области, таким как способы ПЦР со сборкой, известные специалисту в данной области.
Последовательности ДНК и аминокислот аланинрацемазы ОсоЬасШив вΐса^оΐйс^шорй^1ив дикого типа представлены ниже в качестве 8ΕΡ ΙΌ N0:380:
а^ддасдадк йксассдсда Тасдкдддсд даад1:ддаЫ1 ίддасдссаί
БЕасдасаа'Ь диддадаайί ЕдсдссдЕЛГ. дсйдссддас дасасдсаса
ййаЬддсддй сдкдааддсд аасдссйаЕд дасайдддда ίдίдсаддίд
дсааддасад сдсйсдаадс дддддссйсс сдссйддсдд ίίςσοίίίίί
ддаБдаддсд сТсдсйкйаа дддааааадд ааТсдаадсд ссдайЬсйад
ίίσίсддддс Ызсссдйсса дсйдаБдсдд сдсйддссдс ссадсадсдс
айТдсссйда ссдБдББссд скссдасйдд БТддаадаад сдйссдсссЪ
Тйасадсддс ссйББТссБа ίίΟ3ίίίсса 'Ьк'Ьдаааа'Ьд дасассддса
ТдддасддсБ ЕддадТдааа дасдаддаад адасдааасд ааίсдίадсд
сйдаТЕдадс дссайссдса ί ί ГЩдйдсЫ; дааддддкдй асасдсаίίί
ЕдсдасЕдсд дайдаддкда асассдакйа ίίίίίссБак садίаίассс
дБШсйБТдса саБдсБсдаа БддсБдссдЪ сдсдсссдсс дсίсдίοοβί
ίдсдссааса дсдсадсдйс дсЕссдТЕйс сс№ дассдда сдίίсааίаί
ддйссдсБТс ддсаБТдсса БдТаБдддсБ ίдссссдίсд сссддсаίса
адссдсЪдсй дссдкайсса ББаааадаад οθίίίίсдсЩ ссаίадссдс
сйсдкасасд Бсаааааасй дсаассаддс дааааддίда дсίаίддίдс
дасд-Ьасасй дсдсадасдд аддадйддак сдддасдаЬЕ ссдаίсддсί
айдсддасдд сТддсйссдс сдссБдсадс θσίίίсаίдί сс^д^дас
ддасаааадд сдссдаБкдЕ сддссдсаЕй ίдсаίддасс адίдсаίдаί
ссдссйдссй ддкссдсйдс сддйсддсас дааддίдаса сЩда^дд^
дссаадддда сдаддЕааЕЕ кссаГХдаЕд аίдίсдсίсд ссаίίίддаа
асдаБсаасЬ асдаадйдсс ЕкдсасдаТс адίίβίсдад ίдссссдίаί
ЫгЕБЁБссдс сакаадсдка Баакддаадк дадааасдсс дЕЕддссдсд да (8ΕΡ ΙΌ N0:380).
Кодируемая аминокислотная последовательность аланинрацемазы (ОсоЬасШив вΐса^оΐйс^шорй^1ив) представлена ниже в качестве 8ΕΡ ΙΌ N0:381:
- 185 019971
МеЬ Азр С1 и РЬ .е НЬз Агд А зр Т 'Ьг Тгр АЬа СЬи Уа1 Азр Ьеи
Азр АЬа 11е Туг Азр Азп УаЬ СЬи Азп Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Азр
Азр ТЬг Н13 11е МеЬ АЬа Уа1 Уа1 Ьуз АЬа Азп АЬа Туг СЬу НЬз СЬу
Азр Уа1 СЬп Уа1 АЬа Агд ТЬг АЬа Ьеи СЬи АЬа СЬу АЬа Зег Агд Ьеи
АЬа Уа1 АЬа РЬе Ьеи Азр СЬи АЬа Ьеи АЬа Ьеи Агд СЬи Ьуз СЬу 11е
С1и АЬа Рго 11е Ьеи Уа1 Ьеи СЬу АЬа Зег Агд Рго АЬа Азр АЬа АЬа
Ьеи АЬа АЬа СЬп СЬп Агд 11е АЬа Ьеи ТЬг УаЬ РЬе Агд Зег Азр Тгр
Ьеи С1и С1и АЬа Зег АЬа Ьеи Туг Зег СЬу Рго РЬе Рго 11е НЬз РЬе
НЬз Ьеи Ьуз МеЬ Азр ТЬг СЬу МеЬ СЬу Агд Ьеи СЬу Уа1 Ьуз Азр СЬи
СЬи С1и ТЬг Ьуз Агд 11е Уа1 АЬа Ьеи Не СЬи Агд НЬз Рго НЬз РЬе
Уа1 Ьеи С1и СЬу Уа1 Туг ТЬг НЬз РЬе АЬа ТЬг АЬа Азр СЬи Уа1 Азп
ТЬг Азр Туг РЬе Зег Туг СЬп Туг ТЬг Агд РЬе Ьеи НЬз МеЬ Ьеи СЬи
Тгр Ьеи Рго Зег Агд Рго Рго Ьеи Уа1 НЬз Суз АЬа Азп Зег АЬа АЬа
Зег Ьеи Агд РЬе Рго Азр Агд ТЬг РЬе Азп МеЬ Уа1 Агд РЬе СЬу 11е
АЬа МеЬ Туг СЬу Ьеи АЬа Рго Зег Рго СЬу Не Ьуз Рго Ьеи Ьеи Рго
Туг Рго Ьеи Ьуз СЬи АЬа РЬе Зег Ьеи НЬз Зег Агд Ьеи УаЬ НЬз Уа1
Ьуз Ьуз Ьеи СЬп Рго СЬу СЬи Ьуз Уа1 Зег Туг СЬу АЬа ТЬг Туг ТЬг
АЬа С1п ТЬг СЬи СЬи Тгр 11е СЬу ТЬг Не Рго 11е СЬу Туг АЬа Азр
СЬу Тгр Ьеи Агд Агд Ьеи СЬп НЬз РЬе ΗΪ3 Уа1 Ьеи Уа1 Азр СЬу СЬп
Ьуз АЬа Рго 11е Уа1 СЬу Агд 11е Суз МеЬ Азр СЬп Суз МеЬ Не Агд
Ьеи Рго Шу Рго Ьеи Рго Уа1 СЬу ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг Ьеи 11е СЬу Агд
С1п СЬу Азр СЬи Уа1 11е Зег 11е Азр Азр Уа1 АЬа Агд НЬз Ьеи СЬи
ТЬг 11е Азп Туг СЬи Уа1 Рго Суз ТЬг 11е Зег Туг Агд Уа1 Рго Агд
Не РЬе РЬе Агд НЬз Ьуз Агд 11е МеЬ СЬи Уа1 Агд Азп АЬа Уа1 СЬу
Агд СЬу
(8Ер ΙΌ ΝΌ:381).
Мутагенез проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза РшскСЬапдеМиШ ка1е-б1гес1еб ти!адепек1к кй (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА). Для проведения замены У354А использовали следующий мутагенный праймер, 5'-дсса1йддааасда1саасдсддаад1дссйдсасда1сад-3' (8Ер ΙΌ КО:382). Сайт-направленный мутагенез проводили, как описано в протоколе изготовителя. Несколько изолятов секвенировали (Адепсош!, Всхсг1у, М.А.), и изолят с правильной последовательностью отбирали и использовали для дальнейшего анализа.
Единичную мутантную форму рЕТ30У354А трансформировали в ВЬ21(ОЕ3)рЬук8 Е.сой. Очищенный белок получали следующим образом. Штамм выращивали в ЕВ или бульоне Тегпйс Вго1Ь (при 37°С с аэрацией) до ОВ600нм 0,4-0,6 и индуцировали посредством 1 мМ 1РТС. Инкубацию продолжали при 37°С с аэрацией в течение ~3 ч. Клетки собирали центрифугированием, и клеточный осадок хранили при -80°С.
Клеточный осадок размораживали на льду, а затем ресуспендировали в соответствующем объеме ВидВик1ег (Nονадеη, МаШкоп, ν.Ι.) плюс нуклеаза Вепгопаке (Nονадеη, МаШкоп, VI). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, и бесклеточный экстракт наносили на колонку Ш8-Втб (Nονадеη, Майкоп, VI), уравновешенную буфером для связывания. Колонку промывали буфером для связывания и буфером для промывания, и белок элюировали буфером для элюирования (как описано в протоколе изготовителя). Очищенный белок подвергали обессоливанию с использованием колонки ЕВ-10 (СЕ НеаИЬсаге, Р1кса1а^ау, ΝΙ). Белок подвергали обессоливанию в 50 мМ фосфате калия рН 8,0 и 10 мкМ пиридоксаль5'-фосфате в соответствии с протоколом изготовителя. Белок концентрировали с использованием центробежного концентратора Ашьсоп (Мййроге, ВШегсьа, МА). Очищенный и концентрированный белок разделяли на небольшие аликвоты и хранили при -80°С до применения.
Очищенный У354А сравнивали с аланинрацемазой дикого типа (полученной способом, описанным выше) в анализах как аланина, так и триптофана. Анализы проводили при 37°С в 50 мМ фосфатнокалиевом буфере, рН 8, и 10 мкМ РЬР с использованием 400 мкл концентрированного очищенного белка (>1 мг/мл) и 50 мМ субстрата. Детекцию Ό-аланина и Ό-триптофана проводили с использованием технологии хиральных аминокислот, описанной в примере 1.
- 186 019971
Таблица 40
Фермент Субстрат Время Полученный ϋ-изомер (м.д.)
Дикого типа Ь-триптофан 0 ηά*
10 ηά
30 ηά
60 ηά
1080 ηά
Υ354Α 0 ηά
10 198
30 568
60 1386
1080 10080
Дикого типа Ь-аланин 0 5140
10 5960
30 6280
60 6500
1080 5040
Υ354Α 0 4760
10 4980
30 4980
60 4200
1080 5000
*пб = не выявлено
Эти данные анализировали без применения внутреннего стандарта; таким образом, эти данные являются полуколичествеииыми, и их следует применять для сравнительных целей. Тем не менее, эти результаты показывают, что единичная мутация Υ354Λ является достаточной для расширения специфичности алаииирацемазы, чтобы она могла катализировать рацемизацию аминокислот с использованием альтернативных субстратов.
Ό) Анализ фермента ВАВ.
Фермент ВАВ анализировали следующим образом. Анализы Атр1ех Веб проводили, как описано в этом примере. КТ2440 ВАВ Р. рийба использовали в количестве 200 мкг (очищенный как описано в этом примере). Аланинрацемазу О. к1еаго1НегторН11ик дикого типа и Υ354Λ очищали, как описано в этом примере, и использовали в количестве либо 200 мкг/мл, либо 1000 мкг/мл. СЕ представляет собой бесклеточный экстракт, который получали, как описано в этом примере. Результаты для момента времени 60 мин представлены в таблице 41 ниже.
Таблица 41
Фермент Данные флуориметра (через 60 минут)
ВАК (200) 56943
Υ354Α (200) 7860
Υ354Α(1000) 13587
\УТ аланинрацемаза (200) 3646
\УТ аланинрацемаза (1000) 3639
ВАК СЕ (5 мкл) 16228
ВАК СЕ (10 мкл 1) 26662
ВАК СЕ (50 мкл) >58000
Без фермента 1510
Очищенный белок также анализировали в отношении активности триптофанрацемазы в 50 мМ фосфате калия рН 8, 10 мкМ РЬР, и 30 мМ Ь-триптофане, как описано выше. В анализах использовали либо 200 мкг/мл, либо 1000 мкг/мл очищенного фермента (указано в скобках). Э-триптофан анализировали с использованием способа хиральных аминокислот, описанного в примере 1 для детекции.
- 187 019971
Таблица 42
Анализы показывают, что фермент КТ2440 ВАК Р. ри!1ба значительно более активен в отношении триптофана, чем фермент из С. к!еаго!йегторЫ1ик и его мутантная форма У354А.
Е) Образование монатина посредством КТ2440 ВАК Р. ри!1ба.
Анализ образования монатина проводили с очищенным КТ2440 ВАК Р. ри!1ба (очищенным, как описано выше) (100 мкг) или очищенным У354А (очищенным, как описано выше) (500 мкг), Όаминотрансферазой (ВюСа!а1уйск АТ-103 (Ракабепа, СА)) (500 мкг) и альдолазой ЛЕР ГО N0:276 (очищенной, как в примере 23) (50 мкг). Эксперимент по образованию монатина, начиная с I .-триптофана, проводили следующим образом. В дополнение к указанным выше ферментам, на 1 мл реакционной смеси добавляли следующее: 4 мМ МдС12, 50 мМ I .-триптофан, 100 мМ пируват натрия, 100 мМ фосфатнокалиевый буфер рН 7,5 и 0,05 мМ РЬР.
В качестве контроля эксперимент проводили, как описано выше, без рацемазы, и начиная с Όтриптофана вместо I .-триптофана. Обобщенные результаты представлены в таблице 43, ниже.
Таблица 43
Субстрат Рацемаза Время Тотальный монатин %К,К %8,8 %К,8 %8,К
Ь-Тгр Υ354Α 2 часа Не выявлен
18 часов Не выявлен
Игр ВАК 2 часа Не выявлен
18 часов 38,6 м.д. 92,1 5 2,9
Ь-1гр Отсутствует 2 часа Не выявлен
18 Не выявлен
часов
ϋ-ΐΓρ Отсутствует 2 часа 19,9 м.д. Не тестировали Не тестировали Не тестировали Не тестировали
18 часов 221,25 м.д. 97,8 0,2 2
- 188 019971
В этом эксперименте с использованием Υ354А монатин не был выявлен. Эту рацемазу использовали ранее (данные не представлены) для получения монатина, однако использовали значительно более высокий уровень фермента (по меньшей мере 2 мг и вплоть до 10 мг для выявления более высоких уровней монатина). КТ2440 ВАК Р. рибба использовали для получения монатина из Ь-триптофана. 100 мкг, используемых в этом эксперименте, не было достаточно, чтобы выявить образование монатина через два часа, однако их было достаточно, чтобы выявить образование монатина через 18 ч. Распределение стереоизомеров показало, что большая часть образованного монатина представляет собой К,К-изомер. Образования К,8-изомера не происходило. Этот результат указывает на то, что КТ2440 ВАК не способен на поддающемся детекции уровне вызывать рацемизацию К,К-изомера монатина (рацемизация К,К-изомера привела бы к К,8-изомеру). В этом эксперименте образовывалось значительное количество 8,8-изомера. Это, вероятно, является следствием того факта, что АТ-103, используемая в этом эксперименте, не является высокоочищенной и может содержать Ь-аминотрансферазы из клеточного экстракта, и что существует большое количество Ь-триптофана, имеющегося в качестве донора амино для переаминирования 8МР.
Пример 29. Клонирование и экспрессия аргининрацемазы Ркеиботопак !аебо1епк.
Обзор эксперимента
Аргининрацемазу Ркеиботопак !аебо1епк (также известную как Р. дгагео1епк) (регистрационный номер СепЬапк № АВ096176, последовательность нуклеиновой кислоты) и ее мутантную форму Р384М клонировали, экспрессировали и тестировали на активность в отношении превращения Ь-триптофана в Б-триптофан. Этот ген на 72% идентичен гену ВАК Р. рибба из КТ2440 и на 73% идентичен гену ВАК Р. рибба из ИВКС 12996, описанного выше. Аминокислотная последовательность на 72% идентична обоим белкам Р. рибба ВАК.
Протокол полимеразной цепной реакции
Ркеиботопак 1ае1го1епк (АТСС 4683) выращивали в питательном бульоне при 28°С при встряхивании 225 об/мин. Полимеразную цепную реакцию проводили на цельных клетках с использованием праймеров, сконструированных с 5'-участками рестрикции и выступающими концами для клонирования в векторы рЕТ28 и рЕТ30 (Nονадеη, Маб1коп, №Ι).
Последовательности праймеров представляли собой:
^концевой: 5'-АТААТАСАТАТССССТТСТССССТАССС-3' (81Ь) ГО N0:408) и
С-концевой: 5'-ССССССССАТССТТАСТСАТСТТТСАССАТТ-3' (8ΕΟ ГО N0:409).
Ген из Р. !аебо1епк амплифицировали с использованием следующего протокола ПЦР. Двадцать пять мкл выращенных клеток лизировали при 96°С в течение 10 мин. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, и супернатант использовали в качестве матрицы для ПЦР. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержала 5 мкл матрицы (лизированный клеточный супернатант), 1,6 мкМ каждого праймера, 0,3 мМ каждого бЛТР, 10 Е полимеразы гТ!Ь Ро1утегаке ХЬ (Аррбеб Вюкуйетк, Еок!ег Сйу, СА), 1Х буфер ХЬ и 1 мМ Мд(0Ас)2. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин, 8 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин, с последующими 22 повторами следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 58°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин. После 22 повторов образец поддерживали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту 1230 п.н.
Клонирование
Продукт ПЦР выделяли из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (01адеп, Уа1епаа, СА). Продукт клонировали с помощью ТОРО и трансформировали в клетки ТОР 10 в соответствии с протоколом изготовителя (ΙηνΐϋΌβοη, Саг1кЬаб, СА). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием 01адеп (О|адеп, Уа1епс1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством NбеI и ВатНЬ Последовательности плазмид, для которых было выявлено наличие правильной вставки, проверяли посредством секвенирования ДНК с дидезокси-терминированием цепи с универсальными прямым М13 и обратным М13 праймерами.
Скорректированный клон ТОРО расщепляли рестрикционными ферментами NбеI и ВатНб в соответствии с рекомендованными изготовителем протоколами (№\ν Ε^^6 Вю1аЬк, БегеИу, МА) и очищали из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (О|адеп, Уа1епс1а, СА). Векторы рЕТ28 и рЕТ30 получали расщеплением рестрикционными ферментами NбеI и ВатШ с последующей обработкой щелочной фосфатазой креветки (Косйе, ^амароЕк, ГО) и очисткой из гелей на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля 01адеп (01адеп, Уа1епс1а, СА). Расщепленные векторы и вставку лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Кар1б™ ^NА Ыдабоп Кй (Косйе, ^амароЕк, ЕЫ). Приблизительно 50 нг обработанной вставки, 100 нг обработанного вектора (с молярным соотношением вставки и вектора 3 к 1), 5 Е ДНК-лигазы Т4, и 1х буфер для лигирования инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь для лигирования подвергали обессоливанию с использованием набора для высокой очистки продуктов ПЦР Н1дй Риге РСК Ргобис! Рипйсабоп Кй (Косйе, Мгапаробк, ГО) и использовали для трансформации
- 189 019971 электрокомпетентных клеток ЭН10В Е.соН (Γην^ΐ^одеη, Саг1кЬаб, СА). Десять мкл каждой реакционной смеси дли лигирования добавляли к 40 мкл клеток ЭН10В, которые трансформировали электропорацией с использованием ВюКаб Оепе Ри1каг П в следующих условиях: 2,5 кВ, 25 мкФ, 200 Ом в 0,2-см кювете. Клеткам давали возможность восстановиться в 1 мл 80С, находящейся при комнатной температуре, в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 225 об/мин. Клетки размещали на планшеты ЬВ, содержащие канамицин (50 мкг/мл). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием О1адеп (О1адеп, Уа1епс1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством NάеΓ и ВашН!
Экспрессия гена и анализы
Плазмидную ДНК трансформировали в экспрессирующего хозяина В^21(^Ε3) рЬук8 Ксой (№νπ^^ Майкоп, 41). Культуры выращивали, и плазмиды выделяли с использованием набора для выделения в малых количествах О1адеп (О1адеп, Уа1епс1а, СА) и анализировали посредством рестрикционного расщепления для подтверждения их состава.
Индукцию в В^21(^Ε3) рЬук8 первоначально проводили как в векторе рЕТ 28 (маркированном гистидином), так и в векторе рЕТ 30 (без маркера). Исследование с течением времени проводили с помощью культур, выращиваемых при 37°С в 100 мл ЬВ, содержащей канамицин (50 мг/л), до 0Ώ600 0,5 и индуцировали посредством 100 мкМ ШТО (изопропилтиогалактозид), и проводили забор образцов в 0 момент времени и через 3 ч после индукции. Клетки, полученные в моменты времени 0 ч и 3 ч, ресуспендируют в К буфере с додецилсульфатом натрия, содержащем 2-меркаптоэтанол, и нагревают при 95°С в течение 10 мин, и охлаждают. Аликвоты этих образцов тотальных клеточных белков анализируют посредством 8^8-РАОΕ с использованием геля с градиентом 4-15%.
Клеточные экстракты также получают после культивирования в течение 3 ч суспендированием клеточного осадка из 5 мл культуры в реагенте Nоνадеη ВидВик!ег™, содержащем нуклеазу бензоназу и коктейль ингибиторов протеаз #3 (Са1Ь^осйеш-NоνаЬ^осйеш Согр., 8ап О1едо, СА), при комнатной температуре в течение 20 мин при осторожном встряхивании и центрифугированием при 16000хд для удаления клеточного дебриса. Супернатанты (клеточные экстракты) наносят в гели с градиентом 4-15% для анализа клеточных растворимых белков.
Образец после 3 ч из клонированной аргининрацемазы Р. 1ае1го1епк показал полосу тотального белка, которая соответствует точному размеру (приблизительно 45 кДа) в векторе рЕТ 30 (без маркера). Продукт гена Р. 1ае1го1епк рΕТ 30 сверхэкспрессировался на более высоком уровне, чем продукт гена Р. 1ае1го1епк рΕТ 28 (маркированного гистидином), однако ни один из векторов не приводил к заметной полосе растворимого белка.
Клетки из индуцированных культур (100 мл) центрифугировали и промывали один раз посредством 0,85% №□. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл/г сырой массы клеток реагента ВидВик!ег™ (Nоνадеη, Майкоп, 4Ι), содержащего 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз #3 (СаШюсйетNоνаЬ^осйеш Согр., 8ап О1едо, СА) и 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на орбитальном устройстве для встряхивания. Нерастворимый клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000хд в течение 20 мин при 4°С.
Клеточные экстракты анализировали в отношении активности триптофанрацемазы с использованием следующего протокола. Реакции объемом один мл проводили в 50 мМ фосфате калия (рН 8,0), 0,05 мМ РЬР и 30 мМ Ь-триптофане. Реакции инициировали добавлением бесклеточных экстрактов и инкубировали при 30°С в течение ночи. Аликвоты образцов отбирали после инкубации в течение ночи (образцы в моменты времени ноль минут служили в качестве контрольной реакции). В каждую аликвоту образцов объемом 250 мкл добавляли концентрированную муравьиную кислоту (5 мкл) для остановки реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до их анализа в отношении ϋ-триптофана способом хиральных аминокислот, описанным в примере 1.
Результаты анализа клеточных экстрактов после индукции рЕТ28 и рЕТ30 посредством 100 мкМ ШТО (3 ч) показывают, что клоны Р. 1ае1го1епк обладают активностью рацемазы в отношении Ьтриптофана. Снова оказалось, что вариант ВАК с маркером является менее активным и может осаждаться или быть менее растворимым, чем вариант без маркера (рЕТ28). В табл. 44, ниже, показаны первоначальные результаты, хотя и не количественные, поскольку был получен очень слаборастворимый белок.
Таблица 44
Обработка Момент времени Субстрат Экстракт рацемазы (200 мкг) Концентрация ϋ-Ηρ (мкг/мл)
рЕТ28/Р. 1ае1го1епх 0 Ь-1гр 500 мкл не выявлено
рЕТЗО/Р. 1ае1го1епз 0 Ь-1гр 500 мкл не выявлено
рЕТ28/Р. 1ае1го1епх после ночи Ь-1гр 500 мкл 140
рЕТЗО/Р. 1ае1го1еп.ч после ночи Игр 500 мкл 226
- 190 019971
Индукцию конструкции рЕТ30 (без маркера) повторяли с использованием тех же условий, что упомянуты выше, и наблюдали заметную полосу растворимого белка в 8В8-РАСЕ. Анализ повторяли с использованием тех же условий, что описано выше, и получали результаты, представленные в табл. 45, ниже.
Таблица 45
Обработка Момент времени Субстрат Экстракт рацемазы (мкл) Концентрация ϋ-Ггр (мкг/мл)
Р. /ае/го/епх-рЕТЗО 0 Ыгр 300 Не выявлено
Р. 1ае1го1епз-рЕТ30 0 Ε-ίτρ 150 Не выявлено
Р. 1ае1го1епз-рЕТ30 2ч Е-1гр 300 319
Р. 1ае1го1епз-рЕЕ30 2ч Ь-1гр 150 308
Р. 1ае1го1епх-рЕ'1'30 после ночи Ь-1гр 300 1586
Р. 1ае1го1епз-рЕЕ30 после ночи Ь-1гр 150 1658
Снова было отмечено, что удвоение объемов не привело к увеличению активности. Для последующей работы было решено удалить белок из ВидЬик!ег настолько быстро, насколько это возможно, после получения клеточных экстрактов и хранить белок в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8, содержащем 0,01 мМ РЬР. Детергент в ВидЬик!ег может ингибировать реакцию или может вызывать потерю активности при хранении.
Снова проводили индукцию конструкции рЕТ30, и клеточный экстракт подвергали анионообменной хроматографии (как в примере 28) для получения более чистого экстракта. Анализ повторяли с этим частично очищенным препаратом. Количества в скобках в столбце экстракт рацемазы таблицы 46, ниже, указывают на приблизительное количество частично очищенного фермента рацемазы, используемого в этом анализе. Результаты анализа представлены в таблице 46, ниже.
Таблица 46
Источник фермента Момент времени Субстрат Экстракт рацемазы Концентрация О-1гр (мкг/мл)
КТ2440 0 Ь-1гр 75 мкл (90 мкг не выявлено
ΝΒΚΟ 12996 0 Ь-1гр 42 мкл (200 мкг) не выявлено
ЫВКС 12996 0 Ь-1гр 21 мкл (100 мкг) не выявлено
Р. 1ае1го1епх 0 Ь-1гр 108 мкл (200 мкг) не выявлено
Р. 1ае1го1еп8 0 Ь-ΐΓρ 54 мкл (100 мкг) не выявлено
КТ2440 2ч Е-(гр 75 мкл (90 мкг) 661
ΝΒΚΟ 12996 2ч Ь-1гр 42 мкл (200 мкг) 408
ΝΒΚΟ 12996 2ч Игр 21 мкл (100 мкг) 208
Р. 1ае1го1еп.ч 2ч Ь-1гр 108 мкл (200 мкг) 862
Р. 1ае1го1епа 2ч Ь-1гр 54 мкл (100 мкг) 547
КТ2440 после ночи Ь-1гр 75 мкл (90 мкг) 2386
ΝΒΚ,Ο 12996 после ночи Ь-1гр 42 мкл (200 мкг) 2382
ΝΒΚ€ 12996 после ночи Ь-1гр 21 мкл (100 мкг) 1706
Р. 1ае1го1еп8 после ночи Ь-1гр 108 мкл (200 мкг) 2029
Р. 1ае1го1епз после ночи Ь-1гр 54 мкл (100 мкг) 2099
Нелинейность образца после ночи в этом случае, вероятно, является следствием того факта, что реакции достигают равновесия. Очевидно, ВАВ Р. !ае!го1епк обладает значительной активностью в отношении рацемизации триптофана, как и ВАВ 12996 и ВАВ КТ2440. Оказалось, что ВАВ КТ2440 и ВАВ Р. !ае!го1епк обладают сходной активностью, которая является немного более высокой, чем ВАВ 12996.
Последовательность ДНК аргининрацемазы Р. !ае!го1епк представлена ниже в качестве 8ЕО ГО NО:410. Последовательность ПЦР привела к двум заменам по сравнению с опубликованной последовательностью NСВI. Конкретно, последовательность ПЦР содержала аденозин вместо гуанина в положении 902 и цитозин вместо гуанина в положении 921. Эти изменения ДНК привели к одной молчащей мутации, а также к одной замене глицина на аспартат в аминокислотном положении 301.
- 191 019971
АТССССТТСТССССТАСССТССТСССССТТТСССТТСССАТСССАТТССТССААААСС
СССССТТТССТСССССАССССТСТССАТСАСССАСССССТАССТСААСТСААТАСССАССАСА
ССААТСССТСССТССАААТСААТАААССССССТТССАССАСААСАТАСССАСТСТССАААССС
СССТСССССССААСТСССАСАТСТССССССТАСТСААСССССАТСССТАТССССАСССТАТСС
ССТТСТТСАТССССТСССТСАТССССАТСССТСТТСССТСТСТСССТСТССССАССААССААС
ААСССССССТССТСССССАСАССССТТТС7\АСССТС/\АСТСАТАССССТССССАССССТСССС
ТСАСССААСТССААССТССАСТССССТАСААСАТССААСАССТССТССССААССТССАСТТСС
СССТСААССССАСССТСАТТССССАССАТСАСССТСССССССТССТССТССАССТСССТСТСА
АТТССАСССССАТСАССССТААСССАСТССАСАТСАССАССССТСАССССССТССТСАТСССС ТАССТАТСАССААССТСССАААССТССААСТСССССССАТСАТСАСССАСТТСССССТССААС АТССТССССАССТСССТСССССССТСААССССТТСААТСАССААССССААТСССТСАТСААСС ТСССССАССТТСАТСССАССААСАТСАСССТССАСССССССААСТССТТССССАСАСТССАСС ТСССССААТСССАТСТССАСАТССТСССССССССССССССССТСТТСССССАСАСССТАСССТ СССАСАСССАСТАСААСССССТСАТССАСТТСААСТСССАССТССССТСССТСААСАССТАСС ССААССССААСАСССТСССТТАТСАССССАССТАСАСССТССССССССАСТССССССТССССА АСАТСАСССТССССТАСТСТСАССССТАССССССССССТТТАССААТАААСССАТТСТССТСА ТСААСССССАТССССТСССАСТССТССССАААСТСТССАТСААСАСССТСАТССТССАССТСА СТСАССССССССАТСТС7\АААССССССАТСААСТССТССТСТТСССССАССАССССААССССС АСАТТАСССАСССТСАСАТССААСАСАТСААСССТССАСТССТТССССАТСТСТАТАСССТСТ СССССААТТССААСССТААААТССТСАААСАТСАСТАА (8ЕР ГО КО:410).
Белок, кодируемый геном 8ЕО ГО NΟ:410, анализировали посредством программы для предсказания сигнальных пептидов 81дпа1 Р 3.0 (^^^.сЬк.д1и.дк/кегу1сек/81дпа1Р/), и была предсказана лидерная последовательность из 23 аминокислот.
Мутагенез В84М ВАВ Р. 1ае!го1епк
Мутагенез проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОшскСИапдеМи1Р (81та1адепе, Ьа 1о11а, СА) с использованием гена ВАВ Р. 1ае!го1епк в рЕТ30, который приводит к белку без маркера. Для проведения замены В84М использовали следующий мутагенный праймер: 5'-ТАСССАСССТСАСАТССААСАСАТСААСС-3' (8Ер ГО КО:411).
Сайт-направленный мутагенез проводили, как описано в протоколе изготовителя. Несколько изолятов секвенировали (Адепсоиг!, Веуег1у, МА), и изолят с правильной последовательностью отбирали и использовали для последующего анализа.
Плазмиду трансформировали в клетки ВЬ21(ОЕ3) (Жуадеп, МаШкоп, \\3). Рекомбинантный белок получали в среде ОуегшдЫ Ехргекк II (Жуадеп, МаШкоп, ΑΊ), содержащей 50 мкг/мл канамицина в соответствии с протоколами изготовителя. Бесклеточные экстракты получали с использованием ВидВик!ег (Жуадеп, МаШкоп, ΑΊ) в соответствии с протоколами изготовителя, подвергали обессоливанию и анализировали в отношении процентной экспрессии белка-мишени с использованием способа Ехрепоп, описанного выше.
Анализы тотального белка проводили с использованием набора Р1егсе ВСА (Р1егсе, ВоскГогб, ГО). Анализы триптофанрацемазы с мутантным ферментом проводили с использованием фермента дикого типа, полученного таким же образом, как и положительный контроль. Анализируемые образцы содержали на мл: 30 мМ Ь-триптофан, 50 мМ фосфат калия рН 8, 10 мкМ РЬР и приблизительно 100 мкг белка рацемазы в бесклеточном экстракте. В случае, где 100 мкг не использовали (исходя из % экспрессии Ехрепоп и показателей тотального белка Р1егсе), результаты нормализовывали. Образцы в нулевой момент времени, через 30 мин, 2 ч и после ночи собирали, обрабатывали 2% муравьиной кислотой, фильтровали и разбавляли 1:10 для анализа с использованием способа хиральных аминокислот, описанного в примере 1.
Оказалось, что фермент дикого типа образует 49,1 м.д. Ό-триптофана за 30 мин, в то время как В84М мутантной формы образует 108 м.д. Показатели в момент времени 2 ч были сходными - 229,4 м.д. Ό-триптофана получали посредством фермента дикого типа против 541,7 для мутантной формы В84М. Оказалось, что мутация В84М приводит приблизительно к удвоенной активности ВАВ Р. 1ае!то1епк. Результат в момент времени после ночи для мутантной формы также является более высоким, однако, поскольку реакции достигают равновесия, отличия в активности снижаются. Когда анализы проводили в отношении образования монатина, как в примере 28, оказалось, что 1384М не обеспечивает какого-либо преимущества по сравнению с ферментом дикого типа Р. 1ае!го1епк.
Пример 30. Анализ экстракта А. Сау1ае.
Аеготопак сау1ае АТСС 14486 выращивали в питательном бульоне при 37°С. Клетки из культуры
- 192 019971 (200 мл) центрифугировали и промывали один раз посредством 0,85% КаС1. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл/г сырой массы клеток реагента ВидВик1ег™ (Коуадеп Майкоп, \·\Ί)_ содержащего 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз #3 (Са1Ь^осйет-NоνаЬ^осйет Согр., 8ап Э1едо, СА) и 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на орбитальном устройстве для встряхивания. Нерастворимый клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000хд в течение 20 мин при 4°С. Бесклеточный экстракт подвергали обессоливанию на колонке ΓΌ-10 (СЕ Неа1Шсаге, Р1кса1а\\ау_ N1).
Бесклеточный экстракт анализировали в отношении активности триптофанрацемазы с использованием следующего протокола. Реакции объемом один мл проводили в 50 мМ фосфате калия (рН 8,0), 0,05 мМ РЬР и 30 мМ Ь-триптофане. Реакции инициировали добавлением бесклеточного экстракта (либо 100 мкл, либо 500 мкл) и инкубировали при 30°С в течение ночи. Аликвоты образцов отбирали через 2 ч и после инкубации в течение ночи (образцы в момент времени ноль минут служили в качестве контрольных реакций). К каждой аликвоте образца объемом 250 мкл добавляли концентрированную муравьиную кислоту (5 мкл) для остановки реакции, и осажденный белок удаляли центрифугированием. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С до их анализа в отношении Ό-триптофана посредством способа хиральных аминокислот, описанного в примере 1.
Результаты анализа клеточных экстрактов А. сау1ае показали активность рацемазы в отношении Ьтриптофана, как показано в табл. 47.
Таблица 47
Обработка Момент времени Субстрат Экстракт рацемазы Концентрация ϋ-Цр (мкг/мл)
Α. сстае 0 Ь-1гр 100 мкл не выявлено
А. сстае 0 Ыгр 500 мкл не выявлено
А. сстае 2ч Ь-1гр 100 мкл 2
Α. сстае 2ч Ыгр 500 мкл 19
А. сстае после ночи Ыгр 100 мкл 45
Α. сас/ае после ночи Ь-1гр 500 мкл 130
После выявления активности в клеточных экстрактах А. сау1ае конструировали вырожденные праймеры (исходя из превращенных участков известных гомологов ВАК) для получения гена ВАК из этого вида. Последовательности вырожденных праймеров представлены ниже:
Аег йед Е2: 5'-СССАССААССАКСАКССМССССТ-3' (8Е0 ΙΌ N0:412); и
Аег йед К1: 5'-ТСССС8ТКСАТСАССАСА-3' (8Е0 ΙΌ N0:413), где К означает С или Т, К означает А или С, 8 означает С или С, и М означает А или С.
Указанные выше праймеры использовали для амплификации посредством ПЦР фрагмента ДНК длиной 715 п.н. из геномной ДНК А. сау1ае (АТСС 14486). Использовали следующий протокол ПЦР: 50 мкл реакционной смеси содержали 0,5 мкл матрицы (~100 нг геномной ДНК А. сау1ае), 1,6 мкМ каждого праймера, 0,3 мМ каждого йИТ?, 10 Е полимеразы гТ1й Ро1утегаке ХР (АррНей Вюкук1етк, Рок1ег Сйу, СА), 1Х буфер ХР_ 1 мМ Мд(0Ас)2 и 2,5 мкл диметилсульфоксида. Используемая в термическом блоке программа включала горячий старт при 94°С в течение 3 мин и 30 повторов следующих стадий: 94°С в течение 30 с, 53°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин. После 30 повторов, образцы держали при 68°С в течение 7 мин, а затем хранили при 4°С. Этот протокол ПЦР приводил к продукту длиной 715 п.н.
Клонирование
Продукт ПЦР выделяли из геля на основе 0,8% ТАЕ-агарозы с использованием набора для экстракции из геля Ц1адеп (О1адеп, Уа1епс1а, СА). Продукт клонировали с помощью ТОРО и трансформировали в клетки ТОР 10 в соответствии с протоколом изготовителя ЦпуЦгодеп, Саг1кЬай, СА). Плазмидную ДНК очищали из полученных трансформантов с использованием набора для выделения в малых количествах с центрифугированием О1адеп (О1адеп, Уа1епс1а, СА) и подвергали скринингу в отношении правильной вставки рестрикционным расщеплением посредством ЕсоКЕ Последовательности плазмид, для которых было выявлено наличие правильной вставки, проверяли посредством секвенирования ДНК с дидезокситерминированием цепи с универсальными прямыми праймерами М13.
Последовательность ДНК продукта ПЦР А. сау1ае представлена ниже в качестве 8ЕЦ ΙΌ N0:414 с подчеркнутыми участками последовательности вырожденного праймера:
- 193 019971
СССАССААССАКСАКССМССССТТСССССССАСААССдСТТССААССТССССТСАТОС
СССТАССТССССССАССССССАТС/иХСТССАССАСССССТССССТАСААССТССАССАССТСА
ТСБССАСССТССАСАСССССААССССАТСССССАСАТСССССАСССССАТСАСАССААСАТСС СССТССАСАТСССССТСААСТССССССССАТСАСССССААССССАТССАТСТСССССАССАСС АТСССААСССССАТССССТССССАТССТСААССТСААССССАТСАССССССТССССАТСАТСА СССАСТТСССССТССАССАСАААСАССАССТСААССТСССССТСССССАСТТСААССТССАСТ АССАСТСССТСАТССАСССССССААССТССАТСССАССААССТСАССАТССАСССССССААСТ ССТТССССАСССТССААСТАССССААСССТАСТТТОАСАТССТСССССССССССССАТСАТСТ АТССССАСАССАТТСССТССТАСАСССАСТАСААСААССТСАТССССТТСААСАСССАССТСС ССТСССТСААССАСТАССССССССССААСАСССТССССТАТСАССССАССТТСАСССТСААСС СССАСТСССТССТССССААССТССССАТССССТАСТСССАССЗСТАССССССССССАТСАССА АСААССССТАТСТССТСАТСМАЗССССА (8Ε9 ΙΏ N0:414), где К означает А или С, 8 означает С или С, и М означает А или С.
Аминокислотная последовательность неполного фермента ВАК А. сат1ае представлена в качестве 8ΕΟ ΙΏ N0:415, ниже:
АЗИЕЕАКУАКЕКСГЕСКЬМК7КААТР0ЕУЕ(2АЬРУКЬЕЕЬ1С8ЬЕЗАКС1 ΑϋΙΑςΚΗΗ
ТМ1РУН1СЬМЗАСМЗКИС1ОЬКСОРАКА0АЬАМЬКЬКС1ТРУС1МТНГРУЕЕКЕОУКЬСЬА0Г КЬОУСМЪЮАСКЬОКЗКЬТГНААИЗГАТЪЕУРЕАУГОМУКРССИУСОТГРЗУТЕУККУМАГК ТОУАЗУННУРАСНТУСУОКТГТЬККОЗЬЪАМГРМСУЗОСУРКАМЗНКАУУЫХС, где X представляет собой Н, 9, N или К (8Ε9 ΙΏ N0:415).
Консенсусный белковый фрагмент последовательности 8ΕΟ ΙΏ N0:415, представленной выше, на 89% гомологичен на аминокислотном уровне опубликованной последовательности ТЮК для А. йубгорй11а. Ожидалось, что вследствие того, что близкородственный белок Аеготоиак йубгорйПа проявляет активность рацемазы с широкой специфичностью, также как клеточные экстракты А. сат1ае, полноразмерный кодирующий участок А. сат1ае после получения приведет к рацемазе, которая также может обладать активностью с широкой специфичностью в отношении триптофана. Способы прогулки по геному использовали для получения полноразмерной последовательности гена ВАК А. сат1ае, представленной ниже в качестве 8ΕΟ ΙΏ N0:416.
айдсасаада ааасасГдсЬ сдсдасссГд аЬсГЬЬддсс ЬдсГддссдд
ссаддсадЬс дссдсссссЬ аГсЬдссдсЬ сдссдасдас сассдсаасд
дЬсаддааса дассдссдсс аасдссйддс ГддаадЬдда ЬсГсддсдсс
ГЬсдадсаса асайссадас ссЬдаадааЬ сдссЬсддЬд асаадддссс
дсадаЬсЬдс дссаЬсаЬда аддсддасдс сЬасддЬсас ддсаЬсдасс
ЬдсЬддЬссс ЕЬссдЬддЬс ааддсаддса ЬссссГдсаГ сддсаГсдсс
адсаасдаад аадсасдГдЬ Ьдсссдсдад аадддсЬЬсд ааддЬсдссЬ
даГдсдддГа сдЬдссдсса ссссддаГда адЬддадсад дсссЬдсссГ
асаадс-Ьдда ддадсЬсаЬс ддсадссйдд ададсдссаа ддддаЬсдсс
дасайсдссс адсдссаЬса сассаасаЬс ссддЬдсаса ЬсддссЬдаа
сйссдссддс аГдадссдса асддсаГсда ГсЬдсдссад дасдаГдсса
аддссдаЬдс ссЬддссаЬд сЬсаадсЬса аддддаЬсас сссддЬсддс
аЬсаЬдассс асЬЬсссддЬ ддаддадааа даддасдГса адсЬддддс-Ь
ддсссадГЬс аадсГддасГ ассадГддсГ саГсдасдсс ддсаадсГдд
аЬсдсадсаа дсЬсассайс сасдссдсса асЬссЬЬсдс сасссйддаа
дйассддаад ссГасГГГда саГддйдсдс ссдддсддса ЬсаЬсГа-Ьдд
сдасассаГГ сссЬссГаса ссдадЬасаа дааддЬдаГд дсдГГсаада
сссаддЬсдс сЬссдЬсаас сасЬасссдд сдддсаасас сдЬсддсГаГ
дассдсассЬ БсасссЬсаа дсдсдасЬсс сЬдсЬддсса ассЬдссдаЬ
дддсГасЬсс дасддсйасс дссдсдссай дадсаасаад дссЬаЬдЬдс
ЬдаЬссаЬдд ссадааддсс сссдЬсдЬдд дсаадасГЬс сайдаасасс
ассаЬддЬдд асдйсассда сайсаадддд аЬсааасссд д-ЬдасдаддГ
ддЬссЬдЬЬс ддасдссадд дЬдаЬдссда ддйдааасаа ЬсЬдаЬсЬдд
аддадГасаа сддЬдсссЬс ЬГддсддаса ЬдЬасассдЬ сЕддддсЬаЬ
ассаасссса адаадаЬсаа дсдсЬаа (8Ε9 ΙΏ N0:416).
- 194 019971
Соответствующая аминокислотная последовательность для нативной ВАК А. сау1ае представлена ниже в качестве ЛЕО ΙΌ Хо:417:
тЕШИаи 1£д11аддау аару1р1абб йгпддед!аа 41 пах1еуШда йейшдйкп г1дбкдр41с а1ткабаудй 81 дШ11уркуу кад1рс1д1а кпееагуаге кд£едг1тгу 121 гаЩрс1еуес] а1рук1еей дк1екакд1а б1адгйй.1т 161 руЫд1пкад ткгпдиПгс] ббакаба1ат 1к1кдйруд 201 1т!й£руеек ебук!д1ацГ кШудхйба дк1Шкк1й 241 йаапк£а!1е уреауйбтуг рддпудйп рку!еуккут 281 айкЦуакуп йурадп!уду бг!й1кгбк 11ап1ртдук 321 бдуггаткпк аууййддка руудк!ктп! !тубу!Шкд 361 1крдбеуу1£ дгс]дс1аеукс] кШееупда1 1абту!ухду 401 !пркк1кг (ЛЕО ΙΌ N0:417).
С использованием программы Л1дпа1 Р 3.0 (ххх.сЬк.б!и.бк/кегу1сек/Л1дпа1Р/) предсказано, что первые 21 ^концевых аминокислотных остаткова ЛЕО ΙΌ N0:417 представляют собой сигнальный пептид. Экспериментальные данные подтвердили, что продукт экспрессии секретировался в периплазму Е.сой, и сигнальный пептид отщеплялся, как и было предсказано. Было выявлено, что полноразмерный ген, при клонировании и экспрессии с использованием способов, описанных выше, обладает активностью, сравнимой с активностью ВАК Р. !ае!го1епк, но превышающей ее.
Пример 31. Получение альдолазы ЛЕО ΙΌ N0:276 в альтернативном экспрессирующем хозяине.
Ген ЛЕО ΙΌ N0:275 субклонировали с использованием стандартных способов молекулярной биологии в производное вектора рЕТ23б (^маде^ МаШкоп, ®Ι), содержащее ген те!Е Е. сой и промотор, встроенный в участке рестрикции NдοМIУ и втором участке рестрикции ркП, который добавляли для облегчения удаления гена бета-лактамазы (Ь1а). Конструкция этого вектора, содержащего вставку для гена миоинозитолоксигеназы описана в РСТ А0 2006066072 в примерах 2 и 20. Вставку альдолазы подтверждали секвенированием ДНК (Адепсоиг! Вюксчепсе Согрогайоп; Веуег1у, МА), и плазмиду с правильной последовательностью вставки трансформировали в экспрессирующего хозяина Е.сой В\С30384(1)£3) ЛотрТЛте!Е. Конструкция этого экспрессирующего хозяина и протокол трансформации также описаны в РСТ А0 2006066072 (примеры 21 и 22). Ген альдолазы эспрессировали с использованием системы для экспрессии \оуадеп 0уегшдй! Ехргекк™ Аи!отбис!юп Лук!ет ΙΙ ^оуадеп, МаШкоп, ®Ι), содержащей 100 мг/л ампициллина. Эта система была описана в примере 24 для экспрессии Όаланинаминотрансферазы ВасШик крйаепсик (штамм АТСС 10208). Бесклеточные экстракты, содержащие альдолазу, получали с использованием реагента для экстракции \оуадеп ВидВик!ег Ех!гас!юп Кеадеп! (не содержащего первичные амины) ^оуадеп, МаШкоп, ®Ι), содержащего 1 мкл/мл нуклеазы бензоназы, 0,033 мкл/мл г-Ьукохуте и 5 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз Рго!еаке ШИШкот Соск!ай Ле! ΙΙ в соответствии с рекомендованным изготовителем протоколом лизиса клеток. Растворимые белки в бесклеточных экстрактах разделяли на Вю-Каб ЬаЬога!опек Ехрепоп Аи!ота!еб Е1ес!горйогек1к Л!а!юп (Вю-Каб, Негси1ек, СА) и анализировали в отношении процентной экспрессии растворимых белков с использованием программного обеспечения Ехрепоп ЛоЙхаге версии 1.1.98.0, как описано в примере 12.
В целях повышения экспрессии альдолазы в Е.сой, со второго по седьмой кодоны кодирующей последовательности ДНК подвергали мутагенезу с заменами, предложенными, исходя из анализа последовательности дикого типа с использованием алгоритма Косйе Рго!еоЕхрег! КТЛ Е.сой НУ. Замены проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОшкСйапдеВ® Ми1й Лйе-01гес!ей Ми!адепек1к Κι! или ОшкСйапдеВ® ΙΙ Хк Лйе-01гес!ей Ми!адепек1к Κι! (Л!га!адепе, Ьа До11а, СА) в соответствии с предложенным изготовителем протоколом с 0,75 мкл раствора Ошк Ло1и!юп на 25 мкл реакционной смеси и трансформации в компетентные с помощью ультрафиолета клетки ХЬ10-Со1бВ®. Мутации проводили с использованием праймеров (каждый длиной 45 нуклеотидов), сконструированных с помощью хеЬ-программы Л!га!адепе ОшкСйапдеВ® Рптег Оещдп Ргодгатт, доступной он-лайн на хлх. к!га!адепе.сот. дсрптегйещдп.
Таблица 48
Кодон 1 Кодон 2 Кодон 3 Кодон 4 Кодон 5 Кодон 6 Кодон 7
Дикий ТИП АТС ССТ АТС СТТ ОТТ АСС ААС
Рго1еоЕхреП # 1 АТС ССА АТТ ОТТ СТА АСТ ААА
Рго1еоЕхреП #2 АТС ССА АТТ СТТ СТТ АСТ ААА
Рго1еоЕхрег1 #6 АТС ССА АТТ СТТ СТА АСС ААА
Рго1еоЕхрег1 # 10 АТС ССА АТТ СТТ СТТ АСС ААА
Последовательности гена альдолазы с указанными выше заменами кодонов трансформировали в экспрессирующего хозяина Е.сой В\У30384(1)£3) ЛотрТЛте!Е, а затем экспрессировали с использованием \оуадеп 0уегтдй! Ехргекк™ Аи!отбис!юп Лук!ет ΙΙ (Коуадеп, МаШкоп, \ΜΙ). Ни одна из этих мутаций не привела к более высоким уровням экспрессии гена по сравнению с последовательностью дикого типа. Типичные результаты из бесклеточных экстрактов, анализированные посредством программного обеспечения Вю-Каб Ехрепоп Рго260 1.1.98.0, представлены в табл. 49, ниже, в которой в столбце под названием Экспрессия белка показаны значения для % тотального растворимого белка.
Бесклеточные экстракты (0,025 мг/мл растворимого белка на анализ) анализировали в отношении их способности образовывать К,К-монатин из 200 мМ пирувата натрия и 100 мМ Ό-триптофана с ис
- 195 019971 пользованием протокола, описанного в примере 7. Реакции (общим объемом 7 мл) проводили в 14-мл пробирках из полипропилена в анаэробном перчаточном боксе с использованием очищенной Όаминотрансферазы В. зрйаепсиз (ΑΤСС 10208) в конечной концентрации 2 мг/мл. Концентрации монатина, образованного через 1, 4 и 20 ч после добавления ферментов, представлены в табл. 49, ниже. В таблице 49 показано, что бесклеточный экстракт, образованный посредством конструкции, содержащей последовательность альдолазы дикого типа, приводил к немного более высокой концентрации монатина через 20 ч, чем бесклеточные экстракты, полученные с помощью конструкций, несущих мутации Рго1еоΕxре^ί. Концентрации монатина определяли способом ЙС/М8/М8, описанным в примере 1.
Таблица 49
Экспрессия белка(%) [Монатин] мМ-Ι ч [Монатин] мМ -1ч [Монатин] мМ - 20 ч
Дикого типа 22 2,1 4,2 13,4
Рго1еоЕхрег1 #1 18 1,3 3,1 12,4
Рго1еоЕхрег1 #2 18 2,1 4,7 11,6
Рго1еоЕхрег1 #6 18 1,4 1,9 12,4
Рго1еоЕхрег1 #10 20 1,8 1,8 11,7
Эти данные демонстрируют, что альдолазу 8Ε0 Ш N0:276 можно получать в альтернативном экспрессирующем хозяине без индукции посредством ГРТО.
Ген Ь1а удаляли из вектора, и последующую ферментацию для получения альдолазы проводили без применения антибиотика, как описано в РСТ Ш0 2006066072 в отношении другого фермента. Уровни экспрессии при периодической ферментации с подпиткой при 30°С достигали максимума через 6-8 ч после индукции, с образованием альдолазы 8Ε0 Ш N0:276 в количестве 25-30% от растворимого белка, в соответствии с данными Εxре^^οη. Исследования стабильности показали отсутствие заметного снижения активности альдолазы, когда продукт ферментации оставляли в течение 6 ч при 15 или 30°С (как в условиях ограничения кислорода, так и в условиях аэрации) перед концентрированием и разрушением клеток. Было выявлено, что альдолаза была одинаково стабильной при хранении либо в качестве бесклеточного экстракта, либо в качестве клеточного осадка при хранении в течение 5 суток при -80°С. Промывание клеточного осадка в буфере перед хранением при -80°С не было необходимым и в действительности вызывало небольшое снижение активности. Было выявлено, что клетки, ресуспендированные в дистиллированной воде, супернатанте после ферментации или 100 мМ фосфатно-калиевом буфере (рН 7,8), не обладают сниженной активностью или концентрацией белка (исходя из 8^8-РΑОΕ) при хранении в течение 11 суток при комнатной температуре или 4°С. Бесклеточный экстракт, полученный в фосфатнокалиевом буфере, показал отсутствие снижения активности альдолазы при хранении при 4°С или комнатной температуре в течение 5 суток. Клетки можно разрушать в фосфатном буфере, вплоть до 25% культуральном супернатанте или воде с получением сравнимой активности альдолазы; однако было выявлено, что добавление 1 мМ МдС12 в воду немного повышает активность альдолазы. Эти данные показывают, что белок альдолаза является достаточно стабильным для коммерческого применения.
Был описан ряд вариантов осуществления этого изобретения. Варианты осуществления этого изобретения включают один или несколько из описанных выше аспектов. Будет понятно, что различные модификации можно проводить без отклонения от сущности и объема этого изобретения. Таким образом, другие варианты осуществления находятся в объеме следующей формулы изобретения.
- 196 019971
Список последовательностей <110> Вигке, Е11еп
Нтскз, Раи1а М.
ЬидтпЬиШ, РеЕег
В.1сКагдзоп, ТоЬу
Иетпег, ϋβνίά
ΖΗβο, ЫзНап <120> АЛЬДОЛАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
ПРИМЕНЕНИЯ <130> О1710-6ИО <140> РСТ/0507/63515 <141> 2007-03-07 <150> 60/780,515 <151> 2006-03-07 <160> 417 <170> РаСепЫп 3.1 <210> 1 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> Бактериальная ДНК <400> 1
аОдсадссдс ЕдааддааП сдссдадсТс Тссассссдс ЬдаСсдссда сдссЕдсдОд 60
сддсСсдддд аассссЬдсд сдЬсдсдссс дссддсаЬсс СдсссдТсд! сдсдддссдд 120
сдсдЬсдссд дссдддсссТ дсссдОасдд сасЬасддса дсдЕсдасдТ сТОссЬддад 180
дсдТСсддсд аддссдадсс сддТдасдЬс сТсдТсаТсд асаасдсддд ссдсдТсдас 240
даддссТдса ЕсддсдассТ сдссдТссРд даддсддсдд сддссддсаО сдссддддТс 300
дСсдРдСддд дссОдсассд ддасассссс дассОсдОсд адаОсдддсС дсссдбсСЬс 360
РссТасддас дссасдсдсс сддссссдТд сдсдЬсдасс сссдддассс ддасдсдсЕд 420
асдассдсдс ддЫзсддсда дсасдаддЬд ассдссдссд асдТсдТдТЬ сддсдасдас 480
дасддсдрдд РсСТсдксдс сдссдсссдд дссддсдссд ТссЬддаддс ддсссдддсс 540
сЕдЕСссдЕа сддадсдсда дсаддсдсдд сддаЕсаддд сдддддадас дсТдсдсдсс 600
садасссддТ ЬсдасдсдЬа ссСддсдддс сдддссдадд ассссЬсдЬа сассТЬссдд 660
садсассЕдс дссддаЕсдд сддсдсдаТс даддадрда 699
<210> 2 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
- 197 019971 <220>
<223> Бактериальный белок <220>
<221> ДОМЕН <222> (8)...(165) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 2
Меб 1 С1п Рго Ьей Ьуз 5 С1и РЬе А1а С1и Ьей 10 Зег ТЬг Рго Ьей Не 15 А1 а
Азр А1а Суз νβΐ Агд Ьей С1у С1и Рго Ьей Агд Уа1 А1а Рго А1а С1у
20 25 30
Не Ьей Рго Уа1 Уа1 А1а С1у Агд Агд Уа1 А1а С1у Агд А1а Ьей Рго
35 40 45
νβΐ Агд Н13 Туг С1у Зег Уа1 Азр Уа1 РЬе Ьей С1и А1а РЬе С1у С1и
50 55 60
А1а С1и Рго С1у Азр Уа1 Ьей \7а1 Не Азр Азп А1а С1у Агд Уа1 Азр
65 70 75 80
С1и А1а Суз Не С1у Азр Ьец А1а Уа1 Ьей С1и А1а А1а А1а А1а С1у
85 90 95
Не А1а С1у Уа1 Уа1 Уа1 Тгр С1у Ьей Нтз Агд Азр ТЬг Рго Азр Ьей
100 105 110
Уа1 С1и Не С1у Ьей Рго Уа1 РЬе Зег Туг С1у Агд ΗΪ3 А1а Рго С1у
115 120 125
Рго Уа1 Агд \7а1 Азр Рго Агд Азр Рго Азр А1а Ьец ТЬг ТЬг А1а Агд
130 135 140
РЬе С1у С1и Н1з С1и \7а1 ТЬг А1а А1а Азр Уа1 Уа1 РЬе С1у Азр Азр
145 150 155 160
Азр С1у Уа1 Уа1 РЬе Уа1 А1а А1а А1а Агд А1а С1у А1а Уа1 Ьей С1и
165 170 175
А1а А1а Агд А1а Ьей РЬе Агд ТЬг С1и Агд С1и С1п А1а Агд Агд Не
180 185 190
Агд А1а С1у С1и ТЬг Ьей Агд А1а С1п ТЬг Агд РЬе Азр А1а Туг Ьей
195 200 205
А1а С1у Агд А1а С1и Азр Рго Зег Туг ТЬг РЬе Агд С1п Нтз Ьец Агд
210 215 220
Агд Не С1у 01у А1а 11е С1ц С1и
225 230 <210> 3 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 3
- 198 019971
д(дассддсс асдЬсаЬсдб ссдсдадаЬс дассдсдссд асдсдаасдс ссбсдасддс 60
сксдссдсдс ЬсддсдбсЬс дасддбдсас даддссдасд дссдссдсдд сдсдсбсдсс 120
ассдссаЬЬс дассдабсса садЬддаЬЬс асдабсдссд дЬЬсддсддб дасддЬсбсс 180
Ьсссадссдд дсдасаасдр саЬдаЬссас дссдссаЬЬд аддЬдЬдссд дсссддсдас 240
аЬссЬсдЬдд Ьсассассас сбсдссдЬсс ассдасддда ЬдаЬсддсда асЬдсЬддсд 300
асдбсдсбдс дсдсдсасдд ддбдсддддЬ дЬсдбсассд абдссддсдр асдсдасдбс 360
дсссадсбсс дддсдабдаа сЬЬсссддЬд бддасдсдсд ссаЬсадЬсс асаддддасд 420
дбсааддсда дсссдддсбс ддбдаасаЬа ссддЬсдЬсЬ дсдссддсса ддЬсдЬссас 480
сссддсдабд ссаЬсдбсдс сдасдасдас ддсдЬЬдбсд Ьсдбсссдсд сдассдддЬд 540
ссддсддбдс Сддсддссдд ссдддсдсдд дссдададсд аддасдасаа асдсдбссдд 600
сбсдссддЬд дсдаасЬсбс ддбсдасаЬд Ьасдддсбдс дсдадсРдсб сасссдасбс 660
ддадбддадЬ асдбсдассд дсддссддсд Ода 693
<210> 4 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (28)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 4
Меб 1 ТЬг С1у Н13 Уа1 5 11е Ϋ31 Агд С1и Не 10 Азр Агд А1а Азр А1а 15 Азп
А1а Ьеи Азр С1у Ьеи А1а А1а Ьеи С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
Азр С1у Агд Агд С1у А1а Ьеи А1а ТЬг А1а 11е Агд Рго 11е Нтз Зег
35 40 45
С1у РЬе ТЬг 11е А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег С1п Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Уа1 Мер Не Нтз А1а А1а 11е С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Зег Рго Зег ТЬг Азр С1у Меб 11е С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Нтз С1у Уа1 Агд С1у Уа1 Уа1
100 105 110
ТЬг Азр А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа! А1а С1п Ьеи Агд А1а Меб Азп РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр ТЬг Агд А1а 11е Зег Рго С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а Зег
- 199 019971
130 135 140
Рго <31 у Зег \7а1 Азп Не Рго Уа1 Уа1 Суз А1а (31у <31п Уа1 Уа1 Нтз
145 150 155 160
Рго <31у Азр А1а Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Рго
165 170 175
Агд Азр Агд Уа1 Рго А1а Уа1 Ьеи А1а А1а <31 у Агд А1а Агд А1а <31и
180 185 190
Зег С1и Азр Азр Ьуз Агд Уа1 Агд Ьеи А1а <31 у <31у <31и Ьеи Зег Уа1
195 200 205
Азр Меб Туг <31 у Ьеи Агд (31и Ьеи Ьеи ТЬг Агд Ьеи С1у Уа1 <31и Туг
210 215 220
Уа1 Азр Агд Агд Рго А1а
225 230 <210> 5 <211> 762 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 5
абддсдПда абассддПс сдасаИаП сдсссдбсса аддадсбсдб бдссдддсбс 60
ааадсЕсЪбд дсадбдсдас сабсдсдддс асдсбсддсс асабддддП саадаасссд 120
сасабдасдд дсабссбдсс асадасддсд ддсааддбса Ьддссддссс ддсдсбдасд 180
сбдсадбдса бдссдсадсд ассддассбд Исадсдаад дсдаабасдс сдабссбдаа 240
асдсадсбсс ассдссабдб дсбсбабсас дбдсаддадд дсдасдбддб сдбсдбсдаб 300
дсдсдсддсд абабдаадбс дддсабсббс ддсдасабда бдбсдассба сббсаадддс 360
сдсддсддсд ссддсабсдб сабсдасддс бдсабдсдсд абсдбсссаа Ьдбсдаааад 420
сбсдассбдб сдсбсбддсб саадддсбдд асдссдаасб ассасдбсса дассдасабс 480
бббсссбасд сддбдаасдб бссадбсдса бдбддсддсд ИсИдСдсб ссссддсдас 540
абсабсдПд ссдабдасда сддсдсбдбс дбсдбдссдд бдаадабддс дсадсасабс 600
дбсдаддасд дсаадаадса сдссдадбдд даадбдИсб сдсдсдадаа дсбдабддсс 660
ддсдадбсдс ЬссдссдПа сбасссдсбд сассссдабд ссдаддасда абассаддсс 720
Ьддсддаадд сдааддддсб дссдссдбсд сссбсдсдсб аа 762
<210> 6 <211> 253 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 200 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(191) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 6 ТЬг 5 СЬу Зег Азр Не Не 10 Агд Рго Зег Ьуз С1и 15 Ьеи
Меб 1 АЬа Ьеи Азп
Уа1 АЬа СЬу Ьеи Ьуз АЬа Ьеи СЬу Зег А1а ТЬг 1Ье АЬа С1у ТЬг Ьеи
20 25 30
СЬу НЬз Меб СЬу РЬе Ьуз Азп Рго НЬз Меб ТЬг СЬу Не Ьеи Рго С1п
35 40 45
ТНг АЬа СЬу Ьуз УаЬ Меб АЬа СЬу Рго АЬа Ьеи ТЬг Ьеи СЬп Суз Меб
50 55 60
Рго СЬп Агд Рго Азр Ьеи РЬе Зег СЬи СЬу СЬи Туг АЬа Азр Рго СЬи
65 70 75 80
ТЬг С1п Ьеи НЬз Агд НЬз УаЬ Ьеи Туг НЬз УаЬ СЬп СЬи СЬу Азр УаЬ
85 90 95
Уа1 УаЬ УаЬ Азр АЬа Агд СЬу Азр Меб Ьуз Зег СЬу Не РЬе С1у Азр
100 105 110
Меб Меб Зег ТЬг Туг РЬе Ьуз СЬу Агд СЬу СЬу АЬа СЬу Не УаЬ Не
115 120 125
Азр СЬу Суз Меб Агд Азр Агд Рго Азп УаЬ СЬи Ьуз Ьеи Азр Ьеи Зег
130 135 140
Ьеи Тгр Ьеи Ьуз СЬу Тгр ТЬг Рго Азп Туг НЬз УаЬ СЬп ТЬг Азр Не
145 150 155 160
РЬе Рго Туг АЬа Уа1 Азп УаЬ Рго Уа1 АЬа Суз СЬу СЬу УаЬ Ьеи УаЬ
165 170 175
Ьеи Рго СЬу Азр Не Не УаЬ А1а Азр Азр Азр СЬу А1а УаЬ Уа1 УаЬ
180 185 190
Рго УаЬ Ьуз Меб АЬа СЬп НЬз Не УаЬ СЬи Азр СЬу Ьуз Ьуз НЬз А1а
195 200 205
С1и Тгр СЬи УаЬ РЬе Зег Агд СЬи Ьуз Ьеи Меб АЬа СЬу СЬи Зег Ьеи
210 215 220
Агд Агд Туг Туг Рго Ьеи НЬз Рго Азр АЬа СЬи Азр СЬи Туг СЬп АЬа
225 230 235 240
Тгр Агд Ьуз АЬа Ьуз СЬу Ьеи Рго Рго Зег Рго Зег Агд
245 250
<210> 7 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 7
- 201 019971
абдадбдбад бддбдсаааа бабсдадсдд дсадабсадд сааббабсаа ддсдсббдсб 60
даабдсддбд бадсаасбдб дсабдаддсс сааддссдса сддддббдсб ддсббсббаб 120
абдсддссаа бббабадсдд бдсббдсабб ддбдсабсад сддбаассаб бсбддсбссд 180
ссббдсдаба асбддабддб ссабдбддсс аббдадсада бааадссддд бдабдсбсбд 240
дббабддсаа саасабсдбс абсбдабдсс ддабаббббд дбдассбдсб ддсдассбсд 300
абдсаддсдс дбддсддддб бддсабдабб абсдабдссд дддбдсдсда баббааадас 360
сбдассдада бдааабдбсс бдбсбддбса ааадсдабсб дсдсбдаадд дасддбдааа 420
дааасасббд дсбсбдбааа баббссддбд дбббдсдссд дссадббддб саассссддс 480
дабаббдбса бсдсбдабда бдабддддбс бдбдбсдббд адсдсдааад ддсбддсдаа 540
дббсбддааа аадсдсаадс ссдсабддсб ббддаадаад асааасдбаа асдбббддсс 600
бссддбдаас ббдддсбдда бабдбабааб абдсдсдадс дбсбддсбда ааааддбсбс 660
ааабабдббб аа 672
<210> 8 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 8
Меб 1 Зег Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п Азп 11е С1и Агд 10 А1а Азр С1п А1а 11е 15 11е
Ьуз А1а Ьеи А1а О1и Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Н1з С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТНг С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Зег С1у А1а
35 40 45
Суз Не С1у А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Ьеи А1а Рго Рго Суз Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уа1 ΗΪ5 Уа1 А1а Не О1и С1п Не Ьуз Рго С1у Азр А1а Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Меб А1а ТЬг ТНг Зег Зег Зег Азр А1а С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТНг Зег Меб С1п А1а Агд С1у С1у Уа1 С1у Меб 11е 11е Азр
100 105 но
А1а С1у Уа1 Агд Азр 11е Ьуз Азр Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз Суз Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а 11е Суз А1а С1и С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
- 202 019971
130 135
Зег 145 Уа1 Азп 11е Рго Уа1 150 Уа1 Суз
Азр Не Уа1 11е А1а 165 Азр Азр Азр
Агд А1а С1у С1и 180 Уа1 Ьеи С1и Ьуз
С1и Азр Ьуз 195 Агд Ьуз Агд Ьеи А1а 200
Туг Азп 210 Меб Агд С1и Агд Ьеи 215 А1а
140
А1а С1у С1п 155 Ьеи \Аа1 Азп Рго С1у 160
С1у Уа1 170 Суз Уа1 Уа1 С1и Агд 175 С1и
А1а 185 С1п А1а Агд Мер А1а 190 Ьеи С1и
Зег С1у С1и Ьеи С1у 205 Ьеи Азр Меб
С1и Ьуз С1у Ьеи 220 Ьуз Туг Уа1
<210> 9 <211> 552 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 9 абдаасддда ссдЬсдбдсд саасабссаб сдсдссдадд сдддддссаб сдсддсдсбс 60
дддсдсабсд дсдбсбсдас сдбссасдад дсдсаддддс дсассдддсб сабдсаддсс 120
Ьасабдсддс ссдбаСддсд дддсдсдсдс абсдссддса дсдссдбдас сдбссЬдбдс 180
сабсссаасд асаасбддаЬ дабссасдбс дсдабддадд бддсааддсс сддсдасдСд 240
сЬсдЬддбдд сСЬдсбсдад сдадаасасд аасддсдсда ЬсддсдассЬ дабсдссасс 300
бсдсбсабдд сдсдсддсдб даааддсдсд абссбсдаса Ьдддсбдссд сдасдЬдсбд 360
дадсбсдадс адаЬдаддЬЬ Ьссдсбсбдд Ьсдсдддсса Ьсбсддсдса дддаассабс 420
аадддсасдс ЬсддсЬсддЬ саасЬЬсссд дЬсассбдсд ссддсдссса сдбсаддссд 480
ддсдасабсд Ьддбсдсдда сдасдасддс дЬддбддЬсд Ьдссссдсса ддасдсддсд 540
ааадЬдаЬсс аа 552
<210> 10 <211> 184 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (2)...(5)
- 203 019971 <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозатЕ ίά = Р300001 <400> 10
МеЕ 1 Азп С1у ТЬг Уа1 5 Уа1 Агд Азп Не Н13 10 Агд А1а С1и А1а С1у 15 А1а
Не А1а А1а Ьей С1у Агд Не С1у Уа1 Зег ТЬг \7а1 Н13 С1ц А1а С1п
20 25 30
61у Агд ТЬг С1у Ьей МеЕ С1п А1а Туг МеЕ Агд Рго \7а1 Тгр Агд С1у
35 40 45
А1а Агд Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Ьей Суз Н13 Рго Азп Азр
50 55 60
Азп Тгр МеЕ Не Н13 Уа1 А1а МеЕ С1и Уа1 А1а Агд Рго С1у Азр Уа1
65 70 75 80
Ьей Уа1 Уа1 А1а Суз Зег Зег С1и Азп ТЬг Азп С1у А1а Не С1у Азр
85 90 95
Ьей 11е А1а ТЬг Зег Ьей МеЕ А1а Агд С1у Уа1 Ьуз С1у А1а Не Ьей
100 105 но
Азр МеЕ С1у Суз Агд Азр Уа1 Ьей С1и Ьей С1и С1п МеЕ Агд РЬе Рго
115 120 125
Ьей Тгр Зег Агд А1а Не Зег А1а С1п С1у ТЬг Не Ьуз С1у ТЬг Ьей
130 135 140
С1у Зег Уа1 Азп РЬе Рго Уа1 ТЬг Суз А1а С1у А1а Ηί3 Уа1 Агд Рго
145 150 155 160
С1у Азр Не Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Рго Агд
165 170 175
С1п Азр А1а А1а Ьуз Уа1 Не С1п
180 <210> И <211> 645 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 11 аЕддаЕссад дддЕсаЕсад дсдЕсЕдддд дадсЕдддсд ЕЕдсдассдЕ Есасдаддсд 60
сЕсддссдсс адддссЕЕсЕ сдаЕсссдЕс дЕдсдсссда ЕсЕассссдд сдсдсдддсд 120
дссддаассд ссдЕаасддЕ дЕдсЕдЕссд дссддддаса ассЕдаЕдаЕ ссаЕдсддсд 180
сЕссаддЕсд Еддсдсдсдд сдасдЕдсЕс дЕсдЕсасда ссдадссдсс дЕсдасдЕас 240
ддсаЕдЕЕсд дсдасдЕдсЕ ддддасдЕсд Едссаддсдс ЕсддддЕсдс ддддсЕсдЕс 300
аЕсдасдссд дсаЕссдЕда сасддаддад сЕсдадсдда ЕддсдЕЕЕсс сдссЕдддсд 360
сдсдсдасдЕ сддсдсаддд сасддЕдааа дЕддсЕссдд дсаЕсдЕсаа сдсдссдаЕЕ 420
дЕдЕдсдсдд дсдсддасдЕ ЕсдЕссдддс дасдЕЕдЕсд ЕддсддаЕсд сдасддсдЕс 480
- 204 019971
дЬсаЬсдЬсс сдсдсдадсд ддсЬдссдаа дсддсддадс ЬЬддЬдадса дсддсдсдаб 540
сдсдадабсд аабассдссд дсддсбддса ддбддададс Ьдасссрдда сдЬдсбсдас 600
сбссддсдса сссбдсддда даЬсдддабд дасаддсЬдд асбда 645
<210> 12 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (10) ... (162) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 12
Меб 1 Азр Рго С1у Уа1 5 Не Агд Агд Ьеи С1у 10 С1и Ьеи С1у Уа1 А1а 15 ТНг
Уа1 ΗΪ3 С1и А1а Ьеи <31у Агд С1п С1у Ьеи Ьеи Азр Рго \7а1 Уа1 Агд
20 25 30
Рго Не Туг Рго С1у А1а Агд А1а А1а С1у ТНг А1а Уа1 ТНг Уа1 Суз
35 40 45
Суз Рго А1а С1у Азр Азп Ьеи Меб Не Н13 А1а А1а Ьеи С1п Уа1 Уа1
50 55 60
А1а Агд С1у Азр Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 ТНг ТНг С1и Рго Рго Зег ТНг Туг
65 70 75 80
С1у Мер РНе С1у Азр Уа1 Ьеи С1у ТНг 5ег Суз С1п А1а Ьеи С1у Уа1
85 90 95
А1а С1у Ьеи \7а1 Не Азр А1а С1у Не Агд Азр ТНг С1и С1и Ьеи С1и
100 105 НО
Агд Меб А1а РНе Рго А1а Тгр А1а Агд А1а ТНг Зег А1а С1п С1у ТНг
115 120 125
Уа1 Ьуз Уа1 А1а Рго С1у Не Уа1 Азп А1а Рго Не Уа1 Суз А1а С1у
130 135 140
А1а Азр Уа1 Агд Рго С1у Азр Уа1 Уа1 Уа1 А1а Азр Агд Азр С1у Уа1
145 150 155 160
Уа1 Не Уа1 Рго Агд С1и Агд А1а А1а С1и А1а А1а С1и Ьеи С1у С1и
165 170 175
С1П Агд Агд Азр Агд С1и Не С1и Туг Агд Агд Агд Ьеи А1а С1у С1у
180 185 190
С1и Ьеи ТНг Ьеи Азр Уа1 Ьеи Азр Ьеи Агд Агд ТНг Ьеи Агд С1и Не
195 200 205
С1у Меб Азр Агд Ьеи Азр . 210
- 205 019971 <210> 13 <211> 498 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 13 аЬддсдассд дддадЬасда сдсаЬдддсс ддсЬссЬддЬ асЬсдаадсЬ сЬсдссддад60 ссдЬЬсаЬдд аЬсЬсаЬЬсд ЬсссддсасЬ дсссЬддЬда ЬсдасдаЬдс дсссдсадсд120 даЬдЬсддсЬ ссаЬсдддЬс даасаасаЬс сЬссааЬдда адасдсдЬдд даЬддЬддсд180 дЬсдЬдасда асдсдасддс дсдддасасс дасдаааЬсд ЬЬдЬсдадсд сдЬдссдсЬс240
ЬаЬЬЬссддс адссЬддссд сддсаЬссдЬ ссдддссдса аЬдадаЬсда аЬсддЬсаас300 сдЬсссдЬдд ЬсдЬдддсдд ддЬдсЬсдЬд аЬдсссддсд асдЬсаЬсдЬ сддадасддс360 дасддсдЬдд ЬЬдЬсдЬссс асдсдсдсад дссдаддссд ЬддсдсдаЬа ЬдсЬсасасд420 аЬссЬсдада аддасасдда аддасдЬсдд сддсЬсЬасс адсадсЬдаа дсПссаасс 480 даЬЬсдасдд ЬссддЬад498 <210> 14 <211> 165 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <400> 14
Меб 1 А1а ТЬг С1у С1и 5 Туг Азр А1а Тгр А1а 10 С1у Зег Тгр Туг Зег 15 Ьуз
Леи Зег Рго С1и Рго РНе МеЬ Азр Ьеи 11е Агд Рго С1у ТЬг А1а Ьеи
20 25 3 0
Уа1 11е Азр Азр А1а Рго А1а А1а Азр \/а1 С1у Зег 11е С1у Зег Азп
35 40 45
Азп Не Ьеи С1п Тгр Ьуз ТЬг Агд С1у МеЬ Уа1 А1а Уа1 Уа1 ТЬг Азп
50 55 60
А1а ТЬг А1а Агд Азр ТЬг Азр <31и 11е Уа1 Уа1 С1и Агд Уа1 Рго Ьеи
65 70 75 80
Туг РНе Агд С1п Рго С1у Агд С1у 11е Агд Рго С1у Агд Азп С1и Не
85 90 95
С1и Зег 7а1 Азп Агд Рго Уа1 Уа1 Уа1 С1у С1у Уа1 Ьеи Уа1 МеЬ Рго
100 105 110
С1у Азр Уа1 11е \7а1 С1у Азр С1у Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Рго Агд
115 120 125
А1а С1п А1а С1и А1а \7а1 А1а Агд Туг А1а ΗΪ5 ТЬг Не Ьеи С1и Ьуз
130 135 140
- 206 019971
Азр ТЬг С1и С1у Агд Агд Агд Ьеи Туг С1п С1п Ьеи Ьуз Ьеи Рго ТЬг
145 150 155 160
Азр Зег ТЬг \/а1 Агд
165 <210> 15 <211> 723 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 15
абдасаасаа дсасбааааа ЬаЬдсаддба адбсадааад ЬЬаЬЬдасда ЬсЬЬсдбсдс 60
дбдбсаасад саасЬсбдса сасЬдсдсбд ЬЬсаааадад дЬЫасдсаа сассбасабс 120
садддЬдбса дссЬсабсаа саассааааа сЬдаадабдд Ьсддссаддс дЬЬсасссбд 180
сдсЬасабсс сддсЬсдбда адасдЬЬдас ассдЬЬдсдд саЬЬсаааад сссбдадсас 240
ссбсадсдсс ЬддссдЬЬда аЬссдбсссд дааддсабдд ЬдсЬддЬЬЬс адасЬдбсдЬ 300
саддасдсаа садсХдсПс Ьдссдддадс абссЬЬсЬЬа сбсдаЬЬдда адЬЬсдсаад 360
ЬдЬдсдддЬЬ ЬЬдЬЫссда Ьдсдддсабс ададаЬЬЬса асдаЬдсабс Ьдааабдаас 420
аг дссдаЬП ЬЬЬдсдссаа дссаадсдсб ссаассаасс Ьдассаадса ссасдссдба 480
дасабасаад Ьассдабсдд сбдсддсддЬ дЬдабддЬЬа абссаддсда ЬдЬдЬЬадбс 540
ддсдаЬддбд асддсабсаЬ сдЬ0а1:ссс1: дбддаааЬЬд сасаддаддб Ьбсадаадаа 600
дсасЬЬдсаа ЬддаасбсЬЬ сдаадаЬЬЬЬ дЬдсЬддаба аадббсдддс дддаадсааа 660
дбсаЬЬдддс ЬдЬасссбсс Ьаасдсадаа асЬсбддадд адбасаасаа ссааааддса 720
Рад 723 <210> 16 <211> 240 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (19)...(188) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (155) ... (158) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозахЬ ίά. = Р300001 <400> 16
МеС ТЬг ТЬг Зег ТЬг Ьуз Азп Меб С1п \7а1 Зег С1п Ьуз Уа1 Не Азр
10 15
- 207 019971
Азр Ьеи Агд Агд 20 УаЬ Зег ТЬг АЬа ТЬг 25 Ьеи Н13 ТЬг АЬа Ьеи 30 РЬе Ьуз
Агд СЬу Ьеи Агд Азп ТЬг Туг Не СЬп СЬу УаЬ Зег Ьеи Не Азп Азп
35 40 45
С1п Ьуз Ьеи Ьуз Меб УаЬ СЬу СЬп АЬа РЬе ТЬг Ьеи Агд Туг 11е Рго
50 55 60
А1а Агд СЬи Азр УаЬ Азр ТЬг УаЬ АЬа АЬа РЬе Ьуз Зег Рго СЬи НЬз
65 70 75 80
Рго СЬп Агд Ьеи АЬа УаЬ СЬи Зег УаЬ Рго СЬи СЬу МеЬ УаЬ Ьеи УаЬ
85 90 95
Зег Азр Суз Агд СЬп Азр АЬа ТЬг АЬа АЬа Зег АЬа СЬу Зег Не Ьеи
ЬОО 105 110
Ьеи ТЬг Агд Ьеи СЬи УаЬ Агд Ьуз Суз АЬа СЬу РЬе УаЬ Зег Азр АЬа
115 120 125
СЬу Не Агд Азр РЬе Азп Азр АЬа Зег СЬи Меб Азп Меб Рго 11е РЬе
130 135 140
Суз А1а Ьуз Рго Зег АЬа Рго ТЬг Азп Ьеи ТЬг Ьуз НЬз НЬз АЬа УаЬ
145 150 155 160
Азр Не СЬп УаЬ Рго Не СЬу Суз СЬу СЬу УаЬ Меб УаЬ Азп Рго СЬу
165 170 175
Азр УаЬ Ьеи УаЬ СЬу Азр СЬу Азр СЬу 11е Не УаЬ Не Рго УаЬ СЬи
180 185 190
Не А1а СЬп СЬи УаЬ Зег СЬи СЬи АЬа Ьеи АЬа МеЬ СЬи Ьеи РЬе СЬи
195 200 205
Азр РЬе УаЬ Ьеи Азр Ьуз УаЬ Агд АЬа СЬу Зег Ьуз УаЬ Не СЬу Ьеи
210 215 220
Туг Рго Рго Азп АЬа СЬи ТЬг Ьеи СЬи СЬи Туг Азп Азп СЬп Ьуз АЬа
225 230 235 240
<210> 17 <2Ы> 792 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 17
аЬдаПсддЬ ЬдассаассЬ даассссЬЫ дадсддЬЬЬд асдабддссд ссссааддбд 60
сссдаЬдасс Ьдсбддадсд дабдаадсЬд дбсассассд аддаддссбд дддсасдсЬс 120
ЬаЬсасдссд дсЬассбдсд ссадббсдаа ддсаадбддс асдадассса сссдддсдбс 180
аЬсасбдбсд дссдсдссдб сассдсссад ЬЬссбдсссс абсдссссда сЬассасдсс 240
дбддЬдсаад ааассддсдЬ сддсдааддс сдсддсадсд ссддбддЬса даасбсдЬдд 300
абсаЬсдада дссбдсадсд саасдасдбс аЬддЬддбсд асаЬсбЬсдд сааддбсааа 360
- 208 019971
дасддсасдд бсдбсддсда саассСдддс ассдссдбдс дсасссдсас ссдсдссддд 420
дссдбсабсд асддсддсдб дсдсдасбас садддссбда сссадсбсас сдасдЦсаас 480
ббсбасабсс дсддбабдда сссдассддс абсдссдасд бсасссбддс сддсскдаас 540
абссссабсс дсабсддбдд сбдсасадбс сбдсссддсд асдбддбссб сддсасдссс 600
адсддсдбсс бдббсабссс дссдсассбд дбдбсдаадд бддбсдадда дадсдаддас 660
дбссдсдбсс дсдасдадбб бддсаададс сдссбддссд ааддсабббд дассйссддс 720
садабсдасб сддссбддад сдасдадабс ааддссдасб бсдадаасбд дааддссаас 780
сдссссаадб ад 792 <210> 18 <211> 263 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (39) .. . (205) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 18
Меб 1 11е Агд Ьей ТЬг 5 Азп Ьей Азп Рго РЬе 10 С1и Агд РЬе Азр Азр 15 С1у
Агд Рго Ьуз Уа1 Рго Азр Азр Ьей Ьей С1и Агд Меб Ьуз Ьей Уа1 ТЬг
20 25 30
ТЬг С1и С1и А1а Тгр С1у ТЬг Ьей Туг Нтз А1а С1у Туг Ьей Агд С1п
35 40 45
РЬе С1и С1у Ьуз Тгр Н13 С1и ТЬг Нтз Рго О1у Уа1 11е ТЬг Уа1 С1у
50 55 60
Агд А1а \7а1 ТЬг А1а С1п РЬе Ьей Рго Нтз Агд Рго Азр Туг Нбз А1а
65 70 75 80
Уа1 Уа1 С1п С1и ТЬг С1у Уа1 С1у С1и 31у Агд С1у Зег А1а С1у С1у
85 90 95
С1п Азп Зег Тгр 11е 11е С1и Зег Ьей С1п Агд Азп Азр Уа1 Меб Уа1
100 105 110
Уа1 Азр 11е РЬе С1у Ьуз Уа1 Ьуз Азр С1у ТЬг \7а1 Уа1 С1у Азр Азп
115 120 125
Деи С1у ТЬг А1а Уа1 Агд ТЬг Агд ТЬг Агд А1а С1у Аба \/а1 Не Азр
130 135 140
С1у С1у Уа1 Агд Азр Туг С1п С1У Ьей ТЬг С1п Ьей ТЬг Азр Уа1 Азп
145 150 155 160
РЬе Туг 11е Агд С1у Меб Азр Рго ТЬг С1у Не А1а Азр Уа1 ТЬг Ьей
165 170 175
- 209 019971
А1а СЬу Ьеи Азп 180 11е Рго 11е Агд Не 185 С1у С1у Суз ТЬг Уа1 190 Ьеи Рго
СЬу Азр Уа1 195 УаЬ Ьеи СЬу ТЬг Рго 200 Зег С1у УаЬ Ьеи РЬе 205 11е Рго Рго
НЬз Ьеи 210 УаЬ Зег Ьуз УаЬ УаЬ 215 СЬи С1и Зег С1и Азр 220 Уа1 Агд Уа1 Агд
Азр 225 С1и РЬе СЬу Ьуз Зег 230 Агд Ьеи АЬа С1и С1у 235 11е Тгр ТЬг Зег С1у 240
СЬп 11е Азр Зег АЬа 245 Тгр Зег Азр С1и 11е 250 Ьуз АЬа Азр РЬе СЬи 255 Азп
Тгр Ьуз АЬа Азп Агд Рго Ьуз
260 <210> 19 <211> 723 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 19 абдадсдабб абассаасда даббассддс даассдссад сбдсбдаасс бббдссддас60 дадсаддааа ЬсббддаРРб Рдбасддсад аадсбдсабд бсдссдсддб ЬРдсдабабЬ120 ббддабдабб бдддсбассд саабсаадсс абдсассадс даббдсдссс дсбссбассс180 дабаббсдда асбдбддббб Рдбсдддсда дсдсдбасдб бдсдсбддаб ддадассдаб240
Рабаббдбсд аддаадабсс сбабдддсбд дадабсдасб СРабддабад Ьсбдддсдсд300 ддбдабдбса ЬбдРбсаРбс сассдасссб ддсддсасса абдссссдбд дддсдаасбс360 абдассасса Рсдссаадбб дсдсддсдса дббддсбдсд бсбдсдасад ссадабасдс420 дасасддбдс адабсабсда сабдддсббс сссдбсбасб асасдддааб РсдРссдббд480 даббссааад ддсдддсдсд сдбдабдддб ббддабсбдс ссдбасдсбд рддрдабдрд540 ббддбдсабс сбддсдарсб сабсббсдсс дассабдасд дсабсдбддб саббссдсаа600 дсдсаддрдс адсаддбасб саадсбддсс саадаааада бддадаадда даассасасд660 сдсаабдасс бдсбсдсддд саадасасбд сдсдаддбсб абдабасдба РддддбдНд720
Рад723 <210> 20 <211> 240 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
- 210 019971 <221> ДОМЕН <222> (30) . . . (197) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (221) .. . (224) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозаП ίά = Р500001
<400> 20 С1и Рго Рго А1а А1а 15 С1и
Меб 1 Зег Азр Туг ТЬг 5 Азп С1и 11е ТЬг С1у 10
Рго Ьеи Рго Азр С1и С1п С1и 11е Ьеи Азр РЬе Уа1 Агд С1п Ьуз Ьеи
20 25 30
Н15 Уа1 А1а А1а Уа1 Суз Азр 11е Ьеи Азр Азр Ьеи С1у Туг Агд Азп
35 40 45
С1п А1а Меб Нтз С1п Агд Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи Рго Азр 11е Агд Азп
50 55 60
Суз С1у РЬе Уа1 С1у Агд А1а Агд ТЬг Ьеи Агд Тгр Меб С1и ТЬг Азр
65 70 75 80
Туг 11е Уа1 С1и С1и Азр Рго Туг С1у Ьеи С1и 11е Азр РЬе Меб Азр
85 90 95
Зег Ьеи С1у А1а С1у Азр Уа1 11е Уа1 Нтз Зег ТЬг Азр Рго С1у С1у
100 105 110
ТНг Азп А1а Рго Тгр С1у С1и Ьеи Меб ТЬг ТЬг 11е А1а Ьуз Ьеи Агд
115 120 125
С1у А1а Уа1 С1у Суз Уа1 Суз Азр Зег С1п 11е Агд Азр ТЬг Уа1 С1п
130 135 140
11е 11е Азр Меб С1у РЬе Рго Уа1 Туг Туг ТЬг С1у 11е Агд Рго Ьеи
145 150 155 160
Азр Зег Ьуз С1у Агд А1а Агд Уа1 Меб С1у Ьеи Азр Ьеи Рго Уа1 Агд
165 170 175
Суз С1у Азр Уа1 Ьеи Уа1 Н15 Рго С1у Азр Ьеи 11е РЬе А1а Азр Нтз
180 185 190
Азр С1у 11е Уа1 Уа1 11е Рго С1п А1а С1п Уа1 С1п С1п Уа1 Ьеи Ьуз
195 200 205
Ьеи А1а С1п С1и Ьуз Меб С1и Ьуз С1и Азп Н13 ТЬг Агд Азп Азр Ьеи
210 215 220
Ьеи А1а С1у Ьуз ТЬг Ьеи Агд С1и Уа1 Туг Азр ТЬг Туг С1у Уа1 Ьеи
225 230 235 240
<210> 21 <211> 444 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
- 211 019971 <400> 21
абдассаадс сдсбдадбда адссдсдсдс дссаадсбсд ссассдбсад Ьассдссасд 60
сбдасдасдс аасбдббсаа дсдсдддсбд сдсаасассб Ьсабссаддд сдсасдсссд 120
сбсаабсссд асдсдссдсс дабддЬсддс ссддссбаса сдсЬдсдсба бабсссддса 180
сдсдаддаса бсдасасдсб сдабдбдббс аабдассдса сссасссдса асдсааддсс 240
дбддаддаса Ьсссдссддд садсдбдсСд дбдабддасб дссдсддсда сдсдадсдбс 300
дсдбсддссд дсадсабссб ддбдасссдс абдабдабдс дсддсдсадс сддсдбддбс 360
адсдасддсд дссбдсдсда ббсссссдад абсдсдаадс бссссббссс сассбасбдс 420
садддсдддб сддсдсссас саас 444
<210> 22 <211> 148 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <400> 22
Меб 1 ТИг Ьуз Рго Ьеи 5 Зег С1и А1а А1а Агд 10 А1а Ьуз Ьеи А1а ТНг 15 Уа1
Зег ТНг А1а ТНг Ьеи ТНг ТНг С1п Ьеи РНе Ьуз Агд С1у Ьеи Агд Азп
20 25 30
ТЬг РНе 11е С1п С1у А1а Агд Рго Ьеи Азп Рго Азр А1а Рго Рго Меб
35 40 45
Уа1 С1у Рго А1а Туг ТНг Ьеи Агд Туг 11е Рго А1а Агд С1и Азр 11е
50 55 60
Азр ТНг Ьеи Азр Уа1 РНе Азп Азр Агд ТНг Н1з Рго С1п Агд Ьуз А1а
65 70 75 80
Уа1 С1и Азр 11е Рго Рго С1у Зег Уа1 Ьеи Уа1 МеЬ Азр Суз Агд С1у
85 90 95
Азр А1а Зег Уа1 А1а Зег А1а С1у Зег 11е Ьеи Уа1 ТНг Агд Меб Меб
100 105 110
МеО Агд С1у А1а А1а С1у \7а1 Уа1 Зег Азр С1у С1у Ьеи Агд Азр Зег
115 120 125
Рго С1и Не А1а Ьуз Ьеи Рго РНе Рго ТНг Туг Суз С1п С1у С1у Зег
130 135 140
А1а Рго ТИг Азп
145
<210> 23
<211> 801
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
- 212 019971
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 23 абдаЬсааП дссбсдсддс Ьааассасад сддссббссс ааСЬабссаа ЬсссбаОсад 60
дадссСдсса ЬдссадссаЬ сЬсссЬсдаа дСдсПдада аасСдсдсдс аОасдабасд 120
сссассаНЬ дсаасдрдаб сдадсЬдПс дасдбдсддс сдсдсассад сддсЬасабд 180
дабдсссдса Ьссдсдссбд сЬЬссссдад абдссдссдд ЬддбдддсЬЬ ЬдссЬссасс 240
дссассЬЬсс дсдсЬЬсСда адсдссдсбс Ьссддсссдд абабсбасдд сЬсдсбдаас 300
сЬдсаадЪдд ададсПЬдд сасдсбсбсс ддсссддсса ЬсдСддСсй: ЬсаадассЬд 360
дасдасссдд сддбддсддс аассЬЬЬддс даддбдабдб дсассассОа ссадасдбас 420
ддабсддЬсд ддсСдабсас сЬсбддсдсд дддсдсдасс ЬддассаддЬ асдсаадабб 480
ддЬЬасбсдд ЬсЬЬсассаа сддсдсдаЬЬ Ьдсбсдсасд дсЬасбдсса саЬЬссддаЬ 540
дЬсаасдбдс сддбдсдддЬ дддсддсЬЬа аЬсдбдсдсс сддаЬдабсЬ дсСдсасабд 600
дасдбдаасд дсдЬдассаа сабссссаад дадабсдсдд сддаддбддс ддаддссрдс 660
даддссбасд Ьддсддсдда дабддсдасд сбдаасдддс бдсабдсдба Ьаддсаадаб 720
ддддабдссд ддаадсбдса ададдсдаад ааддададба аааддсЬдаб дсаддсдсЬд 780
ааддаасддд Ьдаддаддба а 801
<210> 24 <211> 266 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (36) . . . (207) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 24
Меб 1 11е Азп Суз Ьеи 5 А1а А1а Ьуз Рго С1п 10 Агд Рго Зег С1п Ьеи 15 Зег
Азп Рго Туг С1п С1и Рго А1а Меб Рго А1а Не Зег Ьеи С1и Уа1 Ьеи
20 25 30
С1и Ьуз Ьеи Агд А1а Туг Азр ТЬг Рго ТЬг Не Суз Азп Уа1 Не С1и
35 40 45
Леи РЬе Азр Уа1 Агд Рго Агд ТЬг Зег С1у Туг МеЬ Азр А1а Агд Не
50 55 60
Агд А1а Суз РЬе Рго С1и Меб Рго Рго Уа1 Уа1 С1у РЬе А1а Зег ТЬг
65 70 75 80
А1а ТЬг РЬе Агд А1а Зег С1и А1а Рго Ьеи Зег С1у Рго Азр Не Туг
85 90 95
С1у Зег Ьеи Азп Ьеи С1п Уа1 С1и Зег РЬе С1у ТЬг Ьеи Зег С1у Рго
- 213 019971
100 105 ыо
АЬа Не УаЬ УаЬ РЬе СЬп Азр Ьеи Азр Азр Рго АЬа УаЬ АЬа АЬа ТЬг
115 120 125
РЬе СЬу СЬи УаЬ МеС Суз ТЬг ТЬг Туг СЬп ТЬг Туг СЬу Зег УаЬ СЬу
130 135 140
Ьеи Не ТЬг Зег СЬу АЬа СЬу Агд Азр Ьеи Азр СЬп УаЬ Агд Ьуз 11е
145 150 155 160
СЬу Туг Зег УаЬ РЬе ТЬг Азп СЬу АЬа 11е Суз Зег НЬз СЬу Туг Суз
165 170 175
НЬз Не Рго Азр УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ Агд УаЬ СЬу СЬу Ьеи Не УаЬ
180 185 190
Агд Рго Азр Азр Ьеи Ьеи НЬз МеС Азр УаЬ Азп СЬу УаЬ ТЬг Азп Не
195 200 205
Рго Ьуз СЬи Не АЬа АЬа СЬи УаЬ А1а СЬи АЬа Суз СЬи АЬа Туг УаЬ
210 215 220
АЬа АЬа СЬи Меб АЬа ТЬг Ьеи Азп СЬу Ьеи НЬз АЬа Туг Агд СЬп Азр
225 230 235 240
СЬу Азр АЬа СЬу Ьуз Ьеи СЬп СЬи АЬа Ьуз Ьуз СЬи Зег Ьуз Агд Ьеи
245 250 255
МеС СЬп АЬа Ьеи Ьуз СЬи Агд УаЬ Агд Агд
260 265
<210> 25 <2Ы> 741 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 25
аСддсСдада адааасСдас сдддсддаСС дсдсдддада аааСсаддСС даСддаддСд 60
ссдсддссдс сдсааддсдС сдСсдадсдд ССсаадСсдс СсддсдаССд сассддсаСс 120
аСССссдаса ссаСддаСда асСдддсаСс ссдаасддсд СдаСсддсдс дСсадСдсСд 180
сдассаасса Сссссддсас сдСсаСсдсс дддссддсдС СдасдсСдсд саасаССсСс 240
садсдсаСсд аСссасСсдс сддсдсдсдс дадсасдСса асаадаСддс сдадССсдаа 300
СдСсасаасс Ссдсдасссс дддсдасдСд сСддСдаСсс адддддСдсс даасдСсСсс 360
адСаСдддад дсаСсСсддс дсСдассддс аадсдсдссд дСдаадСсдд сдссаСсдСс 420
дааддсддса СссдсдасаС СдсасаССсд сдСдаддССд дсСССссасС дСддСсдадс 480
садаСсасдс сддСсассдд саадСддсдд сСддаддсдд ссдадаСсаа сддсассаСс 540
даааСсддсд дсдСдсаддС дсассссддс даСсСддСдд Сддссдасда сассддсдСс 600
СдсССсаСсс сдсдсдасаа саССсСддаа дСдсСсдссд адСдсдадаа дааадсдаад 660
- 214 019971 дссдаддасс ЕдсдсЕдсаа ддсдаЕсдаЕ ддсддсдЕсс сддЕдссдда ЕаЕсЕсдааа 720
ЕсдасдЕаЕд дададасдЕд а 741 <210> 26 <211> 246 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (38) .. . (202) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (119) ... (122) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозгЕе ίά = Р300001 <220>
<221> САЙТ <222> (179) ... (182) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозгЕе ίά = Р300001 <400> 26
МеЕ 1 А1а С1и Ьуз Ьуз 5 Ьей ТНг С1у Агд 11е 10 А1а Агд С1и Ьуз 11е 15 Агд
Ьей МеЕ С1и Уа1 Рго Агд Рго Рго С1п С1у Уа1 Уа1 С1и Агд РНе Ьуз
20 25 30
Зег Ъеи С1у Азр Суз ТНг С1у 11е 11е Зег Азр ТНг МеЕ Азр С1и Ьей
35 40 45
С1у 11е Рго Азп С1у Уа1 11е С1у А1а Зег Уа1 Ьей Агд Рго ТНг 11е
50 55 60
Рго С1у ТНг Уа1 11е А1а С1у Рго А1а Ьей ТНг Ьей Агд Азп 11е Ьей
65 70 75 80
С1п Агд 11е Азр Рго Ьей А1а С1у А1а Агд С1и Нгз Уа1 Азп Ьуз МеЕ
85 90 95
А1а С1и РНе С1и Суз Н1з Азп Ьей А1а ТНг Рго С1у Азр Уа1 Ьей Уа1
100 105 110
11е С1п С1у Уа1 Рго Азп Уа1 Зег Зег МеЕ С1у С1у 11е Зег А1а Ьей
115 120 125
ТНг С1у Ьуз Агд А1а С1у С1и Уа1 С1у А1 а 11е Уа1 С1и С1у С1у 11е
130 135 140
Агд Азр 11е А1а Н13 Зег Агд С1и Уа1 С1у РНе Рго Ьей Тгр Зег Зег
145 150 155 160
С1п 11е ТНг Рго Уа1 ТНг С1у Ьуз Тгр Агд Ьей С1и А1а А1а С1и 11е
165 170 175
Азп С1у ТНг 11е С1и 11е С1у С1у Уа1 С1п Уа1 Нгз Рго С1у Азр Ьей
180 185 190
- 215 019971
Уа1 \7а1 А1а 195 Азр Азр ТЬг С1у Уа1 200 Суз РЬе 11е Рго Агд 205 Азр Азп 11е
Ьеи С1и 210 Уа1 Ьеи А1а С1и Суз 215 С1и Ьуз Ьуз А1а Ьуз 220 А1а С1и Азр Ьеи
Агд 225 Суз Ьуз А1а Не Азр 230 С1у С1у Уа1 Рго Уа1 235 Рго Азр 11е Зег Ьуз 240
Зег ТЬг Туг С1у С1и ТЬг
245 <210> 27 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 27
аЬдаЬЬЬабс адссддддас аасаддсабс дЬсдбдсадд абаЬЬдсасд сдсбдаЬсаа 60
дссаЬЬабсд абддссбадс адааЬдЬддб дбддсдасдд ЬдсаЬдаддс асаддддсдс 120
аадддссбдб ЬддсддаСЬа ЬаЬдасдссд аЬЬЬасбсдд дсдсдсдсаб сдсбддаСсб 180
дсддЬдасса ЬЬсбддсасс дссдбдбдас ааЬЬддабда ЬссаЬдЬддс ддбадаасад 240
ЬЬдсаааадд дсдабдЬдЬЬ дсбдсЬдддс асдабсасас сдбссааЬдс ЬддсЬаЬЬЬс 300
ддбдасЬЬдс ЬддссасдЬс адссаЬддсд сасддЬЬдЬс дсддаЬЬдаб саЬЬдабддс 360
ддбдбдсдсд абдбдсаада дсбдасддаб абдддсЬЬЬс сддЬЬЬддЬс сааддссдба 420
сабдсссаад дсасааЬсаа адааасдсбд ддабсддЬса асдбдссадЬ ЬдЬсЬдсддс 480
саададНдд Ьааассссдд ЬдабаЬЬдЬд дбддссдасд абдасддддЬ дбдсдЬЬдЬд 540
сдссдсдаад аадсЬдсбда ЬдЬдсбддсЬ ааддсдсддд сдсдсдадад саабдаадсд 600
дссаадсдсд сдсдЬЬЬЬда ддссддбдад сЬддддсбдд аЬабсЬабда саЪдсдсдсд 660
сддсбддссд аааааддасб даааЬасдбс Ьда 693
<210> 28 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (27)...(179) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 28
Меб 11е Туг С1п Рго <31 у ТНг ТНг С1у 11е \/а1 Уа1 С1п Азр 11е А1а 15 10 15
- 216 019971
Агд А1а Азр С1п 20 А1а 11е Не Азр СЬу 25 Ьеи А1а СЬи Суз СЬу 30 УаЬ А1а
ТЬг Уа1 ΗΪ5 С1и А1а С1п СЬу Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а Азр Туг МеЬ
35 40 45
ТЬг Рго 11е Туг Зег С1у А1а Агд 11е АЬа СЬу Зег АЬа Уа1 ТЬг 11е
50 55 60
Ьеи А1а Рго Рго Суз Азр Азп Тгр МеЬ Не НЬз УаЬ АЬа Уа1 С1и СЬп
65 70 75 80
Ьеи С1п Ьуз СЬу Азр Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи СЬу ТЬг Не ТЬг Рго Зег Азп
85 90 95
АЬа С1у Туг РЬе СЬу Азр Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег АЬа МеЬ АЬа НЬз СЬу
100 105 110
Суз Агд СЬу Ьеи 11е 11е Азр С1у СЬу Уа1 Агд Азр УаЬ С1п СЬи Ьеи
115 120 125
ТЬг Азр МеЬ СЬу РЬе Рго Уа1 Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 НЬз А1а СЬп СЬу
130 135 140
ТЬг 11е Ьуз С1и ТЬг Ьеи СЬу Зег Уа1 Азп УаЬ Рго Уа1 УаЬ Суз СЬу
145 150 155 160
С1п С1и Ьеи УаЬ Азп Рго СЬу Азр 11е Уа1 УаЬ А1а Азр Азр Азр СЬу
165 170 175
Уа1 Суз Уа1 \7а1 Агд Агд С1и С1и А1а А1а Азр УаЬ Ьеи АЬа Ьуз АЬа
180 185 190
Агд АЬа Агд СЬи Зег Азп СЬи А1а А1а Ьуз Агд А1а Агд РЬе СЬи А1а
195 200 205
СЬу СЬи Ьеи С1у Ьеи Азр 11е Туг Азр МеЬ Агд А1а Агд Ьеи АЬа СЬи
210 215 220
Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
225 230 <210> 29 <211> 756 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 29
ЬЬдсадсдас адсЬЬЬссас асЬдсадсдд сдаЬддаадд сЬЬаЬасдЬс дддсаЬддаа 60
садаадаЬЬд сддаасддсЬ дЬсддссЬЬд ЬсддЬддсдс аЬсЬддссда ЬддсЬдссЬд 120
сдЬдссддаа сддсдаЬдсд ддЬддЬддсс ааЬсЬасссс сдаЬсдЬадс ЬддЬсадсда 180
асдЬссддсс ддасасддсс ддЬдсддсаЬ Ьасддсадсд ЬсдасдЬсЬЬ ссЬЬдаадсд 240
сЬддссдасс ссадддсддд сдаЬдЬдсЬд дЬсдЬсдаса аЬддсдассд ддасдаЬдаа 300
ддсЬдсаЬсд дсдассЬдас ддсдсЬддаа дЬсдсЬсадд ссдддсЬддс сдддаЬсаЬс 360
- 217 019971
абсбсдддсс ддсассдсда сасддсдабс сбссдсбсса ИссааЬсдс сШдИсадс 420
сдсддбдссЬ дсдсдсдбдд дссддбссдд сСсдасдбсс дсдсдссдда дасаЬЬсдбс 480
адсдсссдса ЬЬддсдасда ддбсдбаасс дсадсадаЬЬ дддбадсддс сдабдасдас 540
ддсдссабсЬ Ьсабсддсда саассабаЬЬ дсддсддбдд Ьсдсддсддс ддадЬсдабс 600
сдсдасассд адсбссддса дассдддсбд абдааддссд ддасаадсЫ дсдсдадсад 660
сббдаддбсд сддсНабсЬ ддасдсдсдд дсддсддабс сддсдсбдда сЬЬссдсдсс 720
саЫЛдсдсд сдсбсаасдс ддсдабсдад даабда 756
<210> 30 <211> 251 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (28) ... (184) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 30
Меб 1 С1п Агд С1п Ьеи 5 Зег ТЬг Ьеи С1п Агд 10 Агд Тгр Ьуз А1а Туг 15 ТЬг
Зег С1у Меб С1и С1п Ьуз Не А1а С1и Агд Ьеи Зег А1а Ьеи Зег Да1
20 25 30
А1а Нтз Ьеи А1а Азр С1у Суз Ьеи Агд А1а С1у ТЬг А1а Меб Агд Да1
35 40 45
Да1 А1а Азп Ьеи Рго Рго 11е Уа1 А1а С1у С1п Агд ТЬг Зег С1у Агд
50 55 60
ТЬг Агд Рго Уа1 Агд Н13 Туг С1у Зег Уа1 Азр Уа1 РЬе Ьеи С1и А1а
65 70 75 80
Ьеи А1а Азр Рго Агд А1а С1у Азр Уа1 Ьеи Уа1 \7а1 Азр Азп С1у Азр
85 90 95
Агд Азр Азр С1и С1у Суз 11е С1у Азр Ьеи ТЬг А1а Ьеи С1и Уа1 А1а
100 105 110
С1п А1а <31у Ьеи А1а С1у 11е 11е 11е Зег СЬу Агд НЬз Агд Азр ТЬг
115 120 125
А1а 11е Ьеи Агд Зег 11е Рго 11е А1а Ьеи РЬе Зег Агд С1у А1а Суз
130 135 140
А1а Агд С1у Рго Уа1 Агд Ьеи Азр \7а1 Агд А1а Рго СЬи ТЬг РЬе Уа1
145 150 155 160
Зег А1а Агд 11е С1у Азр С1и Уа1 Уа1 ТЬг А1а А1а Азр Тгр Да1 А1а
165 170 175
А1а Азр Азр Азр С1у А1а Не РЬе 11е С1у Азр Азп НЬз 11е А1а А1а
- 218 019971
180 185 190
Уа1 Уа1 А1а А1а А1а С1и Зег 11е Агд Азр ТНг С1и Ьеи Агд С1п ТНг
195 200 205
С1у Леи Меб Ьуз А1а С1у ТНг Зег Ьеи Агд С1и С1п Ьеи С1и Уа1 А1а
210 215 220
А1а Туг Ьеи Азр А1а Агд А1а А1а Азр Рго А1а Ьеи Азр РНе Агд А1а
225 230 235 240
Н13 Ьеи Агд А1а Ьеи Азп А1а А1а 11е С1и С1и
245 250 <210> 31 <211> 327 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 31 дбдадасадд даабдсдасб бдсбсасасд сдбдбддсдс ссдаасббдб абсддссббс 60
бсддсбдббс адассдссас даббсасдад дсасааддбд дбабсддбдс ддбсдсддсд 120
дабаббсдсс сбсбсдассд ддсаабдбсс абсбдсддсс сбдсссбдас дабсаааасб 180
ссдсссдсдд асаассбддс дсббсассад дсдсбббабс бсдсддаасс дддбдасдбд 240
сбддбддбсд аббдсдсаад ссасассдад дссдддсааб ддддсддсаб бсбсабддаа 300
дсадссаадд бдсдсддсаб адссддд 327
<210> 32 <211> 109 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <400> 32
Меб 1 Агд С1п С1у Меб 5 Агд Ьеи А1а Низ ТНг 10 Агд Уа1 А1а Рго С1и 15 Ьеи
Уа1 Зег А1а РНе Зег А1а Уа1 С1п ТНг А1а ТНг Не Н13 С1и А1а С1п
20 25 30
С1у С1у 11е С1у А1а \7а1 А1а А1а Азр Не Агд Рго Ьеи Азр Агд А1а
35 40 45
Меб Зег 11е Суз С1у Рго А1а Ьеи ТНг 11е Ьуз ТНг Рго Рго А1а Азр
50 55 60
Азп Ьеи А1а Ьеи Н13 С1п А1а Ьеи Туг Ьеи А1а С1и Рго С1у Азр Уа1
65 70 75 80
Ьеи Уа1 Уа1 Азр Суз А1а Зег Н1з ТНг С1и А1а С1у С1п Тгр С1 у С1у
85 90 95
- 219 019971
Не Ьеи Меб С1и А1а А1а Ьуз Х7а1 Агд С1у 11е А1а С1у 100 105 <210> 33 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 33
дсдсбсдада дсдбсасдас сдсдасдсбд ассассдбдс Ьдсбдаадса дддссбдсдс 60
аасдЬсбдда Ьдсдсддсас ссддссдсбд дсдадсддбс адссдсдсаа ддбсдддсдс 120
дсдббсасдс ЬссдсЬЬсдб дссддсдсдс даддассбсд сдассссддс ЬЬсабддддс 180
дсдссдабсЬ сдасссдсдс сдсдабсдад дсдабдссдд ааддсдбдаб сдсддбсдсс 240
дабдсдабдд дсдбдасбда сдссддсабс ЬЬсддсдаса ЬссЬдбдсдс ссддабдсдс 300
сддсдсаасд Ьддссдсдсб сдбдассдас ддсдбдабсс дсдассбддс сддсдбдсбд 360
адсассддсс ЬдссддЬсбд дбдссадддб ассдсадсдс сЬЬсдбсддЬ сассддссбд 420
ассЬЬсдбсд ссбддсадса дссддбсддс Ьдсддбдддд ЬддсддЬдЬЬ сссдаасдас 480
дЬддбсдбса Ьсдасдссда сддсдсддбс дЬсабсссдд сЬдсдсбдсЬ сдаЬддсдбс 540
абсдсддадд сдабсдадса ддадасссад дадддсбдда Ьсабдсддда ддбддадддс 600
ддбдсддсдс Ьдссдддссб сЬаЬссдабд аасдаддсда сдааддсдсд сбасдаадсс 660
Ьддаадаадд сдадсдасбд а 681
<210> 34 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (3)...(171) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 34
А1а 1 Ьеи С1и Бег Уа1 5 ТЬг ТЬг А1а ТЬг Ьеи 10 ТЬг ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи 15 Ьуз
61п С1у Ьеи Агд Азп Уа1 Тгр Меб Агд С1у ТЬг Агд Рго Ьеи А1а Зег
20 25 30
С1у С1п Рго Агд Ьуз Уа1 С1у Агд А1а РЬе ТЬг Ьеи Агд РЬе Уа1 Рго
35 40 45
А1а Агд С1и Азр Ьеи А1а ТЬг Рго А1а Зег Тгр О1у А1а Рго 11е Зег
50 55 60
ТЬг Агд А1а А1а 11е С1и А1а Меб Рго С1и <31 у Уа1 11е А1а Уа1 А1а
- 220 019971
70 75 80
Азр А1а Мер СЬу УаЬ 85 ТЬг Азр А1а СЬу 11е 90 РЬе СЬу Азр 11е Ьеи 95 Суз
А1а Агд Меб Агд Агд Агд Азп УаЬ АЬа А1а Ьеи УаЬ ТЬг Азр СЬу УаЬ
100 105 110
11е Агд Азр Ьеи А1а СЬу УаЬ Ьеи Зег ТЬг С1у Ьеи Рго УаЬ Тгр Суз
115 120 125
С1п СЬу ТЬг А1а А1а Рго Зег Зег УаЬ ТЬг С1у Ьеи ТЬг РЬе УаЬ АЬа
130 135 140
Тгр СЬп С1п Рго УаЬ СЬу Суз СЬу СЬу УаЬ А1а УаЬ РЬе Рго Азп Азр
145 150 155 160
\7а1 УаЬ УаЬ 11е Азр А1а Азр СЬу АЬа УаЬ УаЬ 11е Рго АЬа А1а Ьеи
165 170 175
Ьеи Азр СЬу УаЬ 11е А1а СЬи А1а I Ье СЬи С1п СЬи ТЬг СЬп СЬи СЬу
180 185 190
Тгр 11е Меб Агд СЬи УаЬ С1и СЬу СЬу АЬа АЬа Ьеи Рго СЬу Ьеи Туг
195 200 205
Рго Меб Азп СЬи А1а ТЬг Ьуз А1а Агд Туг С1и А1а Тгр Ьуз Ьуз А1а
210 215 220
Зег Азр
225 <210> 35 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 35 дбдассдабс сддРРдбсдб Рсдасадабс дасаддссдб ссдсдаабсб ддРсдсбдаб60 сбдсадсдсб асддсдбсбс сассдбдсас даддсдсаад ддсдбсдсдд ссбдсбсдсд120
Рсдбасабдс ддссдабсба Рдссддсдсд сбсабсдссд дбсссдсдаб сасддбссбд180 дбдссдссбд дсдасаасбб дабдабссас дбсдссдбдд аадбдбдсса дсссддсдас240 дРРсРсабсд Рсдссассас сбсдссдбдс ассдасддсб абРРсддсда дсбдсбддсд300 асдбсдсбдс дддсссдсдд сдбддсдддд срсдбдабсд абдсдддсбд ссдддабдбб360 сдсдсдсбда садааабдсд аРРРсссдбс Рддадссдсд сдабсадсдс дсадддаасс420 дбсааадсда сдсбдддсбс ддбдаасдсд дсддбддрдб дсдссддддс дбсддрдада480 дссддддабс Рсабсдбддс сдасдабдас ддддбддбдд сддбдсддсд ддаддаадбс540 дбсдссдбда сдсаддсадс сдаасадсдс дббсдсаадд аададддсас дсдсдсасдд600 сбсдсдсадд дсдадсбсдд ссбддасарр Расддсббдс дссадаадсб дРсддабсбс660
- 221 019971 ддсббдаадб сабсдбсдбд а 681 <210> 36 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) . . . (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 36
Меб 1 ТНг Азр Рго \7а1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п Не 10 Азр Агд Рго Зег А1а 15 Азп
Деи Уа1 А1а Азр Ьеи С1п Агд Туг С1у Уа1 Зег ТНг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а Ьеи Не А1а С1у Рго А1а Не ТНг Уа1 Ьеи Уа1 Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Ηί3 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Рго С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Не Уа1 А1а ТНг ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд А1а Агд С1у Уа1 А1а С1у Ьеи Уа1
100 105 но
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТНг С1и Меб Агд РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп А1а А1а Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Зег Уа1 Агд
145 150 155 160
А1а С1у Азр Ьеи Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 А1а Уа1 Агд
165 170 175
Агд С1и С1и Уа1 Уа1 А1а Уа1 ТНг С1п А1а А1а С1и С1п Агд \7а1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и С1у ТНг Агд А1а Агд Ьеи А1а С1п С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд С1п Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Бег Зег
225
- 222 019971 <210> 37 <2Ы> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно <220> ' <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 37 аСддссддсд СсдСддССса асадаСсдад сдсдссддСс СсдасасСдс сдсСдсссСс60 ддддааСдсд дсдСсдссас адСдсасдад дсдсадддсс ддасадддсС даСдсдсСсс120
СасаСдсддс сдаСССаССс аддсдсссдс дССдсдддсс ссдсддСаас ддСдСсСаСс180 ссдссдддсд асаасСддаС даССсасдСс дсСдСддаас адСдссддда аддсдасдСс240 сСсдСсдСдд сдссдасдад СссССдсдад дасддсСаСС СсддсдадсС дсСсдссСдс300
СсдсСдсада сссдссдадС дадсддСсСс аСсаСададд ссддддСдсд сдасдСссдс360 дадсСдассд адаСдсддСС сссддСССдд Сссааддсда ССсСсдсаса адддасСдСд420 ааддааасса СсддсСсддС даасдСсдса аСсдСсСдсд ссддСдсддс ддСсадСссс480 ддсдасдСда СсдСсдссда Сдасдасддс дСсСдсаССд Сдссдсдсдд асаддсддад540 асддСдсССс аддсдадссд сдсссдсдад дсдааддадд ссдааасдсд дсддсддсСс600 сддСсдддсд аасСсддссС сдаСаСсСас адсаСдсдсд аааадсСддс ддссаддддс 660 сСдаааСаСд СсСда675 <210> 38 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21) . . . (173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 38
МеС 1 АЬа С1у УаЬ Уа1 5 УаЬ СЬп СЬп 1Ье СЬи 10 Агд АЬа СЬу Ьеи Азр 15 ТЬг
А1а А1а А1а Ьеи СЬу СЬи Суз СЬу УаЬ АЬа ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп
20 25 30
С1у Агд ТНг СЬу Ьеи МеС Агд Зег Туг МеС Агд Рго 1Ье Туг Зег СЬу
35 40 45
А1а Агд УаЬ А1а СЬу Рго АЬа УаЬ ТЬг УаЬ Зег 11е Рго Рго СЬу Азр
50 55 60
Азп Тгр МеС 11е НЬз Уа1 АЬа УаЬ СЬи СЬп Суз Агд С1и СЬу Азр Уа1
65 70 75 80
Ьеи УаЬ УаЬ А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз СЬи Азр СЬу Туг РЬе СЬу СЬи
- 223 019971
90 95
Ьеи Ьеи А1а Суз 100 Зег Ьеи С1п ТНг Агд 105 Агд Уа1 Зег С1у Ьеи 110 11е 11е
С1и А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 Агд С1и Ьеи ТНг С1и Меб Агд РНе Рго
115 120 125
Уа1 Тгр Зег Ьуз А1а 11е Ьеи А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг 11е
130 135 140
С1у Зег Уа1 Азп Уа1 А1а 11е Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 Зег Рго
145 150 155 160
С1у Азр Уа1 11е νβΐ А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз 11е Уа1 Рго Агд
165 170 175
С1у С1п А1а С1и ТНг Уа1 Ьеи С1п А1а Зег Агд А1а Агд С1и А1а Ьуз
180 185 190
С1и А1а С1и ТНг Агд Агд Агд Ьеи Агд Зег С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр
195 200 205
Не Туг Зег МеЕ Агд С1и Ьуз Ьеи А1а А1а Агд С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220
<210> 39 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 39
абддссааад ЬбдНбсаааа НаЬсдаасдс дсадсссааа аддбдаббда НдсдсННддд 60
дссбдсддбд ббдссасддб дсабдаддсд саддддсдса ааддссбдсН сдсббссбаб 120
абдсддссда бббаббссдд бдсдсддсбб дсддсабсдд сддбдассаб абсддсбдса 180
сссддбдаба асбддабддб дсабдбддсд аббдадсаад бдааададдд сдасаббббд 240
дЬдсбСдссс сдассбсдсс Нбдбдаадас ддсбабНЬд дсдабсбдсб ддсдасабсд 300
абдсаддсдс дбддсдддсд Ндддсбдабб абсдабдссд дддббсдсда Наббсдсдаб 360
сбдасддааа ЬдддЫгббсс ддбдбддбса ааддсдаббН абдсссаадд сасддбсаад 420
аааасдсбдд ддбсддббаа баНбссбабс дбсбдсдссд дЬдсдсбЬаб саабдсбддс 480
дасаЬбаббд НЬдссдабда Ьдасддбдбд бдбдббдбдд сссдадаада ддссдаадсд 540
дЬдсбддсса аддсдсаддс дсдсдаддсс аабдаддаад асаадсдсаа дсддЬбддсб 600
дссддбдадб бддддсббда Ьабдбабаас абдсдсдсас ддсбддсдда ааадддссбд 660
ааабаНдббб ад 672
<210> 40 <211> 223 <212> БЕЛОК
- 224 019971 <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) . .. (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 40 Аба Аба Сбп Ьуз Уаб 15 16е
Меб 1 Аба Ьуз Уаб Уаб 5 Сбп Азп 11е С1и Агд 10
Азр А1а Ьей Сбу Аба Суз С1у Уаб Аба ТЬг Уаб Нбз Оби Аба Сбп Сбу
20 25 30
Агд Ьуз Сбу Ьей Ьей Аба Зег Туг Меб Агд Рго I бе Туг Зег Сбу Аба
35 40 45
Агд Ьей Аба Аба Зег Аба Уаб ТЬг Пе Зег Аба Аба Рго Сбу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уаб Нбз Уаб Аба 11е С1и С1п Уаб Ьуз Сби Сбу Азр 11е Ьей
65 70 7 5 80
Уаб Ьей Аба Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр Сбу Туг РЬе Сбу Азр Ьей
85 90 95
Ьей А1а ТЬг Зег Меб С1п Аба Агд 61 у Обу Агд Сб у Ьей ббе I бе Азр
100 105 660
А1а С1у Уаб Агд Азр 11е Агд Азр Ьей ТЬг Оби Меб Сбу РЬе Рго Уаб
115 120 625
Тгр Зег Ьуз Аба 11е Туг Аба С1п Сбу ТЬг Уаб Ьуз Ьуз ТЬг Ьей Сбу
130 135 640
Зег Уаб Азп 11е Рго 11е Уаб Суз Аба Обу Аба Ьей ббе Азп Аба Сбу
145 150 155 660
Азр 11е 11е Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уаб Уаб Аба Агд 66и
165 170 675
Оби Аба С1и Аба Уаб Ьец Аба Ьуз Аба Сбп Аба Агд Оби Аба Азп 66и
180 185 190
Оби Азр Ьуз Агд Ьуз Агд Ьей А1а Аба 61у С1и Ьей Сбу Ьей Азр Меб
195 200 205
Туг Азп Меб Агд Аба Агд Ьей Аба 61ц Ьуз Сбу Ьей Ьуз Туг Уаб
210 215 220
<210> 41 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 41 абдддбдбсд бддбссадаа саббдсссдс дсадссбссд абдбсабсда бсддсбсдса 60
- 225 019971
дссбдсддбд бсдсаасддб асабдаддсд садддбсдса сддддсбдсб бдссадссаб 120
абдсддссда бсбабссддд сдсдсддсбс дсддсаадсд сддбдассаб сбсбдсдссд 180
ссаддбдаса асбддабдаб ссабдбддсд абсдадсадб бдааддабдд сдасдбдсбд 240
сбдсбсдсдс сдасдадссс сбдсдаддаб ддсбабббсд дсдассбссб ддсдасдбсд 300
дссадддсда ддддсбдссд дддссбдабс абсдабдссд дсдбдсдсда сдббдссдаб 360
сбдассдада бдаадбббсс сдбсбддбсд ааддсдабсб ббдсдсаддд аассдбсаад 420
дадасбдбсд дабсддбдаа бдбассддбс дбббдсдссд дбдсбббсдб саабссдддс 480
дабдбдабсд бсдссдасда бдасддсдсс бдсдбсдбдс сссддсаада сдсддссдаб 540
дбддссдаса аддсддаддс асдбдбсдсб дссдаддадд ссаадсдсаа дсддсбддса 600
бсдддсдадс ббдддсбсда сабсбасдас абдсдсдддс ддсбддсдса даддддссбд 660
ааабабдбсб да 672
<210> 42 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 42 Азп 11е А1а Агд 10 А1а А1а Зег Азр Уа1 15 11е
Меб 1 С1у νβΐ \7а1 Уа1 5 С1п
Азр Агд Ьеи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 Н13 С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТЬг С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Низ Меб Агд Рго 11е Туг Рго С1у А1а
35 40 45
Агд Ьеи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТЬг 11е Зег А1а Рго Рго С1 у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е Нтз Уа1 А1а Не С1и С1п Ьеи Ьуз Азр С1у Азр Уа1 Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег А1а Агд А1а Агд С1у Суз Агд С1у Ьеи 11е 11е Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а 11е РЬе А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Уа1 С1у
130 135 140
- 226 019971
Зег 145 Уа1 Азп УаЬ Рго УаЬ 150 УаЬ Суз АЬа СЬу А1а 155 РЬе УаЬ Азп Рго СЬу 160
Азр УаЬ ЬЬе УаЬ А1а Азр Азр Азр СЬу АЬа Суз УаЬ УаЬ Рго Агд С1п
165 170 175
Азр А1а А1а Азр УаЬ АЬа Азр Ьуз АЬа С1и АЬа Агд УаЬ АЬа АЬа СЬи
180 185 190
С1и А1а Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Зег С1у С1и Ьеи СЬу Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг Азр Меб Агд СЬу Агд Ьеи АЬа СЬп Агд СЬу Ьеи Ьуз Туг УаЬ
210 215 220
<210> 43 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 43 абдадсдбсд бсдббсадаа сабсдсдсдс дссдабсааб ссабсдбсда баддсбсддд60 дссбдсддсд бсдссассдб дсасдаадсд садддссдса ааддаббдсб сдсдадссас120 абдсддссда Ьсбаббссдд сдсдсддсбс дсддсдадсд ссдбдассаб сбсддсдссд180 ссдддбдаса аббддабддб ссабдбсдсд абсдадсааб Сдсдадссдд сдасаббабд240 дбдсбсдсдс сдассадссс дбдсдаддаб ддсбабббсд дбдабсбдсб сдсдассбсд300 дсдааадсдс ддддсбдссд сддбсбсабс абсдабдссд дсдбдсдсда бдбсдссдаб360 сбсассдсда Ъдсадбббсс сдбсбддбсс ааддссдбсб бсдсссаддд аассдбдаад420 дааасдсбсд дсбсддбааа сабссссдбд дбсбдсдссд дбдсдсбддб саабссдддс480 дабдбсабсд бсдссдабда сдабддбдбс бдсдбсдбдс дссдсдаада ддсддаддсд540 дбддсдсада аддссдаддс ссдсдбсдсс дссдаддадд абаадсдсаа дсдссбсдсс600 дссддсдаас Осддссбсда сабсбасаад абдсдсдадс ддсбсдссда дааддддсбс 660 ааабабдбсб да672 <210> 44 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 44
- 227 019971
Меб 1 Зег Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п Азп Не А1а Агд 10 А1а Азр С1п Зег Не 15 Уа1
Азр Агд Ьеи С1у А1а Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Н1з С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Н1з Меб Агд Рго Не Туг Зег С1у А1а
35 40 45
Агд Ьеи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТНг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уа1 Н13 Уа1 А1а Не С1и С1п Ьеи Агд А1а С1у Азр Не Меб
65 70 75 80
Уа1 Ьеи А1а Рго ТНг Зег Рго Суз С1и Азр СИу Туг РНе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТНг Зег А1а Ьуз А1а Агд С1у Суз Агд С1у Ьеи Не 11е Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТНг А1а Меб С1п РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 РНе А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Не Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд С1и
165 170 175
С1и А1а С1и А1а Уа1 А1а С1п Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 А1а А1а С1и
180 185 190
С1и Азр Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Ьуз Меб Агд <31и Агд Ьеи А1а (Ии Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 45 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 45
абдаасдббд бсдбссадаа сбббдаасдд дсбдабссбд сддббдббаа ддссббдддс 60
даабдбддбд бддссасддб дсабдаадса садддссдса аддддсбббб адссбсббаб 120
абасдсссда бббабадсдд аасббсбабс ддддсббсдд сбдббассаб асббдсддсб 180
ссабдсдаса асбддабдсб дсабдбддсд абсдаасаад бдсаадсддд сдабдбаббд 240
дбасбддсдд ббасдбсасс абсадасдса ддббасбббд дсдабббдбб адсаасабсб 300
дсдсаадсдс ддддббдсдс аддбббдабс асбдабдсдд дсдбасдсда бдбдсдсдаб 360
- 228 019971
ЬЬдсаддсда ЬдааПИсс ддЬПддЬсд ааадсдаЬсЬ дбдсдсаадд сасддбдааа 420
дааасссЬдд дЬЬсддЬсаа сдПсссдП дЬсЬдЬдсад дадсдаадаб ЬааЬсссддЬ 480
даЬдЬдаЬЬд ЬддсддаЬда ЬдаЬддддСЬ ЬдсдсЬдбда адбдсдаада ддсддсадад 540
дЫхПдаааа аадсдсаадс дсдЬЬСддсс ааЬдаададс адааасдЬас дсдаЪРддсЬ 600
дарддрдадб Оадддсбдда саОдОаОдаО абдсдсдддс дссОадсбда ааааддЬсбд 660
аааЬаЬдЬсЬ аа 672 <210> 46 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 46
МеЬ 1 Азп Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п Азп РЬе С1и Агд 10 А1а Азр Рго А1а Уа1 15 Уа1
Ьуз А1а Ьеи С1у С1и Суз С1у Уа1 А1а ТЬг \7а1 Н13 С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Не Агд Рго Не Туг Зег С1у ТИг
35 40 45
Зег Не С1у А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Ьеи А1а А1а Рго Суз Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Ьеи Нтз \7а1 А1а Не С1и С1п Уа1 С1п А1а С1у Азр Уа1 Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Ьеи А1а Уа1 ТНг Зег Рго Зег Азр А1а С1у Туг РИе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТНг Зег А1а <31п А1а Агд С1у Суз А1а С1у Ьеи Не ТИг Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи С1п А1а Меб Азп РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Не Суз А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго \7а1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьуз 11е Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 11е \7а1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз А1а Уа1 Ьуз Суз С1и
165 170 175
С1и А1а А1а С1и νβΐ Ьеи Ьуз Ьуз А1а С1п А1а Агд Ьеи А1а Азп С1и
180 185 190
С1и С1п Ьуз Агд ТЬг Агд Ьеи А1а Азр С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр МеЬ
- 229 019971
195 200 205
Туг Азр Меб Агд С1у Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1 210 215 220 <210> 47 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 47
аЬдддбаЬЬд ЬЬдЬЬсадаа сабсаадсдд дсддассссд ддабсаЬадс аддбсЬЬддс 60
ааабдсддсд НдссасбдЬ дсабдаадсд саддддбдса аддддсбссЬ ддсддссЬаб 120
абдсддссса ЬЬЬаЬЬсЬдд сдсдсдссбб дссдссбссд сЬдЬсассаЬ ЬЬссдсдссд 180
ссдддадаса асбддаЬддб дсаЬдбсдсс аббдадсадд Ьдаддсаадд ЬдаЬаЬЬсЬд 240
дЬЬсЬЬдссс саасабсдсс сЬдбдаадас ддсбаЬЬЬсд дЬдаЬЬЬдсб сдссассбсс 300
абдсбдсадс дсддсддсад ддддсЬдаЬЪ аЬЬдасдссд дбдЬссдсда ЬаЬссдЬдаЬ 360
сЬдасЬсааа СдаааЬЬЬсс ддЬдЬддбсд аааассдЬЬЬ ЬЬдсдсаддд сассдЬЬаад 420
дааасссЬЬд дсЬсЬдбдаа сдбсссдаЬа дЬЫздсдссд дЬдаадЬддЬ саабссЬддс 480
дасабсабда ЬЬдссдабда ЬдаЬддЬдЬд ЬдсдЬддбсс ддсдсдасда сдсбдааадс 540
дЬдсЬЬдааа аадсаЬЬддс дсдбдаддса ааддаадаад абасасдсаа асдссЬЬдсд 600
дсаддсдадс ЬдддЬсЬЬда ЬаЬЬЬасддс абдсдсдсас дЬсбддссда ааадддссба 660
аааЬаЬдЬсЬ да 672
<210> 48 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 48
Меб 1 С1у 11е \7а1 Уа1 5 С1п Азп Не Ьуз Агд 10 А1а Азр Рго С1у 11е 15 11е
А1а С1у Ьеи С1у Ьуз Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Н13 С1и А1а С1п 01 у
20 25 30
Суз Ьуз С1 у Ьеи Ьеи А1а А1а Туг Меб Агд Рго 11е Туг Зег С1у А1а
35 40 45
Агд Ьеи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТНг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
- 230 019971
55 60
Тгр 65 МеЕ Уа1 Н1з Уа1 А1а 70 Не С1и С1п Уа1 Агд 75 С1п С1у Азр Не Ьей 80
Уа1 Деи А1а Рго ТНг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РНе С1у Азр Ьей
85 90 95
Ьей А1а ТКг Зег МеЕ Ьей С1п Агд С1у С1у Агд С1у Ьей 11е Не Азр
100 105 НО
А1а С1у Уа1 Агд Азр Не Агд Азр Ьей ТНг С1п МеЕ Ьуз РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз ТНг Уа1 РНе А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг Ьей С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не Уа1 Суз А1а С1у С1и Уа1 Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр 11е МеЕ Не А1а Азр Азр Азр С1у \7а1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд Азр
165 170 175
Азр А1а С1и Зег Уа1 Ьей С1и Ьуз А1а Ьей А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
С1и Азр ТНг Агд Ьуз Агд Ьей А1а А1а С1у С1и Ьей С1у Ьей Азр Не
195 200 205
Туг С1у МеЕ Агд А1а Агд Ьей А1а С1и Ьуз С1у Ьей Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 49 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 49
аЕдадсаЕсд ЕсдЕссадаа саЕсдадсдс дссдасаадд аЕдсддЕЕдЕ ддсасЕсддс 60
дааЕдсддсд ЕЕдсдасддЕ дсаЕдаддсд саддсссдса аадддсЕсаЕ дсддссЕЕас 120
аЕдсддссаа ЕсЕаЕдссдд сдсссдсаЕс дссддсссад ссдЕдасддЕ сЕсдаЕсдсд 180
ссдддсдаса асЕддаЕдаЕ ссаЕдЕддса дЕддадсадЕ дссдсдасдд сдаЕаЕссЕс 240
дЕддЕддсас сдассадссс дадЕдаадас ддсЕаЕЕЕсд дсдаасЕдсЕ ддсдсдсЕсд 300
сЕсаЕддсдс дсддЕдЕдаа ддддсЕдаЕс аЕсдаадссд дддЕдсдсда сдЕдсдсдас 360
сЕсассдада ЕсааЕЕЕссс ддЕсЕддЕсд ааадсдаЕсЕ ссдсдсаадд дасддЕдаад 420
дааасдсЕсд дсЕсддЕдаа ЕдЕдссддЕс дЕсЕдсдссд дсдсдсЕддЕ сааЕссдддс 480
дасдЕсаЕса ЕЕдссдаЕда сдасддсдЕс ЕдЕдЕсдЕдд сдсдсдсЕдс ддсаадЕдас 540
дЕЕдсдаадд сдЕсссдаас ссдсдаадсс ааддаадссд ааасссдсаа дсдссЕдаЕд 600
дсдддЕдаас ЕсддасЕсда саЕсЕасддд аЕдсдсдаса адсЕЕдсддс саадддссЕд 660
- 231 019971 аааЬаЬдбсЬ да 672 <210> 50 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 50 А1а Азр Ьуз Азр А1а 15 \7а1
Меб 1 Зег 11е Да1 \7а1 5 С1п Азп 11е СЬи Агд 10
\7а1 А1а Ьеи С1у СЬи Суз СЬу Уа1 А1а ТЬг Уа1 НЬз С1и А1а С1п А1а
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Меб Агд Рго Туг Меб Агд Рго 11е Туг А1а С1у А1а
35 40 45
Агд 11е А1а С1у Рго А1а \7а1 ТЬг Уа1 Зег 11е А1а Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е НЬз Да1 А1а Уа1 СЬи С1п Суз Агд Азр С1у Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
\7а1 \7а1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег С1и Азр С1у Туг РЬе С1у С1и Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а Агд Зег Ьеи Меб А1а Агд СЬу Уа1 Ьуз СЬу Ьеи 11е 11е С1и
100 105 110
А1а СЬу Да1 Агд Азр \7а1 Агд Азр Ьеи ТЬг С1и Не Азп РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а 11е Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи <31 у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Да1 Уа1 Суз А1а СЬу А1а Ьеи Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 11е 11е А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 А1а Агд А1а
165 170 175
А1а А1а Зег Азр Уа1 А1а Ьуз А1а Зег Агд ТЬг Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
А1а С1и ТЬг Агд Ьуз Агд Ьеи Меб А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг С1у Меб Агд Азр Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220
<210> 51 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 232 019971 <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 51
абдддсдбсд бддбссадаа бабсдсссдд дссдадсадб ссдбсдбсда саддсбддсб 60
дсдбдсддбд ббдссасддб дсасдаддсд садддссдса аддддсбдсб сдсдадббсб 120
дбдсддссда бсбабссддд сдсдсдддбд дсддссадсд сддбсасдаб сбсадсдссд 180
ссдддСдаса асбддабддб ссабдбадсд абсдаасадб бдааддаддд сдасабссбд 240
сбдббддсдс сдассадбсс сбдсдаддаб ддсбабббсд дбдабсбдсб сдссасббсд 300
дссабддсдс ддддсбдссд сддасбдабс абадабдсдд дддбдсдсда сдбсдсддас 360
сбдасддсда бдсадбббсс адбсбддбсс ааддсдабсб бсдсссаадд сассдбсаад 420
дааасдсбдд дббсддбдаа баббссбдбд дбсбдсдссд дсдсдсбддб саабсссддб 480
дасдбдабсд бддссдабда сдасддсдбс бдсдбсдбсс дссдсдаада ддсддссдсс 540
дбсдссдааа аддсддаддс асдддбддсд абсдаддаад дсааасдсаа дсддсбсдсд 600
дсдддсдаас бсдддсбсда бабббасдас абдсдсадбс дссббдссда дааддддсбд 660
ааабабдбсб да 672
<210> 52 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 52
Меб 1 СЬу УаЬ УаЬ УаЬ 5 СЬп Азп Не АЬа Агд 10 А1а СЬи СЬп Зег УаЬ 15 УаЬ
Азр Агд Ьеи АЬа АЬа Суз СЬу УаЬ АЬа ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи АЬа Зег Зег УаЬ Агд Рго I Ье Туг Рго СЬу АЬа
35 40 45
Агд УаЬ АЬа АЬа Зег АЬа УаЬ ТЬг Не Зег АЬа Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб УаЬ НЬз УаЬ АЬа Не СЬи СЬп Ьеи Ьуз СЬи СЬу Азр Не Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи АЬа Рго ТЬг Зег Рго Суз СЬи Азр СЬу Туг РЬе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи АЬа ТНг Зег АЬа Меб АЬа Агд СЬу Суз Агд СЬу Ьеи Не Не Азр
ЬОО 105 110
- 233 019971
А1а С1у Уа1 115 Агд Азр Уа1 А1а Азр 120 Ьеи ТЬг А1а МеЬ С1п 125 РЬе Рго Уа1
Тгр Зег 130 Ьуз А1а Не РЬе А1а 135 С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз 140 С1и ТЬг Ьеи С1у
Зег 14 5 Уа1 Азп Не Рго Уа1 150 Уа1 Суз А1а С1у А1а 155 Ьеи Уа1 Азп Рго С1у 160
Азр Уа1 11е Уа1 А1а 165 Азр Азр Азр С1у Уа1 170 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд 175 С1и
<31и А1а А1а А1а 180 Уа1 А1а <31и Ьуз А1а 185 С1и А1а Агд Уа1 А1а 190 Не С1и
С1и С1у Ьуз 195 Агд Ьуз Агд Ьеи А1а 200 А1а С1у С1и Ьеи С1у 205 Ьеи Азр Не
Туг Азр Меб Агд Зег Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 53 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 53 аЬдаадссдд ЬддЬддбдса дасбабсдад сдддссдасс дадсдабсаб сдадддЬсбд 60
дссдсдЬдЬд дсдббдссас сдбссабдад дсдсаддддс дссдддддсб дсПдсдбсс 120
ЬасаЬдсдсс сдабсбаПс дддсдсбдсд дПдсддссб сддссдбсас саЬссЬсбсЬ 180
ссасссЬдсд асаасбддаб дсбдсасдбс дссабсдадс адабссадсс дддсдасабб 240
сЪсдЬЬсЬсд дсасдассбс Ьссдбссдаб дссддсбаИ ЬсддЬдабсЬ дсбддсдасб 300
Ьсддссаадд сдсдсддЬЬд сдбсдддЬЬд дЬсабсдабд ссддсдбасд сдабабссдс 360
дассбдасад сдабдсадП ЬссддЬсбдд Ьссааддссд ИЬсддссса дддсасдабс 420
ааддадасдс ЬдддЬЬсддб саасдбсссс дЬсдбсбдсд ссддбдсЬсб ддбсаабссс 480
ддсдасдбсд Ьсдбддссда Ьдасдасддб дЬсЬдсдбдд Ьдсдссдсда ддаадссдсд 540
дааасдсбдд ааааддсссд ддсдсддабс дссаабдадд аддаааадсд ссадсдсЬЬг 600
дссдсбддсд аасбсдддсб сдасабсбас аадабдсдсд аасдссбсдс Ьдсссбдддд 660
сЬсассЬаЬд бсбда 675
<210> 54 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 234 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 54
МеС 1 Ьуз Рго УаЬ УаЬ 5 УаЬ СЬп ТЬг Ые СЬи 10 Агд АЬа Азр Агд АЬа 15 Ые
Ые СЬи СЬу Ьеи АЬа АЬа Суз СЬу УаЬ АЬа ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп
20 25 30
С1у Агд Агд СЬу Ьеи Ьеи АЬа Зег Туг МеС Агд Рго Ые Туг Зег СЬу
35 40 45
АЬа АЬа УаЬ АЬа АЬа Зег АЬа УаЬ ТЬг Ые Ьеи Зег Рго Рго Суз Азр
50 55 60
Азп Тгр МеС Ьеи НЬз УаЬ АЬа Ые СЬи СЬп 11е СЬп Рго СЬу Азр Ые
65 70 75 80
Ьеи УаЬ Ьеи СЬу ТЬг ТЬг Зег Рго Зег Азр АЬа СЬу Туг РЬе СЬу Азр
85 90 95
Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег АЬа Ьуз АЬа Агд СЬу Суз УаЬ СЬу Ьеи УаЬ Ые
100 105 110
Азр АЬа СЬу УаЬ Агд Азр Ые Агд Азр Ьеи ТЬг АЬа МеС СЬп РЬе Рго
115 120 125
УаЬ Тгр Зег Ьуз АЬа УаЬ Зег АЬа С1п СЬу ТЬг 11е Ьуз СЬи ТЬг Ьеи
130 135 140
СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Рго Уа1 УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ Азп Рго
145 150 155 160
СЬу Азр УаЬ УаЬ УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ Суз УаЬ УаЬ Агд Агд
165 170 175
СЬи СЬи АЬа АЬа СЬи ТЬг Ьеи СЬи Ьуз АЬа Агд АЬа Агд Ые АЬа Азп
180 185 190
СЬи СЬи СЬи Ьуз Агд СЬп Агд РЬе А1а АЬа СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи Азр
195 200 205
Ые Туг Ьуз МеС Агд СЬи Агд Ьеи АЬа АЬа Ьеи СЬу Ьеи ТЬг Туг УаЬ
210 215 220 <210> 55 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 55
аСдааСдаСс сддСддСддС ссддсаадСд дадсадссдс садссдасдс сдССдСсдса 60
ССддадаадС дСддСдСдас дассдСдсаС даадсСсадд дасдССдСдд СсСссССдсс 120
СссСасаСдс дСссдаСССа сСсдддадса адсаСсдссд дССссдсСдС дасСдСсСсС 180
- 235 019971
сбдссбссбд дсдасаассб сабдабссас дбсдссдбсд аддбббдсдд бссдддааас 240
абссбддбсд бббсассаас дбсдссббдс ассдабддсб асббсддада дсбдббддсд 300
асабсбсбсс дбдсссасдд бдбаададдд сбддбдабсд асдссддсбд ссдсдасдбс 360
сддбсдТбаа ссдадабдаа абббссбдбс бддадссдсд дсабсадсбс дсаадддаса 420
дбсааадсса сдсбсддаТс бдбдаасдбд дсддбсасбб дсдсдддбдс асбддбсдаа 480
дсбддсдабд Таабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд ббдбдаадсд сдсдсаддсд 540
саададдбсд ссдссдсддс дсаасаасдд дббсдсааад аадасдбаас бсдададсда 600
сбСдсбсдТд дадаасбсдд асбддабабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд 660
ддссбааадб абсбдбда 678
<210> 56 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 56
Меб 1 Азп Азр Рго Уаб 5 Уаб Уаб Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
Аба Уаб Уаб Аба беи С1и буз Суз Сбу Уаб ТНг ТНг Уаб ΗΪ5 Сби Аба
20 25 30
С1п Сбу Агд Суз С1у беи беи Аба Зег Туг Меб Агд Рго ббе Туг Зег
35 40 45
Сбу Аба Зег 11е А1а С1у Зег Аба Уаб ТНг Уаб Зег Теи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп беи Меб 11е Нбз Уаб Аба Уаб С1и Уаб Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
11е беи Уаб Уаб Зег Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби беи беи Аба ТНг Зег Теи Агд А1а Нбз С1у Уаб Агд С1у Теи Уаб
100 105 110
11е Азр А1а Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Теи ТНг Сби Меб Туз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд С1у 11е Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Туз Аба ТНг
130 135 140
беи Сбу Зег Уаб Азп Уаб А1а Уаб ТНг Суз Аб а Сбу Аба Теи Уаб Сби
145 150 155 660
А1а Сбу Азр Уаб 11е Уаб А1а Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Туз
165 170 175
- 236 019971
Агд АЬа СЬп АЬа 180 СЬп СЬи УаЬ АЬа АЬа 185 АЬа АЬа СЬп СЬп Агд 190 УаЬ Агд
Ьуз СЬи Азр 195 УаЬ ТЬг Агд С1и Агд 200 Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи 205 Ьеи С1у Ьеи
Азр Не Туг Азр Меб Агд С1п Ьуз 11е АЬа С1п Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 57 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 57
абдаабдабс сддбддбадб ссдададдбд дадсадссас садсддабдс ддПдбсаса 60
Ьбддадаадб дсддадбдас аасбдбдсаЬ даддсдсадд дасдЬЬдбдд ссЬЬсбсдсс 120
сасбасабдс дЬссдаШа ЬссЬддадсс ассабсдссд дббссдсбдб сасбдЬсбсЬ 180
Ебдссдссбд дсдасаассб сабдабссас дЬЬдсддбсд аддЬЬЬдбсд Ьссдддааас 240
аЬссбддбсд ЬЬЬсассдас дбсдссПдс ассдабддс-Ь асббсддада дсбдЬЬддсд 300
асаЬсбсбсс дбдсссасдд Ьдбаададдд сЬддбдабсд асдссддсбд ссдсдасдбс 360
сддЬсдббда ссдадабдаа аЬПссбдбс Ьддадссдсд дсабсадсбс дсаадддасд 420
дбсааадсса сдсбсддабс Ьдбдаасдбд дсддбсасЬЬ дсдсдддбдс асбддбсдаа 480
дсбддсдабд Ьаабсдбсдс сдабдасдаб ддадЬЬдбдд ЬЬдбдаадсд сдсдсаддсд 540
саададдбсд ссдссдсддс дсаасаасдд дЫсдсааад аадасдбаас Ьсдададсда 600
сЬбдсбсдбд дадаасбсдд асЬсдабаП Ьасдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд 660
ддссбааадЬ абсЬдбда 678
<210> 58 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) . . . (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 58
Меб Азп Азр Рго Уа1 УаЬ Уа1 Агд С1и УаЬ С1и С1п Рго Рго А1а Азр
10 15
- 237 019971
Аба Уаб Уаб ТЬг 20 Ьей Сби Ьуз Суз Сбу 25 Уаб ТЬг ТЬг Уаб Нбз 30 Сби Аба
Сбп Сбу Агд Суз Сбу Ьей Ьей Аба Нбз Туг Меб Агд Рго Не Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба ТЬг 11е Аба Сбу Зег Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Ьей Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьей Мер Не Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Агд Рго Сбу Азп
65 70 75 80
1бе Ьей Уаб Уаб Зег Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьей Ьей Аба ТЬг Зег Ьей Агд Аба Нбз Сбу Уаб Агд Сбу Ьей Уаб
100 105 110
11е Азр Аба С1у Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьей ТЬг Сби Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Сбу Не Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уа1 Ьуз Аба ТЬг
130 135 140
Ьей С1у Зег Уаб Азп Уаб Аба Уаб ТЬг Суз Аба Сбу А1а Ьей Уаб Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб Не Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Аба Сбп Аба С1п Сби Уаб Аб а Аба Аба Аба Сбп С1п Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Азр Уаб ТЬг Агд Сби Агд Ьей Аба Агд Сбу Сби Ьей Сбу Ьей
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд Сбп Ьуз Не Аба Сбп Ьей Сбу Ьей Ьуз Туг
210 215 220
Ьей
225 <210> 59 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 59
абдаабдабс сддбддбадб ссдададдбд дадсадссас садсддабдс ддббдбсаса 60
ббддадаадб дбддадбдас аассдбдсаб даддсасадд дасдббдбдд ссббсбсдсд 120
сасбасабдс дбссдаббба сссдддддса ассабсдссд дббссдсбдб сасбдбсбсб 180
ббдссдссбд дсдасаассб сабдабссас дбсдссдбсд аддбббдсдд бссдддааас 240
абссбддбсд бббсассдас дбсдссббдс ассдабддсб асббсддада дсбдббддсд 300
асабсбсбсс дбдсссасдд бдбаададдд сбддбдабсд асдссддабд ссдбдабдбс 360
- 238 019971
сддНсдббда ссдадабдаа абббссбдбс бддадссдсд сдабсадсбс дсаадддаса 420
дбсааадсса сдсбсдддбс ддбдаасдбд дсддЬсасбб дсдсдддбдс асбддбсдаа 480
дсбддсдабд баабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд ббдбдаадсд сдсдсдддсд 540
саададдбсд сддссдсддс дсаасаасдд дЬЬсдсааад аадасдбаас бсдададсда 600
сббдсбсдбд дадаасбсдд асбсдабаСС басдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд 660
ддссбааадЬ аЪсбдЬда 678 <210> 60 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 60 Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1и Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
Меб 1 Азп Азр
А1а Уа1 \7а1 ТЬг Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 НЬз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Н13 Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у А1а ТЬг 11е А1а С1у Бег А1а Уа1 ТНг Уа1 Бег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1у Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 \7а1 Бег Рго ТНг Бег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Бег Ьеи Агд А1а Н13 С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Бег Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Бег Агд А1а Пе Бег Бег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТИг
130 135 140
Ьеи С1у Бег Уа1 Азп Уа1 А1а Уа1 ТИг Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр νβΐ 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у \7а1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а Агд А1а С1п С1и Уа1 А1а А1 а А1а А1а С1п С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азр Уа1 ТНг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
- 239 019971
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд С1п Ьуз Не А1а С1п Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг 210 215 220
Ьеи
225 <210> 61 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 61
абдадсддсд бддббдбдсд ддаддбсдсс сдсссддсдс ссдабсбсдб ддссбсдсбс 60
даададдсдд дбдбсбсаас сдбссасдаа дсасадддас дссддддасб дсбсдссасс 120
басабдсдбс сдабсбасдс сддадссасд сбсдсдддас сддсадбсас сдбссбсдбс 180
ссссссддсд асаассбдаб даббсасдба дссдбддадд бдбдссдссс дддбдасдбд 240
сбддбсдбсд ссдбсасдбс дссдбдсасс дасддббасб бсддсдадсб дсбддсдасд 300
бсддббсдсд сдсдсддсдб сааддддсбс дбсабсдабд саддсбдссд ддасдбдсдд 360
дсдсбсассд адабдсддбб бссддбдбдд адссдддсдд бсадсдсдса дддсассдбс 420
ааддссасдс бдддсбссдб дадсдббссд дбсдбббдсд ссддсдсдсб дабсдаддсс 480
ддсдасдбсд бсдбдддсда сдасдасдда дбддббдбсд бдааасддад сдаддссдаб 540
дсддбсдбда дбдсббсдсд ссадсддсбс сбсааддаад аддддасдсд бсадсдссбд 600
дсаадсддбд аасбсддбсб ддасабсбас бсдсбдсдса ааасдсбббс сдассбдддд 660
сбдаадбасс ддбаа 675
<210> 62 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21) . . . (173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 62
Меб 1 Зег С1у Уа1 Уа1 5 Уа1 Агд СЬи УаЬ АЬа ЬО Агд Рго АЬа Рго Азр 15 Ьеи
Уа1 А1а Зег Ьеи С1и СЬи А1а СЬу УаЬ Зег ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа С1п
20 25 30
С1у Агд Агд СЬу Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Туг Меб Агд Рго Не Туг А1а СЬу
- 240 019971
40 45
А1а ТЬг 50 Ьеи А1а 31у Рго А1а 55 Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи Уа1 60 Рго Рго С1у Азр
Азп Ьеи Меб 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр Уа1
65 70 75 80
Ьеи Уа1 Уа1 А1а \7а1 ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у С1и
85 90 95
Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Уа1 Агд А1а Агд С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Уа1 11е
100 105 110
Азр А1а С1у Суз Агд Азр \7а1 Агд А1а Ьеи ТЬг С1и Меб Агд РЬе Рго
115 120 125
Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг Ьеи
130 135 140
С1у Зег \7а1 Зег Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи 11е С1и А1а
145 150 155 160
С1у Азр Уа1 Уа1 Уа1 С1у Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз Агд
165 170 175
Зег С1и А1а Азр А1а Уа1 Уа1 Зег А1а Зег Агд С1п Агд Ьеи Ьеи Ьуз
180 185 190
<31и С1и С1у ТЬг Агд С1п Агд Ьеи А1а Зег С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр
195 200 205
11е Туг Зег Ьеи Агд Ьуз ТЬг Ьеи Зег Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг Агд
210 215 220 <210> 63 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 63
абдассддса бсдбсдбсса дбддббсдад сдсасдссдс ббдссдабдб сдсддсдсбб 60
дссдадббсд дсдбддсбас сабссасдад дсдсааддсс дсааддддсб дсбсдсдбсс 120
басабдсддс сдабсбабдс дддбдсбдсс дсддсдддса абдссдбсас адбабсддбд 180
ссбсссддбд асаасбддаб дабссабдбд дсддбсдадд бдбдссдсда дддсдасдбд 240
сбддбддбсд ссссдассбс дсссбдсдас аасддсбабб бсддбдадсб дсбддссбдс 300
бсдсбсаадд сдсдсддсдб дсдсдддсбс дбсабсдадд ссддсбдссд сдасдбдаад 360
ссасбсбссд асабдаадбб бсссдбдбдд бсдсдсдссд бббссдссса дддсассдбс 420
ааддададсс бдддсдасдб саассбдссд сбсдбдабсд ссадссадас сдбдсабссб 480
ддсдасдбдд бддбсдссда бдасдасддб дбсдбсабсд бсдсбсдсдд сдаддбдсдс 540
дссдбсассд ссаадбсдсд сдадсдсдад дасааддадд ссдсаадссд сдадаадсбд 600
- 241 019971 адсааддддд аддСдддссС сдасаСсСас ддсаСдсддд ссаадсСдаа ддадаадддс 660 аССсдсСасд СсдсдааСсс сдасааасСс Ода 693 <210> 64 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 64
МеС 1 ТНг СЬу Ые УаЬ 5 УаЬ СЬп Тгр РЬе СЬи 10 Агд ТЬг Рго Ьеи АЬа 15 Азр
УаЬ АЬа АЬа Ьеи АЬа СЬи РЬе СЬу УаЬ АЬа ТЬг Ые НЬз СЬи А1а СЬп
20 25 30
СЬу Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи АЬа Бег Туг МеС Агд Рго Ые Туг АЬа СЬу
35 40 45
АЬа АЬа АЬа АЬа СЬу Азп АЬа УаЬ ТЬг УаЬ Бег УаЬ Рго Рго СЬу Азр
50 55 60
Азп Тгр МеС Ые НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз Агд СЬи СЬу Азр УаЬ
65 70 75 80
Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Бег Рго Суз Азр Азп СЬу Туг РЬе СЬу СЬи
85 90 95
Ьеи Ьеи АЬа Суз Бег Ьеи Ьуз АЬа Агд СЬу УаЬ Агд СЬу Ьеи УаЬ Ые
100 105 110
СЬи АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Ьуз Рго Ьеи Бег Азр МеС Ьуз РЬе Рго
115 120 125
УаЬ Тгр Бег Агд АЬа УаЬ Бег АЬа СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз СЬи Бег Ьеи
130 135 140
СЬу Азр УаЬ Азп Ьеи Рго Ьеи УаЬ Ые АЬа Бег СЬп ТЬг УаЬ НЬз Рго
145 150 155 160
СЬу Азр УаЬ УаЬ УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ Ые УаЬ АЬа Агд
165 170 175
СЬу СЬи УаЬ Агд АЬа УаЬ ТЬг АЬа Ьуз Бег Агд СЬи Агд СЬи Азр Ьуз
180 185 190
СЬи АЬа АЬа Бег Агд СЬи Ьуз Ьеи Бег Ьуз СЬу СЬи УаЬ СЬу Ьеи Азр
195 200 205
Ые Туг СЬу МеС Агд АЬа Ьуз Ьеи Ьуз С1и Ьуз СЬу Ые Агд Туг УаЬ
210 215 220
АЬа Азп Рго Азр Ьуз Ьеи
- 242 019971
225 230 <210> 65 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 65
аСдадсабсд Ьсдбсасдаа даЬсдадсдс дссддсдсдд сддссдЁсдс сдсдсбдсдс 60
асаадбддсд ЬЬдссасадЬ дсасдаддсд саадддсдса сдддсЬЬдаЬ дсдЬсссЬас 120
абдсддссда Ьсбасссддд сдсдсдсабс дссддсасдд сдаЬсассдб сЬсссЬдссб 180
ссдддсдаса асЬддаЬдаЬ ссасдбсдсд дбсдадсадЬ дссдсдаддд сдаЬаЬссЬс 240
дЬддбддсдс сдассадссс дадсдасдас ддсЬаЬЬЬсд дсдассЬдсб ЬддсааЬЬсд 300
сЬсдбсдсас дсддсдбсад дддссЬддбд абсдаддссд дЬдЬдсдЬда сдбдсдсдас 360
сбсасддада ЬдсдсЬЬЬсс ддЬсЬддЬсд аадасдаЬЬЬ сддсдсаадд сасддЬсаад 420
дадасдЬЬдд дсЬсддбсаа сдЬдссдабс дЬсбдсдсдд дЬдсЬдссдЬ даассссдда 480
дасдЬдабсд Ьддссдасда сдасддсдбс ЬдсдЬсдбдс сдсдссадас ддЬсасадад 540
дЬсдбсдадд сддсссасдс ссдсдаддсс ааддаддссд аддЬссддса дсддсЬсабс 600
дсдддсдадс ЬЬддссЬсда сдЬсбасддс абдсдсдада адсбддсддс саадддссбс 660
аааЬаЬдЬсЬ да 672
<210> 66 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> 51СЫАЬ <222> (1) ... (27) <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 66
Меб 1 Зег 11е Уа1 Уа1 5 ТНг Ьуз Не <31и Агд 10 А1а С1у А1а А1а А1а 15 \7а1
А1а А1а Ьеи Агд ТНг Зег С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 НЬз С1и А1а С1п 31у
20 25 30
Агд ТНг С1у Ьеи Меб Агд Рго Туг Мер Агд Рго Не Туг Рго С1у А1а
35 40 45
Агд 11е А1а С1у ТНг А1а 11е ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у Азр Азп
55 60
- 243 019971
Тгр 65 Меб Не Н1з \7а1 А1а 70 Уа1 С1и С1п Суз Агд 75 С1и С1у Азр Не Деи 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Деи
85 90 95
Деи С1у Азп Зег Деи Уа1 А1а Агд С1у Уа1 Агд С1у Деи Уа1 Не С1и
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр \7а1 Агд Азр Деи ТЬг С1и Меб Агд РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Дуз ТЬг 11е Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Дуз С1и ТЬг Деи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр \7а1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Рго Агд С1п
165 170 175
ТЬг Уа1 ТНг С1и Уа1 \7а1 С1и А1а А1а Нтз А1а Агд С1и А1а Дуз С1и
180 185 190
А1а С1и Уа1 Агд С1п Агд Деи Не А1а С1у С1и Деи С1у Ьеи Азр Уа1
195 200 205
Туг С1у Меб Агд С1и Дуз Деи А1а А1а Дуз С1у Деи Дуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 67 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 67
абдадсдббд бсдбсасдаа дабсдадсдс дссддсдссд аадсбдббдб адсдсбддсс 60
дааадбддбд бдбсдассдб дсасдаддсд садддссдда ссдддсбдаб дсддссббаб 120
абдсддссда бсбасдсддд сдсдсддабс дссдддасдд сдабсассдб дбсдсбдсад 180
ссдддсдаса асбддабдаб ссабдбддсд дбсдадсааб дссддсаддд сдасабссбс 240
дбсдбддсдс сдассадссс дадсдасдас дддбабббсд дсдассбдсб сддсааббсд 300
сббдбсдсдс ддддсдбсад ддддсбддбд абсдаддссд дсдбдсдсда сдбдсдсдаб 360
сбдассдсда бдддббббсс ддбабддбсд аадасадбсб сддсдсаадд сассдбдаад 420
дадасдсбсд дсбсддбдаа сдбдсссдбс дбсбдсдсдд дддсдассдс ааассссддб 480
дасдбдабсд бддссдабда сдасддсдбс бдсдбддбдс сдсдсдадас ддссдсддса 540
дбддбсдадд сддсссабдс дсдддаддбд ааддаддсад аддбасддсд дсддсбдабс 600
бссддсдадс бсддссбада сабсбасддс абдсдсдаса адсбсдсбдс саадддссбс 660
ааабабдбсб да 672
- 244 019971 <210> 68 <2Ы> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 68 АЬа СЬи АЬа 15 УаЬ
Мер 1 Зег УаЬ УаЬ УаЬ 5 ТЬг Ьуз Не С1и Агд 10 АЬа СЬу
УаЬ А1а Ьеи АЬа СЬи Зег СЬу УаЬ Зег ТЬг УаЬ Н13 СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
Агд ТЬг СЬу Ьеи Меб Агд Рго Туг Меб Агд Рго Не Туг АЬа СЬу АЬа
35 40 45
Агд Не А1а СЬу ТЬг АЬа ЬЬе ТЬг УаЬ Зег Ьеи СЬп Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи СЬп Суз Агд СЬп СЬу Азр Не Ьеи
65 70 75 80
УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр Азр СЬу Туг РЬе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи СЬу Азп Зег Ьеи УаЬ АЬа Агд СЬу УаЬ Агд СЬу Ьеи УаЬ ЬЬе СЬи
100 105 НО
АЬа СЬу УаЬ Агд Азр УаЬ Агд Азр Ьеи ТЬг АЬа Меб СЬу РЬе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Ьуз ТЬг УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз СЬи ТЬг Ьеи СЬу
130 135 140
Зег УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа ТЬг АЬа Азп Рго СЬу
145 150 155 160
Азр УаЬ Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ Суз УаЬ УаЬ Рго Агд СЬи
165 170 175
ТЬг АЬа АЬа АЬа УаЬ УаЬ СЬи А1а АЬа НЬз А1а Агд СЬи УаЬ Ьуз СЬи
180 185 190
АЬа СЬи УаЬ Агд Агд Агд Ьеи Не Зег СЬу С1и Ьеи СЬу Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг СЬу Мер Агд Азр Ьуз Ьеи А1а АЬа Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг УаЬ
210 215 220
<210> 69
<211> 672
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
- 245 019971
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 69
аЕдддсассд ЕддЕЕсаааа саЕЕдсдсдс дсЕдассасЕ ссдЕсаЕсда ссдссЕЕдсЕ 60
дссЕдсддЕд ЕсдссассдЕ Есасдаддсс садддссдса ссддаЕЕдсЕ сдссадЕЕас 120
аЕдсддссда ЕсЕаЕдсддд сдсдсддсЕд дссдсЕадсд ссдЕсассаЕ сЕссдсссса 180
ссдддсдаса асЕддаЕдаЕ ссасдЕсдсс аЕсдадсаас Есааддсадд сдасаЕсаЕд 240
дЕдсЕддссс сдассадссс сЕдсдаддас ддЕЕаЕЕЕсд дсдассЕдсЕ сдссасИсс 300
дсссаадсдс дадддЕдсаа дддссЕааЕс аЕсдасдссд дсдЕдсдсда сдЕЕдсадас 360
сЕдассдсда ЕдддаЕЕЕсс сдЕдЕддЕсс ааддссаЕсЕ Есдсдсаддд ЕасддЕсаад 420
дсдадЕЕЕдд дЕЕсадЕсаа ЕдЕдЕсддЕд дЕсЕдЕдсЕа дЕдссЕЕдаЕ сааЕссдддс 480
дасаЕЕдЕсд Еддссдасда ЕдаЕддЕдЕд ЕдЕдЕсдЕас ддсдсдадда сдсддЕсЕсс 540
дЕддсддсда аддссдаадс дсдддЕддса дссдаададд асаадсдссд дсдссЕсдса 600
дддддсдаас ЕдддасЕЕда ЕаЕЕЕаЕддд аЕдсдсдаса сдсЕсдсддс сааддддсЕа 660
аааЕаЕдЕсЕ да 672
<210> 70 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (149) ... (152) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозИе ίά = Р300001 <400> 70
МеЕ 1 С1у ТНг Уа1 Уа1 5 С1п Азп Не А1а Агд 10 А1а Азр Нгз Зег Уа1 15 Не
Азр Агд Леи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Нгз С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТЬг С1у Леи Леи А1а Зег Туг МеЕ Агд Рго Не Туг А1а С1у А1а
35 40 45
Агд Ьей А1а А1а Зег А1а Уа1 ТНг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр МеЕ 11е Н1з Уа1 А1а Не С1и С1п Леи Ьуз А1а С1у Азр Не МеЕ
65 70 75 80
Уа1 Ьей А1а Рго ТНг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РНе С1у Азр Ьей
85 90 95
Ьей А1а ТНг Зег А1а С1п А1а Агд С1у Суз Ьуз С1у Ьей Не Не Азр
- 246 019971
100 105 но
Аба Сбу Уаб 115 Агд Азр Уаб Аба Азр 120 Ьей ТЬг Аба Меб Сбу 125 РЬе Рго Уаб
Тгр Зег 130 Ьуз Аба Не РЬе Аба 135 Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз 140 Аба Зег Ьей Сбу
Зег 145 Уаб Азп Уаб Зег Уаб 150 Уаб Суз Аба Зег Аба 155 Ьей Не Азп Рго Сбу 160
Азр Не Уаб Уаб Аба 165 Азр Азр Азр Сбу Уаб 170 Суз Уаб Уаб Агд Агд 175 Сби
Азр Аба Уаб Зег 180 Уаб Аба Аба Ьуз Аба 185 Сби Аба Агд Уаб Аба 190 Аба Сби
Сби Азр Ьуз 195 Агд Агд Агд Ьей Аба 200 Сбу Сбу Сби Ьей Сбу 205 Ьей Азр Не
Туг Сбу Меб Агд Азр ТЬг Ьей Аба Аба Ьуз Сбу Ьей Ьуз Туг Уаб
210 215 220 <210> 71 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 71 абдадсдбсд бсдбссадас сабсдсдсдс дссдабсада сддбсабсда ссдссбсддс 60
дссбдсддсд Ьсдссассдб асабдаддсд садддссдса аддддсбасб сдсдадсбас 120
абдсддссса Ьсбаб Г.ссдд сдсдсддсбд дсбдсдадсд сддбдасааб Псддсдссд 180
сссддсдаса асЬддабдаб ссасдбсдсс абсдадсадс Ьсааддссдд сдасабсабд 240
дбдсбсдсбс ссассадссс сбдсдаадас ддсбабИсд дсдассбдсб сдсдасдбсд 300
дсбдбддсдс дсддсбдссд сдддсбсдбс абсдаддссд дсдбдсдсда Ьдбддссдаб 360
сбсассдсда бдаааббссс ддбабддбсд ааадссабсб ссдсбсаддд сассдбсаад 420
дадасдсбдд дсбсддОдда сдбдссдабс дбабдсдссд дсасдсбддб сдадссдддс 480
дасдбсабсд бсдссдасда бдасддсдбс бдсдбсдбдс дссдсдаада ддсддаддсс 540
дбддсдсада аддссдаддс ссдсабсдсс ассдаададд асаадсдсаа асдссбддсд 600
ддсддсдадс ЬсддОсбсда сабсбасаад абдсдсдадс ддсбддссда ааааддасбс 660
ааабабдбсЬ ад 672
<210> 72 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 247 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 72
Меб 1 Зег УаЬ УаЬ УаЬ 5 С1п ТЬг Не АЬа Агд 10 АЬа Азр СЬп ТЬг УаЬ 15 Не
Азр Агд Ьеи СЬу А1а Суз С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 НЬз СЬи АЬа С1п СЬу
20 25 30
Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг Зег С1у А1а
35 40 45
Агд Ьеи А1а АЬа Зег А1а Уа1 ТЬг Не Зег А1а Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е НЬз Уа1 АЬа Не СЬи СЬп Ьеи Ьуз АЬа СЬу Азр Не Меб
65 70 75 80
Уа1 Ьеи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз СЬи Азр СЬу Туг РЬе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег А1а УаЬ А1а Агд СЬу Суз Агд СЬу Ьеи УаЬ Не С1и
100 105 но
А1а СЬу УаЬ Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТЬг АЬа Меб Ьуз РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз АЬа 11е Зег АЬа СЬп С1у ТЬг Уа1 Ьуз СЬи ТЬг Ьеи СЬу
130 135 140
Зег УаЬ Азп УаЬ Рго 11е Уа1 Суз А1а СЬу ТЬг Ьеи УаЬ СЬи Рго СЬу
145 150 155 160
Азр УаЬ 11е УаЬ А1а Азр Азр Азр СЬу УаЬ Суз УаЬ УаЬ Агд Агд СЬи
165 170 175
С1и А1а СЬи АЬа УаЬ АЬа СЬп Ьуз АЬа СЬи АЬа Агд Не А1а ТЬг СЬи
180 185 190
С1и Азр Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи АЬа СЬу СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Ьуз Меб Агд СЬи Агд Ьеи АЬа С1и Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Туг УаЬ
210 215 220 <210> 73 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 73
абдадсдбдд бсабсассаа бабссадсдс сссдаксссд адсасассаа адсдсбсдсс 60
дссббсддсд ббдсдасбаб бсасдаддсд садддссдса ссддасбдаб дсадбссббс 120
абдсдассда бсбабдссдд сдсдсдсдсс дссддсассд ссдбсассдб дбсдсбдссс 180
- 248 019971
сссдссдаса асбддабдаб ссасдбсдсд дбддадсааб дссаддсадд сдасаббсбс 240
дбсдбсдсдс сдассбсдсс сбссдабдбс ддабабббсд дсдадсбссб сдссассбсд 300
сбсдссдсас ддддсдбддб сддссбсабс абсдааддсд дсбдссдсда сдбсдсддса 360
ббдассдада бдддбббссс ддбсбддбсд сдсдссдбаб сддсдсаддд сассдбдаад 420
дадасдсбсд дсбссдбдаа сабассдабс дбсбдсдссд дсдсдсабаб бсабсссддс 480
дасббсдбсд ссдссдасда бдасддсдбд дбсдбсдбдс сссдсдссса сдбддсддаа 540
абсдссдссд ссбсссбсдс дсдсдаддас ааддаддссд ссдббсдсда дсдссбдааа 600
бссддбдадс бсддссбсда бабббасддс абдсдсссдс дссбсаадда даааддссбс 660
дбсбддсдсд ааасдссдда даадааабад 690
<210> 74 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 74
Меб Зег Уа1 Уа1 Не ТНг Азп Не С1п Агд Рго Азр Рго С1и НЬз ТНг
1 5 10 15
Ьуз А1а Ьеи А1а А1а РНе С1у Уа1 А1а ТНг 11е НЬз СЬи А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТНг С1у Ьеи Меб С1п Зег РНе Меб Агд Рго Не Туг А1а СЬу А1а
35 40 45
Агд А1а А1а СЬу ТНг А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго А1а Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не НЬз Уа1 А1а \7а1 С1и С1п Суз С1п А1а СЬу Азр Не Ьеи
65 70 75 80
Да1 \7а1 А1а Рго ТНг Зег Рго Зег Азр Уа1 С1у Туг РНе С1у С1и Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи А1а А1а Агд С1у Уа1 Уа1 С1у Ьеи Не Не СЬи
100 105 НО
СЬу С1у Суз Агд Азр Да1 А1а А1а Ьеи ТНг С1и Меб СЬу РНе Рго \7а1
115 120 125
Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп 11е Рго Не Уа1 Суз А1а С1у А1а НЬз Не НЬз Рго СЬу
145 150 155 160
- 249 019971
Азр РИе Уа1 А1а А1а 165 Азр Азр Азр С1у Уа1 170 Уа1 Уа1 V а 1 Рго Агд 175 А1а
Н1з Уа1 А1а С1и 180 11е А1а А1а А1а Зег 185 Ьеи А1а Агд С1и Азр 190 Ьуз С1и
А1а А1а Уа1 195 Агд С1и Агд Ьеи Ьуз 200 Зег С1у С1и Ьеи С1у 205 Ьеи Азр 11е
Туг С1у Меб Агд Рго Агд Ьеи Ьуз С1и Ьуз <31у Ьеи Уа1 Тгр Агд С1и
210 215 220
ТИг Рго С1и Ьуз Ьуз
225 <210> 75 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 75 абдддадЬсд ЬсдЬЬсадаа ЬаЬсдсдсдд дссдадсадд адаЬсаЬсда ссддсЬддсс 60
дссЬдсддсд ЬЬдссассдЬ Ьсасдаадсд саадддсдса аадддсЬдс-Ь ддсаадсЬаб 120
аЬдсддссда ЬсРабсаддд ЬдсдсддсЬс дссдсдадсд ссдЬсасааЬ сбсддсдссд 180
ссдддсдаса асЬддаЬддЬ ЬсаЬдЬсдсс абсдаасада Ьаадддссдд сдасаЬссЬд 240
сЬдсбЬдсдс ссасаадссс дрдсдаддас ддсЬаЬЬЬЬд дсдаЬсбссЬ сдсаасдбсс 300
дсдсаддсаа дддддЬдссд сдддсЬддЬс аЬсдасдсЬд дЬдЬдсдсда саЬсдссдаЬ 360
сЬдааддсда ЬдааЬЬЪЬсс ддЬсЬддЬсд ааддссдЬдЬ Ьсдсдсаддд аасдабсаад 420
дадасасбсд даЬсддбсаа РдЬдсссдЬд дЬсЬдбдссд дадсдсбддЬ саабссддда 480
дасдЬдаЬЬд Ьддсддасда сдасддсдбс ЬдсдЬсдЬдс дссдддадда ддссдаааас 540
драдрссада аадссдаддс дсдддбсадс дсддаадбдд ссаадсдсдс саддсбсдса 600
дссддсдаас ЬсддссЬсда саЬсЬасадд абдсдсдааа ддсбддсдда дааддддсЬд 660
аааЬабдЬсЬ да 672
<210> 76 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) . . . (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
- 250 019971 <400> 76
Меб 1 С1у Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п Азп Не А1а Агд 10 А1а С1и С1п С1и Не 15 Не
Азр Агд Деи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Дуз С1у Деи Ьеи А1а Зег Туг Мер Агд Рго Не Туг С1п С1у А1а
35 40 45
Агд Деи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уа1 Нтз Уа1 А1а 11е С1и С1п 11е Агд А1а С1у Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
Деи Деи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Деи А1а ТЬг Зег А1а С1п А1а Агд С1у Суз Агд С1у Ьеи Уа1 Не Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Не А1а Азр Ьеи Ьуз А1а Мер Азп РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 РЬе А1а С1п С1у ТЬг Не Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд С1и
165 170 175
С1и А1а С1и Азп Уа1 Уа1 С1п Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 Зег А1а С1и
180 185 190
Уа1 А1а Ьуз Агд А1а Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Агд МеР Агд С1и Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 77 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 77
дрдассдарс сддРРдРсдс РсдасадаРс дасаддссдс ссдсдааРсР ддрсдссдар 60
сРдсадсдсР асддсдРсРс сассдрссас даддсдсаад ддсдРсдсдд ссРдсРсдсд 120
РсдРасаРдс ддссдаРсРа Рдссддсдсд сРсаРРдссд дрсссдсдар сасддРссРд 180
дРассдссРд дсдасаасРР даРдаРссас дрсдссдрдд аадрдрдсса дссРддсдас 240
дРРсРсдРсд Рсдссасдас дрсдссдрдс ассдасддсР аРРРсддсда дсРдсРддсд 300
асдРсдсРдс дддсссдсдд сдрддсдддд сРсдРдаРсд ардсдддсрд ссдддаРдРР 360
- 251 019971
сдсдсдсбда сддааабдсд абббсссдбс Ьддадссдсд сдабсадсдс дсадддаасс 420
дбсааадсса сдсЬдддсбс ддбдаасдсд дсддбддбдр дсдссдддас дбсддрдада 480
дссддддабс ЬсаЬсдбддс сдасдабдас ддддбддЬдд сддбдсддсд ддаддаадбс 540
дбсдссдСда сдсаддсддс сдаасадсдс дггсдсаадд аададддсас дсдсдсасдд 600
сбсдсдсадд дсдадсбсдд ссбддасабб басддсббдс дссадаадсб дЬсддаЬсЬа 660
ддсббдаадЬ сабсдЬсдбд а 681 <210> 78 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 78
Меб 1 ТНг Азр Рго УаЬ 5 УаЬ АЬа Агд СЬп Не 10 Азр Агд Рго Рго АЬа 15 Азп
Ьеи УаЬ АЬа Азр Ьеи СЬп Агд Туг С1у УаЬ Зег ТНг УаЬ НЬз С1и АЬа
20 25 30
С1п С1у Агд Агд СЬу Ьеи Ьеи АЬа Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг АЬа
35 40 45
С1у АЬа Ьеи Не АЬа С1у Рго АЬа 11е ТНг УаЬ Ьеи УаЬ Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е НЬз УаЬ АЬа УаЬ С1и УаЬ Суз СЬп Рго СЬу Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи УаЬ УаЬ АЬа ТНг ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр СЬу Туг РНе СЬу
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Бег Ьеи Агд А1а Агд СЬу УаЬ АЬа СЬу Ьеи УаЬ
ЬОО 105 110
11е Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд АЬа Ьеи ТНг СЬи Меб Агд РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Бег Агд АЬа Не Зег А1а СЬп СЬу ТНг УаЬ Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Бег УаЬ Азп АЬа АЬа Уа1 УаЬ Суз А1а СЬу ТНг Зег УаЬ Агд
145 150 155 160
АЬа СЬу Азр Ьеи Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ Уа1 АЬа УаЬ Агд
165 170 175
Агд СЬи СЬи УаЬ УаЬ АЬа УаЬ ТНг С1п АЬа А1а С1и СЬп Агд УаЬ Агд
180 185 190
- 252 019971
Ьуз Сби Сби 195 Сбу ТНг Агд Аба Агд 200 Ьеи А1а Сбп Сбу Сби 205 Ьеи Сбу Ьеи
Азр 11е 210 Туг Сбу Ьеи Агд Сбп 215 Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи 220 С1у Ьеи Ьуз Зег
Зег Зег
225 <210> 79 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 79
абдадсдадс сддбсдбсдб бсддсадабс дададдсссб сббсддссдс дабсдссдаб 60
сбссддсддб асддсдбсбс дасддббсас даадсдсадд дссдссдсдд асбдсбсдсд 120
бссддссбдс ддссдабсба бдсдассдсд сбсабддсдд дсссбдсдаб сасддбдсбд 180
дбсдсассдд дсдасаассб дабдабссас дбсдссдбсд аддбсбдсса дсссддддаб 240
дбдсбсдбдд бсасдссдас дбсассдбдс асддасддсб абббсддсда дсбдсбддсс 300
асдбсдсбдс дддсдсдадд сдббдсдддс сбсдбсабсд асдссддсбд ссдсдасабб 360
сдсдсдсбда сддадабдсд дбббсссдба бддадбсдсд сдабсадсдс дсадддсасд 420
дбсааадсса сдсбсддсбс сдбдаабдбс сссдбсдбсб дсдссддсдс дсббдбсдаа 480
дсдддсдасд бсабсдбсдс сдасдабдас ддддбсдбдд бддбдаадсд дддсдаадбс 540
дасдбсдбса бссаддсддс ддадсадсдс дбдсдсаадд аадаадбсас дсдддсссдд 600
сбддсдсадд дсдадсбсдд бсбддасабс басддссбдс дсаадаадаб бдсддассбд 660
ддсббдаадб сдбсдбда 678
<210> 80 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 80
Меб 1 Зег Сби Рго Уаб 5 Уаб Уаб Агд Сбп 11е 10 Сби Агд Рго Зег Зег 15 Аба
А1а Не Аба Азр Ьеи Агд Агд Туг Сбу Уаб Зег ТНг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Агд Сбу Ьеи Ьеи Аба Зег Сбу Ьеи Агд Рго 11е Туг Аба
- 253 019971
40 45
ТЬг А1а 50 Деи МеС АЬа СЬу Рго 55 АЬа 11е ТЬг УаЬ Ьеи 60 УаЬ АЬа Рго СЬу
Азр Азп Деи МеС Не НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬп Рго СЬу Азр
65 70 75 80
УаЬ Деи УаЬ УаЬ ТЬг Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
СЬи Деи Деи АЬа ТЬг Зег Ьеи Агд АЬа Агд СЬу УаЬ АЬа СЬу Ьеи УаЬ
100 105 110
11е Азр А1а СЬу Суз Агд Азр Не Агд АЬа Ьеи ТЬг СЬи МеС Агд РЬе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа 11е Зег АЬа СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз АЬа ТЬг
130 135 140
Деи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ СЬи
145 150 155 160
АЬа С1у Азр УаЬ 11е УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Ьуз
165 170 175
Агд СЬу СЬи УаЬ Азр УаЬ УаЬ Не СЬп АЬа АЬа СЬи СЬп Агд УаЬ Агд
180 185 190
Дуз С1и СЬи УаЬ ТЬг Агд АЬа Агд Ьеи АЬа СЬп СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг СЬу Деи Агд Ьуз Ьуз 11е АЬа Азр Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Зег
225 <210> 81 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 81
аСдаасдадс сдассдССдС СсдадсдаСс дасаддссдс сддсддаСдС ддСсдсддсд 60
сСссадсдсС асддсдСдСс дассдСдсаС даадсасаад ддадасдсдд ссСсдСадсд 120
СссСдсаСдс ддссдаСсСа сассддсдсС ССддСсдссд дСссСдссдС аассдСсСсд 180
сСсссдссдд дсдасаассС саСдаССсас дСсдсСдСсд аадссСдсса ддсдддсдас 240
дСдсССдСсд СддСдссдас сСссссдСдс асддасдддС аСССсддСда дССасСддсд 300
асдСсдсСдс асдсасдсдд адСсдСддсС сСсдСсаСсд аСдссддсСд ссдсдасдСд 360
сдсдсСсСдС сддадаСдсд аСССссСдСс Сддадссдсд сдаСсадсдс Ссадддсасд 420
дСсааадсса сдССдддаСс ддСдаасдСС сссдСддСдС дсдсдддадс дсссдСддад 480
сссддсдаСд СдаСсдСсдс сдасдасдаС ддддСддСдд ССдСдаадсд садсдаддСд 540
- 254 019971
дадддддрдд сдсаддсдбс ддадсадсда дбссбдаадд аддаддсдас дсдсдадсдд 600
РРддсдсдсд дсдадсбддд сс^сдаса^с Расдддсбдс ддааааадд!; д£сддасс1:с 660
ддссбдаааб аббсдрда 678
<210> 82 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 82 Агд А1а 11е 10 Азр Агд Рго Рго А1а 15 Азр
Меб 1 Азп С1и Рго ТЬг 5 Уа1 Уа1
Уа1 Уа1 А1а А1а Ьеи С1п Агд Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ыз С1и А1 а
20 25 30
С1п С1у Агд Агд СЬу Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Меб Агд Рго 11е Туг ТЬг
35 40 45
С1у А1а Ьеи Уа1 АЬа СЬу Рго А1а УаЬ ТЬг УаЬ Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 1Ье НЬз Уа1 А1а Уа1 С1и АЬа Суз СЬп АЬа С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 УаЬ Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Н13 А1а Агд СЬу Уа1 УаЬ АЬа Ьеи УаЬ
100 105 110
Не Азр А1а СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд А1а Ьеи Зег СЬи Меб Агд РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд АЬа 11е Зег А1а С1п СЬу ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег УаЬ Азп УаЬ Рго Уа1 Уа1 Суз АЬа С1у А1а Рго Уа1 СЬи
145 150 155 160
Рго С1у Азр УаЬ 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд Зег С1и УаЬ СЬи С1у УаЬ А1а СЬп А1а Зег С1и С1п Агд Уа1 Ьеи
180 185 190
Ьуз СЬи С1и АЬа ТЬг Агд С1и Агд Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг СЬу Ьеи Агд Ьуз Ьуз Уа1 Зег Азр Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
- 255 019971
Зег
225 <210> 83 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 83
абдадсдадс сддбсдбсдб бсддсадабс дададдсссб сббсддссдс дабсдссдаб 60
сбссддсддб асддсдбсбс дасддббсас даадсдсадд дссдссдсдд асбдсбсдсд 120
бссддссбдс ддссдабсба бдсдадсдсд сбсабддбдд дсссбдсдаб сасддбдсбд 180
дбсдсассдд дсдасаассб дабдабссас дбсдссдбсд аддбсбдсса дсссддддаб 240
дбдсбсдбдд бсасдссдас дбсассдбдс асддасддсб абббсддсда дсбдсбддсс 300
асдбсдсбдс дддсдсдадд сдббдсдддс сбсдбсабсд асдссддсбд ссдсдасабб 360
сдсдсдсбда сддадабдсд дбббсссдба бддадбсдсд сдабсадсдс дсадддсасд 420
дбсааадсса сдсбсддсбс сдбдаабдбс сссдбсдбсб дсдссддсдс дсбсдбсдаа 480
дсдддсдасд бсабсдбсдс сдасдабдас ддддбсдбдд бддбдаадсд дддсдаадбс 540
дасдбсдбса бссаддсддс ддадсадсдс дбдсдсаадд аадаадбсас дсдддсдсдд 600
сбддсдсадд дсдадсбсдд бсбддасабс басддссбдс дсаадаадаб бдсддассбд 660
ддсббдаадб сдббдбда 678
<210> 84 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 84
Меб 1 Зег <31и Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п 11е 10 С1и Агд Рго Зег Зег 15 А1а
А1а 11е А1а Азр Ьеи Агд Агд Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Н13 С1и А1а
20 25 30
С1п С1 у Агд Агд О1у Ьеи Ьеи А1а Зег С1у Ьеи Агд Рго 11е Туг А1а
35 40 45
Зег А1а Ьеи Меб Уа1 С1у Рго А1а Не ТЬг Уа1 Ьеи Уа1 А1а Рго О1у
50 55 60
- 256 019971
Азр 65 Азп Ьеи Меб Не Нтз 70 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 75 Суз С1п Рго С1у Азр 80
\7а1 Ьеи Уа1 Уа1 ТНг Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд А1а Агд С1у Уа1 А1а С1у Ьеи \7а1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр 11е Агд А1а Ьеи ТНг С1и Меб Агд РНе
115 120 125
Рго \7а1 Тгр Зег Агд А1а 11е Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
А1 а С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 \7а1 Ьуз
165 170 175
Агд С1у С1и Уа1 Азр Уа1 Уа1 11е С1п А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и Уа1 ТНг Агд А1а Агд Ьеи А1а С1п С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз 11е А1а Азр Ьеи С1 у Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Ьеи
225 <210> 85 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 85
абдассддса ббдбсдбсда дассабсдад сдсдсдбсдс бсдссдасаб сдссдсдббд 60
дссдааббсд дсдбсдссас сабссасдад дсдсадддсс дсабсддссб дсббдссбсс 120
ассабдсдсс сдабсбасдс аддсдсддсд дссдссддса абдссдбсас сдбдбсддбд 180
ссдсссддсд асаасбддаб дабссасдбс дссдбсдадс адбдссдсда аддсдабабб 240
сНсдбсдбсд сссссассад сссдаасдас аасддсбасб ЬНддсдаасб дсбддссбдс 300
бсдсбсаадб сдсдсддсдб дсдсддссбс абсабсдадд ссддсбдссд сдасдбдааа 360
ссдсбсассд адабдаадбб ссссдбсбдд бсссдсдссд бсбссбссса дддсасддбд 420
ааддааадсс бсддсдасдб даассбдссд сбсбсдабсд ссддссадсб сдбсаасссс 480
ддсдабдбса бсдбсдссда бдасдасддс дбддбсдбдд бсбсссдсаа бдаадбсадд 540
адсдбсассд ссаадбсссд сдадсдсдаа дасааддадд ссаадаассд сдбдсадсбс 600
саадссддсс адсбсддсаб сдасабсбас ддсабдсдсд асаадсбсаа ддссаадддс 660
- 257 019971 сЬссдсЬасд ЬсаааЬссдс ддсддадббд аадаадбад 699 <210> 86 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 86
Меб ТЬг Сбу ббе Уаб Уаб Сби ТЬг ббе Сби Агд Аба Зег Ьей Аба Азр
1 5 10 15
ббе Аба Аба Ьей Аба Сби РЬе Сбу Уаб Аба ТЬг ббе Нбз Сби Аба Сбп
20 25 30
Сбу Агд ббе Сбу Ьей Ьей Аба Зег ТЬг МеЬ Агд Рго ббе Туг Аба Сбу
35 40 45
Аба Аба Аба Аба Сбу Азп Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Уаб Рго Рго Сбу Азр
50 55 60
Азп Тгр Меб ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Сбп Суз Агд Сби Сбу Азр ббе
65 70 75 80
Ьей Уаб Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Азп Азр Азп Сбу Туг РЬе Сбу Сби
85 90 95
Ьей Ьей Аба Суз Зег Ьей Ьуз Зег Агд Сбу Уаб Агд Сбу Ьей 11е ббе
100 105 110
Сби Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Ьуз Рго Ьей ТЬг Сби Мер Ьуз РЬе Рго
115 120 125
Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Сби Зег Ьей
130 135 140
Сбу Азр Уаб Азп Ьей Рго Ьей Зег ббе Аба Сбу Сбп Ьей Уаб Азп Рго
145 150 155 160
Сбу Азр Уаб ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Зег Агд
165 170 175
Азп Сби Уаб Агд Зег Уаб ТЬг Аба Ьуз Зег Агд Сби Агд Сби Азр Ьуз
180 185 190
Сби Аба Ьуз Азп Агд Уаб Сбп Ьей Сбп Аба Сбу Сбп Ьей Сбу ббе Азр
195 200 205
ббе Туг Сбу Меб Агд Азр Ьуз Ьей Ьуз Аба Ьуз Сбу Ьей Агд Туг Уаб
210 215 220
Ьуз Зег Аба Аба Сби Ьей Ьуз Ьуз
225 230
- 258 019971 <210> 87 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 87
абдддсаббд бсдббсадаа саббсадсдд дсддадсадб ссдбсабсда бсдбсбсдсб 60
дсббдсддад ббдсдассдб асабдаадсд садддссдса аддддсбдсб сдссадсбас 120
абдсддссда бббабссддд сдсдсддабс дсддсдадбд ссдбдасааб ббссдсдссб 180
ссдддсдаба асбддабдсб дсабдбддсд абсдадсада бсааддсддд сдабабссба 240
сбдсббдсдс сдассадбсс сбдсдаддас ддббабббсд дсдабсбсбб ддсдасдбсб 300
дссабддсас дсддсбдссд сдддббддбд абсдабдссд дсдбдсдсда бдбсдссдаб 360
сбсааддсда бдааббббсс сдбббддбсд аадасдабсб сбдсасаддд дасддбсаад 420
дадасддбдд дсбсддбсаа баббсссдбс дбсбдсдсса дбдсдсбсдб саабссбддс 480
дабдбдабсд ббдссдабда бдабддсдбс бдсдбсдбас ддсдддадда адсбдссдад 540
дбсдсддаба аддссдадса дсдддбсдсд дсадаададд асаадсдссд дсдасбддсс 600
дсдддбдаас бсдддсбсда бабсбасаад абдсдсдадс ддсбддсдда дааддддсбд 660
ааабабдбсб ад 672
<210> 88 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 88
Меб 1 С1у 11е Уа1 УаЬ 5 С1п Азп Не СЬп Агд 10 А1а С1и СЬп Зег УаЬ 15 Не
Азр Агд Ьеи АЬа АЬа Суз СЬу Уа1 АЬа ТЬг Уа1 НЬз СЬи АЬа С1п СЬу
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи АЬа Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг Рго СЬу АЬа
35 40 45
Агд Не А1а АЬа Зег АЬа Уа1 ТЬг Не Зег А1а Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Ьеи Ηίδ Уа1 АЬа Не СЬи СЬп Не Ьуз АЬа СЬу Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
- 259 019971
Ьеи Ьеи Аба Рго ТНг 85 Зег Рго Суз Сби Азр 90 Сбу Туг РНе Сбу Азр 95 Ьеи
Ьеи А1а ТНг Зег А1а Меб Аба Агд С1у Суз Агд Сбу Ьеи Уаб 11е Азр
100 105 110
Аба Сбу Уаб Агд Азр Уаб Аба Азр Ьеи Ьуз Аба Меб Азп РНе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Ьуз ТНг 11е Зег Аба Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Сби ТНг Уаб Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп 11е Рго Уаб Уаб Суз Аба Зег Аба Ьеи Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр Уаб 11е Уаб А1а Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уаб Уаб Агд Агд Сби
165 170 175
Сби Аба Аба Сби Уаб Аба Азр Ьуз Аба Сби Сбп Агд Уаб Аба А1а Сби
180 185 190
Сби Азр Ьуз Агд Агд Агд Ьеи А1а Аба Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг Ьуз Меб Агд Сби Агд Ьеи Аба Сби Ьуз Сбу Ьеи Ьуз Туг Уаб
210 215 220
<210> 89 <211> 696 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 89 абдаадсдсд дсдбддбддб дасссабабс дсдсдддсдд абдсддсдаа сдбддссдбд 60
сбдсдддадд саддсдббдс дассдбссас даддсдсада дссддсббдд бсббсбадсд 120
бдсбасабдс ддссдабсба бссдддсдсд дссаббдссд дассддссдб сасддбдсбс 180
дбдссдссдб сддасаасбд дабдсбдсаб дбддсддбсд аасадбдссд сдсаддсдас 240
дбдсбддбдд бддсдсссас дбсбдссбдс даддасдддб абббсдддда асбдсббдсс 300
асдбсдсбсд сдаадсдсдд сдбасадддс сбдабсабсд абдсдддсбд ссдддабдбд 360
бдсдсдсбса аддсаабдда ббббсссдбд бддбсдаадд ссдбсбссдс дсадддсасд 420
дбсааддада сдсбсддсбс ддбсаабдбд ссддбсдбаб дсдсдсадса дабсдбдсаб 480
ссдддадасд бдабсдбддс сдабдасдас ддсабсдбсд бддсдссдсб сдссассдбс 540
даддсддбад сдааддссдс дсаддсдсдс сбддадаадд аададаадас дсдбдсддбд 600
сбсдсаадсд дсасдсбсдд ссбсдасбас басдсдабдс дбдасаддсб сдсддааада 660
ддсббдсдсб асдбсдаббс ддссбсбдаа сбббда 696
<210> 90 <211> 231
- 260 019971 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 90 Уаб Уаб ТНг
Меб 1 Ьуз Агд С1у Уаб 5
Азп Уаб А1а Уаб 20 Ьеи Агд Сби Аба
Сбп Зег Агд 35 Ьеи Сбу Ьеи Ьеи Аба 40
Сбу Аба 50 Аба 11е Аба Сбу Рго 55 Аба
Азр 65 Азп Тгр Меб Ьеи Нбз 70 Уаб Аба
Уаб Ьеи Уаб Уаб Аба 85 Рго ТНг Зег
<31и Ьеи Ьеи Аба 100 ТНг Зег Ьеи Аба
ббе Азр А1а 115 Сбу Суз Агд Азр Уаб 620
Рго νβΐ 130 Тгр Зег Ьуз Аба Уаб 635 Зег
Ьеи 145 Сбу Зег Уаб Азп Уаб 650 Рго Уаб
Рго Сбу Азр Уаб ббе 665 Уаб Аба Азр
Ьеи Аба ТНг Уаб 180 Сби Аба Уаб Аба
Ьуз Сби Сби 195 Ьуз ТНг Агд Аба Уаб 200
Азр Туг 210 Туг А1а Меб Агд Азр 265 Агд
Уаб 225 Азр Зег Аба Зег Сби 230 Ьеи
Нбз ббе 60 Аба Агд Аба Азр Аба 65 Аба
Сбу 25 Уаб Аба ТНг Уаб Нбз 30 Сби Аба
Суз Туг Меб Агд Рго 45 ббе Туг Рго
Уаб ТНг Уаб Ьеи 60 Уаб Рго Рго Зег
Уаб Сби Сбп 75 Суз Агд Аба Сбу Азр 80
Аба Суз 90 Сби Азр Сбу Туг РНе 95 Сбу
Ьуз 605 Агд Сбу Уаб Сбп Сбу 660 Ьеи ббе
Суз Аба Ьеи Ьуз Аба 625 Меб Азр РНе
Аба СДп Сбу ТНг 640 Уаб Ьуз Сби ТНг
Уаб Суз Аба 155 Сбп Сбп ббе Уаб Нбз 160
Азр Азр 670 Сбу ббе Уаб Уаб Аба 675 Рго
Ьуз 685 Аба Аба Сбп Аба Агд 690 Ьеи Сби
Ьеи Аба Зег Сбу ТНг 205 Ьеи Сбу Ьеи
Ьеи Аба Сби Агд 220 Сбу Ьеи Агд Туг
<260> 96
<211 > 678
<262> ДНК
<263> Неизвестно
<220>
- 261 019971
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 91 абдаасааас сддбддбддб ссддааддбс даасадссдс сасаадабдс ддбддсддсб 60
сбддадаааб абддсдбдбс сасддбдсас даадсдсаад дссдббдсдд дсбдсбсдсс 120
ссббасабдс дсссдабсба бдссддсдсб бссабддссд ддсссдссдб сассдбсбсс 180
сббссдсссд дбдасаассб сабдабссаб дбсдсддбсд аадбдбдсса дсссддааас 240
аббсбддбсд бсдсссссас ббсассббдб ассдасдддб абббсддсда дббдсбддсб 300
асббссббдс дсдсссасдд сдбдааддса сбсабаабсд абдссддабд ссдбдасдбд 360
сдсбсссбса ссдааабдаа дбббсссдбд бддадссдсд ссдбсадббс дсадддааса 420
дбдаадбсса сдсбсддабс адбдаасдбд ддсдбадбдб дбдсдддсдс бббсабсдаа 480
дсдддсдаса бсдбсдбсдс бдабдабдас ддадббдбсд бсдбдаадсд дасбббсдсд 540
сдсдасдбдд ббдаадссбд бдаасададд дббсдсаадд аададдсдас дсдддсасдд 600
сбддсдсддд дсдаасббдд дсбддасабс басддаббдс дсбссааддб ддсддаасбс 660
ддбсбсаадб асабабаа 678
<210> 92 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <22 3> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 92
Меб 1 Азп Луз Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд Луз Уа1 10 С1и С1п Рго Рго С1п 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Леи С1и Луз Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п <31у Агд Суз С1у Леи Леи А1а Рго Туг Меб Агд Рго 11е Туг А1а
35 40 45
С1у А1а Зег Меб А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Леи Меб 11е ΗΪ3 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Леи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Леи Леи А1а ТНг Зег Леи Агд А1а Н1з С1у Уа1 Луз А1а Леи 11е
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Леи ТЬг С1и Меб Дуз РЬе
- 262 019971
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа УаЬ Зег Зег СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз Зег ТЬг
130 135 140
Деи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ СЬу УаЬ УаЬ Суз АЬа С1у АЬа РЬе 11е СЬи
145 150 155 160
АЬа СЬу Азр 11е УаЬ УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Ьуз
165 170 175
Агд ТЬг РЬе АЬа Агд Азр УаЬ УаЬ СЬи АЬа Суз СЬи СЬп Агд УаЬ Агд
180 185 190
Дуз СЬи СЬи АЬа ТЬг Агд АЬа Агд Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг СЬу Деи Агд Зег Ьуз УаЬ АЬа СЬи Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
11е
225 <210> 93 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, <400> 93 полученная из образца из окружающей среды
аЬдааЬааас сддЬддЬадЬ ссддсаадЬд дадсадссас садсддасдс ддЬЬдсддсд 60
сСддадаадЬ аЬддсдЬсас сассдЬдсаЬ даддсЬсадд дасдСЬдЬдд ссЬдсЬсдсд 120
сасЬасаЬдс дЬссдаСЬЬЬ Ьссдддадсд дссаЬсСсдд дЬЬсЬдсЬдЬ сассдбадсс 180
ЬСдссдссдд дсдаЬаассб саЬдаЬссас дЬсдсддЬсд аддСсЬдсдд сссдддааас 240
аЬссЬддЬдд ЬЬдсдссдас сЬсдссЬЬсд асддаЬддсЬ асЬЬсддЬда дсЬдЬЬддсд 300
ассЬсЬсСдс дСдсЬсдсдд ЬдЬдааадда сЫдЬдаЬЬд аЬдссддаЬд ссдбдасдЬЬ 360
сдсСсссСда ссдадабдаа аЬСссссдСс ЬддадссдЬд ссабсадсЬс дсадддааса 420
дЬсааддсса сссСсддаСс ддСдааЬдСд ссддЬсаЬдЬ дсдсдддсдс дсбсдЬсдаа 480
дсСддддаСд СсаСсдЬсдс сдаЬдабдаС ддааССдбдд ЬСдбсаадсд сдсдсабдсд 540
сасдаддЬдд ссдсддсддс адаасааадд дЬдсдсааад адааЬабаас ссдсдаасдд 600
сЬЬсдасдсд дададсбсдд асЬсдаЬаЬЬ ЬасдасаЬдс дссааааааЬ сдсдсаасбд 660
ддссЬсаааЬ ассСдЬда 678
<210> 94 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 263 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 94 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
МеЕ 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1
А1а Уа1 А1а А1а Ьей С1и Ьуз Туг С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Н13 С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьей Ьей А1а Нгз Туг МеЕ Агд Рго Не РНе Рго
35 40 45
С1у А1а А1а Не Зег С1у Зег А1а Уа1 ТНг Уа1 А1а Ьей Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьей МеЕ Не Н1з Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1у Рго С1у Азп
65 70 75 80
Не Ьей Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Зег ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьей Ьей А1а ТЬг Зег Ьей Агд А1а Агд С1у Уа1 Ьуз С1у Ьей Уа1
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Леи ТНг С1и МеЕ Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Леи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 МеЕ Суз А1а С1у А1а Ьей Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Не Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а Нгз А1а Н1з С1и Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп Не ТНг Агд С1и Агд Ьей Агд Агд С1у С1и Ьей С1у Ьей
195 200 205
Азр Не Туг Азр МеЕ Агд С1п Ьуз Не А1а С1п Ьей С1у Ьей Ьуз Туг
210 215 220
Леи
225
<210> 95
<211> 639
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 95
д£дадсда1:с сдаЕсдссда ссЕдсдсддд ЕаЕддадЕсЕ сдасддЕЕса сдаддсссад 60
ддссддсдсд дЕсЕдсЕддс дссЕЕасаЕд сдЕссдаЕсЕ аЕдссддсдс ссЬЬдЬсдсс 120
- 264 019971
ддассадссд бдасддббсб ддбсссдссс ддсдасаасс бдабдабсса сдбсдссдбс 180
дадсддбдсб сдссдддсда сабссбсдбс дбсдсдссда сдбсдссдбд сасддасддс 240
бабббсддсд адсбдсбддс дасдбсдсбд сдддсасдсд дбдбсдссдс асбдабсабс 300
дасдссддсб дсадддасдб дсдадсдсбс ассдадабдс дсббсссддб дбддадссдс 360
дссабсадсд сссааддаас ддбдааддсд асдсбсддсб сддбдаабдб дссадбддбс 420
бдсдссддад ссабсдбсдд бссбддсдас дбсабддббд сддасдабда сддсдбддбс 480
дбддбдадда аддасдаадб сдссдсддбд асдсаддсдд сддсдсадсд ддбссдсааа 540
даададддса сдсдддсдсд дсбддссдсд ддсдадсбсд дссбддасаб сбасддссбс 600
сддсадаадс бдбсддабсб сддссбдаад бсдбсдбда 639
<210> 96 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (9)...(161) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 96 Ьеи Агд С1у 10 Туг С1у Уа1 Зег ТЬг 15 \7а1
Меб 1 Зег Азр Рго Не 5 А1а Азр
НЬз С1и А1а С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Рго Туг Меб Агд Рго
20 25 30
11е Туг А1а С1у А1а Ьеи Уа1 А1а СЬу Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи Уа1
35 40 45
Рго Рго С1у Азр Азп Ьеи Меб 11е НЬз Уа1 А1а Да1 С1и Агд Суз Зег
50 55 60
Рго С1у Азр 11е Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у
65 70 75 80
Туг РНе С1у СЬи Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Агд СЬу Уа1 А1а
85 90 95
А1а Ьеи Не 11е Азр А1а СЬу Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг С1и
100 105 НО
Меб Агд РЬе Рго Да1 Тгр Зег Агд А1а 11е Зег А1а С1п СЬу ТЬг Да1
115 120 125
Ьуз А1а ТЬг Ьеи СЬу Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Да1 Суз А1а С1у А1а
130 135 140
11е \7а1 С1у Рго С1у Азр Уа1 Меб \7а1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 \7а1
145 150 155 160
- 265 019971
Уа1 ν3ι Агд Ьуз Азр 165 С1и Уа1 А1а А1а Уа1 170 ТИг С1п А1а А1а А1а 175 О1п
Агд \7а1 Агд Ьуз 180 С1и С1и С1у ТИг Агд 185 А1а Агд Ьеи А1а А1а 190 С1у С1и
Ьеи С1у Ьеи Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд С1п Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи С1у
195 200 205
Ьеи Ьуз Зег Зег
210 <210> 97 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 97
аЬдадсддсс ссасддЬсдб ЬсдсдадаЬс дассддссдд ааддсдассб сдбдассдса 60
сЬЬдадсасд сдддсдЬдбс дасддбссас даадсасадд дасддсдддд асбдсЬсдсс 120
ассЬасабдс ддссдаЬЬЬа сдссддадсс дЬдаЬсдссд дассддсддб сассдЬссЬс 180
дбдссдсссд дсдасаассб даЬдаЬЬсас дЬддсддбсд аадЬдЬдссд сссдддбдас 240
дЬдсЬддЬсд Ьсдссдбсас дЬсдссдЬдЬ ассдасддсЬ асЬЬсддЬда дсЬдсЬддсд 300
асдЬсддЬЬс дсдсдсдсдд сдбсаааддд сЬсдЬсаЬсд аЬдсадддЬд ссдддасдбд 360
сдддсдсЬса ссдадаСдсд дЬПссддЬд Ьддадссддд сддЬсадЬдс дсадддсасс 420
дбсааддсса сдсЬсддсЬс сдЬдаасдЬЬ ссадЬсдЬдЬ дЬдссддсдс дсбсаЬсаса 480
ддбддадасд ЬсдЬсаЬсдс сдасдасдаб ддддЬддЬсд ЬддЬдаадсд сдаддаадбд 540
дасдсддЬсд ЬЬсаддасЬс дсдссадсдд сЬдсЬсаадд аадасдддас дсдададсдб 600
сбсдсдасад дсдадсбддд дсЬддасабс ЬасЬсдсЬдс дсаадаЬдсЬ дЬссдаЬсЬд 660
ддасЬдаадЬ ассдабад 678
<210> 98 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 98
Меб Зег С1у Рго ТЬг Уа1 \/а1 Агд С1и 11е Азр Агд Рго С1и С1у Азр 15 10 15
- 266 019971
Ьеи Уа1 ТЬг А1а 20 Ьеи С1и Нтз А1а С1у 25 Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нтз 30 С1и А1а
С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а ТЬг Туг Меб Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а Уа1 Не А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи Уа1 Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Н13 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Уа1 ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Уа1 Агд А1а Агд С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг С1и Меб Агд РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Не ТЬг
145 150 155 160
С1у С1у Азр Уа1 Уа1 Не А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 \7а1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд С1и С1и Уа1 Азр А1а Уа1 Уа1 С1п Азр Зег Агд С1п Агд Ьеи Ьеи
180 185 190
Ьуз С1и Азр С1у ТЬг Агд С1и Агд Ьеи А1а ТЬг С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Зег Ьеи Агд Ьуз Меб Ьеи Зег Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Агд
225 <210> 99 <211> 639 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 99
дбдадсдабс сдабсдссда ссбдсдаддд ЬаЬддЬдбсЬ ссасддЬЬса сдаддсдсад 60
ддссддсдсд дссЬдсбддс дссЬЬасабд сдЬссдабсЬ абдссддсдс дсбсдбсдсс 120
ддассадссд ЬдасддбссЬ ддбсссдссс ддсдасаасс Ьдабдабсса сдЬсдсбдбс 180
дадсддСдсб сдссаддсда саЬссЬсдбс дбсдсдссда сдЬсдссдбд сасддасддс 240
ЬаЬПсддсд адсбдсбддс дасдбсдсбд сдддсасдсд дрдбсдссдс асЬдабсабс 300
дасдсбддсб дсадддасдб дсдадсдсбс ассдадабдс дсЬЬсссддб дбддадссдс 360
- 267 019971
дссабсадсд сссааддаас ддбдааадсд асдсбсддсЬ сддЬдаабдЬ дссасбддбс 420
Ьдсдссддад ссабсдбсдд Ьссбддсдас дЬсаЬддИд сддасдабда сддсдбддЬс 480
дбддбдадда аддасдаадб сдссдсддбд асдсаддсдд сддсдсадсд ддбссдсааа 540
даадааддса сдсдддсдсд дсбддссдсд ддсдадсбсд дссЬддасаб сбасддссбс 600
сддсадаадс НдЬсддабсЬ сддссбдаад НсдЬсдбда 639
<210> 100 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (9)...(161) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 100
МеС 1 Зег Азр Рго Не 5 АЬа Азр Ьеи Агд СЬу 10 Туг СЬу УаЬ Зег ТНг 15 УаЬ
НЬз СЬи А1а С1п СЬу Агд Агд СЬу Ьеи Ьеи АЬа Рго Туг Меб Агд Рго
20 25 30
Не Туг А1а СЬу А1а Ьеи УаЬ АЬа СЬу Рго АЬа УаЬ ТЬг УаЬ Ьеи УаЬ
35 40 45
Рго Рго СЬу Азр Азп Ьеи МеС Пе НЬз УаЬ АЬа УаЬ С1и Агд Суз Зег
50 55 60
Рго СЬу Азр 11е Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Рго Суз ТНг Азр СЬу
65 70 75 80
Туг РЬе СЬу СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег Ьеи Агд АЬа Агд СЬу УаЬ АЬа
85 90 95
АЬа Ьеи 11е Не Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд АЬа Ьеи ТНг СЬи
100 105 но
МеС Агд РЬе Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа Не Зег АЬа СЬп СЬу ТНг УаЬ
115 120 125
Ьуз АЬа ТЬг Ьеи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Рго Ьеи УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа
130 135 140
Не УаЬ СЬу Рго СЬу Азр УаЬ МеС УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ
145 150 155 160
УаЬ УаЬ Агд Ьуз Азр СЬи УаЬ АЬа АЬа УаЬ ТНг СЬп АЬа АЬа А1а СЬп
165 170 175
Агд УаЬ Агд Ьуз СЬи СЬи СЬу ТЬг Агд АЬа Агд Ьеи АЬа А1а СЬу СЬи
180 185 190
Ьеи С1у Ьеи Азр Не Туг С1у Ьеи Агд СЬп Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи СЬу
195 200 205
Ьеи Ьуз Зег Зег
- 268 019971
210 <210> 101 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 101 аРдаасасас сддРддРадс аадасаадРд дадсадссас садсддаРдс ааРРдссдса60
РРддадаадР дрддадрдас аассдрссар даддсРсадд дасдррдрдд ссРссббдсд120
РссРасаРРс дсссдаРРРа сссдддадса дссаРсдсад даРссдсРаР сасРдРдРсР180
РРдссРссРд дсдасаассР саРдаРссас дррдсддрдд аддРсРдсдд Рссдддааас240 аРссРддРад РРРсассдас дРсдссРРдР асддасддсР асРРсддРда дррдррддса300 асаРсРсРсс дрдсссасдд адрдаррддд сррдрдарсд ардссддард ссдРдаРдРд360 сдсРсРсРда садаааРдаа аРРсссддРс Рддадссдсд ссаРсРдРРс дсдадддаса420 дРсааддсса сасРРддарс ддРдааРдРд сссаРсдРаР дсдсдддрдс ааРддРсдад480 дсрддрдард дсарсдрсдс сдасдардар ддсдРРдРсд РРдРдаадсд адсдсрддсд540 саддадаРсд сРдсддсддс ддаасааадд дРРсдсааад адаардраас ссдсдаасда600 сРсдсасдРд дададсРсдд асРРдаРаРР РасдасаРдс дссаааадаР сдсдсаасРд 660 ддссРсаааР аРсРсРда678 <210> 102 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (28)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 102 Рго Уаб 5 Уаб Аба Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
Меб 1 Азп ТЬг
Аба ббе Аба Аба Леи Сби Луз Суз Сбу Уаб ТЬг ТЬг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Суз Сбу Леи Леи Аба Зег Туг 11е Агд Рго ббе Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба Аба ббе Аба Сбу Зег Аба ббе ТЬг Уаб Зег Леи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Леи Мер ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
- 269 019971
Не Ьеи Уаб Уаб Зег 85 Рго ТНг Зег Рго Суз 90 ТНг Азр Сбу Туг РНе 95 Сбу
Сби Ьеи Ьеи Аба ТНг Зег Ьеи Агд А1а Нбз Сбу Уаб 11е Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТНг Сби Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд А1а Не Суз Зег Агд Сбу ТНг Уаб Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Рго 11е Уаб Суз Аба Сбу Аба Меб Уаб С1и
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Сбу 11е Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уа1 Уаб Уаб Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд Аба Ьеи Аба Сбп Сби 11е А1а А1а А1а Аба Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Азп Уаб ТНг Агд Сби Агд Ьеи Аба Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Меб Агд Сбп Ьуз 11е Аба Сбп Ьеи Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 103 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 103
абдаабсдас сддбддбадб ссддсаадбд дадсаддсас садсддабдс ддбсдссдса 60
сбддадаадб дсддадбдас сассдбдсаб даддсбсадд дасддддбдд ссбдсббдсс 120
бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дссабсдссд дббссдсдаб сассдбдбсб 180
ббдсссссбд дсдабаассб сабдабссас дбсдсадбдд аддбсбдсдд бссдддааас 240
аббсбддбдд бббсассдаб сбсдссббдб асддабддбб асббсддсда дсбдббддса 300
асабсссбсс дбдсссдсдд бдддададдд сббдбдабсд абдссддабд ссдддасдбд 360
сдсбсбббаа садааабдаа абббссадбс бддадссдсд ссдбсадббс дсаддддаса 420
дбсааддсса сасбдддабс ддбдаабдбд сссдбсдбдб дбдсдддсдс асбддбсдад 480
дсдддбдабд бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд бддбдаадсд сдсдсбддсс 540
саддаддбсд ссдссдсадс ддаасааадд дббсдсааад адаассбдас ссдсдаасда 600
сббдсдсдбд дадаасбсдд асбсдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсааабд 660
ддссббаааб абсбсбаа 678
- 270 019971 <210> 104 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 104 Уаб Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Аба Рго Аба 15 Азр
Меб 1 Азп Агд Рго Уаб 5 Уаб
Аба Уаб Аба Аба Ьеи Сби Ьуз Суз Сбу Уаб ТЬг ТЬг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Сбу Сбу Ьеи Ьеи Аба Зег Туг Мер Агд Рго I бе Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба Аба Не Аба Сбу Зег Аба I бе ТЬг Уаб Зег Ьеи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
Не Ьеи Уаб Уаб Зег Рго Не Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи Аба ТНг Зег Ьеи Агд Аба Агд Сбу Сбу Агд Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
Не Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТЬг Сби Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Аба ТЬг
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Рго Уаб Уаб Суз Аба Сбу Аба Ьеи Уаб Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб Не Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Аба Ьеи Аба Сбп Сби Уаб Аба Аба Аба Аба Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Азп Ьеи ТЬг Агд Сби Агд Ьеи Аба Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд Сбп Ьуз Не Аба Сбп Меб Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Леи
225 <210> 105 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 271 019971 <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 105 абдаабасас сддрддбадб ссддсаадбд дадсадссас сбдсддаддс ддббдссдса60 срддаааадс дбддддрдас аассдрдсаб даддсбсадд дасдРЬдбдд ссЪссЪРдсс120
РссНасаНдс дсссдаРРРа сасдддадса дсдабсдсад дабссдсРаб сасадбдРсс180
Нбдссдсссд дсдасаассЬ сабдаРссас дррдссдрдд аддРаРдРдд РРсаддааас240 аРссРддРад РРРсассаас сРсдссРРдР дсддаРддсР асРРсддРда дсРдРРддса300 асаРсРсРсс дрдсссардд РдРсададдд срддрдарсд ардсдддард ссдрдардрд360 сдсРсссРаа сададаРдаа аРРРссддРс Рддадссдсд ссдРсадсРс асаддддаса420 дрсааддсса сасРРддаРс ддрдаасдрд сссаРсдРРР дсдсдддрдс асрддрсдас480 дсРддРдаРд РсаРсдРсдс адаРдасдаР ддсдррдрдд РддРдаадсд сдсдаРддсд540 саададдРсд ссдсддсддс ддаасааадд дРРсдсааад адааРсРдас ссдсдаасда600 сррдсдсдрд дРдаасРРдд РсРсдаРаРР РасдасаРдс дссаааадаР сдсдсаасрд 660 ддасРРаадР аРсРдРаа678 <210> 106 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 106
Меб 1 Азп ТНг Рго Уа1 5 Уа1 УаЬ Агд
А1а Уа1 А1а АЬа 20 Ьеи С1и Ьуз Агд
С1п С1у Агд 35 Суз С1у Ьеи Ьеи АЬа 40
С1у А1а 50 АЬа Не А1а С1у Зег 55 АЬа
Азр 65 Азп Ьеи Меб Не НЬз 70 УаЬ АЬа
Не Ьеи УаЬ УаЬ Бег 85 Рго ТНг Зег
С1и Ьеи Ьеи АЬа 100 ТЬг Зег Ьеи Агд
СЬп Уа1 10 СЬи СЬп Рго Рго А1а 15 С1и
С1у 25 Уа1 ТНг ТНг УаЬ НЬз 30 С1и А1а
Зег Туг Мер Агд Рго 45 Не Туг ТНг
I Ье ТНг УаЬ Зег 60 Ьеи Рго Рго С1у
УаЬ С1и УаЬ 75 Суз СЬу Зег С1у Азп 80
Рго Суз 90 АЬа Азр СЬу Туг РНе 95 С1у
АЬа 105 НЬз СЬу УаЬ Агд СЬу 110 Ьеи Уа1
- 272 019971
Не Азр А1а 115 С1у Суз Агд Азр Уа1 120 Агд Зег Ьеи ТЬг СЬи 125 Меб Ьуз РЬе
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег СЬп СЬу ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е Уа1 Суз А1а СЬу А1а Ьеи Уа1 Азр
145 150 155 160
АЬа С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр СЬу УаЬ Уа1 УаЬ Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а Меб АЬа С1п С1и УаЬ АЬа А1а А1а А1а СЬи СЬп Агд УаЬ Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп Ьеи ТЬг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Меб Агд СЬп Ьуз 11е АЬа СЬп Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 107 <211> 636 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 107 дбдадсдабс сдабсдссдс ссбдсдсдда бабддсдббб сдасддбдса сдаддсдсад60 дддсддсдсд дссбдсбддс дссббасабд сдсссдабсб абдссддбдс дсбссбсдсс120 дддсссдсдд бдасддбссб ддббссбссб ддсдасаасс бдабдабсса сдбддсддбс180 дадааабдсб сдссбддада сдбссбсдбс дбсдссссдд сдбсбссдбд сасддасддс240 басббсддад ааббдсббдс дасдбсдббд сдддсссдсд дсдббдссдд сббдабсабс300 дабдссддсб дссдддабдб дсдсдсдсбс асддадабдс ддбббссддб дбддадссдс360 ббсдбсбдсд сбсадддсас ддбдааддсс асдсбсддсб сдсбдаабдб дссдсбддбс420 бдсдссддсд сссбсабсдс бсссдсбдаб дбсабсдббд садасдабда сддддбддбд480 дбддбдаада дддасдадаб сдссабддбд асдсаддсдд сддадсадсд ддббсдсааа540 даддааддса сдсдсдсдсд дсбсдссдсд ддсдадсбсд дссбддасаб сбасддсббд600 сддсадаадс бдбсддассб сддссбсаад бсдбда636 <210> 108 <211> 211 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 273 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (9)...(161) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 108
Меб 1 Зег Азр Рго Не 5 А1а А1а Ьеи Агд С1у 10 Туг С1у Уа1 Зег ТЬг 15 Уа1
Нтз С1и А1а С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Рго Туг Меб Агд Рго
20 25 30
Не Туг А1а С1у А1а Ьеи Ьеи А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи Уа1
35 40 45
Рго Рго С1у Азр Азп Ьеи Меб Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Ьуз Суз Зег
50 55 60
Рго С1у Азр Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго А1а Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у
65 70 75 80
Туг РЬе С1у С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Агд С1у Уа1 А1а
85 90 95
С1у Ьеи Не Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг С1и
100 105 НО
Меб Агд РЬе Рго Уа1 Тгр Зег Агд РЬе Уа1 Суз А1а С1п С1у ТЬг Уа1
115 120 125
Ьуз А1а ТЬг Ьеи С1у Зег Ьеи Азп Уа1 Рго Ьеи Уа1 Суз А1а С1у А1а
130 135 140
Ьеи Не А1а Рго А1а Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1
145 150 155 160
Уа1 Уа1 Ьуз Агд Азр С1и Не А1а Меб Уа1 ТЬг С1п А1а А1а С1и С1п
165 170 175
Агд Уа1 Агд Ьуз С1и С1и С1у ТЬг Агд А1а Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и
180 185 190
Ьеи С1у Ьеи Азр Не Туг С1у Ьеи Агд С1п Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи С1у
195 200 205
Ьеи Ьуз Зег
210 <210> 109 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 109
абдаабасас сддбддбадб аадасаадбд дадсадссас садсддабдс ааббдссдса 60
ббааадаадб дбддадбдас аассдбссаб даддсбсадд дасдбддбдд ссбссббдсд 120
бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дссабсдсад дабссдсбаб сасбдбдбсб 180
- 274 019971
ССдссСссСд дсдасаассС саСдаСссас дССдсддСдд аддСсСдсдд Сссдддааас 240
аСссСддСад СССсассдас дСсдссССдС асддасддсС асССсддСда дССдССддса 300
асаСсСсСсс дСдсссасдд адСдаССддд сССдСдаСсд аСдссддаСд ссдСдаСдСд 360
сдсСсссСда садаааСдаа дССсссддСс Сддадссдсд ссаСсСдССс дсаадддаса 420
дСсааддсса сасССддаСс ддСдааСдСд сссаСсдСаС дсдсдддСдс аССддСсдад 480
дсСддСдаСд СсаСсдСсдс сдасдаСдаС ддсдССдСсд ССдСдаадсд адсдсСддсд 540
саададаСсд ссдсддсддс ддаасааадд дССсдсааад адааСдСаас ссдсдаасда 600
сСсдсасдСд дададсСсдд асССдаСаСС СасдасаСдс дссаааадаС сдсдсаасСд 660
ддссСдаааС аСсСсСда 678
<210> 110 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 110
МеС 1 Азп ТЬг Рго УаЬ 5 УаЬ УаЬ Агд СЬп Уа1 10 СЬи СЬп Рго Рго АЬа 15 Азр
АЬа Не АЬа АЬа Ьеи Ьуз Ьуз Суз СЬу Уа1 ТЬг ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
СЬп СЬу Агд СЬу СЬу Ьеи Ьеи АЬа Зег Туг МеС Агд Рго Не Туг Рго
35 40 45
СЬу АЬа АЬа Не АЬа СЬу Зег АЬа Не ТЬг УаЬ Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи МеС ЬЬе НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬу Рго СЬу Азп
65 70 75 80
Не Ьеи УаЬ УаЬ Зег Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу УаЬ Не СЬу Ьеи УаЬ
100 105 110
Не Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТЬг СЬи МеС Ьуз РЬе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа Не Суз Зег СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз АЬа ТЬг
130 135 140
Ьеи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Рго Не Уа1 Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ СЬи
145 150 155 160
- 275 019971
А1а С1у Азр Уа1 11е 165 Уа1 А1а Азр Азр Азр 170 С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 175 Ьуз
Агд А1а Ьеи А1а 180 (31п С1и 11е А1а А1а 185 А1а А1а С1и С1п Агд 190 Уа1 Агд
Ьуз С1и Азп 195 Уа1 ТНг Агд С1и Агд 200 Ьеи А1а Агд С1у С1и 205 Ьеи С1у Ьеи
Азр 11е Туг Азр Меб Агд С1п Ьуз 11е А1а С1п Ьеи <31у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 111 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 111
абдааададд сддбддбддб саддаабабб дадсдсссдс сддссдабдб дабсдсддсд 60
сбддаааадб ббддбдбббс аасддбасас даадсдсаад дссдссдсдд асббсбддсс 120
дсббабабда ддссдаббба бдддддсдсд дсса^Ъдссд ддссбдсддб дасбдбсбсд 180
Сбддсбссдд дбдасаабсб аабдаббсас дбддссдбдд аадбббдссд дбсаддбдас 240
аббсбсдбдд бсдсбссдас дбсдссдбдс асддабдддб аббббддсда дббдсбддсд 300
асббссббдс дсдсдсасдд ддбаааадда сбсдбдабсд аддсаддабд ссдсдабдбс 360
сдддсдсбба сддадабдаа абббсссдбд бддадссдсд сддбдадббс дсадддаасд 420
дбдааддсба дбббдддсбс ддбдаасдбд ддааббдбдб дсдсбдссдс ддсдабсдаа 480
дссддсдасд сдабсдббдс сдабдабдас ддсдббдбдд бддбдааасд сддсдасдсс 540
дссадбдббд бсдссдсдбс дсадсаасдс дбссдсаадд аададдсбдс дсдаддасдс 600
сбддсдсдсд дсдаасбддд ссбддасабб басддссбдс дсдссааддб сдсддадсбб 660
ддсббдаааб абббдбда 678
<210> 112 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 112
- 276 019971
Меб 1 Ьуз Сби Аба Уаб 5 Уаб Уаб Агд Азп 11е 10 Сби Агд Рго Рго Аба 15 Азр
Уаб 11е Аба Аба Ьеи Сби Ьуз РЬе Сбу Уаб Зег ТЬг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Агд Сбу Ьеи Ьеи Аба Аба Туг Меб Агд Рго 11е Туг Сбу
35 40 45
Сбу Аба Аба ббе Аба Сбу Рго Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Ьеи Аба Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Агд Зег Сбу Азр
65 70 75 80
11е Ьеи Уаб Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи Аба ТЬг Зег Ьеи Агд Аба Нбз Сбу Уаб Ьуз Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
11е Сби Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Аба Ьеи ТЬг Сби Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Аба Зег
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Сбу 11е Уаб Суз Аба Аба Аба Аба ббе Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Аба ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Сбу Азр Аба Аба Зег Уаб Уаб Аба Аба Зег Сбп Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Сби Аба Аба Агд Сбу Агд Ьеи Аба Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Сбу Ьеи Агд Аба Ьуз Уаб Аба Сби Ьеи Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 113 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 113
абдааадддд сддбддбддЬ саддаабабс дадсдсссдс сддссдаддб ддбсдсддсд 60
сбддаааадб ЬбддбдШс дасддбдсас даадсдсаад дасдссдсдд асббсбддсс 120
дсббабабда ддссдаббба бдддддсдсд дссаЕЕдссд ддссбдсддб дасбдбсбсд 180
ббддсбссдд дсдасааббб аабдаббсас дбддсддбдд аадбббдссд дбсаддсдас 240
аббсбсдбдд бсдсбссдас дбсдссдбдс асддабдддб аббббддсда дбЬдсбддсд 300
- 277 019971
асббссббдс дсдсдсасдд ддбаааадда сбддбдабсд аддсаддабд ссдсда^дСс 360
сдддсдсбба сддадабдаа абббсссдбд бддадссдсд сддбдадббс дсадддаасд 420
дбдааддсба сбббдддсбс ддбдаасдбд даааббдбдб дсдсбдссдс ддсда£сдаа 480
дссддбдасд бдабсдббдс сдабдабдас ддсдббдбдд бддбдааасд дддсдасдсс 540
дссдсбдбдд бсдссдсдбс дсадсаасдс дбссдсааад аадаадсбас дсдадаасдс 600
сбддсдсдсд дсдаасбддд ссбддасабб басддссбдс дсдссааддб сдсддадс^Ъ 660
ддсббдаааб абббдбда 678 <210> 114 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 114 УаЬ Агд Азп Не 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 С1и
Меб 1 Ьуз С1у А1а Уа1 5 Уа1
Уа1 Уа1 А1а А1а Ьеи СЬи Ьуз РЬе С1у УаЬ Зег ТЬг Уа1 НЬз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Агд СЬу Ьеи Ьеи А1а А1а Туг Меб Агд Рго Не Туг С1у
35 40 45
СЬу А1а А1а Не А1а СЬу Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи А1а Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Н1з Уа1 А1а УаЬ С1и Уа1 Суз Агд Зег СЬу Азр
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а НЬз С1у УаЬ Ьуз С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не СЬи А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 С1и Не Уа1 Суз А1а А1а А1а А1а 11е СЬи
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 УаЬ Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд СЬу Азр А1а А1а А1а Уа1 Уа1 А1а А1а Зег С1п С1п Агд Уа1 Агд
- 278 019971
180 185 190
Ьуз <31и С1и 195 А1а ТЬг Агд С1и Агд 200 Ьеи А1а Агд С1у С1и 205 Ьеи <31 у Ьеи
Азр 11е 210 Туг С1у Ьеи Агд А1а 215 Ьуз Уа1 А1а С1и Ьеи 220 С1у Ьеи Ьуз Туг
Ьеи
225 <210> 115 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 115
абдбсддббд бсдббсадаа сабсдадсдб дсбдабсадб сддбсабсда ссддсбддсс 60
дссбдсддсд ббдссасддб дсабдаадсд садддссдса адддссбдсб сдссадсбаб 120
абдсддссда бсбббссддд бдсасдссбс дсддсдадбд ссдбсасбаб сбссдсассб 180
ссдддсдаса асбддабдсб дсабдбддсд абсдаасадб бдааддссдд сдасаббсбд 240
сбдсбсдссс сдассадссс сбдсдаддас ддсбабббсд дбдабсбссб сдссасдбсб 300
дсдсаддсдс дсддббдсда дддаббдабс абсдабдсдд дбдббсддда бдбддсбдаб 360
сбдасддада бдааабббсс бдбсбддбсд ааддсдабсб бсдсссаддд сасадбсаад 420
дадасссбсд дббсбдбдаа сдбассддбс дбабдсдсбд дсдссбабдб бсдсссдддб 480
дабдбдабсд ббдссдабда бдабддсдбб бдбдббдбдс бдсдсдадда адсбдаадбд 540
дбсдсааада аддсддаадс ссдбдббдсд дссдаадабд дбааасдсаа дсддсбсдсд 600
дссддсдаас бсддссбсда бабсбасдас абдсдсддсс ддсбддсбда ааадддссбд 660
аадбабабсб да 672
<210> 116 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) .. . (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 116 Азп 11е С1и Агд 10 А1а Азр С1п Зег Уа1 15 11е
Меб 1 Зег Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п
Азр Агд Ьеи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Н13 С1и А1а С1п С1у
20 25 30
- 279 019971
Агд Ьуз С1у 35 Ьеи Ьеи А1а Зег Туг 40 Меб Агд Рго Не РЬе 45 Рго С1у А1а
Агд Ьеи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Ьеи Н1з Уа1 А1а Не С1и С1п Ьеи Ьуз А1а С1у Азр Не Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег А1а С1п А1а Агд С1у Суз С1и С1у Ьеи Не Не Азр
100 105 но
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТЬг С1и МеЬ Ьуз РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а 11е РЬе А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Туг Уа1 Агд Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Ьеи Агд С1и
165 170 175
С1и А1а С1и Уа1 Уа1 А1а Ьуз Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 А1а А1а С1и
180 185 190
Азр С1у Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Азр Меб Агд С1у Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Не
210 215 220 <210> 117 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 117
аЬдддбдЬсд Ьсдбссадаа саИдассдс дссдадсаад ссдбсабсда ссддсбсдсс 60
дссбдсддсд Ьсдсдассдб дсабдаддсд саддддсдса аддддсбдсЬ ддсдадсбаЬ 120
абдсддссда ЬсЬабсссдд сдсдсддабс дсддсдадбд сддбдасдаЬ сбсддсдссд 180
ссЬддЬдаса асЬддабддЬ дсабдЬддсд абсдадсадд СдааддаЬдд сдасабссЬд 240
сЬдсбддсас сдассадссс сбдсдаддас ддсбаЬИсд дсдабсПП ддсдассбсд 300
дссИддсдс ддддсбдссд сдддсЬддбс аСсдабдссд дсдбдсдсда сдЬсдсбдас 360
сПдсддсда ЬдаадПЬсс ддЬсбддЬсд ааадсдаЬсб Ьсдсссаддд сасддбсаад 420
дааасдсбдд дПсддбдаа ЬдЬдссддбс дЬсбдсдссд дсдсдсЬддб саассссддс 480
дасдбдаЬсд Ьсдссдасда ЬдасддсдП ЬдЬдЬсдПс дссдсдаада ддсддсддад 540
- 280 019971
дббдсадаса аддсбдаддс ссасдбсдсд дсададдадд дсаадсдсаа дсддсбддсд 600
дссддсдадс ббддбсбсда сабсбасдас аЪдсдсаадс ддсЪсдссда дааадддсбд 660
аааЪа^дЪсЪ да 672
<210> 118 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 118 Уа1 5 С1п Азп Не Азр Агд 10 Аба Сби Сбп Аба Уаб 15 11е
Меб 1 Сбу Уаб Уа1
Азр Агд Ьеи Аба А1а Суз Сбу Уаб Аба ТНг Уаб Нбз Сби Аба Сбп Сбу
20 25 30
Агд Ьуз Сбу Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг Рго С1у А1а
35 40 45
Агд 11е Аба Аба Зег Аба Уа1 ТНг Не Зег Аба Рго Рго Сбу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уаб Нбз Уаб Аба 11е Сби Сбп Уаб Ьуз Азр Сбу Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Аба Рго ТНг Зег Рго Суз Сби Азр Сбу Туг РНе Сбу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи Аба ТНг Зег А1а Ьеи А1а Агд Сбу Суз Агд Сбу Ьеи Уаб Не Азр
100 105 110
Аба Сбу Уаб Агд Азр Уаб А1а Азр Ьеи Аба Аба Меб Ьуз РНе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Ьуз Аба Не РНе А1а Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Сби ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уаб Рго Уаб Уа1 Суз Аба Сбу Аба Ьеи Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр Уа1 11е Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уа1 Уаб Агд Агд Сби
165 170 175
Сби А1а Аба Сби Уа1 А1а Азр Ьуз А1а Сби А1а Нбз Уаб Аба А1а Сби
180 185 190
Сби С1у Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Аба Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Азр Меб Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Сби Ьуз Сбу Ьеи Ьуз Туг Уаб
210 215 220
- 281 019971 <210> 119 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 119 аСдддСаССд ССдССсадаа саСсаадсдд дсддассссд ддаСсаСадс аддСсССддс60 аааСдсддсд ССдссасСдС дсаСдаадсд саддддСдса аддддсЬссС ддсддссСаС120 аСдсддссса СССаССсСдд сдсдсдссСС дссдссСссд сСдСсассаС ССссдсдссд180 ссдддадаса асСддаСддС дсаСдСсдсс аССдадсадд Сдаддсаадд СдаСаССсСд240 дССсССдссс саасаСсдсс сСдСдаадас ддсСаСССсд дСдаСССдсС сдссассСсс300 аСдсСдсадс дсддсддсад ддддсСдаСС аССдасдссд дСдСссдсда СаСссдСдаС360 сСдасСсааа СдаааСССсс ддСдСддСсд аааассдССС ССдсдсаддд сассдССаад420 дааасссССд дсСсСдСдаа сдСсссдаСа дСССдсдссд дСдаадСддС сааСссСддс480 дасаСсаСда ССдссдаСда СдаСддСдСд СдсдСддСсс ддсдсдасда сдсСдааадс540 дСдсССдааа аадсаССддс дсдСдаддса ааддаадаад аСасасдсаа асдссССдсд600 дсаддсдадс СдддСсССда СаСССасддс аСдсдсдсас дСсСддссда ааадддссСа 660 аааСаСдСсС да672 <210> 120 <211> 223.
<212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 120 Не Ьуз Агд 10 АЬа Азр Рго С1у 11е 15 11е
МеС 1 С1у 11е Уа1 УаЬ 5 СЬп Азп
А1а СЬу Ьеи С1у Ьуз Суз СЬу УаЬ А1а ТНг УаЬ НЬз С1и А1а СЬп СЬу
20 25 30
Суз Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а АЬа Туг МеС Агд Рго 11е Туг Зег СЬу А1а
35 40 45
Агд Ьеи АЬа А1а Зег АЬа Уа1 ТНг 11е Зег А1а Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр МеС УаЬ НЬз УаЬ А1а 11е СЬи СЬп УаЬ Агд СЬп СЬу Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
- 282 019971
Уаб Леи Аба Рго ТЬг 85 Зег Рго Суз Сби Азр 90 Сбу Туг РЬе Сбу Азр 95 Леи
Леи Аба ТЬг Зег Мер Деи Сбп Агд Сбу Сбу Агд Сбу Деи ббе ббе Азр
100 105 110
Аба Сбу Уаб Агд Азр ббе Агд Азр Деи ТЬг Сбп МеР Ьуз РЬе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Дуз ТЬг Уаб РЬе Аба Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Сби ТЬг Деи Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Рго ббе Уаб Суз Аба Сбу Сби Уаб Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр ббе Мер ббе Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уаб Уаб Агд Агд Азр
165 170 175
Азр Аба Оби Зег Уаб Деи Сби Ьуз Аба Леи Аба Агд Сби Аба Ьуз Сби
180 185 190
Сби Азр ТЬг Агд Ьуз Агд Деи Аба Аба Сбу Сби Деи Сбу Леи Азр ббе
195 200 205
Туг Сбу Мер Агд Аба Агд Деи Аба Сби Дуз Сбу Леи Ьуз Туг Уаб
210 215 220
<210> 121 <211> 696 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 121
аРдаадсдсд дРдРсдРсдР сасссаРаРс дадсдсдсса асссдсдрда сдрддссдрд 60
сРРсадсадд сдддсдсРдс дассдРРсаР даадсдсада дссдРсРддд ссРдсРсдсд 120
РсдРасаРдс ддсссаРсРа Рдсдддсдсд РсааРсдсдд даРсддсддР дасддРдсРс 180
дрдссдссдр сддасаасРд даРдРРдсас дррдссдссд аасадРдссд сдааддсдас 240
дРдсРсдРдд Рсдсдссдас РРсдссдРдс даадасддсР асРРсддсда асРдсРсдсд 300
асдРсдсРРд ссдсдсдсдд РдРдсдсддд сРсаРсаРсд аРдсдддсРд РсдсдаРдРд 360
сдсдсдсРса аддасаРдаа сРРсссддРс РддРсдааад сддРсРсРдс дсааддсасд 420
дрдааддада сдсРдддсРс ддРсааРдРд ссРдРРдРдР дсдсасадса даРсдРдсаР 480
дсдддсдасд РдаРсдРсдс сдасдаРдас ддсдРсдРдд РсдРдссдРР сдссасддрд 540
РсдсдсдРдд ссдаадсадс дсаддсдсдр сРсдсдаадд аададаадас дсдРРссдРд 600
сРсдсдасдд дсдрдсрддд ссРсдасРас РасадсаРдс дрдасаадср сдсддаааад 660
ддссРдсдРР асдРсдддРс даРсдаддаа дсдРда 696
<210> 122 <211> 231
- 283 019971 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22),..(174) <223> Диметилменахинонметилтран :фераза
<400> 122
Мер 1 Ьуз Агд С1у Уа1 5 Уа1 Уа1 ТЬг
Азр Уа1 А1а Уа1 20 Ьеи С1п С1п А1а
С1п Зег Агд 35 Ьеи С1у Ьеи Ьеи А1а 40
С1у А1а 50 Зег Не А1а С1у Зег 55 А1а
Азр 65 Азп Тгр Меб Ьеи Н13 70 Уа1 А1а
Уа1 Ьеи \7а1 \7а1 А1а 85 Рго ТЬг Зег
С1и Ьеи Ьеи А1а 100 ТЬг Зег Ьеи А1а
Не Азр А1а 115 С1у Суз Агд Азр \7а1 120
Рго Уа1 130 Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 135 Зег
Ьеи 145 С1у Зег Уа1 Азп Уа1 150 Рго Уа1
А1а С1у Азр Уа1 Не 165 Уа1 А1а Азр
РЬе А1а ТЬг Уа1 180 Зег Агд Уа1 А1а
Ьуз С1и С1и 195 Ьуз ТЬг Агд Зег Уа1 200
Азр Туг 210 Туг Зег Мер Агд Азр 215 Ьуз
Уа1 225 С1у Зег Не С1и С1и 230 А1а
<210> 123 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
Нтз Не 10 С1и Агд А1а Азп Рго 15 Агд
С1у 25 А1а А1а ТЬг Уа1 Нтз 30 С1и А1а
Зег Туг Меб Агд Рго 45 Не Туг А1а
7а1 ТЬг Уа1 Ьеи 60 Уа1 Рго Рго Зег
А1а С1и С1п 75 Суз Агд С1и С1у Азр 80
Рго Суз 90 С1и Азр С1у Туг РЬе 95 С1у
А1а 105 Агд С1у Уа1 Агд С1у но Ьеи Не
Агд А1а Ьеи Ьуз Азр 125 Мер Азп РИе
А1а С1п С1у ТЬг 140 Уа1 Ьуз С1и ТНг
Уа1 Суз А1а 155 С1п С1п Не Уа1 Нтз 160
Азр Азр 170 С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 175 Рго
С1и 185 А1а А1а С1п А1а Агд 190 Ьеи А1а
Ьеи А1а ТЬг С1у Уа1 205 Ьеи С1у Ьеи
Ьеи А1а С1и Ьуз 220 С1у Ьеи Агд Туг
- 284 019971
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 123
аЕдаасааас ссдЕддЕадЕ дсддсаасЕд дадсадссас ссдссдаЕдс ддЕЕдсддсс 60
сЕддадаадЕ аЕддсдЕдас ЕассдЕссас даддсЕсадд дасдЕЕдЕдд ссЕдсЕддсЕ 120
ссЕЕаЕаЕдс дассдаЕЕЕЕ Едсдддадсс ЕдсаЕсдссд дЕЕссдссдЕ сассдЕдЕсЕ 180
ЕЕдссдсссд дсдаЕаасЕЕ саЕдаЕссас дЕЕдссдЕсд аддЕсЕдсад Ессдддсадс 240
аЕЕсЕсдЬад Есдсссссас сЕсассЕЕдс асддасддЕЕ аЕЕЕсддсда асЕсЕЕддса 300
асЕЕсссЕсс дсдсЕсасдд ЕдЕсааадда сЕддЕсаЕЕд аЕдссддсЕд ссдддаЕдЕЕ 360
сдсЕсдЕЕаа сддаааЕдаа аЕЕссссдЕЕ ЕддадссдЕд сддЕдадЕЕс дсааддаасд 420
дЕдааддсЕа сдсЕсддаЕс ЕдЕдааЕдЕд ссддЕсаЕЕЕ дсдсдддсдс сдаддЕддаа 480
дссддЕдасд ЕсаЕсаЕсдс сдаЕдасдаЕ ддЕдЕддЕад ЕддЕдаадсд ЕдсдасЕдсс 540
сасдаддЕад садсддсддс ддаасаасда дЕЕсдсаадд адааЕдссас Есдсдаасда 600
сЕддсасдад дадаасЕсдд ссЕсдасаЕс ЕасдасаЕдс ддсааааааЕ сдсдсаасЕЕ 660
ддЕсЕсаааЕ аЕсЕдЕда 678
<210> 124 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 124 Уа1 Уа1 Агд
МеЕ 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5
А1а Уа1 А1а А1а 20 Ьей С1и Ьуз Туг
С1п С1у Агд 35 Суз С1у Ьей Ьей А1а 40
С1у А1а 50 Суз 11е А1а С1у Зег 55 А1а
Азр 65 Азп РЬе МеЕ 11е Нтз 70 Уа1 А1а
11е Леи Уа1 Уа1 А1а 85 Рго ТЬг Зег
С1и Леи Ьей А1а 100 ТЬг Зег Ьей Агд
11е Азр А1а 115 С1у Суз Агд Азр Уа1 120
С1п Ьей 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
С1у 25 Уа1 ТЬг ТЬг Уа1 Н13 30 С1и А1а
Рго Туг МеЕ Агд Рго 45 11е РЬе А1а
Уа1 ТЬг Уа1 Зег 60 Ьей Рго Рго С1у
Уа1 С1и Уа1 75 Суз Зег Рго С1у Зег 80
Рго Суз 90 ТЬг Азр С1у Туг РЬе 95 С1у
А1а 105 Н13 С1у Уа1 Ьуз С1у 110 Ьей Уа1
Агд Зег Ьей ТЬг С1и 125 МеЕ Ьуз РЬе
- 285 019971
Рго Уа1 130 Тгр Зег Агд АЬа УаЬ 135 Зег Зег СЬп СЬу ТНг 140 УаЬ Ьуз А1а ТНг
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп УаЬ Рго УаЬ 1Ье Суз А1а СЬу АЬа СЬи Уа1 СЬи
145 150 155 160
АЬа С1у Азр УаЬ 1Ье 11е А1а Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Ьуз
165 170 175
Агд АЬа ТЬг А1а НЬз СЬи УаЬ АЬа АЬа АЬа А1а СЬи СЬп Агд УаЬ Агд
180 18 5 190
Ьуз СЬи Азп АЬа ТНг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Меб Агд СЬп Ьуз 1Ье АЬа СЬп Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 125 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 125 абдаасдабс ссдбсдбсдб ссдададабс дададдссдб сддсдасдбс дабсдасдаб 60
сбдсддсдбб бсддсдбсбс дасддбдсас даадсдсадд ддсдссдсдд дсбдсбсдса 120
бсдбасабдс ддссдабсба бдссддсдсд сбддбсдссд ддссбдсдаб бассдбссбд 180
дбдасдссдд дсдасаассб дабдабссаб дбсдсддбсд адабсбдсса дссаддсдаб 240
дбссбсдбсд бсдссссдас дбсдссдбдс ассдасддаб асббсддсда дсбдсбддсд 300
асдбсдббдс дадсдсабдд сдбсдсдддб сбдабсабсд абдссддсбд ссдддабдбб 360
сдсбсдббда дсдадабдсд абббсссдбд бддадссдсд сдабсадсдс ссаддддасс 420
дбсааддсда сдсбдддббс ддбдаасдбд ссдсбддбдб дсдссддадс дсбддбсдад 480
ссдддсдабд сдабсдбсдс сдасдасдас ддбдбсдбсд бсдбсаддсд ддаасаддбс 540
дасасбдбдб дссаддсддс дддасадсдс дбдсдсаадд аададдасас дсдсдсдсдд 600
сбддсдсаад дсдадсббдд ссбсдасабс басддсббдс дсааааадсб дбсддассбс 660
дддббдаадб сдбсдбда 678
<210> 126 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 286 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 126 Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд СЬи Не 10 С1и Агд Рго Зег А1а 15 ТЬг
Меб 1 Азп Азр Рго
Зег Не Азр Азр Ьеи Агд Агд РЬе СЬу УаЬ Зег ТЬг Уа1 НЬз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Мер Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а Ьеи Уа1 А1а С1у Рго А1а Не ТЬг Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Мер Не НЬз УаЬ АЬа Уа1 СЬи Не Суз СЬп Рго СЬу Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 УаЬ А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд А1а НЬз С1у Уа1 А1а С1у Ьеи Не
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи Зег СЬи Мер Агд РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд АЬа Не Зег АЬа С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи СЬу Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Ьеи УаЬ Суз АЬа С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
Рго СЬу Азр А1а Не УаЬ А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 УаЬ УаЬ Уа1 Агд
165 170 175
Агд С1и С1п Уа1 Азр ТЬг Уа1 Суз С1п А1а А1а С1у С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз СЬи С1и Азр ТНг Агд АЬа Агд Ьеи АЬа С1п С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Зег
225 <210> 127 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 127 аРдаасдаРс сддРсдРсдР РсдсдадаРс дасаддссдд сдддрассдс саРсдасдаР 60
- 287 019971
сбссддсдсб ЬсддсдбдЬс дассдбссас даадсдсадд ддсдббдсдд сЬЬдсЬсдсб 120
ЬсдЬасабас ддссдаЬЬЬа Сбсаддсдсс сбдсбсдссд дсссддсдаб сассдбссад 180
дЬЬасдссбд дсдасаассб дабдабссас дЬсдсбдбсд аадбдЬдссд дссаддадас 240
дбдсбсдЬсд бсдссссдас дбсдссдбдс асддабддсб аЬЬЬсддсда дсбдсбсдсд 300
асабсдсбдс дбдсссасдд сдЬсдбсддд сЬдаЬсабсд асдссддббд ссдддасдЬЬ 360
сдсдссббда дсдадабдсд аЬЬЬссбдЬд ЬддадЬсдсд сдабсадсдс дсадддсасс 420
дбсааадсса сдсбдддсбс ддбдаасдбд ссдсЬдббдб дбдссдддаЬ дсбддбсдад 480
дссддсдасд сдабсдбддс сдасдасдас ддадбддбдд Ьддбсаддсд дадссаддбс 540
даЬдсбдбсс дсдаддсддс сдаасдасдс дбдсдсаадд аададдасас дсдддсссдд 600
сбсдсссдад дсдадсббдд ссбсдасабс Ьасддссбдс дсаддааасб дбсадасссс 660
ддЬЬЬдаадб сдбсдбда 678
<210> 128 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 128
Мер Азп Азр Рго Уа1 Уа1 Уа1 Агд С1и 11е Азр Агд Рго А1а С1у ТЬг
1 5 10 15
А1а 11е Азр Азр Ьеи Агд Агд РЬе С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Не Агд Рго Не Туг Зег
35 40 45
С1у А1а Ьеи Ьеи А1а С1у Рго А1а 11е ТЬг Уа1 С1п Уа1 ТЬг Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а НТЗ С1у Уа1 Уа1 С1у Ьеи Не
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи Зег С1и Меб Агд РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Бег Агд А1а Не Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
- 288 019971
Ьеи 145 СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ 150 Рго Ьеи Ьеи Суз АЬа 155 СЬу МеС Ьеи УаЬ СЬи 160
А1а СЬу Азр АЬа Ые 165 УаЬ АЬа Азр Азр Азр 170 С1у УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ 175 Агд
Агд Зег СЬп УаЬ 180 Азр АЬа УаЬ Агд СЬи 185 АЬа А1а СЬи Агд Агд 190 УаЬ Агд
Ьуз СЬи СЬи 195 Азр ТЬг Агд АЬа Агд 200 Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи 205 Ьеи СЬу Ьеи
Азр Ые Туг СЬу Ьеи Агд Агд Ьуз Ьеи Зег Азр Рго СЬу Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Зег
225 <210> 129 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 129
аСдаасааас сддСддСддС ссддааддЬс даасадссдс сасаадаСдс ддСддсддсС 60
сСддадаааС аСддсдСсСс сасддСдсас даадсдсаад дссдССдсдд дсСдсСсдсс 120
дсССасаСдс дсссдаСсСа СдссддадсС СссаСддссд дасссдссдС дассдСССсс 180
сССссдсссд дСдасаассС саСдаСссас дСсдсддСсд аадСдСдсса ссссддааас 240
аССсСддСсд Ссдсссссас ССсассССдС ассдасдддС аСССсддсда дССдсСддсС 300
асССссССдс дсдсссасдд сдСдааддса сСсаСааСсд аСдссддаСд ссдСдасдСд 360
сдсСсссСса ссдаааСдаа дСССсссдСд Сддадссдсд ссдСсадССс дсадддааса 420
дСдаадСсса сдсСсддаСс адСдаасдСд ддсдСадСдС дСдсдддсдс СССсаСсдаа 480
дсдддсдаса СсдСсдСсдс СдаСдаСдас ддадСсдСсд СсдСдаадад ддсСССсдсд 540
сдсдасдСдд ССдаадссСд Сдаасададд дСссдсаадд аадаадсдас дсдддсасдс 600
сСддсдсадд дсдадсССдд СсСддасаСс СасддаССдс дсдссааадС ддсддадсСс 660
ддСсСсаадС асаСаСаа 678
<210> 130 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220> .
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174)
- 289 019971 <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 130
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд Ьуз Уа1 10 С1и С1п Рго Рго С1п 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг <31 у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а А1а Туг Меб Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а Зег Меб А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не ΗΪ5 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Нтз Рго <31 у Азп
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Нтз С1у Уа1 Ьуз А1а Ьеи Не
100 105 но
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз Зег ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 С1у Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а РЬе Не С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Не Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 \7а1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а РЬе А1а Агд Азр Уа1 Уа1 С1и А1а Суз С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и А1а ТЬг Агд А1 а Агд Ьеи А1а С1п С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд А1а Ьуз Уа1 А1а С1и Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Не
225 <210> 131 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 131
абдадсабсд бсдбдсадаа сабсдадсда дсддассХдд аддсддббас дасдсббддс 60
даабдсддбд бддсдассдб дсасдаддса сааддссдса сдддссбсаб дсбссссбаб 120
абдсддссда бсбддссддд сдсасддабс дсаддсссдд сбдбдассдб сбсссбдссд 180
ссдддсдаса асбддабдаб ссабдбсдсд д£ддадсаа£ дссдддаддд сдасабссбд 240
- 290 019971
аРсдРддсдс сдассадссс садсдаддас ддсРаРРРсд дсдадсРРсР ддсдсдсрсд 300
сРсдРддсдс дсадсдРсаа дддсРРсдРд аРсдаддсРд дддрдсдсда рдрдсдсдас 360
сРРассдада РасдРРРссс ддрсрддрсд сдддсадРсР ссдсссаддд сасддрсаад 420
дааасдаРсд дсРсддРдаа сдРдссдаРс дРсРдсдсад дрдсрдсддр дааРссдддс 480
дасдрддрсд РддсРдасда РдасддсаРа РдРдРсдРдд сРсдсдасаа адсрддрдад 540
дрддссаадд срдсдсдадс дсдсдаддсд ааддаадсРд ааасдсдссд ссддсРдаРс 600
ааРддсдадс РсдддсРсда саРсРаРдда аРдсдддада адсРРдсддс даадддссРд 660
аааРаРдРсР да 672 <210> 132 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) . .. (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 132
Мер 1 Зег Не Уаб Уаб 5 Сбп Азп Не Сби Агд 10 Аба Азр Леи Сби Аба 15 Уаб
ТЬг ТЬг Леи Сбу Сби Суз Сбу Уаб Аба ТЬг Уаб Нбз Сби Аба Сбп Сбу
20 25 30
Агд ТЬг Сбу Деи Мер Леи Рго Туг Мер Агд Рго Не Тгр Рго Сбу Аба
35 40 45
Агд Не Аба Сбу Рго Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Леи Рго Рго Сбу Азр Азп
50 55 60
Тгр Мер Не Нбз Уаб Аба Уаб Сби Сбп Суз Агд Сби Сбу Азр Не Деи
65 70 75 80
Не Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Зег Сби Азр Сбу Туг РЬе Сбу Сби Леи
85 90 95
Леи А1а Агд Зег Леи Уаб Аба Агд Зег Уаб Луз Сбу РЬе Уаб Не Сби
100 105 110
А1а Сбу Уаб Агд Азр Уаб Агд Азр Деи ТЬг Сби Не Агд РЬе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Аба Сбп Сбу ТЬг Уаб Луз Сби ТЬг I бе Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Рго Не Уаб Суз Аба Сбу Аба Аба Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Авр Уаб Уаб Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу 11е Суз Уаб Уаб Аба Агд Азр
165 170 175
- 291 019971
Ьуз А1а Сбу Сби 180 Уаб Аба Ьуз Аба Аба 185 Агд Аба Агд Сби Аба 190 Ьуз Сби
Аба Сби ТЬг 195 Агд Агд Агд Ьеи 11е 200 Азп Сбу Сби Ьеи Сбу 205 Ьеи Азр ббе
Туг Сбу Меб Агд Сби Ьуз Ьеи Аба Аба Ьуз Сбу Ьеи Ьуз Туг Уаб
210 215 220 <210> 133 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 133
абдаасабсд бсдбссадаа сабсдадсдс дссдабссдд сддбдабсдс сддссбсдсс 60
дадбдсддсд бсдссасадб ссасдаадсд саддддсдса бсдддсбдаб дбсабсдаад 120
абдсддссда бсбасдссдд сдсссдсабс дсддссбсдд сддбдассдб дбсдсбдссд 180
ссддссдаса асбддабдаб ссабдбсдсс дбддадсада бсааадсддд сдасдбсабд 240
дбсдбддсдс сдассбсдсс сбсддасдсд ддсбаббббд дсдассбдсб сдссааббсд 300
сбдсаддссс ддддсбдсдс сддссбсдбд абсдабдссд дддбдсдсда сдбдсдбдас 360
сббассдааа бдсддббссс сдбсбддбсд асддсдабсб сддсдсаддд аассдбсаад 420
дааасдсббд дббсддбдаа сдбсссдабс дбсбдсдссд дбдсасабдб сдаасссддс 480
дасдбдабсд бсдссдасда сдасддсдбс бдсабсдбса адсдсассда сдсддсбдсд 540
дбдсбсдааа аддсдсдддс ссддсбсдсд аасдааассд асаадсдсда дааасбсдсд 600
аасддсасдс бдддссбсда бсбсбасаад абдсдсдадд сдсбддадаа даадддссбс 660
аддбабдссб да 672
<210> 134 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (193)...(196) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозббе 1ά = Р300001 <220>
- 292 019971 <221> САЙТ <222> (204)...(207) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозтбе ίά = Р300001
<400> 134 Уа1 5 С1п Азп 11е С1и Агд 10 А1а Азр Рго А1а Уа1 15 11е
Меб 1 Азп 11е \7а1
А1а С1у Ьеи А1а С1и Суз С1у Уа1 А1а ТИг Уа1 НЬз С1и А1а С1п <31у
20 25 30
Агд 11е С1у Ьеи Меб Зег Зег Ьуз Меб Агд Рго 11е Туг А1а С1у А1а
35 40 45
Агд 11е А1а А1а Зег А1а Уа1 ТИг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго А1а Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е Нтз \7а1 А1а Уа1 С1и <31п 11е Ьуз А1а С1у Азр \7а1 Меб
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Зег Азр А1а С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а Азп Зег Ьеи С1п А1а Агд С1у Суз А1а С1у Ьеи Уа1 11е Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи ТНг (31и Меб Агд РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег ТЬг А1а 11е Зег А1а С1п <31у ТИг Уа1 Ьуз С1и ТИг Ьеи <31у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е Уа1 Суз А1а <31 у А1а Нтз Уа1 <31и Рго С1у
145 150 155 160
Азр \7а1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у \7а1 Суз 11е Уа1 Ьуз Агд ТИг
165 170 175
Азр А1а А1а А1а Уа1 Ьеи С1и Ьуз А1а Агд А1а Агд Ьеи А1а Азп С1и
180 185 190
ТЬг Азр Ьуз Агд С1и Ьуз Ьеи А1а Азп С1у ТИг Ьеи С1у Ьеи Азр Ьеи
195 200 205
Туг Ьуз Меб Агд С1и А1а Ьеи С1и Ьуз Ьуз С1у Ьеи Агд Туг А1а
210 215 220
<210> 135 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 135
абдадсдбсд бсдбссадаа сабсдсдсдс дссда^саад сдабсдбсда бсддсбсдсд 60
дссбдсддбд ббдссасбдб дсабдаадсд садддссдса адддасбдсб сдсдадссаб 120
абдсддссда бсбабсссдд басссддсбс дсддсдадсд сбдбдассаб сбсддсдссд 180
ссдддсдаса асбддабддб ссасдбсдсд а£сдадсаа£ бдсдадсддд сдасабсабд 240
- 293 019971
дбдсбсдссс сдассадссс сбдсдаддаб ддббабббсд дсдабсбдсб бдссасабсд 300
дсдааадсас ддддсбдссд сддбсбсабс абсдабдссд дсдбссдсда бдбсдссдаб 360
сбсасддсда бдсадбббсс бдбсбддбсс ааддссабсб бсдсдсаадд сассдбсаад 420
дааасдсбсд дсбсддбдаа сабсссддбд дбдбдсдсдд дбдсдсбддб саабсссддс 480
дабдбсабсд бсдссдабда сдабддсдбс бдсдббдбдс дссдсдаада ддсддаддсд 540
дбддсдсада аддссдаадс ссдсдбсдсс дссдаддасд асаадсдсаа дсдссбсдсс 600
дссддсдаас бсддбсбсда сабсбасаад абдсдсдадс ддсбддссда дааддддсбс 660
ааабабдбсб да 672
<210> 136 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН .
<222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 136
МеЬ 1 Зег УаЬ УаЬ УаЬ 5 С1п Азп Не АЬа Агд 10 АЬа Азр СЬп АЬа Не 15 УаЬ
Азр Агд Ьеи АЬа АЬа Суз СЬу УаЬ АЬа ТНг УаЬ НЬз С1и АЬа СЬп С1у
20 25 30
Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а Зег НЬз Меб Агд Рго Не Туг Рго СЬу ТНг
35 40 45
Агд Ьеи АЬа АЬа Зег А1а УаЬ ТНг Не Зег АЬа Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб УаЬ НЬз УаЬ А1а 11е СЬи СЬп Ьеи Агд АЬа СЬу Азр Не Меб
65 70 75 80
Уа1 Ьеи АЬа Рго ТНг Зег Рго Суз СЬи Азр СЬу Туг РНе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи АЬа ТЬг Зег АЬа Ьуз АЬа Агд СЬу Суз Агд С1у Ьеи Не Не Азр
100 105 но
АЬа СЬу УаЬ Агд Азр Уа1 АЬа Азр Ьеи ТНг АЬа Меб СЬп РНе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Ьуз АЬа Не РНе АЬа СЬп СЬу ТНг УаЬ Ьуз СЬи ТНг Ьеи СЬу
130 135 140
Зег УаЬ Азп Не Рго Уа1 УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи Уа1 Азп Рго СЬу
145 150 155 160
Азр УаЬ Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ Суз Уа1 Уа1 Агд Агд СЬи
165 170 175
- 294 019971
Сби Аба Сби Аба 180 Уа1 А1а Сбп Ьуз Аба 185 С1и А1а Агд Уа1 Аба 190 А1а Сби
Азр Азр Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи Аба Аба Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг Ьуз Меб Агд Сби Агд Ьеи Аба Сби Ьуз Сбу Ьеи Ьуз Туг Уаб
210 215 220 <210> 137 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 137
абддсбдбсд бддбссадаа баббдсссдб дссдассадд сддбсаббда ссддсбддсс 60
дссбдбдабд бсдссасддб бсабдаддсд садддссдса адддссбдсб сдссддсбас 120
абдсддссда бббабсссдд бдсссддабб дсбдссадбд ссдбаасдаб сбсбдсдссд 180
сссддсдаса асбддабддб ссабдбддсд абсдаасадс бсааддсддд сдабабссбд 240
ббдсббдсдс сдасаадссс сбдсдаддас ддсбабббсд дсдабсббсб сдсдасдбсд 300
дссдббдсдс дсддсбдссд сдддсббабс абсдабдссд дсдбдсдбда сдббдссдаб 360
сбсасддааа бдаадбббсс ддбсбддбсс ааддсддбсб бсдсссаддд сасддбсаад 420
дадасдсбсд дсбсддбсаа бдбдассдбд дбсбдбдссд дбдсссбддб саабдссддс 480
дасдбдабсд бддссдасда сдабддсдбс бдсдбддбсс ддсдсдадда адсддсбдас 540
дбддсбдсса аадссдаддс дсдбдбсдсб дссдаддадд дсаадсдсаа дсддсбсдсд 600
дссддсдаас бсдддсбсда сабббасдас абдсдсдддс даббддсдда даадддасбд 660
адабабдбсб да 672
<210> 138 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (149)...(152) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозббе ίά = Р300001 <400> 138
Меб А1а Уа1 Уа1 Уа1 С1п Азп 11е А1а Агд Аба Азр Сбп Аба Уаб 1бе
- 295 019971
1 5 10 15
Азр Агд Ьеи А1а А1а Суз Азр Уа1 А1а ТЬг Уа1 ΗΪ5 С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи А1а С1у Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго С1у А1а
35 40 45
Агд 11е А1а А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уа1 Н13 Уа1 А1а 11е С1и С1п Ьеи Ьуз А1а С1у Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег А1а Уа1 А1а Агд С1у Суз Агд С1у Ьеи 11е 11е Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 РЬе А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 ТЬг Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азп А1а С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд С1и
165 170 175
С1и А1а А1а Азр Уа1 А1а А1а Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 А1а А1а С1и
180 185 190
С1и С1у Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг Азр Меб Агд С1у Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Агд Туг Уа1
210 215 220 <210> 139 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 139
абдааббабс адссддддас аасаддсабс дбсдбдсадд абаббдсдсд сдсбдабсаа 60
дссаббабсд абддссбадс адаабдбддб дбддсдасдд бдсабдаддс асаадддсдс 120
ааддддсбдб бддсддасба бабдасдссд аббббббсад дсдсдддсаб сдсбддабсб 180
дсддбдасса ббсбддсдсс ассббдбдас ааббддабда ббсабдбддс ддбадаасад 240
ббдсаааадд дсдабдбдбб дсбдсбдддс асдабсасас сдбссаабдс бддсбабббс 300
ддбдасббдс бддссасдбс адссабддсд сасддббдбс дсддаббдаб саббдабддс 360
ддбдбдсдсд абдбдсаада дсбдасддаб абдддсбббс сддбббддбс сааддссдба 420
- 296 019971
саСдсссаад дсасааСсаа адааасдсСд ддаСсддСса асдСдссадС СдСсСдсддс 480
саададССдд СаааСсссдд СдаСаССдСд дСддссдаСд аСдасддддС дСдсдССдСд 540
сдссдсдаад аадсСдсСда СдСдсСддсС ааддсдсддд сдсдсдадад СааСдаадсс 600
дссаадсдсд сдсдССССда ддасддСдад сСддддсСдд аСаСсСаСда саСдсдсдсд 660
сддсСддссд аааадддасС даааСасдСс Сда 693
<210> 140 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (27)...(179) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 140
МеС 1 Азп Туг СЬп Рго 5 СЬу ТНг ТНг СЬу 11е 10 УаЬ УаЬ С1п Азр 11е 15 А1а
Агд А1а Азр СЬп А1а 1Ье Не Азр СЬу Ьеи А1а С1и Суз СЬу Уа1 А1а
20 25 30
ТНг Уа1 НЬз СЬи А1а С1п СЬу Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а Азр Туг МеС
35 40 45
ТНг Рго 11е РНе Бег СЬу А1а СЬу 11е А1а С1у Бег А1а Уа1 ТНг 11е
50 55 60
Ьеи АЬа Рго Рго Суз Азр Азп Тгр МеС 11е НЬз Уа1 А1а УаЬ С1и С1п
65 70 75 80
Ьеи С1п Ьуз С1у Азр Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи С1у ТНг 11е ТНг Рго Зег Азп
85 90 95
АЬа С1у Туг РНе С1у Азр Ьеи Ьеи АЬа ТНг Бег А1а МеС АЬа НЬз С1у
100 105 110
Суз Агд СЬу Ьеи 11е 1Ье Азр СЬу С1у Уа1 Агд Азр Уа1 С1п СЬи Ьеи
115 120 125
ТНг Азр МеС С1у РНе Рго УаЬ Тгр Бег Ьуз АЬа Уа1 НЬз А1а С1п СЬу
130 135 140
ТНг 11е Ьуз СЬи ТНг Ьеи СЬу Бег Уа1 Азп УаЬ Рго УаЬ Уа1 Суз С1у
145 150 155 160
С1п СЬи Ьеи УаЬ Азп Рго С1у Азр 11е Уа1 УаЬ АЬа Азр Азр Азр С1у
165 170 175
Уа1 Суз УаЬ УаЬ Агд Агд СЬи СЬи А1а А1а Азр Уа1 Ьеи А1а Ьуз АЬа
180 185 190
Агд А1а Агд С1и Бег Азп СЬи А1а А1а Ьуз Агд А1а Агд РНе С1и Азр
195 200 205
- 297 019971
СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи Азр 1Ье Туг Азр МеС Агд АЬа Агд Ьеи АЬа СЬи 210 215 220
Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Туг УаЬ
225 230 <210> 141 <2Ы> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 141
абдадсдбсд бсдбссадаа сабсдаасдс дссдасссдд асбссдбсдс сдбдсбсддс 60
дсдадсддсд бсдссассдб дсасдаадсд сааддссдда сдддасбсаб дсддсссбаб 120
абдсддссда бсбаббсддд сдбдсдсабб дссддассда ссдбсасддб сбссабсссд 180
ссдддсдаса асбддабдаб бсабдбсдсд дбсдадсадб дссдсдаадд сдасаббсбс 240
дббдбддсбс сдассадссс дадсдабдас ддсбабббсд дсдассбдсб бдссдддбсд 300
сббабддсас даддсдбсаа ддсбсбсабс абсдаддссд дбдбдсдсда сдббсдсдаб 360
сбдассдааа бдсдсбсбсс ддбсбддбсд аадассаббб ссдсдсаддд аассдбсаад 420
дааасдсббд дсбссдбдаа бдбдссдабс дбсбдсдссд дбдсддсддб саабсссддс 480
дасдсддбсд бддссдабда сдасддсдба бдсдбсдбдс сдсдададсд адсддссдад 540
дбддссаадд сдбсдсаддс ссдсдаддса ааддаадссд ддасдсдссд дсддсбдабд 600
дссддбдаас бддддсбсда сабсбасддс аЬдсдсдада аасбсдсбдс саадддбббд 660
ааабабдбсб да 672
<210> 142 <2Ы> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 142
Меб 1 Зег УаЬ УаЬ УаЬ 5 СЬп Азп Не СЬи Агд 10 АЬа Азр Рго Азр Зег 15 УаЬ
А1а УаЬ Ьеи СЬу АЬа Зег СЬу УаЬ АЬа ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
Агд ТНг СЬу Ьеи Мер Агд Рго Туг Меб Агд Рго Не Туг Зег СЬу УаЬ
40 45
- 298 019971
Агд 11е 50 А1а С1у Рго ТЬг Уа1 55 ТЬг Уа1 Зег Не Рго 60 Рго С1у Азр Азп
Тгр Меб Не Н15 Уа1 А1а Уа1 С1и С1п Суз Агд С1и С1у Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр Азр С1у Туг РЬе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а С1у Зег Ьеи Меб А1а Агд С1у Уа1 Ьуз А1а Ьеи Не 11е С1и
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи ТЬг С1и Меб Агд РЬе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Ьуз ТЬг 11е Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз СЬи ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е Уа1 Суз А1а СЬу А1а А1а Уа1 Азп Рго СЬу
145 150 155 160
Азр А1а Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Αδρ СЬу Уа1 Суз Уа1 Уа1 Рго Агд С1и
165 170 175
Агд А1а А1а СЬи Уа1 А1а Ьуз А1а Зег С1п А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
А1а СЬу ТЬг Агд Агд Агд Ьеи Меб А1а СЬу С1и Ьеи С1у Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг С1у Меб Агд СЬи Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 143 <2Ы> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 143
абдадсдбсд бсдбссадаа сабсдаасдс дссдасссдд асбссдбсас сдбдсбсддс 60
дсдадсддсд бсдссассдб дсасдаадсд сааддссдда сдддасбсаб дсддсссбас 120
абдсддссда бсбаббсддд сдбдсдсабб дссддассдд ссдбсасддб сбссабсссд 180
ссдддсдаса асбддабдаб бсабдбсдсд д£сдадсад£ дссдсдаадд сдасаббсбс 240
дббдбддсбс сдассадссс дадсдабдаб ддсбабббсд дсдассбдсб бдссдддбсд 300
сббдбддсас даддсдбсаа ддсбсбсабс абсдаддссд дбдбдсдсда сдббсдсдаб 360
сбдассдааа бдсдсбббсс ддбсбддбсд аадассаббб ссдсдсаддд аассдбсаад 420
дааасдсббд дсбссдбдаа бдбдссдабс дбсбдсдссд дбдсддсддб саабсссддс 480
дасдсддбсд бддссдабда сдасддсдба бдсдбсдбдс сдсдададсд адсддсбдад 540
дбддссаадд сдбсдсаддс ссдсдаддса ааддаддссд ддасдсдссд дсддсбдабд 600
дссддбдаас бддддсбсда сабсбасддс абдсдсдада аас£сдс£дс саадддбббд 660
- 299 019971 аааРаРдРсР да 672 <210> 144 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20),..(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (1)...(21) <223> ТопВ-зависимые рецепторные белки, признак 1. РгозЬРе ίά = Р300430 <400> 144
Мер 1 Зег Уа1 νβΐ νβΐ 5 С1п Азп Не С1и Агд 10 А1а Азр Рго Азр Зег 15 \7а1
ТИг νβΐ Ьеи С1у А1а Зег С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Н13 С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТИг С1у Ьеи Мер Агд Рго Туг Мер Агд Рго Не Туг Зег С1у \7а1
35 40 45
Агд Не А1а С1у Рго А1а \7а1 ТНг Уа1 Зег Не Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Мер Не ΗΪ5 Уа1 А1а Уа1 С1и С1п Суз Агд С1и С1у Азр Не Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Зег Азр Азр С1у Туг РНе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а С1у Зег Ьеи Уа1 А1а Агд С1у Уа1 Ьуз А1а Ьеи Не Не С1и
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи ТНг С1и МеР Агд РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз ТНг Не Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр А1а Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Рго Агд С1и
165 170 175
Агд А1а А1а С1и Уа1 А1а Ьуз А1а Зег С1п А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
А1а С1у ТНг Агд Агд Агд Ьеи МеР А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг С1у Мер Агд С1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220
<210> 145
- 300 019971 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 145 абдассабсд бсдбсассдд сабсдадсдс дсдддадсдд асасбдбсдс сдсдсбдддс60 асаадсддсд бсдсдассдб асасдаддсд садддссдса ссддссбдаб дсдбсссбас120 абдсддссда бсбабасддд адсдсдсабс дссдддасдд сдаббассдб дбсдсбдссд180 сссддсдаса асбддабдаб ссасдбсдсс дбсдадсадб дссддсаадд сдабабссбс240 дбддбддсдс сдассадссс дадсдасдас ддсбабббсд дсдассбдсб сдссааббсб300 сбсдбсдссс дсддсдбдад дддсабддбс абсдаддссд дсдбдсдбда сдббсдсдаб360 сбсассдада бдсдсббссс ддбсбддбсд аадасдабсб сддсдсаддд аасддбсаад420 дадасдсбсд дсбсддбсаа сдбдссддбс дбсбдсдсбд дсббддссдб даасссдддс480 дасабсабсд бддссдасда сдасддсабс бдсдбддбдс сдсдссадас сдссдсдсад540 дбсдбсдадд сддсбсабдс дсдсдаддсд ааддаддсдд аддбссдбсд дсддсбсабс600 дссддсдаас бсддссбсда бабсбасддс абдсдбдада адсбддсддс саадддссбд 660 ааабабдбсб да672 <210> 146 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 146 Уаб 5 ТЬг Сбу 1бе Сби Агд 10 Аба Сбу Аба Азр ТЬг 15 Уаб
Меб 1 ТЬг Не Уаб
Аба Аба Ьеи Сбу ТЬг Бег Сбу Уаб Аба ТЬг Уаб Нбз Сби Аба С1п Сбу
20 25 30
Агд ТЬг Сбу Ьеи Меб Агд Рго Туг Меб Агд Рго 1бе Туг ТЬг С1у Аба
35 40 45
Агд ббе Аба Сбу ТЬг Аба I бе ТЬг Уаб Зег Ьеи Рго Рго Сбу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не Нбз Уаб Аба Уаб Сби Сбп Суз Агд Сбп Сбу Азр Не Ьеи
65 70 75 80
Уаб Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр Азр Сбу Туг РЬе Сбу Азр Ьеи
85 90 95
- 301 019971
Ьеи А1а Азп Зег 100 Ьеи \7а1 А1а Агд С1у 105 Уа1 Агд С1у МеС \7а1 НО Не С1и
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи ТЬг С1и Меб Агд РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз ТЬг Не Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго \7а1 Уа1 Суз А1а С1у Ьеи А1а Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр 11е Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Не Суз Уа1 Уа1 Рго Агд С1п
165 170 175
ТЬг А1а А1а С1п Уа1 Уа1 С1и А1а А1а Н1з А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
А1а С1и Уа1 Агд Агд Агд Ьеи Не А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг С1у МеЬ Агд С1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220
<210> 147 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 147 дбдадсддса ЬсдЬсдбсса даасабсдад сдсдссдасс ссдсдаЬсаб сасдддссбс60 дссдаабдсд дсдбсдссас ддСдсабдад дсдсадддсс дсаадддЬсб дсбсдсдЬсс120
ЬасаЬдсддс сдабсЬаЬдс сддсдссдсб дЬсддсдсаб сддсддбсас сабссбсдсс180 ссдсссбдсд асаасбддаЬ ддЬдсаЬдбд дсдабсдадс аддбдсдддс аддддасабс240 сбсдбссбсд сдассассбс дсссбссдас дссддсбабб ЬсддсдабсЬ дсбсдссасс300
Ьсдабдаадд сссдсддсдд ЬдЬсддссбс аЬсабсдабд ссддсдЬЬсд ЬдасаЬЬсдс360 дассбсасдд сддЕдсадП сссддЬдбдд Ьссааддссд ЬсЬдсдссса дддсассабс420 ааддааасдс ЬдддсбсддЬ даасдбдссд дЬддбсЬдбд ссддсдадсб ддбсаасссд480 ддсдабдбса Ссдбсдссда Ьдасдасддс дЬсЬдсдбсд Ьдсддсдсда ддаадсбдсс540 даЬдЬдсбда адааддсдса ддсссдсдбд дсдаасдаад дсдасаадсд Ьсадсдссбс600 дсддссддсд аасбсддссЬ сдасаЬдбас аадабдсдсд асаадсЪдаа ддааабдддс660 сЬсаааЬабд бсбда
675 <210> 148 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
- 302 019971 <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 148 С1п Азп Не С1и 10 Агд А1а Азр Рго А1а 15 Не
МеЕ 1 Зег С1у Не Уа1 5 Уа1
11е ТЬг С1у Ьей А1а С1и Суз С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 Н13 С1и А1а С1п
20 25 30
С1у Агд Луз С1у Ьей Ьей А1а Зег Туг МеЕ Агд Рго Не Туг А1а С1у
35 40 45
А1а А1а Уа1 С1у А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Ьей А1а Рго Рго Суз Азр
50 55 60
Азп Тгр МеЕ Уа1 Н1з Уа1 А1а Не С1и С1п Уа1 Агд А1а С1у Азр Не
65 70 75 80
Леи Уа1 Леи А1а ТЬг ТЬг Зег Рго Зег Азр А1а С1у Туг РЬе С1у Азр
85 90 95
Леи Леи А1а ТЬг Зег МеЕ Ьуз А1а Агд С1у С1у Уа1 С1у Ьей Не Не
100 105 110
Азр А1а С1у \7а1 Агд Азр Не Агд Азр Ьей ТЬг А1а νβΐ С1п РЬе Рго
115 120 125
Уа1 Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 Суз А1а С1п С1у ТЬг Не Ьуз С1и ТЬг Леи
130 135 140
С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у С1и Ьей Уа1 Азп Рго
145 150 155 160
С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд
165 170 175
С1и С1и А1а А1а Азр Уа1 Ьей Ьуз Ьуз А1а С1п А1а Агд Уа1 А1а Азп
180 185 190
С1и С1у Азр Ьуз Агд С1п Агд Ьей А1а А1а С1у С1и Ьей С1у Ьей Азр
195 200 205
МеЕ Туг Ьуз МеЕ Агд Азр Ьуз Ьей Ьуз С1и МеЕ С1у Ьей Ьуз Туг Уа1
210 215 220
<210> 149 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 149 аЕдааЕааас сддЕддЕадЕ ЕсдасаддЕс дадсадссаЕ садссдаЕдс ддЕЕдсддса 60 сЕадаааадЕ дЕддсдЕаас дасддЕдсаЕ ааддсЕсадд дасдсЕдсдд сЕЕдсЕЕдса 120
- 303 019971
дссРасаРдс дассдаРРРР сссаддадсР адсаРсдссд дРРсРдсддР сасрдрдрсс 180
сРдссдссдд дсдасаасср дабдаРРсас дрсдсддрсд аддрсрдсад сасаддааас 240
аРРсРддРдд РсдсРссдас сРсдссаРдс асддаРддРР асРРсддРда асРссРсдса 300
асдРсдРРдс дсдсдсасдд РдРаададдс сРРдРдаРсд аРдсРддаРд ссдрдасдрр 360
сдсРсРРРда сддааардаа аРРсссддРс Рддадссдсд ссаРсадсРс Рсаддддаса 420
дрдааадсса сасРсддаРс адрсаардрд ссдаРсасаР дсдсддддас асРсдРРдаа 480
РссддРдасд РсаРсдРсдс сдасдаРдаР ддрдрсдрад РсдРдаадсд Расддссдса 540
саадаадрсд ссдсадссдс Рдаасааадд дрдсдсааад адаабдсдас ссдрдаасда 600
срсдсасддд дсдаасрсдд РсРсдаРаРс РасдадаРдс дссадааааР сдсдсадсРс 660
ддссРсаадР аРсРдРда 678
<210> 150 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 150 Рго Уа1 5 Уа1 УаЬ Агд С1п Уа1 10 СЬи СЬп Рго Зег А1а 15 Азр
Мер 1 Азп Ьуз
АЬа УаЬ АЬа А1а Ьеи СЬи Ьуз Суз С1у Уа1 ТЬг ТЬг Уа1 НЬз Ьуз А1а
20 25 30
С1п СЬу Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а А1а Туг МеР Агд Рго Не РЬе Рго
35 40 45
С1у АЬа Зег Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг УаЬ Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Мер Не НЬз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Зег ТЬг СЬу Азп
65 70 75 80
Не Ьеи УаЬ Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе СЬу
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Н13 С1у УаЬ Агд С1у Ьеи УаЬ
100 105 НО
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТЬг С1и Мер Ьуз РЬе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа Не Зег Зег С1п С1у ТЬг УаЬ Ьуз АЬа ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не ТЬг Суз АЬа СЬу ТЬг Ьеи Уа1 СЬи
145 150 155 160
- 304 019971
Зег Сбу Азр Уаб 11е 165 Уаб Аба Азр Азр Азр 170 Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб 175 Ьуз
Агд ТЬг Аба Аба 180 Сбп Сби Уаб Аба Аба 185 Аба Аба Сби Сбп Агд 190 Уаб Агд
Луз Сби Азп 195 Аба ТЬг Агд Сби Агд 200 Леи Аба Агд Сбу Сби 205 Леи Сбу Леи
Азр ббе Туг Сби Мер Агд Сбп Ьуз ббе Аба Сбп Леи Сбу Леи Ьуз Туг
210 215 220
Леи
225 <210> 151 <211> 675 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 151
аРдадсддаа РРдРРдРсса дааРаРсдад сдсдссдасд сддсддРсаР сдсадссррд 60
дааадсРдсд дсдРсРсаас РдРдсасдад дсРсааддсс дРасРддасР дсРддсРРсР 120
РаРаРдсдРс сааРсРасас аддрдсасдд аРадсаддаа дрдсадрдас РаРсРссдса 180
ссРссРддсд аРаасРддаР ддРдсаРдРд дсРаРсдадс ааРРдсасдс аддсдасаРа 240
РРдаРааРсд сассаассРс дссдрдсдаа дасддсРаРР РсддсдасРР дсРадссасд 300
РсРдсдсадд сссдрдддрд саадддРсРд аРРаРсаасд ссддсдРРсд сдардрдсдс 360
даРРРдасРд аааРдддсРР РсссдРсРдд Рсдааддсса РРРРРдссса аддсасРаРс 420
ааадсаРсдс РдддРРсддР саасаРассс дРсдРдРдсд саддсдсдсс саРсааРссс 480
ддсдардрда ррдрддссда РдаРдасддс дрррдрдрсд Рдссдсдсса дааРдсддса 540
даддрсдсаа аддсддсдаа ддсасдрдад дсдаасдадд ссдсааадсд сдассадсРР 600
дсаассддса РсРРддддсР РдаРаРдРаР дасаРдсдсд даааРсРсдс сдадаРдддд 660
сРдаааРаРа РаРда 675
<210> 152 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 152
Мер Зег Сбу ббе Уаб Уаб Сбп Азп ббе Сби Агд Аба Азр Аба Аба Уаб
- 305 019971
1 5 10 15
11е Аба Аба Ьеи Сби Зег Суз Сбу Уа1 Зег ТНг Уаб Нбз Сби Аба Сбп
20 25 30
Сбу Агд ТНг Сбу Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг ТНг Сбу
35 40 45
Аба Агд 11е Аба Сбу Зег Аба Уаб ТНг 11е Зег Аба Рго Рго Сбу Азр
50 55 60
Азп Тгр Меб Уаб Нбз Уа1 Аба 11е Сби Сбп Ьеи Нбз Аба Сбу Азр 11е
65 70 75 80
Ьеи 11е 11е Аба Рго ТНг Зег Рго Суз С1и Азр Сбу Туг РНе Сбу Азр
85 90 95
Ьеи Ьеи Аба ТНг Зег А1а С1п Аба Агд Сбу Суз Ьуз Сбу Ьеи 11е Не
100 105 110
Азп Аба Сбу Уа1 Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи ТНг Сби Меб С1у РНе Рго
115 120 125
Уаб Тгр Зег Ьуз Аба 11е РНе А1а Сбп Сбу ТНг 11е Ьуз А1а Зег Ьеи
130 135 140
Сбу Зег Уаб Азп 11е Рго Уа1 Уа1 Суз Аба С1у Аба Рго 11е Азп Рго
145 150 155 160
Сбу Азр Уаб Не Уаб А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уаб Рго Агд
165 170 175
Сбп Азп Аба Аба С1и Уа1 А1а Ьуз А1а А1а Ьуз А1а Агд Сби Аба Азп
180 185 190
Сби Аба Аба Ьуз Агд Азр Сбп Ьеи А1а ТНг Сбу 11е Ьеи С1у Ьеи Азр
195 200 205
Меб Туг Азр Меб Агд С1у Азп Ьеи А1а С1и Меб С1у Ьеи Ьуз Туг Не
210 215 220 <210> 153 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 153
абдбссдбсд бсдбссадаа сабсдсдсдс дссдассадб ссдбсабсда бсддсбсддс 60
дссбдсддсд бсдссасбдб дсабдаадсд садддссдса сдддасбдсб адссадсбас 120
абдсдсссса бсбабсдддд бдсдсдбсбд дссдсдадсд сддбдассаб сбсддссссд 180
сссддсдаса аббддабдсб ссабдбсдсс абсдадсадс бдаддсссдд сдасабсабд 240
дбдсббдссс ссассадссс сбдсдаддаб ддсбабббсд дсдассбдсб бдсдасабсд 300
дсссбддсдс дсддсбдссд бддбсбсдбс абсдаддсдд дсдббсдсда бдбсдссдас 360
сбсассдсда бдаадбббсс сдбсбддбсс ааадссабсб бсдсссаддд сассдбсаад 420
- 306 019971
ддаасдсбдд дббсддбдаа сдбдсссдбс дбсбдбдссд дсдсдсбдаб саабсссддб 480
дасдбсаббд бддссдабда сдабддсдбс бдсдбддбдс дссдсдадда адссдаадсд 540
дбддсдсааа аддссдаддс дсдсдбсдсс дссдаададд абаадсдсаа дсдссбсдсс 600
дссддсдаас бсдддсбсда бабсбасаад абдсдсдадс ддсбсдссда ааадддасбс 660
ааабабдбсб ад 672
<210> 154 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 154
Меб 1 Зег Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п Азп Не А1а Агд 10 А1а Азр С1п Зег Уа1 15 Не
Азр Агд Ьеи С1у А1а Суз О1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТЬг С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг Агд С1у А1а
35 40 45
Агд Ьеи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Ьеи Нтз Уа1 А1а Не С1и С1п Ьеи Агд Рго С1у Азр 11е Меб
65 70 75 80
Уа1 Ьеи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег А1а Ьеи А1а Агд С1у Суз Агд С1у Ьеи Уа1 11е С1и
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТЬг А1а Меб Ьуз РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Не РЬе А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1у ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1 а Ьеи 11е Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд С1и
165 170 175
С1и А1а С1и А1а Уа1 А1а С1п Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 А1а А1а С1и
180 185 190
С1и Азр Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
- 307 019971
Туг Ьуз Меб Агд С1и Агд Ьеи АЬа СЬи Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Туг УаЬ 210 215 220 <210> 155 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 155
абдаасабсд бддбдсадаа сабсдадсдс дссдабссдд ссдбдабсдс сддасбсдсд 60
даббдсддсд бсдссассдб дсасдаддсд саддддсдса бсддасбдаб дбсдбссаад 120
абдсдассда бсбабссддд сдсдсдбдбс дсддсдбсдд сддбдасддб дбсдсбдссд 180
ссддссдаса асбддабдаб бсабдбддсд дбддадсада бсааддссдд сдасабсабд 240
дбддбсдсбс сдассбсдсс дбсбдабдсс ддсбасббсд дсдассбасб ддсдассбсд 300
сбсааддсдс ддддсбдсдб дддасбддбд абсдасдсдд дддбдсдсда бдбдсдсдас 360
сбдассдааа бдсадббссс ддбдбддбсд асддсдабсб сддсдсаддд дассдбдааа 420
дааасдсбдд дсбсддбдаа сдбсссбдбс абсбдсдссд дсдсдсабдб ддадссдддс 480
дасдбдаббд ббдссдасда сдасддддбс бдсабсдбса адсдбдссаа бдсддсддсд 540
дбдсббдада аддсдсдадс дсдддбсдсс ддсдаадссд асаадсдсда дадаббадсд 600
аасддсасдс бсдддсбсда ссбсбасаад абдсдсдаад ддсбддадаа даадддбсба 660
ааабабдбсб да 672
<210> 156 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (204) . . . (207) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬбе ίά = Р300001
<400> 156
Меб Азп 11е Уа1 Уа1 С1п Азп 11е С1и Агд А1а Азр Рго А1а Уа1 11е
1 5 10 15
А1а С1у Ьеи АЬа Азр Суз СЬу УаЬ АЬа ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
- 308 019971
Агд 11е <31у 35 Ьеи Меб Зег Зег Ьуз 40 Меб Агд Рго 11е Туг 45 Рго С1у А1а
Агд Уа1 А1а А1а Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго А1а Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и С1п 11е Ьуз А1а С1у Азр Пе Меб
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр А1а С1у Туг РЬе С1 у Азр Ьеи
85 90 95
Деи А1а ТЬг Зег Ьеи Ьуз А1а Агд С1у Суз Уа1 С1у Ьеи Уа1 11е Азр
100 105 110
А1а С1у νβΐ Агд Азр Уа1 Агд Азр Ьеи ТЬг С1и Меб С1п РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег ТЬг А1а 11е Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 11е Суз А1а С1у А1а Нтз Уа1 С1и Рго С1у
145 150 155 160
Азр νβΐ 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз 11е Уа1 Ьуз Агд А1а
165 170 175
Азп А1а А1а А1а Уа1 Ьеи С1и Ьуз А1а Агд А1а Агд Уа1 А1а С1у С1и
180 185 190
А1а Азр Ьуз Агд С1и Агд Ьеи А1а Азп С1у ТЬг Ьеи С1у Ьеи Азр Ьеи
195 200 205
Туг Дуз Меб Агд С1и С1у Ьеи С1и Ьуз Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 157 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 157
абдадсдбдд бсдбсассдд сдбдсадсдд сссдсбсссд сддасдбсдс ддсаббдддс 60
сдсббсддсд бадсдасааб ссасдаддсд садддасдса сбддасбааб дсасдсббас 120
абдсддссда бсбаббссдд сдсдсабдбс бдсддбссад сддбаассдб дбсбсбсссд 180
ссадсддаса асбддабдаб ссасдббдсс абсдадсааб дбдббдсадд сдасабссбс 240
дбддбддсас саассбсдсс ббссдасдсс ддсбабббсд дсдадсбасб ддсаассбсд 300
сббсаддсдс дсддсдбдаа ддддсббабс абсдаддсбд дсбдссдсда бдбсдсддса 360
сбдасбдсса бдсдсббссс ддбдбддбсд сдсбсдабсб сбдсдсаддд дасадбдаад 420
дадасдсбсд дсбсддбааа бдбдсссдбс дбсбдбассд дсдсдсбддб ддсдссдддс 480
дабдббабсд бсдсбдасда сдабддадбб дбсдбддбсс саааддасаа бдбддссдсс 540
- 309 019971
абсдссбссд ссбссдсддс дсдбдаддсд ааддаддаад аддбдсдддс даадсбсаад 600
дссддсдбдс бдддссбсда сабсбасддс дЕдсдсдадс ддсбдаадда дааддддсбб 660
сдсбабсдбд ссдссдасда аддссасбад 690
<210> 158 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) . . . (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (20)...(40) <223> Мультиоксидазы меди, признак 1. РгозПе 1с1 = РБ00079 <400> 158
Меб 1 Бег УаЬ УаЬ УаЬ 5 ТЬг СЬу УаЬ СЬп Агд 10 Рго АЬа Рго АЬа Азр 15 УаЬ
А1а АЬа Ьеи СЬу Агд РЬе СЬу УаЬ А1а ТЬг Не НЬз СЬи АЬа С1п СЬу
20 25 30
Агд ТНг СЬу Ьеи Меб НЬз АЬа Туг Меб Агд Рго Не Туг Бег СЬу АЬа
35 40 45
НЬз УаЬ Суз СЬу Рго АЬа УаЬ ТЬг УаЬ Бег Ьеи Рго Рго АЬа Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Ые НЬз УаЬ АЬа Ые СЬи СЬп Суз УаЬ АЬа СЬу Азр Не Ьеи
65 70 75 80
УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Бег Рго Зег Азр АЬа СЬу Туг РЬе СЬу СЬи Ьеи
85 90 95
Леи АЬа ТЬг Бег Ьеи СЬп АЬа Агд СЬу УаЬ Ьуз СЬу Ьеи Не Не СЬи
100 105 110
АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ АЬа АЬа Ьеи ТЬг АЬа Меб Агд РЬе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Агд Зег Не Бег АЬа С1п СЬу ТЬг УаЬ Ьуз СЬи ТЬг Ьеи СЬу
130 135 140
Зег УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ УаЬ Суз ТЬг СЬу АЬа Ьеи УаЬ АЬа Рго СЬу
145 150 155 160
Азр УаЬ Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр С1у УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Рго Ьуз Азр
165 170 175
Азп УаЬ А1а АЬа Не АЬа Бег АЬа Зег АЬа АЬа Агд СЬи АЬа Ьуз СЬи
180 185 190
СЬи СЬи УаЬ Агд АЬа Ьуз Ьеи Ьуз А1а СЬу УаЬ Ьеи СЬу Ьеи Азр Не
195 200 205
- 310 019971
Туг С1у Уа1 Агд С1и Агд Ьеи Ьуз СЬи Ьуз СЬу Ьеи Агд Туг Агд АЬа 210 215 220
А1а Азр СЬи СЬу НЬз
225 <210> 159 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 159
аСддсддбад Ьсдбссадаа СаЬсдадсдд дсддасддсд сддссабсда саадсбддса 60
асабдсддсд ЬддсдассдЬ дсасдаддсд саддддсдса ссддЬсЬдсС ддсабсддсс 120
абдсддссда Ссбасдссдд сдсссадаб С дссддабсдд сдаСсассаб С Ссддсссса 180
сссддсдаса асЬддаСддЬ дЬасдбсдса абсдаасадс Ьсаадсаддд сдасдбдсЬд 240
дЬдаСЬдссс сдасдадбсс сЬдбдаадас ддаЪасСЬсд дсдассЬдсЬ ЬдссасСЬсд 300
дсдабддсдс дсддсбдссд сддссСдабс аЬсдабдсдд дсдбдсдсда сдЬдсдсдаб 360
сбдассдсаа ЬдсдсНссс ддЬсЬддЬсс ааддсдабсС Ьсдсдсаддд аассдбсаад 420
дадасдсбсд ддЬсддбсаа сдЬддсддбс дЬдбдсдсса асдсдсСддС саассссддс 480
дасдЬдаЬЬа Ьадссдасда сдасддсдбс дСсдЬддЬдс сасдсдсдса ддссддсдад 540
дЬссбдаада аддсддаадс дсдсаСсдса Ьсддаадаад ссаадсдсаа дсддсбддсд 600
дссддсдаас Ьсддссбсда ЬсСсбасдас абдсдсддса дасбддссда саадддссбд 660
аадЬаСдЬСС да 672
<210> 160 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 160
МеС 1 А1а \7а1 \7а1 Уа1 5 С1п Азп 11е С1и Агд 10 А1а Азр СЬу АЬа А1а 15 11е
Азр Ьуз Ьеи А1а ТЬг Суз С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 НЬз СЬи АЬа СЬп С1у
20 25 30
Агд ТЬг СЬу Ьеи Ьеи АЬа 5ег АЬа МеС Агд Рго 11е Туг АЬа СЬу А1а
40 45
- 311 019971
Сбп ббе 50 Аба Сбу Зег Аба ббе 55 ТЬг ббе Зег Аба Рго 60 Рго Сбу Азр Азп
Тгр Мер Уаб Туг Уаб Аба ббе Сби Сбп Деи Ьуз Сбп Сбу Азр Уаб Леи
65 70 75 80
Уаб ббе Аба Рго ТЬг Зег Рго Суз Сби Азр Сбу Туг РЬе Сбу Азр Леи
85 90 95
Леи Аба ТЬг Зег Аба Мер Аба Агд Сбу Суз Агд Сбу Деи ббе ббе Азр
100 105 110
Аба Сбу Уаб Агд Азр Уаб Агд Азр Леи ТЬг Аба Мер Агд РЬе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Ьуз Аба ббе РЬе Аба Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Сби ТЬг Деи Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Аба Уаб Уаб Суз Аба Азп Аба Деи Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр Уаб ббе ббе Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Рго Агд Аба
165 170 175
Сбп Аба Сбу Сби Уаб Леи Ьуз Ьуз Аба Сби Аба Агд ббе Аба Зег Сби
180 185 190
Сби Аба Ьуз Агд Ьуз Агд Леи Аба Аба Сбу Сби Деи Сбу Леи Азр Деи
195 200 205
Туг Азр Мер Агд Сбу Агд Леи Аба Азр Ьуз Сбу Деи Ьуз Туг Уаб
210 215 220 <210> 161 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 161
аРдадсдРдд РсдРсассдд саРсдсдсдд ссРдассдсд ссдаддРдда аддсРРсдсР 60
дссаРсддсд РддсдассаР ссасдаддсд садддссдса ссддссРдаР дсадРссРРс 120
аРдсадссда РсРаРассдд сдсдсасаРР ддсдддсссд сддрдасддр сРсдсРдссд 180
сссддсдаса асРддабдар РсасдРсдсд дрададсадр дссаддссдд сдасдРРсРд 240
дРсдРсдссс ссассРсасс сРсддасдРс ддсРаРРРсд дсдадсРдсР ддсдассРсд 300
сРсдРсдсас дсддсаРссд сддссРсдРс аРсдаддссд дсРдссдсда Раааасддсд 360
сРдасРдсда РдсдсРРРсс сдРРРддРсс сдсдсддрср сддсдсаддд аасддРсаад 420
дадасдсРсд дсРсддРдаа РдРсссасРс дРсРдсдссд дрдсдсрддр ааарсссддр 480
даРсРсдРдд РсдссдаРда сдасддрдрс дрсдррдрдс сдсдсдасаа ддрсдсддсд 540
дйдсдддсдд саРсдсРРдс асдсдаддсд ааддаддаРд дддрдсдсдс дсддсРдсад 600
дссддсдадс РсддасРсда сдРсРасддс аРдсдсдадс дссРдаадда аааддддсРд 660
- 312 019971 дбсбабсдсд сддсдаасас сдасдддааа аасддсбда 699 <210> 162 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 162
Меб 1 Зег Уа1 Уа1 Уа1 5 ТЬг С1у 11е А1а Агд 10 Рго Азр Агд А1а С1и 15 Уа1
С1и С1у РЬе А1а А1а 11е С1у Уа1 А1а ТЬг Не Ηί3 С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТЬг С1у Ьеи Меб С1п Зег РЬе Меб С1п Рго 11е Туг ТЬг С1у А1а
35 40 45
Н13 11е С1у С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не Н1з Уа1 А1а Уа1 С1и С1п Суз С1п А1а С1у Азр Уа1 Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр Уа1 С1у Туг РЬе С1у С1и Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Уа1 А1а Агд С1у 11е Агд С1у Ьеи Уа1 11е С1и
100 105 110
А1а С1у Суз Агд Азр Ьуз ТЬг А1а Ьеи ТЬг А1а Меб Агд РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Ьеи Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Ьеи Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Рго Агд Азр
165 170 175
Ьуз Уа1 А1а А1а Уа1 Агд А1а А1а Зег Ьеи А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
Азр С1у Уа1 Агд А1а Агд Ьеи С1п А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Уа1
195 200 205
Туг С1у Меб Агд С1и Агд Ьеи Ьуз С1и Ьуз С1у Ьеи Уа1 Туг Агд А1а
210 215 220
А1а Азп ТЬг Азр С1у Ьуз Азп С1у
225 230 <210> 163
- 313 019971 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 163
абдадбдбсд бсдбсасадд ааббссдсдд дссбсддсаб сбдадабсда сдсдсббсдс 60
сдсбдсдддд бддсдасдаб ссасдаддсд саадддсдба ссддссббсб дсдсдсдаас 120
абдсддссда бсбасдсбдд бдсссабдсс дбсддабсдд сддбдассдб дбсдббдссс 180
ссддссдаба асбддабдаб ссабдбддсд дбсдадсадб дбсаддсадд адасдбссбс 240
дбсдбддссс сдасббсдсс ббсддабдсс ддсбасбббд дсдадсбдсб ддсдассбсб 300
сбсдссдсдс ддддбдбдсд сддссбсдбб абсдаддсбд ддбдссдсда сдбддсддсд 360
ббдасддсаа бдсдббббсс ддбсбддбса сдсдссдбсб ссдсасаадд дасддбдаад 420
дадасдсббд дббсддбдаа бдбдссдабс абсбдсдссд дбдсбсбсдб даабссддда 480
дасдббдбсд ббдссдасда бдасддсдбд дбсдббдбдс сасдсабсдд адбддсддаб 540
дбсдсбдссд ссбсддссдс дсдбдаадсд ааддаддабс аддбсадддс дсдсббсаад 600
дсдддсдадс бсдддсбсда бабсбабадд абдсдсдадс ддсбдаадда аааадддсбс 660
дбсбассдба ссдсдддбда бддсссаддс дддддсбад 699
<210> 164 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) . .. (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 164 ТНг Сбу Не
Меб 1 Зег Уаб Уаб Уаб 5
Азр Аба Ьеи Агд 20 Агд Суз Сбу Уаб
Агд ТНг Сбу 35 Ьеи Ьеи Агд Аба Азп 40
Нбз Аба 50 Уаб Сбу Зег Аба Уаб 55 ТНг
Тгр 65 Меб ббе Нбз Уаб Аба 70 Уаб Сби
Уаб Уаб Аба Рго ТНг 85 Зег Рго Зег
Рго Агд 10 Аба Зег Аба Зег Сби 15 I бе
Аба 25 ТНг 11е Нбз Сби Аба 30 Сбп Сбу
Меб Агд Рго 11е Туг 45 Аба Сбу Аба
Уаб Зег Ьеи Рго 60 Рго Аба Азр Азп
Сбп Суз Сбп 75 Аба Сбу Азр Уаб Ьеи 80
Азр Аба 90 Сбу Туг РНе Сбу Сби 95 Ьеи
- 314 019971
Ьеи А1а ТНг Зег 100 Ьеи А1а А1а Агд С1у 105 \7а1 Агд С1у Ьеи \7а1 110 Не С1и
А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 А1а А1а Ьеи ТИг А1а Меб Агд РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег А1а С1п С1у ТИг Уа1 Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег \7а1 Азп Уа1 Рго Не Не Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Рго Агд Не
165 170 175
С1у Уа1 А1а Азр Уа1 А1а А1а А1а Зег А1а А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
Азр С1п Уа1 Агд А1а Агд РНе Ьуз А1а С1у <31и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Агд Меб Агд С1и Агд Ьеи Ьуз С1и Ьуз С1у Ьеи Уа1 Туг Агд ТНг
210 215 220
А1а С1у Азр С1у Рго С1у С1у С1у
225 230 <210> 165 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 165 абдддбдбдд бддбссадаа бабсдсссдс дссдсдсааб ссдбсабсда ссддсбсдсд60 дсббдсддсд бсдсдасддб бсабдаадса саддддсдса ааддссбдсб сдссадссдб120 абдсддссда бсбабсссдд сдсссддабс дссдсдадсд сддбдасдаб сбсадсдссд180 сссддбдаса асбддабдаб бсабдбддсд абсдадсадс бсаадасддд бдасабссбд240 сббсбддсдс сдассадбсс ббдсдаддас ддсбабббсд дсдабсбдсб бдсдасдбсс300 дсдабддсдс ддддсбдбсд дддаббдабс абсдабдсбд дсдбдсдсда бдбсдссдас360 сбддссдсда бдаааббссс бдбсбддбсд ааддссабсб бсдсдсаддд сасддбсаад420 дадасадбсд дббссдбдаа бдбдссддбс дбсбдсдссд дсдсдсбддб саабсссддс480 дабдбдабсд бсдссдасда бдасддсдбс бдбдбсдбса ддсдсдадда бдсддсбдаб540 дбддсбдаса аддссдаддс дсдсдбсдсд дссдаадада дсаадсдсаа дсддсбадса600 бсаддсдадс бсддбсбсда сабббасдаб абдсдссаас ддсбсасдда даааддссбб660 адабабдбсб да
672 <210> 166 <211> 223
- 315 019971 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 166 СЬп Азп Не АЬа Агд 10 АЬа АЬа СЬп Зег УаЬ 15 Не
Меб 1 СЬу УаЬ УаЬ УаЬ 5
Азр Агд Ьеи АЬа АЬа Суз СЬу УаЬ АЬа ТЬг УаЬ Н1з СЬи АЬа СЬп С1у
20 25 30
Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а Зег Агд Меб Агд Рго Не Туг Рго СЬу АЬа
35 40 45
Агд Не А1а А1а Зег АЬа УаЬ ТЬг Не Зег АЬа Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не НЬз УаЬ А1а Не СЬи СЬп Ьеи Ьуз ТЬг СЬу Азр Не Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи АЬа Рго ТЬг Зег Рго Суз СЬи Азр СЬу Туг РЬе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег АЬа Меб АЬа Агд СЬу Суз Агд СЬу Ьеи Не Не Азр
100 105 НО
АЬа СЬу УаЬ Агд Азр УаЬ АЬа Азр Ьеи А1а АЬа Меб Ьуз РЬе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Ьуз АЬа Не РЬе АЬа С1п СЬу ТЬг УаЬ Ьуз СЬи ТЬг УаЬ СЬу
130 135 140
Зег УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ Азп Рго СЬу
145 150 155 160
Азр УаЬ Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ Суз УаЬ УаЬ Агд Агд СЬи
165 170 175
Азр А1а АЬа Азр УаЬ АЬа Азр Ьуз А1а СЬи АЬа Агд УаЬ АЬа АЬа СЬи
18 0 185 190
СЬи Зег Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Зег СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Азр Меб Агд СЬп Агд Ьеи ТЬг СЬи Ьуз СЬу Ьеи Агд Туг Уа1
210 215 220
<210> 167 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 167
- 316 019971
абдддсдбсд бддбссадаа сабсдсссдс дссдадсдад абдбсабсда ссддсббдсд 60
абсбдсддсд бсдсдассдб дсабдаддсд саадддсдса аддддсбдсб ддсдадсбаб 120
абдсддссда бсбабсссдд сдсдсддабб дсддсдадсд ссдбсассаб ббсддсбссс 180
сссддбдаса асбддабддб ссабдбддсд абсдадсадд бдадддаддд сдасабссбд 240
сбдсбсдсбс сдасдадссс ббдсдаддас дддбаббббд дсдассбдсб ддсдассбсд 300
дссабддсдс дсддабдссд сдддсбддбс абсдабдссд дсдбдсдбда бдбсдссдаб 360
сбсасддсда бдсадббссс сдбсбддбсд ааддсдабсб бсдсасаддд сасддбсаад 420
дадасдсбдд дсбсбдбдаа бдбдссддбс дбсбдсдссд дсдсдсббаб саабссдддс 480
дабдбсабсд бддсддабда бдасддсдбс бдсдбсдбса ддсдсдадда ддсддссдаб 540
дбсдссдсса аддссдаддс дсдсдббддс дссдаддадд ссаадсдсаа дсдбсбсдсб 600
дссддсдаас бсддасбсда сабсбасдаб абдсдсаддс дбсбсдссда даадддаббд 660
ааабабдбсб да 672
<210> 168 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 168
Меб 1 Сбу Уаб Уаб Уаб 5 Сбп Азп Не Аба Агд 10 А1а Сби Агд Азр Уаб 15 Не
Азр Агд Ьеи Аба Не Суз Сбу Уаб Аба ТНг Уаб Нбз Сби А1а С1п Сбу
20 25 30
Агд Ьуз Сбу Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго Сбу Аба
35 40 45
Агд 11е Аба Аба Зег А1а Уаб ТНг Не Зег Аба Рго Рго Сбу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Уаб Нбз Уаб А1а Не Сби Сбп Уаб Агд Сби С1у Азр I бе Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Аба Рго ТНг Зег Рго Суз Сби Азр С1у Туг РНе Сбу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи Аба ТНг Зег А1а Меб Аба Агд Сбу Суз Агд Сбу Ьеи Уаб Не Азр
100 105 110
А1а Сбу Уаб Агд Азр Уаб А1а Азр Ьеи ТНг Аба Меб Сбп РНе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Не РНе А1а Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Сби ТНг Ьеи Сбу
- 317 019971
130 135
Зег 145 УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ 150 УаЬ Суз
Азр УаЬ 11е УаЬ АЬа 165 Азр Азр Азр
СЬи А1а АЬа Азр 180 УаЬ АЬа АЬа Ьуз
СЬи АЬа Ьуз 195 Агд Ьуз Агд Ьеи АЬа 200
Туг Азр 210 Меб Агд Агд Агд Ьеи 215 АЬа
140
АЬа СЬу АЬа 155 Ьеи Не Азп Рго СЬу 160
СЬу УаЬ 170 Суз УаЬ УаЬ Агд Агд 175 СЬи
АЬа 185 СЬи АЬа Агд УаЬ СЬу 190 АЬа СЬи
АЬа СЬу СЬи Ьеи СЬу 205 Ьеи Азр 11е
СЬи Ьуз СЬу Ьеи 220 Ьуз Туг УаЬ
<210> 169 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 169 абдадбдбдд бсдббсадаа бабсдадсдд дссдабсссд ссабсабсдс сддссббдсс 60
даабдсддбд бддсдассдб ссасдаадсд садддссдса адддссбдсб ддсдбссбаб 120
абдсдбссса бсбасбсддд сдсдсдссбд дсадсаадбд ссдбдассаб ббсддсдссд 180
сссбдсдаса асбддабдбб дсабдбсдсс аббдадаааб бдсдддаддд сдасаббсбс 240
дбссбсдссс саасдбсдсс дбсбдасдсб дддбасбббд дсдассбдсб ддссасббсд 300
дсдсаддссс дсддсбдсаа дддссбдабс аббдабдссд дсдбасдсда сдбддссдас 360
сбсасдсдда бдаааббссс сдбсбддбсс ааддсдабаб ббдсссаддд сасдабсаад 420
дадасдсбдд дсбсддбсаа бдбдссдабб дбсбдсдсдд дсдадсбддб саабдссддс 480
дасабсабсд бддссдабда сдабддддбб бдсдббдбдс дссдсдадда ддсбдсбдсд 540
дбдсбсдаад ссбсдсадаа дсдсдбддсс аабдаадада дсасдсдсаа дсдссбсдсб 600
дссддддаас бдддасбсда сабсбабдда абдсдссадс ддсбдассда дааддддббд 660
аадбабдбсб да 672
<210> 170 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
- 318 019971 <400> 170
Меб 1 Зег УаЬ УаЬ УаЬ 5 СЬп Азп 11е СЬи Агд 10 А1а Азр Рго А1а 11е 15 Не
АЬа СЬу Ьеи АЬа СЬи Суз СЬу УаЬ А1а ТЬг УаЬ Н13 СЬи А1а С1п СЬу
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи АЬа Зег Туг Мер Агд Рго Не Туг Зег СЬу АЬа
35 40 45
Агд Ьеи АЬа А1а Зег А1а УаЬ ТЬг 11е Зег А1а Рго Рго Суз Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Ьеи НЬз УаЬ А1а 11е СЬи Ьуз Ьеи Агд СЬи СЬу Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
УаЬ Ьеи А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр А1а СЬу Туг РЬе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег АЬа С1п А1а Агд СЬу Суз Ьуз С1у Ьеи 11е Не Азр
100 105 110
АЬа СЬу УаЬ Агд Азр УаЬ АЬа Азр Ьеи ТЬг Агд Мер Ьуз РЬе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Ьуз АЬа 11е РЬе А1а СЬп СЬу ТЬг 11е Ьуз СЬи ТЬг Ьеи СЬу
130 135 140
Зег УаЬ Азп УаЬ Рго ЬЬе УаЬ Суз А1а СЬу СЬи Ьеи УаЬ Азп АЬа СЬу
145 150 155 160
Азр 11е Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ Суз УаЬ УаЬ Агд Агд С1и
165 170 175
СЬи А1а А1а А1а УаЬ Ьеи СЬи А1а Зег СЬп Ьуз Агд УаЬ АЬа Азп С1и
180 185 190
СЬи Зег ТЬг Агд Ьуз Агд Ьеи АЬа А1а СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг СЬу Мер Агд СЬп Агд Ьеи ТЬг СЬи Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Туг УаЬ
210 215 220 <210> 171 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 171
ардассдрсд РсдРссдсаа сРРсдадсдс дсдРсдсссд аадРсдРадс сдРдсРдддс 60
дааРдсддсд РддсдасддР дсаРдаадсд сааддссдса дсддссРсаР дсРсдссРРс 120
ардсддссда РсРРсдсддд сдсссдсаРс дссдддссдд сддрдасадр РРссдРсссд 180
ссдддсдаса асРддаРдаб ссаРдРддсд аРсдадсадР дссдсдаадд сдасдРдсРс 240
дрсдрддсдс сдассадссс сРссдаддас ддсРаРРРсд дсдассРдсР сдсдсасРсд 300
сРдаРддсдс ддддсдРсаа ддддсРсдРс аРРдаддссд дсдРРсдсда РсРасдсдаР 360
- 319 019971
сбсассдада ЬдсдсЬПсс ддЬсбддЬсс сддасдаЬсЬ ссдсдсаддд аасддЬсаад 420
дадасдсбсд дсЬсддбдаа сдбдссдабс дбсЬдсдссд дсдсддсдд!; сдабссдддс 480
дасдЬадбсд Ьддссдасда сдасддсдбс ЬдсаЬсдбда дасдсдсссд ддсддаадад 540
дбсдсдааад сддсдсдсда асдсдаддсд ааддададдд адасдсддсд дсддсбддсс 600
дссддсдадс ЬсддЬс'Ьсда сабсЬабддс абдсдсдада адсЖдсддс сааадддсбд 660
ааабаЬдЬсЬ да 672 <210> 172 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 172
Меб 1 ТЬг \7а1 Уа1 Уа1 5 Агд Азп РЬе С1и Агд 10 А1а Зег Рго С1и Уа1 15 Уа1
А1а Уа1 Ьеи С1у С1и Суз С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 Н1з С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Зег С1у Ьеи МеЬ Ьеи А1а РЬе Меб Агд Рго Не РЬе А1а С1у А1а
35 40 45
Агд Не А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Уа1 Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не НФз Уа1 А1а Не С1и С1п Суз Агд С1и С1у Азр Уа1 Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Зег С1и Азр С1у Туг РЬе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а Н13 Зег Ьеи Меб А1а Агд С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Уа1 11е С1и
100 105 НО
А1а С1у Уа1 Агд Азр Ьеи Агд Азр Ьеи ТЬг С1и Меб Агд РЬе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Агд ТЬг Не Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 Азр Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у \7а1 Суз Не \7а1 Агд Агд А1а
165 170 175
Агд А1а С1и С1и Уа1 А1а Ьуз А1а А1а Агд С1и Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
Агд С1и ТЬг Агд Агд Агд Ьеи А1а А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
- 320 019971
195 200 205
Туг С1у Мер Агд С1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг \7а1 210 215 220 <210> 173 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 173
аЬдддсдЬЬд Ьддбссадаа ЬдЬсддссдс дссдаасааЬ ссдЬсабсда ссддсбсдса 60
дссрдрддсд ЬддсдасЬдЬ дсабдаддсд садддссдсс ддддссбссЬ сдсдадсбас 120
абдсддссда ЬсЬаЬЬссдд Ьдсасддабс дссдсдадбд садЬдасдаб сбсддсдссд 180
сссадбдаса асЬддаЬдсЬ дсабдЬддсд абсдадсааЬ Ьдаадсаддд сдаЬсЬдсЬЬ 240
сЬдсЬсдсдс ссассадссс дбдсдаадас ддсЬаЬЬЬсд дЬдассЬдсЬ сдсдассЬсЬ 300
дссдбддсдс даддЬЬдссд сддссЬдаЬс аЬсдасдсдд дсдбасдсда ЬдЬсдссдас 360
сЬдасддсса ЬдЬсдЬЬЬсс ддЬсЬддЬсс ааддсдаЬаЬ сбдсдсаадд сассдбсаад 420
дадасаЬЬдд дсЬсддбдаа ЬдЬдссддЬс дЬсбдсдссд дЬдсдсЬддЬ саасссаддс 480
дасдрдарсд Ьддссдасда сдаЬддсдЬс ЬдсдЬсдЬдс дссдсдадда ддсддсддад 540
абсдссдаса аддссдаадс дсдсдбсдсд дссдаддааа дсаадсдддс дсддсбддса 600
дссддсдаас ЬЬдддЬЬдда ЬаЬсЬасдас аЬдсдсаадс ддсЬсдссда дааадддсбд 660
аадЬабдЬсЬ да 672
<210> 174 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 174
Меб 1 С1у Уа1 \7а1 Уа1 5 С1п Азп \7а1 С1у Агд 10 А1а С1и С1п Зег Уа1 15 11е
Азр Агд Ьеи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Н1з С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Агд <31у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг МеР Агд Рго 11е Туг Зег С1у А1а
35 40 45
Агд 11е А1а А1а Зег А1а Уа1 ТНг 11е Зег А1а Рго Рго Зег Азр Азп
- 321 019971
55 60
Тгр 65 Мер Деи Нбз Уаб Аба 70 ббе Сби Сбп Деи Ьуз 75 Сбп Сбу Азр Деи Деи 80
Ьей Деи А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз Сби Азр Сбу Туг РЬе Сбу Азр Деи
85 90 95
Деи Аба ТЬг Зег Аба Уаб Аба Агд Сбу Суз Агд Сбу Деи Не ббе Азр
100 105 110
Аба Сбу Уаб Агд Азр Уаб Аба Азр Деи ТЬг Аба Мер Зег РЬе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Дуз Аба ббе Зег Аба Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Сби ТЬг Деи Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Рго Уаб Уаб Суз Аба Сбу Аба Деи Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр Уаб Не Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уаб Уаб Агд Агд Сби
165 170 175
Сби Аба Аба Сби ббе Аба Азр Ьуз Аба Сби Аба Агд Уаб Аба Аба Сби
180 185 190
Сби Зег Ьуз Агд Аба Агд Деи Аба Аба Сбу Сби Деи Сбу Деи Азр Не
195 200 205
Туг Азр Мер Агд Ьуз Агд Деи Аба Сби Ьуз Сбу Деи Ьуз Туг Уаб
210 215 220 <210> 175 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 175
аРдддРдРсд РсдРссадаа РаРсдадсдс дссдаРссРР сддРсаРсда асддсРддсд 60
дсардсдддд РРдсРасРдР дсасдаадсд садддасдса адддРсРдсР ддсдадссаР 120
аРдсддссда РсРаРдссдд РдсдсдссРР дсадссадрд ссдРдассаР аРсддсдссд 180
ссдддсдаРа асРддаРдаР ссаРдРсдсс аРсдаасадс Рсадддсддд РдасаРааРд 240
дРдсРРдссс сдасаадрсс сРдсдаддаР ддсРаРРРсд дсдасРРдсР ддсдасдРсР 300
дсРдсддсдс даддсРдссд ддддсРдаРс аРсдаРдсдд дсдРдсдРда сдрддсддас 360
сРдасддсда РдаадРРРсс ддрдрддрсд ааддссаРРР РРдсдсаддд сасддРсаад 420
дааасдсРдд дсРсддРсаа РдРдссддРд дРсРдсдсдд дадсдсРддР саасссдддс 480
дасдрдарсд РддссдаРда сдасддсдРс РдсдРсдРдс дасдсдадда адсддссдсд 540
дрддссдаса аддссдаддс дсдсдРддсР дсддаададд асаадсдсад дсдссРддсд 600
дссддддаас РдддссРсда саРсРасаад аРдсдсдадс дссРддссда даадддссРс 660
- 322 019971 аддбабдбсб да 672 <210> 176 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) .. . (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 176 Сбп Азп ббе Сби Агд 10 Аба Азр Рго Зег Уаб 15 1 бе
Меб 1 Сбу Уаб Уаб Уаб 5
Сби Агд Деи Аба Аба Суз Сбу Уаб Аба ТНг Уаб Нбз Сби Аба Сбп Сбу
20 25 30
Агд Дуз Сбу Деи Деи Аба Зег Нбз Меб Агд Рго Не Туг Аба Сбу Аба
35 40 45
Агд Деи Аба Аба Зег Аба Уаб ТНг ббе Зег Аба Рго Рго Сбу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб I бе Нбз Уаб Аба ббе Сби Сбп Деи Агд Аба Сбу Азр I бе Меб
65 70 75 80
Уаб Деи Аба Рго ТНг Зег Рго Суз Сби Азр Сбу Туг РНе Сбу Азр Деи
85 90 95
Деи Аба ТНг Зег Аба Аба Аба Агд Сбу Суз Агд Сбу Деи 11е 11е Азр
100 105 110
А1а Сбу Уаб Агд Азр Уаб Аба Азр Деи ТНг Аба Меб Дуз РНе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Дуз Аба 11е РНе Аба Сбп Сбу ТНг Уаб Дуз Сби ТНг Деи Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Рго Уаб Уаб Суз Аба Сбу Аба Деи Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр Уаб ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уаб Уаб Агд Агд Сби
165 170 175
Сби Аба Аба Аба Уаб Аба Азр Дуз Аба Сби Аба Агд Уаб Аба Аба Сби
180 185 190
Сби Азр Дуз Агд Агд Агд Деи Аба Аба Сбу Сби Деи Сбу Деи Азр 11е
195 200 205
Туг Дуз Меб Агд Сби Агд Деи Аба Сби Дуз Сбу Деи Агд Туг Уаб
210 215 220
<210> 177
<211> 675
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
- 323 019971
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 177
абддддддсд бадбсдбдса даасабсдад сдддссдасд сддааассаб ссдссддсбс 60
ддсдаабдсд дбдбддсдас ддбдсасдад дсдсаддддс дсадсдддсб дабддсдссс 120
сабабдасдс сддбсбддсд сддсдсабсд дббдссддбб сддсддбдас дабсбссдсс 180
ссдсссддсд асаасбддаб дсбдсасдбд дсдабсдадс аддбдсабда дддсдабабс 240
сбсдбдсбдд сдссдассад бссббссасд дасддсбабб бсддсдаббб дсббдссасс 300
бсддсдабдд сдсдддддбд бсдсдддсбд дбсабсдаад саддсдбдсд сдасдбддсс 360
дассбдасда адабдсддбб ссссдбсбдд бсдааддсдд бссасдсдса дддбасддбс 420
ааададасдс сдддсбсадб саасдбдссд дбсдбсбдсд ссддбдссса бдбдсддссд 480
ддсдасдбса бсдбддссда сдабдасддс дбдбдсдбдд бсаддсдсда ддаддсддсд 540
дааабаббда ддааддссда ддсссдсабс дссаасдаад ссдасаадсд сдадсдбббс 600
дссдссддсд аасбсддссб сдасабсбас ддсабдсдсд адаадсбддс сдссааддда 660
ббдааабаба бсбда 675
<210> 178 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 178
Меб 1 СЬу СЬу УаЬ УаЬ 5 УаЬ СЬп Азп Не СЬи 10 Агд АЬа Азр АЬа СЬи 15 ТЬг
11е Агд Агд Ьеи СЬу СЬи Суз СЬу УаЬ А1а ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп
20 25 30
СЬу Агд Зег СЬу Ьеи Меб АЬа Рго НЬз Меб ТЬг Рго УаЬ Тгр Агд СЬу
35 40 45
АЬа Зег УаЬ АЬа СЬу Зег АЬа УаЬ ТЬг Не Зег АЬа Рго Рго СЬу Азр
50 55 60
Азп Тгр Меб Ьеи НЬз УаЬ АЬа Не СЬи СЬп УаЬ НЬз СЬи СЬу Азр Не
65 70 75 80
Ьеи УаЬ Ьеи АЬа Рго ТЬг Зег Рго Зег ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу Азр
85 90 95
Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег АЬа Меб АЬа Агд СЬу Суз Агд СЬу Ьеи УаЬ Не
100 105 но
СЬи АЬа СЬу УаЬ Агд Азр УаЬ АЬа Азр Ьеи ТЬг Ьуз Меб Агд РЬе Рго
- 324 019971
115 120 125
Уа1 Тгр Зег Ьуз А1а \7а1 Н13 А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1ц ТЬг Рго
130 135 140
С1у Зег \7а1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Н13 Уа1 Агд Рго
145 150 155 160
С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд
165 170 175
С1и С1и А1а А1а С1и 11е Ьец Агд Ьуз А1а С1и А1а Агд 11е А1а Азп
180 185 190
С1и А1а Азр Ьуз Агд С1и Агд РЬе А1а А1а С1у С1и Ьей С1у Леи Азр
195 200 205
11е Туг С1у МеЕ Агд С1и Ьуз Ьей А1а А1а Ьуз С1у Леи Ьуз Туг 11е
210 215 220
<210> 179 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 179 аЕдддддЕсд ЕддЕссадаа саЕсдаасдс дссдаЕсадд ссдЕсаЕсаа ссдссЕЕдсс60 дссЕдсддсд ЕддссассдЕ дсасдаддсд садддссдса адддссЕдсЕ сдссдссааЕ120 аЕдсдЕссда ЕсЕасадсдд адаасдЕсЕд дсддссЕсдд ссдЕдасдаЕ ЕЕссдсдссс180 сссддЕдаса асЕддаЕддЕ ссаЕдЕсдсд аЕсдадсааЕ Едсаддссдд ЕдасаЕсаЕд240 дЕЕЕЕддссс ссассЕсдсс сЕдсдаддас ддсЕаЕЕЕсд дЕдаЕсЕЕсЕ ддссасдЕсд300 дсЕаЕсдсас дЕддсЕдсаа дддссЕдаЕс аЕсдаЕдсдд дсдЕдсдсда ЕдЕдЕсддаЕ360 сЕдасддсда ЕдаааЕЕссс сдЕсЕддЕсс ааддсдаЕсЕ Есдсссаадд сасддЕсаад420 дааасссЕЕд ддЕсддЕдаа ЕаЕЕсссдЕд дЕсЕдсдссд дсдсдсЕдаЕ сааЕсссддЕ480 даЕдЕааЕЕд ЕддссдаЕда сдасддсдЕЕ ЕдсдЕддЕсс дссдсдадда адссдаадсс540 дЕЕдсадсса аадссдаадс ссдЕдЕсдса дссдаадаад дсаадсдсдЕ дсдЕсЕддсс600 дсдддЕдаас ЕдддссЕЕда ЕаЕсЕаЕаас аЕдсдсдаас дЕсЕддссда даадддссЕд 660 аааЕаЕдЕсЕ да672 <210> 180 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 325 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 180
Меб 1 СЬу Уа1 Уа1 Уа1 5 С1п Азп Не С1и Агд 10 АЬа Азр С1п АЬа Уа1 15 Не
Азп Агд Ьеи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТЬг УаЬ НЬз С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи А1а А1а Азп Меб Агд Рго Не Туг Зег С1у С1и
35 40 45
Агд Ьеи АЬа А1а Зег АЬа Уа1 ТНг Не Зег АЬа Рго Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб УаЬ Н1з Уа1 АЬа Не С1и С1п Ьеи С1п АЬа С1у Азр Не Меб
65 70 75 80
Уа1 Ьеи АЬа Рго ТНг Зег Рго Суз С1и Азр СЬу Туг РНе СЬу Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег А1а Не А1а Агд СЬу Суз Ьуз С1у Ьеи Не Не Азр
100 105 110
А1а С1у УаЬ Агд Азр УаЬ Зег Азр Ьеи ТНг АЬа Меб Ьуз РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Не РНе А1а С1п С1у ТНг УаЬ Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Не Рго УаЬ Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Не Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд СЬи
165 170 175
С1и А1а С1и А1а Уа1 А1а А1а Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 АЬа А1а С1и
180 185 190
С1и С1у Ьуз Агд Уа1 Агд Ьеи А1а А1а СЬу С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Не
195 200 205
Туг Азп Меб Агд С1и Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220 <210> 181 <211> 687 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 181
абдадсддбс абсдсабсдб ссдсаасбаб ссаааадсад асбсдддсдб сдссбссдсб 60
сбдддсдсбс бдддсадсдс дассдбдсас даддссабдд дссдсдбддд абасдссддс 120
сассдбабсс ддссдабсса дсадддсдбд бсдабсддсд дсассдссдб аассдбсбсд 180
- 326 019971
дСсдсассдд дСдасаассС даСддССсас дссдсдаССд ссдаддссаа сдааддсдас 240
дСдсСддСсд СсдССсссдС дадсдасадс дсдССсддсС ССаСсддсда ссСдаСддсд 300
асСсадаСдс дсСсСсдссд дсСдсдсддС СасдСдассС ссддсддсдС дсдСдаСасс 360
дссдадССдд сссдсССддд ССССссддСа СддасдаааС асдСсСсдСс дсаадддасд 420
дСдааадаСа сссссддсСс ддСсааСдСд сссдСсдСдс СсдааддсдС сдСддСссаС 480
ссСддадасд СсдСддСадс ддасдасдас ддсдСсасса СсдСдссдсд сдадаСсдсс 540
дссдасасдс Сссаддссдс Ссдддсссдс дСддадаадд аадссдсдас ссдаСсдсдд 600
СаСдсддсдд дсдадсСССс асбсдасдСс аасаассСдс дсссдасссС сдсадсдсСд 660
ддадСддадС аСдСсдаССС сдддСда 687
<210> 182 <211> 228 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> СИГНАЛ <222> (1)...(31) <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 182
МеС 1 Зег С1у НЬз Агд 5 11е Уа1 Агд Азп Туг 10 Рго Ьуз А1а Азр Зег 15 С1у
Уа1 А1а Зег А1а Ьеи С1у А1а Ьеи С1у Зег А1а ТНг Уа1 НЬз С1и А1а
20 25 30
МеС С1у Агд Уа1 С1у Туг А1а С1у НЬз Агд 11е Агд Рго 11е С1п С1п
35 40 45
С1у Уа1 Зег 11е С1у С1у ТНг А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Уа1 А1а Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи МеС Уа1 Н13 А1а А1а 11е А1а С1и А1а Азп С1и С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 Уа1 Рго Уа1 Зег Азр Зег А1а РНе С1у РНе Не С1у
85 90 95
Азр Ьеи МеС А1а ТНг С1п МеС Агд Зег Агд Агд Ьеи Агд С1у Туг Уа1
100 105 110
ТЬг Зег С1у С1у Уа1 Агд Азр ТНг А1а С1и Ьеи А1а Агд Ьеи С1у РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр ТНг Ьуз Туг Уа1 Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз Азр ТНг
130 135 140
- 327 019971
Рго 145 СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ 150 Рго УаЬ УаЬ Ьеи СЬи 155 С1у УаЬ УаЬ Уа1 НЬз 160
Рго СЬу Азр УаЬ УаЬ 165 УаЬ АЬа Азр Азр Азр 170 С1у УаЬ ТНг 11е Уа1 175 Рго
Агд СЬи Не АЬа 180 АЬа Азр ТНг Ьеи СЬп 185 А1а А1а Агд АЬа Агд 190 Уа1 СЬи
Ьуз СЬи АЬа 195 АЬа ТНг Агд Зег Агд 200 Туг А1а А1а СЬу СЬи 205 Ьеи Зег Ьеи
Азр УаЬ Азп Азп Ьеи Агд Рго ТНг Ьеи АЬа А1а Ьеи СЬу Уа1 С1и Туг
210 215 220
УаЬ Азр РНе СЬу
225 <210> 183 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 183 абдсдсддсд НсдЬддбссд даасаббсса сдсдссдасд сдсдсдадаб сдсддббсбд 60
сабдаадсдд дсдбсдссас сдбдсасдад дсдсададсс дссбсддбсб дсбсдсббсд 120
басабдсддс ссаН Ьасда дддсдсабсд аЫдссддбс сддссдбдас сдНдсбсдбд 180
ссдссабсдд асаасбддаб дсбдсасдбс дссдсбдаас адбдссадсс сддсдабдбс 240
сбсдбддбсд сдссдасдбс дссдбдсдаа дасддсбасб бсддсдаасб дббддсдасд 300
бсдсбддсас адсбсддсдб дсдсддасбд абсабсдабд сдддсбдссд сдасабссдб 360
дсдсбсаадд сдабдааббб ссссдбдбдд Нсдаааддда бсбсддсдса адддассдбс 420
ааддааасдс бсдддбсддб даасабсссс дбддбдбдсд сдсадсаасб ддбдсдассд 480
ддсдасдбда бсдбддссда бдасдабддс дбсдбддбсд бсдсдббсда дасддбддсд 540
дссдбддсда дсдссдсасд сдсдсдссбс дадааддаад адаадасдсд садсдбдсбб 600
дсдасаддсс адсбсддбсН сдасбасбас дсдабдсдсд адаадсббдс ддсааадддб 660
ЫдсдЬЬасд Нсдаббссдс ЬдсдддНсбб Ода 693
<210> 184 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173)
- 328 019971 <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 184
Меб 1 Агд С1у Уа1 Уа1 5 Уа1 Агд Азп 11е Рго 10 Агд А1а Азр А1а Агд 15 С1и
11е А1а Уа1 Ьеи Н1з С1и А1а С1у Уа1 А1а ТЬг Уа1 Н13 С1и А1а С1п
20 25 30
Зег Агд Ьеи С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг С1и С1у
35 40 45
А1а Зег 11е А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи Уа1 Рго Рго Зег Азр
50 55 60
Азп Тгр Меб Ьеи Нтз Уа1 А1а А1а С1и С1п Суз С1п Рго С1у Азр \7а1
65 70 75 80
Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РЬе С1у С1и
85 90 95
Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи А1а С1п Ьеи С1у Уа1 Агд С1у Ьеи 11е 11е
100 105 110
Азр А1а С1у Суз Агд Азр Не Агд А1а Ьеи Ьуз А1а Меб Азп РЬе Рго
115 120 125
Уа1 Тгр Зег Ьуз С1у 11е Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз С1и ТЬг Ьеи
130 135 140
С1у Зег Уа1 Азп 11е Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1п С1п Ьеи Уа1 Агд Рго
145 150 155 160
С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 А1а РЬе
165 170 175
С1и ТЬг Уа1 А1а А1а Уа1 А1а Зег А1а А1а Агд А1а Агд Ьеи С1и Ьуз
180 185 190
С1и С1и Ьуз ТЬг Агд Зег Уа1 Ьеи А1а ТЬг С1у С1п Ьеи С1у Ьеи Азр
195 200 205
Туг Туг А1а Меб Агд С1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Агд Туг Уа1
210 215 220
Азр Зег А1а А1а С1у Ьеи
225 230 <210> 185 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 185
абдаабсдас сддбддбадб ссддсаадбб даасадссас садсддабдс ддббдссдса 60
сбддададдб абддсдбдас аассдбссаб даддсбсадд дасссддбдд ссбссбадсс 120
бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дбсабсдссд дббссдсддб сасбдбдбсб 180
- 329 019971
ббассбссбд дсдасаассб сабдабссас дбддссдбдд аддбсбдбдд бссдддааас 240
аббсбддббд ббдсассдаб сбсдссдбдб асддабддсб асббсддада дсбдббддса 300
ассбсбсбсс дсдсссасдд бдбдсдаддд сббдбдабсд абдссддабд ссдддасдбд 360
сдсбсбсбса садааабдаа абббссддсс бддадссдсд ссдбсадббс асаддддаса 420
дбсааддсса сссбдддабс ддбдаабдбд ссдаббдбдб дсдсдддсдс дсдддбсдад 480
дсбддддабд бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд бддбдаадсд сдсдсбддсс 540
даададдбсд ссдссдсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдбдас ссдддаасда 600
сббдсдсдбд дададсбддд асбсдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсасаасбд 660
ддссббаааб абсбсбда 678
<210> 186 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 186
Меб 1 Азп Агд Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Агд Туг С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Рго С1у С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у А1а Уа1 11е А1а С1у Зег А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1у Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго 11е Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд А1а ΗΪ3 С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго А1а Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е Уа1 Суз А1а С1у А1а Агд \7а1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа! Уа1 Уа1 Ьуз
- 330 019971
165 170 175
Агд А1а Ьеи Аба 180 Сби Сби Уаб Аба Аба Аба Аба 185 Сби Сбп Агд 190 Уаб Агд
Ьуз С1и Азп Уаб ТНг Агд Сби Агд Ьеи Аба Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Меб Агд Сбп Ьуз 11е Аба Сбп Ьеи Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 187 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 187
абдаабсдас сддбддбадб ссддсаадбб даасадссас садсддабдс ддббдссдса 60
сбддадаадб абддсдбдас аассдбссаб даддсбсадд дасссддбдд ссбссбадсс 120
бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дбсабсдссд дббссдсддб сасбдбдбсб 180
ббассбссбд дсдасаассб сабдабссас дбддссдбдд аддбсбдбдд бссдддааас 240
аббсбддббд ббдсассдаб сбсдссдбдб асддабддсб асббсддада дсбдббддса 300
ассбсбсбсс дсдсссасдд бдбдсдаддд сббдбдабсд абдссддабд ссдддасдбд 360
сдсбсбсбса садааабдаа абббссддбс бддадссдсд ссдбсадбсс асаддддаса 420
дбсааддсса сссбдддабс ддбдаабдбд ссдаббдбдб дсдсдддсдс дсдддбсдад 480
дсбддддабд бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд бддбдаадсд сдсдсбддсс 540
даададдбсд ссдссдсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдбдас ссдддаасда 600
сббдсдсдбд дададсбддд асбсдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсасаасбд 660
ддссббаааб абсбсбда 678
<210> 188 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 188 '
Меб Азп Агд Рго Уа1 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 С1и С1п Рго Рго А1а Азр
- 331 019971
10 15
Аба Уаб Аба Аба 20 Ьей Сби Ьуз Туг Сбу 25 Уаб ТЬг ТЬг Уаб Нбз 30 Сби Аба
Сбп Сбу Рго Сбу Сбу Ьей Ьей Аба Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба Уаб 11е Аба Сбу Зег Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Леи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьей Меб ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
ббе Ьей Уаб Уаб Аба Рго 11е Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьей Ьей Аба ТЬг Зег Ьей Агд Аба Нбз Сбу Уаб Агд Сбу Деи Уаб
100 105 110
ббе Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Леи ТЬг Сби Мер Луз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Рго Сбп Сбу ТЬг Уаб Дуз Аба ТЬг
130 135 140
Ьей Сбу Зег Уаб Азп Уаб Рго I бе Уаб Суз Аба Сбу Аба Агд Уаб Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Аба Ьей Аба Сби Сби Уаб Аба Аба Аба Аба Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Азп Уаб ТЬг Агд Сби Агд Ьей Аба Агд Сбу Сби Деи Сбу Деи
195 200 205
Азр ббе Туг Азр Мер Агд Сбп Ьуз 11е Аба Сбп Леи Сбу Деи Дуз Туг
210 215 220
Ьей
225 <210> 189 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца
<400> 189
аРдаасааас сддРддРдаР ссддсаасРд
сРсдаааааб аРддРдРдРс сассдРдсаР
РссРасаРдс дассдаРРРа РссдддРдсс
сРРссдсссд дсдаРаассР даРдаРРсас
аРасРсдРдд РРдсссссас сРсдссРРдс
из окружающей среды
дадсдддсдс сддсРдаРдс ддрддсддсд 60
даадсРсадд дасдРРдсдд асРасРсдсР 120
дсРаРРдссд ддРсддсддР сасддрдрса 180
дррдссдрсд аддРРРдсса дрссддсдас 240
РсддасддаР асРРсдддда дррдррддса 300
- 332 019971
асабсЪббдс дсдсссасдд сдбдаадддд сббдбсаббд аддсаддабд ссдбдабдбб 360
сдсбсдсбса ссдааабдаа дббсссддбс бддадссдсд ссдбсадббс дсааддсасс 420
дбдаадбсба ассбсддабс ддбдаабдбд ддсабадбсб дбдсдддбдс асасаббдас 480
дсбддсдабд бддбсдбддс адабдасдас ддбдбсдбдд сддбдаадсд сдсабссдсс 540
саадаадбад ббддддсдбд сдаасаасдд дббсдсаадд аададдсадс ссдбдадсдд 600
сбддсдсддд дададсббдд ссбсдасабс басддсббдс дсасасдааб сдсддааабд 660
ддбсбсаадб абсаабда 678 <210> 190 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 190
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уаб 5 Уаб ббе Агд Сбп Ьеи 10 Сби Агд Аба Рго Аба 15 Азр
Аба Уаб Аба Аба Ьеи Сби Ьуз Туг Сбу Уаб Зег ТНг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
<31п Сбу Агд Суз Сбу Ьеи Ьеи Аба Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба Аба 1 бе Аба Сбу Зег Аба Уаб ТНг Уаб Зег Ьеи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб I бе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбп Зег Сбу Азр
65 70 75 80
ббе Ьеи Уаб Уаб Аба Рго ТНг Зег Рго Суз Зег Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи Аба ТЬг Зег Ьеи Агд Аба Нбз Сбу Уаб Ьуз Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
ббе Сби Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТНг Сби Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Зег Азп
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Сбу ббе Уаб Суз Аба Сбу Аба Нбз 11е Азр
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб Уаб Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Аба Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Аба Зег Аба Сбп Сби Уаб Уаб Сбу Аба Суз Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
- 333 019971
Ьуз С1и СЬи 195 АЬа АЬа Агд СЬи Агд 200 Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи 205 Ьеи СЬу Ьеи
Азр Не Туг СЬу Ьеи Агд ТНг Агд Не АЬа СЬи Меб СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
С1п
225 <210> 191 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 191
аРдаасааас сддрддрдар ссддсаасРд дадсдддсдс сддсРдаРдс ддрддсддсд 60
сРсдаааааР арддрдрдрс сассдрдсар даадсРсадд дасдРРдсдд асРасРсдсР 120
РссРасаРдс дассдаРРРа РссдддРдсс дсРаРРдссд ддРсддсддР сасддрдрса 180
сРРссдсссд дсдаРаассР даРдаРРсас дррдссдрсд аддРРРдсса дрссддсдас 240
аРасРсдРдд РРдсссссас сРсдссРРдс РсддасддаР асРРсдддда дррдррддса 300
асаРсРРРдс дсдсссасдд сдРдаадддд сРРдРсаРРд аддсаддаРд ссдРдаРдРР 360
сдсРсдсРса ссдааардаа дРРсссддРс Рддадссдсд ссдРсадРРс дсааддсасс 420
дРдаадРсРа ассРсддаРс ддрдаардрд ддсаРадРсР дрдсдддрдс асасаРРдас 480
дсРддсдаРд РддРсдРддс адаРдасдас ддрдрсдрдд сддрдаадсд сдсаРссдсс 540
саадаадРад РРддддсдРд сдаасаасдд дРРсдсаадд аададдсаас ссдрдадсдд 600
срддсдсддд дададсррдд ссРсдасаРс РасддсРРдс дсасасдааР сдсддаааРд 660
ддРсРсаадР аРсааРда 678
<210> 192 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 192
Мер Азп Ьуз Рго УаЬ УаЬ Не Агд СЬп Ьеи СЬи Агд А1а Рго АЬа Азр
1 5 10 15
А1а УаЬ А1а АЬа Ьеи СЬи Ьуз Туг СЬу УаЬ Зег ТНг УаЬ НЬз С1и А1а
20 25 30
- 334 019971
С1п С1у Агд 35 Суз С1у Ьеи Ьеи А1а 40 Зег Туг Меб Агд Рго 45 Не Туг Рго
С1у А1а А1а Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Н13 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Зег С1у Азр
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 \7а1 А1а Рго ТИг Зег Рго Суз Зег Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТИг Зег Ьеи Агд А1а Нтз С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Уа1
100 105 но
Не С1и А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго \7а1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз Зег Азп
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 С1у Не Уа1 Суз А1а С1у А1а НЬз Не Азр
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 А1а Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а Зег А1а С1п С1и Уа1 Уа1 С1у А1а Суз С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз <31и С1и А1а ТИг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд ТИг Агд Не А1а С1и Меб С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
С1п
225 <210> 193 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 193
абдаабасас сддбддбадб ссддсаддбд дадсадссдс садсаддбдс ддббдссаса 60
сбддадаадб дбддддбдас аассдбдсаб даддсбсаад дасдббдбдд ссбдсббдсд 120
сссбассбдс дсссдаббба сссдддадса дссабсдссд дббссдсдаб сассдбдасб 180
ббдссбссдд дсдасаассб сабдабссас дббдсддбдд аддбсбдсдд бссдддааас 240
аббсбсдбад бббсассдас сбсддсббдс ассдабддсб асббсддбда дсбдббддсс 300
асабсбсбсс дбдсссасдд бдбдададдд сбддбдабсд абдссддабд ссдбдабдбд 360
сдсбсбсбаа садааабдаа аббсссддбс бддадссдсд ссдбсадбсс дсадддсасс 420
дбсааддсса сдсбдддабс ддбдаабдбд сссабсдбдб дсдсдддсдс асбддбсдаа 480
- 335 019971
дсбддбдабд ббабедбеде сдабдасдаб ддедбддбдд бддбдаддсд сдсдсбддсс 540
даададдбсд ссдсддсддс ддаасааадд дббсадааад адаабдбдас ссдсдадсдд 600
сббдсасдсд дададсбсдд ссбсдабабб басдасаббс дссаасддаб сдсдсаасбд 660
ддссббаааб абебдбаа 678
<210> 194 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 194
Меб 1 Азп ТЬг Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 С1 у
А1а \7а1 А1а ТЬг Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Уа1 ТНг ТЬг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Рго Туг Ьеи Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у А1а А1а Не А1а С1у Зег А1а Не ТЬг Уа1 ТНг Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е ΗΪ5 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1у Рго С1у Азп
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 Зег Рго ТЬг Зег А1а Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Н13 С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Рго С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Агд
165 170 175
Агд А1а Ьеи А1а С1и С1и Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 С1п
180 185 190
Ьуз С1и Азп Уа1 ТЬг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Не Агд С1п Агд Не А1а С1п Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
- 336 019971
Ьеи
225 <210> 195 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 195 аЬдааЬасас сддрддрадр ссддсаддбд дадсадссдс садсаддбдс ддЬЬдссаса60 сбддадаадЬ дрддддрдас аассдрдсар даддсбсаад дасдЬЬдЬдд ссЬдсЬЬдсд120 сссЬасаЬдс дсссдаЬЬЬа сссдддадса дссабсдссд дРЬссдсдаЬ сассдЬдасб180
ЬЬдссЬссдд дсдасаассб саЬдаЬссас дРНдсддРдд аддбсЬдсдд Ьссдддааас240 аЬЫгбддЬдд РРЬсассдас сЬсддсЬЬдс ассдаЬддсб асЬЬсддЬда дсЬдЬЬддсс300 ассЬсЬсЬсс дбдсЬсасдд ЬдЬдададдд сЬддЬдаЬсд аЬдссддаЬд ссдЬдаЬдЬд360 сдсЬсЬсЬаа садааардаа аСЬсссддЬс Ьддадссдсд ссдЬсадЬРс дсадддсасс420 дбсааддсса сасбдддаЬс ддЬдааЬдЬд сссаЬсдЬдЬ дсдсдддсдс асбддЬсдаа480 дсЬддЬдабд ЬсаЬсдЬсдс сдардасдар ддадбддЬдд НддРдаддсд сдсдсбддсс540 даададдбсд ссдссдсддс ддаасааадд дсСсадааад адааРдбдас ссдсдадсда600 сбддсдсдсд дададсбсдд ссРсдаНаРР Ьасдасабдс дссаааадаЬ сдсдсаасбд 660 ддссЬЬаааЬ абссдЬаа678 <210> 196 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 196
МеР 1 Азп ТИг Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 С1у
А1а Уа1 А1а ТИг Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Рго Туг Мер Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у А1а А1а Не А1а С1у Зег А1а Не ТИг Уа1 ТНг Ьеи Рго Рго С1у
55 60
- 337 019971
Азр 65 Азп Ьеи Меб Не НЬз 70 УаЬ АЬа УаЬ С1и УаЬ 75 Суз СЬу Рго СЬу Азп 80
11е Ьеи УаЬ УаЬ Зег Рго ТНг Зег АЬа Суз ТНг Азр СЬу Туг РНе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТНг Зег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу УаЬ Агд СЬу Ьеи УаЬ
100 105 НО
11е Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТНг СЬи Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа УаЬ Зег Зег СЬп СЬу ТНг УаЬ Ьуз АЬа ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег УаЬ Азп УаЬ Рго Ые УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ СЬи
145 150 155 160
А1а СЬу Азр УаЬ Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Агд
165 170 175
Агд АЬа Ьеи АЬа СЬи СЬи УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа СЬи СЬп Агд АЬа СЬп
180 185 190
Ьуз СЬи Азп УаЬ ТНг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд СЬп Ьуз Не АЬа СЬп Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Рго
225 <210> 197 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 197
абдаабааас сддбддбааб ссддсаадбд дадсадссас садсддасдс сдббдсадса 60
ббддадаадб абддсдбсас аассдбдсаб даддбдсадд дасдсбдбдд ссбссбсдсд 120
сасбасдбдс дбссдаббба сдсаддадсб дсаабсдсад дббссдсбдб басбдбдбсд 180
ббдссбсссд дсдасаассб сабдаббсаб дббдсбдбсд аддбсбдсдд бссбддаааб 240
аббсбддббд бббсасссас сбссссббдб асадасддсб абббсддбда асбдббддса 300
асдбсбббдс дсдсбсасдд адбдаадддд сббдбдабсд абдссддабд ссдсдасдбб 360
сдсбсасбда сддадабдаа аббсссддбд бддадссддд ссабсбдсбс асаддддаса 420
дбсааддсба сасбсддабс ддбсаабдбд сссабсабдб дсдсдддсдс асбсдбсдаа 480
дссддсдасд бсабсдбддс сдасдабдаб ддадбддбдд ббдбдаадсд адсдабддсд 540
аббдасдбсд ссдсддссдс сдадсааадд дббсасааад адаабасдас ссдсдаасдд 600
сббдсасдбд дададсббдд дсбсдабабб басдадабдс дбсадааааб сдбасаасбд 660
- 338 019971 ддссббаадб аббссбда 678 <210> 198 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (197)...(200) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозббе ίά = Р300001 <400> 198
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 Не Агд Сбп Уа1 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
А1а Уаб Аба А1а Ьеи С1и Ьуз Туг С1у Уа1 ТЬг ТНг Уаб Нбз Сби Уаб
20 25 30
Сбп Сбу Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Нбз Туг Уаб Агд Рго I бе Туг А1а
35 40 45
Сбу Аба Аба 11е А1а Сбу Зег А1а Уаб ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Нбз Уа1 А1а Уа1 Сби Уа1 Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
11е Ьеи Уаб Уаб Зег Рго ТЬг Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи Аба ТНг Зег Ьеи Агд Аба Нбз Сбу Уа1 Ьуз Сбу Ьеи Уа1
100 105 НО
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТНг Сби Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд А1а Не Суз Зег Сбп Сбу ТНг Уа1 Ьуз Аба ТНг
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не Меб Суз А1а Сбу А1а Ьеи Уа1 Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уаб Уа1 Уаб Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а Меб А1а Не Азр Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и Сбп Агд Уа1 Нбз
180 185 190
Ьуз Сби Азп ТЬг ТЬг Агд Сби Агд Ьеи А1а Агд Сбу Сби Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг Сби Меб Агд С1п Ьуз Не Уа1 С1п Ьеи Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
- 339 019971
Зег
225 <210> 199 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 199 аЕдаасаадс ссдЕддЕддЕ дсдддасаЕс дадсддссдс сддсддаЕдс саЕсдсддсд 60
сЕсдаасддЕ асддЕдЕдЕс сасддЕдсас даддсдсадд дссдЕЕдсдд дсЕдсЕддсс 120
ссЕЕасаЕдс дЕссдаЕсЕа Едсдддсдса дсдаЕсдсЕд дЕсссдссдЕ ЕасадЕЕЕса 180
сЕЕссдссдд дадасаассЕ даЕдаЕссас дЕсдссдЕсд аадЕдЕдссд Есссддадас 240
аЕссЕддЕЕд Есасдссдас сЕсдссдЕдс ассдасддсЕ аЕЕЕЕддада дЕЕдсЕсдсд 300
асЕЕсдсЕдд сЕдсдсасдд ддЕдааадда сЕддЕсаЕЕд аЕдсдддаЕд ссдсдаЕдЕЕ 360
сдадсдЕЕда ссдадаЕдаа аЕЕЕсссдЕс Еддадссдсд ссдЕдадЕЕс дсадддаасд 420
дЕдааддсЕа сасЕЕдддЕс ддЕдааЕдЕд асдаЕЕдсаЕ дсдсдддддс ЕасддЕЕдад 480
сссддЕдасд ЕааЕсдЕадс ддасдаЕдаЕ ддсдЕсдЕЕд ЕддЕдааасд ддсЕдаддсд 540
саадасдЕЕд ЕсдссдсаЕс Едадсадада дЕдсдааадд аададддаас ссдЕааасдд 600
сЕсдсдсадд дсдаасЕсдд сЕЕддаЕаЕЕ ЕасддсЕЕдс дсдсдаадаЕ сдсддассЕс 660
ддссЕсаадЕ асЕЕдЕад 678
<210> 200 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
<220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозФЕе ϊά = Р300001 <400> 200
МеЕ 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 \7а1 Уа1 Агд Азр 11е 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
А1а 11е А1а А1а Леи С1и Агд Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 ΗΪ5 С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьей Ьей А1а Рго Туг МеЕ Агд Рго 11е Туг А1а
- 340 019971
35 40 45
Сбу Аба Аба Не Аба Сбу Рго Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Ьей Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьей Меб Не Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Агд Рго Сбу Азр
65 70 75 80
I бе Ьей Уаб Уаб ТЬг Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьей Ьей Аба ТЬг Зег Ьей Аба Аба Нбз Сбу Уаб Ьуз Сбу Ьей Уаб
100 105 110
Не Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Аба Ьей ТЬг Сби Мер Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Аба ТЬг
130 135 140
Ьей Сбу Зег Уаб Азп Уаб ТЬг Не Аба Суз Аба Сбу Аба ТЬг Уаб Сби
145 150 155 160
Рго Сбу Азр Уаб I бе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Аба Сби Аба Сбп Азр Уаб Уаб Аба Аба Зег Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Сби Сбу ТЬг Агд Ьуз Агд Ьей Аба Сбп Сбу Сби Ьей Сбу Ьей
195 200 205
Азр Не Туг Сбу Ьей Агд Аба Ьуз Не Аба Азр Ьей Сбу Ьей Ьуз Туг
210 215 220
Ьей
225 <210> 201 <211> 633 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 201
аРдадсаасд аРРРдсддсд сРРсддсдРс РсдасдсРдс асдаддсдса аддасддсдс 60
дддРРдсРсд сдРсаРасаР дсддссдаРс РаРссдддсд сдсРддРсдс сддРссддсд 120
дРаассдРсс РсдРдссдсс аддсдасаас сРддРдаРсс асдРсдсддР ддаадсдрдс 180
дсдссдддсд асдРссРсдР сдрсдсдссд асдРсдсссР дсасддасдд сРаРРРРддс 240
дадсРдсРдд сдасдРсРРР асдсдсРсдд аасдРддсдд дссРддРдаР сдасдссддс 300
РдссдддаРд РссдРдсдсР сассдадаРд сддРРсссдд РсРддсдссд сдссаРсадс 360
дсдсадддда сддРсааддс дасдсРсддс РсРсРдааса сдссдаРсдР срдрдссдда 420
дсдсРсдРРд сссссддсда РдРсаРсдРд дссдасдаРд асддадРсдР сдрддрдаад 480
- 341 019971
сдддаддааа бсдсддсддб дасдсаддсд дсддадсадс дсдбссдсаа ддаададддй 540
асдсдадсда ддсбсдсааа сддбдаасбд ддбббддаса бсбасддсбб дсддсадаад 600
с^ддсддасс бдддссбдаа дбсдбсабсд Ода 633
<210> 202 <211> 210 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
<220> <221> <222> ДОМЕН (6)... (158)
<223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 202
Мер 1 Зег Азп Азр Ьеи 5 Агд Агд РЬе С1у Уа1 10 Зег ТНг Ьеи Н1з С1и 15 А1а
С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго
20 25 30
С1у А1а Ьеи Уа1 А1а С1у Рго А1а Уа1 ТНг Уа1 Ьеи Уа1 Рго Рго С1 у
35 40 45
Азр Азп Ьеи Уа1 11е Ηί3 Уа1 А1а Уа1 С1и А1а Суз А1а Рго С1у Азр
50 55 60
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
65 70 75 80
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Агд Азп Уа1 А1а С1у Ьеи Уа1
85 90 95
Не Азр А1а СЬу Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг СЬи Меб Агд РНе
100 105 110
Рго Уа1 Тгр Агд Агд А1а Не Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз АЬа ТНг
115 120 125
Ьеи С1у Зег Ьеи Азп ТЬг Рго 11е Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 А1а
130 135 140
Рго СЬу Азр Уа1 11е УаЬ А1а Азр Азр Азр СЬу Уа1 УаЬ Уа1 Уа1 Ьуз
145 150 155 160
Агд СЬи С1и 11е А1а А1а Уа1 ТНг С1п А1а АЬа С1и С1п Агд Уа1 Агд
165 170 175
Ьуз С1и С1и С1у ТЬг Агд А1а Агд Ьеи А1а Азп СЬу С1и Ьеи С1у Ьеи
180 185 190
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд С1п Ьуз Ьеи А1а Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Зег
195 200 205
Зег Зег
210
- 342 019971
<210> 203 <211> 699 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 203 абдассддса ЬЪдЪсдЪсда дассабсдад сдсдсдбссс ЬсдссдасаЬ сдссдсдсбд 60
дссдадЬЬсд дсдбсдссас сабссасдад дсдсадддсс дсаЬсддбсЬ ссЬсдссбсс 120
ассабдсдсс сдаЬсбасдс дддбдссдса дссдссддса абдссдбсас сдбдбсддЫ: 180
ссдсссддсд асаасбддаб дабссасдЬд дссдбсдадс адбдссдсда дддсдасабс 240
сЬддЬддбдд сссссассад сссдаасдас аасддсЬасб ЬсддсдаасЬ дсЬддссбдс 300
ЬсдсбсаадЬ сдсдсддсдб дсдсддссбс абсабсдаад ссддсбдссд сдасдбдааа 360
ссдсбсассд адабдаадЬЬ ссссдбсбдд Ьсссдсдссд ЬсЬссбссса аддсассдбс 420
ааддааадсс ЬсддсдасдЬ дааЬсбдссд сЬсЬсдабсд сдддссадсб сдЬсаасссс 480
ддсдабдбса Ьсдбсдссда Ьдасдасддс дЬддбсдЬдд Ьсдсссдсад сдабдЬдсдс 540
Ьсадбсассд ссаадбсдсд сдаасдсдаа дасааддаад ссааааассд ддЬдсаасбс 600
саддссддсс адсбсддсаб ЬдасаЬсбаЬ ддсабдсдсд асаадсбсаа ддссаааддс 660
сЬдсдсбасд бдаааадсдс ддсддассбд аадддсбаа 699
<210> 204 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (21)...(173) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 204
Меб 1 ТЬг С1у 11е Уа1 5 Уа1 С1и ТЬг 11е С1и 10 Агд А1а Зег Ьеи А1а 15 Азр
Не А1а А1а Ьеи А1а С1и РЬе С1у Уа1 А1а ТЬг 11е ΗΪ5 С1и А1а С1п
20 25 30
С1у Агд 11е С1у Ьеи Ьеи А1а Зег ТЬг Меб Агд Рго 11е Туг А1а С1у
35 40 45
А1а А1а А1а А1а С1у Азп А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Уа1 Рго Рго С1у Азр
50 55 60
Азп Тгр Меб 11е ΗΪ3 \7а1 А1а Уа1 С1и С1п Суз Агд С1и С1у Азр 11е
65 70 75 80
Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Азп Азр Азп С1у Туг РЬе С1у С1и
- 343 019971
90 95
Ьеи Ьеи АЬа Суз 100 Зег Ьеи Ьуз Зег Агд 105 СЬу Уа1 Агд С1у Ьеи 110 11е 11е
СЬи А1а СЬу Суз Агд Азр УаЬ Ьуз Рго Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе Рго
115 120 125
УаЬ Тгр Зег Агд А1а УаЬ Зег Зег С1п СЬу ТЬг Уа1 Ьуз СЬи Зег Ьеи
130 135 140
СЬу Азр УаЬ Азп Ьеи Рго Ьеи Зег Пе А1а СЬу СЬп Ьеи УаЬ Азп Рго
145 150 155 160
С1у Азр УаЬ 11е УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу Уа1 Уа1 Уа1 УаЬ А1а Агд
165 170 175
Зег Азр УаЬ Агд Зег УаЬ ТЬг А1а Ьуз Зег Агд С1и Агд СЬи Азр Ьуз
180 185 190
СЬи А1а Ьуз Азп Агд УаЬ СЬп Ьеи СЬп А1а С1у С1п Ьеи СЬу 11е Азр
195 200 205
11е Туг С1у Меб Агд Азр Ьуз Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1у Ьеи Агд Туг УаЬ
210 215 220
Ьуз Зег А1а А1а Азр Ьеи Ьуз С1у
225 230
<210> 205 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 205
аРдаасасас сддРддРадс аадасаадРд дадсадссас садсддаРдс ааРРдссдса 60
РРддадаадР дрддадрдас аассдРссаР даддсРсадд дасдРРдРдд ссРссРРдсд 120
РссРасаРРс дсссдаРРРа сссдддадса дссаРсдсад даРссдсРаР сасРдРдРсР 180
РРдссРссРд дсдасаассР саРдаРссас дррдсддрдд аддРсРдсдд Рссдддааас 240
аРссРддРад РРРсассдас дрсдссррдр асддасддсР асРРсддРда дррдррддса 300
асаРсРсРсс дрдсссасдд адРдаР Рддд сРРдРдаРсд ардссддард ссдрдардрд 360
сдсРсРсРда садаааРдаа аРРсссддРс Рддадссдсд ссаРсРдРРс дсаадддаса 420
дрсааддсса сасРРддаРс ддрдаардрд сссаРсдРаР дсдсдддрдс ааРддРсдад 480
дсРддРдаРд РсаРсдРсдс сдасдаРдаР ддсдРРдРсд РРдРдаадсд адсдсРддсд 540
саддадаРсд сРдсддсддс ддаасааадд дРРсдсааад адааРдРаас ссдсдаасда 600
сРсдсасдРд дадаРсРсдд асРРдаРаРР РасдасаРдс дссаааадар сдсдсаасРд 660
ддссРсаааР аРсРсРда 678
<210> 206
- 344 019971 <2И> 225 <2Ь2> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (28)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 206 А1а Агд СЬп УаЬ 10 СЬи СЬп Рго Рго АЬа Ь5 Азр
Меб 1 Азп ТЬг Рго УаЬ 5 УаЬ
АЬа Не АЬа А1а Ьеи С1и Ьуз Суз СЬу УаЬ ТНг ТНг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
СЬп СЬу Агд Суз СЬу Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Не Агд Рго ЬЬе Туг Рго
35 40 45
СЬу АЬа АЬа Не А1а СЬу Зег АЬа Не ТНг УаЬ Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬу Рго СЬу Азп
65 70 75 80
Не Ьеи УаЬ УаЬ Зег Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр СЬу Туг РНе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТНг Зег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу УаЬ Не СЬу Ьеи УаЬ
100 105 НО
Не Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТНг СЬи Меб Ьу5 РНе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд А1а Не Суз Зег СЬп СЬу ТНг УаЬ Ьуз АЬа ТНг
130 135 140
Ьеи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Рго Не УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Меб УаЬ СЬи
145 150 155 Ь60
А1а СЬу Азр УаЬ Не УаЬ А1а Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Ьуз
165 170 Ь75
Агд АЬа Ьеи А1а С1п С1и Не А1а А1а А1а А1а С1и СЬп Агд УаЬ Агд
180 185 Ь90
Ьуз СЬи Азп УаЬ ТНг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд СЬу Азр Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд СЬп Ьуз Не А1а СЬп Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи 225
<2Ь0> <2ЬЬ> <2Ь2> <2ЬЗ> 207 678 ДНК Неизвестно
<220>
- 345 019971
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 207
аСдаасааас сддСддСдаС ссддсаадСд дадсддссдс сддсСдасдс ддСддсддсд 60
сСсдааассс аСддсдСдСс сассдСдсаС даддсссадд ддсдССдсдд асСдсСсдсС 120
СссСасаСдс ддссдаСССа Ссссддсдсс дсдаССдссд ддСсддсддС сасддСдСсд 180
сССссдсссд дсдаСааСсС саСдаССсаС дССдссдСдд аддСсСдсса аСссддсдас 240
аССсСсдСдд ССдсСсссас дСсдссССдС СсддасддСС асССсддСда асСссСддса 300
ассСсссСдс дддсдсасдд сдСсаддддд сСсдССаСсд аСдсаддССд ссдсдасдСС 360
сдсСсдсССа ссдадаСдаа дССссссдСс Сддадссдсд сСдСсадССс дсааддсасс 420
дСдаааСсса сСсСсддаСс ддСдааСдСд адсдСсдССС дсдссддадс асдсаСсдаа 480
дссддсдаСд СддСсдСсдс сдаСдасдаС ддсдСсдССд СддСддадсд адсасдсдсс 540
сасдаадСад СсдсСдсдСд сдаасаасдс аССсдсаадд аададдсаас Ссдсдадсдд 600
сСддсдсддд дадаасСсдд асСсдаСаСс СасддсССдс дсасаааааС сдсддадаСд 660
ддСсСсаадС аСсадСда 678 <210> 208 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргоз1Се ίά = Р300001 <400> 208
МеС 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 11е Агд С1п Уа1 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и ТНг Н13 С1у Уа1 Зег ТНг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг МеС Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у А1а А1а 11е А1а С1у Зег А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи МеС 11е Н1з Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Зег С1у Азр
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 Уа1 А1 а Рго ТНг Зег Рго Суз Зег Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
- 346 019971
Сби Ьеи Ьеи Аба 100 ТНг Зег Ьеи Агд Аба 105 Нбз Сбу Уаб Агд Сбу 110 Ьеи Уаб
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТНг Сби Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Зег ТНг
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Зег Уаб Уаб Суз Аба Сбу Аба Агд 11е Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб Уаб Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Сби
165 170 175
Агд Аба Агд Аба Нбз Сби Уаб Уаб Аба Аба Суз Сби Сбп Агд I бе Агд
180 185 190
Ьуз Сби Сби Аба ТНг Агд Сби Агд Ьеи Аба Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Сбу Ьеи Агд ТНг Ьуз 11е Аба Сби Меб Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Сбп
225 <210> 209 <21б> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 209 абдаабасас садбддбадб ссдасаддбд садсадссас садссдааас ддбддссдсд60 сбддадаадб дбддддбдас аасддбдсаб даддсбсадд дасдбдсбдд ссбдсббдсд620 бссбасабдс дсссдабсба сссдддадса дсдабсдсбд дббссдсбаб сасддбдбсб180 ббдссбсссд дсдасаассб сабдабссас дббдсддбдд аддбсбдсдд сссдддааас240 абссбддбад Шсассаас сбсдссббсб асддабддсб асббсддбда дсбдббддса300 асабсбсбсс дбдсссасдд бдбдададдд сббдбдабсд абдсбддабд ссдбдабдбд360 сдсбсбббаа садааабдаа аббссссдбс бддадссдсд ссабсааббс дсаддддаса420 дбсаадасса сасббддабс ддбдаабдбд сссабсдббб дсдсдддсдс асбддбсдас480 дсбддадабд бсабсдбсдс ддабдасдаб ддадббдбад ббдббаадса ддсдабддсд540 сдададдббд ссдсддсадс ддаасааадд дббсдсааад адаассбдас ссдсдаасда600 сббдсдсдсд дадаасббдд бсбсдасабб басдадабас дасаааадаб сдсдсаасба 660 ддасббаадб абббдбаа678 <210> 210 <211> 225 <212> БЕЛОК
- 347 019971 <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 210 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1п С1п Рго Рго А1а 15 С1и
Меб 1 Азп ТНг Рго Уа1 5
ТЬг Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд А1а С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг Рго
35 40 45
С1у А1а А1а Не А1а С1у Зег А1а Не ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1 у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1 у Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 Уа1 Зег Рго ТНг Зег Рго Зег ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд А1а Н1з С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1
100 105 но
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Азп Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз ТНг ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Не Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азр
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
С1п А1а Меб А1а Агд С1и Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп Ьеи ТНг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1и Не Агд С1п Ьуз Не А1а С1п Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 211 <211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
- 348 019971 <400> 211
дбдадсдссд бсабсаддаа саббссасдс бсдссдсссд адсбссбсда бсдсббсаад 60
ддссбсддсд ббдсдассдб сбсддаадсд садддссдса адддссбббб ддссссдбаб 120
абдсдсссда бсбабссддд ддссдсдсбд абсддсаабд сддбдасддс сбсддбсдсд 180
сссддсдаса аббддасдаб ссабдбсдсс дбсдаадбсб дссаддаадд сдасдсдсбс 240
дбсдбсдсдс ссассбссбб сбдсдаддас ддсбабббсд дсдадсбасб сдссасдбсб 300
сбдсадсадс дсддбдбдсд сдддсбсабб сбсдаадсад дсбдссдсда сдбдсдсдад 360
сббсааадда бдааббббсс ддбббддбсд сдсдсаабсб абдсдсаадд аасбдбдааа 420
дадасддбдд дсдасдбдаа ссбдссдсбс сдсбдсдсад дссадабсдб саабдссддс 480
дабсбсаббд бсдссдасда сдасддсдбб бдсдбсдбдс ссбабдссда бдбсдадаад 540
дбсббдаасд сддсссдсда асдбдсддсд ааддаадада ддаассдбдс сдадббсдсс 600
аадддсдбдс бсддссбсда ссбсбасааа бассдсдадс дссбсдссдс саадддссбс 660
ааабабббсд асдасабсда ддсдбабаад ааддсдаадб да 702
<210> 212 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 212
Меб 1 Зег АЬа УаЬ Не 5 Агд Азп Не Рго Агд 10 Зег Рго Рго СЬи Ьеи 15 Ьеи
Азр Агд РЬе Ьуз СЬу Ьеи СЬу УаЬ А1а ТЬг Уа1 Зег СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
Агд Ьуз СЬу Ьеи Ьеи АЬа Рго Туг Меб Агд Рго Не Туг Рго СЬу АЬа
35 40 45
АЬа Ьеи 11е С1у Азп АЬа УаЬ ТЬг А1а Зег УаЬ АЬа Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр ТЬг Ые НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬп СЬи СЬу Азр АЬа Ьеи
65 70 75 80
УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег РЬе Суз СЬи Азр СЬу Туг РЬе СЬу СЬи Ьеи
85 90 95
Ьеи АЬа ТЬг Зег Ьеи СЬп СЬп Агд СЬу УаЬ Агд СЬу Ьеи Не Ьеи СЬи
100 105 110
А1а СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд СЬи Ьеи СЬп Агд Меб Азп РЬе Рго УаЬ
115 120 125
- 349 019971
Тгр Зег Агд 130 А1а 11е Туг А1а 135 С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз 140 С1и ТЬг Уа1 С1у
Азр Уа1 Азп Ьеи Рго Ьеи Агд Суз А1а С1у С1п 11е Уа1 Азп А1а С1у
145 150 155 160
Азр Ьеи Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Рго Туг А1а
165 170 175
Азр Уа1 С1и Ьуз Уа1 Ьеи Азп А1а А1а Агд С1и Агд А1а А1а Ьуз С1и
180 185 190
С1и Агд Азп Агд А1а С1и РЬе А1а Ьуз С1у Уа1 Ьеи С1у Ьеи Азр Ьеи
195 200 205
Туг Ьуз Туг Агд С1и Агд Ьеи А1а А1а Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг РЬе Азр
210 215 220
Азр 11е С1и А1а Туг Ьуз Ьуз А1 а Ьуз
225 230
<210> 213 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 213 абдадсдббд бсабсасдаа даббасдсдд ссддасссса аасабдбдда дабдсбддсб 60
дсЬЬбсддбд бсдссассаб Ьсабдаддсд садддссдса ссддссбдаб дсадбссбас 120
абдсдссссд бсбабдссдд сдсссдбдсс дссддсасад ссдбсасддб сбсдсбдссс 180
сссдссдаса асбддабдаб ссабдбсдсс дбддадсадб дссдддаадд сдасаббсбс 240
дбсдбсдсдс ссасббсдсс сбссдабдбс дддбабббсд дсдадсбдсб ддсдассбсд 300
сбсдбсдссс дсддсдбссд сддссбсдбс аббдааддсд дсбдссдсда бдбсадддсд 360
сбдассдада бдсдсббссс ддбсбддбсд сдсдссаббб ссдсдсаддд сассдбсаад 420
дааасдсбсд дсбсддбдаа сдбдссдабс дбббдсдссд дсдсдсабаб ссабсссддс 480
дабЬбсаббд ссдссдасда сдабддсдбб дбсдЬддбдс дссдсадссд сдбсдссдад 540
абсдссдссд ссдсдабддс дсдсдаадас ааддааасаа ссдбссдсда дсдссбдааа 600
дссддададс ббддссбсда сабббасдда абдсдсссдс дбсбсаадда ааадддссбс 660
дбсбддсдсд адасдссдда дааддадбад 690
<210> 214 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 350 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 214
Мер 1 Зег Уаб Уаб Не 5 ТЬг Ьуз ббе ТЬг Агд 10 Рго Азр Рго Ьуз Нбз 15 Уаб
Сби Мер Ьей Аба Аба РЬе Сбу Уаб Аба ТЬг 11е Нбз Сби Аба Сбп Сбу
20 25 30
Агд ТЬг Сбу Ьей Мер Сбп Зег Туг Мер Агд Рго Уаб Туг Аба Сбу Аба
35 40 45
Агд А1а Аба Сбу ТЬг Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Ьей Рго Рго Аба Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е Нбз Уаб Аба Уаб Сби Сбп Суз Агд Сби Сбу Азр 11е Ьей
65 70 75 80
Уаб Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Зег Азр Уаб Сбу Туг РЬе Сбу Сби Ьей
85 90 95
Ьей Аба ТЬг Зег Ьей Уаб Аба Агд Сбу Уаб Агд Сбу Ьей Уаб 11е Сби
100 105 110
Сбу Обу Суз Агд Азр Уаб Агд Аба Ьей ТЬг Сби МеР Агд РЬе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Агд Аба ббе Зег Аба Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Сби ТЬг Ьей Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Рго ббе Уаб Суз Аба Сбу Аба Нбз ббе Нбз Рго Сбу
145 150 155 160
Азр РЬе 11е Аба Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Агд Агд Зег
165 170 175
Агд Уаб Аба Сби ббе Аба Аба Аба Аба Мер Аба Агд Сби Азр Ьуз Сби
180 185 190
ТЬг ТЬг Уаб Агд Сби Агд Ьей Ьуз А1а Сбу Сби Ьей Сбу Ьей Азр 11е
195 200 205
Туг Сбу Мер Агд Рго Агд Ьей Ьуз Сби Ьуз Сбу Ьей Уаб Тгр Агд Сби
210 215 220
ТЬг Рго Сби Ьуз Сби
225 <210> 215 <211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 215
дрдадсдссд РсаРсаддаа саРРссасдс ЪсдссдсЪсд адсбссбсда РсдсРРсаад 60
ддссРсддсд РРдсдассдР сРсддаадсд садддссдса адддссРРРР ддссРсдРаР 120
- 351 019971
абдсдсссда бсбабссддд ддссдсдсбд абсддсаабд сддбдасддс сбсддбсдсд 180
сссддсдаса аббддасдаб ссабдбсдсс дбсдаадбсб дссаддаадд сдасдсдсбс 240
дбсдбсдсдс ссассбссбб сбдсдаддас ддсбабббсд дсдадсбасб сдссасдбсб 300
сбдсадсадс дсддбдбдсд сдддсбсабб сбсдаадсад дсбдссдсда сдбдсдсдад 360
сббсааадда бдааббббсс ддбббддбсд сдсдсаабсб абдсдсаадд аасбдбдааа 420
дадасддбдд дсдасдбдаа ссбдссдсбс сдсбдсдсад дссадабсдб саабдссддс 480
дабсбсаббд бсдссдасда сдасддсдбб бдсдбсдбдс ссбабдссда бдбсдадаад 540
дбсббдаасд сддсссдсда асдбдсддсд ааддаадада ддаассдбдс сдадббсдсс 600
аадддсдбдс бсддссбсда ссбсбасааа бассдсдадс дссбсдссдс саадддссбс 660
ааабабббсд асдасабсда ддсдбабаад ааддсдаадб да 702
<210> 216 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 216 Уа1 11е 5 Агд Азп 11е Рго Агд 10 Бег Рго Ьеи С1и Ьеи 15 Ьеи
Меб 1 Бег А1а
Азр Агд РНе Ьуз С1у Ьеи С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Бег С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи А1а Бег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго С1у А1а
35 40 45
А1а Ьеи 11е С1у Азп А1а Уа1 ТНг А1а Бег Уа1 А1а Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр ТНг 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п С1и С1у Азр А1а Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Бег РНе Суз С1и Азр С1у Туг РНе С1у С1и Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТНг Бег Ьеи С1п С1п Агд С1у Уа1 Агд С1у Ьеи 11е Ьеи С1и
100 105 110
А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд С1и Ьеи С1п Агд Меб Азп РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Бег Агд А1а Не Туг А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг Уа1 С1у
130 135 140
Азр Уа1 Азп Ьеи Рго Ьеи Агд Суз А1а С1у С1п 11е Уа1 Азп А1а С1у
145 150 155 160
- 352 019971
Азр Леи 11е Уа1 А1а 165 Азр Азр Азр С1у Уа1 170 Суз Уа1 Уа1 Рго Туг 175 А1а
Азр Уа1 С1и Ьуз Уа1 Ьей Азп А1а А1а Агд С1и Агд А1а А1а Ьуз С1и
180 185 190
С1и Агд Азп Агд А1а С1и РЬе А1а Ьуз С1у Уа1 Ьей С1у Ьей Азр Ьей
195 200 205
Туг Ьуз Туг Агд С1и Агд Ьей А1а А1а Ьуз С1у Ьей Ьуз Туг РЬе Азр
210 215 220
Азр Не С1и А1а Туг Ьуз Ьуз А1а Ьуз
225 230 <210> 217 <211> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 217 дЕдадсдЬдд ЬсаЕссдааа саЬЬссдсдс асдссдсбсд сдсЬдсЕдда садЕЕЬсааа 60
дддЬЕсддсд ЬЕдсдасдаЕ сбсддаддсд садддссдса адддссЕсаб ддсЕЬсЬЕаЕ 120
абдсдЬссда ЬЕЕаЕссддд адсЕдадсЬЕ дЬсддсаабд сддбдасддс сЬсддбсдсд 180
сссддсдаса аЛЕддасдаб ссаЬдбсдсд аЕсдаадЬсЕ дссаддаадд ЕдаЬдЕдсЬс 240
дЬддбсдсдс сЕдссЕсдЕЕ ЕЬдсдаддаЕ ддсЕаЬЕЬсд дсдадсЬЕсЕ сдсдасЕЕсд 300
сЕЕсадсадс дсддсдбдсд сдддсЕсаЕЕ сбсдаадссд дсЬдссдсда сдбасдсдсд 360
сЕЕсадаада ЕдааЕЕЕЕсс ддЬЕЕддЬсд сдсдсдаЬЕЕ Есдсасаадд аассдбдааа 420
дадасддбсд дсдасдбсаа ссЕдссдсЕс сасбдсдсдд дссадабсдЬ дсабддсддс 480
даЕсЕсаЬсд ЕсдссдаЕда ЕдасддсдЕс ЬдсдЬсдЕдс сдсабассда ЬдЕсдадаад 540
дЬсЕЕдадсд сддсдсдсда асдсдсддсд ааддаддадс дааассдсдс сдадЕЕЕдсс 600
аадддсдбдс ЕсддссЕсда ссЕсЕасааа Еассдсдадс дссЬсдсЕса ааадддссбс 660
аадЬаЕЕасд асдасабсда адссЕаЬаас ааадсдаадб да 702
<210> 218 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 218
- 353 019971
Мер 1 Зег УаЬ УаЬ Не 5 Агд Азп 11е Рго Агд 10 ТЬг Рго Ьеи АЬа Ьеи 15 Ьеи
Азр Зег РЬе Ьуз СЬу РЬе СЬу УаЬ А1а ТЬг 11е Зег СЬи А1а СЬп СЬу
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Мер АЬа Зег Туг Мер Агд Рго 11е Туг Рго СЬу А1а
35 40 45
С1и Ьеи УаЬ СЬу Азп АЬа УаЬ ТЬг А1а Зег УаЬ А1а Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр ТЬг 11е Н13 УаЬ АЬа 11е СЬи УаЬ Суз СЬп СЬи С1у Азр УаЬ Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго А1а Зег РЬе Суз СЬи Азр СЬу Туг РЬе СЬу СЬи Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи СЬп СЬп Агд СЬу УаЬ Агд СЬу Ьеи 11е Ьеи СЬи
100 105 110
А1а СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд А1а Ьеи СЬп Ьуз Мер Азп РЬе Рго УаЬ
115 120 125
Тгр Зег Агд АЬа 11е РЬе А1а С1п СЬу ТЬг УаЬ Ьуз С1и ТЬг УаЬ СЬу
130 135 140
Азр УаЬ Азп Ьеи Рго Ьеи НЬз Суз А1а СЬу С1п 1Ье УаЬ НЬз СЬу СЬу
145 150 155 160
Азр Ьеи 11е УаЬ АЬа Азр Азр Азр С1у УаЬ Суз УаЬ УаЬ Рго НЬз ТЬг
165 170 175
Азр УаЬ СЬи Ьуз УаЬ Ьеи Зег А1а А1а Агд СЬи Агд АЬ а А1а Ьуз СЬи
180 185 190
С1и Агд Азп Агд АЬа СЬи РЬе АЬа Ьуз СЬу УаЬ Ьеи СЬу Ьеи Азр Ьеи
195 200 205
Туг Ьуз Туг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа СЬп Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Туг Туг Азр
210 215 220
Азр 11е СЬи А1а Туг Азп Ьуз АЬа Ьуз
225 230 <210> 219 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 219
ардадсдрдд РсдРдсадаа саРсдаасдс дссдасдсдр саРРРдРддс аасдсРсддс 60
дадрдсддсд РддсдассдР дсасдаддсд сааддРсдаа сРддсРРдаР дсдсссРРас 120
аРдсдассда РсРасдссдд сдсссдсаРс дссддассдд сддрдасддр дРсдаРсссд 180
сссддсдаса асРддаРдаР ссасдРсдсд дрсдадсадр дссдсдаддд сдаРаРссРс 240
дрсдрддссс сдассадссс дадсдаддас ддсРаРРРсд дсдадРРдсР ддсдсдсРсд 300
- 354 019971
сРдсРсдсдс дсддсдрдад дддРсРРдРс аРсдаддссд дсд^ссдсда сдРасдсдаР 360
сРсассдада РсаадРРссс сдРаРддРсс ааадсдаРаР сддсдсаадд сасддрдаад 420
дадасдаРсд дсРсддРдаа РдРдссддРс дРаРдРдссд дсдссдсса£ сааРсссддс 480
даРдРсаРад РсдсРдасда сдасддРдРс РдсдРсдРдР сасдсдаасд ддсддаадас 540
дрсдссаадд ссдсдсдсдс ссдсдаадсс ааддаадсдд ааасдсдсаа дсддсРдаРа 600
Рсаддсдадс РсддссРсда РаРсРасддс аРдсдсдада адс^сдсддс даааддссРс 660
аааРаРдссР да 672 <210> 220 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 220
МеР 1 Зег \7а1 Уа1 \7а1 5 С1п Азп Не С1и Агд 10 А1а Азр А1а Зег РНе 15 Уа1
А1а ТИг Ьеи С1у С1и Суз С1у Уа1 А1а ТИг Уа1 Нтз С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд ТИг С1у Ьеи Мер Агд Рго Туг Мер Агд Рго 11е Туг А1а С1у А1а
35 40 45
Агд 11е А1а <31 у Рго А1а Уа1 ТИг Уа1 Зег 11е Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр МеР 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и С1п Суз Агд С1и С1у Азр 11е Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Уа1 А1а Рго ТИг Зег Рго Зег С1и Азр С1у Туг РНе С1у С1и Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а Агд Зег Ьеи Ьеи А1а Агд С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1 11е С1и
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр \7а1 Агд Азр Ьеи ТНг С1и 11е Ьуз РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а 11е Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг 11е С1у
130 135 140
Зег \7а1 Азп \7а1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а 11е Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 \7а1 Зег Агд С1и
165 170 175
Агд А1а С1и Азр Уа1 А1а Ьуз А1а А1а Агд А1а Агд С1и А1а Ьуз С1и
180 185 190
- 355 019971
АЬа СЬи ТНг Агд Ьуз Агд Ьеи Не Зег СЬу СЬи Ьеи С1у Ьеи 205 . Азр 11е
195 200
Туг СЬу Меб 210 Агд С1и Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз С1у 215 Ьеи Ьуз Туг 220 А1а
<210> 221 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 221 абдадсдбдд бсдбдсадаа сабсдаасдс дссдасдсдб сббббдбддс аасдсбсддс 60
дадбдсддсд бддсдассдб дсасдаддсд сааддбсдаа ссддсббдаб дсдссссбас 120
абдсдассда бсбасдссдд сдсссдсабс дссдддссдд сддбдасддб дбсдабссса 180
сссддсдаса асбддабдаб ссасдбсдсд дбсдадсааб дссдсдасдд бдасабссбд 240
дбсдбсдсдс сдассадссс дадсдаддас ддсбабббсд дсдадббдсб ддсдсдсбсд 300
сббсбсдсдс дбддсдбдад аддссбсдбс абсдаддссд дсдбссдсда сдбдсдсдас 360
сббассдааа бсддабббсс сдбсбддбсд ааддсдабсб ссдсасаадд сассдбсаад 420
дадасдсбсд дсббддбдаа сдбдссддбб дбсбдсдссд дсдсбасддб саасссдддс 480
дабдбсабсд бсдсддасда сдасддбдбд бдсдбддбдс сасдсддсаа бдссдаадад 540
дбсдсдаадд ссдсссдсдс ссдсдаддса ааддаддсдд адасдадсаа дсддббдаба 600
дсаддбдадс бсддссбсда сабсбасддс абдсдсдада адсбддсддс саадддссбс 660
ааабабдбсб да 672
<210> 222 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 222
Меб 1 Зег УаЬ УаЬ УаЬ 5 СЬп Азп Не СЬи Агд 10 АЬа Азр АЬа Зег РЬе 15 УаЬ
А1а ТЬг Ьеи СЬу СЬи Суз СЬу УаЬ А1а ТНг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
Агд ТНг СЬу Ьеи Меб Агд Рго Туг Меб Агд Рго Ые Туг АЬа СЬу АЬа
35 40 45
Агд Не А1а СЬу Рго АЬа УаЬ ТНг УаЬ Зег Не Рго Рго СЬу Азр Азп
- 356 019971
50 55
Тгр 65 Меб 11е Нбз Уаб А1а 70 Уа1 Сби
Уаб Уа1 А1а Рго ТНг 85 Зег Рго Зег
Ьеи Аба Агд Зег 100 Ьеи Ьеи А1а Агд
А1а Сбу Уа1 115 Агд Азр Уаб Агд Азр 120
Тгр Зег 130 Ьуз А1а Не Зег Аба 135 Сбп
Ьеи 145 Уаб Азп Уаб Рго Уа1 150 Уа1 Суз
Азр Уа1 11е Уаб А1а 165 Азр Азр Азр
Азп А1а Сби С1и 180 Уаб А1а Ьуз Аба
Аба Сби ТНг 195 Зег Ьуз Агд Ьеи 11е 200
Туг Сбу 210 Меб Агд Сби Ьуз Ьеи 215 Аба
60
Сбп Суз Агд 75 Азр С1у Азр 11е Ьеи 80
Сби Азр 90 С1у Туг РНе Сбу Сби 95 Ьеи
Сбу 105 Уаб Агд С1у Ьеи Уаб 110 11е Сби
Ьеи ТНг Сби 11е Сбу 125 РНе Рго Уаб
Сбу ТНг Уаб Ьуз 140 Сби ТНг Ьеи С1у
Аба Сбу Аба 155 ТНг Уаб Азп Рго Сбу 160
Сбу Уаб 170 Суз Уаб Уаб Рго Агд 175 С1у
Аба 185 Агд Аба Агд Сби А1а 190 Ьуз Сби
Аба С1у Сби Ьеи Сбу 205 Ьеи Азр 11е
Аба Ьуз С1у Ьеи 220 Ьуз Туг Уа1
<210> 223 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 223
абдаасдадс сдабсдбсдб бсддасдабс дсдсддссдб сддссдаддс дабсдсддсд 60
сбдсадсддб асддсдбдбс дасбдбдсаб даадсдсаад дасдасдсдд асбдсбсддд 120
бсбсдсббдс дассдабсба садсддсдсд дсдабсдссд дбссадсддб сассдбббсд 180
сбдссдссбд дбдасаассб сабдаббсас дбсдссдбсд аддбдбдсса дссбддсдас 240
дбдсбсдбсд бддссссдас сбсссссбдс асддасддсб абббсддбда асбдббддсс 300
асдбсдбббс дсдсасдсдд сдбсдбсддс сбдабсабсд абдссддсбд ссдсдасдбд 360
сдсдсдббдб сддадабдсд сбббсссдбс бддадссдсд сдабсадсдс дсадддбасд 420
дбдааддссб сдббдддббс ддбдаасдбб дссдбсдбдб дбдддддадс дбссдбсааб 480
ссаддсдабд сдабсдбддс сдасдабдаб ддддбддбдд бсдбддсдсд саасдаддбд 540
даадсддбдд бдсаддсдбс ддадсадсдс абссддаадд аасаддсдас дсдсдадсдд 600
сбддсдадсд дбдаасбддд ссбсдабабс басддссбса ддаааааддб дбсддассбс 660
- 357 019971 дддсбдаааб аббсдбда 678 <210> 224 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 224
Меб 1 Азп С1и Рго Не 5 Уа1 \7а1 Агд ТЬг 11е 10 А1а Агд Рго Зег А1а 15 С1и
А1а 11е А1а А1а Ьеи С1п Агд Туг С1у Уа1 Зег ТНг Уа1 ΗΪ3 С1и А1а
20 25 30
<31п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи С1у Зег Агд Ьеи Агд Рго 11е Туг Зег
35 40 45
<31у А1а А1а 11е А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго <31 у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е Н1з Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз <31п Рго <31 у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 \7а1 А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТЬг Азр <31у Туг РЬе С1у
85 90 95
<31и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег РНе Агд А1а Агд С1у Уа1 Уа1 <31у Ьеи 11е
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи Зег С1и Меб Агд РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а 11е Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а Зег
130 135 140
Ьеи С1у Зег \7а1 Азп Уа1 А1а Уа1 Уа1 Суз <31у С1у А1а Зег Уа1 Азп
145 150 155 160
Рго <31 у Азр А1а 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1 у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 А1а
165 170 175
Агд Азп С1и \7а1 С1и А1а Уа1 Уа1 С1п А1а Зег С1и <31п Агд 11е Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1п А1а ТЬг Агд <31и Агд Ьеи А1а Зег <31 у <31и Ьеи (31у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз Уа1 Зег Азр Ьеи <31у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Зег
225 <210> 225
- 358 019971 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 225
абдаасдббд бсдбссддаа бабсдадсдд дссдсбдсдд абасдабсдс сдбдсббддс 60
даабдсддсд бсдсдасддб дсасдаддса садддссдса дсддссбсаб дсдбсссбаб 120
абдсдассда бсбабасддд сдсдсдсабс дссддсбсдд сддбсасбдб дбсддбсссд 180
ссдддсдаса асбддабдаб ссабдбсдсд дбсдаасааб дссасдасдд сдасдбссбс 240
дбсдбддсдс сдассадссс абдсдабдас ддсбабббсд дсдадсббсб ддсдсдсбсд 300
сбдсдддсдс асддсдбдад аддссбсдбд абсдаддсад дсдбдсдсда сдбдсдсдаб 360
сбсассдада бдсадббссс ддбсбддбсд ааабсдабсб ссдсдсаадд дасддбдаад 420
дадасдабсд дсбсддбдаа сдбдссддбс дбсбдсдсдд дбдссдссдб саабссдддс 480
дасдбсабсд бддссдасда сдабддсдбс бдсдббдбас сдсдаддсса ддсддсадбс 540
дббдссдадд сддсасдсдс дсдсдаддсд ааддаддссд аддбссдсаа дсдссбддбб 600
дссддддадс бсддбсбсда сабсбасддс абдсдсдаас ддсбддсддс даадддссбд 660
аадбабдбсб да 672
<210> 226 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...(172) <223> Диметилменахинонметилтран :фераза
<400> 226 Агд Азп 11е
Меб 1 Азп Уа1 Уа1 Уа1 5
А1а УаЬ Ьеи С1у 20 С1и Суз С1у Уа1
Агд Зег С1у 35 Ьеи Меб Агд Рго Туг 40
Агд 11е 50 А1а С1у Зег А1а УаЬ 55 ТЬг
Тгр 65 Меб 11е Н13 Уа1 А1а 70 Уа1 С1и
Уа1 УаЬ А1а Рго ТЬг 85 Зег Рго Суз
С1и Агд 10 А1а А1а АЬа Азр ТЬг 15 ЬЬе
АЬа 25 ТЬг УаЬ НЬз СЬи А1а 30 СЬп СЬу
Меб Агд Рго ЬЬе Туг 45 ТЬг С1 у А1а
Уа1 Зег УаЬ Рго 60 Рго СЬу Азр Азп
С1п Суз НЬз 75 Азр СЬу Азр УаЬ Ьеи 80
Азр Азр 90 СЬу Туг РЬе СЬу СЬи 95 Ьеи
- 359 019971
Ьеи Аба Агд Зег 100 Ьеи Агд Аба Нбз Сбу 105 Уаб Агд Сбу Ьеи Уаб 110 ббе Сби
Аба Сбу Уаб Агд Азр Уаб Агд Азр Ьеи ТНг Сби Меб Сбп РНе Рго Уаб
115 120 125
Тгр Зег Ьуз Зег ббе Зег Аба Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Сби ТНг ббе Сбу
130 135 140
Зег Уаб Азп Уаб Рго Уаб Уаб Суз Аба Сбу Аба Аба Уаб Азп Рго Сбу
145 150 155 160
Азр Уаб ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Суз Уаб Уаб Рго Агд Сбу
165 170 175
Сбп Аба Аба Уаб Уаб Аба Сби Аба Аба Агд Аба Агд Сби Аба Ьуз Сби
180 185 190
Аба Сби Уаб Агд Ьуз Агд Ьеи Уаб Аба Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи Азр ббе
195 200 205
Туг Сбу Меб Агд Сби Агд Ьеи Аба Аба Ьуз Сбу Ьеи Ьуз Туг Уаб
210 215 220 <210> 227 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 227
абдаасаадс ссдбддббдб дсддаасабс дадсдбссдс сддсддабдс бдбддссдсд 60
сббдадаааб асддсдбдбс дасддбдсас даддсссадд дссддаасдд ссбасбддсс 120
бссбабабдс дсссдабсба бдсаддадсс дсдабсдсбд дассадссдб сасадбббсс 180
сбсссдссдд дадасаассб дабдаббсас дбсдссдбсд аддбсбдбсд дссбддддаб 240
дбссбсдббд ббдсдссдас абсдссабдс ассдасддсб аббббддада дббдсббдса 300
асббсдсбсд сддсдсабдд ддбдаааддс ббадбсаббд аддсдддабд бсдсдасдбс 360
сдадсбсбда сддааабдаа дбббссадбс бддадссдсд ссдбсадсбс дсааддаасд 420
дбдааддсаа сасббдддбс ддбааабдба асдаббдббб дбдсдддбдс бдсддббдса 480
сссддбдабд бдабсдбддс ддасдабдаб ддсдбсдббд бсдбдааасд дасададдсд 540
саададдбсд ббассдсабс бдадсадада ббдсдааадд аададддаас ссдсаадсдд 600
сббдсббсдд дддаасбсдд ссбддабабб басддссбдс дассдаадаб бдсадассбс 660
ддбсбсаадб асббдбад 678
<210> 228 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
360 019971 <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозбРе ίά = Р300001
<400> 228
Мер 1 Азп Ьуз Рго Уаб 5 Уаб Уаб Агд Азп 11е 10 Сби Агд Рго Рго Аба 15 Азр
Аба Уаб Аба Аба Леи Сби Ьуз Туг Сбу Уаб Зег ТЬг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Азп Сбу Леи Леи Аба Зег Туг Мер Агд Рго 11е Туг Аба
35 40 45
Сбу Аба Аба 11е Аба Сбу Рго Аба Уаб ТЬг Уаб Зег Леи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Леи Мер 11е Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Агд Рго Сбу Азр
65 70 75 80
Уаб Деи Уаб Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Леи Леи Аба ТЬг Зег Леи Аба Аба Нбз Сбу Уаб Ьуз Сбу Леи Уаб
100 105 110
ббе Сби Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Аба Леи ТЬг Сби Мер Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Аба ТЬг
130 135 140
Леи Сбу Зег Уаб Азп Уаб ТЬг 11е Уаб Суз Аба Сбу Аба Аба Уаб Аба
145 150 155 160
Рго Сбу Азр Уаб 11е Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд ТЬг Сби Аба Сбп Сби Уаб Уаб ТЬг Аба Зег Сби Сбп Агд Леи Агд
180 185 190
Дуз Сби Сби Сбу ТЬг Агд Ьуз Агд Леи Аба Зег Сбу Сби Леи Сбу Леи
195 200 205
Азр Не Туг Сбу Деи Агд Рго Ьуз 11е Аба Азр Леи Сбу Леи Ьуз Туг
210 215 220
Деи
225 <210> 229 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 361 019971
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 229
аСдаасаадс ссдСддССдС дсддаасаСс дадсдСссдс сддсддаСдс СдСддссдсд 60
сССдадаааС асддсдСдСс дасддСдсас даддсссадд дссддаасдд ссСасСддсс 120
СссСаСаСдс дсссдаСсСа Сдсаддадсс дсдаСсдсСд дассадссдС сасадСССсс 180
сСсссдссдд дадасаассС даСдаССсас дСсдссдСсд аддСсСдСсд дссСддддаС 240
дСссСсдССд ССдсдссдас аСсдссаСдс ассдасддсС аССССддада дССдсССдса 300
асССсдсСсд сддсдсаСдд ддСдаааддс ССадСсаССд аддсдддаСд СсдсдасдСс 360
сдадсСсСда сддаааСдаа дСССссадСс Сддадссдсд ссдСсадсСс дсааддаасд 420
дСдааддсаа сасССдддСс ддСаааСдСа асдаССдССС дСдсдддСдс СдсддССдса 480
сссддСдаСд СдаСсдСддс ддасдаСдаС ддсдСсдССд СсдСдааасд дасададдсд 540
саададдссд ССассдсаСс Сдадсадада ССдсдааадд аададддаас ссдсаадсдд 600
сССдсССсдд дддаасСсдд ссСддаСаСС СасддссСдс дассдаадаС СдсадассСс 660
ддСсСсаадС асССдСад 678
<210> 230 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151) ... (154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬСе ίά = Р300001 <400> 230
МеС 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 УаЬ Агд Азп Не 10 С1и Агд Рго Рго АЬа 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг СЬу Уа1 Зег ТНг Уа1 НЬз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Азп С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг МеС Агд Рго 11е Туг А1а
35 40 45
С1у А1а А1а 11е АЬа СЬу Рго АЬа УаЬ ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи МеС 11е НЬз Уа1 АЬа УаЬ С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
- 362 019971
90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а 100 ТЬг Зег Ьеи А1а А1а 105 Н13 С1у Уа1 Ьуз С1у 110 Ьеи Уа1
11е С1и А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг С1и МеЬ Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег \7а1 Азп Уа1 ТЬг Не Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 А1а
145 150 155 160
Рго С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд ТЬг С1и А1а С1п С1и А1а Уа1 ТЬг А1а Зег С1и С1п Агд Ьеи Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и С1у ТЬг Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Зег С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Рго Ьуз 11е А1а Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 231 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 231 аЬдаабдаас сддЬддбааЬ ссддсаддбд дадсадссас садсадасдс адЬЬдссдса60
ЬЬддадаааб дбддсдбдас аассдбссаб даадсбсаад дасдЬЬдбдд ссбдсЫтдсд120 сасбасабдс дбсссаЬЬЬЬ сссдддадса ассабсдсдд дЬЬссдссдб сассдЬдбсЬ180 сбдссбсссд дбдасаассЬ сабдабссас дЬЬдсддбсд аадбсЬдсад дссдддааас240 абссЬддЬсд ЬЬЬсассдас абсдссдбдс ЬсддабддсЬ асббсддсда дсбаЬЬддса300 асЬСсбсЬдс дбдсбсасдд Ьдбаададдд сЬЬдЬдабсд асдссддабд садддасдбс360 сдсбсдсбда сбдадабдаа аЬЬЬсссдбс Ьддадссдсд ссабсадЬЬс дсадддбасс420 дбсааадсса сдсбсддабс ддЬдааЬдбд ссдабсасдЬ дсдсдддсдс дббадЬсдас480 дсаддЬдабд ЬсаЬЬдЬсдс ЬдасдабдаЬ ддадЬЬдбдд ЬЬдбдаадсд сдсдсаддсд540 саададдбсд сбдссдсддс ддадсааадд дббсдсааад адаасдсдас ссдсдаасда600 сЬЬдсасдбд дададсбадд асЬсдаТаЬГ ЬасдасаЬдс дссадаадаб сдсдсаасбд 660 ддссЬЬаадб абсддЬда678
- 363 019971 <210> 232 · <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 232 Уа1 Не Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
Меб 1 Азп С1и Рго Уа1 5
А1а Уа1 А1а А1а Деи С1и Дуз Суз С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Н13 С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Деи Деи А1а Нтз Туг Меб Агд Рго Не РНе Рго
35 40 45
С1у А1а ТНг Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Деи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Деи Меб 11е Н13 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Деи Уа1 Уа1 Зег Рго ТНг Зег Рго Суз Зег Азр С1у Туг РНе <31 у
85 90 95
С1и Деи Деи А1а ТНг Зег Деи Агд А1а Нтз С1у Уа1 Агд С1у Деи Уа1
100 105 но
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Деи ТНг С1и Меб Дуз РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Дуз А1а ТНг
130 135 140
Деи С1у Зег \7а1 Азп Уа1 Рго Не ТНг Суз А1а С1у А1а Деи Уа1 Азр
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Дуз
165 170 175
Агд А1а С1п А1а С1п С1и Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Дуз С1и Азп А1а ТНг Агд С1и Агд Леи А1а Агд С1у С1и Деи С1у Деи
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд С1п Дуз Не А1а С1п Деи С1у Деи Дуз Туг
210 215 220
Агд
225 <210> 233 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 364 019971
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 233 абдаасааас сддбддбдаб ссддсаадбд дадсддссдс сддсбдасдс ддбддсддсд 60
сбсдааассб абддсдбдбс сассдбдсас даддсссадд ддсдббдсдд дсбдсбсдсб 120
бссбасабдс ддссдаббба бддсддсдсс сбдаббдссд ддбсддсддб сасддбдбса 180
сббссдсссд дсдабаабсб дабдаббсас дббдссдбдд аддбсбдсса абссддсдас 240
аббсбсдбдд ббдсбсссас дбсдссббдб бсддасддбб асббсддбда асббсбддса 300
ассбсссбдс дддсасасдд сдбсаадддд сбсдбдаббд абдсдддббд ссдсдасдбб 360
сддбсдсбба ссдааабдаа дббссссдбс бддадссдсд сбдбсадббс дсааддаасс 420
дбдааабсда сбсбсддабс ддбдаабдба адсдбсдббб дсдссддадс асдсабсдаа 480
дссддсдабд бддбсдбсдс ддабдасдаб ддсдбсдбдд бддбддсдсд ддсасдсдсс 540
сасдаадбад бсдсддсдбд сдаасаасдс аббсдсаадд аададдсаас ссдсдаасдд 600
сбддсдсддд дадаасбсдд асбсдабабс басддсббдс дсасаааааб сдсддадабд 660
ддбсбсдадб абсаабда 678
<210> 234 <2Ы> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬбе ίά = Р300001 <400> 234
Меб 1 Азп Дуз Рго УаЬ 5 УаЬ Не Агд СЬп УаЬ 10 СЬи Агд Рго Рго АЬа 15 Азр
А1а УаЬ АЬа АЬа Деи СЬи ТЬг Туг СЬу УаЬ Зег ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
СЬп СЬу Агд Суз СЬу Деи Ьеи АЬа Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг СЬу
35 40 45
СЬу АЬа Деи Ые АЬа СЬу Зег АЬа УаЬ ТЬг УаЬ Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Деи Меб 11е НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬп Зег СЬу Азр
65 70 75 80
11е Деи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Рго Суз Зег Азр СЬу Туг РЬе СЬу
- 365 019971
85
СЬи Ьеи Ьеи АЬа 100 ТЬг Зег Ьеи Агд
Не Азр АЬа 115 СЬу Суз Агд Азр УаЬ 120
Рго УаЬ 130 Тгр Зег Агд АЬа УаЬ 135 Зег
Ьеи 145 СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ 150 Зег УаЬ
АЬа СЬу Азр УаЬ УаЬ 165 УаЬ АЬа Азр
Агд АЬа Агд АЬа 180 НЬз СЬи УаЬ УаЬ
Ьуз СЬи СЬи 195 АЬа ТЬг Агд СЬи Агд 200
Азр Не 210 Туг СЬу Ьеи Агд ТЬг 215 Ьуз
90 95
АЬа 105 НЬз СЬу УаЬ Ьуз СЬу 110 Ьеи УаЬ
Агд Зег Ьеи ТЬг СЬи 125 Меб Ьуз РЬе
Зег СЬп СЬу ТЬг 140 УаЬ Ьуз Зег ТЬг
УаЬ Суз АЬа 155 СЬу АЬа Агд Ые СЬи 160
Азр Азр 170 СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ 175 АЬа
АЬа 185 АЬа Суз СЬи СЬп Агд 190 Ые Агд
Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи 205 Ьеи СЬу Ьеи
Не АЬа СЬи Меб 220 СЬу Ьеи СЬи Туг
СЬп
225 <210> 235 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 235
абдаабдаас сддбддбааб ссддсаддбд дадсадссас садсадасдс адббдссдса 60
ббддадаааб дбддсдбдас аассдбссаб даадсбсаад дасдббдбдд ссбдсббдсд 120
сасбасабдс дбсссабббб сссдддадса ассабсдсдд дббссдссдб сассдбдбсб 180
сбдссбсссд дбдасаассб сабдабссас дббдсддбсд аадбсбдсад дссдддааас 240
абссбддбсд бббсассдас абсдссдбдс бсддабддсб асббсддсда дсбаббддса 300
асббсбсбдс абдсбсасдд бдбаададдд сббдбдабсд асдссддабд садддасдбс 360
сдсбсдсбда сбдадабдаа абббсссдбс бддадссдсд ссабсадббс дсадддбасс 420
дбсааадсса сдсбсддабс ддбдаабдбд ссдабсасдб дсдсдддсдс дббадбсдас 480
дсаддбдаба бсаббдбсдс бдасдабдаб ддадббдбдд ббдбдаадсд сдсдсаддсд 540
саададдбсд сбдссдсддс ддадсааадд дббсдсааад адаасдсдас ссдсдаасда 600
сббдсасдбд дададсбадд асбсдабабб басдасабдс дссадаадаб сдсасаасбд 660
ддссббаадб абсддбда 678
- 366 019971 <210> 236 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 236 Не Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
Меб 1 Азп С1и Рго Уа1 5 Уа1
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Уа1 ТЬг ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Нтз Туг Меб Агд Рго 11е РЬе Рго
35 40 45
С1у А1а ТЬг Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Н13 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 Уа1 Зег Рго ТЬг Зег Рго Суз Зег Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Н1з А1а Нтз С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1
100 105 110
11е Азр А1 а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго \7а1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е ТЬг Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азр
145 150 155 160
А1а С1у Азр Не Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а С1п А1а С1п С1и Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп А1а ТЬг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд С1п Ьуз Не А1а С1п Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Агд
225 <210> 237 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 367 019971 <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 237 абдаасаадс ссдбддбддб ссддсасдбд дадсадссас сбдсбдабдс ддбадссдсб60 ббддаааадб абддсдбдбс аассдббсаб даддсссадд дасддбсддд бсббсбсдсс120 адббассбдс ддссдабсбб бдссддсдсс бсаабсдсад ддссддсддб басддбсбсд180 сбдссассбд дддасааббб дабдабссас дбсдссдбсд аддбдбдсас дссбддаадс240 абссббдбсд бсдссссаас сбссссббдб асддасддсб абббсддада дсбдсбддсд300 ассбсдсббс дсдсасасдд сдбааадддд ббддбсабсд абдссдддбд бсдсдасдбб360 аддбсбббаа сддааабдаа сбббсссдбб бддадссдсб сддбсадббс дсааддаасс420 дбсааадсда сдббдддабс ддбдаабдба ддсдбсдбсб дсдссддбдс абасдбсдад480 ссаддсдасд бдабсдбсдс ддасдабдас ддадббдбад бсдбдаадсд ддсддсбдсд540 сссдаддсбд бсдбсдссбс сдаадсдада дббсдбааад аадссдсдас дсдсдадсдб600 сбсбсссдсд дададсббдд ссббдасабс басддссбас дбРсааадаб Рдсддассбб 660 ддссбсдадб абсбдбда678 <210> 238 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 238
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 УаЬ УаЬ Агд НЬз Уа1 10 СЬи С1п Рго Рго А1а 15 Азр
А1а УаЬ А1а А1а Ьеи СЬи Ьуз Туг С1у Уа1 Бег ТЬг УаЬ НЬз С1и А1а
20 25 30
С1п СЬу Агд Бег СЬу Ьеи Ьеи АЬа Бег Туг Ьеи Агд Рго Не РЬе АЬа
35 40 45
С1у А1а Бег Не А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Бег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не НЬз Уа1 А1а Уа1 СЬи УаЬ Суз ТЬг Рго СЬу Бег
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 УаЬ А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Бег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу Уа1 Ьуз С1у Ьеи УаЬ
100 105 110
- 368 019971
Пе Азр А1а 115 Сбу Суз Агд Азр Уаб 120 Агд Зег Ьеи ТНг Сби 125 Меб Азп РНе
Рго Уа1 Тгр Зег Агд Зег Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Аба ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уаб Азп Уаб Сбу Уаб Уаб Суз Аба Сбу Аба Туг Уаб С1и
145 150 155 160
Рго С1у Азр Уаб ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд А1а А1а Аба Рго Сби Аба Уаб Уаб Аба Зег Сби Аба Агд Уаб Агд
680 185 190
Ьуз Сби Аба Аба ТНг Агд Сби Агд Ьеи Зег Агд Сбу Сби Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Сбу Ьеи Агд Зег Ьуз ббе Аба Азр Ьеи Сбу Ьеи Сби Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 239 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 239
абдаасааас сддбддбдаб ссддсаадсд дадсддссдс сддсбдасдс ддбддсддсд 60
сбсдсаассб абддсдбдбс сассдбдсаб даддсссадд ддсдббдсдд асбдсбсдсб 120
бссбасабдс ддссдаббба бсасддсасс дсдаЕЕдссд ддбсддсддб сасддбдбсс 180
сббссдсссд дсдасаабсб дабдаббсас дббдссдбдд аддбсбдсса абссддсдас 240
аббсбсдбдд бсдсбсссас дбсдсссбдб бссдасддбб асббсддсда асбссбддсс 300
ассбсбсбдс дддсдсасдд сдбсаадддд сбсдббаббд абдсдддббд ссдсдасдбб 360
сдсбсдсбса дсдсаабдаа дббссссдбс бддадссдсд сбдбсадббс дсааддсасс 420
дбдааабсба сбсбсддабс ддбдаабдбд адсдбсдббб дсдссддадс асдсабсдаа 480
дссддсдасд бддбсдбсдс ддабдасдаб ддсдбсдбдд бддбддадсд адсабссдсс 540
сасдаадбад бсдбддсдбд сдаасаасдс сббсдсаадд аададдсаас бсдсдадсдс 600
сбддсдсддд дадаасбсдд асбсдасабс басддсббдс дсасаааадб сдсддадабд 660
ддбсбсаадб абсаабда 678
<210> 240 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
- 369 019971 <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозгЕе ίά = Р300001
<400> 240 Уа1 5 \7а1 Не Агд С1п А1а 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
МеЕ 1 Азп Ьуз Рго
А1а \7а1 А1а А1а Ьей А1а ТЬг Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нгз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьей Ьей А1а Зег Туг МеЕ Агд Рго Не Туг Н1з
35 40 45
С1у ТЬг А1а Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьей Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьей МеЕ Не Н1з Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Зег С1у Азр
65 70 75 80
11е Ьей Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз Зег Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьей Ьей А1а ТЬг Зег Ьей Агд А1а Нгз С1у Уа1 Ьуз С1у Ьей \7а1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьей Зег А1а МеЕ Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз Зег ТЬг
130 135 140
Леи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Зег Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Агд Не С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 С1и
165 170 175
Агд А1а Зег А1а Нгз С1и Уа1 Уа1 Уа1 А1а Суз С1и С1п Агд Ьей Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и А1а ТЬг Агд С1и Агд Ьей А1а Агд С1у С1и Ьей С1у Ьей
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьей Агд ТЬг Ьуз Уа1 А1а С1и МеЕ С1у Ьей Ьуз Туг
210 215 220
С1п
225 <210> 241 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 370 019971
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 241 абдаасааас сддбддбдаб ссддсаадбд дадсддссдс сддсбдасдс ддбддсддсд 60
сбсдсаассб абддсдбдбс сассдбдсаб даддсссадд ддсдббдсдд асбдсбсдсб 120
бссбасабдс ддссдаббба бсссддсасс дсдаббдссд ддбсддсддб сасддбдбсс 180
сббссдсссд дсдасаабсб дабдаббсас дббдссдбдд аддбсбдсса абссддсдас 240
аббсбсдбдд бсдсбсссас дбсдссббдб бсддасддбб асббсддсда асбссбддсс 300
ассбсбсбдс дддсдсасда сдбсаадддд сбсдббаббд абдсдддббд ссдсдасдбб 360
сдсбсдсбса дсдсаабдаа дббссссдбс бддадссдсд сбдбсадббс дсааадсасс 420
дбдааабсба сбсбсддабс ддбдаабдбд адсдбсдббб дсдссддадс асдсабсдаа 480
дссддсдасд бддбсдбсдс ддабдасдаб ддсдбсдбдд бддбддадсд адсабссдсс 540
сасдаадбад бсдсддсдбд сдаасаасдс сббсдсаадд аададдсаас бсдсдадсдс 600
сбддсдсддд дадаасбсдд асбсдасабс басддсббдс дсасаааадб сдсддадабд 660
ддбсбсаадб абсаабда 678
<210> 242 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозтбе ίά = Р300001 <400> 242
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 \7а1 11е Агд С1п Уа1 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
А1а \7а1 А1а А1а Ьеи А1а ТИг Туг С1у Уа1 Зег ТИг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у ТНг А1а 11е А1а С1у Зег А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Зег С1у Азр
65 70 75 80
- 371 019971
11е Ьеи Уаб Уаб Аба 85 Рго ТНг Зег Рго Суз 90 Зег Азр Сбу Туг РНе 95 Сбу
Сби Ьеи Ьеи Аба ТНг Зег Ьеи Агд Аба Нбз Азр Уа1 Ьуз Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи Зег А1а Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Зег ТНг Уаб Ьуз Зег ТНг
630 135 140
Ьеи Сбу Зег Уа1 Азп Уаб Зег Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Агд Не Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уа1 Уаб Уа1 Аба Азр Азр Азр Сбу Уа1 Уаб Уаб Уаб Сби
165 170 175
Агд Аба Зег Аба Нбз Сби Уаб Уа1 А1а А1а Суз С1и Сбп Агд Ьеи Агд
180 185 190
Ьуз Сби Сби Аба ТНг Агд Сби Агд Ьеи А1а Агд С1у Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд ТНг Ьуз Уаб А1а Сби Меб Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Сбп
225 <210> 243 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 243
абдаасадас сЬдЬддЬЬдб ссдддаддбд дадсддссдс сддсадабдс ЬдЬдасадсд 60
сбсдадсадб асддддбаЬс дасддбдсаЬ даадсбсаад ддсдЬЬдсдд дПасбсдса 120
ЬсдЬаЬабдс ддссдаЪЪЪа Ьдссддадсд дссаЬсдсбд дбсссдссдЬ дасЬдПЬсб 180
сбассЬссдд дадасаасЬЬ даЬдаЬЬсас дбддсддЬсд аддЬсЬдссд Ьссдддадас 240
аЬссбсдЬЬд Ьддсдссдас дЬсдссдбдЬ асддабддсЬ аЬЬЬЬддада дсЬдсПдса 300
асббсасбсс дадсасабдд сдбдааадда сббдбдабсд абдсдддаЬд Ьсдсдабдбб 360
сдсбсдсЬда сбдадаЬдаа дЬПсссдбд ЬддадЬсдсд сддбдадПс дсадддаасд 420
дбдааддсда сдсЬсддабс адЬааабдЬд адЬаЬсдбдЬ дсдссддсдс асЬсдбсдаа 480
дссддсдабд Ьсабсабсдс ддабдасдаЬ ддадссдбад ЬЬдбдаддад дасадссдсд 540
ааадасдбдд Ьсдсддсдбс Ьдаасадада дбдсдаааад аададдсдас дсдааддсдд 600
сПдсдсаад дсдаасбсдд ЬсбддасаЬс ЬасдддЫдс дсдсдааааб сдсддассбс 660
ддЬсбсаадЬ ассбдЬаа 678
- 372 019971 <210> 244 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151) ... (154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬЬе ίά = Р300001 <400> 244
МеЬ 1 Азп Агд Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1и Уа1 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 ТЬг А1а Ьеи СЬи С1п Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг МеЬ Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а А1а 11е А1а СЬу Рго АЬа УаЬ ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи МеЬ Не Низ Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
11е Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Н13 С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Уа1
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Зег Ьеи ТЬг С1и МеЬ Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Зег Не Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Не Не А1а Азр Азр Азр С1у А1а Уа1 УаЬ Уа1 Агд
165 170 175
Агд ТЬг А1а А1а Ьуз Азр Уа1 Уа1 АЬа А1а Зег СЬи С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и СЬи А1а ТЬг Агд Агд Агд Ьеи А1а С1п СЬу С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг СЬу Ьеи Агд А1а Ьуз Не А1а Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225
- 373 019971 <210> 245 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 245 аРдаасаадР ссдрддрддр РсдсаасдРс дадсадссРс сбдссдардс саРддссдсд60 сбсдаааааР аРддсдРРРс сассдРРсас даадсдсаад дссдсрдсдд сРРдсРсдсс120
РсРРасаРдс дсссааРРРР сдддддРдсс РссдРсдссд дссссдсддр сассдРсРсс180 дрдссдсссд дсдасаасср саРдаРРсас дРсдсРдРад аадРсРдссд сссдддадас240 аРРсРсдРсд Радсссссас арсдсдсрдс ассдасддсР асРРсддсда асРасРадсс300 асРРсдРРдс дсдсссасдд сдРсаааддс сРсдРсаРсд аРдссддРРд ссдсдасдРс360 сдсРссРРда ссдаааРдаа аРРРсссдРс Рддадссдсд ссаРсадРРс дсааддсасс420 дРсаааРсса срдрдддсрс ддРааасдРс сссдрсдрдр дрдсдддсдс асРсаРсдса480 сссддсдасд РсаРддРсдс ддаРдасдаР ддсдРРдРсд РсдРдсадсд сдссдссдсс540 сдсдасдРсд РсдссдссРс ддаасааадд аРРсдсаадд аадаадссас асдрдадсдр600 срддрдсдсд дРдаасРсад ссРсдаРаРс РасддссРдс дсдсаааасР сассдааРРд 660 ддРсРсасдР асРРдРад678 <210> 246 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (2)...(5) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозбРе ίά = Р500001 <400> 246
Мер 1 Азп Ьуз Бег Уаб 5 Уаб Уаб Агд Азп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
Аба Мер Аба Аба Ьей Сби Ьуз Туг Сбу Уаб Бег ТЬг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Суз Сбу Ьей Ьей Аба Бег Туг Мер Агд Рго 11е РЬе Сбу
35 40 45
Сбу Аба Бег Уаб Аба Сбу Рго Аба Уаб ТЬг Уаб Бег Уаб Рго Рго Сбу
- 374 019971
55 60
Азр 65 Азп Ьеи Меб ЬЬе НЬз 70 УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ 75 Суз Агд Рго СЬу Азр 80
Не Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Агд Суз ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу УаЬ Ьуз СЬу Ьеи УаЬ
100 105 110
Не Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТЬг СЬи Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа ЬЬе Зег Зег СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз Зег ТЬг
130 135 140
УаЬ С1у Зег УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ УаЬ Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи ЬЬе АЬа
145 150 155 160
Рго СЬу Азр УаЬ Меб УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ СЬп
165 170 175
Агд АЬа АЬа АЬа Агд Азр УаЬ УаЬ АЬа АЬа Зег СЬи СЬп Агд ЬЬе Агд
180 185 190
Ьуз СЬи СЬи АЬа ТЬг Агд СЬи Агд Ьеи УаЬ Агд СЬу СЬи Ьеи Зег Ьеи
195 200 205
Азр ЬЬе Туг СЬу Ьеи Агд АЬа Ьуз Ьеи ТЬг СЬи Ьеи СЬу Ьеи ТЬг Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 247 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 247
дбдасдддбс сдабсдбсдб бсдсассабс дасадассда бддссдабдб сдбсдссдсд 60
сбдсадсдсс абддсдбсбс дасддббсас даадсасаад ддсдасдддд асбдсбсдсд 120
бссбдсдбдс ддссдабсба бдбдддсдсс дбдаббдсдд дбссбдссдб сассдбсбсд 180
сбдссассбд дсдасаассб дабдаббсас дбсдсддбдд адабдбдбса дсссддсдаб 240
дбссбсдбсд бсдссссдас сбсбссдбдс ассдасддсб абббсддсда асбдсбддсд 300
ассбсаббдс асдсссдсдд сдбсасддда сбсабсабсд абдссддсбд ссдддасдбб 360
сдсдссббда сддасабдсд абббссддбб бддадссдсд сдабсадсдс дсадддсасс 420
дбсаадбсаа сдсбсддабс адбдаасдбд ссддбддбдб дсдссддадс дббддбссас 480
дсдддсдасд ссабсдбддс ддабдасдаб ддсдбддбдд бддбдадасд ддаададдсд 540
дддассдбдб сддаддсдбд сдсддадсдд дсдсдсаадд аададдссас дадддаасдд 600
- 375 019971 сРсдсдсдад дсдадсРРдд РсРсдаРаРс РасддссРдс дааааааасР сассдассРс 660 ддссРдаадР аРРсдРад 678 <210> 248 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) . . . (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 248
Мер 1 ТНг С1у Рго 11е 5 Уа1 Уа1 Агд ТНг 11е 10 Азр Агд Рго МеР А1а 15 Азр
Уа1 Уа1 А1а А1а Ьеи С1п Агд Нтз С1у Уа1 Зег ТНг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п <31 у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Суз Уа1 Агд Рго 11е Туг \7а1
35 40 45
С1у А1а Уа1 11е А1а С1у Рго А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Мер 11е Н13 Уа1 А1а Уа1 С1и Мер Суз С1п Рго С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи ΗΪ5 А1 а Агд С1у \7а1 ТНг С1у Ьеи 11е
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТНг Азр Мер Агд РНе
115 120 125
Рго Х7а1 Тгр Зег Агд А1а 11е Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз Зег ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Нтз
145 150 155 160
А1а С1у Азр А1а 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 \7а1 Уа1 Агд
165 170 175
Агд <31и С1и А1а С1у ТНг Уа1 Зег С1и А1а Суз А1а С1и Агд А1а Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и А1а ТНг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи ТНг Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Зег
225
- 376 019971 <210> 249 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 249 абдаасаадб ссдбддбддб бсдсаасдбс дадсадссбс сбдссдабдс сабддссдсд60 сбсдаааааб абддсдбббс сассдббсас даадсдсаад дссдсбдсдд сббдсбсдсс120 бсббасабдс дсссаабббб сдддддбдсс бссдбсдссд дссссдсддб сассдбсбсс180 дбдссдсссд дсдасаассб сабдаббсас дбсдсбдбад аадбсбдссд сссдддадас240 аббсбсдбсд бадсссссас абсдсссбдс ассдасддсб асббсддсда асбасбадсс300 асббсдббдс дсдсссасдд сдбсаааддс сбсдбсабсд абдссддббд ссдсдасдбс360 сдсбссббда ссдааабдаа абббсссдбс бддадссдсд ссабсадббс дсааддсасс420 дбсааабсса сбдбдддсбс ддбааасдбс сссдбсдбдб дбдсдддсдс асбсабсдса480 сссддсдасд бсабддбсдс ддабдасдаб ддсдббдбсд бсдбдсадсд сдссдссдсс540 сдсдасдбсд бсдссдссбс ддаасааадд аббсдсаадд аадаадссас асдбдадсдб600 сбддбдсдсд дбдаасбсдд ссбсдабабс басддссбдс дсдсаааасб сассдааббд 660 ддбдбсасдб асббдбад678 <210> 250 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (2)...(5) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргоз1бе ίά = Р300001 <400> 250
Меб 1 Азп Ьуз Зег \7а1 5 Уа1 Уа1 Агд Азп Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Меб А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг С1у \7а1 Зег ТЬг Уа1 Низ <31и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго 11е РЬе С1у
35 40 45
С1у А1а Зег Уа1 А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Уа1 Рго Рго С1у
55 60
- 377 019971
Азр 65 Азп Ьеи МеС 11е Н1з 70 Уа1 А1а УаЬ СЬи Уа1 75 Суз Агд Рго С1у Азр 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе СЬу
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд А1а Н13 С1у Уа1 Ьуз СЬу Ьеи Уа1
100 105 110
Не Азр А1а СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТНг СЬи МеС Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег Зег С1п СЬу ТНг Уа1 Ьуз Зег ТНг
130 135 140
Уа1 С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Не А1а
145 150 155 160
Рго СЬу Азр Уа1 МеС Уа1 А1а Азр Азр Азр СЬу Уа1 УаЬ УаЬ Уа1 СЬп
165 170 175
Агд А1а АЬа АЬа Агд Азр Уа1 Уа1 А1а А1а Зег СЬи СЬп Агд Не Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и А1а ТНг Агд С1и Агд Ьеи Уа1 Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд А1а Ьуз Ьеи ТНг СЬи Ьеи С1у Уа1 ТНг Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 251 <211> 693 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 251
аСдаасаадс сддсаССсдС СсдссссдСа дССдССсдса аСдСсдадса ассССсСдсс 60
дасдсддСад ссдсдсСсда ааааСаСддс дСсСсдассд ССсаСдаадс дсадддссдс 120
СдСддсССдс СсдсССссСд СаСссдсссд аССССсдсдд дсдссдссдС сдссддСссс 180
дСддСсассд СССссдСдсс дссаддддас аассСдаСда ССсасдСсдс адСддаадСс 240
Сдссдсссдд дадаСаСссС сдСсдСадсс ссаасдСсСс сССдсассда сддсСасССс 300
ддсдаасСаС СддссасССс дсССсдсдсд сасддсдСса адддсССдаС СаССдасдсс 360
ддсСдссдСд асдСссдсдс ссСсассдаа аСдаааСССс ссдСсСддад ссдсдссдСс 420
адССсдсаад дсасСдСсаа аСссасдССа ддсСсддСда аСдСССсадС сдСсСдСдсс 480
ддсдсасСдд Ссдсасссдд сдасдСсаСс дСсдссдабд асдасддадС ддСсдСсдбс 540
садсдсдсСд ссдсссдсда ддСадСсдсс дссдсадаас аааддаССсд сааддаадаа 600
дссасСсдсд аасдссСсдс дсдсддСдаа сСсддСсСсд аСаСсСасад ссСдсдсдса 660
- 378 019971 ааасбсассд аасбсддссб сассбасббд бда 693 <210> 252 <211> 230 <2Ь2> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (27) ... (179) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (156)...(159) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬбе ίά = Р300001 <400> 252
Меб 1 Азп Дуз Рго АЬа 5 РЬе УаЬ Агд Рго УаЬ 10 УаЬ УаЬ Агд Азп УаЬ 15 СЬи
СЬп Рго Зег АЬа Азр АЬа УаЬ АЬа АЬа Ьеи СЬи Ьуз Туг СЬу УаЬ Зег
20 25 30
ТНг УаЬ НЬз СЬи АЬа СЬп СЬу Агд Суз СЬу Ьеи Ьеи АЬа Зег Суз 1Ье
35 40 45
Агд Рго 11е РЬе АЬа СЬу АЬа АЬа УаЬ АЬа СЬу Рго УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ
50 55 60
Зег УаЬ Рго Рго СЬу Азр Азп Ьеи Меб Не НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ
65 70 75 80
Суз Агд Рго СЬу Азр Не Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг
85 90 95
Азр СЬу Туг РЬе СЬу СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу
100 105 ЬЬО
УаЬ Ьуз СЬу Ьеи Не Не Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд АЬа Ьеи
115 120 125
ТЬг СЬи Меб Ьуз РЬе Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа УаЬ Зег Зег СЬп СЬу
130 135 14 0
ТЬг УаЬ Ьуз Зег ТЬг Ьеи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Зег УаЬ УаЬ Суз АЬа
145 150 155 Ь60
СЬу А1а Ьеи УаЬ АЬа Рго СЬу Азр УаЬ Не УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу
165 170 175
УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ СЬп Агд АЬа АЬа АЬа Агд СЬи УаЬ УаЬ АЬа АЬа АЬа
180 185 190
С1ц СЬп Агд Ые Агд Ьуз СЬи СЬи АЬа ТЬг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд
195 200 205
СЬу СЬи Ьеи СЬу Ьеи Азр Не Туг Зег Ьеи Агд АЬа Ьуз Ьеи ТЬг СЬи
210 215 220
- 379 019971
Ьеи Сбу Ьеи ТНг Туг Ьеи
225 230 <210> 253 <2бб> 702 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 253
абдадсддба бсдбсдбсса ддасббсдад сдсдсабсдс бсдссдасаб сааддсдсбс 60
дссдадббсд дсдбсдссас дабссасдад дсдсадддсс дсдббддссб дсбсдсдбсд 120
басабдсдсс сдабббабдс дддадсбдса дссдссддса абдссдбсас сдбдбсддбд 180
ссдссдддсд асаасбддаб дабссасдбд дсддбддадд бдбдссдсда дддсдасабс 240
сбсдбддбдд сдссдассбс дссааасдас аасддсбасб бсддсдадсб дсбддсдбсб 300
бсасбдаада дссдсддбдб дсдбдддсбс дбсабсдадд ссддабдссд сдасдбдаад 360
ссссбсассд асабдааабб сссддбдбдд бсдсдсдссд бдбссдсдса адддасадбс 420
ааддададсс бсддсдабдб даассбсссд сббдбсаббд ссдддсадас ддбдаасссс 480
ддсдасдбда бсдбддсбда сдасдасддс дббдбсабсд ббддссдсад сдаддбдсдс 540
дссдбдасда ссааабсдсд сдадсдсдад дадааддадд ссаадаассд сббдсадсбс 600
ассадсддсс адсбсддсаб сдасабсбаб ддбабдсдсд дсаадсбсаа ддаааадддд 660
сбдсдсбасд бдаадаасдс дадсдадббд ааддссаааб аа 702
<2б0> 254 <2бб> 233 <2б2> БЕЛОК <2бЗ> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<22б> ДОМЕН <222> (26)...(673) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (229) ... (232) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозббе 1<Д = Р300001 <400> 254
Меб 1 Зег Сбу 11е Уаб 5 Уаб Сбп Азр РНе Сби 10 Агд Аба Зег Ьеи Аба 15 Азр
ббе Ьуз Аба Ьеи Аба Сби РНе Сбу Уаб Аба ТНг ббе Нбз Сби Аба Сбп
20 25 30
Сбу Агд Уаб Сбу Ьеи Ьеи Аба Зег Туг Меб Агд Рго ббе Туг Аба Сбу
35 40 45
- 380
А1а А1а 50 А1а А1а С1у Азп А1а 55 Уа1 ТНг Уа1 Зег Уа1 60 Рго Рго С1у Азр
Азп Тгр Меб Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд С1и С1у Азр Не
65 70 75 80
Ьеи \7а1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Азп Азр Азп С1у Туг РНе С1у С1и
85 90 95
Ьеи Ьеи А1а Зег Зег Ьеи Ьуз Зег Агд С1у Уа1 Агд С1у Ьеи Уа1 Не
100 105 но
С1и А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Ьуз Рго Ьеи ТНг Азр Меб Ьуз РНе Рго
115 120 125
Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и Зег Ьеи
130 135 140
С1у Азр Уа1 Азп Ьеи Рго Ьеи Уа1 Не А1а С1у С1п ТНг Уа1 Азп Рго
145 150 155 160
С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Не Уа1 С1у Агд
165 170 175
Зег С1и Уа1 Агд А1а \7а1 ТНг ТНг Ьуз Зег Агд С1и Агд С1и С1и Ьуз
180 185 190
С1и А1а Ьуз Азп Агд Ьеи С1п Ьеи ТНг Зег С1у С1п Ьеи С1у Не Азр
195 200 205
Не Туг С1у Меб Агд С1у Ьуз Ьеи Ьуз С1и Ьуз С1у Ьеи Агд Туг Уа1
210 215 220
Ьуз Азп А1а Зег С1и Ьеи Ьуз А1а Ьуз
225 230 <210> 255 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 255
абдаасдабс сдабсдбсдб бсдасадабс дасадассаб саддсссббс ддбсдабадб 60
сбдсдбсдсб ббддсдбсбс дассдбдсас даддсасадд ддсдссдсдд дсбдсбсдсд 120
бсдсасабдс ддссдаббба сдссддбдсд сбсдбсдсбд дбссадсдаб сасбдбссбд 180
дбдссдссдд дсдасаассб дабдаббсас дбсдсддбдд аддбдбдсса дссдддбдас 240
дббсбсдббд ббдсбссдас дбсдссдбдс ассдасддсб абббсддсда дсбдсбддсд 300
ассбсдсбдс дддсбсдбдд сдбддсддда сбсабсабсд асдссддббд ссдддабдбб 360
сдддсдсбда дсдадабдсд абббсссдбс бддадбсдсд сдабсадсдс дсадддбасс 420
дбсааддсда сдсбдддббс ддбдаасдбд ссссбддбдб дсдссддддс дсбддбсдад 480
дсдддадаса ббдбсдбсдс сдасдабдас ддсдбсдбда бсдбсаадаа ддабсаддбс 540
- 381 019971
даЬдсддбса сбсаддсадс сдаасадсдс дбдсдсааад аададдасас асдддсдсдд 600
Ьбддсдсдад дсдадсбсдд сс£ддаса£с Ёасдссббдс дсаадаадс^ д£сддасс£с 660
дддсбдаадЬ сдбсдбсдбд а 681
<210> 256 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 256
Меб 1 Азп Азр Рго Не 5 Уа1 Уа1 Агд С1п 11е 10 Азр Агд Рго Зег С1у 15 Рго
Зег Уа1 Азр Зег Ьеи Агд Агд РЬе С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ηί3 С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Н13 Меб Агд Рго 11е Туг А1а
35 40 45
С1у А1а Ьеи Уа1 А1а С1у Рго А1а 11е ТЬг Уа1 Ьеи Уа1 Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е ΗΪ5 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1п Рго С1у Азр
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Агд С1у Уа1 А1а С1у Ьеи 11е
100 105 110
11е Азр А1а <31у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи Зег С1и Меб Агд РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег А1а С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Ьеи Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр 11е Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 11е Уа1 Ьуз
165 170 175
Ьуз Азр С1п Уа1 Азр А1а Уа1 ТЬг С1п А1а А1а С1и С1п Агд \7а1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и Азр ТЬг Агд А1а Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг А1а Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Зег Зег
- 382 019971
225 <210> 257 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 257
абдаасдабс ссббсдбсдб бсдасаддбд дассдассдб садсбдсдбс дабсдасдаб 60
сбдсддсдаб бсддсдбсбс дассдбдсас даддсссадд ддсдссдсдд дббдсбсдса 120
бсдбасабдс ддссдабсба сассддбдсд сбсдбсдссд дбссбдссаб сасддбссбд 180
дбддсдссдд дсдасаассб дабдабссас дбсдсддбдд аддбдбдсса дссбддбдаб 240
дбссбсдбсд бсдссссдас дбсдссабдс асддасдддб абббсддсда асбдсбддсд 300
ассбсдббдс дддсбсдсдд сдбсдсаддд сбсабсабсд асдссддсбд ссдсдабдбб 360
сдадсдббда дсдадабдсд дбббсссдбс бддадбсдсд сдабсадсдс дсадддсасс 420
дбсааддсда сдсбдддббс ддбдаабдбд ссдсбдабдб дсдссддаас дсбддбсдад 480
дссддадасд бдабсдбддс сдабдабдас ддсдбсдбдд бсдбсаадсд ддадсаддбс 540
дабдссдбаа сдсаддссдс сдаасадсдс дбдсдааадд аададдасас асдддсасдд 600
сбсдсдсдад дсдадсбддд ссбсдасабс басддсббдс дсаадааасб дбсддассбс 660
ддбббдаадб сдбсдбда 678
<210> 258 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 258
Меб 1 Азп Азр Рго РНе 5 УаЬ УаЬ Агд СЬп УаЬ 10 Азр Агд Рго Зег АЬа 15 АЬа
Зег Ые Азр Азр Ьеи Агд Агд РНе СЬу УаЬ Зег ТНг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
С1п СЬу Агд Агд СЬу Ьеи Ьеи АЬа Зег Туг Меб Агд Рго Ые Туг ТНг
35 40 45
С1у АЬа Ьеи УаЬ АЬа СЬу Рго АЬа Ые ТНг УаЬ Ьеи УаЬ АЬа Рго СЬу
50 55 60
- 383 019971
Азр 65 Азп Ьеи Меб Не Нтз 70 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 75 Суз С1п Рго С1у Азр 80
Уа1 Ьеи \7а1 Уа1 А1а Рго ТИг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТИг Зег Ьеи Агд А1а Агд С1у Уа1 А1а С1у Ьеи Не
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи Зег С1и Меб Агд РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Ьеи Меб Суз А1а С1у ТНг Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд С1и С1п Уа1 Азр А1а Уа1 ТНг С1п А1а А1а С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и Азр ТИг Агд А1а Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи Зег Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Зег
210 215 220
Зег
225 <210> 259 <211> 579 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 259
абдсддссса бсбабдссдд бдсддсддсс дссддсадсд ссдбсассдб абссдбассб 60
ссдддсдаса асбддабдаб ссасдбддсс дбсдаадбсб дссдсдаадд сдасдбдсбд 120
дбсдбсдссс саассбсдсс абдсдабаас ддсбасббсд дсдадсбдсб сдссадсбсд 180
сбсаадбссс дбддсдбдсд сдддсббдбс абсдаддсад дсбдбсдсда сдбдададса 240
сбсбсддаба бдаааббссс ддбсбддбсд сдддссдбсб ссдсдсаадд сасбдбдаад 300
дааадссбдд дсдасдбдаа ссбдссдсбс дбдабсдссд дасадсбсдб саабссдддс 360
дабдбсдбдд ббдссдасда сдасддсдбс дбсдбсдбдд сдсддббада адсдсдсдсс 420
дбдассдсса адбсдсасда асдддадсад ааадаадсад ссаассдсда дсадсбдадс 480
аадддбдадс бсддсабсда бассбасддс абдсдсаада адсбсдссда сааддддсбд 540
сдсбасдбсд ссассдссда адаасбсаад дсдаадбда 579
- 384 019971 <210> 260 <2Ы> 192 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (1) ... (132) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 260 АЬа А1а 10 А1а С1у Зег А1а УаЬ 15 ТЬг
Мер 1 Агд Рго Не Туг 5 А1а С1у А1а
УаЬ Зег УаЬ Рго Рго СЬу Азр Азп Тгр Мер Не НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи
20 25 30
УаЬ Суз Агд СЬи СЬу Азр УаЬ Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Рго Суз
35 40 45
Азр Азп СЬу Туг РЬе С1у С1и Ьеи Ьеи А1а Зег Зег Ьеи Ьуз Зег Агд
50 55 60
СЬу УаЬ Агд С1у Ьеи УаЬ Не СЬи АЬа СЬу Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а
65 70 75 80
Ьеи Зег Азр Меб Ьуз РЬе Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа УаЬ Зег А1а СЬп
85 90 95
С1у ТНг УаЬ Ьуз СЬи Зег Ьеи СЬу Азр Уа1 Азп Ьеи Рго Ьеи УаЬ Не
100 105 110
АЬа СЬу СЬп Ьеи УаЬ Азп Рго СЬу Азр Уа1 Уа1 Уа1 А1а Азр Азр Азр
115 120 125
С1у Уа1 УаЬ УаЬ УаЬ А1а Агд Ьеи СЬи АЬа Агд АЬа УаЬ ТЬг АЬа Ьуз
130 135 140
Зег Н13 С1и Агд СЬи С1п Ьуз СЬи А1а АЬа Азп Агд С1и СЬп Ьеи Зег
145 150 155 160
Ьуз С1у СЬи Ьеи СЬу Не Азр ТЬг Туг СЬу Мер Агд Ьуз Ьуз Ьеи А1а
165 170 175
Азр Ьуз С1у Ьеи Агд Туг УаЬ А1а ТЬг А1а С1и С1и Ьеи Ьуз А1а Ьуз
180 185 190
<210> 261
<211> 678
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 261
аРдаабсаас сддсддбадр ссдссасдбд дадсадссас ссдссдасдс ддррдсддсд 60
сбддадаадр аРддРдРдас дассдРдсаР даадс^садд дасд£Ъд£дд ссРссРРдсс 120
- 385 019971
дсдбасабдс дбссдабббб сссдддадсд дссабсдссд дсбссдсбдб сассдбдбсд 180
ббдссбсссд дсдасаассб сабдабссаб дбсдсддбсд аддбсбдсад дссдддааас 240
абссбддбсд бббсасссас сбсдссббдб ассдасддаб асббсддбда асбдббддса 300
асббсбсбдс дадсбсасдд сдбдсааддб сббдбдаббд абдссддабд ссдсдасдбб 360
сдассдсбда сбдадабдаа аббсссддбс бддадссдда ссабсадсбс дсаддддасд 420
дбсааддсса сасбсддабс ддбсаабдбс ссдабсабдб дсдсдддсдс асбсдбсдаа 480
дсбддсдасд бсабсабсдс сдабдасдаб ддддбсдбдд ббдбсаадсд бдсадасдсд 540
сассаддбсд сбдсбдсбдс ддаасааадд дббсддааад адаабдбдас ссдбдадсда 600
сббдсдсдбд дададсбадд асбсдабабс басдасабдс дссадааааб сдсдсаасбд 660
ддссбсаааб ассбдбаа 678
<210> 262 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 262
Меб 1 Азп С1п Рго А1а 5 Уа1 \7а1 Агд Нтз Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг С1у Уа1 ТЬг ТЬг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а А1а Туг Меб Агд Рго 11е РЬе Рго
35 40 45
С1у А1а А1а Не А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Н15 Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азп
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 Зег Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Н1з С1у Уа1 С1п С1у Ьеи Уа1
100 105 по
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Рго Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд ТЬг Не Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Леи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е Меб Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 С1и
145 150 155 160
- 386 019971
АЬа С1у Азр Уа1 Не 165 1Ье АЬа Азр Азр Азр 170 СЬу УаЬ УаЬ УаЬ Уа1 175 Ьуз
Агд А1а Азр АЬа НЬз СЬп УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа СЬи СЬп Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп Уа1 ТНг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр МеЬ Агд СЬп Ьуз Не АЬа СЬп Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 263 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 263
абдаабааас сддбддбадб бсдбсаадбд дадсадссас саасддабдс ддббасддса 60
сбадаааадб абддсдбдас дассдбдсаб даадсссадд дасдббдбдд ссбссббдсс 120
бссбасабдс дбссдабббб бссдддадсд адсабсдсдд дббсбдссдб сасбдбдбсб 180
ЬСдссбссбд дсдасаассб дабдабссас дбддсддбсд аддбсбдбдд бссдддаааб 240
абссбсдбсд Ьббсдссдас ЬЬсдссббдб ассдабддсб асббсддбда аббдббддсс 300
асббсссбдс дбдсссдадд бдбссаадда ббадбсабсд абдссддабд ссдбдасдбс 360
сдсбсдсбда сддадабдаа аббсссддбс бддадбсдбд ссабсадсбс дсадддсаса 420
дбсааадсса сссббддабс ддбдаасдбд ссдабсабдб дбдсдддбдс дбссдбддаа 480
дсдддсдабд ЬааСбдбддс сдабдабдаб ддадббдЫзд бсдбдаадсд бдсддссдса 540
саадасдбсд сбдсддссдс ддаасааадд дббсдсаадд аааасдсдас ссдсдаасдб 600
сббдсасдсд дсдаасбсдд асбсдабабс басдасабдс дссадаадаб сдсдсадсбд 660
ддссбсаааб абсСдбда 678
<210> 264 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 264
- 387 019971
МеЕ 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго ТЬг 15 Азр
А1а Уа1 ТЬг А1а Ьей С1и Ьуз Туг С1у Уа1 ТЬг ТЬг Уа1 Н1з С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьей Ьей А1а Зег Туг МеЕ Агд Рго 11е РЬе Рго
35 40 45
С1у А1а Зег 11е А1а С1у Зег А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьей Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьей МеЕ Не НЬз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз С1у Рго С1у Азп
65 70 75 80
11е Ьей \7а1 Уа1 Зег Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1ц Леи Ьей А1а ТЬг Зег Ьей Агд А1а Агд С1у Уа1 С1п С1у Ьей νβΐ
100 105 110
11е Азр А1а С1у Суз Агд Азр \7а1 Агд Зег Ьей ТЬг С1и МеЕ Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а 11е Зег Зег 61п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Леи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго 11е МеЕ Суз А1а С1у А1а Зег Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр \7а1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд А1а А1а А1а С1п Азр Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и С1п Агд \7а1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп А1а ТЬг Агд С1и Агд Ьей А1а Агд С1у С1и Ьей С1у Ьей
195 200 205
Азр 11е Туг Азр МеЕ Агд С1п Ьуз 11е А1а С1п Ьей С1у Ьей Ьуз Туг
210 215 220
Леи
225 <210> 265 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 265
аЕдасдддЕс сЕаЕсдЕсдЕ дсдЕсасаЕс даасддссас сддсадсЕдс сдЕддсасдд 60
сЕдсаддадЕ асддсдЕддс дасддЕссас даадсдсаад дасдссдсдд дЕЕдсЕддсс 120
дссЕаЕаЕдс дассдабсЕа Едсдддсдса дссаЕЕдсдд дсссЕдсддЕ сасддЕдЕсс 180
дЕЕссдссдд дсдасаассЕ даЕдаЕссас дЕсдсддЕдд аддЕсЕдсса дссдддадас 240
дЕдсЕсдЕсд ЕсдсЕсссас дЕсассдЕдс асддасддсЕ асЕЕсддсда дсЕдсЕсдсд 300
- 388 019971
ассбсдсбдс аддсбсабдд сдбсдбсдсд сбсдбсабсд асдссддабд ссдадабдбд 360
сдбдссабда сададабдсд сббссссдбс бддадссдсд садбсадббс дсадддсасс 420
дбдааадсда сдсбддддбс ддбдаасдбд ссддбддсаб дбдсдддсас дсбсдбдааб 480
сссддсдабд бсдбсабадс ддабдабдас ддсдббдбдд бддбдаддсд адасдаддбд 540
даададассд бдадсбсдбс ддаааадсдд абссадааад аддсдаббас дсдададсдд 600
сбсдссадсд дсдадсбсдд дсбддабабс басдддсбдс ддаадааасб сдссдассбс 660
ддасбдаадб асбсабаа 678 <210> 266 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 266
Меб 1 ТНг Сбу Рго Не 5 Уа1 Уа1 Агд Нбз Не 10 Сби Агд Рго Рго Аба 15 Аба
Аба Уа1 Аба Агд Ьеи Сбп Сби Туг Сбу Уаб Аба ТНг Уа1 Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Агд С1у Ьеи Ьеи А1а Аба Туг Меб Агд Рго 1бе Туг А1а
35 40 45
Сбу Аба Аба 11е А1а С1у Рго А1а Уаб ТНг Уа1 Зег Уаб Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Нбз Уа1 Аба Уаб Сби Уа1 Суз Сбп Рго Сбу Азр
65 70 75 80
Уаб Ьеи Уаб Уаб А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Сбп Аба Нбз С1у Уа1 Уаб Аба Ьеи Уаб
100 105 но
11е Азр Аба С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Аба Меб ТНг С1и Меб Агд РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уа1 Зег Зег Сбп С1у ТНг Уаб Ьуз Аба ТНг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уаб Рго Уа1 Аба Суз А1а С1у ТНг Ьеи Уа1 Азп
145 150 155 160
Рго С1у Азр Уа1 Уа1 Не А1а Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уа1 Уа1 Агд
165 170 175
Агд Азр Сби Уаб С1и С1и ТНг Уа1 Зег Зег Зег Сби Ьуз Агд Не Сбп
180 185 190
- 389 019971
Ьуз С1и А1а 195 11е ТЬг Агд С1и Агд 200 Ьеи А1а Зег С1у С1и 205 Ьеи С1у Ьеи
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи А1а Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Зег
225 <210> 267 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 267
абдаабасас сдббддбадб ссдасаадбс дадсадссас садсддасдс ддббдсддса 60
ббддаааадб дсддадбсас аассдбдсаб даддсбсадд дасдбддбдд ссбсбббдсс 120
бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса ассабсдсад дабссдссаб сасадбдбсб 180
дбдссбссдд дсдасаассб бабдабссаб дбддсбдбдд аадбсбдсдд бдсдддааас 240
абссбддбдд бббсассаас сбссссббдб асддабддаб асббсддбда дсбдббддса 300
асабсбсббс дсдсссасдд бдбдаддддд сббдбдабсд абдссддабд бсдбдабдбд 360
сдсбсбсбда сддабабдаа абббссддбб бддадбсдса ссдбсадббс дсаадддаса 420
дбсааддсса сасбсддабс ддбдаабдба сссабсдббб дбдсдддсдс дабддббдад 480
дссддбдабд бдабсдбсдс сдасдасдаб ддадббдбдд бддбдаадсд сдсдсбддсд 540
ссададдбсд ссдсддсддс дсаасааадд дббсдсааад адаабббддс ссдсдаасда 600
сббддасдсд дадаасбсдд асбсдасабб бабдасабдс дсдаааадаб сдсдааасбд 660
ддссббаадб абббдбаа 678
<210> 268 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 268 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
Меб 1 Азп ТЬг Рго Ьеи 5 Уа1 \7а1
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Ньз С1и А1а
20 25 30
- 390 019971
Сбп Обу Агд 35 Сбу Сбу Ьей РНе Аба 40 Зег Туг Мер Агд Рго 45 ббе Туг Рго
Сбу Аба ТНг 11е Аба Сбу Зег Аба ббе ТНг Уаб Зег Уаб Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьей Мер ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбу Аба Сбу Азп
65 70 75 80
Не Ьей Уаб Уаб Зег Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьей Ьей Аба ТНг Зег Ьей Агд Аба Нбз Сбу Уаб Агд Сбу Ьей Уаб
100 105 110
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьей ТНг Азр Мер Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд ТНг Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Аба ТНг
130 135 140
Ьей Сбу Зег Уаб Азп Уаб Рго ббе Уаб Суз Аба Сбу Аба Мер Уаб Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб 11е Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд Аба Ьей Аба Рго Сби Уаб Аба Аба Аба Аба Сбп Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Азп Ьей Аба Агд Сби Агд Ьей Сбу Агд Сбу Сби Ьей Сбу Ьей
195 200 205
Азр ббе Туг Азр Мер Агд Сби Ьуз ббе Аба Ьуз Ьей Сбу Ьей Ьуз Туг
210 215 220
Ьей
225 <210> 269 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 269
абдаасасас сддРсдРадР ссддсаадрд дадсаассаР сааРддаРдР даРРдсадсс 60
сРддадааас аРддРдРдас дассдРасаР даддсссадд дасдррдрдд ссРдсРддсд 120
РдРРасаРдс дРссдаРЬЬЬ ссссддадсд адсаРсдсРд дРРссдсддР сасРдРРРсР 180
РРдссссссд дсдаРаабсР РаРдаРссас дррдсддрсд аддРсРдсад Рссадддаас 240
аРссРРдРад РРдссссдас сРсдссРРдс асддаРддсР аРРРсддада аРРдРРддса 300
асРРсссРдс дсдсРсдсдд РдРдаааддР сРсдРдаРРд ардссддард ссдРдаРдРР 360
сдсРсРРРда сддаааРдаа дРРсссддРс Рддадссдад сдаРсадсРс дсадддаасд 420
дРсаааРсРа сасРсддсРс сдрдаасдрд ссРаРссРдР дсдсдддсдс асРсдРсдад 480
- 391 019971
дссддсдаба бсабсдссдс сдабдасдас ддсдббдбсд ббдбсаадсд сдсаабддсд 540
саддаддбсд ссасддсддс адаасааадд дбдсдсааад адаабдбдас ссдададсдб 600
сббдсдсддд дадабсбсдд дсбсдабабс басдасабдс ддсадааасб сдсссаасбд 660
ддссбсаааб абсбдбда 678
<210> 270
<211> 225
<212> БЕЛОК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 270
Меб 1 Азп ТИг Рго УаЬ 5 УаЬ УаЬ Агд СЬп УаЬ 10 СЬи СЬп Рго Бег Меб 15 Азр
УаЬ Ые АЬа АЬа Ьеи СЬи Ьуз НЬз СЬу УаЬ ТНг ТНг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
СЬп СЬу Агд Суз СЬу Ьеи Ьеи АЬа Суз Туг Меб Агд Рго ЬЬе РНе Рго
35 40 45
СЬу АЬа Бег Ые АЬа СЬу Бег АЬа УаЬ ТНг УаЬ Бег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Ые НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз Бег Рго СЬу Азп
65 70 75 80
Ые Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТИг Бег Рго Суз ТНг Азр СЬу Туг РНе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТИг Бег Ьеи Агд АЬа Агд СЬу УаЬ Ьуз СЬу Ьеи УаЬ
100 105 НО
Ые Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Бег Ьеи ТНг СЬи Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Бег Агд АЬа Не Бег Бег СЬп СЬу ТНг УаЬ Ьуз Бег ТНг
130 135 140
Ьеи СЬу Бег УаЬ Азп УаЬ Рго ЬЬе Ьеи Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ СЬи
145 150 155 160
АЬа СЬу Азр Ые Ые АЬа АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Ьуз
165 170 175
Агд АЬа Меб АЬа СЬп СЬи УаЬ АЬа ТИг А1а АЬа СЬи СЬп Агд УаЬ Агд
180 185 190
Ьуз СЬи Азп УаЬ ТИг Агд СЬи Агд Ьеи АЬа Агд СЬу Азр Ьеи СЬу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Меб Агд СЬп Ьуз Ьеи АЬа СЬп Ьеи СЬу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
- 392 019971
Ьеи
225 <210> 271 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 271 аСдаассаад ссдСддСддС ссддааСаСс дадсдсссдс ссдсддаСдС адССдсСдсд60
ССддадааас ССддСдСССс сасддСдсас даддсдсадд дасдССдсдд СсСдССсдсС120 асдСаСаСда ддссдаСССа СдсдддСдсд дсдаССдссд ддссддсддС СассдСаСсд180
ССдссдссдд дСдасааССС даСдаССсас дСддссдСдд аадСдСдссд сдсдддддас240 аССССддСдд Ссдсдссдас ССсдссССдс асддасдддС аСССсддсда аССдсСддсд300 асССсдССдс дсдсасаСдд сдСсаадддс сСддСдаСсд аСдсддддСд ссдсдасдЬс360 сдадсдсСсд сддадаСдаа аСССсссдСд Сддадссдсд садСаадССс дсадддаасд420 дСдаадСсда сссССддССс ддСааасдСс ддааССдСдС дсдсаддадс асдсдСддаа480 дссддадасд СдаСсдССдс сдасдаСдас ддсдСадСдд дддСдаадСд сддсдсадсд540 саддаадСдд ССдссдсддс дсадсСдсдс дССсдсаадд аададдссас дсдсдаасдс600
ССддддсдСд дсдадсСсдд ссСддаСаСс сасдддсСдс дддссааддС сдсддадсСС 660 ддссСдаааС аСССдСда678 <210> 272 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 272
МеС 1 Азп С1п А1а Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд Азп Не 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
Уа1 Уа1 АЬа АЬа Ьеи СЬи Ьуз Ьеи СЬу Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нтз С1и АЬа
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи РЬе А1а ТЬг Туг МеС Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а АЬа 11е А1а СЬу Рго АЬа Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго СЬу
55 60
- 393 019971
Азр 65 Азп Ьеи Меб Не Нбз 70 Уаб Аба Уаб Сби Уаб 75 Суз Агд Аба Сбу Азр 80
Не Ьеи Уаб Уаб Аба Рго ТНг Зег Рго Суз ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи Аба ТНг Зег Ьеи Агд Аба Нбз Сбу Уаб Ьуз Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Аба Ьеи Аба Сби Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Зег ТЬг
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Сбу Не Уаб Суз Аба Сбу Аба Агд Уаб Сби
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб Не Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Сбу Уаб Ьуз
165 170 175
Суз Сбу Аба Аба Сбп Сби Уаб Уаб Аба Аба Аба Сбп Ьеи Агд Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Сби Аба ТЬг Агд Сби Агд Ьеи Сбу Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр 11е Нбз Сбу Ьеи Агд Аба Ьуз Уаб Аба Сби Ьеи Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 273 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 273
абдаасаадс ссдбддббдб дсддаасабс дадсдбссдс сддсддабдс бдбддссдсд 60
сббдадаааб асддсдбдбс дасддбдсас даддсссадд дссддаасдд ссбасбддсс 120
бссбабабдс дсссдабсба бдсаддадсс дсдабсдсбд дассадссдб сасадбббсс 180
сбсссдссдд дадасаассб дабдаббсас дбсдссдбсд аддбсбдбсд ассбддддаб 240
дбссбсдббд ббдсдссдас абсдссабдс ассдасддсб аббббддсда дббдсббдса 300
асббсдсбсд сддсдсабдд ддбдаааддс ббдабсаббд аддсдддабд бсдсдасдбс 360
сдадсбсбда сддааабдаа дбббссадбс бддадссдсд ссдбсадсбс дсааддаасд 420
дбдааддсаа сасббдддбс ддбааабдба асдаббдббб дбдсдддбдс бдсддббдсд 480
сссддбдабд бдабсдбддс ддасдабдаб ддсдбсдббд бсдбдааасд дасададдсд 540
саададдбсд ббассдсабс бдадсадада ббдсдааадд аададддаас ссдсаадсдд 600
сббдсббсдд дддаасбсдд ссбддабабб басддссбдс дадсдаадаб бдсадассбс 660
- 394 019971 ддРсРсаадР асРРдРад 678 <210> 274 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151) ... (154) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргоз1Ре ίά = Р500001 <400> 274
Мер 1 Азп Ьуз Рго \7а1 5 Уа1 Уа1 Агд Азп Не 10 (31и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг С1у Уа1 Зег ТНг Уа1 НТЗ С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Азп С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Мер Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а А1а 11е А1а С1у Рго А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Мер Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
\7а1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Беи Беи А1а ТНг Зег Ьеи А1а А1а Нтз С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Не
100 105 110
Не С1и А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд А1а Ьеи ТНг С1и Мер Ьуз РНе
115 120 125
Рго \7а1 Тгр Зег Агд А1а \7а1 Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
130 135 140
Беи С1у Зег \7а1 Азп Уа1 ТНг Не Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 А1а
145 150 155 160
Рго С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 \7а1 Ьуз
165 170 175
Агд ТНг С1и А1а С1п С1и Уа1 Уа1 ТНг А1а Зег С1и С1п Агд Ьеи Агд
180 185 190
Буз С1и С1и С1у ТНг Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Зег С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд А1а Ьуз Не А1а Азр Ьеи 61у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
- 395 019971
Ьеи
225 <210> 275 <211> 690 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 275 абдссбабсд ббдббасдаа дабсдассда сссадсдсдд сддасдбсда ааддабсдсс 60
дссбабддбд бсдсдассбб дсабдаадсд сааддасдаа ссдддббдаб ддсдбссааб 120
абдсдсссаа бсбабсдссс бдсдсасабб дссдддсссд сддбдассбд ссббдбддсд 180
ссбддсдаса аббддабдаб ссабдбсдсс дбсдаасадб дссадссддд адабдбссбд 240
дбсдбддбас сдассадссс сбдсдаадас ддсбабббсд дсдабсбдсб ддсдассбсд 300
сбдсддбсдс дсддддбсаа аддбсбдабс абсдаддссд дсдбасдсда бабсдсдаса 360
ббдассдада бдаааббссс ддбсбддбсс ааддсддбдб бсдсдсаадд аасддбсаад 420
дадассабсд ссадсдбсаа бдбдссссбс дбсбдсдсдд дсдсссдсаб сдбдссдддс 480
дабсбдабсд ббдссдасда сдасддддбс дбсдбдаббс саадасдббс сдббссддсд 540
дбссбббсса дсдссдаддс ссдсдаадад ааддаадссс дсаассдсдс ссдсббсдаа 600
дсбддсдадс бдддссбсда сдбсбасаас абдсдссадс дссбддссда саадддсббд 660
сдсбабдбсд адсддсбдсс сдаддаабад 690
<210> 276 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20) ... (172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 276
Меб 1 Рго Не УаЬ УаЬ 5 ТЬг Ьуз ЬЬе Азр Агд 10 Рго Зег АЬа АЬа Азр 15 УаЬ
С1и Агд Не АЬа АЬа Туг СЬу УаЬ АЬа ТЬг Ьеи НЬз СЬи АЬа СЬп СЬу
20 25 30
Агд ТЬг СЬу Ьеи Меб АЬа Зег Азп Меб Агд Рго 11е Туг Агд Рго АЬа
35 40 45
НЬз 11е А1а С1у Рго АЬа УаЬ ТЬг Суз Ьеи УаЬ АЬа Рго СЬу Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб Не НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи СЬп Суз СЬп Рго СЬу Азр УаЬ Ьеи
65 70 75 80
- 396 019971
Уа1 Уа1 Уа1 Рго ТНг 85 Зег Рго Суз С1и Азр 90 С1у Туг РНе С1у Азр 95 Ьеи
Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд Зег Агд С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи 11е 11е С1и
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр 11е А1а ТНг Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а Уа1 РНе А1а С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз С1и ТНг 11е А1а
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Ьеи Уа1 Суз А1а С1у А1а Агд Пе Уа1 Рго С1у
145 150 155 160
Азр Ьеи 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 11е Рго Агд Агд
165 170 175
Зег Уа1 Рго А1а Уа1 Ьеи Зег Зег А1а С1и А1а Агд С1и С1и Ьуз С1и
180 185 190
А1а Агд Азп Агд А1а Агд РНе С1и А1а С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр Уа1
195 200 205
Туг Азп Меб Агд С1п Агд Ьеи А1а Азр Ьуз С1у Ьеи Агд Туг Уа1 С1и
210 215 220
Агд Ьеи Рго С1и С1и
225 <210> 277 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 277
абдаабасас сддбддбадб ссдасаадбд дадсадссас садсддабдс ддббдссдса 60
ббддадаадб дбддадбдас сассдбдсаб даддсдсадд дасдсбдсдд ссбссббдсд 120
бссбасабдс дсссааббба сссдддадса дссабсдссд дббссдсбаб сасбдбдбсб 180
ббдссбссбд дсдасаассб сабдабссаб дббдсддбдд аддбсбдсад бссдддаааб 240
абссбддбад бббсассддс сбсдссббдб ассдабддсб асббсддбда дсбдббддсд 300
асдбсбсбсс дбдсссасдд сдбдададдд сббдбдабсд аддсдддабд ссдбдасдбд 360
сдсбсбсбаа садааабдаа аббсссддбс бддадссдсд ссабсадббс дсаддддаса 420
дбсааддсба сасббддабс ддбааасдбд сссабсдбдб дсдсдддсдс асдддбсдад 480
дсбддбдабд бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадбддбдд ббдбдаадсд ддсдсббдсд 540
саададдбсд ссдсддсддс ддаасааадд дббсдсааад адаабдсдас ссдсдаасда 600
сббдсдсдсд дадаасбсдд асбсдабабб басдассбдс дссаааадаб сдсбсаасбд 660
ддссббаааб абсбдбда 678
- 397 019971 <210> 278 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 278 Уаб Уаб Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
Мер 1 Азп ТНг Рго Уаб 5
Аба Уаб Аба Аба Реи Сби Луз Суз Сбу Уаб ТНг ТНг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Суз Сбу Леи Реи Аба Зег Туг Мер Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба Аба ббе Аба Сбу Зег Аба ббе ТНг Уаб Зег Реи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Леи Мер ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Зег Рго Сбу Азп
65 70 75 80
ббе Деи Уаб Уаб Зег Рго Аба Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби Леи Деи Аба ТНг Зег Реи Агд Аба Нбз Сбу Уаб Агд Сбу Реи Уаб
100 105 110
ббе Сби Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Реи ТНг Сби Мер Луз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба ббе Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Луз Аба ТНг
630 135 140
Леи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Рго ббе Уаб Суз Аба Сбу Аба Агд Уаб Сби
645 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб ббе Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Луз
165 170 175
Агд Аба Деи Аба Сбп Сби Уаб Аба Аба Аба Аба Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Дуз Сби Азп Аба ТНг Агд Сби Агд Реи Аба Агд Сбу Сби Реи Сбу Реи
195 200 205
Азр ббе Туг Азр Реи Агд Сбп Луз 11е Аба Сбп Реи Сбу Реи Луз Туг
260 215 220
Ьец
225 <210> 279 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 398 019971 <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 279
абдаабааас сддбддбадб дсддсаадбс дадсадссас ссдссдабдс ддббдсддсс 60
сбддадаадб абддсдбдас сассдбдсас даадсбсаад сдсдббдбдд ссбдсбддсб 120
сссбабабдс дсссдабббб бдсдддадса бдсабсдссд дббссдссдб дассдбдбсб 180
ббдссдссбд дсдабаабсб сабдабссас дббдссдбсд аддбсбдсас бссдддсадс 240
аббсбддбад ббдсссссас сбсдссббдс асддасддбб абббсдддда асбссбддса 300
асббсссбдс бсдсбсасдд бдбсааадда ббддбсабсд абдсбддсбд бсдддабдбб 360
сдсбсдббаа сддааабдаа аббссссдбс бддадссдбд сбдбсадббс бсааддаасд 420
дбдааддсса сдсбсддабс ддбдаабдбд ссддбсаббб дсдсдддсдс ддаддбддад 480
дсбддсдаба бсабсабсдс сдабдабдаб ддбдбддбдд бддбдаадсд сасдсбддсд 540
сасдаддбдд садсддсддс ддаасбасдд дббсдсаадд адаабдссас ссдсдаасда 600
сбсдсасдад дддабсбсдд ссбсдабабс басдасабдс ддсааааааб сдсдсаасбб 660
ддбсбсаааб абсбдбда 678
<210> 280 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 280
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд С1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг <31 у \7а1 ТНг ТНг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п А1а Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Рго Туг Меб Агд Рго Не РНе А1а
35 40 45
С1у А1а Суз Не А1а С1у Бег А1а Уа1 ТНг Уа1 Бег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз ТНг Рго <31у Бег
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТИг Бег Рго Суз ТНг Азр 01 у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТНг Бег Ьеи Ьеи А1а Нтз С1у Уа1 Ьуз <31у Ьеи Уа1
100 105 но
- 399 019971
11е Азр А1а 115 С1у Суз Агд Азр Уа1 120 Агд Зег Ьеи ТЬг С1и 125 Мер Ьуз РЬе
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Зег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 11е Суз А1а С1у А1а С1и Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр Не 11е 11е А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 \7а1 Ьуз
165 170 175
Агд ТЬг Ьеи А1а Н13 С1и Уа1 А1а А1а А1а А1а С1и Ьеи Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и Азп А1а ТЬг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у Азр Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг Азр Меб Агд С1п Ьуз 11е А1а С1п Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 281 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 281 аРдаасаадс ссдрддрсдр ссддсасдрд дассаассдр садссдасдр РдРддсРдсд60 срддадаадр асддадРсРс дассдрдсас даадсдсаад дссдРРдсдд РсРасРддсс120
РсдРасаРдс асссдаРРРа РсссддсдаР РссаРсдсРд ддссрдсддр сасддРРРсд180 сРРссдссад дРдасааРРР даРдаРссаР дРРдсддРсд аддРсРдссс ддсдддаадс240 дррсрддрсд РддсРсссас сРсассдРдс асадасддРР аРРРсддсда аРРдсРддса300 асРРсРсРдс дсдсРсасса РдРдасдддд РРддРРаРсд аРдссддРРд ссдсдасдРР360 сдсРсасРса сддаааРдаа дРРРссддРд РддадРсдсд ссдРсадРРс асаддддасс420 дРааадРсда сдсРРддсРс сдрдаасдрд ссадРадРдР дсдссддддс ссардрсдаа480 дсдддсдаРа РсаРсдРсдс сдаРдасдаР ддадРддРад РРдРааадсд аРРддасдса540 сссдаддРад РсдсРдсдРд сдаасааадд дРРсдсаадд аасаддрдас дсдсдаасдд600 сРддсдсдсд дсдаасРддд РсРддаРаРР РасддссРдс даадсааааР сдссдаасРР660 ддссРсаадР асдадРад <210> 282 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
678
- 400 019971 <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза
<400> 282 Уа1 Агд Н13 Уа1 10 Азр С1п Рго Бег А1а 15 Азр
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1
\7а1 \7а1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг С1у Уа1 Бег ТЬг \7а1 Низ С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Суз С1у Ьеи Ьеи А1а Бег Туг Меб Н1з Рго 11е Туг Рго
35 40 45
С1у Азр Бег 11е А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Бег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е Нтз Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Рго А1а С1у Бег
65 70 75 80
Уа1 Ьеи \7а1 Уа1 А1а Рго ТЬг Бег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Бег Ьеи Агд А1а Н13 Н13 Уа1 ТЬг С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Уа1 Агд Бег Ьеи ТЬг С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго \7а1 Тгр Бег Агд А1а Уа1 Бег Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз Бег ТЬг
130 135 140
Беи С1у Бег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Н1з Уа1 С1и
145 150 155 160
А1а С1у Азр 11е 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд Ьеи Азр А1а Рго С1и Уа1 Уа1 А1а А1а Суз С1и С1п Агд Уа1 Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1п Уа1 ТЬг Агд С1и Агд Ьеи А1а Агд С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр 11е Туг С1у Ьеи Агд Бег Ьуз Не А1а С1и Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
С1и
225 <210> 283 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 283
- 401
абдаабасас сддбддбадб ссддсаадбд дадсадссас садсддасдс ддбддссдса 60
ббддадаасб дбддсдбдас сассдбдсаб даддсбсадд дасдбадбдд ссбдсббдсс 120
бссбасабдс дсссдаббба ссадддадса дссабсдсад дббссдсбсб сассдбдбсб 180
ббдссбссдд дсдасаассб сабдабдсаб дббдсддбад адббсбдсдд сссдддаааб 240
абссбддбсд ббдсассдас сбсдсссбдб асддабддсб асббсддбда дсбдббддса 300
асабсбсбсс дбдсссасдд бдддададдд сббдбдабсд абдссддабд ссдбдассбд 360
сдсбсбсбаа садааабдаа аббсссбдбс бддадссдсд ссабсадббс дсаадддасд 420
дбсааддсса сасббддабс сдбдаабдбд сссабсдбаб дсдсдддсдс аббддбсдад 480
дссддадабд бсабсдбсдс сдабдасдаб ддадббдбдд ббдбдаадсд сдсссбсдсд 540
саададдбса дддсддсддс ддадсааадд дббсдсааад аааабдсдас ссдсдааада 600
сбсдсасдбд дадаасбсдд асбсдасабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсадсбд 660
ддссббаааб абсбдбда 678
<210> 284 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 284
Меб 1 Азп ТНг Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд О1п Уа1 10 С1и С1п Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Азп Суз С1у Уа1 ТНг ТНг Уа1 Н13 С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Зег С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг С1п
35 40 45
С1у А1а А1а Не А1а С1у Зег А1а Ьеи ТНг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Меб НЬз Уа1 А1а Уа1 С1и РНе Суз С1у Рго С1у Азп
65 70 75 80
Не Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр С1у Туг РНе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи Агд А1а Н1з С1у С1у Агд С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не Азр А1а С1у Суз Агд Азр Ьеи Агд Зег Ьеи ТНг С1и Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уа1 Тгр Зег Агд А1а Не Зег Зег С1п С1у ТНг Уа1 Ьуз А1а ТНг
- 402 019971
130 135
Ьеи СЬу 5ег УаЬ Азп УаЬ Рго 11е
145 150
АЬа С1у Азр УаЬ 11е УаЬ АЬа Азр
165
Агд АЬа Ьеи АЬа СЬп СЬи УаЬ Агд
180
Ьуз С1и Азп А1а ТНг Агд СЬи Агд
195 200
Азр 11е Туг Азр Меб Агд СЬп Ьуз
210 215
140
УаЬ Суз АЬа 155 СЬу АЬа Ьеи УаЬ СЬи 160
Азр Азр 170 СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ 175 Ьуз
АЬа 185 АЬа АЬа СЬи СЬп Агд 190 УаЬ Агд
Ьеи АЬа Агд СЬу СЬи 205 Ьеи СЬу Ьеи
11е АЬа СЬп Ьеи 220 СЬу Ьеи Ьуз Туг
Ьеи
225 <210> 285 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 285 абдаабасас сддбддбадб аадасаадбд дадсадссас садсддабдс ааббдссдса 60
ббдаадаадб дбддсдбдас аассдбссас даддсбсадд дасдбддбдд ссббсббдсд 120
бссбасабдс дсссдаббба сссдддадса дссабсдсад дабссдсбаб сасбдбдбсб 180
ббдссбссбд дсдасаассб сабдабссас дббдсддбдд аддбсбдсдд бссдддааас 240
абссбддбад бббсассдас сбсдссббдб асддабддсб асббсддбда дббдббддса 300
асабсбсбсс дбдсссаддд сдбдаббддд сббдбдабсд абдссддабд ссдбдасдбд 360
сдсбсбсбаа садааабдаа аббсссддбс бддадссдсд ссабсбдббс дсаадддаса 420
дбсааддсса сасббддабс ддбдаабдбд сссабсдбаб дсдсдддбдс аббддбсдад 480
дсбддбдабд бсабсдбсдс сдасдасдаб ддсдббдбдд ббдбааадсд адсдсбддсд 540
саададдбсд ссдсбдсддс ддаасаааад дббсдсааад адаабдбаас ссдсдаасда 600
сбсдсасдбд дададсбсдд асббдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд 660
ддссбсаааб абсбдбда 678
<210> 286 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
- 403 019971 <221> ДОМЕН <222> (22) ... (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 286
Меб 1 Азп ТНг Рго Уаб 5 Уа1 Уаб Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
А1а Не А1а А1а Ьеи Ьуз Ьуз Суз Сбу Уаб ТНг ТНг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
С1п Сбу Агд Сбу Сбу Ьеи Ьеи Аба Зег Туг Меб Агд Рго Ые Туг Рго
35 40 45
Сбу А1а А1а Не А1а Сбу Зег Аба Не ТНг Уаб Зег Ьеи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб 11е Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сб у Рго Сбу Азп
65 70 75 80
11е Ьеи Уаб Уаб Зег Рго ТНг Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи А1а ТНг Зег Ьеи Агд Аба Сбп Сбу Уаб Не Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
11е Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТНг Сби Меб Ьуз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд А1а Не Суз Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Ьуз Аба ТНг
130 135 140
Ьеи Сбу Зег Уа1 Азп Уаб Рго Не Уаб Суз Аба Сбу Аба Ьеи Уаб Сби
145 150 155 160
А1а Сбу Азр Уаб 11е Уаб А1а Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Ьуз
165 170 175
Агд А1а Ьеи А1а С1п Сби Уаб Аба А1а Аба Аба Сби Сбп Ьуз Уаб Агд
180 185 190
Ьуз Сби Азп Уаб ТНг Агд Сби Агд Ьеи Аба Агд Сбу Сби Ьеи Сбу Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг Азр Меб Агд Сбп Ьуз Не Аба Сбп Ьеи Сбу Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 287 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 287
абдаасааас сдббддбдаб ссддсаадбд дадсддссдс сддсбдасдс бдбддсддсд 60
сбсдаааааб абддсдбдбс сассдбдсаб даадсссадд дасдббдсдд асбдсбсдсб 120
бссбасабдс дассдаббба бсссддбдсб дссд££дссд дббсддсддб сассдбабсс 180
- 404 019971
сббссдсссд дсдабаабсб дабдаббсас дббдсбдбсд аддбсбдсса дбссддсдаб 240
аббсбсдбдд ббдсбссдас сбсдссббдс бсддасддаб асббсддбда дббдсбддсд 300
асдбссббдс дсдсдсасдд сдбдаадддс сбсдбсаббд асдсддддбд ссдбдасдбб 360
сдсбсасбба ссдааабдад дббссссдбс бддадссдса дсдбсадсбс дсааддбасс 420
дбдаадбсба сбсбсддабс бдбдаабдбд адсаббдббб дбдссддсдс дсасабсдаа 480
дсбддбдабд бдабсдбсдс ддабдасдас ддбдбсдбдд бддбдаадсд сдсабссдсс 540
сасдаадбад бсдсддсдбд сдаасадсдд дббсдсаадд аададдбсас бсдддадсдд 600
ббддсдсдсд дддадсббдд дсббдасабс басдддббдс дсасаааааб сдсддааабд 660
ддбсбсаадб абсаабда 678 <210> 288 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151) ... (154) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬбе ίά = Р300001 <400> 288
Меб 1 Азп Ьуз Рго Ьеи 5 УаЬ Ые Агд СЬп УаЬ 10 СЬи Агд Рго Рго АЬа 15 Азр
АЬа УаЬ АЬа АЬа Ьеи СЬи Ьуз Туг СЬу УаЬ Зег ТНг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
СЬп СЬу Агд Суз СЬу Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг Рго
35 40 45
СЬу АЬа АЬа УаЬ АЬа СЬу Зег А1а УаЬ ТНг УаЬ Зег Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Ые НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬп Зег СЬу Азр
65 70 75 80
Не Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТНг Зег Рго Суз Зег Азр СЬу Туг РНе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТНг Зег Ьеи Агд АЬа НЬз СЬу УаЬ Ьуз СЬу Ьеи УаЬ
100 105 НО
Ые Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТНг СЬи Меб Агд РНе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд Зег УаЬ Зег Зег СЬп СЬу ТНг УаЬ Ьуз Зег ТНг
130 135 140
- 405 019971
Леи 145 <31 у Зег Уа1 Азп \7а1 150 Зег 11е Уа1 Суз А1а 155 С1у А1а ΗΪ3 11е С1и 160
А1а <31 у Азр Уа1 11е 165 Уа1 А1а Азр Азр Азр 170 С1у Уа1 Уа1 Уа1 \7а1 175 Ьуз
Агд А1а Зег А1а 180 Н1з С1и Уа1 Уа1 А1а 185 А1а Суз С1и С1п Агд 190 Уа1 Агд
Луз С1и С1и 195 νβΐ ТНг Агд С1и Агд 200 Леи А1а Агд С1у С1и 205 Леи С1 у Ьей
Азр 11е 210 Туг С1у Леи Агд ТНг 215 Луз 11е А1а С1и МеЕ 220 С1у Леи Ьуз Туг
С1п
225 <210> 289 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 289 аЕдаасаадс ссдЕддЕЕдЕ дсддаасаЕс дадсдЕссдс сддсддаЕдс ЕдЕддссдсд60 сЕЕдадаааЕ асддсдЕдЕс дасддЕдсас даддсссадд дссддаасдд ссЕасЕддсс120
ЕссЕаЕаЕдс дсссдаЕсЕа Едсаддадсс дсдаЕсдсЕд дассадссдЕ сасадЕЕЕсс180 сЕсссдссдд дадасаассЕ даЕдаЕЕсас дЕсдссдЕсд аддЕсЕдЕсд дссЕддддаЕ240 дЕссЕсдЕЕд ЕЕдсдссдас аЕсдссаЕдс ассдасддсЕ аЕЕЕЕддада дЕЕдсЕЕдса300 асЕЕсдсЕсд сддсдсаЕдд ддЕдаааддс ЕЕадЕсаЕЕд аддсдддаЕд ЕсдсдасдЕс360 сдадсЕсЕда ЕддаааЕдаа дЕЕЕссадЕс Еддадссдсд ссдЕсаасЕс дсааддаасд420 дЕдааддсаа сасЕЕдддЕс ддЕаааЕдЕа асдаЕЕдЕЕЕ дЕдсдддЕдс ЕдсддЕЕдсд480 сссддЕдаЕд ЕдаЕсдЕддс ддасдаЕдаЕ ддсдЕсдЕЕд ЕсдЕдааасд дасададдсд540 саададдЕсд ЕЕассдсаЕс Едадсадада ЕЕдсдааадд аададддаас ссдсаадсдд600 сЕЕдсЕЕсдд дддаасЕсдд ссЕддаЕаЕЕ ЕасддссЕдс дадсдаадаЕ ЕдсадассЕс660 ддЕсЕсаадЕ асЕЕдЕад
678 <210> 290 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22) . . . (174)
- 406 019971 <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <220>
<221> САЙТ <222> (151)...(154) <223> Участок Ν-гликозилирования. Ргозтбе ίά = Р300001
<400> 290
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уа1 5 Уа1 Уа1 Агд Азп Не 10 С1и Агд Рго Рго А1а 15 Азр
А1а Уа1 А1а А1а Ьеи С1и Ьуз Туг С1у Уа1 Зег ТЬг Уа1 Нтз С1и А1а
20 25 30
С1п С1у Агд Азп С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Меб Агд Рго Не Туг А1а
35 40 45
С1у А1а А1а 11е А1а С1у Рго А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Рго Рго С1у
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Не Н1з Уа1 А1а Уа1 С1и Уа1 Суз Агд Рго С1у Азр
65 70 75 80
\7а1 Ьеи Уа1 Уа1 А1а Рго ТЬг Зег Рго Суз ТЬг Азр С1у Туг РЬе С1у
85 90 95
С1и Ьеи Ьеи А1а ТЬг Зег Ьеи А1а А1а Н1з С1у Уа1 Ьуз С1у Ьеи Уа1
100 105 110
Не С1и А1а С1у Суз Агд Азр \7а1 Агд А1а Ьеи Меб С1и Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго \7а1 Тгр Зег Агд А1а Уа1 Азп Зег С1п С1у ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг
130 135 140
Ьеи С1у Зег Уа1 Азп Уа1 ТЬг Не Уа1 Суз А1а С1у А1а А1а Уа1 А1а
145 150 155 160
Рго С1у Азр Уа1 Не Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Уа1 \7а1 Уа1 Ьуз
165 170 175
Агд ТЬг С1и А1а С1п С1и Уа1 Уа1 ТЬг А1а Зег С1и С1п Агд Ьеи Агд
180 185 190
Ьуз С1и С1и С1у ТЬг Агд Ьуз Агд Ьеи А1а Зег С1у С1и Ьеи С1у Ьеи
195 200 205
Азр Не Туг С1у Ьеи Агд А1а Ьуз Не А1а Азр Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 291 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 291
- 407 019971
абдаабааас сддбддбадб ссддсаадбд дадсадссас ссдсддасдс ддббдсддсд 60
сбддадаадб абддсдббас сассдбдсаб даддсбсадд дасдббдбдд ссбдсбсдсд 120
сасбасабдс дбссдабббб бссдддадсд дссабсбсдд дббсбдсбдб сассдбадсб 180
ббдссдссдд дсдабаассб сабдабссас дбсдсддбсд аддбсбдсдд сссдддааас 240
абссбддббд бддсассдас сбсдссббсд асддабддсб асббсддбда дсбдббддсд 300
ассбсбббдс дбдсбсасдд бдбдаааддд сббдбдаббд абдссддабд ссдбдасдбб 360
сдсбсссбда ссдадабдаа аббссссдбс бддадссдбд ссабсадсбс дсадддааса 420
дбсааддсса сссбсддабс ддбдаабдбд ссддбсабдб дсдсдддсдс дсбсдбсдаа 480
дсбддддабд бсабсдбсдс сдабдабдаб ддадббдбдд ббдбдаадсд сдсдаабдсд 540
сасдаддбдд ссдсддсддс адаасааадд дбдсдсаадд адаабабаас ссдсдаасдд 600
сббсдасдсд дададсбсдд асбсдабабб басдасабдс дссааааааб сдсдсаасбд 660
ддссбсаааб ассбдбда 678
<210> 292 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 292
Меб 1 Азп Ьуз Рго Уаб 5 Уаб Уаб Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
Аба Уаб Аба Аба Ьеи Сби Ьуз Туг Сбу Уаб ТЬг ТЬг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Агд Суз Сбу Ьеи Ьеи Аба Нбз Туг Меб Агд Рго ббе РЬе Рго
35 40 45
Сбу Аба Аба ббе Зег Сбу Зег Аба Уаб ТЬг Уаб Аба Ьеи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
ббе Ьеи Уаб Уаб Аба Рго ТЬг Зег Рго Зег ТЬг Азр Сбу Туг РЬе Сбу
85 90 95
Сби Ьеи Ьеи Аба ТЬг Зег Ьеи Агд Аба Нбз Сбу Уаб Ьуз Сбу Ьеи Уаб
100 105 110
ббе Азр Аба Сбу Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Ьеи ТЬг Сби Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба 11е Зег Зег Сбп Сбу ТЬг Уаб Ьуз Аба ТЬг
- 408 019971
130 135
Ьеи 145 СЬу 5ег УаЬ Азп УаЬ 150 Рго УаЬ
АЬа С1у Азр УаЬ 11е 165 УаЬ АЬа Азр
Агд АЬа Азп АЬа 180 НЬз СЬи Уа1 А1а
Ьуз СЬи Азп 195 ЬЬе ТНг Агд СЬи Агд 200
Азр 11е 210 Туг Азр МеС Агд СЬп 215 Ьуз
Ьеи 225
140
МеС Суз А1а 155 С1у А1а Ьеи УаЬ СЬи 160
Азр Азр 170 С1у Уа1 УаЬ УаЬ Уа1 175 Ьуз
А1а 185 А1а А1а С1и СЬп Агд 190 УаЬ Агд
Ьеи Агд Агд СЬу СЬи 205 Ьеи СЬу Ьеи
Не А1а СЬп Ьеи 220 СЬу Ьеи Ьуз Туг
<210> 293 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 293
аСдааСсдас сддСддСадС ссддсаадСС даасадссас садсддаСдс ддССдссдса 60
сСддадаадС аСддсдСдас аассдСссаС даддсСсадд дасссддСдд ссСссСадсс 120
СссСасаСдс дсссдаСССа сссдддадса дСсаСсдссд дССссдсддС сасСдСдСсС 180
ССассСссСд дсдасаассС саСдаСссас дСддссдСдд аддСсСдСдд Сссдддааас 240
аССсСддССд ССдсассдаС сСсдссдСдС асддаСддсС асССсддада дсСдССддса 300
ассСсСсСсс дсдсссасдд СдСдсдаддд сССдСдаСсд аСдссддаСд ссдддасдбд 360
сдсСсСсСса садаааСдаа аСССссддСс Сддадссдсд ссдСсадССс асаддддаса 420
дСсааддсса сссСдддаСс ддСдааСдСд ссдаССдСдС дсдсдддсдс дсдддСсддд 480
дсСддддаСд СсаСсдСсдс сдаСдасдаС ддадССдСдд СддСдаадсд сдсдсСддсс 540
даададдСсд ссдссдсддс ддаасааадд дССсдсааад адааСдСдас ссдддаасда 600
сССдсдсдСд дададсСддд асСсдаСаСС СасдасаСдс дссаааадаС сдсасаасСд 660
ддссССаааС аСсСсСда 678
<210> 294 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
- 409 019971 <221> ДОМЕН <222> (22) . .. (174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 294
Мер 1 Азп Агд Рго Уаб 5 Уаб Уаб Агд Сбп Уаб 10 Сби Сбп Рго Рго Аба 15 Азр
Аба Уаб Аба Аба Реи Сби Луз Туг Сбу Уаб ТНг ТНг Уаб Нбз Сби Аба
20 25 30
Сбп Сбу Рго Сбу Сбу Реи Реи Аба Зег Туг Мер Агд Рго 11е Туг Рго
35 40 45
Сбу Аба Уаб ббе Аба Сбу Зег Аба Уаб ТНг Уаб Зег Реи Рго Рго Сбу
50 55 60
Азр Азп Леи Мер ббе Нбз Уаб Аба Уаб Сби Уаб Суз Сбу Рго Сбу Азп
65 70 75 80
11е Реи Уаб Уаб Аба Рго 11е Зег Рго Суз ТНг Азр Сбу Туг РНе Сбу
85 90 95
Сби Реи Реи Аба ТНг Зег Реи Агд Аба Нбз Сбу Уаб Агд Сбу Реи Уаб
100 105 110
ббе Азр Аба С1у Суз Агд Азр Уаб Агд Зег Реи ТНг Сби Мер Луз РНе
115 120 125
Рго Уаб Тгр Зег Агд Аба Уаб Зег Зег Сбп Сбу ТНг Уаб Луз Аба ТНг
130 135 140
Реи Сбу Зег Уаб Азп Уаб Рго ббе Уаб Суз Аба Сбу Аба Агд Уаб Сбу
145 150 155 160
Аба Сбу Азр Уаб 11е Уаб Аба Азр Азр Азр Сбу Уаб Уаб Уаб Уаб Луз
165 170 175
Агд Аба Реи Аба Сби Сби Уаб Аба Аба Аба Аба Сби Сбп Агд Уаб Агд
180 185 190
Луз Сби Азп Уаб ТНг Агд Сби Агд Реи Аба Агд Сбу Сби Реи Сбу Реи
195 200 205
Азр ббе Туг Азр Мер Агд Сбп Луз 1 бе Аба Сбп Реи Сбу Реи Луз Туг
210 215 220
Леи
225 <210> 295 <211> 678 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 295
абдааРааас сддРддРадР ссддсаадрд дадсадссдс садсддасдс ддррдсддсд 60
сРддадаадР аРддсдРсас сассдРдсаР даддсРсадд дасдРРдРдд ссРдсРсддд 120
сасРасаРдс дРссдаРРРР Рссдддадсд дссаРсРсдд дРРсРдсадР сассдРадсР 180
- 410 019971
ббдссдссдд дсдабаассб сабдабссас дбсдсддбсд аддбсбдсдд сссдддааас 240
абссбддбдд ббдсассдас сбсдссббсд асддабддсб асббсддбда дсбдббддсд 300
ассбсбсбдс дбдсбсдсда бдбдаааддд сббдбдаббд абдссддабд ссдбдасдбб 360
сдсбсссбда ссдадабдаа аббссссдбс бддадссдбд ссабсадсбс дсадддаасд 420
дбсааддсса сссбсддабс ддбдаабдбд ссддбсасдб дсдсдддсдс дсбсдбсдаа 480
дссддддабд бсабсдбсдс сдабдабдаб ддадббдбдд ббдбдаадсд сдсдсабдсд 540
сасдаддбдд сддсддсддс адаасааадд дбдсдсааад адаабабаас ссдсдаасдд 600
сббсдасдсд дададсбсдд асбсдабабб басдасабдс дссаааадаб сдсдсаасбд 660
ддссбсаааб ассбдбда 678
<210> 296 <211> 225 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (22)...(174) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 296
Меб 1 Азп Ьуз Рго УаЬ 5 УаЬ УаЬ Агд СЬп УаЬ 10 СЬи СЬп Рго Рго АЬа 15 Азр
АЬа УаЬ АЬа АЬа Ьеи СЬи Ьуз Туг СЬу УаЬ ТЬг ТЬг УаЬ НЬз СЬи АЬа
20 25 30
СЬп СЬу Агд Суз СЬу Ьеи Ьеи СЬу НЬз Туг Меб Агд Рго Ые РЬе Рго
35 40 45
СЬу АЬа АЬа Ые Зег СЬу Зег АЬа УаЬ ТЬг УаЬ АЬа Ьеи Рго Рго СЬу
50 55 60
Азр Азп Ьеи Меб Ые НЬз УаЬ АЬа УаЬ СЬи УаЬ Суз СЬу Рго СЬу Азп
65 70 75 80
Не Ьеи УаЬ УаЬ АЬа Рго ТЬг Зег Рго Зег ТЬг Азр СЬу Туг РЬе СЬу
85 90 95
СЬи Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег Ьеи Агд АЬа Агд Азр УаЬ Ьуз СЬу Ьеи УаЬ
100 105 110
Ые Азр АЬа СЬу Суз Агд Азр УаЬ Агд Зег Ьеи ТЬг СЬи Меб Ьуз РЬе
115 120 125
Рго УаЬ Тгр Зег Агд АЬа Ые Зег Зег СЬп СЬу ТЬг УаЬ Ьуз АЬа ТЬг
130 135 140
Ьеи СЬу Зег УаЬ Азп УаЬ Рго УаЬ ТЬг Суз АЬа СЬу АЬа Ьеи УаЬ СЬи
145 150 155 160
АЬа СЬу Азр УаЬ Ые УаЬ АЬа Азр Азр Азр СЬу УаЬ УаЬ УаЬ УаЬ Ьуз
- 411 019971
165 170 175
Агд А1а НЬз А1а 180 Н1з С1и Уа1 А1а А1а 185 А1а А1а С1и С1п Агд 190 Уа1 Агд
Ьуз С1и Азп 195 11е ТНг Агд С1и Агд 200 Ьеи Агд Агд С1у С1и 205 Ьеи С1у Ьеи
Азр 11е Туг Азр Меб Агд О1п Ьуз 11е А1а С1п Ьеи С1у Ьеи Ьуз Туг
210 215 220
Ьеи
225 <210> 297 <211> 672 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 297 абдддбдбсд бсдбссаааа сабсдадсдд дсбдсдсаад ддассабсда ссдссбсдсс 60
дссбдсдддд бддсбассдб ссабдаадсд саддддсдса аддддсбдсб ддсдадссас 120
абдсддссдд бсбасадддд сдсасддсбс дссдсдадсд сддбдасдаб ббсддсдссд 180
сссддсдаса асбддабдаб ссабдбсдсс абсдадсадс бссаадссдд сдасабсабд 240
дбдсбддсдс сдассадссс дбдсдаддас ддабабббсд дсдассбссб ддсдассбсд 300
дсдсаддсдс дсдддбдсаа ддддсбддбд абсдабдссд дсдбдсдсда сдббдссдас 360
сббасддсаа бдсадббссс ддбдбддбсд ааддсдабсб бсдсдсаддд сасдсбдааа 420
дадасдсбдд дббсддбдаа сдбдссддбд дбсбдсдссд дсдсдсбддб саасссдддс 480
дасдбсабсд бсдссдабда сдасддддбс бдсдбддбас дссдсдадда ддбсдаддса 540
дбддсддааа аддсддаадс ссдсдбсдсб дссдаддадд асаадсдсаа дсдссбсдсс 600
дддддадаас бддддсбсда сабсбасаад абдсдсдадс дсббддссда даадддссбс 660
ааабабдбсб да 672
<210> 298 <211> 223 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (20)...( 172) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 298
Меб С1у Уа1 Уа1 Уа1 С1п Азп 11е С1и Агд А1а А1а С1п С1у ТНг 11е
- 412 019971
1 5 10 15
Азр Агд Ьеи А1а А1а Суз С1у Уа1 А1а ТНг Уа1 Нтз С1и А1а С1п С1у
20 25 30
Агд Ьуз С1у Ьеи Ьеи А1а Зег Нтз Меб Агд Рго Уа1 Туг Агд С1у А1а
35 40 45
Агд Ьеи А1а А1а Зег А1а Уа1 ТНг Не Зег А1а Рго Рго С1у Азр Азп
50 55 60
Тгр Меб 11е Нтз Уа1 А1а 11е С1и С1п Ьеи С1п А1а С1у Азр 11е Меб
65 70 75 80
Уа1 Ьеи А1а Рго ТНг Зег Рго Суз С1и Азр С1у Туг РНе С1у Азр Ьеи
85 90 95
Ьеи А1а ТНг Зег А1а С1п А1а Агд С1у Суз Ьуз С1у Ьеи Уа1 11е Азр
100 105 110
А1а С1у Уа1 Агд Азр Уа1 А1а Азр Ьеи ТНг А1а Меб С1п РНе Рго Уа1
115 120 125
Тгр Зег Ьуз А1а 11е РНе А1а С1п С1у ТНг Ьеи Ьуз С1и ТНг Ьеи С1у
130 135 140
Зег Уа1 Азп Уа1 Рго Уа1 Уа1 Суз А1а С1у А1а Ьеи Уа1 Азп Рго С1у
145 150 155 160
Азр Уа1 11е Уа1 А1а Азр Азр Азр С1у Уа1 Суз Уа1 Уа1 Агд Агд С1и
165 170 175
С1и Уа1 С1и А1а Уа1 А1а С1и Ьуз А1а С1и А1а Агд Уа1 А1а А1а С1и
180 185 190
С1и Азр Ьуз Агд Ьуз Агд Ьеи А1а С1у С1у С1и Ьеи С1у Ьеи Азр 11е
195 200 205
Туг Ьуз Меб Агд С1и Агд Ьеи А1а С1и Ьуз С1у Ьеи Ьуз Туг Уа1
210 215 220
<210> 299 <211> 501 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 299
абдддббссб бддсаасбдс сдаадсббдб дасасдаабд садсасассб дасаадсддб 60
дасабссддд бссбдссасс асбсббсаад абббасдддс ааадбсдддс аббсбсбддд 120
ссаабсдбда сбдбдааддб абббдаадас аабдбдсбдд басдддаасб бсббдааасс 180
аааддсдасд дбададббсб ддбдабадас ддсддаддда дсабдаддбд бдссббддбс 240
ддаддааасс бддддсадбб адсдсадаас абддддбддд сддддаббдб бдбааасддд 300
бдсабаадад асдбадабда дабсаасддд ЪдсдаХдЪХд дддббададс аббддсабсс 360
сабссасада адбсдаабаа аааддддсаб ддддадааас асабдссдаб баабабсдсд 420
- 413 019971 ддсасдабда Рссдадасдд ададрддррд Ьабдсадаса дЬдаЬддсаЬ РсРсаРсРсс 480 адаасРдадс РсРсРаРсРа д 501 <210> 300 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (2)...(159) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 300
Меб 1 С1у Зег Ьеи А1а 5 ТНг А1а С1и А1а Суз 10 Азр ТЬг Азп А1а А1а 15 Нтз
Ьеи ТЬг Зег С1у Азр Не Агд Уа1 Ьеи Рго Рго Ьеи РЬе Ьуз Не Туг
20 25 30
С1у С1п Зег Агд А1а РЬе Зег С1у Рго Не Уа1 ТЬг Уа1 Ьуз Уа1 РЬе
35 40 45
С1и Азр Азп Уа1 Ьеи Уа1 Агд С1и Ьеи Ьеи С1и ТЬг Ьуз С1у Азр С1у
50 55 60
Агд Уа1 Ьеи Уа1 Не Азр С1у С1у С1у Зег Меб Агд Суз А1а Ьеи Уа1
65 70 75 80
С1у С1у Азп Ьеи С1у С1п Ьеи А1а С1п Азп Мер С1у Тгр А1а С1у Не
85 90 95
\7а1 Уа1 Азп С1у Суз Не Агд Азр Уа1 Азр С1и Не Азп С1у Суз Азр
100 105 110
Уа1 С1у Уа1 Агд А1а Ьеи А1а Зег Нт з Рго С1п Ьуз Зег Азп Ьуз Ьуз
115 120 125
С1у Нтз С1у С1и Ьуз Нтз Мер Рго Не Азп Не А1а С1у ТЬг Меб Не
130 135 140
Агд Азр С1у (31и Тгр Ьеи Туг А1а Азр Зег Азр С1у Не Ьеи Не Зег
145 150 155 160
Агд ТЬг С1и Ьеи Зег 11е
165 <210> 301 <211> 501 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 301 аЬдддЬЬссЬ ЬддсаасЬдс сдаадсЬЬдЬ дасасдаабд садсасассб дасаадсддб 60
- 414 019971
дасаРссддд РссРдссасс асРсРРсаад аРРРасдддс ааадРсдддс аРРсРсРддд 120
ссааРсдРда сРдРдааддР аРРРдаадас ааРдРдсРдд РасдддаасР РсРРдааасс 180
аааддсдасд дРададРРсР ддРдаРадас ддсддаддда дсардаддрд РдссРРддРс 240
ддаддааасс РддддсадРР адсРсадаас арддддрддд садддаРРдР РдРааасддд 300
РдсаРаадад асарадарда даРсаасддд РдсдаРдРРд дддРРададс аррддсарсс 360
саРссасада адРсдааРаа аааддддсаР ддддадааас асаРдссдаР РааРаРсдсд 420
ддсасдаРда Рссдадасдд ададРддРРд РаРдсадаса дРдаРддсаР РсРсаРсРсс 480
адаасрдадс РсРсРаРсРа д 501
<210> 302 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (2)...(159) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 302
Меб 1 СЬу Зег Ьеи АЬа 5 ТЬг АЬа С1и АЬа Суз 10 Азр ТЬг Азп АЬа АЬа 15 Н13
Ьеи ТЬг Зег СЬу Азр Не Агд Уа1 Ьеи Рго Рго Ьеи РЬе Ьуз 11е Туг
20 25 30
СЬу С1п Зег Агд АЬа РЬе Зег С1 у Рго Не Уа1 ТЬг Уа1 Ьуз Уа1 РЬе
35 40 45
СЬи Азр Азп УаЬ Ьеи Уа1 Агд С1и Ьеи Ьеи СЬи ТЬг Ьуз С1у Азр СЬу
50 55 60
Агд Уа1 Ьеи УаЬ Не Азр СЬу С1у С1у Зег Мер Агд Суз АЬ а Ьеи Уа1
65 70 75 80
С1у СЬу Азп Ьеи СЬу СЬп Ьеи А1а С1п Азп Мер СЬу Тгр АЬа СЬу 11е
85 90 95
Уа1 Уа1 Азп С1у Суз Не Агд Азр Не Азр СЬи Не Азп С1у Суз Азр
100 105 110
Уа1 СЬу \7аЬ Агд АЬа Ьеи А1а Зег Н1з Рго С1п Ьуз Зег Азп Ьуз Ьуз
115 120 125
СЬу НЬз С1у СЬи Ьуз НЬз Меб Рго Не Азп 11е А1а СЬу ТЬг Мер Не
130 135 140
Агд Азр СЬу С1и Тгр Ьеи Туг АЬа Азр Зег Азр СЬу Не Ьеи Не Зег
145 150 155 160
Агд ТЬг С1и Ьеи Зег Не
165
- 415 019971 <210> 303 <211> 501 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 303 абддссббад баассасбдс сдаадбббдб дабдсдаасс сасадсбсаб бдбдадсддс60 дадсббсдсд сасбссабсс ааббббссаа абббасддба ддсддсаадб сббсбссддд120 сссдббдбба сдсбдааддб дбббдаадаб аабдбдббдд бдсдсдаабб бсббдаддад180 аддддсаабд дсадддббсб бдббдбсдаб ддбддбддса дсббдадабд сдсаабасбс240 ддбддсаасс ссдббдбаса адсбсадаас аасдддбддд сбддсаббдб ддббаасддд300 бдбабааддд абдббдабда аабсаасддд бдсдасаббд дадбсададс бсбддссдсд360 сасссддбда аадссаабаа даааддсабс ддбдадаадс абдббссддб даасаббддб420 ддаасссдба Сабдбдабдд ададбддсбс бабдсадаба ссдабддбаб бббддбдбсб 480 аааассдадб бдбсбдбсба а501 <210> 304 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (2)...(159) <223> Диметилменахинонметилтрансфераза <400> 304
Меб 1 А1а Ьеи Уа1 ТНг 5 ТНг А1а О1и Уа1 Суз 10 Азр А1а Азп Рго <31п 15 Ьеи
11е \7а1 8ег <31у С1и Ьеи Агд А1а Ьеи Нтз Рго 11е РНе С1п Не Туг
20 25 30
С1у Агд Агд С1п Уа1 РНе Бег С1у Рго Уа1 Уа1 ТНг Ьеи Ьуз Уа1 РНе
35 40 45
<31и Азр Азп Уа1 Ьеи Уа1 Агд С1и РНе Ьеи С1и С1и Агд С1у Азп С1у
50 55 60
Агд \7а1 Ьеи Уа1 Уа1 Азр С1у С1у С1у Бег Ьеи Агд Суз А1а 11е Ьеи
65 70 75 80
С1у С1у Азп Рго Уа1 Уа1 С1п А1а С1п Азп Азп С1у Тгр А1а С1у 11е
85 90 95
Уа1 Уа1 Азп С1у Суз 11е Агд Азр Уа1 Азр С1и 11е Азп <31у Суз Азр
100 105 110
- 416 019971
Ые СЬу УаЬ 115 Агд АЬа Ьеи АЬа АЬа 120 НЬз Рго УаЬ Ьуз АЬа 125 Азп Ьуз Ьуз
СЬу Не 130 СЬу СЬи Ьуз НЬз УаЬ 135 Рго УаЬ Азп Ые СЬу 140 СЬу ТИг Агд Ые
Суз 145 Азр СЬу СЬи Тгр Ьеи 150 Туг АЬа Азр ТЬг Азр 155 СЬу Ые Ьеи УаЬ Зег 160
Ьуз ТЬг СЬи Ьеи Зег УаЬ
165 <210> 305 <2Ы> 639 ' <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 305
ббддабсааа бссасааабс сддсаббабс сссдбсдбсд ааабсдасбс ддбадаасдс 60
дссдбсссдс бддсбдаддс аббдсббдса ддадддсбда сддбсдбдда дабсасссбс 120
сдсассдддд сддсдсбсда дбсдаббсда дсааббдсбс адсаддбасс ададдбсадб 180
дбсддддсад даасадбсаб бассбдддаа саддсдсадд сддсасдбда бдсаддсдсд 240
садббссбсд бсбсассддд дабддбддад саддббдбса бсбдддсдса ддадсассад 300
сббссдабса бассбддсдс адсаасбссс ассдадабда бссдсддсаб саассбдддд 360
сбсаассбсс бдаааббсбб бсссдссдаа асдабдддбд дддбаадсдс бдббааддсд 420
ббабсбдасс сдбббссдса дббдаааббс аббсссасдд дсддсабсад дббддааааб 480
дсадсббсдб абсбсдсдса бссбаааабс сабдсбдбдд дсддсбсдбд дабадсдааа 540
сдададабда бсдсддабдд садабббдаб дадабссддс дбабддсаса ддаадссада 600
дассбддбаа адсадабсад даддаааасд абсссабда 639
<210> 306 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (1)...(195) <223> альдолаза КОРС и КНС <220>
<221> САЙТ <222> (32)...(41) <223> Активный центр альдолаз КОРС и КНС. Ргозббе ίά = Р300159 <400> 306
Меб Азр С1п 11е НЬз Ьуз Зег СЬу Ые Ые Рго УаЬ УаЬ СЬи Ые Азр 15 10 15
- 417 019971
Зег Уа1 С1и Агд 20 А1а Уа1 Рго Ьеи А1а 25 С1и А1а Ьеи Ьеи А1а 30 С1у С1у
Ьеи ТЬг Уа1 Уа1 С1и 11е ТЬг Ьеи Агд ТЬг С1у А1а А1а Ьеи С1и Зег
35 40 45
Не Агд А1а 11е А1а С1п С1п Уа1 Рго С1и Уа1 Зег Уа1 С1у А1а С1у
50 55 60
ТНг Уа1 Не ТЬг Тгр С1и С1п А1а С1п А1а А1а Агд Азр А1а С1у А1а
65 70 75 80
С1п РЬе Ьеи Уа1 Зег Рго С1у Меб Уа1 С1и С1п \7а1 Уа1 Не Тгр А1а
85 90 95
С1п С1и Н13 С1п Ьеи Рго Не Не Рго С1у А1а А1а ТНг Рго ТНг С1и
100 105 110
Меб 11е Агд 31у 11е Азп Ьеи С1у Ьеи Азп Ьеи Ьеи Ьуз РЬе РНе Рго
115 120 125
А1а С1и ТЬг Меб С1у С1у Уа1 Зег А1а \7а1 Ьуз А1а Ьеи Зег Азр Рго
130 135 140
РЬе Рго 31п Ьеи Ьуз РЬе Не Рго ТЬг С1у С1у Не Агд Ьеи <31и Азп
145 150 155 160
А1а А1а Зег Туг Ьеи А1а ΗΪ3 Рго Ьуз Не Н13 А1а Уа1 С1у С1у Зег
165 170 175
Тгр Не А1а Ьуз Агд С1и Меб Не А1а Азр С1у Агд РЬе Азр С1и Не
180 185 190
Агд Агд Меб А1а С1п С1и А1а Агд Азр Ьеи Уа1 Ьуз С1п 11е Агд Агд
195 200 205
Ьуз ТНг 11е Рго
210 <210> 307 <211> 639 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 307
ббдасбббда аасааддсдб дббдссбббд баббббааба аддасдадда ддбдадбабс 60
дсбдббббаа аадсбббаба бдаадсддда аббсдбасад ббдаабабас даабсдбддб 120
даадссдсаб бдааааасбб баадбсдббд сдсааддбаб дбдабассда аббдаабдда 180
абдбассбсд дбаббдддас даббаааааб ддссадсадд сасаадсббб бдбддабдса 240
ддбдсадабб абббааббад бссдддбдба дбддабдабд садсаааадб бдссдабсаа 300
аабддбббдб бабабдбдсс бддбдсаабд ассссаасад аааббабсад ддсададсаа 360
саабббддаб саасдсбддб дааасббббб ссдддбааба ббббаддссс бддсбббдбб 420
адбдсбабба аадааббдбб садсддаббд ааабббабба ббассддадд адббдаассд 480
- 418 019971
даадааааба аЬЁЬдааадд аОддОбсаас дсаддбдссд садсЬдбддд сабдддаадЬ 540
аааЁЁааЬЬа ссааасаддб ЁЁЬддааааЬ ааадасЬабд саааааЫзас ададЬбаасЬ 600
ааддаабсЁЁ ЁаадасЬдаЬ ЁаааЁЬддЬс ададддбаа 639
<210> 308 <211> 212 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (2)...(199) <223> альдолаза ΚΌΡΟ и КНС <400> 308
Меб 1 ТЬг Ьеи Ьуз С1п 5 С1у \7а1 Ьеи Рго Ьеи 10 Туг РЬе Азп Ьуз Азр 15 С1и
С1и \7а1 Зег 11е А1а Уа1 Ьеи Ьуз А1а Ьеи Туг С1и А1а С1у 11е Агд
20 25 30
ТЬг \7а1 С1и Туг ТЬг Азп Агд С1у С1и А1а А1а Ьеи Ьуз Азп РЬе Ьуз
35 40 45
Зег Ьеи Агд Ьуз Уа1 Суз Азр ТЬг С1и Ьеи Азп С1у Меб Туг Ьеи С1у
50 55 60
11е С1у ТЬг 11е Ьуз Азп С1у С1п С1п А1а С1п А1а РЬе Уа1 Азр А1а
65 70 75 80
С1у А1а Азр Туг Ьеи 11е Зег Рго С1у Уа1 Уа1 Азр Азр А1а А1а Ьуз
85 90 95
Уа1 А1а Азр С1п Азп С1у Ьеи Ьеи Туг Уа1 Рго С1у А1а Меб ТЬг Рго
100 105 110
ТЬг С1и 11е 11е Агд А1а С1и С1п С1п РЬе С1у Зег ТЬг Ьеи Уа1 Ьуз
115 120 125
Ьеи РЬе Рго С1у Азп 11е Ьеи С1у Рго С1у РЬе Уа1 Зег А1а 11е Ьуз
130 135 140
С1и Ьеи РЬе Зег С1у Ьеи Ьуз РЬе 11е 11е ТЬг С1у С1у Уа1 С1и Рго
145 150 155 160
С1и С1и Азп Азп Ьеи Ьуз С1у Тгр РЬе Азп А1а С1у А1а А1а А1а Уа1
165 170 175
С1у МеС С1у Зег Ьуз Ьеи Не ТЬг Ьуз О1п Уа1 Ьеи С1и Азп Ьуз Азр
180 185 190
Туг А1а Ьуз 11е ТЬг С1и Ьеи ТЬг Ьуз С1и Зег Ьеи Агд Ьеи 11е Ьуз
195 200 205
Ьеи Уа1 Агд С1у
210
- 419 019971 <210> 309 <211> 687 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 309 абдадбаббд сбдсааабас аддбдбадас аааааааабд адабссбаса аЪЪаасаЪРд60 саасааддбд РдббдссРРР дбабОббааб ааадабдаад аадбдадбаЬ СдсбдООбСд120 ааадсдССаб абдаддсадд саЬЬсдсаса дЬЬдадбаСа ссаабсдбдд адаадссдса180
ЪЪааааааЪЪ РЪааадбасЪ дадааааабб РдЪдаСасдд ааббдадбдд аЫабассЬд240 ддбабсддса ссаббааааа бддадаасад дсаааадсбб Ъбдббдабдс сддбдсадаб300
ЪаЬЪбааЪЪа дбссдддбдб ддбадабдаб дсадсааааа ОСдсбдабса ааабддаббд360
РСабабдбдс сбддбдссаб дасдссаасб даааббабса дддсадааса аШддбдса420 асасбддбаа аасШНсс сддбаабабб Рбаддсссбд дбббсдббад бдссдббаад480 дааббаббса дсддСРСдаа абСбабсабс асбддбддад бадаассбда адаааабааб540 ббдаааддаб ддбббаабдс аддбдсбдсд дссдбаддаа бдддаадбаа аббдабсаса600 ааасааасбб бддаааабаа адасбасдса ааааббасад адсбсасдаа ададбсббба 660 адаббдаббд аасбддбдсд дааабаа687 <210> 310 <211> 228 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (16)...(215) <223> альдолаза КОРС и КНС
<400> 310 Уаб Азр 10 Ьуз Ьуз Азп Сби 11е 15 Ьеи
Меб 1 Бег ббе Аба Аба 5 Азп ТЬг Сбу
Сбп Ьеи ТЬг Ьеи Сбп Сбп Сбу Уаб Ьеи Рго Ьеи Туг РЬе Азп Ьуз Азр
20 25 30
Сби Сби Уаб Бег ббе Аба Уаб Ьеи Ьуз Аба Ьеи Туг Сби Аба Сбу ббе
35 40 45
Агд ТЬг Уаб Сби Туг ТЬг Азп Агд Сбу Сби Аба Аба Ьеи Ьуз Азп РЬе
50 55 60
Ьуз Уаб Ьеи Агд Ьуз 11е Суз Азр ТЬг Сби Ьеи Бег Сбу Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
Сбу ббе Сбу ТЬг 11е Ьуз Азп Сбу Сби Сбп Аба Ьуз Аба РЬе Уаб Азр
- 420 019971
85 90 95
Аба Сбу Аба Азр Туг Реи 11е Зег Рго Сбу Уаб Уаб Азр Азр Аба Аба
100 105 110
Луз ббе Аба Азр Сбп Азп Сбу Реи Реи Туг Уаб Рго Сбу Аба Мер ТНг
115 120 125
Рго ТНг Сби ббе ббе Агд Аба Сби Сбп РНе Сбу Аба ТНг Деи Уаб Дуз
130 135 140
Леи РНе Рго Сбу Азп 11е Реи Сбу Рго Сбу РНе Уаб Зег Аба Уаб Дуз
145 150 155 160
Сби Реи РНе Зег Сбу Реи Луз РНе ббе ббе ТНг Сбу Сбу Уаб Сби Рго
165 170 175
Сби Сби Азп Азп Реи Луз Сбу Тгр РНе Азп Аба Сбу Аба Аба Аба Уаб
180 185 190
Сбу Мер Сбу Зег Луз Реи ббе ТНг Луз Сбп ТНг Деи Сби Азп Луз Азр
195 200 205
Туг Аба Луз ббе ТНг Сби Реи ТНг Луз Сби Зег Деи Агд Деи 11е Сби
210 215 220
Леи Уаб Агд Луз
225
<210> 311 <211> 600 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 311 аРдабаРРсд ссдаРдссаР адссдааРдс ддссРсаРсд ссаРссРдсд сддсаРРдса 60
асддсРдааа РРдаадссдР дддасаадсс сРсаРсдаад ссддсаРРсд сдРсдсРдаа 120
аРРссдсРда асРсдссдда РссаРРРдсс РссаРсдада аааРддссаа ддссРРсаад 180
ддсдадсРдд РРдРсддддс РддаассдРР сРсадРдРдс аддаРдРсаа РРРасРдааа 240
дсссаРддсд дссадаРсад сдРРРсРссс даРРдсаасд аддсддрддр сдсасдсасс 300
ааадаасРдд дРсРддадсс сдРРсссддс дРсРРсасдс ссасРдаддс РРРРдссдсд 360
аРссдсдссд дддсаассса РаРсаадРРд РРРссддсдд аадссдсаад ссссдсаасс 420
аРсадддссР ддсдсдсРдР РсРРссааад сардрдаааа РсРаРссддР дддсддсаРс 480
асдссадсаа аРаРдсаддд сРдддРРдаР дссддсдссд саддсРРРдд ааРРддсРса 540
ааРаРсРаРа адсадддддс сасадссдсс аасдрддсаа аддсддссаа ддааРРсРРР 600
<210> 312 <211> 200 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
- 421 019971 <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (4)...(198) <223> альдолаза КЭРО и КНС <400> 312
Меб 1 Не РНе АЬа Азр 5 А1а 1Ье АЬа СЬи Суз 10 СЬу Ьеи 11е А1а 11е 15 Ьеи
Агд СЬу 11е АЬа ТНг А1а СЬи Пе СЬи А1а УаЬ СЬу С1п А1а Ьеи 11е
20 25 30
СЬи АЬа СЬу 11е Агд УаЬ АЬа СЬи 11е Рго Ьеи Азп Зег Рго Азр Рго
35 40 45
РНе АЬа Зег 11е СЬи Ьуз Меб АЬа Ьуз А1а РНе Ьуз СЬу СЬи Ьеи УаЬ
50 55 60
УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг УаЬ Ьеи Зег УаЬ С1п Азр УаЬ Азп Ьеи Ьеи Ьуз
65 70 75 80
АЬа НЬз СЬу СЬу СЬп 11е Зег УаЬ Зег Рго Азр Суз Азп СЬи А1а Уа1
85 90 95
УаЬ А1а Агд ТНг Ьуз СЬи Ьеи СЬу Ьеи СЬи Рго УаЬ Рго СЬу УаЬ РНе
100 105 110
ТНг Рго ТНг СЬи А1а РНе АЬа АЬа 11е Агд АЬа СЬу А1а ТНг НЬз 11е
115 120 125
Ьуз Ьеи РНе Рго АЬа СЬи АЬа А1а Зег Рго АЬа ТНг Не Агд АЬа Тгр
130 135 140
Агд А1а УаЬ Ьеи Рго Ьуз НЬз УаЬ Ьуз 11е Туг Рго УаЬ СЬу СЬу 11е
145 150 155 160
ТНг Рго АЬа Азп Меб СЬп СЬу Тгр УаЬ Азр А1а СЬу А1а АЬа СЬу РНе
165 170 175
СЬу 11е СЬу Зег Азп Не Туг Ьуз СЬп СЬу А1а ТНг А1а АЬа Азп УаЬ
180 185 190
А1а Ьуз А1а АЬа Ьуз СЬи РНе РНе
195 200
<210> 313 <211> 681 <212> ДНК <213> Неизвестно
<220> <223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 313 абдадссадс ссдабадааа ссбдааддад ассдбдаббд сдббаасбаа ддаабдсддд 60
дббсбдсссб дсабсаадбб дсдсаааааа дабдабббба ббдссбабдс ссаддсдабд 120
бабдасддад дадсбсдсдб сабсдаадбд ассабдасаа сбссаддсдс ссбддаадсд 180
- 422 019971
абсдаадсса бббсдбсбдс сбббааадас ааасбсбабд ббдсббсддд сассасаббд 240
дасдсдбсса сбдсдсдсда ддбсабсасб сасддсддаа дсбдсаббдб баабссббдб 300
дбсабссссд аадбдабсда бдбсдссаас сдсбабддса ббссадббба ббссддадса 360
ббсасбдсда ссдаддбдбб сасддсдабд сдсдссддад сдбссабддб саааабаббб 420
сссдддддбс бдддсддсдс саадбасабд ассаабсбда ааабддбабб сссадаадбд 480
аассбдаббс сббсаддддд ааббаассбб дабаабдсбс ссдаабббаб бсдсдссддс 540
дссбдсдсбд бсадбддбдс асдаасбббс абддабсасд ааабдаббдс саадсабддб 600
ббдааабдда ббасбсааса дасдбсаааа ббсаббдаад бддббсбдда адсдаадсдд 660
аасдсбссад адббдссббд а 681
<210> 314 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (12)...(207) <223> альдолаза КОРС и КНС
<400> 314 Рго Азр 5 Агд Азп Ьеи Ьуз СЬи 10 ТЬг УаЬ ЬЬе АЬа Ьеи 15 ТЬг
Меб 1 Зег СЬп
Ьуз СЬи Суз СЬу УаЬ Ьеи Рго Суз ЬЬе Ьуз Ьеи Агд Ьуз Ьуз Азр Азр
20 25 30
РЬе ЬЬе АЬа Туг АЬа СЬп АЬа Меб Туг Азр СЬу СЬу АЬа Агд УаЬ Ые
35 40 45
СЬи УаЬ ТЬг Меб ТЬг ТЬг Рго СЬу АЬа Ьеи СЬи АЬа ЬЬе СЬи АЬа ЬЬе
50 55 60
Зег Зег АЬа РЬе Ьуз Азр Ьуз Ьеи Туг УаЬ АЬа Зег СЬу ТЬг ТЬг Ьеи
65 70 75 80
Азр АЬа Зег ТЬг АЬа Агд СЬи УаЬ ЬЬе ТЬг НЬз СЬу СЬу Зег Суз ЬЬе
85 90 95
УаЬ Азп Рго Суз УаЬ ЬЬе Рго СЬи УаЬ ЬЬе Азр УаЬ АЬа Азп Агд Туг
100 105 110
СЬу Не Рго УаЬ Туг Зег СЬу АЬа РЬе ТЬг АЬа ТЬг СЬи УаЬ РЬе ТЬг
115 120 125
АЬа Меб Агд АЬа СЬу АЬа Зег Меб УаЬ Ьуз ЬЬе РЬе Рго СЬу СЬу Ьеи
130 135 140
СЬу СЬу АЬа Ьуз Туг Меб ТЬг Азп Ьеи Ьуз Меб УаЬ РЬе Рго СЬи УаЬ
145 150 155 160
Азп Ьеи ЬЬе Рго Зег СЬу СЬу ЬЬе Азп Ьеи Азр Азп АЬа Рго СЬи РЬе
- 423 019971
165 170 175
Не Агд АЬа СЬу 180 АЬа Суз АЬа УаЬ Зег 185 СЬу АЬа Агд ТЬг РЬе 190 МеС Азр
НЬз СЬи МеС 195 ЬЬе АЬа Ьуз НЬз СЬу 200 Ьеи Ьуз Тгр Не ТЬг 205 С1п С1п ТЬг
Зег Ьуз РЬе Не СЬи УаЬ УаЬ Ьеи С1и А1а Ьуз Агд Азп А1а Рго СЬи
210 215 220
Ьеи Рго
225 <210> 315 <211> 576 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 315 аСддсасааС ССасаадааС адаадССдса асадсааСда аадааасСдд даСдаССссС 60
ССдССССССа асаасдаССС адааССаадС аааааадСаС СаааадсССд ССасдаСддС 120
ддадсасдсС СааСддааСС СасСдсСсдС ддадаССССд сасасдаадС ССССддСдаа 180
ССаасааааС аСдсааССдс адааССасса ддааСдаССа СдддСдСадд ССсСдСаасс 240
даСдсадсСд садсаСсССС аЬасаСддсС ССаддадсаа асСССаССдС аасСссадСа 300
ССаададаад аСаСадсааС СдСССдСаас адасдСааад ССССаСддСс СссСддССдС 360
ддаасСССаа сСдаааССас Сааддссдаа дааССаддаС дСдаааССдС ааааССаССс 420
ссСддСдаСа СССаСддасс СсааСССдСа аааддааССа ааддассаса ассССддасС 480
адСдСааСдс саасСддадд адСССсСсса асаааадааа аСССаасадд ССддСССааС 540
дсаддСдСаа сССдСдССдд ааСдддаСсС сааССа 576
<210> 316 <211> 192 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (9) . . . (192) <223> альдолаза КБРС и КНС <220>
<221> САЙТ <222> (176)...(179) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозгСе ίά = Р800001 <400> 316
- 424 019971
МеЕ 1 А1а С1п РНе ТНг 5 Агд Не С1и Уа1 А1а 10 ТНг А1а МеЕ Ьуз С1и 15 ТНг
С1у МеЕ 11е Рго Ьей РНе РНе Азп Азп Азр Ьей С1и Ьей Зег Ьуз Ьуз
20 25 30
Уа1 Ьей Ьуз А1а Суз Туг Азр С1у С1у А1а Агд Ьей МеЕ С1и РНе ТНг
35 40 45
А1а Агд С1у Азр РНе А1а Нтз С1и Уа1 РНе С1у С1и Ьей ТНг Ьуз Туг
50 55 60
А1а 11е А1а С1и Ьей Рго С1у МеЕ Не МеЕ С1у Уа1 С1у Зег \7а1 ТНг
65 70 75 80
Азр А1а А1а А1а А1а Зег Ьей Туг МеЕ А1а Ьей С1у А1а Азп РНе 11е
85 90 95
Уа1 ТЬг Рго \7а1 Ьей Агд С1и Азр 11е А1а 11е Уа1 Суз Азп Агд Агд
100 105 но
Ьуз \7а1 Ьей Тгр Зег Рго С1у Суз С1у ТНг Ьей ТНг С1и 11е ТНг Ьуз
115 120 125
А1а С1и С1и Ьей С1у Суз С1и 11е Уа1 Ьуз Ьей РНе Рго С1у Азр 11е
130 135 140
Туг С1у Рго С1п РНе \7а1 Ьуз С1у 11е Ьуз С1у Рго С1п Рго Тгр ТНг
145 150 155 160
Зег Уа1 МеЕ Рго ТНг С1у С1у Уа1 Зег Рго ТНг Ьуз С1и Азп Ьей ТНг
165 170 175
С1у Тгр РНе Азп А1а С1у Уа1 ТНг Суз Уа1 С1у МеЕ С1у Зег С1п Ьей
180 185 190 <210> 317 <211> 612 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 317
аЕдадсдддс дададаЕсаЕ ЕдсдаЕссЕд сддддсдЕдс дсссдааЕда ддЕддЕддсс 60
аЕЕдддсасд ЕЕсЕдсЕдда ЕдсаддЕаЕс дасаадаЕсд аадЕЕссдсЕ дааЕЕссссс 120
даЕдссЕЕЕд ааадсаЕЕдс дсЕЕЕЕддсд даЕдсдЕЕЕс асдаЕадЕдс ддЕдаЕаддЕ 180
дсЕддсассд ЕЕсЕдасдсс асаадасдЕд дЕдааддЕдс аЕсаасаддд ЕддсдсдаЕд 240
дЕддЕаЕсдс сЕдаЕЕдсаа ЕссддаЕдЕд аЕсааддсаа ссааддсдсЕ дддсаЕдЕЕд 300
ЕсЕЕассссд дЕдЕЕЕЕсас сссдассдаа дсЕЕЕЕассд сссЕдсдЕЕс ЕддЕдсддаЕ 360
дддаЕсааас ЕдЕЕЕссЕдс ЕЕсаддсаЕЕ ддсссЕдсад ддсЕддссдс даЕдЕЕддсс 420
дЕЕЕЕдссса саддсаЕдсд садсЕаЕдсд дЕддддддсд Есдддссада ЕадсЕЕсдсд 480
ссЕЕддаЕсд дадЕЕддсдЕ дассддаЕЕЕ ддсаЕЕддаа сдддссЕдЕЕ сааассдддд 540
- 425 019971
ЬЫддсасдд сЬдаЬдЬддс Ьааасдддса дсддасаНЬд Ьддсддссба ЬдабсддддЬ 600 аННдааа! да 612 <210> 318 <211> 203 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (1) . .. (192) <223> альдолаза КОРС и КНС
<400> 318 Агд Сбу Уаб Агд Рго 15 Азп
Меб 1 Зег Сбу Агд Сби 5 ббе 11е Аба 11е Ьеи 10
Сби Уаб Уаб Аба ббе Сбу Нбз Уаб Ьеи Ьеи Азр Аба Сбу ббе Азр Ьуз
20 25 30
11е Сби Уаб Рго Ьеи Азп Зег Рго Азр Аба РНе Сби Зег ббе Аба Ьеи
35 40 45
Ьеи Аба Азр Аба РНе Нбз Азр Зег Аба Уаб 11е Сбу Аба Сбу ТНг Уаб
50 55 60
Ьеи ТНг Рго Сбп Азр Уаб Уаб Ьуз Уаб Нбз Сбп Сбп Сбу Сбу Аба Меб
65 70 75 80
Уаб Уаб Зег Рго Азр Суз Азп Рго Азр Уаб 11е Ьуз Аба ТНг Ьуз Аба
85 90 95
Ьеи Сбу Меб Ьеи Зег Туг Рго Сбу Уаб РНе ТНг Рго ТНг Сби Аба РНе
100 105 110
ТНг Аба Ьеи Агд Зег Сбу Аба Азр Сбу I бе Ьуз Ьеи РНе Рго Аба Зег
115 120 125
Сбу ббе Сбу Рго Аба Сбу Ьеи Аба Аба МеЬ Ьеи Аба Уаб Ьеи Рго ТНг
130 135 140
Сбу Меб Агд Зег Туг Аба Уаб Сбу Сбу Уаб Сбу Рго Азр Зег РНе Аба
145 150 155 160
Рго Тгр 11е Сбу Уаб Сбу Уаб ТНг Сбу РНе Сбу ббе Сбу ТНг Сбу Ьеи
165 170 175
РНе Ьуз Рго Сбу РНе Сбу ТНг Аба Азр Уаб Аба Ьуз Агд Аба Аба Азр
180 185 190
Не Уаб Аба Аба Туг Азр Агд Сбу 11е Ьеи Ьуз
195 200
<210> 319 <211> 600 <212> ДНК <213> Неизвестно
- 426 019971
<220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 319
дбдссддббс бддбсабсда адасдбсааб дабдссдбдс сдсббдссаа ддссббддбд 60
дссддбддбб бдсдсдбдсб бдааабсасс сбдсдсадбд ссдссдссда ддааадсабб 120
ааасдбабба бсдссдаадб бсссдабдса аббассддбд сдддсассдб дабсаабдсс 180
ааасадабдд аасдбабддс сдааабсддб бдбдсббббд сддбббсдсс дддссабасс 240
дабддбббдс ббааддссдс сааадабасс ддсдбдссдб бдсбдсссдд бдссддаасд 300
ссдбсбдааа бсабдсабсб даббдабсаб ддсбабдаса бсббдааабб сббсссддсс 360
даасаасадд дсддбдбббс дабдсббааа дсссбдбсбд дсссдсбдсс асаддбдааа 420
ббсбдсссда сдддбддбдб дбсдсбддса аабббддддд аббабсбсдс ссбдссаааб 480
абсабсассд ббддбдддбс дбдддбсбсд ссааааадсд сддбсааддс сддбдасбдд 540
дсаасдабса сдсдссбддс асаддаадса ассдасаадд ббдссдаасб бсдсддббаа 600
<210> 320 <2Ы> 199 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (1)...(186) <223> альдолаза КОРС и КНС <220>
<221> САЙТ <222> (23) ... (32) <223> Активный центр альдолаз КЬРС и КНС. Ргозтбе ίά = Р300159 <220>
<221> САЙТ <222> (112) . . . (125) <223> Образующий основание Шиффа остаток альдолаз КОРС и КНС. РгозЬбе ίά
Р300160 <400> 320
Меб 1 Рго УаЬ Ьеи УаЬ 5 11е СЬи Азр УаЬ Азп 10 Азр АЬа УаЬ Рго Ьеи 15 АЬа
Ьуз АЬа Ьеи УаЬ АЬа СЬу СЬу Ьеи Агд УаЬ Ьеи СЬи 11е ТЬг Ьеи Агд
20 25 30
Зег А1а А1а АЬа СЬи СЬи Зег Не Ьуз Агд Пе 11е АЬа СЬи УаЬ Рго
35 40 45
Азр АЬа Не ТЬг СЬу АЬа СЬу ТЬг УаЬ 11е Азп АЬа Ьуз СЬп Меб СЬи
50 55 60
Агд Меб АЬа СЬи Не СЬу Суз АЬа РЬе АЬа УаЬ Зег Рго СЬу НЬз ТЬг
65 70 75 80
- 427 019971
Азр С1у Ьеи Ьеи Ьуз 85 А1а А1а Ьуз Азр ТЬг 90 С1у Уа1 Рго Ьеи Ьеи 95 Рго
С1у А1а С1у ТЬг Рго Зег С1и Не Меб НЬз Ьеи 11е Азр Н1з С1у Туг
100 105 110
Азр Не Ьеи Ьуз РЬе РЬе Рго А1а С1и С1п С1п С1у С1у Уа1 Зег Меб
115 120 125
Ьеи Ьуз А1а Ьеи Зег С1у Рго Ьеи Рго С1п Уа1 Ьуз РЬе Суз Рго ТЬг
130 135 140
С1у С1у Уа1 Зег Ьеи А1а Азп Ьеи С1у Азр Туг Ьеи А1а Ьеи Рго Азп
145 150 155 160
Не Не ТЬг Уа1 С1у С1у Зег Тгр Уа1 Зег Рго Ьуз Зег А1а Уа1 Ьуз
165 170 175
А1а С1у Азр Тгр А1а ТЬг 11е ТЬг Агд Ьеи А1а С1п С1и А1а ТЬг Азр
180 185 190
Ьуз Уа1 А1а С1и Ьеи Агд С1у
195 <210> 321 <211> 654 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды
<400> 321 абдассадсд ааасдаасса дабаббадад дсдааабббд ссдсбдсдсс ддбддбдссс 60
сбдабсдаад ссадбдассс басддббдсд дбадсаабсд саааадсдсб дсаддсдддс 120
ддссбсдабд бдабсдаадб сдбссбссдд ассдасдсдд сдсбсдаббд сабддаадсс 180
аббабсдсдд адасббсдда сабсаббдбб ддсдсдддаа саабсббдас сдсбдасдаб 240
дсдааддсад сбдббасссд сддсдсдсад ббсаббдбдб дсссдддасб ддбсдасдсд 300
дбддбсаабб бсбдсааддс ааабдабсбб ссддбсббсс сдддаасааб дассссдддс 360
даадбдсаас аддсссабаа бсбсддбсбс ддаасддбда ааббсбббсс сдссааасбс 420
дсбддсддбд бдссдабдсб сааддсаббд адсбсддбсб ббсдсаабаб дсдбббсабд 480
ссдасдддбд дддбдбсадс ададаабсбд ддсдаабббс бддссдбдсс ббссдбаабб 540
дссбдсддсд дбадсбддсб сасдссдааа дсддсбабсд асдсдддсда ббасдабдса 600
абсассаадс бддсссдбда адсбдбсдсб сбсдсасдбд ссбсбадасс абаа 654
<210> 322 <211> 217 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно
<220> <223> Белок, полученный из образца из окружающей среды
- 428 019971 <220>
<221> ДОМЕН <222> (9)...(204) <223> альдолаза КОРС и КНС <400> 322
Мер 1 ТНг Зег Сби ТЬг 5 Азп Сбп 11е Ьей Сби 10 Аба Ьуз РНе Аба Аба 15 Аба
Рго Уаб Уаб Рго Ьей ббе Сби Аба Зег Азр Рго ТЬг Уаб Аба Уаб Аба
20 25 30
ббе Аба Ьуз Аба Ьей Сбп Аба Сбу Сбу Ьей Азр Уаб ббе Сби Уаб Уаб
35 40 45
Леи Агд ТНг Азр Аба Аба Ьей Азр Суз Мер Сби Аба 11е 11е Аба Сби
50 55 60
ТНг Зег Азр ббе ббе Уаб Сбу Аба Сбу ТНг 11е Ьей ТНг Аба Азр Азр
65 70 75 80
Аба Луз Аба Аба Уаб ТНг Агд Сбу Аба Сбп РЬе ббе Уаб Суз Рго Сбу
85 90 95
Леи Уаб Азр Аба Уаб Уаб Азп РЬе Суз Ьуз Аба Азп Азр Ьей Рго Уаб
100 105 110
РЬе Рго Сбу ТНг Мер ТНг Рго Сбу Сби Уаб Сбп Сбп Аба Нбз Азп Ьей
115 120 125
Сбу Леи Сбу ТНг Уаб Ьуз РНе РНе Рго Аба Ьуз Ьей Аба Сбу Сбу Уаб
130 135 140
Рго Мер Ьей Ьуз Аба Ьей Зег Зег Уаб РНе Агд Азп Мер Агд РНе Мер
145 150 155 160
Рго ТНг Сбу Сбу Уаб Зег Аба Сби Азп Ьей Сбу Сби РЬе Ьей Аба Уаб
165 170 175
Рго Зег Уаб 11е Аба Суз Сбу Сбу Зег Тгр Ьей ТНг Рго Ьуз Аба Аба
180 185 190
ббе Азр Аба Сбу Азр Туг Азр Аба 11е ТНг Ьуз Ьей Аба Агд Сби Аба
195 200 205
Уаб Аба Ьей Аба Агд Аба Зег Агд Рго
210 215 <210> 323 <211> 603 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 323
аРдасдРРсс сссРдадаРс асрсдрддаа дссдсдасса аддсассдаР РдРасссдРР 60
сРддРсдРсд ассдсаРРда адррдсддсс ссссРРдсдс дддсдсРРдР РдаРддсддс 120
сРдасааРРд ссдаадРсас дсрдсдааса ссРРсддддс РддсддРааР сдаададаРд 180
- 429 019971
ааабссдссд адсссддссб дааддбсддс дсдддсассд бдббдассда абссдабдбс 240
дадаасдсаб бддсддссдд сдсддабббс сбсдбддсас сдддсабдбс дссаааасбд 300
ббддссддас бдддбддсса ссдссдссбд абдабсссбд дсдббдсдас адссадсдаа 360
дссабддсса ддсасдадда сдддббсдас сбдббдааас бдбббссддс сбсдаббдсс 420
ддеддадбеа дсдсбсбсаа ддсдсббддс ддбссдсбдс сдсассбдсд сббсабдссд 480
ассддсддса бсассдаддс ддабдбсддс ааабассбсд сссббсссаа бдббббсдсд 540
дееддаддеб едбддаббде дасдддсдсс дасаббдсбд ссдаадасбс дадссдаабб 600
ебб 603 <210> 324 <211> 201 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (9)...(201) <223> альдолаза КОРС и КНС <220>
<221> САЙТ <222> (40)...(49) <223> Активный центр альдолаз КОРС и КНС. Ргозтбе ίά = Р300159 <400> 324
Меб 1 ТНг РНе Рго Ьеи 5 Агд Зег Ьеи Уа1 С1и 10 А1а А1а ТНг Ьуз А1а 15 Рго
11е Уа1 Рго Уа1 Ьеи Уа1 Уа1 Азр Агд 11е С1и Уа1 А1а А1а Рго Ьеи
20 25 30
А1а Агд А1а Ьеи Уа1 Азр С1у С1у Ьеи ТНг 11е А1а С1и Уа1 ТНг Ьеи
35 40 45
Агд ТНг Рго Зег С1у Ьеи А1а Уа1 Пе С1и С1и Меб Ьуз Зег А1а С1и
50 55 60
Рго С1у Ьеи Ьуз Уа1 С1у А1а С1у ТНг Уа1 Ьеи ТНг С1и Зег Азр Уа1
65 70 75 80
С1и Азп А1а Ьеи А1а А1а С1у А1а Азр РНе Ьеи Уа1 А1а Рго С1у Меб
85 90 95
Зег Рго Ьуз Ьеи Ьеи А1а С1у Ьеи С1у С1у ΗΪ5 Агд Агд Ьеи Меб 11е
100 105 110
Рго С1у Уа1 А1а ТНг А1а Зег С1и А1а Меб А1а Агд ΗΪ3 С1и Азр С1у
115 120 125
РНе Азр Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи РНе Рго А1а Зег 11е А1а С1у С1у Уа1 Зег
130 135 140
А1а Ьеи Ьуз А1а Ьеи С1у С1у Рго Ьеи Рго Нтз Ьеи Агд РНе Меб Рго
- 430 019971
145 150 155 160
ТЬг СЬу СЬу Не ТЬг 165 С1и АЬа Азр Уа1 С1у 170 Ьуз Туг Ьеи А1а Ьеи 175 Рго
Азп УаЬ РЬе АЬа 18 0 А1а СЬу С1у Зег Тгр 185 Не А1а ТЬг С1у А1а 190 Азр 11е
А1а АЬа СЬи Азр Зег Зег Агд Не Ьеи
195 200 <210> 325 <211> 648 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, <400> 325 полученная из образца из окружающей среды
абасаадаад Раааддадаб РддбПаПд ссШаЬаЫ абсасдасда ЬдсадсЬабб 60
РдРсбдааад Радсбаабас РСбдбаРдаР дссдабдЬаа ааРдсабада аРНасааас 120
сдрддрдааб абдсасПас ааасИЬааа сасПадбда адсбдадада Рдаааадабд 180
аааддрсбаб РдсИдсадб дддсасааИ аааассддда сддаЬдсбса даааЬЫаи 240
даЬдссддбд ссдаЫШЛ дабсадссса абаРПдаса дсадсдПЬд сдабасддсс 300
РаИРдааЬа ааасдПдЪд дабассаддб Рдбасаасдс саасадаааб РсаРдбадса 360
садсаадсдд дПдЬаадсб ЬаЬсаааРЪа РЪсссдддаа аЬдЬасЬддд дссдддПП 420
дбадаадсда РсабдссаИ аПсадРдда аПдаШТа сдарсасбдд Рддадбадаа 480
дсаасадаад саааРсбддд ЬдссбддПР аааЬсаддбд ЬдааддбадР Ьддаабдддс 540
адсаадсРРа Раасаааада саШЬааад ааРддбдаП абдаСддаП дааадсбааа 600
асаааадаад РдсПРсааб ааПсдасаб аРРааабсад сЬааабад 648
<210> 326
<211> 215
<212> БЕЛОК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (1)...(200) <223> альдолаза КБРС и КНО <220>
<221> САЙТ <222> (104) .. . (107) <223> Участок Ν-гликозилирования. РгозЬРе ίά = Р300001 <400> 326
11е С1п С1и Уа1 Ьуз С1и 11е С1у Ьеи Ьеи Рго Ьеи Туг Туг Нтз Азр
- 431 019971
1 5 10 15
Азр АЬа АЬа 11е Суз Ьеи Ьуз УаЬ А1а Азп ТНг Ьеи Туг Азр А1а Азр
20 25 30
Уа1 Ьуз Суз ЬЬе СЬи РНе ТНг Азп Агд СЬу СЬи Туг АЬа Ьеи ТНг Азп
35 40 45
РНе Ьуз Ηίδ Ьеи УаЬ Ьуз Ьеи Агд Азр СЬи Ьуз МеС Ьуз СЬу Ьеи Ьеи
50 55 60
Ьеи АЬа УаЬ СЬу ТНг 11е Ьуз ТНг СЬу ТНг Азр А1а СЬп Ьуз РНе 11е
65 70 75 80
Азр АЬа СЬу АЬа Азр РНе Ьеи 11е Зег Рго 11е РНе Азр Зег Зег УаЬ
85 90 95
Суз Азр ТНг АЬа Туг Ьеи Азп Ьуз ТНг Ьеи Тгр 11е Рго СЬу Суз ТНг
100 105 110
ТЬг Рго ТЬг СЬи 1Ье НЬз УаЬ А1а СЬп С1п А1а СЬу Суз Ьуз Ьеи 1Ье
115 120 125
Ьуз Ьеи РНе Рго СЬу Азп УаЬ Ьеи СЬу Рго СЬу РНе УаЬ СЬи АЬа Не
ЬЗО 135 140
МеС Рго Ьеи РНе Зег СЬу Не Азр РНе ТНг 11е ТНг СЬу СЬу УаЬ СЬи
145 150 155 160
АЬа ТЬг СЬи АЬа Азп Ьеи СЬу А1а Тгр РНе Ьуз Зег СЬу УаЬ Ьуз УаЬ
165 170 175
УаЬ СЬу МеС СЬу Зег Ьуз Ьеи 11е ТНг Ьуз Азр Не Ьеи Ьуз Азп СЬу
180 185 190
Азр Туг Азр СЬу Ьеи Ьуз А1а Ьуз ТНг Ьуз СЬи УаЬ Ьеи Зег 11е Не
195 200 205
Агд НЬз 11е Ьуз Зег А1а Ьуз
210 215 <210> 327 <211> 642 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 327 аСддаасааб сЬаЬсЬЬЬда ССасСЬсЬас аааабсддсд СсаССсссдЬ асЬддааабс60 дасСсддсдс СЬсаЬдссаа ассдЬЬадсс даддсдсСдс Ьддсаддадд СсЬдссЬаСс120 дссдадабса сасбдсдсас сдаддсадсд сбсдаддсда ЬЬсдсасСаЬ СдсдсдсдаС180 дСассддабд ЬсаЬсдбсдд ддсбддаасс дбдаЬаассЬ дддаасаадс сдаадсддса240 сдбдасдсдд дсдсдсааЬЬ СсСсдбсЬса сссдддабдд ЬддадсаддЬ ЬдЬсаЬсЬдд300 дсасаддааа аЬсааабссс СдНсбдссс ддсдсЬдбда сссссассда даЬдабссдс360 дссаСссабс ЬсддСЬСдаа дЬЬЬсЬдааа ЬЬЬССсссаЬ сддаадсСдб аддсддасбс420
- 432 019971
ааадсссбса аддсссбсбс адассссббб ссдддаббдс дабббабссс аассддбдда 480
дбдаадбббд адаабсбддс ддаббабсба сааабддааа адабссасдс бдбсддсддс 540
бсдбддабдд сааадсдсса дабдабсдсс дассдааааб бсдасдадаб басдсдаббд 600
дсдаабдаад ссадсдассб бдбдасаааа абсаддаадб ад 642
<210> 328 <211> 213 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (5)...(200) <223> альдолаза КОРС и КНС <220>
<221> САЙТ <222> (37)...(46) <223> Активный центр альдолаз КОРС и КНС. Ргозхбе ίά = Р300159 <400> 328
Меб 1 С1и С1п Зег 11е 5 РНе Азр Туг РНе Туг 10 Ьуз Не С1у Уа1 11е 15 Рго
Уа1 Ьеи С1и Не Азр Зег А1а Ьеи Нтз А1а Ьуз Рго Ьеи А1а С1и А1а
20 25 30
Ьеи Ьеи А1а С1у С1у Ьеи Рго 11е А1а С1и 11е ТНг Ьеи Агд ТНг С1и
35 40 45
А1а А1а Ьеи С1и А1а Не Агд ТНг Не А1а Агд Азр Уа1 Рго Азр Уа1
50 55 60
11е Уа1 С1у А1а С1у ТНг Уа1 11е ТНг Тгр С1и С1п А1а С1и А1а А1а
65 70 75 80
Агд Азр А1а С1у А1а С1п РНе Ьеи Уа1 Зег Рго С1у Меб Уа1 С1и С1п
85 90 95
Уа1 Уа1 11е Тгр А1а С1п С1и Азп С1п Не Рго Уа1 Ьеи Рго С1у А1а
100 105 110
Уа1 ТНг Рго ТНг С1и Меб 11е Агд А1а 11е Нтз Ьеи С1у Ьеи Ьуз РНе
115 120 125
Ьеи Ьуз РНе РНе Рго Зег С1и А1а Уа1 С1у С1у Ьеи Ьуз А1а Ьеи Ьуз
130 135 140
А1а Ьеи Зег Азр Рго РНе Рго С1у Ьеи Агд РНе 11е Рго ТНг С1у С1у
145 150 155 160
Уа1 Ьуз РНе С1и Азп Ьеи А1а Азр Туг Ьеи С1п Меб С1и Ьуз 11е Нтз
165 170 175
А1а Уа1 С1у С1у Зег Тгр Меб А1а Ьуз Агд С1п Меб 11е А1а Азр Агд
180 185 190
- 433 019971
Ьуз РИе Азр С1и 11е ТЬг Агд Ьеи А1а Азп С1и А1а Зег Азр Ьеи Уа1
195 200 205
ТЬг Ьуз 11е Агд Ьуз
210 <210> 329 <211> 618 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 329
абдасЪсдсб ЫзЬсбдаасб ЬаЬдбсаддд сааасаЪЬас ЬдссЬаЬааЬ Ьсаадссдас 60
асассададс ааддсдЬЬаа ааЬадсЬсаа дсЬаЬддсЬа аЬдсЬддссЬ ЬасЬЬЬддЬЬ 120
даадбадрас ЬЬадаасЬда ЬдсабсдЬЬа дабдсаЬЬаа аадсбаЬЬаа ададсаддЬд 180
ссадсдсЬЬа аадбаддСдс аддсасадба абаааЬасЬд асаЬЬЬЬада дсаадсасЬЬ 240
дсадсаддСд ссдасССЬаЬ ЬдЬЬасдсса дсадбдСсЬс сдсааЬЬаЬЬ адссдсдсба 300
асааааЬдса аСдЬдссддЬ асЬЬссСддЬ дСдЬсЬааса сдддСдасаб ЬЬСааЬддсд 360
сЬЬдадСасд дЬЬЬЬдаада асаааааЬЬа ЬЬсссЬдсаб сдсбсдсЬдд Ьддбдсасса 420
ЬЬсдЬабсдд сСдбсбсдЬс адбаЬЬЬада дсЬдсЬадсЬ ЬЬЬдЬссЬас аддбддсдЬа 480
адсдадсааа абаааабдда ЬЬасЫабсС ЫаааЬааЬд ЬаЬЬЬдсЬдЬ дддЬддЬасЬ 540
ЬддаЬЬдсаа аЬааададбд ддЬЬдсасаа даааасбддс аадсааЬЬас ЬдасЬсдбдЬ 600
аЬЬсаадсаЬ Ьааадбад 618
<210> 330 <211> 205 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (4 )...(199) <223> альдолаза КБРС и КНС <400> 330
Меб 1 ТЬг Агд РЬе Зег 5 С1и Ьеи Мер Зег С1у 10 С1п ТЬг Ьеи Ьеи Рго 15 Не
11е С1п А1а Азр ТЬг Рго С1и С1п С1у Уа1 Ьуз 11е А1а С1п А1а Меб
20 25 30
А1а Азп А1а С1у Ьеи ТЬг Ьеи Уа1 С1и Уа1 Уа1 Ьеи Агд ТЬг Азр А1а
35 40 45
Зег Ьеи Азр А1а Ьеи Ьуз А1а 11е Ьуз С1и С1п Уа1 Рго А1а Ьеи Ьуз
55 60
- 434 019971
Уа1 65 СЬу АЬа С1у ТНг УаЬ 70 Пе Азп ТНг Азр 11е 75 Ьеи СЬи СЬп А1а Ьеи 80
АЬа АЬа СЬу А1а Азр РНе 11е УаЬ ТНг Рго АЬа УаЬ Зег Рго СЬп Ьеи
85 90 95
Ьеи АЬа АЬа Ьеи ТНг Ьуз Суз Азп УаЬ Рго УаЬ Ьеи Рго СЬу УаЬ Зег
100 105 110
Азп ТЬг СЬу Азр 11е Ьеи Меб А1а Ьеи СЬи Туг СЬу РНе СЬи С1и С1п
115 120 125
Ьуз Ьеи РНе Рго А1а Зег Ьеи АЬа С1у СЬу АЬа Рго РНе УаЬ Зег АЬа
130 135 140
УаЬ Зег Зег УаЬ РНе Агд А1а АЬа Зег РНе Суз Рго ТНг С1у С1у УаЬ
145 150 155 160
Зег СЬи СЬп Азп Ьуз Меб Азр Туг Ьеи Зег Ьеи Азп Азп УаЬ РНе А1а
165 170 175
УаЬ СЬу СЬу ТНг Тгр Пе А1а Азп Ьуз СЬи Тгр УаЬ АЬа СЬп СЬи Азп
180 185 190
Тгр СЬп АЬа 11е ТНг Азр Зег Суз 11е СЬп А1а Ьеи Ьуз
195 200 205
<210>
<211>
<212>
<213>
331
663
ДНК
Неизвестно <220>
<223>
ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400>
331
абддсабабс сдассдсддб сааббсасад аббассдаса садсаддсаа ддббббдсаб 60
сдсааасбда ббдсбабббб асдсддадбд аадсссдабд аадсддсабс сабддсдсдб 120
дбдсбддбсд абдссдддаб сасдабдабс даддбдссдс бдааббсссс ддаассдсбб 180
аааадсаббд сдабсабдаа ддсадаадбс ддбдасдсдд сссбдабсдд ддсаддбасд 240
дбсббаасдд бсдаддабдб бдбдаасдбб сдбдасдсдд дсддбдадбб бдббдбдбсд 300
сссааббасд абдбсдабдб даббаааааа ассааддаад бсддбабддд аадббддссд 360
ддддбдсбда сбссдассда абдбббсдсс дсдабсаадд ссддддсдда бдддсббааа 420
абаббсссбд ссадсабсаб бддсдсабсд дддабббсдд сдабдсдддс ддббббдсса 480
ааадабабдс сддбббабдс ддббддбддб дббдддссдд абдаббббдс дассбабдсс 540
ааддсддддб дсдабддббб сддссббдда бсддддаббб абааасссдд ссбдасадсд 600
дасдаадбаб сддддсдсдс баббдссббс дбаасддсдс абдасдсддб абббдсдддс 660
бад 663
<210> 332 <211> 220
- 435 019971 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (15) ... (211) <223> альдолаза КЭРО и КНО <400> 332
Меб 1 Аба Туг Рго ТНг 5 Аба Уаб Азп Зег Сбп 10 11е ТНг Азр ТНг Аба 15 Сбу
Ьуз Уаб Ьеи Нбз Агд Ьуз Ьеи 11е Аба 11е Ьеи Агд Сбу Уаб Ьуз Рго
20 25 30
Азр Оби Аба Аба Зег Меб Аба Агд Уаб Ьеи Уаб Азр Аба Сбу Не ТНг
35 40 45
Меб 11е Сби Уаб Рго Ьеи Азп Зег Рго Сби Рго Ьеи Ьуз Зег 11е Аба
50 55 60
11е Меб Ьуз Аба Сби Уаб Сбу Азр Аба Аба Ьеи 11е Сбу Аба Сбу ТНг
65 70 75 80
Уаб Ьеи ТНг Уаб Сби Азр Уаб Уаб Азп Уаб Агд Азр Аба Сбу Сбу Сби
85 90 95
РНе Уаб Уаб Зег Рго Азп Туг Азр Уаб Азр Уаб 11е Ьуз Ьуз ТНг Ьуз
100 105 110
Сби Уаб Сбу Меб Сбу Зег Тгр Рго Сбу Уаб Ьеи ТНг Рго ТНг Сби Суз
115 120 125
РНе Аба Аба 11е Ьуз Аба Сбу Аба Азр Сбу Ьеи Ьуз 11е РНе Рго Аба
130 135 140
5ег 11е 11е Сбу Аба Зег Сбу 11е Зег Аба Меб Агд Аба Уаб Ьеи Рго
145 150 155 160
Ьуз Азр Меб Рго Уаб Туг Аба Уаб Сбу Сбу Уаб Сбу Рго Азр Азр РНе
165 170 175
Аба ТНг Туг Аба Ьуз Аба Сбу Суз Азр Сбу РНе Сбу Ьеи Сбу Зег Сбу
180 185 190
I бе Туг Ьуз Рго Сбу Ьеи ТНг Аба Азр Сби Уаб Зег Сбу Агд Аба 11е
195 200 205
Аба РЬе Уаб ТНг Аба Нбз Азр Аба Уаб РНе Аба Сбу
210 215 220
<210> 333 <211> 648 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>
<223> ДНК, полученная из образца из окружающей среды <400> 333
- 436 019971
абддсдаПд абсссдссдс бдссадбсдд сдсабдсдсд ааббддсддс дсбддссссд 60
дбдабсссдд бдсбддбдаб сдаддабдсс дсаадддсда ддссссбддс сдаддсдсбд 120
дбддсдддЬд дбсбдссддб дсбддаддЬд асдсбдсдса ссссддссдс дссададдбс 180
аЬЬсдсдада бдбсссдддб сссдддддсс аЬЬдЬсддсд ссддсассдб дабсасассд 240
дссдасдбдс ддабсдсаса адсддсдддд дсссдаИсд ссдЬсбсссс сддсдсдасс 300
даЪдсдПдс ЬсдаЬдссЬд сдаадсддсд дддсбдссдс бссбдсссдд сдсддссасд 360
дсдадсдадд сдабддсдсЬ Ьсбддсдсдс ддсбасдаса ЬдсбдаадЫ: сПЬсссдсс 420
даддсадбдд дсддсдсддс ддсдсЬЬдса дсдсбдддсд сдссдсбдсс дсадаШсс 480
ЬЬсбдсссда ссддаддддб садсссддса аасдсдсссд асЬассбсдс сббдсссасд 540
дПсссЬдсд бсддсддсад сЬдддбддсс ссдааассас аддбсдссдс сддсдасбдд 600
дасдсдабсс дЬдсссбсдс сдаасасдсс сдсасссбсд сдсссбда 648
<210> 334 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно <220>
<223> Белок, полученный из образца из окружающей среды <220>
<221> ДОМЕН <222> (12)...(206) <223> альдолаза КОРС и КНС <220>
<221> САЙТ <222> (44)...(53) <223> Активный центр альдолаз КОРС и КНС. РгозбНе ίά = Р300159 <220>
<221> САЙТ <222> (133)...(146) <223> Образующий основание Шиффа остаток альдолаз КОРС и КНС. Ргозйе бб
Р300160 <400> 334
Меб 1 Аба Не Азр Рго 5 Аба Аба Аба Зег Агд 10 Агд МеЬ Агд Сби Ьеи 15 Аба
Аба Ьеи Аба Рго Уаб Не Рго Уаб Ьеи Уаб Не Сби Азр Аба Аба Агд
20 25 30
Аба Агд Рго Ьеи Аба Сби Аба Ьеи Уаб Аба Сбу Сбу Ьеи Рго Уаб Ьеи
35 40 45
Сби Уаб ТНг Ьеи Агд ТНг Рго Аба Аба Рго Сби Уаб Не Агд Сби Меб
50 55 60
Зег Агд Уаб Рго Сбу Аба ббе Уаб Сбу Аба Сбу ТНг Уаб Не ТНг Рго
65 70 75 80
Аба Азр Уаб Агд Не Аба Сбп Аба Аба Сбу Аба Агд РНе Аба Уаб Зег
- 437 019971
Рго СЬу АЬа ТЬг 100 Азр АЬа Ьеи Ьеи
Рго Ьеи Ьеи 115 Рго СЬу АЬа АЬа ТЬг 120
АЬа Агд 130 СЬу Туг Азр Меб Ьеи 135 Ьуз
СЬу 145 АЬа АЬа АЬа Ьеи АЬа 150 АЬа Ьеи
РЬе Суз Рго ТЬг СЬу 165 СЬу УаЬ Зег
АЬа Ьеи Рго ТЬг 180 УаЬ Рго Суз УаЬ
Рго СЬп УаЬ 195 АЬа АЬа СЬу Азр Тгр 200
НЬз АЬа 210 Агд ТЬг Ьеи АЬа Рго 215
90 95
Азр 105 АЬа Суз СЬи АЬа АЬа 110 СЬу Ьеи
АЬа Зег СЬи АЬа Меб 125 АЬа Ьеи Ьеи
РЬе РЬе Рго АЬа 140 СЬи АЬа УаЬ СЬу
СЬу АЬа Рго 155 Ьеи Рго СЬп ЬЬе Зег 160
Рго АЬа 170 Азп АЬа Рго Азр Туг 175 Ьеи
СЬу 185 СЬу Зег Тгр УаЬ АЬа 190 Рго Ьуз
Азр АЬа ЬЬе Агд АЬа 205 Ьеи АЬа СЬи
<210> 335 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <220>
<221> тЬзс_беабиге <222> (1)..(19)
<223> Ь представляет собой С, 9 ' или б
<220>
<221> тЬзс беабиге
<222> (1)..(19)
<223> у представляет собой с или б
<220>
<221> тЬзс беабиге
<222> (1)..(19)
<223> г представляет собой а или д
<220>
<221> тЬзс беабиге
<222> (1)..(19)
<223> м представляет собой а или б
<400> 335 аагдбЬбмуд агдасаабд <210> 336 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 438 019971 <223> Праймер <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (1)..(18) <223> ά представляет собой а, д или б <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (1)..(18)
<223> у представляет собой С или £
<220>
<221> т1зс £еа£иге
<222> (1)..(18)
<223> г представляет собой а или д
<220>
<221> Ш1зс £еа£иге
<222> (1) . . (18)
<223> и представляет собой а или £
<400>336 дсйсаданса ауддг£дд18 <210>337 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (1)..(23) <223> ά представляет собой а, д или £ <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (1)..(23)
<223> у представляет собой С или £
<220>
<221> т1зс £еа£иге
<222> (1)..(23)
<223> г представляет собой а или д
<220>
<221> т1зс £еа£иге
<222> (1)..(23)
<223> з представляет собой с или д
<400>337 сса£сгзуа£ сс1дсг£абад сса23 <210>338 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 439 019971 <223> Праймер <220>
<221> ппзС—Ёеабиге <222> (1) .. (20) <223> ά представляет собой а, д или б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (1)..(20) <223> у представляет собой с или б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (1) .. (20) <223> г представляет собой а или д <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (1)..(20) <223> η представляет собой а, с, д или б <400>338 дсгбабадсс аубспссгбс20 <210>339 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>339 абаадасаба ОдссСабсдС бдббасдаад30 <210>340 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>340 абаададдаб ссббаббссб сдддсадссд сбс33 <210>341 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>341 абаадасаба бдаасадасс бдбддббдбс30 <210>342 <211>33
- 440 019971 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>342 аРаададдаР ссРРасаддР асРРдадасс дад33 <210>343 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>343 аРаадасаРа РдадсдРддР саРссдааас30 <210>344 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>344 аРаададдаР ссРРасРРсд сРРРдРРаРа ддс33 <210>345 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>345 аРаадасаРа Рдаасаадсс сдРддРРдРд30 <210>346 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>346 аРаададдаР ссРРасаадР асРРдадасс дадд34 <210>347 <211>29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер
- 441 019971 <400>347 аЕаадасаЕа ЕдадсдЕддЕ сдЕсассдд <210>348 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>348 аЕаададдаЕ ссЕЕадссдЕ ЕЕЕЕсссдЕс ддЕд34 <210>349 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>349 адаадасаЕа ЕдаЕдадсаЕ сдЕсдЕссад аас33 <210>350 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>350 адаададдаЕ ссЕсадасаЕ аЕЕЕсаддсс сЕЕд34 <210>351 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>351 адаадасаЕа ЕдаЕдадсдЕ ддЕсаЕсасс30 <210>352 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Праймер <400> 352 асаасаддаЕ сссЕаЕЕЕсЕ ЕсЕссддсдЕ ЕЕс <210> 353
352
- 442 019971 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>353 абаабасаба бдадсдбсдб сдббсадаас <210>354 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>354 абаабаддаб ссббадасаб абббдадссс сббс <210>355 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>355 адаадасаба Рдабдбсддб Рдбсдббсад аас <210>356 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>356 адаададдаб ссбсадабаб асббсаддсс с <210>357 <211>852 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> АТСС 4978 ОААТ <400> 357
аРдадРРаба дсббабддаа бдассааабб дбдаабдабд аадаадбадб адббдабаад 60
даддассдбд дсбабсааРР Рддсдабддб дРРРабдаад ббдбаааадб абабаасддб 120
дааббаррба садсддадда дсабдбсдаб сдРРРРРасд сдадбдсбда аааааббсдс 180
дРСасдабсс сРРабасааа адасаааббд саРсааббаб бдсабсадбб адббдааабд 240
- 443 019971
аабааадббс ааасаддаса бабббабббс саааббасдс дбддбдсадд сссбсдбааб 300
сабаббббсс сбддбдабда адбдаадсса дбаббаасад дбаабассаа ддаааабсса 360
сдбсссдбад сааасбббда ааааддбдбд ааадсаасаб ббдбадаада саббсдббдд 420
ббасдсбдбд асаббааабс аббаааббба сббддбдсдд басббдсбаа асаадаадса 480
сабдааааад дабдсбабда адсддбббба сабсдбдабд ааабсдбаас адааддсбсб 540
бсббсаааба бббабддааб бааадабддс дбаббабаса сасабссадс даабаасббс 600
абсббааабд дбаббасасд бсаадбаабс аббааабдбд сбдсбдаааб бддсббасса 660
дбдааддаад аадсаабдас ааааасбсад сббсббдсаа бддабдаадб даббдбббса 720
бсаасдасбб садаадбаас дссааббабс дасабадабд даасадбааб бддбдсдддб 780
ааассдддбд асбддасасд баааббасаа дсасаабббд абасдааааб сссааааддб 840
аббсдсдсаб аа 852
<210> 358 <2Ы> 283 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> АТСС 4978 ОААТ <400> 358
Меб 1 Бег Туг Бег Ьеи 5 Тгр Азп Азр СЬп 11е 10 УаЬ Азп Азр СЬи СЬи 15 УаЬ
УаЬ УаЬ Азр Ьуз СЬи Азр Агд СЬу Туг СЬп РЬе СЬу Азр СЬу УаЬ Туг
20 25 30
СЬи УаЬ УаЬ Ьуз УаЬ Туг Азп СЬу СЬи Ьеи РЬе ТЬг АЬа СЬи СЬи НЬз
35 40 45
УаЬ Азр Агд РЬе Туг АЬа Бег АЬа СЬи Ьуз Ые Агд УаЬ ТИг 11е Рго
50 55 60
Туг ТЬг Ьуз Азр Ьуз Ьеи НЬз СЬп Ьеи Ьеи НЬз СЬп Ьеи УаЬ СЬи Меб
65 70 75 80
Азп Ьуз УаЬ СЬп ТЬг СЬу НЬз 11е Туг РЬе СЬп Не ТЬг Агд СЬу АЬа
85 90 95
СЬу Рго Агд Азп НЬз 11е РЬе Рго СЬу Азр СЬи УаЬ Ьуз Рго УаЬ Ьеи
100 105 110
ТИг СЬу Азп ТЬг Ьуз СЬи Азп Рго Агд Рго УаЬ АЬа Азп РЬе СЬи Ьуз
115 120 125
СЬу УаЬ Ьуз АЬа ТЬг РЬе УаЬ СЬи Азр Ые Агд Тгр Ьеи Агд Суз Азр
130 135 140
11е Ьуз Бег Ьеи Азп Ьеи Ьеи СЬу АЬа УаЬ Ьеи А1а Ьуз СЬп СЬи АЬа
145 150 155 160
НЬз СЬи Ьуз СЬу Суз Туг СЬи АЬа УаЬ Ьеи НЬз Агд Азр СЬи 11е УаЬ
- 444 019971
165
ТЬг СЬи СЬу Зег 180 Зег Зег Азп 11е
Туг ТНг НЬз 195 Рго А1а Азп Азп РНе 200
УаЬ 11е 210 Не Ьуз Суз А1а АЬа 215 С1и
АЬа 225 Меб ТНг Ьуз ТНг СЬп 230 Ьеи Ьеи
Зег ТНг ТНг Зег СЬи 245 УаЬ ТНг Рго
1Ье СЬу АЬа СЬу 260 Ьуз Рго СЬу Азр
РНе Азр ТНг 275 Ьуз 11е Рго Ьуз СЬу 280
170 175
Туг СЬу Не Ьуз Азр СЬу УаЬ Ьеи
185 190
11е Ьеи Азп СЬу Пе ТНг Агд СЬп
205
11е СЬу Ьеи Рго УаЬ Ьуз СЬи СЬи
220
АЬа Меб Азр СЬи УаЬ Не УаЬ Зег
235 240
11е 11е Азр Пе Азр СЬу ТНг УаЬ
250 255
Тгр ТНг Агд Ьуз Ьеи СЬп АЬа СЬп
265 270
Пе Агд АЬа
<210> 359 <2Ы> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>359 дбдаббдббб сабсаасдаа ббсадаадба асдсс <210>360 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>360 дбдаббдббб сабсаасдсд ббсадаадба асдсс <210>361 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>361 дбдаббдббб сабсаасдад ббсадаадба асдсс <210>362 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 445 019971 <220>
<223> Мутагенный праймер <400>362 дбдаббдЪЪб сабсаасддс Рбсадаадба асдсс35 <210>363 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>363 дбдсаддссс Рсдбдсбсаб аббббсссбд д31 <210>364 <211>45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>364 даадбдаббд бббсабсаас дсадбсадаа дбаасдссаа ббабс45 <210>365 <211>40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>365 сабабдадРб аРадсббабд даабдассаа аРРдРдаабд40 <210>366 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>366 сбсдадбдсд дссдсаадсб Одбсдасдда дсбс34 <210>367 <211>95 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 446 019971 <220>
<223> Мутагенный праймер <400> 367
аабабббабд дааббааада бддсдбабба басасасабс садсдаабаа сабдабсбба 60
аабддбабба сасдбсаадб аабсаббааа бдбдс 95
<210> 368
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутагенный праймер
<400> 368
ддссадбдаа ббдбаабасд асбсасбаба дддс 34
<210> 369
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутагенный праймер
<4 00> 369
сдссабсббб ааббссабаа абабббдаад аададссббс бд 42
<210> 370
<211> 66
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутагенный праймер
<400> 370
дсаасабббд бадаадасаб бсдббдддаа басбдббаса ббааабсабб ааабббасбб 60
ддбдсд 66
<210> 371
<211> 55
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутагенный праймер
<400> 371
дбаббабаса сасабссадс даабаасбас абсббааабд дбаббасасд бсаад 55
<210> 372
<211> 64
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 447 019971 <220>
<223>
Мутагенный праймер
372 <400>
дсааЬддабд аадЬдаЬЬдЬ ЬЬсаЬсаасд асбааадаад
РаасдссааР
ЬабсдасаЬа дард <210>
<211>
<212>
<213>
373
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Мутагенный праймер
373 <400>
дсааЬддаЬд аадЬдаЬЬдб ЬЬсабсаасд аабааадаад
Ьаасдссааб
ЬабсдасаЬа даРд <210> <211>
<212>
<213>
374
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Мутагенный праймер
374 <400>
дсааЬддаЬд аадЬдаЬЬдЬ ЬЬсабсаасд ааЬсдЬдаад
ЬаасдссааЬ
ЬаЬсдасаЬа даОд <210>
<211>
<212>
<213>
375
БЕЛОК
Р. зЬгбаЬа <220>
<221>
<222>
<223>
тбзс_£еаЬиге (12)..(12)
Хаа может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту <400>
375
Леи ТНг Аба Уаб Леи Ьуз Аба Азр Аба Туг Обу Хаа Сбу 11е Сбу Ьей 1 <210> 376 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер
- 448 019971
<400> 376
адаадасаРа ОдсссООссд ссдОаддд 28
<210> 377
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 377
адаададдаб ссОсадбсда сдадбабсЫ: сд 32
<210> 378 <211> 1230 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> КТ2440 ВАК <400> 378
абдсссОООс дссдОасссб РсОддсРдса ОсссРддсас ОРсбдабсас сддасаддсс 60
ссссНдСаРд сддсассасс дПдОсдабд дасаасддса ссаасасссб дассдбдсаа 120
аасадсаабд ссбдддбсда адбсадсдсс адсдсссбдс адсасаасаО ссдсасдсбд 180
саддссдадс Ьддссддсаа дРссаадсОд Рдсдссдбдс Осааддссда ЬдссРаОддс 240
сасддбаДсд дссбддНааР дссаОсдабс абсдсссаад дсдрдсссбд сдрддсддбд 300
дссадсаасд аддаддсссд сдрддбссдс дссадОддсО Ссассдддса асбддОдсдд 360
дбасдссбдд ссадссбсад сдадсбддаа даСддсООдс адбасдасаО ддаададсбд 420
дбдддсадсд сддааШдс ссдссаддсс дабдссабсд ссдсдсдсса Оддсаадасс 480
РбдсдсаРРс асабддсдсР саасРссадс ддсабдадсс дсаасдддд! ддадабддсс 540
ассрддрссд дссдрддсда адсдсбдсад аОсассдасс адаадсассб саадсНддЬс 600
дсдсбдаОда сссасббсдс сдбддаадас ааддасдабд Оасдсааддд ссРддсддса 660
РРсаасдадс адассдасОд дНдабсаад сасдссаддс Оддассдсад саадсбсасс 720
сРдсасдссд ссаасбсдН сдсбасдсРд даадбдссдд аадсдсдссб ддасарддба 780
сдаасдддбд дсдсдсРдОР сддсдасасс дСдссддсдс дсассдадОа сааасдбдсд 840
абдсадНса аабсдсасдр ддсддсддрд сасадсбаРс сддссддсаа сассдрдддс 900
ОаЬдассдса ссООсасссб ддсссдрдаб Рсдсддсбдд ссаасаНОас ддОсдддбас 960
НссдаРддсР ассдссдддр аРРсассаас аадддссард ОдсбдаРсаа сддссассдр 1020
дЬдссддОсд НдддсааддО дОсдаНдаас асдсРдаНдд ОсдаОдОсас сдасЫасссО 1080
дабдбдаадд ддддбаасда адОддбдсбд ООсддсаадс аддссддддд сдааабсасс 1140
саддссдада ОддаадаааО саасддсдсд ПдсРсдссд аШдбасас сдОабддддс 1200
- 449 019971 ааНссаасс сдаадабасб сдбсдасбда1230 <210>379 <211>409 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> КТ2440 ВАК <400> 379
Меб 1 Рго РЬе Агд Агд 5 ТЬг Ьеи Ьеи А1а А1а 10 Зег Ьеи А1а Ьеи Ьеи 15 11е
ТЬг С1у С1п А1а Рго Ьеи Туг А1а А1а Рго Рго Ьеи Зег Меб Азр Азп
20 25 30
С1у ТЬг Азп ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 С1п Азп Зег Азп А1а Тгр Уа1 С1и Уа1
35 40 45
Зег А1а Зег А1а Ьеи С1п Н1з Азп Не Агд ТЬг Ьеи С1п А1а С1и Ьеи
50 55 60
А1а С1у Ьуз Зег Ьуз Ьеи Суз А1а Уа1 Ьеи Ьуз А1а Азр А1а Туг С1у
65 70 75 80
Н1з С1у Не С1у Ьеи \/а1 Меб Рго Зег Не Не А1а С1п С1у Уа1 Рго
85 90 95
Суз Уа1 А1а Уа1 А1а Зег Азп С1и С1и А1а Агд Уа1 Уа1 Агд А1а Зег
100 105 но
С1у РЬе ТЬг С1у С1п Ьеи Уа1 Агд Уа1 Агд Ьеи А1а Зег Ьеи Зег С1и
115 120 125
Ьеи С1и Азр С1у Ьеи С1п Туг Азр Меб С1и С1и Ьеи Уа1 С1у Зег А1а
130 135 140
С1и РЬе А1а Агд С1п А1а Азр А1а Не А1а А1а Агд Н1з С1 у Ьуз ТЬг
145 150 155 160
Ьеи Агд Не Ηί з Меб А1а Ьеи Азп Зег Зег С1у Меб Зег Агд Азп С1у
165 170 175
Уа1 С1и Меб А1а ТЬг Тгр Зег С1у Агд С1у С1и А1а Ьеи С1п Не ТЬг
180 185 190
Азр С1п Ьуз Н13 Ьеи Ьуз Ьеи Уа1 А1а Ьеи Меб ТЬг Н1з РЬе А1а Уа1
195 200 205
С1и Азр Ьуз Азр Азр Уа1 Агд Ьуз С1у Ьеи А1а А1а РЬе Азп С1и С1п
210 215 220
ТЬг Азр Тгр Ьеи Не Ьуз Н1з А1а Агд Ьеи Азр Агд Зег Ьуз Ьеи ТЬг
225 230 235 240
Ьеи ΗΪ3 А1а А1а Азп Зег РЬе А1 а ТЬг Ьеи С1и Уа1 Рго С1и А1а Агд
245 250 255
Ьеи Азр Меб Уа1 Агд ТЬг С1у С1у А1а Ьеи РЬе С1у Азр ТЬг Уа1 Рго
260 265 270
- 450 019971
А1а Агд ТНг 275 С1и Туг Ьуз Агд А1а 280 МеЕ С1п РНе Луз Зег 285 Н1з Уа1 А1а
А1а Уа1 Н1з Зег Туг Рго А1а С1у Азп ТНг Уа1 С1у Туг Азр Агд ТНг
290 295 300
РНе ТНг Ьей А1а Агд Азр Зег Агд Леи А1а Азп Не ТНг Уа1 31у Туг
305 310 315 320
Зег Азр С1у Туг Агд Агд Уа1 РНе ТНг Азп Луз С1 у Н13 Уа1 Леи Не
325 330 335
Азп С1у Н13 Агд Уа1 Рго Уа1 \7а1 С1у Луз Уа1 Зег МеЕ Азп ТНг Леи
340 345 350
МеЕ Уа1 Азр Уа1 ТНг Азр РНе Рго Азр Уа1 Луз С1у С1у Азп С1 и Уа1
355 360 365
Уа1 Ьей РНе 31у Ьуз С1п А1а С1у С1у С1и Не ТНг С1п А1а С1и МеЕ
370 375 380
С1и С1и 11е Азп С1у А1а Леи Леи А1а Азр Леи Туг ТНг Уа1 Тгр С1у
385 390 395 400
Азп Зег Азп Рго Ьуз Не Леи Уа1 Азр
405 <210>380 <211>1152 <212> ДНК <213> СеоЬасШиз зЕеагоЕНегторННиз <400>380 аЕддасдадЕ ЕЕсассдсда ЕасдЕдддсд даадЕддаЕЕ ЕддасдссаЕ ЕЕасдасааЕ60 дЕддадааЕЕ ЕдсдссдЕЕЕ дсЕдссддас дасасдсаса ЕЕаЕддсддЕ сдЕдааддсд120 аасдссЕаЕд дасаЕдддда ЕдЕдсаддЕд дсааддасад сдсЕсдаадс дддддссЕсс180 сдссЕддсдд ЕЕдссЕЕЕЕЕ ддаЕдаддсд сЕсдсЕЕЕаа дддааааадд ааЕсдаадсд240 ссдаЕЕсЕад ЕЕсЕсддддс ЕЕсссдЕсса дсЕдаЕдсдд сдсЕддссдс ссадсадсдс300 аЕЕдсссЕда ссдЕдЕЕссд сЕссдасЕдд ЕЕддаадаад сдЕссдсссЕ ЕЕасадсддс360 ссЕЕЕЕссЕа ЕЕсаЕЕЕсса ЕЕЕдааааЕд дасассддса ЕдддасддсЕ ЕддадЕдааа420 дасдаддаад адасдааасд ааЕсдЕадсд сЕдаЕЕдадс дссаЕссдса ЕЕЕЕдЕдсЕЕ480 дааддддЕдЕ асасдсаЕЕЕ ЕдсдасЕдсд даЕдаддЕда асассдаЕЕа ЕЕЕЕЕссЕаЕ540 садЕаЕассс дЕЕЕЕЕЕдса саЕдсЕсдаа ЕддсЕдссдЕ сдсдсссдсс дсЕсдЕссаЕ600
Едсдссааса дсдсадсдЕс дсЕссдЕЕЕс ссЕдассдда сдЕЕсааЕаЕ ддЕссдсЕЕс660 ддсаЕЕдсса ЕдЕаЕдддсЕ ЕдссссдЕсд сссддсаЕса адссдсЕдсЕ дссдЕаЕсса720
ЕЕаааадаад саЕЕЕЕсдсЕ ссаЕадссдс сЕсдЕасасд ЕсаааааасЕ дсаассаддс780 дааааддЕда дсЕаЕддЕдс дасдЕасасЕ дсдсадасдд аддадЕддаЕ сдддасдаЕЕ840 ссдаЕсддсЕ аЕдсддасдд сЕддсЕссдс сдссЕдсадс асЕЕЕсаЕдЕ ссЕЕдЕЕдас900
- 451 019971
ддасаааадд сдссда££д£ сддссдсаЬЬ ЬдсаЬддасс ад£дса£да£ ссдссЬдссС 960
ддЬссдсЬдс сддЪсддсас дааддЬдаса с£да££дд£с дссаадддда сдадд£аа££ 1020
£сса££да£д аСдЬсдсбсд ссабПддаа асдаЬсаасЬ асдаадЬдсс ЁСдсасдаСс 1080
ад££а£сдад ЬдссссдНаЬ ££££££ссдс са£аадсд£а £аа£ддаад£ дадааасдсс 1140
дЬЬддссдсд да 1152
<210>381 <211>384 <212> БЕЛОК <213> СеоЬасШиз з£еагоННегторЫ1из <400>381
Ме£ 1 Азр С1и РНе Н1з 5 Агд Азр ТНг Тгр А1а 10 31и Уа1 Азр Ьеи Азр 15 А1а
11е Туг Азр Азп Уа1 С1и Азп Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Азр Азр ТНг
20 25 30
ΗΪ3 11е Ме£ А1а Уа1 Уа1 Ьуз А1а Азп А1а Туг С1у Н1з С1у Азр Уа1
35 40 45
С1п !7а1 А1а Агд ТНг А1а Ьеи С1и А1а С1у А1а Зег Агд Ьеи А1а Уа1
50 55 60
А1а РНе Ьеи Азр С1и А1а Ьеи А1а Ьеи Агд С1и Ьуз С1у Не (Ии А1а
65 70 75 80
Рго 11е Ьеи \7а1 Ьеи С1у А1а Зег Агд Рго А1а Азр А1а А1а Ьеи А1а
85 90 95
А1а С1п С1п Агд 11е А1а Ьеи ТНг Уа1 РНе Агд Зег Азр Тгр Ьеи (Ли
100 105 110
С1и А1а Зег А1а Ьеи Туг Зег С1у Рго РНе Рго 11е Низ РНе Н13 Ьеи
115 120 125
Ьуз Ме£ Азр ТНг С1у Ме£ С1у Агд Ьеи С1у Уа1 Ьуз Азр С1и С1и С1и
130 135 140
ТНг Ьуз Агд 11е Уа1 А1а Ьеи Не С1и Агд Н1з Рго Низ РНе Уа1 Ьеи
145 150 155 160
С1и С1у Уа1 Туг ТНг НЬз РНе А1а ТНг А1а Азр С1и Уа1 Азп ТНг Азр
165 170 175
Туг РНе Зег Туг С1п Туг ТНг Агд РНе Ьеи Н13 МеЬ Ьеи С1и Тгр Ьеи
180 185 190
Рго Зег Агд Рго Рго Ьеи Уа1 Н1з Суз А1а Азп Зег А1а А1а Зег Ьеи
195 200 205
Агд РНе Рго Азр Агд ТНг РНе Азп Ме£ Уа1 Агд РНе С1у Не А1а Ме£
210 215 220
Туг С1у Ьеи А1а Рго Зег Рго С1у Не Ьуз Рго Ьеи Ьеи Рго Туг Рго
225 230 235 240
Ьеи Ьуз С1и А1а РНе Зег Ьеи ΗΪ3 Зег Агд Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Ьуз Ьуз
- 452 019971
245 250255
Ьеи СЬп Рго СЬу 260 СЬи Ьуз УаЬ Зег Туг 265 СЬу АЬа ТНг Туг ТНг 270 АЬа СЬп
ТНг СЬи СЬи Тгр ЬЬе СЬу ТНг ЬЬе Рго ЬЬе СЬу Туг АЬа Азр СЬу Тгр
275 280 285
Ьеи Агд Агд Ьеи СЬп НЬз РНе НЬз УаЬ Ьеи УаЬ Азр СЬу СЬп Ьуз АЬа
290 295 300
Рго ЬЬе УаЬ СЬу Агд ЬЬе Суз МеЬ Азр СЬп Суз МеЬ ЬЬе Агд Ьеи Рго
305 ЗЬО ЗЬ5 320
СЬу Рго Ьеи Рго УаЬ СЬу ТНг Ьуз УаЬ ТНг Ьеи ЬЬе СЬу Агд СЬп СЬу
325 330 335
Азр СЬи УаЬ ЬЬе Зег ЬЬе Азр Азр УаЬ АЬа Агд НЬз Ьеи СЬи ТНг ЬЬе
340 345 350
Азп Туг СЬи УаЬ Рго Суз ТНг ЬЬе Зег Туг Агд УаЬ Рго Агд ЬЬе РНе
355 360 365
РНе Агд НЬз Ьуз Агд ЬЬе МеС СЬи УаЬ Агд Азп АЬа УаЬ СЬу Агд СЬу
370 375 380
<210>382 <211>43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутагенный праймер <400>382 дссаЪЬЪдда аасдабсаас дсддаадСдс сЬЬдсасдаЬ сад43 <2Ь0>383 <211>30 <2Ь2> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>383 даЬаЬассаЬ ддсабасСса ЪРаЬддааНд30 <210>384 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 384 д-ЬНаЪсддаЬ ссЬЬаддсаЬ ЬааЬЪдаааЬ Тд 32
- 453 019971 <210> 385 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>385 даддадсбсд адбсадасдб аРРбсадбсс бббббс36 <210>386 <211>29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>386 адаадасаба Рдабббабса дссддддас29 <210>387 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>387 адаадасаба РдддРдбсдб сдбссаааас30 <210>388 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>388 абаабаддаб ссббадасаб абббдаддсс с31 <210>389 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>389 аРаабасаба Рдаадссддб ддбддбдс28 <210>390 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 454 019971 <220>
<223> Праймер <400> 390 адаададдаб ссббадасаб аддбдадссс с <210>
<211>
<212>
<213>
391
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Праймер
391 <400>391 абаабассаб дддбдбсдбд дбссад <210> 392· <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>392 адаададдаб ссббадасаб абббсаддсс сс32 <210>393 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>393 дсддаасаба бдбббдадаа саббассдсс30 <210>394 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>394 абаассддаб ссббасадса сбдссасааб сд32 <210>395 <211>36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 395
- 455 019971 сдсЕсНЬаЬд дПсддЬЬЬд сЪЬдддНЪдс Ьсассс36 <210>396 <211>36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>396 дддбдадсаа сссаадсЫзб ссдаассаба ададсд36 <210>397 <211>39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>397 сааааааЬас садсдЬЪаад ддадЬдбддд Едадсаасс39 <210>398 <211>29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>398 саЪЪассдсс дсЬасбдссд асссдаНс29 <210>399 <211>39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>399 сассааааар ЬассЬсддсд РадасддсаЬ сссОдааТЬ39 <210>400 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>400
ЬдаЬдсддаа аабсасдсЬс ННдасЬЬсда Ьдсас35 <210>401
- 456 019971 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>401 дсддсдссаб ддаааабдаб ссдаррддрс Раабд35 <210>402 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>402 дсддсддбсд асдсааЬРас ааРРдОдЬРР дбс33 <210>403 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>403 дсддсдссаЬ ддаРдбаРдР аРааРСРЪаР РРад34 <210>404 <211>36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>404 дсддсддбсд асаааРЪРса РРаСРсаРРс РааЬРР36 <210>405 <211>36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>405 ддссддсаба РдРсдабссб РаасдасЬас ааасдЬ36 <210>406 <211>36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 457 019971 <220>
<223> Праймер <400>406 ддааддсбсд адбсабдабб ддбббссада сааабб36 <210>407 <211>27 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая сигнальная последовательность
<4 00> 407
Меб Зег Не Уа1 \7а1 ТЬг Ьуз Не С1и Агд А1а С1у А1а А1а А1а Уа1
1 5 10 15
А1а А1а Ьеи Агд ТЬг Зег С1у Уа1 А1а ТНг Уа1
20 25
<210> 408
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>408 абаабасаба бдсссббсбс ссдбассс28 <210>409 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность' <220>
<223> Праймер <400>409 дсддсдддаб ссббасбдаб сбббсаддаб б31 <210>410 <211>1230 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая аргининрацемаза Рзеийотопаз баебго1епз <400> 410
абдсссббсб сссдбасссб дсбсдсссбб бсссббддса бддсаббдсб дсаааасссд 60
дссбббдсбд сдссассссб дбсдабдасс дасддсдбад сбсаадбдаа басссаддас 120
адсаабдссб дддбсдаааб саабааадсс дсдббсдадс асаасабасд дасбсбдсаа 180
ассдсссбсд ссддсаадбс дсадабсбдс дссдбасбса аддсддабдс сбабддссас 240
- 458 019971
ддЬаксддсС ОдССдаСдсс сРсддОдаОс дссаОдддОд РЪсссЬдЪдЪ сддрдрсдсс 300
адсаасдаад аадсссдсдб сдЬдсдсдад адсддШса адддксаасО даОасдсдОд 360
сдсассдсбд сссбдадсда асОддаадсО дсасОдссдР асаасаРдда ададсОддОд 420
ддсаассЪдд асСОсдсддО сааддссадс сЬдаЬЪдссд аддаОсасдд ОсдсссдсОд 480
дбддЬдсасс ЬдддРсЬдаа ЪРссадсддс аРдадссдЬа асддадОдда саЬдассасс 540
дсОсадддсс дЬсдОдаРдс ддРадсОаРс ассааддЬдс сааассРдда адрдсдддсд 600
аксаОдассс асЬЪсдсддЬ сдаадаОдсб дссдасдЬдс дОдссдддсО сааддссПс 660
ааОсадсаад сссааРддсР дакдаасдрд дсссадсОЬд абсдсадсаа даРсасссбд 720
сасдсддсса асОсдООсдс сасасрддад дЬдсссдааЪ сдсаЬсЬдда саРддНссдс 780
сссддсддсд сдсбдРЬсдд сдасассдба ссдОсссаса ссдадОасаа дсдддРсаРд 840
садЬЕсаадЪ сссасдОддс дЬсддбсаас адсОасссса адддсаасас сдксддИаЬ 900
дассдсасдр асасссСддд ссдсдасбсд сддсОддсса асаСсассдР сддсРасРсР 960
дасддсЬасс дссдсдсдСС ОассааОааа дддаИдЪдс РдаОсаасдд ссаОсдсдбд 1020
ссадОддбдд дсааадОсбс дардаасасс сРдаОддОдд асдОсасОда сдсдссддаС 1080
дрдаааадсд дсдаОдаадО ддОдсОдРОс дддсассадд дсааддссда даЪЪасссад 1140
дсОдадаОсд аадасаЬсаа сддОдсасОд сООдсддаОс ОдОаОассдО дОддддсааО 1200
РссаасссРа аааСссСдаа адаЬсадРаа 1230
<210> 411 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>411
РасссаддсР дадабддаад асабсаасд <210>412 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 412 дссадсаасд агдагдстсд сдр <210> 413 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 459 019971
<220>
<223> Праймер
<400> 413
бддссзбкда бсадсаса 18
<210> 414
<211> 716
<212> ДНК
<213> Искусственная : последовательность
<220>
<223> Продукт ПЦР А. сауЬае
<400> 414
дссадсаасд агдагдстсд сдббдсссдс дадаадддсб бсдааддбсд ссбдабдсдд 60
дбасдбдссд ссассссдда бдаадбддад саддсссбдс ссбасаадсб ддаддадсбс 120
абсддсадсс бддададсдс сааддддабс дссдасабсд сссадсдсса бсасассаас 180
абсссддбдс асабсддссб даасбссдсс ддсабдадсс дсаасддсаб сдабсбдсдс 240
саддасдабд ссааддссда бдсссбддсс абдсбсаадс бсааддддаб сассссддбс 300
ддсабсабда сссасббссс ддбддаддад ааададдасд бсаадсбддд дсбддсссад 360
ббсаадсбдд асбассадбд дсбсабсдас дссддсаадс бддабсдсад саадсбсасс 420
абссасдссд ссаасбссбб сдссасссбд даадбассдд аадссбасбб бдасабддбд 480
сдсссдддсд дсабсабсба бддсдасасс аббсссбссб асассдадба саадааддбд 540
абддсдббса адасссаддб сдссбссдбс аассасбасс сддсдддсаа сассдбсддс 600
бабдассдса ссббсасссб саадсдсдас бсссбдсбдд ссаассбдсс дабдддсбас 660
бссдасддсб ассдссдсдс сабдадсаас ааддссбабд бдсбдабста зддсса 716
<210> 415
<211> 238
<212> БЕЛОК
<213> Аеготопаз сауЬае
<220>
<221> М13С ΓΕΑΤϋΚΕ
<222> (237 )··(237)
<223> Хаа может представлять собой РНе, С1п, Азп или Ьуз
<400> 415
АЬа Зег ' Азп С1и С1и А1а Агд Уа1 . АЬа Агд С1и Ьуз С1у РНе СЬи СЬу
Ь 5 10 15
Агд Ьеи . Меб Агд Уа1 Агд А1а А1а ТНг Рго Азр СЬи УаЬ С1и , С1п А1а
20 25 30
Ьеи Ргс ί Туг ' Ьуз Ьеи С1и СЬи Ьеи 11е С1у Зег Ьеи С1и Зег А1а Ьуз
35 40 45
СЬу ЬЬе / А1а . Азр 11е А1а СЬп Агд НЬз НЬз ТНг Азп 1Ье Ргс ί УаЬ НЬз
- 460 019971
5560
11е 65 С1у Ьеи Азп Зег А1а 70 С1у Меб Зег Агд Азп 75 С1у 11е Азр Ьеи Агд 80
С1п Азр Азр А1а Ьуз А1а Азр А1а Ьеи А1а Меб Ьеи Ьуз Ьеи Ьуз С1у
85 90 95
11е ТНг Рго Уа1 С1у 11е Меб ТНг Н1з РНе Рго Уа1 С1и С1и Ьуз С1и
100 105 110
Азр Уа1 Ьуз Ьеи С1у Ьеи А1а С1п РНе Ьуз Ьеи Азр Туг С1п Тгр Ьеи
115 120 125
11е Азр А1а С1у Ьуз Ьеи Азр Агд Зег Ьуз Ьеи ТНг 11е Нтз А1а А1а
130 135 140
Азп Зег РНе А1а ТНг Ьеи С1и Уа1 Рго С1и А1а Туг РНе Азр Меб Уа1
145 150 155 160
Агд Рго С1у С1у 11е 11е Туг С1у Азр ТНг 11е Рго Зег Туг ТНг С1и
165 170 175
Туг Ьуз Ьуз Уа1 Меб А1а РНе Ьуз ТНг С1п Уа1 А1а Зег Уа1 Азп НТЗ
180 185 190
Туг Рго А1а С1у Азп ТНг Уа1 С1у Туг Азр Агд ТНг РНе ТНг Ьеи Ьуз
195 200 205
Агд Азр Зег Ьеи Ьеи А1а Азп Ьеи Рго Меб С1у Туг Зег Азр С1у Туг
210 215 220
Агд Агд А1а Меб Зег Азп Ьуз А1а Туг Уа1 Ьеи 11е Хаа С1у
225 230 235
<210>416 <211>1227 <212> ДНК <213> Аеготопаз Οθνίβθ <400> 416
абдсасаада ааасасбдсб сдсдасссбд абсбббддсс бдсбддссдд ссаддсадбс 60
дссдсссссб абсбдссдсб сдссдасдас сассдсаасд дбсаддааса дассдссдсс 120
аасдссбддс бддаадбдда бсбсддсдсс ббсдадсаса асабссадас ссбдаадааб 180
сдссбсддбд асаадддссс дсадабсбдс дссабсабда аддсддасдс сбасддбсас 240
ддсабсдасс бдсбддбссс ббссдбддбс ааддсаддса бссссбдсаб сддсабсдсс 300
адсаасдаад аадсасдбдб бдсссдсдад аадддсббсд ааддбсдссб дабдсдддба 360
сдбдссдсса ссссддабда адбддадсад дсссбдсссб асаадсбдда ддадсбсабс 420
ддсадссбдд ададсдссаа ддддабсдсс дасабсдссс адсдссабса сассаасабс 480
ссддбдсаса бсддссбдаа сбссдссддс абдадссдса асддсабсда бсбдсдссад 540
дасдабдсса аддссдабдс ссбддссабд сбсаадсбса аддддабсас сссддбсддс 600
абсабдассс асббсссддб ддаддадааа даддасдбса адсбддддсб ддсссадббс 660
- 461 019971
аадсРддасР ассадРддсР саРсдасдсс ддсаадсРдд аРсдсадсаа дсРсассаРс 720
сасдссдсса асРссРРсдс сасссРддаа драссддаад ссРасРРРда сарддрдсдс 780
ссдддсддса РсаРсРаРдд сдасассаРР сссРссРаса ссдадРасаа дааддрдард 840
дсдРРсаада сссаддрсдс сРссдРсаас сасРасссдд сдддсаасас сдРсддсРаР 900
дассдсассР РсасссРсаа дсдсдасРсс сРдсРддсса ассрдссдар дддсРасРсс 960
дасддсРасс дссдсдссаР дадсаасаад дссРаРдРдс РдаРссаРдд ссадааддсс 1020
сссдрсдрдд дсаадасРРс саРдаасасс ассарддрдд асдРсассда саРсаадддд 1080
аРсааасссд дрдасдаддр ддрссрдррс ддасдссадд дрдардссда ддрдааасаа 1140
РсРдаРсРдд аддадРасаа сддРдсссРс РРддсддаса РдРасассдР сРддддсРаР 1200
ассаасссса адаадаРсаа дсдсРаа 1227
<210>417 <211>408 <212> БЕЛОК <213> Аеготопаз саубае <400>417
Мер 1 Нбз Ьуз Ьуз ТЬг 5 Ьей Ьей Аба ТЬг Ьей 10 ббе РЬе Сбу Ьей Ьей 15 Аба
Сбу Сбп Аба Уаб Аба Аба Рго Туг Ьей Рго Ьей Аба Азр Азр Нбз Агд
20 25 30
Азп Сбу Сбп Сби Сбп ТЬг Аба Аба Азп А1а Тгр Ьей Сби Уаб Азр Ьей
35 40 45
Сбу Аба РЬе Сби Нбз Азп 11е Сбп ТЬг Ьей Ьуз Азп Агд Ьей Сбу Азр
50 55 60
Ьуз Сбу Рго Сбп ббе Суз Аба Не Мер Ьуз Аба Азр Аба Туг Сбу Нбз
65 70 75 80
Сбу ббе Азр Леи Леи Уаб Рго Зег Уаб Уаб Ьуз Аба Сбу ббе Рго Суз
85 90 95
11е Сбу 11е Аба Зег Азп Сби Сби Аба Агд Уаб Аба Агд Сби Ьуз Сбу
600 105 110
РЬе Сби Сбу Агд Леи Мер Агд Уаб Агд Аба Аба ТЬг Рго Азр Сби Уаб
115 620 625
Сби Сбп Аба Ьей Рго Туг Ьуз Ьей Сби Сби Ьей ббе Сбу Зег Ьей Сби
130 635 140
Зег Аба Ьуз Сбу ббе Аба Азр ббе А1а Сбп Агд Нбз Нбз ТЬг Азп ббе
145 650 655 160
Рго Уаб Нбз ббе Сбу Ьей Азп Зег А1а Сбу Мер Зег Агд Азп Сбу ббе
665 670 175
Азр Ьей Агд Сбп Азр Азр Аба Ьуз А1а Азр Аба Ьей Аба Мер Ьей Ьуз
180 185 190
- 462
Ьеи Ьуз С1у 195 Не ТИг Рго Уа1 С1у 200 Не Меб ТИг Н1з РНе 205 Рго Уа1 С1и
С1и Ьуз С1и Азр Уа1 Ьуз Ьеи С1у Ьеи А1а С1п РНе Ьуз Ьеи Азр Туг
210 215 220
С1п Тгр Ьеи Не Азр А1а С1у Ьуз Ьеи Азр Агд Зег Ьуз Ьеи ТЬг 11е
225 230 235 240
ΗΪ3 А1а А1а Азп Зег РЬе А1а ТИг Ьеи С1и Уа1 Рго С1и А1а Туг РНе
245 250 255
Азр Меб Уа1 Агд Рго С1у С1у Не Не Туг С1у Азр ТИг Не Рго Зег
260 265 270
Туг ТЬг С1и Туг Ьуз Ьуз Уа1 Меб А1а РНе Ьуз ТИг С1п Уа1 А1а Зег
275 280 285
Уа1 Азп ΗΪ3 Туг Рго А1а С1у Азп ТНг Уа1 С1у Туг Азр Агд ТИг РЬе
290 295 300
ТЬг Ьеи Ьуз Агд Азр Зег Ьеи Ьеи А1а Азп Ьеи Рго Меб С1у Туг Зег
305 310 315 320
Азр С1у Туг Агд Агд А1а Меб Зег Азп Ьуз А1а Туг Уа1 Ьеи Не Н13
325 330 335
С1у С1п Ьуз А1а Рго Уа1 Уа1 С1у Ьуз ТИг Зег Меб Азп ТНг ТИг Меб
340 345 350
Уа1 Азр Уа1 ТЬг Азр Не Ьуз С1у Не Ьуз Рго С1у Азр С1и Уа1 Уа1
355 360 365
Ьеи РЬе С1у Агд С1п С1у Азр А1а С1и Уа1 Ьуз С1п Зег Азр Ьеи С1и
370 375 380
С1и Туг Азп С1у А1а Ьеи Ьеи А1а Азр Меб Туг ТИг Уа1 Тгр С1у Туг
385 390 395 400
ТЬг Азп Рго Ьуз Ьуз 11е Ьуз Агд

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:
    (a) нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности 8ЕЦ Ш N0:275 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более нуклеотидов, которая кодирует полипептид полной длины альдолазы или фрагмент указанного полипептида, содержащие иммуногенный эпитоп и способные индуцировать синтез специфичных к альдолазе антител; или (b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в строгих условиях гибридизации с молекулой, комплементарной нуклеиновой кислоте, охарактеризованной в (а); или (c) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид альдолазы полной длины, содержащий 8ЕЦ Ш N0:276, или фрагмент указанного полипептида, обладающий активностью альдолазы;
    (й) нуклеиновую кислоту по (а), (Ь) или (с), кодирующую полипептид или его фрагмент, обладающие по меньшей мере одной консервативной аминокислотной заменой и сохраняющие активность аль долазы;
    (е) нуклеиновую кислоту по (а), (Ь), (с) или (й), кодирующую полипептид альдолазы, лишенный сигнальной последовательности;
    (ί) нуклеиновую кислоту по (а), (Ь), (с), (й) или (е), кодирующую полипептид альдолазы, дополнительно содержащий гетерологичную последовательность;
    (д) нуклеиновую кислоту по (а), (Ь), (с), (й), (е) или (ί), где активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, активность альдолазы ИМО и/или активность альдолазы КНО, или (й) нуклеиновую кислоту, комплементарную нуклеиновой кислоте по любому из (а), (Ь), (с), (й), (е), (ί) и (§).
  2. 2. Экспрессирующая кассета, вектор, в том числе вирусный, или носитель для клонирования, содержащие нуклеиновую кислоту по п.1, где носитель для клонирования может представлять собой плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, причем вирусный вектор может быть аденовирусным вектором, ретровирусным вектором или аденоассоциированным вирусным вектором, а искусственная хромосома представляет собой бактериальную искусственную хромо
    - 463 019971 сому (ВАС), образованный из бактериофага Р1 вектор (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).
  3. 3. Трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1 или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования по п.2.
  4. 4. Трансгенное, не относящееся к человеку животное, содержащее последовательность по п.1 или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования по п.2 или трансформированную клетку по п.3.
  5. 5. Трансгенные растение или часть растения, в частности семя, содержащие последовательность по п.1 или экспрессирующую кассету, вектор или носитель для клонирования по п.2 или трансформированную клетку по п.3.
  6. 6. Выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид альдолазы, содержащий:
    (a) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ЛЕО ΙΌ N0:276 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков, причем указанный полипептид представляет собой полипептид альдолазы полной длины или фрагмент указанного полипептида, обладающий активностью альдолазы; или (b) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид или его фрагмент обладают иммуногенной активностью и способны индуцировать синтез антител, которые специфичны к альдолазе; или (c) аминокислотную последовательность по (а) или (Ь), содержащую консервативную замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка, причем полипептид или его фрагмент сохраняют активность альдолазы;
    (ά) аминокислотную последовательность по (а), (Ь) или (с), лишенную сигнальной последовательности; или (е) аминокислотную последовательность по (а), (Ь), (с) или (ά), дополнительно содержащую гетерологичную последовательность; или (ί) аминокислотную последовательность по (а), (Ь), (с), (ά) или (е), где активность альдолазы включает активность пируватальдолазы, активность альдолазы НМС и/или активность альдолазы КНС; или (д) аминокислотную последовательность по (а), (Ь), (с), (ά), (е) или (ί), где полипептид или его фрагмент содержат по меньшей мере один участок гликозилирования.
  7. 7. Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфично связывается с полипептидом по п.6.
  8. 8. Способ получения рекомбинантного полипептида альдолазы по п.6, включающий стадии:
    (a) получения нуклеиновой кислоты по п.1 и (b) обеспечения экспрессии нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, что приводит к получению рекомбинантного полипептида.
  9. 9. Способ получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида альдолазы, включающий стадии:
    (a) получения матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по п.1; и (b) модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их сочетания с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты, где вариант полипептида альдолазы является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия повышенной температуры; обладает повышенным гликозилированием по сравнению с альдолазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой.
  10. 10. Способ по п.9, в котором на стадии (Ь) осуществляют модификацию кодонов в матричной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид альдолазы, путем замены первоначального кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (а), отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещаемый кодон.
  11. 11. Способ образования углерод-углеродной связи, включающий следующие стадии:
    (a) получение полипептида по п.6;
    (b) получение донорного и акцепторного соединения и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид альдолазы образует углерод-углеродную связь.
  12. 12. Способ по п.11, который является способом получения 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты, включающий следующие стадии:
    (a) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;
    (b) получение акцептора α-кетокислоты и пирувата или донора пирувата и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ь) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 4-замещенной Ό-глутаминовой кислоты.
  13. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий применение Ό-аминотрансферазы.
  14. 14. Способ по п.11, который является способом получения 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, включающий следующие стадии:
    - 464 019971 (a) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;
    (b) получение донорного и акцепторного соединения и (c) приведение полипептида стадии (а) в контакт с соединениями стадии (Ъ) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 3,4-замещенного 2-кетоглутарата.
  15. 15. Композиция, содержащая полипептид по п.6, где композиция выбрана из группы, состоящей из продукта питания, кормового продукта и напитка, добавки к продукту питания, добавки к кормовому продукту, добавки к напитку, теста или хлебного продукта.
  16. 16. Способ превращения биомассы или любого лигноцеллюлозного материала в топливо, включающий приведение биомассы или лигноцеллюлозного материала в контакт с полипептидом по п.6, или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, или с его фрагментом, сохраняющим активность альдолазы, где при необходимости биомассу или лигноцеллюлозный материал предварительно обрабатывают перед контактом с альдолазой и при необходимости перед контактом с альдолазой биомассу или лигноцеллюлозный материал приводят в контакт с ферментом, вызывающим деградацию целлюлозы и/или гемицеллюлозы.
  17. 17. Способ по п.16, где топливо представляет собой этанол, метанол, пропанол, бутанол и/или дизель.
  18. 18. Фармацевтическая композиция, в частности лекарственное средство, содержащая полипептид по п.6.
  19. 19. Композиция по п.18, которая приготовлена в виде таблетки, геля, пилюли, имплантата, аэрозоля, порошка, капсулы или в виде инкапсулированного состава.
  20. 20. Топливо, содержащее полипептид по п.6, представляющее собой этанол, метанол, пропанол, бутанол или дизель.
EA200870329A 2006-03-07 2007-03-07 Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения EA019971B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78051506P 2006-03-07 2006-03-07
PCT/US2007/063515 WO2007103989A2 (en) 2006-03-07 2007-03-07 Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870329A1 EA200870329A1 (ru) 2009-06-30
EA019971B1 true EA019971B1 (ru) 2014-07-30

Family

ID=38475839

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870329A EA019971B1 (ru) 2006-03-07 2007-03-07 Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
EA201301267A EA029538B1 (ru) 2006-03-07 2007-03-07 Полипептид, обладающий активностью альдолазы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способы получения и применения полинуклеотида и полипептида

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201301267A EA029538B1 (ru) 2006-03-07 2007-03-07 Полипептид, обладающий активностью альдолазы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способы получения и применения полинуклеотида и полипептида

Country Status (13)

Country Link
US (3) US8546118B2 (ru)
EP (4) EP3153580A3 (ru)
JP (3) JP5733777B2 (ru)
KR (4) KR101508249B1 (ru)
CN (3) CN105063072A (ru)
AT (1) ATE548450T1 (ru)
AU (1) AU2007223086B2 (ru)
BR (2) BRPI0708614A2 (ru)
CA (1) CA2645225A1 (ru)
EA (2) EA019971B1 (ru)
ES (1) ES2383767T3 (ru)
MX (1) MX2008011442A (ru)
WO (1) WO2007103989A2 (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101223444B (zh) * 2005-04-20 2013-04-24 嘉吉有限公司 在体内分泌莫纳甜的方法
US8158389B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-17 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
US8076108B2 (en) * 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US8043837B2 (en) 2006-03-07 2011-10-25 Cargill, Incorporated Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
RU2505606C2 (ru) 2010-10-14 2014-01-27 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения монатина
CN102181471B (zh) * 2011-03-23 2014-07-02 深圳大学 莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法
US10436790B2 (en) 2011-09-28 2019-10-08 Waters Technologies Corporation Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals
MX350529B (es) 2011-12-22 2017-09-08 Xyleco Inc Procesamiento de biomasa.
CN102559722B (zh) * 2012-03-12 2017-05-17 杭州师范大学 一种高酶活、耐热醛缩酶基因、酶、载体、工程菌及应用
WO2013148328A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Nutritive proteins and methods
CA2868522A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Charged nutritive proteins and methods
MX2014011600A (es) 2012-03-26 2015-02-04 Pronutria Inc Proteínas nutritivas, fragmentos y métodos.
EP2831102A4 (en) 2012-03-26 2015-12-02 Pronutria Inc NUTRIENT FRAGMENTS, NUTRIENT PROTEINS AND METHODS
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
WO2015048333A2 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Pronutria, Inc. Nutritive polypeptides and formulations thereof, and methods of production and use thereof
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
CN115753702A (zh) 2014-10-30 2023-03-07 沃特世科技公司 快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法
EP3744708B1 (en) 2014-11-13 2023-08-09 Waters Technologies Corporation Calibrant for liquid chromatography calibration of labeled n-glycans
US11035832B2 (en) 2016-06-21 2021-06-15 Waters Technologies Corporation Methods of electrospray ionization of glycans modified with amphipathic, strongly basic moieties
US11150248B2 (en) 2016-07-01 2021-10-19 Waters Technologies Corporation Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines from complex matrices using molecular weight cut off filtration and on-filter deglycosylation
CN108079315B (zh) * 2016-11-21 2021-09-24 厦门华绰生物医药科技有限公司 FBP aldolase在制备激活AMPK的药物中的用途
EP3330380A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-06 Evonik Degussa GmbH Process for producing l-methionine from methional
CN107541540B (zh) * 2017-10-18 2021-07-20 南京财经大学 一种活性炭串联大孔树脂纯化菜籽肽的方法
JP2021531749A (ja) * 2018-07-12 2021-11-25 コデクシス， インコーポレイテッド 操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド
WO2020090016A1 (ja) * 2018-10-30 2020-05-07 Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 株式会社 有機化合物の製造方法およびコリネ型細菌
US20220315967A1 (en) * 2019-09-19 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Methods for producing d-tryptophan and substituted d-tryptophans
CN114279952B (zh) * 2020-09-27 2024-03-12 瑞辰星生物技术（广州）有限公司 用于造纸系统控制有机污染物沉积的生物酶酶活力的测定方法
CN112301067B (zh) * 2020-11-06 2022-07-05 杭州濡湜生物科技有限公司 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺
CN112280773B (zh) * 2020-11-06 2022-07-12 杭州濡湜生物科技有限公司 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺
CN113151551A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 山西农业大学 Caps分子标记在鉴定谷子株高性状的用途及引物和检测试剂盒
CN116987601B (zh) * 2023-09-27 2023-12-15 菏泽学院 一种微生物制剂及其在多环芳烃降解中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004018672A1 (ja) * 2002-08-26 2004-03-04 Ajinomoto Co., Inc. 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法
US20050244939A1 (en) * 2004-03-16 2005-11-03 Ajinomoto Co., Inc. Variant aldolase and processes for producing an optically active IHOG and an optically active monatin using the same

Family Cites Families (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
US5780292A (en) 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
ES2063443T3 (es) 1990-01-19 1995-01-01 Technology Finance Corp Procedimiento para la produccion de 3-(1-amino-1,3-dicarboxi-3-hidroxi-but-4-il) indol.
EP0528881A4 (en) 1990-04-24 1993-05-26 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
US5387742A (en) 1990-06-15 1995-02-07 Scios Nova Inc. Transgenic mice displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
DK0558676T3 (da) 1990-11-23 2000-09-25 Aventis Cropscience Nv Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter
WO1992011272A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
AU5676394A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
EP0670670A4 (en) 1993-09-30 1996-04-24 Agracetus HETEROLOGICAL PEROXIDASE PROCESSING TRANSGENIC COTTON PLANTS.
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
NZ279676A (en) 1994-03-09 1998-04-27 Abbott Lab Humanized milk produced by non-human transgenic mammal transformed with a heterologous gene coding for human enzyme producing human oligosaccharides and glycoconjugates
WO1995024488A1 (en) 1994-03-09 1995-09-14 Abbott Laboratories Transgenic animals producing oligosaccharides and glycoconjugates
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
WO1996006927A1 (en) 1994-09-01 1996-03-07 Merck & Co., Inc. Transgenic animal expressing a familial form of human amyloid precursor protein
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5633440A (en) 1994-12-20 1997-05-27 Dna Plant Technology Corporation P119 promoters and their uses
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
EP0805856B2 (en) 1995-01-26 2009-04-01 Novozymes A/S Animal feed additives comprising xylanase
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US5795749A (en) 1995-04-05 1998-08-18 The Scripps Research Institution Use of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase to prepare 2-deoxyfucose, analogues and derivatives
JPH10510433A (ja) 1995-06-06 1998-10-13 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5962258A (en) 1995-08-23 1999-10-05 Diversa Corporation Carboxymethyl cellulase fromthermotoga maritima
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
US6057100A (en) 1996-06-07 2000-05-02 Eos Biotechnology, Inc. Oligonucleotide arrays
DE69835360T2 (de) 1997-01-17 2007-08-16 Maxygen, Inc., Redwood City EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
WO1998041622A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S Method for constructing a library using dna shuffling
CA2284253A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Jesper Vind An in vitro method for construction of a dna library
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
US7019827B2 (en) 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
AUPO758297A0 (en) 1997-06-27 1997-07-24 Rowe, James Baber Control of acidic gut syndrome
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
AU8908198A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
PT1012564E (pt) 1997-09-11 2003-08-29 Bioventures Inc Metodo de producao de arranjos de alta densidade
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
AU1124499A (en) 1997-10-28 1999-05-17 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
WO1999023107A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
US6118044A (en) 1997-11-14 2000-09-12 Sankyo Company, Limited Transgenic animal allergy models and methods for their use
IL136574A0 (en) 1997-12-08 2001-06-14 California Inst Of Techn A method for forming a polynucleotide of desired properties
EP1056842A2 (en) 1998-02-11 2000-12-06 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
EP1054973A1 (en) 1998-02-11 2000-11-29 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
JP2002510505A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 フィロス インク． 位置特定可能な蛋白質アレイ
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
NZ508287A (en) 1998-06-29 2003-08-29 Phylos Inc Method for generating highly diverse libraries
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
GB2340755B (en) 1998-08-24 2002-09-25 Cannon Rubber Ltd Breast pump insert
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US7024312B1 (en) 1999-01-19 2006-04-04 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
DE19910464A1 (de) 1999-03-10 2000-09-14 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Cyclobutanon
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
EP1642596A3 (en) 1999-05-07 2006-04-12 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
JP2001328984A (ja) 2000-05-19 2001-11-27 Kuraray Co Ltd メバロラクトンの製造方法
CA2413022A1 (en) 2000-06-14 2001-12-20 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
WO2002014261A2 (en) 2000-08-10 2002-02-21 Eli Lilly And Company 4-substituted d-glutamic acid derivatives for use as antibiotic
WO2002029032A2 (en) 2000-09-30 2002-04-11 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
CA2393374A1 (en) 2000-10-10 2002-04-18 Diversa Corporation High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
AU2002227064A1 (en) 2000-11-30 2002-06-11 Verenium Corporation Method of making a protein polymer and uses of the polymer
US20060019913A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040033975A1 (en) 2001-10-01 2004-02-19 Diversa Corporation Whole cell engineering using real-time metabolic flux analysis
US7572607B2 (en) * 2002-04-23 2009-08-11 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
PL208998B1 (pl) 2002-04-23 2011-07-29 Cargill Sposób wytwarzania monatyny
EP1625223A4 (en) * 2002-09-20 2009-11-11 Verenium Corp CHEMOENZYMATIC PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF STATINES AND STATIN INTERCONNECTIONS
US6776979B2 (en) 2002-12-30 2004-08-17 Marvin B. Frager Periodontal treatment compound and method of use
CN103555782B (zh) * 2003-10-21 2017-04-12 嘉吉有限公司 生产莫纳甜和莫纳甜前体
JP4500977B2 (ja) 2003-11-05 2010-07-14 味の素株式会社 新規アミノ酸誘導体及び甘味剤
US20060014260A1 (en) 2004-05-07 2006-01-19 Zhiliang Fan Lower cellulase requirements for biomass cellulose hydrolysis and fermentation
US20060030003A1 (en) 2004-05-12 2006-02-09 Simon Michael R Composition and method for introduction of RNA interference sequences into targeted cells and tissues
US7338763B2 (en) 2004-06-02 2008-03-04 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays
CA2506247C (en) * 2004-06-07 2012-02-21 Ajinomoto Co., Inc. Novel aldolase, and method for producing optically active ihog and monatin
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
CN100519756C (zh) * 2004-06-07 2009-07-29 味之素株式会社 新的醛缩酶及光学活性ihog及莫那亭的制备方法
US7635563B2 (en) 2004-06-30 2009-12-22 Massachusetts Institute Of Technology High throughput methods relating to microRNA expression analysis
US20060019258A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for detection of small interfering RNA and micro-RNA
US7923231B2 (en) 2004-12-17 2011-04-12 Cargill, Incorporated Production of glucuronic acid using myo-inositol oxygenase from cryptococcus neoformans
US8076108B2 (en) * 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US7582455B2 (en) * 2005-04-26 2009-09-01 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
WO2014205447A2 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic system with fluid pickups

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004018672A1 (ja) * 2002-08-26 2004-03-04 Ajinomoto Co., Inc. 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法
US20050244939A1 (en) * 2004-03-16 2005-11-03 Ajinomoto Co., Inc. Variant aldolase and processes for producing an optically active IHOG and an optically active monatin using the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAQ-872331.1 *
CAK-08341 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007223086A1 (en) 2007-09-13
JP5793487B2 (ja) 2015-10-14
KR101744157B1 (ko) 2017-06-08
BRPI0708614A2 (pt) 2011-06-07
CN102690833A (zh) 2012-09-26
EP3153580A3 (en) 2017-04-19
CN102690833B (zh) 2015-09-09
US20160251643A1 (en) 2016-09-01
AU2007223086B2 (en) 2013-09-26
ES2383767T3 (es) 2012-06-26
EP2385108B1 (en) 2016-11-23
KR20160058194A (ko) 2016-05-24
JP5793486B2 (ja) 2015-10-14
US8546118B2 (en) 2013-10-01
CN101443446B (zh) 2013-08-21
EA200870329A1 (ru) 2009-06-30
US20100095390A1 (en) 2010-04-15
JP2013063068A (ja) 2013-04-11
KR101508249B1 (ko) 2015-04-10
WO2007103989A2 (en) 2007-09-13
KR20090004918A (ko) 2009-01-12
US9290755B2 (en) 2016-03-22
EP1999256A4 (en) 2009-06-03
EP2385108A1 (en) 2011-11-09
US9719079B2 (en) 2017-08-01
ATE548450T1 (de) 2012-03-15
BR122017003017B1 (pt) 2018-10-23
EA201301267A1 (ru) 2014-11-28
KR20150020722A (ko) 2015-02-26
EA029538B1 (ru) 2018-04-30
EP2388316A3 (en) 2012-03-14
JP2013066469A (ja) 2013-04-18
WO2007103989A8 (en) 2009-07-23
US20140053287A1 (en) 2014-02-20
EP1999256A2 (en) 2008-12-10
MX2008011442A (es) 2008-11-18
CN101443446A (zh) 2009-05-27
KR101588539B1 (ko) 2016-01-25
EP1999256B1 (en) 2012-03-07
WO2007103989A9 (en) 2007-11-29
KR20140023424A (ko) 2014-02-26
JP5733777B2 (ja) 2015-06-10
EP2388316A2 (en) 2011-11-23
JP2009531025A (ja) 2009-09-03
CA2645225A1 (en) 2007-09-13
KR101622894B1 (ko) 2016-05-19
CN105063072A (zh) 2015-11-18
EP3153580A2 (en) 2017-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA019971B1 (ru) Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
JP6165903B2 (ja) トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼ、それらをコードする核酸並びにそれらを製造および使用する方法
CN101437954B (zh) 醛缩酶和编码醛缩酶的核酸以及它们的制备和使用方法
EA013993B1 (ru) Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы
AU2016201456A1 (en) Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2013251189A1 (en) Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU