EA013993B1 - Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы - Google Patents

Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы Download PDF

Info

Publication number
EA013993B1
EA013993B1 EA200700032A EA200700032A EA013993B1 EA 013993 B1 EA013993 B1 EA 013993B1 EA 200700032 A EA200700032 A EA 200700032A EA 200700032 A EA200700032 A EA 200700032A EA 013993 B1 EA013993 B1 EA 013993B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
optionally
polypeptide
chlorophyll
sequence
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200700032A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700032A1 (ru
Inventor
Дэвид Лэм
Дэвид Уэйнер
Тимоти Хитчмэн
Нельсон Роберт Бартон
Марк Дж. Бурк
Original Assignee
Верениум Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Верениум Корпорейшн filed Critical Верениум Корпорейшн
Publication of EA200700032A1 publication Critical patent/EA200700032A1/ru
Publication of EA013993B1 publication Critical patent/EA013993B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/40—Colouring or decolouring of foods
    • A23L5/49—Removing colour by chemical reaction, e.g. bleaching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01014—Chlorophyllase (3.1.1.14)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к композициям и способам ферментативной обработки ("осветлению" или "обесцвечиванию") композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, например препаратов из водорослей, кормов, пищевых продуктов или масел, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, например растительных масел, включая масла, получаемые из семян масличных растений, таких как масло канолы (семян рапса), или соевое масло, или плодов масличных растений, таких как пальмовое масло. В одном аспекте данное изобретение относится к способам, в которых используется фермент хлорофиллаза для ферментативного гидролиза хлорофилла в препарате из водорослей, животного (например, рыбы) или растения, пищевого продукта или масла. В одном аспекте хлорофиллаза иммобилизована на диоксиде кремния. Данное изобретение также относится к промышленным композициям или детергентам.

Description

Данное изобретение относится к области промышленной обработки пищевых продуктов, кормов или растительных масел, продуктов растительного и животного происхождения и энзимологии. В частности, данное изобретение относится к композициям и способам ферментативной обработки (осветлению или обесцвечиванию) содержащих хлорофилл композиций или композиций с примесью хлорофилла, например препаратов из водорослей, животных или растений, пищевых продуктов, кормов или масел, например растительных масел, включая масла, полученные из семян масличных растений, таких как масло канолы (семян рапса) или соевое масло, или плодов масличных растений, таких как пальмовое масло. В одном аспекте данное изобретение относится к способам, в которых используются ферменты, участвующие в катаболизме хлорофилла (например, хлорофиллаза) для ферментативной модификации хлорофилла, например, в препаратах, полученных из водорослей, животных или растений, или в пищевом продукте, корме или масле.
Предпосылки
Растительные масла, полученные из семян масличных растений, таких как канола или соя, или плодов масличных растений, таких как пальмовые, содержат хлорофилл. Хлорофилл удаляют в процессе многих стадий способа производства масла, включая стадии измельчения семян, экстракции масла, рафинирования, обработки щелочью и осветления. В последнем случае, в процессе осветления остаточный хлорофилл удаляют до достижения приемлемого уровня. Этот хлорофилл, как правило, удаляют из масла в процессе стадии осветления, включающем нагревание масла и прохождение его через адсорбент для удаления хлорофилла и других соединений, придающих окраску, которые влияют на внешний вид и/или стабильность обработанного масла. Также эту технологию используют для обработки других содержащих хлорофилл масел или препаратов из водорослей или растений, таких как масла, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (РИРА) (например, эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА) и докозагексаеновую кислоту (ΌΗΑ)).
Высокий уровень пигментов хлорофилла придает нежелательную окраску и вызывает окисление масла в процессе хранения, что приводит к ухудшению качества масла. В промышленности, связанной с обработкой пищевых масел, для снижения уровня хлорофилла до уровня, равного 0,1 ч.млн. для гарантии качества масла в отношении цвета и органолептических свойств используют стадию осветления. Как правило, желаемый уровень хлорофилла в обработанном масле составляет от 0,02 до 0,05 ч.млн. Эта стадия осветления повышает стоимость обработки и снижает выход масла вследствие того, что оно переходит в отбеливающую глину.
У растений, хлорофиллаза (сЫаке) представляет собой первый фермент, вовлеченный в деградацию хлорофилла; она катализирует гидролиз сложноэфирной связи в хлорофилле с образованием хлорофиллида и фитола.
Сущность
Данное изобретение относится к композициям и способам ферментативной обработки (осветления или обесцвечивания) композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, таких как препараты из растений, животных (например, препараты из рыбы, мяса) или из водорослей, пищевые продукты, корма или масла, такие как масла, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (РИРА) или докозагексаеновую кислоту (ΌΗΑ), или их смеси. В одном аспекте ферментативное осветление в соответствии с композициями и способами по данному изобретению включает использование модифицирующего хлорофилл фермента, например полипептида с активностью хлорофиллазы, включая сЫаке и хлорофилл-хлорофиллидо-гидролазу, и сходных полипептидов, или любого фермента, участвующего в катаболизме хлорофилла. Таким образом, как используется в данном описании, термин ферментативное осветление включает любую модификацию молекулы хлорофилла или его аналога, включая частичное или полное обесцвечивание. В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению могут снижать потери выхода вследствие перехода в глину и расщепления жиров, характерного для катализа в условиях наличия глины/отбеливателя.
В альтернативных аспектах методов и способов по данному изобретению хлорофиллазу, которая может представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, включая сЫаке и хлорофилл-хлорофиллидо-гидролазы, и сходные полипептиды или их комбинацию, или любой фермент, участвующий в катаболизме хлорофилла, добавляют в любой момент времени или всюду в ходе осуществления способа или процесса, например, как описано в данном описании. Например, в одном аспекте хлорофиллаза (которая может представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию) и/или любой фермент, участвующий в катаболизме хлорофилла, может быть добавлена в композицию, такую как неочищенное масло, с другим ферментом или без него, например с фосфолипазой (например, с фосфолипазой С), на стадии смешивания или на стадии рафинирования, на стадии в резервуаре для обработки щелочью, в статическом смесителе, в расходной емкости или в смесителе для непрерывного смешения жидких потоков. Альтернативно, в одном аспекте способа или метода по данному изобретению хлорофиллаза (по данному изобретению или известная) и/или любой фермент, участвующий в катаболизме хлорофилла, могут быть добавлены в любую комбинацию из этих стадий или на всех этих стадиях.
- 1 013993
В одном аспекте данное изобретение относится к способам или методам ферментативной модификации хлорофилла для облегчения его удаления из композиции, например, посредством метода водного разделения, как проиллюстрировано на с. 1 приложения А, или метода гидрофобного разделения, или метода аффинного разделения и т.п.
В одном аспекте данное изобретение относится к способам и методам, включающим ферментативную модификацию (например, катаболизм) хлорофилла или эквивалентных соединений в композиции (например, в пищевом продукте, корме, в композиции из растений, животных, водорослей и т.д.), кроме того, включающим удаление компонентов этой композиции (например, соединений, нежелательных для обработанного продукта), таких как остаточный хлорофилл (например, хлорофилл или эквивалентные соединения, не модифицированные хлорофиллазой), пестициды, полициклические ароматические углеводороды и т.д. Нежелательные компоненты, например остаточный хлорофилл, пестициды, полициклические ароматические углеводороды и т.п., могут быть удалены с помощью либо значительно меньших количеств отбеливающей глины, либо другого адсорбента, такого как диоксид кремния или эквивалентные соединения.
В одном аспекте эти компоненты композиции удаляют с использованием отбеливающей глины, например с использованием отбеливающей глины на множестве стадий, где в одном аспекте компоненты композиции удаляют с помощью или значительно меньших количеств отбеливающей глины, и/или по меньшей мере одного другого адсорбента (например, диоксида кремния). В одном аспекте конечный уровень хлорофилла составляет приблизительно от 0,02 до 0,05 ч.млн. В этом иллюстративном способе стадия осветления может повысить стоимость обработки и уменьшить потери выхода вследствие перехода в отбеливающую глину. Композиции и способы по данному изобретению могут уменьшить потери выхода вследствие перехода в глину и расщепления жиров, характерного для катализа в условиях наличия глины/отбеливателя.
В иллюстративно продемонстрированном способе (реакции) по данному изобретению хлорофиллаза катализирует гидролиз хлорофилла с образованием хлорофиллида, который в одном аспекте подвергают водной экстракции, и фитола, который остается в масляной фазе. В другом иллюстративном способе феофорбид может быть удален по методу, аналогичному для хлорофиллида. В одном аспекте при применении композиций и способов по данному изобретению метод водного разделения может частично или полностью снять необходимость в адсорбентах. Однако в другом аспекте способы включают частичную или полную экстракцию растворимого в воде хлорофиллида или феофорбида с использованием метода экстракции на основе диоксида кремния (например, очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента). В одном аспекте хлорофиллаза иммобилизована на диоксиде кремния (который затем адсорбирует хлорофиллид), например на силикагеле. В одном аспекте диоксид кремния включает диоксид кремния 1л8у1 8Шеа или 8ОКВ81Ь В™.
Данное изобретение относится к способам, включая промышленные способы ферментативной обработки композиций, содержащих феофитин или с примесью феофитина, включающим следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей феофитин или с примесью феофитина; (Ь) получение полипептида с активностью хлорофиллазы или феофитиназы (который может представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию); и (с) осуществление взаимодействия композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации феофитина. Производное хлорофилла без магния называется феофитином. Феофитин является окрашенным и часто обнаруживается в масле, особенно при использовании обработки кислотой. В некоторых областях применения желательно удалять феофитин. Продуктом обработки феофитина хлорофиллазой является феофорбид, который может быть удален по методу, аналогичному для удаления хлорофиллида.
В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению применяются на практике в качестве промышленных способов или совместно с ними, например с процессом осветления масла или нейтрализации щелочью, или рафинирования. В одном аспекте использование композиций и способов по данному изобретению облегчает снижение количества адсорбентов или устранение необходимости в них в ходе обработки для осветления, которая, как правило, включает нагревание масла или другой содержащей хлорофилл композиции и прохождение его через адсорбент для удаления хлорофилла и других придающих окраску соединений, что влияет на внешний вид и/или стабильность обработанного масла. Таким образом, при применении на практике этого аспекта изобретения, посредством частичного или полного устранения необходимости в адсорбентах, стоимость обработки может быть снижена, например могут быть снижены стоимость адсорбентов (например, глины), затраты на удаление отходов, стоимость воды, стоимость энергии, стоимость обработки паром. Другие преимущества применения на практике различных аспектов данного изобретения включают получение положительных изменений, например уменьшения перехода масел в сорбирующие субстраты, повышение конечного объема продукта, включая сохранение полезных микронутриентов, таких как бета-каротин, эффективность процесса, включая уменьшение количества стадий обработки, экономию капитала и пользу для окружающей среды, например снижение или устранение увеличения содержания осветляющих адсорбентов в почве.
В одном аспекте при применении на практике композиций и способов по данному изобретению мо
- 2 013993 дифицирующие хлорофилл полипептиды (которые могут представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию) могут быть использованы на любой стадии процесса рафинирования (например, ферментативного рафинирования). Например, модифицирующие хлорофилл полипептиды могут быть добавлены до или после любой стадии способа, или до или после любой комбинации стадий, или до или после всех стадий, в способе, например, до, в течение или после механической и/или химической экстракции, и/или рафинирования, и/или нейтрализации щелочью, и/или осветления и т.п.
В альтернативных аспектах любых способов по данному изобретению по меньшей мере одну стадию проводят в реакционном резервуаре, например в устройстве для рафинирования. В альтернативных аспектах любых способов по данному изобретению по меньшей мере одну стадию проводят в клеточном экстракте. В альтернативных аспектах любых способов по данному изобретению по меньшей мере одну стадию проводят в цельной клетке. Клетка может быть любого происхождения, например растительной клеткой, бактериальной клеткой, клеткой грибов, клеткой животных (например, клеткой млекопитающих, клеткой рыб) или клеткой дрожжей.
Данное изобретение относится к способам ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающим следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей хлорофилл или композиции с примесью хлорофилла; (Ь) получение полипептида с активностью хлорофиллазы (который может представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию); и (с) осуществление взаимодействия композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла.
Данное изобретение относится к промышленным способам ферментативной обработки (осветления) композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающим следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла; (Ь) получение полипептида с активностью хлорофиллазы (который может представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию); и (с) осуществление взаимодействия композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла.
Данное изобретение относится к способам рафинирования, включающим стадию ферментативного осветления композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающим следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла; (Ь) получение полипептида с активностью хлорофиллазы (который может представлять собой новую хлорофиллазу по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию); и (с) осуществление взаимодействия композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла.
Хлорофиллы и феофитины обладают второй сложноэфирной связью - сложноэфирной связью с метильной группой. Способы по данному изобретению могут дополнительно включать гидролиз эстеразой этой сложноэфирной связи с метилом. Это может повысить склонность продукта реакции (уже двухосновной кислоты) к распределению в водный слой.
В иллюстративном способе используется фосфолипаза, например фосфолипаза С, или другая гидролаза (например, целлюлаза, гемицеллюлаза, эстераза, протеаза и/или фосфатаза), например, для улучшения экстракции масла или рафинирования масла.
В альтернативных аспектах способы и методы по данному изобретению могут дополнительно включать гидролиз сложноэфирной связи с метильной группой хлорофилла или феофитина эстеразой (которая может представлять собой новый фермент по данному изобретению, или известный фермент, или их комбинацию). В альтернативных аспектах способы по данному изобретению могут дополнительно включать удаление модифицированного хлорофилла водной экстракцией. Способы могут дополнительно включать изменение рН (например, повышение рН) для обеспечения водного выделения хлорофиллида. Ферменты, используемые в способах, например хлорофиллаза, могут быть добавлены при таком повышенном рН, или во время щелочной фазы процесса разделения. Кроме того, способы могут включать стадию нейтрализации щелочью. Кроме того, способы могут включать стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла. Кроме того, способы могут включать использование гидролазы, например фосфолипазы С.
В одном аспекте методов и способов полипептид представляет собой эстеразу (например, фермент по данному изобретению), например хлорофиллазу, или имеет подобную хлорофиллазе активность, или обладает активностью в отношении катаболизма хлорофилла. В одном аспекте способов полипептид является иммобилизованным. Полипептид может быть иммобилизован на неорганической подложке или органической подложке.
Неорганическая подложка может включать оксид алюминия, целит, хлорид Эо\усх-1. стеклянные бусы или силикагель, или их эквиваленты. Полипептид может быть иммобилизован на альгинатном гидрогеле или альгинатных бусах, или их эквивалентах. В одном аспекте способов полипептид дополни
- 3 013993 тельно содержит липосому, гидрогель или гель.
В одном аспекте способов для полипептида по меньшей мере одну стадию проводят в реакционном резервуаре, например в резервуаре, содержащем устройство для гравитационного удаления камедей, или в накопительной емкости, или подобных. В одном аспекте способы проводят по меньшей мере в одну стадию в клеточном экстракте или цельной клетке. Клетка может представлять собой растительную клетку, бактериальную клетку, клетку грибов, клетку дрожжей, клетку млекопитающих, клетку насекомых и т. п.
В одном аспекте способов композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит растительный материал, растительное масло или экстракт из растения. Растительный материал, растительное масло или экстракт из растения могут содержать растительное масло или масло из семян. Растительное масло может включать пальмовое масло или масло канолы. Альтернативно, растительный материал, растительное масло или экстракт из растений могут содержать препарат из водорослей. В одном аспекте способов композиции, содержащие хлорофилл или композиции с примесью хлорофилла, содержат недревесный или древесный продукт. В одном аспекте способов композиции, содержащие хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержат волокно или ткань. В одном аспекте способов композиции, содержащие хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержат фармацевтический состав, пищевой продукт, масло, корм или диетическую добавку.
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы для обработки неочищенных или очищенных масел, например масел, полученных из растительных источников (например, растительное), из водорослей, из животных источников или рыбы, или синтетического происхождения. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы для обработки неочищенных или очищенных масел при высоких концентрациях масла, или, в одном аспекте, используются для обработки неочищенных и неразбавленных неочищенных масел.
В одном аспекте способы дополнительно включают удаление хлорофиллида, образующегося при ферментативной деградации хлорофилла, адсорбцией на силикагель или эквивалент. Композиции, содержащие хлорофилл или с примесью хлорофилла, могут содержать текстиль, ткань, нитку или волокно, или сходные композиции, продукты из древесной бумаги или субпродукты, такие как древесная масса, бумажная масса, крафт-масса, или продукты из недревесной бумаги или субпродукты, такие как рисовая бумага.
Данное изобретение относится к промышленным изделиям, включающим систему рафинирования для ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающую: (а) устройство для очистки растительного масла; и (Ь) полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы (например, фермент по данному изобретению), где активность полипептида заключается в катализе реакции модификации хлорофилла, и в устройстве для очистки растительного масла можно проводить реакцию композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла, с полипептидом в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла. В одном аспекте промышленного изделия устройство для очистки растительного масла включает экспеллер для выхода масла, накопительную емкость или устройство для гравитационного удаления камедей. Реакции модификации хлорофилла могут включать образование хлорофиллида и фитола.
Данное изобретение относится к детергентам, включающим ферментативную обработку волокон, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающим (а) композицию детергента и (Ь) полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы (например, фермент по данному изобретению), где активность заключается в катализе реакции модификации хлорофилла. В одном аспекте реакция модификации хлорофилла включает образование хлорофиллида и фитола.
Данное изобретение относится к способам ферментативной обработки волокон, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающим (а) получение композиции детергента, содержащего полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы (например, фермент по данному изобретению), где активность заключается в катализе реакции модификации хлорофилла; и (Ь) осуществление взаимодействия композиции детергента с волокном, содержащим хлорофилл или с примесью хлорофилла, в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла. В одном аспекте реакция модификации хлорофилла включает образование хлорофиллида и фитола.
Данное изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью последовательностей с иллюстративной нуклеиновой кислотой по данному изобретению, например 8ЕО ГО N0: 1, 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ГО N0: 5, 8ЕО ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕЦ ГО N0: 15, 8ЕЦ ГО N0: 17 или 8ЕЦ ГО N0: 19, на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, последовательности, по существу, идентичные им, и последовательности, ком
- 4 013993 плементарные им, и кодирующим по меньшей мере один пептид, обладающий ферментативной активностью, как описано в данном описании, например активностью фермента эстеразы.
В альтернативных аспектах идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В одном аспекте алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВБА8Т, например алгоритм ВБА8Т версии 2.2.2, где установлены параметры фильтров: -р ЫаЧр -б пг ра!аа -Р Р, и все другие параметры установлены по умолчанию.
Иллюстративные нуклеиновые кислоты по данному изобретению также включают выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид по данному изобретению, например пептид, имеющий последовательность, как указано в 8ЕО ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 8, 8ЕО ГО N0: 10, 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 16, 8ЕО ГО N0: 18 или 8Е0 ГО N0: 20 и его подпоследовательности, и его варианты.
В альтернативных аспектах полипептид обладает ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (еЫаке), или ферментативной активностью, включающей ферментативную модификацию молекулы хлорофилла, например, где ферментативная модификация заключается в катаболизме молекулы хлорофилла. В одном аспекте активность эстеразы включает хлорофиллхлорофиллидо-гидролазную активность.
В одном аспекте выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по данному изобретению кодирует пептид, обладающий ферментативной активностью, которая является термостабильной. Полипептид может сохранять ферментативную активность в условиях, включающих диапазон температур приблизительно от 37 до приблизительно 95°С; приблизительно от 55 до приблизительно 85°С, приблизительно от 70 до приблизительно 95°С или приблизительно от 90 до приблизительно 95°С.
В другом аспекте выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по данному изобретению кодирует пептид, обладающий ферментативной активностью, которая является термоустойчивой. Полипептид может сохранять ферментативную активность после воздействия температуры в диапазоне от более 37 до приблизительно 95°С или везде в диапазоне от более чем 55 до приблизительно 85°С. Полипептид может сохранять ферментативную активность после воздействия температуры в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 5°С, приблизительно от 5 до приблизительно 15°С, приблизительно от 15 до приблизительно 25°С, приблизительно от 25 до приблизительно 37°С, приблизительно от 37 до приблизительно 95°С, приблизительно от 55 до приблизительно 85°С, приблизительно от 70 до приблизительно 75°С или приблизительно от 90 до приблизительно 95°С или более. В одном аспекте полипептид сохраняет ферментативную активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 90 до приблизительно 95°С при рН 4,5.
Данное изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность по данному изобретению, например последовательность, как указано в 8ЕО ГО N0: 1, 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ГО N0: 5, 8ЕО ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 13, 8Е0 ГО N0: 15, 8Е0 ГО N0: 17 или 8Е0 ГО N0: 19, или ее фрагменты или подпоследовательности (или комплементарные ей последовательности). В одном аспекте нуклеиновая кислота по данному изобретению кодирует пептид, обладающий ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (еЫаке), или ферментативной активностью, включающей ферментативную модификацию молекулы хлорофилла, например, где ферментативная модификация заключается в катаболизме молекулы хлорофилла. В одном аспекте активность эстеразы включает активность хлорофилл-хлорофиллидогидролазы. Длина нуклеиновой кислоты может составлять по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков, или полную длину гена или транскрипта. В одном аспекте жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение 15 мин.
Данное изобретение относится к зонду нуклеиновой кислоты для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, обладающий ферментативной активностью, как описано в данном описании, (например, с ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (еЫаке)), где зонд содержит по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательно расположенных оснований последовательности, содержащей последовательность по данному изобретению, или ее фрагменты или подпоследовательности, где зонд дает возможность идентифицировать нуклеиновую кислоту по связыванию или гибридизации. Зонд может включать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности, содержащей последовательность по данному изобретению, или ее фрагменты, или подпоследовательности.
Данное изобретение относится к зонду нуклеиновой кислоты для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий по меньшей мере одним видом ферментативной активно
- 5 013993 сти, как описано в данном описании, (например, ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (еЫаке)), где зонд содержит нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков по меньшей мере с приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по данному изобретению, где идентичность последовательностей определяют анализом с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием.
Зонд может включать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или ее подпоследовательности.
Данное изобретение относится к паре праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий по меньшей мере одним видом ферментативной активности, как описано в данном описании, (например, ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (еЫаке)), где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по данному изобретению, или ее фрагменты, или подпоследовательности. Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательных оснований последовательности или приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более последовательно расположенных оснований последовательности.
Данное изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более остатков нуклеиновой кислоты по данному изобретению, и второй член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более остатков комплементарной цепи первого члена.
Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим белки (например, ферменты), включая полипептиды по данному изобретению, полученным амплификацией, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по данному изобретению. Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, обладающие по меньшей мере одним видом ферментативной активности, как описано в данном описании, (например, ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (еЫаке)), полученным с использованием пары праймеров для амплификации по данному изобретению. Данное изобретение относится к способам получения и/или идентификации ферментов амплификацией, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по данному изобретению. В одном аспекте с помощью пары праймеров для амплификации амплифицируют нуклеиновую кислоту из библиотеки, например библиотеки генов, такой как библиотека окружающей среды.
Данное изобретение относится к способам амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, обладающий ферментативной активностью, включающим амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары праймеров для амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению, или ее фрагменты, или подпоследовательности.
Данное изобретение относится к экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту по данному изобретению или ее подпоследовательность. В одном аспекте экспрессирующая кассета может содержать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающих или растений. В одном аспекте промотор растений может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать СаМУ358. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В одном аспекте промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый окружающей средой, или промотор, регулируемый в зависимости от стадии развитии. Таким образом, промотор может представлять собой, например, промотор, специфичный для семян, специфичный для листьев, специфичный для корней, специфичный для стебля, или промотор, индуцируемый опаданием листвы. В одном аспекте экспрессирующая кассета может дополнительно содержать экспрессирующий вектор растений или вирусов растений.
Данное изобретение относится к носителям для клонирования, включающим экспрессирующую кассету (например, вектор) по данному изобретению или нуклеиновую кислоту по данному изобретению. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать аденови
- 6 013993 русный вектор, ретровирусный вектор или аденоассоциированный вирусный вектор. Носитель для клонирования может включать бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, полученный из бактериофага Р1 вектор (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).
Данное изобретение относится к трансформированной клетке, содержащей нуклеиновую кислоту по данному изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) по данному изобретению, или носитель для клонирования по данному изобретению. В одном аспекте трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающих, клетку грибов, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку растений. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку злаковых, картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя.
Данное изобретение относится к трансгенным животным, не относящимся к человеку, содержащим нуклеиновую кислоту по данному изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) по данному изобретению. В одном аспекте животным является мышь.
Данное изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим нуклеиновую кислоту по данному изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) по данному изобретению. Трансгенное растение может представлять собой растение злаковых, растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличных культур, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака.
Данное изобретение относится к трансгенным семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по данному изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) по данному изобретению. Трансгенное семя может представлять собой семя злакового растения, семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличного растения, семя рапса, семя сои, ядро пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, орех или семя растения табака.
Данное изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по данному изобретению или способную гибридизоваться с ней в жестких условиях. Данное изобретение относится к способам ингибирования трансляции транскрипта фермента (фермента по данному изобретению) в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по данному изобретению или способную гибридизоваться с ней в жестких условиях. В одном аспекте длина антисмыслового олигонуклеотида составляет приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 оснований.
Данное изобретение относится к способам ингибирования трансляции транскрипта фермента в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по данному изобретению или способную гибридизоваться с ней в жестких условиях. Данное изобретение относится к молекулам двухцепочечных ингибиторных РНК (ΡΗΚί), содержащим подпоследовательность последовательности по данному изобретению. В одном аспекте длина ΡΗΚί составляет приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов. Данное изобретение относится к способам ингибирования экспрессии полипептида (например, фермента по данному изобретению) в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке двухцепочечной ингибиторной РНК (1ΡΗΚ), где РНК содержит подпоследовательность последовательности по данному изобретению.
Данное изобретение относится к выделенному синтетическому или рекомбинантному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательностей, или полную (100%) идентичность последовательностей с иллюстративным полипептидом или пептидом по данному изобретению на протяжении участка по меньшей мере из приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 или более остатков, или на протяжении полной длины полипептида. В одном аспекте идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием.
Иллюстративные последовательности полипептида или пептида по данному изобретению включают ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 4, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 14, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 18 или ЗЕО ГО N0: 20 и их подпоследовательности, и их варианты. Также иллюстративные полипептиды включают фрагменты фермента длиной по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или более остатков, или полноразмерный фермент. Иллюстративные последовательности полипептида или пептида по данному изобретению включают последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по данному изобретению. Иллюстративные последовательности полипептида или пептида по данному изобретению включают полипептиды или пептиды, специфически связываемые антителами по данному изобретению. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив
- 7 013993 (например, сайт связывания), сигнальную последовательность, препропоследовательность, каталитические домены (СЭ) или активный центр.
В одном аспекте полипептид по данному изобретению обладает активностью эстеразы, такой как активность хлорофиллазы (сЫаке), или обладает ферментативной активностью, включающей ферментативную модификацию молекулы хлорофилла, например, где ферментативная модификация заключается в катаболизме молекулы хлорофилла. В одном аспекте активность эстеразы включает активность хлорофилл-хлорофиллидо-гидролазы.
Другой аспект данного изобретения относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному полипептиду или пептиду, содержащему по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100, или более последовательно расположенных оснований последовательности полипептида или пептида по данному изобретению, последовательностей, по существу, ей идентичных, и комплементарных им последовательностей. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, участок связывания), сигнальную последовательность, препропоследовательность или каталитические домены (СО) или активный центр.
Данное изобретение относится к биосинтетическим системам, содержащим нуклеиновые кислоты и/или плазмиды по данному изобретению в клетке, например клетке дрожжей, клетке растений, клетке грибов или микробной (например, бактериальной) клетке. В одном аспекте биосинтетические системы по данному изобретению содержат кодирующие последовательности для всех ферментов или их подклассов, необходимых для катаболизма молекулы хлорофилла. В одном аспекте кодирующие последовательности могут представлять собой плазмиду, рекомбинантный вектор или вирус и т.п.
В одном аспекте ферментативная активность полипептида по данному изобретению является термостабильной. Полипептид по данному изобретению может сохранять активность в условиях, включающих диапазон температур приблизительно от 1 до приблизительно 5°С, приблизительно от 5 до приблизительно 15°С, приблизительно от 15 до приблизительно 25°С, приблизительно от 25 до приблизительно 37°С, приблизительно от 37 до приблизительно 95°С, приблизительно от 55 до приблизительно 85°С, приблизительно от 70 до приблизительно 75°С или приблизительно от 90 до приблизительно 95°С или более. В другом аспекте ферментативная активность полипептида по данному изобретению является термоустойчивой. Полипептид может сохранять активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 37 до приблизительно 95°С или в диапазоне от более чем 55 до приблизительно 85°С. В одном аспекте полипептид может сохранять активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 90 до приблизительно 95°С при рН 4,5.
В одном аспекте выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид по данному изобретению, который лишен сигнальной последовательности. В одном аспекте выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид по данному изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность.
В одном аспекте данное изобретение относится к химерным белкам, включающим первый домен, содержащий сигнальную последовательность по данному изобретению, и по меньшей мере второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может включать фермент. Химерный фермент может включать всю последовательность или подпоследовательность по меньшей мере одного полипептида с активностью, как описано в данном описании (например, ферментативной активностью эстеразы, включая активность хлорофиллазы (сЫаке)).
Данное изобретение относится к химерным полипептидам, включающим по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), препропоследовательность и/или каталитический домен (СО) по данному изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид искусственно ассоциирован с сигнальным пептидом (8Р), препропоследовательностью и/ или каталитическим доменом (СО). В одном аспекте гетерологичный полипептид или пептид не является полипептидом, обладающим активностью, включающей ферментативную активность эстеразы или активность в отношении катаболизма хлорофилла. Гетерологичный полипептид или пептид может быть Ν-концевым, С-концевым или может находиться на обоих концах сигнального пептида (8Р), препропоследовательности и/или каталитического домена (СО).
Данное изобретение относится к выделенным синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим химерный полипептид, где химерный полипептид включает по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СО) по данному изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид искусственно ассоциирован с сигнальным пептидом (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СО).
Данное изобретение относится к выделенным синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям (например, сигнальным пептидам), состоящим из последовательности или содержащим последовательность, как указано, из остатков 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43 или 1-44 полипептида по данному изобретению, например 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 6, <1Ώ ΙΌ ΝΟ: 8, 51Х) ΙΌ ΝΟ: 10, 51Х) ΙΌ ΝΟ: 12, 51Х) ΙΌ ΝΟ: 14, <1Р ΙΌ ΝΟ: 16, УО ΙΌ ΝΟ: 18 или
- 8 013993
8ЕО Ш N0: 20. Данное изобретение относится к выделенным синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям (например, сигнальным пептидам), состоящим из последовательности или содержащим последовательность, как указано ниже в табл. 1.
В одном аспекте фермент по данному изобретению обладает специфичной активностью в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 1200 ед./мг белка или приблизительно от 100 до приблизительно 1000 ед./мг белка при приблизительно 37°С. В другом аспекте фермент по данному изобретению обладает специфичной активностью приблизительно от 100 до приблизительно 1000 ед./мг белка или приблизительно от 500 до приблизительно 750 ед./мг белка. Альтернативно, фермент по данному изобретению обладает специфичной активностью в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 750 ед./мг белка или приблизительно от 500 до приблизительно 1200 ед./мг белка при 37°С. В одном аспекте фермент по данному изобретению обладает специфичной активностью в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 500 ед./мг белка или приблизительно от 750 до приблизительно 1000 ед./мг белка при 37°С. В другом аспекте фермент по данному изобретению обладает специфичной активностью в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 250 ед./мг белка при 37°С. Альтернативно, фермент по данному изобретению обладает специфичной активностью в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 100 ед./мг белка при 37°С. В другом аспекте термоустойчивость включает сохранение, по меньшей мере, половины специфичной активности фермента при 37°С после нагревания до повышенной температуры. Альтернативно, термоустойчивость может включать сохранение специфичной активности в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 1200 ед./мг белка или приблизительно от 500 до приблизительно 1000 ед./мг белка при 37°С после нагревания до повышенной температуры. В другом аспекте термоустойчивость может включать сохранение специфичной активности диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 500 ед./мг белка при 37°С в после нагревания до повышенной температуры.
Данное изобретение относится к выделенному синтетическому или рекомбинантному полипептиду по данному изобретению, где полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может представлять собой Ν-гликозилирование. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после того, как он экспрессируется в Р. ра81от18 или 8. рошЬе.
В одном аспекте полипептид по данному изобретению может сохранять ферментативную активность в условиях, включающих приблизительно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4, или в более кислых условиях. В другом аспекте полипептид по данному изобретению сохраняет активность в условиях, включающих приблизительно рН 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5 или 11, или в более щелочных условиях. В одном аспекте полипептид по данному изобретению сохраняет активность в условиях, включающих приблизительно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или рН 4, или в более кислых условиях. В другом аспекте полипептид по данному изобретению сохраняет активность в условиях, включающих приблизительно рН 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5 или 11, или в более щелочных условиях.
Данное изобретение относится к белковым препаратам, содержащим полипептид по данному изобретению, где белковый препарат включает жидкость, твердое вещество или гель.
Данное изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по данному изобретению, и второй белок или домен. В одном аспекте второй член гетеродимера не является полипептидом по данному изобретению, но предпочтительно является отличным от него ферментом или другим белком. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или таг. В одном аспекте данное изобретение относится к гомодимерам, содержащим полипептид по данному изобретению.
Данное изобретение относится к иммобилизованным полипептидам по данному изобретению, полипептиду, кодируемому нуклеиновой кислотой по данному изобретению, или полипептиду, содержащему полипептид по данному изобретению и второй домен. В одном аспекте полипептид может быть иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, частицах графита, бусах, геле, планшете, матрице или капиллярной трубке.
Данное изобретение относится к матрицам, содержащим иммобилизованную нуклеиновую кислоту по данному изобретению. Данное изобретение относится к матрицам, содержащим антитела по данному изобретению.
Данное изобретение относится к выделенным синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфически связываются с полипептидом по данному изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по данному изобретению. Антитела могут представлять собой моноклональные или поликлональные антитела. Данное изобретение относится к гибридомам, содержащим антитела по данному изобретению, например антитела, которые специфично связываются с полипептидом по данному изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по данному изобретению.
Данное изобретение относится к способу выделения или идентификации полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), включающий стадии (а) получения антител по данному изобретению; (Ь) получения образца, содержащего
- 9 013993 полипептиды; и (с) осуществления взаимодействия образца стадии (Ь) с антителами стадии (а) в условиях, при которых антитела могут специфически связываться с полипептидом, выделяя таким образом или идентифицируя полипептид.
Данное изобретение относится к способам получения антител, которые специфично связываются с полипептидом по данному изобретению (например, ферментом или другим антителом по данному изобретению), включающим введение животному, не относящемуся к человеку, нуклеиновой кислоты по данному изобретению или полипептида по данному изобретению, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для развития гуморального иммунного ответа, таким образом развивая антительный ответ. Данное изобретение относится к способам получения гуморального или клеточного иммунного ответа, включающим введение животному, не относящемуся к человеку, нуклеиновой кислоты по данному изобретению, или полипептида по данному изобретению, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для развития иммунного ответа.
Данное изобретение относится к способам получения рекомбинантного полипептида, включающим стадии (а) получения нуклеиновой кислоты по данному изобретению, функционально связанной с промотором; и (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) в условиях, которые делают возможной экспрессию полипептида, получая, таким образом, рекомбинантный полипептид. В одном аспекте способ может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), получая таким образом рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке.
Данное изобретение относится к способам идентификации полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), включающим следующие стадии: (а) получение полипептида по данному изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению; (Ь) получение соответствующего субстрата (например, субстрата полипептида); и (с) осуществление взаимодействия полипептида или его фрагмента, или варианта стадии (а) с субстратом стадии (Ь) и определение уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции дает возможность выявить полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы).
Данное изобретение относится к способам идентификации субстрата полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), где способ включает следующие стадии: (а) получение полипептида по данному изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению; (Ь) получение анализируемого субстрата и (с) осуществление взаимодействия полипептида стадии (а) с анализируемым субстратом стадии (Ь) и определение уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции дает возможность идентифицировать анализируемый субстрат, как субстрат полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы).
Данное изобретение относится к способам определения того, происходит ли специфическое связывание анализируемого соединения с полипептидом, включающим следующие стадии: (а) экспрессию нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, делающих возможной трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту по данному изобретению, или получение полипептида по данному изобретению; (Ь) получение анализируемого соединения; (с) осуществление взаимодействия полипептида с анализируемым соединением и (б) определение того, происходит ли специфическое связывание анализируемого соединения стадии (Ь) с полипептидом.
Данное изобретение относится к способам идентификации модулятора полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), включающим следующие стадии: (а) получение полипептида по данному изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению; (Ь) получение анализируемого соединения; (с) осуществление взаимодействия полипептида стадии (а) с анализируемым соединением стадии (Ь) и измерение активности полипептида, где изменение активности, измеренной в присутствии анализируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствии анализируемого соединения, дает возможность установить, что анализируемое соединение модулирует активность полипептида. В одном аспекте активность полипептида может быть измерена посредством получения соответствующего субстрата (например, субстрата полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы)) и определения уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, или увеличения количества субстрата или снижения количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии анализируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без анализируемого соединения дает возможность идентифицировать анализируемое соединение как активатор активности. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии анализируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без анали
- 10 013993 зируемого соединения дает возможность идентифицировать анализируемое соединение как ингибитор активности.
Данное изобретение относится к компьютерным системам, включающим процессор и устройство для хранения данных, где на указанном устройстве для хранения данных хранится последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению (например, полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению). В одном аспекте компьютерная система может дополнительно включать алгоритм для сравнения последовательностей и устройство для хранения данных по меньшей мере с одной хранящейся на нем контрольной последовательностью. В другом аспекте алгоритм сравнения последовательностей включает компьютерную программу, которая выявляет полиморфизмы. В одном аспекте компьютерная система может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует один или несколько элементов в указанной последовательности. Данное изобретение относится к компьютерным считываемым носителям информации, на которых хранится последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Данное изобретение относится к способам идентификации элементов последовательности, включающим стадии (а) считывания последовательности с использованием компьютерной программы, которая дает возможность установить один или несколько элементов последовательности, где последовательность включает последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению; и (Ь) идентификации одного или нескольких элементов в последовательности с помощью компьютерной программы. Данное изобретение относится к способам сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающим стадии (а) считывания первой последовательности и второй последовательности с использованием компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность содержит последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению; и (Ь) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать стадию идентификации полиморфизмов. В одном аспекте способ может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует один или несколько элементов в последовательности. В другом аспекте способ может включать считывание первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или нескольких элементов в последовательности.
Данное изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы) из образца из окружающей среды, включающим стадии (а) получения последовательностей пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту по данному изобретению; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца из окружающей среды или обработку образца из окружающей среды, так чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с парой праймеров для амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты стадии (Ь) с парой праймеров для амплификации стадии (а) и амплификацию нуклеиновой кислоты из образца из окружающей среды, выделяя таким образом или извлекая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), из образца из окружающей среды. В одном аспекте один или каждый член пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности по данному изобретению. В одном аспекте пара праймеров для амплификации представляет собой пару для амплификации по данному изобретению.
Данное изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), из образца из окружающей среды, включающим стадии (а) получения полинуклеотидного зонда, включающего нуклеиновую кислоту по данному изобретению или ее подпоследовательность; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца из окружающей среды или обработку образца из окружающей среды, так чтобы нуклеиновая кислота была доступной для гибридизации с полинуклеотидным зондом стадии (а); (с) объединения выделенной синтетической нуклеиновой кислоты или обработанного образца из окружающей среды стадии (Ь) с образцом полинуклеотида стадии (а) и (б) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с образцом полинуклеотида стадии (а), выделяя таким образом или извлекая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), из образца из окружающей среды. Природный образец может включать образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В одном аспекте биологический образец может быть получен из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомых, клетки дрожжей, клетки растений, клетки грибов или клетки млекопитающих.
- 11 013993
Данное изобретение относится к способам получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), включающим стадии (а) получения матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по данному изобретению; и (Ь) модификации, делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинацию с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты. В одном аспекте способ может дополнительно включать экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для получения варианта полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы). Модификации, вставки и делеции могут быть внесены способом, включающим ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющую ПЦР, мутагенез с помощью половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторную сборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (С88М), синтетическую повторную сборку лигированием (8ЬЯ) или их комбинацию. В другом аспекте модификации, вставки или делеции вносятся способом, включающим рекомбинацию, рекомбинацию возвратной последовательности, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек несоответствия, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, мутагенез с делецией, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их комбинацию.
В одном аспекте способ может быть многократно повторен до тех пор, пока не будет получен полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), с измененной или отличающейся активностью или с измененной или отличающейся стабильностью относительно активности и стабильности полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. В одном аспекте измененный полипептид является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия повышенной температуры. В другом аспекте измененный полипептид подвергается повышенному гликозилированию по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой. Альтернативно, измененный полипептид обладает активностью при высокой (или повышенной) температуре, где фермент, кодируемый матричной нуклеиновой кислотой, не является активным при высокой температуре. В одном аспекте способ может быть многократно повторен до тех пор, пока не будет получена кодирующая фермент последовательность, в которой используются кодоны, измененные по сравнению с кодонами матричной нуклеиновой кислоты. В другом аспекте способ может быть многократно повторен до тех пор, пока не будет получен ген, кодирующий фермент, с повышенным или пониженным уровнем экспрессии транскрипта или повышенной или пониженной стабильностью относительно уровня экспрессии или стабильности матричной нуклеиновой кислоты.
Данное изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, где способ включает следующие стадии: (а) получение нуклеиновой кислоты по данному изобретению, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы); и (Ь) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замену его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, модифицируя таким образом нуклеиновую кислоту для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине.
Данное изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы); где способ включает следующие стадии: (а) получение нуклеиновой кислоты по данному изобретению и (Ь) идентификацию кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замену его отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, модифицируя таким образом кодоны в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид.
Данное изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, где способ включает следующие стадии: (а) получение нуклеиновой кислоты по данному изобретению, кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы); и (Ь) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замену его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встре
- 12 013993 чающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительной кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, модифицируя таким образом нуклеиновую кислоту для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине.
Данное изобретение относится к способам модификации кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы) для снижения экспрессии в клеткехозяине, где способ включает следующие стадии: (а) получение нуклеиновой кислоты по данному изобретению и (Ь) идентификацию по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замену его непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, модифицируя таким образом нуклеиновую кислоту для снижения ее экспрессии в клетке-хозяине. В одном аспекте клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, клетку грибов, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений или клетку млекопитающих.
Данное изобретение относится к способам получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров полипептидов (каталитических доменов (СЭ)) или участков связывания субстрата полипептидов, обладающих ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), где модифицированные активные центры или участки связывания субстрата получают из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный центр или первый участок связывания субстрата, где способ включает следующие стадии: (а) получение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный центр или первый участок связывания субстрата, где последовательность первой нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой по данному изобретению, и нуклеиновая кислота кодирует активный центр или участок связывания субстрата; (Ь) получение набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют варианты природных аминокислот во множестве кодонов-мишеней первичной нуклеиновой кислоты; и (с) использование набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора вариантов, кодирующих активный центр или кодирующих участок связывания субстрата нуклеиновых кислот, кодирующих ряд вариантов аминокислот в каждом кодоне аминокислоты, который был подвергнут мутагенезу, получая таким образом библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров или участков связывания субстрата полипептидов, обладающих ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы). В одном аспекте способ включает внесение мутаций в первую нуклеиновую кислоту стадии (а) способом, включающим оптимизированную систему направленных изменений, мутагенез с насыщением сайтов гена (С88М). синтетическую повторную сборку лигированием (8Ш), ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющую ПЦР, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторную сборку гена, синтетическую повторную сборку лигированием (8Ш) и их комбинацию. В другом аспекте способ включает внесение мутаций в первую нуклеиновую кислоту стадии (а) или ее варианты способом, включающим рекомбинацию, рекомбинацию возвратной последовательности, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек несоответствия, мутагенез с дефектом репарации штаммахозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, мутагенез с делецией, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их комбинации.
Данное изобретение относится к способам получения малой молекулы, включающим следующие стадии: (а) получение множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать малую молекулу, где один из ферментов содержит полипептид по данному изобретению или кодируется нуклеиновой кислотой по данному изобретению; (Ь) получение субстрата по меньшей мере для одного из ферментов стадии (а) и (с) осуществление взаимодействия субстрата стадии (Ь) с ферментами в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций с получением малой молекулы посредством серии биокаталитических реакций. Данное изобретение относится к способам модификации малой молекулы, включающим следующие стадии: (а) получение фермента, где фермент содержит полипептид по данному изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению, или его подпоследовательности; (Ь) получение малой молекулы и (с) осуществление взаимодействия фермента стадии (а) с малой молекулой стадии (Ь) в условиях, которые облегчают ферментативную реакцию, катализируемую полипептидом по данному изобретению, или полипептидом,
- 13 013993 кодируемым нуклеиновой кислотой по данному изобретению, модифицируя таким образом малую молекулу. В одном аспекте способ может включать множество субстратов для получения малых молекул ферментом стадии (а), таким образом формируя библиотеку модифицированных малых молекул, получаемых по меньшей мере одной ферментативной реакцией, катализируемой ферментом по данному изобретению. В одном аспекте способ может включать множество дополнительных ферментов в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций с участием ферментов для формирования библиотеки модифицированных малых молекул, получаемых множеством ферментативных реакций. В другом аспекте способ может дополнительно включать стадию исследования библиотеки для того, чтобы определить, существуют ли в библиотеке конкретные модифицированные малые молекулы, которые проявляют желаемую активность. Стадия исследования библиотеки может дополнительно включать стадии систематического удаления всех биокаталитических реакций кроме одной, используемых для получения части из множества модифицированных малых молекул из библиотеки, с исследованием части модифицированных малых молекул на наличие или отсутствие конкретной модифицированной малой молекулы с желаемой активностью, и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, в результате которой образуется модифицированная малая молекула с желаемой активностью.
Данное изобретение относится к способам определения функционального фрагмента полипептида по данному изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению, включающим стадии: (а) получения полипептида по данному изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению, или его подпоследовательности и (Ь) удаления множества аминокислотных остатков из последовательности стадии (а) и исследование оставшейся подпоследовательности на наличие ферментативной или связывающей активности, определяя таким образом функциональный фрагмент фермента. В одном аспекте активность измеряют получением субстрата и определением уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции.
Данное изобретение относится к способам инженерии всех цельных клеток с новыми или модифицированными фенотипами с использованием анализа метаболических изменений в режиме реального времени, где способ включает следующие стадии: (а) получение модифицированной клетки посредством модификации генетического набора клетки, где генетический набор модифицирован добавлением в клетку нуклеиновой кислоты по данному изобретению; (Ь) культивирование модифицированной клетки с получением множества модифицированных клеток; (с) измерение по меньшей мере одного параметра метаболизма клетки посредством контроля клеточной культуры стадии (Ь) в режиме реального времени и (к) анализ данных стадии (с) для определения наличия отличий измеренного параметра от сравнительного измерения в немодифицированной клетке в аналогичных условиях, идентифицируя таким образом полученный с помощью способов инженерии фенотип клетки с использованием анализа метаболических изменений в режиме реального времени. В одном аспекте генетический набор клетки может быть модифицирован способом, включающим удаление последовательности или модификацию последовательности в клетке, или нокаут экспрессии гена. В одном аспекте способ может дополнительно включать селекцию клетки, имеющий новый полученный способами инженерии фенотип. В другом аспекте может включать культивирование отобранной клетки, получая таким образом новый клеточный штамм, имеющий новый полученный способами генной инженерии фенотип.
Данное изобретение относится к способам повышения термоустойчивости или термостабильности полипептида по данному изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по данному изобретению, где способ включает гликозилирование полипептида, содержащего по меньшей мере треть смежных аминокислот полипептида по данному изобретению, или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению, повышая таким образом термоустойчивость или термостабильность полипептида. В одном аспекте специфичная активность может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне от более чем приблизительно 37 до приблизительно 95°С.
Данное изобретение относится к способам сверхэкспрессии рекомбинантного полипептида в клетке, включающим экспрессию вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, включая нуклеиновую кислоту по данному изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению, где идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием, где сверхэкспрессия осуществлена с использованием промотора с высокой активностью, бицистронного вектора или амплификации генов вектора.
Данное изобретение относится к способам получения трансгенного растения, включающим следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению, получая таким образом трансформированную клетку растений; и (Ь) получение трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты электропорацией или микроинъекцией в протопласты клеток растений. В другом аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты непосредствен
- 14 013993 но в ткань растений бомбардировкой частицами с ДНК. Альтернативно, стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК клетки растений с использованием хозяина АдгоЬае1спит 1игпеГас1епз. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя.
Данное изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке растений, включающим следующие стадии: (а) трансформацию в клетку растений гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту по данному изобретению; (Ь) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетке растений. Данное изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке растений, включающим следующие стадии: (а) трансформацию в клетку растений гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность по данному изобретению; (Ь) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетке растений. В другом аспекте фермент по данному изобретению может быть получен экспрессией полинуклеотида по данному изобретению в организме, таком как бактерия, дрожжевой организм, растение, насекомое, гриб или животное. Иллюстративными организмами для экспрессии полипептидов по данному изобретению могут быть З. ротЬе, З. сегеу1з1ае, Р1сЫа зр., например, Ρ. разЮпз, Е. со11, З1герЮтусез §р., ВасШиз ер. и Ьас1оЬасШиз ер.
Другим аспектом данного изобретения является способ получения полипептида по данному изобретению. Способ включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в клетку-хозяина, где нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, и культивирование клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию нуклеиновой кислоты. Другим аспектом данного изобретения является способ получения полипептида или пептида по данному изобретению. Способ включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в клетку-хозяина, где нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, и культивирование клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом полипептид.
Другим аспектом данного изобретения является способ получения варианта, включая получение нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность по данному изобретению, последовательностей, по существу, ей идентичных, последовательностей, комплементарных последовательности по данному изобретению, и их фрагментов и замену одного или нескольких нуклеотидов в последовательности на другие нуклеотиды, удаление одного или нескольких нуклеотидов из последовательности или вставку одного или нескольких нуклеотидов в последовательность.
Данное изобретение относится к биосинтетическим системам для катаболизма хлорофилла, включающим по меньшей мере один фермент по данному изобретению. Данное изобретение относится к биосинтетическим системам для катаболизма хлорофилла, включающим по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, вовлеченный в катаболизм хлорофилла, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по данному изобретению. В одном аспекте система включает множество кодирующих ферменты нуклеиновых кислот, где ферменты вовлечены в катаболизм хлорофилла. В одном аспекте множество кодирующих ферменты нуклеиновых кислот включает все ферменты в пути катаболизма хлорофилла. В одном аспекте множество кодирующих ферменты нуклеиновых кислот включает по меньшей мере одну плазмиду, экспрессирующую кассету или экспрессирующий вектор.
В одном аспекте биосинтетическая система по данному изобретению находится (содержится) в клетке. Клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающих, клетку грибов, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку растений. Клетка дрожжей может представлять собой Ρχΐιίη зр. или Зассйатотусез зр., такие как Ρχΐιίη разЮпз, Зассйатотусез сегеу131ае или ЗсЫхозассйаготусез ротЬе.
Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления данного изобретения представлено далее на прилагаемых ниже чертежах и описании. Другие свойства, цели и преимущества данного изобретения будут очевидны из описания и чертежей, и из формулы изобретения.
Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из ОеиВаик и материалы АТСС, цитированные в данном описании для любых целей, включая приложение А, таким образом, полностью включены в данное описание посредством ссылок.
Описание чертежей
На фиг. 1 представлено схематическое изображение хлорофилла (фиг. 1А), фитола (фиг. 1В) и хлорофиллида (фиг. 1С).
На фиг. 2 и 3 представлены данные, демонстрирующие результаты анализа активности эстеразы (активности хлорофиллазы) с использованием иллюстративных ферментов по данному изобретению, как подробно описано ниже в примере 1.
На фиг. 4 представлена принципиальная схема иллюстративной компьютерной системы по данному изобретению, как подробно описано ниже.
- 15 013993
На фиг. 5 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект способа по данному изобретению, для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с базой данных последовательностей в целях определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных, как подробно описано ниже.
На фиг. 6 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса в компьютере, для определения того, являются ли две последовательности гомологичными, как подробно описано ниже.
На фиг. 7 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса идентификации 300, для определения наличия элемента в последовательности, как подробно описано ниже.
На фиг. 8 представлена реакция деградации хлорофилла с иллюстративной эстеразой по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 9 представлены и сравниваются традиционные способы и иллюстративная реакция ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 10 представлена иллюстративная реакция ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 11 представлен иллюстративный способ ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, который сочетает в себе стадии рафинирования, ферментативного осветления (обесцвечивания) и нейтрализации щелочью, как подробно описано ниже.
На фиг. 12 представлен иллюстративный способ ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 13 представлена иллюстративная схема очистки семян масличного растения, включающая экстракцию, очистку и модификацию семян масличного растения с использованием эстеразы по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 14 представлен иллюстративный промышленный способ по данному изобретению - процесс биологического рафинирования, включающий использование по меньшей мере одного полипептида по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 15 представлен еще один иллюстративный промышленный способ по данному изобретению, включающий использование по меньшей мере одного полипептида по данному изобретению, как подробно описано ниже.
На фиг. 16 представлен другой иллюстративный промышленный способ по данному изобретению, включающий использование по меньшей мере одного полипептида по данному изобретению с ферментативной активностью хлорофиллазы.
Одинаковые указательные символы в различных рисунках показывают одинаковые элементы.
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к новым композициям и способам ферментативной обработки (осветлению или обесцвечиванию) композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, например, препаратов из растений, животных или водорослей, пищевых продуктов, кормов или масел. В одном аспекте обработка (или ферментативное осветление, или обесцвечивание) хлорофилла используется в композициях и способах по данному изобретению, включающих использование фермента хлорофиллазы или другого фермента, вовлеченного в катаболизм хлорофилла, для модификации хлорофилла, например, для облегчения удаления придающего окраску порфиринового кольца, например, водной экстракцией. Хлорофиллаза катализирует гидролиз хлорофилла с образованием хлорофиллида, который может быть экстрагирован в водный экстракт, и фитола, который остается в масляной фазе.
Например, в одном аспекте данное изобретение относится к композициям и способам ферментативной обработки (например, гидролизу) хлорофилла в корме, пищевом продукте или масле, например в растительных маслах, включая масла, получаемые из семян масличных растений, такие как масло канолы (рапса) или соевое масло, или масло из плодов масличных растений, такое как пальмовое масло. В одном аспекте данное изобретение относится к способам ферментативного осветления с использованием фермента хлорофиллазы для ферментативного гидролиза хлорофилла или любого придающего цвет порфиринового кольца в масле животного или растительного происхождения, например в растительных маслах.
Данное изобретение включает способы ферментативной обработки (например, осветления) содержащих хлорофилл пищевых продуктов или масел с помощью технологий ίη νίΐτο или ίη νίνο, например протоколов для цельных клеток, таких как ферментация или другие биокаталитические процессы.
Получение и обработка нуклеиновых кислот
Данное изобретение относится к выделенным рекомбинантным и синтетическим нуклеиновым кислотам (например, к иллюстративной нуклеиновой кислоте по данному изобретению, включая 8ЕО ΙΌ N0: 1, 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ΙΌ N0: 5, 8ЕО ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ΙΌ N0: 13, 8Е0 ΙΌ N0: 15, 8Е0 ΙΌ N0: 17 или 8Е0 ΙΌ N0: 19), последовательностям, обладающим идентичностью последовательностей с иллюстративной нуклеиновой кислотой; нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды по данному изобретению (например, иллюстративные аминокислотные последова
- 16 013993 тельности, как указано в 8Ер ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 4, 81Т) ГО N0: 6, 81V) ГО N0: 8, 81V) ГО N0: 10, 81V) ГО N0: 12, 8 ЕС) ГО N0: 14, 8ЕС) ГО N0: 16, 8ЕС) ΌΌ N0: 18 или 8ЕС) ГО N0: 20). Данное изобретение также относится к экспрессирующим кассетам, таким как экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты по данному изобретению, которые включают полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды по данному изобретению. Данное изобретение также относится к способам разработки новых полипептидных последовательностей с использованием нуклеиновых кислот по данному изобретению. Данное изобретение также относится к способам ингибирования экспрессии генов, транскриптов и полипептидов с использованием нуклеиновых кислот по данному изобретению. Также предполагаются способы модификации нуклеиновых кислот по данному изобретению, например, посредством синтетической повторной сборки лигированием, оптимизированной системы направленных изменений и/или мутагенеза с насыщением.
Нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть получены, выделены и/или обработаны, например, посредством клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и т. п.
Для применения на практике способов по данному изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы воздействием на матричную нуклеиновую кислоту, как описано в данном описании. Данное изобретение может применяться на практике совместно с любым способом или протоколом, или устройством, известными в данной области, которые полностью описаны в научной и патентной литературе.
Один аспект данного изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей одну из последовательностей по данному изобретению или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Выделенные нуклеиновые кислоты могут включать ДНК, включая кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в случае одной цепи она может представлять собой кодирующую или некодирующую (антисмысловую) цепь. Альтернативно, выделенные нуклеиновые кислоты могут включать РНК.
Выделенные нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть использованы для получения одного из полипептидов по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 последовательно расположенных аминокислот одного из полипептидов по данному изобретению.
Таким образом, другой аспект данного изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует один из полипептидов по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 последовательно расположенных аминокислот одного из полипептидов по данному изобретению. Кодирующие последовательности этих нуклеиновых кислот могут быть идентичными одной из кодирующих последовательностей одной из нуклеиновых кислот по данному изобретению или могут представлять собой отличающиеся кодирующие последовательности, которые кодируют один из полипептидов по данному изобретению, имеющих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 последовательно расположенных аминокислот одного из полипептидов по данному изобретению, как результат избыточности или вырожденности генетического кода. Генетический код хорошо известен специалистам в данной области и может быть найден, например, на с. 214 в В. ЬеЮп, Сепек VI 0хГогб ИшуегзИу Ргезз, 1997.
Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует один из полипептидов по данному изобретению, включает, но не ограничивается ими: только кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению и дополнительные кодирующие последовательности, такие как лидерные последовательности или последовательности пробелков, и некодирующие последовательности, такие как интроны или 5'-и/или 3'-некодирующие последовательности кодирующей последовательности. Таким образом, как используется в данном описании, термин полинуклеотид, кодирующий полипептид включает полинуклеотид, который включает только кодирующую полипептид последовательность, а также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательности.
Альтернативно, в последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению могут быть внесены мутации с использованием общепринятых технологий, таких как сайт-направленный мутагенез, или других технологий, известных специалистам в данной области, для введения молчащих изменений в полинуклеотиды по данному изобретению. Как используется в данном описании, молчащие изменения включают, например, изменения, которые не изменяют аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом. Такие изменения могут быть необходимы для повышения уровня полипептида, продуцируемого клетками-хозяевами, содержащими кодирующий полипептид вектор, посредством введения кодонов или кодоновых пар, которые часто встречаются в организме хозяина.
Данное изобретение также относится к полинуклеотидам, которые имеют нуклеотидные замены, которые приводят к аминокислотным заменам, вставкам, делециям, слияниям и укорочениям в полипептидах по данному изобретению. Такие нуклеотидные замены могут быть введены с использованием технологий, таких как сайт-направленный мутагенез, случайный химический мутагенез, делеция экзонук
- 17 013993 леазой III и других технологий рекомбинантных ДНК. Альтернативно, такие нуклеотидные замены могут представлять собой природные аллельные варианты, которые выделяют посредством идентификации нуклеиновых кислот, которые специфично гибридизуются с образцами, содержащими по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований одной из последовательностей по данному изобретению (или комплементарной ей последовательности) в условиях высокой, умеренной и низкой жесткости, как представлено в данном описании.
Как используется в данном описании, термин выделенный означает, что материал удаляется из его естественного окружения (например, из природного окружения, если он природного происхождения). Например, природный полинуклеотид или полипептид, находящийся в живом животном не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих веществ в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут являться частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут являться частью композиции и всетаки быть выделенными, поскольку такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. Как используется в данном описании, термин очищенный не подразумевает абсолютной чистоты; скорее, он подразумевается как относительное определение. Отдельные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, традиционно очищают до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из таких клонов, не могут быть получены непосредственно либо из библиотеки, либо из всей человеческой ДНК. Очищенные нуклеиновые кислоты по данному изобретению очищены от остальной геномной ДНК в организме по меньшей мере до 104-106-кратности. Однако термин очищенный также включает нуклеиновые кислоты, которые очищены от остальной геномной ДНК или от других последовательностей в библиотеке или других окружающих веществ по меньшей мере на один порядок величины, как правило, на два или более порядков и более, как правило, на четыре или пять порядков величины.
Как используется в данном описании, термин рекомбинантный означает, что нуклеиновая кислота является смежной с остовом нуклеиновой кислоты, с которой она не является смежной в природном окружении. Кроме того, для того чтобы являться обогащенными, нуклеиновые кислоты должны быть представлены на 5% или более числом вставок нуклеиновых кислот в совокупности молекул остова нуклеиновых кислот. Молекулы остова в соответствии с данным изобретением включают нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие векторы, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, встраивающиеся нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для хранения или манипуляции с представляющей интерес вставкой нуклеиновой кислоты. Как правило, обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 15% или более числом вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остова. Более конкретно, обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 50% или более числом вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остова. В одном аспекте обогащенные нуклеиновые кислоты представлены на 90% или числом вставок нуклеиновых кислот в совокупности рекомбинантных молекул остовов.
Рекомбинантные полипептиды или белки относятся к полипептидам или белкам, получаемым с помощью технологий рекомбинантных ДНК; т.е. получаемым из клеток, трансформированных конструкцией с экзогенной ДНК, кодирующей желаемый полипептид или белок. Синтетические полипептиды или белок представляет собой полипептиды и белок, полученные химическим синтезом. Твердофазные способы химического синтеза также могут быть использованы для синтеза полипептида или фрагментов по данному изобретению. Такой способ известен в данной области с начала 1960-х годов (Метйе1б Й.В., 1. Ат. СБет. 8ос., 85:2149-2154, 1963) (см. также 81е\\'ай 1.М. апб Уоипд Ι.Ό., 8о11б Рйаке Рерббе 8уп111е515. 2пб Еб., Р1егсе С.’11етка1 Со., йоскГогб. 111, р. 11-12) и ранее использовался в коммерчески доступных лабораторных наборах для разработки и синтеза пептидов (СатЬпбде йекеагсй Вюсйеткай). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, использовались идеи Н.М. Сеукеи е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8е1., И8А, 81:3998 (1984), и они обеспечивали синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых соединены в одном планшете. При использовании такой системы планшет со стержнями или булавками переворачивали и вставляли во второй планшет с соответствующими лунками или резервуарами, которые содержали растворы для присоединения или заякоривания соответствующей аминокислоты на концах стержней или шпилек. При повторении указанной стадии процесса, т.е. переворачивания и помещения концов стержней и булавок в соответствующие растворы, из аминокислот выстраивались желаемые пептиды. Кроме того, является доступным ряд доступных систем для синтеза пептидов РМОС. Например, сборку полипептида или фрагмента можно осуществлять на твердой подложке с использованием устройства для автоматического синтеза пептидов Аррйеб Вюкуйетк., 1ис. Мобе1 431 А. Такое оборудование обеспечивает легкую доступность пептидов по данному изобретению либо непосредственным синтезом, либо синтезом ряда фрагментов, которые соединяют с использованием других известных способов.
Последовательность промотора является функционально связанной с кодирующей последовательностью, если РНК-полимераза, которая инициирует транскрипцию в промоторе, транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК.
Плазмиды обозначают строчной буквой р перед заглавными буквами и/или цифрами и/или по
- 18 013993 сле них. Исходные плазмиды в данном случае являются либо коммерчески доступными, общедоступными без ограничений, либо они могут быть сконструированы из доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Кроме того, плазмиды, эквивалентные плазмидам, описанным в данном описании, известны в данной области и будут понятны среднему специалисту в данной области.
Расщепление ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции, который действует только в определенных последовательностях в ДНК. Различные ферменты рестрикции, используемые в данном описании, являются коммерчески доступными, и условия реакции для них, кофакторы и другие требования, используемые в данном описании, известны среднему специалисту в данной области. Для аналитических целей, как правило, 1 мкг плазмиды или фрагмента ДНК используется с приблизительно 2 ед. фермента в приблизительно 20 мкл буферного раствора. В целях выделения фрагментов ДНК для конструирования плазмиды, как правило, от 5 до 50 мкг ДНК расщепляются ферментом в количестве от 20 до 250 ед. в большем объеме. Соответствующие буферы и количества субстратов для конкретных ферментов рестрикции описаны производителем. Обычно используется время инкубации приблизительно 1 ч при 37°С, но оно может варьировать в соответствии с инструкциями поставщика. После расщепления для выделения желаемого фрагмента может быть проведан гель-электрофорез.
Гибридизация относится к процессу, при котором цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью посредством спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными, так что конкретная представляющая интерес последовательность может быть определена даже в образцах, в которых она представлена в низких концентрациях. Подходящие жесткие условия могут быть определены, например, концентрациями соли или формамида в растворах для прегибридизации и гибридизации, или температурой гибридизации, и хорошо известны в данной области. В частности, жесткость можно увеличивать снижением концентрации соли, повышением концентрации формамида или повышением температуры гибридизации. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты по данному изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях различной жесткости (например, высокой, умеренной и низкой), как указано в данном описании.
Например, гибридизация в условиях высокой жесткости может происходить приблизительно в 50% формамиде при приблизительно от 37 до 42°С. Гибридизация может происходить в условиях сниженной жесткости приблизительно в 35-25% формамиде при приблизительно от 30 до 35°С. В частности, гибридизация может происходить в условиях высокой жесткости при 42°С в 50% формамиде, 5Х 88ΡΕ, 0,3% 8Ό8 и 200 нг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация может происходить в условиях сниженной жесткости, как описано выше, но в 35% формамиде при пониженной температуре до 35°С. Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню жесткости, может быть дополнительно сужен посредством вычисления соотношения пуринов и пиримидинов представляющей интерес нуклеиновой кислоты и соответствующего подбора температуры. Варианты указанных выше диапазонов хорошо известны в данной области.
Термин вариант относится к полинуклеотидам или полипептидам по данному изобретению, модифицированным по одной или нескольким парам оснований, кодонам, интронам, экзонам или аминокислотным остаткам (соответственно), которые все еще сохраняют биологическую активность фермента по данному изобретению. Варианты могут быть получены любым количеством способов, включающих способы, такие как, например, ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющая ПЦР, мутагенез с помощью половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторная сборка гена, О88М и любая их комбинация. Термин мутагенез с насыщением или мутагенез с насыщением сайта гена, или О88М включает способ, в котором используются вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точковых мутаций в полинуклеотид, как подробно описано ниже.
Термин оптимизированная система направленных изменений или оптимизированные направленные изменения включает способ повторной сборки фрагментов сходных последовательностей нуклеиновых кислот, например сходных генов, и подробно пояснен ниже.
Термин синтетическая повторная сборка лигированием или 8Ш включает способ лигирования фрагментов олигонуклеотидов нестохастическим образом и подробно объяснен ниже.
Как используется в данном описании, термины нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из них, к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может быть представлена смысловой или антисмысловой (комплементарной) цепью, к пептидно-нуклеиновой кислоте (ΡΝΑ) или любому ДНК-подобному или РНК-подобному веществу природного или синтетического происхождения. Термины нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты включают олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид, или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, 1РНК) геномного или синтетического происхождения, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может быть представлена смысловой или антисмысловой цепью, пептидно-нуклеиновую кислоту (ΡΝΑ) или любое ДНК-подобное или РНК-подбное вещество природного или синтетического происхождения,
- 19 013993 включая, например, 1РНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные 1РНК, например ЖНР). Термин включает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также включает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими остовами, см., например, МаДа (1997) ТохДсоД. Арр1. РйагтасоД., 144:18 9-197; 8Дгаизз-8оикир (1997) ВДосйетДзДгу, 36:8692-8698; 8атзДад (1996) АиДДзеизе №с1еДс АсДб. Эгид. Эеу., 6:153-156. Термин олигонуклеотид включает либо одноцепочечный полидезоксинуклеотид, либо две комплементарные полидозоксинуклеотидные цепи, которые могут быть химически синтезированными. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5'-фосфата и, таким образом, не лигируются с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата в виде АТР в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид может лигироваться с фрагментом, который не является дефосфорилированным.
Кодирующая последовательность или нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, при нахождении под контролем соответствующих регуляторных последовательностей.
Термин ген означает сегмент ДНК, вовлеченный в продукцию полипептидной цепи; он включает участки, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидер и конец), а также, где существуют, встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). Как используется в данном описании, термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновых кислот (например, ДНК). В одном аспекте он относится к функциональной взаимосвязи регулирующей транскрипцию последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота по данному изобретению, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой экспрессирующей системе. В одном аспекте регулирующие транскрипцию последовательности промотора, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются цис-регуляторными. Однако некоторые регулирующие транскрипцию последовательности, такие как энхансеры, не требуют физического присоединения или локализации, близкой к кодирующим последовательностям, транскрипцию которых они усиливают.
Как используется в данном описании, термин экспрессирующая кассета относится к нуклеотидной последовательности, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т. е. последовательности, кодирующей белок, такой как фермент по данному изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью; и, необязательно, с другими последовательностями, например, с сигналами терминации транскрипции. Также могут быть использованы дополнительные факторы, например энхансеры, необходимые или целесообразные для осуществления экспрессии. Таким образом, экспрессирующие кассеты также включают плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любые формы вектора с рекомбинантной депротеинизированной ДНК и т. п. Вектор содержит нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфецировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Следует учитывать, что вектор может представлять собой депротеинизированную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются ими, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), с которыми фрагменты ДНК могут быть соединены и могут становиться реплицирующимися. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см., например, патент США № 5217879), и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. Если рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описаны как содержащие экспрессирующий вектор, то в этом случае включают как экстрахромосомную кольцевую, так и линейную ДНК, и ДНК, которая встраивается в хромосому(ы) хозяина. В случае если вектор поддерживается в клетке-хозяине, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза в качестве автономной структуры, либо он является встроенным в геном хозяина.
Как используется в данном описании, термин промотор включает все последовательности, способные запускать транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, например в клетке растения. Таким образом, промоторы, используемые в конструкциях по данному изобретению, включают цисрегуляторные элементы контроля транскрипции и регулирующие последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модуляцию времени запуска и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-регуляторный элемент контроля транскрипции, включающий промотор, терминатор транскрипции, ориджин репликации, встроенные в хромосому последовательности, 5'- и 3'-нетранслируемые области или последовательность интрона, который вовлечен в регуляцию транскрипции. Эти цис-регуляторные последовательности, как правило, взаимодействуют с белками или дру
- 20 013993 гими биологическими молекулами для осуществления (запуск/завершение, регуляция, модулирование и т.д.) транскрипции. Конститутивные промоторы представляет собой промоторы, которые осуществляют постоянную экспрессию в большинстве условий окружающей среды и стадий развития или дифференцировки клеток. Индуцибельные или регулируемые промоторы направляют экспрессию нуклеиновой кислоты по данному изобретению под влиянием условий окружающей среды или стадии развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию с индуцибельными промоторами, включают анаэробные условия, повышенную температуру, сухость воздуха или наличие света.
Тканеспецифичные промоторы представляет собой элементы контроля транскрипции, которые активны только в конкретных клетках, или тканях, или органах, например, в растениях или в животных. Тканеспецифичной регуляции можно достигать с помощью определенных внутренних факторов, которые обеспечивают экспрессию генов, кодирующих белки, специфичные для данной ткани. Известно, что такие факторы существуют у млекопитающих и растений, что дает возможность развиваться конкретным тканям.
Общие способы
Настоящее изобретение относится к новым композициям и способам ферментативной обработки (например, осветления), содержащих хлорофилл композиций, таких как композиции из растений, водорослей, пищевых продуктов или масел. Специалисту в данной области будет очевидно, что соединения, используемые в способах по данному изобретению (например, каталитические, исходные или промежуточные соединения) могут быть синтезированы с использованием различных методик и способов, которые полностью описаны в научной и патентной литературе. Например, 0тдашс 8уп(11екек СоПесйте Уо1итек, Сбтап е! а1. (Ебк.) 1о1т ХУбеу & 8опк, 1пс., ΚΥ; Уепиб (1989) РНагт. Кек., 6:867-873. Данное изобретение может быть применено на практике совместно с любым известным в данной области способом или методикой, которые полностью описаны в научной и патентной литературе.
Нуклеиновые кислоты, используемые для осуществления данного изобретения, любые из РНК, 1РНК, антисмысловой нуклеиновой кислоты, кДНК, геномной ДНК, векторов, вирусов или их гибридов, могут быть выделены из множества источников, могут быть получены способами генной инженерии, могут быть амплифицированы и/или экспрессированы/получены рекомбинантными способами. Рекомбинантные полипептиды (например, ферменты по данному изобретению), полученные из этих нуклеиновых кислот, могут быть индивидуально выделены или клонированы и могут быть исследованы на наличие желаемой активности. Могут быть использованы любые рекомбинантные экспрессирующие системы, включая экспрессирующие системы клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.
Альтернативно, такие нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы ш νίΐτο хорошо известными способами химического синтеза, как описано, например, в Абатк (1983) 1. Ат. СНет. 8ос., 105:661; Ве1οπκον (1997) МисЫс Ас1бк. Кек., 25:3440-3444; Ргепке1 (1995) Ргее Каб1с. Вю1. Меб., 19:373-380; В1оттегк (1994) В1осйет1к1гу, 33:7886-7896; №1гапд (1979) Ме(11. Еп7уто1., 68:90; Вготеп (1979) Ме(11. Епхуто1., 68:109; Веаисаде (1981) Тегга. Ьеб., 22:1859; в патенте США № 4458066.
Способы для манипуляции с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, введение зонда (например, мечение со случайными праймерами с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т. п. полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, 8атЬтоок, еб., М0ЬЕСиЬАК СЕ0МНС: А ЬАВ0КАТ0КУ МА№ ИАЬ (2ХО ЕВ.), ν. 1-3, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬотаЮту, (1989); СЫШЕХТ РК0Т0С0Б8 № М0ЬЕСиЬАК ВЮЬ06У, АикиЬе1, еб. .1о1т \\'11е\ & 8опк, 1пс., Хем Уотк (1997); БАВ0КАТ0КУ ТЕСНХЮЕ'Е8 Ш В10СНЕМ18ТКУ АХ^ М0ЬЕСиЬАК ВЮЬ06У: НΥВКI^IΖАТIΟN \\Т1Н NυС^ЕIС АСГО РК0ВЕ8, Рай I. ТНеогу апб N^^N1 ас1б Ртератабоп, Туккеп, еб. Е1ке\зег. КУ. (1993).
Другими подходящими способами получения и манипуляции с нуклеиновыми кислотами, используемыми для осуществления способов по данному изобретению, является клонирование из геномных образцов и, если желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных из, например, геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по данному изобретению, включают геномные библиотеки или библиотеки кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), см., например, патенты США № 5721118; 6025155; искусственных хромосомах человека, см., например, КокепГе1б (1997) N1. Сепе(. 15:333-335; искусственных хромосомах дрожжей (УАС); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р1, см., например, \Уооп (1998) Сепотюк, 50:306-316; векторах, полученных на основе Р1 (РАСк), см., например, Кет (1997) Вю1есйщдиек, 23:120-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах.
Настоящее изобретение относится к новым композициям и способам ферментативной обработки (например, осветления), содержащих хлорофилл композиций, таких как композиции из растений, водорослей, пищевых продуктов или масел. Специалисту в данной области будет очевидно, что соединения, используемые в способах по данному изобретению (например, каталитические, исходные или промежуточные соединения) могут быть синтезированы с использованием различных методик и способов,
- 21 013993 которые полностью описаны в научной и патентной литературе. Например, Огдашс 8уп111С5С5 Со11есОуе Уо1ите§, СПтао е! а1. (Εάδ.) Ιοίιη ^йеу & 8οηκ, 1пс., ΝΥ; УегшО (1989) РНагт Кек., 6:867-873. Данное изобретение может применяться на практике совместно с любым известным в данной области способом или методикой, которые полностью описаны в научной и патентной литературе.
В одном аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по данному изобретению, соединена в соответствующем участке с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслируемого полипептида или его фрагмента.
Данное изобретение относится к слитым белкам и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Полипептид по данному изобретению может быть слитым с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Ν-концевые идентификационные пептиды, которые придают желаемые свойства, такие как повышение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды по данному изобретению также могут быть синтезированы и экспрессированы в качестве слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ними, например, для получения более иммуногенного пептида, для упрощения выделения рекомбинантного синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и т.п. Облегчающие определение и очистку домены включают, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые участки и молекулы гистидин-триптофана, которые делают возможной очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованных иммуноглобулинах, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности ЕЬАС8 (1ттипех Согр., 8еа111е \УЛ). Добавление расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (ΙηνίΐΓο^η, 8ап О1едо СА), между доменом для очистки и пептидом или полипептидом, содержащим мотив, облегчает очистку. Например, экспрессирующий вектор может включать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина с последующим тиоредоксином и участком расщепления энтерокиназой (см., например, ^1Шатк (1995) ВюсйетИйу, 34:1787-1797; ИоЬеН (1998) Рго!ет Ехрг. РипЕ, 12:404-414). Остатки гистидина облегчают определение и очистку, в то время как участок расщепления энтерокиназой обеспечивает средство очистки эпитопа от остального слитого белка. Технология, относящаяся к векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, Кго11 (1993) ΌΝΑ Се11. Βίο1., 12:441-53.
Последовательности для контроля транскрипции и трансляции
Данное изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) по данному изобретению, функционально связанным с последовательностью(ями) для контроля экспрессии (например, транскрипционными или трансляционными), например, с промоторами или энхансерами, для управления и модулирования синтеза/экспрессии РНК. Последовательность для контроля экспрессии может находиться в экспрессирующем векторе. Иллюстративные бактериальные промоторы включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, 1атЬйа РК, Ръ и !гр. Иллюстративные эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор Н8У тимидинкиназы, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина Ι.
Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или !гр Е. со11, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др!, промотор 1атЬ4а РК, промотор 1атЬ4а Рь, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как промотор 3-фосфоглицераткиназы (РСК) и кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор Н8У тимидинкиназы, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина-Ι. Также могут быть использованы другие промоторы, для которых известно, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида или его фрагмента в бактериях, включают промоторы 1ас или !гр Е. со11, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др!, промотор 1атЬ4а РК, промотор 1атЬ4а Ръ, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как промотор 3-фосфоглицераткиназы (РСК) и кислой фосфатазы. Промоторы грибов включают промотор фактора У. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор Н8У тимидинкиназы, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металотионеина-1. Также могут быть использованы другие промоторы, для которых известно, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.
Тканеспецифичные промоторы растений
Данное изобретение относится к экспрессирующим кассетам, которые могут быть экспрессированы с тканевой специфичностью, например которые могут экспрессировать фермент по данному изобретению с тканевой специфичностью. Данное изобретение также относится к растениям или семенам, которые экспрессируют фермент по данному изобретению с тканевой специфичностью. Тканевая специфичность может представлять собой специфичность для семян, специфичность для стебля, специфичность для листьев, специфичность для корней, специфичность для плодов и т. п.
В одном аспекте конститутивный промотор, такой как промотор СаМУ 358, может быть использо
- 22 013993 ван для экспрессии в отдельных частях растения или семени, или во всем растении. Например, для сверхэкспрессии может быть использован фрагмент промотора растения, который направляет экспрессию нуклеиновой кислоты в некоторых или всех тканях растения, например регенерирующего растения. Такие промоторы относятся в данном случае к конститутивным промоторам, и они являются активными при большинстве условий окружающей среды и стадий развития или дифференцировки клетки. Примеры конститутивных промоторов включают участок инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) 358. 1'- или 2'-промотор, полученный из Т-ДНК ЛдгоЬас1спит 1итсГас1СП5. и другие участки инициации транскрипции из различных генов растений, известных специалистам в данной области. Такие гены включают, например, АСТ11 из АгаЬ1борк1к (Ниапд (1996) ΡΙαηΙ Мо1. Βίο1., 33:125-139); Са13 из АгаЬ1борк1к (СепВапк № И43147, Ζ1ιοη§ (1996) Мо1. Сеп. Сспс1., 251:196-203); ген, кодирующий стеароилацильный белок-носитель десатуразу из Вгаккюа парик (СепЬапк № Х74782, 8о1осотЬе (1994) Р1ап! РЬу8ю1., 104:1167-1176); СРс1 из маиса (СепВапк № Х15596; Майте/ (1989) I. Мо1. Вю1., 208:551565); Срс2 из маиса (СепВапк № И45855, МащипаШ (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 33:97-112); промоторы растений, описанные в патентах США № 4962028; 5633440.
В соответствии с данным изобретением используются тканеспецифичные или конститутивные промоторы, полученные из вирусов, которые могут включать, например, субгеномный промотор тобамовируса (Китада1 (1995) Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8Л, 92: 1679-1683; промотор, который запускает высокую экспрессию специфичного для флоэмы репортерного гена, палочковидного вируса риса (ВТВУ), который реплицируется только в клетках флоэмы инфицированных рисовых растений; промотор вируса мозаики жилок кассавы (СУМУ) с наиболее высокой активностью в сосудистых элементах, в клетках мезофилла листьев и на концах корней (Уегбадиег (1996) Р1ап! Мо1. Вю1., 31:1129-1139).
Альтернативно, промотор растений может направлять экспрессию нуклеиновой кислоты, экспрессирующей фермент, в конкретной ткани, органе, типе клеток (т.е. тканеспецифичные промоторы) или иначе экспрессия может находиться под более определенным контролем окружающей среды или стадии развития или под контролем индуцибельного промотора. Примеры окружающих условий, которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, наличие света или опрыскивание химическими реагентами/гормонами. Например, данное изобретение относится к промотору маиса, индуцируемому сухостью воздуха (Викк (1997) выше); промотору картофеля, индуцируемому холодом, сухостью воздуха и высоким содержанием соли (Кпсй (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 33:897 909).
Тканеспецифичные промоторы могут обеспечивать транскрипцию только в течение определенных временных рамок стадии развития этой ткани. См., например, В1ахс.|иех (1998) Р1ап! Се11., 10:791-800, где охарактеризован промотор гена ЬЕАЕУ из АгаЫборкБ. См. также Сагбоп (1997) Р1ап! к, 12:367-77, где описан транскрипционный фактор 8РЬ3, который распознает консервативную последовательность мотива в промоторной области А. Шайапа гена идентичности меристемы цветка АР1; и Мапбе1 (1995) Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, νο1. 29, р. 995-1004, где описан промотор меристемы е1Е4. Могут быть использованы тканеспецифичные промоторы, которые активны в течение всего жизненного цикла конкретной ткани. В одном аспекте нуклеиновые кислоты по данному изобретению функционально связаны с промотором, изначально активном только в клетках хлопковых волокон. В одном аспекте нуклеиновые кислоты по данному изобретению функционально связаны с промотором, изначально активным в процессе стадий удлинения клеток хлопковых волокон, например, как описано Втекай (1996) выше. Нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором гена ЕЬ12А для предпочтительной экспрессии в клетках хлопковых волокон (1Ь1б). См. также бо11п (1997) Ргос. №11. Асаб. 8ск, И8А, 89:5769-5773; .Токп, е1 а1., патенты США № 5608148 и 5602321, где описаны промоторы, специфичные для хлопковых волокон, и способы конструирования трансгенных хлопковых растений. Также для экспрессии нуклеиновых кислот по данному изобретению могут быть использованы промоторы, специфичные для корней. Примеры промоторов, специфичных для корней, включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (ПеЬ1к1е (1990) 1п1. Веν. Су!о1., 123:39-60). Другие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии нуклеиновых кислот по данному изобретению, включают, например, промоторы, специфичные для семяпочки, специфичные для зародыша, специфичные для эндосперма, специфичные для интегумента, специфичные для оболочки семени или некоторые их комбинации; промотор, специфичный для листьев (см., например, Викк (1997) Р1ап! к, 11:1285-1295, где описан промотор маиса, специфичный для листьев); промотор ОВЕ13 из АдгоЬасЮпшп гЫходепек (который проявляет высокую активность в корнях, см., например, Напкеп (1997) выше); промотор, специфичный для пыльцы маиса (см., например, Сиеггего (1990) Мо1. Сеп. Сепе!., 224:161-168); может быть использован промотор томатов, активный в процессе созревания плодов, при старении и опадании листвы и, в меньшей степени, в цветках (см., например, В1ите (1997) Р1ап! I., 12:731-746); промотор, специфичный для пестика, из гена картофеля 8К2 (см., например, Искег (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 35:425-431); ген В1ес4 из гороха, который активен в эпидермальной ткани вегетативных и цветочных верхушек побегов трансгенной люцерны, делая его ценным инструментом для направления экспрессии чужеродных генов в эпидермальный слой активно растущих побегов или волокон; ген, специфичный для семяпочки ВЕЬ1 (см., например, ВеБег (1995) Се11., 83:735-742, СепВапк № И39944); и/или промотор в К1ее, патент США № 558 9583, где описан участок промотора растений, способный обеспечивать высокий уровень транскрипции в ткани меристемы и/или в быстроделя
- 23 013993 щихся клетках.
Альтернативно, для экспрессии нуклеиновых кислот по данному изобретению используются промоторы растений, которые индуцируются под воздействием гормонов растений, таких как ауксины. Например, в соответствии с данным изобретением могут быть использованы отвечающие на ауксин элементы Е1 фрагмента промотора (ЛихКЕз) в сое (О1усте тах Ь.) (Ьш (1997) Р1ап1 Ρΐινδίοΐ.. 115:397-407); отвечающий на ауксин промотор ЛтаЬ1кор818 С8Т6 (также отвечающий на салициловую кислоту и пероксид водорода) (Скеп (1996) Р1ап1 I., 10:955-966); индуцируемый ауксином промотор рагС из табака (8ака1 (1996) 37:906-913); отвечающий на биотин элемент растений (81гек (1997) Мо1. Р1ап1 МютоЬе 1п1егас1., 10:933-937) и промотор, отвечающий на гормон стресса - абсцизовую кислоту (811ееп (1996) 8с1епсе, 274:1900-1902).
Также нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть функционально связаны с промоторами растений, которые индуцируются под воздействием химических реагентов, которые могут быть нанесены на растения, таких как гербициды или противомикробные средства. Например, может быть использован промотор маиса 1п2-2, активируемый антидотами гербицидов на основе бензолсульфонамида (Эе УеуИет (1997) Р1ап1 Се11. Рйузю1., 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов приводит к индуцированию различных систем экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатоде и в апикальной меристеме побега. Кодирующая последовательность может находиться по контролем, например, индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы из Луепа зайуа Ь. (овес) (Маздтаи (1997) Р1ап1 I., 11:465-473); или элемент, отвечающий на салициловую кислоту (81аиде (1997) Р1ап1 I., 11:1315-1324). При использовании химически индуцируемых (например, индуцируемых гормонами или пестицидами) промоторов, т. е. промоторов, отвечающих на химический реагент, который может быть нанесен на трансгенное растение в поле, экспрессия полипептида по данному изобретению может быть индуцирована на конкретной стадии развития растения. Таким образом, данное изобретение также относится к трансгенным растениям, содержащим индуцибельный ген, кодирующий полипептиды по данному изобретению, диапазон растений-хозяев которых ограничивается видами растений-мишеней, такими как кукуруза, рис, ячмень, пшеница, картофель или другие зерновые культуры, индуцируемый на любой стадии развития зерновой культуры.
Специалисту в данной области будет очевидно, что тканеспецифичный промотор растений может запускать экспрессию функционально связанной последовательности в тканях, отличных от тканимишени. Таким образом, тканеспецифичный промотор представляет собой промотор, который запускает экспрессию предпочтительно в намеченной ткани или типе клеток, но, кроме того, также может приводить к некоторой экспрессии в других тканях.
Также нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть функционально связанными с промоторами растений, которые индуцируются под воздействием химических реагентов. Эти реагенты включают, например, гербициды, синтетические ауксины или противомикробные средства, которые могут быть нанесены, например распылены, на трансгенные растения. Индуцируемая экспрессия продуцирующих фермент нуклеиновых кислот по данному изобретению даст возможность специалисту по выращиванию растений проводить селекцию растений с оптимальной экспрессией и/или активностью фермента. Таким образом, можно контролировать развитие частей растений. Таким образом, данное изобретение относится к способам облегчения выращивания растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используется промотор маиса 1п2-2, активируемый антидотами гербицидов на основе бензолсульфонамида (Эе УеуИет (1997) Р1ап1 Се11. Рйу8ю1., 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов приводит к индуцированию определенных систем экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатоде и в апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности по данному изобретению также находятся под контролем индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы из Луепа зайуа Ь. (овес) (Маздтаи (1997) Р1ап1 I., 11:465-473); или отвечающего на салициловую кислоту элемента (81апде (1997) Р1ап1 I., 11:1315-1324).
В некоторых аспектах для должной экспрессии полипептида может быть необходим участок полиаденилирования на 3'-конце кодирующей области. Участок полиаденилирования может быть получен из природного гена, из множества других генов растений (или животных, или других генов) или из генов в Т-ДНК агробактерий.
Термин растение включает целые растения, части растений (например, листья, стебли, цветы, корни и т.д.), протопласты растений, семена и клетки растений и их потомство. Класс растений, которые могут быть использованы в способе по данному изобретению, как правило, настолько же широк, что и класс высших растений, подходящих для технологий трансформации, включая покрытосемянные (однодольные и двудольные растения), а также голосемянные. Они включают растения с множеством уровней плоидности, включая полиплоидное, диплоидное, гаплоидное и гемизиготное состояния. Как используется в данном описании, термин трансгенное растение включает растения или клетки растений, в которые встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, например нуклеиновой кислоты и различных рекомбинантных конструкций (например, экспрессирующие кассеты) по данному изобрете
- 24 013993 нию.
Экспрессирующие векторы и носители для клонирования
Данное изобретение относится к экспрессирующим векторам и носителям для клонирования, содержащим нуклеиновые кислоты по данному изобретению, например последовательности, кодирующие ферменты по данному изобретению. Экспрессирующие векторы и носители для клонирования по данному изобретению могут содержать частицы вирусов, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, искусственные бактериальные хромосомы, вирусную ДНК (например, ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц, вируса псевдобешенства и производных 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как ВасШик, АкретдШик и дрожжи). Векторы по данному изобретению могут включать хромосомные, нехромосомные последовательности и синтетические последовательности ДНК. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области, и они являются коммерчески доступными. Иллюстративные векторы включают бактериальные: векторы рОЕ (О|;щеп). плазмиды рВ1иексг1р1, векторы рNΗ, (векторы 1атЬйаΖΑΡ (81та1адепе); р1тс99а, рКК223-3, рПК.540, рКГТ2Т (РБагтааа); эукариотические: рХТ1, р865 (81та1адепе), р8УК3, рВРУ, рМ86, р8УЪ8У40 (Рйагташа). Однако может быть использована любая другая плазмида или другой вектор при условии, что они способны реплицироваться и являются устойчивыми в хозяине. В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы векторы с низкой копийностью или с высокой копийностью.
Плазмиды могут быть коммерчески доступными, общедоступными без ограничений, или они могут быть сконструированы на основе доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Плазмиды, эквивалентные описанным в данном описании плазмидам, известны в данной области и будут очевидны среднему специалисту в данной области.
Экспрессирующий вектор может содержать промотор, участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации, любые необходимые участки связывания рибосом, участок полиаденилирования, доноры сплайсированных фрагментов и акцепторные участки, последовательности терминации транскрипции и фланкирующие 5'-конец нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов могут быть использованы ДНК последовательности, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.
В одном аспекте экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой, и ген ТРР1 8. сегетыае. Могут быть выбраны промоторные участки из любых других желаемых генов с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селективными маркерами.
Также для повышения уровня экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках могут содержать энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК длиной, как правило, приблизительно от 10 до приблизительно 300 п.о., которые воздействуют на промотор и повышают его транскрипцию. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации с 100-270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.
Последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в вектор различными методами. Как правило, последовательность лигируется с вектором в желаемом положении после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно, могут быть лигированы тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество технологий клонирования, например, как описано Аи8иЬе1 и 8атЬгоок. Такие методики и другие входят в компетенцию специалистов в данной области.
Вектор может быть в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из комбинаций плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства.
Разнообразие векторов для клонирования и экспрессирующих векторов для использования в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, 8атЬгоок.
Конкретные бактериальные векторы, которые могут быть использованы, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора для клонирования рВВ322 (АТСС 37017), рКК223-3 (Рйаттааа Рте Сйеткак, Ирр8а1а, 8мейеп), 6ЕМ1 (Рготеда Вю1ес, Майкоп, ^Ι, И8А) рОЕ70, рОЕ60, рОЕ-9 (Р1адеп), рЭ10, рыХ174 рВ1иексг1р1 ΙΙ К8, рNΗ8Α, рNΗ16а, р]\1Н18А, ]АН46А (81га1а§епе), р!тс99а, рКК223-3, рКК233-3, ΌΒ540, рК1Т5 (Рйатташа), рКК232-8 и
- 25 013993 рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают рЗУ2САТ, р0С44, рХТ1, рЗС (З1га1адепе) рЗУК3, рВΡV, рМЗС и рЗУЪ (Т11агтас1а). Однако может быть использован любой другой вектор при условии, что он способен реплицироваться и является устойчивым в клетке-хозяине.
Нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть экспрессированы в экспрессирующих кассетах, векторах или вирусах и могут быть временно или постоянно экспрессированы в клетках растений и семян. В одной иллюстративной временной экспрессирующей системе используются эписомальные экспрессирующие системы, например вирусная РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), которая образуется в ядре при транскрипции эписомальной мини-хромосомы, содержащей сверхскрученную ДНК, см., например, Соуеу (1990) ΡΐΌα №И. Асаб. Зск, ИЗА, 87:1633-1637. Альтернативно, кодирующие последовательности, т. е. все последовательности по данному изобретению или их субфрагменты, могут быть встроены в геном растительной клетки-хозяина и становятся составляющими частями хромосомной ДНК хозяина. Таким образом, могут экспрессироваться смысловые и антисмысловые транскрипты. Вектор, содержащий последовательности (например, промоторы или кодирующие участки) нуклеиновых кислот по данному изобретению, может содержать маркерный ген, который придает селектируемый фенотип клетке растений или семени. Например, маркер может определять устойчивость к биоциду, в частности устойчивость к антибиотику, такую как устойчивость к канамицину, С418, блеомицину, гигромицину, или устойчивость к гербициду, такую как устойчивость к хлорсульфурону или Ваз1а.
Экспрессирующие векторы, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты и белки в растениях, хорошо известны в данной области и могут включать, например, векторы из АдгоЬас1егшт зрр., вируса картофеля X (см., например, Апде11 (1997) ЕМВ0 1., 16:3675-3684), вируса табачной мозаики (см., например, Сазрег (1996) Сепе, 173:69-73), вируса кустистой карликовости томатов (см., например, Н111тап (1989) У1го1о§у, 169:42-50), вируса гравировки табака (см., например, ЭоЦа (1997) У1го1оду, 234:243-252), вируса желтой мозаики фасоли (см., например, Моппада (1993) МюгоЬю1 1ттипо1., 37:471-476), вируса мозаики цветной капусты (см., например, СессЫш (1997) Мо1. ΡΕιπΙ М1сгоЬе 1п1егас1., 10:1094-1101), перемещающегося элемента маиса Ас/Оз (см., например, КиЬт (1997) Мо1. Се11. Вю1., 17:6294-6302; Кипхе (1996) Сигг. Тор. МюгоЬю1. 1ттипо1., 204:161-194) и перемещающегося элемента маиса супрессорамутатора (Зрт) (см., например, Зсй1арр1 (1996) ΡΕπι! Мо1. Вю1., 32:717-725); и их производных.
В одном аспекте экспрессирующий вектор может иметь две системы репликации для того, чтобы иметь возможность поддерживаться в двух организмах, например в клетках млекопитающих или насекомых, для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и размножения. Более того, в случае встраивающихся экспрессирующих векторов экспрессирующий вектор может содержать по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина. Он может содержать две гомологичных последовательности, которые фланкируют экспрессирующую конструкцию. Встраивающийся вектор может быть направлен в конкретный локус в клетке-хозяине посредством выбора соответствующей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкции для встраивания векторов хорошо известны в данной области.
Экспрессирующие векторы по данному изобретению также могут включать ген селектируемого маркера для обеспечения селекции бактериальных штаммов, в которых произошла трансформация, например гены, которые придают бактериям устойчивость к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, неомицин и тетрациклин. Селективные маркеры также могут включать гены, участвующие в биосинтезе, такие как гены, участвующие в каскадах биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.
Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе функционально связана с соответствующей последовательностью(ями) для контроля экспрессии (промотором) для управления синтезом РНК. Конкретные указанные бактериальные промоторы включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, 1атЬба Ρκ, Ρι. и 1гр. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы НЗУ, ранний и поздний промоторы ЗУ40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотеонеина-1. Выбор подходящего вектора и промотора находится в компетенции специалиста в данной области. Экспрессирующий вектор также содержит участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Промоторные участки могут быть выбраны из любого желаемого гена с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селектируемыми маркерами. Кроме того, в одном аспекте экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных маркеров для придания фенотипических особенностей для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза, или устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой.
Экспрессирующие векторы млекопитающих также могут содержать ориджин репликации, любой необходимый участок связывания рибосом, участок полиаденилирования, доноры сплайсированного фрагмента и акцепторные участки, последовательности терминации транскрипции и фланкирующие 5'-конец нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах для получения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов могут быть использованы последовательности ДНК, полу
- 26 013993 ченные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.
Для повышения уровня экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК с длиной, как правило, приблизительно от 10 до приблизительно 300 п.о., которые воздействуют на промотор и повышают его транскрипцию. Примеры включают 8У40 энхансер на поздней стороне ориджина репликации с 100-270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.
В дополнение, экспрессирующие векторы, как правило, содержат один или несколько генов селектируемых маркеров для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину в Е. со11, и ген ТРР1 8. есгсуыас.
В некоторых аспектах нуклеиновая кислота, кодирующая один из полипептидов по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, соединена в соответствующим участке с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента. Нуклеиновая кислота необязательно может кодировать слитый полипептид, в котором один из полипептидов по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, являются слитыми с гетерологичными пептидами или полипептидами, такими как Ν-концевые идентификационные пептиды, которые придают желаемые свойства, такие как повышенная стабильность или упрощение очистки.
Соответствующая последовательность ДНК может быть встроена в вектор различными методиками. Как правило, последовательность ДНК лигируется с вектором в желаемом положении после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно, могут быть лигированы тупые концы вставки и вектора. Различные технологии клонирования описаны АикиЬе1 е! а1. в СиггсШ Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, Ιοίιη \Убеу 503 8опк, 1пс. 1997 и 8атЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1опίη§: А ЬаЬота1огу Мапиа1 2п6 Еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк (1989). Такие методики и другие находятся в компетенции специалистов в данной области.
Вектор может быть, например, в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические ДНК последовательности, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из комбинаций плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Различные векторы для клонирования и экспрессирующие векторы для использования в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны 8атЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬота1огу Мапиа1 2пб Еб., Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ., (1989).
Клетки-хозяева и трансформированные клетки
Данное изобретение также относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению, например, последовательность, кодирующую фермент по данному изобретению или вектор по данному изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные бактериальные клетки включают Е. сой, Ьас1ососсик 1асбк, 8йер1отусек, ВасШик киЫШк, Вас111ик сегеик, 8а1топе11а 1урЫтипит или любые виды из рода ВасШик, 81гер1отусек и 81арйу1ососсик. Иллюстративные клетки насекомых включают ЭгокорНПа 82 и 8робор!ега 8ί9. Иллюстративные клетки дрожжей включают РюШа ракЮпк, 8ассйатотусек сетеуЩае или 8сЫхокассНаготусек ротЬе. Иллюстративные клетки животных включают СНО, СО8 или клетки меланомы Вотек или любые клеточные линии мыши или человека. Выбор подходящего хозяина находится в компетенции специалистов в данной области. Технологии трансформации для большинства различных видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе. См., например, \Уе1кт§ (1988) Апп. Реу. Оепе!:., 22:421-477; патент США № 5750870.
Вектор может быть введен в клетку-хозяина с использованием любой из различных технологий, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τί-опосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ЭЕАЕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Эа\зк Ь., Э|Ьпег М., Вайеу Ь. Вакю МеШобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986)).
В одном аспекте нуклеиновые кислоты или векторы по данному изобретению вводят в клетки для скрининга так, чтобы нуклеиновые кислоты были введены в клетки подходящим образом для последующей экспрессии нуклеиновой кислоты. Способ введения, главным образом, определяется типом клетокмишеней.
Иллюстративные способы включают осаждение с СаРО4, слияние липосом, липофекцию (например, липофектин™), электропорацию, вирусную инфекцию и т.д. Нуклеиновые кислоты-кандидаты могут
- 27 013993 стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина (например, при ретровирусном введении) или могут существовать либо временно, либо постоянно в цитоплазме (т.е. при использовании традиционных плазмид с использованием стандартных регуляторных последовательностей, селективных маркеров и т.д.). Поскольку для многих фармацевтически важных исследований требуются клетки-мишени человека или модели клеток-мишеней млекопитающих, могут быть использованы ретровирусные векторы, способные трансфецировать такие мишени.
Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, могут культивироваться на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по данному изобретению. После трансформации подходящего штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток выбранный промотор может быть индуцирован соответствующими способами (например, сменой температуры или химическим индуцированием) и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода времени для того, чтобы получить возможность продуцировать желаемый полипептид или его фрагмент.
Клетки могут быть собраны центрифугированием, разрушены физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт может быть сохранен для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент могут быть извлечены и очищены из культур рекомбинантных клеток методами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида могут быть использованы стадии рефолдинга. Если необходимо, для конечной стадии очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Конструкции в клетках-хозяевах могут быть использованы общепринятым образом для продуцирования продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в рекомбинантом продуцировании, полипептиды, продуцируемые клетками-хозяина, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по данному изобретению также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.
Также для продукции полипептида по данному изобретению могут быть использованы бесклеточные системы трансляции. В бесклеточных системах трансляции могут быть использованы мРНК, транскрибируемые с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах перед проведением реакции транскрипции ίη νίίτο конструкция ДНК может быть линеаризована. Транскрибированную мРНК затем инкубируют с подходящим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением желаемого полипептида или его фрагмента.
Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селектируемых маркеров для придания фенотипических особенностей для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой.
Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, например нуклеиновые кислоты по данному изобретению, могут культивироваться на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по данному изобретению. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой условия, которые использовались ранее для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и очевидны для среднего специалиста в данной области. Клоны, идентифицированные как имеющие требуемую ферментативную активность, затем могут быть секвенированы для идентификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент с повышенной активностью.
Данное изобретение относится к способу сверхэкспрессии рекомбинантного фермента в клетке, содержащей вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по данному изобретению, например нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательностей с иллюстративной последовательностью по данному изобретению на протяжении участка длиной по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более остатков, или на протяжении всей длины гена или транскрипта, где идентичность последовательностей определяется анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием, или нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобре
- 28 013993 тению. Сверхэкспрессию можно осуществлять любыми способами, например, используя промотор с высокой активностью, бицистронный вектор, или амплификацией гена в векторе.
Нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть экспрессированы или сверхэкспрессированы в любой экспрессирующей системе ίη νίίτο или ίη νίνο. Для экспрессии или сверхэкспрессии рекомбинантного белка может быть использована любая клеточная культура, включая бактериальные культуры, культуры насекомых, дрожжей, грибов или млекопитающих. Сверхэкспрессия может быть осуществлена посредством целесообразного выбора промоторов, энхансеров, векторов, (например, использованием векторов с репликоном, бицистронных векторов (см., например, Сиг1и (1996) ВюсНет. Βίορίινδ. Век. Сοттиη., 229:295-8), среды, культур и т.п. В одном аспекте для сверхэкспрессии полипептидов по данному изобретению используют амплификацию гена с использованием в клеточных системах маркеров для селекции, например глутаминсинтетазы (см., например, 8апбегк (1987) Эеу. ΒίοΙ. δίαηά., 66:55-63).
Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. В качестве репрезентативных примеров подходящих хозяев могут быть названы бактериальные клетки, такие как Е. οοΐί. 81герЮтуее8. ВасШик киЬбкк, За^сгеНа 1урЫтигшт и различные виды из рода ЗйерЮтусек и 8ί3ρ^1ο^^πκ, клетки грибов, такие как дрожжи, клетки насекомых, такие как ϋϊΌδορΗΐΐΗ 82 и 8ρο6ορ^πι 8£9, клетки животных, такие как СНО, СОЗ или клетки меланомы Воетек и аденовирусы. Выбор подходящего хозяина находится в компетенции специалистов в данной области.
Вектор может быть введен в клетки-хозяева с использованием любой из различных технологий, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τίопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ΌΕΑΕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Όηνίκ Ь., О|Ьнег М., Вайеу I. Вак1с Мебюбк ίη Μο^πΕί Βίοίοβλ', (1986)).
Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, могут культивироваться на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по данному изобретению. После трансформации подходящего штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток выбранный промотор может быть индуцирован соответствующими способами (например, сменой температуры или химическим индуцированием) и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода времени для того, чтобы получить возможность продуцировать желаемый полипептид или его фрагмент.
Как правило, клетки собирают центрифугированием, разрушают физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области.
Экспрессированный полипептид или его фрагмент может быть извлечен и очищен из культур рекомбинантных клеток методами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида могут быть использованы стадии рефолдинга. Если необходимо, для конечной стадии очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Различные системы клеточных культур млекопитающих также могут быть использованы для экспрессии рекомбинантного белка. Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны СО8-7 (описанные 01и7таи, Се11. 23:175, 1981) и другие клеточные линии, способные экспрессировать белки совместимого вектора, такие как клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК.
Конструкции в клетках-хозяевах могут быть использованы общепринятым образом для продуцирования продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в процессе рекомбинантного продуцирования, полипептиды, продуцируемые клеткойхозяином, содержащей вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по данному изобретению также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.
Альтернативно, полипептиды по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 или более их последовательно расположенных аминокислот, могут быть получены синтетически с помощью общепринятых устройств для синтеза пептидов. В других аспектах фрагменты или участки полипептидов могут быть использованы для получения соответствующего полноразмерного полипептида с помощью пептидного синтеза; таким образом, фраг
- 29 013993 менты могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения полноразмерных полипептидов.
Системы бесклеточной трансляции также могут быть использованы для получения одного из полипептидов по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот с использованием мРНК, транскрибируемых из конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах перед проведением реакции транскрипции ίη ν 1(го конструкция ДНК может быть линеаризована. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением желаемого полипептида или его фрагмента.
Амплификация нуклеиновых кислот
Для практического осуществления данного изобретения нуклеиновые кислоты по данному изобретению и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты по данному изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть копированы амплификацией. Также для клонирования или модификации нуклеиновых кислот по данному изобретению может быть использована амплификация. Таким образом, данное изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновых кислот по данному изобретению. Специалист в данной области может разработать последовательности пары праймеров для амплификации для любой части или для полной длины этих последовательностей.
В одном аспекте данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, амплифицируемой парой праймеров по данному изобретению, например парой праймеров, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков нуклеиновой кислоты по данному изобретению и их приблизительно первых (5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков комплементарной цепи.
Данное изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по данному изобретению, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член последовательностей пары праймеров может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности или приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательно расположенных оснований последовательности. Данное изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков нуклеиновой кислоты по данному изобретению, и второй член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков цепи, комплементарной цепи для первого члена. Данное изобретение относится к кодирующим фермент нуклеиновым кислотам, полученным амплификацией, например с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по данному изобретению. Данное изобретение относится к способам получения кодирующих фермент нуклеиновых кислот амплификацией, например с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по данному изобретению. В одном аспекте пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например из библиотеки генов, такой как библиотека окружающей среды.
Реакции амплификации также могут быть использованы для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (такого как количество транскрипта в клеточном образце), внесения метки в нуклеиновую кислоту (например, для использования на матрицах или в блотах), обнаружения нуклеиновой кислоты или определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном аспекте данного изобретения амплифицируется транскрипт, выделенный из клетки или библиотеки кДНК.
Специалист в данной области может выбрать и разработать приемлемые олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (см., например, РСК ргоксо1к, А дшбе Ю тебюбк апб аррйсайопк, еб. 1пп1к, Асабетк Ргекк, Ν.Υ. (1990) и РСК кйакдкк (1995), еб. 1пп1к, Асабетк Ргекк, 1пс., Ν.Υ.), лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (см., например, \¥и (1989) Сепоткк, 4:560; Ьапбедгеп (1988) 8скпсе 241:1077; Ватпдег (1990) Сепе, 89:117); транскрипционную амплификацию (см., например, К^ой (1989) Ргос. №И. Асаб. 8ск, И8А, 86:1173) и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (см., например, СиакШ (1990) Ргос. №И. Асаб. 8ск, И8А, 87:1874); амплификацию с репликазой С Ве1а (см., например, 8тйй (1997) ί. С11п. МкгоЬкй, 35:1477-1491), автоматизированный анализ амплификацией с репликазой О-Ье1а (см., например, Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЬек, 10:257-271) и другие технологии, опосредуемые РНК-полимеразой (например, NΑ8ВΑ, Сапдепе, Мккккаида, Оп1апо); см. также Вегдег (1987) Ме!йобк Епхуток 152:307-316; 8атЬгоок; АикиЬе1; патенты США № 4683195 и 4683202; 8оокпапап (1995) Вкксйпо1оду, 13:563-564.
- 30 013993
Определение степени идентичности последовательностей
Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности по меньшей мере с приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью последовательностей с иллюстративной нуклеиновой кислотой по данному изобретению (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 8РО ΙΌ ΝΟ: 9, 81У) ΙΌ ΝΟ: 11, 8РО ΙΌ ΝΟ: 13, 8РО ΙΌ ΝΟ: 15, 8РО ΙΌ ΝΟ: 17 или 81У) ΙΌ ΝΟ: 19) на протяжении участка по меньшей мере из приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков. Данное изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательности по меньшей мере с приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью последовательностей с иллюстративным полипептидом по данному изобретению. Степень идентичности (гомологии) последовательностей может быть определена с использованием любой компьютерной программы и ассоциированных параметров, включая описанные в данном описании программы, такие как ВЬА8Т 2.2.2. или РА8ТА версии 3.0Д78, с параметрами по умолчанию.
Последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению могут содержать по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных нуклеотидов иллюстративной последовательности по данному изобретению и последовательностей, по существу, идентичных ей. Гомологичные последовательности и фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению могут относиться к последовательности по меньшей мере с 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50% гомологией с этими последовательностями. Гомология может быть определена с использованием любой из компьютерных программ и параметров, описанных в данном описании, включая РА8ТА версии 3.0Д7 8 с параметрами по умолчанию. Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых остатки уридина замещают остатки тимина в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любой из методик, описанных в данном описании, или могут быть получены в результате коррекции ошибок при секвенировании. Следует понимать, что последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению могут отображаться в традиционном формате отдельных символов (см. оборот задней стороны обложки 8Дгуег, ЬиЬегД. ВДосйетДзДгу, 3гб Еб., \.Н. Ргеетап & Со., Νονν Уогк.) или в любом другом формате, в котором записывается название нуклеотидов в последовательности.
Различные программы для сравнения последовательностей, указанные в других местах в данном патентном описании, в частности, предусмотрены для использования в этом аспекте изобретения. Гомология белков и/или последовательностей нуклеиновых кислот может быть оценена с использованием любого из различных алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают, но не ограничиваются ими, ТВЬА81ТН, ВЬА8ТР, РА8ТА, ТРА8ТА и С1ЛУТА1 А\' (Реагзоп апб ЬДртаи, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сД., И8А, 85 (8):2444-2448, 1988; АДДзсйиД еД а1., 1. Мо1. ВДоД., 215 (3):403-410, 1990; Тйотрзоп еД а1., №с1еДс АсДб. Кез., 22(2):4673-4680, 1994; НДддДпз еД а1., МеДйобз Еи7уто1., 266:383-402, 1996; АДДзсйиД еД а1., 1. Мо1. ВДоД., 215 (3):403-410, 1990; АДДзсйиД еД а1., №11иге ОепеДДсз, 3:266-272, 1993).
Гомологию или идентичность часто определяют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, Зедиепсе АпаДузДз 8ойгаге Раскаде, ОепеДДсз СотриДег Огоир, ИпДуегзДДу, \ДзсопзДп ВДоДесйпоДоду СепДег, 1710 ИшуегзДДу Ауепие, МабДзоп, \Ι 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным делециям, заменам и другим модификациям. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают точно определенным процентным количеством аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые оказываются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области, которое измеряется с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или выравниванием вручную и визуальным исследованием.
При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве контрольной последовательности, с которой сравнивают анализируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей анализируемую и контрольную последовательности вносят в компьютер, координаты подпоследовательностей обозначают, если необходимо, и определяют параметры программы алгоритма для последовательностей. Могут быть использованы параметры по умолчанию или могут быть назначены альтернативные параметры. Затем на основании параметров программы алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процентную идентичность последовательностей для анализируемой последовательности относительно контрольной последовательности.
Как используется в данном описании, окно сравнения относится к сегменту любого из числа
- 31 013993 смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, как правило, приблизительно от 50 до приблизительно 200, более конкретно приблизительно от 100 до приблизительно 150, в которых последовательность может быть сравнена с контрольной последовательностью с таким же числом смежных положений после того, как две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, посредством алгоритма локальной гомологии διηίΐΐι & Уа!егтап, Λάν. Арр1. Ма!к., 2:482, 1981, посредством алгоритма выравнивания по гомологии №ек1етаи & Уипкск, I. Мо1. Βίο1., 48:443, 1970, посредством поиска сходства способом Регкоп & Ыртап, Ргос. №1'1. Асак. 8с1., И8А, 85:2444, 1988, посредством компьютеризованного использования этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТЕ1Т, РА8ТА и ТРА8ТА в У1ксоикт Сепейск 8оЙ\уаге Раскаде, Сепекск Сотри!ег Сгоир, 575 8аепсе Όγ., Мак1коп, У1), или посредством выравнивания вручную и визуального исследования. Другие алгоритмы для определения гомологии и идентичности включают, например, помимо программы ВЬА8Т (Вак1с Ьоса1 Акдптеи! 8еагск Тоо1 в №1копа1 Сеп!ег йог Вю1одюа1 1пйогтакоп), ЛЫСН АМА8 (Апа1ук1к ой Ми1кр1у Акдпек 8едиепсе), АМР8 (Рго!еш Ми1кр1е 8ес.|иепсе Акдптеи!), АЗЗЕТ (Акдпек 8едтеп! 81акккса1 Е\'а1иакоп Тоо1), ВАИБЗ, ВЕ8Т8С0К, ΒI08САN (Вю1одюа1 8ес.|иепсе Сотрага!ке Апа1ук1к №ке), ВЫМР8 (ВЬоскк 1МРго\гек Зеагскег), РА8ТА, 1п1егуа1к & Ро1п1к, ВМВ, СЬиЗТАЬ У., СЬи8ТАЬ У., С0№Е^и8, ^С0N8ЕN8υ8, УС0N8ЕN8υ8, алгоритм 8ткк-Уа!егтап, РАКУШ, алгоритм Ьак Уедак, ΡNАТ (Рогсек №1с1еоЕке Акдптеи! Тоо1), Егатеакдп, Ргатекеагск, ΌΥNЛМIС, Е1ЬТЕВ, Р8АР (Ейк!епкку 8ес.|иепсе Апа1ук1к Раскаде), САР (С1оЬа1 Акдптеи! Ргодгат), СЕНАЕ, С1ВВ8, СепОиекЕ 188С (8епккКе 8ес.|иепсе Сотрайкоп), ^А^IСN (Ьоса1 8ес.|иепсе Акдптеи!), ЬСР (Ьоса1 Соп1еп1 Ргодгат), МАСАУ (Ми1йр1е Акдптеи! Соиккисйоп & Апа1ук1к УогкЬепск), МАР (Ми1йр1е Акдптеи! Ргодгат), МВЬКР, МВЙ1<№ Р1МА (Ракет-1пкисек Мик1-кедиепсе Акдптеи!), 8АСА (8ес.|иепсе Акдптеи! Ьу Сепекс А1догккт) и УНАТ-1Е. Такие программы для выравнивания также могут быть использованы для скрининга геномных баз данных для идентификации полинуклеотидных последовательностей, по существу, с идентичными последовательностями. Доступным является ряд геномных баз данных, например основная часть генома человека доступна в качестве части проекта секвенирования генома человека (й. Коаск, ккр://^еЬег.и. УакЫпд!оп. еки/~гоаск/китап_депоте_ргодгекк 2.к!т1) (С1ЬЬк, 1995). По меньшей мере двадцать один геном других организмов уже был секвенирован, включая, например, М. депкайит (Егакег е! а1., 1995), М. _)аппакскп (Вик е! а1., 1996), Н. тПиепхае (Е1е1ксктапп е! а1., 1995), Е. сок (В1акпег е! а1., 1997) и дрожжи (8. сеге^зкае) (Ме^ек е! а1., 1997) и Ό. те1аподак!ег (Акатк е! а1., 2000). Значительный прогресс также был достигнут в секвенировании геномов моделей организмов, таких как мышь, С. е1едапк и АгаЬакоркк кр. Несколько баз данных, содержащих информацию геномов, снабженных некоторой функциональной информацией, поддерживаются различными организациями и являются доступными через Интернет.
Одним примером подходящего алгоритма являются алгоритмы ВЬА8Т и ВЬА8Т 2,0, которые описаны в А1!кски1 е! а1., кис. Ас1кк Кек., 25:3389-3402, 1977 и А1!кски1 е! а1., I. Мо1. Вю1., 215:403-410, 1990 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов ВЬА8Т является общедоступным через КЛпа1 Сеп!ег йог Вю!ескпо1оду 1пйогтайоп. Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (Н8Р) посредством идентификации коротких слов с длиной У в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяется как порог значений для соседних слов (А1!кски1 е! а1., выше). Эти изначальные совпадения соседних слов выступают в роли предшественников для начала поиска при обнаружении более длинных Н8Р, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может повышаться. Суммарные значения вычисляются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда >0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного значения используется оценочная матрица. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливают, если суммарное значение для выравнивания снижается по величине X ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже при накоплении одного или нескольких выровненных остатков с отрицательным значением или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма ВЬА8Т У, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа Β^А8ТN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (У) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа ВЬА8ТР использует в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемые значения (Е) 10 и оценочную матрицу ВЬ08иМ62 (см. Нешкойй & Неткойй, Ргос. №111. Асак. 8сй, И8А, 89:10915, 1989), фрагменты для выравнивания (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.
Алгоритм ВЙА8Т также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Каг1ш & А1!кски1, Ргос. №111. Асак. 8сй, И8А, 90:5873, 1993). Один способ определения сходства, обеспечиваемый алгоритмом ВЙА8Т, представляет собой наименьшую суммар
- 32 013993 ную вероятность (Р(Щ), которая предполагает указание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайным образом. Например, нуклеиновая кислота рассматривается как сходная с контрольной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой составляет менее чем приблизительно 0,2, более того в одном аспекте менее чем приблизительно 0,01 и более всего в одном аспекте менее чем приблизительно 0,001.
В одном аспекте гомологию последовательности белка и нуклеиновой кислоты оценивают с использованием Ваис Ьоса1 АКдптегИ 8еагсй Тоо1 (ВЬА8Т). В частности, для осуществления следующих задач используют пять конкретных программ ВЬА8Т:
(1) ВЬА8ТР и ВЬА8Т3 сравнивают представляющую интерес аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков;
(2) Β^Α8ТN сравнивает представляющую интерес нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей;
(3) ВЬА8ТХ сравнивает концептуальные продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности (обе нити) с базой данных белковых последовательностей;
(4) ТΒ^Α8ТN сравнивает представляющую интерес белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых со всех шести рамок считывания (обе цепи); и (5) ТВЬА8ТХ сравнивает продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции с шести рамок базы данных нуклеотидных последовательностей.
Программы ВЬА8Т идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных сегментов, которые в данном описании называются парами сегментов с максимальным сходством между представляющей интерес последовательностью аминокислоты или нуклеиновой кислоты и анализируемой последовательностью, которая в одном аспекте получена из последовательности белка или нуклеиновой кислоты из базы данных. Пары сегментов с максимальным сходством в одном аспекте идентифицируются (т.е. выравниваются) посредством оценочных матриц, многие из которых известны в данной области. В одном аспекте оценочная матрица представляет собой матрицу ВЬО8ИМ62 (Согте1 е! а1., 8с1епсе. 256:1443-1445, 1992; Нещкойй аЫ Нещкойй, Ро!ет§, 17:49-61, 1993). В меньшей степени в одном аспекте также могут быть использованы матрицы РАМ или РАМ250 (см., например, 8с11\\'аг1х ηηά Оау1юГГ. ебк., 1978, Ма1псе§ йог Пе!ес!тд ^^8ίаηсе Ке1аί^οη8Ыр8: А!1ак ой Рго!ет 8есщеисе аЫ 8!гис!иге, νηδίιίηβίοη: №ΐίοηη1 Вюте±са1 Кекеагск ΡοιιηώιΙίοη). Программы ВЬА8Т являются доступными посредством и.8. №ιΙίοηη1 НЬгагу ой МеЛсте.
Параметры, используемые в приведенных выше алгоритмах, могут быть адаптированы в зависимости от длины последовательности и исследуемой степени гомологии. В некоторых аспектах параметры могут представлять собой параметры по умолчанию, используемые в алгоритмах в отсутствии инструкций пользователя.
В одном аспекте фраза по существу, идентичный в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям, например, по меньшей мере с приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью нуклеотидных или аминокислотных остатков (последовательностей) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, которая определяется с использованием одного из известных алгоритмов сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В альтернативных аспектах значимая идентичность существует на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 1150 или более остатков, или на протяжении полной длины гена или транскрипта. В некоторых аспектах последовательности являются, по существу, идентичными на протяжении всей длины кодирующей области.
Компьютерные системы и компьютерные программы
Для определения и идентификации идентичности последовательностей, структурной гомологии, мотивов и т.п. ίη 8111со последовательность нуклеиновой кислоты или полипептида по данному изобретению может быть сохранена, записана и обработана на любом носителе информации, который может считываться компьютером и который можно подключить к компьютеру.
Таким образом, данное изобретение относится к компьютерам, компьютерным системам, компьютерным считываемым носителям информации, компьютерным программам и т. п. с записанными или сохраненными на них последовательностями нуклеиновых кислот и полипептидов по данному изобретению. Как используется в данном описании, слова записанный и сохраненный относятся к процессу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области может легко освоить любые известные способы записи информации на компьютерный считываемый носитель информации с получением изделия, содержащего одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот и/или полипептидов по данному изобретению.
Полипептиды по данному изобретению включают полипептидные последовательности по данному изобретению, например иллюстративные последовательности по данному изобретению, и последова
- 33 013993 тельности, по существу, идентичные им, и фрагменты любой из указанных выше последовательностей. По существу, идентичные или гомологичные полипептидные последовательности относятся к полипептидным последовательностям по меньшей мере с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или с полной (100%) идентичностью последовательностей с иллюстративной последовательностью по данному изобретению.
Гомология может быть определена с использованием любой из компьютерных программ и параметров, описанных в данном описании, включая РА8ТА версии 3.0178 с параметрами по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любой из методик, описанных в данном описании, или могут быть получены в результате коррекции ошибок при секвенировании. Полипептидные фрагменты содержат по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более последовательно расположенных аминокислот полипептидов по данному изобретению. Следует понимать, что коды полипептидов, как указано в аминокислотных последовательностях по данному изобретению, могут быть представлены в традиционном однобуквенном формате или в трехбуквенном формате (см. оборот задней стороны обложки 81гуег. ЬиЬеп. ВюсйешШгу, 3гб Еб., ν.Η. Ргеетап & Со., №\ν Уогк) или в любом другом формате, который переводит единичные элементы полипептидов в последовательность.
Последовательность нуклеиновой кислоты или полипептида по данному изобретению может быть сохранена, записана и обработана на любом носителе информации, который может считываться компьютером и который можно подключить к компьютеру. Как используется в данном описании, слова записанный и сохраненный относятся к процессу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области может легко освоить любые известные в настоящее время способы записи информации на компьютерный считываемый носитель информации с получением изделия, содержащего одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению, одну или несколько последовательностей полипептидов по данному изобретению. Другим аспектом данного изобретения является компьютерный считываемый носитель информации, с записанными на нем по меньшей мере 2, 5, 10, 15 или 20, или более последовательностями нуклеиновых кислот по данному изобретению.
Другим аспектом данного изобретения является компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот по данному изобретению. Другим аспектом данного изобретения является компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем одной или несколькими последовательностями полипептидов по данному изобретению. Другим аспектом данного изобретения является компьютерный считываемый носитель информации с записанными на нем по меньшей мере 2, 5, 10, 15 или 20 или более последовательностями, которые указаны выше.
Как используется в данном описании, термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в их наиболее широком общем смысле и включают такие устройства, как подробно описано ниже. Кодирующая последовательность или последовательность, которая кодирует конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, если она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей.
Компьютерный считываемый носитель информации включает магнитный считываемый носитель, оптически считываемый носитель, электронный считываемый носитель и магнитный/оптический носитель. Например, компьютерный носитель информации может представлять собой жесткий диск, дискету, магнитную ленту, СЭ-К.0М, универсальный цифровой диск (ΌνΟ), оперативное запоминающее устройство (ВАМ) или постоянное запоминающее устройство (В0М), а также другие типы других носителей, известные специалистам в данной области.
Аспекты данного изобретения относятся к системам (например, системам на основе Интернета), в частности компьютерным системам, которые хранят и обрабатывают информацию последовательностей, описанную в данном описании. Один пример компьютерной системы 100 проиллюстрирован в форме принципиальной схемы на фиг. 7. Как используется в данном описании, термин компьютерная система относится к компонентам аппаратного оборудования, компонентам программного обеспечения и компонентам для хранения данных, используемым для анализа нуклеотидной последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательности полипептида по данному изобретению. Компьютерная система 100, как правило, включает процессор для подготовки, доступа и обработки данных о последовательностях. Процессор 105 может представлять собой любой хорошо известный тип центрального процессорного элемента, такой как, например, Репбит III из 1п1е1 Согрогабоп, или сходный процессор из 8ип, Мо!ого1а, Сотрад, АМИ или !п1егпа(1опа1 Виктекк МасЫпек.
Как правило, компьютерная система 100 представляет собой универсальную систему, которая содержит процессор 105 и один или несколько внутренних устройств для хранения данных 110 и одно или несколько устройств для извлечения данных для того, чтобы извлекать данные, сохраненные на компонентах для хранения данных. Специалист в данной области может легко понять, что подходящей являет
- 34 013993 ся любая из доступных в настоящее время компьютерных систем.
В одном конкретном аспекте компьютерная система 100 содержит процессор 105, соединенный с общей шиной, которая соединена с основным запоминающим устройством 115 (в одном аспекте представленном в виде КАМ) и одним или несколькими внутренними устройствами для хранения данных 110, такими как жесткий диск и/или другие компьютерные считываемые носители информации с записанными на них данными. В некоторых аспектах компьютерная система 100 дополнительно содержит одно или несколько устройств для извлечения данных 118 для считывания данных, хранящихся на внутренних устройствах для хранения данных 110.
Устройство для извлечения данных 118 может быть представлено, например, дисководом для гибких дисков, дисководом для компакт-дисков, накопителем на магнитной ленте или модемом, способным соединяться с удаленными системами хранения данных (например, через Интернет), и т. д. В некоторых аспектах внутреннее устройство для хранения данных 110 представляет собой съемный компьютерный считываемый носитель информации, такой как дискета, компакт диск, магнитная лента и т.д., содержащий логические схемы управления и/или записанные на нем данные. Компьютерная система 100 может предпочтительно содержать подходящее программное обеспечение или может быть запрограммирована с помощью него для чтения логической схемы управления и/или данных с компонента для хранения данных после того, как вставляется устройство для извлечения данных.
Компьютерная система 100 содержит экран 120, который используется для выведения данных пользователю компьютера. Также следует отметить, что компьютерная система 100 может быть связана с другими компьютерным системами 125а-с через сеть или глобальную сеть для получения централизованного доступа в компьютерную систему 100.
Программное обеспечение для доступа и обработки нуклеотидных последовательностей в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению, или последовательности полипептида по данному изобретению (такое как инструменты поиска, инструменты сравнения и инструменты моделирования и т.д.) в процессе выполнения программы может находиться на основном запоминающем устройстве 115.
В некоторых аспектах компьютерная система 100 может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательностей для сравнения последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательности полипептида по данному изобретению, хранящейся на компьютерном считываемом носителе информации, с контрольной последовательностью(ями) нуклеотидов или полипептидов, хранящейся на компьютерном считываемом носителе информации. Термин алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или нескольким программам, которые выполняются (локально или удаленно) на компьютерной системе 100 для сравнения нуклеотидной последовательности с другими нуклеотидными последовательностями и/или соединениями, хранящимися на устройствах для хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности в последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению или полипептидные последовательности по данному изобретению, хранящиеся на компьютерном считываемом носителе информации, с контрольными последовательностями, хранящимися на компьютерном считываемом носителе информации, для идентификации гомологии или структурных мотивов.
На фиг. 5 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса 200 сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями из базы данных в целях определить уровень гомологии между новой последовательностью и последовательностью из базы данных. Последовательности из базы данных могут представлять собой частную базу данных, хранящуюся на компьютерной системе 100, или общедоступную базу данных, такую как СЕНВАИК, которая доступна в Интернете. Процесс 200 начинается в исходном положении 201 и перемещается в положение 202, где новая последовательность, предназначенная для сравнения, сохраняется на запоминающем устройстве компьютерной системы 100. Как описано выше, запоминающее устройство может представлять собой любой тип запоминающего устройства, включая КАМ или внутреннее устройство для хранения.
Затем процесс 200 перемещается в положение 204, где последовательности из баз данных открываются для анализа и сравнения. Затем процесс 200 перемещается в положение 206, где первая последовательность, хранящаяся в базе данных, считывается в запоминающее устройство компьютера. Затем в положении 210 осуществляется сравнение для определения, является ли первая последовательность одинаковой со второй последовательностью. Важно отметить, что эта стадия не ограничивается осуществлением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью из базы данных. Специалистам в данной области известны хорошо известные способы сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не являются идентичными. Например, в одну последовательность могут быть внесены разрывы в целях повышения уровня гомологии между двумя анализируемыми последовательностями. Параметры, контролирующие, будут ли разрывы или другие элементы внесены в последовательность в процессе сравнения, нормально вводятся пользователем компьютерной системы.
После того как выполнено сравнение двух последовательностей в положении 210, в положении для
- 35 013993 принятия решения 210 осуществляется определение того, являются ли две последовательности одинаковыми. Безусловно, термин одинаковый не ограничивается последовательностями, которые абсолютно идентичны. Последовательности, которые находятся в пределах параметров гомологии, введенных пользователем, в процессе 200 будут обозначаться как одинаковые.
Если определяется, что две последовательности являются одинаковыми, процесс 200 перемещается в положение 214, где названия последовательностей из базы данных выводится на экран пользователю. В этом положении пользователь уведомляется о том, что последовательность с отображенным названием удовлетворяет введенным ограничениям. После того как название сохраненной последовательности выводится на экран для пользователя, процесс 200 перемещается в положение для принятия решения 218, где определяется, существуют ли другие последовательности в базе данных. Если в базе данных больше нет последовательностей, тогда процесс 200 завершается в конечном положении 220. Однако если в базе данных существуют другие последовательности, тогда процесс 200 перемещается в положение 224, где указатель перемещается на следующую последовательность в базе данных, так что она может быть сравнена с новой последовательностью. Таким образом, новая последовательность выравнивается и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных.
Следует отметить, что если в положении для принятия решения 212 определяется, что последовательности не гомологичны, тогда процесс 200 непосредственно перемещается в положение для принятия решения 218 в целях определить, если в базе данных есть любые другие доступные последовательности для сравнения.
Таким образом, одним аспектом данного изобретения является компьютерная система, содержащая процессор, устройство для хранения данных с хранящейся на нем последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательностью полипептида по данному изобретению, устройство для хранения данных с хранящимися на нем извлекаемыми контрольными нуклеотидными последовательности или полипептидными последовательностями для сравнения с последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению или полипептидной последовательностью по данному изобретению, и программу для сравнения последовательностей для проведения сравнения. Программа для сравнения последовательностей может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы в описанном выше коде нуклеиновой кислоты в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или в последовательности полипептида по данному изобретению, или она может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с этими кодами нуклеиновых кислот и кодами полипептидов. В некоторых аспектах, устройство для хранения данных может хранить на нем последовательности по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению или последовательностей полипептидов по данному изобретению.
Другим аспектом данного изобретения является способ определения уровня гомологии между последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательностью полипептида по данному изобретению и контрольной нуклеотидной последовательностью. Способ включает считывание кода нуклеиновой кислоты или кода полипептида и контрольной нуклеотидной или полипептидной последовательности с использованием компьютерной программы, которая определяет уровни гомологии, и определение гомологии между кодом нуклеиновой кислоты или кодом полипептида и контрольной нуклеотидной или полипептидной последовательностью с помощью компьютерной программы. Компьютерная программа может представлять собой любую из множества компьютерных программ для определения уровня гомологии, включая программы, конкретно представленные в данном описании, (например, В^Α8Τ2N с параметрами по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами). Способ может быть осуществлен с использованием компьютерных систем, описанных выше. Также способ может быть осуществлен считыванием по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более описанных выше последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению или последовательностей полипептидов по данному изобретению с использованием компьютерной программы и определением гомологии между кодами нуклеиновых кислот или кодами полипептидов и контрольными нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями.
На фиг. 6 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса 250 в компьютере для определения наличия гомологии между двумя последовательностями. Процесс 250 начинается в исходном положении 252 и затем переходит в положение 254, где первая последовательность для сравнения сохраняется на запоминающем устройстве. Тогда вторая последовательность для сравнения сохраняется на запоминающем устройстве в положении 256. Затем процесс 250 переходит в положение 260, где считывается первый элемент первой последовательности, и затем в положение 262, где считывается первый элемент второй последовательности. Следует понимать, что если последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, тогда элемент будет любым из А, Т, С, С или и. Если последовательность представляет собой белковую последовательность, тогда в одном аспекте она представлена однобуквенным аминокислотным кодом, так что первая последовательность и последовательности могут легко быть сравнены.
Затем в положении для принятия решения 264 определяется, являются ли два элемента одинаковы
- 36 013993 ми. Если они являются одинаковыми, тогда процесс 250 переходит в положение 268, где считываются следующие элементы первой и второй последовательностей. Затем определяется, являются ли следующие элементы одинаковыми. Если они являются одинаковыми, тогда процесс 250 продолжает этот цикл до тех пор, пока элементы не будут отличаться. Если определяется, что следующие два элемента не являются одинаковыми, тогда процесс 250 переходит в положение для принятия решения 274 для определения, существуют ли любые другие элементы или последовательности для считывания.
Если элементов для прочтения более не существует, тогда процесс 250 переходит в положение 276, где уровень гомологии между первой и второй последовательностью выводится на экран пользователю. Уровень гомологии определяется вычислением соотношения элементов в последовательностях, которые были одинаковыми из всего количества последовательностей в первой последовательности. Таким образом, если каждый элемент в первой последовательности из 100 нуклеотидов совпал с каждым элементом второй последовательности, тогда уровень гомологии составляет 100%.
Альтернативно, компьютерная программа может представлять собой компьютерную программу, которая сравнивает нуклеотидные последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в соответствии с данным изобретением, с одним или несколькими контрольными нуклеотидными последовательностями в целях определить, отличается ли код нуклеиновой кислоты по данному изобретению от контрольной последовательности нуклеиновой кислоты по одному или нескольким положениям. Такая программа необязательно записывает длину и название вставленных, удаленных или замененных нуклеотидов в отношении последовательности либо контрольного полинуклеотида, либо последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению.
В одном аспекте компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению однонуклеотидный полиморфизм (8ΝΡ) относительно контрольной нуклеотидной последовательности.
Таким образом, другим аспектом данного изобретения является способ определения, отличается ли последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению по одному или нескольким нуклеотидам от контрольной нуклеотидной последовательности, включающий стадии считывания кода нуклеиновой кислоты и контрольной нуклеотидной последовательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует различия между последовательностями нуклеиновых кислот, и идентификации различий между кодом нуклеиновой кислоты и контрольной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы. В некоторых аспектах компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует однонуклеотидные полиморфизмы. Способ может быть осуществлен с помощью описанной выше компьютерной системы и способа, проиллюстрированного на фиг. 6. Способ также может быть осуществлен посредством считывания по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению и контрольных нуклеотидных последовательностей с использованием компьютерной программы, и идентификации различий между кодами нуклеиновых кислот и контрольными нуклеотидными последовательностями с помощью компьютерной программы.
В других аспектах система на основе компьютера может дополнительно содержать идентификатор для идентификации элементов в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательности полипептида по данному изобретению.
Термин идентификатор относится к одной или нескольким программам, которые идентифицируют определенные элементы в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или в последовательности полипептида по данному изобретению. В одном аспекте идентификатор может содержать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению.
На фиг. 7 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса идентификации 300 для определения наличия элементов в последовательности. Процесс 300 начинается в исходном положении 302 и затем переходит в положение 304, где первая последовательность, которую проверяют на наличие элементов, сохранена на запоминающем устройстве 115 в компьютерной системе 100. Процесс 300 затем переходит в положение 306, где открывается база данных с последовательностями элементов. Такая база данных должна содержать список признаков каждого элемента вместе с названием элемента. Например, названием элемента может быть кодон инициации и признаком может быть ΑΤΟ. Другим примером может быть название элемента ТААТАА-Вох и признаком элемента может быть ТААТАА. Примером такой базы данных является база данных, созданная в Ьшуегк11у ο£ \νί^οηκίη Семейск ^тр^ет Огоир. Альтернативно, элементами могут быть структурные мотивы полипептидов, такие как альфа-спирали, бета-слои, или функциональные мотивы полипептидов, такие как ферментативные каталитические домены (СО), или активные центры, мотивы спираль-петля-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области.
После открытия базы данных элементов в положении 306 процесс 300 переходит в положение 308, где первый элемент считывается из базы данных. Затем проводится сравнение признака первого элемента с первой последовательностью в положении 310. В положении для принятия 316 решения определяется, обнаружен ли признак элемента в первой последовательности. Если признак обнаружен, тогда про
- 37 013993 цесс 300 переходит в положение 318, где название обнаруженного элемента выводится на экран пользователю.
Затем процесс 300 переходит в положение для принятия решения 320, где определяется, существуют ли еще в базе данных элементы. Если элементов больше не существует, тогда процесс 300 завершается в конечном положении 324. Однако если в базе данных существуют еще элементы, тогда в процессе 300 считывается следующий элемент последовательности в положении 326 и процесс возвращается в положение 310, где признак следующего элемента сравнивается с первой последовательностью. Следует отметить, что если признак элемента не обнаружен в первой последовательности в положении для принятия решения 316, тогда процесс 300 переходит непосредственно в положение для принятия решения 320 в целях определить, существуют ли еще элементы в базе данных.
Таким образом, другим аспектом данного изобретения является способ идентификации элемента в последовательности нуклеиновой кислоты по данному изобретению или в последовательности полипептида по данному изобретению, включающий считывание кода(ов) нуклеиновой кислоты или кода(ов) полипептида с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует элементы в них, и идентификацию элементов в коде(ах) нуклеиновой кислоты с помощью компьютерной программы. В одном аспекте компьютерная программа включает компьютерную программу, которая идентифицирует открытые рамки считывания. Способ может быть осуществлен посредством считывания единичной последовательности или по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению или последовательностей полипептидов по данному изобретению с использованием компьютерной программы и идентификации элементов в кодах нуклеиновых кислот или кодах полипептидов с помощью компьютерной программы.
Последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательность полипептида по данному изобретению может храниться и обрабатываться во множестве программ для обработки данных в различных форматах. Например, последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению или последовательность полипептида по данному изобретению может быть сохранена в качестве текста в файле для обработки слов, таком как Мкгокой ^ОКЭ™ или ^ОКЭРЕКЕЕСТ™, или в качестве файла А8СП в различных программах с базами данных, известных специалистам в данной области, таких как ОВ2™, 8ΥВΑ8Е™ или ОКАСЙЕ™. Кроме того, различные компьютерные программы и базы данных могут быть использованы в качестве алгоритмов сравнения последовательностей, идентификаторов или источников контрольных нуклеотидных последовательностей или полипептидных последовательностей для сравнения с последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению или с последовательностью полипептида по данному изобретению. Следующий список не предназначен для ограничения данного изобретения, а предоставляет руководство по программам и базам данных, которые подходят для последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению или для последовательностей полипептидов по данному изобретению.
Программы и базы данных, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ими: МасРайегп (ЕМВЙ), ^^ксоνе^уВаке (Мо1еси1аг Аррйсайопк Сгоир), СепеМше (Мо1еси1аг Аррйсайопк Сгоир), йоок (Мо1еси1аг Аррйсайопк Сгоир), Масйоок (Мо1еси1аг Аррйсайопк Сгоир), ВЙА8Т и ВЙА8Т2 ^СВЦ ВЕА8Т\' и ВЙА8ТХ (Айксйи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1., 215: 403, 1990), ЕА8ТА (Реагкоп и Ыртап, Ргос. №Й. Асаб. 8сЕ, И8А, 85: 2444, 1988), ЕА8ТЙВ (ВгиЙад е! а1. Сотр. Арр. ВкксЕ, 6:237-245, 1990), Са1а1ук( (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), Са1а1ук1/8НАРЕ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), СепикхЭВАссекк (Мо1еси1аг 81ти1абопк 1пс.), НуроСеп (Мо1еси1аг 8ппи1а1кпк 1пс.), 1пк1дй( II (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), Эйсоне (Мо1еси1аг 81ти1айопк Шс.), СНАКМт (Мо1еси1аг 81ти1айопк Шс.), Рейх (Мо1еси1аг 81ти1айопк Шс.), Йе1Рй1 (Мо1еси1аг 81ти1абопк Шс.), СиапкММ, (Мо1еси1аг 81ти1абопк Шс.), Ното1оду (Мо1еси1ага 81ти1аЕопк Шс.), Мобе1ег (Мо1еси1аг 81ти1айопк Шс.), ^8 (Мо1еси1аг 81ти1абопк Шс.), Оиап1а/Рго1ет Йек1дп (Мо1еси1аг 81ти1абопк Шс.), ^еЬйаЬ (Мо1еси1аг 81ти1абопк Шс.), ^еЬйаЬ Ойегкйу Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айопк йю.), Сепе Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айопк Шс.), 8ес.|Ео1б (Мо1еси1аг 81ти1айопк йю.), базу данных МОЙ Ανа^1аЬ1е Сйетка1к Ойескгу, базу данных МОЙ Эгид Йа1а Керой, базу данных Сотргейепкйе Мебкша1 Сйеткйу, базу данных Йег\уеп1к'к \Уог1б Эгид Шбех, базу данных ВюВукМаккгЕйе, базу данных СепЬапк и базу данных Сепкецп. Множество других программ и баз данных будут очевидными для специалиста в данной области, учитывая настоящее описание.
Мотивы, которые могут быть определены с использованием приведенных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновую молнию, мотивы спираль-петля-спираль, участки гликозилирования, участки убиквитинилирования, альфа-спирали и бета-слои, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секрецию кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, фрагменты с кислотными свойствами, ферментативные активные центры (каталитические домены (СО)), участки связывания субстрата и участки ферментативного расщепления.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Данное изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые в жестких условиях гибридизуются с иллюстративной последовательностью по дан
- 38 013993 ному изобретению (например, 8ЕЭ ΙΌ N0: 1, 8ЕЭ ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8Е0 ΙΌ N0: 7, 8Е0 ΙΌ N0: 9, 8ЕО ΙΌ N0: 11, 8ЕО ΙΌ N0: 13, 8ЕО ΙΌ N0: 15, 8ЕО ΙΌ N0: 17 или 8ЕО ΙΌ N0: 19). Жесткие условия могут представлять собой высоко жесткие условия, умеренно жесткие условия и/или условия с низкой жесткостью, включая условия с высокой и сниженной жесткостью, описанные в данном описании. В одном аспекте жесткость условий промывания предусматривает условия, определяющие, входит ли нуклеиновая кислота в объем данного изобретения, как описано ниже.
В альтернативных аспектах длина нуклеиновых кислот по данному изобретению, определенных по их способности гибридизоваться в жестких условиях, может составлять приблизительно от пяти остатков до полной длины нуклеиновой кислоты по данному изобретению; например их длина может составлять по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков. Нуклеиновые кислоты, которые короче полной длины, также включены. Эти нуклеиновые кислоты могут быть пригодны, например, в качестве зондов для гибридизации, зондов для мечения, олигонуклеотидных зондов для ПЦР, 1РНК (одноцепочечной или двухцепочечной), антисмысловой последовательности или последовательности, кодирующей пептиды, связывающиеся с антителами (эпитопами), мотивов, активных центров (каталитических доменов (СЭ)) и т.п.
В одном аспекте нуклеиновые кислоты по данному изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих условия приблизительно с 50% формамидом при температуре от 37 до 42°С. В одном аспекте нуклеиновые кислоты по данному изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих условия приблизительно с 35-25% формамидом при температуре приблизительно от 30 до 35°С.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты по данному изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих условия с температурой 42°С в 50% формамиде, 5Х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и с нуклеиновой кислотой, блокирующей повторяющиеся последовательности, такие как со!-1 или ДНК спермы лосося (например, 200 нг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося). В одном аспекте нуклеиновые кислоты по данному изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих 35% формамид при температуре от пониженной до 35°С.
В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня жесткости, будут варьировать в зависимости от природы гибридизуемой нуклеиновой кислоты. Например, при выборе условий гибридизации могут рассматриваться длина, степень комплементарности, состав нуклеотидной последовательности (например, содержание ОС относительно АТ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК) в гибридизуемых участках нуклеиновых кислот. Дополнительно рассматривается, является ли одна из нуклеиновых кислот иммобилизованной, например, на фильтре.
Гибридизация может быть проведена в условиях низкой жесткости, умеренной жесткости или высокой жесткости. В качестве примера гибридизации нуклеиновой кислоты сначала проводят прегибридизацию полимерной мембраны, содержащей иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты в течение 30 мин при 45°С в растворе, состоящем из 0,9М №01, 50 мМ NаН2Р04, рН 7,0, 5,0 мМ ^^ЭТА, 0,5% 8Ό8, 10Х ЭепНагб! и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем в раствор добавляют приблизительно 2х107 срт (имп.мин)(удельная активность 4-9х108 срт/мкг) меченого на конце 32Р олигонуклеотидного зонда. Через 12-16 ч инкубации мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре в ΙΧ 8ЕТ (150 мМ ΜΟ, 20 мМ гидрохлорида Тик, рН 7,8, 1 мМ Nа2Е^ТА), содержащем 0,5% 8Ό8, с последующим промыванием в течение 30 свежим 1Х 8ЕТ при Тт-10°С для олигонуклеотидного зонда. Мембрану затем подвергают воздействию пленки для радиоавтографии для определения сигналов гибридизации.
Все приведенные выше способы гибридизации можно рассматривать, как проходящие в условиях высокой жесткости.
После гибридизации для удаления любых неспецифично связанных детектируемых зондов фильтр можно промывать. Жесткость, используемая для промывания фильтров, также может варьировать в зависимости от природы гибридизуемых нуклеиновых кислот, длины гибридизуемых нуклеиновых кислот, степени комплементарности, состава нуклеотидиой последовательности (например, содержание ОС относительно АТ) и типа нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК). Примеры постепенно повышающихся условий жесткости состоят в следующем: 2Х 88С, 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 в течение от 15 до 30 мин при температуре от температуры гибридизации до 68°С (высокая жесткость) и 0,15М №С1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая жесткость). Конечное промывание с низкой жесткостью может быть проведено в 0,1Х 88С при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только иллюстрацией одного набора условий, который может быть использован для промывания фильтров. Специалисту в данной области известно, что существует множество способов промывания с различной жесткостью. Некоторые другие примеры приведены ниже.
- 39 013993
Нуклеиновые кислоты, которые гибридизовались с зондом, идентифицируют посредством радиоавтографии или других общепринятых способов.
Приведенная выше методика может быть модифицирована для идентификации нуклеиновых кислот с пониженным уровнем гомологии с последовательностью образца. Например, для получения нуклеиновых кислот со сниженной гомологией с образцом для определения могут быть использованы менее жесткие условия. Например, температура гибридизации может быть снижена на интервал 5°С в диапазоне от 68 до 42°С в буфере для гибридизации с концентрацией Νι ' приблизительно 1М. После гибридизации фильтр можно промывать 2Х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре гибридизации. Эти условия рассматриваются как умеренные условия при температуре выше 50°С и низкие условия при температуре ниже 50°С. Конкретный пример умеренных условий гибридизации представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят при 55°С. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят при 45°С.
Альтернативно, гибридизация может быть проведена в буферах, таких как 6Х 88С, содержащий формамид при температуре 42°С. В этом случае концентрация формамида в буфере для гибридизации может быть снижена на 5% интервал в диапазоне от 50 до 0% для идентификации клонов со сниженным уровнем гомологии с образцом. После гибридизации фильтр можно промывать 6Х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия рассматриваются как умеренные условия при концентрации формамида выше 25% и низкие условия при концентрации формамида ниже 25%. Конкретный пример умеренных условий гибридизаций представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят в 30% формамиде. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят в 10% формамиде.
Однако выбор параметров гибридизации не является решающим - решающей является жесткость условий промывания, которая предполагает условия, которые дают возможность определить, входит ли нуклеиновая кислота в объем данного изобретения. Условия промывания, используемые для идентификации нуклеиновых кислот в объеме данного изобретения, включают, например: приблизительно 0,02 молярную концентрацию соли при рН 7 и температуру по меньшей мере приблизительно от 50°С или приблизительно от 55 до приблизительно 60°С; или концентрацию соли приблизительно 0,15М ΝιΟ при 72°С в течение приблизительно 15 мин; или концентрацию соли приблизительно 0,2Х 88С при температуре по меньшей мере приблизительно от 50°С или приблизительно от 55 до приблизительно 60°С в течение приблизительно от 15 до приблизительно 20 мин; или гибридизационный комплекс промывают дважды раствором с концентрацией соли приблизительно 2Х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин и затем промывают дважды 0,1Х 88С, содержащем 0,1% 8Ό8 при 68°С в течение 15 мин; или эквивалентные условия. См. 8атЬгоок, Туккеп и АикиЬе1 для описания буфера 88С и эквивалентных условий.
Указанные способы могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот по данному изобретению. Например, указанные выше способы могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот, имеющих последовательность по меньшей мере с приблизительно 97%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% гомологией с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из одной из последовательностей по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 ее последовательно расположенных оснований и последовательностей, комплементарных им. Гомология может быть определена с использованием алгоритма выравнивания. Например, гомологичные полинуклеотиды могут обладать кодирующей последовательностью, которая является природным аллельным вариантом одной из описанных в данном описании кодирующих последовательностей. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с нуклеиновыми кислотами по данному изобретению.
Кроме того, приведенные выше методики могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере приблизительно 99, 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% гомологию с полипептидом по данному изобретению или фрагментами, содержащими по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, которая определяется с использованием алгоритма выравнивания последовательностей (например, таких как алгоритм ГА8ТА версии 3.0178 с параметрами по умолчанию).
Олигонуклеотидные зонды и способы их использования
Данное изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы, например, для идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих пептид, обладающий ферментативной активностью, или его фрагменты, или для идентификации генов или других нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие ферментативной активностью хлорофиллазы, или ферменты, вовлеченные в катаболизм хлорофилла. В одном аспекте зонд содержит по меньшей мере 10 последовательно
- 40 013993 расположенных оснований нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Альтернативно, зонд по данному изобретению может представлять собой по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 или приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70 последовательно расположенных оснований последовательности, как указано, в нуклеиновой кислоте по данному изобретению. Зонды дают возможность идентифицировать нуклеиновую кислоту посредством связывания и/или гибридизации. Зонды также могут быть использованы в матрицах по данному изобретению, см. обсуждение ниже, включающих, например, капиллярные матрицы. Зонды по данному изобретению также могут быть использованы для выделения других нуклеиновых кислот или полипептидов.
Выделенные нуклеиновые кислоты по данному изобретению, последовательности, комплементарные им, или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований одной из последовательностей по данному изобретению, или последовательности, комплементарные им, также могут быть использованы в качестве зондов для того, чтобы определить, содержит ли биологический образец, такой как образец почвы, организм с последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению или организм, из которого была получена нуклеиновая кислота. По таким методикам получают биологический образец, потенциально содержащий организм, из которого была выделена нуклеиновая кислота, и из образца получают нуклеиновые кислоты. Осуществляют взаимодействие нуклеиновых кислот с зондом в условиях, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда с любой комплементарной последовательностью, которая представлена в них.
При необходимости условия, которые делают возможной специфическую гибридизацию зонда с комплементарной последовательностью, могут быть определены осуществлением взаимодействия образца с комплементарными последовательностями из образцов, о которых известно, что они содержат комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарной последовательности. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, могут варьироваться для идентификации условий, которые дают возможность зонду специфично гибридизоваться с комплементарными нуклеиновыми кислотами.
Если образец содержит организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена, тогда определяют наличие специфической гибридизации зонда. Наличие гибридизации может быть определено посредством мечения зонда детектируемым веществом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование детектируемого продукта.
Специалистам в данной области известны различные способы использования меченых зондов для определения наличия комплементарных нуклеиновых кислот в образце. Они включают анализы саузернблот, нозерн-блот, методы гибридизации колоний и дот-блот анализ. Протоколы для каждого из указанных методов представлены АикиЬе1 е! а1. в Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оНп \УПеу 503 8опк, 1пс. (1997) и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд; А ЬаЬогакгу Маша1 2п6 Еб., Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1989).
Альтернативно, более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфично гибридизоваться с любой комплементарной последовательностью, которая присутствует в образце нуклеиновой кислоты) можно использовать в реакции амплификации для определения, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению (например, организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена). Как правило, зонды включают олигонуклеотиды. В одном аспекте реакция амплификации может включать реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны в АикиЬе1 апб 8атЬгоок выше. Альтернативно, амплификация может включать лигазную цепную реакцию, 38Р или реакцию перемещения цепей. (См. Багаму Р., Т1е Ыдаке Скат Реасйоп ίη а РСР ^ог1б, РСР Ме!1обк апб АррНсайопк, 1:5-16, 1991; Е. Ра1у е! а1., 8е1Г-кик1ашеб 8едиепсе РерНсайоп (38Р): Ап 1ко!11егта1 Тгапкспр!юп-Ьакеб АтрКПсайоп 8ук!ет АНегпаНуе !о РСР, РСР Ме!1обк апб АррНсайопк, 1:2533, 1991 и \Уа1кег С.Т. е! а1., 81гапб О|кр1асетеп! АтрШгсайопап 1ко!кегта1 ίη νί!ΐΌ ^NА АтрШгсайоп ТесЬшдце, ШсШс ас1б Рекеагсй, 20: 1691-1696, 1992). По таким методикам нуклеиновые кислоты в образце контактируют с олигонуклеотидными зондами, проводят реакцию амплификации и определяют любой полученный продукт амплификации. Продукт амплификации может быть определен проведением гель-электрофореза продуктов реакции и окрашиванием геля интеркалирующим красителем, таким как бромистый этидий. Альтернативно, один или несколько зондов могут быть мечены радиоактивным изотопом, и наличие радиоактивного продукта амплификации может быть определено радиоавтографией после гель-электрофореза.
Зонды, полученные из последовательностей вблизи концов последовательностей по данному изобретению, также можно использовать в методах прогулки по хромосоме для идентификации клонов, содержащих геномные последовательности, расположенные рядом с последовательностями по данному изобретению. Такие методы дают возможность выделить из организма хозяина гены, которые кодируют дополнительные белки.
Выделенные нуклеиновые кислоты по данному изобретению, комплементарные им последователь
- 41 013993 ности или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательно расположенных оснований одной из последовательностей по данному изобретению, или последовательности комплементарные им, могут быть использованы в качестве зондов для идентификации и выделения сходных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах сходные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномные ДНК из организмов, иных, чем организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена. Например, другие организмы могут быть родственными организмами. По таким методикам образец нуклеиновой кислоты контактируют с зондом в условиях, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда со сходными последовательностями. Наличие гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма затем определяют с использованием любого из описанных выше способов.
Варьируя жесткость условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномные ДНК, которые гибридизуются с детектируемым зондом, могут быть идентифицированы и выделены нуклеиновые кислоты с различными уровнями гомологии. Жесткость можно варьировать проведением гибридизации при различных температурах ниже температуры плавления зонда. Температура плавления, Тт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН) при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с абсолютно комплементарным зондом. Очень жесткие условия выбирают из условий, равных или приблизительно на 5°С ниже, чем Тт для конкретного зонда. Температура плавления зонда может быть вычислена с использованием следующих формул.
Для образцов с длиной от 14 до 70 нуклеотидами температуру плавления (Тт) вычисляют с использованием формулы ^=81,5+16,6(^1^4)+0,41^^^ С+С)-(600/Ы), где N означает длину зонда.
Если гибридизацию проводят в растворе, содержащем формамид, температура плавления может быть вычислена с использованием формулы
Тт=81,5+16,6(1од|№+])+0,41(фракция С+С)-(0,63% формамида)-(600/Ы), где N означает длину зонда.
Прегибридизацию можно проводить в 6Х ЗЗС, 5Х реагенте ПепйагФ, 0,5% ЗЭЗ, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или в 6Х ЗЗС, 5Х реагенте ПепйагФ, 0,5% ЗЭЗ, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы для растворов ЗЗС и ОепНагФ приведены в ЗатЬгоок е! а1. выше.
В одном аспекте гибридизацию проводят с добавлением детектируемого зонда в растворы для прегибридизации, перечисленные выше. В случае если зонд содержит двухцепочечую ДНК, его денатурируют перед добавлением раствора для гибридизации. Фильтр контактируют с раствором для гибридизации на достаточный период времени для того, чтобы дать возможность зонду гибридизоваться с кДНК или с геномными ДНК, содержащими последовательности, комплементарные ему или гомологичные ему. Для зондов с длиной более 200 нуклеотидов гибридизация может быть проведена при температуре на 15-25°С ниже Тт. Для более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизация может быть проведена при температуре на 5-10°С ниже Тт. В одном аспекте для гибридизации в 6Х ЗЗС, гибридизацию проводят при приблизительно 68°С. В одном аспекте для гибридизации в растворах, содержащих 50% формамид, гибридизацию проводят при приблизительно 42°С.
Ингибирование экспрессии ферментов
Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, комплементарным (например, антисмысловые последовательности) нуклеиновым кислотам по данному изобретению, например нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, обладающие ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы). Антисмысловые последовательности способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию генов, кодирующих фермент. Ингибирования можно достигать посредством направления действия на геномную ДНК или матричную РНК. Транскрипция или функционирование нуклеиновой кислоты-мишени могут быть ингибированы, например, гибридизацией и/или расщеплением. Один особенно полезный ряд ингибиторов, предоставленный в соответствии с настоящим изобретением, включает олигонуклеотиды, способные связывать либо ген, либо транскрипт в любом случае предотвращая или ингибируя продуцирование или функционирование желаемого фермента. Ассоциация может быть получена посредством специфичной для последовательности гибридизации. Другой полезный класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие ферментативной активностью, вовлеченной в катаболизм хлорофилла, или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы). Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, как в случае рибозимов. Олигонуклеотид может быть химически модифицированным или конъюгированным с ферментом или композицией, способной расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Группа из множества различных подобных олигонуклеотидов может быть исследована на наличие олигонуклеотидов с желаемой активностью. Таким образом, данное изобретение относится к различным композициям для ингибирования экспрессии фермента с
- 42 013993 нуклеиновой кислоты и/или уровня белка, например, антисмысловой последовательностью, 1РНК и рибозимами, содержащими последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению, и антителами по данному изобретению.
Ингибирование экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие ферментативной активностью, вовлеченных в катаболизм хлорофилла или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), может иметь различные промышленные применения. Например, композиции по данному изобретению для ингибирования экспрессии фермента (например, антисмысловые последовательности, 1РНК, рибозимы, антитела) могут быть использованы в качестве фармацевтических композиций, например в качестве средств против патогенов, или других лекарственных средств, например, где ингибируемый фермент обладает нежелательным, вредным или токсичным эффектом.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Данное изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, способным связывать транскрипт или ген фермента, которые могут ингибировать ген-мишень или транскрипт-мишень, например, для ингибирования полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), направлением воздействия на мРНК. Стратегии для разработки антисмысловых олигонуклеотидов полностью описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие олигонуклеотиды с использованием новых реагентов по данному изобретению. Например, протоколы прогулок по гену/картирования РНК для поиска эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, см., например, Но (2000) Ме11юйк Епхуток 314:168-183, где описан анализ для картирования РНК, который основан на стандартных молекулярных технологиях, для обеспечения легкого и достоверного способа эффективного выбора антисмысловой последовательности. См. также 8ιηί11ι (2000) Еиг. 1. РЬагт. 8сЕ, 11:191-198.
В качестве антисмысловых олигонуклеотидов используются природные нуклеиновые кислоты. Антисмысловые олигонуклеотиды могут иметь любую длину; например, в альтернативных аспектах длина антисмысловых олигонуклеотидов составляет приблизительно от 5 и 100, приблизительно от 10 до 80, приблизительно от 15 до 60, приблизительно от 18 до 40. Оптимальная длина может быть определена общепринятым скринингом. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть представлены в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена общепринятым скринингом. Известно большое множество синтетических, неприродных аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут решить эту потенциальную проблему. Например, могут быть использованы пептиднонуклеиновые кислоты (ΡNΑ), содержащие неионные остовы, такие как элементы Ю(2-аминоэтил)глицина. Также могут быть использованы антисмысловые олигонуклеотиды с фосфоротиоатными связями, как описано в \У0 97/03211; 96/39154; Ма1а (1997) Тох1со1 Арр1. РЬагтасо1., 144:189-197; Апйкепсе ТЬегареийск, ей. Адга\\'а1 (Нитапа Ргекк, То1ома, N1, 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды с синтетическими аналогами остова ДНК, относящиеся к данному изобретению, также могут включать нуклеиновые кислоты с фосфородитиоатом, метилфосфонатом, фосфорамидатом, алкилфосфотриэфиром, сульфаматом, 3'-тиоацеталем, метилен(метилимино), 3'^-карбаматом и морфолинокарбаматом, как описано выше.
Для создания большого количества олигонуклеотидов, которые могут быть быстро исследованы на наличие конкретных олигонуклеотидов, которые обладают соответствующей аффинностью связывания и специфичностью к любой мишени, такой как смысловые и антисмысловые последовательности по данному изобретению, могут быть использованы комбинаторные химические методы (см., например, Со1й (1995) 1. о£ Вю1. СЬет., 270:13581-13584).
Ингибиторные рибозимы
Данное изобретение относится к рибозимам, способным связывать транскрипт или гены, кодирующие полипептиды по данному изобретению, или кодирующие полипептиды, вовлеченные в катаболизм хлорофилла или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы). Эти рибозимы могут ингибировать активность, например, посредством направления воздействия на мРНК. Стратегии для разработки рибозимов и селекции специфичной ферменту антисмысловой последовательности для воздействия полностью описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может разработать такие рибозимы с использованием новых реагентов по данному изобретению. Рибозимы действуют посредством связывания РНК-мишени с помощью связывающего РНК-мишень участка рибозима, который находится в непосредственной близости от ферментативного участка РНК, который расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим распознает и связывает РНК-мишень посредством комплементарного спаривания оснований и после связывания с соответствующим участком действует, ферментативно расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени подобным образом нарушает ее способность направлять синтез кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После того как рибозим связался и расщепил свою РНК-мишень, он может высвобождаться из этой РНК для повторного связывания и расщепления новых мишеней.
В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может давать преимущества по сравнению с другими технологиями, такими как технологии антисмысловых последовательностей (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью для блокирования ее транс
- 43 013993 крипции, трансляции или ассоциации с другой молекулой), поскольку эффективная концентрация рибозима, необходимая для осуществления обработки лекарственных средств, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Это потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, единичная молекула рибозима способна расщеплять множество молекул РНК-мишеней. Кроме того, рибозим, как правило, представляет собой высокоспецифичный ингибитор со специфичностью ингибирования, зависящей не только от механизма связывания спариванием оснований, но также от механизма, посредством которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. Значит, ингибирование, происходит вследствие расщепления РНК-мишени и, таким образом, специфичность определяется как соотношение скорости расщепления РНК-мишени и скорости расщепления РНК, которая не является мишенью. Этот механизм расщепления зависит от факторов, которые являются дополнительными для факторов, вовлеченных в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть более высокой, чем специфичность антисмыслового олигонуклеотида, связывающего тот же участок РНК.
Рибозим по данному изобретению, например ферментативная молекула РНК рибозима, может находиться в форме мотива в виде головки молотка, мотива в виде шпильки, как мотив вируса гепатита дельта, мотив интрона группы Ι и/или в форме РНК, подобной РНКазе Р в ассоциации со вспомогательной последовательностью РНК. Примеры мотивов в виде головки молотка описаны, например, КоззД (1992) АГО8 Кезеагсй апб Нитап КеДгоуДгизез 8:183; мотивов в виде шпильки в Натре1 (1989) ВДосйетДзДгу 28:4929 и Натре1 (1990) Мс. АсДбз Кез., 18:299; мотив вируса гепатита дельта в Реггойа (1992) ВДосйетДзДгу 31:16; мотив РНКазы Р в Сиеглег-Такаба (1983) Се11. 35:849 и интрон группы Ι в патенте США № 4987071, выданном Сесй. Перечисление этих конкретных мотивов не предназначено для ограничения. Специалистам в данной области будет понятно, что рибозим по данному изобретению, например ферментативная молекула РНК по данному изобретению, может обладать специфичным участком связывания субстрата, комплементарным одному или нескольким участкам РНК гена-мишени. Рибозим по данному изобретению может иметь нуклеотидную последовательность в этом участке связывания субстрата или рядом с ним, которая придает молекуле активность в отношении расщепления РНК.
Интерференция РНК (ΡΗΚΐ)
В одном аспекте данное изобретение относится к ингибиторной молекуле РНК, так называемой молекуле РНКД, содержащей последовательность по данному изобретению. Молекула РНКД содержит двухцепочечную молекулу РНК (бзРНК). РНКД может ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), например, как описано в данном описании. В одном аспекте длина РНКД составляет приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов. Поскольку данное изобретение не ограничивается конкретным механизмом действия, РНКД может проникать в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (ззРНК) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. Если клетка подвергается воздействию двухцепочечной РНК (бзРНК), мРНК гомологичного гена селективно деградируется в процессе, называемом интерференцией РНК (РНКД). Возможный основной механизм, помимо РНКД, представляет собой разрушение двухцепочечной РНК (бзРНК), совпадающей со специфичной последовательностью гена на короткие фрагменты, называемые короткими интерферирующими РНК, которые запускают деградацию мРНК, которая совпадает с их последовательностью. В одном аспекте РНКД по данному изобретению используется в лекарственных средствах для подавления генов, см., например, 8йиеу (2002) Эгид ОДзсоу. Тобау, 7:1040-1046. В одном аспекте данное изобретение относится к способам селективной деградации РНК с использованием РНКД по данному изобретению. Способ может быть осуществлен Дп уДДго, ех уДуо или Дп уДуо. В одном аспекте молекулы РНКД по данному изобретению могут быть использованы для получения мутации с потерей функции в клетке, органе или животном. Способы получения и использования молекул РНКД для селективной деградации РНК хорошо известны в данной области, см., например, патенты США № 6506559; 6511824; 6515109; 6489127.
Модификация нуклеиновых кислот
Данное изобретение относится к способам получения вариантов нуклеиновых кислот по данному изобретению, например вариантов, кодирующих полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), например, описанных в данном описании ферментов. Эти способы могут повторяться или использоваться в различных комбинациях для получения полипептидов, вовлеченных в катаболизм хлорофилла или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы) с измененной или отличающейся активностью или с измененной или отличающейся стабильностью относительно активности и стабильности фермента, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. Эти способы также могут повторяться или использоваться в различных комбинациях, например, для получения изменений в экспрессии гена/транскрипта, трансляции транскрипта или стабильности транскрипта. В другом аспекте генетический набор клетки изменяют, например, посредством модификации гомологичного гена ех уДуо с последующим повторным встраиванием в клетку.
Нуклеиновая кислота по данному изобретению может быть изменена любыми способами. Например, случайными или стохастическими способами, или неслучайными способами, или способами на
- 44 013993 правленных изменений, см., например, патент США № 6361974. Способы случайных мутаций в генах хорошо известны в данной области, см., например, патент США № 5830696. Например, для случайной мутации в гене могут быть использованы мутагены. Мутагены включают, например, облучение ультрафиолетовым светом или гамма-облучение, или химический мутаген, например митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, отдельно или в сочетании, для индуцирования повреждений ДНК, поддающихся репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены представляют собой аналоги нуклеотидных предшественников, например нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Эти вещества могут быть добавлены в реакцию ПЦР вместо нуклеотидных предшественников, вызывая, таким образом, мутации в последовательности. Также могут быть использованы интеркалирующие вещества, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т. п.
Может быть использована любая технология молекулярной биологии, например случайный мутагенез посредством ПЦР, см., например, Ктсе (1992) Ргос. №И. Асаб. 8с1., И8А, 89:5467-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, см., например, Статей (1995) Втксйтдиек, 18:194-196. Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например гены, могут быть повторно собраны после случайной или стохастической фрагментации, см., например, патенты США № 6291242; 6287862; 6287861; 5955358; 5830721; 5824514; 5811238; 5605793. В альтернативных аспектах модификации, вставки или делеции вводят с помощью ПЦР с пониженной точностью, шаффлинга, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, объединяющей ПЦР, мутагенеза с помощью половой ПЦР, мутагенеза ш νίνΌ, кассетного мутагенеза, возвратно-множественного мутагенеза, экспоненциально-множественного мутагенеза, сайтспецифического мутагенеза, повторной сборки гена, мутагенеза с насыщением сайтов гена™ (С88М™), синтетической повторной сборки лигированием (8ЬВ), рекомбинации, рекомбинации возвратной последовательности, мутагенеза модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенеза с содержащей урацил матрицей, мутагенеза с содержащими разрывы дуплексами, мутагенеза с репарацией точек несоответствия, мутагенеза с дефектом репарации цепи хозяина, химического мутагенеза, мутагенеза радиогенного происхождения, мутагенеза с делецией, мутагенеза с рестрикцией и селекцией, мутагенеза с рестрикцией и исправлением ошибок, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, получением химерного мультимера нуклеиновой кислоты и/или сочетанием этих и других способов.
Следующие ниже публикации описывают различные возвратные рекомбинационные методики и/или способы, которые могут быть включены в способы по данному изобретению: 8!еттег (1999) Мо1еси1аг Ьгеебтд оГ уйикек Гог !агде!тад апб о!йег с11шса1 ргорегйек, Титог Тагдейпд, 4:1-4; №кк (1999) Наине Вю1ес1по1оду, 17:893-896; С1апд (1999) Еνο1ийοη оГ а су!октае иктд ЭКА Гатбу кйиГйтд, ^кге Вю1есйпо1оду, 17:793-797; Мтак1ш11 (1999) Ргокт еνο1ийοη Ьу то1еси1аг Ьгеебтд, Сиггеп! 0рштп ш С1ет1са1 Вт1оду, 3:284-290; СНпкбапк (1999) Э1гес!еб еνο1ийοη оГ !11ут1бтае ктаке Гог А2Т ркокрНогукШоп иктд ^NА Гатбу кйиГйтд, Вюксйпо1оду, 17:259-264; Сгатеп (1998) ^NА ккиГПтад оГ а Гатйу оГ депек
Ггот б+егке крес1ек ассе1ега!ек бйес!еб еνο1ийοη, ^ΐω^, 391:288-291; Сгатеп (1997) Мо1еси1аг еνο1ийοη оГ ап агкепак бе!ох1Пса!юп ра!11\гау Ьу кШЙтд, ^кге Втксйпо1оду, 15:436-438; 21апд (1997) Όίгес!еб еνο1иΐ^οη оГ ап еГГесбхе Гисойбаке Ггот а да1ас!ок1баке Ьу кйиГйтд апб ксгеешпд, Ргос. №111.
Асаб. 8ск, И8А, 94:4504-4509; Райеп е! а1. (1997) АррЕсабопк оГ 8Ьи.ГП1пд !о Рйагтасеийса1к апб
Vасс^ηек, Сиггеп! 0ршюп т Вт1есйпо1оду, 8:724-733; Сгатеп е! а1. (1996) Сопкйисбоп апб еνο1иΐ^οη оГ апйЬобу-рйаде НЬгапек Ьу кйиГйтд, ^кге Мебкте, 2:100-103; Са!ек е! а1. (1996) АГПп11у ке1есбуе
1ко1айоп оГ Ндапбк Ггот рерйбе НЬгапек Шгоидй б1кр1ау оп а 1ас гергекког йеабр1есе б1ттег, 1оигпа1 оГ Мо1еси1аг Вт1оду, 255:373-386; 8!еттег (1996) 8ехиа1 РСК апб АккетЬ1у РСВ, Ш: Т1е Епсус1ореб1а оГ Мо1еси1аг Вт1оду. νΟΗ РиЬйкйегк, №\ν Уогк, р. 447-457; Сгатеп апб 8!еттег (1995) СотЬта!опа1 ти1бр1е сакке!!е ти!адепек1к сгеа!ек а11 !1е регти!айопк оГ ти1ап! апб \\'Пб!уре саккейек, ВюТесйтдиек, 18:194-195; 8!еттег е! а1. (1995) 81пд1е-к1ер аккетЬ1у оГ а депе апб епйге р1акт1б Гогт 1агде питЬегк оГ ойдобеохупЬопис1еойбек, Сепе, 164:49-53; 8!еттег (1995) Т1е Еνο1иΐ^οη оГ Мо1еси1аг Сотри1айоп, 8с1епсе, 270: 1510; 8!еттег (1995) 8еагсЫпд 8ес.|иепсе 8расе, Вю/Тесйпо1оду, 13:549-553; 8!еттег (1994) Вар1б еνο1ийοη оГ а рго!ет ш νίΐΐΌ Ьу ^NА кйиГйтд, ^кге 370:389-391 и 8!еттег (1994) ^NА кйиГйтд Ьу гапбот Ггадтеп!айоп апб геаккетЬ1у: Ш νίΐΐΌ гесотЬтайоп Гог то1еси1аг е^'о^топ., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8А, 91:1074710751.
Способы внесения мутаций для получения разнообразия включают, например, сайт-направленный мутагенез (Ьтд е! а1. (1997) Арргоасйек !о ^NА ти!адепек1к: ап ονе^ν^еν, Апа1. Вюсйет., 254(2):157-178; Эа1е е! а1. (1996) 011допис1еойбе-б1гес1еб гапбот ти!адепек1к иктд Ше р1юкр1того!1иоа!е теНоб, Ме!1юбк Мо1. В1о1., 57:369-374; 8тйй (1985) Ш νίΐΐΌ ти1адепек1к, Апп. Йех. Сепе!., 19:423-462; Во1к1ет & 81юг!1е (1985) 8йа1ед1ек апб аррйсайопк оГ ш +11го ти1адепек1к, 8с1епсе, 229:1193-1201; Сайег (1986) 8йе-б1гес!еб ти1адепек1к, Вюсйет. I., 237:1-7 и Кипке1 (1987) Т1е еГйтепсу оГ ойдопис1еойбе бйескб ти1адепек1к, ш Шекк: Ас1бк & Мо1еси1аг Вт1оду (Ескккт Р. апб ЬШеу Э.М.1. ебк., 8рйпдег Vе^1ад, Вейт)); мутагенез с содержащими урацил матрицами (Кипке1 (1985) Вар1б апб еГйаеп! кйе-кресгйс ти!адепек1к \\Д1юи! рйепо!урю ке1есйоп, Ргос. №6. Асаб. 8сг, И8А, 82:488-492; Кипке1 е! а1. (1987) Вар1б апб еГПаеп! кйе-кресгйс тиЩдепейк \\й1юи! р11епо!урю ке1есйоп, Ме!1юбк т ЕпхутоВ 154,367-382 и Вакк е! а1. (1988) Ми!ап! Тгр
- 45 013993 гергеккегБ \νί11ι пе\у ΟΝΑ-όίηάίηβ кресШсйгек, Заеисе, 242:240-245); олигонуклеотид-направленный мутагенез (Мебюбк ίη Εиζутο1., 100:468-500 (1983); Мебюбк ίη Εиζутο1., 154:329-350 (1987); Ζο1Εγ (1982) О1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб тиίадеηек^к иктд М13-бепхеб уесЮгк: аη еГПс1егИ аиб деиега1 ргасебиге Γογ Не ргобис1юг1 οΓ ρο^ηί тиίаί^οηк ίη аиу ΌΝΑ ГгадтеШ, №с1ею Лабк. Век. 10:6487-6500; Ζο1Βγ & Зтйк (1983) О1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб тиίадеηек^к οΓ ΌΝΑ ВадтегИк скиеб ίηΐο М13 уесЮгк, Мебюбк ίη Εиζутο1., 100:468-500 и Ζο1Βγ (1987) О1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб тиίадеηек^к: а к1тр1е тебюб иктд 1\\ό ο1^дοηис1еοί^бе рптегк аиб а к^ηд1е-кί^аηбеб ΌΝΑ 1етр1а1е, Мебюбк ίη Εиζутο1., 154:329-350); мутагенез с модификацией ДНК фосфоротиоатом (Την1οΓ (1985) Т1е ике οΓ ρкοкρкο^οίк^οаίе-тοб^П^еб ΌΝΑ ίη гек1пс1юг1 еиζуте геас1юик ίο ргераге шскеб ΌΝΑ, №с1. Век., 13:8749-8764; Την1οΓ (1985) Т1е гар1б деηе^аί^οη οΓ ο1ί§οηιιс1еοί^бе-б^^есίеб тиίаί^οηк а! Ыдк Ведиему иктд ρкοкρкο^οίк^οаίе-тοб^П^еб ΌΝΑ, №с1. Лс^бк Век., 13:8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) ΙιΗίόίίίοη οΓ гек1пс1юг1 еηбοηис1еаке Να I с1еаνаде Ьу р1юкρкο^οίк^οаίе дгоирк аиб 11к аррИстти ίο ο1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб т^аде^^к, №с1. Лс^бк Век., 14:96799698; Зауегк (1988) Υ-Τ Εχοη^^^ ίη ρкοкρкο^οίк^οаίе-Ьакеб ο1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб т^аде^^к, №с1.
Век., 16:791-802 и Зауегк е1 а1. (1988) ЗВаиб креаПс с1еаνаде οΓ ρкοкρкο^οίк^οаίе-сοηίа^и^ηд ΌΝΑ Ьу геас1юг1 \\йк гск1пс1юп еηбοηис1еакек ίη Не ргекеисе οΓ ебибшт Ьгот1бе, №с1. Век., 16:803-814);
мутагенез с использованием разрывов в дуплексе ДНК (Кгатег е1 а1. (1984) Τке дарреб бир1ех ΌΝΑ арргоаск ίο ο1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб тиίаί^οη сοиκι^исι^οи. Ииск Век., 12:9441-9456; Кгатег & Ρτίίζ (1987) Μеίкοбк ίη Επζутο1. О1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб ^^Β^ύοη οΓ тиίаί^οηк νίη дарреб бир1ех ΌΝΑ, 154:350-367; Кгатег (1988) киргогеб еπζутаί^с ίη νίίτο ^еасί^οηк ίη Не дарреб бир1ех ΌΝΑ арргоаск ίο ο1ίдοηис1еοί^бе-б^^есίеб ^^ύπ^ίοη οΓ тиίаί^οηк, Νπο1. Век., 16:7207 и Ρτίίζ (1988) О1^дοηис1еοί^бебйес1еб οΓ тиίаί^οηк: а дарреб бир1ех ΌΝΑ ргасебиге ^ίΐίουί еиζутаί^с ^еасί^οηк ίη νίίτο, Νπο1.
Век. 16:6987-6999).
Дополнительные протоколы, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения, включают репарацию ошибочно спаренных оснований (Кгатег (1984) Ροίηί М1кта1ск ВераВ, Се11. 38:879-887), мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефектной репарацией (СаВег еί а1. (1985) 1трго\'еб ο1^дοηис1еοί^бе кйе-бйес1еб тиίадеηек^к иктд М13 хесгагк, Кис1. Век., 13:4431- 4443 и айег (1987) 1тргохеб ο1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб тиίадеηек^к иктд М13 νесίο^к, Μеίкοбк ίη Επζутο1., 154:382-403), мутагенез с делециями (НдВебагаабек (1986) Ике οΓ ο1^дοηис1еοί^бек ίο деηе^аίе 1агде бе1е1юпк, №с1. Лс^бк Век., 14:5115), рестрикцию с селекцией, и рестрикцию с селекцией и рестрикцией с исправлением ошибок ^е11к еί а1. (1986) Iтρο^ίапсе οΓ куб^οдеη-Ьοηб ΓοταπΙιοη ίη к1аЫПтд Не Вппкйюп кίаίе οΓ киЬйккт, Ρ1η1. ^аик. В. 8οс. Όοπ6., Α 317:415-423), мутагенез посредством синтеза целого гена (№тЫаг еί а1. (1984) ΤοΙη1 кугйкеак аиб скитд οΓ а деие отбИд Γογ Не ^^Ьοηис1еаке З ρ^οίе^η, Заеисе, 223:1299-1301; Закатаг (1988) ΤοΙη1 кугйкеак аиб ехргеккюи οΓ а деие Γογ Не а-киЬиπ^ί οΓ Ьον^ηе гоб οиίе^ кедтегй диашие ηис1еοί^бе-Ь^ηб^ηд ρ^οίе^η (Ваикбист), Кис1. Век., 14:6361-6372; Vе11к еί а1. (1985)
Саккейе ти1адеиек1к: аи еΓΓ^с^еηί теίкοб Γογ деηе^аί^οη οΓ ти1йр1е пшйПюпк а1 беПиеб кВек, Сеие, 34:315323 и Сг1.тбк1гот еί а1. (1985) О1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб ти1адеиек1к Ьу иисгокса1е 'ккοί-диη' деие кугИкеак, Кис1. Век., 13:3305-3316), репарацию двухцепочечных разрывав (Маибеск1 (1986); Αγπο16 (1993)
Ρ^οίе^η еидтеегтд Γογ иηикиа1 еην^^οπтеηίк, СиггегИ Оршюи ίη Β^οίескπο1οду, 4:450-455; О1^дοηис1еοί^бебйес1еб бοиЬ1е-кί^аπб Ьгеак гераВ ίη р1акт1бк οΓ Б^келсИа отк: а теίкοб Γογ кйе-креаПс шНаде^^к, ΡΐΌα №11. Лсаб. Зск, 83:7177-7181). Дополнительные детали многих из приведенных выше методов можно найти в Μеίкοбк ίη Εпζутο1οду, ν.154, где также описаны приемлемые способы контроля проблем поиска повреждений при различных способах мутагенеза.
Протоколы, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения, описаны, например, в патенте США № 5605793, выданном З1еттег (25 февраля 1997 года), Μеίкοбк Γογ Ιη νίίτο ВесοтЬ^ηаί^οη; в патенте США № 5811238, выданном З1еттег еί а1. (22 сентября 1998 года), Μеίкοбк Γογ СеиепЦтд Ρο1уηис1еοί^бек кахтд Оекйеб Скагас1епкйск Ьу Iίе^аί^νе Зе1ес1юг1 аиб ВесοтЬ^ηаί^οη; в патенте США № 5830721, выданном З1еттег еί а1. (3 ноября 1998 года), ΌΝΑ Ми1адеиек1к Ьу Вапбοт ЕгадтеШаίίοη аиб ВеаккетЬ1у; в патенте США № 5834252, выданном З1еттег еί а1. (10 ноября 1998 года), Επ6Сοтρ1етеηίа^у Ρο1уте^аке Веас1юг1; в патенте США № 5837458, выданном Мткки11 еί а1. (17 ноября 1998 года), Μеίкοбк аиб Сοтροк^ί^οηк Γογ Се11и1аг аиб ΜеίаЬο1^с Εηд^ηее^^ηд; νθ 95/22625, З1еттег и Сгатеп, Ми1адеиек1к Ьу Ваηбοт Ρ^адтеηίаί^οη аиб ВеаккетЬ1у; νθ 96/33207, З1еттег и ЫркскиВ, Επ6 ^трктеНагу Ρο1уте^аке Скат Веас1юг1; νθ 97/20078, З1еттег и Сгатеп, Μеίкοбк Γογ Сег1ега1тд Ρο^η^^ο(1бек кахтд Оекйеб Скагас1епкйск Ьу Iίе^аί^νе Зе1есί^οη аиб ВесοтЬ^ηаί^οη; νθ 97/35966, Мткки11 и Зίетте^, Μеίкοбк аиб Сοтροк^ί^οηк Γογ Се11и1аг аиб ΜеίаЬο1^с Εηд^ηее^^ηд; νθ 99/41402 Ριιηηοικη еί а1., Τι^6^ οΓ Сеие^с νη^ίι^ Vесίο^к; νθ 99/41383, Ριιηηοικη еί а1., Лηί^деη ЫЬгагу Iттиπ^ζаί^οη; νθ 99/41369, Ριιηηοικη еί а1., Сеиекс Vасс^ηе Vесίο^ Εηд^ηее^^ηд; νθ 99/41368, Ριιηηοικη еί а1., Оρί^т^ζаί^οη οΓ Iттиηοтοби1аίο^у Ρ^ορе^ί^ек οΓ Сеиекс Vасс^ηек; ΕΡ 752008, З1еттег и Сгатеп, ΟΝΑ Μиίадеηек^к Ьу Ваηбοт Ρ^адтеηίаί^οη аиб ВеаккетЬ1у; ΕΡ 0932670, З1еттег Ενο1νί^ Се11и1аг ΌΝΑ υρίаке Ьу ВесигкЕе Зедиеисе ВесοтЬ^ηаί^οη; νθ 99/23107, З1еттег еί а1., Μοб^Γ^саί^οη οΓ Vгик Τ^ορ^кт аиб ΗοΒ Ваиде Ьу νία1 Сегюте ЗкиП1й1д; νθ 99/21979, Лρί еί а1., Нитаи Ρаρ^11οтаν^^ик Vесίο^к; νθ 98/31837 бе1 Сагбауге еί а1., Ενο1ιιΙίοη οΓ ν^Β Се11к аиб Огдатктк Ьу ВесигкВе Зедиеисе ВесοтЬ^ηаί^οη; νθ 98/27230, Ρайеη аиб Зίетте^, Μеίкοбк аиб Сοтροк^ί^οηк Γογ Ρο1уρеρί^бе Εηд^ηее^^ηд; VО 98/27230, З1еттег еί а1., Μеίкοбк
- 46 013993 йог Ор11т1/а!1оп ой Сене ТЫегару Ьу КесигкКе 8едиепсе 8Ыиййшд апб 8е1ес!1оп, νθ 00/00632, Мебюбк йог Сепегайпд Н1дЫу Ргуегке ЫЬгапек, νθ 00/09679, Ме!Ыобк йог ОЬ!а1шпд ίη ΥίΙτο КесотЬтеб Ро1упис1еоЕбе 8едиепсе Βаηкк апб КекиШпд 8едиепсек, νθ 98/42832, Ато1б е! а1., КесотЬ1па!1оп ой Ро1упис1еойбе 8едиепсек Икшд Капбот ог РеЕпеб Рптегк, νθ 99/29902, Ато1б е! а1., Ме!Ыоб йог Сгеайпд Ро1упис1ео!1бе апб Ро1урер11бе 8едиепсек, νθ 98/41653, Утб, Ап ίη Уйго Ме!Ыоб йог Сопкйис!юп ой а ^NΑ ЫЬгагу, νθ 98/41622, ВогсЫей е! а1., Ме!Ыоб йог Сопк!гис!шд а ЫЬгагу Икшд ^NΑ 8Ыиййтд и νθ 98/42727, Ра!1 и 2аг11пд, 8едиепсе А1!ега!юпк икшд Ното1одоик КесотЬта!юп.
Протоколы, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (в которых представлены детали различных способов получения разнообразия), описаны, например, в патентной заявке США № (υ88Ν) 09/407800, 811ЫТ1.1ХС1 ОР СОРО\ АЬТЕКЕР СЕ1ЧЕ8, Ра!!еп е! а1., поданной 28 сентября 1999 года; ЕУОЬиТЮХ ОР УПОРЕ СЕЬЬ8 АХО ОКСАХ18М8 ΒΥ КЕСиК81УЕ 8ЕС)Е'Е\СЕ КЕСО\1В1\АТ1О\. бе1 Сагбауге е! а1., в патенте США № 637 9964; ОЕ!СО\иСЕЕОТЮЕ МЕР1АТЕР \иОРЕ1С АСГО КЕСОМВЕИАТЮН Сгатеп е! а1., в патентах США № 6319714; 6368861; 6376246; 6423542; 6426224 и РСТ/и8 00/01203; и8Е ОР СОРО^УАШЕР ОЬЮОХиСЬЕОТГОЕ 8ΥNТНΕ8I8 РОК 8ΥNТНΕТIС 811ЕТТЕ1ХС1. Vе1сЫ е! а1., в патенте США № 6436675; МЕТНОР8 РОК МАК1ХС СНАКАСТЕК 8ТКШС8, РО^ΥNυС^ΕОТI^Ε8 & РО^ΥРΕРТI^Ε8 НАУ!\С РЕ81РЕР СНАКАСТЕК18Т1С8, 8е1йопоу е! а1., поданной 18 января 2000 года, (РСТ/и8 00/01202) и, например, МЕТНОР8 РОК МАКШС СНАКАСТЕК 8ТКГЫС8, РО^ΥNυС^ΕОТI^Ε8 & РО^ΥРΕРТI^Ε8 НАУ!\С РЕ81РЕР СНАКАСТЕК18Т1С8, 8е1й0поу е! а1., поданной 18 июля 2000 года (серийный номер США № 09/618579); МЕТНОР8 ОР РОРи1.АТ1\С1 РАТА 8ТКиСТиКЕ8 РОК и8Е ΙΝ ЕА’С)1.иТ1О\А1Ы 81МиРАТ1О\8. 8е11йопоу и 8!еттег, поданной 18 января 2000 года (РСТ/и8 00/01138) и 8INС^Ε-8ТКΑN^Ε^ НиСЕЕ1С АСГО ТЕМРЬАТЕ- МЕР1АТЕР КΕСОМΒINΑТIОN А\Р \иОРЕ1С АСГО РКАСМЕКГ 18О1.АТ1О\. АйЫо1!ег, поданной. 6 сентября 2000 года (серийный номер США № 09/656549); в патентах США № 6177263;6153410.
Нестохастические способы или направленные изменения включают, например, мутагенез с насыщением сайтов гена (С88М), синтетическую повторную сборку лигированием (8ЬК) или их комбинации, используются для модификации нуклеиновых кислот по данному изобретению для получения полипептидов, вовлеченных в катаболизм хлорофилла или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), с новыми или измененными свойствами (например, активность в высоко кислых или щелочных условиях, при высоких и низких температурах и т.п.). Для полипептидов, кодируемых модифицированными нуклеиновыми кислотами, может быть проведен скрининг на наличие активности перед испытанием на гидролиз глюкана или другого полисахарида, или другую активность. Могут быть использованы любые приемы или протоколы, например использование капиллярной платформы для матрицы. См., например, патенты США № 6361974; 6280926; 5939250.
Мутагенез с насыщением сайтов гена (С88М)
В одном аспекте праймеры с кодонами, содержащие вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, используются для внесения точковых мутаций в полинуклеотид, например нуклеиновую кислоту по данному изобретению, так чтобы получить ряд производных полипептидов, в которых в каждом положении аминокислоты представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен, например для модификации выбирают аминокислотный остаток в активном центре фермента (каталитические домены (СР)) или участке связывания лиганда. Эти олигонуклеотиды могут содержать смежную первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, и необязательно вторую гомологичную последовательность.
Расположенные ниже производные продукты трансляции, полученные в результате применения таких олигонуклеотидов, включают все возможные замены аминокислот в любом положении аминокислоты на протяжении полипептида вследствие того, что вырожденные последовательности Ν,Ν,Ο/Т включают кодоны для всех 20 аминокислот. В одном аспекте один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий, например, одну вырожденную кассету Ν,Ν,Ο/Т) используется для того, чтобы подвергать любой исходный кодон исходной полинуклеотидной матрицы полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используются по меньшей мере две кассеты - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергать по меньшей мере два исходных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Например, может быть получено более одной последовательности Ν,Ν,Ο/Т в одном олигонуклеотиде для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. В этом множестве последовательностей Ν,Ν,Ο/Т могут быть непосредственно смежными или отделенными одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте могут быть использованы олигонуклеотиды, подходящие для внесения вставок или делеций либо отдельно, либо в комбинации с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ο/Т, для внесения любой комбинации или перестановки аминокислотных вставок, делеций и/или замен.
В одном аспекте одновременный мутагенез в двух или более смежных положениях аминокислот проводят с использованием олигонуклеотида, который содержит смежные триплеты Ν,Ν,Ο/Т, т.е. вырожденную последовательность (Ν,Ν,Ο/Γ)η. В другом аспекте используются вырожденные кассеты с вырожденностью, меньшей чем вырожденность последовательности Ν,Ν,Ο/Т. Например, может быть жела
- 47 013993 тельно в некоторых случаях использовать (например, в олигонуклеотиде) вырожденную триплетную последовательность, содержащую только один Ν, где указанный N может находиться в первом, втором или в третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета могут быть использованы любые другие основания, включая любые их комбинации или перестановки. Альтернативно, в некоторых случаях может быть желательно использовать (например, в олигонуклеотидах) вырожденную триплетную последовательность Ν,Ν,Ν.
В одном аспекте использование вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν^/Τ) делает возможным систематическое и легкое получение полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) в любом положении аминокислоты в полипептиде (в альтернативных аспектах способы также включают получение менее чем всех возможных замен в положении аминокислотного остатка или кодона). Например, для полипептида из 100 аминокислот может быть получено 2000 различных образцов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). Используя олигонуклеотид или набор олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν^/Τ, все 20 возможных природных аминокислот могут кодироваться 32 отдельными последовательностями. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходная полинуклеотидная последовательность подвергается мутагенезу с насыщением, при использовании по меньшей мере одного такого олигонуклеотида образуются 32 различных производных полинуклеотида, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида при сайт-направленном мутагенезе приводит к получению только одного производного полипептидного продукта в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды могут необязательно использоваться в комбинации с описанными вырожденными праймерами; например могут быть использованы невырожденные олигонуклеотиды для получения конкретных точковых мутаций в функционирующем полинуклеотиде. Это обеспечивает один из способов получения конкретных молчащих точковых мутаций, точковых мутаций, приводящих к соответствующему изменению аминокислоты, и точковых мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.
В одном аспекте в каждом реакционном сосуде для мутагенеза с насыщением содержатся полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул производных полипептидов (например, полипептидов по данному изобретению, вовлеченных в катаболизм хлорофилла или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы)), так чтобы все 20 природных аминокислот были представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, в который в исходном полинуклеотиде была внесена мутация (в других аспектах используется менее чем все 20 природных комбинаций). Вырожденные 32-кратно производные полипептиды, полученные из реакционного сосуда после каждого мутагенеза с насыщением, могут подвергаться клональной амплификации (например, могут быть клонированы в подходящем хозяине, например, в хозяине Е. сой, с использованием, например, экспрессирующего вектора) и могут подвергаться анализу экспрессии. Если при анализе идентифицируется, что отдельный производный полипептид проявляет положительные изменения свойств (таких как повышенный гидролиз глюкана, активность в щелочных или кислых условиях при сравнении с исходным полипептидом), он может быть секвенирован для идентификации соответствующей положительной аминокислотной замены, находящейся в нем.
В одном аспекте при внесении мутации в любое положение аминокислоты исходного полипептида с использованием мутагенеза с насыщением, как описано в данном описании, положительные изменения аминокислот могут быть идентифицированы в более чем одном положении аминокислоты. Могут быть получены одна или несколько новых производных молекул, которые содержат комбинацию всех или части из этих положительных аминокислотных замен. Например, если 2 конкретных положительных изменения аминокислот идентифицировано в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой, и в каждом из двух положений) и в 3 положениях. Таким образом, существует 3x3x3 или 27 конечных возможностей, включая 7, которые были ранее рассмотрены - 6 единичных точковых мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.
В еще одном аспекте мутагенез с насыщением сайта можно использовать совместно с шаффлингом, химеризацией, рекомбинацией и другими способами внесения мутаций, совместно со скринингом. Данное изобретение относится к многократному использованию любого способа(ов) внесения мутаций, включая мутагенез с насыщением. В одном иллюстративном примере многократное использование любого процесса(ов) внесения мутаций используется в сочетании со скринингом.
Данное изобретение также относится к использованию праймеров с собственными кодоками (содержащими вырожденные последовательности Ν,Ν,Ν) для внесения точковых мутаций в полинуклеотид, так чтобы получить ряд производных полипептидов, в которых в любом положении аминокислоты представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен (мутагенез с насыщением сайтов гена™ (С88М™)). Используемые олигонуклеотиды содержат смежные первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ν и в одном аспекте, но необязательно, вторую гомологичную последовательность. Расположенные ниже производные продукты трансляции при использова
- 48 013993 нии таких олигонуклеотидов включают все возможные аминокислотные изменения в любом положении аминокислоты на протяжении полипептида, вследствие того что вырожденная последовательность N,N,N включает кодоны для всех 20 аминокислот.
В одном аспекте один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий одну вырожденную кассету используется для того, чтобы подвергать любой оригинальный кодон в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используются по меньшей мере две вырожденных кассеты N,N,N - либо в одном олигонуклеотиде, либо в разных, для того чтобы подвергать по меньшей мере два оригинальных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Таким образом, в одном олигонуклеотиде может содержаться более одной последовательности N,N,N для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. Это множество последовательностей N,N,N может быть непосредственно смежным или разделенным одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, подходящие для внесения вставок или делеций, могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность для внесения любой комбинации или перестановки аминокислотных вставок, делеций и/или замен.
В конкретном иллюстративном примере возможно одновременное внесение мутаций в два или более смежных положения аминокислот с использованием олигонуклеотида, который содержит смежные триплеты т.е. вырожденную последовательность
В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию вырожденных кассет с меньшей вырожденностью, чем вырожденность последовательности Например, в некоторых случаях может быть желательно использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, содержащей только один N где N может находиться в первом, втором или третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета могут быть использованы любые другие основания, включая любые их комбинации и перестановки. Альтернативно, в некоторых случаях может быть желательно использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности триплетных последовательностей N,N,6/7 или N,N,6/6.
Следует понимать, однако, что использование вырожденного триплета (такого как триплетная последовательность N,N,6/7 или М^О/С), как описано в соответствии с настоящим изобретением, является предпочтительным по нескольким причинам. В одном аспекте данное изобретение относится к способам систематического и довольно простого получения замены с полным диапазоном возможных аминокислот (всего 20 аминокислот) в любом положении аминокислоты в полипептиде. Таким образом, в случае полипептида из 100 аминокислот данное изобретение относится к способу систематического и довольно простого получения 2000 различных образцов (т. е. 20 возможных аминокислотных перестановок на одно положение в 100 аминокислотных положениях). Следует понимать, что при использовании олигонуклеотида, содержащего вырожденную триплетную последовательность N,N,6/7 или N,N,6/6 образуется 32 отдельных последовательности, которые кодируют 20 возможных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходная полинуклеотидная последовательность подвергается мутагенезу с насыщением, при использовании одного такого олигонуклеотида образуется 32 различных производных полинуклеотида, содержащих 20 различных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида при сайт-направленном мутагенезе приводит к получению только одного производного полипептидного продукта в реакционном сосуде.
Данное изобретение также относится к использованию невырожденных олигонуклеотидов, которые могут необязательно использоваться в комбинации с описанными вырожденными праймерами. Следует понимать, что в некоторых случаях предпочтительным является использование невырожденных олигонуклеотидов для получения конкретной точковой мутации в функционирующем полинуклеотиде. Это обеспечивает способы получения конкретных молчащих точковых мутаций, точковых мутаций, приводящих к соответствующим изменениям аминокислоты, и точковых мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.
Таким образом, в одном аспекте данного изобретения каждый реакционный сосуд для мутагенеза с насыщением содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 производных полипептидных молекул, так чтобы все 20 аминокислот были представлены в одном конкретном аминокислотном положении, соответствующем положению кодона, в который в исходном полинуклеотиде вносится мутация. Вырожденные 32-кратно производные полипептиды, образующиеся при каждой реакции мутагенеза с насыщением, могут подвергаться клональной амплификации (например, могут быть клонированы в подходящем хозяине Е. со11 с использованием экспрессирующего вектора) и могут подвергаться скринингу экспрессии. Если при скрининге идентифицируется, что отдельный производный полипептид проявляет положительное изменение свойства (при сравнении с исходным полипептидом), он может быть секвенирован для идентификации соответствующей положительной аминокислотной замены, находящейся в нем.
Следует понимать, что при внесении мутации в любое положение аминокислоты исходного полипептида с использованием мутагенеза с насыщением, как описано в данном описании, положительные изменения аминокислот могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении.
- 49 013993
Могут быть получены одна или несколько новых производных молекул, которые содержат комбинацию всех или части из этих положительных аминокислотных замен. Например, если 2 конкретных положительных изменения аминокислот идентифицировано в каждом из трех 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой и в каждом из двух положений) и в 3 положениях. Таким образом, существует 3x3x3 или 27 конечных возможностей, включая 7, которые были ранее рассмотрены - 6 единичных точковых мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.
Таким образом, в неограничивающем иллюстративном примере данное изобретение относится к использованию мутагенеза с насыщением в сочетании с дополнительным процессом внесения мутаций, таким как процесс, где два или более сходных полинуклеотида вводятся в подходящую клетку-хозяина, так что образуется гибридный полинуклеотид при рекомбинации и редуктивной рекомбинации.
В дополнение к осуществлению мутагенеза на протяжении всей последовательности гена настоящее изобретение предполагает, что мутагенез может быть использован для замены каждого из любого числа оснований в полинуклеотидной последовательности, где число оснований для внесения мутаций в одном аспекте представляет собой любое от 15 до 100000. Таким образом, вместо внесения мутаций в каждое положение на протяжении молекулы можно подвергать мутагенезу любое основание или отдельное число оснований (в одном аспекте подгруппу, вмещающую от 15 до 100000). В одном аспекте на протяжении полинуклеотидной последовательности для внесения мутации в каждое положение или в группу положений используется отдельный нуклеотид. Группа из 3 положений, предназначенная для внесения мутации, может представлять собой кодон. Мутации могут быть внесены с использованием мутагенного праймера, содержащего гетерологичную кассету, который также называется мутагенной кассетой. Иллюстративные кассеты могут иметь от 1 до 500 оснований. Каждое положение нуклеотида в таких гетерологичных кассетах представляет собой N А, С, С, Т, А/С, А/С, А/Т, С/С, С/Т, С/Т, С/С/Т, А/С/Т, А/С/Т, А/С/С или Е, где Е представляет собой любое основание, которое не является А, С, С или Т (Е может называться конструктором олигонуклеотида).
В широком смысле, мутагенез с насыщением включает внесение мутации с полным набором мутагенных кассет (где в одном аспекте длина каждой кассеты составляет приблизительно 1-500 оснований) в определенную полинуклеотидную последовательность, предназначенную для внесения мутаций (где в одном аспекте длина последовательности, предназначенной для внесения мутаций, составляет приблизительно от 15 до 100000 оснований). Таким образом, группа мутаций (находящаяся в диапазоне от 1 до 100 мутаций) вносится в каждую кассету для внесения мутаций. Группа мутаций, предназначенных для внесения в одну кассету, может отличаться или быть одинаковой со второй группой мутаций, которая вносятся во вторую кассету в процессе выполнения одного цикла мутагенеза с насыщением. Примерами таких групп являются кассеты с делециями, вставками, группами отдельных кодонов и группами отдельных нуклеотидов.
Определенные последовательности, предназначенные для внесения мутаций, включают целый ген, каскад, кДНК, целую открытую рамку считывания (0КР) и целый промотор, энхансер, репрессор/трансактиватор, ориджин репликации, интрон, оператор или любую полинуклеотидную функциональную группу. Как правило, определенные последовательности для этих целей могут представлять собой любой полинуклеотид, который представляет собой полинуклеотид из 15 оснований, и последовательности полинуклеотидов длиной от 15 оснований до 15000 оснований (в соответствии с данным изобретением конкретно указывается каждое число, находящееся между ними). Принципы выбора групп кодонов включают типы аминокислот, кодируемых вырожденной мутагенной кассетой.
В одном иллюстративном примере группы мутаций, которая может быть внесена в мутагенную кассету, данное изобретение конкретно относится к вырожденным заменам кодонов (с использованием вырожденных олигонуклеотидов), которые кодируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 аминокислот в каждом положении, и к библиотеке полипептидов, кодируемых ими.
Синтетическая повторная сборка лигированием (8ЬК)
Данное изобретение относится к системе нестохастической модификации гена, называемой синтетической повторной сборкой лигированием или просто ЗЬК, метод направленных изменений, для получения полипептидов, например ферментов по данному изобретению, с новыми или измененными свойствами.
ЗЬК представляет собой способ нестохастического лигирования олигонуклеотидных фрагментов друг с другом. Этот способ отличается от стохастического олигонуклеотидного шаффлинга тем, что структурные блоки нуклеиновой кислоты не перемещаются, соединяются или химеризуются случайным образом, а предпочтительно собираются нестохастически. См., например, патентную заявку США № (ИЗЗ^ 09/332835 с названием Зуп1Ие11с Ыдайоп КеаззетЬ1у т Ойес1е0 Еуо1и1юп, и поданную 14 июня 1999 года (υЗЗN 09/332835). В одном аспекте ЗЬК включает следующие стадии: (а) получение матричного полинуклеотида, где матричный полинуклеотид содержит последовательность, кодируемую гомологичным геном; (Ь) получение множества полинуклеотидов структурных блоков, где полинуклеотиды структурных блоков разработаны для перекрестной повторной сборки с матричным полинуклеотидом в предопределенной последовательности, и полинуклеотид структурного блока содержит последова
- 50 013993 тельность, которая представляет собой вариант гомологичного гена, и последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, фланкирующую последовательность варианта; (с) комбинирование полинуклеотида структурного блока с матричным полинуклеотидом, так чтобы полинуклеотид структурного блока перекрестно повторно собирался с матричным полинуклеотидом, с получением полинуклеотидов, содержащих варианты последовательностей гомологичного гена.
8ЬЯ не зависит от наличия высокого уровня гомологии между перемещающимися полинуклеотидами. Таким образом, этот способ может быть использован для нестохастического получения библиотек (или наборов) производных молекул, содержащих свыше 10100 различных химер. 8ЬЯ может быть использован для получения библиотек, содержащих свыше 101000 различных производных химер. Таким образом, аспекты по настоящему изобретению включают нестохастические способы получения набора окончательных химерных молекул нуклеиновых кислот с итоговым порядком сборки, который выбирается в соответствии с разработкой. Этот способ включает стадии получения в соответствии с разработкой множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, имеющих подходящие взаимно совместимые лигируемые концы, и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот, так чтобы полностью достигался разработанный порядок сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот, предназначенных для сборки, рассматриваются как пригодные для этого типа упорядоченной сборки, если они способны соединять структурные блоки в предопределенном порядке. Таким образом, весь порядок сборки, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот могут быть соединены, определяется конструкцией лигируемых концов. Если используется более одной стадии сборки, тогда весь порядок сборки, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот могут быть соединены, также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. В одном аспекте соединенные структурные фрагменты обрабатываются ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4), для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов.
В одном аспекте конструкцию олигонуклеотидных структурных блоков получают с помощью анализа набора матриц с исходной последовательностью нуклеиновой кислоты, которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов. Эти исходные олигонуклеотидные матрицы, таким образом, служат в качестве источника информации в последовательности, которая облегчает разработку структурных блоков нуклеиновых кислот, которые предназначены для внесения мутаций, например химеризации или перемещения. В одном аспекте данного способа последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот выравнивают, для того чтобы выбрать одну или несколько пограничных точек. Пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии, и они содержат один или несколько нуклеотидов. В одном аспекте эти пограничные точки являются общими по меньшей мере для двух исходных матриц. Таким образом, пограничные точки могут быть использованы для обозначения границ олигонуклеотидных структурных блоков, предназначенных для образования в целях перегруппировки исходных полинуклеотидов. Пограничные точки, идентифицированные и выбранные в исходных молекулах, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке конечных производных химерных молекул. Пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание), общую по меньшей мере для двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Альтернативно, пограничная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины исходных полинуклеотидных последовательностей, или она может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для двух третей исходных полинуклеотидных последовательностей. Более того, в одном аспекте пригодные пограничные точки представляют собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для трех четвертей полинуклеотидных последовательностей, или она может быть общей для почти всех исходных полинуклеотидных последовательностей. В одном аспекте пограничная точка представляет собой область гомологии, которая является общей для всех исходных полинуклеотидных последовательностей.
В одном аспекте повторную сборку лигированием осуществляют тщательно, чтобы получить исчерпывающую библиотеку производных химерных полинуклеотидов. Другими словами, все возможные упорядоченные комбинации структурных блоков нуклеиновых кислот представляются в виде набора конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, в другом аспекте порядок сборки (т. е. порядок присоединения каждого структурного блока в последовательности от 5' к 3' каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждой комбинации является запрограммированным (или нестохастическим), как описано выше. Вследствие нестохастической природы данного изобретения вероятность нежелательных побочных продуктов снижается.
В другом аспекте способ повторной сборки лигированием осуществляется систематически. Например, способ осуществляется с целью получения систематически разделенной библиотеки производных молекул с отделами, в которых систематически может быть проведен скрининг, например друг за другом. Другими словами данное изобретение предусматривает, чтобы посредством селективного и целесообразного использования структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном использовании последовательных постадийных реакций сборки, мог быть осуществлен
- 51 013993 замысел, где конкретный набор производных продуктов получают в любом из нескольких реакционных сосудов. Это делает возможным осуществление систематического исследования и скрининга. Таким образом, эти способы дают возможность систематически исследовать потенциально очень большое количество производных молекул в уменьшенных группах. Вследствие способности осуществлять химеризацию таким образом, что он является универсальным и в то же время исчерпывающим и систематическим, особенно при наличии низкого уровня гомологии среди исходных молекул, такие способы обеспечивают получение библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы повторной сборки лигированием в соответствии с настоящим изобретением производные молекулы, полученные в соответствии с одним аспектом, включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с таким порядком сборки, в целом, который выбран при разработке. Способы мутагенеза с насыщением и оптимизированного направленного изменения также могут быть использованы для получения различных молекулярных производных образцов. Следует понимать, что данное изобретение предусматривает свободу выбора и контроля в отношении пограничных точек, размера и количества структурных блоков нуклеиновых кислот и размера и конструкции соединенных элементов. Более того, следует понимать, что требование наличия межмолекулярной гомологии не являются особо строгими для удобства использования по данному изобретению. Более того, пограничные точки могут быть выбраны даже в областях небольшой межмолекулярной гомологии и при ее отсутствии. Например, вследствие качания кодонов, т. е. вырожденности кодонов, в структурный блок нуклеиновой кислоты могут быть внесены нуклеотидные замены без изменения аминокислоты, которая изначально кодируется в соответствующей исходной матрице. Альтернативно, может быть изменен кодон, так чтобы код для исходной аминокислоты изменялся. Данное изобретение предусматривает, что такие замены могут быть внесены в структурный блок нуклеиновой кислоты для повышения частоты межмолекулярных гомологичных пограничных точек и, таким образом, сделать возможным повышение количества соединений, которые происходят между структурными блоками, которые, в свою очередь, делают возможным получение большего количества производных химерных молекул.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к нестохастическому способу, называемому синтетической повторной сборкой гена, который в некоторой степени является сходным со стохастическим шаффлингом, за исключением того, что структурные блоки нуклеиновых кислот не перемещаются или соединяются, или химеризуются случайным образом, а предпочтительно собираются нестохастически.
Способ синтетической повторной сборки гена не зависит от наличия высокого уровня гомологии между перемещающимися полинуклеотидами. Данное изобретение можно использовать для нестохастического получения библиотек (или наборов) производных молекул, содержащих свыше 10100 различных химер. Возможно, синтетическую повторную сборку гена можно использовать даже при получении библиотек, содержащих свыше 101000 различных производных химер.
Таким образом, в одном аспекте данное изобретение относится к нестохастическому способу получения набора конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с итоговым порядком сборки, который выбирается в соответствии с разработкой, где способ включает стадии получения в соответствии с разработкой множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот с пригодными взаимно совместимыми лигируемыми концами и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот, чтобы полностью достигался разработанный порядок сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот, предназначенных для сборки, рассматриваются как пригодные для этого типа упорядоченной сборки, если они способны соединять структурные блоки в предопределенном порядке. Таким образом, в одном аспекте весь порядок сборки, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот могут быть соединены, определяется конструкцией лигируемых концов и, если используется более одной стадии сборки, тогда весь порядок сборки, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот могут быть соединены, также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. В одном аспекте соединенные структурные фрагменты обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4), для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов.
В другом аспекте конструкцию структурных блоков нуклеиновых кислот получают с помощью анализа последовательностей набора матриц исходных нуклеиновых кислот, которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов. Эти исходные матрицы нуклеиновых кислот, таким образом, служат в качестве источника информации в последовательности, которая облегчает разработку структурных блоков нуклеиновых кислот, которые предназначены для внесения мутаций, например химеризации или перемещения.
В одном иллюстративном примере данное изобретение относится к химеризации семейства родственных генов и кодируемого ими семейства сходных продуктов. В конкретном иллюстративном примере кодируемые продукты представляют собой ферменты. В полипептиды по настоящему изобретению могут быть внесены мутации в соответствии с описанными в данном описании способами.
Таким образом, с соответствии с одним аспектом данного изобретения последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот (например, полинуклеотидов по данному изобретению) вы
- 52 013993 равнивают, чтобы выбрать одну или несколько пограничных точек, где пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии. Пограничные точки могут быть использованы для обозначения границ структурных блоков нуклеиновых кислот, которые будут образованы. Таким образом, пограничные точки, идентифицированные и выбранные в исходных молекулах, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке производных молекул.
Как правило, подходящая пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание), общую по меньшей мере для двух исходных матриц, но пограничная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины исходных матриц, по меньшей мере для двух третей исходных матриц, по меньшей мере для трех четвертей исходных матриц и в одном аспекте почти для всех исходных матриц. Более того, в еще одном аспекте пригодные пограничные точки представляют собой область гомологии, которая является общей для всех исходных матриц.
В одном аспекте повторную сборку гена осуществляют тщательно для получения исчерпывающей библиотеки. Другими словами, все возможные упорядоченные комбинации структурных блоков нуклеиновых кислот представляются в виде набора конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, порядок сборки (т.е. порядок присоединения каждого структурного блока в последовательности от 5' к 3' каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании является запрограммированным (или нестохастическим). Вследствие нестохастической природы способа вероятность нежелательных побочных продуктов значительно снижается.
В другом аспекте способ предусматривает, что повторная сборка лигированием осуществляется систематически, например, для получения систематически разделенной библиотеки с отделами, в которых систематически может быть проведен скрининг, например, друг за другом. Другими словами, данное изобретение предусматривает, чтобы посредством селективного и целесообразного использования конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном использовании последовательных постадийных реакций сборки, мог быть осуществлен замысел, где конкретный набор производных продуктов получают в любом из нескольких реакционных сосудов. Это делает возможным осуществление систематического исследования и скрининга. Таким образом, эти способы дают возможность систематически исследовать потенциально очень большое количество производных молекул в уменьшенных группах.
Вследствие способности осуществлять химеризацию таким образом, что она является универсальным и в то же время исчерпывающим и систематическим, особенно при наличии низкого уровня гомологии среди исходных молекул, настоящее изобретение предусматривает получение библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы повторной сборки лигированием в соответствии с настоящим изобретением производные молекулы, полученные в соответствии с одним аспектом, включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с таким порядком сборки, в целом, который выбран при разработке. В конкретном аспекте такая полученная библиотека содержит от более чем 103 до более чем 101000 различных производных молекулярных образцов.
В одном аспекте набор конечных химерных молекул нуклеиновых кислот, полученных, как описано, содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид. В соответствии с одним аспектом этот полинуклеотид представляет собой ген, который может представлять собой искусственный ген. В соответствии с другим аспектом этот полинуклеотид представляет собой каскад генов, который может представлять собой искусственный каскад генов. Данное изобретение подразумевает, что один или несколько искусственных генов, полученных по данному изобретению, могут быть включены в искусственный каскад генов, такой как каскад, функционирующий в эукариотическом организме (включая растения).
В другом иллюстративном примере синтетический характер стадии, на которой образуются структурные блоки, дает возможность сконструировать и внести нуклеотиды (например, один или несколько нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны или интроны, или регуляторные последовательности), которые позднее могут быть необязательно удалены в процессе ίη νίίΐΌ (например, посредством мутагенеза) или в процессе ίη νί\Ό (например, используя способность к сплайсингу генов в организме хозяина). Следует понимать, что во множестве примеров введение этих нуклеотидов также может быть желательно по другим причинам, в дополнение к потенциальной пользе в виде получения подходящей пограничной точки.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом данное изобретение подразумевает, что для внесения интрона могут быть использованы структурные блоки нуклеиновых кислот. Таким образом, данное изобретение предусматривает, что функциональные интроны могут быть встроены в искусственный ген по данному изобретению. Данное изобретение также предусматривает, что функциональные интроны могут быть встроены в искусственный каскад генов по данному изобретению. Таким образом, данное изобретение относится к получению химерного полинуклеотида, который представляет собой искусственный ген, содержащий один (или несколько) искусственно встроенный интрон(ов).
Таким образом, данное изобретение также относится к получению химерного полинуклеотида, который представляет собой искусственный каскад генов, содержащий один (или несколько) искусственно
- 53 013993 встроенный интрон(ы). В одном аспекте искусственно встроенный интрон(ы) является функциональным в одном или нескольких клетках-хозяевах для сплайсинга гена подобно тому, как природные интроны функционально служат для сплайсинга генов. Данное изобретение относится к способу получения искусственных содержащих интрон полинуклеотидов для введения в организм хозяина для рекомбинации и/или сплайсинга.
Искусственный ген, полученный по данному изобретению, также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. Аналогично искусственный каскад генов, полученный по данному изобретению, также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. В одном аспекте рекомбинация облегчается с помощью участков гомологии или происходит в участках гомологии между искусственным содержащим интрон геном и нуклеиновой кислотой, которая служит в качестве партнера по рекомбинации. В одном аспекте партнер по рекомбинации также может представлять собой нуклеиновую кислоту, полученную по данному изобретению, включая искусственный ген или каскад генов. Рекомбинация может быть облегчена с помощью гомологии или может происходить в областях гомологии, которые находятся в одном (или нескольких) искусственно встроенном интроне(ах) в искусственном гене.
В способе синтетической повторной сборки гена по данному изобретению используют множество структурных блоков нуклеиновых кислот, каждый из которых в одном аспекте обладает двумя лигируемыми концами. Два лигируемых конца на каждом структурном блоке нуклеиновых кислот может представлять собой два тупых конца (т.е. на каждом выступает ноль нуклеотидов) или в одном аспекте один тупой и один выступающий, или в еще одном аспекте два выступающих.
Пригодный выступающий конец для этих целей может представлять собой 3'-выступающий конец или 5'-выступающий конец. Таким образом, структурный блок нуклеиновой кислоты может иметь 3'-выступающий конец или, альтернативно, 5'-выступающий конец, или, альтернативно, два 3'выступающих конца, или, альтернативно, два 5-выступающих конца. Общий порядок, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот собираются с получением конечной химерной молекулы нуклеиновой кислоты, определяется преднамеренным экспериментальным планом и не является случайным.
В одном аспекте структурный блок нуклеиновой кислоты получают химическим синтезом двух одноцепочечных нуклеиновых кислот (также называемых одноцепочечными олигонуклеотидами) и осуществлением их контакта для того, чтобы дать возможность им соединиться с образованием двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты.
Двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты может быть различного размера. Размеры структурных блоков могут быть небольшими или большими. Иллюстративные размеры структурного блока составляет диапазон от 1 пары оснований (не включая любые выступы) до 100000 пар оснований (не включая любые выступы). Также подразумеваются другие иллюстративные диапазоны размеров, которые обладают нижними границами от 1 до 10000 п. о. (включая любое численное значение между ними) и верхними границами от 2 до 100000 п. о. (включая любое численное значение между ними).
Существует много способов, которыми может быть получен двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты, которые являются подходящими для данного изобретения; и они известны в данной области и могут быть легко проведены специалистом в данной области.
В соответствии с одним аспектом двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты образуется при первоначальном получении двух одноцепочечных нуклеиновых кислот и обеспечении возможности им соединиться с образованием двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты. Две цепи двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты могут быть комплементарными по каждому нуклеотиду, за исключением любого из них, который образует выступ; таким образом имея ошибочно спаренные основания, за исключением любого выступа(ов). В соответствии с другим аспектом две цепи двухцепочечного структурного блока нуклеиновой кислоты являются комплементарными менее чем по каждому нуклеотиду, кроме любого их них, который образует выступ. Таким образом, в соответствии с данным аспектом двухцепочечный структурный блок нуклеиновой кислоты может быть использован для внесения вырожденности кодонов. В одном аспекте вырожденность кодонов вносится с использованием мутагенеза с насыщением сайта, описанного в данном описании, с использованием одной или нескольких кассет Ν,Ν^/Τ или, альтернативно, с использованием одной или нескольких кассет ν,ν,ν.
Способ рекомбинации ш νί\Ό по данному изобретению может быть выполнен вслепую на группе неизвестных гибридов или аллелей конкретного полинуклеотида или последовательности. Однако нет необходимости знать истинную ДНК или РНК последовательность конкретного полинуклеотида.
Подход в использовании рекомбинации в смешанной группе генов может быть полезен при получении любых полезных белков, например интерлейкина I, антител, 1РА и гормона роста. Такой подход может быть использован для получения белков с измененной специфичностью или активностью. Подход также может быть полезен при получении гибридных последовательностей нуклеиновых кислот, например последовательностей промоторных участков, интронов, экзонов, энхансеров, 3'-нетранслируемых областей или 5'-нетранслируемых областей генов. Таким образом, данный поход может быть использован для получения генов с повышенным уровнем экспрессии. Данный подход может быть также полезен
- 54 013993 при исследовании повторяющихся последовательностей ДНК. В заключение, данный подход может быть полезен при внесении мутаций в рибозимы или аптамеры.
В одном аспекте описанное в данном описании изобретение относится к использованию повторяющихся циклов редуктивной рекомбинации, рекомбинации и селекции, которые делают возможными направленные молекулярные изменения в высокой степени сложных линейных последовательностей, таких как ДНК, РНК или белки посредством рекомбинации.
Оптимизированная система направленных изменений
Данное изобретение относится к системе нестохастической модификации генов, называемой оптимизированной системой направленных изменений, для получения полипептидов, например ферментов или антител по данному изобретению с новыми или измененными свойствами. Оптимизированные направленные изменения направлены на использование повторяющихся циклов редуктивной рекомбинации, рекомбинации и селекции, которые делают возможными направленные молекулярные изменения нуклеиновых кислот посредством рекомбинации. Оптимизированные направленные изменения дают возможность получать большую группу измененных химерных последовательностей, где полученная группа значительно обогащена последовательностями, которые имеют предопределенное число случаев кроссинговера.
Элемент кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка обычно находится в точке соединения, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единой последовательности. Этот способ дает возможность вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей, так что конечная химерная группа последовательностей обогащена на выбранное количество элементов кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль над выбранными химерными вариантами с предопределенным числом случаев кроссинговера.
В дополнение, данный способ относится к удобным способам исследования огромного количества возможных вариантов участков белка по сравнению с другими системами. Ранее, если получалось, например, 1013 химерных молекул в ходе реакции, было чрезвычайно сложно тестировать такое большое количество химерных вариантов на наличие конкретной активности. Более того, значительная часть группы производных имеет очень большое число случаев кроссинговера, что приводит к белку, который с меньшей вероятностью обладает повышенным уровнем конкретной активности. При использовании этих способов группа химерных молекул может быть обогащена такими вариантами, которые имеют конкретное число случаев кроссинговера. Таким образом, несмотря на то что все еще образуется 1013 химерных молекул в ходе реакции, каждая из молекул, выбранная для дальнейшего анализа, с большей вероятностью будет иметь, например, только три случая кроссинговера. Вследствие того, что получающаяся в результате группа из производных может быть изменена так, чтобы иметь предопределенное число случаев кроссинговера, границы функционального множества среди химерных молекул уменьшается. Это обеспечивает более контролируемое количество переменных при вычислении олигонуклеотида, который из оригинальных исходных полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.
Один способ получения химерной полинуклеотидной последовательности производного представляет собой создание олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. Каждый олигонуклеотид в одном аспекте включает уникальный участок, который перекрывается, так что смешивание вместе олигонуклеотидов приводит к новому варианту, который обладает каждым олигонуклеотидным фрагментом, собранным в правильном порядке. Дополнительную информацию также можно найти, например, в υ88Ν 09/332835; патенте США № 6361974.
Число олигонуклеотидов, полученных для каждого исходного варианта, соответствует суммарному числу полученных кроссинговеров в химерной молекуле, которая в конечном итоге образуется. Например, могут быть получены три исходных варианта нуклеотидных последовательностей для проведения реакции лигирования, чтобы найти химерный вариант, например, с более высокой активностью при высокой температуре. В качестве одного примера может быть получен набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих каждому участку каждого исходного варианта. Таким образом, в ходе процесса повторной сборки лигированием может произойти вплоть до 50 случаев кроссинговера в каждой химерной последовательности. Вероятность того, что каждый из полученных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого исходного варианта в переменном порядке очень низка. Если каждый олигонуклеотидный фрагмент представлен в реакции лигирования в том же молярном количестве, тогда вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же исходного полинуклеотида будут лигироваться друг с другом и, таким образом, не приведут к случаю кроссинговера. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждого источника сохраняется постоянной в ходе любой стадии лигирования в этом примере, тогда существует вероятность 1/3 (в случае 3 источников) того, что олигонуклеотид из того же исходного варианта будет лигироваться в химерную последовательность и не приведет к получению кроссинговера.
Таким образом, плотность распределения вероятностей (РОЕ) может быть определена для предсказания количества случаев кроссинговера, которые могут произойти в ходе каждой стадии реакции лиги
- 55 013993 рования, с учетом определенного количества исходных вариантов, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентрации каждого варианта в ходе каждой стадии реакции лигирования. Статистические и математические способы помимо определения ΡΌΕ описаны ниже. Используя такие способы, можно вычислить такую плотность распределения вероятностей и, таким образом, обогатить группу химерных производных предопределенным количеством случаев кроссинговера, получаемых в результате конкретной реакции лигирования. Более того, может быть определено число мишеней для случаев кроссинговера, и система затем программируется на вычисление исходных количеств каждого исходного олигонуклеотида в ходе каждой стадии реакции лигирования для вычисления плотности распределения вероятностей, которая зависит от предопределенного количества случаев кроссинговера. Эти способы направлены на использование повторяющихся циклов редуктивной рекомбинации, рекомбинации и селекции, которые делают возможными направленные молекулярные изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, посредством рекомбинации. Эта система дает возможность получить большую группу измененных химерных последовательностей, где полученная группа значительно обогащена последовательностями, которые имеют предопределенное число случаев кроссинговера. Элемент кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка обычно находится в точке соединения, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единичной последовательности. Способ дает возможность вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей, так что конечная химерная группа последовательностей обогащена выбранным числом случаев кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль над выбранными химерными вариантами с предопределенным числом случаев кроссинговера.
Кроме того, эти способы относятся к удобным способам исследования огромного количества возможных вариантов участков белка по сравнению с другими системами. Используя эти способы, описанные в данном описании, группа химерных молекул может быть обогащена такими вариантами, которые имеют конкретное число случаев кроссинговера. Таким образом, несмотря на то что в ходе реакции может образоваться 1013 химерных молекул, причем каждая из молекул, выбранная для дальнейшего анализа, с большой вероятностью будет иметь, например, только три случая кроссинговера. Вследствие того что образовавшаяся в результате группа из производных может быть изменена, чтобы иметь предопределенное число случаев кроссинговера, границы функционального множества среди химерных молекул будут уменьшаться. Это обеспечивает более контролируемое число переменных при вычислении олигонуклеотида, который из оригинальных исходных полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.
В одном аспекте способ дает возможность получить химерную полинуклеотидную последовательность производного посредством получения олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. Каждый олигонуклеотид в одном аспекте включает уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к новому варианту, который имеет каждый олигонуклеотидный фрагмент, присоединенный в правильном порядке. См. также υЗЗN 09/332835.
Определение случаев кроссинговера
Аспекты данного изобретения включают систему и программное обеспечение, которое дает возможность получить требуемую плотность распределения вероятностей (ΡΌΕ) для кроссинговера, с числом исходных генов, предназначенных для повторной сборки, и числом фрагментов при повторной сборке в качестве входных данных. Выходные данные этой программы представляют собой фрагментую ΡΌΕ, которая может быть использована для определения способа получения повторно собранных генов и для определения ΡΌΕ кроссинговера этих генов. Обработка, описанная в данном описании, в одном аспекте осуществляется в МАТЬАВ™ (ТНе Ма1йетогкз, ^йск, Маззасйизейз), языке программирования и средстве проектирования для технической обработки данных.
Повторяющиеся способы
При применении на практике данного изобретения эти способы могут быть многократно повторены. Например, некоторую нуклеиновую кислоту (или конкретную нуклеиновую кислоту), ответственную за измененный или новый фенотип, идентифицируют, повторно выделяют (например, с использованием нуклеиновой кислоты по данному изобретению), снова модифицируют, повторно тестируют на наличие активности. Эти способы могут многократно повторяться до тех пор, пока не будет сконструирован желаемый фенотип. Например, в клетку способами инженерии может быть внедрен целый биохимический анаболический или катаболический путь, включая, например, новый или измененный биосинтетический путь или путь деградации (например, хлорофилла).
Аналогично, если определено, что конкретный олигонуклеотид совсем не влияет на желательное свойство (например, новый или измененный фенотип биосинтетического пути или пути деградации (например, хлорофилла)), тогда он может быть удален в качестве переменной при синтезе более крупных исходных олигонуклеотидов, которые включают удаляемую последовательность. Поскольку встраивание последовательности в более крупную последовательность предотвращает любые случаи кроссинговера, то не будет больше существовать никаких вариантов этих последовательностей в производных полинук
- 56 013993 леотидах. Эта повторяющаяся практика определения олигонуклеотидов, которые более всего соответствуют желаемому свойству и которые не соответствуют, делает возможным более эффективное исследование всех возможных вариантов белков, которые могут обеспечивать конкретное свойство или активность.
Шаффлинг ΐη νίνο
В способах по данному изобретению используется шаффлинг молекул ш νί\Ό. который обеспечивает получение вариантов полипептидов по данному изобретению, например антител, ферментов и т.п. Может быть осуществлен шаффлинг ш у|уо, где используется природное свойство клеток осуществлять рекомбинацию мультимеров. Несмотря на то что рекомбинация ш νί\Ό обеспечивает главный природный путь молекулярного разнообразия, генетическая рекомбинация остается относительно сложным способом, который включает 1) распознавание наличия гомологии; 2) расщепление цепи, вытеснение цепи и метаболические стадии, приводящие к продукции рекомбинантной хиазмы и, наконец, 3) разрешение хиазмы на отдельные рекомбинированые молекулы. Для формирования хиазмы необходимо распознавание гомологичных последовательностей.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения гибридного полинуклеотида по меньшей мере из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. Данное изобретение можно использовать для получения гибридного полинуклеотида посредством введения по меньшей мере первого полинуклеотида и второго полинуклеотида, у которых общим является по меньшей мере один участок частичной гомологии последовательностей (например, 8Е0 ΙΌ N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и их комбинации), в подходящую клетку-хозяина. Участки частичной гомологии последовательностей обеспечивают процесс, который приводит к реорганизации последовательностей с получением гибридного полинуклеотида. Гибридный полинуклеотид, как используется в данном описании, представляет собой любую нуклеотидную последовательность, которая получена способом по настоящему изобретению и содержит последовательность по меньшей мере из двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут быть получены в результате случаев межмолекулярной рекомбинации, которые обеспечивают интеграцию последовательности между молекулами ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут быть результатом внутримолекулярной редуктивной рекомбинации, в которой повторяющиеся последовательности используют для изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК.
Перестройка ш νί\Ό направлена на межмолекулярный процесс, в совокупности называемый рекомбинацией, который в бактериях, как правило, рассматривается как КесА-зависимый феномен. Данное изобретение может основываться на процессе рекомбинации в клетке-хозяине для рекомбинации и перестройки последовательностей или способности клеток обеспечивать редуктивные процессы для снижения комплексности псевдоповторяющихся последовательностей в клетке посредством делеции. Процесс редуктивной перестройки осуществляется посредством внутримолекулярного, КесАнезависимого процесса.
Таким образом, в другом аспекте данного изобретения новые полинуклеотиды могут быть получены посредством способа редуктивной рекомбинации. Способ включает получение конструкций, содержащих последовательности (исходные кодирующие последовательности), их вставку в соответствующий вектор и их последующее введение в соответствующую клетку-хозяина. Рекомбинация отдельных молекулярных элементов происходит посредством комбинаторных процессов между последовательностями в конструкции, обладающей участками гомологии, или между псевдоповторяющимися единицами. В ходе рекомбинации происходит рекомбинация и/или снижение комплексности и протяженности повторяющихся последовательностей, и она приводит к получению новых молекулярных образцов. Для повышения скорости рекомбинации могут быть применены различные способы обработки. Они могут включать обработку ультрафиолетовым светом или повреждающими ДНК химическими веществами, и/или использование линий клеток-хозяев, проявляющих повышенный уровень генетической нестабильности. Таким образом, способ рекомбинации может включать гомологичную рекомбинацию или природное свойство псевдоповторяющихся последовательностей направлять свои собственные изменения.
Повторяющиеся или псевдоповторяющиеся последовательности участвуют в генетической нестабильности. В соответствии с настоящим изобретением псевдоповторы представляют собой повторы, которые не ограничиваются их структурой оригинальной единицы. Псевдоповторяющиеся единицы могут быть представлены в виде набора последовательностей в конструкции; последовательно расположенных единиц сходных последовательностей. После лигирования соединения между последовательностями становятся, по существу, незаметными, и псевдоповторяющаяся природа конечной конструкции становится постоянной на молекулярном уровне. Делеция в клетке происходит для снижения комплексности полученной конструкции посредством взаимодействий между псевдоповторяющимися последовательностями. Псевдоповторяющиеся единицы обеспечивают практически безграничный набор матриц, с помощью которых могут происходить случаи переноса. Конструкции, содержащие псевдоповторы, таким образом, эффективно обеспечивают достаточную молекулярную гибкость, чтобы случаи делеций (и, возможно, вставок) могли происходить, по существу, в любом месте в пределах псевдоповторяющихся единиц.
- 57 013993
В случае если все псевдоповторяющиеся последовательности лигированы в одинаковой ориентации, например голова к хвосту или наоборот, клетка не может различить отдельные единицы. Следовательно, редуктивный процесс может произойти по всей последовательности. Напротив, если, например, единицы представлены в ориентации голова к голове, в большей степени чем голова к хвосту, инверсия определяет конечную точку соседней единицы, так что формирование делеций способствует потере отдельных единиц. Таким образом, для настоящего способа предпочтительно, чтобы последовательности находились в одинаковой ориентации. Случайная ориентация псевдоповторяющихся последовательностей приведет к потере эффективности рекомбинации, в то время как постоянная ориентация последовательностей обеспечит наибольшую эффективность. Однако несмотря на то что наличие непрерывных последовательностей в одинаковой ориентации снижает эффективность, оно, тем не менее, может обеспечить достаточную гибкость для эффективного получения новых молекул. Могут быть получены конструкции с псевдоповторяющимися последовательностями в одинаковой ориентации для обеспечения более высокой эффективности.
Последовательности могут быть собраны в ориентации голова к хвосту с использованием любого из различных способов, включая следующие:
a) могут быть использованы праймеры, которые включают поли-А-головной конец и поли-Т-хвост, которые, в случае если получены одноцепочечными, будут обеспечивать ориентацию; это дополняется наличием первых нескольких оснований в праймерах, полученных из РНК и, таким образом, они легко удаляются РНКазой Н;
b) могут быть использованы праймеры, которые включают уникальные участки для расщепления рестриктазами; могут потребоваться множественные участки, ряд уникальных последовательностей и повторяющиеся стадии синтеза и лигирования;
c) внутренние несколько оснований праймера могут быть тиолированы и может быть использована экзонуклеаза для получения молекул с правильными хвостами.
Получение повторно собранных последовательностей основано на идентификации клонирующих векторов с уменьшенным индексом повторов (ΚΙ). Повторно собранные кодирующие последовательности затем могут быть получены посредством амплификации. Продукты повторно клонируют и экспрессируют. Получение клонирующих векторов со сниженным ΚΙ может быть достигнуто:
1) использованием векторов только стабильно поддерживаемых в случае, если в конструкции снижена комплексность;
2) физическим получением укороченных векторов физическими методами; в этом случае может быть получен клонирующий вектор с использованием стандартных методов выделения плазмид и разделения по размеру либо в агарозном геле, либо на колонке с низкомолекулярным порогом с использованием стандартных методик;
3) получением векторов, содержащих разделенные гены, которые могут быть отобраны при уменьшении размера вставки;
4) использованием технологий направленной селекции с экспрессирующим вектором и соответствующей селекцией.
Кодирующие последовательности (например, гены) из родственных организмов могут демонстрировать высокую степень гомологии и кодировать совершенно разные белковые продукты. Эти типы последовательностей особенно полезны в соответствии с настоящим изобретением в качестве псевдоповторов. Однако несмотря на то что примеры, проиллюстрированные ниже, демонстрируют рекомбинацию практически идентичных исходных кодирующих последовательностей (псевдоповторов), этот способ не ограничивается такими практически идентичными повторами.
Следующий пример демонстрирует способ по данному изобретению. Описаны кодирующие последовательности нуклеиновых кислот (псевдоповторы), полученные из трех (3) уникальных образцов. Каждая последовательность кодирует белок с различным набором свойств. Каждая из последовательностей отличается единственной или несколькими парами оснований в определенном положении в последовательности. Псевдоповторяющиеся последовательности отдельно или совместно амплифицируются и лигируются в случайные объединенные последовательности, так чтобы в группе лигируемых молекул были возможны различные перестановки и комбинации. Количества псевдоповторяющихся единиц может контролироваться условиями сборки. Среднее количество псевдоповторяющихся единиц в конструкции определяют как индекс повторов (ΚΙ).
После формирования конструкции могут быть или не могут быть разделены по размеру в агарозном геле в соответствии с опубликованными протоколами, встроены в клонирующий вектор и трансфецированы в соответствующую клетку-хозяина. Затем клетки размножаются и происходит редуктивная рекомбинация. Если желательно, скорость редуктивной рекомбинации может быть повышена посредством внесения повреждений в ДНК. Является ли снижение ΚΙ опосредованным образованием делеции между повторяющимися последовательностями по внутримолекулярному механизму или оно опосредуется случаями, подобными рекомбинации по межмолекулярным механизмам, несущественно. Конечным результатом является перестройка молекул во всех возможных комбинациях.
Способ необязательно включает дополнительную стадию скрининга членов библиотеки из пере
- 58 013993 строенной группы для идентификации индивидуальных перестроенных членов библиотеки, обладающих способностью связываться или иначе взаимодействовать, или катализировать конкретную реакцию (например, таких как каталитические домены фермента) с предопределенной макромолекулой, такой как, например, белковый рецептор, олигосахарид, вирион или другое предопределенное соединение или структура.
Полипептиды, которые идентифицируются из таких библиотек, могут быть использованы для терапевтических, диагностических, исследовательских и сходных целей (например, катализаторы, растворы для повышения осмотического давления водного раствора и т.п.) и/или могут быть подвергнуты одному или нескольким дополнительным циклам шаффлинга и/или селекции.
В другом аспекте предусматривается, что перед или в ходе рекомбинации или перестройки, полинуклеотиды, полученные способом по данному изобретению, могут подвергаться воздействию средств или способов, которые обеспечивают внесение мутаций в исходные полинуклеотиды. Внесение таких мутаций может повышать разнообразие конечных гибридных полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими. Средства или способы, которые обеспечивают мутагенез, могут включать, но не ограничиваться ими: (+)-СС-1065 или синтетический аналог, такой как (+)-СС-1065-(И3-аденин) (см. 8ип апб Ниг1еу, (1992)); Ν-ацетилированный или деацетилированный 4'-фтор-4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см., например, уап бе Ро11 еД а1. (1992)); или Ν-ацетилированный или деацетилированный 4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см. также уап бе Ро11 еД а1. (1992), р. 751-758); трехвалентный хром, трехвалентную соль хрома, ДНК-аддукты на основе полициклических ароматических углеводородов (РАН), способные ингибировать репликацию ДНК, такие как 7-бромметилбенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3-дибромпропил)фосфат (ТгДз-ВР), 1,2-дибром-3хлорпропан (ЭВСР). 2-бромакролеин (2ВА), бензо[а]пирен-7,8-дигидродиол-9-10-эпоксид (ВРИЕ), галогеновая соль платины(П), №гидрокси-2-амино-3-метилимидазо[4,5-Д] хинолин (Ν-ΙγΜιόχυ-ΙΟ) и Νгидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-Е|пиридин (Ν-йубгоху-РЫР). Иллюстративные способы замедления или остановки амплификации ПЦР включают УФ-свет, (+)-СС-1065 и (+)-ί.’ί.’-1065-(Ν3аденин). В частности, включенные средства представляют собой ДНК-аддукты или полинуклеотиды, содержащие ДНК-аддукты из полинуклеотидов или группы полинуклеотидов, которые могут быть удалены методом, включающим нагревание раствора, содержащего полинуклеотиды, перед дальнейшей обработкой.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения рекомбинантных белков с биологической активностью посредством обработки образца, содержащего двухцепочечные матричные полинуклеотиды, кодирующие белок дикого типа, в условиях в соответствии с данным изобретением, которые обеспечивают продукцию гибридных или повторно собранных полинуклеотидов.
Получение вариантов последовательностей
Данное изобретение также относится к дополнительным способам получения вариантов последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению. Данное изобретение также относится к дополнительным способам выделения полипептидов по данному изобретению. В одном аспекте данное изобретение относится к вариантам кодирующих последовательностей (например, к гену, кДНК или транскрипту) по данному изобретению, которые могут быть изменены любыми способами, включая, например, случайные или стохастические способы, или нестохастические способы, или способы направленных изменений, которые описаны выше.
Выделенные варианты могут быть вариантами природного происхождения. Вариант также может быть получен Дп уДДго. Варианты могут быть получены с использованием способов генной инженерии, таких как сайт-направленный мутагенез, случайный химический мутагенез, делеции с экзонуклеазой ΙΙΙ и стандартные методы клонирования. Альтернативно, такие варианты, фрагменты, аналоги или производные могут быть получены с использованием химического синтеза или модификаций. Другие способы получения вариантов также известны специалистам в данной области. Они включают методы, в которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируются с получением нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, обладающие свойствами, которые повышают их ценность для промышленного или лабораторного применения. По таким методикам получают и охарактеризовывают большое количество вариантов последовательностей с одним или несколькими различиями в нуклеотидах относительно последовательности, полученной из природного изолята. Эти различия в нуклеотидах могут приводить к замене аминокислот относительно полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.
Например, варианты могут быть получены с использованием ПЦР с пониженной точностью. При ПЦР с пониженной точностью ПЦР осуществляют в условиях, где точность копирования ДНК-полимеразы низкая, так что по всей длине продукта ПЦР образуется большое число точковых мутаций. ПЦР с пониженной точностью описана, например, Ьеипд, Ό.\. еД а1., в ТесйпДдие, 1:11-15, 1989) и СаДб^еДД К.С. & Доусе С.Р., РСК МеДйобз АррДДс., 2:28-33, 1992. В кратком изложении, по таким методикам нуклеиновые кислоты, предназначенные для внесения в них мутаций, смешивают с праймерами для ПЦР, буфером для реакции, МдС12, МпС12, Тад-полимеразой и с б№ТР в соответствующей концентрации для достижения большого количества точковых мутаций вдоль всей длины продукта ПЦР. Например, реакция мо
- 59 013993 жет быть проведена с использованием 20 пмоль нуклеиновой кислоты, предназначенной для внесения в нее мутаций, 30 пмоль каждого праймера для ПЦР, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 ММ Так НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатин, 7 мМ МдС12, 0,5 мМ МпС12, 5 единиц Тад-полимеразы, 0,2 мМ бСТР, 0,2 мМ бАТР, 1 мМ бСТР и 1 мМ бТТР. ПЦР проводят в течение 30 циклов, состоящих из 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут быть изменены в соответствующих случаях. Нуклеиновые кислоты с внесенными в них мутациями клонируют в соответствующий вектор и оценивают активность полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами с внесенными в них мутациями.
Варианты также могут быть получены с использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза с получением сайт-специфических мутаций в любой представляющей интерес клонированной ДНК. Мутагенез посредством олигонуклеотидов описан, например, в Ке1бйааг-О1коп (1988) 8с1епсе 241:53-57. В кратком изложении, по таким методикам множество двухцепочечных олигонуклеотидов с одной или несколькими мутациями, предназначенными для внесения в клонированную ДНК, синтезируют и встраивают в клонированную ДНК, предназначенную для внесения в нее мутаций. Клоны, содержащие ДНК с внесенными в нее мутациями, выделяют и оценивают активность полипептидов, которые она кодирует.
Другим способом получения вариантов является объединяющая ПЦР. Объединяющая ПЦР включает сборку продуктов ПЦР из смеси небольших фрагментов ДНК. Большое количество различных реакций ПЦР происходит параллельно в одной и той же пробирке с продуктами одной реакции, являющимися затравками для продуктов другой реакции. Объединяющая ПЦР описана, например, в патенте США № 5965408.
Еще одним способом получения вариантов является мутагенез с помощью половой ПЦР. При мутагенезе с помощью половой ПЦР ускоряется искусственная гомологичная рекомбинация 1п ν 1(го между молекулами ДНК с различными, но высоко сходными последовательностями ДНК, вследствие случайной фрагментации молекулы ДНК, основанной на гомологии последовательностей, с последующим закреплением продуктов кроссинговера посредством удлинения праймеров в реакции ПЦР. Мутагенез с помощью половой ПЦР описан, например, в 81еттег (1994) Ргос. №111. Асаб. 8ск, и8А, 91:10747-10751. В кратком изложении, по таким методикам множество нуклеиновых кислот, предназначенных для рекомбинации, расщепляют ДНКазой с получением фрагментов со средним размером 50-200 нуклеотидов. Фрагменты с желательным средним размером очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновых кислот. Например, ПЦР может быть проведена при ресуспендировании очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/мкл в растворе с 0,2 мМ каждого бЭТР, 2,2 мМ МдС12, 50 мМ КСЬ, 10 мМ Тпк НС1, рН 9,0 и 0,1% Тгйоп Х-100. Добавляют 2,5 ед. Тад-полимеразы на 100:1 реакционной смеси и проводят ПЦР с использованием следующего режима: 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут быть изменены соответствующим образом. В некоторых аспектах в реакции ПЦР могут быть включены олигонуклеотиды. В других аспектах может быть использован фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I в первой группе реакций ПЦР, и Тад-полимераза может быть использована в следующей группе реакций ПЦР. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активность полипептидов, которые они кодируют.
Варианты также могут быть получены посредством мутагенеза ш νί\Ό. В некоторых аспектах создают случайные мутации в представляющей интерес последовательности посредством воспроизведения представляющей интерес последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е. сой, который осуществляет мутации посредством одного или нескольких путей репарации ДНК. Такие штаммымутаторы обладают увеличенным количеством случайных мутаций по сравнению с родительским организмом дикого типа. Воспроизведение ДНК в одном из этих штаммов приведет со временем к образованию случайных мутаций в ДНК. Штаммы мутаторов, пригодные для использования в мутагенезе ш νίνΌ, описаны в публикации РСТ № \¥О 91/16427, опубликованной 31 октября 1991 года под названием Ме!йобк Гог РйепоЕре Сгеабоп Ггот МиШр1е Сепе Рори1абопк.
Варианты также могут быть получены с использованием кассетного мутагенеза. В кассетном мутагенезе небольшой участок двухцепочечной молекулы ДНК замещается синтетической олигонуклеотидной кассетой, которая отличается от нативной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично отобранную случайным образом нативную последовательность.
Также для получения вариантов может быть использован возвратно-множественный мутагенез. Возвратно-множественный мутагенез представляет собой алгоритм для белковой инженерии (белковый мутагенез), разработанный для получения различных групп фенотипически сходных мутантов, члены которых отличаются по аминокислотной последовательности. Для данного способа используют механизм с обратной связью для контроля успешных циклов комбинаторного кассетного мутагенеза. Возвратно-множественный мутагенез описан Агкш А.Р. апб Υоиνаη Э.С., в РNΑ8, и8А, 89:7811-7815, 1992.
В некоторых аспектах варианты получают с использованием экспоненциально-множественного мутагенеза. Экспоненциально-множественный мутагенез представляет собой способ получения комбина
- 60 013993 торных библиотек с большим процентным содержанием уникальных и функциональных мутантов, где небольшие группы остатков случайным образом отбираются параллельно для идентификации в каждом измененном положении аминокислот, которые приводят к функциональным белкам. Экспоненциальномножественный мутагенез описан Ое1едгате 8. и Уонтап Э.С., в В1о1есйпо1оду Векеагск, 11:1548-1552, 1993. Случайный и сайт-направленный мутагенез описаны Агпо1б Е.Н., в Сиггеп! Ор1шоп ш Вю1есйпо1оду, 4:450-455, 1993.
В некоторых аспектах варианты создают с использованием методов шаффлинга, где часть из множества нуклеиновых кислот, которые кодируют различные полипептиды, соединяются вместе с получением химерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные полипептиды, как описано в патенте США № 5965408, выданном 9 мая 1996 года, под названием Ме11юб оГ ΩΝΛ ВеаккетЬ1у Ьу 1п1еггирйпд 8уп1Нек1к и в патенте США № 5939250, выданном 22 мая 1996 года, под названием Ргобисйоп оГ Епхутек Наттд Эекйеб АситШек Ьу Ми1адепек1к.
Варианты полипептидов по данному изобретению могут представлять собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептидов в последовательностях по данному изобретению заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (в одном аспекте консервативным аминокислотным остатком), и такие замененные аминокислотные остатки могут быть или не могут быть кодируемыми генетическим кодом.
Данное изобретение относится к альтернативным вариантам осуществления полипептидов по данному изобретению (и нуклеиновых кислот, которые кодируют их), содержащим по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену, как описано в данном описании (например, консервативные аминокислотные замены представляют собой замену, которая заменяет данную аминокислоту в полипептиде другой аминокислотой со сходными свойствами). Данное изобретение относится к полипептидам (и нуклеиновым кислотам, которые кодируют их), где любые, некоторые или все аминокислотные остатки заменены другими аминокислотами со сходными свойствами, например с консервативной аминокислотной заменой.
Консервативные замены представляют собой замены, при которых происходит замена данной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой со сходными свойствами. Как правило, в качестве консервативных замен встречаются следующие замены: замена алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замена серина треонином или наоборот; замена кислых остатков, таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, другим кислым остатком; замена остатка, несущего амидную группу, такого как аспарагин и глутамин, другим остатком несущим амидную группу; замена основного остатка, такого как лизин и аргинин, другим основным остатком; и замена ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин, другим ароматическим остатком. В альтернативных аспектах эти консервативные замены также могут представлять собой синтетические эквиваленты указанных аминокислот.
Другие варианты представляют собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептида по данному изобретению включают заместитель.
Кроме того, другие варианты представляют собой варианты, в которых полипептид ассоциирован с другим соединением, таким как соединение, увеличивающее период полураспада полипептида (например, полиэтиленгликоль).
Дополнительные варианты представляют собой варианты, в которых дополнительные аминокислоты присоединены к полипептиду, такому как лидерная последовательность, секреторная последовательность, пробелковая последовательность или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида.
В некоторых аспектах фрагменты, производные и аналоги сохраняют такую же биологическую функцию или активность, что и у полипептидов по данному изобретению. В других аспектах фрагмент, производное или аналог включает пробелок, так что фрагмент, производное или аналог может быть активирован при отщеплении участка пробелка с получением активного полипептида.
Оптимизация кодонов для достижения высокого уровня экспрессии белка в клетке-хозяине
Данное изобретение относится к способам модификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, вовлеченные в катаболизм хлорофилла или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), посредством модификации использования кодонов. В одном аспекте данное изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, для повышения или снижения экспрессии в клетке-хозяине. Данное изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, вовлеченные в катаболизм хлорофилла или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), модифицированные для повышения их экспрессии в клетке-хозяине, ферменты, также модифицированные, и к способам получения модифицированных полипептидов, вовлеченных в катаболизм хлорофилла или обладающих активностью эстеразы (например, хлорофиллазы). Способ включает идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительно го кодона в кодирующей фермент нуклеиновой кислоте и замену одного или нескольких из непредпочтигельных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, так чтобы по меньшей мере один непредпочтительный кодон или
- 61 013993 менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте был заменен предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту. Предпочтительный кодон представляет собой кодон, часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, и непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине.
Клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих кассет и векторов по данному изобретению, включают клетки бактерий, дрожжей, грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Таким образом, данное изобретение относится к способам оптимизации использования кодонов во всех указанных клетках, где нуклеиновые кислоты и полипептиды с измененными кодонами получают с помощью нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Иллюстративные клеткихозяина включают грамотрицательные бактерии, такие как ЕксйейсШа сой; грамположительные бактерии, такие как 8!гер!отусек, ЬасЮЬасШик даккеп, Ьас1ососсик 1асйк, ЬасЮсоссик сгетойк, ВасШик кр., ВасШик киЫШк, ВасШик сегеик. Иллюстративные клетки-хозяева также включают эукариотические организмы, например различные дрожжи, такие как 8ассйаготусек кр., включая 8ассйаготусек се^еν^к^ае, 8с1ихокасс11аготусек ротЬе, РюЫа рак!опк и К1иутеготусек 1асйк, Напкепи1а ро1утогрйа, АкрегдШик шдег, и клетки и клеточные линии млекопитающих, и клетки и клеточные линии насекомых. Таким образом, данное изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и полипептидам, оптимизированным для экспрессии в указанных организмах и видах, например нуклеиновые кислоты по данному изобретению являются оптимизированными по кодонам для экспрессии в клетке-хозяине, например в РюШа кр., например в Р. ракЮпк, 8ассйаготусек кр., или ВасШик кр., 8!гер!отусек кр. и т.п.
Например, кодоны нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по данному изобретению или сходный фермент, выделенный из бактериальной клетки, модифицируют таким образом, чтобы нуклеиновая кислота (кодирующая фермент) оптимально экспрессировалась в бактериальной клетке, отличной от бактерий, из которых фермент (например, полипептид по данному изобретению) был получен, в клетке дрожжей, грибов, в клетке растений, клетке насекомых или клетке млекопитающих. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области, см., например, патент США № 5795737; Васа (2000) Ιηΐ. 1. Рагакйок, 30:113-118; На1е (1998) Рго!ет Ехрг. РшгГ., 12:185-188; Nа^ит (2001) 1пГес!. 1ттип., 69:7250-7253. См. а1ко Nа^ит (2001) 1пГес!. 1ттип., 69:7250-7253, где описаны оптимизированные кодоны в мышиных системах; Ои!с11коигот (2002) Рго!ет Ехрг. РшгГ., 24:18-24, где описаны оптимизированные кодоны у дрожжей; Репд (2000) Вюсйетщйу, 39:15399-15409, где описаны оптимизированные кодоны в Е. сой; Нитрйгеук (2000) Рго!ет Ехрг. РипГ., 20:252-264, где описано использование оптимизированных кодонов, которые влияют на секрецию в Е. сой; Оао (2004) Вю!ес11по1. Ргод., 20:443-448, где описан ирОепе, доступный через сеть алгоритм оптимизации кодонов ДНК на основе сети.
Трансгенные животные, не относящиеся к человеку
Данное изобретение относится к трансгенным животным, не относящимся к человеку, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид, экспрессирующую кассету или вектор, или трансфецированную или трансформированную клетку по данному изобретению. Данное изобретение также относится к способам получения и использования указанных трансгенных животных, не относящихся к человеку.
Трансгенные животные, не относящиеся к человеку, могут представлять собой, например, коз, кроликов, овец, свиней, коров, крыс и мышей, содержащих нуклеиновые кислоты по данному изобретению. Эти животные могут быть использованы, например, в качестве моделей ίη νί\Ό для исследования ферментативной активности или в качестве моделей для поиска веществ, которые изменяют ферментативную активность ίη νί\Ό. Кодирующие последовательности полипептидов, предназначенные для экспрессии в трансгенных животных, не относящихся к человеку, могут быть сконструированы конститутивными или находящимися под контролем тканеспецифичных, специфичных для стадий развития или индуцибельных факторов регуляции транскрипции. Трансгенные животные, не относящиеся к человеку, могут быть разработаны и получены с использованием любого способа, известного в данной области; см., например, патенты США № 6211428; 6187992; 6156952; 6118044; 6111166; 6107541; 5959171; 5922854; 5892070; 5880327; 5891698; 5639940; 5573933; 5387742; 5087571, где описано получение и использование трансформированных клеток и яйцеклеток, и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и коров. См. также, например, Ро11оск (1999) Т 1ттипо1. МеШобк, 231:147-157, где описано получение рекомбинантных белков в молоке у трансгенных молочных животных; Вадшк1 (1999) Вю1есйпо1., 17:456-461, где демонстрируется получение трансгенных коз. В патенте США № 6211428 описано получение и использование трансгенных млекопитающих, не относящихся к человеку, в головном мозге которых экспрессируется конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК. В патенте США № 5387742 описана инъекция клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенную мышиную яйцеклетку, имплантация инъецированных яйцеклеток в ложнобеременных самок и выращивание до рождения трансгенных мышей, клетки которых экспрессируют белки, связанные с патологией при болезни Альцгеймера. В патенте США № 6187992 описано получение и использование трансгенной мыши, геном которой содержал поломку в гене, кодирующем белокпредшественник амилоида (АРР).
Для осуществления способов по данному изобретению также могут быть использованы животные
- 62 013993 с нокаутом. Например, в одном аспекте трансгенные или модифицированные животные по данному изобретению включают животное с нокаутом например мышь с нокаутом, полученную способами инженерии, для того, чтобы не происходило экспрессии эндогенного гена, который заменен геном, экспрессирующим фермент по данному изобретению, или слитый белок, содержащий фермент по данному изобретению.
Трансгенные растения и семена
Данное изобретение относится к трансгенным растениям и семенам, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид (например, полипептид, вовлеченный в катаболизм хлорофилла или обладающий активностью эстеразы (например, хлорофиллазы)), экспрессирующую кассету или вектор, или трансфецированную или трансформированную клетку по данному изобретению. Данное изобретение также относится к растительным продуктам, например, маслам, семенам, листьям, экстрактам и т.п., содержащим нуклеиновую кислоту и/или полипептид по данному изобретению. Трансгенное растение может быть двудольным (кюо!) или однодольным растением (топосо!). Данное изобретение также относится к способам получения и использования указанных трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующие полипептид по данному изобретению, могут быть сконструированы в соответствии с любым способом, известным в данной области. См., например, патент США № 6309872.
Нуклеиновые кислоты и экспрессирующие конструкции по данному изобретению могут быть введены в клетку растений любыми способами. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут быть встроены в геном желаемого растительного хозяина, или нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут представлять собой эписомы. Встраивание в геном желаемого растения может быть таким, чтобы эндогенные элементы контроля транскрипции и/или трансляции хозяина регулировали активность введенной нуклеиновой кислоты как встроенной, так и эписомальной. Данное изобретение также относится к растениям с нокаутом, где вставка последовательности гена, например, посредством гомологичной рекомбинации нарушает экспрессию эндогенного гена. Способы получения растений с нокаутом хорошо известны в данной области, см., например, 81герр (1998) Ргос. N311. Асак. 8сг, И8А, 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап! й., 7:359-365. См. описание трансгенных растений ниже.
Нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть использованы для придания желаемых свойств, по существу, любому растению, например растениям, продуцирующим крахмал, таким как картофель, пшеница, рис, ячмень и т. п. Нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут быть использованы для управления метаболическими путями растений в целях оптимизации или изменения экспрессии полипептида хозяина по данному изобретению или гомологичного фермента в хозяине. Это может изменять активность фермента (например, хлорофиллазы) или продукт биосинтетического пути (путь деградации хлорофилла) в растении. Альтернативно, фермент или нуклеиновая кислота по данному изобретению могут быть использованы для получения трансгенного растения для продуцирования соединения, которое в природе растением не продуцируется. Это может привести к снижению стоимости продукции или к получению нового продукта.
В одном аспекте первая стадия продукции трансгенного растения включает получение экспрессирующей конструкции для экспрессии в клетке растений. Эти технологии хорошо известны в данной области. Они могут включать выбор и клонирование промотора кодирующей последовательности для облегчения связывания рибосом с мРНК и выбор подходящей последовательности терминатора гена. Одним иллюстративным конститутивным промотором является СаМУ358 из вируса мозаики цветной капусты, который, как правило, вызывает высокий уровень экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и отвечают на сигнал из внутренней и наружной окружающей среды растения. Иллюстративным индуцируемым светом промотором является промотор гена саЬ, кодирующего основной связывающий хлорофилл а/Ь белок.
В одном аспекте нуклеиновую кислоту модифицируют для достижения более высокой экспрессии в клетке растений. Например, последовательность по данному изобретению может иметь более высокое процентное содержание нуклеотидных пар А-Т по сравнению с содержанием, которое обнаруживается в растении, в некоторых из которых преобладают нуклеотидные пары С-С. Таким образом, нуклеотиды А-Т в кодирующей последовательности могут быть заменены нуклеотидами С-С без значительного изменения аминокислотной последовательности для повышения продуцирования продукта гена в клетках растений.
Ген селективного маркера может быть добавлен в конструкцию гена для идентификации клеток растений или ткани, в которых успешно интегрировался трансген. Это может быть необходимым, поскольку достижение встраивания и экспрессии генов в клетках растений является редким случаем, происходящим только в нескольких процентах тканей-мишеней или клеток-мишеней. Гены селективных маркеров кодируют белки, которые придают устойчивость к средствам, которые обычно токсичны для растений, таким как противомикробные средства или гербициды. Только те клетки растений, которые обладают встроенным геном селектируемого маркера, выживают при выращивании на среде, содержащей соответствующее противомикробное средство или гербицид. Как и в случае других встраиваемых генов, для правильного функционирования маркерных генов также необходимы промоторная и термина- 63 013993 торная последовательности.
В одном аспекте получение трансгенных растений или семян включает встраивание последовательности по данному изобретению и, необязательно, маркерных генов в выбранную экспрессирующую конструкцию (например, плазмиду) совместно с внесением промоторной и терминаторной последовательностей. Это может включать перенос модифицированного гена в растение с помощью приемлемого способа. Например, конструкция может быть встроена непосредственно в геномную ДНК клетки растений с использованием способов, таких как электропорация и микроинъекция в протопласты клетки растений, или конструкции могут быть введены непосредственно в ткань растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Например, см., например, С11пз!ои (1997) Ρίπτι! Мо1. Вю1., 35:197-203; 1кп\1о\\зк1 (1996) Мо1. Вю1есйпо1., 6:17-30; К1ет (1987) N3^16, 327:70-73; Такит1 (1997) Сепез Сепе!. Зуз!., 72:63-69, где обсуждается использование бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшено; и Абат (1997) выше использования бомбардировки частицами для введения УАС в клетки растений. Например, Ктейай (1997) выше использовал бомбардировку частицами для получения трансгенных хлопковых растений. Устройство для ускорения частиц описано в патенте США № 5015580; и коммерчески доступным является устройство для ускорения частиц ВюКаб (ВюНзйсз) Ρ^З-2000; см. также 1ойи, патент США № 5608148 и ЕШз, патент США № 5681730, где описана опосредуемая частицами трансформация голосемянных.
В одном аспекте протопласты могут быть иммобилизованы и инъецированы нуклеиновыми кислотами, например экспрессирующей конструкцией. Несмотря на то что регенерация из протопластов не является легкой для зерновых, регенерация растений возможна в бобовых с использованием соматического эмбриогенеза из каллюса, полученного из протопласта. Сформированные ткани могут быть трансформированы депротеинизированной ДНК с использованием технологии с генной пушкой, где ДНК покрывают вольфрамовыми быстролетящими микрочастицами, пробивающими 1/100 размера клетки, что приводит к переносу ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем в трансформированной ткани индуцируется регенерация, как правило, посредством соматического эмбриогенеза. Этот способ оказался успешным для некоторых видов зерновых, включая маис и рис.
Нуклеиновые кислоты, например экспрессирующие конструкции, также могут быть введены в клетки растений с использованием рекомбинантных вирусов. Клетки растений могут быть трансформированы с использованием вирусных векторов, таких как, например, векторы, полученные из вируса табачной мозаики (Коитепба1 (1997) ΡΗπΐ Мо1. Вю1., 33:989-999), см. Ρо^!а (1996) Изе оГ νίπιΐ герКсопз Гог !11е ехргеззюп оГ депез ш р1ап!з, Мо1. В1о1есЬпо1., 5:209-221.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например экспрессирующие конструкции, могут быть комбинированы с подходящими фланкирующими участками Т-ДНК и введены в традиционный векторхозяин Адгойас1егшт !итеГас1епз. Функция вирулентности хозяина АдгоЬас1егшт !итеГас1епз направляет вставку конструкции и соседнего маркера в ДНК клетки растения при инфицировании клетки бактериями. Способ трансформации, опосредованный АдгоЬас1егшт ШтеГааепз, включая нейтрализацию и использование бинарных векторов, подробно описан в научной литературе. См., например, НогзсН (1984) Заепсе, 233:496-498; Ега1еу (1983) Ριό^ №11. Асаб. ЗсЬ, ИЗА, 80:4803 (1983); Сепе ТгапзГег !о ΡΠώδ, Ρоΐгукиз, еб. (Зргтдег-Уег1ад, Вег1ш 1995). ДНК в клетке А. !итеГас1епз находится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как плазмида Т1 (индуцирующая опухоль). Т1-плазмида содержит участок ДНК, называемый Т-ДНК (длина ~20 т.п.н.), который переносится в клетку растений в процессе инфекции, и набор генов νπ (вирулентность), которые управляют процессом инфекции. А. !итеГааепз может инфицировать растение только через повреждения: при повреждении корня или стебля оно подает определенные химические сигналы, в ответ на которые активируются гены νίΓ А. ТитеГааепз, и они направляют ряд событий по переносу Т-ДНК из Т1-плазмида в хромосому растения. Затем Т-ДНК проникает в клетку растений через повреждение. Существует предположение, что Т-ДНК ждет репликации и транскрипции ДНК растения, а затем встраивается в доступную ДНК растения. Для того чтобы использовать А. ШтеГааепз в качестве трансгенного вектора, необходимо удалить индуцирующий опухоль фрагмент Т-ДНК при сохранении краевых участков Т-ДНК и генов νίΓ. Затем встраивают трансген между краевыми участками Т-ДНК, где он перемещается в клетку растений и встраивается в хромосомы растений.
Данное изобретение относится к трансформации однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот по данному изобретению, включая основные злаковые, см. Н1е1 (1997) Ρίπΐ'ΐ! Мо1. В1о1., 35:205-218. См. также, например, Ногзсй, Зс1епсе (1984) 233:496; Ега1еу (1983) ΡΐΌα №11. Асаб. Зс1, ИЗА, 80:4803; Т11ук)аег (1997) выше; Ρπγ1< (1996) Ρίπτι! Мо1. Вю1., 32:1135-1148, где описано встраивание Т-ДНК в геномную ДНК. См. также П'На11шп, патент США № 5712135, где описан способ стабильного встраивания ДНК, содержащей ген, который является функциональным в клетке зерновых или других однодольных растений.
В одном аспекте третья стадия может включать селекцию и регенерацию всех растений, способных передавать встроенный целевой ген следующему поколению. Такие способы регенерации основаны на методиках с определенными фитогормонами в среде для выращивания культуры ткани, как правило, на основе биоцидного и/или гербицидного маркера, который вводится вместе с желательными нуклеотид
- 64 013993 ными последовательностями. Регенерация растений из культивированных протопластов описана Еνаηк е! а1., в Ртокр1ак1к !ко1а11оп апб Сибите, НапбЬоок оГ Р1ап! Се11. Сибите, р. 124-176, МасМПШап РиЫкбтд Сотрапу, Хе\ν Уотк, 1983 и Вшбтд, Кедепетабоп оГ Р1ап!к, Р1ап! Ртокр1ак1к, р. 21-73, СКС Ргекк, Воса Ка!оп, 1985. Регенерации также можно добиться из каллюса растений, эксплантатов, органов или их частей. Такие способы регенерации описаны, главным образом, К1ее (1987) в Апп. Кем. оГ Р1ап! Рбук., 38:467-486. Для получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, они могут быть выращены под контролем окружающих условий на ряде сред, содержащих пищевые добавки и гормоны, по способу, известному как культура тканей. После получения целого растения и получения семян начинается оценка потомства.
После того как экспрессирующая кассета стабильно встроена в трансгенные растения, она может быть введена в другие растения посредством полового скрещивания. Может быть использован любой из различных стандартных способов выведения в зависимости от вида, предназначенного для скрещивания. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот по данному изобретению приводит к изменениям фенотипа, то можно осуществить половое скрещивание растений, содержащих рекомбинантные нуклеиновые кислоты по данному изобретению, со вторым растением для получения конечного продукта. Таким образом, семя по данному изобретению может быть получено при скрещивании двух трансгенных растений по данному изобретению или при скрещивании растения по данному изобретению и другого растения. Желаемые эффекты (например, экспрессия полипептидов по данному изобретению с получением растения, в котором изменен характер цветения или образования семян) могут быть усилены, если оба родительских растения экспрессируют полипептиды по данному изобретению. Желаемые эффекты могут быть переданы последующим поколениям растений стандартными способами размножения.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды по данному изобретению экспрессируются в любом растении или семени или встроены в него. Трансгенные растения по данному изобретению могут представлять собой двудольные или однодольные растения. Примерами однодольных трансгенных растений по данному изобретению являются травы, такие как мятлик луговой (мятлик, Роа), кормовая трава, такая как овсянница, райграс, медленно растущая трава, такая как Адтокбк, и зерновые, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примерами двудольных трансгенных растений по данному изобретению являются табак, бобовые, такие как люпины, картофель, свекла сахарная, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Втакккасеае), такие как цветная капуста, рапс и близко родственная модель организма АтаЫборкк 1бабапа. Таким образом, трансгенные растения и семена по данному изобретению включают широкий диапазон растений, включая, но, не ограничиваясь ими, виды из родов Апасатбшт, АгасЫк, Акрагадик, Абора, Ауепа, Втаккка, Сйгик, Сйгибик, Сарккит, Саббатик, Сосок, СоГГеа, Сисит1к, СисигЬйа, Паисик, Е1ае1к, Ргадаба, 61усше, Ооккуршт, НебаШбик, Не1егосаШк, Ногбеит, Нуоксуатик, Ьаскса, Ьтит, бойит, Еиртик, Ьусорегккоп, Ма1ик, МатбоЕ Ма_)огапа, Мебкадо, Мсобапа, 01еа, 0гу/а, Рапкит, Рапткект, Регкеа, Рбакео1ик, Р1к1асб1а, Ркит, Ругик, Ргипик, Карбапик, Ккшик, 8еса1е, 8епеск, 8тарк, 8о1абит, 8огдбит, ТбеоЬготик, Тпдопе11а, Тббсит, Ук1а, У1бк, У1дпа и 2еа.
В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по данному изобретению экспрессированы в растениях, которые содержат волокнистые клетки, включая, например, хлопок, хлопковое дерево (капок, Се1ба реп!апбга), иву пустынную, креозотовый куст, терескен шерстистый, бальзу, рами, кенаф, коноплю, розель, джут, сизаль, абаку и лен. В альтернативных вариантах осуществления трансгенные растения по данному изобретению могут являться членами рода 6оккуршт, включая члены любого из видов 6оккуршт, такие как 6. агЬогеит; 6. бегЬасеит, 6. ЬагЬабепке и 6. Ыгкикт.
Данное изобретение также относится к трансгенным растениям, предназначенным для использования при получении больших количеств полипептидов (например, ферментов или антител) по данному изобретению. Например, см. Ра1тдгеп (1997) Тгепбк 6епе!., 13:348; Сбопд (1997) Тгапкдешс Кек., 6:289296 (где продуцируется человеческий белок молока бета-казеин в трансгенных растениях картофеля с использованием ауксин-индуцируемого двунаправленного промотора маннопин-синтеназы (так1',2') с опосредуемыми АдгоЬаскбит ШтеГаскпк способами трансформации в пластинке листа).
Используя известные методики, специалист в данной области может проводить отбор растений по данному изобретению, определяя повышение или снижение количества трансгенной мРНК или белка в трансгенном растении. Средства для определения и количественной оценки мРНК или белков хорошо известны в данной области.
Полипептиды и пептиды
В одном аспекте данное изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, имеющим идентичность последовательностей (например, по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5% или более, или полную (100%) идентичность последовательностей) с иллюстративной последовательностью по данному изобретению, например с белками, имеющими последовательность, как указано в 8ЕО ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8ЕО ΙΌ N0: 6, 8ЕО ΙΌ N0: 8, 8ЕО ΙΌ N0: 10, 8ЕО ΙΌ N0: 12, 8ЕО ΙΌ N0: 14, 8ЕО ΙΌ N0: 16, 8ЕО ΙΌ N0: 18 или 8ЕО ΙΌ N0: 20.
- 65 013993
В одном аспекте полипептид по данному изобретению обладает активностью эстеразы, такой как активность хлорофиллазы (сЬ1аке), или обладает ферментативной активностью, включающей ферментативную модификацию молекулы хлорофиллы, например, где ферментативная модификация заключается в катаболизме молекулы хлорофилла. В одном аспекте активность эстеразы включает активность хлорофилл-хлорофиллидо-гидролазы.
Другой аспект данного изобретения относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному полипептиду или пептиду, включающему по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100, или более последовательно расположенных оснований последовательности полипептида или пептида по данному изобретению, последовательностей, по существу, идентичных ему, и последовательностей, комплементарных им. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, участок связывания), сигнальную последовательность, препропоследовательность или каталитические домены (СО), или активный центр.
Данное изобретение также относится к химерным полипептидам (нуклеиновым кислотам, кодирующим их), содержащим по меньшей мере два фермента по данному изобретению или их подпоследовательности, например активные центры или каталитические домены (СО). Химерный белок по данному изобретению (например, слитый белок или другой гетеродимер, например, два соединенных друг с другом другими способами домена, например, с помощью линкера или электростатически) может содержать полипептид (например, пептид с активным центром или каталитическим доменом) по данному изобретению и другой полипептид (например, пептид с активным центром или каталитическим доменом) по данному изобретению или другой полипептид. Например, химерный белок по данному изобретению может обладать любой активностью полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), например, как описано в данном описании. В одном аспекте химерный белок по данному изобретению содержит слитые домены, например единичный домен может проявлять один вид активности или любую комбинацию видов активности.
Полипептиды по данному изобретению включают ферменты в активной и неактивной форме. Например, полипептиды по данному изобретению включают пробелки перед созреванием или процессингом препропоследовательностей, например ферментом процессинга пробелка, таким как конвертаза пробелка, с получением активного зрелого белка. Полипептиды по данному изобретению включают ферменты, неактивные по другим причинам, например перед активацией посредством событий посттрансляционного процессинга, например, воздействия эндо- и экзопептидаз или протеаз, событий фосфорилирования, амидирования, гликозилирования или сульфатации, событий димеризации и т. п. Полипептиды по данному изобретению включают все активные формы ферментов, включая активные подпоследовательности, например каталитические домены или активные центры.
Способы идентификации последовательностей препро-домена и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области, см., например, Уап йе Уеп (1993) СгО. Κον. 0псод., 4 (2): 115-136. Например, для идентификации препропоследовательности белок очищают от экстрацеллюлярного окружения и N-концевую белковую последовательность определяют и сравнивают с непроцессированной формой.
Данное изобретение относится к полипептидам с сигнальной последовательностью и/или препропоследовательностью или без них. Данное изобретение относится к полипептидам с гетерологичными сигнальными последовательностями и/или препропоследовательностями. Препропоследовательность (включая последовательность по данному изобретению, используемую в качестве гетерологичного препродомена) может быть локализована на Юконце или на С-конце белка. Данное изобретение также относится к выделенным или рекомбинантным сигнальным последовательностям, препропоследовательностям и каталитическим доменам (например, активным центрам), содержащим последовательности по данному изобретению.
Процентная идентичность последовательностей может существовать на протяжении полной длины полипептида или идентичность может существовать на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков. Полипептиды по данному изобретению также могут быть короче, чем полная длина иллюстративных полипептидов. В альтернативных аспектах данное изобретение относится к полипептидам (пептидам, фрагментам) с размером, находящимся в диапазоне приблизительно от 5 остатков и полной длины полипептида, например фермента по данному изобретению; иллюстративные размеры составляют приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков, например смежных остатков иллюстративных ферментов по данному изобретению.
Пептиды по данному изобретению (например, подпоследовательность иллюстративного полипептида по данному изобретению) могут быть полезными в качестве, например, зондов для внесения метки, антигенов, толерагенов, мотивов, активных центров ферментов (например, каталитических доменов ферментов по данному изобретению), участков связывания ферментов по данному изобретению, сигнальных последовательностей и/или препродоменов.
Полипептиды и пептиды по данному изобретению могут быть выделены из природных источников,
- 66 013993 могут представлять собой синтетические полипептиды или полипептиды, полученные в результате рекомбинации. Пептиды и белки могут быть экспрессированы посредством рекомбинации ш νίΙΐΌ или ΐπ νί\Ό. Пептиды и полипептиды по данному изобретению могут быть получены и выделены с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептид и пептиды по данному изобретению также могут быть синтезированы, целиком или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. См. например, СагиНегк (1980) N1.1^+ Ас1к. Кек. 8утр. 8ег., 215-223; Нот (1980) Шсйю Ас1к Кек. 8утр. 8ег., 225-232; Вапда А.К., Ткегареикс Рерккек апк Рго!етк, Еогти1акоп, Ргосекктд апк Ре1ц'егу 8ук!етк (1995) ТесЬпотю РиЬккЫпд Со., Ьапсак!ег, РА. Например, синтез пептида может быть проведен с использованием различных твердофазных способов (см., например, КоЬегде (1995) 8с1епсе 269:202; Метйе1к (1997) Ме!кокк Епхуто1., 289:3-13) и может быть применен автоматический синтез, например, с использованием АВ1 431 А Реркке 8уп1кек1/ег (Регкт Е1тег) с соответствием с инструкциями, предоставляемыми изготовителем.
Пептиды и полипептиды по данному изобретению также могут быть гликозилированными. Гликозилирование может быть добавлено посттрансляционно либо химически, либо клеточными биосинтетическими механизмами, где последние включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными в последовательности или могут быть добавлены в виде пептида, или могут быть добавлены в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может представлять собой О-гликозилирование или ^гликозилирование.
Пептиды и полипептиды по данному изобретению, как определено выше, включают все формы миметиков и пептидомиметиков. Термины миметик и пептидомиметик относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладает, по существу, такими же структурными и/или функциональными характеристиками, что и полипептиды по данному изобретению. Миметик может либо целиком состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо он представляет собой химерную молекулу частично с аминокислотами природных пептидов и частично с аналогами аминокислот. Миметик также может включать любое количество консервативных замен природных аминокислот, поскольку такие замены также, по существу, не изменяют структуру и/или активность миметика. Как в случае полипептидов по данному изобретению, которые представляют собой консервативные варианты, общепринятые способы экспериментирования дадут возможность определить, что миметик входит в объем данного изобретения, т.е. что его структура и/или функция, по существу, не отличаются от иллюстративного полипептида по данному изобретению. В одном аспекте композиция миметика используется в композиции, клеточной системе или процессе по данному изобретению (например, в клеткехозяине с плазмидой, экспрессирующей по меньшей мере один фермент по данному изобретению).
Композиции миметиков полипептидов по данному изобретению могут содержать любую комбинацию неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте композиции миметиков по данному изобретению включают одну или все из следующих трех структурных групп: а) группы со связью с остатками, отличной от природной амидной связи (пептидная связь); Ь) неприродные остатки вместо природных аминокислотных остатков или с) остатки, которые приводят к вторичной структурной мимикрии, т.е. к индуцированию или стабилизации вторичной структуры, например конформации бетапетли, гамма-петли, бета-слоя, альфа-спирали и т.п. Например, полипептид по данному изобретению может быть охарактеризован как миметик, если все или некоторые его остатки присоединены химическими способами, отличными от природных пептидных связей. Отдельные остатки пептидомимика могут быть соединены пептидными связями, другими химическими связями или способами конденсации, такими как, например, в случае глутаральдегида, сложных эфиров N-гидроксисукцинимида, бифункциональных малеинимидов, N,N'-дициклогексилкарбодиимида (ЭСС) или -диизопропилкарбодиимида (Р1С). Присоединенные группы, которые могут быть альтернативными традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(О)-СН2- для -С^^КН-), аминометилен (СШ-ХН), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-О), тиоэфир (СН2-8), тетразол (С^-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, 8ра!о1а (1983) в Скет1к!гу апк ВюскетЦку о’ Атто ас1кк, Рерккек апк Рго!етк, νο1. 7, р. 267-357, Реркке ВаскЬопе МокШсакопк, Магсе11 Эеккег, NΥ).
Полипептид по данному изобретению также может быть охарактеризован в качестве миметика по наличию всех или нескольких неприродных остатков на месте природных аминокислотных остатков. Неприродные остатки полностью описаны в научной и патентной литературе; некоторые иллюстративные неприродные композиции, подходящие в качестве миметиков природных аминокислотных остатков и руководства, описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот могут быть получены заменой, например Ό- или Ь-нафтилаланином; Ό- или Ь-фенилглицином; Ό-или Ь-2-тиенилаланином; Ό- или Ь-1, -2,3- или 4-пиренилаланином; Ό- или Ь-3-тиенилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(3-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2-пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; Р-(трифторметил)фенилглицином; Р-(трифторметил)фенилаланином; Ό-п-фторфенилаланином; Ό- или Ь-п-бифенилфенилаланином; Ό- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином; Ό- или Ь-2-индол(алкил)аланинами; и Ό- или Ь-алкиламинами, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, вторичный изобутил, изо
- 67 013993 пентил или некислотные аминокислоты.
Ароматические кольца неприродных аминокислот включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.
Миметики кислых аминокислот могут быть получены заменой, например некарабоксилатными аминокислотами при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартильная или глутамильная) также могут быть селективно модифицированными посредством реакции с карбоимидами (К'-Ы-С-Н-К'), такими как, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил также могут быть превращены в остатки аспарагинила и глутаминила реакцией с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут быть получены заменой, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислот орнитином, цитруллином или гуанидинуксусной кислотой, или гуанидиналкилуксусной кислотой, где алкил определен выше. Производное нитрила (например, содержащее С№группу вместо СООН) может быть заменено аспарагином или глутамином. Остатки аспарагинила и глутаминила могут быть дезаминированы до соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики аргининовых остатков могут быть получены реакцией аргинила, например, с одним или несколькими общепринятыми реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, в одном аспекте в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина могут быть получены реакцией тирозила, например, с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Ν-ацетилимидазол и тетранитрометан могут быть использованы для образования О-ацетилтирозильных продуктов и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики остатка цистеина могут быть получены реакцией остатков цистеинила, например, с альфа-галоацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующими аминами; с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Миметики цистеиновых остатков также могут быть получены реакцией остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5имидозоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, Ν-алкилмилеинимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом; метил-2-пиридилдисульфидом; п-хлорртутьбензоатом; 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина могут быть получены (и Ν-концевые остатки могут быть изменены) реакцией лизинила, например, с ангидридом янтарной или другой карбоновой кислоты. Лизин и другие альфа-аминосодержащие остатки также могут быть получены реакцией с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и реакцией с глиоксилатом, катализируемой трансамидазой. Миметики метионина могут быть получены реакцией, например, с сульфоксидом метионина. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3диметилпролин. Миметики гистидиновых остатков могут быть получены реакцией гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, миметики, полученные гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп остатков серила или треонила; метилированием альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием Ν-концевого амина; метилированием остатков амида главной цепи или заменой Ν-метиламинокислотами; или амидированием С-концевых карбоксильных групп.
Остаток полипептида, например аминокислота, по данному изобретению также может быть заменен аминокислотой (или остатком пептидомиметика) с противоположной хиральностью. Таким образом, любая аминокислота, встречающаяся в природе в Ь-конфигурации (которая также может называться К или 8 в зависимости от целостной химической структуры), может быть заменена аминокислотой такого же структурного типа или пептидомиметиком, но с противоположной хиральностью, называемой Ό-аминокислотой, но также может называться К- или 8-формой.
Данное изобретение также относится к способам модификации полипептидов по данному изобретению либо посредством природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), либо посредством способов химической модификации и полученных модифицированных полипептидов. Модификации могут быть осуществлены на любом участке полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и Ν- или С-концы. Следует понимать, что один и тот же тип модификации может быть выражен в той же или другой степени в разных участках данного полипептида. Также данный полипептид может иметь многие типы модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АЭР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СРЬякоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в бе
- 68 013993 лок, такую как аргинилирование. См., например, Сге1д1Иоп Т.Е. Рго1етк -81гис1иге апб Мо1еси1аг РгорегИек 2пб Еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1993); Рокйгапк1акопа1 Сота1еп1 МобШсайоп оГ Рго1етк, В.С. 1ойпкоп, Еб., Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, р. 1-12 (1983).
Твердофазные способы химического синтеза пептидов также могут быть использованы для синтеза полипептида или фрагментов по данному изобретению. Такой способ известен в данной области с начала 1960-х (Метйе1б В.В., 1. Ат. С1ет. 8ос., 85:2149-2154, 1963) (См. также 81е^ай 1.М. апб Уоипд Ι.Ό., 8о11б Р1аке Рерйбе 8упШек1к, 2пб Еб., Р1егсе С1етка1 Со., ВоскГогб, 111, р. 11-12)) и в последнее время используется в коммерчески доступных лабораторных наборах для разработки и синтеза пептидов (СатЬпбде Векеагск Вюсйетюа1к). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, используются идеи Н.М. Сеукеп е! а1., Ргос. Асаб. 8е!., И8А, 81:3998 (1984) и они обеспечивают синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых соединены в едином планшете. При использовании такой системы планшет со стержнями или булавками переворачивают и вставляют во второй планшет с соответствующими лунками или резервуарами, которые содержат растворы для присоединения или заякоривания соответствующей аминокислоты на концах стержней или шпилек. При повторении этой стадии процесса, т.е. переворачивание и помещение концов стержней и булавок в соответствующие растворы, из аминокислот выстраиваются желаемые пептиды. Кроме того, является доступным ряд доступных систем для синтеза пептидов РМОС. Например, сборку полипептида или фрагмента можно осуществить на твердой подложке с использованием устройства для автоматического синтеза пептидов Аррйеб Вюкуйетк, 1пс. Мобе1 431 АТМ. Такое оборудование обеспечивает легкую доступность пептидов по данному изобретению либо непосредственным синтезом, либо синтезом ряда фрагментов, которые сочетают с использованием других известных способов.
Данное изобретение относится к полипептидам по данному изобретению с сигнальной последовательностью или без нее. Полипептид, содержащий сигнальную последовательность по данному изобретению, может представлять собой полипептид по данному изобретению или другой полипептид.
Данное изобретение относится к иммобилизованным полипептидам по данному изобретению, включая ферменты, антитела и их фрагменты. Данное изобретение относится к способам ингибирования активности полипептида, например, с использованием доминантно-негативных мутантов или антител по данному изобретению. Данное изобретение относится к гетерокомплексам, например слитым белкам, гетеродимерам и т.д., содержащим ферменты по данному изобретению.
Полипептиды по данному изобретению могут обладать ферментативной активностью в различных условиях, например при крайних значениях рН и/или температуры, количества оксидирующих агентов и т.п. Данное изобретение относится к способам, приводящим к получению альтернативных ферментных препаратов с различной каталитической эффективностью и стабильностью, например, в отношении температуры, оксидирующих агентов и изменению условий промывания. В одном аспекте варианты ферментов могут быть получены с использованием способов сайт-направленного мутагенеза и/или случайного мутагенеза. В одном аспекте направленные изменения могут быть использованы для получения большого числа вариантов ферментов с альтернативной специфичностью и стабильностью.
Белки по данному изобретению также полезны в качестве экспериментальных реагентов для идентификации модуляторов ферментов, например активаторов или ингибиторов ферментативной активности. В кратком изложении, анализируемые образцы (соединения, бульоны, экстракты и т.п.) добавляют к образцу фермента для определения их способности ингибировать расщепление субстрата. Ингибиторы, идентифицированные таким способом, могут быть использованы в промышленности и исследованиях для снижения или предотвращения нежелательного протеолиза. Ингибиторы ферментов могут быть комбинированы для повышения диапазона активности.
Данное изобретение также относится к способам выявления новых ферментов, обладающих активностью, аналогичной активности фермента по данному изобретению, с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител по данному изобретению. В одном аспекте проводят скрининг библиотек фагмид для выявления на основании экспрессии нового фермента. В другом аспекте проводят скрининг библиотек фага лямбда для выявления на основе экспрессии нового фермента. Скрининг библиотек фагов или фагмид может обеспечить определение токсичных клонов; улучшение доступа к субстрату; снижение необходимости в получении способами инженерии хозяина, обход потенциальных любых ошибок, возникающих вследствие множественных удалений в библиотеках; и ускорение роста при низких плотностях клонов. Скрининг библиотек фагов или фагмид можно проводить в жидкой фазе или в твердой фазе. В одном аспекте данное изобретение относится к скринингу в жидкой фазе. Это обеспечивает большую универсальность условий анализа; дополнительную универсальность субстрата; повышенную чувствительность для слабых клонов и легкость автоматизации по сравнению с твердофазным анализом.
Данное изобретение относится к способам скрининга с использованием белков и нуклеиновых кислот по данному изобретению и роботизации для обеспечения выполнения тысяч биокаталитических реакций и скрининга за короткий период времени, например за сутки, а также для обеспечения высокого уровня точности и воспроизводимости (см. описание матриц ниже). В результате, библиотека производных соединений может быть получена всего за несколько недель. Для других описаний модификаций
- 69 013993 молекул, включая малые молекулы, см. РСТ/И8 94/09174.
Другим аспектом данного изобретения является выделенный или очищенный полипептид, содержащий последовательность одного из полипептидов по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот. Как описано выше, такие полипептиды могут быть получены встраиванием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид в вектор, так чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с последовательностью, способной направлять экспрессию кодируемого полипептида в подходящей клетке-хозяине. Например, экспрессирующий вектор может содержать промотор, участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может содержать подходящие последовательности для усиления экспрессии.
Другим аспектом данного изобретения являются полипептиды или их фрагменты, которые имеют по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или более чем приблизительно 95% идентичность последовательностей (гомологию) с одним из полипептидов по данному изобретению, или фрагментом, содержащим по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более его последовательно расположенных аминокислот. Идентичность последовательностей (гомология) может быть определена с использованием любой из программ, описанных выше, которая выравнивает сравниваемые полипептиды или фрагменты и определяет степень идентичности аминокислот или сходство между ними. Следует понимать, что эквивалентность аминокислот или идентичность, или гомология включает консервативные аминокислотные замены, такие как описано выше.
Полипептиды или фрагменты, обладающие гомологией с одним из полипептидов по данному изобретению или фрагментом, содержащим по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, могут быть получены выделением нуклеиновых кислот, кодирующих их, с использованием описанных выше способов.
Альтернативно, гомологичные полипептиды или фрагменты могут быть получены методами биохимического насыщения или очистки. Последовательность потенциально гомологичных полипептидов или фрагментов может быть определена анализом активности, гель-электрофорезом и/или микросеквенированием. Последовательность предполагаемого гомологичного полипептида или фрагмента может быть сравнена с одним из полипептидов по данному изобретению или фрагментом, содержащим по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, с использованием любой из описанных выше программ.
Другим аспектом данного изобретения является анализ для идентификации фрагментов или вариантов по данному изобретению, которые сохраняют ферментативную функцию полипептидов по данному изобретению. Например, фрагменты или варианты полипептидов по данному изобретению могут быть использованы для катализа биохимических реакций, который показывает, что фрагмент или вариант сохраняет ферментативную активность полипептида по данному изобретению.
Анализ для определения того, сохраняют ли фрагменты вариантов ферментативную активность полипептидов по данному изобретению, включает стадии: осуществления взаимодействия полипептидного фрагмента или варианта молекулой субстрата в условиях, которые дают возможность полипептидному фрагменту или варианту функционировать, и определения либо снижения уровня субстрата, либо повышения уровня конкретного продукта реакции между полипептидом и субстратом.
Полипептиды по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот могут быть использованы в различных областях применения. Например, полипептиды или их фрагменты могут быть использованы для катализа биохимических реакций. В соответствии с одним аспектом данного изобретения предоставляется способ с использованием полипептидов по данному изобретению или полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды, для гидролиза сложноэфирных связей. По таким методикам субстрат, содержащий сложноэфирную связь (например, хлорофилл), контактируют с одним из полипептидов по данному изобретению или с последовательностями, по существу, ему идентичными, в условиях, которые облегчают гидролиз сложноэфирной связи.
В соответствии с настоящим изобретением используют определенные каталитические свойства ферментов. В то время как использование биокатализаторов (т.е. очищенных или неочищенных ферментов, неживых или живых клеток) в химических превращениях обычно требует идентификации конкретного биокатализатора, который взаимодействует с конкретным исходным соединением, в соответствии с настоящим изобретением используют подобранные биокатализаторы и условия реакции, которые являются особыми для функциональных групп, которые находятся в различных исходных соединениях, таких как малые молекулы. Каждый биокатализатор специфичен для одной функциональной группы или нескольких сходных функциональных групп и может взаимодействовать с различными исходными соединениями, содержащими эту функциональную группу.
Биокаталитические реакции приводят к получению группы производных из единственного исход
- 70 013993 ного соединения. Эти производные могут быть подвергнуты другому циклу биокаталитических реакций с получением второй группы производных соединений. Тысячи вариантов исходных малых молекул или соединений может быть получено при каждом повторе биокаталитического получения производных.
Ферменты действуют на конкретные участки исходного соединения, не влияя на остальную часть молекулы, что представляет собой процесс, который очень сложно добиться с использованием традиционных химических способов. Такая высокая степень биокаталитической специфичности обеспечивает способы идентификации единственного активного соединения из библиотеки. Библиотека характеризуется рядом биокаталитических реакций, используемых для ее получения, так называемой биосинтетической историей. Скрининг библиотеки на виды биологической активности и прослеживание биосинтетической истории дает возможность идентифицировать конкретную последовательность реакций получения активного соединения. Последовательность реакций повторяют и определяют структуру синтезированного соединения. Этот способ идентификации, в отличие от других подходов синтеза и тестирования, не требует технологий иммобилизации, и соединения могут быть синтезированы и проанализированы в свободной форме в растворе с использованием практически любого типа скрининга. Важно отметить, что высокая степень специфичности ферментативных реакций для функциональных групп дает возможность проследить конкретные ферментативные реакции, посредством которых была создана биокаталитически полученная библиотека.
Множество стадий по методикам осуществляют с использованием роботизации, способной выполнять тысячи биокаталитических реакций и анализов для отбора в сутки, а также обеспечивать высокий уровень точности и воспроизводимости. В результате за несколько недель может быть получена библиотека производных соединений, которая отняла бы год для ее получения с использованием современных химических способов.
В конкретном аспекте данное изобретение относится к способу модификации малых молекул, включающему контактирование полипептида, кодируемого описанным в данном описании полинуклеотидом, или его ферментативно активных фрагментов с малой молекулой с получением модифицированной малой молекулы. Библиотеку модифицированных малых молекул анализируют для определения, присутствует ли в библиотеке модифицированная малая молекула, которая проявляет желаемую активность. Конкретную биокаталитическую реакцию, по которой получают модифицированную малую молекулу с желаемой активностью, идентифицируют систематическим удалением каждой из биокаталитических реакций, используемых для получения части библиотеки, и затем анализом малых молекул, полученных в части библиотеки, на наличие или отсутствие модифицированной малой молекулы с желаемой активностью. Конкретные биокаталитические реакции, по которым получают модифицированную малую молекулу с желаемой активностью, необязательно повторяют. Биокаталитические реакции проводят с группой биокатализаторов, которые взаимодействуют с определенными структурными группами, находящимися в структуре малой молекулы, где каждый катализатор специфичен для одной структурной группы или группы сходных структурных групп; и каждый биокатализатор взаимодействует с множеством различных малых молекул, которые содержат определенную структурную группу.
Сигнальные последовательности, препропоследовательности, связывающие домены и каталитические домены
Данное изобретение относится к сигнальным последовательностям ферментов (например, сигнальным пептидам (8Р)), препродоменам, связывающим доменам и каталитическим доменам (СР) (например, активным центрам). 8Р, препродомены и/или СР по данному изобретению могут быть выделенными или рекомбинантными пептидами или могут быть частью слитого белка, например, в качестве гетерологичного домена в химерном белке. Данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти каталитические домены (СР), препродомены и сигнальные последовательности (8Р, например, пептид с последовательностью, содержащей/состоящий из Ν-концевых остатков полипептида по данному изобретению). В одном аспекте данное изобретение относится к сигнальной последовательности, содержащей пептид, содержащий/состоящий из последовательности, как указано, с остатками 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1 с по 28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43, 1-44, 1-45, 1-46, 1-47, 1-48, 1-49, 1-50, 1-51 или 1-52, или более полипептида по данному изобретению.
В одном аспекте данное изобретение также относится к химерным полипептидам (и кодирующим их нуклеиновым кислотам), содержащим по меньшей мере два фермента по данному изобретению или их подпоследовательности, например каталитические домены (СР) или активные центры. Например, химерный белок по данному изобретению может обладать любой комбинацией видов активности. В одном аспекте химерный белок по данному изобретению содержит слитые домены, например, единичный домен может проявлять один вид активности или любую их комбинацию (например, как рекомбинантный химерный белок).
Данное изобретение также относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям, содержащим/состоящим из сигнальной последовательности по данному изобретению, например иллюстративные сигнальные последовательности, как указано ниже в таблице, и к полипептидам, содержащим эти сигнальные последовательности. Полипептид может представлять собой
- 71 013993 другой фермент по данному изобретению или другой тип фермента или полипептида. Например, для упрощения прочтения таблицы данное изобретение относится к выделенной, синтетической или рекомбинантной сигнальной последовательности, как представлено далее с Юконцевыми аминокислотными остатками 1-21 ('^Н;-М8КУСЕРЕТЕТЕАЕТЕ8АРА) в 8ЕО ΙΌ N0: 2, кодируемой, например, 8Е0 ΙΌ N0: 1, и т.д_________________________________________________________________________________
ЗЕб ГО N0: Положение сигнальной последовательности (АА=Аминокислота) Сигнальная последовательность
1,2 АА1-20 МЗКУСЬРБТЪТЬАЬТЪЗАКА
11,12
13,14
15,16
17,18 АА1-25 МККУКТ6ЬУЬ366СТК6ГАНЬ6У1А
19,20
3,4
5,6 АА1-25 ΜΚΚΐνΓΙΎΙΙΑΕΙΧν5σΑΝΚΝΡ5ν5
7,8 АА1-51 МТКККIСЬАЬЗССААКСГАНЪС'/ЬКУЕАЕНС, IРV βIV А5ТЗАЙЗЕАСААЕА
9,10 АА1-23 МЕЫКАЬРААААУАСЬГЪЗТЗАМА
Сигнальные последовательности (8Р) и/или препропоследовательности по данному изобретению могут представлять собой выделенные пептиды или последовательности, соединенные с другим ферментом по данному изобретению, или гетерологичный белок, например слитый (химерный) белок. В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим сигнальные последовательности по данному изобретению. В одном аспекте полипептиды, содержащие сигнальные последовательности 8Р и/или препропоследовательности по данному изобретению содержат последовательности, гетерологичные ферментам по данному изобретению (например, слитый белок, содержащий 8Р и/или препропоследовательность по данному изобретению и/или последовательности из другого белка). В одном аспекте данное изобретение относится к ферменту по данному изобретению с гетерологичными 8Р и/или препропоследовательностями, например к последовательностям с сигнальной последовательностью дрожжей. Ферменты по данному изобретению могут содержать гетерологичную 8Р и/или препропоследовательность в векторе, например в векторе серии рРК.’ (^йгодеп, СагкЬай, СА). В одном аспекте 8Р и/или препропоследовательности по данному изобретению идентифицируются после идентификации новых полипептидов. Пути, посредством которых белки сортируются и транспортируются в нужные отделы клетки, часто называются путями направления белков. Одним из наиболее важных элементов во всех из указанных направляющих систем является короткая аминокислотная последовательность на Юконце вновь синтезированного полипептида, называемая сигнальной последовательностью. Эта сигнальная последовательность направляет белок в соответствующий ему отдел клетки, и она удаляется в процессе транспорта или при достижении белком пункта назначения. Большинство лизосомальных, мембранных или секретируемых белков обладают Юконцевой сигнальной последовательностью, которая маркирует их для транспорта в просвет эндоплазматической сети. Было определено более чем 100 сигнальных последовательностей для белков из этой группы. Сигнальные последовательности могут варьировать в длину от 13 до 36 аминокислотных остатков. Различные способы распознавания сигнальных последовательностей известны специалистам в данной области. Например, в одном аспекте новые сигнальные пептиды идентифицируются способом, называемым 81дпа1Р. В 81дпа1Р используется комбинированная нейронная сеть, которая распознает как сигнальные пептиды, так и их участки расщепления. (Юе1кеп е( а1., йепййсаНоп оГ ргокагуойс апй еикагуойс 81§па1 рерЕйек апй ргейюйоп оГ 1Не1г с1еауаде кйек., Рго1ет Епщпееппд, νο1. 10, по. 1, р. 1-6 (1997).
Следует понимать, что в некоторых аспектах фермент по данному изобретению может не иметь 8Р и/или препропоследовательности, или одного или нескольких доменов. В одном аспекте данное изобретение относится к ферменту по данному изобретению, лишенному всех или части 8Р и/или препродомена. В одном аспекте данное изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность (8Р) и/или препропоследовательность из одного фермента по данному изобретению, функционально связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты другого фермента по данному изобретению, или необязательно может быть желательна сигнальная последовательность (8Р) и/или препродомен из белка другого типа.
Данное изобретение также относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, содержащим сигнальные последовательности (8Р), препродомен и/или каталитические домены (СО) по данному изобретению и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, искусственно ассоциированные (например, для ферментов по данному изобретению) с 8Р, препродоменом и/или СО.
Последовательность, с которой 8Р, препродомен и/или СО могут быть искусственно ассоциирова
- 72 013993 ны, может находиться на Ν-конце, С-конце 8Р, препродомена и/или СО на обоих концах 8Р и/или СО. В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, содержащему (или состоящему из) полипептид, содержащий сигнальную последовательность (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СО) по данному изобретению, при условии, что он не ассоциирован с любой последовательностью, с которой он ассоциирован в природе. Аналогично, в одном аспекте данное изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим эти полипептиды. Таким образом, в одном аспекте выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота по данному изобретению содержит кодирующую последовательность для сигнальной последовательности (8Р), препродомена и/или каталитического домена (СО) по данному изобретению, и гетерологичную последовательность (т.е. последовательность, искусственно ассоциированную с сигнальной последовательностью (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СО) по данному изобретению). Гетерологичная последовательность может находиться на 3'-конце, 5'-конце и/или на обоих концах последовательности, кодирующей 8Р, препродомен и/или СО.
Библиотеки гибридных (химерных) ферментов и пептидов
В одном аспекте данное изобретение относится к гибридным ферментам по данному изобретению и слитым белкам, включая пептидные библиотеки, содержащие последовательности по данному изобретению. Пептидные библиотеки по данному изобретению могут быть использованы для выделения модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) пептидов-мишеней, таких как фермент по данному изобретению, их субстраты и т.д. Пептидные библиотеки по данному изобретению могут быть использованы для идентификации соответствующих партнеров для связывания мишеней, таких как лиганды, например цитокины, гормоны и т. п. В одном аспекте данное изобретение относится к химерным белкам, содержащим сигнальную последовательность (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СО) по данному изобретению или их комбинацию, и гетерологичную последовательность (см. выше).
В одном аспекте слитые белки по данному изобретению (например, пептидные группы) конформационно стабилизируют (относительно линейных пептидов) для обеспечения более высокой аффинности связывания мишеней. Данное изобретение относится к слитым ферментам по данному изобретению и другим пептидам, включая известные и случайные пептиды. Они могут быть слитыми таким образом, что структура полипептида не искажается значительно, и пептид является метаболически или структурно конформационно стабилизированным. Это дает возможность создавать библиотеку пептидов, которую легко исследовать как на их наличие в клетках, так и на их количество.
Варианты последовательностей аминокислот по данному изобретению могут характеризоваться предопределенной природой изменения, свойствами, которые выделяют их отдельно от природных форм, например аллельные и межвидовые варианты ферментов по данному изобретению. В одном аспекте варианты по данному изобретению проявляют качественно такую же биологическую активность, что и природный аналог.
Альтернативно, варианты могут быть выбраны с модифицированными свойствами. В одном аспекте в то время как участок или область для внесения изменения в аминокислотной последовательности предопределена, мутация, по существу, не должна быть предопределена. Например, для оптимизации осуществления мутации в данном участке может быть проведен случайный мутагенез в кодоне-мишени или участке-мишени и может быть проведен скрининг вариантов экспрессируемых ферментов на наличие оптимальной комбинации для желаемой активности. Способы получения мутаций с заменами в предопределенных участках ДНК с известной последовательностью хорошо известны, как описано в данном описании, например, для мутагенеза М13 с праймерами и мутагенеза посредством ПЦР. Скрининг мутантных форм может быть проведен с использованием, например, анализа гидролиза хлорофилла, как описано ниже в примере 1. В альтернативных аспектах аминокислотные замены могут представлять собой единичные остатки; размер вставок может составлять порядка приблизительно от 1 до 20 аминокислот, хотя могут быть сделаны значительно большие вставки. Размер делений может варьировать приблизительно от 1 до приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70 остатков или более. Для получения конечного производного с оптимальными свойствами могут быть использованы замены, делеции, вставки или любая их комбинация. Как правило, такие изменения проводят для небольшого количества аминокислот, чтобы свести к минимуму изменения молекулы. Однако в определенных условиях могут быть допустимы большие изменения.
Данное изобретение относится к полипептидам, например ферментам, по данному изобретению, где структура остова полипептида, вторичная или третичная структура, например структура альфа-спирали или бета-слоя, модифицированы. В одном аспекте модифицированы заряд или гидрофобность. В одном аспекте модифицирован объем боковой цепи. Значительные изменения функции или иммунологической идентичности получают при выборе замен, которые являются менее консервативными. Например, могут быть проведены замены, которые наиболее значительно влияют на структуру остова полипептида в области изменения, например структуру альфа-спирали или бета-слоя; на заряженный или гидрофобный участок молекулы, который может находиться активном центре; или на боковую цепь. Данное изобретение относится к заменам в полипептиде по данному изобретению, где (а) гидрофильные остатки, например серил или треонил, заменены (или посредством) гидрофобным остатком, например лейцилом, изо
- 73 013993 лейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (Ь) цистеин или пролин заменен (или посредством) любым другим остатком; (с) остаток с электроположительной боковой цепью, например лизил, аргинил или гистидил, заменен (или посредством) электроотрицательным остатком, например глутамилом или аспартилом; или (б) остаток с объемной боковой цепью, например фенилаланин, заменен (или посредством) остатком, не имеющим боковой цепи, например глицином. Варианты могут проявлять качественно такую же биологическую активность, что и ферменты по данному изобретению, хотя, при необходимости, могут быть отобраны варианты для модификации свойств фермента.
Как используется в данном описании, термины аминокислота или аминокислотная последовательность относятся к олигопептиду, пептиду, полипептиду или белковой последовательности, или к фрагменту, участку или субъединице любого из них, и к природным или синтетическим молекулам.
Термины аминокислота или аминокислотная последовательность включают олигопептид, пептид, полипептид или белковую последовательность, или фрагмент, участок или субъединицу любого из них, и природные или синтетические молекулы. Как используется в данном описании, термин полипептид относится к аминокислотам, соединенным друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. к изостерическим пептидам, и может содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы посредством любого природного процесса, такого как посттрансляционный процессинг, или способами химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Модификации могут осуществляться в любом участке полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и Ν- или С-концы. Следует понимать, что указанный тип модификации может быть представлен в одинаковой или в различной степени в нескольких участках данного полипептида. Также данный полипептид может иметь много типов модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АЭР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы тема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СРЬякоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в белок, такую как аргинилирование. (См., Сге1дй1оп Т.Е. Рго1е1пк -81гнс1нге апб Мо1еси1аг Ргорегйек 2пб Еб., \У.Н. Егеетап апб Сотрапу, №\ν Υо^к (1993); Рокйгапк1абопа1 Соνа1еηΐ МобШсабоп оГ Ргоктк, В.С. 1ойпкоп, Еб., Асабетк Ргекк, №\ν Υо^к, р. 1-12 (1983)). Пептиды и полипептиды по данному изобретению также включают все формы миметиков и пептидомиметиков, как подробнее описано ниже.
Кроме того по существу, идентичная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от контрольной последовательности одной или несколькими консервативными или неконсервативными аминокислотными заменами, делециями или вставками, особенно если такая замена происходит в участке, который не является активным центром (каталитическими доменами (СО)) молекулы, и при условии, что полипептид, по существу, сохраняет свои функциональные свойства. Консервативная аминокислотная замена, например замена одной аминокислоты другой из того же класса (например, замена одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой или замена одной полярной аминокислоты другой, например аргинина лизином, глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой или глутамина аспарагином). Одна или несколько аминокислот могут быть удалены, например, из полипептида, что приведет к модификации структуры полипептида без значительного изменения его биологической активности. Например, могут быть удалены Ν- или С-концевые аминокислоты, которые не являются необходимыми для биологической активности фермента. Модифицированные последовательности полипептидов по данному изобретению могут быть проанализированы на наличие биологической (например, ферментативной или связывающей) активности любым из способов, включающих контактирование модифицированной последовательности полипептида с субстратом фермента и определение приводит ли модифицированный полипептид при анализе к снижению количества специфичного субстрата или к повышению биопродуктов ферментативной реакции функционального полипептида с субстратом.
Как используется в данном описании, фрагменты представляют собой участки природного белка, которые могут существовать по меньшей мере в двух различных конформациях. Фрагменты могут иметь последовательность, одинаковую или, по существу, одинаковую с аминокислотной последовательностью природного белка. Термин по существу, одинаковая означает, что аминокислотная последовательность в значительной степени, но не полностью, одинакова с последовательностью, с которой она сходна, но сохраняет по меньшей мере один вид функциональной активности этой последовательности. В альтернативных аспектах две аминокислотные последовательности по существу, одинаковые или по существу, гомологичные, если они имеют по меньшей мере приблизительно 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,
- 74 013993
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательностей. Также включаются фрагменты, которые обладают отличающимися трехмерными структурами относительно природного белка; например, молекула проформы, такая как пробелок с низкой активностью, который может быть модифицирован расщеплением с получением зрелого фермента со значительно более высокой активностью.
В одном аспекте ферменты по данному изобретению содержат эпитопы или таги для очистки, сигнальные последовательности или другие слитые последовательности и т.д. В одном аспекте ферменты могут быть слитыми со случайным пептидом с получением слитого полипептида. Под термином слитый или функционально связанный в данном описании подразумевается, что случайный пептид и фермент связаны вместе таким образом, чтобы свести к минимуму поломки, для придания стабильности структуре фермента, например, где он сохраняет свою активность. Слитый полипептид (или слитый полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид), может также содержать дополнительные компоненты, включая множественные пептиды во множественных петлях.
В одном аспекте пептиды и кодирующие их нуклеиновые кислоты являются рандомизированными, либо полностью рандомизированными, либо они имеют тенденцию к рандомизации, например, в частоте нуклеотидов/остатков в целом или в одном положении. Под термином рандомизированный подразумевают, что каждая нуклеиновая кислота и пептид состоят, по существу, из случайных нуклеотидов и аминокислот соответственно. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, которые являются предшественниками пептидов, могут быть химически синтезированы и таким образом могут включать любой нуклеотид в любом положении. Таким образом, при экспрессии нуклеиновых кислот с получением пептидов любой аминокислотный остаток может встраиваться в любое положение. Способ синтеза может быть разработан с получением рандомизированных нуклеиновых кислот для обеспечения образования всех или большинства из возможных сочетаний на протяжении длины нуклеиновой кислоты, получая таким образом библиотеку рандомизированных нуклеиновых кислот. Библиотека может обеспечить структурно достаточно разнородную группу продуктов с рандомизированной экспрессией для того, чтобы влиять в вероятностном смысле на достаточный диапазон клеточных ответов для получения одной или нескольких клеток, проявляющих желаемый ответ. Таким образом, данное изобретение относится к библиотеке для взаимодействий, достаточно большой, чтобы по меньшей мере один из ее членов обладал структурой, которая придает ему аффинность к некоторой молекуле, белку или другому фактору.
Данное изобретение относится к способам получения химерных полипептидов, которые могут кодировать биологически активные гибридные полипептиды (например, гибридные ферменты по данному изобретению). В одном аспекте исходные полинуклеотиды кодируют биологически активные полипептиды. Способ по данному изобретению обеспечивает продукцию новых гибридных полипептидов с использованием клеточных процессов, при которых последовательность исходных полинуклеотидов интегрируется, так чтобы полученный гибридный полинуклеотид кодировал полипептид, демонстрирующий активность, полученную от исходных биологически активных полипептидов. Например, исходные полинуклеотиды могут кодировать конкретный фермент из различных микроорганизмов. Фермент, кодируемый первым полинуклеотидом из одного организма, или вариант может, например, эффективно функционировать в конкретных условиях окружающей среды, например при высоком процентном содержании соли. Фермент, кодируемый вторым полинуклеотидом из другого организма, или вариант может эффективно функционировать в других условиях окружающей среды, таких как крайне высокие температуры. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который проявляет свойства обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, общих для каждого из ферментов кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например при высоком процентном содержании соли и предельных температурах.
Гибридный полипептид, полученный способом по данному изобретению, может проявлять специализированную ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редуктивной рекомбинации полинуклеотидов, определяющих виды активности ферментов, может быть проведен скрининг полученного гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом, на наличие специализированных видов активности ферментов, полученных из каждого из исходных ферментов, т.е. на тип связи, на которую действует фермент, и температуру, при которой фермент функционирует. Таким образом, например, может быть проведен скрининг фермента для определения тех химических функциональных свойств, которые отличают гибридный фермент от исходных ферментов, таких как субстратная специфичность или температура, рН или концентрация соли, при которых гибридный полипептид функционирует.
Источники исходных полинуклеотидов могут быть выделены из отдельных организмов (изолятов), коллекций организмов, которые были выращены на определенных средах (обогащенные культуры), или некультивированных организмов (образцы из окружающей среды). Использование независимого от культивирования подхода для получения полинуклеотидов, кодирующих новые виды биологической активности из образцов из окружающей среды, является наиболее предпочтительным, поскольку оно обеспечивает доступ к неизмененным источникам биологического разнообразия.
- 75 013993
Библиотеки окружающей среды получают из образцов из окружающей среды и представляют собой совокупные геномы природных организмов, сохраненные в клонирующих векторах, которые могут быть воспроизведены в подходящих прокариотических хозяевах. Вследствие того, что клонированная ДНК исходно выделяется непосредственно из образцов из окружающей среды, библиотеки не ограничиваются небольшой фракцией прокариот, которые могут быть выращены в монокультуре. Кроме того, упорядочивание ДНК из окружающей среды, представленной в этих образцах, может обеспечить более единообразную репрезентацию ДНК из всех видов, представленных в исходном образце. Это может привести к резкому повышению эффективности поиска представляющих интерес генов из менее представленных компонентов образца, который на несколько порядков значимости может быть более редко встречающимся по сравнению с доминантными видами.
Например, библиотеки генов, полученные из одного или нескольких некультивированных микроорганизмов, анализируют на наличие представляющей интерес активности. Потенциальные пути, кодирующие представляющие интерес биологически активные молекулы, сначала переводят в прокариотические клетки в форме библиотек для экспрессии генов. Полинуклеотиды, определяющие представляющие интерес виды активности, выделяют из библиотек и вводят в клетку-хозяина. Клетку-хозяина выращивают в условиях, которые обеспечивают рекомбинацию и/или редуктивную рекомбинацию, с получением потенциально активных биологических молекул с новыми или усиленными видами активности.
Микроорганизмы, из которых может быть получен полинуклеотид, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕиЬас1епа и АгсйаеЬас1ег1а, и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды могут быть выделены из образцов из окружающей среды, в случае которых нуклеиновая кислота может быть выделена без культивирования организма или выделена из одного или нескольких культивированных организмов. В одном аспекте такие микроорганизмы могут быть экстремофилами, такими как гипертермофилы, психрофилы, психротрофы, галофилы, барофилы и ацидофилы. Могут быть использованы полинуклеотиды, кодирующие ферменты, выделенные из экстремофильных микроорганизмов. Такие ферменты могут функционировать при температурах свыше 100°С в горячих источниках на суше и в термических кратерах на больших глубинах при температурах ниже 0°С в арктических водах, в окружающей среде Мертвого моря, насыщенной солью, при значениях рН приблизительно 0 в месторождениях угля и геотермических богатых серой источниках, или при значениях рН свыше 11 в осадках сточных вод. Например, некоторые эстеразы и липазы, клонированные и экспрессированные из экстремофильных организмов, проявляют высокую активность в широком диапазоне температур и рН.
Полинуклеотиды, выбранные и выделенные, как описано выше, вводятся в подходящую клеткухозяина. Подходящая клетка-хозяин представляет собой любую клетку, способную обеспечивать рекомбинацию и/или редуктивную рекомбинацию. Выбранные полинуклеотиды в одном аспекте уже находятся в векторе, который включает соответствующие контрольные последовательности. Клетка-хозяин может представлять собой клетку высших эукариот, такую как клетка млекопитающих, или клетку низших эукариот, такую как клетка дрожжей, или в одном аспекте клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина может достигаться трансфекцией с фосфатом кальция, трансфекцией, опосредуемой ПЕАЕ-декстраном, или электропорацией (ΌηνΗ е! а1., 1986).
В качестве репрезентативных примеров приемлемых хозяев могут быть приведены бактериальные клетки, такие как Е. сой, ЗйерФтусез, За1топе11а 1урЫтигшт; клетки грибов, такие как клетки дрожжей; клетки насекомых, такие как ЭгозорЫ1а З2 и Зробор!ега ЗГ9; клетки животных, такие как СНО, С0З или клетки меланомы Во\\гез; аденовирусы и клетки растений. Выбор походящего хозяина находится в компетенции специалистов в данной области, исходя из приведенных в данном описании описаний.
В отношении конкретных различных культуральных систем клеток млекопитающих, которые могут быть использованы для экспрессии рекомбинантного белка, примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии С0З-7 фибробластов почки обезьяны, описанные в ЗУ40-!гапзГогтеб з1т1ап се11з зиррог! Не герйсайоп оГ еаг1у ЗУ40 ти!ап!з (СН/тап, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать совместимый вектор, например клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Экспрессирующие векторы млекопитающих должны содержать ориджин репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые участки связывания рибосом, участки полиаденилирования, доноры сплайсированного фрагмента и акцепторные участки, последовательности терминации транскрипции и фланкирующие 5'-конец нетранскрибируемые последовательности. Для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов могут быть использованы последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования ЗУ40.
В другом аспекте предусмотренный способ по настоящему изобретению может быть использован для получения новых полинуклеотидов, кодирующих биохимические каскады, из одного или нескольких оперонов или кластеров генов или их фрагментов.
Например, бактерии и множество эукариот обладают координированным механизмом регуляции генов, продукты которых вовлечены в сходные процессы. Гены образуют группы в структурах, называемых кластерами генов, на одной хромосоме и транскрибируются вместе под контролем единой регуля
- 76 013993 торной последовательности, включая единый промотор, который инициирует транскрипцию целого кластера. Таким образом, кластер генов представляет собой группу соседних генов, которые, как правило, либо идентичные, либо родственные в отношении их функции. Примером биохимического каскада, кодируемого кластерами генов, являются поликетиды.
ДНК кластера генов может быть выделена из различных организмов и лигирована в векторы, в частности в векторы, содержащие регуляторные последовательности для экспрессии, которые могут контролировать и регулировать продукцию детектируемого белка или совокупную активность, связанную с белком, в лигированном кластере генов. Использование векторов, которые обладают исключительно высокой способностью к встраиванию экзогенной ДНК, является особенно подходящим для таких кластеров генов и описано в данном описании в качестве примера, включая й-фактор (или фактор фертильности) Е. сой. й-Фактор Е. сой представляет собой плазмиду, которая инициирует самоперенос с высокой частотой в процессе конъюгации и является идеальной для получения и стабильного воспроизведения крупных фрагментов ДНК, таких как кластеры генов из смешанных микробных образцов. Одним аспектом является использование векторов для клонирования, называемых фосмидой, или векторов с искусственной бактериальной хромосомой (ВАС). Их получают из й-фактора Е. сой, который способен стабильно встраивать большие сегменты геномной ДНК. В случае интеграции с ДНК из смешанного некультивированного образца из окружающей среды, это делает возможным получать большие геномные фрагменты в форме ДНК библиотеки из окружающей среды. Другим типом вектора для использования по настоящему изобретению является космидный вектор. Космидные векторы изначально были разработаны для клонирования и воспроизведения крупных сегментов геномной ДНК.
Клонирование в космидные векторы подробно описано 8атЬгоок е! а1., в Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (1989). После лигирования в соответствующий вектор два или более векторов, содержащих различные гены синтетазы поликетида, могут быть введены в подходящую клетку-хозяина. Участки частичной гомологии последовательностей, общие для кластеров генов, будут промотировать процессы, которые приведут к реорганизации последовательностей, приводящей к гибридному кластеру генов. Может быть проведен скрининг нового гибридного кластера генов на наличие усиленной активности, не обнаруживаемой в исходных кластерах генов.
Таким образом, в одном аспекте данное изобретение относится к способу получения биологически активного гибридного полипептида и к скринингу такого полипептида на наличие усиленной активности посредством:
1) введения в подходящую клетку-хозяина по меньшей мере первого функционально связанного полинуклеотида и второго функционально связанного полинуклеотида, где по меньшей мере первый полинуклеотид и второй полинуклеотид имеют по меньшей мере один общий участок частичной гомологии последовательностей;
2) выращивания клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают реорганизацию последовательностей, приводящую к функционально связанному гибридному полинуклеотиду;
3) экспрессии гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;
4) скрининга гибридного полипептида в условиях, которые обеспечивают идентификацию усиленной биологической активности; и
5) выделения полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.
Методы анализа на наличие различных видов ферментативной активности известны специалистам в данной области и описаны в настоящем описании. Такие способы могут быть использованы при выделении полипептидов и полинуклеотидов по данному изобретению.
Методы скрининга и устройство для исследования οη-1ΐηβ
В применении на практике способов по данному изобретению могут быть использованы различные устройства и методы в отношении полипептидов и нуклеиновых кислот по данному изобретению, например, для отбора полипептидов с наличием ферментативной активности, для отбора соединений в качестве потенциальных модуляторов, например активаторов или ингибиторов активности, антител, которые связываются с полипептидом по данному изобретению, нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой по данному изобретению, для отбора клеток, экспрессирующих полипептид по данному изобретению и т. п. В дополнение к формату матриц, подробно описанному ниже, для отбора образцов для применения на практике способов по данному изобретению также могут быть использованы альтернативные форматы. Такие форматы включают, например, масс-спектрометры, хроматографы, например высокопроизводительные ВЭЖХ и другие формы жидкостной хроматографии, и малые форматы, такие как 1536-луночные планшеты, 384-луночные планшеты и т.д. Для применения на практике способов по данному изобретению могут быть адаптированы и использованы устройства для высокопроизводительного скрининга, см., например, патентную заявку США № 20020001809.
Капиллярные матрицы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по данному изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу. Матрицы могут быть использованы для скрининга или исследования библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) на их способность связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по данному изобретению или модулировать их актив
- 77 013993 ность. Капиллярные матрицы, такие как 6ЮАМАТР1Х™, Олегка Согрогайоп, 8ап Окдо, СА; и чипы, описанные, например, в патентной заявке США № 20020080350 А1; \УО 0231203 А; 0244336 А, относятся к альтернативным устройствам для хранения и скрининга образцов. В одном аспекте капиллярная матрица включает множество капилляров, составляющих матрицу из смежных капилляров, где каждый капилляр содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для хранения образца. Просвет может быть цилиндрической, квадратной, шестиугольной или любой другой геометрической формы, при условии, что стенки формируют просвет для хранения жидкости или образца. Капилляры капиллярной матрицы могут находиться вместе в непосредственной близости с формированием плоскостной структуры. Капилляры могут быть связаны друг с другом, посредством слияния (например, если капилляры изготовлены из стекла), склеивания, связывания или они могут быть скрепленными стенка к стенке. Кроме того, капиллярная матрица может включать промежуточный материал, находящийся между соседними капиллярами в чипе, образуя таким образом твердое плоское устройство, содержащее множество сквозных отверстий.
Капиллярная матрица может быть образована любым количеством отдельных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Кроме того, капиллярная матрица с приблизительно 100000 или более отдельных капилляров может быть изготовлена со стандартным размером и формой планшета МкгоШег® для установки в стандартное лабораторное оборудование. Просветы заполняют вручную или автоматически с использованием либо капиллярного действия, либо микроинъекций с использованием тонкой иглы. Представляющие интерес образцы могут быть последовательно удалены из отдельных капилляров для дальнейшего анализа или характеризации. Например, тонкий игольчатый наконечник устанавливают в подвижное соединение с выбранным капилляром либо для добавления, либо для отбора материала из просвета.
В анализе для скрининга из одного сосуда перед добавлением в капиллярную матрицу компоненты для анализа смешивают с получением представляющего интерес раствора. Просвет вследствие капиллярного действия заполняется, если по меньшей мере часть матрицы погружена в представляющий интерес раствор. Химические или биологические реакции и/или активность в каждом капилляре анализируют по наличию детектируемых событий. Детектируемые события часто называют совпадением, которое, как правило, дифференцируют от несовпадений, получаемых в капиллярах способами оптического определения. Таким образом, капиллярные матрицы дают возможность множественного параллельного определения совпадений.
В анализе для скрининга из множества сосудов полипептид или нуклеиновая кислота, например лиганд, могут быть введены в первый компонент, который вводится по меньшей мере в часть капилляров капиллярной матрицы. Затем в капилляры после первого компонента могут быть введены пузырьки воздуха. Затем в капилляры может быть введен второй компонент, где второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Первый и второй компоненты затем могут быть смешаны, применяя гидростатическое давление с обеих сторон капиллярной матрицы, для разрушения пузырька. Затем капиллярную матрицу исследуют на наличие детектируемого события, возникающего в результате наличия реакции или отсутствия реакции двух компонентов.
При анализе для скрининга на наличие связывания представляющий интерес образец может быть введен в качестве первой жидкости, меченной детектируемыми частицами, в капилляр капиллярной матрицы, где просвет капилляра покрывают связующим материалом для связывания детектируемых частиц в просвете. Затем первая жидкость может быть удалена из капиллярной трубки, где связанные детектируемые частицы сохраняются на капилляре, и в капиллярную трубку может быть введена вторая жидкость. Затем капилляр анализируют на наличие детектируемого события, возникающего в результате наличия реакции или отсутствия реакции частицы со второй жидкостью.
Матрицы, или биочипы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по данному изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу. Матрицы могут быть использованы для скрининга или анализа библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т. д.) на их способность связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по данному изобретению или модулировать их активность. Например, в одном аспекте данного изобретения анализируемым параметром является экспрессия транскрипта гена, например гена по данному изобретению (нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по данному изобретению). Один или несколько, или все транскрипты клетки могут быть определены гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки, или нуклеиновые кислоты, репрезентативные или комплементарные транскриптам клетки, гибридизацией с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице, или биочипе. С использованием матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе некоторые или все транскрипты клетки могут быть одновременно определены количественно. Альтернативно, могут быть использованы матрицы, содержащие геномные нуклеиновые кислоты, для определения генотипа вновь полученного способами инженерии штамма, полученного способами по данному изобретению. Также для одновременного количественного определения множества белков могут быть использованы полипептидные матрицы. Настоящее изобретение может быть осуществлено на практике с любой известной матрицей, также называемой микроматрицей или матрицей нуклеиновых кислот, или
- 78 013993 полипептидной матрицей, или матрицей антител, или биочипом, или их вариантами. Матрицы представляют собой, в общем, множество пятен или элементов-мишеней, где каждый элементмишень содержит определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности с субстратом для специфического связывания молекулы образца, например транскриптов мРНК.
В осуществлении на практике способов по данному изобретению может быть использована любая известная матрица и/или способ получения и использования матриц, в целом или частично, или их варианты, как описано, например, в патентах США № 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098;5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; см. также, например, АО 99/51773; 99/09217; 97/46313; 96/17958; см. также, например, 1о11пк1оп (1998) Сигг. Вю1., 8:В171-В174; 8скиттег (1997) Вкксйтдиек, 23:1087-1092; Кет (1997) Вюйсйтдиек, 23:120-124; 8о1шак-То1бо (1997) Сепек, Скготокотек & Сапсег, 20:399-407; Во\\1е11 (1999) Какие Сепейск 8ирр., 21:25-32. См. также опубликованные патентные заявки США № 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
Как используется в данном описании, термины матрица или микроматрица, или биочип, или чип представляют собой множество элементов-мишеней, где каждый элемент-мишень содержит определенное количество одного или нескольких полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности с субстратом, как более подробно описано ниже.
Антитела и способы скрининга на основе антител
Данное изобретение относится к выделенным или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по данному изобретению. Эти антитела могут быть использованы для выделения, идентификации и количественного определения полипептида по данному изобретению или сходных полипептидов. Эти антитела могут быть использованы для выделения других полипептидов в объеме данного изобретения или других сходных полипептидов. Могут быть разработаны антитела для связывания с активным центром полипептида по данному изобретению. Таким образом, данное изобретение относится к способам ингибирования ферментов с использованием антител по данному изобретению (см. описание ниже). Данное изобретение относится к фрагментам ферментов по данному изобретению, включая иммуногенные фрагменты полипептида по данному изобретению. Данное изобретение относится к композициям, содержащим полипептид или пептид по данному изобретению и адъюванты или носители и т.п.
Антитела могут быть использованы для иммунопреципитации, мечения, в иммуноаффинных колонках и т.п. Если желательно, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих конкретные антигены, могут быть получены посредством иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на матрице по данному изобретению. Альтернативно, способы по данному изобретению могут быть использованы для модификации структуры антител, продуцируемых клеткой, предназначенной для модификации, например аффинность антител может быть повышена или снижена. Более того, способность получать или модифицировать антитела может представлять собой полученный способами инженерии фенотип в клетке посредством способов по данному изобретению.
Способы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описаны в научной и патентной литературе, см., например, СоНдап, СиВВЕКТ РВОТОСОЬ8 ΙΝ 1ММиКОЬОСУ, АПеу/Сгеепе, ΝΥ (1991); 8шек (ебк.) ВА81С АКО ΕΈΙΝΚΆΕ 1\1\1и\С)1.ОС>¥ (7Л еб.) Ьапде Меб1са1 РиЫкайопк, Ьок А1!ок, СА (8Йек); Собшд, МОКОСРОКАР АКТ1ВОБ1Е8: РВ1КС1РРЕ8 АКБ РВАСТ1СЕ (2б еб.) Асабетк Ргекк, Кеи Уогк, ΝΥ (1986); КоЫег (1975) Книге 256:495; Наг1ои (1988) АКТ1ВОБ1Е8, А ЬАВОВАТОВУ МАКЕ А Р, Со1б 8рппд НагЬог РиЬИсайопк, Кеи Уогк. В дополнение к традиционным способам ш т1то с использованием животных антитела также могут быть получены ш т11го, например, с использованием демонстрационных библиотек фагов, экспрессирующих рекомбинантные участки связывания антител. См., например, НоодепЬоот (1997) Тгепбк Вю1есЬпо1., 15:62-70; Как (1997) Аппи. Вет. Вкрйук. Вюшо1. 8!гис1., 26:27-45.
Полипептиды по данному изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более их последовательно расположенных аминокислот, также могут быть использованы для получения антител, которые специфично связываются с полипептидами или фрагментами. Полученные в результате антитела могут быть использованы в методах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида, или для определения наличия полипептида в биологическом образце. По таким методикам препарат белка, такой как экстракт или биологический образец, контактируют с антителами, способными специфично связываться с одним из полипептидов по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более его последовательно расположенных аминокислот.
По иммуноаффинным методикам антитела присоединяют к твердой подложке, такой как бусы или
- 79 013993 другая матрица колонки. Препарат белка контактируют с антителами в условиях, при которых антитела специфично связываются с одним из полипептидов по данному изобретению или его фрагментом. После промывания для удаления неспецифично связанных белков элюируют специфично связанные полипептиды.
Способность белков в биологическом образце связываться с антителами может быть определена с использованием любой из различных методик, известных специалистам в данной области. Например, связывание может быть определено мечением антител детектируемой меткой, такой как флуоресцентное вещество, ферментативная метка или радиоизотоп. Альтернативно, связывание антител с образцом может быть определено с использованием вторичных антител с такой детектируемой меткой на них. Конкретные способы анализа включают твердофазные иммуноферментные анализы, сэндвич анализы, радиоиммунные анализы и вестерн-блот анализы.
Поликлональные антитела, полученные против полипептидов по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более их последовательно расположенных аминокислот, могут быть получены посредством непосредственной инъекции полипептидов в животное или введения полипептидов животному, например, не относящемуся к человеку. Полученные таким образом антитела будут затем связывать сам полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующая только фрагмент полипептида, может быть использована для получения антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Такие антитела затем могут быть использованы для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих данный полипептид.
Для получения моноклональных антител может быть использован любой способ, который обеспечивает получение антител, продуцируемых непрерывными культурами клеточных линий. Примеры включают способы с гибридомами (КоЫег апк М11к!ет, 256:495-497, 1975), способ с !гюта, способ В-клеточной гибридомы (КохЬог е! а1., 1ттипо1оду Токау, 4:72, 1983) и способ ЕВУ-гибридомы (Со1е, е! а1., 1985, т Мопос1опа1 Ап!1Ьок1ек апк Сапсег Ткегару, А1ап К. Ыкк, 1пс., р. 77-96).
Способы, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США № 4946778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител против полипептидов по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательно расположенных аминокислот.
Альтернативно, для экспрессии гуманизированных антител против указанных полипептидов или их фрагментов могут быть использованы трансгенные мыши.
Антитела, полученные против полипептидов по данному изобретению или фрагментов, содержащих по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более их последовательно расположенных аминокислот, могут быть использованы для скрининга аналогичных полипептидов из других организмов и образцов. В таких способах полипептиды из организма контактируют с антителами и определяют те полипептиды, которые специфически связываются с антителами. Для определения антител могут быть использованы любые из описанных выше методик. Один такой анализ для скрининга описан в Ме!кокк йог Меакигшд Се11и1аке Аскуййек, Ме!кокк 1п Епхуто1оду, νο1. 160, р. 87-116.
Термин антитела включает пептид или полипептид, полученный из, смоделированный после или, по существу, кодируемый геном иммуноглобулинов или генами иммуноглобулинов, или его фрагменты, способные специфически связываться с антигеном или эпитопом, см., например Еипкатеп!а1 1шщцпо1оду, ТЫгк Екйюп, У.Е. Раи1, ек., Кауеп Ргекк, ΚΥ. (1993); Уйкоп (1994) й. йттипой Ме!кокк, 175:267273; Υι^^Ι (1992) й. Вюскет. Вюркук. МеШокк, 25:85-97. Термин антитела включает антигенсвязывающие фрагменты, т.е. антигенсвязывающие участки (например, фрагменты, подпоследовательности, гипервариабельные участки (СРК)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (1) ЕаЬфрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два ЕаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) Ек-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Εν-фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН на одном плече антитела, (ν) кАЬ-фрагмент (Уагк е! а1. (1989) 341:544-546), который состоит из домена УН; и (νί) отдельного гипервариабельного участка (СРК). Одноцепочечные антитела также входят в понятие термина антитело.
Наборы
Данное изобретение относится к наборам, содержащим композиции, например нуклеиновые кислоты, экспрессирующие кассеты, векторы, клетки, трансгенные семена или растения, или части растений, полипептиды (например, ферменты, вовлеченные в катаболизм хлорофилла или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы)) и/или антитела по данному изобретению. Наборы также могут содержать учебный материал, обучающий методикам и промышленному использованию данного изобретения, как описано в данном описании. В одном аспекте наборы разработаны для приспособления к промышленному масштабу уровней обработки, например, пищевых продуктов, кормов, масел и т.п.
Инженерия цельных клеток и измерение параметров метаболизма
Способы по данному изобретению относятся к изменению цельных клеток или инженерии цельных
- 80 013993 клеток для разработки новых клеточных штаммов с новым фенотипом, например с модифицированным путем катаболизма хлорофилла, или с новой или модифицированной ферментативной активностью (например, хлорофиллазы), посредством модификации генетического набора клетки. Генетический набор может быть модифицирован добавлением в клетку нуклеиновой кислоты по данному изобретению, например, кодирующей последовательности для фермента по данному изобретению. См., например, \Ο 0229032; 0196551.
Для определения нового фенотипа в клетке анализируют по меньшей мере один параметр метаболизма модифицированной клетки в режиме реального времени или в режиме оп-ДДпе. В одном аспекте множество клеток, таких как клеточная культура, анализируют в режиме реального времени или опДДпе. В одном аспекте множество параметров метаболизма анализируют в режиме реального времени или оп-ДДпе. Параметры метаболизма могут анализироваться с использованием фермента по данному изобретению.
Анализ метаболических изменений (МРА) основан на известной биохимической концепции. На основе закона сохранения масс и на гипотезе квазистационарного состояния (Р88Н) внутриклеточных метаболитов конструируют линейную независимую метаболическую матрицу. При использовании способов по данному изобретению устанавливают метаболические каскады (схемы), включающие идентичность всех маршрутов субстратов, продуктов и промежуточных соединений;
идентичность всех химических реакций в пути взаимопревращения метаболитов, стереохимии путей реакций, идентичность всех ферментов, катализирующих реакции, кинетику ферментативных реакций, регуляторные пути взаимодействия между компонентами, например аллостерические взаимодействия, взаимодействия фермент-фермент и т. д., внутриклеточную компартментализацию ферментов или любых других надмолекулярных организаций ферментов и наличие любого градиента концентрации метаболитов, ферментов или эффекторных молекул, или диффузионных барьеров для их движения.
После того как метаболический каскад для данного штамма построен, для оценки внутриклеточных метаболических изменений может быть проведена математическая презентация по принципу матрицы, если доступны данные метаболома оп-ДДпе.
Метаболический фенотип основан на изменениях целого метаболического каскада внутри клетки. Метаболический фенотип основан на изменении использования каскада относительно условий окружающей среды, генетического регулирования, стадии развития и генотипа и т. д. В одном аспекте способов по данному изобретению после вычисления МРА оп-ДДпе динамическое поведение клеток, их фенотип и другие свойства анализируют исследованием использования каскада. Например, если в ходе ферментации дрожжей запас глюкозы повышается, а кислорода снижается, использование респираторных путей будет снижаться и/или остановится, а использование ферментативных путей будет преобладать. Контроль физиологического состояния клеточной культуры становится возможным после анализа путей. Способы по данному изобретению могут помочь определить, как манипулировать ферментацией посредством определения того, как изменять запас субстрата, температуру, использование индукторов и т.д. для контроля физиологического состояния клеток для продвижения в желаемом направлении. В осуществлении на практике способов по данному изобретению результаты МРА также могут сравниваться с транскриптомными и протеомными данными для разработки экспериментов и протоколов для метаболической инженерии или шаффлинга генов и т.д.
В практическом осуществлении способов по данному изобретению может быть передан клетке и определен любой модифицированный или новый фенотип, включая новые или улучшенные свойства. Любой аспект метаболизма или роста может быть проанализирован.
Мониторинг экспрессии транскрипта мРНК
В одном аспекте данного изобретения фенотип, полученный способами инженерии, включает повышение или снижение экспрессии транскрипта мРНК (например, транскрипта полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы)) или образование новых транскриптов в клетке. Эта повышенная или пониженная экспрессия может быть прослежена посредством тестирования на наличие фермента по данному изобретению или посредством анализа ферментативной активности. Транскрипты мРНК, или элементы информации, также могут быть обнаружены и количественно определены любым способом, известным в данной области, включая, например, нозерн-блот анализ, количественные реакции амплификации, гибридизацию с матрицей и т.п. Количественные реакции амплификации включают, например, количественную ПЦР, включающую, например, количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, или КТ-ПЦР; количественную КТ-ПЦР в режиме реального времени или кинетическую КТ-ПЦР в реальном времени (см., например, Кгеихег (2001) Вг. Д. НаетаДо1., 114:313-318; ХДа (2001) ТигарДаЛа^^ 72:907-914).
В одном аспекте данного изобретения фенотип, полученный способами инженерии, получают посредством экспрессии гомологичного гена с помощью нокаута. Может быть осуществлен нокаут кодирующей последовательности гена или одного или нескольких элементов контроля транскрипции, напри
- 81 013993 мер промоторов или энхансеров. Таким образом, экспрессия транскрипта может быть полностью остановлена или только снижена.
В одном аспекте данного изобретения фенотип, полученный способами инженерии, включает повышение экспрессии гомологичного гена. Этого можно добиться посредством нокаута отрицательного контрольного элемента, включая цис- или транс-регуляторный элемент регуляции транскрипции, или внесение мутации в положительный контрольный элемент. Один или несколько, или все транскрипты клетки могут быть определены гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки, или нуклеиновые кислоты, репрезентативные или комплементарные транскрипту клетки, с иммобилизованными на матрице нуклеиновыми кислотами.
Мониторинг экспрессии полипептидов, пептидов и аминокислот
В одном аспекте данного изобретения фенотип, полученный способами инженерии, включает повышенную или сниженную экспрессию полипептида (например, полипептида, вовлеченного в катаболизм хлорофилла или обладающего активностью эстеразы (например, хлорофиллазы)) или образование новых полипептидов в клетке. Эта повышенная или сниженная экспрессия может быть обнаружена определением количества имеющегося фермента или анализом активности. Полипептиды, пептиды и аминокислоты также могут быть обнаружены и количественно определены любым способом, известным в данной области, включая, например, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спектрофотометрию, радиографию (внесения метки в белок), электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТЬС), супердиффузионную хроматографию, различные иммунологические способы, например иммунопреципитацию, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, способы радиоиммунного анализа (ША), способы твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А), способы иммунофлюоресцентного анализа, гель-электрофорез (например, 8Ό8РА6Е), окрашивание с помощью антител, активизированную флюоресценцией сортировку клеток (РАС8), пиролитическую масс-спектрометрию, инфракрасную спектрометрию Фурье, Раман-спектрометрию, способы масс-спектрометрии 6С-М8 и ЬС-электрораспыление, и сар-ЬСЛапбет-электрораспыление и т.п. Скрининг новых видов биологической активности также может быть проведен с использованием способов или их вариантов, описанных в патенте США № 6057103. Более того, как подробно описано ниже, один или несколько, или все полипептиды клеток могут быть определены с использованием белковой матрицы.
Ферменты
Данное изобретение относится к новым композициям и способам ферментативной обработки, например обесцвечивания или осветления препаратов из водорослей, животных (например, рыб) и/или растений, кормов, пищевых продуктов или масел, содержащих хлорофилл (хлорофилл может быть природным в препаратах, кормах, пищевых продуктах или маслах, в качестве примеси, в качестве нежелательной композиции в обработанном продукте и т.д.). В одном аспекте композиции, содержащие хлорофилл или с примесью хлорофилла, например препараты из водорослей, животных или растений, корма, пищевые продукты или масла, ферментативно обрабатывают с использованием хлорофиллазы или эквивалентного фермента. В композиции или способе по данному изобретению может быть использован любой полипептид, обладающий активностью, которая может модифицировать хлорофилл или метаболит хлорофилла.
Хлорофиллазы
Полипептиды и/или пептиды по данному изобретению могут обладать активностью эстеразы, например хлорофиллазы или сходной активностью. Полипептиды и/или пептиды по данному изобретению могут включать каталитические антитела, ферменты, активные центры и т.п. Эти полипептиды и/или пептиды по данному изобретению с активностью эстеразы (например, хлорофиллазы) могут быть использованы в композициях или способах по данному изобретению. Например, в одном аспекте с помощью композиций и способов по данному изобретению композиции, содержащие хлорофилл или с примесью хлорофилла, ферментативно обрабатывают путем гидролиза хлорофилла (фиг. 1А) до фитола (фиг. 1В) и хлорофиллида (фиг. 1С).
Любая хлорофиллаза, сб1аке или хлорофилл-хлорофиллидо-гидролаза или полипептид, обладающий аналогичной активностью (например, хлорофилл-хлорофиллидо-гидролаза 1 или сб1аке 1, или хлорофилл-хлорофиллидо-гидролаза 2 или сЫаке 2, см., например, NСВI Р59677 1 и Р59678, соответственно) может быть использована в композиции или способе по данному изобретению. В композиции или способе по данному изобретению может быть использован любой полипептид (например, фермент или каталитическое антитело), который катализирует гидролиз сложноэфирной связи хлорофилла с образованием хлорофиллида и фитола. Может быть использован любой выделенный рекомбинантный или синтетический, или химерный (сочетание синтетического и рекомбинантного) полипептид (например, фермент или каталитическое антитело), например, в композиции или способе по данному изобретению может быть использована хлорофиллаза, сб1аке или хлорофилл-хлорофиллидо-гидролаза или полипептид, обладающий аналогичной активностью, см., например, Магсб1ег-Ваиег (2003) N^^^1 Ас1бк Кек., 31:383-387.
В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы с ферментами, как описано в \У0 0229022. Например, в одном аспекте композиции и способы по данному
- 82 013993 изобретению могут включать рекомбинантную экспрессию ферментов, например хлорофиллазу, такую как экспрессия кодирующих хлорофиллазу полинуклеотидов. В одном аспекте рекомбинантная нуклеиновая кислота экспрессируется в цельных клетках, клеточных экстрактах или ш νίΐΐΌ. В одном аспекте полинуклеотид, кодирующий фермент, модифицируют с продуцированием в результате измененного уровня фермента (например, хлорофиллазы) в трансформированной клетке-хозяине.
В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению, которые могут быть использованы с известными ферментами, такими как хлорофиллазы (включая сЫаке и хлорофилл-хлорофиллидогидролазы) и сходные полипептиды хорошо известны в данной области. Например, хлорофиллаза из АгаЬ1борк1к ШаПапа может быть использована, как описано, например, в NСВI в записи NМ_123753 (где фермент с последовательностью, как указано в 8Е0 ГО N0: 22, кодируется, например 8Е0 ГО N0: 21): 5Е0 ГР N0:21
АААААААаТАААвАААА<ЗАААААСТААТААА(ЗААСААААААААТСТССТСТТСТТСАТСААдАААСеСС
ТТТаААаАТбССАААТАСАААТСАААТСТСТТААССТТдСАСТСАТСАТСТССТТССТдСААААТААСА
СССТСТТСТА|ЕАССТТСАССОТСТСсаССАААССА<ЗСТСТТ®ЗТОССТАССССОСТе13АевААООАСАТ ТАТССаСТС(ЗТОАТ<ЗСТССТССАТ(ЗаТТАССТТСТСТАСААСТССТТСТАТТСТСА<ЗСТТАТ(ЗТТССАТ СТСТСТТСТСАТбССТТСАТССТСАТСбСТССТСАСТТАТАТАатАТС<ЗССССАССА<ЗАСАСААТ60АТ САСАТТАААТСААССССС6АСАТТАТССАТТССТТАТСАСТАеаАСТТААТСАСТТТСТТССА0СеСАА ОТААСАССАААССТАТССАААТТтеСССТСТССеСССАТАаССаСССТаССААААССССдТТТаСССТС 0ССТТАААвАААТТТдС6ТАСТССТССААТСТАААОАТСТСОАСАТТдАТССОТАТАСАТССАеТССАТ СОААСАбСбАААаЗОАААСАААССССТССТССбСТСТТСССТТАССТТССАААСТСАТТТСАССТДСАС ААААСаССТАТАСТТСТеАТСОйТТСбООССТТддТбАААССССТСОСААСССАТТАТТСССАССдТСТ зсАсстссссеА(зтаААТСАСсаАдА<зттстттсдооААтвтсАА®зтссА<зсАтассАТ7?тсатт<зса ААСОАТГАТСдССАТТТССАСАТССТТСАтеАТдАТАСААААСеОА'ГТАЗАдСеААСАСЗТТСТТАТТСТ ТТеТСТААСААТССТОААСАеАдаАОАССААТеАСеАеАТТСбТТдСТвСАСТТеТТСТАТСАТТТТТВ ААаеСТТАТТТССААСаАСАТОАТССТОААТТАаТТААеАТСАААСАтаабТвТСАС<ЗАббАТ<ЗТТССС (ЗТТбАААТТСААбАбТТТаАбеТТАТСАТаТАААСАТААОТТТТТСТТТАбйеесТСЮТТТТТСТАТТе ТСААТАТСАТСАССТТТТаТТССТТАТСбТТТТАСАААСТТАТАТТСТАСААСТСТТТААСТСАССТСТ ТТ0 СТТАТО АТАТТААССССАТС
ЗЕО ТО N0:22
МббевеКЫАРЕРвКУКВИЬЬТРРВЗвКССКХТРввКАВРБРРКОЬЬУАТРУЕЕСРУРУТМЫЛбУЬЬУН
ЗК/501МЕН735НСР1Ь1АР0ЬУ51АдР0ТМОЕ1К8ТАЕ1МОИЬ8УЕЫ;ШЕ'ЬРАаУТРКЪ5КГАЬЗаН2
ЕаОКТАЕАтаЬККР<3¥88НЬК18ТЫ6ХПР71ХЗТ6КекаТРРРУ1АХЪРМ5РрЬОКТР1ЬУ1е8бЬеЕТ
АКИРЬРРРСАРРСУННКЕРРНЕСООРАИНРУАКРУеНЬРМЬРРВТКеТКеКЗЗУСЪСкНСЕЕККРМККР
Уб0ЬУУЗРЬКАУЪЕдРРКЕЬУК1КРССНЕРУРУЕ1ОЕРЕУ1М
- 83 013993
Может быть использована хлорофиллаза С1пкдо Ь11оЬа, как описано, например, в NСВI в записи
ΑΥ292526:
ЗЕО 10 N0:23
ТТ(ЗАААААСАААААСОАА6ААСАТСААСТСАСТАСТТОСАСАСАОССАТСССССАТОСТТТТАСТ6ААО дАТ6ТСТТСАСССААССТССТТТАССТ13ТТСАААТССТС0СААТТССАСААСССААСТСАТСТССАТОС ТСААААТТАбСАОАСАААААСОСААСТОСААССАСОССТТСТССТгаТСОСССТССТАААССССТОСТО АТСбСТСТТССТТСССААСАТЗСАЗАТТАТССТСТСАТССТСТТТТТССАСООСТАТОТАСТССТСААТ тсстгстаттстсаастсттссоссатеттосттсссатобатасатсоссатасстсстсаоатотас АОТСТААТТеаСССАААТАССАСТССАеАААТАаСССАТССАСС®ЗСС!АТТАСА(ЗАСТ(ЗСТТАСОА6АТ бОАСТСТСеСАТААТСТТССССААЗСТТТАААСААТСАТСТОАСССССААТТТТСАСАААТТТЗТОСТА СССв0ССАСТС(ЗССС(ЗСа(ЗОТААА(Зте(ЗСАТТТ6САСТТ6СССТАО0ТС6АеТСТСйСАОС€АТСТТТА ААЗТАСТССЗСССТТаТАОСТСТТЗАТССАЗТССАтеСААТОСОААААОАТСААСАААССАСТСАТССТ АТТСТаТСАТАСАСАОАССаТТССТТТаАТТТССОТАТСССААСАТТАОТОСТАООТТСССбССТОбОТ ССвТаСААААСАААСССТСТСТТСССТСССТ(ЗТССТССССАА(ЗЗТ<ЗТТААССАССАТеАТТТСТТСТАС еААТСТСТСССТССТСССТАТСАТТТТаТТСССТСТСАТТАТОСССАТСТТСАТТТСТТАСАСЗАСеАС АССАДАааААТДАСАееАААСССТАСТТАТТвССТСГ0ТАА(ЗААТОа(ЗЙААеСААОА13АОССААТЗСЙО АА8ТТТАвСС0ТОСААТТаТС0ТТССАТТТСТТСААЗСАТТТСТТ06Т6АТААТСеТС&АОСССТ<ЗААТ йАТАТТАТСОТТТАТССТТСАСАТССТССАСТСААОАТТСАСССТССАОАОТСТТТСбТТАСАОААОАТ еТААААТССССАСААСТС0ААТТАТТАСаСС(ХВДСА0ТТтеСАеАТ6АТ6ТАССАТебТАТТАТ!ЭСАТТ АААеСААТбТАТТТбТТАТТАААААААТАТТААбААСТААААААААААААААА
ЗЕО 10 N0:24
МУЬУКРУРЗЕСРЬРУ01ЬА1Р0А№8РС8К1АОККеТАТТР8РСЕРРК1ЪЫАЬ₽50Н60¥РЫЬРИ16
УЧЬЬИЗРУ80ШгНУА8НаГГА1АР0М¥5У1СРМТТРЕ1АПААА1ТОтК1ХЗЬЗОНЬР0А1Л®1НУКР№ ЕКГУЪАСНЗРаСКУАЕАЬАЬСНУЗОРЗЬКУЗАЬУаЬОРУГХЗМСКОООТЗНРХЬЕтаЕНЗЕОЬаМРТЬУУ аЗОЬаРСККЫРЬЕРРСАРОеУЫННОРЕУЕСТАРАУНРУАЗОУОНЬПРЫИЮТКСГКСКАТТСЬСКЫОЕА .
ΗΕΡΜΚΚΡ3<30ΐννΑΡΕΟΑΡθαθΝΚ0ΑΟΝΟΙΜνΥΡ5ΗΑΡνΚΙΕΡΡΕ3^ΖΤΕηνΚ3ΡΕνΕΠΟΗΚΆνσΚ
Может быть использована хлорофиллаза Вгаккка о1егасеа, как описано, например, в NСВI в записи АЕ337546:
ЗЕО ΙΟ N0:25
АСАСАААААААТАТАТААСАСААА6АААТА6ААОААЙ<ЗААААААТСТСССССТССТТТСТТТТСТТТАС ТТТОТТТТТаАТАААаСАААТСТССТСТТСАТСАТСАССАААСТССТТТСАССАССССАААТАСААААС АОАТСТТТТААСА<ЗТАСОСТТАТСАТСТТОСТ6СТСЗСАААААОСССТССТСТТСТСССАСТССССА0ТС ТССеСССАА6А0<ЗСТТТТСеТСССААССССОСТ®ЗА(3<ЗААВСАаААТАТССаСТССТОАТОСТССТССА ТСЗСТТАССТТСТСТАСААСТСАТТТТАТТСССАССТТАТОТТОСАТОТСТСТТСССАТС0СТТСАТТОТ САТСССТССОСАОТТАТАТАаСАТТОССбОАССАОАСАССАТОСАТСАСАТААААТСААСОССАСАСАТ ТАТТСАТТСЗОТТАТССОТСССАСТАААССАСТТТСТТССАССАСААаТААСАССАААССТАТССАЖЗТТ СССАСТСТСС00ССАТАСССеТ0СТ(ЗС<ЗААСАСС0САТТТ<ЗССТТетЗССТТАААвАААТТТа<ЗАТАСТС 0ТСССАССТААА0АТСТС00САТТ0АТА00ТАТАЯАТСТТ00ААСТаТТТТТТ00АСАААТаОСТАТ0а ССААТАТТССб0Т0ААТТТТТСаАбСААТТТОАТТ0ТС0АААТ8АСС06АТТСТб0ААТСбТА(ЗаАТТС АТТеТТАТСАСгаСТАТССТАТАОТСТААТСАТАТАТСАААААССААОТТСеТТТСААТСАОАААТСАА АЗТСТААААТА0АТТАТТТ0ТААААТАТСТАТАТТА0ААТТАТ0А0СТАА0АААССТСТТОТаТТТААА АТСеАСААСТТАТААСАААОТТАТААААААСТТТОТАААСААТТТабтеГ'СТТАЗС
ЗЕО ГО N0:26
МЗРЗРЬРРТЬРЫКЕМЗЗЗЗЗАНЗРЕКЗКУКТОЬЬТУСЪЗЗССИККРЗЗЗРТРОЗРРКЕЬЬУАТРУЕЕО
Е¥РУ™ЬЪНСУЬЬ¥НЗЕ¥50ЪМЬНЧЗЗНОР171АР0Ц¥31А<ЭРОТМОЕ1КЗТЛЕ11ОИЬЗТСЬННРЪРР
О’Л’РЫЬЗКРАЬЗСНЗЕСЗКТАРАААЬККГОУЗЗПЬКГЗАШСГСУ'ЗТ/РИТНетСОУЗОЕГгЕОРОСПН
ОЕХУЕЗ
- 84 013993
Может быть использована хлорофиллаза Скгиз зтепз1з, как описано, например, в NСВI в записи Р9МУ14:
ЗЕО ТО N0:27
РАДИУС АОАА5У0ОТРЬ1ЛТАТЬРУРТЙС1УЗТКР.1ТЬЕТ55Р5£РРРРКРЦ11УТРАСКОТгТГУ1Г,Р
ЬН<ЗТ5Ь8НКЗ¥ЗК1РОН1АЗН<ЗГ1УУАРаЪУТ31РРРЗА’ГНВиУЗААЕУАЕИЬ₽ааь00НЬРЕНТЕАЫУ ЗЬУАУМаНЗКа(ЗаТАРАЬЗЬЕУ<ЗраАУ1СШРУАСТЗКТТСШР31ЦЗРЦЗЕЦР31РУТУ1<ЗТОЫЗОУА КС1ТАСАРЕСАМНЕЕРРКНСК№ЗЙАНРУАТ0¥СНМП1ШЦЫРЗПУК5ИАЬЗКУРСК№КЕЗКЦ₽МККС У8<Э1УУАРЦКЦРГУ<ЗЦАЕЦРК01ЦКЦРЗРАР1КШЗУЕ¥1ОАБ8МЬТТТНУКУ
Препараты ферментов
Ферменты, используемые в способах по данному изобретению, могут быть разработаны или модифицированы, например химически модифицированы, например, для повышения растворимости масла, стабильности, активности или для иммобилизации. Например, ферменты, используемые в способах по данному изобретению, могут быть разработаны амфипатическими или более липофильными. Например, ферменты, используемые в способах по данному изобретению, могут быть инкапсулированы, например, в липосомы или гели, например альгинатные гидрогели или альгинатные сферы, или эквиваленты. Ферменты, используемые в способах по данному изобретению, могут быть разработаны в мицеллярных системах, например, в среде с тройной мицеллярной (ТМЗ) или обратной мицеллярной системой (КМЗ). Могут быть разработаны ферменты, используемые в способах по данному изобретению, как описано в Υί (2002) 1. оГ Мо1еси1аг Са!а11уз1з В: Епхутайс, νо1. 19, № 0, р. 319-325. Например, амфипатический фермент, например хлорофиллаза, в форме среды с тройной мицеллярной (ТМЗ) или обратной мицеллярной системой (КМЗ) может быть инкапсулирован в альгинатные гидрогели. В одном аспекте фермент, например хлорофиллаза, получают в водном буфере и хранят в гидрогеле, например ТМЗ/альгинат и КМЗ/альгинат. Одним подходом для инкапсулирования фермента, например хлорофиллазы, может быть эмульгация и/или внутренняя желатинизация системы фермент-ТМЗ или -КМЗ.
Ферментативные реакции способов по данному изобретению могут быть проведены 1п У1!го, включая, например, капиллярные матрицы, как описано ниже, или в системах цельных клеток. В одном аспекте ферментативные реакции способов по данному изобретению проводят в одном реакционном сосуде или во множестве сосудов. В одном аспекте ферментативные реакции способов по данному изобретению проводят в устройстве для очистки растительного масла.
Композиции и способы по данному изобретению могут применяться на практике с иммобилизованными ферментами, например иммобилизованной хлорофиллазой. Фермент может быть иммобилизован на любой органической или неорганической подложке. Иллюстративные неорганические подложки включают оксид алюминия, целит, хлорид По^ех-1, стеклянные бусы и силикагель. Иллюстративные органические подложки включают альгинатные гидрогели и альгинатные бусы или эквиваленты.
В различных аспектах данного изобретения иммобилизация хлорофиллазы может быть оптимизирована посредством физической адсорбции на различные неорганические подложки, включая оксид алюминия, целит, хлорид По^ех-1, стеклянные бусы и силикагель. Ферменты, используемые для осуществления данного изобретения, могут быть иммобилизованы в различных средах, включая воду, Тпз-НС1 буферный раствор и тройную мицеллярную систему, содержащую буферный раствор Тпз-НС1, гексан и поверхностно-активное вещество. Наибольшую эффективность иммобилизации (84,56%) и специфичную активность (0,34 ммоль гидролизованного хлорофилла-мг белка-1 в мин) получали, если хлорофиллаза была суспендирована в буферном растворе Тпз-НС1 и адсорбирована на силикагель.
Промышленное и медицинское применение
Полипептиды, например ферменты по данному изобретению, вовлеченные в катаболизм хлорофилла или обладающие активностью эстеразы (например, хлорофиллазы), могут быть использованы в различных областях медицинского и промышленного применения, как описано в данном описании. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы в отношении любого промышленного использования или фармацевтического или медицинского применения для обработки хлорофиллсодержащих материалов, например препаратов растений, маслосодержащих материалов. Например, чтобы назвать всего несколько областей применения, композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы в способах превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, рафинирования масел, обработки масел из растений, рыбы, водорослей и т.п. Например, способы по данному изобретению могут быть использованы при обработки жиров и масел, как описано, например, в публикации патентной заявки ΓΡ Н6-306386, где описано превращение фосфолипидов, находящихся в маслах и жирах, в растворимые в воде вещества, содержащие группы фосфорной кислоты.
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами обработки растительных масел, таких как масла, полученные или выделенные из рисовых отрубей, сои, канолы, пальмы, хлопчатника, кукурузы, ядра пальмы, кокосового ореха, арахиса, кунжута, подсолнечника. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами обработки эфирных масел, например масел, полученных из масел семян плодов, например из семян
- 85 013993 винограда, абрикоса, бурачника и т.д. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами обработки масел и фосфолипидов в различных формах, включая неочищенные формы, рафинированные формы, камеди, промывочную воду, глину, диоксид кремния, жировую смесь для варки мыла и т.п. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами обработки масел с высоким содержанием фосфора (например, соевого масла), рыбьего жира, животных масел, растительных масел, масел из водорослей и т. п.
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами обработки и получения пищевых масел, биодизельных масел, липосом для лекарственных и косметических средств, структурных фосфолипидов и структурных липидов. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами экстракции масел. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы совместно со способами получения различных видов мыла.
Кроме того, способы могут включать модификацию рН (например, повышение рН) для обеспечения водного удаления хлорофиллида. Таким образом, композиции и способы по данному изобретению также могут включать нейтрализацию щелочью, например в условиях нейтрализованного щелочью рН. В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению включают стадию нейтрализации, например, при обработке химически очищенных масел, например, с использованием хлорофиллаз, и/или при удалении хлорофиллида. Композиции и способы по данному изобретению могут включать модификацию рН для обеспечения водного удаления хлорофиллида.
В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению включают использование устройств и методов очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, которые известны в данной области, например, с использованием методов очистки с диоксидом кремния Тп8у1 8Шса (Сгасе Рау1коп, Со1итЫа, МО) или диоксидом кремния 8ОКВ81Ь К™ (ШЕО8 8111сак, 1ойе!, 1Ь).
Способы ферментативной обработки или осветления, или обесцвечивания
Данное изобретение относится к новым композициям и способам ферментативной обработки, например обесцвечивания или осветления препаратов из водорослей, животных (например, рыбы) и/или растений, кормов, пищевых продуктов или масел, как проиллюстрировано на фиг. 8-16. В одном аспекте обрабатывают пищевые продукты или масла, содержащие хлорофилл или с примесью хлорофилла. Например, в альтернативных аспектах растительные масла, включая масла, полученные из семян масличного растения, такие как масло канолы (семян рапса) или соевое масло, или масла из плодов масличных растений, такие как пальмовое масло, обрабатывают с использованием композиций и/или способов по данному изобретению.
По меньшей мере одна стадия в этом иллюстративном способе включает использование фермента, например хлорофиллазы, который гидролизует хлорофилл до фитола и хлорофиллида. В альтернативных аспектах фермент используют на одной, нескольких или всех стадиях. Реакции могут быть проведены ίη νί!Γ0 или ίη νίνο.
На фиг. 8 представлена реакция деградации хлорофилла иллюстративной эстеразой по данному изобретению - хлорофиллаза (с11аке) катализирует гидролиз сложноэфирной связи в хлорофилле с получением хлорофиллида и фитола, где хлорофиллид переходит в водную фазу вследствие гидрофильного порфиринового кольца, а фитол распределяется в масляной (гидрофобной) фазе. В одном аспекте способа по данному изобретению гидрофильное порфириновое кольцо удаляют фракционированием в системе камедь/вода с использованием любого из различных хорошо известных способов.
На фиг. 9 представлены и сравниваются традиционный и иллюстративный способы ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, где в способе ферментативного осветления может быть использована эстераза по данному изобретению. В традиционном способе неочищенное растительное масло рафинируют (необязательно, щелочной нейтрализацией), осветляют с использованием, например, адсорбции с глиной, с последующим удалением глины и дезодорацией, с получением очищенного, осветленного и дезодорированного, или КВР, масла. В иллюстративном способе ферментативного осветления по данному изобретению неочищенное растительное масло рафинируют (необязательно, нейтрализацией щелочью), осветляют с использованием, например, полипептида по данному изобретению, такого как хлорофиллаза по данному изобретению, с последующим водным удалением хлорофиллида, с последующей дезодорацией с получением очищенного, осветленного и дезодорированного, или КВР, масла. Необходимость в рафинировании зависит от содержания фосфора и других факторов (все известны в данной области). Сою и канолу, как правило, рафинируют.
На фиг. 10 представлен иллюстративный способ ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению - объединенный способ рафинирования-осветления (обесцвечивания). В этом иллюстративном способе ферментативного осветления по данному изобретению неочищенное растительное масло рафинируют и ферментативно осветляют с использованием полипептида по данному изобретению, такого как эстераза, например хлорофиллаза, по данному изобретению, в одну стадию или в одном сосуде. Рафинирование может быть традиционным или ферментативным рафинированием, например, с вовлечением фосфолипида(ов) и/или гидролиза. В одном аспекте иллюстративный способ по
- 86 013993 данному изобретению включает последующую стадию водного разделения с удалением продукта реакции хлорофиллида, камеди и/или мыла. В одном аспекте за ней следует стадия дезодорации с получением очищенного, осветленного и дезодорированного, или РВО, масла.
На фиг. 11 представлен иллюстративный способ ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, который сочетает стадии рафинирования, ферментативного осветления (обесцвечивания) и нейтрализации щелочью. В иллюстративном способе ферментативного осветления по данному изобретению неочищенное растительное масло рафинируют, нейтрализуют и ферментативно осветляют с использованием полипептида по данному изобретению, такого как эстераза, например хлорофиллаза, по данному изобретению, в одну стадию или в одном сосуде. Рафинирование может представлять собой традиционное или ферментативное рафинирование, например, с вовлечением фосфолипида(ов) и/или гидролиза. В одном аспекте иллюстративный способ по данному изобретению включает последующую стадию водного разделения для удаления продукта реакции хлорофиллида, камеди и/или мыла.
На фиг. 12 представлен иллюстративный способ ферментативного обесцвечивания (осветления) по данному изобретению, который включает использование полипептида по данному изобретению, такого как эстераза, например хлорофиллаза, в отношении препарата семян масличного растения, с последующей стадией водного разделения (для удаления, например, продукта реакции хлорофиллида или камедей, и/или мыла), за которой следуют стадии, проиллюстрированные на фиг. 9, 10 или 11.
На фиг. 13 представлена общая схема очистки семян масличного растения, включающая экстракцию, очистку и модификацию семян масличного растения, где в дополнение к полипептиду по данному изобретению, такому как эстераза, например хлорофиллаза, к семенам масличного растения на одной или нескольких из этих стадий также добавляют, например, целлюлазу, гемицеллюлазу, протеазу, пектиназу, фосфолипазу А, В, С и/или Ό, эстеразу (например, селективную эстеразу), липазу (например, 1,3 липазу), селективную липазу, известную хлорофиллазу или другой фермент, вовлеченный в катаболизм хлорофилла, и т.п.
На фиг. 14 представлен иллюстративный промышленный способ по данному изобретению - способ биологического рафинирования, включающий использование фосфолипазы А и по меньшей мере одного полипептида по данному изобретению, обладающего ферментативной активностью хлорофиллазы. По меньшей мере один полипептид по данному изобретению, обладающий активностью хлорофиллазы, может быть добавлен на одной или нескольких, или на всех из следующих стадий: добавление к неочищенному маслу, в ходе рафинирования или в рафинированное масло, в резервуар для хранения или накопительную емкость, на стадии с фосфолипазой А (например, в расходном резервуаре на фигуре) и/или в резервуар для обработки щелочью.
На фиг. 15 представлен другой иллюстративный промышленный способ по данному изобретению, включающий использование по меньшей мере одного полипептида по данному изобретению с ферментативной активностью хлорофиллазы. По меньшей мере один полипептид по данному изобретению с активностью хлорофиллазы может быть добавлен на одной или нескольких, или на всех из следующих стадий: добавление к неочищенному маслу, в ходе рафинирования или в рафинированное масло, в резервуар для хранения или накопитель, в резервуар для обработки щелочью и/или смеситель для непрерывного смешения жидких потоков.
На фиг. 16 представлен другой иллюстративный промышленный способ по данному изобретению, включающий использование по меньшей мере одного полипептида по данному изобретению с ферментативной активностью хлорофиллазы. В этом иллюстративном процессе, в ходе рафинирования или в рафинированное масло с ферментом хлорофиллазой по данному изобретению добавляют фосфолипазу С (РЬС). По меньшей мере один полипептид по данному изобретению с активностью хлорофиллазы может быть добавлен на одной или нескольких, или на всех из следующих стадий: добавление к неочищенному маслу, в ходе рафинирования или в рафинированное масло (посредством РЬС), в резервуар для хранения или накопительную емкость, в резервуар для обработки щелочью и/или смеситель для непрерывного смешения жидких потоков.
Рафинирование масла и обработка растительного масла
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы на различных стадиях обработки растительного масла, таких как экстрагирование растительного масла, в частности удаление фосфолипидных камедей, в ходе процесса, называемого рафинированием масла.
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы в способах обработки растительных масел из различных источников, таких как рисовые отруби, соя, семена рапса, арахис и другие орехи, кунжут, подсолнечник, пальма и кукуруза. Способы могут быть использованы совместно со способами на основе экстракции гексаном с последующей очисткой неочищенных экстрактов до пищевых масел. Первая стадия в последовательности очистки представляет собой так называемый процесс рафинирования, который обеспечивает удаление фосфатидов при добавлении воды. Вещества, осажденные при рафинировании, разделяют и дополнительно обрабатывают до получения смесей лецитинов. Коммерческие лецитины, такие как лецитин сои и лецитин подсолнечника, представляют собой полутвердые или очень вязкие вещества. Они состоят из смеси полярных липидов, главным образом фосфо
- 87 013993 липидов, и масел, главным образом триглицеридов. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы перед или после любой стадии способа, или перед или после любой комбинации стадий, или перед или после всех стадий способа, например перед, в течение или после механической и/или химической экстракции, рафинирования и/или осветления, и т.п.
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы (т. е. совместно с) в любом методе рафинирования, включая водное рафинирование, рафинирование маслом Α^С0N (например, для соевых), рафинирование с каГшсо, суперрафинирование, рафинирование ИЕ, рафинирование ТОР, уни-рафинирование, сухое рафинирование и рафинирование с Е^УМАХ™. См., например, патенты США № 6355693; 6162623; 6103505; 6001640; 5558781; 5264367. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы в любом способе обработки масла, например при рафинировании или эквивалентном процессе. Например, композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы, как описано в патентах США № 5558781; 5288619; 5264367; 6001640; 6376689; XV0 0229022; при рафинировании масла, как описано, например, в ν0 98/18912; в способах, как описано в заявке ДР № Н5-132283 (поданной 25 апреля 1993 года); в заявке ЕР № 82870032.8 и т.п.
Различные методы рафинирования, используемые в способах по данному изобретению, описаны в Воск1ксЬ М. (1998) Ιπ Еа1к апй 011к НапйЬоок, ТЬе ех1гасНоп оГ Уеде1аЬ1е 0118 (С1ар1ег 5), 345-445, А0С8 Ргекк, СЬатращп, П1то18. Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы в области промышленного применения ферментативного рафинирования триглицеридных масел, как описано, например, в ЕР 513709.
В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению используются для обработки растительных масел, например неочищенных масел, таких как масла из отрубей риса, сои, канолы, цветов и т.п. В одном аспекте это приводит к повышению эффективности процесса рафинирования. В одном аспекте способы по данному изобретению приводят к улучшению удаления хлорофилла из масляной фазы, например, в процессе центрифугирования. Улучшенное разделение этих фаз может привести к более эффективному удалению хлорофилла из масла, включая как гидратированные, так и негидратированные масла.
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы в области промышленного применения ферментативного рафинирования, как описано, например, в СА 1102795, где описан способ выделения полярных липидов из липидов злаковых добавлением по меньшей мере 50 мас.% воды. Этот способ представляет собой модифицированное рафинирование в том смысле, что в нем используется принцип добавления воды в смесь неочищенных масел.
В одном аспекте данное изобретение относится к ферментативным способам, включающим использование композиций и способов по данному изобретению, включающим гидролиз гидратированных фосфолипидов в масле при температуре приблизительно от 20 до 40°С при щелочном рН, например при рН приблизительно от рН 8 до 10, с использованием времени проведения реакции приблизительно от 3 до 10 мин.
В различных иллюстративных способах по данному изобретению число отдельных стадий включает рафинирование, предшествующее основным методам очистки и дезодорации. Эти стадии включают нагревание, смешивание, выдерживание, разделение и высушивание.
После стадии нагревания добавляют воду и часто кислоту и смешивают до обеспечения агломерации нерастворимых фосфолипидных камедей в частицы, которые могут быть удалены. Несмотря на то что с помощью воды при рафинировании удаляется много фосфатидов, часть фосфолипидов представляет собой негидратируемые фосфатиды (NНΡ), представленные в качестве солей кальция или магния. Методы рафинирования для таких NНΡ обеспечивают добавлением кислоты. После гидратации фосфолипидов масло перемешивают, выдерживают и разделяют центрифугированием. В заключение, масло высушивают и хранят, транспортируют или очищают. Полученные камеди либо дополнительно обрабатывают для получения лецитиновых продуктов, либо добавляют обратно в пищу. Как указано выше, композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы до или после любой из указанных стадий, или до или после любой комбинации стадий, или до или после всех стадий, в любом способе обработки.
После завершения ферментативной обработки по данному изобретению обработанную жидкость (например, масло) разделяют с помощью соответствующих устройств, таких как центрифужный сепаратор, и получают обработанное масло. В одном аспекте соединения, получаемые при ферментативной модификации хлорофилла, частично или полностью переходят в водную фазу и удаляются из масляной фазы. После завершения ферментативной обработки, если необходимо, обработанное масло дополнительно может быть промыто водой или органической или неорганической кислотой, такой как, например, уксусная кислота, фосфорная кислота, янтарная кислота и т. п., или растворами солей.
В одном иллюстративном способе рафинирования ультрафильтрацией фермент, используемый в способе по данному изобретению, связан на фильтре или фермент добавляют к маслу перед фильтрацией. Ферменты, используемые в композициях или способах по данному изобретению, могут быть иммобилизованы на любом субстрате, например фильтрах, волокнах, колонках, бусах, коллоидах, гелях, гидрогелях, ситах и т. п.
- 88 013993
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы для улучшения экстракции масла, рафинирования масла и нейтрализации щелочью (например, для растительных масел). В одном аспекте в способе по данному изобретению используют композицию или способ по данному изобретению и по меньшей мере одно вещество, вызывающее деградацию клеточной стенки растений (для размягчения стенок и повышения выхода при экстракции, например целлюлаза, гемицеллюлаза или сходные с ними). В иллюстративном способе для улучшения экстракции масла и рафинирования масла используется фосфолипаза, например фосфолипаза С, или другая гидролаза (например, целлюлаза, гемицеллюлаза, эстераза, протеаза и/или фосфатаза). Например, в одном аспекте в ходе стадии измельчения, ассоциированной с продукцией масла (включая, но, не ограничиваясь ими, масло из сои, канолы, подсолнечника, рисовых отрубей), может быть использована фосфолипаза или другой фермент. Используя ферменты до или вместо экстракции растворителем, можно повысить выход масла и снизить количество гидратруемых и негидратируемых фосфолипидов в неочищенном масле. Общее снижение количества фосфолипидов в неочищенном масле приведет к повышению выхода в ходе очистки с возможностью устранить необходимость в отдельной стадии рафинирования перед осветлением и дезодорацией.
Композиции и способы по данному изобретению также могут применяться на практике при использовании способов, как описано в патенте США № 5414100. Например, в одном аспекте способы или композиции дополнительно включают хроматографические методы для понижения кислотности в растительных маслах при температуре окружающей среды. Эти методы могут быть модифицированы в методы понижения кислотности с использованием очистки с мисцеллой или экстракции растворителем, где неочищенное растительное масло растворяют в растворителе, таком как изопропиловый спирт, и пропускают через колонку с активированным глиноземом (оксидом алюминия) при комнатной температуре. Способ, при котором устраняется физический контакт как между маслом и щелочным реагентом, так и между маслом и водой, упрощает последующие способы осветления, также удаляя некоторые цветные пигменты. Использованный оксид алюминия может быть повторно активирован промыванием его разбавленным раствором гидроксида натрия или гидроксида калия.
Композиции и способы по данному изобретению также могут применяться на практике при использовании способов, как описано в ΙΡ 57156482, 1982 (заявка № ΙΡ 19810040794 19810320), где описана очистка растительных жиров или масел в качестве субпродуктов.
Композиции и способы по данному изобретению также могут применяться на практике при использовании способов, как описано в патенте США № 5315021. Например, в одном аспекте способы или композиции по данному изобретению могут применяться на практике со способами удаления цветных примесей хлорофилла из растительных масел. Способы могут включать диспергирование источника фосфорной кислоты в растительном масле с получением смеси с содержанием влаги менее чем 0,1 мас.%, и выдерживание этой смеси при температуре в диапазоне от 70 до 160°С до тех пор, пока не образуется осадок, содержащий цветные примеси хлорофилла. За этим может следовать разделение осажденных веществ из масла для удаления цветных примесей хлорофилла с осажденными веществами, например, в ходе традиционной обработки масла вплоть до добавления в масло или удаления из масла отбеливающей глины.
Ферментативная обработка семян масличных растений
Композиции и способы по данному изобретению могут быть использованы для ферментативной обработки семян масличных растений, включая пасту из сои, канолы (семян рапса), кокосового ореха, авокадо и оливок. В одном аспекте способы по данному изобретению могут повышать выход масла и улучшать питательные качества полученной пищи. В некоторых аспектах ферментативная обработка семян масличных растений с использованием ферментов и способов по данному изобретению обеспечит экономические и экологические преимущества, а также альтернативные технологии экстракции масла и обработки пищевого продукта для потребления человеком и животными. В альтернативных аспектах способы по данному изобретению дополнительно включают использование фосфолипаз, протеаз, фосфатаз, фитаз, ксиланаз, амилаз (например, α-амилаз), глюканаз (например, β-глюканаз), полигалактуроназ, галактолипаз, целлюлаз, гемицеллюлаз, пектиназ и других ферментов, участвующих в деградации клеточной стенки растений, а также смесей препаратов ферментов и клеточных лизатов. В альтернативных аспектах способы по данному изобретению могут применяться на практике совместно с другими способами, например с ферментативной обработкой, например, карбогидразами, включая целлюлазу, гемицеллюлазу, и другими активными в отношении деградации веществами, или с химическими способами, например экстракцией соевого масла гексаном. Ферментативная обработка может повысить экстрагируемость на 8-10%, если ферментативную обработку проводят перед экстракцией растворителем.
В альтернативных аспектах способы по данному изобретению могут применяться на практике со способами водной экстракции. Способы водной экстракции могут быть экологически более чистыми по сравнению с альтернативными методами экстракции масла. В способах по данному изобретению также могут быть использованы ферменты, которые гидролизуют структурные полисахариды, формирующие клеточную стенку семян масличных растений, или которые гидролизуют белки, которые формируют клеточную мембрану и мембрану липидного слоя, например, с использованием веществ для расщепления, включающих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или протопектиназу, для экстракции масла из клеток сои.
- 89 013993
В одном аспекте способы применяются на практике с ферментом по данному изобретению, как описано КазаД (2003) Д. АдгДс. Рооб СНет., 51:6217-6222, который сообщил, что наиболее эффективным ферментом для расщепления клеточной стенки является целлюлаза.
В одном аспекте в сочетании со способами по данному изобретению используют протеазы. Оценивалось комбинированное влияние функциональных переменных и ферментативной активности протеазы и целлюлазы на выход при экстракции масла и белка в сочетании с другими параметрами способа, такими как концентрация фермента, время гидролиза, размер частиц и соотношение твердой и жидкой фаз. В одном аспекте способы по данному изобретению применяются на практике с протоколами, как описано КозепДНаД (2001) Епхуше апб МДсгоЬ. ТесН., 28:499-509, который сообщил, что такое использование протеазы может привести к значительно более высокому выходу масла и белка по сравнению с контролем при использовании муки, обработанной нагреванием.
В одном аспекте в сочетании со способами по данному изобретению используют полную экстракцию белка, пектина и гемицеллюлозы. Клетка растений состоит из набора полисахаридов, часто ассоциированных с белками или фенольными соединениями, или замененных ими. Большинство из этих углеводородов только частично расщепляется и слабо утилизируется ферментами, участвующими в расщеплении. Разрушение этих структур посредством обработки или деградации ферментов может улучшить их пищевую доступность. В одном аспекте способы по данному изобретению применяются на практике с протоколами, как описано Οιιΐ^η (2002) Д. АдгДс. Рооб СНет., 50:1933-1938, который сообщил, что значительная деградация целлюлозы клеточной стенки сои (вплоть до 20%) достигается после полной экстракции белка, пектина и гемицеллюлозы.
В одном аспекте способы по данному изобретению дополнительно включают добавление различных способов ферментативной обработки при обработке семян, например семян канолы, где способы обработки включают использование протеаз, целлюлаз и гемицеллюлаз (в различных комбинациях друг с другом и с одним или несколькими ферментами по данному изобретению). Например, способы могут включать ферментативную обработку семян канолы при 20-40-кратном увлажнении в ходе инкубации с ферментами перед традиционным способом; как описано, например, 8ози1зкД (1990) Ргос. Сап. ШзД. Рооб 8сД. ТесНпоД., 3:656. Способы по данному изобретению могут дополнительно включать объединение протеаз, α-амилаз, полигалактуроназ (в различных комбинациях друг с другом и с одним или несколькими ферментами по данному изобретению) для гидролиза клеточного материала в кокосовой муке и выделения кокосового масла, которое может быть извлечено центрифугированием, как описано, например, МсОДопе (1986) Д. о£ Рооб 8сД., 51:695-697. Способы по данному изобретению могут дополнительно включать объединение пектиназ, α-амилаз, протеаз, целлюлаз в различных комбинациях (друг с другом и с одним или несколькими ферментами по данному изобретению) с получением значительного повышения выхода (~70% в лучшем случае) в ходе ферментативной экстракции масла авокадо, как описано, например, Виеш’озДго (1986) ВДоДесН. Ьейегз, 8(7):505-506. В способах по данному изобретению для экстракции оливкового масла оливковую пасту обрабатывают целлюлазой, гемицеллюлазой, полигалактуроназой, пектинметилтрансферазой, протеазой и их комбинациями (друг с другом и с одним или несколькими ферментами по данному изобретению), как описано, например, МопДебого (1976) АсДа УДДатДп. ЕпхутоД (МДДапо) 30:13.
В одном аспекте композиции и способы по данному изобретению могут применяться на практике со способами, как описано в патенте США № 6376689. Например, в одном аспекте композиции и способы по данному изобретению могут включать одностадийный способ рафинирования/обесцвечивания кислотой, при котором из растительных масел из семян удаляются подобные хлорофиллу соединения, особенно из семян, поврежденных охлаждением, в которых содержится большое количество подобных хлорофиллу соединений. В одном аспекте способы по данному изобретению дополнительно включают смесь водной серной и фосфорной кислот, которую смешивают с маслом для удаления из масла подобных хлорофиллу соединений. Очищенное масло может обладать менее чем 5 ч.млн. подобных хлорофиллу соединений, менее чем приблизительно 50 ч.млн. фосфора или менее чем приблизительно 1,0 мас.% свободных жирных кислот.
Очистка фитостеринов из растительных масел
Композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению также могут быть использованы совместно со способами и методами очистки фитостеринов и тритерпенов, или растительных стеринов, из растительных масел. Фитостерины, которые могут быть очищены с использованием способов по данному изобретению включают β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клаонастерин и брассикастерин. Растительные стерины представляют собой важные сельскохозяйственные продукты для отраслей промышленности в области здоровья и питательных добавок. Таким образом, композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению могут быть использованы для получения эмульгаторов для производителей косметики и стероидных промежуточных соединений и предшественников для гормональных лекарственных средств. Композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению могут быть использованы для получения (например, очистки) аналогов фитостеринов и их сложных эфиров для ис
- 90 013993 пользования в средствах, снижающих уровень холестерина, с получением пользы для здоровья сердечнососудистой системы. Композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению могут быть использованы для очистки растительных стеринов для снижения уровня сывороточного холестерина посредством ингибирования всасывания холестерина в просвете кишечника. Композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению могут быть использованы для очистки растительных стеринов, которые обладают иммуномодулирующими свойствами при крайне низких концентрациях, включая усиление клеточного ответа Т-лимфоцитов и цитотоксических возможностей естественных киллеров против опухолевой клеточной линии. Композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению могут быть использованы для очистки растительных стеринов для лечения туберкулеза легких, ревматоидного артрита, управления течением у ВИЧ-инфицированных пациентов и ингибирования иммунного стресса, например, у участников марафонов.
Композиции (например, эстеразы) и способы по данному изобретению могут быть использованы для очистки стериновых компонентов, находящихся в стериновых фракциях продовольственных растительных масел (например, масла кокоса, канолы, масла какао, кукурузы, хлопкового масла, масла из семян льна, оливок, пальмы, арахиса, рисовых отрубей, саффлора, кунжута, сои, подсолнечника), таких как систостерин (40,2-92,3%), кампестерин (2,6-38,6%), стигмастерин (0-31%) и 5-авенастерин (1,5-29%).
Устройство для очистки растительного масла
Данное изобретение относится к промышленному изделию, состоящему из системы рафинирования для ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающей (а) устройство для очистки растительного масла и (Ь) полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы, функционально интегрированный в устройство для очистки растительного масла, где активность полипептида заключается в катализе реакции модификации хлорофилла, и устройство для очистки растительного масла может обеспечивать реакцию композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла, с полипептидом в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла.
Промышленные изделия по данному изобретению могут содержать любое устройство для очистки растительного масла или их комбинацию, например экспеллер для выхода масла (например, из Репигаб Согр.) или устройство для гравитационного удаления камедей.
Данное изобретение относится к промышленному изделию, содержащему иммобилизованные ферменты, например иммобилизованную хлорофиллазу, например эстеразу по данному изобретению. В одном аспекте промышленного изделия хлорофиллаза включает хлорофиллазу, иммобилизованную на диоксиде кремния. Диоксид кремния включает силикагель или эквивалент. Диоксид кремния включает диоксид кремния Тг18у1 8Шса или диоксид кремния 80КБ 8Ι6 К™.
В одном аспекте продукты производства по данному изобретению включают устройство для изменения рН, например увеличения рН (щелочной обработки), и затем, альтернативно, для нейтрализации рН.
Данное изобретение дополнительно описано на основании следующих ниже примеров; однако следует понимать, что данное изобретение не ограничивается такими примерами.
Примеры
Пример 1. Иллюстративный анализ активности эстеразы.
Следующий пример демонстрирует иллюстративный анализ активности эстеразы (хлорофиллазы) для выделения и характеризации ферментов по данному изобретению и нуклеиновых кислот, которые их кодируют, и для определения, входит ли полипептид в объем данного изобретения.
Эстеразы анализировали на наличие активности в отношении хлорофилла из шпината с получением хлорофиллида. В этом иллюстративном анализе активности эстеразы (хлорофиллазы) формат для скрининга эстеразы включает:
скрининг планшетов в двух экземплярах;
положительный (СНЬаке) и отрицательный контроли в каждом планшете;
мМ СНЬ, 20% клеточного лизата, 20% ацетона, рН 7,5, 0,01% НВТ;
время инкубации 24 ч при температуре 30°С в темноте;
объем реакции 100 мл;
анализ посредством ЬС-УК; инъекция 1 мл образца.
При этом способе скрининга для анализа продукта реакции эстеразы использовали ВЭЖХ. На фиг. 2 и 3 представлены данные, показывающие результаты анализа активности эстеразы (хлорофиллазы) с использованием указанных иллюстративных ферментов по данному изобретению.
Для ВЭЖХ:
колонка: СготоШб 8реебК0О КР-18е 50-4, 6 мм (каталожный № ИМ1082/086);
поток: 1,0 мл/мин;
инъекция: 1,0 мл.
- 91 013993
А: Н2О В: МЕОН+1 мМ ΝΗ4ΟΑο С: МТВЕ
Т (мин) А в С
0 10% 80% 10%
2,3 10% 80% 10%
2,31 0% 50% 50%
4 0% 50% 50%
4,1 10% 80% 10%
7 10% 80% 10%
Данные, представленные на фиг. 2, иллюстрируют повышение уровней продукта реакции между моментами времени 24 и 48 ч, где уровни продукта реакции показывают активность хлорофиллазы для 8ЕО ГО N0: 2, 8Ер ГО N0: 4, 8ЕО ГО N0: 6, 8Ер ГО N0: 8, 8Ер ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 14, 8Ер ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 18 и 8Е0 ГО N0: 20. Данные, представленные на фиг. 3, иллюстрируют повышенные уровни продукта реакции между моментами времени 24 и 48 ч, где уровни продукта реакции показывают активность хлорофиллазы для 8Е0 ГО N0: 10.
Было описано множество вариантов осуществления данного изобретения. Тем не менее, следует понимать, что могут быть произведены различные модификации без отклонения от существа и объема данного изобретения. Таким образом, другие варианты осуществления входят в объем приведенной ниже формулы изобретения.

Claims (30)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:
    (а) последовательность нуклеиновой кислоты, которая (ί) по меньшей мере на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или на 100% (полностью) идентична последовательности 8Е0 ГО N0: 17, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью эстеразы, или (ίί) по меньшей мере на 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или на 100% (полностью) идентична последовательностям 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 7 или 8Е0 ГО N0: 15, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью эстеразы, или (ίίί) по меньшей мере на 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или на 100% (полностью) идентична последовательностям 8Е0 ГО N0: 5 или 8Е0 ГО N0: 11, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью эстеразы, или (ίν) по меньшей мере на 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или на 100% (полностью) идентична последовательностям 8Е0 ГО N0: 1, 8Е0 ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 13, или
    - 92 013993 (νί) по меньшей мере на 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или на 100% (полностью) идентична последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 19, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью эстеразы, и необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием, и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВЬА8Т версии 2.2.2, где установлены параметры фильтрования Ь1ак!а11 -р Ь1ак!р -к пг ра!аа -Е Е, и все другие параметры установлены по умолчанию;
    где идентичность последовательностей существует на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более остатков, или на протяжении полной длины гена или транскрипта; или (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, имеющий последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2, 8ЕО ΙΌ N0: 4, 8ЕО ΙΌ N0: 6, 8ЕО ΙΌ N0: 8, 8ЕО ΙΌ N0: 10, 8ЕО ΙΌ N0: 12, 8ЕО ΙΌ N0: 14, 8 ЕС) ΙΌ N0: 16, 8ЕС) ΙΌ N0: 18 или 8ЕС) ΙΌ N0: 20; или (c) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, которая в жестких условиях гибридизуется с 8ЕС) ΙΌ N0: 1, 8ЕС) ΙΌ N0: 3, 8ЕС) ΙΌ N0: 5, 8ЕС) ΙΌ N0: 7, 8ЕС) ΙΌ N0: 9, 8ЕС) ΙΌ N0: 11, 8ЕС) ΙΌ N0: 13, 8Е0 ΙΌ N0: 15, 8Е0 ΙΌ N0: 17 или 8Е0 ΙΌ N0: 19, и длина нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более остатков, или полную длину гена или транскрипта, и жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин; или (к) последовательность нуклеиновой кислоты по пп.(а), (Ь) или (с), но лишенную своей гомологичной секреторной сигнальной последовательности; или (е) последовательность нуклеиновой кислоты по пп.(а), (Ь), (с) или (к), дополнительно содержащую гетерологичную секреторную сигнальную последовательность; или (й) последовательность нуклеиновой кислоты по пп.(а), (Ь), (с), (к) или (е), дополнительно содержащую направляющую последовательность, №концевой идентификационный пептид, транспортный пептид или последовательность, придающую желаемое свойство; или (д) последовательность нуклеиновой кислоты по пп.(а), (Ь), (с), (к), (е) или (й), дополнительно содержащую гетерологичную последовательность; или (к) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарную последовательности по пп.(а), (Ь), (с), (к), (е), (й) или (д), где активность эстеразы необязательно включает ферментативную модификацию молекулы хлорофилла, ферментативный катаболизм молекулы хлорофилла; активность хлорофиллазы, активность ск1аке или активность хлорофилл-хлорофиллидо-гидролазы;
    где активность полипептида необязательно является термостабильной или термоустойчивой и необязательно полипептид сохраняет ферментативную активность в условиях, включающих диапазон температур приблизительно от 37 до приблизительно 95°С, или приблизительно от 55 до приблизительно 85°С, или приблизительно от 70 до приблизительно 75°С, или приблизительно от 70 до приблизительно 95°С, или приблизительно от 90 до приблизительно 95°С;
    где активность полипептида необязательно является термоустойчивой и полипептид необязательно сохраняет ферментативную активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 37 до приблизительно 95°С, от более чем 55 до приблизительно 85°С, или приблизительно от 70 до приблизительно 75°С, или от более чем 90 до приблизительно 95°С.
  2. 2. Зонд нуклеиновой кислоты для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы или вовлеченный в катаболизм молекулы хлорофилла, где зонд содержит:
    (a) нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более последовательно расположенных остатков последовательности нуклеиновой кислоты по п.1, или (b) по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности, содержащей 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8Е0 ΙΌ N0: 7, 8ЕС) ΙΌ N0: 9, 8ЕС) ΙΌ N0: 11, 8ЕС) ΙΌ N0: 13, 8ЕС) ΙΌ N0: 15, 8ЕС) ΙΌ N0: 17 или 8ЕС) ΙΌ N0: 19, и необязательно зонд содержит олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80, приблизительно от 60 до 100 или приблизительно от 50 до 150 последовательно расположенных оснований.
  3. 3. Пара праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы или вовлеченный в катаболизм молекулы хлорофилла, где пара праймеров для амплификации:
    (а) способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по п.1, и необязательно член пары праймеров для амплификации содержит олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности
    - 93 013993 или приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более последовательно расположенных оснований последовательности, или (Ь) содержит первый член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более остатков 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕО Ш ΝΟ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 13; 8ЕО Ш ΝΟ: 15, 8Е0 Ш ΝΟ: 17 или 8Е0 Ш ΝΟ: 19, и второй член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более остатков, комплементарных цепи первого члена.
  4. 4. Нуклеиновая кислота, полученная амплификацией полинуклеотида с использованием пары праймеров для амплификации по п.3, где необязательно амплификацию осуществляют посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), или необязательно нуклеиновую кислоту получают посредством амплификации библиотеки генов, или необязательно библиотека генов представляет собой библиотеку окружающей среды.
  5. 5. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.4, где полипептид обладает активностью хлорофиллазы или вовлечен в катаболизм молекулы хлорофилла.
  6. 6. Антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную последовательности по п.1 или способную гибридизоваться с ними в жестких условиях, и необязательно длина антисмыслового олигонуклеотида составляет приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80, приблизительно от 60 до 100 или приблизительно от 75 до 125 или более оснований.
  7. 7. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид (ί) имеющий:
    (a) по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полную) идентичность с последовательностями 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75 или 100, или более остатков или на протяжении полной длины 8ЕО Ш ΝΟ: 2, 8ЕО Ш ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16 или 8ЕО Ш ΝΟ: 18, или (b) по меньшей мере 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полную) идентичность с последовательностями 8ЕО Ш ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75 или 100, или более остатков или на протяжении полной длины 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, или (c) по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полную) идентичность с последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 10,
    15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75 или 100 или более остатков или на протяжении полной длины 8ЕО Ш ΝΟ: 4, или (б) по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полную) идентичность с последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75 или 100, или более остатков или на протяжении полной длины 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, или (е) по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полную) идентичность с последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75 или 100 или более остатков или на протяжении полной длины 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, и необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным наблюдением, и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВЬА8Т версии 2.2.2, где установлены параметры фильтрования Ь1ак!а11 -р Ь1ак!р -б пг ра!аа -Р Р, и все другие параметры установлены по умолчанию;
    где идентичность последовательностей существует на протяжении участка по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более остатков или на протяжении полной длины гена или транскрипта;
    и полипептид обладает активностью эстеразы или содержит иммуногенный фрагмент, способный вызывать гуморальный антительный или клеточный иммунный ответ, характерный для 8ЕО Ш ΝΟ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:
    16, 8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 18 или 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 20, или (ίί) кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, или (ΐϊϊ) полипептид по пп.(1) и (ίί) и содержащий, по меньшей мере, консервативную замену аминокислотного остатка, где необязательно консервативная замена включает замену алифатической аминокисло
    - 94 013993 ты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком, или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком, или их комбинацию, и необязательно алифатический остаток включает аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент, и необязательно кислый остаток включает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент, и необязательно остаток, содержащий амидную группу, включает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент, и необязательно основный остаток включает лизин, аргинин или их синтетический эквивалент, и необязательно ароматический остаток включает фенилаланин, тирозин или их синтетический эквивалент, и полипептид сохраняет свою активность эстеразы или иммуногенную активность; или (ίν) полипептид по пп.(1), (ίί) или (ίίί), но лишенный своей гомологичной секреторной сигнальной последовательности; или (ν) полипептид по пп.(1), (ίί), (ίίί) или (ίν), дополнительно содержащий гетерологичную секреторную сигнальную последовательность (лидерную последовательность) или последовательность пробелка; или (νί) полипептид по пп.(1), (ίί), (ίίί), (ίν) или (ν), дополнительно содержащий направляющую последовательность, последовательность Ν-концевого идентификационного пептида или пептида для стабильности или очистки; или (νίί) полипептид по пп.(1), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν) или (νί), дополнительно содержащий гетерологичную последовательность, где необязательно активность эстеразы включает ферментативную модификацию молекулы хлорофилла, ферментативный катаболизм молекулы хлорофилла, активность хлорофиллазы, активность с11аке или активность хлорофилл-хлорофиллидо-гидролазы;
    где необязательно активность полипептида является термостабильной и необязательно полипептид сохраняет ферментативную активность в условиях, включающих диапазон температур приблизительно от 37 до приблизительно 95°С, приблизительно от 55 до приблизительно 85°С, приблизительно от 70 до приблизительно 95°С, приблизительно от 70 до приблизительно 75°С или приблизительно от 90 до приблизительно 95°С;
    где необязательно активность полипептида является термоустойчивой, и необязательно полипептид сохраняет ферментативную активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 37 до приблизительно 95°С, от более чем 55 до приблизительно 85°С, или приблизительно от 70 до приблизительно 75°С, или от более чем 90 до приблизительно 95°С или более, и необязательно термоустойчивость включает сохранение, по меньшей мере, половины специфичной активности фермента при 37°С после нагревания до повышенной температуры, и необязательно термоустойчивость включает сохранение специфичной активности в диапазоне приблизительно от 500 до приблизительно 1200 ед./мг белка при 37°С после нагревания до повышенной температуры, где необязательно полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, и необязательно гликозилирование представляет собой Ν-гликозилирование, и необязательно полипептид гликозилирован после экспрессии в Р. рак!опк или 8. ротЬе, и необязательно полипептид сохраняет ферментативную активность в условиях, включающих приблизительно рН 6,8; 6,5; 6,0; 5,5; 5,0; 4,5 или 4,0 или менее (более кислый), или приблизительно рН от 6,8 до 3,0, и необязательно полипептид сохраняет ферментативную активность в условиях, включающих приблизительно рН 7,5; 8,0; 8,5; 9; 9,5; 10; 10,5 и 11 или более щелочной, или приблизительно рН от 7,5 до 11,0.
  8. 8. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид, содержащий полипептид по п.7 и (a) лишенный сигнальной последовательности или препропоследовательности; или (b) имеющий гетерологичную сигнальную последовательность или гетерологичную препропоследовательность.
  9. 9. Гетеродимер, содержащий полипептид по п.7 и второй домен или гомодимер, содержащий полипептид по п.7 или препарат белка, содержащий полипептид по п.7, где препарат белка включает жидкость, твердое вещество или гель или гомодимер, содержащий полипептид по п.7, где необязательно второй домен представляет собой полипептид, и гетеродимер представляет собой слитый белок и необязательно второй домен представляет собой эпитоп, иммуноген или таг.
  10. 10. Иммобилизованный полипептид, где полипептид содержит последовательность по п.7, или гетеродимер, или гомодимер по п.9, где необязательно полипептид иммобилизован на матрице, клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, бусах, геле, планшете, матрице или капиллярной трубке, и необязательно матрица дополнительно содержит иммобилизованную нуклеиновую кислоту по п.1.
  11. 11. Выделенные синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфично связываются с полипептидом по п.7, где необязательно антитела представляют собой моноклональные антитела.
    - 95 013993
  12. 12. Гибридома, содержащая антитела, которые специфично связываются с полипептидом по п.7.
  13. 13. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий стадии:
    (a) получения нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по п.1; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) в условиях, которые делают возможной экспрессию полипептида, получая, таким образом, рекомбинантный полипептид, и необязательно способ дополнительно включает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), получая, таким образом, рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке.
  14. 14. Компьютерный считываемый носитель информации с сохраненной на нем последовательностью полипептида или последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность полипептида содержит полипептид по п.7; где полипептид кодируется нуклеиновой кислотой по п.1.
  15. 15. Выделенная синтетическая или рекомбинантная сигнальная последовательность, состоящая из последовательности, как указано, с остатками 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43 или 144 из (a) 8 ЕС) ΙΌ КО: 2, 8ЕС) 10 КО: 4, 8ЕС) 10 КО: 6, 8ЕС) 10 КО: 8, 8ЕС) 10 КО: 10, 8ЕС) 10 КО: 12, 8ЕС) 10 КО: 14, 8ЕС) 10 КО: 16, 8ЕС) 10 КО: 18 или 8ЕС) 10 КО: 20; или (b) подпоследовательности по п.7.
  16. 16. Химерный полипептид, содержащий, по меньшей мере, первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), имеющий последовательность по п.15, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид искусственно ассоциирован с сигнальным пептидом (8Р), где необязательно гетерологичный полипептид или пептид не является эстеразой или хлорофиллазой или не вовлечен в ферментативную модификацию молекулы хлорофилла, и необязательно гетерологичный полипептид или пептид является К-концевым, С-концевым или находится на обоих концах сигнального пептида (8Р) или каталитического домена (СБ).
  17. 17. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая химерный полипептид, где химерный полипептид содержит, по меньшей мере, первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), имеющий последовательность по п.15, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид искусственно ассоциирован с 8Р.
  18. 18. Способ ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающий следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла;
    (b) получение по меньшей мере одного полипептида с активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофилла; и (c) проведение реакции композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, где полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1 или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит пищевой продукт, масло или корм, или композицию, полученную из растения, животного или водорослей, или их смесь, и необязательно пептид является иммобилизованным, и необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или на органической подложке, и подложка необязательно содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Боиех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или органической подложке и подложка необязательно содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Боиех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно неорганическая подложка или органическая подложка содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Боиех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквивалент, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в реакционном сосуде, и необязательно реакционный сосуд содержит устройство для гравитационного удаления камедей или накопительную емкость, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в клеточном экстракте, или необязательно одну стадию осуществляют в цельной клетке, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит растительный материал, растительное масло или экстракт из растений, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений содержит растительное масло или масло из семян, и необязательно растительное масло включает пальмовое масло или масло канолы, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений содержат препарат из водорослей, и необязательно способ дополнительно включает использование липоксигеназы, и необязательно активность хлорофиллазы заключается в катализе расщепления тетрапиррольного
    - 96 013993 полициклического кольца и расщеплении кислородом полициклического кольца, и необязательно способ дополнительно включает удаление хлорофиллида, образующегося при ферментативной деградации хлорофилла посредством адсорбирования на силикагель или эквивалент, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит ткань или волокно, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит древесный или бумажный продукт или субпродукт, или необязательно древесный или бумажный продукт или субпродукт включают древесное волокно или бумажную волокнистую массу, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит недревесный бумажный продукт или субпродукт, или необязательно недревесный или бумажный продукт включает рисовую бумагу, и необязательно способ дополнительно включает стадию нейтрализации щелочью, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  19. 19. Промышленный способ ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающий следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла;
    (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофилла; и (c) проведение реакции композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, где полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит пищевой продукт, масло или корм, или композицию, полученную из растения, животного или водорослей, или их смесь, и необязательно пептид является иммобилизованным, и необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или на органической подложке, и подложка необязательно содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Όο\\όχ-Ε стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или органической подложке, и подложка необязательно включает диоксид алюминия, целит, хлорид Όο\\όχ-Ε стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно неорганическая подложка или органическая подложка включает диоксид алюминия, целит, хлорид Όο\\όχ-Ε стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквивалент, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в реакционном сосуде, и необязательно реакционный сосуд содержит устройство для гравитационного удаления камедей, или накопительную емкость, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в клеточном экстракте, или необязательно одну стадию осуществляют в цельной клетке, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит растительный материал, растительное масло или экстракт из растений, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений содержат растительное масло или масло из семян, и необязательно растительное масло включает пальмовое масло или масло канолы, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений содержат препарат из водорослей, и необязательно способ дополнительно включает использование липоксигеназы, и необязательно активность хлорофиллазы заключается в катализе расщепления тетрапиррольного полициклического кольца и расщепления кислородом полициклического кольца, и необязательно способ дополнительно включает удаление хлорофиллида, образующегося при ферментативной деградации хлорофилла, посредством адсорбирования на силикагель или эквивалент, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит ткань или волокно, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит древесный или бумажный продукт или субпродукт, или необязательно древесный или бумажный продукт или субпродукт включают древесное волокно или бумажную волокнистую массу, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит недревесный бумажный продукт или субпродукт, или необязательно недревесный или бумажный продукт включает рисовую бумагу, и необязательно способ дополнительно включает стадию нейтрализации щелочью, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсор
    - 97 013993 бента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  20. 20. Способ рафинирования, включающий стадию ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающий следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла;
    (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофилла; и (c) проведение реакции композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, где полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, или необязательно полипептид представляет собой фермент или каталитическое антитело, и необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или на органической подложке, и подложка необязательно содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Эо^ех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или органической подложке, и подложка необязательно содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Эо^ех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно неорганическая подложка или органическая подложка содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Эо^ех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквивалент, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в реакционном сосуде и необязательно реакционный сосуд содержит устройство для гравитационного удаления камедей или накопительную емкость, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в клеточном экстракте, или необязательно одну стадию осуществляют в цельной клетке, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит растительный материал, растительное масло или экстракт из растений, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений содержит растительное масло или масло из семян, и необязательно растительное масло включает пальмовое масло или масло канолы, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений содержат препарат из водорослей, и необязательно способ дополнительно включает использование липоксигеназы, и необязательно активность хлорофиллазы заключается в катализе расщепления тетрапиррольного полициклического кольца и расщепления кислородом полициклического кольца, и необязательно способ дополнительно включает удаление хлорофиллида, образующегося при ферментативной деградации хлорофилла, посредством адсорбирования на силикагель или эквивалент, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит ткань или волокно, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит древесный или бумажный продукт или субпродукт, или необязательно древесный или бумажный продукт или субпродукт включают древесное волокно или бумажную волокнистую массу, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит недревесный бумажный продукт или субпродукт, или необязательно недревесный или бумажный продукт включает рисовую бумагу, и необязательно способ дополнительно включает стадию нейтрализации щелочью, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С, и необязательно растительное масло представляет собой неочищенное масло или очищенное масло, и необязательно растительное масло представляет собой препарат неразбавленного неочищенного масла.
  21. 21. Промышленное изделие, содержащее систему рафинирования для ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающую:
    (a) устройство для очистки растительного масла и (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофиллазы, где активность заключается в
    - 98 013993 катализе реакции модификации хлорофилла и где устройство для очистки растительного масла может осуществлять реакцию композиции, содержащей хлорофилл или с примесью хлорофилла, с полипептидом в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, и полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, и необязательно устройство для очистки растительного масла содержит експеллер для выхода масла, накопительную емкость или устройство для гравитационного удаления камедей, и необязательно реакция модификации хлорофилла включает образование хлорофиллида и фитола, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С, и необязательно хлорофиллаза включает хлорофиллазу, иммобилизованную на диоксиде кремния, и необязательно диоксид кремния включает силикагель или эквивалент, и необязательно диоксид кремния включает диоксид кремния ТгД8у1 8Шса или δΟΚβδΙΕ К™.
  22. 22. Детергент для ферментативной обработки волокон, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающий:
    (a) композицию детергента и (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении хлорофилла, где активность заключается в катализе реакции модификации хлорофилла, и полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, и необязательно реакция модификации хлорофилла включает образование хлорофиллида и фитола, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  23. 23. Способ ферментативной обработки волокон, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающий:
    (a) получение композиции детергента, содержащей по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофилла, где активность заключается в катализе реакции модификации хлорофилла, и (b) контактирование композиции детергента с волокном, содержащим хлорофилл или с примесью хлорофилла, в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, и полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, и необязательно реакция модификации хлорофилла включает образование хлорофиллида и фитола, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  24. 24. Способ ферментативной обработки композиций, содержащих феофитин или с примесью феофитина, включающий следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей феофитин или с примесью феофитина;
    (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или каталитической ферментативной активностью в отношении хлорофилла; и (c) проведение реакции композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации феофитина, и необязательно реакция модификации хлорофилла включает образование хлорофиллида и фитола, и полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсор
    - 99 013993 бента или со сниженным количеством адсорбента для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  25. 25. Промышленный способ ферментативной обработки композиций, содержащих феофитин или с примесью феофитина, включающий следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей феофитин или с примесью феофитина;
    (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофилла; и (c) проведение реакции композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации феофитина, и полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, и необязательно способ дополнительно включает гидролиз эстеразой сложноэфирной связи хлорофилла с метильной группой, и необязательно способ дополнительно включает гидролиз эстеразой сложноэфирной связи феофитина с метильной группой, и необязательно способ дополнительно включает удаление модифицированного хлорофилла водной экстракцией, и необязательно способ дополнительно включает модификацию рН для обеспечения водного удаления хлорофиллида, и необязательно способ дополнительно включает удаление модифицированного феофитина водной экстракцией, и необязательно способ дополнительно включает модификацию рН для обеспечения водного удаления феофитина, и необязательно способ дополнительно включает стадию нейтрализации щелочью, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  26. 26. Способ ферментативной обработки композиций, содержащих хлорофилл или с примесью хлорофилла, включающий следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей хлорофилл или в примесью хлорофилла;
    (b) получение иммобилизованной на диоксиде кремния хлорофиллазы или фермента, участвующего в катаболизме хлорофилла; и (c) проведение реакции композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, и диоксид кремния может адсорбировать модифицированный хлорофилл, и полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, и необязательно диоксид кремния включает силикагель или эквивалент, и необязательно диоксид кремния включает диоксид кремния Тп8у1 8Шса или 80КБ8I^ К™.
  27. 27. Растительное масло, полученное способом, включающим следующие стадии:
    (a) получение композиции, содержащей хлорофилл или в примесью хлорофилла;
    (b) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего активностью хлорофиллазы или ферментативной активностью в отношении катаболизма хлорофилла; и (c) осуществление взаимодействия композиции стадии (а) с полипептидом стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать реакцию модификации хлорофилла, где полипептид имеет последовательность по п.7 или кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит пищевой продукт, масло или корм, или композицию, полученную из растения, животного или водорослей, или их смеси, и необязательно пептид является иммобилизованным, и необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или на органической подложке, и подложка необязательно включает диоксид алюминия, целит, хлорид Потех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно полипептид иммобилизован на неорганической подложке или органической подложке, и подложка необязательно содержит диоксид алюминия, целит, хлорид Эо^ех-1, стеклянные бусы, силикагель, альги
    - 100 013993 натный гидрогель или альгинатные бусы или эквиваленты, или необязательно неорганическая подложка или органическая подложка содержит диоксид алюминия, целит, хлорид По^ех-1, стеклянные бусы, силикагель, альгинатный гидрогель или альгинатные бусы или эквивалент, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в реакционном сосуде, и необязательно реакционный сосуд содержит устройство для гравитационного удаления камедей или накопительную емкость, и необязательно по меньшей мере одну стадию проводят в клеточном экстракте, или необязательно одну стадию осуществляют в цельной клетке, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит растительный материал, растительное масло или экстракт из растений, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений включают растительное масло или масло из семян, и необязательно растительное масло включает пальмовое масло или масло канолы, и необязательно растительный материал, растительное масло или экстракт из растений включают препарат из водорослей, и необязательно способ дополнительно включает использование липоксигеназы, и необязательно активность хлорофиллазы заключается в катализе расщепления тетрапиррольного полициклического кольца и расщепления кислородом полициклического кольца, и необязательно способ дополнительно включает удаление хлорофиллида, образующегося при ферментативной деградации хлорофилла, посредством адсорбирования на силикагель или эквивалент, и необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит ткань или волокно, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит древесный или бумажный продукт или субпродукт, или необязательно древесный или бумажный продукт или субпродукт включают древесное волокно или бумажную волокнистую массу, или необязательно композиция, содержащая хлорофилл или с примесью хлорофилла, содержит недревесный бумажный продукт или субпродукт, или необязательно недревесный или бумажный продукт включает рисовую бумагу, и необязательно способ дополнительно включает добавление фосфолипазы, и необязательно фосфолипаза представляет собой фосфолипазу С.
  28. 28. Продукт по п.27, где способ дополнительно включает водное удаление хлорофиллида с последующей дезодорацией для получения очищенного, осветленного и дезодорированного (КВЭ) растительного масла, и необязательно водное удаление хлорофиллида включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента, для удаления хлорофиллида, образованного при ферментативной деградации хлорофилла, и необязательно способ дополнительно включает стадию очистки с диоксидом кремния без адсорбента или со сниженным количеством адсорбента для удаления феофорбида, образованного при ферментативной деградации феофитина, и необязательно способ дополнительно включает стадию нейтрализации щелочью.
  29. 29. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеиновую кислоту с последовательностью ЗЕО ГО N0: 1, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 11, ЗЕО ГО N0: 13, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 17 или ЗЕО ГО N0: 19, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид с активностью эстеразы или его фрагмент с активностью эстеразы.
  30. 30. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид, содержащий последовательность ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 4, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 14, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 18 или ЗЕО ГО N0: 20, где полипептид обладает активностью эстеразы или его фрагмент обладает активностью эстеразы.
EA200700032A 2004-06-16 2005-06-14 Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы EA013993B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58044704P 2004-06-16 2004-06-16
PCT/US2005/020866 WO2006009676A2 (en) 2004-06-16 2005-06-14 Compositions and methods for enzymatic decolorization of chlorophyll

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700032A1 EA200700032A1 (ru) 2008-08-29
EA013993B1 true EA013993B1 (ru) 2010-08-30

Family

ID=35785649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700032A EA013993B1 (ru) 2004-06-16 2005-06-14 Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP2468853B1 (ru)
JP (1) JP2008505619A (ru)
CN (2) CN101432292B (ru)
AU (1) AU2005264938B2 (ru)
BR (1) BRPI0510939A (ru)
CA (1) CA2570872A1 (ru)
EA (1) EA013993B1 (ru)
ES (2) ES2461857T3 (ru)
PL (1) PL2468853T3 (ru)
WO (1) WO2006009676A2 (ru)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3299465A1 (en) 2003-03-07 2018-03-28 DSM IP Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20080070291A1 (en) 2004-06-16 2008-03-20 David Lam Compositions and Methods for Enzymatic Decolorization of Chlorophyll
US8557551B2 (en) 2004-09-10 2013-10-15 Dsm Ip Assets B.V. Compositions and methods for making and modifying oils
NZ584460A (en) 2007-09-12 2012-10-26 Martek Biosciences Corp Biological oil produced by a microorganism of the kingdom Stramenopil by heterotropic fermentation
DE102008024084A1 (de) * 2008-05-17 2009-11-19 Clariant International Ltd. Wasch- und Reinigungsmittel
EP2373803A4 (en) * 2008-12-08 2013-05-29 Sapphire Energy Inc REMOVAL OF NITROGEN FROM CHLOROPHYLL OR PHEOPHYTIC BIOMASS
AU2009333021B2 (en) * 2008-12-31 2015-09-10 Sapphire Energy, Inc. Genetically engineered herbicide resistant algae
AR077042A1 (es) 2009-06-12 2011-07-27 Danisco Metodo para tratar una composicion que contiene pirofiofitina
US20110195449A1 (en) 2009-12-28 2011-08-11 Martek Biosciences Corporation Recombinant Thraustochytrids that Grow on Sucrose, and Compositions, Methods of Making, and Uses Thereof
MX2012010399A (es) 2010-03-12 2012-10-05 Dupont Nutrition Biosci Aps Proceso.
AR081950A1 (es) * 2010-06-17 2012-10-31 Danisco Proceso de tratamiento de semillas que contienen aceite
ES2649912T3 (es) * 2011-02-23 2018-01-16 Dupont Nutrition Biosciences Aps Tratamiento enzimático de la clorofila en los aceites vegetales
AR085251A1 (es) 2011-02-23 2013-09-18 Danisco Proceso para tratar aceite vegetal
CA2825628A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-30 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method
WO2013104660A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating a plant oil comprising hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative and involving partial caustic neutralisation
WO2013104659A2 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process
WO2013160374A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for refining crude plant oil involving enzymatic hydrolysis and gum recycling
WO2013160372A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating plant oil involving addition of serial doses of chlorophyll or chlorophyll derivative degrading enzyme
WO2014086928A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-12 Novozymes A/S Polypeptides having chlorophyllase activity and polynucleotides encoding same
US9677028B2 (en) * 2015-08-10 2017-06-13 R.J. Reynolds Tobacco Company Seed oil refinement
CN105670770A (zh) * 2016-01-28 2016-06-15 广西大学 一种处理含油种子叶绿素的方法
CN106590924A (zh) * 2016-12-30 2017-04-26 晨光生物科技集团股份有限公司 一种葡萄籽油的脱色工艺
US20210065844A1 (en) * 2017-09-05 2021-03-04 Adaptive Phage Therapeutics, Inc. Methods to determine the sensitivity profile of a bacterial strain to a therapeutic composition
CN113210264B (zh) * 2021-05-19 2023-09-05 江苏鑫源烟草薄片有限公司 烟草杂物剔除方法及装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1602393A3 (ru) * 1986-10-01 1990-10-23 Берингер Ингельгейм Интернациональ Гмбх (Фирма) Способ получени гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерферону типа омега
RU2225034C2 (ru) * 1999-07-05 2004-02-27 Мицубиси Денки Кабусики Кайся Способ и устройство, компьютерная программа, компьютерная система и считываемая компьютером память для представления и поиска объекта в изображении

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE417441B (sv) 1977-08-19 1981-03-16 Kare Larsson Forfarande for att isolera polera lipider ur en blandning av polera och opolera cerealiclipider genom blandning med vatten och derpa foljande tyngdkraftsseparation
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
JPS57156482A (en) 1981-03-20 1982-09-27 Koichi Ogawa Concentrating and purifying method of tocopherol
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CH0229046H1 (de) 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
US5030240A (en) * 1986-06-09 1991-07-09 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5288619A (en) 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
EP0528881A4 (en) 1990-04-24 1993-05-26 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
JPH06507782A (ja) 1990-06-15 1994-09-08 サイオス　ノバ　インコーポレイテッド アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
CA2096843C (en) 1990-11-23 2007-08-07 Kathleen D'halluin Process for transforming monocotyledonous plants
AU9166691A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JP2626380B2 (ja) 1991-11-12 1997-07-02 株式会社大林組 クレーン用吊治具の旋回防止装置
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
US5315021A (en) 1992-07-01 1994-05-24 The Procter & Gamble Company Process for removing chlorophyll color impurities from vegetable oils
WO1994012014A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
JPH06306386A (ja) 1993-04-25 1994-11-01 Showa Sangyo Co Ltd 油脂の精製方法
US5414100A (en) 1993-08-27 1995-05-09 Howard University Deacidification of vegetable oils
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
MX198456B (es) 1994-03-09 2000-09-05 Abbott Lab Animales trangenicos que producen oligosacaridos y glucoconjugados.
NZ279676A (en) 1994-03-09 1998-04-27 Abbott Lab Humanized milk produced by non-human transgenic mammal transformed with a heterologous gene coding for human enzyme producing human oligosaccharides and glycoconjugates
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
CA2198451A1 (en) 1994-09-01 1996-03-07 Gurparkash Singh Transgenic animal expressing a familial form of human amyloid precursor protein
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5633440A (en) 1994-12-20 1997-05-27 Dna Plant Technology Corporation P119 promoters and their uses
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
EP0831854A4 (en) 1995-06-06 2001-01-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGONUCLEOTIDS WITH PHOSPHOROTHIOATE BINDINGS OF HIGH CHIRAL PURITY
SK176397A3 (en) 1995-06-27 1998-07-08 Unilever Nv A method for immobilization of enzymes
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
SE504664C2 (sv) 1995-09-22 1997-03-24 Scotia Lipidteknik Ab Sätt att framställa fraktionerad olja, oljan, dess användning samt emulsionskomposition innehållande oljan
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
WO1997046313A1 (en) 1996-06-07 1997-12-11 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
JP2001504327A (ja) 1996-10-31 2001-04-03 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規ホスホリパーゼ、その生産及び使用
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DK1717322T3 (da) 1997-01-17 2012-10-22 Codexis Mayflower Holdings Llc Udvikling af hele celler og organismer ved rekursiv sekvensrekombination
WO1998041622A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S Method for constructing a library using dna shuffling
ATE399880T1 (de) 1997-03-18 2008-07-15 Novozymes As Ein in-vitro-verfahren zur herstellung einer dna- bibliothek
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US7019827B2 (en) 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
AU8908198A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
CN1249418C (zh) 1997-09-11 2006-04-05 生物风险公司 一种生产目标物质的高密度阵列的方法及高密度阵列
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
AU1449499A (en) 1997-10-31 1999-05-24 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
CA2251263A1 (en) 1997-11-14 1999-05-14 Hajime Karasuyama Transgenic animal allergy models and methods for their use
DK1036198T3 (da) 1997-12-08 2013-01-02 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
CN1152135C (zh) * 1997-12-23 2004-06-02 诺沃挪第克公司 酶的固定化方法
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999041369A2 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
EP1054973A1 (en) 1998-02-11 2000-11-29 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
CA2323638A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
JP4700805B2 (ja) 1998-06-29 2011-06-15 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 多様性の高いライブラリーを製造する方法
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US6376689B1 (en) 1999-09-02 2002-04-23 Cargill, Incorporated Removal of gum and chlorophyll-type compounds from vegetable oils
JP4357044B2 (ja) * 1999-09-20 2009-11-04 カゴメ株式会社 クロロフィラーゼをコードするｄｎａ及びそれにより形質転換された植物
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
EP1294869A2 (en) 2000-06-14 2003-03-26 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
WO2002029032A2 (en) 2000-09-30 2002-04-11 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
AU2001296577A1 (en) 2000-10-05 2002-04-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Chlorophyllases
MXPA02005717A (es) 2000-10-10 2003-10-14 Diversa Corp Analisis de alto rendimiento o a base de capilares para bioactividad o biomoleuclas.
EP1332153A4 (en) 2000-10-12 2006-01-11 Exelixis Inc HUMAN ECT2 AND METHOD OF USE THEREOF
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
CA2430559A1 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Diversa Corporation Method of making a protein polymer and uses of the polymer
AU2003243157C1 (en) * 2002-04-19 2008-09-04 Verenium Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BR0303436A (pt) * 2002-09-06 2004-09-08 Kao Corp Processo de regenaração de enzima imobilizada
EP3299465A1 (en) * 2003-03-07 2018-03-28 DSM IP Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP1869173A4 (en) * 2005-03-08 2010-04-07 Verenium Corp HYDROLASES, NUCLEIC ACIDS FOR THEIR CODING AND METHOD FOR INCREASING THE THICKNESS OF PAPER
AU2014284148B2 (en) 2013-06-21 2017-02-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic system with fluid pickups

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1602393A3 (ru) * 1986-10-01 1990-10-23 Берингер Ингельгейм Интернациональ Гмбх (Фирма) Способ получени гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерферону типа омега
RU2225034C2 (ru) * 1999-07-05 2004-02-27 Мицубиси Денки Кабусики Кайся Способ и устройство, компьютерная программа, компьютерная система и считываемая компьютером память для представления и поиска объекта в изображении

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAF87662, Henne A. et al.: Direct Submission. 11.01.2000, Naydeno v Internet:<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?tool=portal&db=protein&term=&que *
AAM34295, Kim H.E. et al.: Gene Cloning, Sequencing, and Expression of an Esterase from Acinetobacter Iwoffii 16C-1. Park K.R. et al. Direct Submission. 04.05.2002, Naydeno v Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?tool=portal&db=protein&term=&que *
Beatriz Gandul-Rojas et al.: Chlorophyllase Activity in Olive Fruits and its Relationship with the Loss of Chlorophyll Pigments in the Fruits and Oils. J. Sci Food Agric., 1996, 72, 291-294, referat *
Doson R. i dr. Spravochnik biokhimika.-M.: Mir, 1991, s. 190-194 *
Glik B. i dr. Molekulyarnaya biotekhnologiya. Printsipy i primenenie.-M.: Mir, 2002, s. 94-103 *
Gracheva I.M. i dr. Tekhnologiya fermentnykh preparatov.-Moskva: Elevar, 2000, s. 151-163 *
YP 074850, Hattori M. et al.: Direct Submission. 20.04.2004, Naydeno v Internet:<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?tool=portal&db=protein&term=&que *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2468853B1 (en) 2015-04-01
AU2005264938B2 (en) 2011-11-24
ES2461857T3 (es) 2014-05-21
JP2008505619A (ja) 2008-02-28
CN101432292A (zh) 2009-05-13
EA200700032A1 (ru) 2008-08-29
BRPI0510939A (pt) 2007-07-17
ES2540728T3 (es) 2015-07-13
CA2570872A1 (en) 2006-01-26
WO2006009676A3 (en) 2009-04-16
EP1791853A2 (en) 2007-06-06
WO2006009676A2 (en) 2006-01-26
CN101432292B (zh) 2013-03-13
EP1791853B1 (en) 2014-02-26
EP2468853A1 (en) 2012-06-27
PL2468853T3 (pl) 2015-08-31
EP1791853A4 (en) 2009-10-21
CN103173282A (zh) 2013-06-26
AU2005264938A1 (en) 2006-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013993B1 (ru) Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы
EA015591B1 (ru) Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
EA022979B1 (ru) Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их производства и применения
EA018577B1 (ru) Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
EA010903B1 (ru) Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
EA029538B1 (ru) Полипептид, обладающий активностью альдолазы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способы получения и применения полинуклеотида и полипептида
Mølhøj et al. Towards understanding the role of membrane-bound endo-β-1, 4-glucanases in cellulose biosynthesis
UA111708C2 (uk) Спосіб рафінування олії
CA2999335C (en) Lowering saturated fatty acid content of plant seeds
EA021178B1 (ru) Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
Li et al. A purple acid phosphatase, GmPAP33, participates in arbuscule degeneration during arbuscular mycorrhizal symbiosis in soybean
CN104651381A (zh) 转移酶和氧化还原酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
Hu et al. AKR2A participates in the regulation of cotton fibre development by modulating biosynthesis of very‐long‐chain fatty acids
AU730471B2 (en) Phosphate starvation-inducible proteins
JP7270550B2 (ja) 炭水化物産生植物材料
WO2008108116A1 (ja) セルラーゼ酵素及びその製法
US20210317467A1 (en) Improved method for the production of high levels of pufa in plants
US20170145433A1 (en) Lowering saturated fatty acid content of plant seeds
Sedivy-Haley et al. Molecular characterization of organellar rhomboid proteins in Arabidopsis
WO2023151004A1 (en) Methods and compositions for increasing protein and oil content and/or modifying oil profile in plant
CN112996915A (zh) 用于在植物中产生高水平pufa的改进方法
Robinson Feeding hungry plants: the secreted purple acid phosphatase isozymes atpap12 and atpap26 play a pivotal role in extracellular phosphate scavenging in arabidopsis thaliana
Dewald Enzymatic activity, localization, and gene expression of the soybean vegetative storage proteins, VSP-alpha and VSP-beta
CN1189856A (zh) 子房组织转录因子的用途
Veljanovski Phosphate-starvation Inducible Vacuolar Purple Acid Phosphatase from Arabidopsis Thaliana Suspension Cell Cultures

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU