JP5089680B2 - 形質転換植物、形質転換細胞、タンパク質生産キットおよびタンパク質の生産方法 - Google Patents
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Description
本発明に係る形質転換植物は、発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、サイレンシングサプレッサーポリヌクレオチドを含まない植物RNAウイルスベクターと、NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが少なくとも導入されている形質転換植物であって、上記植物RNAウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドのうち、少なくとも一つは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えており、上記サイレンシングサプレッサーポリヌクレオチドは、上記NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの上流に、発現誘導型のプロモーターを備える。
本発明において、利用される植物RNAウイルスは、サイレンシングサプレッサーを含まない植物ウイルスであり、好ましくはウイルスゲノムが複数本の(+)鎖RNAから構成されるものである。より好ましくは、BMV、AlMV、 cowpea chlorotic mottle virus(CCMV)であり、特に好ましくはBMVである。なお、上記CCMVは、BMVと極めて近縁なブロモウイルス属のウイルスであり、特にマメ科でよく増えるという特徴を有する。
ウイルスRNAは、RNA抽出法として公知の方法、例えばグアニジン法、熱フェノール法、ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)フェノール法等を用い、ウイルス粒子から抽出することができる。BMV、CMV、AlMV、CCMVの場合、ゲノムが数種類のRNAからなるため、アガロースゲル電気泳動でRNA1、2及び3として分画精製する。それぞれのRNAの相補性DNA(cDNA)の構築は、常法の遺伝子操作技術を利用して行うことができる(Ahlquistら、(1984)J.Mol.Biol.172:369−383;Moriら、(1991)J.Gen.Virol.72:243−246)。
本発明に係る形質転換植物は、NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを要する。NSsタンパク質とは、Tomato spotted wilt virus(以下「TSWV」と記載する)の一本鎖RNAのうちS RNA(2.9kb)がコードするタンパク質であり、サイレンシングサプレッサーとして機能することが知られている(Atsushi Takeda et al., FEBS Letters, 532, 75-79, 2002)。本発明者らは、上記植物RNAウイルスベクターと、当該NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが少なくとも導入されている形質転換植物において、上記植物RNAウイルスベクターが誘導発現されている場合にNSsタンパク質を誘導発現させることにより、サイレンシングを抑制すると共に、植物の生育異常を回避でき、植物RNAウイルスベクター中の外来タンパク質を効率よく生産することができることを見出した。
本発明に係る形質転換植物は、(1−2)で説明した植物RNAウイルスベクターと、(1−3)で説明したNSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが少なくとも導入されている。上記導入は、上述の公知の遺伝子導入法を用いることによって行うことができる。上記導入は、植物個体に直接行ってもよいし、植物細胞、植物の断片等に導入し、導入された植物細胞や植物の断片を、(1−2)に記載した方法によって植物体に再生してもよい。植物としては、上述のように、双子葉植物であっても単子葉植物であってもよく、マメ科、セリ科、アブラナ科、ウリ科、ナス科およびイネ科よりなる群より選ばれる科に属することが好ましく、ベンサミアーナ植物であることが特に好ましい。
(1−2)で説明した植物RNAウイルスベクターおよび(1−3)で説明したNSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、有用な任意のタンパク質を生産する細胞または植物を作製するために利用できるものである。したがって、上記植物RNAウイルスベクターおよびNSsタンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに細胞の形質転換に必要な試薬、器具等をキット化しておけば、利用者は上記植物RNAウイルスベクターおよびNSsタンパク質を導入した形質転換植物または形質転換細胞を簡便に作製することが可能となる。
非特許文献3に記載されているように、PVXベクターを用いた増幅系において特定の部位に変異を導入したHC−Pro変異体を恒常的に発現させた場合、ベンサミアーナ植物の生育異常は起こらないことが示されている。
デキサメタゾン(DEX)特異的遺伝子発現形質転換植物の作出には、TiプラスミドpTA7001(McNellisら, 1998, Plant J., 14, 247−257)を用いた。
6xUASgal4プロモーター下流に連結したBMV RNA1cDNAの形質転換用TiプラスミドpTA7001と、35Sプロモーターの下流に連結したBMV RNA2cDNAの形質転換用TiプラスミドpBICBPB2Rは、(Mori et al., Plant J. 27(1), 79-86, 2001)に記載されているものを用いた。上記6xUASgal4プロモーターの上流には、転写因子としてGVGが連結されており、GVGは35Sプロモーターの下流に連結されている。
TiプラスミドベクターpTA7001-NSs、pTA7001-P19およびpTA7001-2bを用い、アグロバクテリウム法によって、6xUASgal4プロモーター下流に連結したNSs、P19または2b遺伝子を導入した形質転換ベンサミアーナ植物を作出した。再分化したハイグロマイシン耐性植物の種子を播種し、4週間後、展開葉にDEX(30μg/mlになるようエタノールに溶解したもの)を適量塗布した(DEX処理)。処理1日後に全RNAを抽出してノーザンブロッティングを行い、DEX特異的にNSs、P19または2b遺伝子が発現している形質転換植物を選抜した(夫々の植物を、GVG−NSs植物、GVG−P19植物、GVG−2b植物と称する)。
pBICBPB2R、pTA7001BB1、pBICHGCP2smGFPRを用い、それぞれアグロバクテリウム法によりベンサミアーナ植物を形質転換し、6XUASGAL4プロモーター下流に連結したBMV RNA1 cDNAを導入したGVG1植物、35Sプロモーター下流に連結したBMV RNA2 cDNAを導入した35S2植物、35Sプロモーター下流に連結した外被タンパク質遺伝子がGFP遺伝子と置換されたBMV RNA3 cDNAを導入した35SGR植物を得た。
GVG1xB2xGR植物と、GVG−NSs植物、GVG−P19植物、およびGVG−2b植物をそれぞれ交配することにより、ブロムモザイクウイルスベクターを誘導発現し、さらにサプレッサー遺伝子を誘導発現する形質転換植物(GVG1xB2xGRxGVG-NSs植物、GVG1xB2xGRxGVG-P19植物、GVG1xB2xGRxGVG-2b植物)を作出した。
Claims (19)
- 発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、サイレンシングサプレッサーをコードするポリヌクレオチドを含まない植物RNAウイルスベクターと、
NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが少なくとも導入されている形質転換植物であって、
上記植物RNAウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドのうち、少なくとも一つは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えており、
上記NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えるものであることを特徴とする植物。 - 上記植物RNAウイルスがブロムモザイクウイルスであることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の植物。
- 上記プロモーターが、ステロイドホルモンによって誘導されることを特徴とする請求の範囲第1項または第2項に記載の植物。
- 上記ステロイドホルモンはデキサメタゾンであることを特徴とする請求の範囲第3項に記載の植物。
- 上記植物は、マメ科、セリ科、アブラナ科、ウリ科、ナス科およびイネ科よりなる群より選ばれる科に属することを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれか1項に記載の植物。
- 上記植物はベンサミアーナ植物であることを特徴とする請求の範囲第5項に記載の植物。
- 発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、サイレンシングサプレッサーをコードするポリヌクレオチドを含まない植物RNAウイルスベクターと、
NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが少なくとも導入されている形質転換細胞であって、
上記植物RNAウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドのうち、少なくとも一つは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えており、
上記NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えるものであることを特徴とする形質転換細胞。 - 上記植物RNAウイルスがブロムモザイクウイルスであることを特徴とする請求の範囲第7項に記載の形質転換細胞。
- 上記プロモーターが、ステロイドホルモンによって誘導されることを特徴とする請求の範囲第7項または第8項に記載の形質転換細胞。
- 上記ステロイドホルモンはデキサメタゾンであることを特徴とする請求の範囲第9項に記載の形質転換細胞。
- 発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、サイレンシングサプレッサーをコードするポリヌクレオチドを含まない植物RNAウイルスベクターと、
NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも含むタンパク質生産キットであって、
上記植物RNAウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドのうち、少なくとも一つは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えており、
上記NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備えるものであることを特徴とするタンパク質生産キット。 - 上記植物RNAウイルスがブロムモザイクウイルスであることを特徴とする請求の範囲第11項に記載のタンパク質生産キット。
- 上記タンパク質生産キットであって、さらに、ステロイドホルモンを含むことを特徴とする請求の範囲第11項または第12項に記載のタンパク質生産キット。
- 上記ステロイドホルモンはデキサメタゾンであることを特徴とする請求の範囲第13項に記載のタンパク質生産キット。
- 発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、サイレンシングサプレッサーをコードするポリヌクレオチドを含まない植物RNAウイルスベクターをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する工程と、
NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物に導入する工程と、
上記植物を転写誘導する工程と、を少なくとも含むタンパク質の生産方法であって、
上記植物RNAウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドのうち、少なくとも一つは、当該ポリヌクレオチドの上流に発現誘導型のプロモーターを備え、
上記NSsタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの上流に、発現誘導型のプロモーターを備えることを特徴とするタンパク質の生産方法。 - 上記植物RNAウイルスがブロムモザイクウイルスであることを特徴とする請求の範囲第15項に記載のタンパク質の生産方法。
- 上記転写誘導はステロイドホルモンによって行われることを特徴とする請求の範囲第15項または第16項に記載のタンパク質の生産方法。
- 上記植物は、マメ科、セリ科、アブラナ科、ウリ科、ナス科およびイネ科よりなる群より選ばれる科に属することを特徴とする請求の範囲第15項から第17項のいずれか1項に記載のタンパク質の生産方法。
- 上記植物は、ベンサミアーナ植物であることを特徴とする請求の範囲第18項に記載のタンパク質の生産方法。
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