ES2540728T3 - Método para la decoloración enzimática de feofitina - Google Patents

Abstract

Uso de al menos un polipéptido según un polipéptido de SEC ID NO:22, o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO:21, que tiene una actividad de clorofilasa, en un tratamiento enzimático que es una decoloración de una composición que contiene feofitina en condiciones en las que el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de la feofitina para generar una feoforbida y un fitol; y la feoforbida y el fitol se separan.

Description

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segundo miembro que tiene una secuencia como se expone en alrededor de los primeros (los 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más restos de la hebra complementaria del primer miembro.

La descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican proteínas (por ejemplo, enzimas), incluyendo los polipéptidos de la descripción, generadas mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando un par de cebadores de amplificación de la descripción. La descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen al menos una actividad enzimática como se describe aquí (por ejemplo, actividad enzimática de esterasa, incluyendo una actividad de clorofilasa (una clasa)) usando un par de cebadores de amplificación de la descripción. La descripción proporciona métodos para obtener y/o identificar enzimas mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando un par de cebadores de amplificación de la descripción. En un aspecto, el par de cebadores de amplificación amplifica un ácido nucleico de una biblioteca, por ejemplo una biblioteca génica, tal como una biblioteca medioambiental.

La decripción proporciona métodos para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática, que comprenden la amplificación de un ácido nucleico molde con un par de secuencias cebadoras de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácido nucleico de la decripción, o sus fragmentos o subsecuencias.

La descripción proporciona casetes de expresión que comprenden un ácido nucleico de la descripción o una subsecuencia del mismo. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender el ácido nucleico que está enlazado operablemente a un promotor. El promotor puede ser un promotor vírico, bacteriano, de mamífero o vegetal. En un aspecto, el promotor vegetal puede ser un promotor de patata, de arroz, de maíz, de trigo, de tabaco

o de cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tejido, o un promotor regulado medioambientalmente o un promotor regulado mediante el desarrollo. De este modo, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico de semillas, un promotor específico de hojas, un promotor específico de raíces, un promotor específico de tallos o un promotor inducido por abscisión. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender además un vector de expresión vegetal o de virus vegetal.

La descripción proporciona vehículos de clonación que comprenden un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la descripción o un ácido nucleico de la descripción. El vehículo de clonación puede ser un vector vírico, un plásmido, un fago, un fagómido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial. El vector vírico puede comprender un vector adenovírico, un vector retrovírico o un vector vírico adenoasociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plásmido, un vector derivado del bacteriófago P1 (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o un cromosoma artificial de mamífero (MAC).

La descripción proporciona célula transformada que comprende un ácido nucleico de la descripción o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la descripción, o un vehículo de clonación de la descripción. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal. En un aspecto, la célula vegetal puede ser una célula de cereal, de patata, de trigo, de arroz, de maíz, de tabaco o de cebada.

La descripción proporciona animales transgénicos no humanos que comprenden un ácido nucleico de la descripción

o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la descripción. En un aspecto, el animal es un ratón.

La descripción proporciona plantas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la descripción o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la descripción. La planta transgénica puede ser una planta de cereal, una planta de maíz, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de oleaginosa, una planta de colza, una planta de haba de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, o una planta de tabaco.

La descripción proporciona semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la descripción o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la descrición. La semilla transgénica puede ser una planta de cereal, una semilla de maíz, una semilla de trigo, una oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de haba de soja, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de sésamo, una semilla de cacahuete, o una semilla de planta de tabaco.

La descripción proporciona un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la descripción. La descripción proporciona métodos para inhibir la traducción de un mensaje enzimático (de una enzima de la descripción) en una célula, que comprenden administrar a la célula o expresar en la célula un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la descripción. En un aspecto, el oligonucleótido antisentido tiene una longitud entre alrededor de 10 y 50, alrededor de 20 y 60, alrededor de 30 y 70, alrededor de 40 y 80, o alrededor de 60 y 100 bases.

La descripción proporciona métodos para inhibir la traducción de un mensaje enzimático en una célula que comprenden administrar a la célula o expresar en la célula un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico

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de la descripción. La descripción proporciona moléculas de ARN inhibidor (ARNi) bicatenario que comprenden una subsecuencia de una secuencia de la descripción. En un aspecto, el ARNi tiene una longitud de alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex. La descripción proporciona métodos para inhibir la expresión de un polipéptido (por ejemplo, una enzima de la descripción) en una célula, que comprenden administrar a la célula o expresar en la célula un ARN inhibidor bicatenario (ARNi), en el que el ARN comprende una subsecuencia de una secuencia de la descripción.

La descripción proporciona un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o una identidad de secuencia completa (100%) con un polipéptido o péptido ejemplar de la descripción a lo largo de una región de al menos alrededor de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o más restos, o a lo largo de toda la longitud del polipéptido. En un aspecto, las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante una inspección visual. Las secuencias polipeptídicas o peptídicas ejemplares de la descripción incluyen SEC ID NO:2, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, SEC ID NO:18 o SEC ID NO:20, y sus subsecuencias y sus variantes. Los polipéptidos ejemplares también incluyen fragmentos de al menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 o más restos en longitud, o a lo largo de toda la longitud de una enzima. Las secuencias polipeptídicas o peptídicas ejemplares de la descripción incluyen secuencia codificada por un ácido nucleico de la descripción. Las secuencias polipeptídicas o peptídicas ejemplares de la descripción incluyen polipéptidos o péptidos específicamente unidos mediante un anticuerpo de la descripción. El péptido puede ser, por ejemplo, un fragmento inmunógeno, un motivo (por ejemplo, un sitio de unión), una secuencia señal, una secuencia prepro, un dominio catalítico (CDs) o un sitio activo.

En un aspecto, un polipéptido de la descripción tiene una actividad de esterasa, tal como una actividad de clorofilasa (una clasa), o tiene una actividad enzimática que comprende modificación enzimática de una molécula de clorofila, por ejemplo, en el que la modificación enzimática comprende el catabolismo de la molécula de clorofila. En un aspecto, la actividad de esterasa comprende una actividad de clorofila clorofilido-hidrolasa.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un polipéptido o péptido aislado, sintético o recombinante, que incluye al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 o más bases consecutivas de una secuencia polipeptídica o peptídica de la descripción, secuencias sustancialmente idénticas a ella, y las secuencias complementarias a ella. El péptido puede ser, por ejemplo, un fragmento inmunógeno, un motivo (por ejemplo, un sitio de unión), una secuencia señal, una secuencia prepro o un dominio catalítico (CDs) o un sitio activo.

La descripción proporciona sistemas biosintéticos que comprenden ácidos nucleicos y/o plásmidos de la descripción en una célula, por ejemplo una célula de levadura, una célula vegetal, una célula fúngica, o una célula microbiana (por ejemplo, bacteriana). En un aspecto, los sistemas biosintéticos de la descripción comprenden secuencias codificantes para todas las enzimas necesarias, o un subconjunto de las mismas, para el catabolismo de una molécula de clorofila. En un aspecto, las secuencias codificantes pueden estar en un plásmido, un vector recombinante o virus y similar.

En un aspecto, la actividad enzimática de un polipéptido de la descripción, es termoestable. El polipéptido de la descripción, puede retener actividad en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de entre alrededor de 1ºC y alrededor de 5ºC, entre alrededor de 5ºC y alrededor de 15ºC, entre alrededor de 15ºC y alrededor de 25ºC, o entre alrededor de 25ºC y alrededor de 37ºC, entre alrededor de 37ºC y alrededor de 95ºC, entre alrededor de 55ºC y alrededor de 85ºC, entre alrededor de 70ºC y alrededor de 75ºC, o entre alrededor de 90ºC y alrededor de 95ºC, o más. En otro aspecto, la actividad enzimática de un polipéptido de la descripción es termotolerante. El polipéptido puede retener actividad tras la exposición a una temperatura en el intervalo de más de 37ºC a alrededor de 95ºC, o en el intervalo de más de 55ºC a alrededor de 85ºC. En un aspecto, el polipéptido puede retener actividad tras la exposición a una temperatura en el intervalo de más de 90ºC a alrededor de 95ºC a pH 4,5.

En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante puede comprender el polipéptido de la descripción que carece de una secuencia señal. El polipéptido aislado, sintético o recombinante puede comprender el polipéptido de la descripción que comprende una secuencia señal heteróloga.

En un aspecto, la descripción proporciona proteínas quiméricas que comprenden un primer dominio que comprende una secuencia señal de la descripción y al menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima quimérica puede comprender toda o una subsecuencia de al menos un polipéptido que tiene actividad como se describe aquí (por ejemplo, actividad enzimática de esterasa, incluyendo actividad de clorofilasa (una clasa)).

La descripción proporciona polipéptidos quiméricos que comprenden al menos un primer dominio que comprende un péptido señal (SP), una secuencia prepro y/o un dominio catalítico (CD) de la descripción, y al menos un segundo

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dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en el que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado naturalmente con el péptido señal (SP), una secuencia prepro y/o un dominio catalítico (CD). En un aspecto, el polipéptido o péptido heterólogo no es un polipéptido que tiene actividad que comprende actividad enzimática de esterasa o actividad de catabolismo de la clorofila. El polipéptido o péptido heterólogo puede ser aminoterminal a, carboxiterminal a, o puede estar en ambos extremos del péptido señal (SP), secuencia prepro y/o dominio catalítico (CD).

La descripción proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que codifican un polipéptido quimérico, en el que el polipéptido quimérico comprende al menos un primer dominio que comprende un péptido señal (SP), un dominio prepro y/o un dominio catalítico (CD) de la descripción, y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en el que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado naturalmente con el péptido señal (SP), secuencia prepro y/o dominio catalítico (CD).

La descripción proporciona secuencias señal aisladas, sintéticas o recombinantes (por ejemplo, péptidos señal) que consisten en o que comprenden una secuencia como se expone en los restos 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 40; 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43 o 1 a 44, de un polipéptido de la descripción, por ejemplo, SEC ID NO:2, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, SEC ID NO:18 o SEC ID NO:20. La descripción proporciona secuencias señal aisladas, sintéticas o recombinantes (por ejemplo, péptidos señal) que consisten en o que comprenden una secuencia como se expone en la Tabla 1, más abajo.

En un aspecto, una enzima de la descripción tiene una actividad específica a alrededor de 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 1200 unidades por miligramo de proteína, o alrededor de 100 a alrededor de 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, una enzima de la descripción tiene una actividad específica de alrededor de 100 a alrededor de 1000 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 500 a alrededor de 750 unidades por miligramo de proteína. Como alternativa, una enzima de la descripción tiene una actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 750 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 500 a alrededor de 1200 unidades por miligramo de proteína. En un aspecto, una enzima de la descripción tiene una actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 500 unidades por miligramo de proteína,

o de alrededor de 750 a alrededor de 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, una enzima de la descripción tiene una actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 250 unidades por miligramo de proteína. Como alternativa, una enzima de la descripción tiene una actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 100 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la termotolerancia comprende retención de al menos la mitad de la actividad específica de la enzima a 37ºC después de calentarla hasta la temperatura elevada. Como alternativa, la termotolerancia puede comprender retención de la actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 1200 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 500 a alrededor de 1000 unidades por miligramo de proteína, después de calentarla hasta la temperatura elevada. En otro aspecto, la termotolerancia puede comprender retención de la actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 500 unidades por miligramo de proteína después de calentarla hasta la temperatura elevada.

La descripción proporciona un polipéptido aislado, sintético o recombinante de la descripción, en el que el polipéptido comprende al menos un sitio de glucosilación. En un aspecto, la glucosilación puede ser una glucosilación enlazada mediante N. En un aspecto, el polipéptido se puede glucosilar después de ser expresado en una P. pastoris o una S. pombe.

En un aspecto, un polipéptido de la presente descripción puede retener actividad enzimática en condiciones que comprenden alrededor de pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4 o más ácidas. En otro aspecto, un polipéptido de la descripción retiene actividad en condiciones que comprenden alrededor de pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11 o más básicas. En un aspecto, un polipéptido de la descripción retiene actividad enzimática en condiciones que comprenden alrededor de pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4 o más ácidas. En otro aspecto, un polipéptido de la descripción retiene actividad en condiciones que comprenden alrededor de pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11 o más básicas.

La descripción proporciona preparaciones proteicas que comprenden un polipéptido de la descripción, en las que la preparación proteica comprende un líquido, un sólido o un gel.

La descripción proporciona heterodímeros que comprenden un polipéptido de la descripción y una segunda proteína

o dominio. En un aspecto, el segundo miembro del heterodímero no es un polipéptido de la descripción, sino más bien es una enzima diferente u otra proteína. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido, y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una etiqueta. En un aspecto, la invención proporciona homodímeros que comprenden un polipéptido de la descripción.

La descripción proporciona polipéptidos inmovilizados de la descripción, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la descripción, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la descripción y un segundo dominio. En un aspecto, el polipéptido se puede inmovilizar en una célula, un metal, una resina, un polímero, un material

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que el ácido nucleico comprende una secuencia de la descripción. En un aspecto, el sistema comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican enzimas, en el que las enzimas están implicadas en el catabolismo de la clorofila. En un aspecto, la pluralidad de ácidos nucleicos que codifican enzimas comprende todas las enzimas en una ruta de catabolismo de la clorofila. En un aspecto, la pluralidad de ácidos nucleicos que codifican enzimas está contenida en al menos un plásmido, casete de expresión o vector de expresión.

En un aspecto, el sistema biosintético de la descripción está contenido en (comprende) una célula. La célula puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto,

o una célula vegetal. La célula de levadura puede ser una Pichia sp. o una Saccharomyces sp., tal como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe.

Los detalles de una o más realizaciones de la descripción se muestran en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos, y ventajas de la descripción resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una representación esquemática de clorofila (Figura 1A), fitol (Figura 1B) y clorofilida (Figura 1C).

La Figura 2 y la Figura 3 ilustran datos que muestran los resultados de un ensayo de actividad de esterasa (actividad de clorofilasa) usando enzimas ejemplares de la descripción, como se describe con detalle en el Ejemplo 1, más abajo.

La Figura 4 es un diagrama de bloques de un sistema de ordenador ejemplar de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un procedimiento de la descripción para comparar una nueva secuencia nucleotídica o proteica con una base de datos de secuencias a fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 6 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un procedimiento en un ordenador para determinar si dos secuencias son homólogas, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 7 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un procedimiento identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 8 ilustra la reacción de una esterasa ejemplar de la descripción en la degradación de la clorofila, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 9 ilustra y compara la reacción de decoloración (blanqueo) enzimática tradicional frente a la ejemplar de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 10 ilustra una reacción de decoloración (blanqueo) enzimática ejemplar de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 11 ilustra un procedimiento de decoloración (blanqueo) enzimática ejemplar de la descripción, que combina etapas de desgomado, blanqueo (“decoloración”) enzimático y neutralización cáustica, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 12 ilustra un procedimiento de decoloración (blanqueo) enzimática ejemplar de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 13 ilustra un esquema de refinado de oleaginosa ejemplar, que comprende la extracción, el refinado y la modificación de una oleaginosa usando una esterasa de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 14 ilustra un procedimiento industrial ejemplar de la descripción – un procedimiento de biodesgomado -, que comprende usar al menos un polipéptido de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 15 ilustra otro procedimiento industrial ejemplar de la descripción, que comprende usar al menos un polipéptido de la descripción, como se describe con detalle más abajo.

La Figura 16 ilustra otro procedimiento industrial ejemplar de la descripción, que comprende usar al menos un polipéptido de la descripción que tiene actividad de enzima clorofilasa.

Símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.

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los péptidos deseados. Además, hay disponibles varios sistemas de síntesis peptídica FMOC asequibles. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipéptido o fragmento se puede llevar a cabo sobre un soporte sólido utilizando un sintetizador peptídico automático Applied Biosystems, Inc. Modelo 431A. Tal equipo proporciona acceso fácil a los péptidos de la descripción, ya sea mediante síntesis directa o mediante síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar usando otras técnicas conocidas.

Una secuencia promotora está “enlazada operablemente a” una secuencia codificante cuando el ARN polimerasa que inicia la transcripción en el promotor transcribirá la secuencia codificante en ARNm.

“Plásmidos” se designan mediante una “p” en minúsculas, precedida y/o seguida de mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida aquí están comercialmente disponibles, están públicamente disponibles en una base no restringida, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles según procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a los descritos aquí son conocidos en la técnica y serán manifiestos para un experto normal.

“Digestión” de ADN hace referencia a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas aquí están comercialmente disponibles, y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como conocen los expertos normales. Con fines analíticos, típicamente se usa 1 g de plásmido o fragmento de ADN con alrededor de 2 unidades de enzima en alrededor de 20 l de disolución tampón. Con el fin de aislar fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digieren típicamente 5 a 50 g de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. Los tampones y las cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Normalmente se usan tiempos de incubación de alrededor de 1 hora a 37°C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la digestión, se puede llevar a cabo la electroforesis en gel para aislar el fragmento deseado

“Hibridación” se refiere al proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través de emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas, de manera que se puede identificar una secuencia particular de interés incluso en muestras en las que está presente a concentraciones bajas. Adecuadamente, las condiciones restrictivas se pueden definir, por ejemplo, mediante las concentraciones de sal o formamida en las disoluciones de prehibridación e hibridación, o mediante la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. En particular, la restricción se puede incrementar reduciendo la concentración de sal, incrementando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridación. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la descripción se definen por su capacidad para hibridarse en diversas condiciones de restricción (por ejemplo, elevada, media, y baja), como se expone aquí.

Por ejemplo, la hibridación en condiciones de restricción elevada se podría producir en alrededor de 50% de formamida a alrededor de 37ºC a 42ºC. La hibridación se podría producir en condiciones de restricción reducida en alrededor de 35% a 25% de formamida a alrededor de 30ºC a 35ºC. En particular, la hibridación se podría producir en condiciones de restricción elevada a 42ºC en 50% de formamida, 5X SSPE, 0,3% de SDS, y 200 n/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado. La hibridación se podría producir en condiciones de restricción reducida como se describe anteriormente, pero en 35% de formamida a una temperatura reducida de 35ºC. El intervalo de temperatura que corresponde a un nivel particular de restricción se puede estrechar adicionalmente calculando la relación de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura en consecuencia. Las variaciones en los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la técnica.

El término “variante” hace referencia a polinucleótidos o polipéptidos de la descripción modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones, o restos de aminoácidos (respectivamente), conservando aún la actividad biológica de una enzima de la descripción. Las variantes se pueden producir por cualquier número de medios, incluyendo métodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a error, transposición de fragmentos, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por inserción de un casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, GSSM, y cualquier combinación de los mismos.

La expresión “mutagénesis por saturación”, “mutagénesis por saturación de sitios génicos” o “GSSM” incluye un método que usa cebadores oligonucleotídicos degenerados para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, como se describe con detalle más abajo.

La expresión “sistema de evolución dirigida optimizada” o “evolución dirigida optimizada” incluye un método para reensamblar fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas, por ejemplo genes relacionados, y se explica con detalle, más abajo.

La expresión “reensamblaje por ligación sintética” o “SLR” incluye un método para ligar fragmentos oligonucleotídicos de una manera no estocástica, y se explica con detalle, más abajo.

Las expresiones “ácido nucleico” o “secuencia de ácido nucleico”, como se usan aquí, se refieren a un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o a un fragmento de cualquiera de estos, a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una hebra sentido o

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antisentido (complementaria), a ácido nucleico peptídico (PNA), o a cualquier material semejante a ADN o semejante a ARN, de origen natural o sintético. Las expresiones “ácido nucleico” o “secuencia de ácido nucleico” incluyen oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o a un fragmento de cualquiera de estos, a ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genómico o sintético que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una hebra sentido o antisentido, a ácido nucleico peptídico (PNA), o a cualquier material semejante a ADN o semejante a ARN, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, ARNi, ribonucleoproteínas (por ejemplo, ARNi bicatenarios, por ejemplo RNPi). La expresión engloba ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. La expresión también engloba estructuras semejantes a ácidos nucleicos, con cadenas principales sintéticas; véanse, por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156. “Oligonucleótido” incluye un polidesoxinucleótido monocatenario o dos hebras polidesoxinucleotídicas complementarias que se pueden sintetizar químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen 5’ fosfato, y de este modo no se ligarán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se puede ligar a un fragmento que no se ha desfosforilado.

Una “secuencia codificante de” o una “secuencia nucleotídica que codifica” un polipéptido o proteína particular es una secuencia de ácido nucleico que es transcrita y traducida en un polipéptido o proteína cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.

El término “gen” significa el segmento de ADN implicado en producir una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y que siguen a la región codificante (líder y tráiler), así como también, cuando sea aplicable, secuencias interventoras (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones). “Enlazado operablemente”, como se usa aquí, hace referencia a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácido nucleico (por ejemplo, ADN). En un aspecto, hace referencia a la relación funcional de secuencia reguladora transcripcional a una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor esta enlazado operablemente a una secuencia codificante, tal como un ácido nucleico de la descripción, si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedante u otro sistema de expresión apropiado. En un aspecto, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que están enlazadas operablemente a una secuencia transcrita son contiguas físicamente a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como los potenciadores, no necesitan estar contiguos físicamente o situados en estrecha proximidad a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.

La expresión “casete de expresión”, como se usa aquí, se refiere a una secuencia nucleotídica que es capaz de efectuar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia codificante proteica, tal como una enzima de la descrición) en un hospedante compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos un promotor enlazado operablemente con la secuencia codificante polipeptídica; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo señales de terminación de la transcripción. También se pueden usar factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo potenciadores. De este modo, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de “ADN desnudo” recombinante, y similar. Un “vector” comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoria o permanentemente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico complejado con proteína o lípido. El vector comprende opcionalmente ácidos nucleicos y/o proteínas víricas o bacterianas, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una cubierta lipídica vírica, etc.). Los vectores incluyen, pero no se limitan a, replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN y se pueden replicar. De este modo, los vectores incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN o ARN circular o lineal autorreplicante autónomo (por ejemplo, plásmidos, virus, y similares; véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.217.879), e incluyen tanto los plásmidos de expresión como de no expresión. Cuando un microorganismo recombinante o cultivo celular se describe como hospedante de un “vector de expresión”, esto incluye tanto ADN circular y lineal extracromosómico como también ADN que se ha incorporado en el cromosoma o cromosomas del hospedante. Cuando un vector se mantiene mediante una célula hospedante, el vector se puede replicar de forma estable mediante las células durante mitosis como una estructura autónoma, o se incorpora en el genoma del hospedante.

Como se usa aquí, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de dirigir la transcripción de una secuencia codificante en una célula, por ejemplo una célula vegetal. De este modo, los promotores usados en los constructos de la descripción incluyen elementos de control de la transcripción que actúan en cis y secuencias reguladoras que están implicadas en la regulación o la modulación de la duración y/o la velocidad de la transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de la transcripción que actúa en cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones no traducidas 5’ y 3’, o una secuencia intrónica, que están implicados en la regulación de la transcripción. Estas secuencias que actúan en cis interactúan típicamente con proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción. Los promotores “constitutivos” son aquellos que dirigen la expresión continuamente en la mayoría de las condiciones medioambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los promotores “inducibles” o “regulables” dirigen la expresión del ácido nucleico de la descripción bajo la influencia de las condiciones medioambientales o condiciones de desarrollo. Los ejemplos de las condiciones medioambientales que puede afectar a la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, sequía, o la presencia de luz.

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fácilmente un péptido sintetizado recombinantemente, para identificar y aislar anticuerpos y linfocitos B que expresan anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales tales como tramos de polihistidina y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad de FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). La inclusión de secuencias ligadoras escindibles, tales como el Factor Xa o enterocinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido que comprende un motivo para facilitar la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo enlazada a seis restos de histidina seguido de una tiorredoxina y un sitio de escisión de enterocinasa (véanse, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Los restos de histidina facilitan la detección y purificación, mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para purificar el epítopo del resto de la proteína de fusión. La tecnología que pertenece a vectores que codifican proteínas de fusión, y la aplicación de las proteínas de fusión, está bien descrita en la bibliografía científica y de patentes; véase, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53.

Secuencias de control transcripcionales y traduccionales

La descripción proporciona secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) de la descripción operablemente enlazadas a secuencia o secuencias de control de la expresión (por ejemplo, transcripcionales o traduccionales), por ejemplo promotores o potenciadores, para dirigir o modular la síntesis/expresión del ARN. La secuencia de control de la expresión puede estar en un vector de expresión. Los promotores bacterianos ejemplares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucariotas ejemplares incluyen el inmediato temprano del CMV, HSV timidina cinasa, temprano y tardío del SV40, LTRs de retrovirus, y metalotioneína I de ratón.

Los promotores adecuados para expresar un polipéptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacI, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), y el promotor de fosfatasa ácida. Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de HSV timidina cinasa, promotores de choque térmico, el promotor de SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína I de ratón. También se pueden usar otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas, o sus virus. Los promotores adecuados para expresar el polipéptido o su fragmento en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacI, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), y el promotor de fosfatasa ácida. Los promotores fúngicos incluyen el promotor del factor . Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de HSV timidina cinasa, promotores de choque térmico, el promotor de SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína I de ratón. También se pueden usar otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas,

o sus virus.

Promotores Vegetales Específicos de Tejidos

La descripción proporciona casetes de expresión que se pueden expresar de una manera específica del tejido, por ejemplo, que puede expresar una enzima de la descripción de una manera específica del tejido. La descripción también proporciona plantas o semillas que expresan una enzima de la descripción de una manera específica del tejido. La especificidad del tejido puede ser específica de la semilla, específica del tallo, específica de la hoja, específica de la raíz, específica del fruto, y similar.

En un aspecto, un promotor constitutivo tal como el promotor 35S de CaMV se puede usar para la expresión en partes específicas de la planta o semilla o en toda la planta. Por ejemplo, para la sobreexpresión, se puede emplear un fragmento de promotor vegetal que dirigirá la expresión de un ácido nucleico en algunos o en todos los tejidos de una planta, por ejemplo una planta regenerada. Tales promotores son denominados aquí como promotores “constitutivos”, y son activos en la mayoría de las condiciones medioambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de los promotores constitutivos incluyen la región de iniciación de la transcripción del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1’ o 2’ derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones de iniciación de la transcripción procedentes de diversos genes vegetales conocidos por los expertos en la técnica. Tales genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); el gen codificante de la desaturasa de la proteína portadora de estearoilo-acilo de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176); GPc1 del maíz (GenBank No. X15596; Martínez (1989) J. Mol. Biol 208:551-565); Gpc2 del maíz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); los promotores vegetales descritos en las patentes U.S. nos 4.962.028 y 5.633.440.

La descripción usa promotores específicos de tejidos o promotores constitutivos derivados de virus que pueden incluir, por ejemplo, el promotor subgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:16791683; el virus baciliforme tungro del arroz (RTBV), que se replica solamente en células del floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que dirige la expresión fuerte del gen informador específico del floema; el

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promotor del virus del mosaico de la nervadura de la yuca (CVMV), con la actividad más alta en los elementos vasculares, en células del mesófilo de las hojas, y en las puntas de las raíces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139).

Alternativamente, el promotor vegetal puede dirigir la expresión del ácido nucleico que expresa la enzima en un tejido específico, órgano o tipo celular (es decir, promotores específicos de tejido), o puede estar de otro modo bajo control medioambiental o de desarrollo más preciso, o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de las condiciones medioambientales que pueden afectar a la transcripción incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, la presencia de luz, o pulverización con productos químicos/hormonas. Por ejemplo, la descripción incorpora el promotor inducible por sequía del maíz (Busk (1997), más arriba); el promotor inducible por frío, sequía, y alta concentración de sal de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897 909).

Los promotores específicos de tejido pueden promover la transcripción solamente en un cierto marco temporal del estado de desarrollo en ese tejido. Véase, por ejemplo, Blázquez (1998) Plant Cell 10:791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de Arabidopsis. Véase también Cardon (1997) Plant J 12:367-77, que describe el factor de transcripción SPL3, que reconoce un motivo de secuencia conservado en la región promotora del gen AP1 de identidad del meristemo floral de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, págs. 995-1004, que describen el promotor del meristemo eIF4. Se pueden usar promotores específicos de tejido que son activos a lo largo del ciclo de vida de un tejido concreto. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la descripción están enlazados operablemente a un promotor activo principalmente durante las etapas de alargamiento de células de fibra de algodón, por ejemplo como se describe por Rinehart (1996), más arriba. Los ácidos nucleicos pueden estar enlazados operablemente al promotor del gen Fb12A para ser expresados preferentemente en células de fibra de algodón (Ibid). Véase también, John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al., patentes U.S. nos

5.608.148 y 5.602.321, que describen promotores específicos de fibra de algodón y métodos para la construcción de plantas de algodón transgénicas. También se pueden usar promotores específicos de raíz para expresar los ácidos nucleicos de la descripción. Los ejemplos de los promotores específicos de raíz incluyen el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60). Otros promotores que se pueden usar para expresar los ácidos nucleicos de la descripción incluyen, por ejemplo, promotores específicos de ovulo, específicos de embrión, específicos de endospermo, específicos de integumento, específicos del revestimiento del tegumento, o alguna de sus combinaciones; un promotor específico de hoja (véase, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, que describe un promotor específico de hoja en el maíz); el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que muestra actividad elevada en raíces; véase, por ejemplo, Hansen (1997), más arriba); un promotor específico de polen de maíz (véase, por ejemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168); se puede usar un promotor de tomate activo durante la maduración del fruto, la senescencia y la abscisión de las hojas y, en menor grado, de las flores (véase, por ejemplo, Blume (1997) Plant J. 12:731 746); un promotor específico del pistilo procedente del gen SK2 de la patata (véase, por ejemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431); el gen Blec4 del guisante, que es activo en tejido epidérmico de ápices de brotes vegetativos y florales de alfalfa transgénica, que lo hacen una herramienta útil para dirigir la expresión de genes foráneos a la capa epidérmica de brotes o fibras que crecen activamente; el gen BEL1 específico de óvulos (véase, por ejemplo, Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944); y/o, el promotor de Klee, patente U.S. nº 5.589.583, que describe una región promotora vegetal que es capaz de conferir niveles elevados de transcripción en tejido meristémico y/o células que se dividen rápidamente.

Alternativamente, los promotores vegetales que son inducibles con la exposición a hormonas vegetales, tales como auxinas, se usan para expresar los ácidos nucleicos de la descripción. Por ejemplo, la descripción puede usar el fragmento de promotor E1 de los elementos de respuesta a auxinas (AuxREs) en la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407); el promotor GST6 de Arabidopsis sensible a auxinas (también sensible a ácido salicílico y peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC inducible por auxinas del tabaco (Sakai (1996) 37:906-913); un elemento de respuesta a biotina vegetal (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); y, el promotor sensible a la hormona del estrés ácido abscísico (Sheen (1996) Science 274:19001902).

Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden enlazar también operablemente a promotores vegetales que son inducibles con la exposición a sustancias químicas que se pueden aplicar a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, se puede usar el promotor In2-2 de maíz, activado por protectores contra herbicidas de bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); la aplicación de diferentes protectores contra herbicidas induce distintos patrones de expresión génica, incluyendo expresión en la raíz, hidatodos, y el meristemo apical de los brotes. La secuencia codificante puede estar bajo el control de, por ejemplo, un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo como se describe con las plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de la arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324). Usando promotores inducidos químicamente (por ejemplo, por hormonas o plaguicidas), es decir, un promotor sensible a un agente químico que se puede aplicar a la planta transgénica en el campo, se puede inducir la expresión de un polipéptido de la descripción en una etapa concreta de desarrollo de la planta. De este modo, la descripción también proporciona plantas transgénicas que contienen un gen inducible que codifica polipéptidos de la descripción cuya gama de anfitriones está limitada a especies de plantas diana, tales como maíz, arroz, cebada, trigo, patata u otros cultivos, inducible en cualquier etapa de desarrollo del cultivo.

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Un experto en la técnica advertirá que un promotor vegetal específico de tejido puede dirigir la expresión de secuencias enlazadas operablemente en tejidos distintos del tejido diana. De este modo, un promotor específico de tejido es el que dirige la expresión preferentemente en el tejido diana o tipo celular, pero puede además conducir también a cierta expresión en otros tejidos.

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden estar enlazados operablemente a promotores vegetales que son inducibles con la exposición a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos que se pueden aplicar, por ejemplo pulverizar, sobre las plantas transgénicas. La expresión inducible de los ácidos nucleicos que producen la enzima de la descripción permitirá al productor seleccionar plantas con expresión y/o actividad enzimática óptima. De este modo se puede controlar el desarrollo de partes de las plantas. De este modo, la descripción proporciona el medio para facilitar la cosecha de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en diversas realizaciones, se usa el promotor In2-2 de maíz, activado por protectores contra herbicidas de bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); la aplicación de diferentes protectores contra herbicidas induce distintos patrones de expresión génica, incluyendo expresión en la raíz, hidatodos, y el meristemo apical del brote. Las secuencias codificantes de la descripción también están bajo el control de un promotor de tetraciclina inducible, por ejemplo como se describe con plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de la arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324).

En algunos aspectos, la expresión apropiada del polipéptido puede requerir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de la región codificante. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de genes de otra planta (o animal u otro), o de genes en el ADN-T agrobacteriano.

El término “planta” incluye plantas completas, partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, etc.), protoplastos vegetales, semillas y células vegetales y sus progenies. La clase de plantas que se pueden usar en el método de la descripción es generalmente tan amplio como la clase de plantas superiores susceptibles de técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidía, incluyendo los estados poliploide, diploide, haploide y hemizigoto. Como se usa aquí, el término “planta transgénica” incluye plantas o células vegetales en las que se ha insertado una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo, los ácidos nucleicos y diversos constructos recombinantes (por ejemplo, casetes de expresión) de la descripción.

Vectores de expresión y vehículos de clonación

La descripción proporciona vectores de expresión y vehículos de clonación que comprenden ácidos nucleicos de la descripción, por ejemplo secuencias que codifican las enzimas de la descripción. Los vectores de expresión y los vehículos de clonación de la descripción pueden comprender partículas víricas, baculovirus, fago, plásmidos, fagómidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN vírico (por ejemplo de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales a base de P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualesquiera otros vectores específicos para hospedantes específicos de interés (tales como Bacillus, Aspergillus y levadura). Los vectores de la descripción pueden incluir secuencias de ADN sintéticas, cromosómicas y no cromosómicas. Un gran número de vectores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica, y están comercialmente disponibles. Los vectores ejemplares incluyen: vectores bacterianos: pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro plásmido u otro vector con tal de que sean replicables y viables en el hospedante. Con la presente descripción, se pueden emplear vectores con bajo número de copias o alto número de copias.

Los “plásmidos” pueden estar comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles según procedimientos publicados. Los plásmidos equivalentes a los descritos aquí son conocidos en la técnica y serán manifiestos para un experto normal.

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. El vector puede incluir también las secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, cualesquiera sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios dadores y aceptores de ayuste, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias no transcritas flanqueantes 5’. En algunos aspectos, se pueden usar secuencias de ADN derivadas de los sitios de ayuste y poliadenilación de SV40 para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables, para permitir la selección de células hospedantes que contienen el vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que codifican dihidrofolato reductasa, o genes que confieren resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, genes que confieren resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae. Las regiones

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promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado usando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Los vectores para expresar el polipéptido o su fragmento en células eucariotas también pueden contener potenciadores para incrementar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de alrededor de 10 a alrededor de 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores adenovíricos.

Una secuencia de ácido nucleico se puede insertar en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia se liga a la posición deseada en el vector tras la digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. Como alternativa, se pueden ligar extremos romos tanto en el inserto como en el vector. En la técnica se conoce una variedad de técnicas de clonación, por ejemplo como se describe en Ausubel y Sambrook. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

El vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula vírica, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN fágico, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fágico, ADN vírico tal como el virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, y pseudorrabia. Una variedad de vectores de clonación y de expresión para uso con hospedantes procariotas y eucariotas se describen, por ejemplo, por Sambrook.

Los vectores bacterianos particulares que se pueden usar incluyen los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector en tanto que sea replicable y viable en la célula hospedante.

Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden expresar en casetes de expresión, vectores o virus, y se pueden expresar transitoria o establemente en células vegetales y semillas. Un sistema de expresión transitorio ejemplar usa sistemas de expresión episómicos, por ejemplo, ARN vírico del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) generado en el núcleo mediante transcripción de un mini-cromosoma episómico que contiene ADN superenrollado, véase, por ejemplo, Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. Como alternativa, secuencias codificantes, es decir, todas o sub-fragmentos de secuencias de la descripción se pueden insertar en un genoma de una célula hospedante vegetal conviertiéndose en una parte integrante del ADN cromosómico del hospedante. De esta manera, se pueden expresar transcritos sentido o antisentido. Un vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificantes) de ácidos nucleicos de la descripción puede comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable sobre una célula vegetal o una semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, particularmente resistencia a antibióticos, tal como resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia a clorosulfurón o Basta.

Los vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, vectores de Agrobacterium spp., virus X de la patata (véase, por ejemplo, Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684), virus del mosaico del tabaco (véase, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173:69-73), virus del enanismo arbustivo del tomate (véase, por ejemplo, Hillman (1989) Virology 169:42-50), virus del grabado del tabaco (véase, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234:243-252), virus del mosaico amarillo de la judía (véase, por ejemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476), virus del mosaico de la coliflor (véase, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento transponible del maíz Ac/Ds (véanse, por ejemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), y elemento transponible supresor-mutador (Spm) del maíz (véase, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725); y derivados de los mismos.

En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación para permitirle mantenerse en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o insecto para su expresión y en un hospedante procariota para su clonación y amplificación. Además, para los vectores de expresión integrantes, el vector de expresión puede contener al menos una secuencia homóloga al genoma de la célula hospedante. Puede contener dos secuencias homólogas que flanquean el constructo de expresión. El vector integrante puede dirigirse a un locus específico en la célula hospedante seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Los constructos para los vectores integrantes son bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión de la descripción pueden incluir también un gen marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado, por ejemplo genes que vuelven la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores

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seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de la histidina, el triptófano y la leucina.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está enlazada operativamente a una secuencia o secuencias de control de la expresión (promotor) apropiadas, para dirigir la síntesis de ARN. Los promotores bacterianos designados concretos incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, PR, PL lambda y trp. Los promotores eucariotas incluyen el temprano inmediato de CMV, timidina cinasa del HSV, temprano y tardío de SV40, las LTR de retrovirus, y metalotioneína I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está al nivel de conocimiento normal en la técnica. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el comienzo de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Las regiones promotoras se pueden seleccionar entre cualquier gen deseado usando vectores de la cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables. Además, en un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedantes transformadas, tal como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para un cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Los vectores de expresión de mamíferos puede comprender también un origen de replicación, cualesquiera sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios dadores o aceptores de ayuste, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes 5’. En algunos aspectos, se pueden usar secuencias de ADN derivadas de los sitios de ayuste y poliadenilación de SV40 para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

Los vectores para expresar el polipéptido o su fragmento en células eucariotas también pueden contener potenciadores para incrementar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de alrededor de 10 a alrededor de 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores adenovíricos.

Además, la vectores de expresión contienen típicamente uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de células hospedantes que contienen el vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que codifican genes de la dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucariotas, genes que confieren resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae.

En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica uno de los polipéptidos de la descripción, o fragmentos que comprenden al menos alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos del mismo, se ensambla en la fase apropiada con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o un fragmento del mismo. Opcionalmente, el ácido nucleico puede codificar un polipéptido de fusión en el que uno de los polipéptidos de la descripción, o fragmentos que comprenden al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos del mismo, se fusiona a péptidos o polipéptidos heterólogos, tales como péptidos de identificación N-terminal que confieren las características deseadas, tales como mayor estabilidad

o purificación simplificada.

La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector por medio de una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se liga a la posición deseada en el vector después de la digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. Alternativamente, se pueden ligar los extremos romos tanto en el inserto como en el vector. Una variedad de técnicas de clonación son descritas en Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press (1989. Se considera que tales procedimientos y otros están al alcance de los expertos en la técnica.

El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN fágico, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fágico, ADN vírico tal como el virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, y pseudorrabia. Una variedad de vectores de clonación y de expresión para uso con hospedantes procariotas y eucariotas son descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).

Células hospedantes y células transformadas

La descripción también proporciona una célula transformada que comprende una secuencia de ácido nucleico de la descripción, por ejemplo una secuencia que codifica una enzima de la descripción, o un vector de la descripción. La célula hospedante puede ser cualquiera de las células hospedantes familiares para los expertos en la técnica, incluyendo células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células vegetales. Las células bacterianas ejemplares incluyen

E. coli, Lactococcus lactis, Streptomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium o cualquier

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especie dentro de los géneros Bacillus, Streptomyces, y Staphylococcus. Las células de insecto ejemplares incluyen S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera. Las células de levadura ejemplares incluyen Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Las células animales ejemplares incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes, o cualquier línea celular de ratón o humana. La selección de un hospedante apropiado se encuentra dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. Las técnicas para la transformación de una amplia variedad de especies de plantas supriores son bien conocidas y se describen en la bibliografía técnica y científica. Véanse, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; patente U.S. 5.750.870.

El vector se puede introducir en las células hospedantes usando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfección, transducción, infección vírica, pistolas génicas, o transferencia génica mediada por plásmidos Ti. Los métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores de la descripción se introducen en las células para escrutar, de ese modo, los ácidos nucleicos que entran en las células de una manera adecuada para la posterior expresión del ácido nucleico. El método de introducción está dictado en gran parte por el tipo de célula seleccionada como diana. Los métodos ejemplares incluyen precipitación con CaPO4, fusión de liposomas, lipofección (por ejemplo, LIPOFECTIN™), electroporación, infección vírica, etc. Los ácidos nucleicos candidato se pueden integrar establemente en el genoma de la célula hospedante (por ejemplo, con introducción retrovírica) o pueden existir transitoria o establemente en el citoplasma (es decir, a través del uso de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras convencionales, marcadores de selección, etc.). Puesto que muchos escrutinios farmacéuticamente importantes requieren dianas celulares humanas o de mamíferos modelo, se pueden usar vectores retrovíricos capaces de transfectar tales dianas.

Cuando sea apropiado, las células hospedantes manipuladas mediante ingeniería se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la descripción. Después de la transformación de una cepa hospedante adecuada y el crecimiento de la cepa hospedante hasta una densidad celular apropiada, se puede introducir el promotor seleccionado por medio de métodos apropiados (por ejemplo, desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se pueden cultivar durante un período adicional para permitirlas producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Las células se pueden cosechar mediante centrifugación, se pueden destruir por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden destruir mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelacióndescongelación, tratamiento con ultrasonidos, interrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. El polipéptido expresado o su fragmento se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con etanol o sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita, y cromatografía con lecitina. Las etapas de replegamiento proteico se pueden usar, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, para las etapas de purificación final, se puede emplear cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC).

Los constructos en células hospedantes se pueden usar de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por células hospedantes que contienen el vector pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos de la descripción también pueden incluir o no un resto de aminoácido metionina inicial.

Para producir un polipéptido de la descripción, también se pueden emplear sistemas de traducción libres de células. Los sistemas de traducción libres de células pueden usar ARNm transcritos a partir de un constructo de ADN que comprende un promotor enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, el constructo de ADN se puede linealizar antes de llevar a cabo una reacción de transcripción in vitro. El ARNm transcrito se incuba entonces con un extracto de traducción libre de células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedantes transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Las células hospedantes que contienen los polinucleótidos de interés, por ejemplo ácidos nucleicos de la descripción, se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y

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similares, son las que se han usado previamente con la célula hospedante seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para los expertos normales en la técnica. Los clones que se identifican que tienen la actividad enzimática especificada se pueden secuenciar a continuación para identificar la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima que tiene la actividad intensificada.

La descripción proporciona un método para sobreexpresar una enzima recombinante en una célula, que comprende expresar un vector que comprende un ácido nucleico de la descripción, por ejemplo un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico con al menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de secuencia con una secuencia ejemplar de la descripción, a lo largo de una región de al menos alrededor de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o más restos, o toda la longitud de un gen o transcrito, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual, o un ácido nucleico que se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de ácido nucleico de la descripción. La sobreexpresión se puede efectuar por cualquier medio, por ejemplo uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico o mediante amplificación génica del vector.

Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden expresar, o sobreexpresar, en cualquier sistema de expresión in vitro o in vivo. Se puede emplear cualquier sistema de cultivo celular para expresar, o sobreexpresar, proteína recombinante, incluyendo cultivos bacterianos, de insecto, de levadura, fúngicos o de mamíferos. La sobreexpresión se puede efectuar por medio de la elección apropiada de promotores, potenciadores, vectores (por ejemplo, uso de vectores de replicón, vectores dicistrónicos (véase, por ejemplo, Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8), medios, sistemas de cultivo y similares. En un aspecto, la amplificación génica que usa marcadores de selección, por ejemplo glutamina sintetasa (véase, por ejemplo, Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63), en sistemas celulares se usa para sobreexpresar los polipéptidos de la descripción.

La célula hospedante puede ser cualquiera de las células hospedantes familiares para los expertos en la técnica, incluyendo células procariotas, células eucariotas, células de mamífero, células de insecto, o células vegetales. Como ejemplos representativos de los hospedantes apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros Streptomyces y Staphylococcus, células fúngicas, tales como levadura, células de insecto tales como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera, células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes, y adenovirus. La selección de un hospedante apropiado se encuentra dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

El vector se puede introducir en las células hospedantes usando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfección, transducción, infección vírica, pistolas génicas, o transferencia génica mediada por plásmidos Ti. Los métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Cuando sea apropiado, las células hospedantes manipuladas mediante ingeniería genética se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la descripción. Tras la transformación de una cepa hospedante adecuada y el crecimiento de la cepa hospedante hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se puede inducir por medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química), y las células se pueden cultivar durante un período adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Las células se pueden cosechar mediante centrifugación, se pueden destruir por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden destruir mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelacióndescongelación, tratamiento con ultrasonidos, interrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. El polipéptido expresado o su fragmento se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con etanol o sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita, y cromatografía con lecitina. Las etapas de replegamiento proteico se pueden usar, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, para las etapas de purificación final, se puede emplear cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC).

También se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las estirpes COS-7 de fibroblastos de riñón de mono (descritas por Gluzman, Cell, 23:175, 1981) y otras estirpes celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como las estirpes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.

Los constructos en las células hospedantes se pueden utilizar de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del hospedante empleado en un

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Cangene, Mississauga, Ontario); véanse también Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; patentes U.S. nos 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

Determinación del grado de identidad de secuencia

La descripción proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias que tienen al menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad o más, o identidad de secuencia completa (100%) con un ácido nucleico ejemplar de la descripción (por ejemplo, SEC ID NO:1, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:15, SEC ID NO:17 o SEC ID NO:19) a lo largo de una región de al menos alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más restos. La descripción proporciona polipéptidos que comprenden secuencias que tienen al menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad o más, o identidad de secuencia completa (100%) con un polipéptido ejemplar de la descripción. El grado de identidad de secuencia (homología) se puede determinar usando cualquier programa informático y parámetros asociados, incluyendo los descritos aquí, tales como BLAST 2.2.2. o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por defecto.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la descripción pueden comprender al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 nucleótidos consecutivos de una secuencia ejemplar de la descripción, y secuencias sustancialmente idénticas a éstas. Las secuencias homólogas y los fragmentos de las secuencias de ácido nucleico de la descripción hacen referencia a una secuencia que tiene una homología de al menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, o 50% con estas secuencias. La homología se puede determinar utilizando cualquiera de los programas informáticos y los parámetros descritos aquí, incluyendo FASTA versión 3.0t78 con los parámetros por defecto. Las secuencias homólogas también incluyen secuencias de ARN en las que las uridinas sustituyen a las timinas en las secuencias de ácido nucleico de la invención. Las secuencias homólogas se pueden obtener usando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se apreciará que las secuencias de ácido nucleico de la descripción se pueden representar en el formato de un solo carácter tradicional (Véase la contraportada de Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed., W. H Freeman & Co., Nueva York.) o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia.

Se contemplan particularmente para uso en este aspecto de la descripción diversos programas de comparación de secuencias identificados en otra parte en esta memoria descriptiva de patente. Las homologías de las secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos se pueden evaluar usando cualquiera de la variedad de algoritmos de comparación de secuencias y programas conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no están limitados de ningún modo a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993).

La homología o identidad se miden con frecuencia utilizando programas de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tales programas emparejan secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a diversas supresiones, sustituciones u otras modificaciones. Los términos “homología” e “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipetídicas, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o región designada según se mide usando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se diseñan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden usar parámetros del programa por defecto, o se pueden diseñar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula a continuación el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, según se usa aquí, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de las varias posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, habitualmente alrededor de 50 a alrededor de 200, más habitualmente alrededor de 100 a alrededor de 150 en las que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado óptimamente las dos secuencias. Los métodos para el alineamiento de secuencias para comparación son bien

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En un aspecto, las homologías de las secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos se evalúan usando la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico (“BLAST”). En particular, se usan cinco programas BLAST específicos para realizar la siguiente tarea:

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BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia problema de aminoácidos frente a una base de datos de secuencias proteicas;

(2)

BLASTN compara una secuencia problema de nucleótidos frente a una base de datos de secuencias nucleotídicas;

(3)

BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia nucleotídica problema (ambas hebras) frente a una base de datos de secuencias proteicas;

(4)

TBLASTN compara una secuencia problema de proteínas frente a una base de datos de secuencias nucleotídicas traducidas en los seis marcos de lectura (ambas hebras); y

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TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia problema de nucleótidos frente a las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias nucleotídicas.

Los programas BLAST identifican secuencias homólogas identificando segmentos similares, que son referidos aquí como “pares de segmentos de alta puntuación”, entre una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico y una secuencia de ensayo que, en un aspecto, se obtiene a partir de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. En un aspecto, los pares de segmentos de alta puntuación se identifican (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuación, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. En un aspecto, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993). En un aspecto menos preferible, también se pueden usar las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). Los programas BLAST son accesibles a través de la U.S. National Library of Medicine.

Los parámetros usados con los algoritmos anteriores se pueden adaptar dependiendo de la longitud de la secuencia y el grado de homología estudiado. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros por defecto usados por los algoritmos en ausencia de instrucciones desde el usuario.

En un aspecto, la frase “sustancialmente idéntico”, en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a dos o más secuencias que tienen, por ejemplo, al menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de nucleótidos o restos de aminoácidos (secuencia), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, según se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias conocidos o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, existe identidad sustancial a lo largo de una región de al menos alrededor de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o más restos, o toda la longitud de un gen o transcrito. En algunos aspectos, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de las regiones codificantes.

Sistemas informáticos y productos de programas informáticos

Para determinar e identificar identidades de secuencia, homologías estructurales, motivos y similares vía simulación computacional, una secuencia de ácido nucleico o polipeptídica de la descripción se puede almacenar, registrar, y manipular en cualquier medio que pueda ser leído y al que se pueda acceder mediante un ordenador.

En consecuencia, la descripción proporciona ordenadores, sistemas informáticos, medios legibles por ordenador, productos de programas informáticos y similares que tienen registradas o almacenadas en ellos las secuencias de ácidos nucleicos y polipeptídicas de la descripción. Como se usa aquí, las palabras “registrado” y “almacenado” hacen referencia a un procedimiento para almacenar información en un medio informático. Un experto en la técnica puede adoptar fácilmente cualquier método conocido para registrar información en un medio legible por ordenador para generar construcciones que comprenden una o más de las secuencias de ácidos nucleicos y/o polipeptídicas de la descripción.

Los polipéptidos de la descripción incluyen las secuencias polipeptídicas de la descripción, por ejemplo las secuencias ejemplares de la descripción, y secuencias sustancialmente idénticas a ellas, y fragmentos de cualquiera de las secuencias anteriores. Las secuencias polipeptídicas sustancialmente idénticas, u homologas, hacen referencia a una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de secuencia de al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o identidad completa (100%) con una secuencia ejemplar de la descripción.

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leer la lógica de control y/o los datos del componente de almacenamiento de datos una vez insertados en el dispositivo de recuperación de datos.

El sistema informático 100 incluye una pantalla 120 que se utiliza para la visualización por un usuario del ordenador. También se debe observar que el sistema informático 100 puede estar conectado a otros sistemas informáticos 125a-c en una red o red de área extendida para proporcionar acceso centralizado al sistema informático 100.

El soporte lógico para acceder a y procesar las secuencias nucleotídicas de una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, (tales como herramientas de búsqueda, herramientas de comparación y herramientas de formación de modelos, etc.) puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución.

En algunos aspectos, el sistema informático 100 puede comprender adicionalmente un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, almacenada en un medio legible por ordenador, con una secuencia o secuencias nucleotídicas o polipeptídicas de referencia almacenadas en un medio legible por ordenador. Un “algoritmo de comparación de secuencias” hace referencia a uno o más programas que son implementados (local o remotamente) en el sistema informático 100 para comparar una secuencia nucleotídica con otras secuencias nucleotídicas y/o compuestos almacenados en los medios de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias nucleotídicas de una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, almacenada en un medio legible por ordenador, con secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por ordenador, para identificar homologías o motivos estructurales.

La Figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra un proceso 200 para comparar una nueva secuencia nucleotídica o proteica con una base de datos de secuencias a fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada, almacenada en el sistema 100 de ordenador, o una base de datos pública, tal como GENBANK, que está disponible a través de Internet.

El proceso 200 comienza en el estado 201 de partida, y después continúa a un estado 202, en el que la nueva secuencia a comparar se almacena en una memoria en un sistema informático 100. Como se explica anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo RAM o un dispositivo de almacenamiento interno.

El proceso 200 continúa entonces a un estado 204, en el que se abre una base de datos de secuencias para el análisis y comparación. El proceso 200 continúa entonces a un estado 206, en el que la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en el ordenador. Después se lleva a cabo una comparación en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante observar que esta etapa no está limitada a llevar a cabo una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Aquellos expertos en la técnica conocen métodos bien conocidos para comparar dos secuencias nucleotídicas o proteicas, incluso si no son idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir saltos en una secuencia a fin de elevar el nivel de homología entre las dos secuencias ensayadas. Los parámetros que controlan si se introducen saltos u otras características en una secuencia durante la comparación son introducidos normalmente por el usuario del sistema de ordenador.

Una vez que se ha llevado a cabo una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se realiza una determinación en un estado 210 de decisión sobre si las dos secuencias son iguales. Por supuesto, el término “iguales” no está limitado a secuencias que son absolutamente idénticas. Las secuencias que están dentro de los parámetros de homología introducidos por el usuario se marcarán como “iguales” en el proceso 200.

Si se realiza una determinación de que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 continúa hasta un estado 214, en el que se presenta al usuario el nombre de la secuencia de la base de datos. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre presentado cumple las restricciones de homología que se introdujeron. Una vez que se presenta al usuario el nombre de la secuencia almacenada, el proceso 200 continúa a un estado 218 de decisión, en el que se realiza una determinación sobre si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en el estado 220 final. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 continúa a un estado 224, en el que un puntero se mueve a la siguiente secuencia en la base de datos de manera que se puede comparar con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia en la base de datos.

Se debería señalar que si se ha hecho una determinación en el estado 212 de decisión de que las secuencias no fueron homólogas, entonces el proceso 200 continuaría inmediatamente al estado 218 de decisión, a fin de determinar si cualesquiera otras secuencias estaban disponibles en la base de datos para comparación.

En consecuencia, un aspecto de la descripción es un sistema informático que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenado en él una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, un dispositivo de almacenamiento de datos recuperables que tiene almacenado en él secuencias nucleotídicas o secuencias polipeptídicas de referencia para compararlas con una secuencia de ácido nucleico de la descripción o con una secuencia polipeptídica de la

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En otros aspectos, el sistema a base de ordenador puede comprender además un identificador para identificar características dentro de una secuencia de ácido nucleico de la descripción o una secuencia polipeptídica de la descripción.

Un “identificador” se refiere a uno o más programas que identifica ciertas características dentro de una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o de una secuencia polipeptídica de la descripción. En un aspecto, el identificador puede comprender un programa que identifica un marco de lectura abierto en una secuencia de ácido nucleico de la descripción.

La Figura 7 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 300 identificador para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un estado 302 de partida y continúa entonces hacia un estado 304, en el que una primera secuencia que se va a comprobar en busca de características se almacena en una memoria 115 en el sistema informático 100. El proceso 300 continúa entonces hacia un estado 306, en el que se abre una base de datos de características de secuencias. Tal base de datos incluiría una lista de cada atributo de la característica, junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre de característica podría ser “Codón de Iniciación”, y el atributo sería “ATG”. Otro ejemplo sería el nombre de característica “Caja TAATAA”, y el atributo de la característica sería “TAATAA”. Un ejemplo de tal base de datos se produce por el University of Wisconsin Genetics Computer Group. Como alternativa, las características pueden ser motivos polipeptídicos estructurales, tales como hélices alfa, láminas beta, o motivos polipeptídicos funcionales tales como dominios catalíticos enzimáticos (CDs), o sitios activos, motivos de hélice-vuelta-hélice, u otros motivos conocidos por los expertos en la técnica.

Una vez que la base de datos de las características se abre en el estado 306, el proceso 300 continúa hacia un estado 308, en el que la primera característica se lee de la base de datos. Entonces se lleva a cabo en un estado 310 una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia. Entonces se realiza una determinación en un estado 316 de decisión sobre si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si se encontró el atributo, entonces el proceso 300 continúa hacia un estado 318, en el que se presenta al usuario el nombre de la característica encontrada.

El proceso 300 continúa entonces hacia un estado 320 de decisión, en el que se realiza una determinación sobre si existen más características en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en un estado final 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente característica de secuencia en una etapa 326 y vuelve nuevamente al estado 310, en el que el atributo de la siguiente característica se compara frente a la primera secuencia. Se debería señalar que si no se encuentra el atributo de la característica en la primera secuencia en el estado 316 de decisión, el proceso 300 continúa directamente al estado 320 de decisión, a fin de determinar si existen más características en la base de datos.

En consecuencia, otro aspecto de la descripción, es un método para identificar una característica dentro de una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, que comprende leer el código o códigos del ácido nucleico o el código o códigos del polipéptido mediante el uso de un programa informático que identifica características en ellos, e identificar características en el código o códigos del ácido nucleico con el programa informático. En un aspecto, un programa informático comprende un programa informático que identifica marcos de lectura abiertos. El método se puede llevar a cabo leyendo una sola secuencia o al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, o 40 de las secuencias de ácido nucleico de la descripción, o las secuencias polipeptídicas de la descripción, mediante el uso del programa informático, e identificar características dentro de los códigos de los ácidos nucleicos o de los códigos de los polipéptidos con el programa informático.

Una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, se puede almacenar y manipular en una variedad de programas procesadores de datos, en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción, se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de palabras, tal como MicrosoftWORD o WORDPERFECT, o como un archivo ASCII en una variedad de programas de bases de datos familiares para los expertos en la técnica, tales como DB2, SYBASE, u ORACLE. Además, muchos programas informáticos y bases de datos se pueden usar como algoritmos de comparación de secuencias, identificadores, o fuentes de secuencias nucleotídicas o secuencias polipeptídicas de referencia a comparar con una secuencia de ácido nucleico de la descripción, o una secuencia polipeptídica de la descripción. Se pretende que la siguiente lista no limite la descripción sino que proporcione apoyo a los programas y bases de datos que son útiles con las secuencias de ácido nucleico de la descripción, o las secuencias polipeptídicas de la descripción.

Los programas y bases de datos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST y BLAST2 (NCBI), BLASTN y BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.),

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