JP2004135597A - 発現誘導型プロモーター及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】新たな発現誘導型プロモーターを提供する。
【解決手段】下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター。（１）第一ＤＮＡ：ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する領域を有するＤＮＡ（２）第二ＤＮＡ：下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。（ｃ）特定の塩基番号からなるＤＮＡ。（ｄ）（ｃ）の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ。（ｅ）（ｃ）の塩基配列に相補性を有する塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ。
【選択図】 なし
【解決手段】下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター。（１）第一ＤＮＡ：ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する領域を有するＤＮＡ（２）第二ＤＮＡ：下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。（ｃ）特定の塩基番号からなるＤＮＡ。（ｄ）（ｃ）の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ。（ｅ）（ｃ）の塩基配列に相補性を有する塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発現誘導型プロモーター及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の細胞へ遺伝子を導入し発現させることによって有用形質を付与された形質転換植物の作出又は有用物質の植物における生産等が試みられている。このような形質転換植物においては、通常、導入される遺伝子は植物細胞において機能可能なプロモーターの制御下に置かれ、当該プロモーターによってその発現量や発現時期等が調節される。
形質転換植物に有用形質を付与する場合又は形質転換植物を利用して有用物質を生産させる場合において、その形質を常時発現させると植物にストレスを与えて生育阻害や生産性の低下を引き起こす場合があり、植物の収穫時又は環境ストレス付加時等の特定の時期に、例えば、傷害、強光、熱等の外的要因に惹起されて当該形質が発現させることが好ましい場合がある。このような場合には、かかる特定条件下に当該遺伝子を発現させるような発現誘導型プロモーターを使用することがよい。
【０００３】
【特許文献１】
特開２０００−６０５５８号公報
【特許文献２】
特開２０００−１１６２５９号公報
【特許文献３】
特開２０００−１１６２６０号公報
【特許文献４】
特開２００２−２７２４６９号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来知られている発現誘導型プロモーターは限られており、新たな発現誘導型プロモーターの開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは鋭意検討を行った結果、新たな発現誘導型プロモーターを見出し本発明に至った。
【０００６】
本発明は、
１．下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター（以下、本発明プロモーターと記すこともある。）、
（１）第一ＤＮＡ：
ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する塩基配列を有するＤＮＡ
（２）第二ＤＮＡ：
下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ；
２．下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター、
（１）第一ＤＮＡ：
下記の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基番号１７５２から塩基番号１８８６までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）ゲノム遺伝子が有するプロモーター領域から切り出される一部のＤＮＡであって、当該ＤＮＡにおける３’末端は転写開始点に相当するヌクレオチドであり、かつ、当該ＤＮＡにおける５’末端は前記３末’端より４６〜２００塩基上流の位置にあるヌクレオチドであって、ミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡ。
（２）第二ＤＮＡ：
下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ；
３．前項１記載の発現誘導型プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなることを特徴とするＤＮＡ；
４．前項１記載の発現誘導型プロモーターを含むことを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
５．前項１記載の発現誘導型プロモーターの下流に遺伝子挿入部位及び植物ターミネーターを含むことを特徴とする前項３記載のベクター；
６．前項３記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター；
７．前項１記載の発現誘導型プロモーターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
８．前項３記載のＤＮＡ又は請求項５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
９．前項４及び５記載のいずれかのベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１０．宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする前項７〜９記載のいずれかの形質転換体；
１１．前項１記載の発現誘導型プロモーター、前項２記載のＤＮＡ又は前項４及び５記載のいずれかのベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
１２．前項８記載の形質転換体を培養又は育成する工程、外的ストレス処理を与えた後、形質転換体が産生した外来遺伝子産物を回収する工程を有することを特徴とするタンパク質の取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）；１３．下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ；
１４．配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、例えば、Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．，Ｆ．，Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、及びＤ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ著、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＩＲＬ発行、１９８５年等に記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
【０００８】
ゲノム遺伝子が有するプロモーターは、通常、（１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する塩基配列を有するＤＮＡ、例えば、転写に必須な塩基配列を含む領域であって、一般的には転写開始点から上流１０塩基付近に存在する共通配列及び上流３５塩基付近に存在する共通配列を含むミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡからなる領域と、（２）前記（１）の領域からさらに５’上流側に位置して、前記ゲノム遺伝子の発現における時期特異性、組織特異性、発現量等を決める制御プロモーター機能を有するＤＮＡからなる領域（所謂、シス制御領域）とに大きく２分できる。
本発明プロモーターは、ミニマムプロモーター機能を有するような第一ＤＮＡ、及び、特定な塩基配列からなり、制御プロモーター機能を有するような第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを基本的な特徴としている。このようなプロモーターは、発現誘導型プロモーター、特に各種ストレス処理の結果生じるだろうと考えられている過酸化水素によるストレスに対してプロモーター活性を誘導するようなプロモーターとして利用することができる。
【０００９】
本発明プロモーターにおける第一ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する塩基配列を有するＤＮＡであって、例えば、コアプロモーターとか、ミニマムプロモーターともいわれ、通常、ゲノム遺伝子の転写開始部位付近の比較的狭い部分にみられる塩基配列を有するＤＮＡである。このようなＤＮＡが有する必須な領域の塩基配列としては、例えば、ＴＡＴＡボックス及び転写開始点近傍の塩基配列、好ましくは約５０ｂｐ程度の短い塩基配列があげられる。
本発明プロモーターにおける第一ＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号１の塩基番号１７５２から塩基番号１８８６までの塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）ゲノム遺伝子が有するプロモーター領域から切り出される一部のＤＮＡであって、当該ＤＮＡにおける３’末端は転写開始点に相当するヌクレオチドであり、かつ、当該ＤＮＡにおける５’末端は前記３末’端より４６〜２００塩基上流の位置にあるヌクレオチドであって、ミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡ、のいずれかのＤＮＡ等をあげることができる。
より具体的には、第一ＤＮＡとしては、ジンクフィンガータンパク質遺伝子ｚａｔ１２（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ３３：６１５−６２４（１９９７））の翻訳開始点（３’末端）から上流１３５ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）までに存在する領域、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流４６ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１５ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、ニンジン根部タンパク質Ｇ６プロモーター（特開２０００−１６６５７７号公報に記載される）の翻訳開始点（３’末端）から上流１９６ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）までに存在する領域、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子の転写開始点より上流３３ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１５ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、ニワトリオボアルブミン遺伝子の転写開始点より上流４０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＹａサブユニット遺伝子の転写開始点より上流１６４ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流６６ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、チトクロムＰ４５０１Ａ１遺伝子の転写開始点より上流７０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１２０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域等をあげることができる。さらに具体的には、例えば、配列番号１の塩基番号１７５１から塩基番号１８８６までの塩基配列、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等があげられる。
【００１０】
本発明プロモーターにおける第二ＤＮＡは、（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ、又は、（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ、のいずれかのＤＮＡである。
尚、本発明プロモーターは、第二ＤＮＡを一つ含んでいてもよく、また、同一若しくは相異なる複数の第二ＤＮＡを含んでいてもよい。さらに、例えば、エンハンサー機能等の特定機能を有するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ等のＤＮＡも第二ＤＮＡとしてあげることができる。
第二ＤＮＡにおいて「配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ」とは、（Ａ）例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、６５℃でハイブリダイズさせることにより配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１ Ｘ ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、６５℃で３０分間保温した後でも当該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。また、（Ｂ）例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、（２）２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
具体的には、例えば、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと配列同一性が８０％以上であるＤＮＡ等があげられる。かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００１１】
本発明における「発現誘導型プロモーター」とは、外的要因、例えば、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩、病害、植物ホルモン処理等のストレスによって、その下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。強光ストレスとは、通常の環境条件下においては見られない、光合成能を超える程の光照射であって、例えば、２００〜２０００μＥ／ｍ２ｓの光を３０分程度以上照射するこという。またＵＶストレスとは、例えば、波長２２０ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線を３０分以上照射することをいう。また傷害ストレスとは、物理的に植物細胞が破壊されることによるストレスで、例えば、植物組織をハサミ・シュレッダー等を用いて人為的に切り刻むことをいう。また低温ストレスとは、植物の生育適温の下限を超えるような環境に植物が遭遇することによって受けるストレスで、例えば、１〜５℃の温度条件下で３０分以上インキュベートすることをいう。また高温ストレスとは、植物の生育適温の上限を超えるような環境に植物が遭遇することによって受けるストレスで、例えば、３５℃以上の温度条件下で３０分以上インキュベートすることをいう。また塩ストレスとは、土壌中或いは培地中の塩化ナトリウム濃度が上昇し、植物の生育にとって不利となることを意味し、例えば、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を潅水することをいう。また病害ストレスとは、細菌・真菌等による罹病を意味し、例えば、青枯れ病菌（Ｒａｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、いもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）等の植物病原菌が感染することを意味する。また植物ホルモン処理とは、ジャスモン酸（ＪＡ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）、サリチル酸（ＳＡ）等の植物ホルモンを植物に与えることを意味し、例えば、１〜１０ｍＭのサリチル酸水溶液を葉にスプレーすることをいう。発現誘導型プロモーターとは、これらのストレスを植物細胞又は植物体が受けることによって、下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。
【００１２】
本発明プロモーターは、例えば、シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのゲノム遺伝子のＤＮＡ等からＰＣＲ法を利用して調製することができる。
具体的には、例えば、シロイヌナズナの葉等の組織を採取し、採取された組織を液体窒素中で凍結させた後、これを乳鉢等により物理的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とする。当該組織片から通常の方法によりゲノム遺伝子のＤＮＡを抽出する。当該抽出操作は、例えば、Ｍ．Ｓｈｕｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ３５：２２５（１９８３）等に記載されているＣＴＡＢ法、Ｓ．Ｏ．Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｂｅｎｄｉｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ５：６９（１９８５）等に記載されている尿素―フェノール法等により行うことができる。得られたゲノム遺伝子のＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１の塩基番号１から塩基番号２８までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１の塩基番号１８６３から塩基番号１８８６までの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、１回〜数回のＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅することができる。また、前記オリゴヌクレオチドの５’末端側に制限酵素認識配列等を付加したオリゴヌクレオチドを前記ＰＣＲのプライマーとして用いてもよい。
【００１３】
本発明プロモーターは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。使用されるベクターとしては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターや、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等のプラスミドベクターを挙げることができる。クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ， Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ， Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）， ７４， ５４６３頁−５４６７頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法等により分析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。
【００１４】
本発明プロモーターは、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを接続することにより作製することができる。
例えば、本発明プロモーターのＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１の塩基番号８６３から塩基番号８９０までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、或いは配列番号１の塩基番号１３４９から塩基番号１３８０までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１の塩基番号１７２４から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補的は塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、１回から数回のＰＣＲを行うことにより、第二ＤＮＡを増幅することができる。また、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（＋鎖）とその相補鎖である配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（―鎖）を化学合成し、これらを試験管内でアニールさせることにより、第一ＤＮＡを調製することができる。また、例えば、ニンジン由来のゲノム遺伝子のＤＮＡ又はｐＢＩＣＲＰＴ１６Ｇ６（特開２０００−１６６５７７号公報に記載される）を鋳型として、配列番号４の塩基番号１から塩基番号２４までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基番号１７３から塩基番号１９６までの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、１回〜数回のＰＣＲを行うことにより、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片である第一ＤＮＡを調製することができる。
このようにして得られた配列番号１の塩基番号８６３から塩基番号１７５１までの塩基配列を有するＤＮＡ断片又は配列番号１の塩基番号１３４９から塩基番号１７５１までの塩基配列を有するＤＮＡ断片の３’下流側に、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて結合させることにより、本発明プロモーターを作製することができる。
【００１５】
第二ＤＮＡは、また、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列に下記の方法によって変異を導入することによって取得することができる。例えば、Ａ．Ｇｒｅｅｎｅｒ， Ｍ．Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、１９９４年、７巻、３２−３４頁等に記載される方法に準じて配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡにランダムに変異を導入し取得してもよいし、Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年、１２巻、９４４１頁若しくはＷ．Ｋｒａｍｅｒ， Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８７年、１５４巻、３５０頁等に記載されるギャップド・デユープレックス（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）法、又は、Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ． ｏｆ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８５年、８２巻、４８８頁若しくはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８７年、１５４巻、３６７頁等に記載されるクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法等に準じて、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡに部位特異的に変異を導入し取得してもよい。また、例えば、Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９８４年、２８巻、３５１頁、Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９８５年、３３巻、１０３頁等に記載される方法に準じて、配列番号１で示される塩基配列の特定の部位を欠失させた塩基配列を有する第二ＤＮＡを取得してもよい。
【００１６】
また、例えば、植物において遺伝子の転写効率を増大させる機能（即ちエンハンサー機能）を有するＤＮＡを、例えば、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成する方法、エンハンサー機能を有する塩基配列を元に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うことにより増幅する方法、又はゲノムから適当な制限酵素で切り出してくる方法等により取得し、取得されたＤＮＡを通常の方法、例えば、Ｓ．Ｂｏｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００１年、６巻、８６１頁等に記載される方法に準じて、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡに連結させることによっても、第二ＤＮＡを取得することができる。エンハンサー機能を有するＤＮＡとしては、例えば、アグロバクテリウムのオクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３３３番目から同１１６番目までの塩基配列の下流に、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３１８番目から同１３８番目までの塩基配列を連結した塩基配列からなるＤＮＡ、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３１８番目から同２１３番目までの塩基配列に、オクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３３３番目から同１１６番目までの塩基配列を連結した塩基配列からなるＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ７（４）：６６１−６７６（１９９５））、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質の転写開始点の上流３４３番目から同９１番目までの塩基配列からなるＤＮＡ（Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：８１０−８１２（１９８５））、トマトのリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃ−３Ａ）の転写開始点の上流１０９９番目から同２０５番目までの塩基配列からなるＤＮＡ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １：２１７−２２７（１９９０））、タバコのＰＲ１ａ遺伝子の転写開始点の上流９０２番目から同２８７番目までの塩基配列（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：３５７−３６６（１９９０））、ジャガイモのプロテアーゼインヒビター遺伝子（ＰＩ−ＩＩ）の転写開始点の上流１３００番目から同１９５番目までの塩基配列からなるＤＮＡ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：６１−７０（１９９０））等が挙げられる。
【００１７】
本発明プロモーターが有する機能については、例えば、下記のようにして確認することができる。
本発明プロモーターの下流にレポーター遺伝子、例えば、ホタル由来ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子を連結し、これを必要に応じてベクターにクローニングして、後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌による感染法等の方法を用いて、例えば、タバコ野生株細胞又はシロイヌナズナ野生株細胞等の植物細胞に導入し、この細胞から植物体を再生させた形質転換植物を作出する。作出された植物体若しくはその子孫に光強度１，０００〜２，０００μＥ／ｍ２ｓの白色光を４〜２４時間照射するようなストレス処理、又は波長２２０ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線を４〜２４時間照射するようなストレス処理、又は葉組織をハサミ・シュレッダー等で切り刻んで、５℃若しくは室温で４〜２４時間インキュベートするようなストレス処理、又は植物体を４０〜４５℃の温度条件下で１〜８時間インキュベートするようなストレス処理、又は植物体を１〜５℃の温度条件下で１〜８時間インキュベートするようなストレス処理、又は５０〜２００ｍＭＮａＣｌ水溶液を潅水して１〜２週間生育させるようなストレス処理、又は植物体に青枯れ病菌等の植物病原菌を感染させて１〜３日間生育させるようなストレス処理、又は１〜１０ｍＭのサリチル酸水溶液を葉にスプレーするようなストレス処理等を施した後、葉組織のＬＵＣ活性を測定するか、又は葉組織に１ｍＭルシフェリン水溶液を噴霧して１０分後に、例えば、浜松フォトニクス社のＡｒｇｕｓ画像解析装置を用いて発光を観察する。これらの結果を、ストレス処理していない対照体と比較することによって、即ち、レポーター遺伝子の発現量を比較することによって、本発明プロモーターの機能を確認することができる。尚、レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子に限らず、β−グルクロニダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセイントプロテイン遺伝子等を使用することもできる。
【００１８】
本発明プロモーターを用いて所望の外来遺伝子を植物細胞内で発現させる場合には、本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡを利用すればよい。ここで所望の外来遺伝子とは、植物で発現させようとする外来遺伝子であって、例えば、酵素、貯蔵タンパク質、抗体、受容体、転写調節因子、シグナル伝達因子等のタンパク質をコードする遺伝子があげられ、本発明プロモーターの下流に目的に応じてセンス方向又はアンチセンス方向に当該遺伝子を結合するとよい。植物ターミネーターとしては、導入される植物において転写終結作用を有するＤＮＡであればよく、例えば、アグロバクテリウム属細菌のＴｉ−プラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＮＯＳ）、ニンニクウイルスＧＶ１、ＧＶ２等の植物ウイルス由来のプロモーター等をあげることができる。尚、「機能可能な形で」とは、本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡを導入し植物細胞を形質転換させたときに、所望の外来遺伝子が、本発明プロモーター及び植物ターミネーターの制御下に発現するように、前記プロモーター及び前記ターミネーターと結合された状態にあることを意味する。
【００１９】
本発明ベクターに使用できるベクターとしては、大腸菌、酵母、植物細胞等の宿主細胞内で増殖可能なプラスミド、ファージ、ファージミッド等があげられ、宿主細胞の種類や用途に応じて選択することができる。
前記ベクターとしては、本発明ベクターが導入された宿主細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。また、本発明プロモーター及び所望の外来遺伝子が機能可能な形で連結されるような位置、例えば、本発明プロモーターを挿入する部位の下流の位置に遺伝子挿入部位が設けられている本発明ベクターは、所望の外来遺伝子を細胞内で発現させるためのベクターとして各種ベクターの構築に好ましく利用することができる。ここで「遺伝子挿入部位」とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明ベクター上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましく、遺伝子挿入部位としては、例えば、ｐＢＩＮ１９（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１（１９８４））に記載されるような遺伝子挿入部位（マルチクローニング部位）等をあげることができる。前記ベクターとして、より具体的には、例えば、ｐＵＣ系プラスミド［ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（宝酒造社）等］、ｐＳＣ１０１系プラスミド、Ｔｉ−プラスミド［ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）等］、フルースクリプト系ファージミッド［ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋／−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等］、Ｍ１３系ファージ［ｍｐ１０、ｍｐ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、λ系ファージ［λｇｔ１０、ｇｔ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、コスミッド類［ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等］、ｐＡＵＲ系プラスミド［ｐＡＵＲ１１２（宝酒造社）等］等があげられる。
さらに、本発明ベクターは、本発明プロモーターの下流に植物ターミネーターが機能可能な形で挿入されていてもよい。
【００２０】
本発明ベクターは、前記ベクターに、通常の方法で本発明プロモーターを組み込むことによって作製することができる。例えば、１２１−ＬＵＣ（福田裕穂、西村幹夫、中村研三監修：植物の細胞を観る実験プロトコール（秀潤社）１９６−２００頁）、ｐＢＩ１０１．３（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ｐＢＩＮ１９（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１（１９８４））等のベクターの遺伝子挿入部位に、本発明プロモーターを挿入してもよい。また、当該遺伝子挿入部位に、本発明プロモーター及び植物ターミネーターを機能可能な形で挿入することによっても作製することができる。
さらに、通常の方法により所望の外来遺伝子をベクターにおける本発明プロモーターの下流に機能可能な形で挿入することによって、所望の外来遺伝子を有する本発明ベクターを作製できる。また、本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡをカセットとして通常の方法により作製して、これを、例えば、１２１−ＬＵＣ（福田裕穂、西村幹夫、中村研三監修：植物の細胞を観る実験プロトコール（秀潤社）１９６−２００頁）、ｐＢＩ１０１．３（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ｐＢＩＮ１９（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１（１９８４））等のベクターの遺伝子挿入部位に挿入してもよい。
【００２１】
本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなることを特徴とするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むことを特徴とするベクター、或いは、本発明プロモーターを含むことを特徴とするベクター（即ち、本発明ベクター）又は本発明プロモーターの下流に遺伝子挿入部位及び植物ターミネーターを含むことを特徴とする前記ベクターのいずれかのベクターを、例えば、Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．，Ｆ．，Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ著、モレキュラー・クローニング第２版（１９８９）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法等により大腸菌やアグロバクテリウム菌に導入することによって、宿主細胞が微生物である本発明形質転換体が作製できる。かかる形質転換体は、本発明プロモーター又は前記の所望の外来遺伝子の調製や植物細胞への導入等に使用できる。
【００２２】
宿主細胞が植物である場合における本発明形質転換体（以下、本発明形質転換植物と記すこともある。）は、下記のようにして作製することができる。例えば、本発明プロモーター単独、又は本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡのカセット又は本発明ベクターを、例えば、パーティクルガン法（遺伝子銃による植物細胞への直接導入法）、アグロバクテリウム菌による感染法（アグロバクテリウム菌を植物組織に感染させる方法）、電気的導入法（植物プロトプラストへの電気的導入法）等の方法により植物の細胞に導入することによって形質転換された植物の細胞を作製することができる。
【００２３】
本発明形質転換植物を作製する場合において宿主細胞として使用できる植物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の単子葉植物、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ、ミヤコグサ等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、キャベツ、ナタネ、カラシナ、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、メロン、カボチャ、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、レタス等のキク科植物等の双子葉植物等をあげることができる。
【００２４】
形質転換された植物の細胞は、例えば、Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ， Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｅｒｏｏｔ ａｎｄ Ｄ．Ｐ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ著：プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｐｒｅｓｓ （１９８８））、島本功、岡田清孝監修：モデル植物の実験プロトコール（イネ、シロイヌナズナ編）（秀潤社）（ＩＳＢＮ４−８７９６２−１５７−９ Ｃ３３４５、１９９６）７８−１４３頁或いは内宮博文著（植物遺伝子操作マニュアル、トランスジェニック植物の作り方（講談社サイエンティフィック））１９９０、ＩＳＢＮ４−０６−１５３５１３−７ Ｃ３０４５）２８−３３に記載されている通常の植物組織培養技術において用いられる方法に準じて再分化することによって、当該植物細胞由来の形質転換された植物の個体又はその一部を得ることができる。さらに、前記のようにして得られる植物の個体を栽培し自殖させることにより、当該植物の個体の子孫が得られる。
【００２５】
尚、本発明形質転換植物より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを制限酵素で切断することにより得られたＤＮＡに対して、宿主細胞の形質転換に用いたＤＮＡ又はその一部をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、所望の外来遺伝子の導入有無を確認することができる。また、本発明形質転換植物より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、本発明プロモーターの制御下に発現させようとする所望の外来遺伝子のセンス配列又はアンチセンス配列を有するＤＮＡをプローブとして用いたノザンハイブリダイゼーションを行うことにより、所望の外来遺伝子の発現を調べることができる。
【００２６】
本発明形質転換植物では、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩、病害、植物ホルモン処理等のストレスである外的要因に惹起され、導入された所望の外来遺伝子が発現されることにより、所望の有用形質を発現し得る。
外的要因としては、例えば、光強度１，０００μＥ／ｍ２ｓ〜２，０００μＥ／ｍ２ｓの白色光照射、波長２２０ ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線照射、ハサミ等による人為的傷害又は有害生物等による傷害、５０ｍＭ〜２００ｍＭ ＮａＣｌ処理、１〜５℃の低温、４０℃〜４５℃の高温、青枯れ病菌（Ｒａｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、いもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）等の植物病原菌の感染による罹病、１〜１０ｍＭのサリチル酸水溶液を葉にスプレーする植物ホルモン処理等のストレスをあげることができる。所望の外来遺伝子が、例えば、ワクチンとなるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（コレラ毒素タンパク質遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：２９２−２９７（１９９８））、ＨＢ抗原遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１１６７−１１７１（２０００））等）、抗体となるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（抗ヘルペスシンプレックスウイルスＩｇＧ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：１３６１−１３６４（１９９８））等）、医薬となるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（コラーゲン遺伝子（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４６９：１３２−１３６（２０００））、ラクトフェリン遺伝子（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．， ９：７１−７８（２０００））等）、ダイズのグリシニン遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６１（５）：７９４−７９９（１９９７））、β−コングリシニン遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６１（５）：７９４−７９９（１９９７））、ブラジルナッツの２Ｓアルブミン遺伝子（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６（３）：４３７−４４８（１９９１））、大腸菌等のｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ 、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ遺伝子（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １７８（１４）：４１２２−４１３０（１９９６））等の場合には、例えば、植物の収穫前又は収穫後に、強光、ＵＶ、葉組織をハサミ・シュレッダー等で切り刻むことによる傷害、低温、高温、高塩、サリチル酸等の植物ホルモン処理等のストレスを与えた後、形質転換体が産生した外来遺伝子産物を回収することにより、所望の外来遺伝子に対応したタンパク質を取得することができる。
また、所望の外来遺伝子が、例えば、ストレス耐性付与遺伝子（大腸菌カタラーゼ遺伝子（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４２８：４７−５１ （１９９８））、葉緑体型スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：１６２９−１６３３（１９９３））、浸透圧調整物質であるベタインの合成に関わるコリンオキシダーゼ遺伝子（ＣＯＤ）（Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １２：１３３−１４２（１９９７））、低温誘導性遺伝子の発現制御を担っている転写因子遺伝子（ＣＢＦ１或いはＤＲＥＢ１）（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０：１０４−１０６ （１９９８）、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １０：１３９１−１４０６ （１９９８））、）等の場合には、本発明形質転換植物では、強光、塩、低温、乾燥等に対する抵抗性が増強され得る。
また、所望の外来遺伝子が、例えば、植物防御遺伝子（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（ＰＡＬ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７（１）：３３５−３４１（１９８７））、カルコンシンターゼ遺伝子（ＣＨＳ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７（１）：３３５−３４１（１９８７））、キチナーゼ遺伝子（ＣＨＴ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２５４（１１）：４９０１−４９０７（１９７９））、リゾチーム遺伝子（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２４４（６）：１３９９−１４０９（１９６９））、ＰＲタンパク質遺伝子（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６（３）：１７７−１８５（１９８６））等）、病害抵抗性遺伝子（Ｐｔｏ遺伝子（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ９３（２３）：１３３９３−１３３９７（１９９６）等）、ウイルスコートタンパク質遺伝子（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６１（２）：５６１−５６９（１９８７））等の場合には、本発明形質転換植物では、細菌、カビ、ウイルス等に対する抵抗性が増強され得る。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （本発明プロモーター（ＲＨＬ４１プロモーター）の調製及びＬＵＣ発現ベクターの構築）
播種後３週間目のシロイヌナズナ葉部１００ｍｇをエッペンドルフチューブ中で、液体窒素を用いて凍結させ、これからＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いてゲノム遺伝子のＤＮＡを調製した。調製されたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、かつ、配列番号５で示される塩基配列（ＰＲ−２Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号６で示される塩基配列（ＰＲ−ＲＢ）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、約１．９ｋｂのＲＨＬ４１プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた後、増幅されたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該ＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。次にバイナリーベクター１２１−ＬＵＣ（福田裕穂、西村幹夫、中村研三監修：植物の細胞を観る実験プロトコール（秀潤社）１９６−２００頁）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該バイナリーベクターに相当するＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。精製された上記両者のＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターを得た。
当該ベクターを作製した過程を図１に示した。
【００２８】
実施例２ （ＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーターの調製及び発現ベクタ−の構築）
第二ＤＮＡをクローニングするために、実施例１で得られた１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターＤＮＡ １０ｎｇを鋳型として、かつ、配列番号７で示される塩基配列（ＰＲ−１Ｈ）若しくは配列番号８で示される塩基配列（ＰＲ−５Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号１０で示される塩基配列（ＰＲ−９Ｂ）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、それぞれ、約０．９ｋｂ、約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させた後、増幅されたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該ＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。次にバイナリーベクターｐＢＩ１２１−ＬＵＣをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該バイナリーベクターに相当するＤＮＡ断片を切り出し、さらにＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。精製された上記両者のＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターを得た。当該ベクターをＢａｍＨＩで完全消化した後、ＢＡＰ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化させた。
第一ＤＮＡである３５Ｓミニマムプロモーターを得るために、配列番号２で示される塩基配列（３５Ｓ（＋））からなるＤＮＡ及び配列番号３で示される塩基配列（３５Ｓ（−））からなるＤＮＡを合成した。それぞれのＤＮＡ溶液濃度を１００μＭに調整し、それぞれの調整されたＤＮＡ溶液３μｌずつをエッペンドルフチューブ内で混合した。当該エッペンドルフチューブを９４℃にて３分間加熱した後、室温に放置してアニーリングさせた。反応液をＢａｍＨＩで完全消化した後、エタノール沈殿した。一方、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶで完全消化した後、エタノール沈殿した。エタノール沈殿により得られたそれぞれのＤＮＡ沈殿をＴＥに溶解した。これらをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、３５Ｓミニマムプロモーターが挿入されたベクターを得た。当該ベクターをＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから３５Ｓミニマムプロモーターに相当するＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片と、上記の脱リン酸化させた０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ又は０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターとをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、３５Ｓミニマムプロモーターが正方向又は逆方向に挿入された発現ベクターを得た。３５Ｓミニマムプロモーターの向きを確認するために、いくつかのカナマイシン耐性株から得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１１で示される塩基配列（３５Ｓ−ｍｉｎ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ１）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、ＤＮＡ断片の増幅が認められるものを３５Ｓミニマムプロモーターが正方向に挿入された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現ベクターとして選定した。得られた当該ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した後、これをＢｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化し、さらにライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてセルフライゲーション処理を行うことにより、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターを得た。当該ベクターを作製した過程を図２〜３に示した。
【００２９】
実施例３ （ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターの調製と発現ベクタ−の構築）
第一ＤＮＡであるＧ６ミニマムプロモーターを得るために、ｐＢＩＣＲ１６Ｇ６ＰＴ（特開２０００−１６６５７７号公報に記載される）１０ｎｇを鋳型として、かつ、配列番号１３で示される塩基配列（Ｇ６−１）からなるＤＮＡと配列番号１４で示される塩基配列（Ｇ６−２）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、約２２０ｂｐのＧ６ミニマムプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた。増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩで完全消化した後、エタノール沈殿した。実施例２で作製された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ又は０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターとをＢａｍＨＩで完全消化した後、ＢＡＰ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化させた。精製された、Ｇ６ミニマムプロモーター領域を含むＤＮＡ断片と、上記の脱リン酸化させた０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ又は０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターとをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、Ｇ６ミニマムプロモーターが正方向又は逆方向に挿入された発現ベクターを得た。Ｇ６ミニマムプロモーターの向きを確認するために、いくつかのカナマイシン耐性株から得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１４で示される塩基配列（Ｇ６−１）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ１）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、ＤＮＡ断片の増幅が認められるものをＧ６ミニマムプロモーターが正方向に挿入された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ発現ベクターとして選定した。得られた当該ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した後、これをＢｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化し、さらにライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてセルフライゲーション処理を行うことにより、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターを得た。当該ベクターを作製した過程を図４に示した。
【００３０】
実施例４ （形質転換タバコの育成）
本発明形質転換植物の作製は、Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ， Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ａｎｄ Ｄ．Ｐ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ著；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｋｌｉｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：６６３６−５５４０（１９８８）に記載される方法に準じて行った。
ＹＥＢ培地中、３０℃にて一晩振とう培養したアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４を、新たなＹＥＢ培地に植え継ぎ、ＯＤ６００が０．６になるまで培養した。以下の操作は低温室内で行った。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、回収された菌体を冷やしておいた滅菌蒸留水で懸濁した後、再度遠心分離により菌体を回収した。このような洗浄操作を２回繰り返した後、滅菌蒸留水を１０％グリセロール溶液に代えて同様の洗浄操作を行った。こうして得られた菌体を最終的に４００倍濃縮になるように１０％グリセロール溶液に懸濁した。このようにして調製されたコンピテントセルに、上記で構築された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ及び１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣを、エレクトロポレーション法を用いて導入した後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＥＢプレート上で生育させることにより、生育してきたカナマイシン耐性クローン７株（０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４）を取得した。各カナマイシン耐性クローンをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＥＢ液体培地で、３０℃にて２晩振とう培養した。得られた培養液から、ＱＩＡ−ｐｒｅｐ ｓｐｉｎカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４又は３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１１で示される塩基配列（３５Ｓ−ｍｉｎ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、また０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４又はＧ６ｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１４で示される塩基配列（Ｇ６−１）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、また１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号９で示される塩基配列（ＰＲ−６Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣそれぞれがアグロバクテリウムに導入されていることをＤＮＡ断片の増幅により確認した。
無菌培養されたタバコの葉部切片（０．７ｃｍ角）を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＥＢ液体培地で３０℃にて１晩培養された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４或いは１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４の各培養液に２分間浸した後、当該葉部切片から滅菌されたろ紙で余分な水分を除いた後、これをＭＳ−ＮＢ培地上に置いた。２５℃にて１２時間明所、８時間暗所の条件下で２日間培養した後、当該葉部切片をＭＳ液体培地で洗浄し、ＭＳ−ＮＢＣ培地上に置いた。さらに前記と同様な条件下で７日間培養した後、選択薬剤を含むＭＳ−ＮＢＣＫ培地に当該葉部切片を移し、さらに約１ヶ月間程度静置培養し、再生されたシュートを当該葉部切片より切断し、これをＭＳ−ＣＫ培地に植え継いだ。約１ヶ月間後、発根した個体を土壌に植えかえることにより、自殖種子（Ｔ１世代）を得た。
【００３１】
実施例５ （形質転換シロイヌナズナの育成）
本発明形質転換植物の作製は、島本功、岡田清孝監修：モデル植物の実験プロトコール（イネ、シロイヌナズナ編）（秀潤社）９９−１０４頁に記載される方法に準じて行った。
実施例４に記載される方法を用いて、実施例１で得られた１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株に導入することにより、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４を取得した。さらに実施例４に記載される方法と同様にして、配列番号９で示される塩基配列（ＰＲ−６Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、それぞれのアグロバクテリウムに上記ベクターが導入されていることを確認した。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＳ）種子を滅菌した後、これをＢＭ培地に播種し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて１週間培養した。発芽した実生を培地から引き抜き、これをＢＭ培地上に並べ、さらに１週間培養した。根をハサミで切り出して束にして、約１ｃｍ長さに切った後、これをＣＩＭ培地に置床し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて３〜５日間培養した。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１．５ｍｌで３０℃にて２晩培養した１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４の培養液をＬＢ培地で１０倍希釈する（ＯＤ６００を０．１〜１とする）。さらにこの培養液をＢ５塩溶液により５倍希釈し、当該希釈液にＣＩＭ培地で培養された根切片を２〜３分間浸漬した。浸漬された根切片から滅菌ろ紙で余分な水分を除いた後、これをＣＩＭ培地に移し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて２日間培養した。培養された根切片をクラフォラン２５０μｇ／ｍｌを含む洗浄液の入ったシャーレに移し、これを５分間程軽く混ぜた後、当該根切片から滅菌ろ紙で余分な水分を除いた。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択用ＳＩＭ培地に移し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて培養を続けた。２週間毎にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む新しい選択用ＳＩＭ培地に移し、シュートが再生してきたら切り取ってＲＩＭ培地に移植し、引き続き培養した。発根した個体を無菌培養用ポット（直径１０ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に入れたカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ジェランガム０．２５％を含むＭＳ培地に移植して、採種できるまで培養した。得られた種子（Ｔ１世代）をカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ジェランガム０．２５％を含むＭＳ培地に無菌播種し、カナマイシン耐性の実生を土入りのポットに移植・馴化させ、採種できるまで栽培を行うことにより、自殖種子（Ｔ２世代）を得た。
【００３２】
実施例６ （ＲＨＬ４１／Ｇ６又はＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける傷害誘導発現解析）
実施例４で得られた７種類の形質転換タバコの自殖種子（Ｔ１世代）を１０％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に５分間浸し、次いで、滅菌蒸留水で４〜５回洗浄した後、これをカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ培地に播種し、２３℃にて１６時間明所、８時間暗所の条件下で２週間生育させた。カナマイシン耐性を示した植物体（約３個体）の葉をピンセットで押しつぶすことにより、傷害処理を施した。６時間後に傷害処理された植物及び未処理の植物を採取し、採取された植物材料におけるルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）キットを用いて測定した。また各植物試料の抽出液のタンパク質含量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いて測定し、測定されたタンパク質含量に基づきタンパク質当りの活性を算出した。その結果を図５に示した。１．９ｋｂ ＲＨＬ４１プロモーターの場合には、傷害処理により未処理の１９倍の誘導活性が認められ、当該プロモーターが傷害誘導性を有することが確認された。また、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターの場合には、傷害処理により未処理の２〜７倍の誘導活性が認められた。一方、ＲＨＬ４１プロモーターを付加していない３５Ｓミニマムプロモーター単独又はＧ６ミニマムプロモーター単独の場合には、上記のような高い誘導活性は認められなかった。これらの結果から、ＲＨＬ４１／３５Ｓ又はＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターも傷害誘導性を有することが確認された。また、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターの傷害誘導時の活性は、１．９ｋｂＲＨＬ４１プロモーターの場合よりも、２．７〜７倍高いことが確認された。
【００３３】
実施例７ （０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける種々のストレス誘導発現解析）
０．９ｋｂＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター／ＬＵＣを発現する組み換えタバコを用いて、傷害、高温又はＵＶ等のストレスによるプロモーター活性の誘導性を調査した。実施例４に記載される方法においてＭＳ−ＣＫ培地で選抜している組換え植物シュート（Ｔ０世代）を発根させ、発根した個体を鉢上げ・馴化させた。傷害ストレスの場合には、ハサミで葉の葉柄部分を残して幅５〜１０ｍｍの切り込みを入れた。高温ストレスの場合には、６０〜１００μＥ／ｍ２ｓの光強度、４５℃の温度の条件下で植物をインキュベートした。ＵＶストレスの場合には、波長が３０２ｎｍに設定されたトランスイルミネーター（３ＵＶＴＭｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ｕｐｌａｎｄ社）を逆さまに設置することにより上方１４〜１７ｃｍの位置から植物にＵＶを照射した。各ストレス付与において、経時的に葉を採取し、採取された試料を液体窒素にて凍結させた。凍結された葉試料を乳鉢を用いて破砕した後、当該試料におけるルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）キットを用いて測定した。また各植物試料の抽出液のタンパク質含量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いて測定し、測定されたタンパク質含量に基づきタンパク質当りの活性を算出した。その結果を図６に示した。各ストレス付与によりＬＵＣ活性が認められ、０．９ｋｂＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター活性は傷害、高温、ＵＶ等のストレスにより誘導されることが確認された。
【００３４】
実施例８ （ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける種々のストレス応答解析）
１．９ｋｂＲＨＬ４１／ＬＵＣを発現する組み換えシロイヌナズナを用いて、強光、ＵＶ、傷害、高温（４０℃）、青枯れ病菌感染、植物ホルモン（ＪＡ、ＡＢＡ、ＳＡ）処理及びこれらストレス付与の結果生じるだろうと考えられている過酸化水素によるストレスにおけるプロモーター活性の誘導性を調査した。０．５％ショ糖を含むＭＳ液体培地を２４穴プレートに１ｍｌ入れ、そこに滅菌された組換え植物（Ｔ２世代、ホモライン）の種子を約２０粒ずつ加え、１５０ｒｐｍにて回転培養した。７日目に０．５ｍｌずつ液体培地を追加し、１０日目に実験に用いた。液体培地に５０μＭ ジャスモン酸（ＪＡ）、１００μＭ アブシジン酸（ＡＢＡ）、１ｍＭサリチル酸（ＳＡ）、１０〜２０ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）となるよう添加して培養した。また、ＢＧ培地で一晩培養した青枯れ病菌ＪＣＭ１０４８９を蒸留水で洗浄した後、ＯＤ６００が０．２５になるように調製し、調製された菌懸濁液と液体培地とを交換して培養した。
また、組換え植物（Ｔ２世代、ホモライン）の種子を鉢に播き、６０〜１００μＥ／ｍ２ｓの光強度（明所／暗所＝１６時間／８時間）、２３℃の温度、７０％の湿度の条件下で３週間生育させ、実験に用いた。強光処理の場合には、植物に光環境シミュレーター（ＴＧＥ−２Ｓ、タバイエスペック社）を用いて２，０００μＥ／ｍ２ｓの光強度の強光を照射した。ＵＶ処理の場合には、波長が３０２ｎｍに設定されたトランスイルミネーター（３ＵＶＴＭｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ｕｐｌａｎｄ社）を逆さまに設置することにより上方２５ｃｍの位置から植物にＵＶを照射した。傷害処理の場合には、ピンセットで葉をつまむことにより、葉組織を破壊した。高温処理の場合には、６０〜１００μＥ／ｍ２ｓの光強度、４０℃の温度の条件下で植物をインキュベートした。
各処理につき、経時的に葉を採取し、採取された葉試料を液体窒素にて凍結させた。凍結された葉組織をエッペンドルフチューブ内にて破砕した後、当該試料でのＬＵＣ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （プロメガ社）を用いて測定した。また各植物試料の抽出液のタンパク質含量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いて測定し、測定されたタンパク質含量に基づきタンパク質当りの活性を算出した。その結果を図７〜１３に示した。各処理ともに、ＬＵＣ活性が認められ、ＲＨＬ４１プロモーター活性はこれらのストレス処理により誘導されることが確認された。
【００３５】
実施例において用いられた培地の組成を示す。
（Ａ）タバコ用培地
（１）ＭＳ寒天培地
ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ ＡＮＤ ＳＫＯＯＧ ＢＡＳＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社）４．４ｇ、ショ糖３０ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、アガー（和光純薬）を８ｇ添加した後、オートクレーブ滅菌した培地である。
（２）ＭＳ−ＮＢ寒天培地
ＭＳ寒天培地に、１−ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）０．１μｇ／ｍｌ、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）１．０μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（３）ＭＳ−ＮＢＣ寒天培地
ＭＳ―ＮＢ寒天培地に、クラフォラン３００μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（４）ＭＳ−ＮＢＣＫ寒天培地
ＭＳ―ＮＢ寒天培地に、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クラフォラン３００μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（５）ＭＳ−ＣＫ寒天培地
ＭＳ寒天培地に、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クラフォラン３００μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（Ｂ）シロイヌナズナ用培地
（１）ＢＭ培地
ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ ＡＮＤ ＳＫＯＯＧ ＢＡＳＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社）４．４ｇ、ＭＥＳ（和光純薬）０．５ｇ、ショ糖１０ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、ジェランガム（ｘｘ）２．５ｇを添加した後、オートクレーブ滅菌した培地である。
（２）ＣＩＭ培地
ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ ＡＮＤ ＳＫＯＯＧ ＢＡＳＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社）４．４ｇ、ＭＥＳ（和光純薬）０．５ｇ、グルコース２０ｇ、２，４−Ｄ０．５ｍｇ、カイネチン０．１ｍｇを蒸留水１Ｌに溶かし、１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、ジェランガム（ｘｘ）２．５ｇを添加した後、オートクレーブ滅菌した培地である。
（３）選択用ＳＩＭ培地
ＣＩＭ培地の２，４−Ｄとカイネチンの代わりに、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）０．１５ｍｇ、Ｎ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（２ｉｐ）０．５ｍｇ、カナマイシン５０ｍｇを添加した培地である。
（４）ＲＩＭ培地
ＣＩＭ培地の２，４−Ｄとカイネチンの代わりに、３−インドールブチル酸（ＩＢＡ）０．５ｍｇを添加した培地である。
（Ｃ）細菌用培地
（１）ＬＢ培地
バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ、バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整し、オートクレーブ滅菌した培地である。プレートの場合にはこれに１５ｇの寒天を添加して用いる。（２）ＹＥＢ培地
バクトビーフエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）５ｇ、バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ、ポリペプトン５ｇ、ショ糖５ｇ及び１０Ｍ ＮａＯＨ ０．２ｍｌを蒸留水１Ｌに溶かし、オートクレーブ滅菌する培地である。オートクレーブ滅菌した後、フィルター滅菌された１Ｍ ＭｇＳＯ４を０．２ｍｌ添加した培地である。プレートの場合にはこれに１５ｇの寒天を添加して用いる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、発現誘導型プロモーター等が提供可能になった。
【００３７】
［配列表フリーテキスト］
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
【００３８】
【配列表】
【００３９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明ベクターである１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図２】図２は、本発明ベクターである０．９ｋｂ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、３５Ｓは３５Ｓミニマムプロモーターを示し、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図３】図３は、本発明ベクターである３５ｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、３５Ｓは３５Ｓミニマムプロモーターを示し、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図４】図４は、本発明ベクターである０．９ｋｂ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ発現ベクター、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、Ｇ６はＧ６ミニマムプロモーターを示し、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図５】図５は、ＲＨＬ４１／Ｇ６及びＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける傷害誘導発現解析の結果を示す図である。図中の横軸に記載される各プロモーターは、左から順に、３５Ｓミニマムプロモーター単独（３５Ｓｍｉｎ）、Ｇ６ミニマムプロモーター単独（Ｇ６ｍｉｎ）、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーター（０．４ｋ−Ｇ６）、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター（０．４ｋ−３５Ｓ）、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーター（０．９ｋ−Ｇ６）、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター（０．９ｋ−３５Ｓ）、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１プロモーター（１．９ｋ）である。図中の横軸に記載される各プロモーターにおける左側の棒グラフは未処理区での誘導活性を表しており、右側の棒グラフは傷害処理区での誘導活性を表している。
【図６】図６は、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける種々のストレス誘導発現解析の結果を示す図である。図中の横軸に記載される各ストレスは、左から順に、未処理、傷害ストレス、高温ストレス、ＵＶストレスである。また、数字とｈとで示された記載は、各ストレスにおける処理時間を表している。
【図７】図７は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける植物ホルモン処理によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある英字は植物ホルモン名を表しており、ＪＡはジャスモン酸、ＡＢＡはアブシジン酸、ＳＡはサリチル酸を表している。また、数字とｈとで示された記載は、各ストレスにおける処理時間を表している。
【図８】図８は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける過酸化水素によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図９】図９は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける青枯れ病菌感染によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１０】図１０は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける強光によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１１】図１１は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおけるＵＶによるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１２】図１２は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける傷害によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１３】図１３は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける高温によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、発現誘導型プロモーター及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の細胞へ遺伝子を導入し発現させることによって有用形質を付与された形質転換植物の作出又は有用物質の植物における生産等が試みられている。このような形質転換植物においては、通常、導入される遺伝子は植物細胞において機能可能なプロモーターの制御下に置かれ、当該プロモーターによってその発現量や発現時期等が調節される。
形質転換植物に有用形質を付与する場合又は形質転換植物を利用して有用物質を生産させる場合において、その形質を常時発現させると植物にストレスを与えて生育阻害や生産性の低下を引き起こす場合があり、植物の収穫時又は環境ストレス付加時等の特定の時期に、例えば、傷害、強光、熱等の外的要因に惹起されて当該形質が発現させることが好ましい場合がある。このような場合には、かかる特定条件下に当該遺伝子を発現させるような発現誘導型プロモーターを使用することがよい。
【０００３】
【特許文献１】
特開２０００−６０５５８号公報
【特許文献２】
特開２０００−１１６２５９号公報
【特許文献３】
特開２０００−１１６２６０号公報
【特許文献４】
特開２００２−２７２４６９号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来知られている発現誘導型プロモーターは限られており、新たな発現誘導型プロモーターの開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは鋭意検討を行った結果、新たな発現誘導型プロモーターを見出し本発明に至った。
【０００６】
本発明は、
１．下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター（以下、本発明プロモーターと記すこともある。）、
（１）第一ＤＮＡ：
ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する塩基配列を有するＤＮＡ
（２）第二ＤＮＡ：
下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ；
２．下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター、
（１）第一ＤＮＡ：
下記の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基番号１７５２から塩基番号１８８６までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）ゲノム遺伝子が有するプロモーター領域から切り出される一部のＤＮＡであって、当該ＤＮＡにおける３’末端は転写開始点に相当するヌクレオチドであり、かつ、当該ＤＮＡにおける５’末端は前記３末’端より４６〜２００塩基上流の位置にあるヌクレオチドであって、ミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡ。
（２）第二ＤＮＡ：
下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ；
３．前項１記載の発現誘導型プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなることを特徴とするＤＮＡ；
４．前項１記載の発現誘導型プロモーターを含むことを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
５．前項１記載の発現誘導型プロモーターの下流に遺伝子挿入部位及び植物ターミネーターを含むことを特徴とする前項３記載のベクター；
６．前項３記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター；
７．前項１記載の発現誘導型プロモーターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
８．前項３記載のＤＮＡ又は請求項５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
９．前項４及び５記載のいずれかのベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１０．宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする前項７〜９記載のいずれかの形質転換体；
１１．前項１記載の発現誘導型プロモーター、前項２記載のＤＮＡ又は前項４及び５記載のいずれかのベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
１２．前項８記載の形質転換体を培養又は育成する工程、外的ストレス処理を与えた後、形質転換体が産生した外来遺伝子産物を回収する工程を有することを特徴とするタンパク質の取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）；１３．下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ；
１４．配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、例えば、Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．，Ｆ．，Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、及びＤ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ著、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＩＲＬ発行、１９８５年等に記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
【０００８】
ゲノム遺伝子が有するプロモーターは、通常、（１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する塩基配列を有するＤＮＡ、例えば、転写に必須な塩基配列を含む領域であって、一般的には転写開始点から上流１０塩基付近に存在する共通配列及び上流３５塩基付近に存在する共通配列を含むミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡからなる領域と、（２）前記（１）の領域からさらに５’上流側に位置して、前記ゲノム遺伝子の発現における時期特異性、組織特異性、発現量等を決める制御プロモーター機能を有するＤＮＡからなる領域（所謂、シス制御領域）とに大きく２分できる。
本発明プロモーターは、ミニマムプロモーター機能を有するような第一ＤＮＡ、及び、特定な塩基配列からなり、制御プロモーター機能を有するような第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを基本的な特徴としている。このようなプロモーターは、発現誘導型プロモーター、特に各種ストレス処理の結果生じるだろうと考えられている過酸化水素によるストレスに対してプロモーター活性を誘導するようなプロモーターとして利用することができる。
【０００９】
本発明プロモーターにおける第一ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する塩基配列を有するＤＮＡであって、例えば、コアプロモーターとか、ミニマムプロモーターともいわれ、通常、ゲノム遺伝子の転写開始部位付近の比較的狭い部分にみられる塩基配列を有するＤＮＡである。このようなＤＮＡが有する必須な領域の塩基配列としては、例えば、ＴＡＴＡボックス及び転写開始点近傍の塩基配列、好ましくは約５０ｂｐ程度の短い塩基配列があげられる。
本発明プロモーターにおける第一ＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号１の塩基番号１７５２から塩基番号１８８６までの塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）ゲノム遺伝子が有するプロモーター領域から切り出される一部のＤＮＡであって、当該ＤＮＡにおける３’末端は転写開始点に相当するヌクレオチドであり、かつ、当該ＤＮＡにおける５’末端は前記３末’端より４６〜２００塩基上流の位置にあるヌクレオチドであって、ミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡ、のいずれかのＤＮＡ等をあげることができる。
より具体的には、第一ＤＮＡとしては、ジンクフィンガータンパク質遺伝子ｚａｔ１２（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ３３：６１５−６２４（１９９７））の翻訳開始点（３’末端）から上流１３５ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）までに存在する領域、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流４６ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１５ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、ニンジン根部タンパク質Ｇ６プロモーター（特開２０００−１６６５７７号公報に記載される）の翻訳開始点（３’末端）から上流１９６ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）までに存在する領域、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子の転写開始点より上流３３ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１５ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、ニワトリオボアルブミン遺伝子の転写開始点より上流４０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＹａサブユニット遺伝子の転写開始点より上流１６４ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流６６ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域、チトクロムＰ４５０１Ａ１遺伝子の転写開始点より上流７０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（５’末端）から前記転写開始点より下流１２０ｂｐの位置にあるヌクレオチド（３’末端）までに存在する領域等をあげることができる。さらに具体的には、例えば、配列番号１の塩基番号１７５１から塩基番号１８８６までの塩基配列、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等があげられる。
【００１０】
本発明プロモーターにおける第二ＤＮＡは、（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ、又は、（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ、のいずれかのＤＮＡである。
尚、本発明プロモーターは、第二ＤＮＡを一つ含んでいてもよく、また、同一若しくは相異なる複数の第二ＤＮＡを含んでいてもよい。さらに、例えば、エンハンサー機能等の特定機能を有するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ等のＤＮＡも第二ＤＮＡとしてあげることができる。
第二ＤＮＡにおいて「配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ」とは、（Ａ）例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、６５℃でハイブリダイズさせることにより配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１ Ｘ ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、６５℃で３０分間保温した後でも当該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。また、（Ｂ）例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、（２）２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
具体的には、例えば、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと配列同一性が８０％以上であるＤＮＡ等があげられる。かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００１１】
本発明における「発現誘導型プロモーター」とは、外的要因、例えば、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩、病害、植物ホルモン処理等のストレスによって、その下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。強光ストレスとは、通常の環境条件下においては見られない、光合成能を超える程の光照射であって、例えば、２００〜２０００μＥ／ｍ２ｓの光を３０分程度以上照射するこという。またＵＶストレスとは、例えば、波長２２０ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線を３０分以上照射することをいう。また傷害ストレスとは、物理的に植物細胞が破壊されることによるストレスで、例えば、植物組織をハサミ・シュレッダー等を用いて人為的に切り刻むことをいう。また低温ストレスとは、植物の生育適温の下限を超えるような環境に植物が遭遇することによって受けるストレスで、例えば、１〜５℃の温度条件下で３０分以上インキュベートすることをいう。また高温ストレスとは、植物の生育適温の上限を超えるような環境に植物が遭遇することによって受けるストレスで、例えば、３５℃以上の温度条件下で３０分以上インキュベートすることをいう。また塩ストレスとは、土壌中或いは培地中の塩化ナトリウム濃度が上昇し、植物の生育にとって不利となることを意味し、例えば、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を潅水することをいう。また病害ストレスとは、細菌・真菌等による罹病を意味し、例えば、青枯れ病菌（Ｒａｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、いもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）等の植物病原菌が感染することを意味する。また植物ホルモン処理とは、ジャスモン酸（ＪＡ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）、サリチル酸（ＳＡ）等の植物ホルモンを植物に与えることを意味し、例えば、１〜１０ｍＭのサリチル酸水溶液を葉にスプレーすることをいう。発現誘導型プロモーターとは、これらのストレスを植物細胞又は植物体が受けることによって、下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。
【００１２】
本発明プロモーターは、例えば、シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのゲノム遺伝子のＤＮＡ等からＰＣＲ法を利用して調製することができる。
具体的には、例えば、シロイヌナズナの葉等の組織を採取し、採取された組織を液体窒素中で凍結させた後、これを乳鉢等により物理的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とする。当該組織片から通常の方法によりゲノム遺伝子のＤＮＡを抽出する。当該抽出操作は、例えば、Ｍ．Ｓｈｕｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ３５：２２５（１９８３）等に記載されているＣＴＡＢ法、Ｓ．Ｏ．Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｂｅｎｄｉｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ５：６９（１９８５）等に記載されている尿素―フェノール法等により行うことができる。得られたゲノム遺伝子のＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１の塩基番号１から塩基番号２８までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１の塩基番号１８６３から塩基番号１８８６までの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、１回〜数回のＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅することができる。また、前記オリゴヌクレオチドの５’末端側に制限酵素認識配列等を付加したオリゴヌクレオチドを前記ＰＣＲのプライマーとして用いてもよい。
【００１３】
本発明プロモーターは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。使用されるベクターとしては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターや、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等のプラスミドベクターを挙げることができる。クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ， Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ， Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）， ７４， ５４６３頁−５４６７頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法等により分析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。
【００１４】
本発明プロモーターは、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを接続することにより作製することができる。
例えば、本発明プロモーターのＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１の塩基番号８６３から塩基番号８９０までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、或いは配列番号１の塩基番号１３４９から塩基番号１３８０までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１の塩基番号１７２４から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補的は塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、１回から数回のＰＣＲを行うことにより、第二ＤＮＡを増幅することができる。また、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（＋鎖）とその相補鎖である配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（―鎖）を化学合成し、これらを試験管内でアニールさせることにより、第一ＤＮＡを調製することができる。また、例えば、ニンジン由来のゲノム遺伝子のＤＮＡ又はｐＢＩＣＲＰＴ１６Ｇ６（特開２０００−１６６５７７号公報に記載される）を鋳型として、配列番号４の塩基番号１から塩基番号２４までの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基番号１７３から塩基番号１９６までの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、１回〜数回のＰＣＲを行うことにより、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片である第一ＤＮＡを調製することができる。
このようにして得られた配列番号１の塩基番号８６３から塩基番号１７５１までの塩基配列を有するＤＮＡ断片又は配列番号１の塩基番号１３４９から塩基番号１７５１までの塩基配列を有するＤＮＡ断片の３’下流側に、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて結合させることにより、本発明プロモーターを作製することができる。
【００１５】
第二ＤＮＡは、また、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列に下記の方法によって変異を導入することによって取得することができる。例えば、Ａ．Ｇｒｅｅｎｅｒ， Ｍ．Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、１９９４年、７巻、３２−３４頁等に記載される方法に準じて配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡにランダムに変異を導入し取得してもよいし、Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年、１２巻、９４４１頁若しくはＷ．Ｋｒａｍｅｒ， Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８７年、１５４巻、３５０頁等に記載されるギャップド・デユープレックス（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）法、又は、Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ． ｏｆ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８５年、８２巻、４８８頁若しくはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８７年、１５４巻、３６７頁等に記載されるクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法等に準じて、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡに部位特異的に変異を導入し取得してもよい。また、例えば、Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９８４年、２８巻、３５１頁、Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９８５年、３３巻、１０３頁等に記載される方法に準じて、配列番号１で示される塩基配列の特定の部位を欠失させた塩基配列を有する第二ＤＮＡを取得してもよい。
【００１６】
また、例えば、植物において遺伝子の転写効率を増大させる機能（即ちエンハンサー機能）を有するＤＮＡを、例えば、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成する方法、エンハンサー機能を有する塩基配列を元に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うことにより増幅する方法、又はゲノムから適当な制限酵素で切り出してくる方法等により取得し、取得されたＤＮＡを通常の方法、例えば、Ｓ．Ｂｏｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００１年、６巻、８６１頁等に記載される方法に準じて、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡに連結させることによっても、第二ＤＮＡを取得することができる。エンハンサー機能を有するＤＮＡとしては、例えば、アグロバクテリウムのオクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３３３番目から同１１６番目までの塩基配列の下流に、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３１８番目から同１３８番目までの塩基配列を連結した塩基配列からなるＤＮＡ、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３１８番目から同２１３番目までの塩基配列に、オクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流３３３番目から同１１６番目までの塩基配列を連結した塩基配列からなるＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ７（４）：６６１−６７６（１９９５））、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質の転写開始点の上流３４３番目から同９１番目までの塩基配列からなるＤＮＡ（Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：８１０−８１２（１９８５））、トマトのリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃ−３Ａ）の転写開始点の上流１０９９番目から同２０５番目までの塩基配列からなるＤＮＡ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １：２１７−２２７（１９９０））、タバコのＰＲ１ａ遺伝子の転写開始点の上流９０２番目から同２８７番目までの塩基配列（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：３５７−３６６（１９９０））、ジャガイモのプロテアーゼインヒビター遺伝子（ＰＩ−ＩＩ）の転写開始点の上流１３００番目から同１９５番目までの塩基配列からなるＤＮＡ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：６１−７０（１９９０））等が挙げられる。
【００１７】
本発明プロモーターが有する機能については、例えば、下記のようにして確認することができる。
本発明プロモーターの下流にレポーター遺伝子、例えば、ホタル由来ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子を連結し、これを必要に応じてベクターにクローニングして、後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌による感染法等の方法を用いて、例えば、タバコ野生株細胞又はシロイヌナズナ野生株細胞等の植物細胞に導入し、この細胞から植物体を再生させた形質転換植物を作出する。作出された植物体若しくはその子孫に光強度１，０００〜２，０００μＥ／ｍ２ｓの白色光を４〜２４時間照射するようなストレス処理、又は波長２２０ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線を４〜２４時間照射するようなストレス処理、又は葉組織をハサミ・シュレッダー等で切り刻んで、５℃若しくは室温で４〜２４時間インキュベートするようなストレス処理、又は植物体を４０〜４５℃の温度条件下で１〜８時間インキュベートするようなストレス処理、又は植物体を１〜５℃の温度条件下で１〜８時間インキュベートするようなストレス処理、又は５０〜２００ｍＭＮａＣｌ水溶液を潅水して１〜２週間生育させるようなストレス処理、又は植物体に青枯れ病菌等の植物病原菌を感染させて１〜３日間生育させるようなストレス処理、又は１〜１０ｍＭのサリチル酸水溶液を葉にスプレーするようなストレス処理等を施した後、葉組織のＬＵＣ活性を測定するか、又は葉組織に１ｍＭルシフェリン水溶液を噴霧して１０分後に、例えば、浜松フォトニクス社のＡｒｇｕｓ画像解析装置を用いて発光を観察する。これらの結果を、ストレス処理していない対照体と比較することによって、即ち、レポーター遺伝子の発現量を比較することによって、本発明プロモーターの機能を確認することができる。尚、レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子に限らず、β−グルクロニダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセイントプロテイン遺伝子等を使用することもできる。
【００１８】
本発明プロモーターを用いて所望の外来遺伝子を植物細胞内で発現させる場合には、本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡを利用すればよい。ここで所望の外来遺伝子とは、植物で発現させようとする外来遺伝子であって、例えば、酵素、貯蔵タンパク質、抗体、受容体、転写調節因子、シグナル伝達因子等のタンパク質をコードする遺伝子があげられ、本発明プロモーターの下流に目的に応じてセンス方向又はアンチセンス方向に当該遺伝子を結合するとよい。植物ターミネーターとしては、導入される植物において転写終結作用を有するＤＮＡであればよく、例えば、アグロバクテリウム属細菌のＴｉ−プラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＮＯＳ）、ニンニクウイルスＧＶ１、ＧＶ２等の植物ウイルス由来のプロモーター等をあげることができる。尚、「機能可能な形で」とは、本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡを導入し植物細胞を形質転換させたときに、所望の外来遺伝子が、本発明プロモーター及び植物ターミネーターの制御下に発現するように、前記プロモーター及び前記ターミネーターと結合された状態にあることを意味する。
【００１９】
本発明ベクターに使用できるベクターとしては、大腸菌、酵母、植物細胞等の宿主細胞内で増殖可能なプラスミド、ファージ、ファージミッド等があげられ、宿主細胞の種類や用途に応じて選択することができる。
前記ベクターとしては、本発明ベクターが導入された宿主細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。また、本発明プロモーター及び所望の外来遺伝子が機能可能な形で連結されるような位置、例えば、本発明プロモーターを挿入する部位の下流の位置に遺伝子挿入部位が設けられている本発明ベクターは、所望の外来遺伝子を細胞内で発現させるためのベクターとして各種ベクターの構築に好ましく利用することができる。ここで「遺伝子挿入部位」とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明ベクター上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましく、遺伝子挿入部位としては、例えば、ｐＢＩＮ１９（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１（１９８４））に記載されるような遺伝子挿入部位（マルチクローニング部位）等をあげることができる。前記ベクターとして、より具体的には、例えば、ｐＵＣ系プラスミド［ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（宝酒造社）等］、ｐＳＣ１０１系プラスミド、Ｔｉ−プラスミド［ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）等］、フルースクリプト系ファージミッド［ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋／−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等］、Ｍ１３系ファージ［ｍｐ１０、ｍｐ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、λ系ファージ［λｇｔ１０、ｇｔ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、コスミッド類［ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等］、ｐＡＵＲ系プラスミド［ｐＡＵＲ１１２（宝酒造社）等］等があげられる。
さらに、本発明ベクターは、本発明プロモーターの下流に植物ターミネーターが機能可能な形で挿入されていてもよい。
【００２０】
本発明ベクターは、前記ベクターに、通常の方法で本発明プロモーターを組み込むことによって作製することができる。例えば、１２１−ＬＵＣ（福田裕穂、西村幹夫、中村研三監修：植物の細胞を観る実験プロトコール（秀潤社）１９６−２００頁）、ｐＢＩ１０１．３（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ｐＢＩＮ１９（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１（１９８４））等のベクターの遺伝子挿入部位に、本発明プロモーターを挿入してもよい。また、当該遺伝子挿入部位に、本発明プロモーター及び植物ターミネーターを機能可能な形で挿入することによっても作製することができる。
さらに、通常の方法により所望の外来遺伝子をベクターにおける本発明プロモーターの下流に機能可能な形で挿入することによって、所望の外来遺伝子を有する本発明ベクターを作製できる。また、本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡをカセットとして通常の方法により作製して、これを、例えば、１２１−ＬＵＣ（福田裕穂、西村幹夫、中村研三監修：植物の細胞を観る実験プロトコール（秀潤社）１９６−２００頁）、ｐＢＩ１０１．３（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ｐＢＩＮ１９（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１（１９８４））等のベクターの遺伝子挿入部位に挿入してもよい。
【００２１】
本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなることを特徴とするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むことを特徴とするベクター、或いは、本発明プロモーターを含むことを特徴とするベクター（即ち、本発明ベクター）又は本発明プロモーターの下流に遺伝子挿入部位及び植物ターミネーターを含むことを特徴とする前記ベクターのいずれかのベクターを、例えば、Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．，Ｆ．，Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ著、モレキュラー・クローニング第２版（１９８９）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法等により大腸菌やアグロバクテリウム菌に導入することによって、宿主細胞が微生物である本発明形質転換体が作製できる。かかる形質転換体は、本発明プロモーター又は前記の所望の外来遺伝子の調製や植物細胞への導入等に使用できる。
【００２２】
宿主細胞が植物である場合における本発明形質転換体（以下、本発明形質転換植物と記すこともある。）は、下記のようにして作製することができる。例えば、本発明プロモーター単独、又は本発明プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるＤＮＡのカセット又は本発明ベクターを、例えば、パーティクルガン法（遺伝子銃による植物細胞への直接導入法）、アグロバクテリウム菌による感染法（アグロバクテリウム菌を植物組織に感染させる方法）、電気的導入法（植物プロトプラストへの電気的導入法）等の方法により植物の細胞に導入することによって形質転換された植物の細胞を作製することができる。
【００２３】
本発明形質転換植物を作製する場合において宿主細胞として使用できる植物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の単子葉植物、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ、ミヤコグサ等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、キャベツ、ナタネ、カラシナ、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、メロン、カボチャ、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、レタス等のキク科植物等の双子葉植物等をあげることができる。
【００２４】
形質転換された植物の細胞は、例えば、Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ， Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｅｒｏｏｔ ａｎｄ Ｄ．Ｐ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ著：プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｐｒｅｓｓ （１９８８））、島本功、岡田清孝監修：モデル植物の実験プロトコール（イネ、シロイヌナズナ編）（秀潤社）（ＩＳＢＮ４−８７９６２−１５７−９ Ｃ３３４５、１９９６）７８−１４３頁或いは内宮博文著（植物遺伝子操作マニュアル、トランスジェニック植物の作り方（講談社サイエンティフィック））１９９０、ＩＳＢＮ４−０６−１５３５１３−７ Ｃ３０４５）２８−３３に記載されている通常の植物組織培養技術において用いられる方法に準じて再分化することによって、当該植物細胞由来の形質転換された植物の個体又はその一部を得ることができる。さらに、前記のようにして得られる植物の個体を栽培し自殖させることにより、当該植物の個体の子孫が得られる。
【００２５】
尚、本発明形質転換植物より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを制限酵素で切断することにより得られたＤＮＡに対して、宿主細胞の形質転換に用いたＤＮＡ又はその一部をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、所望の外来遺伝子の導入有無を確認することができる。また、本発明形質転換植物より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、本発明プロモーターの制御下に発現させようとする所望の外来遺伝子のセンス配列又はアンチセンス配列を有するＤＮＡをプローブとして用いたノザンハイブリダイゼーションを行うことにより、所望の外来遺伝子の発現を調べることができる。
【００２６】
本発明形質転換植物では、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩、病害、植物ホルモン処理等のストレスである外的要因に惹起され、導入された所望の外来遺伝子が発現されることにより、所望の有用形質を発現し得る。
外的要因としては、例えば、光強度１，０００μＥ／ｍ２ｓ〜２，０００μＥ／ｍ２ｓの白色光照射、波長２２０ ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線照射、ハサミ等による人為的傷害又は有害生物等による傷害、５０ｍＭ〜２００ｍＭ ＮａＣｌ処理、１〜５℃の低温、４０℃〜４５℃の高温、青枯れ病菌（Ｒａｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、いもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）等の植物病原菌の感染による罹病、１〜１０ｍＭのサリチル酸水溶液を葉にスプレーする植物ホルモン処理等のストレスをあげることができる。所望の外来遺伝子が、例えば、ワクチンとなるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（コレラ毒素タンパク質遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：２９２−２９７（１９９８））、ＨＢ抗原遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１１６７−１１７１（２０００））等）、抗体となるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（抗ヘルペスシンプレックスウイルスＩｇＧ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：１３６１−１３６４（１９９８））等）、医薬となるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（コラーゲン遺伝子（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４６９：１３２−１３６（２０００））、ラクトフェリン遺伝子（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．， ９：７１−７８（２０００））等）、ダイズのグリシニン遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６１（５）：７９４−７９９（１９９７））、β−コングリシニン遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６１（５）：７９４−７９９（１９９７））、ブラジルナッツの２Ｓアルブミン遺伝子（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６（３）：４３７−４４８（１９９１））、大腸菌等のｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ 、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ遺伝子（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １７８（１４）：４１２２−４１３０（１９９６））等の場合には、例えば、植物の収穫前又は収穫後に、強光、ＵＶ、葉組織をハサミ・シュレッダー等で切り刻むことによる傷害、低温、高温、高塩、サリチル酸等の植物ホルモン処理等のストレスを与えた後、形質転換体が産生した外来遺伝子産物を回収することにより、所望の外来遺伝子に対応したタンパク質を取得することができる。
また、所望の外来遺伝子が、例えば、ストレス耐性付与遺伝子（大腸菌カタラーゼ遺伝子（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４２８：４７−５１ （１９９８））、葉緑体型スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：１６２９−１６３３（１９９３））、浸透圧調整物質であるベタインの合成に関わるコリンオキシダーゼ遺伝子（ＣＯＤ）（Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １２：１３３−１４２（１９９７））、低温誘導性遺伝子の発現制御を担っている転写因子遺伝子（ＣＢＦ１或いはＤＲＥＢ１）（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０：１０４−１０６ （１９９８）、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １０：１３９１−１４０６ （１９９８））、）等の場合には、本発明形質転換植物では、強光、塩、低温、乾燥等に対する抵抗性が増強され得る。
また、所望の外来遺伝子が、例えば、植物防御遺伝子（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（ＰＡＬ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７（１）：３３５−３４１（１９８７））、カルコンシンターゼ遺伝子（ＣＨＳ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７（１）：３３５−３４１（１９８７））、キチナーゼ遺伝子（ＣＨＴ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２５４（１１）：４９０１−４９０７（１９７９））、リゾチーム遺伝子（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２４４（６）：１３９９−１４０９（１９６９））、ＰＲタンパク質遺伝子（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６（３）：１７７−１８５（１９８６））等）、病害抵抗性遺伝子（Ｐｔｏ遺伝子（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ９３（２３）：１３３９３−１３３９７（１９９６）等）、ウイルスコートタンパク質遺伝子（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６１（２）：５６１−５６９（１９８７））等の場合には、本発明形質転換植物では、細菌、カビ、ウイルス等に対する抵抗性が増強され得る。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （本発明プロモーター（ＲＨＬ４１プロモーター）の調製及びＬＵＣ発現ベクターの構築）
播種後３週間目のシロイヌナズナ葉部１００ｍｇをエッペンドルフチューブ中で、液体窒素を用いて凍結させ、これからＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いてゲノム遺伝子のＤＮＡを調製した。調製されたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、かつ、配列番号５で示される塩基配列（ＰＲ−２Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号６で示される塩基配列（ＰＲ−ＲＢ）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、約１．９ｋｂのＲＨＬ４１プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた後、増幅されたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該ＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。次にバイナリーベクター１２１−ＬＵＣ（福田裕穂、西村幹夫、中村研三監修：植物の細胞を観る実験プロトコール（秀潤社）１９６−２００頁）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該バイナリーベクターに相当するＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。精製された上記両者のＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターを得た。
当該ベクターを作製した過程を図１に示した。
【００２８】
実施例２ （ＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーターの調製及び発現ベクタ−の構築）
第二ＤＮＡをクローニングするために、実施例１で得られた１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターＤＮＡ １０ｎｇを鋳型として、かつ、配列番号７で示される塩基配列（ＰＲ−１Ｈ）若しくは配列番号８で示される塩基配列（ＰＲ−５Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号１０で示される塩基配列（ＰＲ−９Ｂ）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、それぞれ、約０．９ｋｂ、約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させた後、増幅されたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該ＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。次にバイナリーベクターｐＢＩ１２１−ＬＵＣをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから当該バイナリーベクターに相当するＤＮＡ断片を切り出し、さらにＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。精製された上記両者のＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターを得た。当該ベクターをＢａｍＨＩで完全消化した後、ＢＡＰ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化させた。
第一ＤＮＡである３５Ｓミニマムプロモーターを得るために、配列番号２で示される塩基配列（３５Ｓ（＋））からなるＤＮＡ及び配列番号３で示される塩基配列（３５Ｓ（−））からなるＤＮＡを合成した。それぞれのＤＮＡ溶液濃度を１００μＭに調整し、それぞれの調整されたＤＮＡ溶液３μｌずつをエッペンドルフチューブ内で混合した。当該エッペンドルフチューブを９４℃にて３分間加熱した後、室温に放置してアニーリングさせた。反応液をＢａｍＨＩで完全消化した後、エタノール沈殿した。一方、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶで完全消化した後、エタノール沈殿した。エタノール沈殿により得られたそれぞれのＤＮＡ沈殿をＴＥに溶解した。これらをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、３５Ｓミニマムプロモーターが挿入されたベクターを得た。当該ベクターをＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩで完全消化した。得られた消化物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから３５Ｓミニマムプロモーターに相当するＤＮＡ断片を切り出し、さらにこれをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片と、上記の脱リン酸化させた０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ又は０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターとをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、３５Ｓミニマムプロモーターが正方向又は逆方向に挿入された発現ベクターを得た。３５Ｓミニマムプロモーターの向きを確認するために、いくつかのカナマイシン耐性株から得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１１で示される塩基配列（３５Ｓ−ｍｉｎ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ１）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、ＤＮＡ断片の増幅が認められるものを３５Ｓミニマムプロモーターが正方向に挿入された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現ベクターとして選定した。得られた当該ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した後、これをＢｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化し、さらにライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてセルフライゲーション処理を行うことにより、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターを得た。当該ベクターを作製した過程を図２〜３に示した。
【００２９】
実施例３ （ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターの調製と発現ベクタ−の構築）
第一ＤＮＡであるＧ６ミニマムプロモーターを得るために、ｐＢＩＣＲ１６Ｇ６ＰＴ（特開２０００−１６６５７７号公報に記載される）１０ｎｇを鋳型として、かつ、配列番号１３で示される塩基配列（Ｇ６−１）からなるＤＮＡと配列番号１４で示される塩基配列（Ｇ６−２）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、約２２０ｂｐのＧ６ミニマムプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた。増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩで完全消化した後、エタノール沈殿した。実施例２で作製された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ又は０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターとをＢａｍＨＩで完全消化した後、ＢＡＰ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化させた。精製された、Ｇ６ミニマムプロモーター領域を含むＤＮＡ断片と、上記の脱リン酸化させた０．９ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ又は０．４ｋｂ ＲＨＬ４１（−ＴＡＴＡ）／ＬＵＣ発現ベクターとをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、これを大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。このようにして調製された大腸菌ＨＢ１０１株の中からカナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマイシン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収することにより、Ｇ６ミニマムプロモーターが正方向又は逆方向に挿入された発現ベクターを得た。Ｇ６ミニマムプロモーターの向きを確認するために、いくつかのカナマイシン耐性株から得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１４で示される塩基配列（Ｇ６−１）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ１）からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、ＤＮＡ断片の増幅が認められるものをＧ６ミニマムプロモーターが正方向に挿入された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ発現ベクターとして選定した。得られた当該ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで完全消化した後、これをＢｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化し、さらにライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてセルフライゲーション処理を行うことにより、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターを得た。当該ベクターを作製した過程を図４に示した。
【００３０】
実施例４ （形質転換タバコの育成）
本発明形質転換植物の作製は、Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ， Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ａｎｄ Ｄ．Ｐ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ著；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｋｌｉｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：６６３６−５５４０（１９８８）に記載される方法に準じて行った。
ＹＥＢ培地中、３０℃にて一晩振とう培養したアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４を、新たなＹＥＢ培地に植え継ぎ、ＯＤ６００が０．６になるまで培養した。以下の操作は低温室内で行った。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、回収された菌体を冷やしておいた滅菌蒸留水で懸濁した後、再度遠心分離により菌体を回収した。このような洗浄操作を２回繰り返した後、滅菌蒸留水を１０％グリセロール溶液に代えて同様の洗浄操作を行った。こうして得られた菌体を最終的に４００倍濃縮になるように１０％グリセロール溶液に懸濁した。このようにして調製されたコンピテントセルに、上記で構築された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ及び１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣを、エレクトロポレーション法を用いて導入した後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＥＢプレート上で生育させることにより、生育してきたカナマイシン耐性クローン７株（０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４）を取得した。各カナマイシン耐性クローンをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＥＢ液体培地で、３０℃にて２晩振とう培養した。得られた培養液から、ＱＩＡ−ｐｒｅｐ ｓｐｉｎカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４又は３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１１で示される塩基配列（３５Ｓ−ｍｉｎ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、また０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４又はＧ６ｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号１４で示される塩基配列（Ｇ６−１）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、また１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として、かつ、配列番号９で示される塩基配列（ＰＲ−６Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行うことにより、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣそれぞれがアグロバクテリウムに導入されていることをＤＮＡ断片の増幅により確認した。
無菌培養されたタバコの葉部切片（０．７ｃｍ角）を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＥＢ液体培地で３０℃にて１晩培養された０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、３５Ｓｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４或いは１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４の各培養液に２分間浸した後、当該葉部切片から滅菌されたろ紙で余分な水分を除いた後、これをＭＳ−ＮＢ培地上に置いた。２５℃にて１２時間明所、８時間暗所の条件下で２日間培養した後、当該葉部切片をＭＳ液体培地で洗浄し、ＭＳ−ＮＢＣ培地上に置いた。さらに前記と同様な条件下で７日間培養した後、選択薬剤を含むＭＳ−ＮＢＣＫ培地に当該葉部切片を移し、さらに約１ヶ月間程度静置培養し、再生されたシュートを当該葉部切片より切断し、これをＭＳ−ＣＫ培地に植え継いだ。約１ヶ月間後、発根した個体を土壌に植えかえることにより、自殖種子（Ｔ１世代）を得た。
【００３１】
実施例５ （形質転換シロイヌナズナの育成）
本発明形質転換植物の作製は、島本功、岡田清孝監修：モデル植物の実験プロトコール（イネ、シロイヌナズナ編）（秀潤社）９９−１０４頁に記載される方法に準じて行った。
実施例４に記載される方法を用いて、実施例１で得られた１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株に導入することにより、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４を取得した。さらに実施例４に記載される方法と同様にして、配列番号９で示される塩基配列（ＰＲ−６Ｈ）からなるＤＮＡと配列番号１２で示される塩基配列（ＬＵＣ−１）とをプライマーとするＰＣＲ（９４℃１分間、５４℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクル）を行い、それぞれのアグロバクテリウムに上記ベクターが導入されていることを確認した。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＳ）種子を滅菌した後、これをＢＭ培地に播種し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて１週間培養した。発芽した実生を培地から引き抜き、これをＢＭ培地上に並べ、さらに１週間培養した。根をハサミで切り出して束にして、約１ｃｍ長さに切った後、これをＣＩＭ培地に置床し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて３〜５日間培養した。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１．５ｍｌで３０℃にて２晩培養した１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ：ＬＢＡ４４０４の培養液をＬＢ培地で１０倍希釈する（ＯＤ６００を０．１〜１とする）。さらにこの培養液をＢ５塩溶液により５倍希釈し、当該希釈液にＣＩＭ培地で培養された根切片を２〜３分間浸漬した。浸漬された根切片から滅菌ろ紙で余分な水分を除いた後、これをＣＩＭ培地に移し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて２日間培養した。培養された根切片をクラフォラン２５０μｇ／ｍｌを含む洗浄液の入ったシャーレに移し、これを５分間程軽く混ぜた後、当該根切片から滅菌ろ紙で余分な水分を除いた。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択用ＳＩＭ培地に移し、３０〜５０μＥ／ｍ２ｓの連続照明下、２３℃にて培養を続けた。２週間毎にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む新しい選択用ＳＩＭ培地に移し、シュートが再生してきたら切り取ってＲＩＭ培地に移植し、引き続き培養した。発根した個体を無菌培養用ポット（直径１０ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に入れたカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ジェランガム０．２５％を含むＭＳ培地に移植して、採種できるまで培養した。得られた種子（Ｔ１世代）をカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ジェランガム０．２５％を含むＭＳ培地に無菌播種し、カナマイシン耐性の実生を土入りのポットに移植・馴化させ、採種できるまで栽培を行うことにより、自殖種子（Ｔ２世代）を得た。
【００３２】
実施例６ （ＲＨＬ４１／Ｇ６又はＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける傷害誘導発現解析）
実施例４で得られた７種類の形質転換タバコの自殖種子（Ｔ１世代）を１０％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に５分間浸し、次いで、滅菌蒸留水で４〜５回洗浄した後、これをカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ培地に播種し、２３℃にて１６時間明所、８時間暗所の条件下で２週間生育させた。カナマイシン耐性を示した植物体（約３個体）の葉をピンセットで押しつぶすことにより、傷害処理を施した。６時間後に傷害処理された植物及び未処理の植物を採取し、採取された植物材料におけるルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）キットを用いて測定した。また各植物試料の抽出液のタンパク質含量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いて測定し、測定されたタンパク質含量に基づきタンパク質当りの活性を算出した。その結果を図５に示した。１．９ｋｂ ＲＨＬ４１プロモーターの場合には、傷害処理により未処理の１９倍の誘導活性が認められ、当該プロモーターが傷害誘導性を有することが確認された。また、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターの場合には、傷害処理により未処理の２〜７倍の誘導活性が認められた。一方、ＲＨＬ４１プロモーターを付加していない３５Ｓミニマムプロモーター単独又はＧ６ミニマムプロモーター単独の場合には、上記のような高い誘導活性は認められなかった。これらの結果から、ＲＨＬ４１／３５Ｓ又はＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターも傷害誘導性を有することが確認された。また、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーターの傷害誘導時の活性は、１．９ｋｂＲＨＬ４１プロモーターの場合よりも、２．７〜７倍高いことが確認された。
【００３３】
実施例７ （０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける種々のストレス誘導発現解析）
０．９ｋｂＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター／ＬＵＣを発現する組み換えタバコを用いて、傷害、高温又はＵＶ等のストレスによるプロモーター活性の誘導性を調査した。実施例４に記載される方法においてＭＳ−ＣＫ培地で選抜している組換え植物シュート（Ｔ０世代）を発根させ、発根した個体を鉢上げ・馴化させた。傷害ストレスの場合には、ハサミで葉の葉柄部分を残して幅５〜１０ｍｍの切り込みを入れた。高温ストレスの場合には、６０〜１００μＥ／ｍ２ｓの光強度、４５℃の温度の条件下で植物をインキュベートした。ＵＶストレスの場合には、波長が３０２ｎｍに設定されたトランスイルミネーター（３ＵＶＴＭｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ｕｐｌａｎｄ社）を逆さまに設置することにより上方１４〜１７ｃｍの位置から植物にＵＶを照射した。各ストレス付与において、経時的に葉を採取し、採取された試料を液体窒素にて凍結させた。凍結された葉試料を乳鉢を用いて破砕した後、当該試料におけるルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）キットを用いて測定した。また各植物試料の抽出液のタンパク質含量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いて測定し、測定されたタンパク質含量に基づきタンパク質当りの活性を算出した。その結果を図６に示した。各ストレス付与によりＬＵＣ活性が認められ、０．９ｋｂＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター活性は傷害、高温、ＵＶ等のストレスにより誘導されることが確認された。
【００３４】
実施例８ （ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける種々のストレス応答解析）
１．９ｋｂＲＨＬ４１／ＬＵＣを発現する組み換えシロイヌナズナを用いて、強光、ＵＶ、傷害、高温（４０℃）、青枯れ病菌感染、植物ホルモン（ＪＡ、ＡＢＡ、ＳＡ）処理及びこれらストレス付与の結果生じるだろうと考えられている過酸化水素によるストレスにおけるプロモーター活性の誘導性を調査した。０．５％ショ糖を含むＭＳ液体培地を２４穴プレートに１ｍｌ入れ、そこに滅菌された組換え植物（Ｔ２世代、ホモライン）の種子を約２０粒ずつ加え、１５０ｒｐｍにて回転培養した。７日目に０．５ｍｌずつ液体培地を追加し、１０日目に実験に用いた。液体培地に５０μＭ ジャスモン酸（ＪＡ）、１００μＭ アブシジン酸（ＡＢＡ）、１ｍＭサリチル酸（ＳＡ）、１０〜２０ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）となるよう添加して培養した。また、ＢＧ培地で一晩培養した青枯れ病菌ＪＣＭ１０４８９を蒸留水で洗浄した後、ＯＤ６００が０．２５になるように調製し、調製された菌懸濁液と液体培地とを交換して培養した。
また、組換え植物（Ｔ２世代、ホモライン）の種子を鉢に播き、６０〜１００μＥ／ｍ２ｓの光強度（明所／暗所＝１６時間／８時間）、２３℃の温度、７０％の湿度の条件下で３週間生育させ、実験に用いた。強光処理の場合には、植物に光環境シミュレーター（ＴＧＥ−２Ｓ、タバイエスペック社）を用いて２，０００μＥ／ｍ２ｓの光強度の強光を照射した。ＵＶ処理の場合には、波長が３０２ｎｍに設定されたトランスイルミネーター（３ＵＶＴＭｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ｕｐｌａｎｄ社）を逆さまに設置することにより上方２５ｃｍの位置から植物にＵＶを照射した。傷害処理の場合には、ピンセットで葉をつまむことにより、葉組織を破壊した。高温処理の場合には、６０〜１００μＥ／ｍ２ｓの光強度、４０℃の温度の条件下で植物をインキュベートした。
各処理につき、経時的に葉を採取し、採取された葉試料を液体窒素にて凍結させた。凍結された葉組織をエッペンドルフチューブ内にて破砕した後、当該試料でのＬＵＣ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （プロメガ社）を用いて測定した。また各植物試料の抽出液のタンパク質含量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いて測定し、測定されたタンパク質含量に基づきタンパク質当りの活性を算出した。その結果を図７〜１３に示した。各処理ともに、ＬＵＣ活性が認められ、ＲＨＬ４１プロモーター活性はこれらのストレス処理により誘導されることが確認された。
【００３５】
実施例において用いられた培地の組成を示す。
（Ａ）タバコ用培地
（１）ＭＳ寒天培地
ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ ＡＮＤ ＳＫＯＯＧ ＢＡＳＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社）４．４ｇ、ショ糖３０ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、アガー（和光純薬）を８ｇ添加した後、オートクレーブ滅菌した培地である。
（２）ＭＳ−ＮＢ寒天培地
ＭＳ寒天培地に、１−ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）０．１μｇ／ｍｌ、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）１．０μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（３）ＭＳ−ＮＢＣ寒天培地
ＭＳ―ＮＢ寒天培地に、クラフォラン３００μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（４）ＭＳ−ＮＢＣＫ寒天培地
ＭＳ―ＮＢ寒天培地に、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クラフォラン３００μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（５）ＭＳ−ＣＫ寒天培地
ＭＳ寒天培地に、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クラフォラン３００μｇ／ｍｌを添加した培地である。
（Ｂ）シロイヌナズナ用培地
（１）ＢＭ培地
ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ ＡＮＤ ＳＫＯＯＧ ＢＡＳＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社）４．４ｇ、ＭＥＳ（和光純薬）０．５ｇ、ショ糖１０ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、ジェランガム（ｘｘ）２．５ｇを添加した後、オートクレーブ滅菌した培地である。
（２）ＣＩＭ培地
ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ ＡＮＤ ＳＫＯＯＧ ＢＡＳＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社）４．４ｇ、ＭＥＳ（和光純薬）０．５ｇ、グルコース２０ｇ、２，４−Ｄ０．５ｍｇ、カイネチン０．１ｍｇを蒸留水１Ｌに溶かし、１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、ジェランガム（ｘｘ）２．５ｇを添加した後、オートクレーブ滅菌した培地である。
（３）選択用ＳＩＭ培地
ＣＩＭ培地の２，４−Ｄとカイネチンの代わりに、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）０．１５ｍｇ、Ｎ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（２ｉｐ）０．５ｍｇ、カナマイシン５０ｍｇを添加した培地である。
（４）ＲＩＭ培地
ＣＩＭ培地の２，４−Ｄとカイネチンの代わりに、３−インドールブチル酸（ＩＢＡ）０．５ｍｇを添加した培地である。
（Ｃ）細菌用培地
（１）ＬＢ培地
バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ、バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整し、オートクレーブ滅菌した培地である。プレートの場合にはこれに１５ｇの寒天を添加して用いる。（２）ＹＥＢ培地
バクトビーフエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）５ｇ、バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ、ポリペプトン５ｇ、ショ糖５ｇ及び１０Ｍ ＮａＯＨ ０．２ｍｌを蒸留水１Ｌに溶かし、オートクレーブ滅菌する培地である。オートクレーブ滅菌した後、フィルター滅菌された１Ｍ ＭｇＳＯ４を０．２ｍｌ添加した培地である。プレートの場合にはこれに１５ｇの寒天を添加して用いる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、発現誘導型プロモーター等が提供可能になった。
【００３７】
［配列表フリーテキスト］
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明ベクターである１．９ｋｂ ＲＨＬ４１／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図２】図２は、本発明ベクターである０．９ｋｂ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、３５Ｓは３５Ｓミニマムプロモーターを示し、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図３】図３は、本発明ベクターである３５ｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、３５Ｓは３５Ｓミニマムプロモーターを示し、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図４】図４は、本発明ベクターである０．９ｋｂ、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６／ＬＵＣ発現ベクター、Ｇ６ｍｐ／ＬＵＣ発現ベクターの制限酵素地図及びその構築過程を示す図である。図中、ＫｍｒはＮＯＳプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子及びＮＯＳターミネーターからなる発現カセットを示す。また、Ｇ６はＧ６ミニマムプロモーターを示し、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子を示し、ＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーターを示し、ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。
【図５】図５は、ＲＨＬ４１／Ｇ６及びＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける傷害誘導発現解析の結果を示す図である。図中の横軸に記載される各プロモーターは、左から順に、３５Ｓミニマムプロモーター単独（３５Ｓｍｉｎ）、Ｇ６ミニマムプロモーター単独（Ｇ６ｍｉｎ）、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーター（０．４ｋ−Ｇ６）、０．４ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター（０．４ｋ−３５Ｓ）、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／Ｇ６キメラプロモーター（０．９ｋ−Ｇ６）、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓキメラプロモーター（０．９ｋ−３５Ｓ）、１．９ｋｂ ＲＨＬ４１プロモーター（１．９ｋ）である。図中の横軸に記載される各プロモーターにおける左側の棒グラフは未処理区での誘導活性を表しており、右側の棒グラフは傷害処理区での誘導活性を表している。
【図６】図６は、０．９ｋｂ ＲＨＬ４１／３５Ｓ／ＬＵＣ発現組換えタバコにおける種々のストレス誘導発現解析の結果を示す図である。図中の横軸に記載される各ストレスは、左から順に、未処理、傷害ストレス、高温ストレス、ＵＶストレスである。また、数字とｈとで示された記載は、各ストレスにおける処理時間を表している。
【図７】図７は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける植物ホルモン処理によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある英字は植物ホルモン名を表しており、ＪＡはジャスモン酸、ＡＢＡはアブシジン酸、ＳＡはサリチル酸を表している。また、数字とｈとで示された記載は、各ストレスにおける処理時間を表している。
【図８】図８は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける過酸化水素によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図９】図９は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける青枯れ病菌感染によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１０】図１０は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける強光によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１１】図１１は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおけるＵＶによるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１２】図１２は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける傷害によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
【図１３】図１３は、ＲＨＬ４１プロモーター／ＬＵＣ発現組換えシロイヌナズナにおける高温によるストレス応答解析の結果を示す図である。図中の横軸にある数字とｈとで示された記載は、当該ストレスにおける処理時間を表している。
Claims (14)
- 下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター。
（１）第一ＤＮＡ：
ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与する領域を有するＤＮＡ
（２）第二ＤＮＡ：
下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。 - 下記の第一ＤＮＡ及び下記の第二ＤＮＡを有し、かつ、第一ＤＮＡの５’末端側に第二ＤＮＡを有することを特徴とする発現誘導型プロモーター。
（１）第一ＤＮＡ：
下記の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基番号１７５２から塩基番号１８８６までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）ゲノム遺伝子が有するプロモーター領域から切り出される一部のＤＮＡであって、当該ＤＮＡにおける３’末端は転写開始点に相当するヌクレオチドであり、かつ、当該ＤＮＡにおける５’末端は前記３末’端より４６〜２００塩基上流の位置にあるヌクレオチドであって、ミニマムプロモーター機能を有するＤＮＡ。
（２）第二ＤＮＡ：
下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。 - 請求項１記載の発現誘導型プロモーター、所望の外来遺伝子及び植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなることを特徴とするＤＮＡ。
- 請求項１記載の発現誘導型プロモーターを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項１記載の発現誘導型プロモーターの下流に遺伝子挿入部位及び植物ターミネーターを含むことを特徴とする請求項３記載のベクター。
- 請求項３記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項１記載の発現誘導型プロモーターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 請求項３記載のＤＮＡ又は請求項５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 請求項４及び５記載のいずれかのベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項７〜９記載のいずれかの形質転換体。
- 請求項１記載の発現誘導型プロモーター、請求項２記載のＤＮＡ又は請求項４及び５記載のいずれかのベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 請求項８記載の形質転換体を培養又は育成する工程、外的ストレス処理を与えた後、形質転換体が産生した外来遺伝子産物を回収する工程を有することを特徴とするタンパク質の取得方法。
- 下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列に相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物細胞において発現誘導型の制御プロモーター機能を有するＤＮＡ。 - 配列番号１の塩基番号１から塩基番号１７５１までの塩基配列からなるＤＮＡ。
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| JP2002304115A JP2004135597A (ja) | 2002-10-18 | 2002-10-18 | 発現誘導型プロモーター及びその利用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008117811A1 (ja) * | 2007-03-27 | 2008-10-02 | Japan Science And Technology Agency | 形質転換植物、形質転換細胞、タンパク質生産キットおよびタンパク質の生産方法 |
| JP2011193801A (ja) * | 2010-03-19 | 2011-10-06 | National Univ Corp Shizuoka Univ | プロモーター |
| CN114107305A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-01 | 朱博 | 一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用 |
-
2002
- 2002-10-18 JP JP2002304115A patent/JP2004135597A/ja active Pending
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| CN114107305B (zh) * | 2021-12-14 | 2023-11-28 | 朱博 | 一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用 |
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